JP7053559B2 - 血管新生障害の処置 - Google Patents
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Description
本願は、2011年2月11日出願の米国特許仮出願第61/441,738号の優先権を主張するものである。前記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
政府条項
本発明は、国防総省から助成された助成W81XWH-10-1-0535の下で、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
適する担体と上記薬剤の1つ以上とを含有する組成物は、本発明の範囲内である。前記組成物は、医薬的に許容され得る担体を含有する医薬組成物、飲食に許容され得る適する担体を含有する飲食用組成物、または化粧品的に許容され得る担体を含有する化粧品組成物であり得る。
本記載発明は、被験体における血管新生性障害または血管新生の障害を処置するための方法を提供する。
本記載発明は、診断キットおよび方法も提供する。癌細胞または腫瘍形成しやすい細胞を有する被験体を、該被験体からの試験試料中の上記遺伝子またはポリペプチドの1つ以上についての発現または活性に基づき、診断することができる。前記ポリペプチドおよび核酸を、癌細胞または腫瘍形成しやすい細胞の存在または不在を示すマーカーとして使用することができる。本記載発明の診断および予後アッセイは、前記ポリペプチドまたは核酸の発現レベルを評定するための方法を含む。
すべての細胞系を、Tavazoie,S.F.ら、Nature 451(7175)、147(2008)に記載されているとおりに増殖させた。293T細胞は、10%FBSを補足したDMEM培地で培養し;H29細胞は、10%FBS、20ng/mL ドキシサイクリン、2μg/mL ピューロマイシンおよび0.3mg/mL G418を補足したDMEM培地で培養し;ならびにHUVEC細胞は、EGM-2培地(CC-3162、Lonza、スイス国バーゼル)で培養した。MDA-MB-231およびCN34乳癌細胞系ならびにその転移誘導体LM2、BoM2およびLm1aは、Minn,A.J.ら、Nature 436(7050)、518(2005)に記載されている。
すべての動物実験は、The Rockefeller Universityの施設内動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee:IACUC)により承認されたプロトコルに従って行った。同齢の雌NOD/SCIDマウス(週齢6~8週)を、同所性乳房脂肪体腫瘍開始アッセイ(Minn,A.J.ら、Nature 436(7050)、518(2005)と肺転移アッセイ(Tavazoie,S.F.ら、Nature 451(7175)、147(2008))の両方に使用した。8週齢同齢雌無胸腺マウスを全身転移アッセイ(Kang,Y.ら、Cancer Cell 3(6)、537(2003)およびYin,J.J.ら、J Clin Invest 103(2)、197(1999))に使用した。
レンチウイルスの産生のために、1×106293T細胞を10cmプレートに播種し、24時間インキュベートした。その後、40μLのTRANSIT(登録商標)-293トランスフェクション試薬(MIR2700、MIRUS BIO LLC、ウィスコンシン州マディソン)を使用して、12マイクログラムのベクターK(Gag/Pol)、6μgのベクターA(Env)および12μgの適切なshRNAプラスミドを293T細胞にコトランスフェクトした。16時間後、培地を、10%FBSを補足した新たな抗生物質不含DMEMと交換した。さらに24時間後、5分間、1,500gでの回転によりウイルスを回収し、その後、0.45μmフィルターによって濾過した。レトロウイルスの産生のために、H29細胞を10cmプレートに播種し、放置して集密度90%まで成長させた。その後、60μLのLIPOFECTAMINE(商標)2000トランスフェクション試薬(カリフォルニア州カールズバッドのLIFE TECHNOLOGIESによる11668-019、INVITROGEN)を使用して、10マイクログラムの適切なプラスミドをH29細胞にトランスフェクトした。16時間後、培地を、10%FBSを補足した新たな抗生物質不含DMEMと交換した。さらに48時間後、5分間、1,500gでの回転によりウイルスを回収し、0.45μmフィルターによって濾過した。2ミリリットルの適切なウイルスを使用して、10μg/mLのポリブレン(TR-1003-G、MILLIPORE、ビルリカ、A)の存在下で50K癌細胞に形質導入した。24時間後、培地を、10%FBSと選択のために2μg/mL ピューロマイシン(レンチウイルス)または10μg/mL ブラスチシジンとを補足したDMEMに交換した。さらに72時間後、細胞を洗浄し、放置してD10Fで成長させ、qPCRによって対象となる遺伝子のノックダウンについて試験した。
