ES2763087T3 - Método para la identificación de ácidos nucleicos que regulan la metastatización - Google Patents

Método para la identificación de ácidos nucleicos que regulan la metastatización Download PDF

Info

Publication number
ES2763087T3
ES2763087T3 ES17184170T ES17184170T ES2763087T3 ES 2763087 T3 ES2763087 T3 ES 2763087T3 ES 17184170 T ES17184170 T ES 17184170T ES 17184170 T ES17184170 T ES 17184170T ES 2763087 T3 ES2763087 T3 ES 2763087T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
population
cells
cancer cells
metastatic
mir
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17184170T
Other languages
English (en)
Inventor
Sohail Tavazoie
Nils Halberg
Kim Png
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rockefeller University
Original Assignee
Rockefeller University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rockefeller University filed Critical Rockefeller University
Application granted granted Critical
Publication of ES2763087T3 publication Critical patent/ES2763087T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/12—Applications; Uses in screening processes in functional genomics, i.e. for the determination of gene function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Un método para la identificación de un gen o ARN no codificante que regula la colonización por cáncer metastásico de un tejido corporal, que comprende, a) introducir una o más moléculas de ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante en una población de células cancerosas iniciales para generar una población de células cancerosas modificadas por ingeniería, en donde la población de células cancerosas iniciales se obtiene realizando tandas en serie de trasplante, aislamiento y trasplante repetido de una población de células cancerosas marcadas o no marcadas en un tejido vivo no humano; b) trasplantar dicha población de células cancerosas modificadas por ingeniería en un tejido del cuerpo no humano; c) aislar células trasplantadas para obtener una población de células cancerosas aisladas; y d) evaluar la cantidad de molécula de ARNhc, ARNi, microARN o de ARN no codificante o de gen codificante de proteína en la población de células cancerosas aisladas, en donde una disminución en la cantidad de dicho ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante en la población de células aisladas con respecto a su cantidad antes del trasplante indica que el gen o genes diana de dicho ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante representan un gen necesario para la colonización metastásica de dicho tejido.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la identificación de ácidos nucleicos que regulan la metastatización
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud estadounidense provisional n.° 61/441.738, presentada el 11 de febrero de 2011.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a tratamientos para trastornos de la angiogénesis.
Antecedentes de la invención
La angiogénesis es un proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos y remodelación de vasos sanguíneos preexistentes. Es vital para el crecimiento y desarrollo normales, así como otros procesos fisiológicos, tales como la cicatrización de heridas. Por otro lado, la angiogénesis también es importante en diversos procesos patológicos. Por ejemplo, la angiogénesis patológica es una etapa fundamental en la transición de tumores de un estado latente a uno maligno, caracterizado por las propiedades de anaplasia, invasividad y metástasis.
La evolución metastásica del cáncer constituye un reto clínico formidable. Los avances tecnológicos han permitido la detección y el tratamiento de algunas neoplasias de estadio temprano, sin embargo, las tasas de mortalidad total debido a cánceres malignos epiteliales han permanecido esencialmente inalteradas a lo largo de los últimos cuarenta años (seer.cancer.gov/csr/1975_2007/, Instituto Nacional de Salud, 2007). Generalmente se cree que esto se debe a varios factores, incluyendo heterogeneidad molecular dentro de los tipos de cáncer, regímenes quimioterápicos de eficacia moderada que se derivaron históricamente de manera empírica, y una atención de larga tradición en los elementos impulsores moleculares del crecimiento de tumor primario en vez de evolución metastásica.
La prevención o el tratamiento eficaces de metástasis exige la compresión de eventos moleculares y celulares, incluyendo la angiogénesis, subyacentes a este proceso complejo (Talmadge, J. E. et al., Cancer Res 70 (14), 5649 (2010); Sleeman, J. et al., Eur J Cancer 46 (7), 1177 (2010); y Hurst, D. R., et al, Cancer Res 69 (19), 7495 (2009)). Se ha descubierto VEGF como promotor de la tumorigénesis en tumores primarios (Kim, K. J. et al., Nature 362 (6423), 841 (1993)). Algunos ensayos clínicos han mostrado que la inhibición de VEGF puede prolongar, en combinación con quimioterapia, la supervivencia en 2-3 meses en pacientes con cáncer de pulmón o colorrectal de estadio IV (Hurwitz, H. et al, N Engl J Med 350 (23), 2335 (2004); Giantonio, B. J. et al., J Clin Oncol 25 (12), 1539 (2007); y Sandler, A. et al., N Engl J Med 355 (24), 2542 (2006)). Sin embargo, no se ha probado que la inhibición de VEGF sea beneficiosa para la prevención de metástasis en la práctica de terapia adyuvante (Barugel, M. E., et al. Expert Rev Anticancer Ther 9 (12), 1829 (2009) y en recientes modelos de metástasis preclínicos (Paez-Ribes, M. et al., Cancer Cell 15 (3), 220 (2009) y Ebos, J. M. et al., Cancer Cell 15 (3), 232 (2009)). Aunque se ha propuesto que la compensación por otros factores desconocidos que fomentan la angiogénesis metastásica subyace a estos desenlaces, varios investigadores han tratado de abordar la metástasis mediante rutas distintas a la angiogénesis. Por ejemplo, el documento WO 2009082744 describió genes sobre expresados en metástasis en hueso y pulmón de cáncer de mama, en los que los genes no estaban relacionados con la angiogénesis. Otros se esforzaron por identificar factores que medien en la angiogénesis metastásica. Sin embargo, han tenido un éxito limitado.
Por tanto, existe la necesidad de agente y métodos para regular la angiogénesis y para tratar trastornos caracterizados por angiogénesis patológica, incluyendo cáncer.
Sumario de la invención
Esta invención se basa, al menos en parte, en un descubrimiento inesperado de una nueva ruta que regular el reclutamiento endotelial y, a su vez, la angiogénesis.
Por consiguiente, en el presente documento se describe un método para inhibir el reclutamiento endotelial, así como la angiogénesis, en un sujeto que lo necesita. El método incluye una etapa de administrar al sujeto un primer agente que inhibe la expresión o actividad de una primera proteína seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1. En un ejemplo, el sujeto tiene un trastorno de la angiogénesis, es decir, un trastorno caracterizado por angiogénesis patológica, tales como cáncer, un trastorno ocular o un trastorno inflamatorio. Los ejemplos del cáncer incluyen cáncer metastásico. El método mencionado anteriormente puede incluir además una etapa de administrar al sujeto un segundo agente que inhibe la expresión o actividad de una segunda proteína seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR. El primer agente o el segundo agente mencionados anteriormente pueden ser un anticuerpo (o una parte de unión a antígeno del mismo), un ácido nucleico, un polipéptido o un compuesto de molécula pequeña. En un ejemplo, el anticuerpo anterior es uno monoclonal que contiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 mostradas a continuación.
Además, en el presente documento se describe un método para tratar cáncer metastásico en un sujeto que lo necesita. El método incluye una etapa de administrar al sujeto un primer agente que inhibe la expresión o actividad de una primera proteína seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1, en el que el primer agente inhibe la angiogénesis. Los ejemplos del cáncer incluyen cáncer de mama. El método puede incluir además una etapa de administrar al sujeto un segundo agente que inhibe la expresión o actividad de una segunda proteína seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR. El primer agente o segundo agente pueden ser un anticuerpo (o una parte de unión a antígeno del mismo), un ácido nucleico, un polipéptido o un compuesto de molécula pequeña. En un ejemplo, el anticuerpo anterior es uno monoclonal que contiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 mostradas a continuación.
Adicionalmente, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia que codifica para un agente de iARN que puede inhibir la expresión de una proteína seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1. En una realización, el agente de iARN tiene una estructura bicatenaria que tiene una primera hebra y una segunda hebra; cada una de las hebras primera y segunda tiene entre 19 y 30 nucleótidos de largo; y la primera hebra está codificada por una cualquiera de SEQ ID NO: 1-6 tal como se enumera en la tabla 5 a continuación.
Además, en el presente documento se proporciona una composición que tiene un agente que inhibe la expresión o actividad de una proteína seleccionada del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1, en el que el agente puede ser un anticuerpo (o una parte de unión a antígeno del mismo), un ácido nucleico, un polipéptido o un compuesto de molécula pequeña. En un ejemplo, el agente es el ácido nucleico aislado mencionado anteriormente. En otros casos, el agente es un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo.
También se describe en el presente documento un método para diagnosticar el potencial metastásico de cáncer en un sujeto. El método incluye las etapas de obtener un primer nivel de expresión para un primer gen del sujeto seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, MERTK y PITPNC1, y comparar el primer nivel de expresión con un primer nivel predeterminado para el primer gen seleccionado. Se determina que el sujeto tiene o es propenso a desarrollar cáncer metastásico si el primer nivel de expresión es mayor que el primer nivel predeterminado. El primer nivel predeterminado puede obtenerse a partir de un sujeto de control que está libre de cáncer. En un ejemplo, el método incluye además las etapas de obtener un segundo nivel de expresión para un segundo gen del sujeto seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR; y comparar el segundo nivel de expresión con un segundo nivel predeterminado para el segundo gen seleccionado. Se determina que el sujeto tiene o es propenso a desarrollar cáncer metastásico si tanto el primer nivel de expresión como el segundo nivel de expresión son mayores que el primer nivel predeterminado y el segundo nivel predeterminado, respectivamente. El segundo nivel predeterminado también puede obtenerse a partir de un sujeto de control que está libre de cáncer.
La patente también proporciona un método para inhibir el reclutamiento endotelial en un sujeto que lo necesita. El método incluye una etapa de administrar al sujeto un primer agente que aumenta la expresión o actividad de GAS6 (es decir, un agente de activación de GAS6).
La descripción presenta además una composición que tiene un agente que aumenta la expresión o actividad de GAS6. En un ejemplo, el agente mencionado anteriormente tiene GAS6 actividad. En otros casos, el agente es un anticuerpo (o una parte de unión a antígeno del mismo), un ácido nucleico, un polipéptido o un compuesto de molécula pequeña. En un ejemplo, el agente es un polipéptido que tiene la secuencia de GAS6.
Además, la descripción proporciona un kit para diagnosticar el potencial metastásico de cáncer en un sujeto. El kit incluye un primer reactivo que se une específicamente a un primer producto de expresión (por ejemplo, polipéptido o ARNm) de un primer gen seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, MERTk y PITPNC1. El kit puede incluir además un segundo reactivo que se une específicamente a un segundo producto de expresión de un segundo gen seleccionado del grupo que consiste en IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR.
La invención presenta un método para la identificación de genes y ARN no codificantes que regulan la colonización por cáncer metastásico de cualquier tejido corporal. El método incluye una primera etapa de generar una población de células cancerosas de mamífero con un potencial aumentado de colonización tisular metastásica realizando tandas en serie de a) trasplante de una población de células cancerosas marcadas o no marcadas en cualquier tejido vivo del cuerpo y luego b) realización del aislamiento de dichas células cancerosas marcadas del tejido después de haberse producido la colonización metastásica y luego c) realización de un trasplante repetido de células cancerosas marcadas aisladas en tejido vivo del cuerpo. Al realizar tandas en serie de trasplante, aislamiento y trasplante repetido de células cancerosas marcadas tal como se describió anteriormente, se genera una población de células cancerosas marcadas o no marcadas con alto potencial de colonización tisular metastásica. La segunda etapa del método incluye transducir, transfectar o introducir de otro modo una población de una o más moléculas de ARNhc en la población de células cancerosas con alto potencial de colonización tisular metastásica para generar una población de células cancerosas modificadas por ingeniería con alto potencial metastásico que expresan una o más moléculas de ARNhc que reducen la expresión de uno o más genes o ARN no codificantes. Esta población de células cancerosas modificadas por ingeniería con alto potencial metastásico que expresan una o más moléculas de ARNhc luego a) se trasplantan en cualquier tejido vivo y luego b) se aíslan del tejido vivo después de haberse producido la colonización metastásica. La presencia, ausencia o abundancia de uno o más de los ARNhc transfectados, transducidos o introducidos de otro modo en la población de células cancerosas modificadas por ingeniería tras el trasplante aisladas se evalúa luego mediante o bien análisis de microalineamientos, tecnología de secuenciación de ADN, tecnología de secuenciación masiva o bien clonación. La reducción de los niveles de cualquier ARNhc individual en la población de células aisladas con relación a su representación antes de la inyección indica que se requiere el gen diana de ARNhc para la colonización metastásica del tejido. El aumento de los niveles de cualquier ARNhc individual en la población de células aisladas con relación a su representación antes de la inyección indica que la diana de ARNhc antagoniza la colonización metastásica del tejido. La segunda etapa de este método también podría incluir transducir, transfectar o introducir de otro modo una población de una o más moléculas de iARN, microARN o ARN no codificantes. Adicionalmente, la segunda etapa también podría incluir transducir, transfectar o introducir de otro modo una población de uno o más secuencias que codifican para genes codificantes de proteínas. La población de células cancerosas modificadas por ingeniería con alto potencial metastásico que expresan uno o más genes codificantes de proteínas luego a) se trasplantan en cualquier tejido vivo y luego b) se aíslan del tejido vivo después de haberse producido la colonización metastásica. La presencia, ausencia o abundancia de uno o más de los genes codificantes transfectados, transducidos o introducidos de otro modo en la población de células cancerosas modificadas por ingeniería tras el trasplante aisladas se evalúa luego mediante o bien análisis de microalineamientos, tecnología de secuenciación de ADN, tecnología de secuenciación masiva o bien clonación. El aumento de los niveles de cualquier gen individual en la población de células aisladas con relación a su representación antes de la inyección indica que el gen representa un gen diana requerido para la colonización metastásica del tejido. La disminución de los niveles de cualquier gen individual en la población de células aisladas con relación a su representación antes de la inyección indica que el gen representa un gen diana que antagoniza la colonización metastásica del tejido.
También se proporciona en el presente documento un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado o humano) o una parte de unión a antígeno del mismo que neutraliza la función de IGFBP2 inhibiendo la unión de IGFBP2 a IGF1. Este anticuerpo puede inhibir el reclutamiento endotelial por células cancerosas, tales como células de cáncer de mama metastásicas o inhibir la angiogénesis patológica. Este anticuerpo también puede inhibir la evolución tumoral o metástasis tumoral de células cancerosas, tales como de cáncer de mama humanas, in vivo. En un ejemplo, el anticuerpo monoclonal contiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 mostradas a continuación.
Se exponen los detalles de una o más realizaciones de la invención a continuación en la descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones.
Descripción de dibujos
Las figuras 1a-f son diagramas y fotografías que muestran que miR-126 endógeno suprime la colonización metastásica. a, obtención de imágenes de bioluminiscencia de metástasis en pulmón por células de cáncer de mama escasamente metastásicas tras la inhibición de miR-126. Se les inyectaron 4 X 104 células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto (miR-Zip) o la horquilla de control por vía intravenosa a ratones NOD-SCID inmunodeficientes. Los ratones representativos mostrados corresponden al conjunto MDA-MB-231/miR-126KD (parte superior) y al conjunto MDA-MB-231/reordenadas (parte inferior) en el día 49. Se cuantificó la colonización pulmonar a través de la obtención de imágenes de bioluminiscencia. n=5; las barras de error representan el e.e.m.; valor de p basado en una prueba de la t de Student unilateral en el día 49. Se extirparon los pulmones en el día 49 y se tiñeron de manera inmunohistoquímica para vimentina humana (parte derecha). b, obtención de imágenes de bioluminiscencia de metástasis sistémica por células de cáncer de mama escasamente metastásicas con expresión de miR-126 inhibida. Se les inyectaron 4 X 104 células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control a través de la vía intracardiaca a ratones desnudos atímicos. Los ratones representativos mostrados corresponden al conjunto MDA-MB-231/miR-126KD (parte superior) y al conjunto MDA-MB-231/reordenado (parte inferior) en el día 34. Se midió la colonización en cuerpo entero mediante bioluminiscencia y se cuantificó. n=4; las barras de error representan el e.e.m.; valor de p basado en una prueba de la t de Student unilateral en el día 34. c, se contó el número total de focos metastásicos en ratones a los que se les inyectó por vía intracardiaca células MDA-MB-231/miR-126KD y MDA-MB-231/reordenadas (parte superior). Se muestran imágenes representativas de nódulos metastásicos en hueso y cerebro (parte inferior). d, se les inyectaron 5 X 105 células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control a los panículos adiposos mamarios de ratones inmunodeficientes. Se midieron los volúmenes tumorales a lo largo del tiempo. n=15; las barras de error indican el e.e.m.; valores de p basados en una prueba de la t de Student unilateral en el día 35. e, se tiñeron los pulmones extirpados de (a) para vimentina humana y se midió el tamaño de cada nódulo metastásico a través de análisis de imágenes usando ImageJ. f, se les inyectaron 4 X 104 células Lm2 que expresan un casete de pre-miR-126 inducible por doxiciclina a través de la vena de la cola a ratones NOD-SCID en el día 0. En el día 3, se añadieron doxiciclina (2 mg/ml) y sacarosa (5 %) al agua para beber en un grupo de ratones y sólo sacarosa al 5 % en el otro. En el día 48, se extirparon los ratones y se tiñeron de manera inmunohistoquímica para vimentina humana (parte derecha). Se muestra el número total de nódulos en cada pulmón en la parte izquierda.
Las figuras 2a-2J son diagramas y fotografías que muestran que miR-126 endógeno suprimió de manera autónoma no celular la angiogénesis metastásica por células de cáncer de mama metastásicas. a, se tiñeron doblemente de manera histológica secciones de pulmón de la figura 1a para vimentina humana y MECA-32 o b, para vimentina y se inyectó lectina por vía intravenosa. Se delimitó el borde de cada nódulo basándose en la tinción de vimentina y la tinción de lectina/MECA-32 en el interior del nódulo metastásico destacó en negro (paneles inferiores). Luego se determinó el área positiva para la tinción de lectina/MECA-32 dentro de cada nódulo usando el software ImageJ y se presentó como el área cubierta por la tinción de lectina/MECA-32 por área del nódulo dado (% de densidad de vasos). La distribución del % de densidad de vasos entre las células miR-126 KD y el control de MDA-MB-231 inyectado se muestra en una representación gráfica de fracción acumulada. n=8/grupo (dando como resultado un total 18 nódulos metastásicos en el control, y 68 en las células miR-126 KD), valor de p basado en la prueba de Kolmogorov-Smirnov. c, se sembraron 5 X 104 células LM2 que expresan miR-126 o una horquilla de control sobre una monocapa de HUVEC y se cuantificó la adhesión. Se obtuvieron imágenes de células que se habían adherido a la monocapa de HUVEC y se analizaron usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m. d , se obtuvieron medios condicionados a partir de 5 X 105 células LM2 que expresan miR-126 o una horquilla de control incubando las células con medios EGM-2 durante 24 h. Se sembraron 2,5 X 104 células HUVEC por triplicado, se hicieron crecer en los medios condicionados y se contaron las células viables a los 5 días tras la siembra. n=3; las barras de error representan el e.e.m. e, se mezclaron 2 X 104 células HUVEC con 1 X 104 células LM2 que se transdujeron con miR-126 o una horquilla de control, y se sometió a ensayo la formación de tubos por las células HUVEC. Se obtuvieron imágenes de cada pocillo y se cuantificó el número de puntos de ramificación en cada imagen usando el software MetaMorph. n=3; las barras de error representan el e.e.m. La barra de escala representa 250 |im. f, se sembraron 2,5 X 104 células MDA-MB-231 y células LM2 por cuadruplicado. Luego se evaluó la migración en Transwell de 5 X 104 células HUVEC hacia las células cancerosas contando el número de células que habían migrado al lado basal de los insertos Transwell en imágenes obtenidas usando ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. g, se sometieron células LM2 que expresan miR-126 o la horquilla de control, así como células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control al ensayo de reclutamiento de HUVEC. Se obtuvieron imágenes del lado basal de los insertos y se contaron las células usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. Las imágenes representativas mostradas corresponden al conjunto LM2/miR-126OE o de control (parte superior) y al conjunto MDA-MB-231/miR-126KD o de control (parte inferior). La barra de escala representa 100 |im. h, se sometieron células parentales CN34 y células CN34 LM1a al ensayo de reclutamiento de HUVEC. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. i, se sometieron células CN34 LM1a que expresan miR-126 o la horquilla de control, así como células parentales CN34 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control, al ensayo de reclutamiento de HUVEC. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. Se muestran imágenes representativas. La barra de escala representa 100 |im. j , se mezclaron 5 X 105 células Lm2 que sobreexpresan miR-126 o la horquilla de control, así como 5 X 105 células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control, 1:1 con Matrigel y se inyectaron en el panículo adiposo mamario. Se analizaron tumores de tamaño coincidente para determinar la densidad de vasos sanguíneos mediante tinción inmunohistoquímica para MECA-32. se tomaron 5 campos individuales para cada tumor y se facilita el porcentaje de cada campo cubierto por una tinción de MECA-32 seleccionada como umbral como el % de densidad de vasos. Se muestra la cuantificación en la parte superior y se muestran a continuación imágenes representativas. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 3a-3f son diagramas y fotografías que muestran la identificación sistemática de una red reguladora de miR-126 que media en el reclutamiento endotelial metastásico. a, El rasgo distintivo de metástasis de miR-126 se compone de genes sobreexpresados en células metastásicas, regulados por disminución por miR-126 OE, e inducidos por miR-126 KD. El mapa de calor representa niveles de expresión normalizados según la varianza basados en análisis de microalineamientos y de qPCR. El mapa de colores corresponde al cambio de desviaciones estándar con respecto a la media. b-d, curvas de Kaplan-Meier para la (b) cohorte de cáncer de mama UCSF (117 tumores), (c) cohorte NKI (295 tumores), y (d) la cohorte combinada NKI/MSK/UCSF (494 tumores) que representa la supervivencia libre de metástasis de aquellos pacientes cuyos cánceres primarios sobreexpresaron el rango distintivo de ocho genes de miR-126 (positivos) y los que no lo hicieron (negativos). Valores de p basados en la prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox. e , Ensayos de indicador de luciferasa de genes de metástasis de miR-126 en células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla KD de control. Se transfectaron constructos de indicador que contenían el gen de luciferasa en el sentido de 5' de las secuencias de 3'UTR o codificantes (CDS) de cada gen regulado por miR-126 en las diversas líneas celulares y se sometió a ensayo la actividad luciferasa a las 30 horas tras la transfección. n=4; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. f, se mutaron las regiones complementarias de miR-126 de los constructos 3'UTR/CDS y se repitió el ensayo de indicador de luciferasa con estos constructos en células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control (parte derecha). n=4; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 4a-4e son un conjunto de diagramas y fotografías que muestran que la angiogénesis y colonización metastásica fomentada por IGFBP2, PITPNC1 y Me RTK. a, se sembraron 2,5 X 104 células LM2 que expresan horquillas que seleccionan como diana IGFBP2, MERTK, PITPNC1, SHMT2 o la horquilla de control por cuadruplicado. Luego se evaluó la migración en Trans-well de 5 X 104 células HUVEC hacia las células cancerosas. Se obtuvieron imágenes de las células que migraron a través de los insertos Transwell y se analizaron usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando a la prueba de la t de Student. Se muestran imágenes representativas. La barra de escala representa 100 p. b, se cuantificaron los niveles de expresión relativos de IGFBP2, MERTK o PITPNC1 en muestras de tumor de mama humano de pacientes en estadio I/II (n=53) en comparación con el estadio III (n=29) o el estadio IV (n=9) a partir de los microalineamientos de cáncer de mama OriGene TissueScan usando qPCR. Las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. c-e, obtención de imágenes de bioluminiscencia de metástasis en pulmón por células de cáncer de mama metastásicas en pulmón con expresión inhibida de los diversos genes regulados por miR-126. Se les inyectaron 4 X 104 células LM2 que expresan la horquilla de control u horquillas cortas independientes que seleccionan como diana IGFBP2 (c), Se les inyectaron PITPNci (d) y MERTK (e) por vía intravenosa a ratones NOD-SCID inmunodeficientes. Se midió la colonización en pulmón mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia y se cuantificó. n=5; las barras de error representan el e.e.m.; valor de p basado en una prueba de la t de Student unilateral.
Las figuras 5a-5g son diagramas y fotografías que muestran que IGFBP2 medió en el reclutamiento endotelial activando la señalización de IGF1/IGF1R en células endoteliales. a, se cuantificaron mediante ELISA los niveles de IGFBP2 en medios condicionados a partir de los ensayos de reclutamiento de HUVEC usando células MDA-MB-231 y células LM2 (figura 2f). n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. b, se sembraron 2,5 X 104 células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control, así como células LM2 que expresan miR-126 o la horquilla de control, por cuadruplicado. Luego se evaluó el reclutamiento en Trans-well de 5 X 104 células HUVEC en presencia de Ac contra IGFBP2 50 ng/ml o Ac contra IgG 50 ng/ml hacia las células cancerosas. Se obtuvieron imágenes del lado basal de los insertos Transwell y se cuantificó el número de células que habían migrado usando ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. La barra de escala representa 100 |im. c, se sembraron 2,5 X 104 células CN34 Par que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control, así como células CN34 Lmla que expresan miR-126 o la horquilla de control, por cuadruplicado. Luego se evaluó la migración en Trans-well de 5 X 104 células HUVEC en presencia de Ac contra IGFBP2 50 ng/ml o Ac contra IgG 50 ng/ml hacia las células cancerosas. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. d , e , se sometió a ensayo el reclutamiento en Trans-well de células HUVEC incubadas con Ac de bloqueo de IGF-1 20 |ig/ml (d), Ac de bloqueo de IGF-2 20 |ig/ml (d), Ac de bloqueo de IGF1R 20 |ig/ml (e), Ac de bloqueo de IGF2R 5 |ig/ml (e) o IgG de control (d, e) hacia células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. f, se pretrataron células HUVEC y cancerosas con Ac de bloqueo de IGF1R 20 |ig/ml o Ac contra IgG de control durante 1 hora antes de evaluarse el reclutamiento en Transwell de células HUVEC hacia células cancerosas. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student g, se simuló un gradiente de IGFBP2 mezclando las cantidades dadas de proteína IGFBP2 recombinante con Matrigel (1:1) en el fondo de un pocillo. Luego se evaluó la quimiotaxia de 1,5 X 105 células HUVEC a lo largo del gradiente de IGFBP2 contando el número de células que habían migrado al lado basal de insertos Trans-well después de 20 h usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 6a-6e son diagramas y fotografías que muestran que MERTK medió en el reclutamiento a través de GAS6. a, se cuantificaron los niveles de IGFBP2 en medios condicionados a partir de Lm2 células que expresan la horquilla de control o 2 horquillas independientes contra PITPNC1 tal como se determina mediante ELISA. b, se sembraron 2,5 X 104 células MDA-MB-231 que expresan una horquilla de control o una horquilla que selecciona como diana miR-126 por cuadruplicado. Luego se evaluó la migración en Trans-well de 5 X 104 células HUVEC hacia las células cancerosas en presencia de GAS6 1 ng/ml y/o MerFc 10 |ig/ml contando el número de células que habían migrado al lado basal de insertos porosos en imágenes obtenidas usando ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student. c, simuló un gradiente de IGFBP2 en presencia de Gas6 y MERTK secretado mezclando proteína rhIGFBP2 (520 ng), Gas6 (5 ng) y MerFc (10 ug) con Matrigel (1:1) en el fondo de un pocillo. Luego se evaluó la quimiotaxia de 1,5 X 105 células HUVEC a lo largo del gradiente contando el número de células que habían migrado al lado basal de insertos Trans-well después de 20 h usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student. d , Se tiñeron doblemente secciones de pulmón para vimentina y MECA-32. Se trazó el borde de cada nódulo basándose en la tinción de vimentina humana y la tinción de MECA-32 en el interior del nódulo metastásico destacado en negro (paneles inferiores). Luego se determinó el área positiva para la tinción de MECA-32 dentro de cada nódulo usando ImageJ y se presentó como el área cubierta por la tinción de MECA-32 por área del nódulo dado (% de densidad de vasos). La distribución de % de densidad de vasos entre las células LM2 inyectadas que expresan horquillas que seleccionan como diana IGFBP2, PITPNC1, MERTK o una horquilla de control se muestra en una representación gráfica de fracción acumulada. n=4, valor de p basado en la prueba de Kolmogorov-Smirnov. e , esquema de la regulación por miR-126 de reclutamiento endotelial y colonización metastásica a través de interacción con IGFBP2, PTTPNC1 y MERTK.
