ES2645366T3 - Tratamiento de trastornos de la angiogénesis - Google Patents

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ES2645366T3 ES12745124.3T ES12745124T ES2645366T3 ES 2645366 T3 ES2645366 T3 ES 2645366T3 ES 12745124 T ES12745124 T ES 12745124T ES 2645366 T3 ES2645366 T3 ES 2645366T3
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Abstract

Agente que se une a IGFBP2 e inhibe que IGFBP2 se una a IGF1, para su uso en el tratamiento de cáncer.

Description

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DESCRIPCION
Tratamiento de trastornos de la angiogenesis Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud estadounidense provisional n.° 61/441.738, presentada el 11 de febrero de 2011.
Clausula gubernamental
Esta invencion se realizo con respaldo gubernamental con la subvencion W81XWH-10-1-0535 concedida por el DoD (Departamento de Defensa). El gobierno ostenta ciertos derechos con respecto a la invencion.
Campo de invencion
Esta invencion se refiere a tratamientos para trastornos de la angiogenesis.
Antecedentes de invencion
La angiogenesis es un proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguineos y remodelacion de vasos sanguineos preexistentes. Es vital para el crecimiento y desarrollo normales, asi como otros procesos fisiologicos, tales como la cicatrizacion de heridas. Por otro lado, la angiogenesis tambien es importante en diversos procesos patologicos. Por ejemplo, la angiogenesis patologica es una etapa fundamental en la transicion de tumores de un estado latente a uno maligno, caracterizado por las propiedades de anaplasia, invasividad y metastasis.
La evolucion metastasica del cancer constituye un reto clinico formidable. Los avances tecnologicos han permitido la deteccion y el tratamiento de algunas neoplasias de estadio temprano, sin embargo, las tasas de mortalidad total debido a canceres malignos epiteliales han permanecido esencialmente inalteradas a lo largo de los ultimos cuarenta anos (seer.cancer.gov/csr/1975_2007/, Instituto Nacional de Salud, 2007). Generalmente se cree que esto se debe a varios factores, incluyendo heterogeneidad molecular dentro de los tipos de cancer, regimenes quimioterapicos de eficacia moderada que se derivaron historicamente de manera empirica, y una atencion de larga tradicion en los elementos impulsores moleculares del crecimiento de tumor primario en vez de evolucion metastasica.
La prevencion o el tratamiento eficaces de metastasis exige la compresion de eventos moleculares y celulares, incluyendo la angiogenesis, subyacentes a este proceso complejo (Talmadge, J. E. et al., Cancer Res 70 (14), 5649 (2010); Sleeman, J. et al., Eur J Cancer 46 (7), 1177 (2010); y Hurst, D. R., et al, Cancer Res 69 (19), 7495 (2009)). Se ha descubierto VEGF como promotor de la tumorigenesis en tumores primarios (Kim, K. J. et al., Nature 362 (6423), 841 (1993)). Algunos ensayos clinicos han mostrado que la inhibicion de VEGF puede prolongar, en combinacion con quimioterapia, la supervivencia en 2-3 meses en pacientes con cancer de pulmon o colorrectal de estadio IV (Hurwitz, H. et al, N Engl J Med 350 (23), 2335 (2004); Giantonio, B. J. et al., J Clin Oncol 25 (12), 1539 (2007); y Sandler, A. et al., N Engl J Med 355 (24), 2542 (2006)). Sin embargo, no se ha probado que la inhibicion de VEGF sea beneficiosa para la prevencion de metastasis en la practica de terapia adyuvante (Barugel, M. E., et al. Expert Rev Anticancer Ther 9 (12), 1829 (2009) y en recientes modelos de metastasis preclinicos (Paez-Ribes, M. et al., Cancer Cell 15 (3), 220 (2009) y Ebos, J. M. et al., Cancer Cell 15 (3), 232 (2009)). Aunque se ha propuesto que la compensacion por otros factores desconocidos que fomentan la angiogenesis metastasica subyace a estos desenlaces, varios investigadores han tratado de abordar la metastasis mediante rutas distintas a la angiogenesis. Por ejemplo, el documento WO 2009082744 describio genes sobre expresados en metastasis en hueso y pulmon de cancer de mama, en los que los genes no estaban relacionados con la angiogenesis. Otros se esforzaron por identificar factores que medien en la angiogenesis metastasica. Sin embargo, han tenido un exito limitado.
Por tanto, existe la necesidad de agente y metodos para regular la angiogenesis y para tratar trastornos caracterizados por angiogenesis patologica, incluyendo cancer.
Sumario de invencion
Esta invencion se basa, al menos en parte, en un descubrimiento inesperado de una nueva ruta que regular el reclutamiento endotelial y, a su vez, la angiogenesis.
Por consiguiente, un aspecto de esta invencion presenta un metodo para inhibir el reclutamiento endotelial, asi como la angiogenesis, en un sujeto que lo necesita. El metodo incluye una etapa de administrar al sujeto un primer agente que inhibe la expresion o actividad de una primera proteina seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1. En una realizacion, el sujeto tiene un trastorno de la angiogenesis, es decir, un trastorno caracterizado por angiogenesis patologica, tales como cancer, un trastorno ocular o un trastorno inflamatorio. Los ejemplos del cancer incluyen cancer metastasico. El metodo mencionado anteriormente puede incluir ademas una
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etapa de administrar al sujeto un segundo agente que inhibe la expresion o actividad de una segunda proteina seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MErTk, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR. El primer agente o el segundo agente mencionados anteriormente pueden ser un anticuerpo (o una parte de union a antigeno del mismo), un acido nucleico, un polipeptido o un compuesto de molecula pequena. En un ejemplo, el anticuerpo anterior es uno monoclonal que contiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 mostradas a continuacion.
En un segundo aspecto, esta invencion presenta un metodo para tratar cancer metastasico en un sujeto que lo necesita. El metodo incluye una etapa de administrar al sujeto un primer agente que inhibe la expresion o actividad de una primera proteina seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1, en el que el primer agente inhibe la angiogenesis. Los ejemplos del cancer incluyen cancer de mama. El metodo puede incluir ademas una etapa de administrar al sujeto un segundo agente que inhibe la expresion o actividad de una segunda proteina seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR. El primer agente o segundo agente pueden ser un anticuerpo (o una parte de union a antigeno del mismo), un acido nucleico, un polipeptido o un compuesto de molecula pequena. En un ejemplo, el anticuerpo anterior es uno monoclonal que contiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 mostradas a continuacion.
En un tercer aspecto, esta invencion presenta un acido nucleico aislado que tiene una secuencia que codifica para un agente de iARN que puede inhibir la expresion de una proteina seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1. En una realizacion, el agente de iARN tiene una estructura bicatenaria que tiene una primera hebra y una segunda hebra; cada una de las hebras primera y segunda tiene entre 19 y 30 nucleotidos de largo; y la primera hebra esta codificada por una cualquiera de SEQ ID NO: 1-6 tal como se enumera en la tabla 5 a continuacion.
En un cuarto aspecto, esta invencion proporciona una composicion que tiene un agente que inhibe la expresion o actividad de una proteina seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1, en el que el agente puede ser un anticuerpo (o una parte de union a antigeno del mismo), un acido nucleico, un polipeptido o un compuesto de molecula pequena. En un ejemplo, el agente es el acido nucleico aislado mencionado anteriormente. En otros casos, el agente es un anticuerpo o una parte de union a antigeno del mismo.
En un quinto aspecto, esta invencion presenta un metodo para diagnosticar el potencial metastasico de cancer en un sujeto. El metodo incluye las etapas de obtener un primer nivel de expresion para un primer gen del sujeto seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1, y comparar el primer nivel de expresion con un primer nivel predeterminado para el primer gen seleccionado. Se determina que el sujeto tiene o es propenso a desarrollar cancer metastasico si el primer nivel de expresion es mayor que el primer nivel predeterminado. El primer nivel predeterminado puede obtenerse a partir de un sujeto de control que esta libre de cancer. En un ejemplo, el metodo incluye ademas las etapas de obtener un segundo nivel de expresion para un segundo gen del sujeto seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR; y comparar el segundo nivel de expresion con un segundo nivel predeterminado para el segundo gen seleccionado. Se determina que el sujeto tiene o es propenso a desarrollar cancer metastasico si tanto el primer nivel de expresion como el segundo nivel de expresion son mayores que el primer nivel predeterminado y el segundo nivel predeterminado, respectivamente. El segundo nivel predeterminado tambien puede obtenerse a partir de un sujeto de control que esta libre de cancer.
La invencion tambien presenta un metodo para inhibir el reclutamiento endotelial en un sujeto que lo necesita. El metodo incluye una etapa de administrar al sujeto un primer agente que aumenta la expresion o actividad de GAS6 (es decir, un agente de activacion de GAS6). La invencion presenta ademas una composicion que tiene un agente que aumenta la expresion o actividad de GAS6. En un ejemplo, el agente mencionado anteriormente tiene GAS6 actividad. En otros casos, el agente es un anticuerpo (o una parte de union a antigeno del mismo), un acido nucleico, un polipeptido o un compuesto de molecula pequena. En una realizacion, el agente es un polipeptido que tiene la secuencia de GAS6.
En aun otro aspecto, la invencion presenta un kit para diagnosticar el potencial metastasico de cancer en un sujeto. El kit incluye un primer reactivo que se une especificamente a un primer producto de expresion (por ejemplo, polipeptido o ARNm) de un primer gen seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1. El kit puede incluir ademas un segundo reactivo que se une especificamente a un segundo producto de expresion de un segundo gen seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR.
En un aspecto adicional, la invencion presenta un metodo para identificar genes y ARN no codificantes que regulan la colonizacion por cancer metastasico de cualquier tejido corporal. El metodo incluye una primera etapa de generar una poblacion de celulas cancerosas de mamifero con un potencial aumentado de colonizacion tisular metastasica realizando tandas en serie de a) trasplante de una poblacion de celulas cancerosas marcadas o no marcadas en
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cualquier tejido vivo del cuerpo y luego b) realizacion del aislamiento de dichas celulas cancerosas marcadas del tejido despues de haberse producido la colonizacion metastasica y luego c) realizacion de un trasplante repetido de celulas cancerosas marcadas aisladas en tejido vivo del cuerpo. Al realizar tandas en serie de trasplante, aislamiento y trasplante repetido de celulas cancerosas marcadas tal como se describio anteriormente, se genera una poblacion de celulas cancerosas marcadas o no marcadas con alto potencial de colonizacion tisular metastasica. La segunda etapa del metodo incluye transducir, transfectar o introducir de otro modo una poblacion de una o mas moleculas de ARNhc en la poblacion de celulas cancerosas con alto potencial de colonizacion tisular metastasica para generar una poblacion de celulas cancerosas modificadas por ingenieria con alto potencial metastasico que expresan una o mas moleculas de ARNhc que reducen la expresion de uno o mas genes o ARN no codificantes. Esta poblacion de celulas cancerosas modificadas por ingenieria con alto potencial metastasico que expresan una o mas moleculas de ARNhc luego a) se trasplantan en cualquier tejido vivo y luego b) se aislan del tejido vivo despues de haberse producido la colonizacion metastasica. La presencia, ausencia o abundancia de uno o mas de los ARNhc transfectados, transducidos o introducidos de otro modo en la poblacion de celulas cancerosas modificadas por ingenieria tras el trasplante aisladas se evalua luego mediante o bien analisis de microalineamientos, tecnologia de secuenciacion de ADN, tecnologia de secuenciacion masiva o bien clonacion. La reduccion de los niveles de cualquier ARNhc individual en la poblacion de celulas aisladas con relacion a su representacion antes de la inyeccion indica que se requiere el gen diana de ARNhc para la colonizacion metastasica del tejido. El aumento de los niveles de cualquier ARNhc individual en la poblacion de celulas aisladas con relacion a su representacion antes de la inyeccion indica que la diana de ARNhc antagoniza la colonizacion metastasica del tejido. La segunda etapa de este metodo tambien podria incluir transducir, transfectar o introducir de otro modo una poblacion de una o mas moleculas de iARN, microARN o ARN no codificantes. Adicionalmente, la segunda etapa tambien podria incluir transducir, transfectar o introducir de otro modo una poblacion de uno o mas secuencias que codifican para genes codificantes de proteinas. La poblacion de celulas cancerosas modificadas por ingenieria con alto potencial metastasico que expresan uno o mas genes codificantes de proteinas luego a) se trasplantan en cualquier tejido vivo y luego b) se aislan del tejido vivo despues de haberse producido la colonizacion metastasica. La presencia, ausencia o abundancia de uno o mas de los genes codificantes transfectados, transducidos o introducidos de otro modo en la poblacion de celulas cancerosas modificadas por ingenieria tras el trasplante aisladas se evalua luego mediante o bien analisis de microalineamientos, tecnologia de secuenciacion de ADN, tecnologia de secuenciacion masiva o bien clonacion. El aumento de los niveles de cualquier gen individual en la poblacion de celulas aisladas con relacion a su representacion antes de la inyeccion indica que el gen representa un gen diana requerido para la colonizacion metastasica del tejido. La disminucion de los niveles de cualquier gen individual en la poblacion de celulas aisladas con relacion a su representacion antes de la inyeccion indica que el gen representa un gen diana que antagoniza la colonizacion metastasica del tejido.
En un aspecto adicional, la invencion presenta un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado o humano) o una parte de union a antigeno del mismo que neutraliza la funcion de IGFBP2 inhibiendo la union de IGFBP2 a IGF1. Este anticuerpo puede inhibir el reclutamiento endotelial por celulas cancerosas, tales como celulas de cancer de mama metastasicas o inhibir la angiogenesis patologica. Este anticuerpo tambien puede inhibir la evolucion tumoral o metastasis tumoral de celulas cancerosas, tales como de cancer de mama humanas, in vivo. En un ejemplo, el anticuerpo monoclonal contiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de sEq ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 mostradas a continuacion.
Se exponen los detalles de una o mas realizaciones de la invencion a continuacion en la descripcion. Otras caracteristicas, objetos y ventajas de la invencion resultaran evidentes a partir de la descripcion y de las reivindicaciones.
Descripcion de dibujos
Las figuras 1 a-f son diagramas y fotografias que muestran que miR-126 endogeno suprime la colonizacion metastasica. a, obtencion de imagenes de bioluminiscencia de metastasis en pulmon por celulas de cancer de mama escasamente metastasicas tras la inhibicion de miR-126. Se les inyectaron 4 X 104 celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto (miR-Zip) o la horquilla de control por via intravenosa a ratones NOD-SCID inmunodeficientes. Los ratones representativos mostrados corresponden al conjunto MDA-MB-231/miR-126KD (parte superior) y al conjunto MDA-MB-231/reordenadas (parte inferior) en el dia 49. Se cuantifico la colonizacion pulmonar a traves de la obtencion de imagenes de bioluminiscencia. n=5; las barras de error representan el e.e.m.; valor de p basado en una prueba de la t de Student unilateral en el dia 49. Se extirparon los pulmones en el dia 49 y se tineron de manera inmunohistoquimica para vimentina humana (parte derecha). b, obtencion de imagenes de bioluminiscencia de metastasis sistemica por celulas de cancer de mama escasamente metastasicas con expresion de miR-126 inhibida. Se les inyectaron 4 X 104 celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control a traves de la via intracardiaca a ratones desnudos atimicos. Los ratones representativos mostrados corresponden al conjunto MDA- MB-231/miR-126KD (parte superior) y al conjunto MDA-MB-231/reordenado (parte inferior) en el dia 34. Se midio la colonizacion en cuerpo entero mediante bioluminiscencia y se cuantifico. n=4; las barras de error representan el e.e.m.; valor de p basado en una prueba de la t de Student unilateral en el dia 34. c, se conto el numero total de focos metastasicos en ratones a los que se les inyecto por via intracardiaca celulas MDA-MB-231/miR-126KD y
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MDA-MB-231/reordenadas (parte superior). Se muestran imageries representatives de nodulos metastasicos en hueso y cerebro (parte inferior). d, se les inyectaron 5 X 105 celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control a los paniculos adiposos mamarios de ratones inmunodeficientes. Se midieron los volumenes tumorales a lo largo del tiempo. n=15; las barras de error indican el e.e.m.; valores de p basados en una prueba de la t de Student unilateral en el dia 35. e, se tineron los pulmones extirpados de (a) para vimentina humana y se midio el tamano de cada nodulo metastasico a traves de analisis de imagenes usando ImageJ. f, se les inyectaron 4 X 104 celulas Lm2 que expresan un casete de pre-miR-126 inducible por doxiciclina a traves de la vena de la cola a ratones NOD-SCID en el dia 0. En el dia 3, se anadieron doxiciclina (2 mg/ml) y sacarosa (5%) al agua para beber en un grupo de ratones y solo sacarosa al 5% en el otro. En el dia 48, se extirparon los ratones y se tineron de manera inmunohistoquimica para vimentina humana (parte derecha). Se muestra el numero total de nodulos en cada pulmon en la parte izquierda.
Las figuras 2a-2J son diagramas y fotografias que muestran que miR-126 endogeno suprimio de manera autonoma no celular la angiogenesis metastasica por celulas de cancer de mama metastasicas. a, se tineron doblemente de manera histologica secciones de pulmon de la figura 1 a para vimentina humana y MECA-32 o b, para vimentina y se inyecto lectina por via intravenosa. Se delimito el borde de cada nodulo basandose en la tincion de vimentina y la tincion de lectina/MECA-32 en el interior del nodulo metastasico destaco en negro (paneles inferiores). Luego se determino el area positiva para la tincion de lectina/MECA-32 dentro de cada nodulo usando el software ImageJ y se presento como el area cubierta por la tincion de lectina/MECA-32 por area del nodulo dado (% de densidad de vasos). La distribucion del % de densidad de vasos entre las celulas miR-126 KD y el control de MDA-MB-231 inyectado se muestra en una representacion grafica de fraccion acumulada. n=8/grupo (dando como resultado un total 18 nodulos metastasicos en el control, y 68 en las celulas miR-126 KD), valor de p basado en la prueba de Kolmogorov-Smirnov. c, se sembraron 5 X 104 celulas LM2 que expresan miR-126 o una horquilla de control sobre una monocapa de HUVEC y se cuantifico la adhesion. Se obtuvieron imagenes de celulas que se habian adherido a la monocapa de HUVEC y se analizaron usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m. d, se obtuvieron medios condicionados a partir de 5 X 105 celulas LM2 que expresan miR-126 o una horquilla de control incubando las celulas con medios EGM-2 durante 24 h. Se sembraron 2,5 X 104 celulas HUVEC por triplicado, se hicieron crecer en los medios condicionados y se contaron las celulas viables a los 5 dias tras la siembra. n=3; las barras de error representan el e.e.m. e, se mezclaron 2 X 104 celulas HUVEC con 1 X 104 celulas LM2 que se transdujeron con miR-126 o una horquilla de control, y se sometio a ensayo la formacion de tubos por las celulas HUVEC. Se obtuvieron imagenes de cada pocillo y se cuantifico el numero de puntos de ramificacion en cada imagen usando el software MetaMorph. n=3; las barras de error representan el e.e.m. La barra de escala representa 250 pm. f, se sembraron 2,5 X 104 celulas MDA-MB-231 y celulas LM2 por cuadruplicado. Luego se evaluo la migracion en Transwell de 5 X 104 celulas HUVEC hacia las celulas cancerosas contando el numero de celulas que habian migrado al lado basal de los insertos Transwell en imagenes obtenidas usando ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. g, se sometieron celulas LM2 que expresan miR-126 o la horquilla de control, asi como celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control al ensayo de reclutamiento de HUVEC. Se obtuvieron imagenes del lado basal de los insertos y se contaron las celulas usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. Las imagenes representativas mostradas corresponden al conjunto LM2/miR-126OE o de control (parte superior) y al conjunto MDA-MB-231/miR-126KD o de control (parte inferior). La barra de escala representa 100 pm. h, se sometieron celulas parentales CN34 y celulas CN34 LM1a al ensayo de reclutamiento de HUVEC. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. i, se sometieron celulas CN34 LM1a que expresan miR-126 o la horquilla de control, asi como celulas parentales CN34 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control, al ensayo de reclutamiento de HUVEC. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. Se muestran imagenes representativas. La barra de escala representa 100 pm. j, se mezclaron 5 X 105 celulas Lm2 que sobreexpresan miR-126 o la horquilla de control, asi como 5 X 105 celulas MDA-MB-231 que expresan un miR- 126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control, 1:1 con Matrigel y se inyectaron en el paniculo adiposo mamario. Se analizaron tumores de tamano coincidente para determinar la densidad de vasos sanguineos mediante tincion inmunohistoquimica para MECA-32. se tomaron 5 campos individuales para cada tumor y se facilita el porcentaje de cada campo cubierto por una tincion de MECA-32 seleccionada como umbral como el % de densidad de vasos. Se muestra la cuantificacion en la parte superior y se muestran a continuacion imagenes representativas. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 3a-3f son diagramas y fotografias que muestran la identificacion sistematica de una red reguladora de miR-126 que media en el reclutamiento endotelial metastasico. a, El rasgo distintivo de metastasis de miR-126 se compone de genes sobreexpresados en celulas metastasicas, regulados por disminucion por miR-126 OE, e inducidos por miR-126 KD. El mapa de calor representa niveles de expresion normalizados segun la varianza basados en analisis de microalineamientos y de qPCR. El mapa de colores corresponde al cambio de desviaciones estandar con respecto a la media. b-d, curvas de Kaplan-Meier para la (b) cohorte de cancer de mama UCSF (117 tumores), (c) cohorte NKI (295 tumores), y (d) la cohorte combinada NKI/MSK/UCSF (494 tumores) que representa la supervivencia libre de metastasis de aquellos pacientes cuyos canceres primarios sobreexpresaron el rango distintivo de ocho genes de miR-126 (positivos) y los que no lo hicieron (negativos). Valores de p basados en la
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prueba de rangos logaritmicos de Mantel-Cox. e, Ensayos de indicador de luciferasa de genes de metastasis de miR-126 en celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla KD de control. Se transfectaron constructos de indicador que contenian el gen de luciferasa en el sentido de 5’ de las secuencias de 3’UTR o codificantes (CDS) de cada gen regulado por miR-126 en las diversas lineas celulares y se sometio a ensayo la actividad luciferasa a las 30 horas tras la transfeccion. n=4; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. f, se mutaron las regiones complementarias de miR-126 de los constructos 3’UTR/CDS y se repitio el ensayo de indicador de luciferasa con estos constructos en celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control (parte derecha). n=4; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 4a-4e son un conjunto de diagramas y fotografias que muestran que la angiogenesis y colonizacion metastasica fomentada por IGFBP2, PITPNC1 y MERTK. a, se sembraron 2,5 X 104 celulas LM2 que expresan horquillas que seleccionan como diana IGFBP2, MERTK, PITPNC1, SHMT2 o la horquilla de control por cuadruplicado. Luego se evaluo la migracion en Trans-well de 5 X 104 celulas HUVEC hacia las celulas cancerosas. Se obtuvieron imagenes de las celulas que migraron a traves de los insertos Transwell y se analizaron usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando a la prueba de la t de Student. Se muestran imagenes representativas. La barra de escala representa 100mm. b, se cuantificaron los niveles de expresion relativos de IGFBP2, MERTK o PITPNC1 en muestras de tumor de mama humano de pacientes en estadio I/II (n=53) en comparacion con el estadio III (n=29) o el estadio IV (n=9) a partir de los microalineamientos de cancer de mama OriGene TissueScan usando qPCR. Las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. c-e, obtencion de imagenes de bioluminiscencia de metastasis en pulmon por celulas de cancer de mama metastasicas en pulmon con expresion inhibida de los diversos genes regulados por miR-126. Se les inyectaron 4 X 104 celulas LM2 que expresan la horquilla de control u horquillas cortas independientes que seleccionan como diana IGFBP2 (c), Se les inyectaron PITPNC1 (d) y MERTK (e) por via intravenosa a ratones NOD-SCID inmunodeficientes. Se midio la colonizacion en pulmon mediante obtencion de imagenes de bioluminiscencia y se cuantifico. n=5; las barras de error representan el e.e.m.; valor de p basado en una prueba de la t de Student unilateral.
Las figuras 5a-5g son diagramas y fotografias que muestran que IGFBP2 medio en el reclutamiento endotelial activando la senalizacion de IGF1/IGF1R en celulas endoteliales. a, se cuantificaron mediante ELISA los niveles de IGFBP2 en medios condicionados a partir de los ensayos de reclutamiento de HUVEC usando celulas MDA-MB-231 y celulas LM2 (figura 2f). n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. b, se sembraron 2,5 X 104 celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control, asi como celulas LM2 que expresan miR-126 o la horquilla de control, por cuadruplicado. Luego se evaluo el reclutamiento en Trans-well de 5 X 104 celulas HUVEC en presencia de Ac contra IGFBP2 50 ng/ml o Ac contra IgG 50 ng/ml hacia las celulas cancerosas. Se obtuvieron imagenes del lado basal de los insertos Transwell y se cuantifico el numero de celulas que habian migrado usando ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. La barra de escala representa 100 pm. c, se sembraron 2,5 X 104 celulas CN34 Par que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control, asi como celulas CN34 Lmla que expresan miR-126 o la horquilla de control, por cuadruplicado. Luego se evaluo la migracion en Trans-well de 5 X 104 celulas HUVEC en presencia de Ac contra IGFBP2 50 ng/ml o Ac contra IgG 50 ng/ml hacia las celulas cancerosas. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. d, e, se sometio a ensayo el reclutamiento en Trans-well de celulas HUVEC incubadas con Ac de bloqueo de IGF-1 20 pg/ml (d), Ac de bloqueo de IGF-2 20 pg/ml (d), Ac de bloqueo de IGF1R 20 pg/ml (e), Ac de bloqueo de IGF2R 5 pg/ml (e) o IgG de control (d, e) hacia celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. f, se pretrataron celulas HUVEC y cancerosas con Ac de bloqueo de IGF1R 20 pg/ml o Ac contra IgG de control durante 1 hora antes de evaluarse el reclutamiento en Transwell de celulas HUVEC hacia celulas cancerosas. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student g, se simulo un gradiente de IGFBP2 mezclando las cantidades dadas de proteina IGFBP2 recombinante con Matrigel (1:1) en el fondo de un pocillo. Luego se evaluo la quimiotaxia de 1,5 X 105 celulas HUVEC a lo largo del gradiente de IGFBP2 contando el numero de celulas que habian migrado al lado basal de insertos Trans-well despues de 20 h usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 6a-6e son diagramas y fotografias que muestran que MERTK medio en el reclutamiento a traves de GAS6. a, se cuantificaron los niveles de IGFBP2 en medios condicionados a partir de Lm2 celulas que expresan la horquilla de control o 2 horquillas independientes contra PITPNC1 tal como se determina mediante ELISA. b, se sembraron 2,5 X 104 celulas MDA-MB-231 que expresan una horquilla de control o una horquilla que selecciona como diana miR-126 por cuadruplicado. Luego se evaluo la migracion en Trans-well de 5 X 104 celulas HUVEC hacia las celulas cancerosas en presencia de GAS6 1 ng/ml y/o MerFc 10 pg/ml contando el numero de celulas que habian migrado al lado basal de insertos porosos en imagenes obtenidas usando ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. c, simulo un gradiente de
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IGFBP2 en presencia de Gas6 y MERTK secretado mezclando proteina rhIGFBP2 (520 ng), Gas6 (5 ng) y MerFc (10 ug) con Matrigel (1:1) en el fondo de un pocillo. Luego se evaluo la quimiotaxia de 1,5 X 105 celulas HUVEC a lo largo del gradiente contando el numero de celulas que habian migrado al lado basal de insertos Trans-well despues de 20 h usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. d, Se tineron doblemente secciones de pulmon para vimentina y MECA-32. Se trazo el borde de cada nodulo basandose en la tincion de vimentina humana y la tincion de MECA-32 en el interior del nodulo metastasico destacado en negro (paneles inferiores). Luego se determino el area positiva para la tincion de MECA-32 dentro de cada nodulo usando ImageJ y se presento como el area cubierta por la tincion de MECA-32 por area del nodulo dado (% de densidad de vasos). La distribucion de % de densidad de vasos entre las celulas LM2 inyectadas que expresan horquillas que seleccionan como diana IGFBP2, PITPNC1, MERTK o una horquilla de control se muestra en una representacion grafica de fraccion acumulada. n=4, valor de p basado en la prueba de Kolmogorov-Smirnov. e, esquema de la regulacion por miR-126 de reclutamiento endotelial y colonizacion metastasica a traves de interaccion con IGFBP2, PTTPNC1 y MERTK.