動員アッセイ開始のおおよそ24時間前に癌細胞(25,000個)を24ウェルプレートに播種した。0.2%FBSを補足したEGM-2培地で24時間、HUVEC細胞を血清飢餓させた。その後、HUVEC細胞を、CELLTRACKER Red CMTPX色素(C34552、INVITROGEN)で45分間標識し、2%FBSを補足したEGM-2培地で30分間レスキューした。その間に、癌細胞をPBSで洗浄し、1mLの0.2%FBS EGM-2培地を各ウェルに添加した。その後、各ウェルに3.0μm HTS FLUROBLOCKインサート(351151、BD FALCON、カリフォルニア州サンホゼ)を取り付けた。抗体実験のために、その後、適切な濃度の各抗体を各ウェルに添加した:50ng/mL 抗IGFBP2(AF674、R&D SYSTEMS、ミネソタ州ミネアポリス)、20μg/mL 抗IGF-1(AF-291-NA、R&D SYSTEMS)、40μg/mL 抗IGF-2(MAB292、R&D SYSTEMS)、20μg/mL 抗IGF1R(MAB391、R&D SYSTEMS)、5μg/mL 抗IGF2R(AF2447、R&D Systems)および抗IgG(AB-108-C、R&D SYSTEMS)。抗体とのプレインキュベーションを必要とする内皮動員アッセイについては、その後、HUVEC細胞または癌細胞のいずれかを20μg/mL 抗IGF1Rまたは対照IgG抗体と共に1時間インキュベートし、PBSで1回洗浄した。その後、HUVEC細胞を1時間、血清飢餓させた後、1mLにつき100KのHUVECで0.2%FBS EGM-2に再懸濁させた。その後、その再懸濁液(0.5mL)を各FLUOROBLOCKインサートに添加し、動員アッセイを16時間、進行させた。アッセイ完了後、FLUOROBLOCKインサートを4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、VECTASHIELD封入剤(H-1000、VECTOR LABORATORIES、カリフォルニア州バーリンゲーム)でスライドにマウントした。各インサートについて3画像を撮り、IMAGEJ(NIH)を用いて画像を分析した。
所与の量のウシ血清アルブミン(A2153、Sigma Aldrich)、rhIGFBP2(674-B2、R&D Systems)、rhGas6(885-GS、R&D Systems)、抗IGF1R(MAB391、R&D Systems)およびMerFc(891-MR-100、R&D Systems)を含有する、マトリゲル(250μL、BD BIOSCIENCES、#356231)を、24ウェルプレートの底部で30分間放置して凝固させた後、0.2%FBSを含有する250μL HUVEC培地を添加した。その後、3.0μm HTS Fluroblockインサート(351151、BD Falcon)を各ウエルに配置した。HUVEC細胞をCellTracker Red CMTPX色素(C34552、Invitrogen)で標識した後、0.2%FBS EGM-2の1mLにつき300KのHUVECを再懸濁させた。その後、0.5mLのその再懸濁液を各Fluoroblockインサートに添加し、アッセイを20時間、進行させた。その後、それらのインサートを15分間、4%パラホルムアルデヒドで固定し、VectaShield封入剤(H-1000、Vector Laboratories)でスライドにマウントした。その後、各インサートの基底側の5視野を撮像し、ImageJ(NIH)を使用して分析した。
HUVEC細胞を集密度90%に成長させ、0.2%FBSを含有するHUVEC培地中の所与の濃度のウシ血清アルブミン(Sigma Aldrich、#A2153)、rhIGFBP2(674-B2、R&D Systems)および抗IGF1R(MAB391、R&D Systems)中で40分間、37℃で刺激した。その後、それらの細胞をトリプシン処理し、50K細胞をHTS Fluroblockインサート(351151、BD Falcon)に添加した。5%CO2で37℃で24時間後、それらのインサートを除去し、膜を切除し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。膜の基底側に移動したHUVEC細胞をDAPIで可視化し、ImageJ(NIH)を使用して膜1枚につき5視野に関して計数した。
