CN111808938A - Atp6v0d2用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控 - Google Patents

Atp6v0d2用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ATP6V0D2用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控，具体地，本发明人发现ATP6V0D2在泡沫细胞模型以及动脉粥样硬化临床样本中都有显著的高表达，且表达水平与疾病进展程度及预后有着显著地相关性。因此囊泡型质子泵复合体V0亚基D2配体(ATP6V0D2)可以作为诊断标志物用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控。

Description

ATP6V0D2用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及囊泡型质子泵复合体V0亚基D2配体(ATP6V0D2)作为诊断标志物用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种以胆固醇等脂质代谢障碍为病变基础的慢性复杂性疾病。《中国心血管病报告2017》指出，中国心血管病(CVD)患病率处于持续上升阶段，其死亡率更是居于首位，高于肿瘤及其他疾病。农村CVD死亡率从2009年起超过并持续高于城市水平。2015年农村CVD死亡率为298.42/10万，其中心脏病死亡率为144.79/10万，脑血管病死亡率为128.23/10万；城市CVD死亡率264.84/10万，其中心脏病死亡率为136.61/10万，脑血管病死亡率为128.23/10万。2015年农村、城市CVD死亡占全部死因的比率分别为45.01％和42.61％。平均每5例死亡中有2例死于CVD，而AS正是引发各类心血管疾病的主要原因。
AS的特点表现为受累动脉病变从内膜开始，一般先有内皮损伤、脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，最终导致血栓形成、动脉壁增厚变硬、管腔狭窄。AS的病因及发病机制多样，主要包括内皮损伤、脂质代谢异常、血流动力学损伤、遗传、理化损伤等。尽管AS发病机制复杂，但大量研究表明血脂代谢异常，尤其是高胆固醇血症是促进AS发病的重要危险因素。血浆中过多的胆固醇沉积于动脉内皮下，促进大量泡沫细胞聚集及动脉粥样斑块病变形成，导致动脉管腔狭窄或斑块破裂后血栓栓塞动脉管腔以致心肌缺血坏死。因此，寻找通过调控胆固醇代谢从而防治AS发生发展的新靶点具有重要意义。
发明概述
本发明的目的是提供一种新的动脉粥样硬化生物标志物ATP6V0D2蛋白以及其片段、类似物和衍生物，在诊断和/或治疗动脉粥样硬化中的用途。
本发明第一方面提供了一种ATP6V0D2蛋白、其编码基因或其检测试剂的用途，用于制备诊断试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于：
(1)诊断或辅助诊断动脉粥样硬化，
(2)动脉粥样硬化的疗效监控，或者
(3)动脉粥样硬化的预后评价。
在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。
在另一优选例中，所述的ATP6V0D2蛋白包括ATP6V0D2全长蛋白或ATP6V0D2蛋白片段。
在另一优选例中，所述的ATP6V0D2蛋白、其编码基因来源于哺乳动物，更佳地来源于灵长动物和人。
在另一优选例中，所述诊断为组织样品检测或血清检测。
在另一优选例中，所述的ATP6V0D2蛋白偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述ATP6V0D2蛋白还包括ATP6V0D2蛋白的衍生物。
在另一优选例中，所述ATP6V0D2蛋白的衍生物包括经修饰的ATP6V0D2蛋白、氨基酸序列与天然ATP6V0D2蛋白同源且具有天然ATP6V0D2蛋白活性的蛋白分子、ATP6V0D2蛋白的二聚体或多聚体、含有ATP6V0D2蛋白氨基酸序列的融合蛋白。
在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然ATP6V0D2蛋白同源且具有天然ATP6V0D2蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与ATP6V0D2蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然ATP6V0D2蛋白活性的蛋白分子。
本发明第二方面提供了一种ATP6V0D2拮抗剂的用途，用于制备药物或组合物，所述药物或组合物用于预防或治疗动脉粥样硬化。
在另一优选例中，所述ATP6V0D2拮抗剂选自下组：
(a)降低或抑制ATP6V0D2的活性的物质；
(b)降低ATP6V0D2的表达或稳定性的物质。
另一优选例中，所述ATP6V0D2拮抗剂选自：抗体、多肽、sh-RNA、dsRNA、miRNA、siRNA、反义寡核苷酸、化合物或其组合。
在另一优选例中，所述ATP6V0D2拮抗剂选自：抗ATP6V0D2抗体，针对ATP6V0D2的反义寡核苷酸、siRNA或dsRNA，ATP6V0D2的化学抑制剂(化合物)。
在另一优选例中，所述药物或组合物用于预防或治疗心力衰竭、急性冠脉综合征患者或慢性冠心病。
本发明第三方面提供了一种检测动脉粥样硬化的方法，包括：
a)准备受试者测试样品；和
b)检测测试样品中ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平，并将检测结果与参比值进行比较，其中ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平显著高于参比值，表明受试者患有动脉粥样硬化，或患动脉粥样硬化的几率高于正常人群。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指测试样品的ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平E1与参比值E0之比≥1.12，较佳地≥1.15，更佳地≥1.2。
在另一优选例中，所述测试样品为血清样品。
