ES2647568T3 - Tratamiento de cáncer - Google Patents

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Abstract

Un antagonista de la alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para uso en el tratamiento de un cáncer que no depende de la vasculoproliferación para el crecimiento o que no es sensible al tratamiento con un agente antiangiogénico o antivasculoproliferativo, comprendiendo el antagonista un anticuerpo que se une con Lrg1, un ARN bicatenario que se dirige a ARN de Lrg1, un ARN antisentido que se dirige a ARN de Lrg1, un aptámero que se une con Lrg1 o un péptido o peptidomimético que compite con Lrg1 de longitud completa y por lo tanto bloquea la función de Lrg1.

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento de cáncer
Campo de la invención 5
La invención está en el campo de la fisiología molecular y se refiere al uso de antagonistas de la alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para uso en el tratamiento o la prevención de cáncer.
Antecedentes de la invención 10
El término cáncer se refiere a una amplia serie de crecimientos neoplásicos malignos, que pueden surgir de la transformación de muchos tipos celulares normales. El cáncer puede estar asociado con muchos cambios diferentes en los fenotipos celulares. Sin embargo, todos los cánceres implican crecimiento celular desregulado. Existen muchos tipos diferentes de fármacos antineoplásicos. Sin embargo, muchos de estos están asociados con efectos 15 secundarios indeseables, con frecuencia como resultado de la dirección no específica de células no cancerosas. Además, los fármacos convencionales que son más específicos de cáncer tienden a serlo para un número limitado de cánceres particulares.
Fármacos quimioterapéuticos convencionales tales como cisplatino actúan inhibiendo la mitosis. Estos agentes no 20 son, sin embargo, específicos de células cancerosas, sino que en su lugar afectarán a todas las células de división rápida. Por lo tanto, pueden verse con frecuencia afectadas inintencionadamente células no cancerosas pero de división rápida, tales como células que reemplazan el epitelio intestinal.
De forma similar, el efecto de agentes que bloquean la actividad del factor de crecimiento, tales como inhibidores de 25 tirosina quinasa tales como imatinib o anticuerpos para factores de crecimiento o sus receptores, no estará restringido a células neoplásicas. Agentes tales como interferón γ (IFNγ) e interleucina 2 (IL2), que pueden usarse para tratar cánceres de riñón, también pueden afectar a células no cancerosas.
La terapia hormonal es otro tratamiento de cáncer común. Este tipo de terapia solamente es adecuado para ciertos 30 cánceres, concretamente los que son sensibles a hormonas o dependientes de hormonas. Por ejemplo, el tamoxifeno bloquea el receptor de estrógenos y puede usarse en el tratamiento de cáncer de mama. Sin embargo, células no cancerosas que son sensibles a o dependientes de la dirección a hormonas también pueden verse afectadas por terapia hormonal, lo que conduce a efectos secundarios indeseables.
35
Otros agentes antineoplásicos, tales como anticuerpos monoclonales son más específicos, pero actúan solamente en un tipo de cáncer particular, por ejemplo, cáncer de mama, o incluso subgrupos particulares de un cáncer. Por ejemplo, trastuzumab (Herceptina) puede usarse solamente para tratar cáncer HER2 positivo, típicamente cánceres de mama o adenocarcinomas de estómago HER2 positivos. Un enfoque terapéutico alternativo ha sido dirigir al ambiente inmunosupresor localizado dentro del tumor mediante enfoques que incluyen terapia génica. 40
Adicionalmente, para ciertos cánceres, particularmente tumores sólidos, una vez que el cáncer crece más allá de un cierto tamaño, la difusión ya no es suficiente para proporcionar oxígeno y nutrientes para mantener el crecimiento. Estos tumores deben después desarrollar vasos sanguíneos, típicamente mediante angiogénesis, para satisfacer sus necesidades metabólicas. Por lo tanto, otros fármacos antineoplásicos convencionales incluyen agentes 45 antiangiogénicos que influyen en el desarrollo de la vasculatura tumoral, y de este modo limitan el crecimiento tumoral. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti VEGF bevacizumab (Avastin) es una terapia de cáncer antiangiogénica conocida.
Sin embargo, no todos los cánceres requieren el desarrollo de vasculatura tumoral para crecimiento continuado. Por 50 ejemplo los mielomas y las leucemias, aunque incluso aquí hay indicios de que la proliferación de células tumorales en la médula ósea puede ser sensible a antiangiogénicos. Además, incluso para cánceres que requieran el crecimiento de vasos sanguíneos, algunos tumores pueden no ser sensibles a la terapia antiangiogénica. Como alternativa, puede ser deseable dirigirse a múltiples procesos tales como angiogénesis tumoral, neoplasia y el sistema inmunitario simultáneamente para inducir un efecto antineoplásico mayor. 55
Existe por lo tanto la necesidad de identificar dianas terapéuticas alternativas y fármacos nuevos que, aislados o en combinación con terapias existentes, puedan ser más eficaces, adecuados para tratar una amplia serie de cánceres y poseer menos efectos fuera de la diana para el tratamiento del cáncer.
60
Sumario de la invención
Se identificó la alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina (identificadores génicos de Lrg1: HGNC: 29480; Entrez Gene: 116844; Ensembl: ENSG00000171236; UniProtKB: P02750) en 1977 (Haupt y Baudner, 1977) y su estructura primaria se determinó en 1985 (Takahashi et al, 1985). Lrg1 está altamente conservada evolutivamente entre 65 ratones y seres humanos, están disponibles en el mercado anticuerpos policlonales para Lrg1 humana y existen informes de aumentos simultáneos en el nivel de factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFβ1), receptor de TGFβ II (TGFβRII) y Lrg1 en ciertas enfermedades (Sun et al, 1995; Li et al, 1997). Otros grupos han identificado Lrg1 como un biomarcador de ciertas enfermedades (documentos US 2005/0064516, WO 2008/092214) y como un ligando para el citocromo c (documento US 2007/0184503). Lynch et al. (2012) demuestran que el microARN-335 (miR-335) se dirige a Lrg1 lo que conduce a migración e invasión reducida de células de neuroblastoma reduciendo 5 el estado de fosforilación de la cadena ligera de miosina (MLC).
Los presentes inventores han mostrado previamente que la alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina es una diana a la que puede dirigirse un fármaco para la modulación de remodelación vascular patógena. Por lo tanto, los inventores han predicho que el antagonismo de Lrg1 puede ser útil en el tratamiento de afecciones en las que se produce 10 remodelación vascular patógena o angiogénesis patógena, particularmente en el ojo en afecciones tales como AMD neovascular, retinopatía diabética y retinopatía del prematuro (documento WO 2011/027129). Sin embargo, los inventores han descubierto ahora que Lrg1 tiene un efecto directo en células neoplásicas así como función de células inmunitarias, y por lo tanto puede usarse como una diana en el tratamiento y/o la prevención de cáncer afectando directamente a estas células. 15
Los presentes inventores han identificado ahora Lrg1 como una diana a la que puede dirigirse un fármaco para el tratamiento y/o prevención de cáncer. En particular, los inventores han demostrado que la dirección a Lrg1 tiene un efecto directo en células neoplásicas, y por lo tanto la dirección Lrg1 también puede usarse para tratar y/o prevenir cáncer por este efecto directo en células cancerosas, específicamente regulando negativamente la proliferación de 20 células neoplásicas, en lugar de mediante un efecto en la vascularización tumoral. También han descubierto que Lrg1 modifica propiedades de células inmunitarias que contribuyen al ambiente prooncogénico.
Los inventores han investigado previamente la relación entre Lrg1 y la ruta de señalización de TGFβ.
25
En células endoteliales puede producirse señalización de TGFβ mediante asociación del receptor de TGFβ II con el receptor de TGFβ de tipo I ubicuo quinasa de tipo receptor de activina 5 (ALK5) o con ALK1, o con ALK5 y ALK1 juntos, dependiendo la respuesta celular de qué ruta predomine. En el caso de ALK5 hay, en ciertas condiciones, deposición de ECM aumentada y quiescencia celular mientras que con ALK1 hay activación de células endoteliales manifestada como migración y proliferación aumentadas. Esta señalización diferencial está controlada parcialmente 30 por la concentración/biodisponibilidad de TGFβ, moléculas accesorias tales como endoglina y betaglucano y por miembros de una familia de proteínas efectoras corriente abajo denominadas Smad, en las que Smad 2 y 3 están activadas por ALK5 y Smad 1, 5 y 8 por ALK1. Como alternativa, la activación del receptor de TGFβ puede activar una ruta no canónica que implica rutas de señalización tales como GTPasa Rho y las MAP quinasas.