HUVEC細胞を6cmプレートに播種し、放置して集密になるまで成長させた。0.2%FBSを補足したDMEM培地中で30分間、癌細胞を血清飢餓させ、CELLTRACKER Green CMFDA色素(C7025、Invitrogen)で45分間標識し、10%FBSを補足したDMEM培地中で30分間インキュベートした。その後、癌細胞をトリプシン処理し、10%FBS/DMEMに再懸濁させて10K細胞/mLにした。その後、5ミリリットルのその再懸濁液をHUVECの各プレートに添加し、プレートを37℃で10分間インキュベートした。その後、プレートをPBSで穏やかに洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで15分間、固定した。その後、各プレートを1mLのPBSで処理し、各プレートから6画像を撮った。その後、IMAGEJを使用して、HUVEC細胞に接着した癌細胞の数を定量した。
癌細胞(1×106)を10cmプレートに播種し、24時間放置して成長させた。その後、癌細胞をPBSで穏やかに洗浄し、2%FBSを補足したEGM-2培地を各プレートに添加した。そのEGM-2調整培地を24時間後に回収した。HUVEC細胞(25K)を6ウェルプレートに三重反復で播種し、16時間放置して成長させた。その後、HUVEC細胞をPBSで穏やかに洗浄し、3mLのEGM-2調整培地を各ウェルに添加した。48時間後、その調整培地を別の3mLの調整培地で置換した。さらに48時間後、細胞をトリプシン処理し、血球計数器を使用して計数した。
製造業者のプロトコル(354149、BD BIOCOAT(商標)ANGIOGENESIS SYSTEM-Endothelial Cell Tube Formation)に従って、管腔形成アッセイを行った。簡単に言うと、0.2%FBSを補足したEGM-2培地中で24時間、HUVEC細胞を血清飢餓させた。その後、HUVEC細胞を、CELLTRACKER Red CMTPX色素(C34552、INVITROGEN)で45分間標識し、その後、2%FBSを補足したEGM-2培地で30分間処理した。この間に、管腔形成アッセイプレート(これは、96ウェル形式であった)を37℃で30分間インキュベートした。癌細胞およびHUVEC細胞をトリプシン処理し、2%FBSを補足したEGM-2培地にそれぞれ400K/mLおよび800K/mLで再懸濁させた。その後、癌細胞懸濁液とHUVEC細胞懸濁液を1:1比で混合し、50μLの各混合物を管腔形成アッセイプレートの各ウェルに播種した。そのアッセイプレートを37℃で16時間インキュベートした。各ウェルの画像を撮り、METAMORPH分析ソフトウェア(MOLECULAR DEVICES,Inc.)を使用してそれらの画像を処理して、1画像あたりの分岐点の数を得た。
MIRVANAキット(AM1560、APPLIED BIOSYSTEMS、テキサス州オースティン)を使用して、様々な細胞系から全RNAを抽出した。TAQMANマイクロRNAアッセイ(4427975-0002228、APPLIED BIOSYSTEMS)を使用して、Tavazoie,S.F.ら、Nature 451(7175)、147(2008)に記載されているように成熟miRNAの発現レベルを定量した。mRNAの定量のために、cDNA First-Strand Synthesis Kit(18080-051、INVITROGEN)を使用して400ngの全RNAを逆転写した。その後、おおよそ4ngの得られたcDNAをSYBRグリーンPCR MASTER MIX(4309155、APPLIED BIOSYSTEMS)および適切なプライマー(表1)と混合した。ABI PRISM 7900HT Real-Time PCR System(APPLIED BIOSYSTEMS)を使用して定量的mRNA発現データを得た。Smad4を正規化のための内因性対照として使用した。TISSUESCAN qPCR Array Breast Cancer Panels 2および3(BCRT102 & BCRT103、ORIGENE、メリーランド州ロックヴィル)を使用して、様々な病期におけるヒト乳癌の発現分析を行った。
ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイは、Tavazoie,S.F.ら、Nature 451(7175)、147(2008)に記載されているとおりに行った。簡単に言うと、ABCB9、IGFBP2、MERTK、PITPNC1、PSAT1、PYGB、SHMT2およびVIPR1の完全長3’UTRおよびCDSをpsiCheck2二重ルシフェラーゼレポーターベクター(C8021、PROMEGA、ウィスコンシン州マディソン)にクローニングした。前記CDSおよび3’UTRの配列を下に列挙する。
MDA-MB-231細胞にそれぞれの特異的レポーター構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの30時間後、細胞を溶解し、二重ルシフェラーゼアッセイ(E1910、PROMEGA)を使用してウミシイタケルシフェラーゼ発現のホタルルシフェラーゼ発現に対する比を決定した。クローニングプライマー配列を下の表2に示す。
対照ヘアピンまたはIGFBP2、PITPNC1もしくはMERTKをターゲットにする短鎖ヘアピンを発現するLM2細胞(2.5×104)を6ウェルプレートに三重反復で播種し、播種の5日後に生細胞を計数した。
4%パラホルムアルデヒドを血管系におよび気管に灌流させる灌流固定により肺を準備した。切除後、肺を一晩、4%パラホルムアルデヒド中に置き、パラフィンに包埋した。固定の5分前に100mgのビオチン化レクチン(B-1175、VECTOR LABORATORIES)を尾静脈経由で循環に注射した。注射したビオチン化レクチンの検出のために、5マイクロメートル厚パラフィン切片をMECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、アイオワ州)、ビメンチン(VP-V684、VECTOR LABORATORIES)、およびFITC標識アビジン(B-1175、VECTOR LABORATORIES)で染色した。様々なAlexa Flour色素コンジュゲート二次抗体を使用して、一次抗体を検出した。ZEISSレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM510)を使用して蛍光を得た。転移結節の血管新生化を判定するために、IMAGEJを使用してMECA-32およびレクチンシグナルを定量し、その一方で、転移結節の抽出物をヒトビメンチンでの共染色によって判定した。血管に覆われた総面積を、バックグラウンド(1ピクセルの回転球半径)を引くことにより、および所定の閾値をカットオフとして用いることにより決定した。血管密度は、転移結節の全面積と比較した血管によって覆われた面積の百分率として得られる。2000μm2より上の全面積を有するビメンチン染色について陽性の面積によって転移結節を定義した。
調整培地中のIGBFP2レベルを、IGFBP2 ELISA(AAHBLG-1-2、RAYBIOTECH、ジョージア州ノークロス(Norgross))を用いて判定した。
プロテアーゼ阻害因子を含有する1mL氷冷RIPA緩衝液(ROCHE、ドイツ国マンハイム)に細胞を溶解することにより、MDA-MB-231細胞から細胞溶解物を調製した。無血清培地中でMDA-MB-231細胞を24時間インキュベートすることにより調整培地を調製した。その後、その培地を回転濾過によって20倍濃縮した。その後、40μgタンパク質を4~12%SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。ヒトMERTKに対するモノクローナル抗体(CVO-311、CAVEO THERAPEUTICS、コロラド州オーロラ)を使用してMERTKを検出した。
統合分析により8つのmiR-126調節遺伝子を同定することで、これらの遺伝子の発現が全体としてヒト臨床的転移と相関するかどうかを判定した。UCSF46、NKI47およびMSKCC13からのシリーズの公開マイクロアレイデータを使用して、プローブレベル発現値を得た。多数のプローブによって表された遺伝子については、独立したデータセットにおいて十分なシグナル強度はもちろん、高い変動係数(情報価値が最も高い)も提示するプローブを使用した。8遺伝子の発現値のZスコアの合計がその集団の平均より高かった場合、各乳癌をmiR-126シグネチャ陽性と分類した。GRAPHPAD PRISM 5ソフトウェア(GRAPHPAD Software,Inc.、カリフォルニア州ラホーヤ)を使用して、カプラン・マイヤー無転移生存曲線を生成した。GRAPHPAD Prism 5ソフトウェアを使用してマンテル・コックス・ログランク検定を用いて患者の生存曲線間の差についての統計学的有意性を判定した。