La figura 7 es un diagrama que muestra que el sistema de miARN-ARNhc antisentido miR-Zip inhibió de manera estable la expresión de miR-126 en células MDA-MB-231. Se transdujeron células MDA-MB-231 con lentivirus que expresan o bien un constructo de miR-Zip que selecciona como diana miR-126 o una versión reordenada del constructo que no selecciona como diana ningún microARN conocido (SYSTEM BIOSCIENCES, Mountain View, CA). Luego se sometieron a prueba los niveles de expresión de miR-126 maduro usando qPCR.
La figura 8 es un conjunto de fotografías y un diagrama que muestran que miR-126 expresado en células de cáncer de mama regula la perfusión en nódulos metastásicos. Se les inyectaron 4 X 104 células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto o la horquilla de control por vía intravenosa a ratones NOD-SCID inmunodeficientes. En el día 59, se le inyectó por vía intravenosa una disolución de dextrano de bajo peso molecular (MW de 10.000) marcado con FITC. Se permitió que circulasen las moléculas de dextrano durante 15 min antes de sacrificarse los ratones y extirparse los pulmones. Se prepararon secciones congeladas y se tiñeron para vimentina humana con el fin de localizar nódulos metastásicos, y se cuantificó la señal de FITC en el interior de los nódulos con un umbral constante usando ImageJ. n=5; las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 9a-9b son un conjunto de diagramas que muestran que miR-126 endógeno no suprimió la adhesión, proliferación o formación de tubos endoteliales. a, se sembraron 5 X 104 MDA células que expresan miR-126 KD o un vector KD de control sobre una monocapa de HUVEC y se evaluó la adhesión. Se obtuvieron imágenes de células que se habían adherido a la monocapa de HUVEC y se analizaron usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m. b, se obtuvieron medios condicionados a partir de 5 X 105 células MDA miR-126 KD o MDA control KD incubando las células con medios EGM-2 durante 24 h. Se sembraron 2,5 X 104 células HUVEC por triplicado, se hicieron crecer en los medios condicionados y se contaron las células viables a los 5 días después de la siembra. n=3; las barras de error representan el e.e.m. c, se mezclaron 2 X 104 células HUVEC con 1 X 104 MDA miR-126 KD o MDA control KD células, y se sometió a ensayo la formación de tubos por células HUVEC. Se obtuvieron imágenes de cada pocillo y se analizó el número de puntos de ramificación en cada imagen usando el software MetaMorph. n=3; las barras de error representan el e.e.m.
Las figuras 10a-10c son un conjunto de diagramas y diagramas que muestran que miR-126 endógeno reguló la angiogénesis, pero no el reclutamiento de linfocitos positivos para CD45 y de macrófagos positivos para Mac-2. a-c, se mezclaron 5 X 105 células MDA que expresan la horquilla de control o una horquilla que selecciona como diana miR-126 en una razón 1:1 con Matrigel y se inyectaron en el panículo adiposo mamario. 5 min antes del sacrificio, se inyectó lectina biotinilada en la vena de la cola. Se extirparon tumores de tamaño coincidente y se detectaron vasos sanguíneos funcionales mediante tinción de la lectina inyectada (a), se detectaron linfocitos CD45+ mediante el anticuerpo anti-CD45 (b) y se detectaron macrófagos Mac-2+ mediante el anticuerpo anti-Mac-2 (c).
La figura 11 es un diagrama de Venn que muestra la ruta experimental integradora que dio como resultado la identificación de supuestos genes diana de miR-126. Se solaparon perfiles de transcriptomas de genes regulados por disminución en más de 1,6 veces tras la sobreexpresión de miR-126 con genes regulados por incremento en más de 1,4 veces en células LM2 metastásicas en comparación con las células MDA parentales. Esto condujo a la identificación de 23 posibles genes diana de miR-126. Mediante qPCR, 8 de estos 23 genes se vieron modulados por miR-126 tanto en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 como en la línea celular primaria CN34. Se sometieron estos 8 genes a pruebas funcionales para determinar la regulación directa por miR-126 a través de ensayos de indicador de luciferasa.
Las figuras 12a-12b son diagramas que muestran que miR-126 reguló IGFBP2 y MERTK a través de interacciones de 3'UTR y PITPNC1 y SHMT2 a través de interacciones de CDS. a, b, ensayos de indicador de luciferasa del conjunto de genes de metástasis de miR-126 en células MDA-MB-231 que expresan un miR-126 de selección como diana en horquilla corto así como la horquilla KD de control. Se transfectaron constructos de indicador que contenían el gen de luciferasa en el sentido de 5' de 3'UTR (a) o CDS (b) de ABCB9, IGFBP2, MERTK, PITPNC1, PSAT1, PYBG, SHMT2 y VIPR1 en las diversas líneas celulares y se sometió a ensayo la actividad luciferasa a las 30 horas tras la transfección. n=4; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student.
Las figuras 13a-13d son un conjunto de diagramas que muestran que horquillas independientes regularon por disminución los niveles de expresión de IGFBP2, PITPNC1 y MERTK en células LM2. Se transdujeron células LM2 con lentivirus que expresan una horquilla de control o un constructo de horquilla corta que selecciona como diana IGFBP2, PITPNC1 o MERTK. Se analizaron los niveles de expresión de los genes diana a través de qPCR.
La figura 14 es un diagrama que muestra el análisis de proliferación de genes diana de miR-126. Se sembraron 2,5 X 104 células LM2 que expresan una horquilla de control u horquillas cortas que seleccionan como diana IGFBP2, PITPNC1 o MERTK por triplicado y se contaron las células viables a los 5 días después de la siembra. n=3; las barras de error representan el e.e.m.
La figura 15 es un diagrama que muestra que IGFBP2 fomentó la migración de HUVEC. Se estimularon células HUVEC con las cantidades dadas de proteína IGFBP2 humana recombinante y Ac anti-IGF1R (10 |ig/ml) durante 40 min, se tripsinizaron y se sembraron 5 X 104 células en un inserto Transwell poroso. Se permitió que las células migrasen durante 24 horas antes de cuantificarse el número de células que migraron a través de la membrana. n=6; las barras de error representan el e.e.m.; se obtuvieron valores de p usando la prueba de la t de Student.
La figura 16 es una fotografía del análisis de inmunotransferencia de tipo Western de MERTK en lisado celular de MDA-MB-231 y medios condicionados, que muestra que se escindió el ectodominio de MERTK y se secretó por células MDA-MB-231.
La figura 17 es un conjunto de fotografías y diagramas que muestran que GFBP2, PITPNC1 y MERTK fomentaron la angiogénesis metastásica. Se tiñeron doblemente de manera histológica secciones de pulmón para vimentina humana y se inyectó lectina por vía intravenosa. Se delimitaron los bordes de nódulo basándose en la tinción de vimentina y la tinción de lectina en el interior de los nódulos metastásicos. Se usó ImageJ para determinar el área positiva para la tinción de lectina dentro de cada nódulo. % de densidad de vasos representa el área cubierta por la tinción de lectina por área de un nódulo dado. La distribución de % de densidad de vasos entre las células LM2 inyectadas que expresan la horquilla de control u horquillas cortas que seleccionan como diana IGFBP2, PITPNC1 o MERTK se muestra en una representación gráfica de fracción acumulada. n=5. Valor de p basado en la prueba de Kolmogorov-Smirnov.
La figura 18 es un diagrama que muestra que la expresión de miR-126 endógeno en células HUVEC no suprimió el reclutamiento de otras células HUVEC. Se transfectaron un antagomiR que selecciona como diana miR-126 o un antagomiR de control en células HUVEC antes de someterse al ensayo de reclutamiento de HUVEC. Se obtuvieron imágenes del lado basal de los insertos y se contaron las células usando el software ImageJ. n=4; las barras de error representan el e.e.m.
La figura 19 es un diagrama que muestra la expresión de posibles dianas de miR-126 en células HUVEC con niveles de miR-126 suprimidos. Se transfectaron un antagomiR que selecciona como diana miR-126 o un antagomiR de control en células HUVEC y se cuantificó la expresión relativa de posibles dianas en células transfectadas usando qPCR. Las barras de error representan el e.e.m., valores de p obtenidos usando la prueba de la t de Student.
La figura 20 es un conjunto de diagramas que muestran datos de ensayos ELISA de captura de anticuerpo usados para caracterizar las propiedades de unión de anticuerpos neutralizantes de IGFBP2. La figura muestra que el sobrenadante de una de las bibliotecas de hibridomas (wo6663-1) generadas a partir de animales inoculados con péptido total de IGFBP2 recombinante, contiene anticuerpos que se unen a IGFBP2 con alta afinidad.
La figura 21 es un conjunto de diagramas que muestran datos de ensayos ELISA de captura de anticuerpo usados para caracterizar las propiedades de unión de anticuerpos neutralizantes de IGFBP2. La figura muestra que el sobrenadante del hibridoma wo6663-1 contiene anticuerpos que se unen a IGFBP2 para neutralizar la unión de IGF1 a IGFBP2. Obsérvese también que los anticuerpos procedentes del hibridoma wo6663-1 se unen específicamente a IGFBP2, y no se unen a otros miembros de la familia de IGFBP (IGFBP3, IGFBP4).
La figura 22 es un conjunto de diagramas que muestran datos de ensayos ELISA de captura de anticuerpo usados para caracterizar las propiedades de unión de anticuerpos neutralizantes de IGFBP2 monoclonales recuperados a partir de clones de hibridomas individuales aislados de la biblioteca de hibridomas wo6663-1. Varios de los anticuerpos monoclonales neutralizantes de IGFBP2, incluyendo M1, M4, M6, M9, M13, M14, M15 y M16, pudieron unirse a IGFBP2 con alta afinidad y neutralizar su unión a iGF1.
La figura 23 es un diagrama que muestra que una composición que contiene concentraciones fisiológicas del anticuerpo monoclonal M14 puede inhibir el reclutamiento endotelial por células de cáncer de mama metastásicas. Como en los experimentos descritos anteriormente, se usó un ensayo de migración en Trans-well para cuantificar el reclutamiento endotelial por células metastásicas. Se pusieron células de cáncer de mama humanas LM2 altamente metastásicas en la parte inferior de una cámara de Boyden, en la que pudo someterse a ensayo su capacidad para reclutar HUVECS a través de un inserto Trans-well poroso. La adición de una pequeña concentración fisiológica de M14 al Transwell pudo inhibir significativamente el reclutamiento y la migración (células migradas por campo) de células HUVEC (reducción del 50 % de las células migradas) frente a los controles negativos (anticuerpos contra IgG y M5). Las barras de error representan el e.e.m.
La figura 24 es un diagrama que muestra que una composición que contiene concentraciones fisiológicas del anticuerpo monoclonal M14 puede inhibir la evolución tumoral de cáncer de mama in vivo en un modelo de ratón. Obtención de imágenes de bioluminiscencia del crecimiento de tumor de mama por 2000 células de cáncer de mama humanas MDA-MB-231 en animales tratados con o bien PBS o bien anticuerpo monoclonal M14. En el día 14, se inhibió significativamente la evolución tumoral mediante el tratamiento con M14 (reducción de 7 a 11 veces de la evolución tumoral) en comparación con los ratones tratados con PBS. Se normaliza la señal con respecto a la señal del día 0. La significación se basa una prueba de la t de Student bilateral.
Descripción detallada de la invención
La invención descrita proporciona reactivos y métodos para tratar trastornos caracterizados por angiogénesis patológica, tales como metástasis.
Tal como se da a conocer en el presente documento, un análisis sistemático y la atención centrada en la metástasis y angiogénesis metastásica condujo a la identificación de varias moléculas, incluyendo IGFBP2 secretado, la transferasa PITPNC1, la cinasa MERTK y miR-126, como dianas para la inhibición terapéutica con el potencial para tratar cáncer metastásico. Una ruta recién descubierta coordina los genes proangiogénicos de IGFBP2, PITPNC1 y MERTK que se correlacionan en la expresión con metástasis humana. Estos genes representan reguladores de la angiogénesis y el reclutamiento endotelial metastásicos. Por ejemplo, IGFBP2, una proteína secretada por células metastásicas, recluta endotelios modulando la actividad mediada por IGF1 del receptor de tipo I de IGF en células endoteliales.
El reclutamiento endotelial es un proceso en el que se movilizan células endoteliales o sus células progenitoras y el anidamiento (homing) en un sitio o una región en un sujeto para generar nuevos vasos sanguíneos o la remodelación de vasos sanguíneos preexistentes, es decir, angiogénesis. La inhibición de este proceso a través de la nueva ruta mencionada anteriormente puede usarse para inhibir la angiogénesis patológica, y tratar de ese modo trastornos caracterizados por angiogénesis patológica, tales como metástasis.
Para el inhibir reclutamiento endotelial y la angiogénesis resultante en un sujeto que lo necesita, puede administrarse al sujeto un agente que inhibe la expresión o actividad de una proteína seleccionada de IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR. Se enumeran a continuación las secuencias de aminoácidos de estas proteínas. El agente puede ser un ácido nucleico, un polipéptido, un anticuerpo o un compuesto de molécula pequeña.
IGFBP2
MLPRVGCPALPLPPPPLLPLLPLLLLLLGASGGGGGARAEVLFRCPPCTPERLAACGPPP
VAPPAAVAAVAGGARMPCAELVREPGCGCCSVCARLEGEACGVYTPRCGQGLRCYPHPGS
ELPLQALVMGEGTCEKRRDAEYGASPEQVADNGDDHSEGGLVENHVDSTMNMLGGGGSAG
RKPLKSGMKELAVFREKVTEQHRQMGKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLER
IS TMRLPDERG PLEHLY S LHIPNC DKHGLYNLKQCKMS LNGQRGECWCVNPNTGKLIQGA
PTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ
IGF1 (isoforma 1)
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVD
ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARS
VRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK
IGF1 (isoforma 2)
MITPTVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKP
TGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEV
HLKNASRGSAGNKNYRM
IGF1 (isoforma 3)
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVD
ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARS
VRAQRHTDMPKTGKYQPPSTNKNTKSQRRKGWPKTHPGGEQKEGTEASLQIRGKKKEQRR
EIGSRNAECRGKKGK
IGF1 (isoforma 4)
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVD
ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARS
VRAQRHTDMPKTQKEVHLKHASRGSAGHKHYRM
IGF1R
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLEHCTVIEGYLH
ILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIF
EMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGD
LCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCS
APDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHD
GECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNL
LINIRRGNNIASELENFMGLIEWTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSF
YVLDHQHLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFHPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTR
NNGERASCE S DVLHFT ST TT SKHRI1ITWHRYRPPDYRDLIS FTVYYKEAPFKNVTEYDG
QDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSE
ILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRH
NYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRK
VFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFES
RVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTW
EPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGN
YTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHR
KRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKG
WKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHWRLLGWSQGQPTLVIME
LMTRGDLKSYLRSLRPEMENHPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLHANKFVHRDLAARN
CMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGV
VLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNC PDMLFELMRMC WQYNPKMRPSFL
EliSSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRH SGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
MERTK
MGPAPLPLLLGLFLPALWRRAITEAREEAKPYPLFPGPFPGSLQTDHTPLLSLPHASGYQ
PALMFSPTQPGRPHTGNVAIPQVTSVESKPLPPLAFKHTVGHIILSEHKGVKFNCSISVP
NIYQDTTISMWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTAIIASFSITSVQRSDNGSYICKMKIN
NEEIVSDPIYIEVQGLPHFTKQPESMNVTRNTAFNLTCQAVGPPEPVNIFWVQNSSRVNE
QPEKSPSVLTVPGLTEMAVFSCEAHNDKGLTVSKGVQINIKAIPSPPTEVSIRNSTAHSI
LISWVPGFDGYSPFRNCSIQVKEADPLSNGSVMIFNTSALPHLYQIKQLQALANYSIGVS
CMNEIGWSAVSPWILASTTEGAPSVAPLNVTVFLNE S S DNVDIRWMKPPTKQQDGELVGY
RISHVWQSAGISKELLEEVGQNGSRARISVQVHNATCTVRIAAVTRGGVGPFSDPVKIFI
PAHGMVDYAPSSTPAPGNADPVLIIFGCFCGFILIGLILYISLAIRKRVQETKFGNAFTE
EDSELWNYIAKKSFCRRAIELTLHSLGVSEELQNKLEDWIDRNLLILGKILGEGEFGS
VMEGNLKQEDGTSLKVAVKTMKLDNSSQREIEEFLSEAACMKDFSHPNVIRLLGVCIEMS
SQGIPKPMVILPFMKYGDLHTYLLYSRLETGPKHIPLQTLLKFMVDIALGMEYLSNRNFL
HRDLAARNCMLRDDMTVCVADFGLSKKIYSGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSK
SDVWAFGVTMWEIATRGMTPYPGVQNHEMYDYLLHGHRLKQPEDCLDELYEIMYSCWRTD
PLDRPTFSVLRLQLEKLLESLPDVRNQADVIYVNTQLLESSEGLAQGSTLAPLDLNIDPD
SIIASCTPRAAISWTAEVHDSKPHEGRYILNGGSEEWEDLTSAPSAAVTAEKNSVLPGE
RLVRNGVSWSHSSMLPLGSSLPDELLFADDSSEGSEVLM
PTTPNC1 (isoforma a)
MLLKE YRICMPLTVDE YKIGQLYMISKHSHEQSDRGEGVEWQNE PFE DPHHGNGQFTEK
RVYLNSKLPSWARAWPKIFYVTEKAWNYYPYTITEYTCSFLPKFSIHIETKYEDNKGSN
DTIFDNEAKDVEREVCFIDIACDEIPERYYKESEDPKHFKSEKTGRGQLREGWRDSHQPI
MCSYKLVTVKFEVWGLQTRVEQFVHKWRDILLIGHRQAFAWVDEWYDMTMDEVREFERA
TQEATNKKIGIFPPAISISSIPLLPSSVRSAPSSAPSTPLSTDAPEFLSVPKDRPRKKSA
PETLTLPDPEKKATLNLPGMHSSDKPCRPKSE
PITPNC1 (isoforma b)
MLLKEYRICMPLTVDEYKIGQLYMISKHSHEQSDRGEGVEWQNEPFEDPHHGNGQFTEK
RVYLNSKLPSWARAWPKIFYVTEKAWNYYPYTITEYTCSFLPKFSIHIETKYEDNKGSN
DTIFDNEAKDVEREVCFIDIACDEIPERYYKESEDPKHFKSEKTGRGQLREGWRDSHQPI
MCSYKLVTVKFEVWGLQTRVEQFVHKWRDILLIGHRQAFAWVDEWYDMTMDDVREYEKN
MHEQTNIKVCNQHSSPVDDIESHAQTST
ABCB9
MRLWKAVWTLAFMSVDICVTTAIYVFSHLDRSLLEDIRHFNIFDSVLDLWAACLYRSCL
LLGATIGVAKHSALG PRRLRASWLVITLVC LFVGIYAMVKLLLFSEVRRPIRDPWFWALF
VWTYISLGASFLLWWLLSTVRPGTQALEPGAATEAEGFPGSGRPPPEQASGATLQKLLSY
TKPDVAFLVAASFFLIVAALGETFLPYYTGRAIDGIVIQKSMDQFSTAWIVCLLAIGSS
FAAGIRGGIFTLIFARLNIRLRNCLFRSLVSQETSFFDENRTGDLISRLTSDTTMVSDLV
SQNINVFLRNTVKVTGVWFMFSLSWQLSLVTFMGFPIIMMVSNIYGKYYKRLSKEVQNA
LARASN TAE E TISAMKTVRS FANEEEEAEVYLRKLQQVYKLNRKEAAAYMYYVWG SGLTL
LWQVSILYYGGHLVISGQMTSGNLIAFIIYEFVLGDCMESVGSVYSGLMQGVGAAEKVF
EFIDRQPTMVHDGSLAPDHLEGRVDFENVTFTYRTRPHTQVLQNVSFSLSPGKVTALVGP
SGSGKSSCVNILENFYPLEGGRVLLDGKPISAYDHKYLHRVISLVSQEPVLFARSITDNI
SYGLPTVPFEMWEAAQKANAHGFIMELQDGYSTETGEKGAQLSGGQKQRVAMARALVRN
PPVLILDEATSALDAESEYLIQQAIHGNLQKHTVLIIAHRLSTVEHAHLIWLDKGRWQ
Q G T HQ Q L LAQG G L YAK LVQ RQML G L Q P AAD FTAGHNE PVANG S HKA
PSAT1 (isoforma 1)
MDAPRQWNFGPGPAKLPHSVLLEIQKELLDYKGVGISVLEMSHRSSDFAKIINNTENLV
RELLAVPDNYKVIFLQGGGCGQFSAVPLNLIGLKAGRCADYWTGAWSAKAAEEAKKFGT
INIVHPKLGSYTKIPDPSTWNLNPDASYVYYCANETVHGVEFDFIPDVKGAVLVCDMSSN
F L S K PVDV S KFGVIFAGAQKWVGSAGVTWIVRDDLLGFALREC PSVLEYKVQAGNS SLY
NTPPCFSIYVMGLVLEWIKNNGGAAAMEKLSSIKSQTIYEIIDNSQGFYVCPVEPQNRSK
MNIPFRIGNAKGDDALEKRFLDKALELNML SLKGHRSVGGIRASLYNAVTIEDVQKLAAF
MKKFLEMHQL
PSAT1 (isoforma 2)
MDAPRQWNFGPGPAKLPHSVLLEIQKELLDYKGVGISVLEMSHRSSDFAKIINNTENLV
RE L L AV P DN Y KV IFLQGGGCGQF S AV P LN L IG LKAG RC AD Y W T GAW S AKAAE E AKK FG T
INIVHPKLGSYTKIPDPSTMNLNPDASYVYYCANETVHGVEFDFIPDVKGAVLVCDMSSN
FL S K PVDVS K FGVIFAGAQKNVGSAGVTWIVRDDL LGFALREC PSVLE YKVQAGN S S LY
NTPPCFSIYVMGLVLEWIKNNGGAAAMEKLSSIKSQTIYEIIDNSQGFYVSVGGIRASLY
NAVTIEDVQKLAAFMKKFLEMHQL PYGB
MAK PLTDSEKRKQISVRGLAGLGDVAEVRKSFNRH LHFTLVKDRNVAT PRDYFFALAHTV
RDHLVGRWIRTQQHYYERDPKRIYYLSLEFYMGRTLQNTMVNLGLQNACDEAIYQLGLDL
EELEEIEEDAGLGNGGLGRLAACFLDSMATLGLAAYGYGIRYEFGIFNQKIVNGWQVEEA
DDWLRYGNPWEKARPEYMLPVHFYGRVEHTPDGVKWLDTQWLAMPYDTPVPGYKNNTVN
TMRLW SAKA PND FK L Q DFNVG DYIEAVLDRNLAENISRVLY PNDNFFEGKELRLKQEYFV
VAATLQDIIRRFKSSKFGCRDPVRTCFETFPDKVAIQLNDTHPALSIPELMRILVDVEKV
DWDKAWEITKKTCAYTNHTVLPEALERWPVSMFEKLLPRHLEIIYAINQRHLDHVAALFP
GDVDRLRRMSVIEEGDCKRINMAHLCVIGSHAVNGVARIHSEIVKQSVFKDFYELEPEKF
QNKTNGITPRRWLLLCNPGLADTIVEKIGEEFLTDLSQLKKLLPLVSDEVFIRDVAKVKQ
ENKLKFSAFLEKEYKVKINPSSMFDVHVKRIHEYKRQLLNCLHWTLYNRIKRDPAKAFV
PRTVMIGGKAAPGYHMAKLIIKLVTSIGDWNHDPWGDRLKVIFLENYRVSLAEKVIPA
ADLSQQISTAGTEASGTGNMKFMLNGALTIGTMDGANVEMAEEAGAENLFIFGLRVEDVE
AL DRKGYNARE YYDHLPEL KQAVDQISSGFFSPKEPDCFKDIVNMLMHHDRFKVFADYEA
YMQCQAQVDQLYRNPKEWTKKVIRNIACSGKFSSDRTITEYAREIWGVEPSDLQIPPPNI
PRD
SHMT2 (isoforma 1)
MLYFSLFWAARPLQRCGQLVRMAIRAQHSNAAQTQTGEANRGWTGQESLSDSDPEMWELL
QREKDRQCRGLELIASENFCSRAALEALGSCLNNKYSEGYPGKRYYGGAEWDEIELLCQ
RRALEAFDLDPAQWGVNVQPYSGSPANLAVYTALLQPHDRIMGLDLPDGGHLTHGYMSDV
KRISATSIFFESMPYKLNPKTGLIDYNQ LALTARLFRPRL11AGT SAYARLIDYARMREV
CDEVKAHLLADMAHISGLVAAKVIPSPFKHADIVTTTTHKTLRGARSGLIFYRKGVKAVD
PKT G REIPYTFEDRIHFAVFPSLQGGPHNHAIAAVAVALKQAC TPMFREYSLQVLKNARA
MADALLERGYSLVSGGTDNHLVLVDLRPKGLDGARAERVLELVSITANKNTCPGDRSAIT
PGGLRLGAPALTSRQFREDDFRRWDFIDEGVNIGLEVKSKTAKLQDFKSFLLKDSETSQ
RLANLRQRVE QFARAFPMPGFDEH
SHMT2 (isoforma 2)
MLYFSLFWAARPLQRCGQLVRMAIRAQHSNAAQTQTGEANRGWTGQESLSDSDPEMWELL
QREKDRQCRGLELIASENFCSRAALEALGSCLNNKYSEGYPGKRYYGGAEWDEIELLCQ
RRALEAFDLDPAQWGVNVQPYSGSPANLAVYTALLQPHDRIMGLDLPDGGHLTHGYMSDV
KRISAT S IFFE SMPYKLNLALTARLFRPRL11AGT SAYARLIDYARMREVCDEVKAHLLA
DMAHISGLVAAKVIPSPFKHADIVTTTTHKTLRGARSGLIFYRKGVKAVDPKTGREIPYT
FE DRINFAVFP S LQGGPHNHAIAAVAVALKQACT PMFREYSLQVLKHARAMADALLERGY
SLVSGGTDNHLVLVDLRPKGLDGARAERVLELVSITANKNTCPGDRSAITPGGLRLGAPA
LTSRQFREDDFRRWDFIDEGVNIGLEVKSKTAKLQDFKSFLLKDSETSQRLANLRQRVE
Q FARAF PMPGFDEH
SHMT2 (isoforma 3)
MAIRAQHSNAAQTQTGEANRGWTGQESLSDSDPEMWELLQREKDRQCRGLELIASENFCS
RAALEALGSCLNNKYSEGYPGKRYYGGAEWDEIELLCQRRALEAFDLDPAQWGVNVQPY
SGSPANLAVYTALLQPHDRIMGLDLPDGGHLTHGYMSDVKRISATSIFFESMPYKLNPKT
GLIDYHQLALTARLFRPRLIIAGTSAYARLIDYARMREVCDEVKAHLLADMAHISGLVAA
KVIPSPFKHADIVTTTTHKTLRGARSGLIFYRKGVKAVDPKTGREIPYTFEDRINFAVFP
S L QG G P HHHAIAAVAVALKQACT PMFREYSLQVLKHARAMADALLERGYSLVSGGTDNHL
VLVDLRPKGLDGARAERVLELVSITANKNTCPGDRSAITPGGLRLGAPALTSRQFREDDF
RRWDFIDEGVNIGLEVKSKTAKLQDFKSFLLKDSETSQRLANLRQRVEQFARAFPMPGF
DEH
VIPR1
MRPPSPLPARWLCVLAGALAWALGPAGGQAARLQEECDYVQMIEVQHKQCLEEAQLENET
IGCSKMWDNLTCWPATPRGQWVLACPLIFKLFSSIQGRNVSRSCTDEGWTHLEPGPYPI
ACGLDDKAASLDEQQTMFYGSVKTGYTIGYGLSLATLLVATAILSLFRKLHCTRNYIHMH
LFISFILRAAAVFIKDLALFDSGESDQCSEGSVGCKAAMVFFQYCVMANFFWLLVEGLYL
YTLLAVSFFSERKYFWGYILIGWGVPSTFTMVWTIARIHFEDYGCWDTINSSLWWIIKGP
ILTSILVNFILFIC IIR ILLQ KLRPPDIRKSDSSPYSRLARSTLLLIPLFG VHYIM FAFF
P DNFK PEVKMVFE LW G S FQG FW AILYCFLNGEV QAE L RRK WRRWH LQ GVLG WH PK YRH
PSGGSNGATCSTQVSMLTRVSPGARRSSSFQAEVSLV
Un agente inhibidor (es decir, inhibidor) o un agente de activación (es decir, activador) puede ser un ácido nucleico, un polipéptido, un anticuerpo o un compuesto de molécula pequeña. Preferiblemente, es un agente aislado, pero no una molécula endógena (un microARN) en una célula del sujeto. En un ejemplo, excluye un microARN que es endógeno en células humanas, por ejemplo, miR-126, miR206 o/y miR-335. En otro ejemplo, el agente inhibidor o de activación funciona a nivel de la transcripción, Estabilidad de ARNm, traducción, estabilidad/degradación de proteínas, modificación de proteínas y unión a proteínas.