35
Un grupo adicional de proteínas que se sabe que es importante en cáncer son las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP) y sus receptores, los receptores de proteína morfogenética del hueso (BMPR). Pueden reclutarse quinasas de tipo receptor de activina (ALK) a complejos BMP/BMPR para mediar en la señalización dentro de células neoplásicas. Los inventores han demostrado que Lrg1 efectúa señalización de BMP.
40
Los inventores han demostrado previamente que Lrg1 forma un complejo con TGFβRII, ALK5 y ALK1 lo que sugiere que Lrg1 tiene un papel en la mediación de la formación de este complejo receptor y conducción de señalización por la ruta de ALK1/Smad 1, 5 y 8 (documento WO 2011/027129). Uno de los mecanismos mediante los cuales se consigue esto es mediante unión de Lrg1 directamente con la molécula accesoria endoglina que promueve la formación del complejo receptor posterior. Por lo tanto, los inventores han planteado previamente la hipótesis de que 45 Lrg1 actúa como un modulador de la señalización de TGFβ, provocando ajuste entre las cascadas de señalización activadas por ALK1 y ALK5.
Se sabe que TGFβ desempeña un papel en el desarrollo de cáncer. Durante los estadios tempranos de la progresión tumoral la ruta de TGFβ es predominantemente supresora. Sin embargo, las células tumorales son 50 capaces de cambiar su respuesta a TGFβ de modo que promueva la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT), invasión tumoral, diseminación metastásica y evasión del sistema inmunitario (Meulmeester y ten Dijke., 2011). Esto se conoce como el cambio de TGFβ. Aunque sin quedar ligado a esta teoría, los inventores plantean la hipótesis de que la regulación positiva de Lrg1 en células neoplásicas provoca una alteración en su respuesta a señalización de TGFβ que da como resultado un cambio de un estímulo supresor a uno oncogénico. 55
De hecho, en células endoteliales los inventores han descubierto que Lrg1 potencia la acción mitógena de TGFβ. Por lo tanto, las células endoteliales cerebrales de ratones Lrg1-/- proliferaron más lentamente que las de animales WT. La adición de TGFβ1 potenció significativamente la proliferación de células endoteliales de animales WT pero inhibió el crecimiento de células de ratones Lrg1-/-, supuestamente mediante señalización de ALK5-Smad2/3 60 potenciada en ausencia de activación de la ruta de ALK1-Smad1/5/8. La adición de Lrg1 por sí sola no tuvo ningún efecto, pero cuando se añadieron tanto TGFβ1 como Lrg1 la proliferación celular aumentó significativamente en células tanto WT como nulas para Lrg1. Estas observaciones se basaron adicionalmente en estudios que mostraban que la sobreexpresión de Lrg1 en la línea celular endotelial cerebral GPNT condujo a aumento de la fosforilación de Smad1/5 y potenciación de la proliferación celular mediada por TGFβ1, mientras que la atenuación de Lrg1 con 65 ARNip dio como resultado reducción de la fosforilación de Smad1/5 y reducción de la división celular. Esto implica que Lrg1 potencia las propiedades mitógenas de TGFβ. En apoyo de Lrg1 que desempaña un papel en neoplasia, la exploración de publicaciones de cáncer y bases de datos (Tabla 1) muestra que la expresión de genes y proteínas de Lrg1 aumenta frecuentemente en tumores tales como ovárico, de mama, de pulmón y de próstata.
Además de ser prooncogénico, también se sabe que TGFβ es inmunosupresor en el ambiente tumoral lo que evita la 5 inmunidad antitumoral que apoya el crecimiento y la supervivencia de tumores (Flavell et al., 2010). Aunque sin quedar ligado a esta teoría, los inventores también plantean la hipótesis de que la regulación positiva de Lrg1 en el ambiente tumoral da como resultado un cambio en la señalización de TGFβ en células inmunitarias lo que provoca un desplazamiento de las respuestas inmunitarias antitumorales a supresión inmunitaria (mediante mecanismos tales como bloqueo de células T proinflamatorias, regulación positiva de células inmunitarias reguladoras incluyendo 10 Treg y macrófagos reguladores, lo que induce anergia o regulación positiva de mecanismos tolerogénicos y promoción de la muerte celular inducida por activación).
Los inventores han mostrado que en varios tumores (por ejemplo de mama y glioma) la expresión de Lrg1 está regulada positivamente en gran medida (Figura 1b) y se expresa en la línea celular tumoral de pulmón de Lewis de 15 ratón LL/2 y línea celular de melanoma de ratón B16/F10 (Figura 1a, panel inferior). Cuando estas líneas celulares se injertan por vía subcutánea en ratones C57BL/6 de tipo silvestre y ratones con inactivación de Lrg1 en el mismo fondo la tasa de crecimiento de los tumores se inhibe significativamente en estos últimos (Figura 1a, gráficas). Estas observaciones sugieren que Lrg1 media en un cambio en la respuesta celular tumoral a TGFβ de ser supresora a ser prooncogénica. En apoyo de esto, los inventores han demostrado que un anticuerpo de bloqueo de Lrg1 da 20 como resultado una reducción significativa del tamaño de colonias de células de carcinoma de pulmón de Lewis murino (LL/2) cultivadas en suspensión en un gel de agarosa (Figura 2).
Esta idea está apoyada además por la visión emergente de que la señalización por TGFβ puede producirse a través del eje TGFβRII/ALK5/ALK2/3-Smad1/Smad5. Por lo tanto, informes recientes muestran que en diversas células 25 epiteliales TGFβ puede activar Smad1 y Smad5 a través de una ruta independiente de BMP que implica ALK2 y/o ALK3 con ALK5 (Daly et al., 2008).
Los inventores han mostrado que, además de células LL/2, otras líneas celulares secretan Lrg1 incluyendo la línea celular mamaria humana MCF10A, la línea celular de carcinoma de pulmón epitelial humano A549 y la línea celular 30 de adenocarcinoma mamario humano MDA MB 468 (Tabla 2). Además, las células MCF10A y A549 también expresan el receptor accesorio endoglina con el que se ha mostrado que se une Lrg1 directamente.
Además, los inventores han presentado pruebas que muestran que Lrg1 puede inducir señalización de TGFβ tanto canónica como no canónica en estas células. Por lo tanto, han mostrado que Lrg1, en ausencia de ALK1, induce 35 fosforilación de Smad 1/5 en células MDA MB 468 (Figura 4a) y fosforilación de cadena ligera de miosina (en Thr18/Ser19), indicativa de activación de Rho/Rho quinasa, en células MCF10A (Figura 4b) y A549 (Figura 4c). Lrg1 también tiene un efecto en la migración celular. Por lo tanto, en células epiteliales MCF10A la adición de Lrg1 exógena provoca un aumento significativo de la migración celular como se determina por el ensayo de arañazo de heridas (Figura 5a) y una pérdida de direccionalidad de migración celular (Figura 5b) medida durante un ensayo de 40 lapso de tiempo de 5 h.
Habiendo generado anticuerpos monoclonales de ratón contra Lrg1 humana los inventores muestran que uno de estos anticuerpos inhibió significativamente la tasa de proliferación de la línea celular de carcinoma de pulmón epitelial humano A549 (Figura 3). Sin embargo un anticuerpo monoclonal de ratón anti Lrg-1 secundario, aunque 45 reconoce Lrg1, no provocó ninguna reducción significativa en la proliferación de células A549. Esto establece el potencial de bloqueo de la actividad de Lrg1 en el tratamiento del cáncer.
En el sistema inmunitario los inventores han mostrado también que la expresión del factor de transcripción asociado a Th17 RORγt en células T CD4 después de la activación de células T durante 5 días con estimulación anti 50 CD3/CD28 se inhibe significativamente en presencia de Lrg1 (Figura 6). Esto demuestra que entre otros efectos moduladores inmunitarios Lrg1 tiene la capacidad de inducir la supresión de células T proinflamatorias. De hecho, se ha propuesto que en ciertas condiciones las células Th17 pueden ser antitumorigénicas y su regulación negativa en tumores puede apoyar la supervivencia y expansión de células tumorales (Zou y Restifo., 2010).