La figura 7 es un diagrama que muestra que el sistema de miARN-ARNhc antisentido miR-Zip inhibio de manera estable la expresion de miR-126 en celulas MDA-MB-231. Se transdujeron celulas MDA-MB-231 con lentivirus que expresan o bien un constructo de miR-Zip que selecciona como diana miR-126 o una version reordenada del constructo que no selecciona como diana ningun microARN conocido (SYSTEM BIOSCIENCES, Mountain View, CA). Luego se sometieron a prueba los niveles de expresion de miR-126 maduro usando qPCR.
La figura 8 es un conjunto de fotografias y un diagrama que muestran que miR-126 expresado en celulas de cancer de mama regula la perfusion en nodulos metastasicos. Se les inyectaron 4 X 104 celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto o la horquilla de control por via intravenosa a ratones NOD- SCID inmunodeficientes. En el dia 59, se le inyecto por via intravenosa una disolucion de dextrano de bajo peso molecular (MW de 10.000) marcado con FITC. Se permitio que circulasen las moleculas de dextrano durante 15 min antes de sacrificarse los ratones y extirparse los pulmones. Se prepararon secciones congeladas y se tineron para vimentina humana con el fin de localizar nodulos metastasicos, y se cuantifico la senal de FITC en el interior de los nodulos con un umbral constante usando ImageJ. n=5; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 9a-9b son un conjunto de diagramas que muestran que miR-126 endogeno no suprimio la adhesion, proliferacion o formacion de tubos endoteliales. a, se sembraron 5 X 104 MDA celulas que expresan miR-126 KD o un vector KD de control sobre una monocapa de HUVEC y se evaluo la adhesion. Se obtuvieron imagenes de celulas que se habian adherido a la monocapa de HUVEC y se analizaron usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m. b, se obtuvieron medios condicionados a partir de 5 X 105 celulas MDA miR- 126 KD o MDA control KD incubando las celulas con medios EGM-2 durante 24 h. Se sembraron 2,5 X 104 celulas HUVEC por triplicado, se hicieron crecer en los medios condicionados y se contaron las celulas viables a los 5 dias despues de la siembra. n=3; las barras de error representan el e.e.m. c, se mezclaron 2 X 104 celulas HUVEC con 1 X 104 MDA miR-126 KD o MDA control KD celulas, y se sometio a ensayo la formacion de tubos por celulas HUVEC. Se obtuvieron imagenes de cada pocillo y se analizo el numero de puntos de ramificacion en cada imagen usando el software MetaMorph. n=3; las barras de error representan el e.e.m.
Las figuras 10a-10c son un conjunto de diagramas y diagramas que muestran que miR-126 endogeno regulo la angiogenesis, pero no el reclutamiento de linfocitos positivos para CD45 y de macrofagos positivos para Mac-2. a-c, se mezclaron 5 X 105 celulas MDA que expresan la horquilla de control o una horquilla que selecciona como diana miR-126 en una razon 1:1 con Matrigel y se inyectaron en el paniculo adiposo mamario. 5 min antes del sacrificio, se inyecto lectina biotinilada en la vena de la cola. Se extirparon tumores de tamano coincidente y se detectaron vasos sanguineos funcionales mediante tincion de la lectina inyectada (a), se detectaron linfocitos CD45+ mediante el anticuerpo anti-CD45 (b) y se detectaron macrofagos Mac-2+ mediante el anticuerpo anti-Mac-2 (c).
La figura 11 es un diagrama de Venn que muestra la ruta experimental integradora que dio como resultado la identificacion de supuestos genes diana de miR-126. Se solaparon perfiles de transcriptomas de genes regulados por disminucion en mas de 1,6 veces tras la sobreexpresion de miR-126 con genes regulados por incremento en mas de 1,4 veces en celulas LM2 metastasicas en comparacion con las celulas MDA parentales. Esto condujo a la identificacion de 23 posibles genes diana de miR-126. Mediante qPCR, 8 de estos 23 genes se vieron modulados por miR-126 tanto en la linea celular de cancer de mama MDA-MB-231 como en la linea celular primaria CN34. Se sometieron estos 8 genes a pruebas funcionales para determinar la regulacion directa por miR-126 a traves de ensayos de indicador de luciferasa.
Las figuras 12a-12b son diagramas que muestran que miR-126 regulo IGFBP2 y MERTK a traves de interacciones de 3’UTR y PITPNC1 y SHMT2 a traves de interacciones de CDS. a, b, ensayos de indicador de luciferasa del conjunto de genes de metastasis de miR-126 en celulas MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de seleccion como diana en horquilla corto asi como la horquilla KD de control. Se transfectaron constructos de indicador que contenian el gen de luciferasa en el sentido de 5’ de 3’UTR (a) o CDS (b) de ABCB9, IGFBP2, MERTK, PITPNC1, PSAT1, PYBG, SHMT2 y VIPR1 en las diversas lineas celulares y se sometio a ensayo la actividad luciferasa a las 30 horas tras la transfeccion. n=4; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la
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t de Student.
Las figuras 13a-13d son un conjunto de diagramas que muestran que horquillas independientes regularon por disminucion los niveles de expresion de IGFBP2, PITPNC1 y MERTK en celulas LM2. Se transdujeron celulas LM2 con lentivirus que expresan una horquilla de control o un constructo de horquilla corta que selecciona como diana IGFBP2, PITPNC1 o MERTK. Se analizaron los niveles de expresion de los genes diana a traves de qPCR.
La figura 14 es un diagrama que muestra el analisis de proliferacion de genes diana de miR-126. Se sembraron 2,5 X 104 celulas LM2 que expresan una horquilla de control u horquillas cortas que seleccionan como diana IGFBP2, PITPNC1 o MERTK por triplicado y se contaron las celulas viables a los 5 dias despues de la siembra. n=3; las barras de error representan el e.e.m.
La figura 15 es un diagrama que muestra que IGFBP2 fomento la migracion de HUVEC. Se estimularon celulas HUVEC con las cantidades dadas de proteina IGFBP2 humana recombinante y Ac anti-IGF1 R (10 pg/ml) durante 40 min, se tripsinizaron y se sembraron 5 X 104 celulas en un inserto Transwell poroso. Se permitio que las celulas migrasen durante 24 horas antes de cuantificarse el numero de celulas que migraron a traves de la membrana. n=6; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student.
La figura 16 es una fotografia del analisis de inmunotransferencia de tipo Western de MERTK en lisado celular de MDA-MB-231 y medios condicionados, que muestra que se escindio el ectodominio de MERTK y se secreto por celulas MDA-MB-231.
La figura 17 es un conjunto de fotografias y diagramas que muestran que GFBP2, PITPNC1 y MERTK fomentaron la angiogenesis metastasica. Se tineron doblemente de manera histologica secciones de pulmon para vimentina humana y se inyecto lectina por via intravenosa. Se delimitaron los bordes de nodulo basandose en la tincion de vimentina y la tincion de lectina en el interior de los nodulos metastasicos. Se uso ImageJ para determinar el area positiva para la tincion de lectina dentro de cada nodulo. % de densidad de vasos representa el area cubierta por la tincion de lectina por area de un nodulo dado. La distribucion de % de densidad de vasos entre las celulas LM2 inyectadas que expresan la horquilla de control u horquillas cortas que seleccionan como diana IGFBP2, PITPNC1 o MERTK se muestra en una representacion grafica de fraccion acumulada. n=5. Valor de p basado en la prueba de Kolmogorov-Smirnov.
La figura 18 es un diagrama que muestra que la expresion de miR-126 endogeno en celulas HUVEC no suprimio el reclutamiento de otras celulas HUVEC. Se transfectaron un antagomiR que selecciona como diana miR-126 o un antagomiR de control en celulas HUVEC antes de someterse al ensayo de reclutamiento de HUVEC. Se obtuvieron imagenes del lado basal de los insertos y se contaron las celulas usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m.
La figura 19 es un diagrama que muestra la expresion de posibles dianas de miR-126 en celulas HUVEC con niveles de miR-126 suprimidos. Se transfectaron un antagomiR que selecciona como diana miR-126 o un antagomiR de control en celulas HUVEC y se cuantifico la expresion relativa de posibles dianas en celulas transfectadas usando qPCR. Las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
La figura 20 es un conjunto de diagramas que muestran datos de ensayos ELISA de captura de anticuerpo usados para caracterizar las propiedades de union de anticuerpos neutralizantes de IGFBP2. La figura muestra que el sobrenadante de una de las bibliotecas de hibridomas (wo6663-1) generadas a partir de animales inoculados con peptido total de IGFBP2 recombinante, contiene anticuerpos que se unen a IGFBP2 con alta afinidad.
La figura 21 es un conjunto de diagramas que muestran datos de ensayos ELISA de captura de anticuerpo usados para caracterizar las propiedades de union de anticuerpos neutralizantes de IGFBP2. La figura muestra que el sobrenadante del hibridoma wo6663-1 contiene anticuerpos que se unen a IGFBP2 para neutralizar la union de IGF1 a IGFBP2. Observese tambien que los anticuerpos procedentes del hibridoma wo6663-1 se unen especificamente a IGFBP2, y no se unen a otros miembros de la familia de IGFBP (IGFBP3, IGFBP4).
La figura 22 es un conjunto de diagramas que muestran datos de ensayos ELISA de captura de anticuerpo usados para caracterizar las propiedades de union de anticuerpos neutralizantes de IGFBP2 monoclonales recuperados a partir de clones de hibridomas individuales aislados de la biblioteca de hibridomas wo6663-1. Varios de los anticuerpos monoclonales neutralizantes de IGFBP2, incluyendo M1, M4, M6, M9, M13, M14, M15 y M16, pudieron unirse a IGFBP2 con alta afinidad y neutralizar su union a IGF1.
La figura 23 es un diagrama que muestra que una composicion que contiene concentraciones fisiologicas del anticuerpo monoclonal M14 puede inhibir el reclutamiento endotelial por celulas de cancer de mama metastasicas. Como en los experimentos descritos anteriormente, se uso un ensayo de migracion en Trans-well para cuantificar el reclutamiento endotelial por celulas metastasicas. Se pusieron celulas de cancer de mama humanas LM2 altamente metastasicas en la parte inferior de una camara de Boyden, en la que pudo someterse a ensayo su capacidad para reclutar HUVECS a traves de un inserto Trans-well poroso. La adicion de una pequena concentracion fisiologico de
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M14 al Transwell pudo inhibir significativamente el reclutamiento y la migracion (celulas migradas por campo) de celulas HUVEC (reduccion del 50% de las celulas migradas) frente a los controles negativos (anticuerpos contra IgG y M5). Las barras de error representan el e.e.m.
La figura 24 es un diagrama que muestra que una composicion que contiene concentraciones fisiologicas del anticuerpo monoclonal M14 puede inhibir la evolucion tumoral de cancer de mama in vivo en un modelo de raton. Obtencion de imagenes de bioluminiscencia del crecimiento de tumor de mama por 2000 celulas de cancer de mama humanas MDA-MB-231 en animales tratados con o bien PBS o bien anticuerpo monoclonal M14. En el dia 14, se inhibio significativamente la evolucion tumoral mediante el tratamiento con M14 (reduccion de 7 a 11 veces de la evolucion tumoral) en comparacion con los ratones tratados con PBS. Se normaliza la senal con respecto a la senal del dia 0. La significacion se basa una prueba de la t de Student bilateral.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion descrita proporciona reactivos y metodos para tratar trastornos caracterizados por angiogenesis patologica, tales como metastasis.
Tal como se da a conocer en el presente documento, un analisis sistematico y la atencion centrada en la metastasis y angiogenesis metastasica condujo a la identificacion de varias moleculas, incluyendo IGFBP2 secretado, la transferasa PITPNC1, la cinasa MERTK y miR-126, como dianas para la inhibicion terapeutica con el potencial para tratar cancer metastasico. Una ruta recien descubierta coordina los genes proangiogenicos de IGFBP2, PITPNC1 y MERTK que se correlacionan en la expresion con metastasis humana. Estos genes representan reguladores de la angiogenesis y el reclutamiento endotelial metastasicos. Por ejemplo, IGFBP2, una proteina secretada por celulas metastasicas, recluta endotelios modulando la actividad mediada por IGF1 del receptor de tipo I de IGF en celulas endoteliales.
El reclutamiento endotelial es un proceso en el que se movilizan celulas endoteliales o sus celulas progenitoras y el anidamiento (homing) en un sitio o una region en un sujeto para generar nuevos vasos sanguineos o la remodelacion de vasos sanguineos preexistentes, es decir, angiogenesis. La inhibicion de este proceso a traves de la nueva ruta mencionada anteriormente puede usarse para inhibir la angiogenesis patologica, y tratar de ese modo trastornos caracterizados por angiogenesis patologica, tales como metastasis.
Para el inhibir reclutamiento endotelial y la angiogenesis resultante en un sujeto que lo necesita, puede administrarse al sujeto un agente que inhibe la expresion o actividad de una proteina seleccionada de IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR. Se enumeran a continuacion las secuencias de aminoacidos de estas proteinas. El agente puede ser un acido nucleico, un polipeptido, un anticuerpo o un compuesto de molecula pequena.
IGFBP2
MLPRVGCPALPLPPPPLLPLLPLLLLLLGASGGGGGARAEVLFRCPPCTPERLAACGPPP
VAPPAAVAAVAGGARMPCAELVREPGCGCCSVCARLEGEACGVYTPRCGQGLRCYPHPGS
ELPLQALVMGEGTCEKRRDAEYGASPEQVADNGDDHSEGGLVENHVDSTMNMLGGGGSAG
RKPLKSGMKELAVFREKVTEQHRQMGKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLER
ISTMRLPDERGPLEHLYSLHIPNCDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGA
PTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ
IGF1 (isoforma 1)
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVD
ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARS
VRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK
IGF1 (isoforma 2)
MITPTVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKP
TGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEV
HLKNASRGSAGNKNYRM
IGF1 (isoforma 3)
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVD
ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARS
VRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGWPKTHPGGEQKEGTEASLQIRGKKKEQRR
EIGSRNAECRGKKGK
IGF1 (isoforma 4)
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVD
ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARS
VRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYRM
5 IGF1R
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLH ILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIF EMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGD LCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCS APDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHD GECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNL LINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSF YVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTR NNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDG QDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSE ILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRH NYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRK VFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFES RVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTW EPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGN YTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHR KRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKG VVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIME LMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARN CMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGV VLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFL ElISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRH SGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
10 MERTK
MGPAPLPLLLGLFLPALWRRAITEAREEAKPYPLFPGPFPGSLQTDHTPLLSLPHASGYQ PALMFSPTQPGRPHTGNVAIPQVTSVESKPLPPLAFKHTVGHIILSEHKGVKFNCSISVP NIYQDTTISWWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTAIIASFSITSVQRSDNGSYICKMKIN NEEIVSDPIYIEVQGLPHFTKQPESMNVTRNTAFNLTCQAVGPPEPVNIFWVQNSSRVNE QPEKSPSVLTVPGLTEMAVFSCEAHNDKGLTVSKGVQINIKAIPSPPTEVSIRNSTAHSI LISWVPGFDGYSPFRNCSIQVKEADPLSNGSVMIFNTSALPHLYQIKQLQALANYSIGVS CMNEIGWSAVSPWILASTTEGAPSVAPLNVTVFLNESSDNVDIRWMKPPTKQQDGELVGY RISHVWQSAGISKELLEEVGQNGSRARISVQVHNATCTVRIAAVTRGGVGPFSDPVKIFI PAHGWVDYAPSSTPAPGNADPVLIIFGCFCGFILIGLILYISLAIRKRVQETKFGNAFTE EDSELVVNYIAKKSFCRRAIELTLHSLGVSEELQNKLEDVVIDRNLLILGKILGEGEFGS VMEGNLKQEDGTSLKVAVKTMKLDNSSQREIEEFLSEAACMKDFSHPNVIRLLGVCIEMS SQGIPKPMVILPFMKYGDLHTYLLYSRLETGPKHIPLQTLLKFMVDIALGMEYLSNRNFL HRDLAARNCMLRDDMTVCVADFGLSKKIYSGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSK SDVWAFGVTMWEIATRGMTPYPGVQNHEMYDYLLHGHRLKQPEDCLDELYEIMYSCWRTD PLDRPTFSVLRLQLEKLLESLPDVRNQADVIYVNTQLLES SEGLAQGSTLAPLDLNIDPD SIIASCTPRAAISVVTAEVHDSKPHEGRYILNGGSEEWEDLTSAPSAAVTAEKNSVLPGE RLVRNGVSWSHSSMLPLGSSLPDELLFADDSSEGSEVLM
PTTPNC1 (isoforma a)
15
MLLKEYRICMPLTVDEYKIGQLYMISKHSHEQSDRGEGVEVVQNEPFEDPHHGNGQFTEK RVYLNSKLPSWARAVVPKIFYVTEKAWNYYPYTITEYTCSFLPKFSIHIETKYEDNKGSN DTIFDNEAKDVEREVCFIDIACDEIPERYYKESEDPKHFKSEKTGRGQLREGWRDSHQPI MCSYKLVTVKFEVWGLQTRVEQFVHKVVRDILLIGHRQAFAWVDEWYDMTMDEVREFERA TQEATNKKIGIFPPAISISSIPLLPSSVRSAPSSAPSTPLSTDAPEFLSVPKDRPRKKSA PETLTLPDPEKKATLNLPGMHSSDKPCRPKSE
PITPNC1 (isoforma b)
MLLKEYRICMPLTVDEYKIGQLYMISKHSHEQSDRGEGVEVVQNEPFEDPHHGNGQFTEK
RVYLNSKLPSWARAVVPKIFYVTEKAWNYYPYTITEYTCSFLPKFSIHIETKYEDNKGSN
DTIFDNEAKDVEREVCFIDIACDEIPERYYKESEDPKHFKSEKTGRGQLREGWRDSHQPI
MCSYKLVTVKFEVWGLQTRVEQFVHKVVRDILLIGHRQAFAWVDEWYDMTMDDVREYEKN
MHEQTNIKVCNQHSSPVDDIESHAQTST
ABCB9
MRLWKAVVVTLAFMSVDICVTTAIYVFSHLDRSLLEDIRHFNIFDSVLDLWAACLYRSCL LLGATIGVAKNSALGPRRLRASWLVITLVCLFVGIYAMVKLLLFSEVRRPIRDPWFWALF VWTYISLGASFLLWWLLSTVRPGTQALEPGAATEAEGFPGSGRPPPEQASGATLQKLLSY TKPDVAFLVAASFFLIVAALGETFLPYYTGRAIDGIVIQKSMDQFSTAVVIVCLLAIGSS FAAGIRGGIFTLIFARLNIRLRNCLFRSLVSQETSFFDENRTGDLISRLTSDTTMVSDLV SQNINVFLRNTVKVTGVVVFMFSLSWQLSLVTFMGFPIIMMVSNIYGKYYKRLSKEVQNA LARASNTAEETISAMKTVRSFANEEEEAEVYLRKLQQVYKLNRKEAAAYMYYVWGSGLTL LVVQVSILYYGGHLVISGQMTSGNLIAFIIYEFVLGDCMESVGSVYSGLMQGVGAAEKVF 5 EFIDRQPTMVHDGSLAPDHLEGRVDFENVTFTYRTRPHTQVLQNVSFSLSPGKVTALVGP SGSGKSSCVNILENFYPLEGGRVLLDGKPISAYDHKYLHRVISLVSQEPVLFARSITDNI SYGLPTVPFEMVVEAAQKANAHGFIMELQDGYSTETGEKGAQLSGGQKQRVAMARALVRN PPVLILDEATSALDAESEYLIQQAIHGNLQKHTVLIIAHRLSTVEHAHLIVVLDKGRVVQ QGTHQQLLAQGGLYAKLVQRQMLGLQPAADFTAGHNEPVANGSHKA
PSAT1 (isoforma 1)
MDAPRQVVNFGPGPAKLPHSVLLEIQKELLDYKGVGISVLEMSHRSSDFAKIINNTENLV RELLAVPDNYKVIFLQGGGCGQFSAVPLNLIGLKAGRCADYVVTGAWSAKAAEEAKKFGT INIVHPKLGSYTKIPDPSTWNLNPDASYVYYCANETVHGVEFDFIPDVKGAVLVCDMSSN FLSKPVDVSKFGVIFAGAQKNVGSAGVTVVIVRDDLLGFALRECPSVLEYKVQAGNSSLY NTPPCFSIYVMGLVLEWIKNNGGAAAMEKLSSIKSQTIYEIIDNSQGFYVCPVEPQNRSK MNIPFRIGNAKGDDALEKRFLDKALELNMLSLKGHRSVGGIRASLYNAVTIEDVQKLAAF 10 MKKFLEMHQL
PSAT1 (isoforma 2)
MDAPRQVVNFGPGPAKLPHSVLLEIQKELLDYKGVGISVLEMSHRSSDFAKIINNTENLV RELLAVPDNYKVIFLQGGGCGQFSAVPLNLIGLKAGRCADYVVTGAWSAKAAEEAKKFGT INIVHPKLGSYTKIPDPSTWNLNPDASYVYYCANETVHGVEFDFIPDVKGAVLVCDMSSN FLSKPVDVSKFGVIFAGAQKNVGSAGVTVVIVRDDLLGFALRECPSVLEYKVQAGNSSLY NTPPCFSIYVMGLVLEWIKNNGGAAAMEKLSSIKSQTIYEIIDNSQGFYVSVGGIRASLY NAVTIEDVQKLAAFMKKFLEMHQL 15
PYGB
MAKPLTDSEKRKQISVRGLAGLGDVAEVRKSFNRHLHFTLVKDRNVATPRDYFFALAHTV RDHLVGRWIRTQQHYYERDPKRIYYLSLEFYMGRTLQNTMVNLGLQNACDEAIYQLGLDL EELEEIEEDAGLGNGGLGRLAACFLDSMATLGLAAYGYGIRYEFGIFNQKIVNGWQVEEA DDWLRYGNPWEKARPEYMLPVHFYGRVEHTPDGVKWLDTQVVLAMPYDTPVPGYKNNTVN TMRLWSAKAPNDFKLQDFNVGDYIEAVLDRNLAENISRVLYPNDNFFEGKELRLKQEYFV VAATLQDIIRRFKSSKFGCRDPVRTCFETFPDKVAIQLNDTHPALSIPELMRILVDVEKV DWDKAWEITKKTCAYTNHTVLPEALERWPVSMFEKLLPRHLEIIYAINQRHLDHVAALFP GDVDRLRRMSVIEEGDCKRINMAHLCVIGSHAVNGVARIHSEIVKQSVFKDFYELEPEKF QNKTNGITPRRWLLLCNPGLADTIVEKIGEEFLTDLSQLKKLLPLVSDEVFIRDVAKVKQ ENKLKFSAFLEKEYKVKINPSSMFDVHVKRIHEYKRQLLNCLHVVTLYNRIKRDPAKAFV PRTVMIGGKAAPGYHMAKLIIKLVTSIGDVVNHDPVVGDRLKVIFLENYRVSLAEKVIPA ADLSQQISTAGTEASGTGNMKFMLNGALTIGTMDGANVEMAEEAGAENLFIFGLRVEDVE ALDRKGYNAREYYDHLPELKQAVDQISSGFFSPKEPDCFKDIVNMLMHHDRFKVFADYEA YMQCQAQVDQLYRNPKEWTKKVIRNIACSGKFSSDRTITEYAREIWGVEPSDLQIPPPNI PRD
20 SHMT2 (isoforma 1)
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MLYFSLFWAARPLQRCGQLVRMAIRAQHSNAAQTQTGEANRGWTGQESLSDSDPEMWELL QREKDRQCRGLELIASENFCSRAALEALGSCLNNKYSEGYPGKRYYGGAEVVDEIELLCQ RRALEAFDLDPAQWGVNVQPYSGSPANLAVYTALLQPHDRIMGLDLPDGGHLTHGYMSDV KRISATSIFFESMPYKLNPKTGLIDYNQLALTARLFRPRLIIAGTSAYARLIDYARMREV CDEVKAHLLADMAHISGLVAAKVIPSPFKHADIVTTTTHKTLRGARSGLIFYRKGVKAVD PKTGREIPYTFEDRINFAVFPSLQGGPHNHAIAAVAVALKQACTPMFREYSLQVLKNARA MADALLERGYSLVSGGTDNHLVLVDLRPKGLDGARAERVLELVSITANKNTCPGDRSAIT PGGLRLGAPALTSRQFREDDFRRVVDFIDEGVNIGLEVKSKTAKLQDFKSFLLKDSETSQ RLANLRQRVEQFARAFPMPGFDEH
SHMT2 (isoforma 2)
MLYFSLFWAARPLQRCGQLVRMAIRAQHSNAAQTQTGEANRGWTGQESLSDSDPEMWELL QREKDRQCRGLELIASENFCSRAALEALGSCLNNKYSEGYPGKRYYGGAEVVDEIELLCQ RRALEAFDLDPAQWGVNVQPYSGSPANLAVYTALLQPHDRIMGLDLPDGGHLTHGYMSDV KRISATSIFFESMPYKLNLALTARLFRPRLIIAGTSAYARLIDYARMREVCDEVKAHLLA DMAHISGLVAAKVIPSPFKHADIVTTTTHKTLRGARSGLIFYRKGVKAVDPKTGREIPYT FEDRINFAVFPSLQGGPHNHAIAAVAVALKQACTPMFREYSLQVLKNARAMADALLERGY SLVSGGTDNHLVLVDLRPKGLDGARAERVLELVSITANKNTCPGDRSAITPGGLRLGAPA LTSRQFREDDFRRVVDFIDEGVNIGLEVKSKTAKLQDFKSFLLKDSETSQRLANLRQRVE QFARAFPMPGFDEH
SHMT2 (isoforma 3)
MAIRAQHSNAAQTQTGEANRGWTGQESLSDSDPEMWELLQREKDRQCRGLELIASENFCS RAALEALGSCLNNKYSEGYPGKRYYGGAEVVDEIELLCQRRALEAFDLDPAQWGVNVQPY SGSPANLAVYTALLQPHDRIMGLDLPDGGHLTHGYMSDVKRISATSIFFESMPYKLNPKT GLIDYNQLALTARLFRPRLIIAGTSAYARLIDYARMREVCDEVKAHLLADMAHISGLVAA KVIPSPFKHADIVTTTTHKTLRGARSGLIFYRKGVKAVDPKTGREIPYTFEDRINFAVFP SLQGGPHNHAIAAVAVALKQACTPMFREYSLQVLKNARAMADALLERGYSLVSGGTDNHL VLVDLRPKGLDGARAERVLELVSITANKNTCPGDRSAITPGGLRLGAPALTSRQFREDDF RRVVDFIDEGVNIGLEVKSKTAKLQDFKSFLLKDSETSQRLANLRQRVEQFARAFPMPGF DEH
VIPR1
MRPPSPLPARWLCVLAGALAWALGPAGGQAARLQEECDYVQMIEVQHKQCLEEAQLENET IGCSKMWDNLTCWPATPRGQVVVLACPLIFKLFSSIQGRNVSRSCTDEGWTHLEPGPYPI ACGLDDKAASLDEQQTMFYGSVKTGYTIGYGLSLATLLVATAILSLFRKLHCTRNYIHMH LFISFILRAAAVFIKDLALFDSGESDQCSEGSVGCKAAMVFFQYCVMANFFWLLVEGLYL YTLLAVSFFSERKYFWGYILIGWGVPSTFTMVWTIARIHFEDYGCWDTINSSLWWIIKGP ILTSILVNFILFICIIRILLQKLRPPDIRKSDSSPYSRLARSTLLLIPLFGVHYIMFAFF PDNFKPEVKMVFELVVGSFQGFVVAILYCFLNGEVQAELRRKWRRWHLQGVLGWNPKYRH PSGGSNGATCSTQVSMLTRVSPGARRSSSFQAEVSLV
Un agente inhibidor (es decir, inhibidor) o un agente de activacion (es decir, activador) puede ser un acido nucleico, un polipeptido, un anticuerpo o un compuesto de molecula pequena. Preferiblemente, es un agente aislado, pero no una molecula endogena (un microARN) en una celula del sujeto. En un ejemplo, excluye un microARN que es endogeno en celulas humanas, por ejemplo, miR-126, miR206 o/y miR-335. En otro ejemplo, el agente inhibidor o de activacion funciona a nivel de la transcripcion, Estabilidad de ARNm, traduccion, estabilidad/degradacion de proteinas, modificacion de proteinas y union a proteinas.
