ES2647359T3 - Tratamiento de afecciones vasculoproliferativas - Google Patents

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Abstract

Un antagonista de alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para su uso en el tratamiento o la prevención de la vascularización patogénica, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une a Lrg1.

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento de afecciones vasculoproliferativas
Campo de la invención 5
La invención se establece en el campo de la fisiología molecular y se refiere al uso de antagonistas de alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina (Lrg1), en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une a Lrg1, para su uso en el tratamiento o la prevención de la vascularización patogénica, particularmente en el ojo y en el tratamiento de tumores que exhiben proliferación vascular. 10
Antecedentes de la invención
El remodelado aberrante de la vasculatura de la retina es una característica prominente de las afecciones que ponen en riesgo la visión, tales como retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, retinopatía de prematuros, 15 degeneración macular relacionada con la edad y telangiectasia macular. Estos cambios vasculares se manifiestan tanto como un nuevo crecimiento capilar de los vasos pre-existentes de la retina (angiogénesis) como el desarrollo de las malformaciones vasculares de los vasos existentes (p. ej., telangiectasia). Este remodelado vascular patogénico en estas enfermedades es un factor importante que contribuye a la pérdida de la visión.
20
Una patología y disfunción vascular similares también acompañan el crecimiento del tumor, en el que la angiogénesis permite el agrandamiento y el crecimiento de tumores sólidos.
El recurso sustancial ha sido dirigido hacia la comprensión de los mecanismos que estimulan estas respuestas vasculares (referido como angiogénesis, neoangiogénesis, proliferación vascular, remodelado vascular, patología 25 vascular). De las diversas moléculas identificadas que desempeñan un papel importante en el proceso, los factores de crecimiento endotelial vascular (FCEV) y sus receptores son vistos como componentes críticos. La orientación selectiva terapéutica de la vía FCEV en la angiogénesis ocular utilizando el agente contra el cáncer Avastin (o el estrechamente relacionado Lucentis) ha dado lugar a un mejor resultado clínico, al menos a corto plazo, de una serie de afecciones que ponen en riesgo la visión. No obstante, es motivo de preocupación el uso a largo plazo de 30 las estrategias anti-FCEV para el tratamiento de los problemas vasculares de la retina puesto que FCEV tiene actividades neuroprotectoras y funciones de gestión, tales como el mantenimiento de la fenestración coroidea. Además, aunque se considera que FCEV es el principal factor pro-angiogénico en la neoangiogénesis, el proceso requiere una intercomunicación coordinada entre muchos factores, y la base biológica para otros cambios vasculares, tales como la formación de vasos telangiectásicos dilatados y tortuosos, es desconocida. 35
Es, pues, necesario identificar dianas terapéuticas alternativas y fármacos innovadores que, de forma aislada o en combinación con las terapias existentes, puedan ser más eficaces y posean menos efectos secundarios para el tratamiento de afecciones en las que el crecimiento incontrolado de los vasos sanguíneos y/o el remodelado contribuyen a la enfermedad. 40
El documento WO 2007/010912 desvela anticuerpos que se unen a ALK-1 que funcionan para abrogar una vía de señalización ALK-1/TGF-beta/Smad-1 e inhibir la angiogénesis.
Sumario de la invención 45
Se ha identificado una alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina (identificadores del gen Lrg1: HGNC: 29480; Entrez Gene: 116844; Ensembl: ENSG00000171236; UniProtKB: P02750) como una diana susceptible de convertirse en fármaco para la modulación del remodelado vascular patogénico.
50
Lrg1 se identificó en 1977 (Haupt & Baudner, 1977) y su estructura primaria se determinó en 1985 (Takahashi et al, 1985). Lrg1 es evolutivamente muy conservada entre ratones y seres humanos, anticuerpos policlonales frente a Lrg1 humana están disponibles comercialmente y existen informes de aumentos concomitantes en el nivel del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFβ1), receptor TGF II (TGFβRII) y Lrg1 en ciertas enfermedades (Sun et al, 1995; Li et al, 1997). Otros grupos han identificado Lrg1 como un biomarcador de ciertas enfermedades 55 (documentos US 2005/0064516; WO 2008/092214) y como un ligando para el citocromo c (documento US 2007/0184503). La disfunción de la señalización de TGFβ en las células endoteliales conduce a la enfermedad telangiectasia hemorrágica hereditaria (THH).
En este grupo de enfermedades, que se caracterizan por anomalías vasculares incluyendo telangiectasias, 60 mutaciones en el receptor accesorio de endoglina en el endotelio del TGFβ y el co-receptor ALK1 del TβRI conducen a THH1 (McAllister et al. 1994) y THH2 (Johnson et al. 1995), respectivamente. Se ha hallado también que TGFβ se aumenta en la retina de los pacientes con retinopatía diabética (Spirin et al., 1999), en la que el remodelado vascular es frecuente. Se ha hallado también que la expresión de Lrg1 se aumenta en el plasma de ciertos pacientes con tumores, lo que sugiere que puede servir como un posible biomarcador tumoral (Heo et al, 2007; Ferrero et al, 2009; 65 Kakisaka et al, 2007). Sin embargo, se sabe muy poco acerca de la biología de Lrg1.
Ya se ha identificado Lrg1 como una diana susceptible de convertirse en fármaco para la modulación del remodelado vascular patogénico, particularmente en el ojo y en tumores que exhiben proliferación vascular.
Al utilizar modelos de ratón de la enfermedad de la retina que implica cambios vasculares, se determinó en primer lugar que, entre otros genes, Lrg1 está regulada positivamente en los vasos de estas retinas enfermas. El aumento 5 de la expresión de Lrg1 en la retina de estos modelos de ratón fue entonces validado por PCR cuantitativa e inmunoelectrotransferencia y su distribución retiniana se confirmó como vascular por hibridación e inmunohistoquímica in situ. Estos modelos son modelos convencionales de angiogénesis y son aplicables a la angiogénesis en sitios distintos del ojo.
10
Seguidamente se investigó la conexión entre Lrg1 y la vía de señalización de TGFβ.
En las células endoteliales, la señalización de TGFβ puede ocurrir a través del receptor II de TGFβ que se asocia o bien con quinasa 5 tipo receptor de activina (ALK5) del receptor tipo I de TGFβ que se expresa de forma ubicua o a ALK1 específico de células endoteliales con la respuesta celular dependiendo de la vía que predomina. En el caso 15 de ALK5, se aumenta bajo ciertas condiciones la deposición de ECM y la quiescencia celular mientras que con ALK1 se produce una activación de células endoteliales que se manifiestan como un aumento de la migración y la proliferación. Esta señalización diferencial es controlada, en parte, por la concentración/biodisponibilidad del TGFβ y por los miembros de una familia de proteínas efectoras aguas abajo llamadas Smads, conforme lo cual Smad 2 y 3 son activadas por ALK5 y Smad 1, 5 y 8 por ALK1. 20
La inmunoprecipitación mostró que Lrg1 se asocia tanto con TGFβRII como con ALK1, lo que sugiere que Lrg1 tiene un papel en relación con estas dos moléculas como parte del complejo de señalización del TGFβ.
Se plantea la hipótesis, por tanto, de que Lrg1 actúa como un modulador de la señalización del TGFβ, causando el 25 ajuste entre las cascadas de señalización activadas por ALK1 y ALK5. En apoyo de esto, la atenuación génica de Lrg1 en las células endoteliales con ARNip bloquea el aumento de la proliferación celular mediada por TGFβ y la reducción de la fosforilación de Smad5 mientras que expresión excesiva de Lrg1 conduce a una mayor proliferación, a una regulación negativa de la expresión de Smad2 y a un aumento de la fosforilación de Smad5. Por lo tanto, estas observaciones revelan una forma en que Lrg1 puede regular la angiogénesis. Asimismo, en un ensayo de 30 angiogénesis en Matrigel para investigar el efecto de Lrg1 sobre la formación de "vasos", el grado de formación vascular, medido por la formación de vasos, la formación de tubos y la formación de cordones se incrementaron significativamente cuando se añadió un medio acondicionado de células que sobreexpresaban Lrg1 y el aumento de la vascularización se correlacionó con la expresión de la proteína Lrg1 en el medio.
35
Estos datos son acordes con una disminución de la señalización por la vía compleja del receptor TGFβRII/ALK5 y por ende con un desplazamiento hacia la activación de la vía de señalización del TGFβRII/ALK1 vasculopatogénica.
Esto sugiere que el bloqueo de Lrg1 dentro del complejo de señalización de TGFβ tiene el potencial para alejar el TGFβ de la vascularización patogénica. Para someter a ensayo esta proposición, se determinó si se podría bloquear 40 la fosforilación de Smad5 endotelial inducida por TGFβ, ya sea con un anticuerpo anti-Lrg1 o por secuencias peptídicas derivadas de Lrg1 que cabría esperar que compitiesen con Lrg1 para unirse a ALK1. El anticuerpo anti-Lrg1 causó una reducción en la fosforilación, mientras que uno de los péptidos exhibió una reducción particularmente grande en la fosforilación.
45
Por lo tanto, la fosforilación de Smad5 puede inhibirse mediante el bloqueo de Lrg1 y, debido a que Smad5 está asociada con la cascada de señalización activada por ALK1 vasculopatogénica, esto demuestra que el bloqueo de Lrg1 tiene el potencial para bloquear esa cascada con respecto a la cascada alternativa activada por ALK5 no patogénica.