55
Además, en células mononucleares de sangre periférica humana Lrg1 induce una población de células CD14/CD11b que expresan el receptor accesorio de TGFβ endoglina que es un receptor importante de Lrg1 (Figura 7) y que altera la señalización de TGFβ y la función celular.
Los inventores han mostrado que los monocitos tratados con Lrg1 expresan mucho menos HLA-DR que los 60 controles (Figura 8). Esto es importante para el cáncer porque los macrófagos asociados a tumor (TAM) que expresan MHC de clase II bajo son inmunosupresores y promueven la angiogénesis tumoral. También es notable que en un estudio de perfiles génicos que investigaba genes expresados diferencialmente en TAM, se descubrió que Lrg1 estaba regulado positivamente (Schmieder et al., 2011). Una proporción pequeña de TAM también expresa Tie2 y bajos niveles de MHC de clase II, los denominados macrófagos que expresan Tie2 (TEM) y se ha descubierto 65 que la supresión de TEM mejora en gran medida la eficacia de la terapia tumoral (Welford et al, 2011). Los inventores proporcionan datos que demuestran que el fenotipo de macrófago ENG
Lrg1 es una diana potencialmente superior a las de agentes antineoplásicos convencionales. No solamente se expresa en muchas células cancerosas, aumentando su especificidad, sino que también se expresa por numerosos 5 tipos diferentes de células neoplásicas, lo que sugiere que puede ser una diana eficaz en el tratamiento de una amplia serie de cánceres. Un atractivo adicional de Lrg1 como diana es que es extracelular y por lo tanto se accede a él más fácilmente mediante vías terapéuticas sistémicas.
En consecuencia, la invención se define en las reivindicaciones y proporciona: 10
un antagonista de alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para uso en el tratamiento de un cáncer que no depende de la vasculoproliferación para su crecimiento o que no es sensible al tratamiento con un agente antiangiogénico o antivasculoproliferativo, comprendiendo el antagonista un anticuerpo que se une con Lrg1, un ARN bicatenario que se dirige a ARN de Lrg1, un ARN antisentido que se dirige a ARN de Lrg1, un aptámero que 15 se une con Lrg1, o un péptido o peptidomimético que compite con Lrg1 de longitud completa y por lo tanto bloquea la función de Lrg1.
El antagonista actúa preferentemente en células no vasculares. En una realización preferida, el efecto del antagonista de la invención en células neoplásicas es la regulación negativa de la proliferación de células 20 neoplásicas, y puede tener al menos un efecto adicional en células neoplásicas seleccionado de regulación negativa de la migración de células neoplásicas, regulación negativa de interacciones célula-célula entre células neoplásicas, regulación negativa de la expresión de genes neoplásicos por células neoplásicas y bloqueo del cambio de TGFβ de un factor anti a uno prooncogénico para células neoplásicas.
25
El efecto del antagonista de Lrg1 de la invención en las células neoplásicas también puede seleccionarse de regulación negativa de migración de células neoplásicas, regulación negativa de interacciones célula-célula entre células neoplásicas, regulación negativa de la expresión de genes neoplásicos por células neoplásicas y bloqueo del cambio de TGFβ de un factor anti a uno prooncogénico para células neoplásicas.
30
La invención proporciona además un antagonista de alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para su uso de acuerdo con la invención, en el que el método de tratamiento del cáncer es mediante un efecto en la función de células inmunitarias en el ambiente tumoral. El antagonista de Lrg1 puede reducir el porcentaje de células CD14 positivas CD11b positivas dentro de una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en comparación con un control en el que no se administra el antagonista y/o puede aumentar el porcentaje de linfocitos 35 T CD4 RORγt positivos en comparación con un control en el que no se administra el antagonista.
El antagonista de Lrg1 de acuerdo con la invención puede bloquear la interacción entre Lrg1 y el Receptor de TGFβ II (TGFβRII) y/o Lrg1 y TGFβ y/o Lrg1 y una quinasa de tipo receptor de activina (ALK) y/o Lrg1 y endoglina, y/o Lrg1 y betaglucano, y/o Lrg1 y una proteína morfogenética del hueso (BMP), y/o Lrg1 y un receptor de proteína 40 morfogenética del hueso (BMPR), y/o una ALK y BMPR en señalización de TGFβ o BMP, y/o Lrg1 y receptor de tipo activina II (ACVRII), y/o endoglina y ALK, y/o ALK y BMPR, y/o ALK y TGFβRII. El bloqueo por un antagonista de Lrg1 de la invención puede reducir la interacción entre endoglucano y Lrg1 y modula de este modo la interacción entre la ALK y el receptor de TGFβ II (TGFβRII) y/o reduce la interacción entre betaglucano y la Lrg1, y de este modo modula la interacción entre la ALK y TGFβRII y/o altera la formación de complejo de BMP, BMPR y ALK, o la 45 señalización por dicho complejo, y/o altera la señalización de TGFβ no canónica, y/o altera la formación de un complejo de BMP, ACVRII y ALK, o la señalización por dicho complejo.
El antagonista de Lrg1 es para uso en el tratamiento de un cáncer que no depende de la vasculoproliferación para su crecimiento o que no es sensible a tratamiento con un agente antiangiogénico o antivasculoproliferativo. 50
Los antagonistas de Lrg1 para uso de acuerdo con la invención pueden ser para uso en combinación con otro producto terapéutico antineoplásico, que se selecciona opcionalmente de un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento y un anticuerpo monoclonal antineoplásico.
55
El antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con la invención puede ser para uso en combinación con un compuesto antiangiogénico, que se selecciona opcionalmente de un antagonista de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un antagonista de angiopoyetina, un antagonista de factor de crecimiento placentario (PLGF), un antagonista de endoglina, un antagonista de CD160 o un antagonista de quinasa de tipo receptor de activina 1 (ALK1), y preferentemente dicho antagonista de VEGF es un anticuerpo anti VEGF. 60
Se desvela un método para identificar un antagonista de Lrg1 de la invención que comprende:
(a) proporcionar un antagonista candidato y
65
(b) determinar si dicho antagonista candidato bloquea o no el efecto directo de Lrg1 en células neoplásicas;
en el que dicho antagonista candidato se identifica como un antagonista de Lrg1 si se observa bloqueo del efecto de Lrg1 en células neoplásicas.
El antagonista de la Lrg1 puede bloquear opcionalmente la interacción entre endoglina y Lrg1, y/o Lrg1 y Receptor de TGFβ II (TGFβRII), y/o Lrg1 y una quinasa de tipo receptor de activina (ALK), y/o Lrg1 y TGFβ, y/o Lrg1 y 5 betaglucano, y/o Lrg1 y una proteína morfogenética del hueso (BMP) y/o Lrg1 y un receptor de proteína morfogenética del hueso (BMPR), y/o ALK y BMPR, y/o Lrg1 y receptor de tipo activina II (ACVRII), y/o endoglina y ALK, y/o ALK y BMPR, y/o ALK y TGFβRII.
Se desvela el uso de un antagonista de Lrg1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la 10 prevención de cáncer por un efecto en células neoplásicas.
Se desvela un método de tratamiento de cáncer por un efecto en células neoplásicas que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de Lrg1.
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Se desvela el uso de un antagonista de Lrg1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer por un efecto en la función de células inmunitarias en el ambiente tumoral.
Se desvela un método de tratamiento de cáncer por un efecto en la función de células inmunitarias en el ambiente tumoral que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de Lrg1. 20
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Crecimiento de tumores de ratón LL/2 (gráfica superior) y B16/F10 (gráfica inferior) injertados por vía subcutánea en ratones de tipo silvestre y Lrg1-/-. Panel inferior: transferencia de western de Lrg1 de medio 25 acondicionado de líneas celulares LL/2 y B16/F10. b) Secciones histológicas de tejido de mama humano normal (superior) y canceroso (inferior) teñido con respecto a Lrg1.
Figura 2. El bloqueo de Lrg1 con un anticuerpo policlonal anti Lrg1 redujo el tamaño de las colonias de LL/2 en un gel de agarosa. Se suspendieron células LL/2 a 6,7x104 células/ml en agarosa 0,5 % compuesta en DMEM 30 complementado con FCS 10 % en presencia de IgG 500 nM, anti Lrg1 500 nM o ninguno. La suspensión se sembró en pocillos que se recubrieron con agarosa 1 % compuesta en DMEM. Se añadió medio y tratamiento correspondiente sobre la suspensión semisólida y se cambió semanalmente. El tamaño de las colonias se analizó después de 20 días usando software ImageJ.