physics.csbsju.edu/stats/KS-test.htmlで公的に入手できるソフトウェアを使用して、コルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて、MECA-32染色とレクチン染色両方についての血管密度の差の有意性を判定した。
本実施例では、miR-126機能喪失の設定で転移進行を分析するためのアッセイを行った。これにより、対照細胞とmiR-126ノックダウン(KD)細胞の間のインビボ転移事象を比較して、転移コロニー形成への内因性miR-126の影響を明らかにすることができる。
上述の発見は、miR-126サイレンシングが、転移コロニー形成中に転移細胞および初期転移に利点をもたらすことができることを示唆している。この利点の基礎を考究しているとき、肺H&E組織切片の顕微鏡可視化に基づき、miR-126ノックダウン転移が、より高い血管密度を提示することに気づいた。これを定量するために、MDA-231乳癌細胞を標識するヒトビメンチン、および対照またはmiR-126 KD乳癌細胞のいずれかを注射したマウスの肺における転移結節内の内皮密度の定量を可能にする内皮マーカーMECA-32について、共免疫染色を行った。画像分析および定量により、miR-126 KD細胞に由来する転移のほうが有意に高い内皮密度を有することが明らかになった(図2a;35%増加;P=0.02)。
本実施例では、観察されたmiR-126依存性血管新生表現型について細胞的基礎を決定しようと努めた。
本実施例では、内皮動員および転移コロニー形成を媒介するmiR-126の分子ターゲットを同定するために系統的検索を行った。具体的には、miR-126を過発現するLM2細胞のトランスクリプトーム分析を行い、低転移性MDA-231細胞および高転移性LM2細胞への全転写産物変化を比較した。
本実施例では、miR-126ターゲット遺伝子のいずれかが癌細胞による内皮細胞の動員を調節するかどうかを検査するためのアッセイを行った。これら4遺伝子のうち、独立した短鎖ヘアピンを使用するIGFBP2、MERTKまたはPITPNC1のノックダウンは、内皮細胞を動員する転移性LM2細胞の能力を有意に抑制した(図4aおよび図13)。重要なこととして、これらの遺伝子のノックダウンは、結果として細胞増殖の有意な減少をもたらさなかった(図14)。
25倍;図4c)。加えて、PITPNC1およびMERTKのノックダウンも、転移コロニー形成を有意に阻害した(PITPNC1sh1:7.69倍;PITPNC1sh2:4.55倍、図4d;MERTKsh1:3.91倍;MERTK1sh2:3.08倍、図4e)。使用したshRNA配列を下の表5に収載する。
miR-126ターゲットのうち、IGFBP2は分泌因子であり、然るが故に、転移癌細胞と内皮細胞との細胞間情報伝達を媒介する態勢が整っている。したがって、転移細胞が増加されたレベルのIGFBP2を分泌するかどうかを検査した。実際、ELISA分析は、転移性LM2細胞が低転移性MDA-231親系統より2.1倍高いレベルのこの因子を分泌することを明示することが判明した(図5a)。
本実施例では、他のmiR-126ターゲット遺伝子PITPNC1およびMERTKが内皮動員を媒介するメカニズムを調査するためのアッセイを行った。
上記発見により、癌細胞において発現されるmiRNAは、転移性内皮動員および血管灌流の複合過程を、IGFBP2、MERTKおよびPITPNC1(血管新生および転移遺伝子の新規セット)の協調的調節によって非細胞自律的に調節することができることが明らかになった。
本実施例は、体組織の転移癌コロニー形成を調節する遺伝子またはノンコーディングRNAを同定するための2つのアプローチを記載するものである。
1. レンチ-miRアプローチ
レンチ-miRライブラリーの細胞への形質導入および動物への注射 レンチ-miRライブラリー(SYSTEM BIOSCIENCES、Cat # PMIRHPLVAHT-1)をこのアプローチでは使用した。このライブラリーは、全ヒトゲノムを代表する前駆体マイクロRNAを含有するレンチウイルスのプールから成る。SW620およびLS174T細胞系の親集団(2×105細胞)に前記ライブラリーを1の感染多重度(MOI)で形質導入して、個々の細胞が異なるマイクロRNAを過発現する親細胞の不均一プールを得た。形質導入後、各マイクロRNA前駆体がおおよそ50Xで提示された。形質導入の4日後、形質導入細胞の半分を取っておいて、Qiagen DNeasyキットを使用してゲノムDNAを抽出した。これは、肝臓コロニー形成の選択圧前のゲノムDNAの参照プールであった。その残りの半分の集団をNOD/SCIDマウスの肝臓に注射した。注射の3~5週間後、それらの肝臓において形成された腫瘍からゲノムDNAを抽出した。形質導入および注射を両方の細胞系に反復して行った。