50
En conjunto, estos datos sugieren que: (a) Lrg1 interactúa tanto con TGFβRII como con ALK1, favoreciendo directamente o a través de uno o más productos intermedios la interacción entre TGFβRII y ALK1 en contraposición a ALK5, de modo que (b) el bloqueo de Lrg1 dirigirá la actividad de TGFβ lejos de la cascada de señalización activada por ALK1 vasculopatogénica y en la cascada activada por ALK5 no patogénica, con el resultado de que (c) Lrg1 es una diana farmacéutica válida para el tratamiento de la vascularización patogénica en el ojo y otros lugares. 55 Los tratamientos con diversos agentes de bloqueo de Lrg1, especialmente los fragmentos peptídicos de Lrg1, anticuerpos monoclonales frente a moléculas de Lrg1 y ARNip, se pueden prever por ende, para los trastornos oculares y otros trastornos que implican la vascularización de tejido patógeno. Sin quedar ligado a teoría alguna, la Figura 16 ilustra el papel de Lrg1 que es sugerido por nuestros datos.
60
Adicionalmente, nuestros datos sugieren que, al contrario que con FCEV, Lrg1 puede estar implicada solo en la vascularización patogénica en el ojo y no en el desarrollo normal de la vascularización u homeostasis vascular. Esto hace que sea una diana potencialmente superior a FCEV en términos de evitar la interferencia con los procesos que no son deseables alterar. Un aliciente adicional de Lrg1 como diana es que es extracelular y por ende se accede con más facilidad a través de vías terapéuticas sistémicas. 65
También se llevaron a cabo experimentos para investigar el papel de Lrg1 ex vivo e in vivo. Nuestros experimentos muestran que la formación de vasos angiogénicos se reduce en anillos aórticos de ratones nuligénicos Lrg1 en comparación con los anillos aórticos de los ratones de control. Además, se halla que la neovascularización coroidea (NVC) tras la lesión retiniana y la neovascularización retiniana seguida de la retinopatía inducida por oxígeno (RIO) se redujo en los ratones nuligénicos Lrg1 en comparación con los ratones de control. 5
Como prueba de la función de Lrg1 en patología humana, nuestros datos muestran que la expresión de Lrg1 y TGFβ se incrementa en pacientes humanos que padecen retinopatía diabética proliferativa, apoyando los datos in vivo obtenidos de ratones.
10
También se demostró que los anticuerpos contra Lrg1 son capaces de inhibir la formación de tubos por las células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC) en ensayos de angiogénesis en Matrigel. Estos datos sugieren que los anticuerpos contra Lrg1 serán útiles en el tratamiento o la prevención de afecciones vasculoproliferativas, en particular las del ojo y los tumores que exhiben proliferación vascular.
15
Por consiguiente, la invención proporciona:
Un antagonista de alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para su uso en el tratamiento o la prevención de la vascularización patogénica, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une a Lrg1.
20
También se desvela:
Un método de identificación de antagonistas de Lrg1 que comprende: proporcionar un antagonista candidato, y determinar de manera positiva o negativa si dicho antagonista candidato bloquea la función o la actividad de Lrg1; en el que dicho antagonista candidato se identifica como un antagonista de Lrg1 si se observa un bloqueo 25 de la función o la actividad de Lrg1.
También se desvela:
Un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un epítopo dentro de los aminoácidos LI-24 del 30 Apéndice 2 o L94-117 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) y bloquea la actividad de Lrg1.
También se desvela: 35
Un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un epítopo dentro de los aminoácidos L1-24 del Apéndice 2 o L94-117 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) y bloquea la interacción entre ALK1, TGFβRII y/o TGF y Lrg1. 40
También se desvela:
Un método de producción de un anticuerpo tal, que comprende: inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un epítopo dentro de la secuencia de L1-24 del Apéndice 2 o L94-117 del Apéndice 45 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) de Lrg1; y obtener una preparación de anticuerpos de dicho mamífero y derivar del mismo anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente dicho epítopo.
También se desvela: 50
Un método para determinar qué sitios dentro de Lrg1 pueden ser orientados selectivamente para bloquear la función o la actividad de Lrg1, que comprende proporcionar fragmentos peptídicos de la proteína Lrg1; y determinar en caso afirmativo o negativo si cada uno de dichos fragmentos peptídicos bloquea la función o la actividad de Lrg1. 55
La invención también proporciona:
Uso de un antagonista de Lrg1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la vascularización patogénica, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une a Lrg1. 60
También se desvela:
Un método de tratamiento de una afección vasculoproliferativa que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un antagonista de Lrg1. 65
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Imágenes de bajo y alto poder del remodelado vascular de la retina en la rata RCS (20 semanas), ratón VLDLR-/- (16 semanas), ratón de cola enroscada-J (13 semanas) y ratón RD1 (16 semanas). Los vasos en los montajes planos de la retina se tiñeron con anticuerpos anti-colágeno IV y anti-claudin-5 para decorar la lámina 5 basal vascular y las uniones celulares endoteliales, respectivamente.
Figura 2. A. Representación esquemática de la proteína Lrg1 y sus sitios de glicosilación propuestos. B. Estructura de la proteína de Lrg1 predicha por ROBETTA (Universidad de Washington, EE.UU.).
10
Figura 3. A. Análisis por RT PCR cuantitativa de la expresión de Lrg1 en toda la retina del ratón de los ratones de control C57B16 (BL6), ratones nuligénicos con receptor VLDL (VLDLR-/-), ratones de cola enroscada-J (CE) y ratones con distrofia de la retina 1 (DR1). B. Membrana Western de la expresión de proteínas de Lrg1 (parte superior) y semi-cuantificación (parte inferior) del conjunto de la retina. C. Hibridación in situ de la retina normal que muestra la expresión génica de Lrg1. D. Tinción inmunohistoquímica de Lrg1 en montajes planos de la retina 15 (parte superior) y secciones de la retina (parte inferior) que muestra un patrón de expresión vascular.
Figura 4. A. Co-inmunoprecipitación de lisados de células endoteliales GPNT de Lrg1 con TGFβRII y ALK1. B. Lrg1 etiquetada con HA recombinante se asocia tanto con TGFβ como con TGFβRII. C. Co-localización de la expresión de Lrg1 y TGFβRII en células endoteliales GPNT. D. Ensayo de proliferación de células endoteliales 20 que demuestra que la atenuación génica de Lrg1 atenúa la proliferación inducida por TGFβ y la disminución de la fosforilación de Smad1/5 (*p <0,05). E. Ensayo de proliferación de células endoteliales que demuestra que la expresión excesiva de Lrg1 aumenta la proliferación inducida por TGFβ y aumenta la fosforilación de Smad1/5 (*p <0,05).
25
Figura 5. El péptido que bloquea Lrg1 derivado del extremo C-terminal inhibe la fosforilación de Smad5 inducida por Lrg1/TGFβ1 en células endoteliales GPNT (n = 3 para cada afección, p <0,0001). Los dos carriles de la derecha son solo el péptido C-terminal, y los tres péptidos L1-24 del Apéndice 2 o L94-117 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) en combinación. 30
Figura 6. A. Membrana Western de la atenuación génica de Lrg1 en células endoteliales GPNT con ARNip y expresión excesiva de Lrg1 en células GPNT. B. La atenuación génica de Lrg1 reduce la proliferación de células endoteliales mediada por TGFβ1 (*p <0,0001) y la expresión excesiva de Lrg1 potencia la proliferación de células endoteliales mediada por TGFβ1 (*p <0,0005) (n = 3 para cada afección). 35
Figura 7. Efecto de Lrg1 en la formación in vitro de "vasos" en HUVEC. A. Se añadió un medio no tratado o un medio de células endoteliales (CE) de control o de CE que sobreexpresan Lrg1 a un ensayo de angiogénesis en Matrigel. El medio acondicionado de Lrg1 potenció la formación de "cordones" en HUVEC. B. Membrana Western de Lrg1 en un medio sin acondicionar, medio acondicionado con células endoteliales GPNT (7 días) y 40 medio acondicionado a partir de células GPNT que sobreexpresan Lrg1. C. Cuantificación de la complejidad de la formación de cordones endoteliales en Matrigel (número de círculos vasculares cerrados y área vascular total) tras diferentes tratamientos (n = 3 para cada afección). El medio acondicionado con Lrg1 a partir de células que sobreexpresan Lrg1 indujo el mayor plexo vascular angiogénico medido por el número de círculos vasculares cerrados o área vascular total (p <0,0001). 45
Figura 8. Efecto del anticuerpo de Lrg1 (un anticuerpo policlonal disponible comercialmente frente al dominio N-terminal de Lrg1) y péptidos de Lrg1 en la fosforilación de Smad5 endotelial tras el tratamiento con TGFβ y Lrg1.
Figura 9. Anillos aórticos de ratones nuligénicos Lrg1 reducen la formación de vasos angiogénicos en 50 comparación con los anillos aórticos de los ratones de tipo silvestre. Imágenes representativas de la angiogénesis de anillo aórtico (teñidas de verde con isolectina B4) demuestran una reducción en la formación de vasos angiogénicos en aortas de ratones nuligénicos Lrg1 y su cuantificación. n = 30 anillos aórticos para cada grupo (**p <0,01).
55
Figura 10. Los genes regulados positivamente en modelos de ratón de cola enroscada-J, RD1 y VLDLR-/- de enfermedad de la retina.
Figura 11. A. Angiogramas con fluoresceína (AF) de neovascularización coroidea inducida por quemaduras por láser en la retina de los ratones TS y nuligénicos Lrg1. La cuantificación de AF temprana (B) y tardía (C) muestra 60 el tamaño de crecimiento angiogénico y fugas registradas respectivamente a los 7 días después de la lesión. n = 10 (**p <0,01).