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Figura 3. La adición de un anticuerpo anti Lrg1 monoclonal, pero no un segundo anticuerpo monoclonal, dio como resultado una reducción significativa en la proliferación de la línea celular de carcinoma epitelial de pulmón humano A549 como se evalúa por el ensayo de MTT (n ≥ 3). Las células se cultivaron en DMEM que contenía FCS 10 % durante 5 días, con un cambio de medio el día 3.
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Figura 4. Lrg1 induce rutas de señalización de TGFβ canónicas y no canónicas en líneas celulares epiteliales derivadas de tumor y normales. Las células se privaron de suero durante una noche y se trataron después con TGFβ 5 ng/ml o Lrg1 200 ng/ml, ambos en combinación o ninguno para a, b) 60 minutos o c) 10 minutos al día siguiente, antes de lisar las células para análisis por transferencia western. a) Lrg1 induce fosforilación de Smad 1/5 en la línea celular de adenocarcinoma mamario humano MDA MB 468. b) Lrg1 induce fosforilación de 45 Thr18/Ser19 de cadena ligera de miosina (MLC) en la línea celular epitelial mamaria humana MCF10A. c) Lrg1 induce fosforilación de Thr18/Ser19 de cadena ligera de miosina (MLC) en la línea celular de carcinoma epitelial de pulmón humano A549. El histograma muestra semicuantificación de transferencia de western (n = 3) usando software ImageJ.
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Figura 5. Invasión y direccionalidad de células epiteliales mamarias humanas MCF10A en presencia de TGFβ 5 ng/ml o Lrg1 200 ng/ml, ambos en combinación o ninguno. a) Se dejaron células MCF10A confluyentes durante una noche en medio de tratamiento apropiado. Se generaron heridas de “arañazo” usando una punta de pipeta estéril para raspar la monocapa celular. Se añadió sobre ellas medio nuevo con condiciones de tratamiento correspondientes. Se midió el análisis de tamaño normalizado de arañazo durante 25 h usando ImageJ. La 55 adición de Lrg1 induce un aumento significativo en la tasa de cierre de una herida de arañazo a través de una monocapa de células MCF10A. La adición simultánea de TGFβ invierte el efecto (n = 3). b) Se sembraron células MCF10A a 1x104 células/ml. Al día siguiente se trataron con los factores apropiados. Se capturaron imágenes de pistas celulares por lapso temporal cada 15 minutos y se analizaron usando software ImageJ, siendo la direccionalidad una medida de la distancia desde el origen/distancia acumulada. Lrg1 provoca una reducción 60 significativa en la direccionalidad de migración de células MCF10A (n = 3).
Figura 6. Expresión del factor de transcripción asociado a Th17 RORγt en la población de células T CD4 después de la activación de linfocitos T durante 5 días con estimulación anti CD3/CD28 en ausencia y presencia de Lrg1 200 ng/ml. 65
Figura 7. Inducción de Lrg1/TGFβ de una población de células monocíticas CD14/CD11b positivas, endoglina positivas (región encuadrada) en células mononucleares periféricas humanas. a) células no tratadas. b) Después del tratamiento de 4 días con TGFβ 5 ng/ml. c) Después de 4 días de tratamiento con Lrg1 200 ng/ml y d) después de 4 días de tratamiento con TGFβ 5 ng/ml + Lrg1 200 ng/ml.
5
Figura 8. a) Expresión de HLA-DR en monocitos humanos tratados durante 48 h con medio solamente, TGFβ1, Lrg1 o TGFβ1 + Lrg1. b) Comparación de poblaciones de HLADRhi y HLADRlo en macrófagos CD14+ después de 48 h. NT: sin tratamiento; L; Lrg-1; T: TGFβ1; L+T: Lrg-1+ TGFβ1. c) La población de CD14+ HLADRlo en presencia de la Lrg1 a las 48 h es endoglina (CD105) positiva (línea continua). Control de isotipo (línea discontinua). d) La población de CD14+ HLADR10 en presencia de Lrg1 a las 48 h es TIE2 positiva (línea 10 continua). Control de isotipo (línea discontinua).
Descripción detallada de la invención
Bloqueo de Lrg1 15
Los antagonistas de la invención bloquean la función de Lrg1. El bloqueo de Lrg1 abarca cualquier reducción en su actividad o función que dé como resultado un efecto entre las neoplásicas o en un efecto en la función celular inmunitaria en el ambiente tumoral. Los efectos en células neoplásicas incluyen regulación negativa de la proliferación de células neoplásicas, regulación negativa de la migración de células neoplásicas y/o direccionalidad 20 de la migración, modulación de interacciones célula-célula entre células neoplásicas, regulación negativa de la expresión de genes neoplásicos y bloqueo del cambio de TGFβ de un factor anti a uno prooncogénico para células neoplásicas. El bloqueo de Lrg1 puede inhibir la señalización de TGFβ canónica y/o no canónica inducida por Lrg1. Por ejemplo, los antagonistas de la invención pueden bloquear la fosforilación de Smad 1/5 independiente de ALK1 mediada por Lrg1, fosforilación de cadena ligera de miosina mediada por Lrg1 y/o activación de Rho/Rho quinasa 25 mediada por Lrg1. En una realización preferida, el efecto en células neoplásicas es la regulación negativa de la proliferación de células neoplásicas. Los efectos en la función de células inmunitarias en el ambiente tumoral incluyen reducción del porcentaje de células CD14 positivas CD11b positivas dentro de una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y aumento del porcentaje de células T CD4 RORγt positivas. Los antagonistas de la invención también pueden bloquear una reducción mediada por Lrg1 en expresión del MCH de 30 clase II en monocitos y macrófagos, particularmente macrófagos asociados a tumor (TAM). En particular, los antagonistas de la invención pueden bloquear una reducción mediada por Lrg1 en la expresión de HLA-DR. Los antagonistas de la invención también pueden bloquear un aumento mediado por Lrg1 en la expresión de Tie2 en TAM, particularmente macrófagos que expresan Tie2 (TEM).
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Por ejemplo, el bloqueo de Lrg1 puede ser mediante bloqueo de su interacción con endoglucano, betaglucano, una quinasa de tipo receptor de activina (ALK), receptor de tipo activina II (ACVRII), TGFβRII y/o TGFβ. El bloqueo de Lrg1 también puede dar como resultado biodisponibilidad reducida de TGFβ. El bloqueo de Lrg1 puede implicar el bloqueo de la interacción entre ALK-BMP, ALK-BMPR, endoglina-ALK y/o ALK-TGFβRII. El BMPR es preferentemente BMPRII. 40
El bloqueo abarca reducción tanto total como parcial de la actividad o función de Lrg1, por ejemplo prevención total o parcial de las interacciones endoglina-Lrg1, betaglucano-Lrg1, ALK-Lrg1, TGFβRII-Lrg1, ACVRII-Lrg1 y/o TGFβ-Lrg1. El bloqueo abarca la reducción tanto total como parcial de la actividad o función de la Lrg1, por ejemplo prevención total o parcial de la interacción entre ALK-BMP, ALK-BMPR, endoglina-ALK y/o ALK-TGFβRII. Por 45 ejemplo, un antagonista de bloqueo de la invención puede reducir la actividad de Lrg1 en del 10 al 50 %, al menos 50 % o al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %.
El bloqueo de la actividad o función de Lrg1 puede medirse por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, el bloqueo de la interacción de endoglina-Lrg1, betaglucano-Lrg1, ALK-Lrg1, ACVRII-Lrg1, TGFβRII-Lrg1, TGFβ-Lrg1, ALK-50 BMP, ALK-BMPR, endoglina-ALK y/o ALK-TGFβRII puede determinarse midiendo la inhibición de la fosforilación de intermedios de señalización corriente abajo. Estos intermedios de señalización corriente abajo pueden seleccionarse de moléculas de señalización canónicas tales como los factores de transcripción de Smad o moléculas de señalización no canónicas tales como MAP quinasas, PI3K, Rho GTPasa y PKC. El BMPR es preferentemente BMPRII. 55
El bloqueo de Lrg1 también puede medirse mediante ensayos que miden uno de los efectos del bloqueo de Lrg1. Por ejemplo, pueden usarse estudios de proliferación y/o migración. Puede usarse crecimiento independiente de anclaje como una medida de la tumorigenicidad. El bloqueo de Lrg1 también puede evaluarse usando ensayos in vivo tales como los que miden la tasa de crecimiento tumoral en modelos animales en los que puede conseguirse 60 inducción tumoral mediante administración de agentes promotores de tumores tales como forbol éster, mediante injerto de líneas celulares tumorales o en modelos animales de tumorigénesis tales como el ratón RIP-Tag.