Un acido nucleico se refiere a una molecula de ADN (por ejemplo, pero sin limitarse a, un ADNc o ADN genomico), una molecula de ARN (por ejemplo, pero sin limitarse a, un ARNm), o un analogo de ADN o ARN. Un analogo de ADN o ARN puede sintetizarse a partir de analogos de nucleotidos. La molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. Un “acido nucleico aislado” es un acido nucleico cuya estructura no es identica a la de ningun acido nucleico que se produce de manera natural o a la de ningun fragmento de un acido nucleico genomico que se produce de manera natural. El termino cubre por tanto, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de una molecula de ADN genomica que se produce de manera natural pero no esta flanqueada por ambas secuencias codificantes que flanquean esa parte de la molecula en el genoma del organismo en el que se produce de manera natural; (b) un acido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genomico de una procariota o eucariota de tal manera que la molecula resultante no es identica a ningun vector o ADN genomico que se produce de manera natural; (c) una molecula independiente tal como un ADNc, un fragmento genomico, un fragmento producido por una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restriccion; y (d) una secuencia de nucleotidos recombinante que forma parte de un gen hibrido, es decir, un gen que codifica para una proteina de fusion.
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Los terminos “ARN”, “molecula de ARN” y “molecula de acido ribonucleico” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y se refieren a un polfmero de ribonucleotidos. El termino “ADN” o “molecula de ADN” o molecula de acido desoxirribonucleico” se refiere a un polfmero de desoxirribonucleotidos. El ADN y el ARN pueden sintetizarse de manera natural (por ejemplo, mediante replicacion de ADN o transcripcion de ADN, respectivamente). El ARN puede modificarse de manera postraduccional. El ADN y el ARN tambien pueden sintetizarse qmmicamente. El ADN y el ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ARNmc y ADNmc, respectivamente) o multicatenarios (por ejemplo, bicatenarios, es decir, ARNbc y ADNbc, respectivamente).
La secuencia de acido nucleico puede codificar para un ARN de interferencia pequeno (por ejemplo, un agente de iARN) que selecciona como diana uno o mas de los genes mencionados anteriormente e inhibe su expresion o actividad. El termino “agente de iARN” se refiere a un ARN, o analogo del mismo, que tiene suficiente complementariedad de secuencia con un ARN diana para dirigir la interferencia de ARN. Los ejemplos tambien incluyen un ADN que puede usarse para producir el aRn. La interferencia de ARN (iARN) se refiere a un proceso selectivo o especffico de secuencia mediante el cual una molecula diana (por ejemplo, un gen, protefna o ARN diana) esta regulada por disminucion. Generalmente, un ARN interferente (“ARNi”) es un ARN interferente corto bicatenario (ARNic), ARN en horquilla corto (ARNhc) o micro-ARN monocatenario (miARN) que da como resultado la degradacion catalftica de ARNm especfficos, y tambien puede usarse para reducir o inhibir la expresion genica.
El termino “ARN interferente corto” o “ARNic” (tambien conocido como “ARN interferentes pequenos”) se refiere a un agente de ARN, preferiblemente un agente bicatenario, de aproximadamente 10-50 nucleotidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15-25 nucleotidos de longitud, mas preferiblemente de aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleotidos de longitud, teniendo opcionalmente las hebras extremos de proyeccion que comprenden, por ejemplo 1,2 o 3 nucleotidos (o analogos de nucleotidos) de proyeccion, que puede dirigir o mediar en la interferencia de ARN. Se generan ARNic que se producen de manera natural a partir de moleculas de ARNbc mas largas (por ejemplo, >25 nucleotidos de longitud) por la maquinaria de iARN de una celula (por ejemplo, Dicer o un homologo de la misma).
El termino “miARN” o “microARN” se refiere a un agente de ARN, preferiblemente un agente monocatenario, de aproximadamente 10-50 nucleotidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15-25 nucleotidos de longitud, mas preferiblemente de aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleotidos de longitud, que puede dirigir o mediar en la interferencia de ARN. Se generan miARN que se producen de manera natural a partir de ARN precursores de tallo-bucle (es decir, pre-miARN) por Dicer. El termino “Dicer” tal como se usa en el presente documento, incluye Dicer asf como cualquier ortologo u homologo de Dicer que puede procesar estructuras de ARNbc para dar ARNic, miARN, moleculas similares a ARNic o moleculas similares a miARN. El termino microARN (o “miARN”) se usa de manera intercambiable con el termino “ARN temporal pequeno” (o “ARNtp”) basado en el hecho de que se ha encontrado que se expresan microARN que se producen de manera natural (o “miARN”) de manera temporal (por ejemplo, durante el desarrollo).
El termino “ARNhc”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente de ARN que tiene una estructura de tallo-bucle, que comprende una primera y una segunda regiones de secuencia complementaria, siendo suficiente el grado de complementariedad y orientacion de las regiones de tal manera que se produce el apareamiento de bases entre las regiones, uniendose las regiones primera y segunda mediante una region de bucle, resultando el bucle de una ausencia de apareamiento de bases entre nucleotidos (o analogos de nucleotidos) dentro de la region de bucle.
Por tanto, tambien dentro del alcance de esta invencion esta la utilizacion de iARN que presenta degradacion de moleculas de ARN (por ejemplo, dentro de una celula). La degradacion esta catalizada por un complejo enzimatico de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un agente de ARN que tiene una secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARN diana (por ejemplo, uno o mas de los genes mencionados anteriormente) para dirigir la iARN significa que el agente de ARN tiene una homologfa de al menos el 50%, (por ejemplo, una homologfa del 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o el 100%) con la secuencia de ARN diana de modo que las dos son suficientemente complementarias entre sf como para hibridar y desencadenar la destruccion del ARN diana por la maquinaria o el proceso de iARN (por ejemplo, el complejo RISC). Un agente de ARN que tiene una “secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARN diana para dirigir la iARN” tambien significa que el agente de ARN tiene una secuencia suficiente como para desencadenar la inhibicion traduccional del ARn diana por la maquinaria o el proceso de iARN. Un agente de ARN tambien puede tener una secuencia suficientemente complementaria a un ARN diana codificada por la secuencia de ADN diana de tal manera que la secuencia de ADN diana se silencia de manera cromatica. Dicho de otro modo, el agente de ARN tiene una secuencia suficiente como para inducir silenciamiento genico transcripcional, por ejemplo, para modular por disminucion la expresion genica en o cerca de la secuencia de ADN diana, por ejemplo, induciendo cambios estructurales de la cromatina en o cerca de la secuencia de ADN diana.
Los polinucleotidos mencionados anteriormente pueden administrarse usando dispositivos de administracion de micropartfculas o microcapsulas polimericas, biodegradables conocidos en la tecnica. Otro modo de conseguir la captacion de los polinucleotidos es usando liposomas, preparados mediante metodos convencionales. El polinucleotido puede incorporarse solo en estos vehfculos de administracion o incorporarse conjuntamente con
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anticuerpos especificos de tejido. Alternativamente, puede prepararse un conjugado molecular que se compone de un plasmido u otro vector unido a poli-L-lisina mediante fuerzas electrostaticas o covalentes. La poli-L-lisina se une a un ligando que puede unirse a un receptor en celulas diana (Cristiano, et a/., 1995, J. Mol. Med. 73:479). Alternativamente, pueden obtenerse dianas especificas de tejido mediante el uso de elementos reguladores de la transcripcion especificos de tejido que se conocen en la tecnica. La administracion de ADN desnudo (es decir, sin un vehiculo de administracion) a un sitio intramuscular, intradermico o subcutaneo es otro medio de lograr la expresion in vivo.
Pueden disenarse moleculas de ARNic, miARN y ARNas (ARN antisentido) mediante metodos bien conocidos en la tecnica. Pueden disenarse moleculas de ARNic, miARN y ARNas con homologia suficiente para proporcionar la especificidad de secuencia requerida para degradar de manera unica cualquier ARN usando programas conocidos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los mantenidos en los sitios web de AMBION, Inc. y DHARMACON, Inc. Los expertos en la tecnica pueden realizar de manera rutinaria pruebas sistematicas de varias especies disenadas para la optimizacion de la secuencia de ARNic, miARN y ARNas. Las consideraciones cuando se disenan moleculas de acido nucleico interferente corto incluyen, pero no se limitan a, consideraciones biofisicas, termodinamicas y estructurales, preferencias de bases en posiciones especificas en la hebra sentido y homologia. Estas consideraciones se conocen bien en la tecnica y proporcionar directrices para el diseno de las moleculas de ARN mencionadas anteriormente.
En un ejemplo, el polipeptido es un anticuerpo. El termino “anticuerpo” se refiere a una molecula de inmunoglobulina o parte inmunologicamente activa de la misma, es decir, una parte de union a antigeno. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, una proteina que tiene al menos una o dos, regiones variables de cadena pesada (H) (Vh), y al menos una o dos regiones variables de cadena ligera (L) (Vl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones que son mas conservadas, denominadas “regiones de entramado” (FR). Tal como se usa en el presente documento, el termino “inmunoglobulina” se refiere a una proteina que consiste en uno o mas polipeptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen los genes de region constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, epsilon y mu, asi como los multiples genes de region variable de inmunoglobulina.
El termino “parte de union a antigeno” de un anticuerpo (o “parte de anticuerpo”) se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 o VIPR). Se ha mostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union englobados dentro del termino “parte de union a antigeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los Vh dominios y Ch1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una region determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes independientes, pueden unirse, usando metodos recombinantes, mediante un ligador sintetico que les permite constituirse como una sola cadena de proteina en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); vease por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tambien se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla esten englobados dentro del termino “parte de union a antigeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y se examinan los fragmentos para determinar su utilidad de la misma manera que se hace con anticuerpos intactos.
Pueden producirse anticuerpos que se unen especificamente a una de las proteinas diana mencionadas anteriormente usando metodos conocidos en la tecnica. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o uno monoclonal. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen los descritos en los ejemplos de trabajo a continuacion. En una realizacion, el anticuerpo puede producirse de manera recombinante, por ejemplo, producirse mediante presentacion en fago o mediante metodos combinatorios. En otra realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano (por ejemplo, un anticuerpo producido en un raton que se ha modificado por ingenieria genetica para producir un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo no humano, por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo de roedor (raton o rata), cabra, primate (por ejemplo, pero sin limitarse a, mono), conejo o camello. Los ejemplos de metodos para generar una version humanizada de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, injerto de CDR (Queen et al., patente estadounidense n.° 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)), intercambio de cadenas (patente estadounidense n.° 5,565,332); y revestimiento o remodelado de la superficie (documentos EP 592.106; EP 519.596); Padlan, Molecular Immunology 28(415):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)). Los ejemplos de metodos para generar anticuerpos completamente humanos incluyen, pero no se limitan a, la generacion de anticuerpos a partir de ratones que pueden expresar genes de inmunoglobulina humanos y el uso de la tecnologia de presentacion en fago para generar y examinar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humanos.
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Un “anticuerpo aislado” pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 o VIPR esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especificamente a antigenos distintos de tal antigeno). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une especificamente al antigeno puede tener reactividad cruzada con otros antigenos, tales como moleculas de IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 o VIPR de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos quimicos.
Los terminos “anticuerpo monoclonal” o “composicion de anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refieren a una preparacion de moleculas de anticuerpo de composicion molecular sencilla. Una composicion de anticuerpo monoclonal presenta una unica afinidad y especificidad de union para un epitopo particular.
El termino “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones de entramado como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Ademas, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante tambien se deriva de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir residuos de aminoacido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagenesis al azar o especifica de sitio in vitro o mediante mutacion somatica in vivo). Sin embargo, el termino “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamifero, tal como un raton, sobre secuencias de entramado humanas.
El termino “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que presentan una unica afinidad de union que tienen regiones variables en las que tanto las regiones de entramado como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. En una realizacion, los anticuerpos monoclonales humanos los produce un hibridoma que incluye una celula B obtenida a partir de un animal no humano transgenico, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionados a una celula inmortalizada.
El termino “anticuerpo humano recombinante”, tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina humanos o un hibridoma preparado a partir de los mismos (descrito adicionalmente a continuacion), (b) anticuerpos aislados de una celula huesped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otros medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humanos a otras secuencias de aDn. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones de entramado y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humanas, mutagenesis somatica in vivo) y por tanto las secuencias de aminoacidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y estan relacionadas con secuencias de Vh y Vl de linea germinal humana, pueden no existir de manera natural dentro del repertorio de linea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Tal como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que esta codificada por los genes de region constante de cadena pesada.
Las expresiones “un anticuerpo que reconoce un antigeno” y “un anticuerpo especifico para un antigeno” se usan de manera intercambiable en el presente documento con el termino “un anticuerpo que se une a especificamente a un antigeno”.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “alta afinidad” por un anticuerpo contra IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-7 M o menos, preferiblemente 10-8 M o menos, mas preferiblemente 10-9 M o menos e incluso mas preferiblemente 10-10 M o menos para un antigeno diana. Sin embargo, la union de “alta afinidad” puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la union de “alta afinidad” para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-7 M o menos, mas preferiblemente 10-8 M o menos.
En un ejemplo, se describe una composicion que comprende un anticuerpo monoclonal que neutraliza la funcion de IGFBP2 inhibiendo la union de IGFBP2 a IGF1. En una realizacion, este anticuerpo puede ser un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo no humano, por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo de roedor (raton o rata), cabra, primate (por ejemplo, pero sin limitarse a, mono), conejo o camello. En una realizacion, pueden sustituirse uno o mas aminoacidos de este anticuerpo monoclonal con el fin de alterar sus propiedades fisicas. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, especificidad de union, afinidad de union,
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inmunogenicidad e isotipo de anticuerpo. Pueden usarse composiciones farmaceuticas que contienen versiones completamente humanas o humanizadas de los anticuerpos descritos anteriormente para tratar trastornos de angiogenesis patologica.
En un ejemplo, una composicion que comprende un anticuerpo neutralizante de IGFBP2 que inhibe que se una IGF1 a IGFBP2 inhibe la evolucion tumoral de cancer de mama y la carga tumoral in vivo. En este ejemplo, la administracion del anticuerpo descrito anteriormente redujo la carga tumoral de cancer de mama humano in vivo en un modelo de raton de cancer humano.
Pueden usarse composiciones farmaceuticas que contienen versiones completamente humanas o humanizadas de los anticuerpos descritos anteriormente para inhibir metastasis de cancer de mama en pacientes humanos inhibiendo el reclutamiento endotelial por celulas metastasicas. En otra realizacion, pueden usarse composiciones farmaceuticas que contienen versiones completamente humanas o humanizadas de estos anticuerpos para tratar otros tipos de tumores vasculares. Los tumores vascularizados tipicos que pueden tratarse con esta composicion incluyen tumores solidos, particularmente carcinomas, que requieren una componente vascular para la provision de oxigeno y nutrientes. Los tumores solidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmon, mama, oseo, de ovario, estomago, pancreas, laringe, esofago, testiculos, higado, parotideo, de vias biliares, colon, recto, cuello uterino, utero, endometrio, rinon, vejiga, prostata, tiroides, carcinomas de celulas escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de celulas pequenas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas, sarcoma de Kaposi y sarcomas.
En otra realizacion, el polipeptido es una forma mutante de la proteina mencionada anteriormente, que interfiere en la ruta mencionada anteriormente y, por tanto, inhibe la angiogenesis y el reclutamiento endotelial. El termino “mutante” engloba mutantes que se producen de manera natural y mutantes creados quimicamente y/o usando tecnicas de ADN recombinantes. Un mutante de uno de los peptidos de tipo natural mencionados anteriormente puede deberse a la alteracion, por ejemplo, truncamiento, elongacion, sustitucion, delecion o insercion, de uno o mas aminoacidos. La alteracion tambien puede tener un aminoacido modificado, tal como uno que comprende una modificacion postraduccional. La actividad proangiogenica de un mutante, si la hay, es sustancialmente menor que la actividad del polipeptido de tipo natural en al menos aproximadamente el 20% (por ejemplo, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 100%) tal como se mide usando un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la tecnica. Un ejemplo es un polipeptido que tiene el dominio extracelular de IGF1 -R, pero que carece el dominio intracelular. Compitiendo por iGF-1, este mutante puede inhibir la ruta mencionada anteriormente y la actividad proangiogenica de manera dominante negativa.
Las composiciones de aminoacidos de los anticuerpos o polipeptidos mencionados anteriormente pueden variar con o sin perturbar la capacidad (por ejemplo, afinidad) para unirse a las dianas o los antigenos respectivos, y desencadenar o inhibir la respuesta celular respectiva. Por ejemplo, pueden contener una o mas sustituciones de aminoacido conservativas. Una “sustitucion de aminoacido conservativa” es una en la que el residuo de aminoacido se reemplaza por un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. En la tecnica se han definido familias de residuos de aminoacido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales con ramificacion p (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por tanto, un residuo de aminoacido no esencial predicho en, por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o 10 puede reemplazarse por otro residuo de aminoacido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de las secuencias, tal como mediante mutagenesis de saturacion, y los mutantes resultantes pueden examinarse para determinar la capacidad para unirse al antigeno respectivo y desencadenar la respuesta celular respectiva para identificar mutantes que conservan la actividad.
Composiciones
Dentro del alcance de esta invencion es una composicion que contiene un portador adecuado y uno o mas de los agentes descritos anteriormente. La composicion puede ser una composicion farmaceutica que contiene un portador farmaceuticamente aceptable, una composicion dietetica que contiene un portador dieteticamente aceptable adecuado, o una composicion cosmetica que contiene un portador cosmeticamente aceptable.
El termino “composicion farmaceutica” se refiere a la combinacion de un agente activo con un portador, inerte o activo, haciendo que la composicion sea especialmente adecuada para uso diagnostico o terapeutico in vivo o ex vivo. Un “portador farmaceuticamente aceptable”, despues de administrarse a o sobre un sujeto, no provoca efectos fisiologicos adversos. El portador en la composicion farmaceutica debe ser “aceptable” tambien en el sentido de que sea compatible con el principio activo y pueda estabilizarlo. Pueden usarse uno o mas agentes solubilizantes como portadores farmaceuticos para la administracion de un compuesto activo. Los ejemplos de un portador farmaceuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, vehiculos, adyuvantes, aditivos y diluyentes biocompatibles para obtener una composicion que puede usarse como forma de dosificacion. Los ejemplos de otros
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portadores incluyen oxido de silicio coloidal, estearato de magnesio, celulosa, laurilsulfato de sodio y amarillo D&C n.2 10.
La composicion descrita anteriormente, en cualquiera de las formas descritas anteriormente, puede usarse para tratar trastornos caracterizados por angiogenesis patologica. Una cantidad eficaz se refiere a la cantidad de un compuesto/agente activo que se requiere para conferir un efecto terapeutico en un sujeto tratado. Las dosis eficaces variaran, tal como reconocen los expertos en la tecnica, dependiendo de los tipos de enfermedades tratadas, via de administracion, uso de excipientes y la posibilidad de uso conjunto de otro tratamiento terapeutico.
Una composicion farmaceutica de esta invencion puede administrarse por via parenteral, por via oral, por via nasal, por via rectal, de manera topica o por via bucal. El termino “parenteral” tal como se usa en el presente documento se refiere a inyeccion subcutanea, intracutanea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional o intracraneal, asi como cualquier tecnica de infusion adecuada.
Una composicion inyectable esteril puede ser una disolucion o suspension en un diluyente o disolvente no toxico aceptable por via parenteral. Tales disoluciones incluyen, pero no se limitan a, disolucion en 1,3-butanodiol, manitol, agua, solucion de Ringer y disolucion isotonica de cloruro de sodio. Ademas, de manera convencional se emplean aceites fijos como disolvente o medio de suspension (por ejemplo, mono o digliceridos sinteticos). Los acidos grasos, tales como, pero sin limitarse a, acido oleico y sus derivados de glicerido, son utiles en la preparacion de productos inyectables, como lo son los aceites naturales farmaceuticamente aceptables, tales como, pero sin limitarse a, aceite de oliva o aceite de ricino, versiones polioxietiladas de los mismos. Estas disoluciones o suspensiones en aceite tambien pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga tal como, pero sin limitarse a, carboximetilcelulosa, o agentes de dispersion similares. Tambien pueden usarse con el fin de formulacion otros tensioactivos usados habitualmente, tales como, pero sin limitarse a, Tween o Span u otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad similares, que se usan habitualmente en la fabricacion de formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables solidas, liquidas u otras.
Una composicion para administracion oral puede ser cualquier forma de dosificacion aceptable por via oral incluyendo capsulas, comprimidos, emulsiones y suspensiones, dispersiones y disoluciones acuosas. En el caso de los comprimidos, los portadores usados habitualmente incluyen, pero no se limitan a, lactosa y almidon de maiz. Normalmente se anaden agentes lubricantes, tales como, pero sin limitarse a, estearato de magnesio. Para la administracion oral en forma de capsula, los diluyentes utiles incluyen, pero no se limitan a, lactosa y almidon de maiz desecado. Cuando se administran suspensiones o emulsiones acuosas por via oral, el principio activo puede suspenderse o disolverse en una fase de aceite combinada con agentes emulsionantes o de suspension. Si se desea, pueden anadirse determinados agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.
Pueden formularse composiciones farmaceuticas para administracion topica segun la invencion descrita como disoluciones, pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites. Alternativamente, las formulaciones topicas pueden estar en forma de parches o apositos impregnados con principio(s) activo(s), que pueden comprender opcionalmente uno o mas excipientes o diluyentes. En algunas realizaciones preferidas, las formulaciones topicas incluyen un material que aumentaran la absorcion o penetracion del/de los principio(s) activo(s) a traves de la piel u otras zonas afectadas. La composicion topica es util para tratar trastornos en la piel, tal como melanoma y determinados trastornos inflamatorios.
Una composicion topica contiene una cantidad segura y eficaz de un portador dermatologicamente aceptable adecuado para la aplicacion a la piel. Una composicion o un componente “cosmeticamente aceptable” o “dermatologicamente aceptable” se refiere a una composicion o un componente que es adecuado para su uso en contacto con la piel humana sin excesiva toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alergica, y similares. El portador permite que se administren un agente activo y componente opcional a la piel a una(s) concentracion/concentraciones apropiada(s). Por tanto, el portador puede actuar como diluyente, dispersante, disolvente, o similar para garantizar que los materiales activos se aplican a y se distribuyen uniformemente por la diana seleccionada a una concentracion apropiada. El portador puede ser solido, semisolido o liquido. El portador puede estar en forma de una locion, una crema o un gel, en particular uno que tiene un limite de elasticidad o consistencia suficiente para impedir que sedimenten los materiales activos. El portador puede ser inerte o presentar beneficios dermatologicos. Tambien debe ser fisica y quimicamente compatible con los componentes activos descritos en el presente documento, y no deben afectar indebidamente la estabilidad, eficacia u otros beneficios de uso asociados con la composicion.
Metodos de tratamiento
La invencion descrita proporciona metodos para tratar en un sujeto un trastorno angiogenico o un trastorno de la angiogenesis.
Los terminos “trastorno angiogenico”, “trastorno de la angiogenesis” y “trastorno de la angiogenesis” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y se refieren a un trastorno caracterizado por angiogenesis patologica. Un trastorno caracterizado por angiogenesis patologica se refiere a un trastorno en el que angiogenesis
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anomala o aberrante, sola o en combinacion con otros, contribuye a la causalidad, el origen o sintoma del trastorno. Los ejemplos de este trastorno incluyen diversos canceres (por ejemplo, tumores vascularizados), trastornos oculares, trastornos inflamatorios, y otros.
Los tumores vascularizados tipicos que pueden tratarse con el metodo incluyen tumores solidos, particularmente carcinomas, que requieren una componente vascular para la provision de oxigeno y nutrientes. Los tumores solidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmon, mama, oseo, de ovario, estomago, pancreas, laringe, esofago, testiculos, higado, parotideo, de vias biliares, colon, recto, cuello uterino, utero, endometrio, rinon, vejiga, prostata, tiroides, carcinomas de celulas escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de celulas pequenas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas, sarcoma de Kaposi y sarcomas.
Tambien pueden tratarse varios trastornos o estados, distintos de cancer, con el metodo descrito anteriormente. Los ejemplos incluyen artritis, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatia diabetica, degeneracion macular asociada con la edad, enfermedad de Graves, reestenosis vascular (incluyendo reestenosis tras angioplastia), malformaciones arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma, glaucoma neovascular, enfermedad renal cronica, nefropatia diabetica, enfermedad renal poliquistica, enfermedad pulmonar intersticial, hipertension pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), enfisema, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad hepatica inflamatoria cronica, cirrosis hepatica, linfoma cutaneo de celulas T, rosacea y carcinoma de celulas basales.
Otras dianas de tratamiento incluyen las descritas en, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses 2009004297, 20090175791 y 20070161553, tales como angiofibroma, placas ateroscleroticas, neovascularizacion de injerto corneal, articulaciones hemofilicas, cicatrices hipertroficas, sindrome de Osler-Weber, granuloma piogeno, fibroplasia retrolenticular, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, otras diversas enfermedades y trastornos inflamatorios y endometriosis.
Un “sujeto” se refiere a un ser humano y un animal no humano. Los ejemplos de un animal no humano incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamiferos, tales como mamiferos no humanos, primates no humanos (particularmente primates superiores), perros, roedores (por ejemplo, ratones o ratas), cobayas, gatos y conejos, y animales no mamiferos, tales como aves, anfibios, reptiles, etc. En una realizacion, el sujeto es un ser humano. En otra realizacion, el sujeto es un animal de experimentacion o animal adecuado como modelo de enfermedad. Puede identificarse un sujeto que ha de tratarse para un trastorno mediante tecnicas de diagnostico convencionales para el trastorno.
Opcionalmente, el sujeto puede examinarse para detectar una mutacion, un nivel de expresion o nivel de actividad de uno o mas de las proteinas o los genes mencionados anteriormente mediante metodos conocidos en la tecnica o descritos anteriormente antes del tratamiento. Si el sujeto tiene una mutacion particular en el gen, o si el nivel de actividad o expresion genica es, por ejemplo, mayor en una muestra del sujeto que el de una muestra de una persona normal, el sujeto es un candidato para el tratamiento.
Para confirmar la inhibicion o el tratamiento, puede evaluarse y/o verificar la inhibicion de la angiogenesis o el reclutamiento endotelial resultante usando una tecnologia conocida en la tecnica antes y/o despues de la etapa de administracion. Las tecnologias a modo de ejemplo incluyen angiografia o arteriografia, una tecnica de obtencion de imagenes medicas usadas para visualizar el interior de, o la luz, de vasos sanguineos y organos del cuerpo, puede realizarse generalmente inyectando un agente de contraste radiopaco en el vaso sanguineo y obteniendo imagenes usando tecnicas basadas en rayos X tales como fluoroscopia.
“Tratar” o “tratamiento” se refiere a la administracion de un compuesto o agente a un sujeto que tiene un trastorno con el fin de curar, aliviar, paliar, remediar, retrasar la aparicion de, prevenir o mejorar el trastorno, el sintoma del trastorno, el estado patologico secundario al trastorno o la predisposicion al trastorno.
Una “cantidad eficaz” o “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad del compuesto o agente que puede producir un resultado deseable a nivel medico en un sujeto tratado. El metodo de tratamiento puede realizarse in vivo o ex vivo, solo o junto con otros farmacos o terapias. Puede administrarse una cantidad terapeuticamente eficaz en una o mas administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no pretende limitarse a una formulacion o via de administracion particular.
El agente puede administrarse in vivo o ex vivo, solo o coadministrarse junto con otros farmacos o terapias, es decir, un terapia de coctel. Tal como se usa en el presente documento, el termino “coadministracion” o “coadministrarse” se refiere a la administracion de al menos dos agente(s) o terapias a un sujeto. Por ejemplo, en el tratamiento de tumores, particularmente tumores vascularizados, malignos, los agentes pueden usarse solos o en combinacion con, por ejemplo, agentes quimioterapicos, radioterapicos, apoptopicos, antiangiogenicos y/o inmunotoxinas o coaguligandos.