Un ácido nucleico se refiere a una molécula de ADN (por ejemplo, pero sin limitarse a, un ADNc o ADN genómico), una molécula de ARN (por ejemplo, pero sin limitarse a, un ARNm), o un análogo de ADN o ARN. Un análogo de ADN o ARN puede sintetizarse a partir de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. Un “ácido nucleico aislado” es un ácido nucleico cuya estructura no es idéntica a la de ningún ácido nucleico que se produce de manera natural o a la de ningún fragmento de un ácido nucleico genómico que se produce de manera natural. El término cubre por tanto, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de una molécula de ADN genómica que se produce de manera natural pero no está flanqueada por ambas secuencias codificantes que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el que se produce de manera natural; (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de una procariota o eucariota de tal manera que la molécula resultante no es idéntica a ningún vector o ADN genómico que se produce de manera natural; (c) una molécula independiente tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que forma parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica para una proteína de fusión.
Los términos “ARN”, “molécula de ARN” y “molécula de ácido ribonucleico” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y se refieren a un polímero de ribonucleótidos. El término “ADN” o “molécula de ADN” o molécula de ácido desoxirribonucleico” se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos. El ADN y el ARN pueden sintetizarse de manera natural (por ejemplo, mediante replicación de ADN o transcripción de ADN, respectivamente). El ARN puede modificarse de manera postraduccional. El ADN y el ARN también pueden sintetizarse químicamente. El ADN y el ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ARNmc y ADNmc, respectivamente) o multicatenarios (por ejemplo, bicatenarios, es decir, ARNbc y ADNbc, respectivamente).
La secuencia de ácido nucleico puede codificar para un ARN de interferencia pequeño (por ejemplo, un agente de iARN) que selecciona como diana uno o más de los genes mencionados anteriormente e inhibe su expresión o actividad. El término “agente de iARN” se refiere a un ARN, o análogo del mismo, que tiene suficiente complementariedad de secuencia con un ARN diana para dirigir la interferencia de ARN. Los ejemplos también incluyen un ADN que puede usarse para producir el ARN. La interferencia de ARN (iARN) se refiere a un proceso selectivo o específico de secuencia mediante el cual una molécula diana (por ejemplo, un gen, proteína o ARN diana) está regulada por disminución. Generalmente, un ARN interferente (“ARNi”) es un ARN interferente corto bicatenario (ARNic), ARN en horquilla corto (ARNhc) o micro-ARN monocatenario (miARN) que da como resultado la degradación catalítica de ARNm específicos, y también puede usarse para reducir o inhibir la expresión génica.
El término “ARN interferente corto” o “ARNic” (también conocido como “ARN interferentes pequeños”) se refiere a un agente de ARN, preferiblemente un agente bicatenario, de aproximadamente 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud, teniendo opcionalmente las hebras extremos de proyección que comprenden, por ejemplo 1, 2 o 3 nucleótidos (o análogos de nucleótidos) de proyección, que puede dirigir o mediar en la interferencia de ARN. Se generan ARNic que se producen de manera natural a partir de moléculas de ARNbc más largas (por ejemplo, >25 nucleótidos de longitud) por la maquinaria de iARN de una célula (por ejemplo, Dicer o un homólogo de la misma).
El término “miARN” o “microARN” se refiere a un agente de ARN, preferiblemente un agente monocatenario, de aproximadamente 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud, que puede dirigir o mediar en la interferencia de ARN. Se generan miARN que se producen de manera natural a partir de ARN precursores de tallo-bucle (es decir, pre-miARN) por Dicer. El término “Dicer” tal como se usa en el presente documento, incluye Dicer así como cualquier ortólogo u homólogo de Dicer que puede procesar estructuras de ARNbc para dar ARNic, miARN, moléculas similares a ARNic o moléculas similares a miARN. El término microARN (o “miARN”) se usa de manera intercambiable con el término “ARN temporal pequeño” (o “ARNtp”) basado en el hecho de que se ha encontrado que se expresan microARN que se producen de manera natural (o “miARN”) de manera temporal (por ejemplo, durante el desarrollo).
El término “ARNhc”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente de ARN que tiene una estructura de tallo-bucle, que comprende una primera y una segunda regiones de secuencia complementaria, siendo suficiente el grado de complementariedad y orientación de las regiones de tal manera que se produce el apareamiento de bases entre las regiones, uniéndose las regiones primera y segunda mediante una región de bucle, resultando el bucle de una ausencia de apareamiento de bases entre nucleótidos (o análogos de nucleótidos) dentro de la región de bucle.
Por tanto, también dentro del alcance de esta invención está la utilización de iARN que presenta degradación de moléculas de ARN (por ejemplo, dentro de una célula). La degradación está catalizada por un complejo enzimático de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un agente de ARN que tiene una secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARN diana (por ejemplo, uno o más de los genes mencionados anteriormente) para dirigir la iARN significa que el agente de ARN tiene una homología de al menos el 50 %, (por ejemplo, una homología del 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %) con la secuencia de ARN diana de modo que las dos son suficientemente complementarias entre sí como para hibridar y desencadenar la destrucción del ARN diana por la maquinaria o el proceso de iARN (por ejemplo, el complejo RISC). Un agente de ARN que tiene una “secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARN diana para dirigir la iARN” también significa que el agente de ARN tiene una secuencia suficiente como para desencadenar la inhibición traduccional del a Rn diana por la maquinaria o el proceso de iARN. Un agente de ARN también puede tener una secuencia suficientemente complementaria a un ARN diana codificada por la secuencia de ADN diana de tal manera que la secuencia de ADN diana se silencia de manera cromática. Dicho de otro modo, el agente de ARN tiene una secuencia suficiente como para inducir silenciamiento génico transcripcional, por ejemplo, para modular por disminución la expresión génica en o cerca de la secuencia de ADN diana, por ejemplo, induciendo cambios estructurales de la cromatina en o cerca de la secuencia de ADN diana.
Los polinucleótidos mencionados anteriormente pueden administrarse usando dispositivos de administración de micropartículas o microcápsulas poliméricas, biodegradables conocidos en la técnica. Otro modo de conseguir la captación de los polinucleótidos es usando liposomas, preparados mediante métodos convencionales. El polinucleótido puede incorporarse solo en estos vehículos de administración o incorporarse conjuntamente con anticuerpos específicos de tejido. Alternativamente, puede prepararse un conjugado molecular que se compone de un plásmido u otro vector unido a poli-L-lisina mediante fuerzas electrostáticas o covalentes. La poli-L-lisina se une a un ligando que puede unirse a un receptor en células diana (Cristiano, et al., 1995, J. Mol. Med. 73:479). Alternativamente, pueden obtenerse dianas específicas de tejido mediante el uso de elementos reguladores de la transcripción específicos de tejido que se conocen en la técnica. La administración de ADN desnudo (es decir, sin un vehículo de administración) a un sitio intramuscular, intradérmico o subcutáneo es otro medio de lograr la expresión in vivo.
Pueden diseñarse moléculas de ARNic, miARN y ARNas (ARN antisentido) mediante métodos bien conocidos en la técnica. Pueden diseñarse moléculas de ARNic, miARN y ARNas con homología suficiente para proporcionar la especificidad de secuencia requerida para degradar de manera única cualquier ARN usando programas conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los mantenidos en los sitios web de AMBION, Inc. y DHARMACON, Inc. Los expertos en la técnica pueden realizar de manera rutinaria pruebas sistemáticas de varias especies diseñadas para la optimización de la secuencia de ARNic, miARN y ARNas. Las consideraciones cuando se diseñan moléculas de ácido nucleico interferente corto incluyen, pero no se limitan a, consideraciones biofísicas, termodinámicas y estructurales, preferencias de bases en posiciones específicas en la hebra sentido y homología. Estas consideraciones se conocen bien en la técnica y proporcionar directrices para el diseño de las moléculas de ARN mencionadas anteriormente.
En un ejemplo, el polipéptido es un anticuerpo. El término “anticuerpo” se refiere a una molécula de inmunoglobulina o parte inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte de unión a antígeno. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, una proteína que tiene al menos una o dos, regiones variables de cadena pesada (H) (Vh), y al menos una o dos regiones variables de cadena ligera (L) (Vl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas “regiones de entramado” (FR). Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunoglobulina” se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, épsilon y mu, así como los múltiples genes de región variable de inmunoglobulina.
El término “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo (o “parte de anticuerpo”) se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 o VIPR). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los Vh dominios y Cm; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes independientes, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permite constituirse como una sola cadena de proteína en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla estén englobados dentro del término “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y se examinan los fragmentos para determinar su utilidad de la misma manera que se hace con anticuerpos intactos.
Pueden producirse anticuerpos que se unen específicamente a una de las proteínas diana mencionadas anteriormente usando métodos conocidos en la técnica. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o uno monoclonal. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen los descritos en los ejemplos de trabajo a continuación. En un ejemplo, el anticuerpo puede producirse de manera recombinante, por ejemplo, producirse mediante presentación en fago o mediante métodos combinatorios. En otro ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano (por ejemplo, un anticuerpo producido en un ratón que se ha modificado por ingeniería genética para producir un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo no humano, por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, pero sin limitarse a, mono), conejo o camello. Los ejemplos de métodos para generar una versión humanizada de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, injerto de CDR (Queen et al., patente estadounidense n.° 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)), intercambio de cadenas (patente estadounidense n.° 5,565,332); y revestimiento o remodelado de la superficie (documentos EP 592.106; EP 519.596); Padlan, Molecular Immunology 28(415):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)). Los ejemplos de métodos para generar anticuerpos completamente humanos incluyen, pero no se limitan a, la generación de anticuerpos a partir de ratones que pueden expresar genes de inmunoglobulina humanos y el uso de la tecnología de presentación en fago para generar y examinar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humanos.
Un “anticuerpo aislado” pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 o VIPR está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de tal antígeno). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al antígeno puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de IGFBP2, IGF1, IGF1R, MERTK, PITPNC1, ABCB9, PSAT1, PYGB, SHMT2 o VIPR de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.
Los términos “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una única afinidad y especificidad de unión para un epítopo particular.
El término “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones de entramado como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis al azar o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, el término “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, sobre secuencias de entramado humanas.
El término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que presentan una única afinidad de unión que tienen regiones variables en las que tanto las regiones de entramado como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En un ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos los produce un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.
El término “anticuerpo humano recombinante”, tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humanos o un hibridoma preparado a partir de los mismos (descrito adicionalmente a continuación), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otros medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humanos a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones de entramado y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En determinados ejemplos, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y están relacionadas con secuencias de Vh y Vl de línea germinal humana, pueden no existir de manera natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Tal como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de región constante de cadena pesada.
Las expresiones “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan de manera intercambiable en el presente documento con el término “un anticuerpo que se une a específicamente a un antígeno”.
Tal como se usa en el presente documento, el término “alta afinidad” por un anticuerpo contra IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-7 M o menos, preferiblemente 10-8 M o menos, más preferiblemente 10-9 M o menos e incluso más preferiblemente 10-10 M o menos para un antígeno diana. Sin embargo, la unión de “alta afinidad” puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión de “alta afinidad” para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-7 M o menos, más preferiblemente 10-8 M o menos.
En un ejemplo, se describe una composición que comprende un anticuerpo monoclonal que neutraliza la función de IGFBP2 inhibiendo la unión de IGFBP2 a IGF1. En un ejemplo, este anticuerpo puede ser un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo no humano, por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, pero sin limitarse a, mono), conejo o camello. En un ejemplo, pueden sustituirse uno o más aminoácidos de este anticuerpo monoclonal con el fin de alterar sus propiedades físicas. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, especificidad de unión, afinidad de unión, inmunogenicidad e isotipo de anticuerpo. Pueden usarse composiciones farmacéuticas que contienen versiones completamente humanas o humanizadas de los anticuerpos descritos anteriormente para tratar trastornos de angiogénesis patológica.
En un ejemplo, una composición que comprende un anticuerpo neutralizante de IGFBP2 que inhibe que se una IGF1 a IGFBP2 inhibe la evolución tumoral de cáncer de mama y la carga tumoral in vivo. En este ejemplo, la administración del anticuerpo descrito anteriormente redujo la carga tumoral de cáncer de mama humano in vivo en un modelo de ratón de cáncer humano.
Pueden usarse composiciones farmacéuticas que contienen versiones completamente humanas o humanizadas de los anticuerpos descritos anteriormente para inhibir metástasis de cáncer de mama en pacientes humanos inhibiendo el reclutamiento endotelial por células metastásicas. En otro ejemplo, pueden usarse composiciones farmacéuticas que contienen versiones completamente humanas o humanizadas de estos anticuerpos para tratar otros tipos de tumores vasculares. Los tumores vascularizados típicos que pueden tratarse con esta composición incluyen tumores sólidos, particularmente carcinomas, que requieren una componente vascular para la provisión de oxígeno y nutrientes. Los tumores sólidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmón, mama, óseo, de ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parotídeo, de vías biliares, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata, tiroides, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células pequeñas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas, sarcoma de Kaposi y sarcomas.
En otro ejemplo, el polipéptido es una forma mutante de la proteína mencionada anteriormente, que interfiere en la ruta mencionada anteriormente y, por tanto, inhibe la angiogénesis y el reclutamiento endotelial. El término “mutante” engloba mutantes que se producen de manera natural y mutantes creados químicamente y/o usando técnicas de ADN recombinantes. Un mutante de uno de los péptidos de tipo natural mencionados anteriormente puede deberse a la alteración, por ejemplo, truncamiento, elongación, sustitución, deleción o inserción, de uno o más aminoácidos. La alteración también puede tener un aminoácido modificado, tal como uno que comprende una modificación postraduccional. La actividad proangiogénica de un mutante, si la hay, es sustancialmente menor que la actividad del polipéptido de tipo natural en al menos aproximadamente el 20 % (por ejemplo, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 %) tal como se mide usando un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. Un ejemplo es un polipéptido que tiene el dominio extracelular de IGF1-R, pero que carece el dominio intracelular. Compitiendo por IGF-1, este mutante puede inhibir la ruta mencionada anteriormente y la actividad proangiogénica de manera dominante negativa.
Las composiciones de aminoácidos de los anticuerpos o polipéptidos mencionados anteriormente pueden variar con o sin perturbar la capacidad (por ejemplo, afinidad) para unirse a las dianas o los antígenos respectivos, y desencadenar o inhibir la respuesta celular respectiva. Por ejemplo, pueden contener una o más sustituciones de aminoácido conservativas. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación p (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en, por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o 10 puede reemplazarse por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de las secuencias, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden examinarse para determinar la capacidad para unirse al antígeno respectivo y desencadenar la respuesta celular respectiva para identificar mutantes que conservan la actividad.
Composiciones
En el presente documento se proporciona una composición que contiene un portador adecuado y uno o más de los agentes descritos anteriormente. La composición puede ser una composición farmacéutica que contiene un portador farmacéuticamente aceptable, una composición dietética que contiene un portador dietéticamente aceptable adecuado, o una composición cosmética que contiene un portador cosméticamente aceptable.
El término “composición farmacéutica” se refiere a la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, haciendo que la composición sea especialmente adecuada para uso diagnóstico o terapéutico in vivo o ex vivo. Un “portador farmacéuticamente aceptable”, después de administrarse a o sobre un sujeto, no provoca efectos fisiológicos adversos. El portador en la composición farmacéutica debe ser “aceptable” también en el sentido de que sea compatible con el principio activo y pueda estabilizarlo. Pueden usarse uno o más agentes solubilizantes como portadores farmacéuticos para la administración de un compuesto activo. Los ejemplos de un portador farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes biocompatibles para obtener una composición que puede usarse como forma de dosificación. Los ejemplos de otros portadores incluyen óxido de silicio coloidal, estearato de magnesio, celulosa, laurilsulfato de sodio y amarillo D&C n.° 10.
La composición descrita anteriormente, en cualquiera de las formas descritas anteriormente, puede usarse para tratar trastornos caracterizados por angiogénesis patológica. Una cantidad eficaz se refiere a la cantidad de un compuesto/agente activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico en un sujeto tratado. Las dosis eficaces variarán, tal como reconocen los expertos en la técnica, dependiendo de los tipos de enfermedades tratadas, vía de administración, uso de excipientes y la posibilidad de uso conjunto de otro tratamiento terapéutico.
Una composición farmacéutica como se describe en el presente documento puede administrarse por vía parenteral, por vía oral, por vía nasal, por vía rectal, de manera tópica o por vía bucal. El término “parenteral” tal como se usa en el presente documento se refiere a inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional o intracraneal, así como cualquier técnica de infusión adecuada.
Una composición inyectable estéril puede ser una disolución o suspensión en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral. Tales disoluciones incluyen, pero no se limitan a, disolución en 1,3-butanodiol, manitol, agua, solución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, de manera convencional se emplean aceites fijos como disolvente o medio de suspensión (por ejemplo, mono o diglicéridos sintéticos). Los ácidos grasos, tales como, pero sin limitarse a, ácido oleico y sus derivados de glicérido, son útiles en la preparación de productos inyectables, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como, pero sin limitarse a, aceite de oliva o aceite de ricino, versiones polioxietiladas de los mismos. Estas disoluciones o suspensiones en aceite también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga tal como, pero sin limitarse a, carboximetilcelulosa, o agentes de dispersión similares. También pueden usarse con el fin de formulación otros tensioactivos usados habitualmente, tales como, pero sin limitarse a, Tween o Span u otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad similares, que se usan habitualmente en la fabricación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables sólidas, líquidas u otras.
Una composición para administración oral puede ser cualquier forma de dosificación aceptable por vía oral incluyendo cápsulas, comprimidos, emulsiones y suspensiones, dispersiones y disoluciones acuosas. En el caso de los comprimidos, los portadores usados habitualmente incluyen, pero no se limitan a, lactosa y almidón de maíz. Normalmente se añaden agentes lubricantes, tales como, pero sin limitarse a, estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen, pero no se limitan a, lactosa y almidón de maíz desecado. Cuando se administran suspensiones o emulsiones acuosas por vía oral, el principio activo puede suspenderse o disolverse en una fase de aceite combinada con agentes emulsionantes o de suspensión. Si se desea, pueden añadirse determinados agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.
Pueden formularse composiciones farmacéuticas para administración tópica según la invención descrita como disoluciones, pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites. Alternativamente, las formulaciones tópicas pueden estar en forma de parches o apósitos impregnados con principio(s) activo(s), que pueden comprender opcionalmente uno o más excipientes o diluyentes. En algunos ejemplos, las formulaciones tópicas incluyen un material que aumentarán la absorción o penetración del/de los principio(s) activo(s) a través de la piel u otras zonas afectadas. La composición tópica es útil para tratar trastornos en la piel, tal como melanoma y determinados trastornos inflamatorios.
Una composición tópica contiene una cantidad segura y eficaz de un portador dermatológicamente aceptable adecuado para la aplicación a la piel. Una composición o un componente “cosméticamente aceptable” o “dermatológicamente aceptable” se refiere a una composición o un componente que es adecuado para su uso en contacto con la piel humana sin excesiva toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, y similares. El portador permite que se administren un agente activo y componente opcional a la piel a una(s) concentración/concentraciones apropiada(s). Por tanto, el portador puede actuar como diluyente, dispersante, disolvente, o similar para garantizar que los materiales activos se aplican a y se distribuyen uniformemente por la diana seleccionada a una concentración apropiada. El portador puede ser sólido, semisólido o líquido. El portador puede estar en forma de una loción, una crema o un gel, en particular uno que tiene un límite de elasticidad o consistencia suficiente para impedir que sedimenten los materiales activos. El portador puede ser inerte o presentar beneficios dermatológicos. También debe ser física y químicamente compatible con los componentes activos descritos en el presente documento, y no deben afectar indebidamente la estabilidad, eficacia u otros beneficios de uso asociados con la composición.
Métodos de tratamiento
La presente descripción proporciona métodos para tratar en un sujeto un trastorno angiogénico o un trastorno de la angiogénesis.
Los términos “trastorno angiogénico”, “trastorno de la angiogénesis” y “trastorno de la angiogénesis” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y se refieren a un trastorno caracterizado por angiogénesis patológica. Un trastorno caracterizado por angiogénesis patológica se refiere a un trastorno en el que angiogénesis anómala o aberrante, sola o en combinación con otros, contribuye a la causalidad, el origen o síntoma del trastorno. Los ejemplos de este trastorno incluyen diversos cánceres (por ejemplo, tumores vascularizados), trastornos oculares, trastornos inflamatorios, y otros.
Los tumores vascularizados típicos que pueden tratarse con el método incluyen tumores sólidos, particularmente carcinomas, que requieren una componente vascular para la provisión de oxígeno y nutrientes. Los tumores sólidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmón, mama, óseo, de ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parotídeo, de vías biliares, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata, tiroides, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células pequeñas, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas, sarcoma de Kaposi y sarcomas.
También pueden tratarse varios trastornos o estados, distintos de cáncer, con el método descrito anteriormente. Los ejemplos incluyen artritis, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular asociada con la edad, enfermedad de Graves, reestenosis vascular (incluyendo reestenosis tras angioplastia), malformaciones arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma, glaucoma neovascular, enfermedad renal crónica, nefropatía diabética, enfermedad renal poliquística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad hepática inflamatoria crónica, cirrosis hepática, linfoma cutáneo de células T, rosácea y carcinoma de células basales.
Otras dianas de tratamiento incluyen las descritas en, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses 2009004297, 20090175791 y 20070161553, tales como angiofibroma, placas ateroscleróticas, neovascularización de injerto corneal, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, síndrome de Osler-Weber, granuloma piógeno, fibroplasia retrolenticular, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, otras diversas enfermedades y trastornos inflamatorios y endometriosis.
Un “sujeto” se refiere a un ser humano y un animal no humano. Los ejemplos de un animal no humano incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como mamíferos no humanos, primates no humanos (particularmente primates superiores), perros, roedores (por ejemplo, ratones o ratas), cobayas, gatos y conejos, y animales no mamíferos, tales como aves, anfibios, reptiles, etc. En una realización, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal de experimentación o animal adecuado como modelo de enfermedad. Puede identificarse un sujeto que ha de tratarse para un trastorno mediante técnicas de diagnóstico convencionales para el trastorno.