ライブラリー特異的T7促進因子含有プライマー(フォワードプライマー:5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCTGGAGACGCCATCCAC GCTG -3’;リバースプライマー:5’:GATGTGCGCTCTGCCCACTGAC-3’)を使用する参照ゲノムDNAおよび腫瘍ゲノムDNAに対する線形範囲内のPCR増幅により、ゲノムDNAからレンチ-miR由来のマイクロRNA前駆体を回収した。400ngのゲノムDNAをテンプレートとして使用して、1試料につき4回のPCR反応を行い、プールして、形質導入前駆体マイクロRNAの妥当な提示を確保した。
2. レンチプレックス(lentiplex)アプローチ
レンチプレックスライブラリーの細胞への形質導入および動物への注射
レンチプレックス全ゲノムshRNAライブラリー(SIGMA-ALDRICH、Cat # SHPH01)をこのアプローチで使用した。このライブラリーは、全ヒトゲノムをターゲットにするおおよそ150,000のshRNAを含有するレンチウイルスのプールライブラリーであり、3~5個の独立したshRNAが各ゲノムをターゲットにする。
ゲノムDNAからshRNAライブラリー配列の複合プールを回収するために、PCRアプローチ、続いてPCRアンプリコンのSolexaディープシークエンシングを用いた。ウイルスベクターに特異的なプライマー(フォワードプライマー:5’-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACT-3’;リバースプライマー:5’-AAAGAGGATCTCTGTCCCTGT-3’)を使用し、続いてSolexaディープシークエンシングに必要とされる配列を有するプライマー(フォワードプライマー:5’-AATGATACGGCGACCACCGAG
ATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTATTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGAC-3’;リバースプライマー:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGGATGAATACTGCCATTTGTCTCGAGGTCGA-3’)を使用して500ngのゲノムDNAに対する初期PCR増幅を行って、shRNA配列を含有するアンプリコンを得た。5ugのゲノムDNAと等価の10のPCR反応をゲノムDNAの各セットについて行い、シークエンシングのためにそれらの産物をプールして、shRNAの妥当な提示を確保した。
本実施例は、IGFBP2に結合してIGFBP2へのIGF1の相互作用(結合)を阻害することにより転移性乳癌細胞による内皮動員を阻害するモノクローナル抗体を実証する。IGFBP2へのIGF1結合を遮断することにより、このモノクローナル抗体は、転移性ヒト乳癌細胞による内皮動員を阻害できる。IGFBP2に対する中和抗体の産生に用いる方法は、当該技術分野において一般に公知のものである。
要するに、マウスを組換えIGFBP2全ペプチドで免疫してポリクローナル抗体応答を生じさせた。次に、その免疫処置マウスから単離したB細胞の骨髄腫細胞系への融合により、ハイブリドーマライブラリーを産生させた。その後、これらのハイブリドーマからの上清を単離して、抗体捕捉競合ELISAアッセイを用いて、IGFBP2を高親和性で結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、同定した(図20)。同定したら、抗体捕捉競合ELISAアッセイを用いて、IGFBP2に対して高い親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングして、IGFBP2がIGF1を結合するのを阻害できる抗体を産生するものを同定した(図21)。ハイブリドーマライブラリーwo6663-1は、IGFBP2に結合してIGF1結合を中和する抗体であって、他のIGFBPファミリーメンバーIGFBP3およびIGFBP4には結合しない抗体を含有した(図20および21)。