En algunas realizaciones, la coadministracion de dos o mas agentes/terapias es concurrente. En otras realizaciones, un primer agente/terapia se administra antes del segundo agente/terapia. Los expertos en la tecnica entienden que
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las formulaciones y/o vias de administracion de los diversos agentes/terapias usados pueden variar.
En un enfoque in vivo, se administra un compuesto o agente a un sujeto. Generalmente, el compuesto se suspende en un portador farmaceuticamente aceptable (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, solucion salina fisiologica) y se administra por via oral o mediante infusion intravenosa, o inyectarse o implantarse por via subcutanea, por via intramuscular, por via intratecal, por via intraperitoneal, por via intrarrectal, por via intravaginal, por via intranasal, por via intragastrica, por via intratraqueal o por via intrapulmonar.
La dosificacion requerida depende de la eleccion de la via de administracion; la naturaleza de la formulacion; la naturaleza de la enfermedad del paciente; la talla, el peso, el area superficial, la edad y el sexo del sujeto; otros farmacos que se administren; y el criterio del medico encargado. Las dosificaciones adecuadas se encuentran en el intervalo de 0,01-100 mg/kg. Se esperan variaciones en la dosificacion necesaria en vista de la variedad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de diversas vias de administracion. Por ejemplo, se esperaria que la administracion oral requiera mayores dosificaciones que la administracion mediante inyeccion i.v. Pueden ajustarse variaciones en estos niveles de dosificacion usando rutinas empiricas convencionales para la optimizacion tal como se entiende bien en la tecnica. La encapsulacion del compuesto en un vehiculo de administracion adecuado (por ejemplo, microparticulas polimericas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de administracion, particularmente para la administracion oral.
Diagnostico
La invencion descrita tambien proporciona kits y metodos de diagnostico. Puede diagnosticarse a un sujeto que tiene celulas cancerosas o celulas propensas a la tumorigenesis basandose en la expresion o actividad de uno o mas de los genes o polipeptidos descritos anteriormente en una muestra de prueba del sujeto. El polipeptido y los acidos nucleicos pueden usarse como marcadores para indicar la presencia o ausencia de una celula cancerosa o celula propensa a la tumorigenesis. Los ensayos de diagnostico y pronostico de la invencion descrita incluyen metodos para evaluar el nivel de expresion del polipeptido o acido nucleico.
Puede evaluarse la presencia, el nivel o la ausencia del polipeptido o acido nucleico en una muestra de prueba obteniendo una muestra de prueba de un sujeto de prueba y poniendo en contacto la muestra de prueba con un compuesto o un agente que puede detectar el polipeptido o acido nucleico (por ejemplo, sonda de ARNm, sonda de ADNc genomico o sonda de ADNc). La “muestra de prueba” puede incluir tejidos, celulas y liquidos biologicos aislados de un sujeto, asi como tejidos, celulas y liquidos presentes dentro de un sujeto. El nivel de expresion del gen puede medirse de varias maneras, incluyendo, pero sin limitarse a, medir el ARNm codificado por el gen; medir la cantidad de polipeptido codificado por el gen; o medir la actividad de polipeptido codificado por el gen.
El nivel de ARNm correspondiente al gen en una celula puede determinarse tanto mediante formatos in situ como mediante formatos in vitro. Puede usarse ARN mensajero aislado de una muestra de prueba en ensayos de hibridacion o amplificacion que incluyen, pero no se limitan a, analisis de transferencia de tipo Southern o Northern, analisis de PCR y alineamientos de sondas. Por ejemplo, un metodo de diagnostico para la deteccion de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una sonda de acido nucleico que puede hibridar con el ARNm codificado por el gen. La sonda puede ser un acido nucleico de longitud completa, o una parte del mismo, tal como un oligonucleotido de al menos 10 nucleotidos de longitud y suficiente para hibridar especificamente en condiciones rigurosas con ARNm o ADN genomico.
En un formato, se inmoviliza ARNm (o ADNc preparado a partir del mismo) sobre una superficie y se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, haciendo correr el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En otro formato, se inmovilizan las sondas sobre una superficie y se pone en contacto el ARNm (o ADNc) con las sondas, por ejemplo, en un alineamiento de chips de gen. Un experto en la tecnica puede adaptar metodos de deteccion de ARNm conocidos para detectar el nivel de ARNm.
Puede evaluarse el nivel de ARNm (o ADNc preparado a partir del mismo) en una muestra codificado por uno o mas de los genes mencionados anteriormente con acido nucleico amplificacion, por ejemplo, mediante PCR convencional (patente estadounidense n.° 4.683.202), RT-PCR (Bustin S. J Mol Endocrinol. 25:169-93, 2000), PCR cuantitativa (Ong Y. et al., Hematology. 7:59-67, 2002), real time PCR (Ginzinger D. Exp Hematol. 30:503-12, 2002), y PCR in situ (Thaker V. Methods Mol Biol. 115:379-402, 1999), o cualquier otro metodo de amplificacion de acidos nucleicos, seguido por la deteccion de las moleculas amplificadas usando tecnicas conocidas en la tecnica. Tal como se usa en el presente documento, los “cebadores de amplificacion” se definen que son un par de moleculas de acido nucleico que pueden aparearse a regiones en 5’ o 3’ de un gen (hebras positiva y negativa, respectivamente, o viceversa) y contienen una region corta entremedias. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificacion de una molecula de acido nucleico que tiene la secuencia de nucleotidos flanqueada por los cebadores.
Para metodos in situ, puede prepararse una muestra de celulas o tejido e inmovilizarse sobre un soporte, tal como, pero sin limitarse a, un portaobjetos de vidrio, y luego ponerse en contacto con una sonda que puede hibridar con
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ADN genomico en cromosomas o ARNm que codifica para el polipeptido correspondiente.
En otra realizacion, los metodos de la invencion descrita incluyen ademas poner en contacto una muestra de control con un compuesto o agente que puede detectar ARNm, o ADN genomico, y comparar la presencia de ARNm o ADN genomico en la muestra de control con la presencia de ARNm o ADN genomico en la muestra de prueba.
Los metodos de diagnostico basados en acidos nucleicos descritos anteriormente pueden proporcionar informacion cualitativa y cuantitativa para determinar si un sujeto tiene o esta predispuesto a una enfermedad asociada con la expresion genica aberrante y angiogenesis aberrante, por ejemplo, canceres.
Puede usarse una variedad de metodos para determinar el nivel de uno o mas de los polipeptidos mencionados anteriormente. En general, estos metodos incluyen poner un contacto un agente que se une selectivamente al polipeptido, tal como un anticuerpo, para evaluar el nivel de polipeptido en una muestra. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Tambien puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab’)2). En otra realizacion, el anticuerpo porta un marcador detectable. El termino “marcado”, con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende englobar el marcaje directo de la sonda o el anticuerpo uniendo fisicamente una sustancia detectable a la sonda o al anticuerpo, asi como el marcaje indirecto de la sonda o el anticuerpo mediante reactividad con una sustancia detectable. Por ejemplo, un anticuerpo con una region Fc de conejo puede marcarse indirectamente usando un segundo anticuerpo dirigido contra la region Fc de conejo, en la que el segundo anticuerpo se acopla a una sustancia detectable. Se proporcionan ejemplos de sustancias detectables en el presente documento. Las sustancias o los marcadores detectables apropiados incluyen, pero no se limitan a,
1 HOC 1Q1 qc o qo 11 J 1
radioisotopos (por ejemplo, pero sin limitarse a, I, I, S, H o P), enzimas (por ejemplo, pero sin limitarse a, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rabano, luciferasa o p-galactosidasa), restos o proteinas fluorescentes (por ejemplo, pero sin limitarse a, fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, GFP o BFP), o restos luminiscentes (por ejemplo, pero sin limitarse a, nanoparticulas Qdot™ de Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA).
Los metodos de deteccion pueden usarse para detectar uno o mas de los polipeptidos mencionados anteriormente en una muestra biologica in vitro asi como in vivo. Las tecnicas in vitro para la deteccion del polipeptido incluyen analisis mediante ELISA, inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, EIA, RIA y de inmunotransferencia de tipo Western. Las tecnicas in vivo para la deteccion del polipeptido incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con una sustancia detectable tal como se describio anteriormente. La presencia y ubicacion de la sustancia detectable en un sujeto puede detectarse mediante tecnicas de obtencion de imagenes convencionales.
Los metodos de diagnostico descritos en el presente documento pueden identificar sujetos que tienen, o corren el riesgo de desarrollar, una enfermedad o un trastorno asociado con la expresion o actividad aberrante de uno o mas de los polipeptidos mencionados anteriormente. Tal como se describe en el presente documento, los ejemplos de una enfermedad o un trastorno de este tipo incluyen los descritos anteriormente.
Los ensayos de pronostico descritos en el presente documento pueden usarse para determinar si es adecuado administrar a un sujeto un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimetico, una proteina, un peptido, acido nucleico, una molecula pequena u otro candidato a farmaco) para tratar un trastorno, tal como cancer. Por ejemplo, tales ensayos pueden usarse para determinar si puede administrarse a un sujeto un farmaco citotoxico para tratar el trastorno.
La informacion obtenida de la practica de los ensayos anteriores es util en el pronostico, la identificacion de la evolucion de y la gestion clinica de enfermedades y otros estados perjudiciales que afectan al estado de salud de un individuo. En algunas realizaciones, los ensayos de diagnostico anteriores proporcionan informacion util en el pronostico, la identificacion de la evolucion de y la gestion clinica de tumores malignos (canceres) que se caracterizan por una angiogenesis patologica anomala. La informacion ayuda mas especificamente al medico clinico en el diseno de regimenes quimioterapicos u otros regimenes de tratamiento para erradicar tales tumores malignos del cuerpo de un mamifero aquejado, por ejemplo, un ser humano.
Ejemplo 1: Metodos y materiales
Este ejemplo describe metodos y materiales generales usados en los ejemplos 2-8.
Cultivo celular
Todas las lineas celulares se propagaron tal como se describe en Tavazoie, S. F. eta/., Nature 451 (7175), 147 (2008). Se cultivaron celulas 293T con medios DMEM complementados con FBS al 10%; se cultivaron celulas H29 con medios DMEM complementados con FBS al 10%, doxiciclina 20 pg/ml, puromicina 2 pg/ml y G418 0,3 mg/ml; y se cultivaron celulas HUVEC con medios EGM-2 (CC-3162, Lonza, Basilea, Suiza). Las lineas celulares de cancer de mama MDA-MB-231 y CN34 y sus derivados metastasicos LM2, BoM2 y Lmla se describen en Minn, A. J. et al., Nature 436 (7050), 518 (2005).
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Estudios con animales
Todo el trabajo con animales se realizo segun un protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en la Universidad Rockefeller. Se usaron ratones NOD/SCID hembra ratones de edades coincidentes (6-8 semanas de edad) tanto para ensayos de inicio de tumor en el paniculo adiposo mamario ortotopico (Minn, A. J. et a/., Nature 436 (7050), 518 (2005) como para ensayos de metastasis de pulmon (Tavazoie, S. F. eta/., Nature 451 (7175), 147 (2008)). Se usaron ratones atimicos hembra de edades coincidentes de ocho semanas de edad para ensayos de metastasis sistemica (Kang, Y. et a/., Cancer Cell 3 (6), 537 (2003) y Yin, J. J. et a/., J Clin Invest 103 (2), 197 (1999)).
Se obtuvo expresion de miR-126 inducible clonando pre-miR-126 en el vector pTripz que contenia tet-ON (Thermo Scientific, Huntsville, AL). En el dia 3, se anadio doxiciclina 2 mg/ml (Sigma Aldrich) al agua potable que contenia sacarosa al 5%. Se dio a los ratones de control agua potable con sacarosa al 5%.
Generacion de Lentivirus, Retrovirus, silenciamiento y celulas de sobreexpresion
Para la generacion de lentivirus, se sembraron 1x106 celulas 293T sobre una placa de 10 cm y se incubaron durante 24 h. Entonces se cotransfectaron doce microgramos de vector K (Gag/Pol), 6 pg de vector A (Env) y 12 pg del plasmido de ARNhc apropiado en las celulas 293T usando 40 pl de reactivo de transfeccion TRANSIT®-293 (MIR 2700, MIRUS BIO LLC, Madison, WI). Tras 16 h, se reemplazaron los medios por DMEM libre de antibioticos recien preparado complementado con FBS al 10%. Tras otras 24 h, se recogio el virus centrifugando durante 5 min a 1.500 g antes de filtrarse a traves de un filtro de 0,45 pm. Para la generacion de retrovirus, se sembraron celulas H29 sobre una placa de 10 cm y se dejaron crecer hasta una confluencia del 90%. Entonces se transfectaron diez microgramos del plasmido apropiado en las celulas H29 usando 60 pl de reactivo de transfeccion LIPOFECTAMINE™ 2000 (11668-019, INVITROGEN por LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA). Tras 16 h, se reemplazaron los medios por DMEM libre de antibioticos recien preparado complementado con FBS al 10%. Tras otras 48 h, se recogio el virus centrifugando durante 5 min a 1.500 g y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm. Se usaron dos mililitros del virus apropiado para transducir 50 K celulas cancerosas en presencia de 10 pg/ml de polibreno (TR-1003-G, MILLIPORe, Billerica, A). Tras 24 h, se cambiaron los medios a DMEM complementado con FBS al 10% y puromicina 2 pg/ml (lentivirus) o blasticidina 10 pg/ml para la seleccion. Tras otras 72 h, se lavaron las celulas y se dejaron crecer en D10F y se sometieron a prueba para determinar el silenciamiento del gen de interes mediante qPCR.
Reclutamiento endotelial
Se sembraron celulas cancerosas (25.000) en placas de 24 pocillos aproximadamente 24 h antes del comienzo del ensayo de reclutamiento. Se privaron de suero celulas HUVEC en medios EGM-2 complementados con FBS al 0,2% durante 24 horas. Entonces se marcaron las celulas HUVEC con colorante CELLTRACKER Red CMTPX (C34552, INVITROGEN) durante 45 min y se rescataron en medios EGM-2 complementados con FBS al 2% durante 30 min. Mientras, se lavaron las celulas cancerosas con PBS y 1 ml de FBS al 0,2% y se anadieron medios EGM-2 a cada pocillo. Se equipo cada pocillo con un inserto HTS FLUROBLOCK de 3,0 pm (351151, BD FALCON, San Jose, CA). Para los experimentos con anticuerpos, se anadio entonces la concentracion apropiada de cada anticuerpo a cada pocillo: anticuerpo anti-IGFBP2 50 ng/ml (AF674, R&D SYSTEMS, Minneapolis, mN), anticuerpo anti-IGF-1 20 pg/ml (AF-291-NA, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF-2 40 pg/ml (MAB292, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF1R 20 pg/ml (MAB391, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF2R 5 pg/ml (AF2447, R&D SYSTEMS) y anticuerpo anti-IgG (AB-108-C, R&D SYSTEMS). Para los ensayos de reclutamiento endotelial que requieren pre-incubacion con anticuerpos, se incubaron entonces o bien celulas HUVEC o bien celulas cancerosas con anticuerpo anti-IGF1 R 20 pg/ml o anticuerpo contra IgG de control durante 1 h y se lavaron una vez PBS. Entonces se privaron de suero las celulas HUVEC durante 1 h antes de resuspenderse en EGM-2 con FBS al 0,2% en 100 K HUVEC por ml. Entonces se anadio la resuspension (0,5 ml) a cada inserto FLUOROBLOCK y se dejo que el ensayo de reclutamiento continuara durante 16 h. Tras la finalizacion del ensayo, se fijaron las piezas de insercion FLUOROBLOCK con paraformaldehido al 4% durante 15 min y se montaron en portaobjetos con medios de montaje VECTASHIELD (H- 1000, VECTOR LABORATORIES, Burlingame, CA). Se tomaron tres imagenes de cada inserto y se analizaron las imagenes usando IMAGEJ (NIH).
Ensayo de quimiotaxia
Se dejo que Matrigel (250 pl, BD BIOSCIENCES, n.° 356231) que contenia cantidades dadas de albumina serica bovina (A2153, Sigma Aldrich), rhIGFBP2 (674-B2, R&D SYSTEMS), rhGas6 (885-GS, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF1 R (MAB391, R&D SYSTEMS) y MerFc (891 -MR-100, R&D SYSTEMS) solidificara en el fondo de una placa de 24 pocillos durante 30 min antes de que se anadieran 250 pl de medios HUVEC que contenian FBS al 0,2%. Entonces se coloco un inserto HTS Fluroblock de 3,0 pm (351151, BD Falcon) en cada pocillo. Se marcaron las celulas HUVEC con colorante CellTracker Red CMTPX (C34552, Invitrogen) antes de resuspender 300 K HUVEC por ml de EGM-2 con FBS al 0,2%. Entonces se anadieron 0,5 ml de la resuspension a cada inserto Fluoroblock y se dejo que el ensayo continuara durante 20 h. Entonces se fijaron las piezas de insercion durante 15 min en
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paraformaldehido al 4% y se montaron en portaobjetos con medios de montaje VectaShield (H-1000, Vector Laboratories). Entonces se tomaron imagenes de 5 campos del lado basal de cada inserto y se analizaron las imagenes usando ImageJ (NIH).
Ensayo de migration
Se hicieron crecer celulas HUVEC hasta una confluencia del 90% y de estimularon en las concentraciones dadas de albumina serica bovina (Sigma Aldrich, n.° A2153), rhIGFBP2 (674-B2, R&D SYSTEMS) y anticuerpo anti-IGFIR (MAB391, R&D SYSTEMS) en medios HUVEC que contenian FBS al 0,2% durante 40 min a 37°C. Entonces se sometieron las celulas a tripsinizacion y se anadieron y 50 K celulas a piezas de insercion HTS Fluroblock (351151, BD Falcon). Tras 24 horas a 37°C con el 5% de CO2, se retiraron las piezas de insercion, se escindio la membrana y se fijo en paraformaldehido al 4%. Se visualizaron las celulas HUVEC que habian migrado al lado basal de la membrana con DAPI y se contaron en 5 campos por membrana usando Image J (NIH).
Adhesion endotelial
Se sembraron celulas HUVEC en una placa de 6 cm y se dejaron crecer hasta la confluencia. Se privaron de suero celulas cancerosas en medios DMEM complementados con FBS al 0,2% durante 30 min, se marcaron con colorante CELLTRACKER Green CMFDA (C7025, Invitrogen) durante 45 min y se incubaron en medios DMEM complementados con FBS al 10% durante 30 min. Entonces se sometieron las celulas cancerosas a tripsinizacion y se resuspendieron en FBS al 10%/DMEM hasta 10 K celulas/ml. Entonces se anadieron cinco mililitros de la resuspension a cada placa de HUVEC y se incubo la placa a 37°C durante 10 min. Entonces se lavaron las placas suavemente con PBS y se fijaron con paraformaldehido al 4% durante 15 min. Entonces se trato cada placa con 1 ml de PBS y se tomaron 6 imagenes de cada placa. Entonces se cuantifico el numero de celulas cancerosas adherentes a las celulas HUVEC usando IMAGEJ.
Proliferation endotelial
Se sembraron celulas cancerosas (1x106) en una placa de 10 cm y se dejaron crecer durante 24 h. Entonces se lavaron suavemente las celulas cancerosas con PBS y se anadieron medios EGM-2 complementados con FBS al 2% a cada placa. Se recogieron los medios EGM-2 acondicionados tras 24 h. Se sembraron celulas HUVEC (25 K) por triplicado en una placa de 6 pocillos y se dejaron crecer durante 16 h. Entonces se lavaron suavemente las celulas HUVEC con PBS y se anadieron 3 ml de medios EGM-2 acondicionados a cada pocillo. Tras 48 h, se reemplazaron los medios acondicionados por otros 3 ml de medios acondicionados. Tras otras 48 h, se sometieron las celulas a tripsinizacion y se contaron usando un hemocitometro.
Ensayo de formation de tubos
Se realizo un ensayo de formacion de tubos segun el protocolo del fabricante (354149, BD BIOCOAT™ ANGIOGENESIS SYSTEM - Endothelial Cell Tube Formation). Brevemente, se privaron de suero celulas HUVEC en Medios EGM-2 complementados con FBS al 0,2% durante 24 horas. Entonces se marcaron las celulas HUVEC con colorante CELLTRACKER Red CMTPX (C34552, INVITROGEN) durante 45 min y se trataron posteriormente en medios EGM-2 complementados con FBS al 2% durante 30 min. Mientras, se incubo la placa de ensayo de formacion de tubos, que estaba en un formato de 96 pocillos, a 37°C durante 30 min. Se sometieron las celulas cancerosas y las celulas HUVEC a tripsinizacion y se resuspendieron a 400 K/ml y 800 K/ml, respectivamente en medios EGM-2 complementados con FBS al 2%. Entonces se mezclaron las suspensiones de celulas cancerosas y celulas HUVEC a una razon 1:1 y se sembraron 50 pl de cada mezcla en cada pocillo de la placa de ensayo de formacion de tubos. Se incubo la placa de ensayo a 37°C durante 16 h. Se tomaron imagenes de cada pocillo y se procesaron las imagenes usando el software de analisis METAMORPH (MOLECULAR DEVICES, Inc.) para obtener el numero de puntos de ramificacion por imagen.
Analisis de expresion de miARNy expresion de ARNm
Se extrajo el ARN total de diversas lineas celulares usando el kit MIRVANA (AM1560, APPLIED BIOSYSTEMS, Austin, TX). Se uso el ensayo de microARN TAQMAN (4427975-0002228, APPLIED BIoSySTEMS) para cuantificar los niveles de expresion de miARN maduro tal como se describe en Tavazoie, S. F. et al., Nature 451 (7175), 147 (2008). Para la cuantificacion del ARNm, se sometieron a transcripcion inversa 400 ng del ARN total usando el kit de de sintesis de primera cadena de ADNc (18080-051, INVITROGEN). Entonces se mezclaron aproximadamente 4 ng del ADNc resultante con el reactivo SYBR green PCR MASTER MIX (4309155, APPLIED BIOSYSTEMS) y cebadores apropiados (tabla 1). Se obtuvieron datos de expresion de ARNm cuantitativos usando un sistema de PCR en tiempo real ABI PRISM 7900HT (APPLIED BIOSYSTEMS). Se uso Smad4 como control endogeno para normalizacion. Se realizo analisis de expresion de canceres de mama humanos en diversos estadios de enfermedad usando los paneles 2 y 3 de cancer de mama en serie mediante qPCR ISSUESCAN (BCRT102 & BCRT103, ORIGENE, Rockville, MD).
Tabla 1. Cebadores de qPCR con SYBR green
Gen
Directo Inverso
ABCB9
GACCTTCACCTACCGCACTC CACAGGAGCTCTTCCCACTG
BEX2
GCCCCGAAAGTAGGAAGC CTCCATTACTCCTGGGCCTAT
BGLAP
GGCGCTACCTGTATCAATGG TCAGCCAACTCGTCACAGTC
CA12
CCAAGGCT ACAAT CT GTCTGC GGGCAGGTTCAGCTTCACT
GDF15
CCGGATACTCACGCCAGA AGAGATACGCAGGTGCAGGT
GEM
GACAGCAT GGACAGCGACT AACCATCAGGGTTCGTT CAT
IGFBP2
CCAAGAAGCT GCGACCAC GGGAT GT GCAGGGAGT AGAG
ITGB4
TCAGCCTCTCTGGGACCTT TATCCACACGGACACACTCC
KIAA0746
GTTGTCTGTGCAGATGTACGC TAGCAGGGCCAGGTTAAAAA
KLF4
GCCGCTCCATTACCAAGA TCTTCCCCTCTTTGGCTTG
MARS
AACAACCT GGGCAACTT CAT ACCATCTCAGGCACATAGCC
MERTK
GGAGACAGGACCAAAGC GGGCAAT ATCCACCAT GAAC
PADI4
AAGT GCAAGCT GACCATCT G GCCGAT CTCCATTT CATCC
PHGDH
TGGT GGAAAAGCAGAACCTT AACAATAAGGCCTTCACAGTCC
PITPNC1
GCGCT ACT ACAAAGAAT CT GAGG GAGCACAT GAT AGGCTGAT GAC
PSAT1
TCTTGTGCGGGAATTGCTA AAGGGGACAGCACT GAACT G
PYGB
TCCAGGGTCCTGTATCCAAA CCACGAAGTACTCCTGCTTCA
RGC32
TGCTGATCTT GACAAAACTTT AGC GCAGGTCCTCGGAACTTTCT
SHMT2
GAGGGAGAAGGACAGGCAGT CTCGGCTGCAGAAGTTCTCT
SMAD4
TGGCCCAGGATCAGTAGGT CATCAACACCAATTCCAGCA
THBD
AATTGGGAGCTT GGGAAT G T GAGGACCT GATT AAGGCT AGG
TNFSF4
GTATCCTCGAATTCAAAGTATCAAAGT CTGAGTTGTTCTGCACCTTCA
VIPR1
CTGTCCCCTCATCTTCAAGC CAGCT GCGGCTT ACATT G
Prediction de diana de miR-126
Se identificaron posibles dianas de miR-126 usando 3 conjuntos de perfiles de microalineamiento: celulas LM2 5 control en relacion con celulas LM2 que sobreexpresan miR-126 (GSE n.° 23905) y 2 alineamientos por duplicado de celulas MDA y LM2 (GSE n.° 23904 y Minn, A. J. et al., Nature 436 (7050), 518 (2005). Con estos alineamientos, se usaron los siguientes criterios para identificar posibles genes diana de miR-126: (1) Genes regulados por disminucion mas de 1,6 veces con la sobreexpresion de miR-126 en celulas LM2 y (2) genes regulados por incremento mas de 1,4 veces en uno de los dos alineamientos de LM2 frente a MDA. Posteriormente se verificaron 10 todas las posibles dianas mediante qPCR.
Ensayo de indicador de luciferasa
Se realizo en ensayo de indicador de luciferasa tal como se describe en Tavazoie, S. F. et al., Nature 451 (7175), 15 147 (2008). Brevemente, se clonaron 3’UTR y CDS de longitud completa de ABCB9, IGFBP2, MERTK, PITPNC1,
PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR1 en el vector de indicador de luciferasa dual psiCheck2 (C8021, PrOMEGA, Madison, WI). A continuacion se enumeran las secuencias de las CDS y las 3’UTR.