在另一优选例中，所述参比值为正常血清中ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平。
在另一优选例中，所述检测步骤(b)包括通过RT-qPCR方法进行检测。
在另一优选例中，所述的检测步骤(b)包括使用抗ATP6V0D2蛋白的抗体进行检测。
在另一优选例中，检测步骤(b)通过免疫组化或酶联免疫反应法(ELISA法)实现。
在另一优选例中，所述抗ATP6V0D2蛋白的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体(如抗血清)。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
本发明第四方面提供了一种诊断试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)ATP6V0D2蛋白、或其编码基因；和/或
(b)抗ATP6V0D2蛋白抗体，或者，特异性扩增ATP6V0D2蛋白编码基因的引物或引物对；
以及标签或说明书；
其中，所述的组分(a)、(b)分别位于一个或多个不同的容器或位于同一容器中。
在另一优选例中，所述组分(a)可作为对照品或参照品。
在另一优选例中，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于：检测或诊断动脉粥样硬化。
本发明第五方面提供了一种筛选或确定预防和/或治疗动脉粥样硬化的潜在治疗剂的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达ATP6V0D2蛋白的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平L1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平L2；和
(b)将上一步骤所检测的L1、L2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗贫血或其相关疾病的潜在治疗剂；
其中，如果L1显著低于L2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗动脉粥样硬化的潜在治疗剂。
在另一优选例中，所述“显著低于”指L2/L1≥1.12,较佳地，≥1.15，更佳地，≥1.2。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述表达ATP6V0D2蛋白的细胞为平滑肌细胞。
在另一优选例中，在测试组和对照组中，在培养体系中添加Ox-LDL。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1:颈动脉内膜斑块组织中ATP6V0D2显著上调。
图2:ATP6V0D2的表达随Ox-LDL刺激时间的延长而升高。
发明详述
本发明经过广泛而深入的研究，发现了新的动脉粥样硬化诊断标志物，可用于动脉粥样硬化诊断或辅助性诊断、预后评价、或治疗。具体地，本发明人发现ATP6V0D2在泡沫细胞模型以及动脉粥样硬化临床样本中都有显著的高表达，且表达水平与疾病进展程度及预后有着显著地相关性。因此囊泡型质子泵复合体V0亚基D2配体(ATP6V0D2)可以作为诊断标志物用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“ATP6V0D2”“ATP6V0D2蛋白”、“ATP6V0D2多肽”或“动脉粥样硬化标志物ATP6V0D2”可互换使用，都指具有人ATP6V0D2蛋白氨基酸序列的蛋白或多肽。这些蛋白或多肽可以是分离的。
囊泡型质子泵复合体V0亚基D2配体(ATP6V0D2)是由ATP6V0D2基因编码的人类蛋白质，可表达于各种膜性细胞器的膜表面和各类细胞膜。其主要功能是介导质子转运，调控微环境酸化，进而影响细胞代谢和细胞增殖、迁移、修复等细胞学功能。在AS发生发展过程中，随着内皮细胞损伤、脂质沉积、泡沫细胞形成等病理改变的不断进展，ATP6V0D2的表达量逐步上升，而且其上调程度与疾病严重程度成正比，提示ATP6V0D2有望成为动脉粥样硬化早期诊断或疗效监控的血清标志物。
在本发明一个优选地实施方式中，ATP6V0D2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示：
Figure BDA0002023654730000051
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的ATP6V0D2蛋白或多肽”是指ATP6V0D2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化ATP6V0D2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人ATP6V0D2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人ATP6V0D2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“ATP6V0D2多肽”指具有人ATP6V0D2蛋白活性的SEQ ID NO.1序列的全长多肽或成熟多肽。该术语还包括具有与人ATP6V0D2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人ATP6V0D2蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人ATP6V0D2DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人ATP6V0D2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人ATP6V0D2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人ATP6V0D2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人ATP6V0D2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人ATP6V0D2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人ATP6V0D2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人ATP6V0D2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