El bloqueo puede tener lugar mediante cualquier mecanismo adecuado, dependiendo por ejemplo de la naturaleza (véase posteriormente) del antagonista usado, por ejemplo interferencia estérica en cualquier interacción directa o 65 indirecta de endoglina-Lrg1, betaglucano-Lrg1, ALK-Lrg1, ACVRII-Lrg1, TGFβRII-Lrg1 TGFβ-Lrg1, ALK-BMP, ALK-BMPR, endoglina-ALK y/o ALK-TGFβRII o atenuación de la expresión de Lrg1.
Antagonistas de Lrg1
Puede usarse cualquier antagonista adecuado de acuerdo con la invención, por ejemplo péptidos y 5 peptidomiméticos, anticuerpos, inhibidores de moléculas pequeñas, ARN bicatenario y antisentido, aptámeros y ribozimas. Los antagonistas preferidos incluyen fragmentos peptídicos de Lrg1, ARN bicatenario, aptámeros y anticuerpos.
Péptidos 10
Los antagonistas peptídicos serán típicamente fragmentos de Lrg1 que compiten con Lrg1 de longitud completa por la unión con TGFβRII, TGFβ, endoglina, betaglucano, BMP, BMPR y/o una quinasa de tipo receptor de activina (ALK) y por lo tanto antagonizan Lrg1. Dichos péptidos pueden ser lineales o cíclicos. Los antagonistas peptídicos serán típicamente de 5 a 50, preferentemente 10-40, 10-30 o 15-25 aminoácidos de longitud y serán generalmente 15 idénticos a las secuencias contiguas de dentro de Lrg1 pero pueden tener menos de 100 % de identidad, por ejemplo 95 % o más, 90 % o más u 80 % o más, siempre que conserven propiedades de bloqueo de Lrg1. Pueden identificarse péptidos de bloqueo de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante exploración sistémica de péptidos contiguos o solapantes que abarcan parte de o toda la secuencia de Lrg1. También pueden diseñarse peptidomiméticos que imiten dichos péptidos de bloqueo. 20
Un antagonista peptídico de acuerdo con la invención puede ser un fragmento de Lrg1 que tiene la secuencia de L1-24 del Apéndice 1 o L94-117 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 1 o L262-285 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 1 o L320-345 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 5) de Lrg1 o una parte de una cualquiera de estas secuencias. Como alternativa, el anticuerpo de péptido de la invención puede comprender una 25 secuencia de aminoácidos de otra región de Lrg1, o una parte de la misma.
ARN bicatenario
Usando técnicas conocidas y basadas en un conocimiento de la secuencia de Lrg1, pueden diseñarse moléculas de 30 ARN bicatenario (ARNbc) para antagonizar Lrg1 por dirección basada en homología de secuencia de ARN de Lrg1. Dichos ARNbc serán típicamente ARN de interferencia pequeños (ARNip), habitualmente en una configuración de tallo-bucle (“en horquilla”) o micro ARN (miARN). La secuencia de dichos ARNbc comprenderá una parte que corresponde a la de una parte del ARNm que codifica Lrg1. Esta parte será habitualmente 100 % complementaria de la parte diana dentro del ARNm de Lrg1 pero también pueden usarse niveles menores de complementariedad (por 35 ejemplo, 90 % o más o 95 % o más).
ARN antisentido
Usando técnicas conocidas y basadas en un conocimiento de la secuencia de Lrg1, pueden diseñarse moléculas de 40 ARN antisentido monocatenario para antagonizar Lrg1 por dirección basada en homología de secuencia de ARN de Lrg1. La secuencia de dicho antisentido comprenderá una parte que corresponde a la de una parte del ARNm que codifica Lrg1. Esta parte será habitualmente 100 % complementaria de la parte diana dentro del ARNm de Lrg1 pero también pueden usarse niveles menores de complementariedad (por ejemplo 90 % o más o 95 % o más).
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Aptámeros
Los aptámeros son en general moléculas de ácido nucleico que se unen con una molécula diana específica. Los aptámeros pueden modificarse técnicamente completamente in vitro, se producen fácilmente por síntesis química, poseen propiedades de almacenamiento deseables e inducen poca o ninguna inmunogenicidad en aplicaciones 50 terapéuticas. Estas características los hacen particularmente útiles en utilidades farmacéuticas y terapéuticas.
Como se usa en el presente documento, “aptámero” se refiere en general a un oligonucleótido mono o bicatenario o una mezcla de dichos oligonucleótidos, en los que el oligonucleótido o mezcla es capaz de unirse específicamente con una diana. Se analizarán en el presente documento aptámeros de oligonucleótidos, pero el experto en la materia 55 apreciará que pueden usarse otros aptámeros que tengan características de unión equivalentes, tales como aptámeros peptídicos.
En general, los aptámeros pueden comprender oligonucleótidos que son de al menos 5, al menos 10 o al menos 15 nucleótidos de longitud. Los aptámeros pueden comprender secuencias que son de hasta 40, hasta 60 o hasta 100 o 60 más nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los aptámeros pueden ser de 5 a 100 nucleótidos, de 10 a 40 nucleótidos o de 15 a 40 nucleótidos de longitud. Cuando sea posible, se prefieren aptámeros de longitud más corta ya que estos conducirán con frecuencia a menos interferencia por otras moléculas o materiales.
Se eliminan rápidamente aptámeros no modificados del torrente sanguíneo, con una semivida de minutos a horas, 65 principalmente debido a la degradación por nucleasa y eliminación del cuerpo por los riñones. Dichos aptámeros no modificados tienen utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de afecciones transitorias tal como en la estimulación de la coagulación sanguínea. Como alternativa, pueden modificarse aptámeros para mejorar su semivida. Están disponibles varias de dichas modificaciones, tales como la adición de pirimidinas 2’-flúor sustituidas o enlaces de polietilenglicol (PEG).
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Pueden generarse aptámeros usando métodos rutinarios tales como el procedimiento de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). SELEX es un método para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con unión altamente específica con moléculas diana. Se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.654.151, US 5.503.978, US 5.567.588 y WO 96/38579.
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El método de SELEX implica la selección de aptámeros de ácido nucleico y en particular ácidos nucleicos monocatenarios capaces de unirse con una diana deseada, a partir de una colección de oligonucleótidos. Una colección de ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, ADN, ARN o variantes de los mismos) se pone en contacto con una diana, en condiciones favorables para la unión, los ácidos nucleicos que se unen con dianas en la mezcla se separan de los que no se unen, los complejos de ácido nucleico-diana se disocian, los ácidos nucleicos 15 que se han unido a la diana se amplifican para producir una colección o biblioteca que está enriquecida en ácidos nucleicos que tienen la actividad de unión deseada y después la serie de etapas se repite según sea necesario para producir una biblioteca de ácidos nucleicos (aptámeros) que tengan afinidad de unión específica por la diana relevante.
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Anticuerpos
El término “anticuerpo” como se indica en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, “parte de unión a antígeno”) o cadenas sencillas de los mismos. Un anticuerpo se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras 25 (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una parte de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones VH y 30 VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR).
Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina con tejidos 35 hospedadores o factores, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, y será preferentemente un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, un 40 anticuerpo con injertos de CDR, un nanocuerpo, un anticuerpo humano o humanizado o una parte de unión a antígeno de cualquiera de los mismos. Para la producción de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, el animal experimental es típicamente un mamífero no humano tal como una cabra, un conejo, una rata o un ratón pero también inducirse en otras especies tales como camélidos.
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Pueden producirse anticuerpos policlonales por métodos rutinarios tales como inmunización de un animal adecuado, con el antígeno de interés. Posteriormente puede extraerse sangre del animal y purificarse la fracción de IgG.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la invención pueden producirse por diversas técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas 50 convencional de Kohler y Milstein. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido y puede conseguirse usando técnicas bien conocidas en este campo.