Figura 12. (Izquierda) La estirpe de células endoteliales del cerebro GPNT expresa los componentes requeridos para estudiar el efecto de Lrg1 en la señalización de TGFβ. P = sedimento celular; M = medio celular. (Derecha) 65 TGFβ induce la expresión génica de Lrg1 en células GPNT.
Figura 13. Imágenes representativas de la vasculatura retiniana de ratón (teñidas de color rojo con isolectina B4) en P17 seguido por retinopatía inducida por oxígeno (RIO) que demuestra el aumento de región avascular y la disminución de microhemangiomas iridianos neovasculares en ratones nuligénicos Lrg1. Cuantificación de (B) región avascular y (C) microhemangiomas iridianos neovasculares en ratones silvestres y nuligénicos Lrg1 (n = 6 y 9 respectivamente). La región avascular se incrementa en el ratón nuligénico Lrg1 (*p <0,05), con un menor 5 número de microhemangiomas iridianos neovasculares visibles en el ratón nuligénico en comparación con el tipo silvestre (**p0,01).
Figura 14. La formación de tubos de células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC) en Matrigel in vitro se redujo tras la adición de un anticuerpo policlonal anti-humano Lrg1 neutralizante en 10 comparación con IgG irrelevante. La formación de tubos se midió con respecto a A. el número de puntos de ramificación, número de tubos y B. longitud total del tubo (n = 3, *p <0,05, **p <0,01).
Figura 15. A. Sección transversal a través de una retina humana teñida para Lrg1. B. Membrana Western y cuantificación de Lrg1 (n = 4) en muestras vítreas de pacientes no diabéticos y pacientes con retinopatía 15 diabética proliferativa (RDP). C. Membrana Western y cuantificación de TGFβ1 en muestras vítreas de pacientes no diabéticos y pacientes con RDP (**p <0,01).
Figura 16. Esquemática de una hipótesis de trabajo. A. En condiciones normales, la señalización de TGFβ1 que se dirige predominantemente hacia la vía TGFβRII/ALK5/Smad2/3 y Lrg1 es secuestrada en la lámina basal. B. 20 Bajo condiciones patógenas se aumentó la expresión de Lrg1 que da lugar a una redirección de la señalización de TGFβ1 hacia la vía TGFβRII/Smad1/5/8 que contribuye al remodelado vascular.
Descripción detallada de la invención
25
Bloqueo de Lrg1
Los antagonistas de la invención bloquean la función de Lrg1 mediante la unión a Lrg1. El bloqueo de Lrg1 abarca cualquier reducción en su actividad o función que resulta en la reducción de efectos vasculoproliferativos, incluyendo proliferación de células endoteliales, separación de pericitos, muerte celular endotelial, remodelado vascular, 30 angiogénesis, telangiectasia, fuga vascular.
Por ejemplo, el bloqueo de Lrg1 puede efectuarse mediante el bloqueo de su interacción con ALK1, TGFβRII y/o TGFβ, en el que nuestros datos sugieren que favorece la interacción.
35
TGFβRII y ALK5 en lugar de ALK1, alejan así la actividad de TGFβ en la cascada de señalización activada por ALK5 menos patógena y lejos de la cascada asociada a ALK1 vasculopatogénica. El bloqueo de Lrg1 también puede resultar en la reducción de la biodisponibilidad de TGFβ.
El bloqueo abarca tanto la reducción total como parcial de la actividad o función de Lrg1, por ejemplo, prevención 40 total o parcial de las interacciones ALK1-Lrg1, TGFβRII-Lrg1 y/o TGFβ-Lrg1. Por ejemplo, un antagonista de bloqueo de la invención puede reducir la actividad de Lrg1 de 10 a 50 %, al menos 50 % o al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %.
El bloqueo de la actividad o función de Lrg1 se puede medir por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, el bloqueo 45 de la interacción ALK1-Lrg1, TGFβRII-Lrg1 y/o TGFβ-Lrg1 puede determinarse midiendo el efecto sobre la fosforilación de Smad5, sobre la base de que la fosforilación de Smad5 es característica de la vía activada por ALK1 en lugar de la activada por ALK5.
El bloqueo de Lrg1 también se puede medir a través de ensayos que miden la angiogénesis, por ejemplo ensayos in 50 vitro tales como el crecimiento de vasos en Matrigel, el crecimiento de vasos a partir de anillos aórticos y ensayos in vivo tales como los que miden la angiogénesis de la retina (p. ej., neovascularización coroidea inducida por láser, retinopatía inducida por oxígeno).
El bloqueo puede tener lugar a través de cualquier mecanismo adecuado, dependiendo por ejemplo de la naturaleza 55 (véase a continuación) del antagonista utilizado, p. ej., interferencia estérica en cualquier interacción directa de ALK1-Lrg1, TGFβRII-Lrg1 y/o TGFβ-Lrg1.
Antagonistas de Lrg1
60
Cualquier antagonista de anticuerpo adecuado puede ser utilizado de acuerdo con la invención.
También se desvelan:
Péptidos
Los antagonistas peptídicos serán normalmente fragmentos de Lrg1 que compiten con Lrg1 de longitud completa para la unión a TGFβRII y/o ALK1 y por ende antagonizan Lrg1. Tales péptidos pueden ser lineales o cíclicos. Los antagonistas peptídicos serán normalmente de 5 a 50, preferentemente 10-40, 10-30 o 15-25 aminoácidos de 5 longitud y generalmente serán idénticos a secuencias contiguas dentro de Lrg1 pero pueden tener menos de 100 % de identidad, por ejemplo 95 % o más, 90 % o más u 80 % o más, siempre que conserven las propiedades de bloqueo de Lrg1. Los péptidos de bloqueo pueden ser identificados de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante la identificación sistemática de los péptidos contiguos o superpuestos que abarcan la totalidad o parte de la secuencia de Lrg1. Los peptidomiméticos también pueden ser diseñados para imitar tales péptidos de bloqueo. 10
ARN bicatenario
Usando técnicas conocidas y en base a un conocimiento de la secuencia de Lrg1, las moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) pueden diseñarse para antagonizar Lrg1 por la orientación selectiva basada en homología de secuencias 15 del ARN de Lrg1. Tales ARNbcs serán normalmente ARN pequeños de interferencia (ARNip), generalmente en una configuración tallo-bucle ("horquilla"), o micro-ARNs (miARNs). La secuencia de tales ARNbcs comprenderá una porción que se corresponde con la de una porción del ARNm que codifica Lrg1. Esta porción será generalmente 100 % complementaria a la porción diana dentro del ARNm de Lrg1 pero también puede ser utilizada con niveles más bajos de complementariedad (p. ej., 90 % o más o 95 % o más). 20
Aptámeros
Los aptámeros son generalmente moléculas de ácido nucleico que se unen a una molécula diana específica. Los aptámeros se pueden modificar por completo por ingeniería genética in vitro, se producen fácilmente por síntesis 25 química, poseen propiedades de almacenamiento deseables y provocan una inmunogenicidad escasa o ninguna inmunogenicidad en aplicaciones terapéuticas. Estas características los hacen particularmente útiles en las utilidades farmacéuticas y terapéuticas.
Como se usa en la presente memoria, "aptámero" se refiere en general a un oligonucleótido monocatenario o 30 bicatenario o a una mezcla de dichos oligonucleótidos, en el que el oligonucleótido o la mezcla es capaz de unirse específicamente a una diana. Los aptámeros de oligonucleótidos serán discutidos en la presente memoria, pero el lector experto apreciará que otros aptámeros que tienen características de unión equivalentes también se puedan utilizar, tales como aptámeros peptídicos.
35
En general, los aptámeros pueden comprender oligonucleótidos que son al menos 5, al menos 10 o al menos 15 nucleótidos de longitud. Los aptámeros pueden comprender secuencias que son de hasta 40, hasta 60 o hasta 100 o más nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los aptámeros pueden ser de 5 a 100 nucleótidos, de 10 a 40 nucleótidos, o de 15 a 40 nucleótidos de longitud. De ser posible, los aptámeros de longitud más corta se prefieren ya que estos conducen a menudo a una menor interferencia con otras moléculas o materiales. 40
Los aptámeros no modificados se eliminan rápidamente del torrente sanguíneo, con una semivida de minutos a horas, debido principalmente a la degradación por nucleasas y depuración del cuerpo por los riñones. Tales aptámeros no modificados tienen utilidad en, por ejemplo, el tratamiento de afecciones transitorias, tales como en la estimulación de la coagulación sanguínea. Como alternativa, los aptámeros pueden ser modificados para mejorar su 45 semivida. Varias de estas modificaciones están disponibles, tales como la adición de pirimidinas sustituidas con 2'-flúor o enlaces de polietilenglicol (PEG).
Los aptámeros pueden ser generados usando métodos rutinarios, tales como el procedimiento de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). SELEX es un método para la evolución in vitro de 50 moléculas de ácido nucleico con unión altamente específica a moléculas diana. Se describe en, por ejemplo, los documentos US 5.654.151, US 5.503.978, US 5.567.588 y WO 96/38579.
El método SELEX implica la selección de aptámeros de ácidos nucleicos y en particular de ácidos nucleicos monocatenarios capaces de unirse a una diana deseada, a partir de una colección de oligonucleótidos. Una 55 colección de ácidos nucleicos monocatenarios (p. ej., ADN, ARN, o variantes de los mismos) se pone en contacto con una diana, en condiciones favorables para la unión, aquellos ácidos nucleicos que se unen a las dianas en la mezcla se separan de los que no se unen, los complejos de ácido nucleico diana se disocian, aquellos ácidos nucleicos que se habían unido a la diana se amplifican para producir una colección o biblioteca que está enriquecida en ácidos nucleicos que tienen la actividad de unión deseada, y a continuación esta serie de etapas se repite según 60 sea necesario para producir una biblioteca de ácidos nucleicos (aptámeros) que tienen afinidad de unión específica para la diana pertinente.