Opcionalmente, el sujeto puede examinarse para detectar una mutación, un nivel de expresión o nivel de actividad de uno o más de las proteínas o los genes mencionados anteriormente mediante métodos conocidos en la técnica o descritos anteriormente antes del tratamiento. Si el sujeto tiene una mutación particular en el gen, o si el nivel de actividad o expresión génica es, por ejemplo, mayor en una muestra del sujeto que el de una muestra de una persona normal, el sujeto es un candidato para el tratamiento.
Para confirmar la inhibición o el tratamiento, puede evaluarse y/o verificar la inhibición de la angiogénesis o el reclutamiento endotelial resultante usando una tecnología conocida en la técnica antes y/o después de la etapa de administración. Las tecnologías a modo de ejemplo incluyen angiografía o arteriografía, una técnica de obtención de imágenes médicas usadas para visualizar el interior de, o la luz, de vasos sanguíneos y órganos del cuerpo, puede realizarse generalmente inyectando un agente de contraste radiopaco en el vaso sanguíneo y obteniendo imágenes usando técnicas basadas en rayos X tales como fluoroscopía.
“Tratar” o “tratamiento” se refiere a la administración de un compuesto o agente a un sujeto que tiene un trastorno con el fin de curar, aliviar, paliar, remediar, retrasar la aparición de, prevenir o mejorar el trastorno, el síntoma del trastorno, el estado patológico secundario al trastorno o la predisposición al trastorno.
Una “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad del compuesto o agente que puede producir un resultado deseable a nivel médico en un sujeto tratado. El método de tratamiento puede realizarse in vivo o ex vivo, solo o junto con otros fármacos o terapias. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no pretende limitarse a una formulación o vía de administración particular.
El agente puede administrarse in vivo o ex vivo, solo o coadministrarse junto con otros fármacos o terapias, es decir, una terapia de cóctel. Tal como se usa en el presente documento, el término “coadministración” o “coadministrarse” se refiere a la administración de al menos dos agente(s) o terapias a un sujeto. Por ejemplo, en el tratamiento de tumores, particularmente tumores vascularizados, malignos, los agentes pueden usarse solos o en combinación con, por ejemplo, agentes quimioterápicos, radioterápicos, apoptópicos, antiangiogénicos y/o inmunotoxinas o coaguligandos.
En algunos ejemplos, la coadministración de dos o más agentes/terapias es concurrente. En otros ejemplos, un primer agente/terapia se administra antes del segundo agente/terapia. Los expertos en la técnica entienden que las formulaciones y/o vías de administración de los diversos agentes/terapias usados pueden variar.
En un enfoque in vivo, se administra un compuesto o agente a un sujeto. Generalmente, el compuesto se suspende en un portador farmacéuticamente aceptable (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, solución salina fisiológica) y se administra por vía oral o mediante infusión intravenosa, o inyectarse o implantarse por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intratecal, por vía intraperitoneal, por vía intrarrectal, por vía intravaginal, por vía intranasal, por vía intragástrica, por vía intratraqueal o por vía intrapulmonar.
La dosificación requerida depende de la elección de la vía de administración; la naturaleza de la formulación; la naturaleza de la enfermedad del paciente; la talla, el peso, el área superficial, la edad y el sexo del sujeto; otros fármacos que se administren; y el criterio del médico encargado. Las dosificaciones adecuadas se encuentran en el intervalo de 0,01-100 mg/kg. Se esperan variaciones en la dosificación necesaria en vista de la variedad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiera mayores dosificaciones que la administración mediante inyección i.v. Pueden ajustarse variaciones en estos niveles de dosificación usando rutinas empíricas convencionales para la optimización tal como se entiende bien en la técnica. La encapsulación del compuesto en un vehículo de administración adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de administración, particularmente para la administración oral.
Diagnóstico
La presente descripción también proporciona kits y métodos de diagnóstico. Puede diagnosticarse a un sujeto que tiene células cancerosas o células propensas a la tumorigénesis basándose en la expresión o actividad de uno o más de los genes o polipéptidos descritos anteriormente en una muestra de prueba del sujeto. El polipéptido y los ácidos nucleicos pueden usarse como marcadores para indicar la presencia o ausencia de una célula cancerosa o célula propensa a la tumorigénesis. Los ensayos de diagnóstico y pronóstico de la invención descrita incluyen métodos para evaluar el nivel de expresión del polipéptido o ácido nucleico.
Puede evaluarse la presencia, el nivel o la ausencia del polipéptido o ácido nucleico en una muestra de prueba obteniendo una muestra de prueba de un sujeto de prueba y poniendo en contacto la muestra de prueba con un compuesto o un agente que puede detectar el polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo, sonda de ARNm, sonda de ADNc genómico o sonda de ADNc). La “muestra de prueba” puede incluir tejidos, células y líquidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y líquidos presentes dentro de un sujeto. El nivel de expresión del gen puede medirse de varias maneras, incluyendo, pero sin limitarse a, medir el ARNm codificado por el gen; medir la cantidad de polipéptido codificado por el gen; o medir la actividad de polipéptido codificado por el gen.
El nivel de ARNm correspondiente al gen en una célula puede determinarse tanto mediante formatos in situ como mediante formatos in vitro. Puede usarse ARN mensajero aislado de una muestra de prueba en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia de tipo Southern o Northern, análisis de PCR y alineamientos de sondas. Por ejemplo, un método de diagnóstico para la detección de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una sonda de ácido nucleico que puede hibridar con el ARNm codificado por el gen. La sonda puede ser un ácido nucleico de longitud completa, o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 10 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones rigurosas con ARNm o ADN genómico.
En un formato, se inmoviliza ARNm (o ADNc preparado a partir del mismo) sobre una superficie y se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, haciendo correr el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En otro formato, se inmovilizan las sondas sobre una superficie y se pone en contacto el ARNm (o ADNc) con las sondas, por ejemplo, en un alineamiento de chips de gen. Un experto en la técnica puede adaptar métodos de detección de ARNm conocidos para detectar el nivel de ARNm.
Puede evaluarse el nivel de ARNm (o ADNc preparado a partir del mismo) en una muestra codificado por uno o más de los genes mencionados anteriormente con ácido nucleico amplificación, por ejemplo, mediante PCR convencional (patente estadounidense n.° 4.683.202), RT-PCR (Bustin S. J Mol Endocrinol. 25:169-93, 2000), PCR cuantitativa (Ong Y. et al., Hematology. 7:59-67, 2002), real time PCR (Ginzinger D. Exp Hematol. 30:503-12, 2002), y PCR in situ (Thaker V. Methods Mol Biol. 115:379-402, 1999), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, los “cebadores de amplificación” se definen que son un par de moléculas de ácido nucleico que pueden aparearse a regiones en 5' o 3' de un gen (hebras positiva y negativa, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta entremedias. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.
Para métodos in situ, puede prepararse una muestra de células o tejido e inmovilizarse sobre un soporte, tal como, pero sin limitarse a, un portaobjetos de vidrio, y luego ponerse en contacto con una sonda que puede hibridar con ADN genómico en cromosomas o ARNm que codifica para el polipéptido correspondiente.
En otra realización, los métodos de la invención descrita incluyen además poner en contacto una muestra de control con un compuesto o agente que puede detectar ARNm, o ADN genómico, y comparar la presencia de ARNm o ADN genómico en la muestra de control con la presencia de ARNm o ADN genómico en la muestra de prueba.
Los métodos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos descritos anteriormente pueden proporcionar información cualitativa y cuantitativa para determinar si un sujeto tiene o está predispuesto a una enfermedad asociada con la expresión génica aberrante y angiogénesis aberrante, por ejemplo, cánceres.
Puede usarse una variedad de métodos para determinar el nivel de uno o más de los polipéptidos mencionados anteriormente. En general, estos métodos incluyen poner un contacto un agente que se une selectivamente al polipéptido, tal como un anticuerpo, para evaluar el nivel de polipéptido en una muestra. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. También puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')2). En otra realización, el anticuerpo porta un marcador detectable. El término “marcado”, con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende englobar el marcaje directo de la sonda o el anticuerpo uniendo físicamente una sustancia detectable a la sonda o al anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o el anticuerpo mediante reactividad con una sustancia detectable. Por ejemplo, un anticuerpo con una región Fc de conejo puede marcarse indirectamente usando un segundo anticuerpo dirigido contra la región Fc de conejo, en donde el segundo anticuerpo se acopla a una sustancia detectable. Se proporcionan ejemplos de sustancias detectables en el presente documento. Las sustancias o los marcadores detectables apropiados incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos (por ejemplo, pero sin limitarse a, 125I, 131I, 35S, 3H o 32P), enzimas (por ejemplo, pero sin limitarse a, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano, luciferasa o p-galactosidasa), restos o proteínas fluorescentes (por ejemplo, pero sin limitarse a, fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, GFP o BFP), o restos luminiscentes (por ejemplo, pero sin limitarse a, nanopartículas Qdot™ de Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA).
Los métodos de detección pueden usarse para detectar uno o más de los polipéptidos mencionados anteriormente en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Las técnicas in vitro para la detección del polipéptido incluyen análisis mediante ELISA, inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, EIA, RIA y de inmunotransferencia de tipo Western. Las técnicas in vivo para la detección del polipéptido incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con una sustancia detectable tal como se describió anteriormente. La presencia y ubicación de la sustancia detectable en un sujeto puede detectarse mediante técnicas de obtención de imágenes convencionales.
Los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento pueden identificar sujetos que tienen, o corren el riesgo de desarrollar, una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de uno o más de los polipéptidos mencionados anteriormente. Tal como se describe en el presente documento, los ejemplos de una enfermedad o un trastorno de este tipo incluyen los descritos anteriormente.
Los ensayos de pronóstico descritos en el presente documento pueden usarse para determinar si es adecuado administrar a un sujeto un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, una proteína, un péptido, ácido nucleico, una molécula pequeña u otro candidato a fármaco) para tratar un trastorno, tal como cáncer. Por ejemplo, tales ensayos pueden usarse para determinar si puede administrarse a un sujeto un fármaco citotóxico para tratar el trastorno.
La información obtenida de la práctica de los ensayos anteriores es útil en el pronóstico, la identificación de la evolución de y la gestión clínica de enfermedades y otros estados perjudiciales que afectan al estado de salud de un individuo. En algunos ejemplos, los ensayos de diagnóstico anteriores proporcionan información útil en el pronóstico, la identificación de la evolución de y la gestión clínica de tumores malignos (cánceres) que se caracterizan por una angiogénesis patológica anómala. La información ayuda más específicamente al médico clínico en el diseño de regímenes quimioterápicos u otros regímenes de tratamiento para erradicar tales tumores malignos del cuerpo de un mamífero aquejado, por ejemplo, un ser humano.
EJEMPLO 1: Métodos y materiales
Este ejemplo describe métodos y materiales generales usados en los ejemplos 2-8.
Cultivo celular
Todas las líneas celulares se propagaron tal como se describe en Tavazoie, S. F. et al., Nature 451 (7175), 147 (2008). Se cultivaron células 293T con medios DMEM complementados con FBS al 10 %; se cultivaron células H29 con medios DMEM complementados con FBS al 10 %, doxiciclina 20 |ig/ml, puromicina 2 |ig/ml y G4180,3 mg/ml; y se cultivaron células HUVEC con medios EGM-2 (CC-3162, Lonza, Basilea, Suiza). Las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 y CN34 y sus derivados metastásicos LM2, BoM2 y Lmla se describen en Minn, A. J. et al., Nature 436 (7050), 518 (2005).
Estudios con animales
Todo el trabajo con animales se realizó según un protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en la Universidad Rockefeller. Se usaron ratones NOD/SCID hembra ratones de edades coincidentes (6-8 semanas de edad) tanto para ensayos de inicio de tumor en el panículo adiposo mamario ortotópico (Minn, A. J. et al., Nature 436 (7050), 518 (2005) como para ensayos de metástasis de pulmón (Tavazoie, S. F. et al., Nature 451 (7175), 147 (2008)). Se usaron ratones atímicos hembra de edades coincidentes de ocho semanas de edad para ensayos de metástasis sistémica (Kang, Y. et al., Cancer Cell 3 (6), 537 (2003) y Yin, J. J. et al., J Clin Invest 103 (2), 197 (1999)).
Se obtuvo expresión de miR-126 inducible clonando pre-miR-126 en el vector pTripz que contenía tet-ON (Thermo Scientific, Huntsville, AL). En el día 3, se añadió doxiciclina 2 mg/ml (Sigma Aldrich) al agua potable que contenía sacarosa al 5 %. Se dio a los ratones de control agua potable con sacarosa al 5 %.
Generación de Lentivirus, Retrovirus, silenciamiento y células de sobreexpresión
Para la generación de lentivirus, se sembraron 1x106 células 293T sobre una placa de 10 cm y se incubaron durante 24 h. Entonces se cotransfectaron doce microgramos de vector K (Gag/Pol), 6 |ig de vector A (Env) y 12 |ig del plásmido de ARNhc apropiado en las células 293T usando 40 |il de reactivo de transfección TRANSIT®-293 (MIR 2700, MIRUS BIO LLC, Madison, WI). Tras 16 h, se reemplazaron los medios por DMEM libre de antibióticos recién preparado complementado con FBS al 10 %. Tras otras 24 h, se recogió el virus centrifugando durante 5 min a 1.500 g antes de filtrarse a través de un filtro de 0,45 |im. Para la generación de retrovirus, se sembraron células H29 sobre una placa de 10 cm y se dejaron crecer hasta una confluencia del 90%. Entonces se transfectaron diez microgramos del plásmido apropiado en las células H29 usando 60 |il de reactivo de transfección LIPOFECTAMINE™ 2000 (11668-019, INVITROGEN por LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA). Tras 16 h, se reemplazaron los medios por DMEM libre de antibióticos recién preparado complementado con FBS al 10 %. Tras otras 48 h, se recogió el virus centrifugando durante 5 min a 1.500 g y se filtró a través de un filtro de 0,45 |im. Se usaron dos mililitros del virus apropiado para transducir 50K células cancerosas en presencia de 10 |ig/ml de polibreno (TR-1003-G, MILLIPORE, Billerica, A). Tras 24 h, se cambiaron los medios a DMEM complementado con FBS al 10 % y puromicina 2 |ig/ml (lentivirus) o blasticidina 10 |ig/ml para la selección. Tras otras 72 h, se lavaron las células y se dejaron crecer en D10F y se sometieron a prueba para determinar el silenciamiento del gen de interés mediante qPCR.
Reclutamiento endotelial
Se sembraron células cancerosas (25.000) en placas de 24 pocillos aproximadamente 24 h antes del comienzo del ensayo de reclutamiento. Se privaron de suero células HUVEC en medios EGM-2 complementados con FBS al 0,2 % durante 24 horas. Entonces se marcaron las células HUVEC con colorante CEl Lt RACKER Red CMTPX (C34552, INVITROGEN) durante 45 min y se rescataron en medios EGM-2 complementados con FBS al 2 % durante 30 min. Mientras, se lavaron las células cancerosas con PBS y 1 ml de FBS al 0,2 % y se añadieron medios EGM-2 a cada pocillo. Se equipó cada pocillo con un inserto HTS FLUROBLOCK de 3,0 |im (351151, BD FALCON, San Jose, CA). Para los experimentos con anticuerpos, se añadió entonces la concentración apropiada de cada anticuerpo a cada pocillo: anticuerpo anti-IGFBP2 50 ng/ml (AF674, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN), anticuerpo anti-IGF-1 20 |ig/ml (AF-291-NA, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF-2 40 |ig/ml (MAB292, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF1R 20 |ig/ml (MAB391, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF2R 5 |ig/ml (AF2447, R&D SYSTEMS) y anticuerpo anti-IgG (AB-108-C, R&D SYSTEMS). Para los ensayos de reclutamiento endotelial que requieren pre-incubación con anticuerpos, se incubaron entonces o bien células HUVEC o bien células cancerosas con anticuerpo anti-IGF1R 20 |ig/ml o anticuerpo contra IgG de control durante 1 h y se lavaron una vez PBS. Entonces se privaron de suero las células HUVEC durante 1 h antes de resuspenderse en EGM-2 con FBS al 0,2 % en 100 K HUVEC por ml. Entonces se añadió la resuspensión (0,5 ml) a cada inserto FLUOROBLOCK y se dejó que el ensayo de reclutamiento continuara durante 16 h. Tras la finalización del ensayo, se fijaron las piezas de inserción FLUOROBLOCK con paraformaldehído al 4 % durante 15 min y se montaron en portaobjetos con medios de montaje VECTASHIEl D (H-1000, VECTOR LABORATORIES, Burlingame, CA). Se tomaron tres imágenes de cada inserto y se analizaron las imágenes usando IMAGEJ (NIH).
Ensayo de quimiotaxia
Se dejó que Matrigel (250 |il, BD BIOSCIENCES, n.° 356231) que contenía cantidades dadas de albúmina sérica bovina (A2153, Sigma Aldrich), rhIGFBP2 (674-B2, R&D SYSTEMS), rhGas6 (885-GS, R&D SYSTEMS), anticuerpo anti-IGF1R (MAB391, R&D SYSTEMS) y MerFc (891-MR-100, R&D SYSTEMS) solidificara en el fondo de una placa de 24 pocilios durante 30 min antes de que se añadieran 250 |il de medios HUVEC que contenían FBS al 0,2 %. Entonces se colocó un inserto HTS Fluroblock de 3,0 |im (351151, BD Falcon) en cada pocillo. Se marcaron las células HUVEC con colorante CellTracker Red CMTPX (C34552, Invitrogen) antes de resuspender 300 K HUVEC por ml de EGM-2 con FBS al 0,2 %. Entonces se añadieron 0,5 ml de la resuspensión a cada inserto Fluoroblock y se dejó que el ensayo continuara durante 20 h. Entonces se fijaron las piezas de inserción durante 15 min en paraformaldehído al 4% y se montaron en portaobjetos con medios de montaje VectaShield (H-1000, Vector Laboratories). Entonces se tomaron imágenes de 5 campos del lado basal de cada inserto y se analizaron las imágenes usando ImageJ (NIH).
Ensayo de migración
Se hicieron crecer células HUVEC hasta una confluencia del 90 % y de estimularon en las concentraciones dadas de albúmina sérica bovina (Sigma Aldrich, n.° A2153), rhIGFBP2 (674-B2, R&D SYSTEMS) y anticuerpo anti-IGF1R (MAB391, R&D SYSTe Ms ) en medios HUVEC que contenían FBS al 0,2% durante 40 min a 37°C. Entonces se sometieron las células a tripsinización y se añadieron y 50 K células a piezas de inserción HTS Fluroblock (351151, BD Falcon). Tras 24 horas a 37°C con el 5 % de CO2, se retiraron las piezas de inserción, se escindió la membrana y se fijó en paraformaldehído al 4 %. Se visualizaron las células HUVEC que habían migrado al lado basal de la membrana con DAPI y se contaron en 5 campos por membrana usando Image J (NIH).
Adhesión endotelial
Se sembraron células HUVEC en una placa de 6 cm y se dejaron crecer hasta la confluencia. Se privaron de suero células cancerosas en medios DMEM complementados con FBS al 0,2 % durante 30 min, se marcaron con colorante CELLTRACKER Green CMFDA (C7025, Invitrogen) durante 45 min y se incubaron en medios DMEM complementados con FBS al 10 % durante 30 min. Entonces se sometieron las células cancerosas a tripsinización y se resuspendieron en FBS al 10%/DMEM hasta 10 K células/ml. Entonces se añadieron cinco mililitros de la resuspensión a cada placa de HUVEC y se incubó la placa a 37°C durante 10 min. Entonces se lavaron las placas suavemente con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min. Entonces se trató cada placa con 1 ml de PBS y se tomaron 6 imágenes de cada placa. Entonces se cuantificó el número de células cancerosas adherentes a las células HUVEC usando IMAGEJ.
Proliferación endotelial
Se sembraron células cancerosas (1x106) en una placa de 10 cm y se dejaron crecer durante 24 h. Entonces se lavaron suavemente las células cancerosas con PBS y se añadieron medios EGM-2 complementados con FBS al 2 % a cada placa. Se recogieron los medios EGM-2 acondicionados tras 24 h. Se sembraron células HUVEC (25 K) por triplicado en una placa de 6 pocillos y se dejaron crecer durante 16 h. Entonces se lavaron suavemente las células HUVEC con PBS y se añadieron 3 ml de medios EGM-2 acondicionados a cada pocillo. Tras 48 h, se reemplazaron los medios acondicionados por otros 3 ml de medios acondicionados. Tras otras 48 h, se sometieron las células a tripsinización y se contaron usando un hemocitómetro.
Ensayo de formación de tubos
Se realizó un ensayo de formación de tubos según el protocolo del fabricante (354149, BD BIOCOAT™ ANGIOGÉNESIS SYSTEM - Endothelial Cell Tube Formation). Brevemente, se privaron de suero células HUVEC en Medios EGM-2 complementados con FBS al 0,2 % durante 24 horas. Entonces se marcaron las células HUVEC con colorante CELLTRACKER Red CMTPX (C34552, INVITROGEN) durante 45 min y se trataron posteriormente en medios EGM-2 complementados con FBS al 2 % durante 30 min. Mientras, se incubó la placa de ensayo de formación de tubos, que estaba en un formato de 96 pocillos, a 37°C durante 30 min. Se sometieron las células cancerosas y las células HUVEC a tripsinización y se resuspendieron a 400 K/ml y 800 K/ml, respectivamente en medios EGM-2 complementados con FBS al 2 %. Entonces se mezclaron las suspensiones de células cancerosas y células HUVEC a una razón 1:1 y se sembraron 50 |il de cada mezcla en cada pocillo de la placa de ensayo de formación de tubos. Se incubó la placa de ensayo a 37°C durante 16 h. Se tomaron imágenes de cada pocillo y se procesaron las imágenes usando el software de análisis METAMORPH (MOLECULAR DEVICES, Inc.) para obtener el número de puntos de ramificación por imagen.
Análisis de expresión de miARN y expresión de ARNm
Se extrajo el ARN total de diversas líneas celulares usando el kit MIRVANA (AM1560, APPLIED BIOSYSTEMS, Austin, TX). Se usó el ensayo de microARN TAQMAN (4427975-0002228, APPLIED BIOSYSTEMS) para cuantificar los niveles de expresión de miARN maduro tal como se describe en Tavazoie, S. F. et al., Nature 451 (7175), 147 (2008). Para la cuantificación del ARNm, se sometieron a transcripción inversa 400 ng del ARN total usando el kit de síntesis de primera cadena de ADNc (18080-051, INVITROGEN). Entonces se mezclaron aproximadamente 4 ng del ADNc resultante con el reactivo SYBR green PCR MASTER MIX (4309155, APPLIED BIOSYSTEMS) y cebadores apropiados (tabla 1). Se obtuvieron datos de expresión de ARNm cuantitativos usando un sistema de PCR en tiempo real ABI PRISM 7900HT (APPLIED BIOSYSTEMS). Se usó Smad4 como control endógeno para normalización. Se realizó análisis de expresión de cánceres de mama humanos en diversos estadios de enfermedad usando los paneles 2 y 3 de cáncer de mama en serie mediante qPCR ISSUESCAN (BCRT102 & BCRT103, ORIGENE, Rockville, MD).
T l 1. r P R n YBR r n
Figure imgf000023_0001
Predicción de diana de miR-126
Se identificaron posibles dianas de miR-126 usando 3 conjuntos de perfiles de microalineamiento: células LM2 control en relación con células LM2 que sobreexpresan miR-126 (GSE n.° 23905) y 2 alineamientos por duplicado de células MDA y LM2 (GSE n.° 23904 y Minn, A. J. et al., Nature 436 (7050), 518 (2005). Con estos alineamientos, se usaron los siguientes criterios para identificar posibles genes diana de miR-126: (1) Genes regulados por disminución más de 1,6 veces con la sobreexpresión de miR-126 en células LM2 y (2) genes regulados por incremento más de 1,4 veces en uno de los dos alineamientos de LM2 frente a MDA. Posteriormente se verificaron todas las posibles dianas mediante qPCR.
Ensayo de indicador de luciferasa
Se realizó en ensayo de indicador de luciferasa tal como se describe en Tavazoie, S. F. et al., Nature 451 (7175), 147 (2008). Brevemente, se clonaron 3'UTR y CDS de longitud completa de ABCB9, IGFBP2, MERTK, PITPNC1, PSAT1, PYGB, SHMT2 y VIPR1 en el vector de indicador de luciferasa dual psiCheck2 (C8021, PROMEGA, Madison, WI). A continuación, se enumeran las secuencias de las CDS y las 3'UTR.