Figure BDA0002023654730000061
Figure BDA0002023654730000071
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码ATP6V0D2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％或95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2或4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码ATP6V0D2蛋白的多核苷酸。
本发明的人ATP6V0D2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ATP6V0D2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ATP6V0D2多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人ATP6V0D2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人ATP6V0D2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人ATP6V0D2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人ATP6V0D2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选对抗ATP6V0D2蛋白功能的抗体、多肽或其它物质。
另一方面，本发明还包括对人ATP6V0D2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ATP6V0D2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ATP6V0D2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
抗人ATP6V0D2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人ATP6V0D2蛋白。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与ATP6V0D2蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白的抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
ATP6V0D2拮抗剂(如抗体和反义序列)可直接用于疾病的诊断或治疗，例如，用于AS的诊断和治疗。此外，还可联用其他治疗剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的ATP6V0D2蛋白的拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
本发明还涉及定量和定位检测人ATP6V0D2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人ATP6V0D2蛋白水平，可以用于诊断AS。
一种检测样品中是否存在ATP6V0D2蛋白的方法是利用ATP6V0D2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与ATP6V0D2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在ATP6V0D2蛋白。
ATP6V0D2蛋白的多核苷酸可用于ATP6V0D2蛋白相关疾病的诊断和治疗。编码ATP6V0D2蛋白的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用ATP6V0D2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测ATP6V0D2蛋白的转录产物。
本发明还提供了一种检测AS的试剂盒，它含有特异性扩增ATP6V0D2的引物对和/或ATP6V0D2特异性抗体。此外，还可含有特异性探针和/或PCR缓冲液等。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例
(1)细胞培养
复苏人主动脉平滑肌细胞(HASMC)(购自：ATCC；货号：
Figure BDA0002023654730000112
PCS-100-012TM)于细胞培养皿中，加入4ml完全培养基(DMEM培养基+10％胎牛血清)，置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)孵育培养。待细胞汇合度达80-90％后取出细胞，加入500μl胰酶消化细胞，于显微镜下观察细胞开始皱缩时，加入200μl胎牛血清终止消化，反复轻轻吹打细胞，使其从皿底脱落，转至15ml离心管，1300r/min离心5min，弃去上清，加入适量完全培养基重悬细胞，等量分装至2-4个新的细胞培养皿中，用完全培养基补足4ml/皿，继续于细胞培养箱中孵育培养。重复以上步骤，保持细胞正常传代，以备后续实验使用。
(2)细胞内总蛋白提取
将待处理的细胞从细胞培养箱中取出，弃去培养液，用PBS洗2遍，弃去PBS，加入80μl蛋白裂解液，使裂解液覆盖皿底，静置5min，待细胞被充分裂解后，用细胞刮刮下细胞，用加样枪吸取全部细胞悬液并转移至1.5ml EP管中，4℃、13000r/min离心3min，收集上清并转移至标记好的新1.5ml EP管中，定量后于-20℃保存待用。