Los antagonistas de la invención son anticuerpos que se unen a Lrg1.
65
Anticuerpos
El término "anticuerpo", como se refiere en la presente memoria, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión al antígeno") o cadenas sencillas de los mismos. Un anticuerpo se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (P) y dos cadenas ligeras 5 (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión al antígeno de las mismas. Cada cadena pesada de está comprendida por una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como VH) y una región constante de la cadena pesada. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como VL) y una región constante de la cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las 10 regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (RDC), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (RM). Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina con tejidos del huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. 15
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, y será preferentemente un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado en RDC, un nanocuerpo, un anticuerpo humano o humanizado o una porción de unión al antígeno de cualquiera de los mismos. Para la producción de ambos anticuerpos monoclonales y policlonales, el 20 animal experimental es normalmente un mamífero no humano tal como una cabra, conejo, rata o ratón, pero también se puede cultivar en otras especies tales como los camélidos.
Los anticuerpos policlonales se pueden producir por métodos rutinarios tales como la inmunización de un animal adecuado, con el antígeno de interés. La sangre puede ser extraída posteriormente del animal y la fracción de IgG 25 purificarse.
Los anticuerpos monoclonales (AMs) de la invención pueden ser producidos por una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal convencional p. ej., la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La 30 producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido y se puede conseguir utilizando técnicas bien conocidas en la materia.
Un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede ser producido por un método que comprende: inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende Lrg1 de longitud completa, un fragmento peptídico de 35 Lrg1, un epítopo dentro de la secuencia de L1-24 del Apéndice 2 o L94-117 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) de Lrg1 o un epítopo dentro de otras regiones de Lrg1; obtener una preparación de anticuerpos de dicho mamífero; y derivar de los mismos los anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente dicho epítopo. 40 La expresión "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro de la expresión "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento dAb y una 45 región determinante de la complementariedad aislada (RDC). Los anticuerpos de cadena sencilla, tales como anticuerpos scFv también tienen por objeto ser abarcados dentro de la expresión "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se pueden obtener usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos pueden ser identificados sistemáticamente para su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. 50
Un anticuerpo de la invención se puede preparar, expresar, crear o aislar por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina de interés o un hibridoma preparado del mismo, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo de interés, p. ej., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una 55 biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implican corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN.
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. La expresión 60 "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, tiene por objeto incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones RDC como marco se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (p. ej., 65 mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin
embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, no tiene por objeto incluir anticuerpos en los que las secuencias RDC derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como un ratón, han sido injertadas sobre secuencias marco humanas.
Un anticuerpo humano de este tipo puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Un anticuerpo monoclonal 5 humano de este tipo puede ser producido por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, p. ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.
Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido por 10 transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr.
La expresión "derivados de anticuerpos humanos" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, p. ej., un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.
15
La expresión "anticuerpo humanizado" tiene por objeto hacer referencia a anticuerpos en los que las secuencias RDC derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas sobre secuencias marco humanas. Las modificaciones adicionales de la región marco se pueden hacer dentro de las secuencias marco humanas.
20
Los métodos de identificación sistemática que se describen en la presente memoria pueden usarse para identificar anticuerpos adecuados que son capaces de unirse a Lrg1. De este modo, los métodos de identificación selectiva descritos en la presente memoria pueden llevarse a cabo utilizando un anticuerpo de interés como el compuesto de ensayo.
25
Los anticuerpos de la invención pueden someterse a ensayo por la unión a Lrg1 mediante, por ejemplo, ELISA o inmunoelectrotransferencia convencional. Un ensayo ELISA también puede utilizarse para identificar sistemáticamente hibridomas que muestran reactividad positiva con la proteína diana. La especificidad de unión de un anticuerpo también se puede determinar mediante el control de la unión del anticuerpo a células que expresan la proteína diana, por ejemplo por citometría de flujo. Así, un método de identificación sistemática de la invención 30 puede comprender la etapa de identificar un anticuerpo que es capaz de unirse a Lrg1 mediante la realización de un ELISA o membrana Western o por citometría de flujo. Los anticuerpos que tienen las propiedades de unión requeridas pueden entonces someterse a ensayo adicionalmente para determinar sus efectos sobre la actividad de Lrg1 como se describe más arriba.
35
Los anticuerpos de la invención tendrán propiedades (bloqueo) de antagonistas de Lrg1 que se han discutido anteriormente. En una realización, un anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo dentro de Lrg1 y bloquea la actividad de Lrg1. En una realización, el anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo dentro de Lrg1 y bloquea la interacción entre ALK1, TGFβRII o TGFβ y Lrg1. Un anticuerpo monoclonal desvelado en la presente memoria reconoce específicamente un epítopo dentro de los aminoácidos L1-24 del Apéndice 2 o 40 L94-117 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) y bloquea la actividad de Lrg1. En una realización, un anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo dentro de los aminoácidos L1-24 del Apéndice 2 o L94-117 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) y bloquea la interacción entre ALK1, 45 TGFβRII o TGFβ y Lrg1
Los anticuerpos de la invención reconocen específicamente Lrg1, es decir epítopos dentro de Lrg1. Un anticuerpo u otro compuesto, "se une específicamente" o "reconoce específicamente" una proteína cuando se une con afinidad preferente o alta a la proteína para la que es específica pero no se une sustancialmente, o se une con baja afinidad, 50 a otras proteínas. La especificidad de un anticuerpo de la invención para la proteína diana se puede estudiar adicionalmente determinando en caso afirmativo o negativo si el anticuerpo se une a otras proteínas relacionadas como se ha discutido anteriormente o si se discrimina entre ellas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede unirse a Lrg1 humano pero no a ratón o a otra Lrg1 de mamífero.
55
Los anticuerpos de la invención se unirán deseablemente a Lrg1 con alta afinidad, preferentemente en el intervalo picomolar, p. ej., con una constante de afinidad (KD) de 10 nM o menos, 1 nM o menos, 500 pM o menos, o 100 pM o menos, medida por resonancia de plasmón superficial o cualquier otra técnica adecuada.
Una vez identificado y seleccionado un anticuerpo adecuado, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se puede 60 identificar por métodos conocidos en la materia. Los genes que codifican el anticuerpo pueden ser clonados utilizando cebadores degenerados. El anticuerpo puede producirse de forma recombinante mediante métodos rutinarios.
Los epítopos dentro de Lrg1 pueden ser identificados por métodos conocidos en la materia y discutidos en la 65 presente memoria, se muestran especialmente mediante la identificación sistemática de los péptidos contiguos o
superpuestos a través de un enfoque "PEPSCAN" o mediante la formación de anticuerpos con fragmentos peptídicos (véase anteriormente) para bloquear Lrg1. Ejemplos de tales péptidos en los que los epítopos pueden ser identificados para la producción de anticuerpos son los péptidos L1-24 del Apéndice 2 o L94-117 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 2 o L262-285 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 4) y L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 (SEQ ID NO: 5) discutidos en la presente memoria. Estos y otros péptidos que contienen 5 epítopos pueden utilizarse como inmunógenos para la generación de anticuerpos.
Indicaciones terapéuticas
Cualquier afección en la que la proliferación vascular mediada por Lrg-1 se produce, puede en principio, ser tratada, 10 impedida o mejorada de acuerdo con la presente invención. "Proliferación vascular", "vasculoproliferativo", "afecciones vasculoproliferativas" y términos similares, como se usa en la presente memoria, abarcan cualquiera y todas las patologías relacionadas con el desarrollo aberrante o no deseado de los vasos sanguíneos o células o tejido vascular. Por ejemplo, tanto la angiogénesis patógena (la formación de nuevos vasos sanguíneos, por ejemplo a través de un nuevo crecimiento capilar de los vasos sanguíneos existentes) como la malformación vascular (p. ej., 15 telangiectasia, la formación de vasos dilatados, tortuosos e incompetentes, microaneurismas) puede prevenirse o reducirse, como puede la neovascularización y la proliferación de células endoteliales vasculares. También, como se conoce en la materia, el crecimiento neoplásico requiere la formación de nuevos vasos sanguíneos para proporcionar un suministro de sangre al tumor en crecimiento. Los tumores en los que ocurre la proliferación vascular mediada por Lrg1 son también por lo tanto afecciones que pueden tratarse, prevenirse o mejorarse de 20 acuerdo con la presente invención.
Preferentemente, no hay efecto o hay un efecto mínimo sobre, p. ej., el desarrollo de vascularización normal, especialmente el desarrollo de vascularización en la retina. El tratamiento de afecciones oculares vasculoproliferativas es una realización preferida. Entre las afecciones que se pueden tratar se encuentran: 25 retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, retinopatía de prematuros, telangiectasia macular, degeneración macular relacionada con la edad o neovascularización coroidea.
El tratamiento de tumores, normalmente tumores sólidos, se puede efectuar también, ya que la prevención de la angiogénesis en los tumores se deriva del tumor del suministro de sangre. Las dianas de tratamiento del tumor 30 incluyen tumores en el cerebro, mama, riñón, colon, pulmón, próstata, cabeza y cuello, estómago, páncreas, piel, cuello de útero, hueso, ovario, testículos e hígado.
Composiciones farmacéuticas, dosificaciones y regímenes de dosificación
35
Los antagonistas de la invención pueden formularse normalmente en composiciones farmacéuticas, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es 40 adecuado para administración parenteral, p. ej., intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular o intravítrea (p. ej., por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el modulador puede estar recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
45
Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado. Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base.