CDS de ABCB9
ATGCGGCTGTGGAAGGCGGTGGTGGTGACTTTGGCCTTCATGAGTGTGGACATCTGCGTGACCACG
GCCATCTATGTCTTCAGCCACCTGGACCGCAGCCTCCTGGAGGACATCCGCCACTTCAACATCTTT
GACTCGGTGCTGGATCTCTGGGCAGCCTGCCTGTACCGCAGCTGCCTGCTGCTGGGAGCCACCATT
GGTGTGGCCAAGAACAGTGCGCTGGGGCCCCGGCGGCTGCGGGCCTCGTGGCTGGTCATCACCCTC
GTGTGCCTCTTCGTGGGCATCTATGCCATGGTGAAGCTGCTGCTCTTCTCAGAGGTGCGCAGGCCC
ATCCGGGACCCCTGGTTTTGGGCCCTGTTCGTGTGGACGTACATTTCACTCGGCGCATCCTTCCTG
CTCTGGTGGCTGCTGTCCACCGTGCGGCCAGGCACCCAGGCCCTGGAGCCAGGGGCGGCCACCGAG
GCTGAGGGCTTCCCTGGGAGCGGCCGGCCACCGCCCGAGCAGGCGTCTGGGGCCACGCTGCAGAAG
CTGCTCTCCTACACCAAGCCCGACGTGGCCTTCCTCGTGGCCGCCTCCTTCTTCCTCATCGTGGCA
GCTCTGGGAGAGACCTTCCTGCCCTACTACACGGGCCGCGCCATTGATGGCATCGTCATCCAGAAA
AGCATGGATCAGTTCAGCACGGCTGTCGTCATCGTGTGCCTGCTGGCCATTGGCAGCTCATTTGCC
GCAGGTATTCGGGGCGGCATTTTTACCCTCATATTTGCCAGACTGAACATTCGCCTTCGAAACTGT
CTCTTCCGCTCACTGGTGTCCCAGGAGACAAGCTTCTTTGATGAGAACCGCACAGGGGACCTCATC
TCCCGCCTGACCTCGGACACCACCATGGTCAGCGACCTGGTCTCCCAGAACATCAATGTCTTCCTG
CGGAACACAGTCAAGGTCACGGGCGTGGTGGTCTTCATGTTCAGCCTCTCATGGCAGCTCTCCTTG
GTCACCTTCATGGGCTTCCCCATCATCATGATGGTGTCCAACATCTACGGCAAGTACTACAAGAGG
CTCTCCAAAGAGGTCCAGAATGCCCTGGCCAGAGCGAGCAACACGGCGGAGGAGACCATCAGTGCC
AT GAAG AC T G T C CGGAGC T T C G C C AATG AG GAGG AG GAGG C AGAGG T G TAC C T G C GGAAG C T GC AG
CAGGTGTACAAGCTGAACAGGAAGGAGGCAGCTGCCTACATGTACTACGTCTGGGGCAGCGGGCTC
ACACTGCTGGTGGTCCAGGTCAGCATCCTCTACTACGGGGGCCACCTTGTCATCTCAGGCCAGATG
ACCAGCGGCAACCTCATCGCCTTCATCATCTACGAGTTTGTCCTGGGAGATTGTATGGAGTCCGTG
GGCTCCGTCTACAGTGGCCTGATGCAGGGAGTGGGGGCTGCTGAGAAGGTGTTCGAGTTCATCGAC
CGGCAGCCGACCATGGTGCACGATGGCAGCTTGGCCCCCGACCACCTGGAGGGCCGGGTGGACTTT
GAGAATGTGACCTTCACCTACCGCACTCGGCCCCACACCCAGGTCCTGCAGAATGTCTCCTTCAGC
CTGTCCCCCGGCAAGGTGACGGCCCTGGTGGGGCCCTCGGGCAGTGGGAAGAGCTCCTGTGTCAAC
ATCCTGGAGAACTTCTACCCCCTGGAGGGGGGCCGGGTGCTGCTGGACGGCAAGCCCATCAGCGCC
TACGACCACAAGTACTTGCACCGTGTGATCTCCCTGGTGAGCCAGGAGCCCGTGCTGTTCGCCCGC
TCCATCACGGATAACATCTCCTACGGCCTGCCCACTGTGCCTTTCGAGATGGTGGTGGAGGCCGCA
CAGAAGGCCAATGCCCACGGCTTCATCATGGAACTCCAGGACGGCTACAGCACAGAGACAGGGGAG
AAGGGCGCCCAGCTGTCAGGTGGCCAGAAGCAGCGGGTGGCCATGGCCCGGGCTCTGGTGCGGAAC
CCCCCAGTCCTCATCCTGGATGAAGCCACCAGCGCTTTGGATGCCGAGAGCGAGTATCTGATCCAG
CAGGCCATCCATGGCAACCTGCAGAAGCACACGGTACTCATCATCGCGCACCGGCTGAGCACCGTG
GAGCACGCGCACCTCATTGTGGTGCTGGACAAGGGCCGCGTAGTGCAGCAGGGCACCCACCAGCAG
CTGCTGGCCCAGGGCGGCCTCTACGCCAAGCTGGTGCAGCGGCAGATGCTGGGGCTTCAGCCCGCC
GCAGACTTCACAGCTGGCCACAACGAGCCTGTAGCCAACGGCAGTCACAAGGCCTGA
UTR de ABCB9
TGGGGGGCCCCTGCTTCTCCCGGTGGGGCAGAGGACCCGGTGCCTGCCTGGCAGATGTGCCCACGG
AGGCCCCCAGCTGCCCTCCGAGCCCAGGCCTGCAGCACTGAAAGACGACCTGCCATGTCCCATGGA
TCACCGCTTCCTGCATCTTGCCCCTGGTCCCTGCCCCATTCCCAGGGCACTCCTTACCCCTGCTGC
CCTGAGCCAACGCCTTCACGGACCTCCCTAGCCTCCTAAGCAAAGGTAGAGCTGCCTTTTTAAACC
TAGGTCTTACCAGGGTTTTTACTGTTTGGTTTGAGGCACCCCAGTCAACTCCTAGATTTCAAAAAC
CTTTTTCTAATTGGGAGTAATGGCGGGCACTTTCACCAAGATGTTCTAGAAACTTCTGAGCCAGGA
GTGAATGGCCCTTCCTTAGTAGCCTGGGGGATGTCCAGAGACTAGGCCTCTCCCCTTTACCCCTCC
AGAGAAGGGGCTTCCCTGTCCCGGAGGGAGACACGGGGAACGGGATTTTCCGTCTCTCCCTCTTGC
CAGCTCTGTGAGTCTGGCCAGGGCGGGTAGGGAGCGTGGAGGGCATCTGTCTGCCATCGCCCGCTG
CCAATCTAAGCCAGTCTCACTGTGAACCACACGAAACCTCAACTGGGGGAGTGAGGGGCTGGCCAG
GTCTGGAGGGGCCTCAGGGGTGCCCCCAGCCCGGCACCCAGCGCTTTCGCCCCTCGTCCACCCACC
CCTGGCTGGCAGCCTCCCTCCCCACACCCGCCCCTGTGCTCTGCTGTCTGGAGGCCACGTGGATGT
TCATGAGATGCATTCTCTTCTGTCTTTGGTGGATGGGATGGTGGCAAAGCCCAGGATCTGGCTTTG
CCAGAGGTTGCAACATGTTGAGAGAACCCGGTCAATAAAGTGTACTACCTCTTACCCCTAA CDS de IGFBP2
ATGCTGCCGAGAGTGGGCTGCCCCGCGCTGCCGCTGCCGCCGCCGCCGCTGCTGCCGCTGCTGCTG
C TGCTAC TGGGCGCGAGTGGCGGCGGCGGCGGGGCGCGCGCGGAGGTGC TGTTCCGC TGCCCGCCC
TGCACACCCGAGCGCCTGGCCGCCTGCGGGCCCCCGCCGGTTGCGCCGCCCGCCGCGGTGGCCGCA
GTGGCCGGAGGCGCCCGCATGCCATGCGCGGAGCTCGTCCGGGAGCCGGGCTGCGGCTGCTGCTCG
GTGTGCGCCCGGCTGGAGGGCGAGGCGTGCGGCGTCTACACCCCGCGCTGCGGCCAGGGGCTGCGC
TGCTATCCCCACCCGGGCTCCGAGCTGCCCCTGCAGGCGCTGGTCATGGGCGAGGGCACTTGTGAG
AAGC GC C GGGAC GC C GAGT ATGGCGCCAGCCCGGAGCAGGTT GCAGACAAT GGC GAT GAC C AC T C A
GAAG GAGG C C T G G T GGAGAAC CAC G T GGACAG CAC CAT GAACAT GTTGGGCGGG GGAG GCAG TGCT
GGC C GGAAGC C C C T C AAGT C GGG TA T GAAGGAGC TGGCCGTGTTCC GGGAGAAGG TCACTGAGCAG
CAC C GG CAGAT G GG CAAG GG T G GCAAGCAT CACCTTGGCCTG GAGGAG C C CAAGAAGC T G C GAC CA
CCCCCTGCCAGGACTCCCTGCCAACAGGAACTGGACCAGGTCCTGGAGCGGATCTCCACCATGCGC
CTTCCGGATGAGCGGGGCCCTCTGGAGCACCTCTACTCCCTGCACATCCCCAACTGTGACAAGCAT
GGCCTGTACAACCTCAAACAGTGCAAGATGTCTCTGAACGGGCAGCGTGGGGAGTGCTGGTGTGTG
AACCCCAACACCGGGAAGCTGATCCAGGGAGCCCCCACCATCCGGGGGGACCCCGAGTGTCATCTC
T T C TACAAT GAG CAGCAG GAGG CTCGCGGGGT GCACAC C CAG C G GAT G CAG TAG
3'UTR de IGFBP2
ACCGCAGCCAGCCGGTGCCTGGCGCCCCTGCCCCCCGCCCCTCTCCAAACACCGGCAGAAAACGGA
GAGTGCTTGGGTGGTGGGTGCTGGAGGATTTTCCAGTTCTGACACACGTATTTATATTTGGAAAGA
GACCAGCACCGAGCTCGGCACCTCCCCGGCCTCTCTCTTCCCAGCTGCAGATGCCACACCTGCTCC
TTCTTGCTTTCCCCGGGGGAGGAAGGGGGTTGTGGTCGGGGAGCTGGGGTACAGGTTTGGGGAGGG
GGAAGAGAAATTTTTATTTTTGAACCCCTGTGTCCCTTTTGCATAAGATTAAAGGAAGGAAAAGTA
A
CDS de MERTK
ATGGGGCCGGCCCCGCTGCCGCTGCTGCTGGGCCTCTTCCTCCCCGCGCTCTGGCGTAGAGCTATC
ACTGAGGC AAGGGAAGAAGC CAAGC CTTACCCGCTATTCCCGGGACCT TT TCCAGGGAGCCTGCAA
ACTGACCACACACCGCTGTTATCCCTTCCTCACGCCAGTGGGTACCAGCCTGCCTTGATGTTTTCA
CCAACCCAGCCTGGAAGACCACATACAGGAAACGTAGCCATTCCCCAGGTGACCTCTGTCGAATCA
AAG CCCCTACCGCCTCTTGCCTT CAAACACACAG T T G GACACATAATAC T T T C T GAACATAAAGG T
G T C AAAT T T AAT TGCT C AAT CAG T G TAC C TAATATATAC CAGGACAC CACAAT TTCTTGGT GGAAA
GA T GGGAAGGAA TTGCTTGGGGCACATCATGC AA TTACACAGTTTTATCCAGAT GA T GAAGT TACA
G CAATAAT CGCTTCCTT CAGCATAAC CAG TGTGCAGCGTT CAGAC AAT GGGTCGTATATCTG T AAG
ATGAAAATAAACAATGAAGAGATCGTGTCTGATCCCATCTACATCGAAGTACAAGGACTTCCTCAC
T T TAC TAAG CAGC C T GAGAGCAT GAAT G T CAC CAG AAACACAG C C T T CAAC CTCACCTGT CAG GC T
GTGGGCCCGCCTGAGCCCGTCAACATTTTCTGGGTTCAAAACAGTAGCCGTGTTAACGAACAGCCT
GAAAAATCCCCCTCCGTGCTAACTGTTCCAGGCCTGACGGAGATGGCGGTCTTCAGTTGTGAGGCC
CACAAT GACAAAGGGC TGACCGTGTC CAAGGGAG T GCAGA T C AACA T C AAAGCAAT TCCCTCCCCA
CCAACTGAAGTCAGCATCCGTAACAGCACTGCACACAGCATTCTGATCTCCTGGGTTCCTGGTTTT
GA T GGA TACTCCCCGTTC AGGAAT TGCAGCATTCAGGT CAAGGAAGC T GA T C C GC T GAGT AA T GGC
TCAGTCATGATTTTTAACACCTCTGCCTTACCACATCTGTACCAAATCAAGCAGCTGCAAGCCCTG
GC TAATTACAGCAT TGGTGT TTCC TGCATGAATGAAATAGGC TGGTCTGCAGTGAGCCCT TGGATT
C TAGC CAGCAC GAC T GAAG GAGC C C CAT CAG TAGCAC C T T TAAAT GTCACTGTGTTTCT GAAT GAA
T C TAG T GATAAT G T G GACAT CAGAT GGAT GAAG C C T C C GAC TAAG CAGCAG GAT G GAGAAC T G G T G
GGC T AC C GGA TATCCCACGTGT GGCAGAGT GCAGGGATTTCC AAAGAGC T C T T GGAGGAAGT T GGC
CAGAAT G GCAG C C GAGC TCGGATCTCTGTT C AAG T C CACAAT G C TAC G T GCACAG T GAG GAT T GCA
GCCGTCAC CAGAGGGGGAGT TGGGCCCTTCAGTGATCCAGT GAAAA TATTTATCCCTGCACACGGT
TGGGTAGATTATGCCCCCTCTTCAACTCCGGCGCCTGGCAACGCAGATCCTGTGCTCATCATCTTT
GGCTGCTTTTGTGGATTTATTTTGATTGGGTTGATTTTATACATCTCCTTGGCCATCAGAAAAAGA
GT C C AGGAGACAAAGT T T GGGAAT GCATTCAC AGAGGAGGAT T C T GAA TTAGTGGT GAAT TA TA TA
GCAAAGAAATCCTTCTGTCGGCGAGCCATTGAACTTACCTTACATAGCTTGGGAGTCAGTGAGGAA
CTACAAAATAAACTAGAAGATGTTGTGATTGACAGGAATCTTCTAATTCTTGGAAAAATTCTGGGT
GAAGGAGAG TTTGGGTCTG TAAT GG AAGG AAAT C T TAAG CAGGAAGAT G GGAC C T C T C T GAAAG T G
G CAG T GAAGAC CAT GAAG T T G GACAAC TCTTCACAGCGG GAGAT C GAGGAG T T T C T CAG T GAG GCA
GCGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTGTGTGTATAGAAATGAGC
T C T CAAG GCAT C C CAAAGC C CAT GG TAAT TTTACCCTTCAT GAAATAC G GG GAC CTGCATACTTAC
TTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGCATATTCCTCTGCAGACACTATTGAAGTTCATG
G T G GATAT T GC C C T G GGAAT G GAG TAT C T GAGCAACAGGAAT TTTCTTCATC GAGAT T TAG C T GC T
CGAAACTGCATGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATT
TACAGTGGCGATTATTACCGCC AAGGC CGCATTGCT AAGA TGCCTGTT AAAT GGATCGCCAT AGAA
AGTCTTGCAGACCGAGTCTACACAAGTAAAAGTGATGTGTGGGCATTTGGCGTGACCATGTGGGAA
ATAGCTACGCGGGGAATGACTCCCTATCCTGGGGTCCAGAACCATGAGATGTATGACTATCTTCTC
CAT GG C CACAG G T T GAAGCAG C C C GAAGAC TGCCTGGAT GAAC T G TAT GAAATAAT GTACTCTTGC
TGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTA
GAAAGT T T GC C T GAC G T T C GGAAC CAAGCAGAC GTTATTTACGT CAAT ACACAGTTGCT GGAGAGC
TCTGAGGGCCTGGCCCAGGGCTCCACCCTTGCTCCACTGGACTTGAACATCGACCCTGACTCTATA
ATTGCCTCCTGCACTCCCCGCGCTGCCATCAGTGTGGTCACAGCAGAAGTTCATGACAGCAAACCT
CATGAAGGACGGTACATCCTGAATGGGGGCAGTGAGGAATGGGAAGATCTGACTTCTGCCCCCTCT
GCTGCAGTCACAGCTGAAAAGAACAGTGTTTTACCGGGGGAGAGACTTGTTAGGAATGGGGTCTCC
TGGTCCCATTCGAGCATGCTGCCCTTGGGAAGCTCATTGCCCGATGAACTTTTGTTTGCTGACGAC
TCCTCAGAAGGCTCAGAAGTCCTGATGTGA
3'UTR de MERTK
GGAGAG G T GC GG GGAGACAT T C CAAAAAT CAAGC CAAT TCTTCTGCTG TAGGAG AAT C CAAT T G TA
CCTGATGTTTTTGGTATTTGTCTTCCTTACCAAGTGAACTCCATGGCCCCAAAGCACCAGATGAAT
G T T G T TAAG TAAGC T G T CAT TAAAAATACATAATATATAT T TAT T T AAAGAG AAAAAATAT G T G TA
TATCATGGAAAAAGACAAGGATATTTTAATAAAACATTACTTATTTCATTTCACTTATCTTGCATA
TCTTAAAATTAAGCTTCAGCTGCTCCTTGATATTAACATTTGTACAGAGTTGAAGTTGTTTTTTCA
AGTTCTTTTCTTTTTCATGACTATTAAATGTAAAAATATTTGTAAAATGAAATGCCATATTTGACT
TGGCTTCTGGTCTTGATGTATTTGATAAGAATGATTCATTCAATGTTTAAAGTTGTATAACTGATT
AATTTTCTGATATGGCTTCCTAATAAAATATGAATAAGGAAG
CDS de isoforma A de PITPNC1
ATGCTGCTGA AAGAGTACCG GATCTGCATG CCGCTCACCG TAGACGAGTA CAAAATTGGA
CAGCTGTACA TGATCAGCAA ACACAGCCAT GAACAGAGTG ACCGGGGAGA AGGGGTGGAG
GTCGTCCAGA ATGAGCCCTT TGAGGACCCT CACCATGGCA ATGGGCAGTT CACCGAGAAG
CGGGTGTATC TCAACAGCAA ACTGCCTAGT TGGGCTAGAG CTGTTGTCCC CAAAATATTT
TATGTGACAG AGAAGGCTTG GAACTATTAT CCCTACACAA TTACAGAATA CACATGTTCC
TTTCTGCCGA AATTCTCCAT TCATATAGAA ACCAAGTATG AGGACAACAA AG GAAG CAAT
GACACCATTT TCGACAATGA AGCCAAAGAC GTGGAGAGAG AAGTTTGCTT TATTGATATT
GCCTGCGATG AAATTCCAGA GCGCTACTAC AAAGAATCTG AGGATCCTAA GCACTTCAAG
TCAGAGAAGA CAGGACGGGG ACAGTTGAGG GAAGGCTGGA GAGATAGTCA TCAGCCTATC
ATGTGCTCCT ACAAGCTGGT GACTGTGAAG TTTGAGGTCT GGGGGCTTCA GACCAGAGTG
GAACAATTTG TACACAAGGT GGTCCGAGAC ATTCTGCTGA TTGGACATAG ACAGGCTTTT
GCATGGGTTG ATGAGTGGTA TGACATGACA ATGGATGAAG TCCGAGAATT TGAACGAGCC
ACTCAGGAAG CCACCAACAA GAAAATCGGC ATTTTCCCAC CTGCAATTTC TATCTCCAGC
ATCCCCCTGC TGCCTTCTTC CGTCCGCAGT GCGCCTTCTA GTGCTCCATC CACCCCTCTC
TCCACAGACG CACCCGAATT TCTGTCCGTT CCCAAAGATC GGCCCCGGAA AAAGTCTGCC
CCAGAAACTC TCACACTTCC AGACCCTGAG AAAAAAGCCA CCCTGAATTT ACCCGGCATG
CACTCTTCAG ATAAGCCATG TCGGCCCAAA TCTGAGTAA
CDS de isoforma B de PITPNC1
ATGCTGCT GAAAGAG TAC C G GAT CTGCATGCCGCT CAC C G TAGAC GAG TACAAAAT T G GACAGC T G
T AC AT GA T C AGCAAACACAGC CA T GAACAGAGT GAC C GGGGAGAAGGGG T GGAGG T C GT C C AGAA T
GAGC C C T T T GAG GAC CCTCACCATGG CAAT GG GCAG T T CAC C GAGAAG CGGGTGTATCT CAACAGC
AAACTGCCTAGTTGGGCTAGAGCTGTTGTCCCCAAAATATTTTATGTGACAGAGAAGGCTTGGAAC
TATTATCCCTACACAATTACAGAATACACATGTTCCTTTCTGCCGAAATTCTCCATTCATATAGAA
AC CAAG TAT GAG GACAACAAAG GAAG CAAT GACAC CAT T T T C GACAAT GAAG C C AAAGAC G T GGAG
AGAGAAGTTTGCTTTATTGATATTGCCTGCGATGAAATTCCAGAGCGCTACTACAAAGAATCTGAG
GAT C C T AAGCAC T T CAAG T CAGAGAAGACAGGAC GG GGACAG T T GAGG GAAG GC T G GAGAGATAG T
CATCAGCCTATCATGTGCTCCTACAAGCTGGTGACTGTGAAGTTTGAGGTCTGGGGGCTTCAGACC
AGAGT GGAACAAT TTGTACAC AAGG T GGT C C GAGACA TTCTGCTGATT GGACA TAGACAGGC T T T T
GCATGGGTTGAT GAG TGGTATGATAT GACAAT GGAT GAT G T T C G GG AATAC GAG AAAAACAT GCAT
GAACAAACCAACATAAAAGTTTGCAATCAGCATTCCTCCCCTGTGGATGACATAGAGAGTCATGCC
CAAACAAG TACAT GA
3'UTR de PITPNC1
C AA T GGA T GAAGT C C GAGAAT T T GAAC GAGC CAC T CAGGAAGC CAC C AACAAGAAAA TCGGCATTT
TCCCACCTGCAATTTCTATCTCCAGCATCCCCCTGCTGCCTTCTTCCGTCCGCAGTGCGCCTTCTA
GTGCTCCATCCACCCCTCTCTCCACAGACGCACCCGAATTTCTGTCCGTTCCCAAAGATCGGCCCC
GGAAAAAGTCTGCCCCAGAAACTCTCACACTTCCAGACCCTGAGAAAAAAGCCACCCTGAATTTAC
CCGGCATGCACTCTT CAGATAAGC CATGTCGGCC CAAAT C T GAG TAAC T T TATATAAATAT C T CAT
GGGGTTTTATATTTTCATTTGTTGTTGTTGTTTTTTTTTAAGAATCTTCTGATAGAGAAAAAGACT
GCTTTGTCACTCAAACATGTTCCTTCGACCTTTCAGTGTGCATGTGACTCAGTAACTTCACATAGA
ATAT GAT T C C C TAAG TATGCTACACAGCATCATAT TAGAT G TAAGAT G TAAGAC T T GC AAAG GACA
GAAGGAATC TTCTGTAACCACATAGCTGTATGCCAGAGAGGAAGCCT TGTTAT TGGGCATT TGATG
AGGTTTGGCATGGACTTCAAGGATAAATGAATGAAAACTTTGCACCACTTTTGTTACAAGGTACGG
TAGAAAATAGTGAAGTCAGTTTCCTCTCATCAAATCTAAAATTCTCCAAAATACTCTCAGGCATAA
CATAC TTAGCTGT TAAATT TTGAAC TGCTAATTAC TAATAC TTGAATACCAATAGTTAC TGAGAT T
CCTATTTTGTGGTTAGTCTGACTCAGGATTTGGAGCCTAATTAACTCTAAACTTTTGAAAATTTTA
ATCATCAAGCTATAGAGGC TCCAAGTGCAAT TAATAATAAC TCAT TTATACCT TCCACAGAAT TTA
ATAAAGATTCTACTTGTTTCTGTCTTTTAA
CDS de PSAT1
ATGGACGCCCCCAGGCAGGTGGTCAACTTTGGGCCTGGTCCCGCCAAGCTGCCGCACTCAGTGTTG
T TAGAGA TACAAAAGGAAT TATTAGAC TACAAAGGAG TTGGCATTAGTGTTCTT GAAAT GAGT CAC
AG G T CAT CAGAT T T T G C CAAGAT TAT TAACAATACAGAGAAT CTTGTGCG GGAAT TGCTAGCTGTT
CCAGACAACTATAAGGTGATT TT TC TGCAAGGAGGTGGGTGCGGCCAGT TCAGTGCTGTCCCC TTA
AAC CTCATTGGCTT GAAAGCAGGAAGG T G T GC T GAC TATGTGGTGAC AGGAGC TTGGTCAGCT AAG
GC C G CAGAAG AAGC CAAGAAG T T T GG GAC TATAAATAT CGTTCACCC TAAAC T T GG GAG T TATACA
AAAATTCCAGATCCAAGCACCTGGAACCTCAACCCAGATGCCTCCTACGTGTATTATTGCGCAAAT
GAGACGGTGCATGGTGTGGAGTTTGACTTTATACCCGATGTCAAGGGAGCAGTACTGGTTTGTGAC
ATGTCCTCAAACTTCCTGTCCAAGCCAGTGGATGTTTCCAAGTTTGGTGTGATTTTTGCTGGTGCC
CAGAAGAATGTTGGCTCTGCTGGGGTCACCGTGGTGATTGTCCGTGATGACCTGCTGGGGTTTGCC
CTCCGAGAGTGCCCCTCGGTCCTGGAATACAAGGTGCAGGCTGGAAACAGCTCCTTGTACAACACG
CCTCCATGT TTCAGCATCTACGTCATGGGCT TGGT TC TGGAGTGGAT TAAAAACAATGGAGGTGCC
GCGGCCAT GGAG AAGC T TAG C T C CAT CAAAT C T CAAACAAT T TAT GAGAT TAT T GATAAT T C T CAA
GGATTCTACGTTTGTCCAGTGGAGCCCCAAAATAGAAGCAAGATGAATATTCCATTCCGCATTGGC
AATGCCAAAGGAGATGATGCTTTAGAAAAAAGATTTCTTGATAAAGCTCTTGAACTCAATATGTTG
TCCTTGAAAGGGCATAGGTCTGTGGGAGGCATCCGGGCCTCTCTGTATAATGCTGTCACAATTGAA
GAC G T T CAGAAG CTGGCCGCCTTCAT GAAAAAAT T T T T GGAGAT GCATCAGCTATGA
3'UTR de PSAT1
ACACATCCTAACCAGGATATACTCTGT TC TTGAACAACATACAAAGT TTAAAGTAAC TTGGGGATG
GCTACAAAAAGTTAACACAGTATTTTTCTCAAATGAACATGTTTATTGCAGATTCTTCTTTTTTGA
AAGAACAACAGCAAAACATCCACAACTCTGTAAAGCTGGTGGGACCTAATGTCACCTTAATTCTGA
CTTGAACTGGAAGCATTTTAAGAAATCTTGTTGCTTTTCTAACAAATTCCCGCGTATTTTGCCTTT
GCTGCTACTTTTTCTAGTTAGATTTCAAACTTGCCTGTGGACTTAATAATGCAAGTTGCGATTAAT
TATTTCTGGAGTCAT GGGAAC AC AC AGCACAGAGGGT AGGGGGGCCCTCTAGGTGCT GAAT C T AC A
CATCTGTGGGGTCTCCTGGGTTCAGCGGCTGTTGATTCAAGGTCAACATTGACCATTGGAGGAGTG
GTT TAAGAGTGCCAGGCGAAGGGCAAACTGTAGATCGATCT TTATGC TGTTAT TACAGGAGAAGTG
ACATACTTTATATATGTTTATATTAGCAAGGTCTGTTTTTAATACCATATACTTTATATTTCTATA
CAT TTATAT TTCTAATAATACAGTTATCACTGATATATGTAGACACT TT TAGAAT TTAT TAAATCC
TTGACCTTGTGCATTATAGCATTCCATTAGCAAGAGTTGTACCCCCTCCCCAGTCTTCGCCTTCCT
CTTTTTAAGCTGTTTTATGAAAAAGACCTAGAAGTTCTTGATTCATTTTTACCATTCTTTCCATAG
GTAGAAGAGAAAGTTGATTGGTTGGTTGTTTTTCAATTATGCCATTAAACTAAACATTTCTGTTAA
ATTACCCTATCCTTTGTTCTCTACTGTTTTCTTTGTAATGTATGACTACGAGAGTGATACTTTGCT
GAAAAGTCTTTCCCCTATTGTTTATCTATTGTCAGTATTTTATGTTGAATATGTAAAGAACATTAA
AGTCCTAAAACATCTAA
CDSde PYGB
ATGGCGAAGCCGCTGACGGACAGCGAGAAGCGGAAGCAGATCAGCGTGCGCGGCCTGGCGGGGCTA
GGC GAC GTGGCCGAGGTGC GGAAGAGC T T CAAC CGGCACTTGCACTTCACGCTGGTC AAGGAC C GC
AATGTGGCCACGCCCCGCGACTACTTCTTCGCGCTGGCGCACACGGTGCGCGACCACCTCGTGGGC
CGCTGGATCCGCACGCAGCAGCACTACTACGAGCGCGACCCCAAGCGCATTTATTATCTTTCCCTG
GAATTCTACATGGGTCGCACGCTGCAGAACACGATGGTGAACCTGGGCCTTCAGAATGCCTGCGAT
GAAG CCATCTATCAGTTGGGGT TAGAC T T G GAGGAAC T C GAG GAGATAGAAGAAGAT GCTGGCCTT