Puede producirse un anticuerpo de acuerdo con la invención por un método que comprende: inmunizar un mamífero 55 no humano con un inmunógeno que comprende Lrg1 de longitud completa, un fragmento peptídico de Lrg1, un epítopo dentro de la secuencia de L1-24 del Apéndice 1 o L94-117 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 1 o L262-285 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 1 o L320-345 del Apéndice 2 ( SEQ ID NO: 5) o un epítopo dentro de otras regiones de Lrg1; obtener una preparación de anticuerpo de dicho mamífero; y obtener del mismo anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente dicho epítopo. 60
La expresión “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad para unirse específicamente con un antígeno. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "parte de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen un 65 fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fab’, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento dAb y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. También se pretende que los anticuerpos monocatenarios tales como anticuerpos scFv estén abarcados dentro de la expresión “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos pueden explorarse con respecto a utilidad de la misma manera que anticuerpos intactos. 5
Un anticuerpo de la invención puede prepararse, expresarse, crearse o aislarse por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina de interés o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo de interés, por ejemplo, de un transfectoma, (c) 10 anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. Se pretende que la 15 expresión “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que se obtienen regiones tanto marco conservadas como CDR de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana 20 (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, no se pretende que la expresión “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, incluya anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco conservadas humanas.
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Dicho anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Dicho anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionados con una célula inmortalizada.
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Pueden prepararse anticuerpos humanos por inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr.
La expresión “derivados de anticuerpos humanos” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. 35
Se pretende que la expresión “anticuerpo humanizado” se refiera a anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco conservadas humanas. Pueden realizarse modificaciones de región marco conservada adicionales dentro de las secuencias marco conservadas humanas. 40
Pueden usarse métodos de exploración como se han descrito en el presente documento para identificar anticuerpos adecuados que son capaces de unirse con Lrg1. Por lo tanto, los métodos de exploración descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo usando un anticuerpo de interés como el compuesto de ensayo.
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Pueden ensayarse anticuerpos de la invención para unión con Lrg1 mediante, por ejemplo, ELISA convencional o transferencia de Western. También puede usarse un ensayo ELISA para explorar con respecto a hibridomas que muestran reactividad positiva con la proteína diana. La especificidad de unión de un anticuerpo también puede determinarse supervisando la unión del anticuerpo con células que expresan la proteína diana, por ejemplo mediante citometría de flujo. Por lo tanto, un método de exploración de la invención puede comprender la etapa de identificar 50 un anticuerpo que es capaz de unirse con Lrg1 llevando a cabo un ELISA o transferencia Western o por citometría de flujo. Pueden después ensayarse adicionalmente anticuerpos que tienen las propiedades de unión requeridas para determinar sus efectos sobre la actividad de Lrg1 como se ha descrito anteriormente adicionalmente.
Los anticuerpos de la invención tendrán propiedades antagonistas de Lrg1 (de bloqueo) como se ha analizado 55 anteriormente. En una realización, un anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo dentro de Lrg1 y bloquea la actividad de Lrg1. En una realización, el anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo dentro de Lrg1 y bloquea la interacción entre TGFβRII, TGFβ, una ALK, endoglina, betaglucano, una BMP o un BMPR y Lrg1. En una realización, un anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo dentro de los aminoácidos L1-24 del Apéndice 1 o L94-117 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 1 o L262-285 60 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 1 o L320-345 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 5) y bloquea la actividad de Lrg1. En una realización, un anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo dentro de los aminoácidos L1-24 del Apéndice 1 o L94-117 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 3), L169-192 del Apéndice 1 o L262-285 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 del Apéndice 1 o L320-345 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 5) y bloquea la interacción entre TGFβRII, TGFβ, una ALK, endoglina, betaglucano, una BMP, BMPRII o receptor de tipo activina II 65 (ACVRII) y Lrg1.
Los anticuerpos de la invención reconocen específicamente Lrg1, es decir, epítopos dentro de Lrg1. Un anticuerpo, u otro compuesto, “se une específicamente” o “reconoce específicamente” una proteína cuando se une con afinidad preferente o alta con la proteína para la que es específica pero no se une sustancialmente, o se une con baja afinidad, con otras proteínas. La especificidad de un anticuerpo de la invención para proteína diana puede estudiarse adicionalmente determinando si el anticuerpo se une o no con otras proteínas relacionadas como se ha analizado 5 anteriormente o se diferencia entre ellas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede unirse con Lrg1 humana pero no con Lrg1 de ratón u otra de mamífero.
Los anticuerpos de la invención se unirán convenientemente con Lrg1 con alta afinidad, preferentemente en el intervalo picomolar, por ejemplo con una constante de afinidad (KD) de 10 nM o menos, 1 nM o menos, 500 pM o 10 menos o 100 pM o menos, medida por resonancia de plasmón superficial o cualquier otra técnica adecuada.
Una vez que se ha identificado y seleccionado un anticuerpo adecuado, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede identificarse por métodos conocidos en la técnica. Los genes que codifican el anticuerpo pueden clonarse usando cebadores degradados. El anticuerpo puede producirse de forma recombinante por métodos rutinarios. 15
Pueden identificarse epítopos dentro de Lrg1 por métodos conocidos en la técnica y analizados en el presente documento, notablemente por exploración sistemática de péptidos contiguos o solapantes mediante un enfoque de “PEPSCAN” o formando anticuerpos para fragmentos peptídicos (véase anteriormente) que se ha mostrado que bloquean Lrg1. Son ejemplos de dichos péptidos dentro de los que pueden identificarse epítopos para la producción 20 de anticuerpos los péptidos L1-24 del Apéndice 1 o el L94-117 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 3), el L169-192 del Apéndice 1 o el L262-285 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 4) y L227-252 del Apéndice 1 o L320-345 del Apéndice 2 (SEQ ID NO: 5) analizados en el presente documento. Estos y otros péptidos que contienen epítopos pueden usarse como inmunógenos para la generación de anticuerpos.
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Efecto en células neoplásicas
Como se analiza en el presente documento, los inventores han mostrado previamente que pueden usarse antagonistas de Lrg1 para inhibir la angiogénesis. Los agentes antiangiogénicos son una clase conocida de productos terapéuticos antineoplásicos. Sin embargo, los presentes inventores han mostrado ahora que los 30 antagonistas de Lrg1 pueden ejercer un efecto en células neoplásicas, es decir que los antagonistas de Lrg1 son capaces de tener un efecto terapéutico antineoplásico que es independiente de la capacidad de estos antagonistas para inhibir la angiogénesis.
El efecto de los antagonistas de Lrg1 de la invención en células neoplásicas puede ser directo, es decir el 35 antagonista interacciona directamente con una o más células neoplásicas, o indirecto, es decir el antagonista interacciona con otro tipo celular o compuesto y ejerce su efecto en células neoplásicas mediante un intermediario. Preferentemente el efecto del antagonista de Lrg1 en células neoplásicas es directo.
Los efectos de los antagonistas de Lrg1 en células neoplásicas incluyen la regulación negativa de proliferación de 40 células neoplásicas, regulación negativa de transición epitelial-mesenquimatosa (EMT), invasión tumoral, diseminación metastásica, evasión del sistema inmunitario, regulación negativa de la migración de células neoplásicas, modulación, incluyendo regulación negativa, de interacciones célula-célula entre células neoplásicas, regulación negativa de la expresión de genes neoplásicos (tales como oncogenes) o regulación positiva de expresión de genes antineoplásicos (tal como genes supresores de tumores) por células neoplásicas o bloqueo del 45 cambio de TGFβ de un factor anti a uno prooncogénico para células neoplásicas.
El antagonista de Lrg1 de la invención puede reducir la actividad de Lrg1 de modo que, por ejemplo, la proliferación, migración, interacción célula-célula, expresión de genes neoplásicos o cambio de TGFβ se reduce del 10 al 50 %, al menos 50 % o al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %. Si el efecto del antagonista de Lrg1 es aumentar la 50 expresión de genes antineoplásicos por una célula neoplásica, el antagonista puede aumentar esta expresión del 10 al 50 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos el doble de la expresión de los genes antineoplásicos en ausencia del antagonista.
El efecto del antagonista de Lrg1 puede estar mediado por el antagonista que bloquea la interacción entre endoglina-55 Lrg1, betaglucano-Lrg1, TGFβRII-Lrg1, TGFβ-Lrg1, una quinasa de tipo receptor de activina (ALK)-Lrg1, una proteína morfogenética del hueso (BMP)-Lrg1, un receptor de proteína morfogenética del hueso (BMPR)-Lrg1, BMP-ALK, BMPR-ALK, receptor de tipo activina II (ACVRII)-Lrg1, endoglina-ALK o ALK-TGFβRII. El receptor de proteína morfogenética del hueso es preferentemente BMPRII.