50
Los vehículos farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden vehículos o diluyentes acuosos. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. En muchos casos, será preferible 55 incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición.
Las composiciones terapéuticas deben ser normalmente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura 60 ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender principios activos adicionales, en particular antagonistas de FCEV como se discute en la presente memoria.
65
También dentro del alcance de la presente invención se encuentran kits que comprenden antagonistas de la
invención e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se ha discutido anteriormente. Los antagonistas y composiciones de la presente invención se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.
En las aplicaciones terapéuticas, los moduladores o las composiciones se administran a un sujeto que ya padece un 5 trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Tal tratamiento terapéutico puede resultar en una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, o un aumento en la frecuencia o la duración de los periodos libres de síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz". 10
En aplicaciones profilácticas, las formulaciones se administran a un sujeto en riesgo de un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o 15 lesión así como del peso y estado general del sujeto. Un ejemplo de una afección que puede ser tratada profilácticamente en el contexto de la invención es la DME (degeneración macular relacionada con la edad) húmeda; un ojo puede desarrollar la afección antes que el otro, siendo el primer ojo tratado una vez que se reconoce el problema y el segundo se trata profilácticamente.
20
Un sujeto para la administración de los antagonistas de la invención puede ser un animal humano o no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Se prefiere la administración a seres humanos.
25
Un antagonista de la presente invención se puede administrar a través de una o más vías de administración utilizando uno o diversos métodos conocidos en la materia. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías preferidas de administración para los moduladores de la invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo por inyección o 30 infusión. La frase "administración parenteral", como se usa en la presente memoria, significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección. Alternativamente, un anticuerpo de la invención se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa.
35
Una dosificación adecuada de un modulador de la invención puede ser determinada por un médico experto. Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar a fin de obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de 40 las composiciones particulares de la presente invención empleada, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración de la tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y el historial médico anterior del paciente a tratar, y factores similares bien conocidos en la técnica médica. 45
Una dosis adecuada puede encontrarse, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 μg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente a ser tratado. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día o de aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día. Para administración intraocular, 50 una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 µg-1 mg, normalmente cada 28 días.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una dosis única, pueden ser administradas varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las 55 exigencias de la situación terapéutica. La forma de dosificación unitaria como se usa en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
60
La administración puede proporcionarse en dosis únicas o múltiples. Las dosis múltiples pueden administrarse a través de las mismas o diferentes vías y en los mismos o diferentes lugares. Alternativamente, las dosis pueden realizarse a través de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere menos administración frecuente. La dosificación y frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración del tratamiento deseado. 65
Como se ha mencionado anteriormente, los moduladores de la invención pueden administrarse conjuntamente con uno u otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, el otro agente puede ser un analgésico, anestésico, agente inmunosupresor o antiinflamatorio; o un antagonista de FCEV. La administración combinada de dos o más agentes se puede lograr en una serie de maneras diferentes. Pueden administrarse juntos en una única composición, o pueden administrarse en composiciones separadas como parte de 5 una terapia combinada. Por ejemplo, uno puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro.
Terapias de combinación
Como se ha señalado anteriormente, los antagonistas de Lrg1 de la invención se pueden administrar en 10 combinación con cualquier otro compuesto activo adecuado. En particular, debido al antagonismo de Lrg1 y FCEV, se reducirá la vascularización patogénica, los antagonistas de Lrg1, los anticuerpos en particular anti-FCEV tales como Avastin y/o Lucentis y/o trampas de FCEV basados en receptores tales como Aflibercept.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. 15
Ejemplos
1. Análisis de la expresión génica de vasos retinianos anormales.
20
Hay varios modelos animales de enfermedad de la retina que, a pesar de tener orígenes genéticos y celulares distintos, exhiben una respuesta vascular aberrante que incorpora no solo angiogénesis, sino también otros cambios vasculares, tales como telangiectasia (vasos dilatados, tortuosos e incompetentes). Con el fin de obtener una nueva perspectiva sobre las bases biológicas del remodelado vascular de la retina, se llevó a cabo un estudio en cuatro de estos modelos (Fig 1) con lo cual se investigó la expresión diferencial de genes en microvasos retinanos patógenos 25 en comparación con los microvasos de los controles normales. Se investigaron fragmentos de microvasos aislados y purificados a partir de las retinas de ratones de tipo silvestre (TS), ratones con distrofia retiniana (DR) 1, ratones de cola enroscada (CE) y ratones nuligénicos del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR) en los puntos temporales correspondientes a etapas, cuando había anomalías vasculares. El análisis de la expresión génica en micromatrices (Affymetrix) en ARN aislado de los tres modelos de ratón reveló 63 genes comunes a todos 30 los que ya se regularon positiva o negativamente en los microvasos de la retina enferma (Fig. 10). De los 63 genes expresados diferencialmente en la vasculatura de la retina de los tres modelos de ratón del remodelado vascular, la alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) se clasificó como la más significativa (seguido por análisis FDR). Lrg1 es una glicoproteína secretada (Fig 2) de la familia de las proteínas de repetición rica en leucina que están implicadas en interacciones proteína-proteína, señalización, adhesión celular y desarrollo. 35
2. Validación de la sobreexpresión de Lrg1 observada en los datos de micromatrices.
El aumento de la expresión de Lrg1 en la retina de los modelos de ratón fue validado por primera vez por PCR cuantitativa. El ARNm de toda la retina de ratones TS, RD1, CE y VLDLR-/- se extrajo y se sometió a PCR 40 cuantitativa en tiempo real (QRTPCR). Como se indica por el análisis de microensayos, la qRTPCR demostró que había un aumento significativo (p <0,05) de la expresión del transcrito de Lrg1 en los tres modelos de patología vascular de la retina en comparación con los ratones de control (Fig 3A). Para establecer que el aumento en el ARNm traducido en un aumento de la expresión de la proteína, se aisló a continuación retinas en puntos temporales idénticos con respecto a los estudios de expresión génica y se preparó el tejido para el análisis de proteínas por 45 membrana Western (Fig 3 B). La semi-cuantificación de los datos de membrana Western (n ≥ 3) mediante análisis densitométrico en comparación con una proteína constitutiva (GAPDH) reveló un aumento significativo en la expresión de proteínas Lrg1 (p <0,05). Para determinar la distribución de Lrg1 en la vasculatura de la retina y para establecer si otras células de la retina expresan Lrg1, se llevó a cabo la hibridación e inmunohistoquímica in situ para detectar ARNm y proteínas Lrg1, respectivamente. En ratones normales, ARNm (Fig 3C) y proteína (Fig 3D) de 50 Lrg1 se expresaron predominantemente por la vasculatura.
3. Lrg1 se asocia con receptores TGFβ, TGFβRII y ALK1.
No se sabe prácticamente nada con respecto a la biología de Lrg1. Varios informes han descrito aumentos 55 concomitantes en el nivel de expresión de TGFβ1, TβR-II y Lrg1 en una serie de enfermedades (Sun et al,. 1995; Li et al., 2007). Esto es particularmente pertinente ya que la disfunción de la señalización de TGFβ en las células endoteliales conduce a la enfermedad telangiectasia hemorrágica hereditaria (THH). En este grupo de enfermedades, que se caracterizan por anomalías vasculares incluyendo telangiectasias, las mutaciones en el receptor accesorio de endoglina en el endotelio del TGFβ y el receptor ALK1 tipo I de TGFβ conducen a THH1 60 (McAllister et al. 1994) y THH2 (Johnson et al.1995), respectivamente. Además, se dispone de datos piloto en ratones VLDLR -/- en el sentido de que ARNm de TGFβ aumenta significativamente en el tejido de la retina, pero no en RPE o microvasos. De mayor relevancia, se ha descubierto que TGFβ se aumenta en las retinas de los pacientes con retinopatía diabética (Spirin et al., 1999), en el que es frecuente el remodelado vascular.
65
En las células endoteliales, la señalización del TGFβ puede ocurrir a través del receptor II de TGFβ que se asocia o
bien con quinasa 5 tipo receptor de activina (ALK5) del receptor tipo I de TGFβ que se expresa de forma ubicua o ALK1, que se expresa principalmente en las células endoteliales, con la respuesta celular en función de la vía que predomina. En el caso de ALK5, hay un aumento de la deposición de ECM y la quiescencia celular mientras que con ALK1 hay activación de células endoteliales que se manifiestan como un aumento de la migración y proliferación. Esta señalización diferencial es controlada en parte por la concentración/biodisponibilidad de TGFβ y por los 5 miembros de una familia de proteínas efectoras corriente abajo llamadas Smads, con lo que Smads 2 y 3 se asocian con ALK5, y Smads 1, 5 y 8 con ALK1. Se ha explorado la conexión entre Lrg1 y la vía de señalización de TGF. Se estableció en primer lugar que una línea de células endoteliales de cerebro de rata (GPNT) expresa tanto Lrg1, TGFβRII así como otros componentes de la señalización de TGFβ (véase el apéndice 1). Se ha demostrado que la inmunoprecipitación de Lrg1 partir de lisados celulares GPNT resultó en co-precipitación de los receptores TGFβRII 10 y ALK1 (Fig 4A). Del mismo modo, la inmunoprecipitación de cualquier TGFβRII o ALK1 resultó en co-precipitación de Lrg1 lo que indica que Lrg1 se asocia con ambos receptores (Fig 4A). También se ha demostrado que la proteína Lrg1 recombinante etiquetada con HA a partir de bacterias se asocia con TGFβRII y TGFβ (Fig 4B). Además, la visualización inmunocitoquímica de la expresión de Lrg1 y TGFβRII en células GPNT demuestra co-localización (Fig 4C). Se plantea la hipótesis de que, por tanto, Lrg1 actúa como un modulador de la señalización de TGFβ causando 15 un ajuste entre TGFβRII y las cascadas de señalización activadas por ALK1 y ALK5. También se ha demostrado que TGFβ induce la expresión génica de Lrg1en células GPNT, sugiriendo un posible mecanismo de realimentación (Fig. 16).