GGGAATGGAGGCC TGGGGAGGCTGGCAGCGTGT TTCC TTGACTCAATGGCTACCT TGGGCC TGGCA
GCATAC GG C TAT GGAAT C C G C TAT GAAT T T GG GAT T T T TAAC CAGAAGAT T G T CAAT G GC T G GCAG
G TAGAGGAGGC C GAT GAC TGGCTGCGCTACGGC AAC C C C T GGGAGAAAGC GC GGC C T GAGT AT AT G
CTTCCCGTGCACTTCTACGGACGCGTGGAGCACACCCCCGACGGCGTGAAGTGGCTGGACACACAG
GTGGTGCTGGCCATGCCCTAC GACAC CCCAGTGCCCGGC TACAAGAACAACAC C G T CAACAC CAT G
CGGCTGTGGTCCGCC AAGGC T C C C AAC GAC T T C AAGC TGCAGGACTT C AAC GT GGGAGAC T AC AT C
GAGGCGGTCCTGGACCGGAACTTGGCTGAGAACATCTCCAGGGTCCTGTATCCAAATGATAACTTC
T T T GAGGGGAAGGAGC T GC GGC T GAAGCAGGAG TACTTCGTGGTGGCCGCCACGCTCCAGGACATC
ATCCGCCGCTTCAAGTCGTCCAAGTTCGGCTGCCGGGACCCTGTGAGAACCTGTTTCGAGACGTTC
CCAGACAAGGTGGCCATCCAGCTGAACGACACCCACCCCGCCCTCTCCATCCCTGAGCTCATGCGG
ATCCTGGT GGAC G T GGAGAAGGT GGACTGGGAC AAGGC C T GGGAAAT CAC GAAGAAGAC C T GT GC A
TACACCAACCACACTGTGCTGCCTGAGGCCTTGGAGCGCTGGCCCGTGTCCATGTTTGAGAAGCTG
CTGCCGCGGCACCTGGAGATAATCTATGCCATCAACCAGCGGCACCTGGACCACGTGGCCGCGCTG
TTTCCCGGCGATGTGGACCGCCTGCGCAGGATGTCTGTGATCGAGGAGGGGGACTGCAAGCGGATC
AACATGGCCCACCTGTGTGTGATTGGGTCCCATGCTGTCAATGGTGTGGCGAGGATCCACTCGGAG
A T C GT GAAACAGT CGGTCTTT AAGGAT T T T T AT GAAC T GGAGC CAGAGAAG TTCC AGAA TAAGAC C
AATGGCATCACCCCCCGCCGGTGGCTGCTGCTGTGCAACCCGGGGCTGGCCGATACCATCGTGGAG
AAAAT T GGGGAGGAG TTCCTGACTGACCT GAGC CAGC T GAAGAAGC TGCTGCCGCTGGTCAGT GAC
GAGGTGTTCATCAGGGACGTGGCCAAGGTCAAACAGGAGAACAAGCTCAAGTTCTCGGCCTTCCTG
GAGAAG GAG TACAAGG T GAAGAT CAAC CCCTCCTCCATGTTC GAT GTGCATGT GAAGAGGAT C CAC
GAG TACAAGC GGCAGCTGCTC AAC TGCCTGCACGTCGTCACCCTG TAC AAT C GAA T C AAGAGAGAC
CCGGCCAAGGCTTTTGTGCCCAGGACTGTTATGATTGGGGGCAAGGCAGCGCCCGGTTACCACATG
GCCAAGCTGATCATCAAGTTGGTCACCTCCATCGGCGACGTCGTCAATCATGACCCAGTTGTGGGT
GACAGGTTGAAAGTGATCTTCCTGGAGAACTACCGTGTGTCCTTGGCTGAGAAAGTGATCCCGGCC
GCTGATCTGTCG CAGCAGAT C T C CAC TGCAGGCACC GAGG C C T CAG GCACAG GCAACAT GAAG T T C
A T GC T CAAC GGGGCCCTCACCATCGGCACCAT GGAC GGC GC CAAC GTGGAGATGGCC GAGGAGGC C
GGGGCCGAGAACCTCTTCATCTTCGGCCTGCGGGTGGAGGATGTCGAGGCCTTGGACCGGAAAGGG
TAC AA TGCCAGGGAGTACTAC GAC CACCTGCCC GAGC T GAAGC AGGC C G T GGAC CAGATCAGCAGT
GGCTTTTTTTCTCC CAAG GAGC CAGAC T GC T T CAAG GACAT C G T GAACAT GC T GAT GCAC CAT GAC
AG GTT CAAGG T G T T T G CAGAC TAT GAAG CCTACATGCAGTGCCAGGCACAGGTG GAC CAG C T G TAC
C G GAAC C C CAAG GAG T GGAC CAAGAAGG T CAT CAGGAACAT CGCCTGCTCGG GCAAG TTCTCCAGT
GAC C GGAC C AT CAC GGAGT AT GC AC GGGAGA TCTGGGGTGTGGAGCCCTCC GAC C T GCAGA T C C C G
CCCCCCAACATCCCCCGGGACTAG
3'UTR de PYGB
GCACACCCTGCCTTGGCGGGACCAGCGGGCATTTGTTTTCTTGCTGACTTTGCACCTCCTTTTTTC
CCCAAACACTTTGCCAGCCACTGGTGGTCCCTGCTTTTCTGAGTACCATGTTTCCAGGAGGGGCCA
TGGGGGTCAGGGTGGTTTT GAGAGAGC AGGG TAAGGAAGGAAT GT GC TAGAAG TGCTCCTAGTTTC
TTGTAAAGGAAGCCAGAGTTGACAGTACAAAGGGTCGTGGCCAGCCCTGCAGCTTCAGCACCTGCC
C CAC C CAGAGT GGGAGT CAGG T GGAGC CACCTGCTGGGCTCCCCC AGAAC TTTGCACACATCTTGC
TATGTATTAGCCGATGTCTTTAGTGTTGAGCCTCTGGATTCTGGGGTCTGGGCCAGTGGCCATAGT
GAAGC C T GGGAAT GAGT GTTACTGCAGCATCTGGGCTGCCAGC CACAGGGAAGGGC C AAGC C C CA T
GTAGCCCCAGTCATCCTGCCCAGCCCTGCCTCCTGGCCATGCCGGGAGGGGTCGGATCCTCTAGGC
ATCGCCTTCACAGCCCCCTGCCCCCTGCCCTCTGTCCTGGCTCTGCACCTGGTATATGGGTCATGG
ACCCAGATGGGGCTTTCCCTTTGTAGCCATCCAATGGGCATTGTGTGGGTGCTTGGAACCCGGGAT
GACTGAGGGGGACACTGGAGTGGGTGCTTGTGTCTGCTGTCTCAGAGGCCTTGGTCAGGATGAAGT
TGGCTGACACAGC TTAGCT TGGT TT TGCT TATTCAAAAGAGAAAATAAC TACACATGGAAA TG AAA
CTAGCTGAAGCCTTTTCTTGTTTTAGCAACTGAAAATTGTACTTGGTCACTTTTGTGCTTGAGGAG
GCCCATTTTCTGCCTGGCAGGGGGCAGGTCTGTGCCCTCCCGCTGACTCCTGCTGTGTCCTGAGGT
GCATTTCCTGTTGTACACACAAGGGCCAGGCTCCATTCTCCCTCCCTTTCCACCAGTGCCACAGCC
TCGTCTGGAAAAAGGACCAGGGGTCCCGGAGGAACCCATTTGTGCTCTGCTTGGACAGCAGGCCTG
GCACTGGGAGGTGGGGGTGAGCCCCTCACAGCCTTGCCCCTCCCCAAGGCTGGCAACCTGCCTCCC
A T T GC C C AAGAGAGAGGGC AGGG AACAGGC TACTGTCCTTCCCTGT GGAAT T GC C GAGAAA T C TAG
CACCTTGCATGCTGGATCTGGGCTGCGGGGAGGCTCTTTTTCTCCCTGGCCTCCAGTGCCCACCAG
GAGGATC TGCGCACGGTGCACAGCCCACCAGAGCACTACAGCC TT TTAT TGAGTGGGGCAAGTGC T
GGGCTGTGGTCGTGCCCTGACAGCATCTTCCCCAGGCAGCGGCTCTGTGGAGGAGGCCATACTCCC
CTAGTTGGCCACTGGGGCCACCACCCTGACCACCACTGTGCCCCTCATTGTTACTGCCTTGTGAGA
TAAAAACTGATTAAACCTTTGTGGCTGTGGTTGGCTGA
CDS de SHMT2
ATGCTGTACTTCTCTTTGTTTTGGGCGGCTCGGCCTCTGCAGAGATGTGGGCAGCTGGTCAGGATG
GCCATTCGGGCT CAGCACAG CAAC GCAG C C CAGAC T CAGAC T GG GGAAGCAAACAG GG GC T G GACA
GGCCAGGAGAGCC TGTCGGACAGTGATCC TGAGATGTGGGAGT TGCTGCAGAGGGAGAAGGACAGG
CAGTGTCGTGGCCTGGAGCTCATTGCCTCAGAGAACTTCTGCAGCCGAGCTGCGCTGGAGGCCCTG
GGGTCCTGTCT GAAC AACAAG TAC T C GGAGGGT TA T C C T GGCAAGAGAT AC TA T GGGGGAGCAGAG
GTGGTGGATGAAATTGAGCTGCTGTGCCAGCGCCGGGCCTTGGAAGCCTTTGACCTGGATCCTGCA
CAGTGGGGAGTCAATGTCCAGCCCTACTCCGGGTCCCCAGCCAACCTGGCCGTCTACACAGCCCTT
C T GCAAC CTCACGACC GGA TCATGGGGCTGGACCTGCCC GA TGGGGGCCATCTCACCCACGGCTAC
ATGTCTGACGTCAAGCGGATATCAGCCACGTCCATCTTCTTCGAGTCTATGCCCTATAAGCTCAAC
CCCAAAACTGGCCTCATTGACTACAACCAGCTGGCACTGACTGCTCGACTTTTCCGGCCACGGCTC
ATCATAGCTG GCAC CAGCGCCTATGCTCGCCTCATT GAC TAC GCCCGCAT GAGAGAGG TGTGTGAT
GAAGTCAAAGCACACCTGCTGGCAGACATGGCCCACATCAGTGGCCTGGTGGCTGCCAAGGTGATT
CCCTCGCCTTTCAAGCACGCGGACATCGTCACCACCACTACTCACAAGACTCTTCGAGGGGCCAGG
TCAGGGCTCATCTTCTACCGGAAAGGGGTGAAGGCTGTGGACCCCAAGACTGGCCGGGAGATCCCT
TACACATTTGAGGACCGAATCAACTTTGCCGTGTTCCCATCCCTGCAGGGGGGCCCCCACAATCAT
GCCATTGCTGCAGTAGCTGTGGCCCTAAAGCAGGCCTGCACCCCCATGTTCCGGGAGTACTCCCTG
CAGGTTCTGAAGAATGCTCGGGCCATGGCAGATGCCCTGCTAGAGCGAGGCTACTCACTGGTATCA
GGTGGTACT GACAAC CACCTGGTGCTGGTGGACCTGCGGCC CAAGGGC C T GGA T GGAGC T C GGGCT
GAGO GG G T GC TAGAGC TTGTATCCATCACTGC CAACAAGAACAC CTGTCCTG GAGAC C GAAG T G C C
ATCACACCGGGCGGCCTGCGGCTTGGGGCCCCAGCCTTAACTTCTCGACAGTTCCGTGAGGATGAC
T T C C GGAGAG T T G T GGAC T T TATAGAT GAAGG GG T CAACAT T GG C T TAGAGG T GAAGAGCAAGAC T
GCCAAGCTCCAGGATTTCAAATCCTTCCTGCTTAAGGACTCAGAAACAAGTCAGCGTCTGGCCAAC
CTCAGGCAACGGGTGGAGCAGTTTGCCAGGGCCTTCCCCATGCCTGGTTTTGATGAGCATTGA
3'UTR de SHMT2
AGGCACCTGGGAAATGAGGCCCACAGACTCAAAGTTACTCTCCTTCCCCCTACCTGGGCCAGTGAA
ATAGAAAGCC TT TC TATT TT TTGGTGCGGGAGGGAAGACC TC TCAC TTAGGGCAAGAGCCAGGTAT
AGTCTCCCTTCCCAGAATTTGTAACTGAGAAGATCTTTTCTTTTTCCTTTTTTTGGTAACAAGACT
TAGAAGGAGGGCCCAGGCACTTTCTGTTTGAACCCCTGTCATGATCACAGTGTCAGAGACGCGTCC
TC TT TC TTGGGGAAGT TGAGGAGTGCCC TTCAGAGCCAGTAGCAGGCAGGGGTGGGTAGGCACCCT
CCTTCCTGTTTTTATCTAATAAAATGCTAACCTGCCCTGAGTTTCCATTACTGTGGGTGGGGTTCC
CCTGGGCCAAACAGTGATTTGTCTCCCTCAATGTGTACACCGCTCCGCTCCCACCACCGCTACCAC
AAGGACCCCCGGGGCTGCAGCCTCCTCTTTCTGTCTCTGATCAGAGCCGACACCAGACGTGATTAG
CAGGCGCAGCAAATTCAATTTGTTAAATGAAATTGTATTTTG
CDS de VIPR1
ATGCGCCCGCCAAGTCCGCTGCCCGCCCGCTGGCTATGCGTGCTGGCAGGCGCCCTCGCCTGGGCC
CTTGGGCCGGCGGGCGGC CAG GC GG C CAG GC T G CAGGAG GAG T G T GAC TAT G T GCAGAT GAT C GAG
GT GC AGCACAAGCAGT GC C T GGAGGAGGC C CAGC T GGAGAAT GAGACAAT AGGCTGCAGC AAGA T G
TGGGACAACCTCACCTGCTGGCCAGCCACCCCTCGGGGCCAGGTAGTTGTCTTGGCCTGTCCCCTC
ATCTTCAAGCTCTTCTCCTCCATTCAAGGCCGCAATGTAAGCCGCAGCTGCACCGACGAAGGCTGG
ACGCACCTGGAGCCTGGCCCGTACCCCATTGCCTGTGGTTTGGATGACAAGGCAGCGAGTTTGGAT
GAGCAGCAGACCATGTTCTACGGTTCTGTGAAGACCGGCTACACCATTGGCTACGGCCTGTCCCTC
GCCACCCTTCTGGTCGCCACAGCTATCCTGAGCCTGTTCAGGAAGCTCCACTGCACGCGGAACTAC
ATCCACATGCACCTCTTCATATCCTTCATCCTGAGGGCTGCCGCTGTCTTCATCAAAGACTTGGCC
CTCTTCGACAGCGGGGAGTCGGACCAGTGCTCCGAGGGCTCGGTGGGCTGTAAGGCAGCCATGGTC
TTTTTCCAATATTGTGTCATGGCTAACTTCTTCTGGCTGCTGGTGGAGGGCCTCTACCTGTACACC
CTGCTTGCCGTCTCCTTCTTCTCTGAGCGGAAGTACTTCTGGGGGTACATACTCATCGGCTGGGGG
GTACCCAGCACATTCACCATGGTGTGGACCATCGCCAGGATCCATTTTGAGGATTATGGGTGCTGG
GACACCATCAACTCCTCACTGTGGTGGATCATAAAGGGCCCCATCCTCACCTCCATCTTGGTAAAC
TTCATCCTGTTTATTTGCATCATCCGAATCCTGCTTCAGAAACTGCGGCCCCCAGATATCAGGAAG
AGTGACAGCAGTCCATACTCAAGGCTAGCCAGGTCCACACTCCTGCTGATCCCCCTGTTTGGAGTA
CACTACATCATGTTCGCCTTCTTTCCGGACAATTTTAAGCCTGAAGTGAAGATGGTCTTTGAGCTC
GTCGTGGGGTCTTTCCAGGGTTTTGTGGTGGCTATCCTCTACTGCTTCCTCAATGGTGAGGTGCAG
GCGGAGCT GAGGC GGAAG TGGCGGCGCTGGCACCTGCAGGGCGTCCTGGGCT GG AAC C C C AAAT AC
CGGCACCCGTCGGGAGGCAGCAACGGCGCCACGTGCAGCACGCAGGTTTCCATGCTGACCCGCGTC
AGCCCAGGTGCCCGCCGCTCCTCCAGCTTCCAAGCCGAAGTCTCCCTGGTCTGA
3'UTR de VIPR1
CCACCAGGATCCCAGGGGCCCAAGGCGGCCCCTCCCGCCCCTTCCCACTCACCCCGGCAGACGCCG
GGGACAGAGGCCTGCCCGGGCGCGGCCAGCCCCGGCCCTGGGCTCGGAGGCTGCCCCCGGCCCCCT
GGTC TC TGGTCCGGACAC TCCTAGAGAACGCAGCCC TAGAGCCTGCCTGGAGCGTT TC TAGCAAGT
GAGAGAGATGGGAGCTCCTCTCCTGGAGGATTGCAGGTGGAACTCAGTCATTAGACTCCTCCTCCA
AAGGCCCCCTACGCCAATCAAGGGCAAAAAGTCTACATACTTTCATCCTGACTCTGCCCCCTGCTG
GCTCTTCTGCCCAATTGGAGGAAAGCAACCGGTGGATCCTCAAACAACACTGGTGTGACCTGAGGG
CAGAAAGGTTCTGCCCGGGAAGGTCACCAGCACCAACACCACGGTAGTGCCTGAAATTTCACCATT
GC TGTCAAGT TCCT TTGGGT TAAGCATTACCACTCAGGCATT TGAC TGAAGATGCAGC TCAC TACC
CTATTCTCTCTTTACGCTTAGTTATCAGCTTTTTAAAGTGGGTTATTCTGGAGTTTTTGTTTGGAG
AGCACACCTATCTTAGTGGTTCCCCACCGAAGTGGACTGGCCCCTGGGTCAGTCTGGTGGGAGGAC
GGTGCAACCCAAGGAC TGAGGGAC TC TGAAGCCTCTGGGAAATGAGAAGGCAGCCACCAGCGAATG
CTAGGTCTCGGACTAAGCCTACCTGCTCTCCAAGTCTCAGTGGCTTCATCTGTCAAGTGGGATCTG
TCACACCAGCCATACTTATCTCTCTGTGCTGTGGAAGCAACAGGAATCAAGAGCTGCCCTCCTTGT
CCACCCACCTATGTGCCAACTGTTGTAACTAGGCTCAGAGATGTGCACCCATGGGCTCTGACAGAA
AGCAGATACCTCACCCTGCTACACATACAGGATTTGAACTCAGATCTGTCTGATAGGAATGTGAAA
GCACGGACTCTTACTGCTAACTTTTGTGTATCGTAACCAGCCAGATCCTCTTGGTTATTTGTTTAC
CACTTGTATTATTAATGCCATTATCCCTGAATCCCCCTTGCCACCCCACCCTCCCTGGAGTGTGGC
TGAGGAGGCCTCCATCTCATGTATCATCTGGATAGGAGCCTGCTGGTCACAGCCTCCTCTGTCTGC
CCTTCACCCCAGTGGCCACTCAGCTTCCTACCCACACCTCTGCCAGAAGATCCCCTCAGGACTGCA
ACAGGC TTGTGCAACAATAAATGT TGGC TTGGA
Se transfectaron células MDA-MB-231 que expresan o bien una horquilla de control o bien un miR-126 de selección como diana en horquilla con el constructo indicador específico respectivo. Treinta horas tras la transfección, se lisaron las células y se determinó la razón de expresión de luciferasa de Renilla con respecto a la de luciérnaga usando un ensayo de luciferasa dual (E1910, PROMEGA). Las secuencias del cebador de clonación se muestran en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Cebadores de clonación
Figure imgf000031_0001
Se identificaron los posibles sitios de miR-126 en los genes mediante la alineación con la secuencia de miR-126 complementaria 5-TTACTCACGGTACGA-3, y se realizó mutagénesis usando el kit de mutagénesis dirigida a múltiples sitios QUICKCHANGE (200514, a G iLe NT TECHNOLOGIES, Santa Clara, CA). Basándose en el buscador de genomas UCSC, se mutó la 3’UTR de MERTK en la posición 5 (de GTT a CAC), se mutó la 3’UTR de IGFBP2 en la posición 246 (de GGT a CAC), se mutó la CDS de PlTPNCI en la posición 709 (de TAC a GTA) del codón inicial y se mutó la CDS de SHMT2 en la posición 1126 (de GGT a CAC). Los cebadores de mutagénesis se muestran en la tabla 3 a continuación
Tabla 3. Cebadores de muta énesis
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000032_0001
Proliferación de células cancerosas
Se sembraron células LM2 (2,5 X 104) que expresan una horquilla de control o IGFBP2, PITPNC1 o MERTK de selección como diana en horquillas cortas por triplicado en placas de 6 pocillos y se contaron las células viables a los 5 días tras la siembra.
Histología
Se prepararon pulmones mediante fijación por perfusión con paraformaldehído al 4 % infundido a través del sistema vascular y a través de la tráquea. Tras la escisión, se colocaron los pulmones en paraformaldehído al 4 % durante la noche y se incluyeron en parafina. Cinco minutos antes de la fijación, se inyectaron 100 mg de lectina biotinilada (B-1175, VECTOR LABORATORIES) en la circulación a través de la vena de la cola. Se tiñeron cortes en parafina de cinco micrómetros de grosor con anticuerpos primarios contra MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank, Universidad de Iowa, IA), vimentina (VP-V684, VECTOR LABORATORIES) y con avidina marcada con FITC (B-1175, VECTOR LABORATORIES) para la detección de la lectina biotinilada inyectada. Los anticuerpos primarios se detectaron usando diversos anticuerpos secundarios conjugados con el colorante Alexa Flour. Se obtuvo la fluorescencia usando un microscopio confocal de barrido láser ZEISS (LSM 510). Para determinar la vascularización de los nódulos metastásicos, se cuantificaron las señales de MECA-32 y lectina usando IMAGEJ mientras que las extensiones de los nódulos metastásicos se determinaron a través de cotinción con vimentina humana. Se determinó el área colectiva cubierta por vasos restando el fondo (radio de bola rodante de 1 píxel) y usando un umbral predeterminado como punto de corte. La densidad de vasos se da como el porcentaje del área cubierta por los vasos sanguíneos en comparación con el área total del nódulo metastásico. Un nódulo metastásico se definió por un área positiva para tinción con vimentina con un área total por encima de 2000 |im2
Se escindieron tumores de panículo adiposo mamario y se sumergieron en paraformaldehído al 4 % durante 24 horas. Se incluyó el tejido fijado en parafina y se cortó en cortes de 5 |im de grosor. Se realizó inmunodetección usando anticuerpos dirigidos hacia MECA-32 (Developmental Studies Hybridoma Bank), Mac-2 (CL8942AP, Cederlane, Burlington) y CD45 (550539, BD Biosciences). La detección de anticuerpos primarios se realizó usando diversos anticuerpos secundarios biotinilados (Vector Laboratories). Posteriormente se amplificó la señal usando el kit ABC (Vector Laboratories) y se detectó usando DAB (3,3'-diaminobencidina). Antes del montaje, los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina.
Se determinó la permeabilidad del dextrano tal como se describe en Arnold et al., 2010 Dis Model Mech 3 (1-2), 57 (2010) con ligeras modificaciones. Brevemente, se infundió un bolo intravenoso de rodamina B 10 mg/ml marcada con dextrano de bajo peso molecular (1 x 104 kDa: D1824, INVITROGEN) en PBS estéril. Quince minutos después, se anestesió a los ratones y se perfundieron los pulmones con OCT, se extrajeron y se congelaron en hielo seco. Se realizó un corte de diez micrómetros y se midió la permeabilidad del dextrano dentro de los nódulos metastásicos (tal como se determina mediante tinción con vimentina) mediante microscopía de fluorescencia. Usando IMAGEJ, se usó un umbral preseleccionado para determinar los niveles de permeabilidad del dextrano. Los resultados se presentan como el porcentaje medio del área de umbral dentro del nódulo metastásico.
ELISA
Se determinaron los niveles de IGBFP2 en medios acondicionados usando un ELISA de IGFBP2 (AAHBLG-1-2, RAYBIOTECH, Norgross, GA).
Inmunotransferencia de tipo Western
Se prepararon lisados celulares de células MDA-MB-231 lisando células en 1 ml de tampón RIPA helado que contenía inhibidores de proteasa (ROCHE, Mannheim, Alemania). Se prepararon medios acondicionados incubando células MDA-MB-231 en medios libres de suero durante 24 horas. Entonces se concentraron los medios veinte veces mediante filtración por centrifugación. Posteriormente se separaron 40 |ig de proteína en un SDS-PAGE al 4­ 12 % y se transfirieron a una membrana de PVDF. Se usó un anticuerpo monoclonal contra MERTK humana (CVO-311, CAVEO THERAPEUTICS, Aurora, CO) para detectar MERTK.