CDSde ABCB9
ATGCGGCTGTGGAAGGCGGTGGTGGTGACTTTGGCCTTCATGAGTGTGGACATCTGCGTGACCACG GCCATCTATGTCTTCAGCCACCTGGACCGCAGCCTCCTGGAGGACATCCGCCACTTCAACATCTTT GACTCGGTGCTGGATCTCTGGGCAGCCTGCCTGTACCGCAGCTGCCTGCTGCTGGGAGCCACCATT GGTGTGGCCAAGAACAGTGCGCTGGGGCCCCGGCGGCTGCGGGCCTCGTGGCTGGTCATCACCCTC GTGTGCCTCTTCGTGGGCATCTATGCCATGGTGAAGCTGCTGCTCTTCTCAGAGGTGCGCAGGCCC ATCCGGGACCCCTGGTTTTGGGCCCTGTTCGTGTGGACGTACATTTCACTCGGCGCATCCTTCCTG CTCTGGTGGCTGCTGTCCACCGTGCGGCCAGGCACCCAGGCCCTGGAGCCAGGGGCGGCCACCGAG GCTGAGGGCTTCCCTGGGAGCGGCCGGCCACCGCCCGAGCAGGCGTCTGGGGCCACGCTGCAGAAG CTGCTCTCCTACACCAAGCCCGACGTGGCCTTCCTCGTGGCCGCCTCCTTCTTCCTCATCGTGGCA GCTCTGGGAGAGACCTTCCTGCCCTACTACACGGGCCGCGCCATTGATGGCATCGTCATCCAGAAA AGCATGGATCAGTTCAGCACGGCTGTCGTCATCGTGTGCCTGCTGGCCATTGGCAGCTCATTTGCC GCAGGTATTCGGGGCGGCATTTTTACCCTCATATTTGCCAGACTGAACATTCGCCTTCGAAACTGT CTCTTCCGCTCACTGGTGTCCCAGGAGACAAGCTTCTTTGATGAGAACCGCACAGGGGACCTCATC TCCCGCCTGACCTCGGACACCACCATGGTCAGCGACCTGGTCTCCCAGAACATCAATGTCTTCCTG CGGAACACAGTCAAGGTCACGGGCGTGGTGGTCTTCATGTTCAGCCTCTCATGGCAGCTCTCCTTG GTCACCTTCATGGGCTTCCCCATCATCATGATGGTGTCCAACATCTACGGCAAGTACTACAAGAGG CTCTCCAAAGAGGTCCAGAATGCCCTGGCCAGAGCGAGCAACACGGCGGAGGAGACCATCAGTGCC ATGAAGACTGTCCGGAGCTTCGCCAATGAGGAGGAGGAGGCAGAGGTGTACCTGCGGAAGCTGCAG CAGGTGTACAAGCTGAACAGGAAGGAGGCAGCTGCCTACATGTACTACGTCTGGGGCAGCGGGCTC ACACTGCTGGTGGTCCAGGTCAGCATCCTCTACTACGGGGGCCACCTTGTCATCTCAGGCCAGATG ACCAGCGGCAACCTCATCGCCTTCATCATCTACGAGTTTGTCCTGGGAGATTGTATGGAGTCCGTG GGCTCCGTCTACAGTGGCCTGATGCAGGGAGTGGGGGCTGCTGAGAAGGTGTTCGAGTTCATCGAC CGGCAGCCGACCATGGTGCACGATGGCAGCTTGGCCCCCGACCACCTGGAGGGCCGGGTGGACTTT GAGAATGTGACCTTCACCTACCGCACTCGGCCCCACACCCAGGTCCTGCAGAATGTCTCCTTCAGC CTGTCCCCCGGCAAGGTGACGGCCCTGGTGGGGCCCTCGGGCAGTGGGAAGAGCTCCTGTGTCAAC ATCCTGGAGAACTTCTACCCCCTGGAGGGGGGCCGGGTGCTGCTGGACGGCAAGCCCATCAGCGCC TACGACCACAAGTACTTGCACCGTGTGATCTCCCTGGTGAGCCAGGAGCCCGTGCTGTTCGCCCGC TCCATCACGGATAACATCTCCTACGGCCTGCCCACTGTGCCTTTCGAGATGGTGGTGGAGGCCGCA CAGAAGGCCAATGCCCACGGCTTCATCATGGAACTCCAGGACGGCTACAGCACAGAGACAGGGGAG AAGGGCGCCCAGCTGTCAGGTGGCCAGAAGCAGCGGGTGGCCATGGCCCGGGCTCTGGTGCGGAAC CCCCCAGTCCTCATCCTGGATGAAGCCACCAGCGCTTTGGATGCCGAGAGCGAGTATCTGATCCAG CAGGCCATCCATGGCAACCTGCAGAAGCACACGGTACTCATCATCGCGCACCGGCTGAGCACCGTG GAGCACGCGCACCTCATTGTGGTGCTGGACAAGGGCCGCGTAGTGCAGCAGGGCACCCACCAGCAG CTGCTGGCCCAGGGCGGCCTCTACGCCAAGCTGGTGCAGCGGCAGATGCTGGGGCTTCAGCCCGCC GCAGACTTCACAGCTGGCCACAACGAGCCTGTAGCCAACGGCAGTCACAAGGCCTGA
3’UTR de ABCB9 5
TGGGGGGCCCCTGCTTCTCCCGGTGGGGCAGAGGACCCGGTGCCTGCCTGGCAGATGTGCCCACGG AGGCCCCCAGCTGCCCTCCGAGCCCAGGCCTGCAGCACTGAAAGACGACCTGCCATGTCCCATGGA TCACCGCTTCCTGCATCTTGCCCCTGGTCCCTGCCCCATTCCCAGGGCACTCCTTACCCCTGCTGC CCTGAGCCAACGCCTTCACGGACCTCCCTAGCCTCCTAAGCAAAGGTAGAGCTGCCTTTTTAAACC TAGGTCTTACCAGGGTTTTTACTGTTTGGTTTGAGGCACCCCAGTCAACTCCTAGATTTCAAAAAC CTTTTTCTAATTGGGAGTAATGGCGGGCACTTTCACCAAGATGTTCTAGAAACTTCTGAGCCAGGA GTGAATGGCCCTTCCTTAGTAGCCTGGGGGATGTCCAGAGACTAGGCCTCTCCCCTTTACCCCTCC AGAGAAGGGGCTTCCCTGTCCCGGAGGGAGACACGGGGAACGGGATTTTCCGTCTCTCCCTCTTGC CAGCTCTGTGAGTCTGGCCAGGGCGGGTAGGGAGCGTGGAGGGCATCTGTCTGCCATCGCCCGCTG CCAATCTAAGCCAGTCTCACTGTGAACCACACGAAACCTCAACTGGGGGAGTGAGGGGCTGGCCAG GTCTGGAGGGGCCTCAGGGGTGCCCCCAGCCCGGCACCCAGCGCTTTCGCCCCTCGTCCACCCACC CCTGGCTGGCAGCCTCCCTCCCCACACCCGCCCCTGTGCTCTGCTGTCTGGAGGCCACGTGGATGT TCATGAGATGCATTCTCTTCTGTCTTTGGTGGATGGGATGGTGGCAAAGCCCAGGATCTGGCTTTG C CAGAGG T T GCAACAT G T T GAGAG AAC C CGGTCAATAAAGTGTACTACCTCTTACCCCTAA
CDS de IGFBP2
ATGCTGCCGAGAGTGGGCTGCCCCGCGCTGCCGCTGCCGCCGCCGCCGCTGCTGCCGCTGCTGCTG CTGCTACTGGGCGCGAGTGGCGGCGGCGGCGGGGCGCGCGCGGAGGTGCTGTTCCGCTGCCCGCCC TGCACACCCGAGCGCCTGGCCGCCTGCGGGCCCCCGCCGGTTGCGCCGCCCGCCGCGGTGGCCGCA GTGGCCGGAGGCGCCCGCATGCCATGCGCGGAGCTCGTCCGGGAGCCGGGCTGCGGCTGCTGCTCG GTGTGCGCCCGGCTGGAGGGCGAGGCGTGCGGCGTCTACACCCCGCGCTGCGGCCAGGGGCTGCGC TGCTATCCCCACCCGGGCTCCGAGCTGCCCCTGCAGGCGCTGGTCATGGGCGAGGGCACTTGTGAG AAGCGCCGGGACGCCGAGTATGGCGCCAGCCCGGAGCAGGTTGCAGACAATGGCGATGACCACTCA GAAGGAGGCCTGGTGGAGAACCACGTGGACAGCACCATGAACATGTTGGGCGGGGGAGGCAGTGCT GGCCGGAAGCCCCTCAAGTCGGGTATGAAGGAGCTGGCCGTGTTCCGGGAGAAGGTCACTGAGCAG CACCGGCAGATGGGCAAGGGTGGCAAGCATCACCTTGGCCTGGAGGAGCCCAAGAAGCTGCGACCA CCCCCTGCCAGGACTCCCTGCCAACAGGAACTGGACCAGGTCCTGGAGCGGATCTCCACCATGCGC CTTCCGGATGAGCGGGGCCCTCTGGAGCACCTCTACTCCCTGCACATCCCCAACTGTGACAAGCAT GGCCTGTACAACCTCAAACAGTGCAAGATGTCTCTGAACGGGCAGCGTGGGGAGTGCTGGTGTGTG AACCCCAACACCGGGAAGCTGATCCAGGGAGCCCCCACCATCCGGGGGGACCCCGAGTGTCATCTC 10 TTCTACAATGAGCAGCAGGAGGCTCGCGGGGTGCACACCCAGCGGATGCAGTAG
3’UTR de IGFBP2
ACCGCAGCCAGCCGGTGCCTGGCGCCCCTGCCCCCCGCCCCTCTCCAAACACCGGCAGAAAACGGA GAGTGCTTGGGTGGTGGGTGCTGGAGGATTTTCCAGTTCTGACACACGTATTTATATTTGGAAAGA GACCAGCACCGAGCTCGGCACCTCCCCGGCCTCTCTCTTCCCAGCTGCAGATGCCACACCTGCTCC TTCTTGCTTTCCCCGGGGGAGGAAGGGGGTTGTGGTCGGGGAGCTGGGGTACAGGTTTGGGGAGGG GG AAG AG AAAT T T T T AT T T T T G AAC C C C T G T G T C C C T T T T GC AT AAG AT T AAAGG AAG G AAAAG T A A
5
CDS de MERTK
ATGGGGCCGGCCCCGCTGCCGCTGCTGCTGGGCCTCTTCCTCCCCGCGCTCTGGCGTAGAGCTATC ACTGAGGCAAGGGAAGAAGCCAAGCCTTACCCGCTATTCCCGGGACCTTTTCCAGGGAGCCTGCAA ACTGACCACACACCGCTGTTATCCCTTCCTCACGCCAGTGGGTACCAGCCTGCCTTGATGTTTTCA CCAACCCAGCCTGGAAGACCACATACAGGAAACGTAGCCATTCCCCAGGTGACCTCTGTCGAATCA AAGCCCCTACCGCCTCTTGCCTTCAAACACACAGTTGGACACATAATACTTTCTGAACATAAAGGT GTCAAATTTAATTGCTCAATCAGTGTACCTAATATATACCAGGACACCACAATTTCTTGGTGGAAA GATGGGAAGGAATTGCTTGGGGCACATCATGCAATTACACAGTTTTATCCAGATGATGAAGTTACA GCAATAATCGCTTCCTTCAGCATAACCAGTGTGCAGCGTTCAGACAATGGGTCGTATATCTGTAAG AT GAAAAT AAACAATGAAGAGATCGTGTCTGATCCCATCTACATCGAAGTACAAGGAC T TCC TCAC TTTACTAAGCAGCCTGAGAGCATGAATGTCACCAGAAACACAGCCTTCAACCTCACCTGTCAGGCT GTGGGCCCGCCTGAGCCCGTCAACATTTTCTGGGTTCAAAACAGTAGCCGTGTTAACGAACAGCCT GAAAAATCCCCCTCCGTGCTAACTGTTCCAGGCCTGACGGAGATGGCGGTCTTCAGTTGTGAGGCC CACAATGACAAAGGGCTGACCGTGTCCAAGGGAGTGCAGATCAACATCAAAGCAATTCCCTCCCCA CCAACTGAAGTCAGCATCCGTAACAGCACTGCACACAGCATTCTGATCTCCTGGGTTCCTGGTTTT GATGGATACTCCCCGTTCAGGAATTGCAGCATTCAGGTCAAGGAAGCTGATCCGCTGAGTAATGGC TCAGTCATGATTTTTAACACCTCTGCCTTACCACATCTGTACCAAATCAAGCAGCTGCAAGCCCTG GCTAATTACAGCATTGGTGTTTCCTGCATGAATGAAATAGGCTGGTCTGCAGTGAGCCCTTGGATT CTAGCCAGCACGACTGAAGGAGCCCCATCAGTAGCACCTTT AAATGTCACTGTGTTTCTG AATG AA TCTAGTGATAATGTGGACATCAGATGGATGAAGCCTCCGACTAAGCAGCAGGATGGAGAACTGGTG GGCTACCGGATATCCCACGTGTGGCAGAGTGCAGGGATTTCCAAAGAGCTCTTGGAGGAAGTTGGC CAGAATGGCAGCCGAGCTCGGATCTCTGTTCAAGTCCACAATGCTACGTGCACAGTGAGGATTGCA GCCGTCACCAGAGGGGGAGTTGGGCCCTTCAGTGATCCAGTGAAAATATTTATCCCTGCACACGGT TGGGTAGATTATGCCCCCTCTTCAACTCCGGCGCCTGGCAACGCAGATCCTGTGCTCATCATCTTT GGCTGCTTTTGTGGATTTATTTTGATTGGGTTGATTTTATACATCTCCTTGGCCATCAGAAAAAGA GTCCAGGAGACAAAGTTTGGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATA GCAAAGAAATCCTTCTGTCGGCGAGCCATTGAACTTACCTTACATAGCTTGGGAGTCAGTGAGGAA CTACAAAATAAACTAGAAGATGTTGTGATTGACAGGAATCTTCTAATTCTTGGAAAAATTCTGGGT GAAGGAGAGTTTGGGTCTGTAATGGAAGGAAATCTTAAGCAGGAAGATGGGACCTCTCTGAAAGTG GCAGTGAAGACCATGAAGTTGGACAACTCTTCACAGCGGGAGATCGAGGAGTTTCTCAGTGAGGCA GCGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTGTGTGTATAGAAATGAGC TCTCAAGGCATCCCAAAGCCCATGGTAATTTTACCCTTCATGAAATACGGGGACCTGCATACTTAC TTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGCATATTCCTCTGCAGACACTAT TG AAGT TCATG GTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCT CGAAACTGCATGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATT TACAGTGGCGATTATTACCGCCAAGGCCGCATTGCTAAGATGCCTGTTAAATGGATCGCCATAGAA AGTCTTGCAGACCGAGTCTACACAAGTAAAAGTGATGTGTGGGCATTTGGCGTGACCATGTGGGAA ATAGCTACGCGGGGAATGACTCCCTATCCTGGGGTCCAGAACCATGAGATGTATGACTATCTTCTC CATGGCCACAGGTTGAAGCAGCCCGAAGACTGCCTGGATGAACTGTATGAAATAATGTACTCTTGC TGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTA GAAAGTTTGCCTGACGTTCGGAACCAAGCAGACGTTATTTACGTCAATACACAGTTGCTGGAGAGC TCTGAGGGCCTGGCCCAGGGCTCCACCCTTGCTCCACTGGACTTGAACATCGACCCTGACTCTATA ATTGCCTCCTGCACTCCCCGCGCTGCCATCAGTGTGGTCACAGCAGAAGTTCATGACAGCAAACCT CATGAAGGACGGTACATCCTGAATGGGGGCAGTGAGGAATGGGAAGATCTGACTTCTGCCCCCTCT GCTGCAGTCACAGCTGAAAAGAACAGTGTTTTACCGGGGGAGAGACTTGTTAGGAATGGGGTCTCC TGGTCCCATTCGAGCATGCTGCCCTTGGGAAGCTCATTGCCCGATGAACTTTTGTTTGCTGACGAC TCCTCAGAAGGCTCAGAAGTCCTGATGTGA
10
3’UTR de MERTK
GGAGAGGTGCGGGGAGACATTCCAAAAATCAAGCCAATTCTTCTGCTGTAGGAGAATCCAATTGTA
CCTGATGTTTTTGGTATTTGTCTTCCTTACCAAGTGAACTCCATGGCCCCAAAGCACCAGATGAAT
GTTGTTAAGTAAGCTGTCATTAAAAATACATAATATATATTTATTTAAAGAGAAAAAATATGTGTA
TATCATGGAAAAAGACAAGGATATTTTAATAAAACATTACTTATTTCATTTCACTTATCTTGCATA
TCTTAAAATTAAGCTTCAGCTGCTCCTTGATATTAACATTTGTACAGAGTTGAAGTTGTTTTTTCA
AGTTCTTTTCTTTTTCATGACTATTAAATGTAAAAATATTTGTAAAATGAAATGCCATATTTGACT
TGGCTTCTGGTCTTGATGTATTTGATAAGAATGATTCATTCAATGTTTAAAGTTGTATAACTGATT
AATTTTCTGATATGGCTTCCTAATAAAATATGAATAAGGAAG
CDS de isoforma A de PITPNC1
5
ATGCTGCTGA AAGAGTACCG GATCTGCATG CAGCTGTACA TGATCAGCAA ACACAGCCAT GTCGTCCAGA ATGAGCCCTT TGAGGACCCT CGGGTGTATC TCAACAGCAA ACTGCCTAGT TATGTGACAG AGAAGGCTTG GAACTATTAT TTTCTGCCGA AATTCTCCAT TCATATAGAA GACACCATTT TCGACAATGA AGCCAAAGAC GCCTGCGATG AAATTCCAGA GCGCTACTAC TCAGAGAAGA CAGGACGGGG ACAGTTGAGG ATGTGCTCCT ACAAGCTGGT GACTGTGAAG GAACAATTTG TACACAAGGT GGTCCGAGAC GCATGGGTTG ATGAGTGGTA TGACATGACA ACTCAGGAAG CCACCAACAA GAAAATCGGC ATCCCCCTGC TGCCTTCTTC CGTCCGCAGT TCCACAGACG CACCCGAATT TCTGTCCGTT CCAGAAACTC TCACACTTCC AGACCCTGAG CACTCTTCAG ATAAGCCATG TCGGCCCAAA
CDS de isoforma B de PITPNC1
CCGCTCACCG TAGACGAGTA CAAAATTGGA GAACAGAGTG ACCGGGGAGA AGGGGTGGAG CACCATGGCA ATGGGCAGTT CACCGAGAAG TGGGCTAGAG CTGTTGTCCC CAAAATATTT CCCTACACAA TTACAGAATA CACATGTTCC ACCAAGTATG AGGACAACAA AGGAAGCAAT GTGGAGAGAG AAGTTTGCTT TATTGATATT AAAGAATCTG AGGATCCTAA GCACTTCAAG GAAGGCTGGA GAGAT AG T CA TCAGCCTATC TTTGAGGTCT GGGGGCTTCA GACCAGAGTG ATTCTGCTGA TTGGACATAG ACAGGCTTTT ATGGATGAAG TCCGAGAATT TGAACGAGCC ATTTTCCCAC CTGCAATTTC TATCTCCAGC GCGCCTTCTA GTGCTCCATC CACCCCTCTC CCCAAAGATC GGCCCCGGAA AAAGTCTGCC AAAAAAGCCA CCCTGAATTT ACCCGGCATG TCTGAGTAA
ATGCTGCTGAAAGAGTACCGGATCTGCATGCCGCTCACCGTAGACGAGTACAAAATTGGACAGCTG TACATGATCAGCAAACACAGCCATGAACAGAGTGACCGGGGAGAAGGGGTGGAGGTCGTCCAGAAT GAGCCCTTTGAGGACCCTCACCATGGCAATGGGCAGTTCACCGAGAAGCGGGTGTATCTCAACAGC AAACTGCCTAGTTGGGCTAGAGCTGTTGTCCCCAAAATATTTTATGTGACAGAGAAGGCTTGGAAC TATTATCCCTACAC AATTACAG AATACACATGTTCCTTTCTGCCG AAATTCTCCATTCATATAG AA ACCAAGTATGAGGACAACAAAGGAAGCAATGACACCATTTTCGACAATGAAGCCAAAGACGTGGAG AGAGAAGTTTGCTTTATTGATATTGCCTGCGATGAAATTCCAGAGCGCTACTACAAAGAATCTGAG GATCCTAAGCACTTCAAGTCAGAGAAGACAGGACGGGGACAGTTGAGGGAAGGCTGGAGAGATAGT CATCAGCCTATCATGTGCTCCTACAAGCTGGTGACTGTGAAGTTTGAGGTCTGGGGGCTTCAGACC AGAGTGGAACAATTTGTACACAAGGTGGTCCGAGACATTCTGCTGATTGGACATAGACAGGCTTTT GCATGGGTTGATGAGTGGTATGATATGACAATGGATGATGTTCGGGAATACGAGAAAAACATGCAT GAACAAACCAACATAAAAGTTTGCAATCAGCATTCCTCCCCTGTGGATGACATAGAGAGTCATGCC CAAACAAG TACAT GA
10 3’UTR de PITPNC1
CAATGGAT GAAGTCCGAGAATT TGAACGAGCC AC TCAGGAAGCCACCAACAAGAAAATCGGC AT TT TCCCACCTGCAATTTCTATCTCCAGCATCCCCCTGCTGCCTTCTTCCGTCCGCAGTGCGCCTTCTA GTGCTCCATCCACCCCTCTCTCCACAGACGCACCCGAATTTCTGTCCGTTCCCAAAGATCGGCCCC GG AAAAAG T C T GC C C C AG AAAC T C T C AC AC T T C C AG AC C C T G AG AAAAAAGC C AC C C T G AAT T T AC CCGGCATGCACTCTTCAGATAAGCCATGTCGGCCCAAATCTGAGTAACTTTATATAAATATCTCAT GGGGTTTTATATTTTCATTTGTTGTTGTTGTTTTTTTTTAAGAATCTTCTGATAGAGAAAAAGACT GCTTTGTCACTCAAACATGTTCCTTCGACCTTTCAGTGTGCATGTGACTCAGTAACTTCACATAGA AT AT GAT T C C C T AAG T AT GC T ACACAGCAT CAT AT TAGAT G TAAGAT G TAAGAC T T GCAAAGGACA GAAGGAATCTTCTGTAACCACATAGCTGTATGCCAGAGAGGAAGCCTTGTTATTGGGCATTTGATG AGGTTTGGCATGGACTTCAAGGATAAATGAATGAAAACTTTGCACCACTTTTGTTACAAGGTACGG TAGAAAATAGTGAAGTCAGTTTCCTCTCATCAAATCTAAAATTCTCCAAAATACTCTCAGGCATAA CATACTTAGCTGTTAAATTTTGAACTGCT AATTACT AATACTTG AATACC AATAGTTACTGAGATT CCTATTTTGTGGTTAGTCTGACTCAGGATTTGGAGCCTAATTAACTCTAAACTTTTGAAAATTTTA ATCATC AAGCTATAGAGGCTCC AAGTGC AATTAAT AAT AACTCATTTATACCTTCCACAGAATTTA ATAAAGATTCTACTTGTTTCTGTCTTTTAA
CDS de PSAT1
15 _________________________________________________________________________
ATGGACGCCCCCAGGCAGGTGGTCAACTTTGGGCCTGGTCCCGCCAAGCTGCCGCACTCAGTGTTG
TTAGAGATACAAAAGGAATTATTAGACTACAAAGGAGTTGGCATTAGTGTTCTTGAAATGAGTCAC
AGGTCATCAGATTTTGCCAAGATTATTAACAATACAGAGAATCTTGTGCGGGAATTGCTAGCTGTT
CCAGACAACTATAAGGTGATTTTTCTGCAAGGAGGTGGGTGCGGCCAGTTCAGTGCTGTCCCCTTA
AACCTCATTGGCTTGAAAGCAGGAAGGTGTGCTGACTATGTGGTGACAGGAGCTTGGTCAGCTAAG
GCCGCAGAAGAAGCCAAGAAGTTTGGGACTATAAATATCGTTCACCCTAAACTTGGGAGTTATACA
AAAATTCCAGATCCAAGCACCTGGAACCTCAACCCAGATGCCTCCTACGTGTATTATTGCGCAAAT
GAGACGGTGCATGGTGTGGAGTTTGACTTTATACCCGATGTCAAGGGAGCAGTACTGGTTTGTGAC
ATGTCCTCAAACTTCCTGTCCAAGCCAGTGGATGTTTCCAAGTTTGGTGTGATTTTTGCTGGTGCC CAGAAGAATGTTGGCTCTGCTGGGGTCACCGTGGTGATTGTCCGTGATGACCTGCTGGGGTTTGCC CTCCGAGAGTGCCCCTCGGTCCTGGAATACAAGGTGCAGGCTGGAAACAGCTCCTTGTACAACACG CCTCCATGTTTCAGCATCTACGTCATGGGCTTGGTTCTGGAGTGGATTAAAAACAATGGAGGTGCC GCGGCCATGGAGAAGCTTAGCTCCATCAAATCTCAAACAATTTATGAGATTATTGATAATTCTCAA GGATTCTACGTTTGTCCAGTGGAGCCCCAAAATAGAAGCAAGATGAATATTCCATTCCGCATTGGC AAT GC C AAAGGAGAT GAT GC T T TAG AAAAAAGAT T T C T T GATAAAGC TC T TG AAC TCAATATGTTG TCCTTGAAAGGGCATAGGTCTGTGGGAGGCATCCGGGCCTCTCTGTATAATGCTGTCACAATTGAA GACGTTCAGAAGCTGGCCGCCTTCATGAAAAAATTTTTGGAGATGCATCAGCTATGA
3’UTR de PSAT1
ACACATCCTAACCAGGATATACTCTGTTCTTGAACAACATACAAAGTTTAAAGTAACTTGGGGATG GCTACAAAAAGTTAACACAGTATTTTTCTCAAATGAACATGTTTATTGCAGATTCTTCTTTTTTGA AAGAACAACAGCAAAACATCCACAACTCTGTAAAGCTGGTGGGACCTAATGTCACCTTAATTCTGA CTTGAACTGGAAGCATTTTAAGAAATCTTGTTGCTTTTCTAACAAATTCCCGCGTATTTTGCCTTT GCTGCTACTTTTTCTAGTTAGATTTCAAACTTGCCTGTGGACTTAATAATGCAAGTTGCGATTAAT TATTTCTGGAGTCATGGGAACACACAGCACAGAGGGTAGGGGGGCCCTCTAGGTGCTGAATCTACA CATCTGTGGGGTCTCCTGGGTTCAGCGGCTGTTGATTCAAGGTCAACATTGACCATTGGAGGAGTG GTTTAAGAGTGCCAGGCGAAGGGCAAACTGTAGATCGATCTTTATGCTGTTATTACAGGAGAAGTG ACATACTTTATATATGTTTATATTAGCAAGGTCTGTTTTTAATACCATATACTTTATATTTCTATA CATTTATATTTCT AATAATACAGTTATCACTGATATATGTAGACACTTTTAG AATTTATTAAATCC
ttgaccttgtgcattatagcattccattagcaagagttgtaccccctccccagtcttcgccttcct
CTTTTTAAGCTGTTTTATGAAAAAGACCTAGAAGTTCTTGATTCATTTTTACCATTCTTTCCATAG GTAGAAGAGAAAGTTGATTGGTTGGTTGTTTTTCAATTATGCCATTAAACTAAACATTTCTGTTAA ATTACCCTATCCTTTGTTCTCTACTGTTTTCTTTGTAATGTATGACTACGAGAGTGATACTTTGCT GAAAAGTCTTTCCCCTATTGTTTATCTATTGTCAGTATTTTATGTTGAATATGTAAAGAACATTAA 5 AGTCCTAAAACATCTAA
CDS de PYGB
ATGGCGAAGCCGCTGACGGACAGCGAGAAGCGGAAGCAGATCAGCGTGCGCGGCCTGGCGGGGCTA GGCGACGTGGCCGAGGTGCGGAAGAGCTTCAACCGGCACTTGCACTTCACGCTGGTCAAGGACCGC AATGTGGCCACGCCCCGCGACTACTTCTTCGCGCTGGCGCACACGGTGCGCGACCACCTCGTGGGC CGCTGGATCCGCACGCAGCAGCACTACTACGAGCGCGACCCCAAGCGCATTTATTATCTTTCCCTG GAATTCTACATGGGTCGCACGCTGCAGAACACGATGGTGAACCTGGGCCTTCAGAATGCCTGCGAT GAAGCCATCTATCAGTTGGGGTTAGACTTGGAGGAACTCGAGGAGATAGAAGAAGATGCTGGCCTT GGGAATGGAGGCCTGGGGAGGCTGGCAGCGTGTTTCCTTGACTCAATGGCTACCTTGGGCCTGGCA GCATACGGCTATGGAATCCGCTATGAATTTGGGATTTTTAACCAGAAGATTGTCAATGGCTGGCAG GTAGAGGAGGCCGATGACTGGCTGCGCTACGGCAACCCCTGGGAGAAAGCGCGGCCTGAGTATATG CTTCCCGTGCACTTCTACGGACGCGTGGAGCACACCCCCGACGGCGTGAAGTGGCTGGACACACAG GTGGTGCTGGCCATGCCCTACGACACCCCAGTGCCCGGCTACAAGAACAACACCGTCAACACCATG CGGCTGTGGTCCGCCAAGGCTCCCAACGACTTCAAGCTGCAGGACTTCAACGTGGGAGACTACATC GAGGCGGTCCTGGACCGGAACTTGGCTGAGAACATCTCCAGGGTCCTGTATCCAAATGATAACTTC TTTGAGGGGAAGGAGCTGCGGCTGAAGCAGGAGTACTTCGTGGTGGCCGCCACGCTCCAGGACATC ATCCGCCGCTTCAAGTCGTCCAAGTTCGGCTGCCGGGACCCTGTGAGAACCTGTTTCGAGACGTTC CCAGACAAGGTGGCCATCCAGCTGAACGACACCCACCCCGCCCTCTCCATCCCTGAGCTCATGCGG ATCCTGGTGGACGTGGAGAAGGTGGACTGGGACAAGGCCTGGGAAATCACGAAGAAGACCTGTGCA TACACCAACCACACTGTGCTGCCTGAGGCCTTGGAGCGCTGGCCCGTGTCCATGTTTGAGAAGCTG CTGCCGCGGCACCTGGAGATAATCTATGCCATCAACCAGCGGCACCTGGACCACGTGGCCGCGCTG TTTCCCGGCGATGTGGACCGCCTGCGCAGGATGTCTGTGATCGAGGAGGGGGACTGCAAGCGGATC AACATGGCCCACCTGTGTGTGATTGGGTCCCATGCTGTCAATGGTGTGGCGAGGATCCACTCGGAG AT C G T GAAACAG TCGGTCTTTAAGGAT T T T TAT GAAC TGGAGCCAGAGAAGT TCCAGAAT AAGACC AATGGCATCACCCCCCGCCGGTGGCTGCTGCTGTGCAACCCGGGGCTGGCCGATACCATCGTGGAG AAAATTGGGGAGGAGTTCCTGACTGACCTGAGCCAGCTGAAGAAGCTGCTGCCGCTGGTCAGTGAC GAGGTGTTCATCAGGGACGTGGCCAAGGTCAAACAGGAGAACAAGCTCAAGTTCTCGGCCTTCCTG GAGAAGGAG TACAAGG T GAAGAT CAAC CCCTCCTCCATGTTCGATGTGCATGTG AAGAGGATCCAC GAGTACAAGCGGCAGCTGCTCAACTGCCTGCACGTCGTCACCCTGTACAATCGAATCAAGAGAGAC CCGGCCAAGGCTTTTGTGCCCAGGACTGTTATGATTGGGGGCAAGGCAGCGCCCGGTTACCACATG GCCAAGCTGATCATCAAGTTGGTCACCTCCATCGGCGACGTCGTCAATCATGACCCAGTTGTGGGT
GACAGGTTGAAAGTGATCTTCCTGGAGAACTACCGTGTGTCCTTGGCTGAGAAAGTGATCCCGGCC
GCTGATCTGTCGCAGCAGATCTCCACTGCAGGCACCGAGGCCTCAGGCACAGGCAACATGAAGTTC