単一クローン(モノクローナル)ハイブリドーマ細胞を単離するために、ハイブリドーマライブラリーwo6663-1に対する分離およびスクリーニングを行った。2000個の単一ハイブリドーマクローン(モノクローナル)をこのライブラリーからスクリーニングして、高親和性でIGFBP2に結合してIGF1結合を中和するモノクローナル抗体を産生するものを同定した。図22中の表は、上のスクリーニングからの幾つかのモノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体IGFBP2_14(M14)(図22中の断続線囲み枠)を含めて、その多くがIGFBP2への親和性を有し、IGFBP2へのIGF1結合を阻害した(図22)モノクローナル抗体についての抗体捕捉ELISA競合因子アッセイデータを収載するものである。その後、トランスウェル内皮動員アッセイを用いて、これらのIGFBP2中和モノクローナル抗体をスクリーニングして、転移細胞による内皮動員を阻害できるものを同定した。モノクローナル抗体IGFBP2_M14(M14)は、ヒト転移性乳癌細胞による内皮動員を阻害した:
内皮動員を阻害し得るモノクローナル抗体を同定するために、上記スクリーニングで産生されたIGFBP2中和モノクローナル抗体を、トランスウェルを用いるインビトロ内皮動員アッセイで試験した。高転移性LM2ヒト乳癌細胞をボイデンチャンバーの底部に配置し、そこで多孔質トランスウェルインサートを通ってHUVECSを動員するそれらの能力をアッセイした。少量の生理濃度のIGFBP2中和抗体(M1、M4、M6、M9、M13、M14、M15およびM16を含む(図22から))をトランスウェルに生理濃度で個々に添加した。試験したすべての抗体のうち、M14(図22中の断続線囲み枠)は、陰性対照抗体IgGおよびM5に対してHUVEC細胞の動員(移動細胞/視野)を有意に阻害できた(移動細胞の50%低減)(図23)。これは、ヒト転移癌細胞によるヒト内皮細胞動員を阻害するモノクローナル抗体M14の能力を実証する(図23)。
Claims (3)
- 体組織の転移癌コロニー形成を調節するshRNA、siRNA、またはマイクロRNAを同定するための方法であって、
a)1つ以上のshRNA、siRNA、またはマイクロRNA分子を標識または非標識の開始癌細胞の集団に導入して、改変癌細胞の集団を産生させる段階であって、前記標識または非標識の開始癌細胞の集団が、セルライン、又は、非ヒト動物の生組織への癌細胞の集団の移植、単離そして反復移植の一連のラウンドを行う段階を含む方法に従って得られるものである、段階;
b)前記改変癌細胞の集団を非ヒト動物の身体の組織に移植する段階;
c)移植された細胞を単離して、単離された癌細胞の集団を得る段階;および
d)単離された癌細胞の集団におけるshRNA、siRNA、またはマイクロRNAの量を評定する段階
を含み、
単離された細胞の集団における前記shRNA、siRNA、またはマイクロRNAの量の、移植前のその量に対する減少が、前記shRNA、siRNA、またはマイクロRNAのターゲット遺伝子(単数または複数)が前記組織の転移コロニー形成に必要とされる遺伝子に相当することを示す方法。 - 体組織の転移癌コロニー形成を調節するshRNA、siRNA、またはマイクロRNAを同定するための方法であって、
a)shRNA、siRNA、またはマイクロRNAをコードしている1つ以上のDNA分子を標識または非標識の開始癌細胞の集団に導入して、改変癌細胞の集団を産生させる段階であって、前記標識または非標識の開始癌細胞の集団が、セルライン、又は、非ヒト動物の生組織への癌細胞の集団の移植、単離そして反復移植の一連のラウンドを行う段階を含む方法に従って得られるものである、段階;
b)前記改変癌細胞の集団を非ヒト動物の身体の組織に移植する段階;
c)移植された細胞を単離して、単離された癌細胞の集団を得る段階;および
d)単離された癌細胞の集団におけるshRNA、siRNA、またはマイクロRNAの量を評定する段階
を含み、
単離された細胞の集団における前記shRNA、siRNA、またはマイクロRNAの量の、移植前のその量に対する増加が、該shRNA、siRNA、またはマイクロRNAが前記組織の転移コロニー形成に必要とされることを示す方法。 - 前記評定段階が、マイクロアレイ分析、DNAシークエンシング技術、ディープシークエンシング技術またはクローニング分析を用いて行われる、請求項1または2に記載の方法。
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