(3)蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)
①制备分离胶及浓缩胶，体系如下表所示：
10％分离胶体系：
Figure BDA0002023654730000111
Figure BDA0002023654730000121
5％浓缩胶体系：
Figure BDA0002023654730000122
②将制备好的凝胶安装至垂直电泳槽中，在第一孔泳道中加入5μl marker指示剂，其余各孔泳道分别加入80μg蛋白样品(体积视各样品浓度而定)，接通电源，80V电泳20min，待蛋白样品处于积层胶与分离胶分界线，然后将电压调至120V，电泳1h，蛋白在电压作用下逐渐往下转移，并依次分离至不同水平位置。根据marker和蛋白分子大小，待所需蛋白达到可完全分离位置时，停止电泳。
③取出电泳槽中的凝胶，根据marker切下目的蛋白对应的条带，打开转膜夹，在转膜夹黑色面依次放上滤纸、凝胶条带、PVDF膜，滤纸，用钝性板水平在PVDF膜上来回轻轻按压以赶走里面的气泡，然后盖上转膜板白色板，转膜板的黑面对准转膜槽的黑面，转膜板的白面对着槽的红面。将转膜槽装满转膜液，使所有目的蛋白所在凝胶均浸泡在转膜液中，再将转膜槽置于冰水混合物中，打开电源，100V、70min，进行转膜。
④取出转膜后的条带，置于5％脱脂牛奶中，于摇床室温封闭2h。
⑤取出条带，用TBST清洗3次，每次5min。
⑥配制与目的蛋白的对应抗体，将条带放入抗体中溶液中，于4℃摇床慢速孵育过夜。
⑦取出条带，用TBST清洗3次，每次5min。
⑧根据一抗种属配制对应的二抗(稀释比例为1:5000-1:10000)，将条带移入二抗溶液中，室温摇床上缓慢孵育1h。
⑨取出条带，用TBST清洗3次，每次5min。
⑩在条带上滴加超敏发光液，于曝光仪中进行曝光并分析结果。
结果
(1)ATP6V0D2在人动脉内膜斑块组织中的表达显著上调。
分别取3例人颈动脉内膜斑块组织及3例正常颈动脉内膜组织进行基因芯片分析，寻找斑块组织与正常组织中差异表达的基因(信使RNA，即mRNA)，经检测共发现4230个在斑块组织中上调的mRNA及4128个下调的mRNA，其中ATP6V0D2的上调倍数达177.04，P<0.01。为表达上调前十的mRNA之一。(图1、表1)
表1
Figure BDA0002023654730000131
(2)氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)能够诱导平滑肌细胞中ATP6V0D2的表达上调
用50μg/ml Ox-LDL分别刺激平滑肌细胞(SMC)，于0h、6h、12h、24h后测定ATP6V0D2在SMC中的蛋白表达水平，结果表明ATP6V0D2的表达随Ox-LDL刺激时间的延长而升高(图2)。
(3)人血清样本中ATP6V0D2的表达水平
通过收集临床血清样本，将其分为心力衰竭患者组(HF组)，正常人组(NC组)，急性冠脉综合征病人组(ACS组)，慢性冠心病病人组(CCHD组)，经ELISA检测上述四组血清ATP6V0D2的表达，结果发现相比NC组，ATP6V0D2在HF及CCHD组中的表达明显上升，差异具有统计学意义，而在ACS组中，ATP6V0D2的表达升高则更为显著(表2)，说明ATP6V0D2在心力衰竭、急性冠脉综合征、慢性冠心病等动脉粥样硬化类疾病中具有显著高表达，提示ATP6V0D2对动脉粥样硬化具有一定的临床诊断价值，是其潜在的诊断检测指标。
表2
Figure BDA0002023654730000141
讨论
囊泡型质子泵复合体V0亚基D2配体(ATP6V0D2)能介导质子转运，调控人体内微环境酸化，进而影响细胞代谢和细胞增殖、迁移、修复等细胞学功能。本研究经基因芯片分析发现，动脉粥样硬化斑块组织中ATP6V0D2的表达较正常组织上调177.04倍，临床验证结果表明ATP6V0D2在心力衰竭患者、急性冠脉综合征患者及慢性冠心病患者血清中呈明显高表达，其中ATP6V0D2在急性冠脉综合征患者中的高表达尤为显著。此外，经基础研究发现，在平滑肌细胞中ATP6V0D2的蛋白表达随氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)刺激时间的延长而升高，提示ATP6V0D2参与介导Ox-LDL影响下的平滑肌源性泡沫细胞形成，从而影响细胞内胆固醇代谢、细胞迁移修复等过程，进而导致动脉粥样硬化的发生发展。
ATP6V0D2在泡沫细胞模型以及动脉粥样硬化临床样本中都有显著的高表达，且表达水平与疾病进展程度及预后有着显著地相关性。因此囊泡型质子泵复合体V0亚基D2配体(ATP6V0D2)可以作为诊断标志物用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 南方医科大学南方医院
<120> ATP6V0D2用于动脉粥样硬化的早期诊断或疗效监控
<130> 060002
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Leu Glu Gly Ala Glu Leu Tyr Phe Asn Val Asp His Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Glu Gly Leu Val Arg Gly Cys Lys Ala Ser Leu Leu Thr Gln Gln Asp
20 25 30
Tyr Ile Asn Leu Val Gln Cys Glu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile His
35 40 45
Leu Gln Thr Thr Asp Tyr Gly Asn Phe Leu Ala Asn His Thr Asn Pro
50 55 60
Leu Thr Val Ser Lys Ile Asp Thr Glu Met Arg Lys Arg Leu Cys Gly
65 70 75 80
Glu Phe Glu Tyr Phe Arg Asn His Ser Leu Glu Pro Leu Ser Thr Phe
85 90 95
Leu Thr Tyr Met Thr Cys Ser Tyr Met Ile Asp Asn Val Ile Leu Leu