Análisis de supervivencia libre de metástasis
Tras identificar los ocho genes regulados por miR-126 a través de un análisis integrador, se determinó si la expresión de estos genes en agregado se correlaciona con metástasis clínica humana. Se usaron datos de microalineamientos publicados de series de UCSF46, NKI47 y MSKCC13 para obtener valores de expresión a nivel de sonda. Para los genes que estaban representados por múltiples sondas, se usaron sondas que presentaban una intensidad de señal suficiente, así como el mayor coeficiente de variación (en su mayor parte informativo) en un conjunto de datos independiente. Cada cáncer de mama se clasificó como positivo para rasgo distintivo de miR-126 si la suma de puntuaciones Z para los valores de expresión de los 8 genes era mayor que la media de la población. Se generaron curvas de supervivencia libre de metástasis de Kaplan-Meier usando el software GRAPHPAd PRISM 5 (GRAPHPAD Software, Inc., LA Jolla, CA). Se determinó la significación estadística para las diferencias entre curvas de supervivencia de pacientes usando la prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox usando el software GRAPHPAD Prism 5.
Análisis de la densidad de vasos
Se usó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar la significación de la diferencia en la densidad de vasos sanguíneos para tinción tanto de MECA-32 y de lectina usando el software disponible públicamente en physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html.
EJEMPLO 2: Colonización metastásica sistémica suprimida de mIR-126 endógeno
En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para analizar la evolución metastásica en la práctica de pérdida de función de miR-126. Esto permitió comparar acontecimientos metastásicos in vivo entre células de control y con silenciamiento de miR-126 (KD) y revelar la influencia de miR-126 endógeno sobre la colonización metastásica.
Se generó una línea celular de cáncer de mama MDA-231 en la que miR-126 estaba silenciado de manera notable (silenciamiento del 94 %; figura 7) usando el sistema de inhibición de microARN anti sentido de miR-Zip. Se inyectaron miR-126 KD y células KD de control en ratones inmunodeficientes y se evaluaron para determinar la capacidad de colonización metastásica en ensayos de colonización en la vena de la cola. El silenciamiento de miR-126 en células escasamente metastásicas aumentó la colonización metastásica pulmonar en 4,2 veces (P = 0,0073) tal como se evaluó mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia cuantitativa (figura 1a) y aumentó espectacularmente la colonización metastásica en histología macroscópica (figura 1a). La inyección intracardiaca de MDA miR-126 KD y células KD de control reveló adicionalmente que miR-126 endógeno suprime la metástasis sistémica tal como se pone de manifiesto por la colonización potenciada de múltiples órganos tales como el cerebro y el hueso en la práctica de silenciamiento de miR-126 (figura 1b-c; P = 0,0232(b), P = 0,0119(c)).
A continuación, se llevaron a cabo ensayos para examinar hasta qué punto en aumento espectacular en la colonización metastásica observada con la inhibición de miR-126 se debía al efecto de miR-126 sobre el crecimiento tumoral. Para este fin, se inyectaron miR-126 KD y células KD de control en los panículos adiposos mamarios de ratones inmunodeficientes y se monitorizó el volumen tumoral. La inhibición de miR-126 condujo a un aumento modesto (39,4 %) en el volumen tumoral (figura 1d) que fue de un orden de magnitud más pequeño que el efecto de la inhibición de miR-126 sobre la potenciación de la metástasis, lo que indica que el efecto de miR-126 sobre la metástasis no es simplemente el resultado de su efecto sobre la supresión del crecimiento tumoral.
Para entender mejor el papel de este miARN sobre la colonización metastásica, se cuantificaron los números y los tamaños de todas las metástasis a través del análisis de imágenes de pulmones de ratones de control y con miR-126 KD (figura 1e). Esto reveló un aumento sustancial en el número total de nódulos metastásicos en pulmones con miR-126 KD en relación con los pulmones de control (13,6+3,2 frente a 4,9+1,8; P = 0,03). Este aumento se observó para nódulos tanto pequeños como grandes (figura 1e) y reflejó el aumento en el número de metástasis en otros órganos (figura 1c). De manera importante, el aumento en el número de nódulos fue más pronunciado para los tamaños de nódulo más pequeños en relación con los más grandes, lo que concuerda principalmente con un aumento en el inicio de metástasis más que con un aumento en el crecimiento de la metástasis establecida. Sin restringirse a la teoría, si el silenciamiento de miR-126 proporciona una ventaja de inicio de metástasis para las células cuando inicial la metástasis en el nicho metastásico, su inducción en la fase inicial de formación de metástasis reducirá el número de nódulos metastásicos. Para someter esto a prueba, se indujo la expresión de miR-126 en células de cáncer de mama metastásicas (LM2) que mostraban silenciamiento de este miARN usando un sistema tet-on condicionado. De acuerdo con esto, el restablecimiento de la expresión de miR-126 a células LM2 una vez que se han extravasado en el pulmón (día 3) redujo significativamente la colonización metastásica (figura 1f). Por tanto, el restablecimiento de la expresión de miR-126 en esta fase temprana de inicio de metástasis en el nicho redujo significativamente el número de nódulos metastásicos visualizados en el día 49.
Los hallazgos anteriores demostraron que el silenciamiento de miR-126 potencia la eficacia de formación de metástasis que conduce a un mayor número de metástasis. Los hallazgos revelaron por tanto que miR-126 endógeno es un supresor del inicio metastásico y la colonización metastásica.
EJEMPLO 3: miR-126 suprime el reclutamiento endotelial metastásico por células de cáncer de mama
Los hallazgos anteriores sugieren que el silenciamiento de miR-126 puede dar a las células metastásicas y a la metástasis incipiente una ventaja durante la colonización metastásica. Aunque se considerar la base de esta ventaja, se observó que las metástasis con silenciamiento de miR-126 mostraban densidades de vasos superiores en visualización microscópica de cortes tisulares de pulmón con H&E. Para cuantificar esto, se realizó coinmunotinción para vimentina humana, que marca células de cáncer de mama MDA-231, y el marcador endotelial MECA-32, que permitía cuantificar la densidad endotelial dentro de nódulos metastásicos en pulmones de ratones a los que se inyectaron o bien células de cáncer de mama de control o con miR-126 KD. El análisis de imágenes y la cuantificación revelaron que las metástasis derivadas de células miR-126 KD tenían una densidad endotelial significativamente suprior (figura 2a; aumento del 35 %; P= 0,02).
Para determinar si la densidad endotelial potenciada en metástasis de miR-126 KD representa vasos funcionales, se inyectó lectina de unión a azúcar en la circulación de ratones antes de las extracciones de pulmón, y posteriormente se tiñeron para determinar la lectina inyectada. La citoquímica de lectina reveló que la metástasis de silenciamiento de miR-126 aumentó la densidad de vasos sanguíneos funcionales (figura 2b; aumento del 33 %; P = 0,001).
Finalmente, se buscó determinar si miR-126 regula la perfusión hemodinámica a metástasis a través de perfusión intravenosa y posterior visualización de dextrano de bajo peso molecular (1 x 104 kDa). De hecho, la metástasis de miR-126 KD presentó una perfusión significativamente aumentada en relación con la metástasis de control (figura 8; P =0,02).
Por tanto, estos métodos independientes y complementarios revelan que miR-126 suprime la perfusión y la angiogénesis metastásica funcional in vivo. Estos hallazgos están de acuerdo con el silenciamiento de miR-126 da a las metástasis una ventaja selectiva en la progresión angiogénica.
EJEMPLO 4: mir-126 suprime el reclutamiento endotelial en cáncer in vitro
En este ejemplo, se buscó determinar la base celular para el fenotipo de angiogénesis dependiente de miR-126 observado.
Se analizó la capacidad de miR-126 para regular diversas interacciones endoteliales del cáncer tales como adhesión endotelial, proliferación endotelial y formación de tubos en células LM2 metastásicas (derivadas originalmente de la población MdA-231 escasamente metastásica, Minn, A. J. et al., Nature 436 (7050), 518 (2005)) en cocultivo con células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). El restablecimiento de la expresión de miR-126 a células LM2, que muestran silenciamiento de miR-126, no suprimió la adhesión de las células metastásicas a células endoteliales (figura 2c), la proliferación de células endoteliales (figura 2d) o la formación de tubos tal como se evalúa mediante cuantificación automatizada de puntos de ramificación (figura 2e). De acuerdo con esto, la inhibición de miR-126 en células MDA-231 tampoco no potenció estos fenotipos angiogénicos (figuras 9a-c).
Se investigó el papel de miR-126 en la regulación del reclutamiento de células endoteliales a células metastásicas. Células LM2 metastásicas colocadas en el fondo de una cámara de Boyden reclutaron fuertemente HUVEC a través de un inserto Transwell poroso y presentaron una capacidad significativamente potenciada para reclutar endotelios en comparación con su línea parental escasamente metastásica (figura 2f). El reclutamiento endotelial por células metastásicas se inhibió fuertemente (reducción del 47 %) por la sobreexpresión de miR-126 (figura 2g). A la inversa, el silenciamiento de miR-126 en la población MDA-231 parental escasamente metastásica aumentó significativamente el reclutamiento endotelial (aumento del 146%; figura 2g). La línea CN34LM1a, un derivado de pulmón altamente metastásico que se obtuvo previamente a través de selección in vivo de la población maligna primaria CN34 (Tavazoie et al., Nature 451 (7175), 147 (2008)) (una población maligna primaria independiente obtenida del líquido pleural de una paciente con cáncer de mama metastásico Gupta et al., Nature 446 (7137), 765 (2007)), también presentó capacidad de reclutamiento endotelial significativamente potenciada en comparación con su línea parental escasamente metastásica (figura 2h). Ambos experimentos de ganancia de función y pérdida de función revelaron que miR-126 también suprime significativamente el reclutamiento endotelial por la población de CN34 (figura 2i). Los hallazgos revelaron que la capacidad de reclutamiento endotelial potenciada era una característica clave de las poblaciones con cáncer de mama metastásico e identificaron miR-126 endógeno como un regulador principal de este proceso.
A continuación, se buscó determinar si miR-126 endógeno puede regular selectivamente el reclutamiento endotelial a células de cáncer de mama independientemente de su ubicación. Por tanto, se implantaron células de cáncer de mama metastásicas que expresaban una horquilla de control o que sobreexpresaban miR-126 en los panículos adiposos mamarios de ratones. Las células metastásicas, que presentan expresión de miR-126 silenciada, presentaron densidad de vasos superior en la glándula mamaria en relación con las células escasamente metastásicas. El reclutamiento endotelial a células metastásicas en el panículo adiposo mamario se inhibió por la expresión de miR-126 (figura 2j), mientras que el silenciamiento de miR-126 en células escasamente metastásicas aumentó significativamente el reclutamiento endotelial a y el contenido en vasos funcionales de tumores de mama en crecimiento en panículos adiposos mamarios tal como se determina por tinción con meca-32 (figura 2j) y tinción con lectina (figura 10a), respectivamente. Este efecto del reclutamiento fue selectivo para células endoteliales ya que el silenciamiento de miR-126 no aumentó la densidad de leucocitos (figura 10b) o la densidad de macrófagos (figura 16c) en tumores mamarios.
Los hallazgos anteriores revelaron que miR-126 regula selectivamente el reclutamiento endotelial a células de cáncer de mama independientemente de su ubicación anatómica.
EJEMPLO 5: El regulón de mir-126 promueve el reclutamiento endotelial
En este ejemplo, se realizó una investigación sistemática para identificar las dianas moleculares de miR-126 que median el reclutamiento endotelial y la colonización metastásica. Específicamente, se realizó análisis de transcriptomas de células LM2 que sobreexpresan miR-126 y se compararon alteraciones de transcrito global en células MDA-231 escasamente metastásicas y células LM2 altamente metastásicas.
Sin restringirse a la teoría, se lanzó la hipótesis de que, dado el papel de miR-126 en inhibir la metástasis, los mediadores biológicos de miR-126 presentan una expresión aumentada en células metastásicas y de que se suprimirían por este miARN. Se identificó un conjunto de 23 genes ya que se suprimieron tras la sobreexpresión de miR-126 (>1,6 veces; figura 11; tabla 4), y se regularon por incremento (>1,4 veces) en células metastásicas en relación con la línea parental de MDA-231 (figura 11).
De estos genes, se validó que 14 habían cambiado significativamente mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de células MDA-231 control y miR-126KD así como células LM2 control y células que sobreexpresaban miR-126. Para aumentar adicionalmente la confianza de esta lista, se sometió a prueba la expresión de estos genes en los derivados metastásicos de la línea CN34 independiente, y se identificó que 8 genes presentaban una expresión significativamente aumentada en múltiples derivados de CN34 metastásicos en relación con su línea parental (figura 3a).
La contribución de estos 8 genes a la metástasis humana se comprobó determinando si su sobreexpresión en cánceres de mama humanos primarios se correlaciona con la supervivencia libre de metástasis distal. Era significativamente más probable que las pacientes cuyos cánceres de mama primarios presentaban sobreexpresión desarrollaran metástasis distal y experimentaran una supervivencia libre de metástasis más corta que aquellas cuyos cánceres no sobreexpresaban estos genes (figura 3b-d). Esta asociación presentó significación en las cohortes UCSF (n=117; P <0,0165), NKI (n=295; P < 0,0005) y las cohortes combinadas MSK/NKI/UCSF (n=494; P < 0,0004). Por tanto, miR-126 suprimió la expresión de un conjunto de ocho genes que estaban correlacionados positiva y fuertemente con recidiva metastásica humana.
A continuación, se llevaron a cabo ensayos para identificar las dianas directas de miR-126. Para este fin, se clonaron las regiones no traducidas en 3' (3'-UTR) y las secuencias codificantes (CDS) de los ocho genes regulados de miR-126 y se usaron para generar constructos de fusión de luciferasa. Ensayos de indicador de luciferasa con este conjunto completo revelaron que miR-126 regula la expresión de IGFBP2 y MERTK a través de interacciones con sus 3'-UTR y PITPNC1 y SHMT2 a través de interacciones con sus regiones codificantes ya que el silenciamiento de miR-126 endógeno en células MDA-231 potenciaba la expresión de estos genes de fusión de luciferasa (figura 3e y figura 12). La mutación de secuencias complementarias de miR-126 en las 3'-UTR de IGFBP2 y MERTK anularon la regulación mediada por miR-126 de la expresión de luciferasa (figura 3f), mientras que la mutación de las CDS de PIPNC1 y SHMT2 anularon la selección como diana mediada por miARN (figura 3f).
T l 4. R i n n v r miR-12 n l l LM2
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Por tanto, la proteína de unión, proteína de unión a IGF 2, la cinasa receptora MERTK, la proteína de transferencia de fosfatidilinositol PITPNC1 y la enzima hidroximetiltranferasa SHMT2 comprenden un conjunto de dianas directas de miR-126 en cáncer de mama humano.
EJEMPLO 6: IGFBP2, PITPNC1 y MERTK promueven el reclutamiento endotelial y la metástasis
En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para examinar si cualquiera de los genes diana de miR-126 regula el reclutamiento de células endoteliales por células cancerosas. De estos cuatro genes, el silenciamiento de IGFBP2, MERTK o PITPNC1 usando horquillas cortas independientes suprime significativamente la capacidad de las células LM2 metastásicas para reclutar células endoteliales (figura 4a y figura 13). De manera importante, el silenciamiento de estos genes no dio como resultado una disminución significativa en la proliferación celular (figura 14).
Dados los efectos robustos de los genes diana de miR-126 sobre el reclutamiento endotelial, se examinó si los niveles de expresión de estos genes se correlacionan individualmente con la propensión metastásica de cánceres humanos. Se analizaron por tanto los niveles de expresión de cada uno de estos genes a través de qPCR en un conjunto completamente independiente de 96 cánceres de mama humanos para los que estaban disponibles ADNc.
Las pacientes con cánceres de mama en estadio III y estadio IV presentan diseminación metastásica local y metástasis distales, respectivamente, y comprenden colectivamente las que desarrollan recidiva distal a tasas mucho mayores que las pacientes en los estadios I y II. Resulta interesante que los niveles de expresión de IGFBP2 (P < 0,0003), MERTK (P < 0,002) y PITPNC1 (P < 0,004) estaban significativamente aumentados de manera individual en los cánceres primarios de pacientes en los estadios III y IV en relación con pacientes en los estadios I y II (figura 4b). Dado el requisito para reclutamiento endotelial por células metastásicas, así como su selección como diana directa por miR-126, se buscó determinar si se requiere cualquiera de los genes diana de miR-126 para la colonización metastásica.
Se encontró que, de manera importante, el silenciamiento de IGFBP2 usando horquillas cortas independientes suprimió significativamente la colonización al pulmón (sh1 (donde sh es la forma siglada de short hairpin: horquilla corta): 10 veces; sh2: 6,25 veces; figura 4c). Además, el silenciamiento de PITPNC1 y MERTK también inhibió fuertemente la colonización metastásica (PITPNC1sh-i: 7,69 veces; PITPNC1sh2: 4,55 veces, figura 4d; MERTKsh-i: 3,91 veces; MERTK1sh2: 3,08 veces, figura 4e). Las secuencias de ARNhc usadas se enumeran en la tabla 5 a continuación.
Estos hallazgos revelaron que se requieren individualmente cada uno los genes diana directos de miR-126 IGFBP2, PITPNC1 y MERTK para el reclutamiento endotelial y la colonización metastásica y que se correlacionan individualmente en la expresión con la evolución metastásica humana.
Tabla 5. Secuencias de ARNhc
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
EJEMPLO 7: IGFBP2 media el reclutamiento a través de la activación de IGF1/IGF1R de células endoteliales
De las dianas de miR-126, IGFBP2 es un factor secretado y, como tal, dispuesto para mediar la comunicación intercelular entre células de cáncer metastásicas y células endoteliales. Por tanto, se examinó si las células metastásicas secretan niveles aumentados de IGFBP2. Se encontró que, de hecho, los análisis de ELISA revelaron que las células LM2 metastásicas secretan niveles 2,1 veces superiores de este factor que la línea parental MDA-231 escasamente metastásica (figura 5a).
Los miembros de la familia de IGFBP ejercen sus efectos interaccionando con diversos factores de crecimiento de tipo insulina (IGF) y modulan su unión a receptores de IGF (Baxter, R. C., Horm Res 42 (4-5), 140 (1994) y Jones, J. I. et al. Endocr Rev 16 (1), 3 (1995). Para determinar si el reclutamiento endotelial metastásico está mediado a través de IGFBP2 secretada, se inhibió la unión de IGFBP2 a IGF por medio de la incubación con anticuerpo neutralizante contra IGFBP2.
Se encontró que la inhibición mediada por anticuerpos de IGFBP2 en un ensayo de reclutamiento Transwell inhibió significativamente el reclutamiento endotelial celular metastásicos hasta niveles comparables a los obtenidos con la sobreexpresión de miR-126 (figura 5b) y también evitó el reclutamiento dependiente de miR-126 (figura 5b). Por tanto, este efecto fue específico para la ruta de miR-126/IGFBP2, ya que la inhibición del reclutamiento endotelial por el anticuerpo contra IGFBP2 se ocluyó con la sobreexpresión de miR-126 (figura 5b). La inhibición mediada por anticuerpos de IGFBP2 también suprimió el reclutamiento endotelial por el derivado de CNLM1A de la línea maligna CN34 independiente y dio como resultado una reducción estadísticamente significativa en el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126 (figura 5c). Estos hallazgos revelaron que IGFBP2 secretada es un mediador de la señalización intercelular para el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126 por células metastásicas.
Se sabía que IGFBP2 se une tanto a IGF1 como IGF2 en el espacio extracelular y modulan su actividad de señalización (Jones, J. I. et al. Endocr Rev 16 (1), 3 (1995); Arai, T., et al. Endocrinology 137 (11), 4571 (1996); Rajaram, S., et al. Endocr Rev 18 (6), 801 (1997); y Hoflich, A. et al., FEBS Lett 434 (3), 329 (1998)). Para determinar que IGF media el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126, se trataron las células con anticuerpos bloqueantes contra IGF1, IGF2, o con control con inmunoglobulina. La inhibición mediada por anticuerpos de IGF1, pero no de IGF2, redujo significativamente el reclutamiento endotelial que resulta del silenciamiento de miR-126 (figura 5d).
A continuación, se buscó determinar el receptor a través del cual se está mediando el reclutamiento endotelial dependiente de miR-126. La inhibición del receptor de IGF de tipo 1 (IGF1R) mediante incubación con anticuerpos bloqueantes contra IGF1R redujo significativamente el reclutamiento que resulta del silenciamiento de miR-126, mientras que la neutralización de IGF2R no tuvo efecto (figura 5e). Estos hallazgos demostraron que la ruta de miR-126/IGFBP2/IGF1 activa IGF1R en células endoteliales.
Para asegurarse de que el reclutamiento dependiente de miR-126 estaba mediado a través de IGF1R en células endoteliales (en lugar de en células cancerosas) se preincubaron células endoteliales HUVEC o cancerosas con el anticuerpo contra IGF1R antes del ensayo de reclutamiento endotelial. Esto reveló que sólo la preincubación con el anticuerpo contra IGF1R de células endoteliales inhibió el reclutamiento endotelial mediado por miR-126 ya que no hubo efecto sobre el reclutamiento con la preincubación con las células cancerosas (figura 5f).
Los hallazgos anteriores están de acuerdo con el reclutamiento endotelial metastásico que resulta de la secreción de IGFBP2 de gen diana de miR-126, que se une a IGF1 en el espacio extracelular y potencia la activación dependiente de IGF1 del receptor de IGF1 en células endoteliales. La activación de IGF1R potenciada en células endoteliales estimula a su vez la migración endotelial hacia las células de cáncer de mama metastásicas. De acuerdo con este modelo, fue suficiente la proteína IGFBP2 recombinante, de un modo dependiente de la dosis, para promover la quimiotaxia endotelial (figura 5g) y la migración (figura 15) de una manera dependiente de IGF1R.
EJEMPLO 8: MERTK media el reclutamiento a través de GAS6
En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos para investigar los mecanismos por los que los otros genes diana de miR-126 PTTPNC1 y MERTK median el reclutamiento endotelial.
Dada la identificación de IGFBP2 como un factor dependiente de miR-126 secretado que media este fenotipo, se investigó el papel de PITPNC1 o MERTK en la regulación de la secreción de este factor de las células cancerosas. Se encontró que el silenciamiento de PITPNC1 usando horquillas independientes reducía la secreción de IGFBP2 de células de cáncer de mama (figura 6a), de acuerdo con la regulación por PITPNC1 del reclutamiento endotelial que está mediado en parte a través de regulación positiva de la secreción de IGFBP2. Sin embargo, el silenciamiento de MERTK no condujo a secreción de IGFBP2 disminuida, lo que sugiere una ruta independiente de IGFBP2 por la que este gen diana de miR-126 media el reclutamiento.
Para determinar el mecanismo por el que el receptor de MERTK media el reclutamiento, se llevaron a cabo ensayos para someter a prueba el impacto de su ligando soluble GAS6 sobre el reclutamiento endotelial mediado por cáncer. La adición de GAS6 recombinante al sistema de cocultivo, a la concentración fisiológica encontrada en el suero humano (Balogh, I. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 25 (6), 1280 (2005)) redujo potencialmente el reclutamiento dependiente de miR-126 (figura 6b), lo que sugiere que GAS6 actúa como inhibidor del reclutamiento endotelial. El receptor de MERTK existe tanto en formas unidas a membrana como solubles, donde se ha escindido el dominio extracelular y por tanto se cree generalmente que actúa como un receptor señuelo para regular negativamente la activación del receptor de MERTK en células que lo expresan (Sather, S. et al., Blood (3), 1026 (2007). Se detectó MERTK soluble en medios acondicionados de células MDA-MB-231 (figura 16). Sin restringirse a la teoría, MERTK soluble liberada de células cancerosas puede promover el reclutamiento endotelial a través de la unión e inhibición de GAS6. De acuerdo con esto, la adición de la forma soluble recombinante del dominio extracelular de MERTK (MerFc) suprimió la inhibición mediada por GAS6 exógeno así como sérico del reclutamiento endotelial por células cancerosas (figura 6b). De manera importante, ese efecto fue dependiente de miR-126 (figura 6b). Estos hallazgos sugieren que MERTK secretada de células metastásicas actúa como un receptor señuelo para GAS6, reduciendo de ese modo los efectos supresores de GAS6 en el reclutamiento de células endoteliales. A continuación, se enumeran secuencias de aminoácidos de tres isoformas de GAS6.
Isoforma 1
MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGH
LERECVEELCSKEEAKEVFEHDPETDYFYPRYLDCIHKYGSPYTKNSGFATCVQHLPDQC
T PNPCDRKGT QAC QDLMGNFFCLC KAGWG GRLC DKDVNE CSQENGGCLQICHNKPGSFHC
SCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVD
ECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCEDILPCVPFSVAKSVKSLYLGRM
FSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLR
YNGVGRVT S SGPVINHGMWQTISVEE LARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDL FQ PERGLYH LN
LTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFY
PGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEWAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALV
DYHSTKKLKKQLWLAVEHTALALMEIKVCDGQEHWTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVS
AAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAAY
KHSDITAHSCPPVEPAAA
Isoforma 2
MDTCE D IL PCVPFSVAKSVKS LYLGRMFSGT PVIRLRFKRLQ PTRLVAE FDFRTFDPEGI
LLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLRYNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVI
KVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLNLTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNG
EDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEWAHI
RPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLWLAVEHTALALMEIKVCDGQ
EHWTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTS
APVTAFYRGCMT LEVNRRL L D L DEAAYKH S DITAHSCPPVE PAAA
Isoforma 3
MFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQL
RYNGVGRVT S SGPVINHGMWQTISVEE LARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDL FQ PERGLYH L
NLTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSF
YPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEWAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVAL
VDYHSTKKLKKQLWLAVEHTALALMEIKVCDGQEHWTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEV
SAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAA
YKHSDITAHSCPPVEPAAA
Para determinar si las formas recombinantes de IGFBP2 y MERTK, que se expresan por células metastásicas, y GAS6, que está presente en el suero humano, son suficientes para regular la quimiotaxia endotelial, se realizaron ensayos quimiotácticos Transwell para cuantificar la migración quimiotáctica migración de células endoteliales hacia estos factores. GAS6 recombinante a dosis fisiológicas bajas inhibió la quimiotaxia endotelial hacia IGFBP2 recombinante (figura 6c). De manera importante, el ectodominio de MERTK soluble recombinante anuló el efecto supresor de GAS6 sobre la quimiotaxia endotelial (figura 6c). La preincubación de células endoteliales con GAS6 no afectó a la migración endotelial, lo que sugiere que GAS6 inhibe la migración quimiotáctica. Estos hallazgos revelan que IGFBP2 media una señal migratoria y quimiotáctica positiva para células endoteliales a través del receptor de IGF tipo 1 receptor, mientras que el receptor de MERTK soluble antagoniza con una señal quimiotáctica inhibidora mediada por GAS6.