ATGCTCAACGGGGCCCTCACCATCGGCACCATGGACGGCGCCAACGTGGAGATGGCCGAGGAGGCC
GGGGCCGAGAACCTCTTCATCTTCGGCCTGCGGGTGGAGGATGTCGAGGCCTTGGACCGGAAAGGG
TACAATGCCAGGGAGTACTACGACCACCTGCCCGAGCTGAAGCAGGCCGTGGACCAGATCAGCAGT
GGCTTTTTTTCTCCCAAGGAGCCAGACTGCTTCAAGGACATCGTGAACATGCTGATGCACCATGAC
AGGTTCAAGGTGTTTGCAGACTATGAAGCCTACATGCAGTGCCAGGCACAGGTGGACCAGCTGTAC
CGGAACCCCAAGGAGTGGACCAAGAAGGTCATCAGGAACATCGCCTGCTCGGGCAAGTTCTCCAGT
GACCGGACCATCACGGAGTATGCACGGGAGATCTGGGGTGTGGAGCCCTCCGACCTGCAGATCCCG
CCCCCCAACATCCCCCGGGACTAG
3’UTR de PYGB
GCACACCCTGCCTTGGCGGGACCAGCGGGCATTTGTTTTCTTGCTGACTTTGCACCTCCTTTTTTC CCCAAACACTTTGCCAGCCACTGGTGGTCCCTGCTTTTCTGAGTACCATGTTTCCAGGAGGGGCCA TGGGGGTCAGGGTGGTTTTGAGAGAGCAGGGTAAGGAAGGAATGTGCTAGAAGTGCTCCTAGTTTC TTGTAAAGGAAGCCAGAGTTGACAGTACAAAGGGTCGTGGCCAGCCCTGCAGCTTCAGCACCTGCC CCACCCAGAGTGGGAGTCAGGTGGAGCCACCTGCTGGGCTCCCCCAGAACTTTGCACACATCTTGC TATGTATTAGCCGATGTCTTTAGTGTTGAGCCTCTGGATTCTGGGGTCTGGGCCAGTGGCCATAGT GAAGCCTGGGAATGAGTGTTACTGCAGCATCTGGGCTGCCAGCCACAGGGAAGGGCCAAGCCCCAT GTAGCCCCAGTCATCCTGCCCAGCCCTGCCTCCTGGCCATGCCGGGAGGGGTCGGATCCTCTAGGC ATCGCCTTCACAGCCCCCTGCCCCCTGCCCTCTGTCCTGGCTCTGCACCTGGTATATGGGTCATGG ACCCAGATGGGGCTTTCCCTTTGTAGCCATCCAATGGGCATTGTGTGGGTGCTTGGAACCCGGGAT GACTGAGGGGGACACTGGAGTGGGTGCTTGTGTCTGCTGTCTCAGAGGCCTTGGTCAGGATGAAGT TGGCTGACACAGCTTAGCTTGGTTTTGCTTATTCAAAAGAGAAAATAACTACACATGGAAATGAAA CTAGCTGAAGCCTTTTCTTGTTTTAGCAACTGAAAATTGTACTTGGTCACTTTTGTGCTTGAGGAG GCCCATTTTCTGCCTGGCAGGGGGCAGGTCTGTGCCCTCCCGCTGACTCCTGCTGTGTCCTGAGGT GCATTTCCTGTTGTACACACAAGGGCCAGGCTCCATTCTCCCTCCCTTTCCACCAGTGCCACAGCC TCGTCTGGAAAAAGGACCAGGGGTCCCGGAGGAACCCATTTGTGCTCTGCTTGGACAGCAGGCCTG GCACTGGGAGGTGGGGGTGAGCCCCTCACAGCCTTGCCCCTCCCCAAGGCTGGCAACCTGCCTCCC ATTGCCCAAGAGAGAGGGCAGGGAACAGGCTACTGTCCTTCCCTGTGGAATTGCCGAGAAATCTAG CACCTTGCATGCTGGATCTGGGCTGCGGGGAGGCTCTTTTTCTCCCTGGCCTCCAGTGCCCACCAG GAGGATCTGCGCACGGTGCACAGCCCACCAGAGCACTACAGCCTTTTATTGAGTGGGGCAAGTGCT GGGCTGTGGTCGTGCCCTGACAGCATCTTCCCCAGGCAGCGGCTCTGTGGAGGAGGCCATACTCCC CTAGTTGGCCACTGGGGCCACCACCCTGACCACCACTGTGCCCCTCATTGTTACTGCCTTGTGAGA 5 TAAAAACTGATTAAACCTTTGTGGCTGTGGTTGGCTGA
CDS de SHMT2
ATGCTGTACTTCTCTTTGTTTTGGGCGGCTCGGCCTCTGCAGAGATGTGGGCAGCTGGTCAGGATG GCCATTCGGGCTCAGCACAGCAACGCAGCCCAGACTCAGACTGGGGAAGCAAACAGGGGCTGGACA GGCCAGGAGAGCCTGTCGGACAGTGATCCTGAGATGTGGGAGTTGCTGCAGAGGGAGAAGGACAGG CAGTGTCGTGGCCTGGAGCTCATTGCCTCAGAGAACTTCTGCAGCCGAGCTGCGCTGGAGGCCCTG GGGTCCTGTCTGAACAACAAGTACTCGGAGGGTTATCCTGGCAAGAGATACTATGGGGGAGCAGAG GTGGTGGATGAAATTGAGCTGCTGTGCCAGCGCCGGGCCTTGGAAGCCTTTGACCTGGATCCTGCA CAGTGGGGAGTCAATGTCCAGCCCTACTCCGGGTCCCCAGCCAACCTGGCCGTCTACACAGCCCTT CTGCAACCTCACGACCGGATCATGGGGCTGGACCTGCCCGATGGGGGCCATCTCACCCACGGCTAC ATGTCTGACGTCAAGCGGATATCAGCCACGTCCATCTTCTTCGAGTCTATGCCCTATAAGCTCAAC CCCAAAACTGGCCTCATTGACTACAACCAGCTGGCACTGACTGCTCGACTTTTCCGGCCACGGCTC ATCATAGCTGGCACCAGCGCCTATGCTCGCCTCATTGACTACGCCCGCATGAGAGAGGTGTGTGAT GAAGTCAAAGCACACCTGCTGGCAGACATGGCCCACATCAGTGGCCTGGTGGCTGCCAAGGTGATT CCCTCGCCTTTCAAGCACGCGGACATCGTCACCACCACTACTCACAAGACTCTTCGAGGGGCCAGG TCAGGGCTCATCTTCTACCGGAAAGGGGTGAAGGCTGTGGACCCCAAGACTGGCCGGGAGATCCCT TACACATTTGAGGACCGAATCAACTTTGCCGTGTTCCCATCCCTGCAGGGGGGCCCCCACAATCAT GCCATTGCTGCAGTAGCTGTGGCCCTAAAGCAGGCCTGCACCCCCATGTTCCGGGAGTACTCCCTG CAGGTTCTGAAGAATGCTCGGGCCATGGCAGATGCCCTGCTAGAGCGAGGCTACTCACTGGTATCA GGTGGTACTGACAACCACCTGGTGCTGGTGGACCTGCGGCCCAAGGGCCTGGATGGAGCTCGGGCT GAGCGGGTGCTAGAGCTTGTATCCATCACTGCCAACAAGAACACCTGTCCTGGAGACCGAAGTGCC ATCACACCGGGCGGCCTGCGGCTTGGGGCCCCAGCCTTAACTTCTCGACAGTTCCGTGAGGATGAC TTCCGGAGAGTTGTGGACTTTATAGATGAAGGGGTCAACATTGGCTTAGAGGTGAAGAGCAAGACT GCCAAGCTCCAGGATTTCAAATCCTTCCTGCTTAAGGACTCAGAAACAAGTCAGCGTCTGGCCAAC 10 CTCAGGCAACGGGTGGAGCAGTTTGCCAGGGCCTTCCCCATGCCTGGTTTTGATGAGCATTGA
3’UTR de SHMT2
AGGCACCTGGGAAATGAGGCCCACAGACTCAAAGTTACTCTCCTTCCCCCTACCTGGGCCAGTGAA
ATAGAAAGCCTTTCTATTTTTTGGTGCGGGAGGGAAGACCTCTCACTTAGGGCAAGAGCCAGGTAT
AGTCTCCCTTCCCAGAATTTGTAACTGAGAAGATCTTTTCTTTTTCCTTTTTTTGGTAACAAGACT
TAGAAGGAGGGCCCAGGCACTTTCTGTTTGAACCCCTGTCATGATCACAGTGTCAGAGACGCGTCC
TCTTTCTTGGGGAAGTTGAGGAGTGCCCTTCAGAGCCAGTAGCAGGCAGGGGTGGGTAGGCACCCT
CCTTCCTGTTTTTATCTAATAAAATGCTAACCTGCCCTGAGTTTCCATTACTGTGGGTGGGGTTCC
CCTGGGCCAAACAGTGATTTGTCTCCCTCAATGTGTACACCGCTCCGCTCCCACCACCGCTACCAC
AAGGACCCCCGGGGCTGCAGCCTCCTCTTTCTGTCTCTGATCAGAGCCGACACCAGACGTGATTAG
CAGGCGCAGCAAATTCAATTTGTTAAATGAAATTGTATTTTG
CDS de VIPR1
ATGCGCCCGCCAAGTCCGCTGCCCGCCCGCTGGCTATGCGTGCTGGCAGGCGCCCTCGCCTGGGCC CTTGGGCCGGCGGGCGGCCAGGCGGCCAGGCTGCAGGAGGAGTGTGACTATGTGCAGATGATCGAG GTGCAGCACAAGCAGTGCCTGGAGGAGGCCCAGCTGGAGAATGAGACAATAGGCTGCAGCAAGATG TGGGACAACCTCACCTGCTGGCCAGCCACCCCTCGGGGCCAGGTAGTTGTCTTGGCCTGTCCCCTC ATCTTCAAGCTCTTCTCCTCCATTCAAGGCCGCAATGTAAGCCGCAGCTGCACCGACGAAGGCTGG ACGCACCTGGAGCCTGGCCCGTACCCCATTGCCTGTGGTTTGGATGACAAGGCAGCGAGTTTGGAT GAGCAGCAGACCATGTTCTACGGTTCTGTGAAGACCGGCTACACCATTGGCTACGGCCTGTCCCTC GCCACCCTTCTGGTCGCCACAGCTATCCTGAGCCTGTTCAGGAAGCTCCACTGCACGCGGAACTAC ATCCACATGCACCTCTTCATATCCTTCATCCTGAGGGCTGCCGCTGTCTTCATCAAAGACTTGGCC CTCTTCGACAGCGGGGAGTCGGACCAGTGCTCCGAGGGCTCGGTGGGCTGTAAGGCAGCCATGGTC TTTTTCCAATATTGTGTCATGGCTAACTTCTTCTGGCTGCTGGTGGAGGGCCTCTACCTGTACACC CTGCTTGCCGTCTCCTTCTTCTCTGAGCGGAAGTACTTCTGGGGGTACATACTCATCGGCTGGGGG GTACCCAGCACATTCACCATGGTGTGGACCATCGCCAGGATCCATTTTGAGGATTATGGGTGCTGG GACACCATCAACTCCTCACTGTGGTGGATCATAAAGGGCCCCATCCTCACCTCCATCTTGGTAAAC TTCATCCTGTTTATTTGCATCATCCGAATCCTGCTTCAGAAACTGCGGCCCCCAGATATCAGGAAG AGTGACAGCAGTCCATACTCAAGGCTAGCCAGGTCCACACTCCTGCTGATCCCCCTGTTTGGAGTA CACTACATCATGTTCGCCTTCTTTCCGGACAATTTTAAGCCTGAAGTGAAGATGGTCTTTGAGCTC GTCGTGGGGTCTTTCCAGGGTTTTGTGGTGGCTATCCTCTACTGCTTCCTCAATGGTGAGGTGCAG GCGGAGCTGAGGCGGAAGTGGCGGCGCTGGCACCTGCAGGGCGTCCTGGGCTGGAACCCCAAATAC CGGCACCCGTCGGGAGGCAGCAACGGCGCCACGTGCAGCACGCAGGTTTCCATGCTGACCCGCGTC 5 AGCCCAGGTGCCCGCCGCTCCTCCAGCTTCCAAGCCGAAGTCTCCCTGGTCTGA
3’UTR de VIPR1
CCACCAGGATCCCAGGGGCCCAAGGCGGCCCCTCCCGCCCCTTCCCACTCACCCCGGCAGACGCCG GGGACAGAGGCCTGCCCGGGCGCGGCCAGCCCCGGCCCTGGGCTCGGAGGCTGCCCCCGGCCCCCT GGTCTCTGGTCCGGACACTCCTAGAGAACGCAGCCCTAGAGCCTGCCTGGAGCGTTTCTAGCAAGT GAGAGAGATGGGAGCTCCTCTCCTGGAGGATTGCAGGTGGAACTCAGTCATTAGACTCCTCCTCCA AAGGCCCCCTACGCCAATCAAGGGCAAAAAGTCTACATACTTTCATCCTGACTCTGCCCCCTGCTG GCTCTTCTGCCCAATTGGAGGAAAGCAACCGGTGGATCCTCAAACAACACTGGTGTGACCTGAGGG CAGAAAGGTTCTGCCCGGGAAGGTCACCAGCACCAACACCACGGTAGTGCCTGAAATTTCACCATT GCTGTCAAGTTCCTTTGGGTTAAGCATTACCACTCAGGCATTTGACTGAAGATGCAGCTCACTACC CTATTCTCTCTTTACGCTTAGTTATCAGCTTTTTAAAGTGGGTTATTCTGGAGTTTTTGTTTGGAG AGCACACCTATCTTAGTGGTTCCCCACCGAAGTGGACTGGCCCCTGGGTCAGTCTGGTGGGAGGAC GGTGCAACCCAAGGACTGAGGGACTCTGAAGCCTCTGGGAAATGAGAAGGCAGCCACCAGCGAATG CTAGGTCTCGGACTAAGCCTACCTGCTCTCCAAGTCTCAGTGGCTTCATCTGTCAAGTGGGATCTG TCACACCAGCCATACTTATCTCTCTGTGCTGTGGAAGCAACAGGAATCAAGAGCTGCCCTCCTTGT CCACCCACCTATGTGCCAACTGTTGTAACTAGGCTCAGAGATGTGCACCCATGGGCTCTGACAGAA AGCAGATAC C T CAC C C T GC TACACATACAGGAT T T G AAC T CAGAT C T G T C T GATAGGAAT G T GAAA GCACGGACTCTTACTGCTAACTTTTGTGTATCGTAACCAGCCAGATCCTCTTGGTTATTTGTTTAC CACTTGTATTATTAATGCCATTATCCCTGAATCCCCCTTGCCACCCCACCCTCCCTGGAGTGTGGC TGAGGAGGCCTCCATCTCATGTATCATCTGGATAGGAGCCTGCTGGTCACAGCCTCCTCTGTCTGC CCTTCACCCCAGTGGCCACTCAGCTTCCTACCCACACCTCTGCCAGAAGATCCCCTCAGGACTGCA 10 ACAGGCTTGTGCAACAATAAATGTTGGCTTGGA
Se transfectaron celulas MDA-MB-231 que expresan o bien una horquilla de control o bien un miR-126 de seleccion como diana en horquilla con el constructo indicador espeafico respectivo. Treinta horas tras la transfeccion, se lisaron las celulas y se determino la razon de expresion de luciferasa de Renilla con respecto a la de luciernaga 15 usando un ensayo de luciferasa dual (E1910, PROMEGA). Las secuencias del cebador de clonacion se muestran en la tabla 2 a continuacion.
Tabla 2. Cebadores de clonacion
Gene
Forward Reverse
3’UTR de ABCB9
CCGGCCCTCGAGTGGGGGGCCCCTGCTTCTC C CCGGCCGCGGCCGCTTAGGGGTAAGAGG TAGTAC
CDS de ABCB9
CCGGCCCTCGAGATGCGGCTGTGGAAGGCGG T CCGGCCGCGGCCGCTCAGGCCTTGTGAC TGCCGT
3’UTR de IGFBP2
CCGGCCCTCGAGACCGCAGCCAGCCGGTGCC T CCGGCCGCGGCCGCTTACTTTTCCTTCC TTTAAT
CDS de BP2
CCGGCCCTCGAG ATGCTGCCGAGAGTGGGCTG CCGGCCGCGGCCGCCTACTGCATCCGCT GGGTGT
3’UTR de MERTK
CCGGCCCTCGAGGGAGAGGTGCGGGGAGACA T CCGGCCGCGGCCGCCTTCCTTATTCATA TTTTAT
CDS de MERTK
CCGGCCCTCGAGATGGGGCCGGCCCCGCTGC C CCGGCCGCGGCCGCTCACATCAGGACTT CTGAGC
3’UTR de PITPNC1
CCGGCCCTCGAG CAATGGATGAAGTCCGAGAA CCGGCCGCGGCCGCTTAAAAGACAGAAA CAAGTA
CDS de PITPNC1
CCGGCCCTCGAG ATGCTGCTGAAAGAGTACCG CCGGCCGCGGCCGCTCATGTACTTGTTT GGGCAT
3’UTR de PSAT1
CCGGCCCTC GAG AC AC AT C C T AAC C AGG AT A T CCGGCCGCGGCCGCTTAGATGTTTTAGG ACTTTA
CDS de PSAT1
CCGGCCGCGGCCGCTCATAGCTGATGCATCT CCA CCGGCCCTCGAGATGGACGCCCCCAGGC AGGT
3’UTR de PYGB
CCGGCCCTCGAGGCACACCCTGCCTTGGCGG G CCGGCCGCGGCCGCTCAGCCAACCACAG CCACAA
CDS de PYGB
CCGGCCGTTTAAACATGGCGAAGCCGCTGAC GGA CCGGCCGCGGCCGCCTAGTCCCGGGGGA TGTTGG
3’UTR de SHMT2
CCGGCCCTCGAGAGGCACCTGGGAAATGAGG C CCGGCCGCGGCCGCCAAAATACAATTTC ATTTAA
CDS de SHMT2
CCGGCCCTCGAGATGCTGTACTTCTCTTTGT T CCGGCCGCGGCCGCTCAATGCTCATCAA AACCAG
CDS de VIPR
CCGGCCGTTTAAACTCAGACCAGGGAGACTT CGG CCGGCCCTCGAGATGCGCCCGCCAAGTC CGCT
3’UTR de VIPR1
CCGGCCCTCGAGCCACCAGGATCCCAGGGGC C CCGGCCGCGGCCGCTCCAAGCCAACATT TATTGT
Se identificaron los posibles sitios de miR-126 en los genes mediante la alineacion con la secuencia de miR-126 complementaria 5-TTACTCACGGTACGA-3, y se realizo mutagenesis usando el kit de mutagenesis dirigida a multiples sitios QUICKCHANGE (200514, AGILENT TECHNOLOGIES, Santa Clara, CA). Basandose en el buscador 5 de genomas UCSC, se muto la 3’UTR de MERTK en la posicion 5 (de GTT a CAC), se muto la 3’UTR de IGFBP2 en la posicion 246 (de GGT a CAC), se muto la CDS de PITPNC1 en la posicion 709 (de TAC a GTA) del codon inicial y se muto la CDS de SHMT2 en la posicion 1126 (de GGT a CAC). Los cebadores de mutagenesis se muestran en la tabla 3 a continuacion
10 Tabla 3. Cebadores de mutagenesis_____________________________________________________________________
Gen
Directo
3’UTR de IGFBP2
AAGGGGGTTGTGGTCGGGGAGCTGGCACACAGGTTTGGGGAGGGGGAAGAGAA
3’UTR de MERTK
ATTCTAGGCGATCGCTCGAGGGAGACACGCGGGGAGACATTCCAAAAATCAAG
CDS de PITPNC1
T AT GACAATGGAT GATGTTCGGGAAGT AGAGAAAAACAT GCAT GAACAAACCA
CDS de SHMT2
GCGAGGCTACTCACTGGTATCAGGTCACACTGACAACCACCTGGTGCTGGTGG
Inverso
3’UTR de IGFBP2
TT CT CTT CCCCCTCCCCAAACCTGT GT GCCAGCT CCCCGACCACAACCCCCTT
3’UTR de MERTK
CTTGATTTTTGGAATGTCTCCCCGCGTGTCTCCCTCGAGCGATCGCCTAGAAT
CDS de PITPNC1
TGGTTTGTT CATGCAT GTTTTT CT CT ACTT CCCGAACAT CAT CCATTGTCAT A
CDS de SHMT2
CCACCAGCACCAGGTGGTTGTCAGTGTGACCTGATACCAGTGAGTAGCCTCGC
Proliferacidn de celulas cancerosas
5
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40
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60
65
Se sembraron celulas LM2 (2,5 X 104) que expresan una horquilla de control o IGFBP2, PITPNC1 o MERTK de seleccion como diana en horquillas cortas por triplicado en placas de 6 pocillos y se contaron las celulas viables a los 5 dias tras la siembra.
Histologia
Se prepararon pulmones mediante fijacion por perfusion con paraformaldehido al 4% infundido a traves del sistema vascular y a traves de la traquea. Tras la escision, se colocaron los pulmones en paraformaldehido al 4% durante la noche y se incluyeron en parafina. Cinco minutos antes de la fijacion, se inyectaron 100 mg de lectina biotinilada (B- 1175, VECTOR LABORATORIES) en la circulacion a traves de la vena de la cola. Se tineron cortes en parafina de cinco micrometros de grosor con anticuerpos primarios contra MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank, Universidad de Iowa, IA), vimentina (VP-V684, VECTOR LABORATORIES) y con avidina marcada con FITC (B- 1175, VECTOR LABORATORIES) para la deteccion de la lectina biotinilada inyectada. Los anticuerpos primarios se detectaron usando diversos anticuerpos secundarios conjugados con el colorante Alexa Flour. Se obtuvo la fluorescencia usando un microscopio confocal de barrido laser ZEISS (LSM 510). Para determinar la vascularizacion de los nodulos metastasicos, se cuantificaron las senales de MECA-32 y lectina usando IMAGEJ mientras que las extensiones de los nodulos metastasicos se determinaron a traves de cotincion con vimentina humana. Se determino el area colectiva cubierta por vasos restando el fondo (radio de bola rodante de 1 pixel) y usando un umbral predeterminado como punto de corte. La densidad de vasos se da como el porcentaje del area cubierta por los vasos sanguineos en comparacion con el area total del nodulo metastasico. Un nodulo metastasico se definio por un area positiva para tincion con vimentina con un area total por encima de 2000 pm2.
Se escindieron tumores de paniculo adiposo mamario y se sumergieron en paraformaldehido al 4% durante 24 horas. Se incluyo el tejido fijado en parafina y se corto en cortes de 5 pm de grosor. Se realizo inmunodeteccion usando anticuerpos dirigidos hacia MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank), Mac-2 (CL8942AP, Cederlane, Burlington) y CD45 (550539, BD Biosciences). La deteccion de anticuerpos primarios se realizo usando diversos anticuerpos secundarios biotinilados (Vector Laboratories). Posteriormente se amplifico la senal usando el kit ABC (Vector Laboratories) y se detecto usando DAB (3,3’-diaminobencidina). Antes del montaje, los portaobjetos se contratineron con hematoxilina.
Se determino la permeabilidad del dextrano tal como se describe en Arnold et al., 2010 Dis Model Mech 3 (1-2), 57 (2010) con ligeras modificaciones. Brevemente, se infundio un bolo intravenoso de rodamina B 10 mg/ml marcada con dextrano de bajo peso molecular (1 x 104 kDa: D1824, INVITROGEN) en PBS esteril. Quince minutos despues, se anestesio a los ratones y se perfundieron los pulmones con OCT, se extrajeron y se congelaron en hielo seco. Se realizo un corte de diez micrometros y se midio la permeabilidad del dextrano dentro de los nodulos metastasicos (tal como se determina mediante tincion con vimentina) mediante microscopia de fluorescencia. Usando IMAGEJ, se uso un umbral preseleccionado para determinar los niveles de permeabilidad del dextrano. Los resultados se presentan como el porcentaje medio del area de umbral dentro del nodulo metastasico.
ELISA
Se determinaron los niveles de IGBFP2 en medios acondicionados usando un ELISA de IGFBP2 (AAHBLG-1-2, RAYBIOTECH, Norgross, GA).
Inmunotransferencia de tipo Western
Se prepararon lisados celulares de de celulas MDA-MB-231 lisando celulas en 1 ml de tampon RIPA helado que contenia inhibidores de proteasa (ROCHE, Mannheim, Alemania). Se prepararon medios acondicionados incubando celulas MDA-MB-231 en medios libres de suero durante 24 horas. Entonces se concentraron los medios veinte veces mediante filtracion por centrifugacion. Posteriormente se separaron 40 pg de proteina en un SDS-PAGE al 412% y se transfirieron a una membrana de PVDF. Se uso un anticuerpo monoclonal contra MERTK humana (CVO- 311, CAVEO THERAPEUTICS, Aurora, CO) para detectar MERTK.
Analisis de supervivencia libre de metastasis
Tras identificar los ocho genes regulador por miR-126 a traves de un analisis integrador, se determino si la expresion de estos genes en agregado se correlaciona con metastasis clinica humana. Se usaron datos de microalineamientos publicados de series de UCSF46, NKI47 y MSKCC13 para obtener valores de expresion a nivel de sonda. Para los genes que estaban representados por multiples sondas, se usaron sondas que presentaban una intensidad de senal suficiente, asi como el mayor coeficiente de variacion (en su mayor parte informativo) en un conjunto de datos independiente. Cada cancer de mama se clasifico como positivo para rasgo distintivo de miR-126 si la suma de puntuaciones Z para los valores de expresion de los 8 genes era mayor que la media de la poblacion. Se generaron curvas de supervivencia libre de metastasis de Kaplan-Meier usando el software GRAPHPAD PRISM 5 (GRAPHPAD Software, Inc., LA Jolla, CA). Se determino la significacion estadistica para las diferencias entre curvas de supervivencia de pacientes usando la prueba de rangos logaritmicos de Mantel-Cox usando el software
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65
GRAPHPAD Prism 5.