60
El efecto del antagonista de Lg1 de la invención en células neoplásicas puede medirse directamente, por ejemplo midiendo la proliferación de células neoplásicas, migración y/o direccionalidad de la migración en presencia del antagonista (y opcionalmente comparando esto con el nivel de proliferación de células neoplásicas, migración y/o direccionalidad de la migración en ausencia del antagonista), o midiendo el nivel de interacción entre endoglina-Lrg1, betaglucano-Lrg1, TGFβRII-Lrg1, TGFβ-Lrg1, una quinasa de tipo receptor de activina (ALK)-Lrg1, una proteína 65 morfogenética del hueso (BMP)-Lrg1, un receptor de proteína morfogenética del hueso (BMPR)-Lrg1, BMP-ALK o BMPR-ALK, receptor de tipo activina II (ACVRII)-BMPR, ACVRII-Lrg1, endoglina-ALK o ALK-TGFβRII o la presencia de moléculas de señalización corriente abajo. Se conocen en este campo técnicas convencionales para medir dichos parámetros.
El trabajo de los presentes inventores sugiere que la endoglina puede ser un receptor de Lrg1 y también que Lrg1 5 puede ser mitógena en ciertas células. Por lo tanto, Lrg1 puede ejercer un efecto proliferativo mediante células que expresan endoglina. Además, se sabe que TGFβ tiene propiedades mitógenas y los inventores han mostrado previamente que Lrg1 modula la señalización de TGFβ. Por lo tanto, los antagonistas de Lrg1 pueden ser capaces de ejercer un efecto antineoplásico en células neoplásicas indirectamente, mediante la inhibición del efecto proliferativo de Lrg1 proporcionado mediante endoglina y TGFβ. 10
Indicaciones terapéuticas
Cualquier cáncer en el que Lrg-1 medie en un efecto en células neoplásicas o en función de células inmunitarias en ambiente tumoral puede, en principio, tratarse, prevenirse o aliviarse de acuerdo con la presente divulgación. Un 15 “efecto en células neoplásicas” o expresiones similares como se usa en el presente documento abarca todos y cada uno de los efectos directos de Lrg1 en células neoplásicas, incluyendo efectos en la proliferación de células neoplásicas, migración de células neoplásicas, adhesión de células neoplásicas a otras células neoplásicas, expresión de genes neoplásicos o genes requeridos para el crecimiento y progresión del cáncer, el cambio de TGFβ de un factor anti a uno prooncogénico. Un “efecto en la función de células inmunitarias en ambiente tumoral” o 20 expresiones similares como se usa en el presente documento abarca todos y cada uno de los efectos de Lrg1 en cualquier célula inmunitaria en proximidad al tumor, es decir en contacto directo o indirecto dentro de células neoplásicas o dentro de los límites del crecimiento neoplásico, incluyendo reducción del porcentaje de células CD14 positivas CD11b positivas dentro de una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o aumento del porcentaje de células T CD4 RORγt positivas y mediante mecanismos del sistema inmunitario tales 25 como bloqueo de células T proinflamatorias, regulación positiva de células inmunitarias reguladoras incluyendo Treg y macrófagos reguladores, induciendo anergia o regulación positiva de mecanismos tolerogénicos y promoviendo muerte celular inducida por activación. En el contexto de la presente invención, la expresión “células inmunitarias” o cualquier expresión similar usada en el presente documento abarca tanto leucocitos polimorfonucleares como leucocitos mononucleares. Los leucocitos polimorfonucleares pueden ser uno o más de neutrófilos, eosinófilos y 30 basófilos. Los leucocitos mononucleares pueden ser uno o más de linfocitos B, linfocitos T, monocitos, macrófagos y células dendríticas. En una realización preferida las células inmunitarias son leucocitos mononucleares. En una realización particularmente preferida los leucocitos mononucleares son monocitos o linfocitos T. En una realización aún más preferida las células inmunitarias son CD4 positivas (linfocitos T auxiliares).
35
Todos los efectos del antagonista de Lrg1 de la invención, solo o en combinación con otro producto terapéutico antineoplásico, puede medirse en comparación con un control apropiado en el que no se han administrado el antagonista de Lrg1 o, cuando sea apropiado, combinación de antagonista de Lrg1 y otro producto terapéutico antineoplásico.
40
Los tumores en los que se producen efectos mediados por Lrg1 pero que no se basan en la angiogénesis para el crecimiento tumoral son afecciones que pueden tratarse, prevenirse o aliviarse de acuerdo con la presente invención. Además, los tumores que no son sensibles o son resistentes a productos terapéuticos antiangiogénicos se tratan, previenen o alivian de acuerdo con la presente invención. Además, los tumores que pueden beneficiarse de la inhibición de la angiogénesis tumoral y la inhibición de los efectos directos de Lrg1 en células neoplásicas 45 pueden tratarse, prevenirse o aliviarse de acuerdo con la presente invención.
Preferentemente, no hay ningún efecto, o hay un efecto mínimo, en células normales, incluso cuando las células normales están en proximidad estrecha o en contacto directo con las células tumorales para tratar.
50
Los tumores que pueden tratarse, prevenirse o aliviarse de acuerdo con la presente invención incluyen mieloma, leucemia, tumores de cerebro, de mama, de riñón, colorrectal, de pulmón, de próstata, de cabeza y cuello, de estómago, pancreático, de piel, de cuello uterino, de hueso, ovárico, testicular y de hígado.
Composiciones farmacéuticas, dosificaciones y regímenes de dosificación 55
Los antagonistas de la invención se formularán típicamente en composiciones farmacéuticas, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los 60 disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular o intravítrea (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el modulador puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden 65 inactivar el compuesto.
Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y no transmite ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.
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Los vehículos farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden vehículos o diluyentes acuosos. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como etil oleato. En muchos casos, será preferible incluir 10 agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura 15 ordenada adecuada para alta concentración farmacológica.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender principios activos adicionales como se analiza en el presente documento.
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Se desvelan kits que comprenden antagonistas de la invención e instrucciones para su uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un producto terapéutico o agente profiláctico adicional como se analiza posteriormente.
Los antagonistas y composiciones de la presente invención pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o 25 terapéuticos.
En aplicaciones terapéuticas, se administran moduladores o composiciones a un sujeto que ya padece un trastorno o una afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o parcialmente detener la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una 30 reducción de la gravedad de los síntomas de enfermedad, o un aumento de la frecuencia o duración de periodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una “cantidad terapéuticamente eficaz”.
En aplicaciones profilácticas, se administran formulaciones a un sujeto en riesgo de un trastorno o una afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la 35 afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una “cantidad profilácticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como el peso y el estado general del sujeto.
Un sujeto para administración de los antagonistas de la invención puede ser un ser humano o animal no humano. La 40 expresión “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Se prefiere la administración a seres humanos.
Un antagonista de la presente invención puede administrarse mediante una o más vías de administración usando 45 uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciarán los expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías preferidas de administración para moduladores de la invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo por inyección o infusión, administración intracraneal ventricular o subdural. La expresión “administración parenteral” como se usa en 50 el presente documento significa modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, habitualmente por inyección. Como alternativa, un anticuerpo de la invención puede administrarse mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa.
Una dosificación adecuada de un antagonista de la invención puede determinarse por un practicante médico 55 experto. Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que es eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la 60 vía de administración, el momento de administración, la tasa de secreción del compuesto particular que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general y el historial médico previo del paciente que se trate, y factores similares bien conocidos en la técnica médica.
65
Una dosis adecuada puede ser, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 μg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente para tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 μg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día o de aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una 5 respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una dosis individual, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. La forma de dosificación unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos para tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico 10 deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
La administración puede ser en dosis individuales o múltiples. Pueden administrarse múltiples dosis mediante las mismas vías o vías diferentes en la misma localización o en localizaciones diferentes. Como alternativa, las dosis pueden ser mediante una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración menos 15 frecuente. La dosificación y frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración del tratamiento deseado.