Dados los papeles de IGFPB2, PITPNC1 y MERTK en el reclutamiento endotelial in vitro y la colonización metastásica in vivo, se llevaron a cabo ensayos para examinar si estos genes regulan el reclutamiento endotelial in vivo. Para este fin, se realizó tinción con MECA-32 en pulmones de ratones a los que se inyectaron células de cáncer de mama de control y silenciamiento para cuantificar el reclutamiento endotelial in vivo tal como se mide mediante densidad de vasos metastásicos. La inhibición de IGFPB2, PITPNC1 y MERTK individualmente usando horquillas cortas independientes redujo significativamente la densidad endotelial metastásico (figura 6d; P < 0,0001 y P = 0,002 para shIGFBP2, P = 0,01 y P = 0,02 para shPITPNC1, y P < 0,0001 y P = 0,005 para shMERTK). Adicionalmente, la perfusión de lectina y la citoquímica revelaron también una reducción significativa en el contenido de vasos metastásicos funcionales (figura 17). Por tanto, se requieren individualmente los genes diana de miR-126 IGFBP2, PITPNC1 y MERTK para el reclutamiento endotelial metastásico in vivo.
Los hallazgos anteriores, que comprenden ensayos in vitro así como análisis in vivo tanto de reclutamiento endotelial mediado por células de cáncer como de reclutamiento mediado por proteínas recombinantes, demostraron que IGFBP2 y MERTK expresados en cáncer son necesarios y bastan para mediar el reclutamiento endotelial y transmiten rutas paralelas que emanan de células de cáncer metastásicas (figura 6e).
EJEMPLO 9. Regulón de miARN que media angiogénesis metastásica
Los hallazgos descritos anteriormente revelaron que un miARN expresado en células cancerosas puede regular de manera autónoma no celular el complejo proceso de perfusión vascular y reclutamiento endotelial metastásicos a través de la regulación coordinada de IGFBP2, MERTK y PITPNC 1 (un conjunto novedoso de genes de angiogénesis y metástasis).
Se encontró que la expresión aumentada de estos genes de angiogénesis metastásica dota a células de cáncer de mama altamente metastásicas de capacidad de reclutamiento endotelial potenciada en relación con células escasamente metastásicas. Las células metastásicas que sobreexpresan estos genes pueden establecer más fácilmente los vasos sanguíneos necesarios para la colonización eficaz. Aunque se demostró la necesidad de estos tres genes en el reclutamiento endotelial metastásico, uno de ellos, es decir, IGFBP2 secretada, es un mediador transcelular de este fenotipo.
Adicionalmente, se descubrió la ruta de señalización de IGF1 (modulada por IGFBP2 secretada de células cancerosas y que culmina en la activación de IGF1R en células endoteliales) como mediator del reclutamiento endotelial de células metastásicas y se ha identificado miR-126 en células cancerosas como regulador de esta ruta. Aunque se han notificado los papeles de IGF1 y IGF2 en el crecimiento celular y de organismos (Laviola, L., et al. Curr Pharm Des 13 (7), 663 (2007) y Varela-Nieto, I., et al. Curr Pharm Des 13 (7), 687 (2007).), la expresión ubicua de estos factores de crecimiento y sus receptores en diversos tejidos y sus requisitos para fisiología normal limitan su aplicación terapéutica (Varela-Nieto, I., et al. Curr Pharm Des 13 (7), 687 (2007)).
IGFBP2 es uno de los 16 miembros de la familia de IGFBP; véase Schmid, C., Cell Biol Int 19 (5), 445 (1995); Hwa, V., et al. Endocr Rev 20 (6), 761 (1999); y Firth, S. M. et al. Endocr Rev 23 (6), 824 (2002). La identificación de IGFBP2 como promotor de metástasis, su sobreexpresión en cáncer de mama humano metastásico y el efecto robusto de su inhibición mediada por anticuerpos en el reclutamiento endotelial por células metastásicas proporciona un apoyo específico para la selección como diana terapéutica de la ruta de IGF en la evolución del cáncer de mama la angiogénesis del cáncer.
Aunque se identificó IGFBP2 como regulador positivo positive del reclutamiento endotelial a través de su activación de un regulador positive de este proceso (IGF1), también se descubrió MERTK como promotor de reclutamiento a través de su inhibición de un regulador negativo de quimiotaxia endotelial (GAS6). Por tanto, un solo miARN puede controlar un fenotipo complejo modulando tanto los reguladores positivos como los negativos de un fenómeno.
Posteriormente a su identificación como miARN supresor de metástasis, miR-126, que se expresa en desarrollo en células endoteliales, se seleccionó como diana genéticamente en ratones. Se encontró que la deleción de miR-126 conducía a letalidad embrionaria parcial, pérdida de integridad vascular y hemorragia (Wang, S. et al., Dev Cell 15 (2), 261 (2008).). Por tanto, se encontró que miR-126 expresado de manera era un promotor de la angiogénesis en desarrollo normal en sistemas de ratón y pez cebra (Nicoli, S. et al., Nature 464 (7292), 1196 (2010) y Fish, J. E. et al., Dev Cell 15 (2), 272 (2008).)
En vista de su papel como promotor de angiogénesis, resultó inesperado que miR-126 también suprimía la angiogénesis en, por ejemplo, cáncer de mama, tal como se da a conocer en el presente documento. Resultó inesperado que miR-126 pudiera actuar al menos de dos modos diferentes. Por una parte, actúa de forma específica del tipo celular para suprimir la angiogénesis patológica tal como se da a conocer en esta solicitud. Tal como se da a conocer en esta solicitud, miR-126 suprimía la migración endotelial patológica hacia metástasis. Por otra parte, mientras está en desarrollo, la expresión de miR-126 mantiene la integridad de los vasos. De hecho, se demostró que miR-126 endotelial regula la angiogénesis en desarrollo a través de la selección como diana de Spred-1 y PIK3R2, genes no se regularon significativamente por miR-126 en células de cáncer de mama (Wang, S. et al., Dev Cell 15 (2), 261 (2008) y Fish, J. E. et al., Dev Cell 15 (2), 272 (2008).). Véase la tabla 6. A la inversa, se encontró que la inhibición de miR-126 en células endoteliales no potencia el reclutamiento endotelial por células endoteliales (figura 18) como lo hace en células de cáncer de mama. De acuerdo con esto, la inhibición de miR-126 en células endoteliales no alteró la expresión de PITPNC1, MERTK o IGFBP2, mientras que aumentó la expresión de las dianas de miR-126 endoteliales establecidas, SPRED1 y PIK3R2 (figura 19).
Tabla 6
Figure imgf000042_0001
EJEMPLO 10. Identificación de genes o ARN no codificantes que regulan la colonización de cáncer metastásico de cualquier tejido corporal
Este ejemplo describe dos enfoques para identificar un gen o un ARN no codificante que regula la colonización de cáncer metastásico de un tejido corporal
1. Enfoque de Lenti-miR
Transducción de biblioteca Lenti-miR en células e inyección en animales
En este enfoque se usó la biblioteca Lenti-miR (SYSTEM BIOSCIENCES, n.° de catálogo PMIRHPLVAHT-1). Esta biblioteca consiste en un conjunto de lentivirus que contiene microARN precursores representativos de todo el genoma humano. Se transdujeron poblaciones parenterales de las líneas celulares SW620 y LS174T (2 x 105 células) con la biblioteca a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 para obtener un conjunto heterogéneo de células parentales con células individuales que sobreexpresan diferentes microARN. Cada precursor de microARN estaba representado aproximadamente en 50X tras la transducción. Cuatro días tras la transducción, se apartó la mitad de las células y se extrajo el ADN genómico usando el kit DNeasy de Qiagen. Este fue el conjunto de referencia del ADN genómico antes de la presión selectiva de colonización hepática. La mitad de la población restante se inyectó en los hígados de ratones NOD/SCID. 3-5 semanas tras la inyección, se extrajo el ADN genómico de los tumores que se formaron en los hígados. Se realizaron transducciones e inyecciones en repeticiones para ambas líneas celulares.
Identificación de microARN que modulan la colonización hepática
Se recuperaron precursores de microARN derivados de Lenti-miR de ADN genómico mediante amplificación por PCR en el intervalo linear usando cebadores que contienen el promotor de T7 específicos de biblioteca (cebador directo: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCTGGAGACGCCATCCACGCTG-3'; cebador inverso: 5': GATGTGCGCTCTGCCCACTGAC-3') en el ADN genómico de referencia y el ADN genómico tumoral. Se realizaron cuatro reacciones de PCR usando 400 ng de ADN genómico como molde y se reunieron por muestra para garantizar la representación adecuada de microARN precursores transducidos.
Los amplicones de PCR resultantes fueron un material compuesto de diferentes microARN precursores con secuencias de promotor de T7 y se usaron como moldes para la transcripción in vitro para obtener una biblioteca de precursores biotinilada. La biblioteca biotinilada obtenida de los tumores y el conjunto de referencia se marcaron con Cy3 y Cy5, respectivamente y se hibridaron con un microalineamiento diseñado para detectar las secuencias de microARN (Genosensor). Se realizó un experimento de intercambio de colorante para controlar la diferencia de colorantes.
Se calculó la razón de la abundancia de cada precursor de microARN entre el conjunto de referencia y tras la presión selectiva durante la colonización hepática tras la normalización de la señal de microalineamiento. Los microARN quedaron representados en exceso en la población tumoral en comparación con el conjunto de referencia se consideraron promotores y los microARN que quedaron representados insuficientemente, supresores de la colonización hepática.
2. Enfoque de Lentiplex
Transducción de biblioteca Lentiplex en células e inyección en animales
En este enfoque se usó la biblioteca de ARNhc de genoma completo Lentiplex (SIGMA-ALDRICH, n. de catálogo SHPH01). Esta biblioteca es una biblioteca reunida lentivirus que contiene aproximadamente 150.000 ARNhc que seleccionan como diana el genoma humano completo, seleccionándose como objetivo cada gen por 3-5 ARNhc independientes.
Se transdujeron poblaciones parenterales de las líneas celulares SW620, LS174T y WiDR (2 x 106 células) con la biblioteca a una MOI de 1, dando como resultado un conjunto población heterogénea, expresando las células individuales un único ARNhc. Se tradujo cada ARNhc a una representación de aproximadamente 100X. 48 h tras la transducción; se seleccionaron las células transducidas con puromicina durante 48 h para retirar las células no transducidas. Tras la selección con antibióticos, se dejó que las células restantes se recuperaran durante una semana antes de los experimentos posteriores. Se apartó la mitad de las células seleccionadas y se extrajo el ADN genómico. Este fue el conjunto de referencia de ADN genómico antes de la presión selectiva de la colonización hepática. La mitad de la población restante se inyectó en los hígados de ratones NOD/SCID. 3-5 semanas tras la inyección, se extrajo el a Dn genómico de los tumores que se formaron en los hígados. Se realizaron transducciones e inyecciones en repeticiones para las tres líneas celulares.
Identificación de genes novedosos que modulan la colonización hepática a través del examen de ARNhc reunido de genoma completo
Para recuperar un conjunto complejo de secuencias de biblioteca de ARNhc a partir de ADN genómico, se usó un enfoque de PCR seguido por secuenciación masiva Solexa de amplicones de p Cr . Se realizó amplificación de PCR inicial en 500 ng de ADN genómico usando cebadores (cebador directo: 5-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACT-3'; cebador inverso: 5'-AAAGAGGATCTCTGTCCCTGT-3') específicos para el vector viral, seguido por cebadores con secuencias requeridas para secuenciación masiva Solexa (cebador directo: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTATTCTTGGCTTTATAT ATCTTGTGGAAAGGAC-3'; cebador inverso: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGCTCTTCCGATCTGGATGAATACTGCCATTTGTCTCGAGGTCGA-3') para obtener amplicones que contenían las secuencias de ARNhc. Se realizaron diez reacciones de PCR equivalentes a 5 ug de ADN genómico por cada conjunto de ADN genómico y se reunieron los productos para secuenciación para garantizar la representación adecuada de ARNhc.
Los amplicones reunidos representan un material compuesto de secuencias de ARNhc de genoma completo y se realizó secuenciación masiva para determinar la representación de cada especie de ARNhc en el conjunto de referencia en comparación con el conjunto amplificado de tumores. Se normalizó el recuento para cada especie de ARNhc contra el número total de secuencias obtenidas y se identificaron sus dianas génicas haciéndolas coincidir con una base de datos de Sigma. Las dianas génicas cuyos ARNhc que quedaron representadas en exceso en el conjunto tumoral se consideran supresores de la colonización hepática y viceversa. Para explicar efectos no específicos de silenciamiento de ARNhc, sólo los resultados positivos de dianas génicas identificados por tres o más “resultados positivos” de ARNhc independientes se consideraron posibles supresores o promotores.
EJ
Figure imgf000043_0001
anticuerpo monoclonal que neutraliza la función de IGFBP2 inhibió el reclutamiento
endotelial por las células de cáncer de mama humanas metastásicas.
Este ejemplo demuestra un anticuerpo monoclonal que inhibe el reclutamiento endotelial por células de cáncer de mama metastásicas uniéndose a IGFBP2 e inhibiendo la interacción (unión) de IGF1 a IGFBP2. Mediante el bloque de la unión de IGF1 a IGFBP2, este anticuerpo monoclonal puede inhibir el reclutamiento endotelial por las células de cáncer de mama humanas metastásicas. Los métodos usados para generar anticuerpos neutralizantes frente a IGFBP2 son los conocidos comúnmente en la técnica.
En resumen, se inmunizaron ratones con péptido total IGFBP2 recombinante para generar una respuesta de anticuerpo policlonal. A continuación, se generaron bibliotecas de hibridomas mediante la fusión de células B aisladas de los ratones inmunizados a líneas celulares de mieloma. Entonces se aisló el sobrenadante de estos

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la identificación de un gen o ARN no codificante que regula la colonización por cáncer metastásico de un tejido corporal, que comprende,
a) introducir una o más moléculas de ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante en una población de células cancerosas iniciales para generar una población de células cancerosas modificadas por ingeniería, en donde la población de células cancerosas iniciales se obtiene realizando tandas en serie de trasplante, aislamiento y trasplante repetido de una población de células cancerosas marcadas o no marcadas en un tejido vivo no humano;
b) trasplantar dicha población de células cancerosas modificadas por ingeniería en un tejido del cuerpo no humano;
c) aislar células trasplantadas para obtener una población de células cancerosas aisladas; y
d) evaluar la cantidad de molécula de ARNhc, ARNi, microARN o de ARN no codificante o de gen codificante de proteína en la población de células cancerosas aisladas,
en donde una disminución en la cantidad de dicho ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante en la población de células aisladas con respecto a su cantidad antes del trasplante indica que el gen o genes diana de dicho ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante representan un gen necesario para la colonización metastásica de dicho tejido.
2. Un método para la identificación de un gen o un ARN no codificante que regula la colonización por cáncer metastásico de un tejido corporal, que comprende
a) introducir una o más moléculas de ADN que codifican un gen codificante de proteína en una población de células cancerosas iniciales para generar una población de células cancerosas modificadas por ingeniería, en donde la población de células cancerosas iniciales se obtiene realizando tandas en serie de trasplante, aislamiento y trasplante repetido de una población de células cancerosas marcadas o no marcadas en un tejido vivo no humano;
b) trasplantar dicha población de células cancerosas modificadas por ingeniería en un tejido del cuerpo no humano;
c) aislar células trasplantadas para obtener una población de células cancerosas aisladas; y
d) evaluar la cantidad del gen codificante de proteína en la población de células cancerosas aisladas, en donde un aumento en la cantidad de dicho gen codificante de proteína en la población de células aisladas con respecto a su cantidad antes del trasplante indica que el gen codificante de proteína es necesario para la colonización metastásica de dicho tejido.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la etapa de evaluación se realiza utilizando análisis de microalineamientos, tecnología de secuenciación de ADN, tecnología de secuenciación masiva o análisis de clonación.
4. Un método para la identificación de un gen o un ARN no codificante que regula la colonización por cáncer metastásico de un tejido corporal, que comprende,
a) proporcionar una población de células cancerosas aisladas obtenidas de un sujeto no humano que se ha trasplantado con una población de células cancerosas modificadas por ingeniería, en donde las células cancerosas modificadas por ingeniería se han producido introduciendo una o más moléculas de ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante en una población de células cancerosas iniciales, en donde la población de células cancerosas iniciales se obtiene realizando tandas en serie de trasplante, aislamiento y trasplante repetido de una población de células cancerosas marcadas o no marcadas en un tejido vivo no humano;
b) evaluar la cantidad de molécula de ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante o de gen codificante de proteína en la población de células cancerosas aisladas,
en donde una disminución en la cantidad de dicho ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificante en la población de células aisladas con respecto a su cantidad antes del trasplante indica que el gen o genes diana de dicho ARNhc, ARNi, microARN o ARN no codificantes representan un gen necesario para la colonización metastásica de dicho tejido.
5. Un método para la identificación de un gen o un ARN no codificante que regula la colonización por cáncer metastásico de un tejido corporal, que comprende
a) proporcionar una población de células cancerosas aisladas obtenidas de un sujeto no humano que se ha trasplantado con una población de células cancerosas modificadas por ingeniería, en donde las células cancerosas modificadas por ingeniería se han producido introduciendo una o más moléculas de ADN que codifican un gen codificante de proteína en una población de células cancerosas iniciales para generar una población de células cancerosas modificadas por ingeniería, en donde la población de células cancerosas iniciales se obtiene realizando tandas en serie de trasplante, aislamiento y trasplante repetido de una población de células cancerosas marcadas o no marcadas en un tejido vivo no humano;
b) evaluar la cantidad del gen codificante de proteína en la población de células cancerosas aisladas, en donde un aumento en la cantidad de dicho gen codificante de proteína en la población de células aisladas con respecto a su cantidad antes del trasplante indica que el gen codificante de proteína es necesario para la colonización metastásica de dicho tejido.
6. El método de la reivindicación 4 o 5, en donde la etapa de evaluación se realiza utilizando análisis de microalineamientos, tecnología de secuenciación de ADN, tecnología de secuenciación masiva o análisis de clonación
ES17184170T 2011-02-11 2012-02-10 Método para la identificación de ácidos nucleicos que regulan la metastatización Active ES2763087T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161441738P 2011-02-11 2011-02-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2763087T3 true ES2763087T3 (es) 2020-05-27

Family

ID=46639221

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17184170T Active ES2763087T3 (es) 2011-02-11 2012-02-10 Método para la identificación de ácidos nucleicos que regulan la metastatización
ES12745124.3T Active ES2645366T3 (es) 2011-02-11 2012-02-10 Tratamiento de trastornos de la angiogénesis

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12745124.3T Active ES2645366T3 (es) 2011-02-11 2012-02-10 Tratamiento de trastornos de la angiogénesis

Country Status (8)

Country Link
US (6) US8980261B2 (es)
EP (3) EP3301176B1 (es)
JP (4) JP6178241B2 (es)
CA (2) CA2841404C (es)
DK (1) DK2673363T3 (es)
ES (2) ES2763087T3 (es)
HK (1) HK1245330A1 (es)
WO (1) WO2012109567A2 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3301176B1 (en) * 2011-02-11 2019-09-25 The Rockefeller University Method for identifying nucleic acids regulating metastasation
TWI465241B (zh) * 2012-12-19 2014-12-21 Ind Tech Res Inst 圓柏（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）萃取物或木酚素（ｌｉｇｎａｎ）用於製造抑制血管新生之藥物的用途
HUP1300509A2 (hu) * 2013-08-30 2015-03-30 Gabor Firneisz CXCL12 (Chemokine (C-X-C motif) Ligand 12) és IGFBP2 (Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 2) gátlók cukorbetegséggel összefüggõ hasnyálmirigyrák kezelésénél történõ alkalmazásra
ES2688737A1 (es) * 2017-05-04 2018-11-06 Universidad Del País Vasco / Euskal Herriko Unibertsitatea Método para diagnosticar placa ateroesclerótica inestable
EP3823982A4 (en) * 2018-07-17 2022-04-13 Helixmith Co., Ltd TREATMENT OF NEUROPATHY WITH IGF-1-ENCODING DNA CONSTRUCTS AND HGF-ENCODING DNA CONSTRUCTS
CN111808938A (zh) * 2019-04-11 2020-10-23 南方医科大学南方医院 Atp6v0d2用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1997018454A2 (en) * 1995-11-16 1997-05-22 Baylor College Of Medicine Method for identifying metastatic sequences
US6545139B1 (en) * 1998-03-13 2003-04-08 Baylor College Of Medicine DNA sequence encoding the p99 gene and kits for the detection of neoplasia
US8257750B2 (en) 1999-04-30 2012-09-04 Kibow Biotech, Inc. Calcium carbonate compositions for preventing or treating hyperphosphatemia
WO2000069454A1 (en) 1999-05-17 2000-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Suppression of endogenous igfbp-2 to inhibit cancer
CA2421087C (en) * 2000-09-14 2012-03-27 Martin Gleave Antisense insulin-like growth factor binding protein (igfbp)-2 oligodeoxynucleotides for prostate and other endocrine tumor therapy
US20040018973A1 (en) * 2002-01-25 2004-01-29 University Of Pittsburgh Nuclear matrix protein alterations associated with colon cancer and colon metastasis to the liver, and uses thereof
WO2004018676A2 (en) 2002-08-21 2004-03-04 The University Of British Columbia Rnai probes targeting cancer-related proteins
JP4663634B2 (ja) 2003-07-10 2011-04-06 財団法人実験動物中央研究所 腫瘍転移の分析のための動物モデル
WO2005059109A2 (en) * 2003-12-15 2005-06-30 The Regents Of The University Of California Molecular signature of the pten tumor suppressor
FR2865736B1 (fr) 2004-02-02 2006-07-14 Synt Em Inhibiteurs de l'angiogenese, compositions les contenant et leur utilisation pour le traitement des maladies liees a une deregulation de l'angiogenese
WO2006074292A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Target validation assay
AU2006228989B2 (en) 2005-03-30 2012-06-14 Murdoch Childrens Research Institute Methods and agents for modulating cellular activity
WO2007056604A2 (en) * 2005-11-09 2007-05-18 Irm Llc Methods and compositions for modulating cell motility and inhibiting tumor metastasis
US9060961B2 (en) 2006-11-09 2015-06-23 University Of Washington Molecules and methods for treatment and detection of cancer
KR101502267B1 (ko) 2007-11-09 2015-03-18 페레그린 파마수티컬즈, 인크 항-ｖｅｇｆ 항체 조성물 및 방법
WO2009082744A2 (en) 2007-12-22 2009-07-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prognosis and interference-mediated treatment of breast cancer
US9179654B2 (en) 2008-04-07 2015-11-10 Cornell Research Foundation, Inc. Inhibition of angiogenesis
JP5721230B2 (ja) 2008-04-29 2015-05-20 ファーネクストＰｈａｒｎｅｘｔ 血管新生の調節を通したアルツハイマー病および関連障害の処置のための新たな治療アプローチ
WO2009154790A2 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 University Of Massachusetts Novel metastasis suppresor genes and uses thereof
WO2010064702A1 (ja) 2008-12-05 2010-06-10 国立大学法人 東京大学 癌の予後を予測するためのバイオマーカー
WO2011011061A2 (en) 2009-07-21 2011-01-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of regulating angiogenesis and lymphangiogenesis, and a pharmaceutical composition for effecting anti-angiogenic and anti-lymphangiogenic cancer therapy
EP3301176B1 (en) 2011-02-11 2019-09-25 The Rockefeller University Method for identifying nucleic acids regulating metastasation

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014507435A (ja) 2014-03-27
WO2012109567A2 (en) 2012-08-16
EP3604534A1 (en) 2020-02-05
EP2673363A4 (en) 2015-04-15
US10894989B2 (en) 2021-01-19
JP2022088607A (ja) 2022-06-14
JP2020054375A (ja) 2020-04-09
EP2673363B1 (en) 2017-08-23
JP6178241B2 (ja) 2017-08-09
US20170362664A1 (en) 2017-12-21
CA2841404C (en) 2022-04-26
JP7536049B2 (ja) 2024-08-19
HK1245330A1 (zh) 2018-08-24
US10301684B2 (en) 2019-05-28
JP6633029B2 (ja) 2020-01-22
CA3146962A1 (en) 2012-08-16
JP7053559B2 (ja) 2022-04-12
US9493841B2 (en) 2016-11-15
US12060619B2 (en) 2024-08-13
DK2673363T3 (da) 2017-11-13
ES2645366T3 (es) 2017-12-05
WO2012109567A3 (en) 2012-11-01
US20130330333A1 (en) 2013-12-12
US20150292031A1 (en) 2015-10-15
EP2673363A2 (en) 2013-12-18
US8980261B2 (en) 2015-03-17
EP3301176B1 (en) 2019-09-25
JP2018007672A (ja) 2018-01-18
US20210139997A1 (en) 2021-05-13
EP3301176A1 (en) 2018-04-04
CA2841404A1 (en) 2012-08-16
US20130323241A1 (en) 2013-12-05
US20190352722A1 (en) 2019-11-21
US8715660B2 (en) 2014-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7536049B2 (ja) 血管新生障害の処置
CN110037999B (zh) 治疗和诊断黑素瘤
ES2647359T3 (es) Tratamiento de afecciones vasculoproliferativas
JP2019512489A (ja) マイクロｒｎａおよびその使用方法
JP2014533681A (ja) 神経膠腫を治療するための組成物および方法
CN111655724A (zh) Smc介导的疾病的治疗
US20240279667A1 (en) Compositions and methods of treating diseases associated with bile acid transporter
WO2012074842A2 (en) Compositions and methods for treating neoplasia
US20200319166A1 (en) Compositions and methods for detecting and treating pathological fibroblast cells
JP7033072B2 (ja) Ｓｍｏｃ２を標的化する線維症のための治療方法
JPWO2020138503A1 (ja) 神経膠腫の治療および予防剤、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカー、脳腫瘍の悪性度および予後の判定方法並びに腫瘍増殖を抑制する抗体
WO2014095916A1 (en) Ninjurin-1 as therapeutic target for brain tumor
RATIH STUDY OF MAMMAGLOBIN 1 AS A REGULATOR IN TRASTUZUMAB RESISTANT CELLS’AGGRESSIVENESS
ES2710174T3 (es) Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la metástasis ósea
JP2018061481A (ja) 癌の予後マーカー及びその使用