Analisis de la densidad de vasos
Se uso la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar la significacion de la diferencia en la densidad de vasos sanguineos para tincion tanto de MECA-32 y de lectina usando el software disponible publicamente en physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html.
Ejemplo 2: Colonizacion metastasica sistemica suprimida de mIR-126 endogeno
En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para analizar la evolucion metastasica en la practica de perdida de funcion de miR-126. Esto permitio comparar acontecimientos metastasicos in vivo entre celulas de control y con silenciamiento de miR-126 (KD) y revelar la influencia de miR-126 endogeno sobre la colonizacion metastasica.
Se genero una linea celular de cancer de mama MDA-231 en la que miR-126 estaba silenciado de manera notable (silenciamiento del 94%; figura 7) usando el sistema de inhibicion de microARN anti sentido de miR-Zip. Se inyectaron miR-126 KD y celulas KD de control en ratones inmunodeficientes y se evaluaron para determinar la capacidad de colonizacion metastasica en ensayos de colonizacion en la vena de la cola. El silenciamiento de miR- 126 en celulas escasamente metastasicas aumento la colonizacion metastasica pulmonar en 4,2 veces (P = 0,0073) tal como se evaluo mediante obtencion de imagenes de bioluminiscencia cuantitativa (figura 1a) y aumento espectacularmente la colonizacion metastasica en histologia macroscopica (figura 1a). La inyeccion intracardiaca de MDA miR-126 KD y celulas KD de control revelo adicionalmente que miR-126 endogeno suprime la metastasis sistemica tal como se pone de manifiesto por la colonizacion potenciada de multiples organos tales como el cerebro y el hueso en la practica de silenciamiento de miR-126 (figura 1b-c; P = 0,0232(b), P = 0,0119(c)).
A continuacion, se llevaron a cabo ensayos para examinar hasta que punto en aumento espectacular en la colonizacion metastasica observada con la inhibicion de miR-126 se debia al efecto de miR-126 sobre el crecimiento tumoral. Para este fin, se inyectaron miR-126 KD y celulas KD de control en los paniculos adiposos mamarios de ratones inmunodeficientes y se monitorizo el volumen tumoral. La inhibicion de miR-126 condujo a un aumento modesto (39,4%) en el volumen tumoral (figura 1d) que fue de un orden de magnitud mas pequeno que el efecto de la inhibicion de miR-126 sobre la potenciacion de la metastasis, lo que indica que el efecto de miR-126 sobre la metastasis no es simplemente el resultado de su efecto sobre la supresion del crecimiento tumoral.
Para entender mejor el papel de este miARN sobre la colonizacion metastasica, se cuantificaron los numeros y los tamanos de todas las metastasis a traves del analisis de imagenes de pulmones de ratones de control y con miR- 126 KD (figura 1e). Esto revelo un aumento sustancial en el numero total de nodulos metastasicos en pulmones con miR-126 KD en relacion con los pulmones de control (13,6±3,2 frente a 4,9±1,8; P = 0,03). Este aumento se observo para nodulos tanto pequenos como grandes (figura 1e) y reflejo el aumento en el numero de metastasis en otros organos (figura 1c). De manera importante, el aumento en el numero de nodulos fue mas pronunciado para los tamanos de nodulo mas pequenos en relacion con los mas grandes, lo que concuerda principalmente con un aumento en el inicio de metastasis mas que con un aumento en el crecimiento de la metastasis establecida. Sin restringirse a la teoria, si el silenciamiento de miR-126 proporciona una ventaja de inicio de metastasis para las
celulas cuando inicial la metastasis en el nicho metastasico, su induccion en la fase inicial de formacion de
metastasis reducira el numero de nodulos metastasicos. Para someter esto a prueba, se indujo la expresion de miR- 126 en celulas de cancer de mama metastasicas (LM2) que mostraban silenciamiento de este miARN usando un sistema tet-on condicionado. De acuerdo con esto, el restablecimiento de la expresion de miR-126 a celulas LM2 una vez que se han extravasado en el pulmon (dia 3) redujo significativamente la colonizacion metastasica (figura 1f). Por tanto, el restablecimiento de la expresion de miR-126 en esta fase temprana de inicio de metastasis en el nicho redujo significativamente el numero de nodulos metastasicos visualizados en el dia 49.
Los hallazgos anteriores demostraron que el silenciamiento de miR-126 potencia la eficacia de formacion de
metastasis que conduce a un mayor numero de metastasis. Los hallazgos revelaron por tanto que miR-126
endogeno es un supresor del inicio metastasico y la colonizacion metastasica.
Ejemplo 3: miR-126 suprime el reclutamiento endotelial metastasico por celulas de cancer de mama
Los hallazgos anteriores sugieren que el silenciamiento de miR-126 puede dar a las celulas metastasicas y a la metastasis incipiente una ventaja durante la colonizacion metastasica. Aunque se considerar la base de esta ventaja, se observo que las metastasis con silenciamiento de miR-126 mostraban densidades de vasos superiores en visualizacion microscopica de cortes tisulares de pulmon con H&E. Para cuantificar esto, se realizo co- inmunotincion para vimentina humana, que marca celulas de cancer de mama MDA-231, y el marcador endotelial MECA-32, que permitia cuantificar la densidad endotelial dentro de nodulos metastasicos en pulmones de ratones a los que se inyectaron o bien celulas de cancer de mama de control o con miR-126 KD. El analisis de imagenes y la cuantificacion revelaron que las metastasis derivadas de celulas miR-126 KD tenian una densidad endotelial significativamente suprior (figura 2a; aumento del 35%; P= 0,02).
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10
15
20
25
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65
Para determinar si la densidad endotelial potenciada en metastasis de miR-126 KD representa vasos funcionales, se inyecto lectina de union a azucar en la circulacion de ratones antes de las extracciones de pulmon, y posteriormente se tineron para determinar la lectina inyectada. La citoquimica de lectina revelo que la metastasis de silenciamiento de miR-126 aumento la densidad de vasos sanguineos funcionales (figura 2b; aumento del 33%; P = 0,001).
Finalmente, se busco determinar si miR-126 regula la perfusion hemodinamica a metastasis a traves de perfusion intravenosa y posterior visualizacion de dextrano de bajo peso molecular (1 x 104 kDa). De hecho, la metastasis de miR-126 KD presento una perfusion significativamente aumentada en relacion con la metastasis de control (figura 8; P = 0,02).
Por tanto, estos metodos independientes y complementarios revelan que miR-126 suprime la perfusion y la angiogenesis metastasica funcional in vivo. Estos hallazgos estan de acuerdo con el silenciamiento de miR-126 da a las metastasis una ventaja selectiva en la progresion angiogenica.
Ejemplo 4: mir-126 suprime el reclutamiento endotelial en cancer in vitro
En este ejemplo, se busco determinar la base celular para el fenotipo de angiogenesis dependiente de miR-126 observado.
Se analizo la capacidad de miR-126 para regular diversas interacciones endoteliales del cancer tales como adhesion endotelial, proliferacion endotelial y formacion de tubos en celulas LM2 metastasicas (derivadas originalmente de la poblacion MDA-231 escasamente metastasica, Minn, A. J. et al., Nature 436 (7050), 518 (2005)) en cocultivo con celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). El restablecimiento de la expresion de miR-126 a celulas LM2, que muestran silenciamiento de miR-126, no suprimio la adhesion de las celulas metastasicas a celulas endoteliales (figura 2c), la proliferacion de celulas endoteliales (figura 2d) o la formacion de tubos tal como se evalua mediante cuantificacion automatizada de puntos de ramificacion (figura 2e). De acuerdo con esto, la inhibicion de miR-126 en celulas MDA-231 tampoco no potencio estos fenotipos angiogenicos (figuras 9a-c).
Se investigo el papel de miR-126 en la regulacion del reclutamiento de celulas endoteliales a celulas metastasicas. Celulas LM2 metastasicas colocadas en el fondo de una camara de Boyden reclutaron fuertemente HUVEC a traves de un inserto Transwell poroso y presentaron una capacidad significativamente potenciada para reclutar endotelios en comparacion con su linea parental escasamente metastasica (figura 2f). El reclutamiento endotelial por celulas metastasicas se inhibio fuertemente (reduccion del 47%) por la sobreexpresion de miR-126 (figura 2g). A la inversa, el silenciamiento de miR-126 en la poblacion MDA-231 parental escasamente metastasica aumento significativamente el reclutamiento endotelial (aumento del 146%; figura 2g). La linea CN34LM1a, un derivado de pulmon altamente metastasico que se obtuvo previamente a traves de seleccion in vivo de la poblacion maligna primaria CN34 (Tavazoie et al., Nature 451 (7175), 147 (2008)) (una poblacion maligna primaria independiente obtenida del liquido pleural de una paciente con cancer de mama metastasico Gupta et al., Nature 446 (7137), 765 (2007)), tambien presento capacidad de reclutamiento endotelial significativamente potenciada en comparacion con su linea parental escasamente metastasica (figura 2h). Ambos experimentos de ganancia de funcion y perdida de funcion revelaron que miR-126 tambien suprime significativamente el reclutamiento endotelial por la poblacion de CN34 (figura 2i). Los hallazgos revelaron que la capacidad de reclutamiento endotelial potenciada era una caracteristica clave de las poblaciones con cancer de mama metastasico e identificaron miR-126 endogeno como un regulador principal de este proceso.
A continuacion, se busco determinar si miR-126 endogeno puede regular selectivamente el reclutamiento endotelial a celulas de cancer de mama independientemente de su ubicacion. Por tanto, se implantaron celulas de cancer de mama metastasicas que expresaban una horquilla de control o que sobreexpresaban miR-126 en el paniculos adiposos mamarios de ratones. Las celulas metastasicas, que presentan expresion de miR-126 silenciada, presentaron densidad de vasos superior en la glandula mamaria en relacion con las celulas escasamente metastasicas. El reclutamiento endotelial a celulas metastasicas en el paniculo adiposo mamario se inhibio por la expresion de miR-126 (figura 2j), mientras que el silenciamiento de miR-126 en celulas escasamente metastasicas aumento significativamente el reclutamiento endotelial a y el contenido en vasos funcionales de tumores de mama en crecimiento en paniculos adiposos mamarios tal como se determina por tincion con meca-32 (figura 2j) y tincion con lectina (figura 10a), respectivamente. Este efecto del reclutamiento fue selectivo para celulas endoteliales ya que el silenciamiento de miR-126 no aumento la densidad de leucocitos (figura 10b) o la densidad de macrofagos (figura 16c) en tumores mamarios.
Los hallazgos anteriores revelaron que miR-126 regula selectivamente el reclutamiento endotelial a celulas de cancer de mama independientemente de su ubicacion anatomica.
Ejemplo 5: El regulon de mir-126 promueve el reclutamiento endotelial
En este ejemplo, se realizo una investigacion sistematica para identificar las dianas moleculares de miR-126 que median el reclutamiento endotelial y la colonizacion metastasica. Especificamente, se realizo analisis de transcriptomas de celulas LM2 que sobreexpresan miR-126 y se compararon alteraciones de transcrito global en
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celulas MDA-231 escasamente metastasicas y celulas LM2 altamente metastasicas.
Sin restringirse a la teorfa, se lanzo la hipotesis de que, dado el papel de miR-126 en inhibir la metastasis, los mediadores biologicos de miR-126 presentan una expresion aumentada en celulas metastasicas y de que se suprimirfan por este miARN. Se identifico un conjunto de 23 genes ya que se suprimieron tras la sobreexpresion de miR-126 (>1,6 veces; figura 11; tabla 4), y se regularon por incremento (>1,4 veces) en celulas metastasicas en relacion con la lfnea parental de MDA-231 (figura 11).
De estos genes, se valido que 14 habfan cambiado significativamente mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de celulas MDA-231 control y miR-126KD asf como celulas LM2 control y celulas que sobreexpresaban miR- 126. Para aumentar adicionalmente la confianza de esta lista, se sometio a prueba la expresion de estos genes en los derivados metastasicos de la lfnea CN34 independiente, y se identifico que 8 genes presentaban una expresion significativamente aumentada en multiples derivados de CN34 metastasicos en relacion con su lfnea parental (figura 3a).
La contribucion de estos 8 genes a la metastasis humana se comprobo determinando si su sobreexpresion en canceres de mama humanos primarios se correlaciona con la supervivencia libre de metastasis distal. Era significativamente mas probable que las pacientes cuyos canceres de mama primarios presentaban sobreexpresion desarrollaran metastasis distal y experimentaran una supervivencia libre de metastasis mas corta que aquellas cuyos canceres no sobreexpresaban estos genes (figura 3b-d). Esta asociacion presento significacion en las cohortes UCSF (n=117; P < 0,0165), NKI (n=295; P < 0,0005) y las cohortes combinadas MSK/NKI/UCSF (n=494; P < 0,0004). Por tanto, miR-126 suprimio la expresion de un conjunto de ocho genes que estaban correlacionados positiva y fuertemente con recidiva metastasica humana.
A continuacion, se llevaron a cabo ensayos para identificar las dianas directas de miR-126. Para este fin, se clonaron las regiones no traducidas en 3’ (3’-UTR) y las secuencias codificantes (CDS) de los ocho genes regulados de miR-126 y se usaron para generar constructos de fusion de luciferasa. Ensayos de indicador de luciferasa con este conjunto completo revelaron que miR-126 regula la expresion de IGFBP2 y MERTK a traves de interacciones con sus 3’-UTR y PITPNC1 y SHMT2 a traves de interacciones con sus regiones codificantes ya que el silenciamiento de miR-126 endogeno en celulas MDA-231 potenciaba la expresion de estos genes de fusion de luciferasa (figura 3e y figura 12). La mutacion de secuencias complementarias de miR-126 en las 3’-UTR de IGFBP2 y MERTK anularon la regulacion mediada por miR-126 de la expresion de luciferasa (figura 3f), mientras que la mutacion de las CDS de PIPNC1 y SHMT2 anularon la seleccion como diana mediada por miARN (figura 3f).
Tabla 4. Reduccion ^ en veces por miR-126 en celulas LM2
Nombre del gen
Veces Nombre del gen Veces Nombre del gen Veces Nombre del gen Veces
GDF15
-4,15 CTAGE5 -1,93 PRKAR1A -1,80 KIAA0746 -1,71
RARA
-3,53 CDA -1,93 CHAC1 -1,80 PADI4 -1,71
P8
-2,98 FLJ46385 -1,92 SCD -1,80 BEX2 -1,71
RPS6KA2
-2,54 RALGPS2 -1,92 PCK2 -1,80 TAF13 -1,70
C20orf100
-2,47 BDNFOS -1,91 CDC42BPB -1,79 KLF4 -1,70
C12orf39
-2,38 MBNL1 -1,91 DSCR1 -1,79 DLG1 -1,70
HERPUD1
-2,37 MKX -1,91 TCF7L2 -1,79 DDEFL1 -1,70
CTH
-2,36 LPIN1 -1,90 TNRC6C -1,79 MID1IP1 -1,70
LOC23117
-2,35 DNAJB9 -1,90 TncRNA -1,78 LOC124220 -1,70
LOC23117
-2,35 TncRNA -1,90 CLDN23 -1,78 C10orf58 -1,70
ASNS
-2,35 BCL2L1 -1,90 GPR153 -1,78 CDKN1C -1,70
RGC32
-2,33 DNAJB9 -1,90 KRTHA4 -1,78 DTX3 -1,70
CTH
-2,33 ENTH -1,89 SCD -1,78 SETD5 -1,70
NRP1
-2,28 S100A5 -1,89 VIPR1 -1,78 SLC7A11 -1,69
RIT1
-2,26 CST4 -1,89 SLC1A4 -1,77 WSB1 -1,69
HMGA1
-2,24 TRIB3 -1,89 PNPLA3 -1,77 KIAA1618 -1,69
DDIT3
-2,20 PHLDA1 -1,89 PPP1R11 -1,77 PYGB -1,69
MBNL1
-2,20 RGNEF -1,89 CFLAR -1,77 CSNK1A1 -1,69
SUPT6H
-2,16 GFPT1 -1,88 NSF -1,77 THBD -1,68
LPIN1
-2,15 TMTC2 -1,88 ABHD4 -1,77 CG012 -1,68
ZNF451
-2,12 TPARL -1,87 SOCS2 -1,77 DDX17 -1,68
THBD
-2,10 INHBB -1,87 TACSTD2 -1,76 BGLAP -1,68
ITGB4
-2,10 FASN -1,87 SESN2 -1,76 MAGI1 -1,68
BHLHB8
-2,09 CALB2 -1,86 CTNNB1 -1,76 WARS -1,68
SLCO4C1
-2,09 IGFBP2 -1,86 MAP1LC3B -1,76 LOC283050 -1,68
AFF4
-2,07 SLC6A9 -1,86 LOC165186 -1,76 AQP3 -1,68
ATP6V0D2
-2,05 PLAT -1,86 FLJ20054 -1,75 LOC400581 -1,68
KRT19
-2,05 SIN3B -1,86 ZNF69 -1,74 CILN2 -1,68
SMAD3
-2,04 S100A6 -1,85 TNFSF4 -1,74 CD97 -1,68
ARHGAP5
-2,04 WSB1 -1,85 LOC441453 -1,74 CNTNAP3 -1,67
DNAJB9
-2,04 C20orf18 -1,85 MARS -1,74 PDE2A -1,67
ATF3
-2,03 HMGCS1 -1,85 LOC647135 -1,74 AOF1 -1,67
LOC440092
-2,03 MBNL1 -1,85 ACSL3 -1,74 IDS -1,67
RIT1
-2,03 MBNL1 -1,85 SCD -1,74 SCD -1,67
ZNF499
-2,02 WHSC1L1 -1,85 SERINC2 -1,73 SHMT2 -1,67
ATXN1
-2,02 NCF2 -1,85 ZCCHC7 -1,73 RNF10 -1,67
CST6
-2,01 MERTK -1,84 ETNK1 -1,73 CRLF3 -1,67
WBP2
-2,00 PFAAP5 -1,84 CHRM3 -1,73 PSAT1 -1,67
ZFAND3
-2,00 RTN4 -1,83 DCAMKL1 -1,73 FNBP1 -1,67
FLJ38717
-1,99 LARP6 -1,83 C20orf119 -1,73 LOC554203 -1,66
LOC158160
-1,99 TRIB3 -1,83 CDKN1C -1,73 MYADM -1,66
PITPNC1
-1,99 RAB37 -1,83 CXorf33 -1,72 ATXN1 -1,66
JMJD1C
-1,99 LOC399959 -1,83 LPIN1 -1,72 CA12 -1,66
PRO2852
-1,98 SYTL1 -1,82 GEM -1,72 SF3B4 -1,66
AGR2
-1,97 SDF2L1 -1,82 KIAA0746 -1,72 KHDRBS1 -1,66
SLC7A5
-1,94 RPH3AL -1,82 LOC115648 -1,72 EGFR -1,66
NSF
-1,94 OGDH -1,82 TIA1 -1,72 FRMD5 -1,65
BCL2L1
-1,94 CDIL -1,81 FLJ10120 -1,71 ZNF252 -1,65
KIAA1267
-1,93 RHOQ -1,81 DUSP5 -1,71 FNBP1 -1,65
NT5C2
-1,93 ITGB4 -1,81 RNF12 -1,71 TNKS2 -1,65
C9orf3
-1,65 C14orf118 -1,61
AOF1
-1,65 PIAS1 -1,61
PDP2
-1,65 PXN -1,61
MLLT10
-1,65 C14orf118 -1,61
WIRE
-1,65 PIAS1 -1,61
ATXN1
-1,65 FLJ43663 -1,65
WARS
-1,65 SOS2 -1,61
RAB5B
-1,64 FLJ43663 -1,60
SQLE
-1,64 HCRP1 -1,60
SCNN1A
-1,64 LOC646916 -1,60
C14orf78
-1,64 NUP43 -1,60
SHMT2
-1,63 PEBP1 -1,60
PSCD3
-1,63 FLJ23556 -1,60
LOC643998
-1,63 NRP1 -1,60
PHGDH
-1,63 JUP -1,60
HEXA
-1,63
CDRT4
-1,63
ACTN4
-1,63
C6orf155
-1,63
EXT1
-1,63
JDP2
-1,63
LSS
-1,63
PITPNC1
-1,63
C20orf18
-1,63
CLDN7
-1,63
NPC1
-1,62
IDH1
-1,62
THBD
-1,62
GSTM4
-1,62
ATP5C1
-1,62
PMM1
-1,62
C9orf5
-1,62
COL8A2
-1,62
CST1
-1,62
MAGI1
-1,62
G6PD
-1,62
FOSL1
-1,61
RASD1
-1,61
PITX1
-1,61
P2RY2
-1,61
HYOU1
-1,61
CSF2RA
-1,61
SLC16A4
-1,61
SQLE
-1,61
EFHD2
-1,61
ABCB9
-1,61
SYDE1
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MAGI1
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SLC7A11
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HSPA5
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Por tanto, la proteina de union, proteina de union a IGF 2, la cinasa receptora MERTK, la proteina de transferencia de fosfatidilinositol PITPNC1 y la enzima hidroximetiltranferasa SHMT2 comprenden un conjunto de dianas directas de miR-126 en cancer de mama humano.
Ejemplo 6: IGFBP2, PITPNC1 y MERTK promueven el reclutamiento endotelial y la metastasis
En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para examinar si cualquiera de los genes diana de miR-126 regula el reclutamiento de celulas endoteliales por celulas cancerosas. De estos cuatro genes, el silenciamiento de IGFBP2, MERTK o PITPNC1 usando horquillas cortas independientes suprime significativamente la capacidad de las celulas LM2 metastasicas para reclutar celulas endoteliales (figura 4a y figura 13). De manera importante, el silenciamiento de estos genes no dio como resultado una disminucion significativa en la proliferacion celular (figura 14).
Dados los efectos robustos de los genes diana de miR-126 sobre el reclutamiento endotelial, se examino si los niveles de expresion de estos genes se correlacionan individualmente con la propension metastasica de canceres humanos. Se analizaron por tanto los niveles de expresion de cada uno de estos genes a traves de qPCR en un conjunto completamente independiente de 96 canceres de mama humanos para los que estaban disponibles ADNc.
Las pacientes con canceres de mama en estadio III y estadio IV presentan diseminacion metastasica local y metastasis distales, respectivamente, y comprenden colectivamente las que desarrollan recidiva distal a tasas mucho mayores que las pacientes en los estadios I y II. Resulta interesante que los niveles de expresion de IGFBP2 (P < 0,0003), MERTK (P < 0,002) y PITPNC1 (P < 0,004) estaban significativamente aumentados de manera individual en los canceres primarios de pacientes en los estadios III y IV en relacion con pacientes en los estadios I y II (figura 4b). Dado el requisito para reclutamiento endotelial por celulas metastasicas, asi como su seleccion como diana directa por miR-126, se busco determinar si se requiere cualquiera de los genes diana de miR-126 para la colonizacion metastasica.
Se encontro que, de manera importante, el silenciamiento de IGFBP2 usando horquillas cortas independientes suprimio significativamente la colonizacion al pulmon (sh1 10 veces; sh2: 6,25 veces; figura 4c). Ademas, el silenciamiento de PITPNC1 y MERTK tambien inhibio fuertemente la colonizacion metastasica (PITPNC1sh1: 7,69 veces; PITPNC1sh2: 4,55 veces, figura 4d; MERTKshq: 3,91 veces; MERTK1sh2: 3,08 veces, figura 4e). Las secuencias de ARNhc usadas se enumeran en la tabla 5 a continuacion.
Estos hallazgos revelaron que se requieren individualmente cada uno los genes diana directos de miR-126 IGFBP2, PITPNC1 y MERTK para el reclutamiento endotelial y la colonizacion metastasica y que se correlacionan individualmente en la expresion con la evolucion metastasica humana.
Tabla 5. Secuencias de ARNhc
Gen
Secuencia
IGFBP2_sh1
CCGGCCAGTT CT GACACACGT ATTT CTCGAGAAAT ACGTGT GTCAGAACT GGTTTTT (SEQ ID NO: 1)
IGFBP2_sh2
CCGGCAGGTTGCAGACAATGGCGATCTCGAGATCGCCATTGTCTGCAACCTGTTTTT (SEQ ID NO: 2)
MERTK_sh1
CCGGGCTTCTGGT CTT GAT GT ATTT CTCGAGAAAT ACAT CAAGACCAGAAGCTTTTT (SEQ ID NO: 3)
MERTK_sh2
CCGGCCT GCAT ACTTACTT ACTTT ACTCGAGT AAAGT AAGT AAGT AT GCAGGTTTTT (SEQ ID NO: 4)
PITPNC1_sh1
CCGGCGGGTGTATCT CAACAGCAAACTCGAGTTTGCT GTT GAGAT ACACCCGTTTTT G (SEQ ID NO: 5)
PITPNC1_sh2
CCGGCAATGGATGAAGTCCGAGAATCTCGAGATTCTCGGACTTCATCCATTGTTTTTG (SEQ ID NO: 6)
SHMT2hc
CCGGCCGGAGAGTTGTGGACTTTATCTCGAGATAAAGTCCACAACTCTCCGGTTTTTG (SEQ ID NO: 7)
controlhc
CCGGCAACAAGAT GAAGAGCACCAACTC-GAGTTGGT GCT CTT CAT CTT GTT GTTTTT (SEQ ID NO: 8)
Ejemplo 7: IGFBP2 media el reclutamiento a traves de la activacion de IGF1/IGF1R de celulas endoteliales
De las dianas de miR-126, IGFBP2 es un factor secretado y, como tal, dispuesto para mediar la comunicacion intercelular entre celulas de cancer metastasicas y celulas endoteliales. Por tanto, se examino si las celulas
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metastasicas secretan niveles aumentados de IGFBP2. Se encontro que, de hecho, los analisis de ELISA revelaron que las celulas LM2 metastasicas secretan niveles 2,1 veces superiores de este factor que la linea parental MDA- 231 escasamente metastasica (figura 5a).
Los miembros de la familia de IGFBP ejercen sus efectos interaccionando con diversos factores de crecimiento de tipo insulina (IGF) y modulan su union a receptores de IGF (Baxter, R. C., Horm Res 42 (4-5), 140 (1994) y Jones, J. I. et al. Endocr Rev 16 (1), 3 (1995). Para determinar si el reclutamiento endotelial metastasico esta mediado a traves de IGFBP2 secretada, se inhibio la union de IGFBP2 a IGF por medio de la incubacion con anticuerpo neutralizante contra IGFBP2.
Se encontro que la inhibicion mediada por anticuerpos de IGFBP2 en un ensayo de reclutamiento Transwell inhibio significativamente el reclutamiento endotelial celular metastasicos hasta niveles comparables a los obtenidos con la sobreexpresion de miR-126 (figura 5b) y tambien evito el reclutamiento dependiente de miR-126 (figura 5b). Por tanto, este efecto fue especifico para la ruta de miR-126/IGFBP2, ya que la inhibicion del reclutamiento endotelial por el anticuerpo contra IGFBP2 se ocluyo con la sobreexpresion de miR-126 (figura 5b). La inhibicion mediada por anticuerpos de IGFBP2 tambien suprimio el reclutamiento endotelial por el derivado de CNLM1A de la linea maligna CN34 independiente y dio como resultado una reduccion estadisticamente significativa en el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126 (figura 5c). Estos hallazgos revelaron que IGFBP2 secretada es un mediador de la senalizacion intercelular para el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126 por celulas metastasicas.
Se sabia que IGFBP2 se une tanto a IGF1 como IGF2 en el espacio extracelular y modulan su actividad de senalizacion (Jones, J. I. et al. Endocr Rev 16 (1), 3 (1995); Arai, T., et al. Endocrinology 137 (11), 4571 (1996); Rajaram, S., et al. Endocr Rev 18 (6), 801 (1997); y Hoflich, A. et al., FEBS Lett 434 (3), 329 (1998)). Para determinar que IGF media el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126, se trataron las celulas con anticuerpos bloqueantes contra IGF1, IGF2, o con control con inmunoglobulina. La inhibicion mediada por anticuerpos de IGF1, pero no de IGF2, redujo significativamente el reclutamiento endotelial que resulta del silenciamiento de miR-126 (figura 5d).