4. Lrg1 modifica la señalización de TGFβ a través de la fosforilación diferencial de Smad. 20
Para establecer si Lrg1 afecta a las respuestas de células endoteliales vasculares mediadas por TGFβ, a continuación se efectuó una atenuación génica de Lrg1 en células GPNT con ARNip y se determinó sus efectos sobre la proliferación celular mediada por TGFβ. En las células de control, TGFβ induce un aumento significativo (p <0,05) en la proliferación de células endoteliales (70 % de células confluentes) en un periodo de 2 horas. La 25 atenuación génica de Lrg1 en las células endoteliales GPNT con ARNips bloquea este aumento mediado por TGFβ en la proliferación celular (Fig 6A y B). Esto se correlacionó con una reducción en la fosforilación de Smad5 (Fig 4D). Por el contrario, en las células GPNT transfectadas con el gen Lrg1, se muestra que la sobreexpresión de Lrg1 conduce a la proliferación de células endoteliales mejorada en respuesta a TGFβ (Fig 6A y B). Esta respuesta potenciada se correlaciona con una regulación negativa de la expresión de Smad2 y fosforilación aumentada de 30 Smad5 (Fig 4E). Estos datos son acordes con una disminución de la señalización a través de la vía compleja del receptor TGFβRII/ALK5 y por ende un desplazamiento hacia la activación de la vía de señalización TGFβRII/ALK1 vasculopatogénica.
5. Un medio acondicionado con Lrg1 potencia la angiogénesis in vitro. 35
Habiendo establecido que Lrg1 modifica la señalización de TGFβ en las células endoteliales y afecta a la proliferación de células mediadas por TGFβ, se determina a continuación si Lrg1 afecta a la angiogénesis usando un ensayo de angiogénesis convencional in vitro. Las células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC) se cultivaron en Matrigel y se sometieron a medio de crecimiento no acondicionado, medio acondicionado 40 por células GPNT (que secretan constitutivamente Lrg1) y medio acondicionado por células GPNT que sobreexpresan Lrg1. El medio de control no contenía Lrg1 mientras que el medio GPNT que sobreexpresa Lrg1 contenía niveles moderados y altos de Lrg1 respectivamente (Fig 7B). El grado de formación vascular era mayor cuando se añadió un medio acondicionado de células que sobreexpresan Lrg1 (Fig 7A y C). El aumento de la vascularización se correlacionó con la expresión de proteínas Lrg1 en el medio. 45
6. La secuencia peptídica L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3 derivada de Lrg1 modifica la señalización de TGFβ en las células GPNT.
Se establece a continuación si se podría bloquear la fosforilación de Smad5 endotelial inducida por TGFβ, ya sea 50 con un anticuerpo anti-Lrg1 o por secuencias peptídicas derivadas de Lrg1. Se generaron péptidos derivados de las regiones de repetición ricas en leucina de la secuencia de Lrg1 (L1-24 y L169-192 del Apéndice 2 o L94-117 y L262-285 del Apéndice 3), que se cree que están implicadas en las interacciones proteína-proteína, y del dominio C-terminal altamente conservado rico en leucinas (L227-252 del Apéndice 2 o L320-345 del Apéndice 3) (Apéndice 2). La sobreexpresión de Lrg1 en células GPNT no dio lugar a la fosforilación de Smad5. El tratamiento de células de 55 control con 5 ng/ml de TGFβ resulta en un aumento significativo en la fosforilación de Smad5. En las células que sobreexpresan Lrg1, el efecto de TGFβ sobre la fosforilación de Smad5 se potencia de manera significativa. Cuando las células endoteliales que sobreexpresan Lrg1 se co-trataron con el anticuerpo policlonal anti-Lrg1, se produjo una disminución en el nivel de fosforilación de Smad5, lo que sugiere que el anticuerpo es capaz de interferir con las interacciones Lrg1. El co-tratamiento con los péptidos tuvo efectos variables con el péptido L1-24 del Apéndice 2 60 (L94-117 del Apéndice 3) que no tuvo ningún efecto sobre la fosforilación de Smad5, el péptido L169-192 del Apéndice 2 (L262-285 del Apéndice 3) tenía una parcial efecto mientras que el péptido L227-252 del Apéndice 2 (L320-345 del Apéndice 3) (Fig 5) tenía un efecto inhibidor dramático. La combinación de los tres péptidos abolió casi completamente la fosforilación de Smad5 mediada por TGFβ. Estos datos apoyan la hipótesis de que Lrg1 modifica la señalización mediada por TGFβ y que los antagonistas de Lrg1 se pueden utilizar como agentes 65 terapéuticos.
7. Anillos aórticos de ratones nuligénicos Lrg1 muestran una reducción en la formación de vasos angiogénicos.
El papel de Lrg1 en la angiogénesis in vivo se examinó a continuación. Las aortas torácicas se extrajeron de ratones nuligénicos Lrg1 P14 o de controles de la misma camada de tipo silvestre sacrificados por dislocación cervical y se 5 transfirieron inmediatamente a una placa de cultivo que contiene OPTI-MEM libre de suero enfriado en hielo (Invitrogen). El tejido fibroadiposo periaórtico se extrajo cuidadosamente con unas pinzas de microdisección finas. Se seccionaron y embebieron anillos aórticos de un milímetro de largo en un gel de colágeno I de cola de rata (1,5 mg/ml) preparado en DMEM a pH 7,4. Los geles de colágeno que contienen los anillos aórticos se mantuvieron a 37 ºC en placas de 96 pocillos durante 7 días. Cada medio contenía medio de células endoteliales basales 10 suplementado con 2,5 % de SFB, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio Olympus.
Se cuantificó el número de vasos angiogénicos que forman cada anillo aórtico. Los anillos aórticos aislados de ratones heterocigotos y homocigotos para la desactivación génica Lrg1 exhibida redujeron significativamente la 15 formación de vasos angiogénicos en comparación con anillos aórticos de ratones de tipo silvestre (p <0,01) (Fig 9).
8. La neovascularización coroidea (NVC) después de la lesión de la retina se reduce en ratones nuligénicos Lrg1.
20
La membrana de Bruch se rompió por medio de un láser en tres lugares que rodean el nervio óptico en cada ojo de los ratones nuligénicos Lrg1 o controles de la misma camada de tipo silvestre. Las lesiones de la NVC en los sitios de ruptura de la membrana de Bruch se midieron 1 semana después del tratamiento con láser por angiografía de fondo de ojo con fluoresceína (AF) in vivo. La fluoresceína se administró a través de una inyección intraperitoneal. Se obtuvieron angiogramas de fondo de ojo de fase temprana y tardía en un intervalo de 7 minutos. El angiograma 25 de fase temprana se obtuvo 90 segundos después de la inyección que indica el tamaño de la neovascularización coroidea. El angiograma de fase tardía demuestra la fuga de la membrana neovascular coroidea. La AF mostró claramente que la neovascularización coroidea se redujo en los ratones nuligénicos Lrg1 (Fig 11A). La cuantificación de la neovasculatura coroidea reveló que el tamaño del área de crecimiento angiogénico y la fuga se redujeron significativamente en el ratón nuligénico Lrg1 en comparación con los ratones de tipo silvestre (Fig 11B y 30 C) (**p <0,01).
9. La neovascularización retiniana tras retinopatía inducida por oxígeno (RIO) se reduce en ratones nuligénicos Lrg1.
35
Los ratones nuligénicos Lrg1 P7 y controles de la misma camada de tipo silvestre con madres lactantes se sometieron a hiperoxia (75 % de oxígeno) durante 5 días, lo que origina en los neonatos una inhibición significativa del desarrollo de los vasos retinianos. En P12, los ratones regresaron a normoxia después de lo cual la retina avascular hipóxica desencadena un nuevo crecimiento de vasos normales y la neovascularización patológica, que alcanza un pico en P17. Las retinas se aislaron, se fijaron y se sometieron a todo el montaje de inmunotinción 40 utilizando isolectina-B4 (Fig 13A). El recrecimiento vascular se cuantificó mediante la comparación del área avascular con el área de la retina total. La neovascularización se cuantificó midiendo manualmente el área de microhemangiomas iridianos neovasculares.
Se descubrió que el tamaño de la región avascular aumenta de manera significativa en las retinas de ratones 45 nuligénicos Lrg1 (*p <0,05) (Fig 13B). Además, el número de microhemangiomas iridianos neovasculares se redujo significativamente en los ratones nuligénicos Lrg1 en comparación con los ratones de tipo silvestre (**p <0,002) (Fig 13C).
10. La formación de tubos, cordones y vasos de células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical 50 (HUVEC) en Matrigel in vitro se reduce por la adición de un anticuerpo policlonal anti-Lrg1.
Se llevaron a cabo ensayos de formación de tubos in vitro en Matrigel usando células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC). Placas de 96 pocillos se recubrieron con 60 µl de Matrigel por pocillo. Cada pocillo se trató con 100 µl de medio EGM2 que contenía 15.000 HUVEC en presencia de 100 nM de anticuerpo 55 policlonal anti-humano de Lrg1 (cultivado contra la glicoproteína de Lrg1), IgG de isotipo 100 nM o volumen equivalente de tampón de elución de anticuerpos durante 16 horas a 37 ºC, 5 % de CO2. Las células se lavaron y se fijaron. La formación de tubos se redujo significativamente por la adición de un anticuerpo policlonal anti-humano Lrg1 neutralizante, en comparación con la adición de tampón de elución de anticuerpos (p <0,01) o en comparación con la adición de un anticuerpo de IgG irrelevante (p <0,05). La formación de tubos se midió por el número de puntos 60 de ramificación (Fig 14A), número de tubos (Fig 14A) y la longitud total del tubo (Fig 14B).