100 105 110
Met Asn Gly Ala Leu Gln Lys Lys Ser Val Lys Glu Ile Leu Gly Lys
115 120 125
Cys His Pro Leu Gly Arg Phe Thr Glu Met Glu Ala Val Asn Ile Ala
130 135 140
Glu Thr Pro Ser Asp Leu Phe Asn Ala Ile Leu Ile Glu Thr Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Phe Phe Gln Asp Cys Met Ser Glu Asn Ala Leu Asp Glu Leu
165 170 175
Asn Ile Glu Leu Leu Arg Asn Lys Leu Tyr Lys Ser Tyr Leu Glu Ala
180 185 190
Phe Tyr Lys Phe Cys Lys Asn His Gly Asp Val Thr Ala Glu Val Met
195 200 205
Cys Pro Ile Leu Glu Phe Glu Ala Asp Arg Arg Ala Phe Ile Ile Thr
210 215 220
Leu Asn Ser Phe Gly Thr Glu Leu Ser Lys Glu Asp Arg Glu Thr Leu
225 230 235 240
Tyr Pro Thr Phe Gly Lys Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Arg Leu Leu Ala
245 250 255
Gln Ala Glu Asp Phe Asp Gln Met Lys Asn Val Ala Asp His Tyr Gly
260 265 270
Val Tyr Lys Pro Leu Phe Glu Ala Val Gly Gly Ser Gly Gly Lys Thr
275 280 285
Leu Glu Asp Val Phe Tyr Glu Arg Glu Val Gln Met Asn Val Leu Ala
290 295 300
Phe Asn Arg Gln Phe His Tyr Gly Val Phe Tyr Ala Tyr Val Lys Leu
305 310 315 320
Lys Glu Gln Glu Ile Arg Asn Ile Val Trp Ile Ala Glu Cys Ile Ser
325 330 335
Gln Arg His Arg Thr Lys Ile Asn Ser Tyr Ile Pro Ile Leu
340 345 350

Claims (10)

1.一种ATP6V0D2蛋白、其编码基因或其检测试剂的用途，用于制备诊断试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于：
(1)诊断或辅助诊断动脉粥样硬化，
(2)动脉粥样硬化的疗效监控，或者
(3)动脉粥样硬化的预后评价。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。
3.一种ATP6V0D2拮抗剂的用途，用于制备药物或组合物，所述药物或组合物用于预防或治疗动脉粥样硬化。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述ATP6V0D2拮抗剂选自下组：
(a)降低或抑制ATP6V0D2的活性的物质；
(b)降低ATP6V0D2的表达或稳定性的物质。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述ATP6V0D2拮抗剂选自：抗体、多肽、sh-RNA、dsRNA、miRNA、siRNA、反义寡核苷酸、化合物或其组合。
6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述ATP6V0D2拮抗剂选自：抗ATP6V0D2抗体，针对ATP6V0D2的反义寡核苷酸、siRNA或dsRNA，ATP6V0D2的化学抑制剂。
7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物或组合物用于预防或治疗心力衰竭、急性冠脉综合征患者或慢性冠心病。
8.一种检测动脉粥样硬化的方法，其特征在于，包括步骤：
a)准备受试者测试样品；和
b)检测测试样品中ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平，并将检测结果与参比值进行比较，其中ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平显著高于参比值，表明受试者患有动脉粥样硬化，或患动脉粥样硬化的几率高于正常人群。
9.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
(a)ATP6V0D2蛋白、或其编码基因；和/或
(b)抗ATP6V0D2蛋白抗体，或者，特异性扩增ATP6V0D2蛋白编码基因的引物或引物对；
以及标签或说明书；
其中，所述的组分(a)、(b)分别位于一个或多个不同的容器中。
10.一种筛选预防和/或治疗动脉粥样硬化的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达ATP6V0D2蛋白的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平L1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的ATP6V0D2蛋白、或其编码基因的水平L2；和
(b)将上一步骤所检测的L1、L2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗贫血或其相关疾病的潜在治疗剂；
其中，如果L1显著低于L2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗动脉粥样硬化的潜在治疗剂。
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