A continuacion, se busco determinar el receptor a traves del cual se esta mediando el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126. La inhibicion del receptor de IGF de tipo 1 (IGF1R) mediante incubacion con anticuerpos bloqueantes contra IGF1R redujo significativamente el reclutamiento que resulta del silenciamiento de miR-126, mientras que la neutralizacion de IGF2R no tuvo efecto (figura 5e). Estos hallazgos demostraron que la ruta de miR- 126/IGFBP2/IGF1 activa IGF1R en celulas endoteliales.
Para asegurarse de que el reclutamiento dependiente de miR-126 estaba mediado a traves de IGF1R en celulas endoteliales (en lugar de en celulas cancerosas) se preincubaron celulas endoteliales HUVEC o cancerosas con el anticuerpo contra IGF1R antes del ensayo de reclutamiento endotelial. Esto revelo que solo la preincubacion con el anticuerpo contra IGF1R de celulas endoteliales inhibio el reclutamiento endotelial mediado por miR-126 ya que no hubo efecto sobre el reclutamiento con la preincubacion con las celulas cancerosas (figura 5f).
Los hallazgos anteriores estan de acuerdo con el reclutamiento endotelial metastasico que resulta de la secrecion de IGFBP2 de gen diana de miR-126, que se une a IGF1 en el espacio extracelular y potencia la activacion dependiente de IGF1 del receptor de IGF1 en celulas endoteliales. La activacion de IGF1R potenciada en celulas endoteliales estimula a su vez la migracion endotelial hacia las celulas de cancer de mama metastasicas. De acuerdo con este modelo, fue suficiente la proteina IGFBP2 recombinante, de un modo dependiente de la dosis, para promover la quimiotaxia endotelial (figura 5g) y la migracion (figura 15) de una manera dependiente de IGF1R.
Ejemplo 8: MERTK media el reclutamiento a traves de GAS6
En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para investigar los mecanismos por los que los otros genes diana de miR-126 PTTPNC1 y MERTK median el reclutamiento endotelial.
Dada la identificacion de IGFBP2 como un factor dependiente de miR-126 secretado que media este fenotipo, se investigo el papel de PITPNC1 o MERTK en la regulacion de la secrecion de este factor de las celulas cancerosas. Se encontro que el silenciamiento de PITPNC1 usando horquillas independientes reducia la secrecion de IGFBP2 de celulas de cancer de mama (figura 6a), de acuerdo con la regulacion por PITPNC1 del reclutamiento endotelial que esta mediado en parte a traves de regulacion positiva de la secrecion de IGFBP2. Sin embargo, el silenciamiento de MERTK no condujo a secrecion de IGFBP2 disminuida, lo que sugiere una ruta independiente de IGFBP2 por la que este gen diana de miR-126 media el reclutamiento.
Para determinar el mecanismo por el que el receptor de MERTK media el reclutamiento, se llevaron a cabo ensayos para someter a prueba el impacto de su ligando soluble GAS6 sobre el reclutamiento endotelial mediado por cancer. La adicion de GAS6 recombinante al sistema de cocultivo, a la concentracion fisiologica encontrada en el suero humano (Balogh, I. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 25 (6), 1280 (2005)) redujo potencialmente el reclutamiento dependiente de miR-126 (figura 6b), lo que sugiere que GAS6 actua como inhibidor del reclutamiento endotelial. El receptor de MERTK existe tanto en formas unidas a membrana como solubles, donde se ha escindido el dominio
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extracelular y por tanto se cree generalmente que actua como un receptor senuelo para regular negativamente la activacion del receptor de MERTK en celulas que lo expresan (Sather, S. et al., Blood (3), 1026 (2007). Se detecto MERTK soluble en medios acondicionados de celulas MdA-MB-231 (figura 16). Sin restringirse a la teorfa, MERTK soluble liberada de celulas cancerosas puede promover el reclutamiento endotelial a traves de la union e inhibicion de GAS6. De acuerdo con esto, la adicion de la forma soluble recombinante del dominio extracelular de MERTK (MerFc) suprimio la inhibicion mediada por GAS6 exogeno asf como serico del reclutamiento endotelial por celulas cancerosas (figura 6b). De manera importante, ese efecto fue dependiente de miR-126 (figura 6b). Estos hallazgos sugieren que MERTK secretada de celulas metastasicas actua como un receptor senuelo para GAS6, reduciendo de ese modo los efectos supresores de GAS6 en el reclutamiento de celulas endoteliales. A continuacion se enumeran secuencias de aminoacidos de tres isoformas de GAS6.
Isoforma 1
MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGH LERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQC TPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHC SCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVD ECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCEDILPCVPFSVAKSVKSLYLGRM FSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLR YNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLN LTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFY PGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALV DYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVCDGQEHVVTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVS AAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAAY KHSDITAHSCPPVEPAAA
Isoforma 2
MDTCEDILPCVPFSVAKSVKSLYLGRMFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGI
LLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLRYNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVI
KVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLNLTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNG
EDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHI
RPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVCDGQ
EHWTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTS
APVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAAYKHSDITAHSCPPVEPAAA
Isoforma 3
MFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQL
RYNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHL
NLTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSF
YPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVAL
VDYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVCDGQEHVVTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEV
SAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAA
YKHSDITAHSCPPVEPAAA
Para determinar si las formas recombinantes de IGFBP2 y MERTK, que se expresan por celulas metastasicas, y GAS6, que esta presente en el suero humano, son suficientes para regular la quimiotaxia endotelial, se realizaron ensayos quimiotacticos Transwell para cuantificar la migracion quimiotactica migracion de celulas endoteliales hacia estos factores. GAS6 recombinante a dosis fisiologicas bajas inhibio la quimiotaxia endotelial hacia IGFBP2 recombinante (figura 6c). De manera importante, el ectodominio de MERTK soluble recombinante anulo el efecto supresor de GAS6 sobre la quimiotaxia endotelial (figura 6c). La preincubacion de celulas endoteliales con GAS6 no afecto a la migracion endotelial, lo que sugiere que GAS6 inhibe la migracion quimiotactica. Estos hallazgos revelan que IGFBP2 media una senal migratoria y quimiotactica positiva para celulas endoteliales a traves del receptor de IGF tipo 1 receptor, mientras que el receptor de MERTK soluble antagoniza con una senal quimiotactica inhibidora mediada por GAS6.
Dados los papeles de IGFPB2, PITPNC1 y MERTK en el reclutamiento endotelial in vitro y la colonizacion metastasica in vivo, se llevaron a cabo ensayos para examinar si estos genes regulan el reclutamiento endotelial in vivo. Para este fin, se realizo tincion con MECA-32 en pulmones de ratones a los que se inyectaron celulas de cancer de mama de control y silenciamiento para cuantificar el reclutamiento endotelial in vivo tal como se mide mediante densidad de vasos metastasicos. La inhibicion de IGFPB2, PITPNC1 y MERTK individualmente usando horquillas cortas independientes redujo significativamente la densidad endotelial metastasico (figura 6d; P < 0,0001 y P = 0,002 para shIGFBP2, P = 0,01 y P = 0,02 para shPITPNC1, y P < 0,0001 y P = 0,005 para shMERTK). Adicionalmente, la perfusion de lectina y la citoqufmica revelaron tambien una reduccion significativa en el contenido de vasos metastasicos funcionales (figura 17). Por tanto, se requieren individualmente los genes diana de miR-126 IGFBP2, PITPNC1 y MERTK para el reclutamiento endotelial metastasico in vivo.
Los hallazgos anteriores, que comprenden ensayos in vitro asf como analisis in vivo tanto de reclutamiento endotelial mediado por celulas de cancer como de reclutamiento mediado por protefnas recombinantes, demostraron que
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IGFBP2 y MERTK expresados en cancer son necesarios y bastan para mediar el reclutamiento endotelial y transmiten rutas paralelas que emanan de celulas de cancer metastasicas (figura 6e).
Ejemplo 9. Regulon de miARN que media angiogenesis metastasica
Los hallazgos descritos anteriormente revelaron que un miARN expresado en celulas cancerosas puede regular de manera autonoma no celular el complejo proceso de perfusion vascular y reclutamiento endotelial metastasicos a traves de la regulacion coordinada de IGFBP2, MERTK y PITPNC 1 (un conjunto novedoso de genes de angiogenesis y metastasis).
Se encontro que la expresion aumentada de estos genes de angiogenesis metastasica dota a celulas de cancer de mama altamente metastasicas de capacidad de reclutamiento endotelial potenciada en relacion con celulas escasamente metastasicas. Las celulas metastasicas que sobreexpresan estos genes pueden establecer mas facilmente los vasos sanguineos necesarios para la colonizacion eficaz. Aunque se demostro la necesidad de estos tres genes en el reclutamiento endotelial metastasico, uno de ellos, es decir, IGFBP2 secretada, es un mediador transcelular de este fenotipo.
Adicionalmente, se descubrio la ruta de senalizacion de IGF1 (modulada por IGFBP2 secretada de celulas cancerosas y que culmina en la activacion de IGF1R en celulas endoteliales) como mediator del reclutamiento endotelial de celulas metastasicas y se ha identificado miR-126 en celulas cancerosas como regulador de esta ruta. Aunque se han notificado los papeles de IGF1 y IGF2 en el crecimiento celular y de organismos (Laviola, L., et al. Curr Pharm Des 13 (7), 663 (2007) y Varela-Nieto, I., et al. Curr Pharm Des 13 (7), 687 (2007).), la expresion ubicua de estos factores de crecimiento y sus receptores en diversos tejidos y sus requisitos para fisiologia normal limitan su aplicacion terapeutica (Varela-Nieto, I., et al. Curr Pharm Des 13 (7), 687 (2007)).
IGFBP2 es uno de los 16 miembros de la familia de IGFBP; vease Schmid, C., Cell Biol Int 19 (5), 445 (1995); Hwa, V., et al. Endocr Rev 20 (6), 761 (1999); y Firth, S. M. et al. Endocr Rev 23 (6), 824 (2002). La identificacion de IGFBP2 como promotor de metastasis, su sobreexpresion en cancer de mama humano metastasico y el efecto robusto de su inhibicion mediada por anticuerpos en el reclutamiento endotelial por celulas metastasicas proporciona un apoyo especifico para la seleccion como diana terapeutica de la ruta de IGF en la evolucion del cancer de mama la angiogenesis del cancer.
Aunque se identifico IGFBP2 como regulador positivo positive del reclutamiento endotelial a traves de su activacion de un regulador positive de este proceso (IGF1), tambien se descubrio MERTK como promotor de reclutamiento a traves de su inhibicion de un regulador negativo de quimiotaxia endotelial (GAS6). Por tanto, un solo miARN puede controlar un fenotipo complejo modulando tanto los reguladores positivos como los negativos de un fenomeno.
Posteriormente a su identificacion como miARN supresor de metastasis, miR-126, que se expresa en desarrollo en celulas endoteliales, se selecciono como diana geneticamente en ratones. Se encontro que la delecion de miR-126 conducia a letalidad embrionaria parcial, perdida de integridad vascular y hemorragia (Wang, S. et al., Dev Cell 15 (2), 261 (2008).). Por tanto, se encontro que miR-126 expresado de manera era un promotor de la angiogenesis en desarrollo normal en sistemas de raton y pez cebra (Nicoli, S. et al., Nature 464 (7292), 1196 (2010) y Fish, J. E. et al., Dev Cell 15 (2), 272 (2008).)
En vista de su papel como promotor de angiogenesis, resulto inesperado que miR-126 tambien suprimia la angiogenesis en, por ejemplo, cancer de mama, tal como se da a conocer en el presente documento. Resulto inesperado que miR-126 pudiera actuar al menos de dos modos diferentes. Por una parte, actua de forma especifica del tipo celular para suprimir la angiogenesis patologicas tal como se da a conocer en esta solicitud. Tal como se da a conocer en esta solicitud, miR-126 suprimia la migracion endotelial patologica hacia metastasis. Por otra parte, mientras esta en desarrollo, la expresion de miR-126 mantiene la integridad de los vasos. De hecho, se demostro que miR-126 endotelial regula la angiogenesis en desarrollo a traves de la seleccion como diana de Spred-1 y PIK3R2, genes no se regularon significativamente por miR-126 en celulas de cancer de mama (Wang, S. et al., Dev Cell 15 (2), 261 (2008) y Fish, J. E. et al., Dev Cell 15 (2), 272 (2008).). Vease la tabla 6. A la inversa, se encontro que la inhibicion de miR-126 en celulas endoteliales no potencia el reclutamiento endotelial por celulas endoteliales (figura 18) como lo hace en celulas de cancer de mama. De acuerdo con esto, la inhibicion de miR-126 en celulas endoteliales no altero la expresion de PITPNC1, MERTK o IGFBP2, mientras que aumento la expresion de las dianas de miR-126 endoteliales establecidas, SPRED1 y PIK3R2 (figura 19).
Tabla 6
Nombre del gen
LM2 miR-126 OE de LM2 Veces
SPRED1
979 851 -1,1030
PIK3R2
2188 1513 -1,2634
Ejemplo 10. Identificacion de genes o ARN no codificantes que regulan la colonizacion de cancer
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metastasico de cualquier tejido corporal
Este ejemplo describe dos enfoques para identificar un gen o un ARN no codificante que regula la colonizacion de cancer metastasico de un tejido corporal
1. Enfoque de Lenti-miR
Transduccion de biblioteca Lenti-miR en celulas e inyeccion en animales
En este enfoque se uso la biblioteca Lenti-miR (SYSTEM BIOSCIENCES, n.° de catalogo PMIRHPLVAHT-1). Esta biblioteca consiste en un conjunto de lentivirus que contiene microARN precursores representativos de todo el genoma humano. Se transdujeron poblaciones parenterales de las lineas celulares SW620 y LS174T (2 x 105 celulas) con la biblioteca a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 1 para obtener un conjunto heterogeneo de celulas parentales con celulas individuales que sobreexpresan diferentes microARN. Cada precursor de microARN estaba representado aproximadamente en 50X tras la transduccion. Cuatro dias tras la transduccion, se aparto la mitad de las celulas y se extrajo el ADN genomico usando el kit DNeasy de Qiagen. Este fue el conjunto de referencia del ADN genomico antes de la presion selectiva de colonizacion hepatica. La mitad de la poblacion restante se inyecto en los higados de ratones NOD/SCID. 3-5 semanas tras la inyeccion, se extrajo el ADN genomico de los tumores que se formaron en los higados. Se realizaron transducciones e inyecciones en repeticiones para ambas lineas celulares.
Identificacion de microARN que modulan la colonizacion hepatica
Se recuperaron precursores de microARN derivados de Lenti-miR de ADN genomico mediante amplificacion por PCR en el intervalo linear usando cebadores que contienen el promotor de T7 especificos de biblioteca (cebador directo: 5'-GAAATT AATACGACTCACTAT AGGGCCT GGAGACGCCATCCACGCT G-3'; cebador inverso: 5': GATGTGCGCTCTGCCCACTGAC-3') en el ADN genomico de referencia y el ADN genomico tumoral. Se realizaron cuatro reacciones de PCR usando 400 ng de ADN genomico como molde y se reunieron por muestra para garantizar la representacion adecuada de microARN precursores transducidos.
Los amplicones de PCR resultantes fueron un material compuesto de diferentes microARN precursores con secuencias de promotor de T7 y se usaron como moldes para la transcripcion in vitro para obtener una biblioteca de precursores biotinilada. La biblioteca biotinilada obtenida de los tumores y el conjunto de referencia se marcaron con Cy3 y Cy5, respectivamente y se hibridaron con un microalineamiento disenado para detectar las secuencias de microARN (Genosensor). Se realizo un experimento de intercambio de colorante para controlar la diferencia de colorantes.
Se calculo la razon de la abundancia de cada precursor de microARN entre el conjunto de referencia y tras la presion selectiva durante la colonizacion hepatica tras la normalizacion de la senal de microalineamiento. Los microARN quedaron representados en exceso en la poblacion tumoral en comparacion con el conjunto de referencia se consideraron promotores y los microARN que quedaron representados insuficientemente, supresores de la colonizacion hepatica.
2. Enfoque de Lentiplex
Transduccion de biblioteca Lentiplex en celulas e inyeccion en animales
En este enfoque se uso la biblioteca de ARNhc de genoma completo Lentiplex (SIGMA-ALDRICH, n. de catalogo SHPH01). Esta biblioteca es una biblioteca reunida lentivirus que contiene aproximadamente 150.000 ARNhc que seleccionan como diana el genoma humano completo, seleccionandose como objetivo cada gen por 3-5 ARNhc independientes.
Se transdujeron poblaciones parenterales de las lineas celulares SW620, LS174T y WiDR (2 x 106 celulas) con la biblioteca a una MOI de 1, dando como resultado un conjunto poblacion heterogenea, expresando las celulas individuales un unico ARNhc. Se tradujo cada ARNhc a una representacion de aproximadamente 100X. 48 h tras la transduccion; se seleccionaron las celulas transducidas con puromicina durante 48 h para retirar las celulas no transducidas. Tras la seleccion con antibioticos, se dejo que las celulas restantes se recuperaran durante una semana antes de los experimentos posteriores. Se aparto la mitad de las celulas seleccionadas y se extrajo el ADN genomico. Este fue el conjunto de referencia de aDn genomico antes de la presion selectiva de la colonizacion hepatica. La mitad de la poblacion restante se inyecto en los higados de ratones NOD/SCID. 3-5 semanas tras la inyeccion, se extrajo el ADN genomico de los tumores que se formaron en los higados. Se realizaron transducciones e inyecciones en repeticiones para las tres lineas celulares.
Identificacion de genes novedosos que modulan la colonizacion hepatica a traves del examen de ARNhc reunido de genoma completo
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Para recuperar un conjunto complejo de secuencias de biblioteca de ARNhc a partir de ADN genomico, se uso un enfoque de PCR seguido por secuenciacion masiva Solexa de amplicones de PCR. Se realizo amplificacion de PCR inicial en 500 ng de ADN genomico usando cebadores (cebador directo: 5’-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACT- 3’; cebador inverso: 5’-AAAGAGGATCTCTGTCCCTGT-3’) especificos para el vector viral, seguido por cebadores con secuencias requeridas para secuenciacion masiva Solexa (cebador directo: 5’-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTATTCTTGGCTTTATAT ATCTTGTGGAAAGGAC-3’; cebador inverso: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGCTCTTCCGATCTGGATGAATACTGCCATTTGTCTCGAGGTCGA-3’) para obtener amplicones que contenian las secuencias de ARNhc. Se realizaron diez reacciones de PCR equivalentes a 5 ug de ADN genomico por cada conjunto de ADN genomico y se reunieron los productos para secuenciacion para garantizar la representacion adecuada de ARNhc.
Los amplicones reunidos representan un material compuesto de secuencias de ARNhc de genoma completo y se realizo secuenciacion masiva para determinar la representacion de cada especie de ARNhc en el conjunto de referencia en comparacion con el conjunto amplificado de tumores. Se normalizo el recuento para cada especie de ARNhc contra el numero total de secuencias obtenidas y se identificaron sus dianas genicas haciendolas coincidir con una base de datos de Sigma. Las dianas genicas cuyos ARNhc que quedaron representadas en exceso en el conjunto tumoral se consideran supresores de la colonizacion hepatica y viceversa. Para explicar efectos no especificos de silencimiento de ARNhc, solo los resultados positivos de dianas genicas identificados por tres o mas “resultados positivos” de ARNhc independientes se consideraron posibles supresores o promotores.
Ejemplo 11. El anticuerpo monoclonal que neutraliza la funcion de IGFBP2 inhibio el reclutamiento endotelial por las celulas de cancer de mama humanas metastasicas.
Este ejemplo demuestra un anticuerpo monoclonal que inhibe el reclutamiento endotelial por celulas de cancer de mama metastasicas uniendose a IGFBP2 e inhibiendo la interaccion (union) de IGF1 a IGFBP2. Mediante el bloque de la union de IGF1 a IGFBP2, este anticuerpo monoclonal puede inhibir el reclutamiento endotelial por las celulas de cancer de mama humanas metastasicas. Los metodos usados para generar anticuerpos neutralizantes frente a IGFBP2 son los conocidos comunmente en la tecnica.
En resumen, se inmunizaron ratones con peptido total IGFBP2 recombinante para generar una respuesta de anticuerpo policlonal. A continuacion, se generaron bibliotecas de hibridomas mediante la fusion de celulas B aisladas de los ratones inmunizados a lineas celulares de mieloma. Entonces se aislo el sobrenadante de estos hibridomas con el fin de examinar e identificar aquellas celulas de hibridoma que generan anticuerpos que se unen a IGFBP2 con alta afinidad, usando ensayos de ELISA competitivos de captura de anticuerpos (figura 20). Una vez identificados, se examinaron los hibridomas que generan anticuerpos con alta afinidad para IGFBP2 con el fin de identificar aquellos que generan anticuerpos que pueden inhibir que IGFBP2 se una a IGF1, usando ensayos de ELISA competitivos de captura de anticuerpos (figura 21). La biblioteca de hibridomas wo6663-1 contenia anticuerpos que se unen a IGFBP2 para neutralizar la union de IGF1, sin union a los otros miembros de la familia de IGFBP, IGFBP3 e IGFBP4 (figuras 20 y 21). Para aislar celulas de hibridoma de clones individuales (monoclonales), se realizo separacion y examen en la biblioteca de hibridomas wo6663-1. Se examinaron 2000 clones de hibridomas individuales (monoclonales) de esta biblioteca para identificar los que generaban anticuerpos monoclonales que se unen a IGFBP2 con alta afinidad para neutralizar la union de IGF1. La tabla en la figura 22 enumera datos del ensayo competidor de ELISA de captura de anticuerpos de varios anticuerpos monoclonales aislados del examen anterior, muchos de los cuales tenian afinidad por IGFBP2 y podian inhibir la union de IGF1 a IGFBP2 (figura 22), incluyendo el anticuerpo monoclonal IGFBP2_14 (M14) (recuadro en lineas discontinuas en la figura 22). Se examinaron entonces estos anticuerpos monoclonales neutralizantes contra IGFBP2 para identificar los que podian inhibir el reclutamiento endotelial por celulas metastasicas usando ensayos de migracion endotelial Transwell. El anticuerpo monoclonal IGFBP2_M14 (M14) inhibio el reclutamiento endotelial por celulas de cancer de mama metastasicas humanas.
Para identificar anticuerpos monoclonales que podrian inhibir el reclutamiento endotelial, se sometieron a prueba los anticuerpos monoclonales neutralizantes contra IGFBP2 generados en el examen anterior en un ensayo de reclutamiento endotelial in vitro usando Transwell. Se colocaron celulas de cancer de mama humanas LM2 altamente metastasicas en el fondo de una camara de Boyden, donde pudo someterse a ensayo su capacidad para reclutar HUVEC a traves de un inserto Transwell poroso. Se anadio una pequena concentracion fisiologica de anticuerpos neutralizantes contra IGFBP2 (incluyendo M1, M4, M6, M9, M13, m14, M15 y M16 (de la figura 22)) a los Transwell de manera individual en concentraciones fisiologicas. De todos los anticuerpos sometidos a prueba, M14 (recuadro en linea discontinua en la figura 22) pudo inhibir significativamente el reclutamiento (celulas migradas/campo) de celulas HUVEC (reduccion del 50% en celulas migradas) frente a los anticuerpos control negativos IgG y M5 (figura 23). Esto demuestra la capacidad del anticuerpo monoclonal M14 para inhibir el reclutamiento de celulas endoteliales humanas por celulas de cancer metastasicas humanas (figura 23).
Para caracterizar adicionalmente M14, se secuenciaron las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo. La secuencia de aminoacidos de las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera de M14 se presentan en la tabla 7.
Tabla 7
Secuencia de aminoacidos de region variable de cadena pesada de M14
QVQLEQSGGGLVQPGGSLKLSCGASGFTFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVAYISNG GGITYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAVYYCVRRSDGSWFVYW GQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 9)
Secuencia de aminoacidos de region variable de cadena ligera de M14
DTVTTOSPSST ,A VS VGF.KVTT .SCKSSOST ,T .YSSNOKNCT .AWYOOKPGOSPKTI IYW ASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYLTFGAGTKLEL KRADAAPTVS (SEQ ID NO: 10)
Ejemplo 12. El anticuerpo monoclonal M14 inhibio la evolucion tumoral del cancer de mama humano in vivo.
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Este ejemplo demuestra que el anticuerpo neutralizante M14 contra IGFBP2 puede inhibir la evolucion tumoral y la metastasis tumoral in vivo en un modelo de raton de cancer de mama humano.
Para someter a prueba si el anticuerpo monoclonal M14 podia reducir la carga tumoral e inhibir la evolucion tumoral
10 in vivo, se mezclaron 2000 celulas de cancer de mama humanas MDA-MB-231 que expresan luciferasa en una
razon 1:1 con factor de crecimiento reducido Matrigel y se inyectaron bilateralmente en los panfculos adiposos mamarios de ratones NOD-SCID. Inmediatamente tras la inyeccion, se inyecto luciferina y se cuantifico la senal de bioluminiscencia de las celulas de cancer para establecer una senal de nivel inicial en el dfa 0 de la carga tumoral. Entonces se separaron aleatoriamente los ratones en dos grupos: un grupo de control que se trato con PBS solo, y 15 un grupo de M14 tratado con el anticuerpo monoclonal M14. Se administraron inmediatamente inyecciones intraperitoneales de PBS y anticuerpo M14 (250 microgramos) en el dfa 0 a los ratones en cada grupo respectivamente, y despues posteriormente, se administraron inyecciones bisemanalmente. Se realizo un seguimiento de la carga tumoral tanto en los ratones tratados con M14 como en los de control tratados con PBS dos veces a la semana mediante bioluminiscencia del indicador de luciferasa. En el dfa 14, la evolucion tumoral estaba 20 significativamente inhibida por el tratamiento con M14 (reduccion de 7 a 11 veces en la evolucion tumoral) en
comparacion con los ratones tratados con PBS (figura 24).
Los ejemplos y la descripcion anteriores de las realizaciones preferidas deben considerarse como ilustrativas, mas que limitativas la presente invencion tal como se define por las reivindicaciones. Tal como se apreciara facilmente, 25 pueden utilizarse numerosas variaciones y combinaciones de las caracterfsticas expuestas anteriormente sin aparatarse de la presente invencion tal como se expone en las reivindicaciones. No se considera que tales variaciones se aparten del alcance de la invencion.

Claims (15)

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    25
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    50
    REIVINDICACIONES
    1. Agente que se une a IGFBP2 e inhibe que IGFBP2 se una a IGF1, para su uso en el tratamiento de cancer.
  2. 2. Agente para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el tratamiento da como resultado una inhibicion de metastasis de cancer.
  3. 3. Agente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el cancer es un cancer metastasico.
  4. 4. Agente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que el cancer es un cancer de mama.
  5. 5. Agente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el agente es un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo.
  6. 6. Agente para su uso segun la reivindicacion 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  7. 7. Agente para su uso segun la reivindicacion 6, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10, o parte de union a antigeno del mismo.
  8. 8. Agente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que el anticuerpo monoclonal se une a IGFBP2 con una Kd de 10-7 M o menos.
  9. 9. Agente para su uso segun la reivindicacion 7, en el que el anticuerpo monoclonal no presenta sustancialmente union a IGFBP3 o IGFBP4.
  10. 10. Agente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que el anticuerpo monoclonal inhibe el reclutamiento de celulas endoteliales por celulas de cancer de mama humanas metastasicas.
  11. 11. Agente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que el anticuerpo monoclonal es humanizado.
  12. 12. Agente para su uso segun la reivindicacion 6, en el que el anticuerpo monoclonal es una version humanizada de un primer anticuerpo, comprendiendo dicho primer anticuerpo una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:9 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:10, en el que dicho anticuerpo monoclonal se genera mediante injerto de CDR.
  13. 13. Anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que se une a IGFBP2, comprendiendo dicho anticuerpo una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:9 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:10.
  14. 14. Anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo segun la reivindicacion 13, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  15. 15. Anticuerpo monoclonal, o parte de union a antigeno del mismo, que se une a IGFBP2, anticuerpo monoclonal que es una version humanizada de un primer anticuerpo, comprendiendo dicho primer anticuerpo una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:9 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:10, en el que dicho anticuerpo monoclonal se genera mediante injerto de CDR.
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