11. La expresión de Lrg1 y TGFβ en el humor vítreo se incrementa en pacientes humanos que padecen retinopatía diabética proliferativa (RDP).
65
Se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico de una retina humana, con tinción para Lrg1 detectada en la
vasculatura de la retina (Fig 15A). Las muestras de humor vítreo se obtuvieron de pacientes no diabéticos y pacientes que padecen RDP. La presencia de Lrg1 en las muestras vítreas se determinó utilizando inmunoelectrotransferencia y se cuantificó por análisis densitométrico (Fig 15B). Lrg1 fue significativamente mayor en el vítreo de los pacientes que padecen RDP que en comparación con los pacientes no diabéticos (p <0,01). La presencia de TGFβ en las muestras vítreas también se determinó por inmunoelectrotransferencia y se cuantificó al 5 igual que para Lrg1 (Fig 15C). TGFβ también fue significativamente mayor en los pacientes que padecen RDP (p <0,01).
Por lo tanto, los presentes inventores han demostrado que la reducción de la expresión de Lrg1 se asocia con una respuesta angiogénica reducida con un traumatismo de la retina. También se ha demostrado que Lrg1 y TGFβ se 10 regulan de manera positiva en pacientes que padecen RDP, una afección caracterizada por un aumento de la neovascularización de la retina. Esto apoya la hipótesis de que Lrg1 está implicada en la estimulación de la proliferación vascular a través de la señalización mediada por TGFβ, y que los antagonistas de Lrg1, especialmente anticuerpos, se pueden utilizar como agentes terapéuticos para combatir la proliferación vascular no deseada.
15
Apéndice 1
Cambio_VLDLR múltiplo en log2 5,777919149 4,015170052 -2,568344913 2,11155484 3,430316425 3,827068592 -2,474550588 1,277641505 2,247410862 -3,214444147 -3,066735413 2,266282648 -2,156662562 -1,892365323 -2,277307668 -1,631838059 -1,936973954 -1,844864996 -1,206897797 -1,347053782 -1,740841839 -1,592312043
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3,816848952 2,015383555 -4,125380964 2,649653567 3,156981806 3,692692577 -3,9006414 1,259509319 1,89078393 -4,361535072 -1,179261665 2,272847784 -2172837472 -2,036684918 -2,213802579 -2,309095175 -2804674797 -1,667727966 -1,091181534 -1,699029862 -1,940264082 -2,054920044
Cambio_CT múltiplo en log2
6,519850734 4,737700645 -3,416739788 3,311352995 3,055248193 3,054367211 3,030865082 2,665924081 2,647126931 -2536206087 -2,384035095 2,023505786 -1,954283912 -1,818125782 -1,775990978 -1,774932834 -1,72511362 -1,723237635 -1,705821329 -1,672238827 -1,653035647 -1,593241687
Descripción
alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina proteína asociada a la vesícula plasmalema secuencia de ADNc BC032203 gen del ADNc RIKEN A130040M12 tipo i del receptor de angiotensina proteína de unión a lipopolisacáridos proteína 1 básica espermátida redonda, rosbin prosaposina factor b del complemento homólogo de fosfatasa y tensina homólogo 2 (humano) que contiene el dominio regulador del factor X miembro 1 de clase I de ATPasa tipo 8B homólogo del RAD52 (S. cerevisiae) transcrito 1 inducido por glucocorticoides gen del ADNc RIKEN 4932417H02 gen 1 de la región candidata supresora del tumor glioma gen del ADNc RIKEN 1500031I19 transcrito 1 inducido por glucocorticoides regulador 1 (tipo cordina) de la BMP transmembrana rica en cisteínas dominio 1B (tipo Rbp2) interactivo rico en AT en jumonji
Símbolo
Lrg1 Plvap BC032203 A130040M 12Rik Agtrl1 Lbp Rsbn1 Psap Cfb Pten Rfxdc2 Atp8b1 Rad52 Glcci1 4932417H0 2Rik Gltscr1 1500031119 Rik Glcci1 Crim1 Jarid1b
Sonda
1417290_at 1418090_at 1444552_at 1428909_at 1438651_a_at 1448550_at 1441789_at 1421813_a_at 1417314_at 1441593_at 1440068_at 1455396_at 1445746_at 1447024_at 1441671_at 1458068_at 1446616_at 1429113_at 1444599_at 1442411_at 1442548_at 1442278_at
Cambio_VLDLR múltiplo en log2 -1,384970196 1,643819758 -1,184280404 -1,956274263 1,086669094 -1,456998627 1,171794534 0,835345089 -1,608667724 -1,546880217 -1,10552067 -1,284670518 1,068334016 -1,349663196 -0,866281171 0,940147563 0,941050305 -0,705298896 -1,615279068 -0,692698458 -0,961142854 -1,239422567
Cambio_RD1 múltiplo en log2
-2239579279 1,668786796 -1,466939411 -1825546132 0,99575522 -1633794668 0,726805713 0,852655229 -2,325957358 -2,573702542 -1,532910502 -1,370689608 1,435822999 -1,939819175 -0,886239428 0,786730964 1,011010936 -0,934117344 -0,76932415 -0,538998769 -1,096312483 -0,683423202
Cambio_CT múltiplo en log2
-1,560872761 1,514592532 -1,50571231 -1,494802256 1,471971509 -1,449026953 1,433022778 1,399246787 -1,392466072 -1,296353942 -1,12906095 -1,123702369 1,111238973 -1,09095976 -1,068488611 1,065952649 1,023069178 -1,014077281 -1,008999711 -0,908527509 -0,879594769 -0,866335737
Descripción
dominio 2 que contiene EVH1 relacionado con sprouty miembro 4 de la familia GTPasa IMAP secuencia de ADNc BC032203 homólogo 2 (humano) que contiene el dominio regulador del factor x proteína 2 de unión a quimiocina ornitina decarboxilasa antizima 2 leucemia/linfoma 3 de células b miembro 1 de la familia del dominio similar a Der-1 factor 6 específico de la escisión y la poliadenilación tipo 2 muscleblind gen 1 vecino de Brca1 piruvato deshidrogenasa E1 alfa 1 TNFRSF1A asociado a través del dominio mortal 1 que contiene repetición HEAT gen del ADNc RIKEN 9030607L02 gen del ADNc RIKEN 1200006F02 proteína 1 de unión a X-box gen del ADNc RIKEN 1110033F14 inhibidor de la proteína de STAT 1 activada atexina 7 gen del ADNc RIKEN 4833426J09
Símbolo
Spred2 Gimap4 BC032203 Rfxdc2 Ccbp2 Oaz2 Bcl3 Derl1 Cpsl6 Mbnl2 Nbr1 Pdha1 Tradd Heatr1 9030607L0 2RIk 1200006F0 2Rlk Xbp1 1110033F1 4Rik Pias1 Atxn7 4833426J09 Rik
Sonda
1436892_at 1424374_at 1458798_at 1460567_at 1437937_at 1442735_at 1418133_at 1423082_at 1459687_x_at 1457477_at 1440755_at 1446954_at 1429117_at 1437965_at 1432978_at 1451486_at 1420886_a_at 1445436_at 1435984_at 1455611_at 1426287_at 1428996_at
Cambio_VLDLR múltiplo en log2 -0,76202582 0,689687416 1,084920536 -0,713864956 0,778790464 1,056537225 0,708281895 -0,57158557 -0,820431257 0,979461584 0,495717954 0,705527995 0,509893114 -0,46515885 -0,624932339 0,538623288 0,615251382 0,46866585
Cambio_RD1 múltiplo en log2
-1,091162548 0,751048508 0,820922725 -1,223847712 0,848318756 0,861839016 0,709146206 -0,533392331 -1,279893048 1,136323881 0,440366945 0,874125971 0,621367847 -0,580166221 -0,605230238 0,433538341 0,760717934 0,75831887
Cambio_CT múltiplo en log2
-0,845768882 0,839346345 0,777306593 -0,774526167 0,731805211 0,713272364 0,711778746 -0,711608755 -0,70543309 0,69318397 0,621125798 0,616966306 0,536426675 -0,531772283 -0,530476172 0,474374089 0,467526394 0,396366101
Descripción
dominio 1 que contiene DDHD proteína 1 de unión a X-box copina VIII miembro 1 de la subfamilia E (OABP) de casete de unión a ATP gen del ADNc RIKEN 4632419122 receptor del piliovirus miotrofina gen del ADNc RIKEN 9430079B08 helicasa (ADN) B proteína 1 que interactúa con E18 BCL2/adenovirus, NIP3 dominio 6 que contiene abhidrolasa familia del oncogén miembro RAS RA82 dominio 3 de repetición de pentatricopéptido cebado doble B 1, subunidad del factor de iniciación de la transcripción IIIB de ARN la polimerasa III sincolina fosfatidilserina decarboxilasa dominio 5 que contiene DCN1 defectiva en nedilación 1 de la culina proteína X similar a MAX
Símbolo
Ddhd1 Xbp1 Cpne8 Abce1 4632419122 Rik Pvr Mtpn 9430079B0 8RIk Helb Bnip3 Abhd6 Rab2 Ptcd3 Bdp1 Sync Pisd Dcun1d5 Mlx
Sonda
1445438_at 1420011_s_at 1431146_a_at 1442071_at 1433954_at 1451160_s_at 1420475_at 1440331 at 1419236_at 1422470_at 1419104_at 1418621_at 1428090_at 1437919_at 1442443_at 1460585_x_at 1432271_a_at 1418437_a_at
Apéndice 2
Mlrg1
1 LRELHLSSNRLQALSPELLAPVPR 24 L+ELHLSSN L++LSPE L PVP+
HLrg1
1 LQELHLSSNGLESLSPEFLRPVPQ 24
M1rg1
25 LRALDLTRNALRSLPPGLFSTSAN 48 LR LDLTRNAL LPPGLF SA
HLrg1
25 LRVLDLTRNIALTGLPPGLFQASAT 48
MIrg1
49 LSTLVLRENQLREVSAQNLQWLDA 72 L TLVL+ENQL + WL GL A
HLrg1
49 LDTLVLKENQLEVLEVSWLHGLKA 72
Hlrg1
73 LGHLDLAENQLSSLPSGLLASLGA 96 LGHLDL+ N+L LP GLLA+
HLrg1
73 LGHLDLSGNRLRKLPPGLLANFTL 96
Mlrg1
97 LHTLDLGYNLLESLPEGLLRGPRR 120 L TLDLG N LE+LP LLRGP +
HLrg1
97 LRTLDLGENQLETLPPDLLRGPLQ 120
H1rg1
121 LQRLHLEGNRLQRLEDSLLAPQPF 144 L+RLHLEGN+LQ L LL POP
HLrg1
121 LERLHLEGNKLQVLGKDLLLPQPD 144
Hlrg1
145 LRVLFLNDQLVGVATGSFQGLQH 168 LR LFLN N+L VA G+FQGT+
HLrg1
145 LRYLFLNGNKLARVAAGAFQGLRQ 168
Mlrg1
169 LDMLDLSNNSLSSTPPGLWAFLGR 192 LDMLDLSNNSL+S P GLWA LG+
HLrg1
169 LDMLDLSNNSLASVPEGLWASLGQ 192
H1rg1
193 PTRDMQDGFDISHNPWICDKNLADLCRWLVANRN 226 P DM+DGFDIS NPWICD+NL+DL RWL A ++
HLrg1
193 PNMDHRDGFDISGNPWICDQNLSDLYRWLOAQKD 226
Hlrg1
227 KMFSQMDTRCAGPEAMKGQRLLDVAE 252 KMFSQNDTRCAGPEA+KGQ LL VA+
HLrg1
227 KMFSONDTRCAGFEAVKGQTLLAVAK 252
L1-24:
LQELHLSSNGLESLSPEFLRPVPQ
L169-192:
LDMLDLSNNSLASVPEGLWASLGQ
L227-252:
KMFSQNDTTRCAGPEAVKGQTLLAVAK
El alineamiento de la secuencia parcial de Lrg1 de ratón y humano, se dispone para ilustrar las repeticiones ricas en leucina (rojo), y los dominios C-terminales altamente conservados (verde).
Apéndice 3
Humano 1
MSSWSRQRPK M SW Q SPGGIQPHVS RTLFLLLLLA L LL ASAWGVTLSP G S
Ratón 1
MVSWQHQGSL QDLKTCLART LFLLALL-- ----GRVSSL
Humano 41
KDCQVFRSDH K+C + +S GSSISCQPPA GS++SC EIPGYLPADT P E P LPADT VHLAVEFFNL VHL+VEF NL
Ratón 34
KECLILQSAE GSTVSCHGPT EFPSSLPADT VHLSVEFSNL
Humano 81
THLPANLLQG T LPA LQG ASKLQELHLS L+ELHLS SNGLESLSPE SN L++LSPE FLRPVPQLRV L PVP+LR
Ratón 74
TQLPAAALQG CPGLRELHLS SNRLQALSPE LLAPVPRLRA
Humano 121
LDLTRNALTG LDLTRNAL LPPGLFQASA LPPGLF SA TLDTLVLKEN L TLVL+EN QLEVLEVSWL QL + WL
Ratón 114
LDLTRNALRS LPPGLFSTSA NLSTLVLREN QLREVSAQWL
Humano 161
HGLKALGHLD GL ALGHLD LSGNRLRKLP L+ N+L LP PGLLANFTLL GLLA+ L RTLDLGENQL TLDLG N L
Ratón 154
QGLDALGHLD LAENQLSSLP SGLLASLGAL HTLDLGYNLL
Humano 201
ETLPPDLLRG E+LP LLRGP PLQLERLHLE +L+RLHLE GNKLQVLGKD GN+LQ L LLLPQPDLRY LL PQP LR
Ratón 194
ESLPEGLLRG PRRLQRLHLE GNRLQRLEDS LLAPQPFLRV
Humano 241
LFLNGNKLAR LFLN N+L VAAGAFQGLR VA G+FQGL+ QLDMLDLSNN LDMLDLSNN SLASVPEGLW SL+S P GLW
Ratón 234
LFLNDNQLVG VATGSFQGLQ HLDMLDLSNN SLSSTPPGLW
Humano 281
ASLGQPNWDM A LG+P DM RDGFDISGNP +DGFDIS NP WICDQNLSDL WICD NL+DL YRWLQAQKDK RWL A ++K
Ratón 274
AFLGRPTRDM QDGFDISHNP WICDKNLADL CRWLVANRNK
Humano
MFSQNDTRCA GPEAVKGQTL LAVAKSQ L VA+
321
FSQNDTRCA GPEA+KGQ L
Ratón 314
MFSQNDTRCA GPEAMKGQRL LDVAELGSL
La alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) exhibió el mayor cambio múltiplo en los vasos de la retina remodelados. Secuencia de aminoácidos alineada de Lrg1 humana y de ratón. En rojo se representan las regiones de repetición ricas en leucina y en verde se representa la región del dominio C-terminal humana utilizada como un péptido de bloqueo. 5
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Documento US 2005/0064516
Documento WO 2008/092214
55
Documento US 2007/0184503
Información de secuencias
Secuencias de Lrg1 humana 60
SEQ ID NO: 1 - Secuencia de ADN de Lrg1 humana
[La secuencia que codifica la proteína de SEQ ID NO: 2 está en negrita y subrayada en SEQ ID NO: 1 a
continuación]
SEQ ID NO: 2 - Secuencia de aminoácidos de Lrg1 humana [Las secuencias de SEQ ID NOS: 3-5 están en negrita y subrayadas en SEQ ID NO: 2 a continuación]
5
SEQ ID NOS: 3-5 - Secuencias de aminoácidos de péptidos dentro de Lrg1
SEQ ID NO: 3 - Aminoácidos 1-24 de Lrg1 humana del Apéndice 2 (L94-117 del Apéndice 3) 10
L1-24/L94-117:
LQELHLSSNGLESLSPEFLRPVPQ
SEQ ID NO: 4 - Aminoácidos 169-192 de Lrg1 humana del Apéndice 2 (L262-285 del Apéndice 3)
L169-192/L262-285:
LDMLDLSNNSLASVPEGLWASLGQ
SEQ ID NO: 5 - Aminoácidos 227-252 de Lrg1 humana del Apéndice 2 (L320-345 del Apéndice 3) 15
L227-252/L320-345:
KMFSQNDTRCAGPEAVKGQTLLAVAK

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un antagonista de alfa-2-glicoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para su uso en el tratamiento o la prevención de la vascularización patogénica, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une a Lrg1.
    5
  2. 2. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho antagonista bloquea la interacción entre:
    (a) quinasa 1 tipo receptor de activina (ALK1) y Lrg1;
    (b) Lrg1 y receptor II de TGFβ (TGFβRII); y/o 10
    (c) Lrg1 y TGFβ,
    en el complejo de señalización de TGFβ.
  3. 3. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho bloqueo por 15 dicho antagonista reduce la interacción entre ALK y Lrg1, reduciendo de este modo la interacción entre ALK1 y el receptor II de TGFβ (TGFβRII) y favoreciendo la interacción entre TGFβRII y la quinasa 5 tipo receptor de activina (ALK5) de tal manera que el efecto de TGFβ en la cascada de señalización activada por ALK1 se reduce en relación con el efecto de TGFβ en la cascada de señalización activada por ALK5.
    20
  4. 4. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo monoclonal.
  5. 5. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha vascularización patogénica comprende la neovascularización, la proliferación de 25 células endoteliales vasculares, la angiogénesis, la telangiectasia o las microaneurismas.
  6. 6. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso en el tratamiento de la vascularización patogénica del ojo.
    30
  7. 7. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 de acuerdo con la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de un trastorno del ojo seleccionado entre retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, retinopatía de prematuros, telangiectasia macular, degeneración macular relacionada con la edad o neovascularización coroidea.
  8. 8. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el 35 tratamiento de un tumor que exhibe proliferación vascular.
  9. 9. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 de acuerdo con la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento de un tumor que se selecciona entre tumor cerebral, tumor de mama, tumor renal, tumor colorrectal, tumor de pulmón, tumor de próstata, tumores de cabeza y cuello, tumor de estómago, tumor pancreático, tumor cutáneo, tumor cervical, tumor 40 óseo, tumor de ovarios, tumor testicular y tumores de hígado.
  10. 10. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso en la combinación con un compuesto antiangiogénico.
    45
  11. 11. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho compuesto antiangiogénico es un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV).
  12. 12. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho antagonista de FCEV es un anticuerpo anti-FCEV. 50
  13. 13. Un anticuerpo antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho antagonista de FCEV es Aflibercept.
  14. 14. Uso de un antagonista de Lrg1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la 55 vascularización patogénica, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une a Lrg1.
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