Como se analiza en detalle posteriormente, los antagonistas de la invención pueden coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. 20
Terapias de combinación
Como se ha observado anteriormente, pueden administrarse antagonistas de Lrg1 de la invención en combinación con cualquier otro compuesto activo adecuado. En particular, el antagonista de Lrg1 de la invención puede 25 administrarse en combinación con uno o más productos terapéuticos antineoplásicos adicionales y/o uno o más agentes antiangiogénicos. La terapia de combinación incluye la administración de una formulación de una única dosificación farmacéutica que contiene antagonista de Lrg1 de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales; así como administración de un antagonista de Lrg1 de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, un antagonista de Lrg1 de 30 la invención y un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento o un anticuerpo monoclonal antineoplásico pueden administrarse al paciente juntos en una composición de una única dosificación tal como una formulación combinada, o cada agente puede administrarse en una formulación de dosificación separada. Cuando se usan formulaciones de dosificaciones separadas, el antagonista de Lrg1 de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse simultáneamente, o en momentos escalonados por 35 separado, es decir, secuencialmente. El efecto antineoplásico ejercido por la combinación de un antagonista de Lrg1 y otro producto terapéutico antineoplásico será preferentemente mayor que el efecto antineoplásico del antagonista de Lrg1 o el otro producto terapéutico antineoplásico administrado solo.
La expresión “agente citotóxico” como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o 40 previene la función de células y/o provoca la destrucción de células. Se pretende que la expresión incluya isótopos radiactivos (por ejemplo I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.
Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes 45 quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (Cytoxan®); alquilsulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, 50 novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, 55 potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, 60 propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; desfofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; 65 razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (Taxotere®; Aventis Antony, Francia); gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; 5 inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales 10 como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide y goserelina; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.
Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa bien in vitro o bien in vivo. 15 Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de fase S), tales como agentes que inducen detención en G1 y detención en fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), Taxol® e inhibidores de topo II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen en G1 también se propagan a detención en fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, 20 dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C.
Un “anticuerpo monoclonal antineoplásico” cuando se usa en el presente documento significa cualquier anticuerpo monoclonal que puede usarse para ejercer un efecto antineoplásico, independientemente del mecanismo por el que se consigue el efecto antineoplásico. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales antineoplásicos incluyen 25 alemtuzumab (Campath) para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, bevacizumab (Avastin) para el tratamiento de cáncer de cerebro, cáncer de colon, cáncer de riñón y cáncer de pulmón, cetuximab (Erbitux) para el tratamiento de cáncer de colon y cánceres de cabeza y cuello, ibritumomab (Zevalin) para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin, ofatumumab (Arzerra) o para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, panitumumab (Vectibix) para el tratamiento de cáncer de colon, rituximab (Rituxan) para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica y 30 linfoma no de Hodgkin, tositumomab (Bexxar) para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin, trastuzumab (Herceptin) para el tratamiento de cáncer de mama y cáncer de estómago y edrecolomab (Panorex) para el tratamiento de cáncer de colon.
Pueden administrarse antagonistas de Lrg1 de la invención en combinación con uno o más agentes o compuestos 35 antiangiogénicos. El compuesto antiangiogénico puede seleccionarse de un antagonista de cualquier molécula proangiogénica. Los antagonistas pueden seleccionarse de péptidos y peptidomiméticos, anticuerpos, inhibidores de moléculas pequeñas, ARN bicatenario, aptámeros y ribozimas adecuados, como se ha analizado anteriormente en relación con Lrg1. Por ejemplo, el compuesto antiangiogénico puede seleccionarse de un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un antagonista de angiopoyetina, un antagonista del factor de crecimiento 40 placentario (PLGF), un antagonista de endoglina, un antagonista de CD160 o un antagonista de quinasa de tipo receptor de activina 1 (ALK1). Preferentemente el agente antiangiogénico es un antagonista de VEGF o PLGF. Los antagonistas de VEGF pueden ser preferentemente un anticuerpo anti VEGF tales como Avastin y/o Lucentis y/o una trampa de VEGF basada en receptor tal como Aflibercept.
45
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos
1. El crecimiento tumoral está reducido en ratones con inactivación de Lrg1 50
El efecto de Lrg1 en el crecimiento tumoral se ha investigado. Se cultivaron células B16-F0 (melanoma) o LL/2 (carcinoma de pulmón de Lewis) como cultivos de adhesión en DMEM complementado con FCS 10 %, L-glutamina 4 mM y penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Las células subconfluyentes se tripsinizaron y se resuspendieron en medio sin suero. Se inyectaron 1x106 células tumorales en 100 μl por vía subcutánea en la región 55 dorsal cerca del muslo de ratones de tipo silvestre (WT) o con inactivación de Lrg1 (KO) de 2 meses de edad. Los tumores se calibraron 3 veces a la semana, 7 días después de la inyección. Los ratones se sacrificaron cuando el tumor hubo alcanzado un volumen superior a 1,5 cm3. Al final del experimento, los tumores se recogieron y se procesaron para análisis histológico.
60
Para los tumores tanto B16-F0 como LL/2, el crecimiento tumoral se redujo en ratones Lrg1 KO en comparación con ratones WT (Figura 1a). Los datos presentados en la Figura 1a de hecho infraestiman la diferencia en el crecimiento tumoral entre ratones WT y Lrg1 KO, debido a que los tumores en ratones WT alcanzaron con frecuencia el volumen final de 1,5 cm3, y por lo tanto tuvieron que sacrificarse antes del punto final del experimento. Estos datos muestran que en ratones que carecían de expresión de Lrg1 endógena, se redujo el crecimiento tumoral, es decir, el número 65 total de células tumorales. Esto demuestra que Lrg1 estimula la proliferación de células tumorales.
El medio de cultivo de muestras de las líneas celulares B16-F0 y LL/2 se analizó por transferencia de Western y se descubrió que ambas líneas celulares cancerosas expresaban y secretaban proteína Lrg1 (Figura 1a, panel inferior). Se sometieron matrices tisulares de un cáncer de mama humano (derivado de células epiteliales de mama) y un control de tejido de mama humano no canceroso a análisis histológico para examinar la expresión de Lrg1 (Figura 1b). Se usó un anticuerpo específico para Lrg1 para teñir las matrices, indicándose la expresión de Lrg1 por tinción 5 marrón de la muestra. El tejido de mama no canceroso expresó poca Lrg1, observándose solamente mínima tinción en células epiteliales (Figura 1b, panel superior). Sin embargo, la matriz tisular de cáncer de mama humano se tiñó fuertemente con respecto a Lrg1 (Figura 1b, panel inferior). Se cree que las células teñidas más fuertemente expresan Lrg1 y la secretan al ambiente extracelular del tumor, por lo tanto el nivel de fondo de tinción de Lrg1 observado a través de la matriz de cáncer de mama (casi no se observa tinción de fondo en la muestra de control). 10 Esta Lrg1 secretada no pudo entonces actuar solamente en otras células tumorales, sino también en otras células en el ambiente tumoral, tales como células inmunitarias.
A partir de estos datos de transferencia de Western e histológicos se ha concluido que las células tumorales son capaces de producir su propio aporte de Lrg1. Ya que se ha mostrado que el crecimiento tumoral se reduce en 15 ausencia de Lrg1 (Figura 1a), se predice que en ausencia de esta Lrg1 generada por tumor, o si la actividad biológica de la Lrg1 producida por las células tumorales se bloqueaba, el nivel de proliferación de células tumorales y crecimiento tumoral se reduciría aún más en ratones Lrg1 KO. Esto podría conseguirse debido a que el ratón KO no produce Lrg1 y la actividad de Lrg1 que se produce por las células tumorales se inhibiría.
20
2. La expresión de Lrg1 está regulada positivamente en una diversidad de tumores
Habiendo descubierto que el crecimiento tumoral se reduce en ausencia de expresión de Lrg1, los inventores investigaron después la expresión de Lrg1 en una diversidad de tipos tumorales. La exploración de publicaciones y bases de datos de cáncer (Tabla 1) muestra que la expresión del gen y proteína de Lrg1 aumenta con frecuencia en 25 tumores tales como ovárico, de mama, de pulmón y de próstata. Tomado junto con los resultados en el Ejemplo 1, esto demuestra que Lrg1 es una diana a la que puede dirigirse un fármaco para el tratamiento de cáncer.
3. Anticuerpos anti Lrg1 reducen el crecimiento de células tumorales in vitro
30
Habiendo establecido que las células de carcinoma de pulmón de Lewis (LL/2) crecen más lentamente en ratones Lrg1-/- en comparación con controles WT se determinó a continuación si el bloqueo de Lrg1 con un anticuerpo policlonal anti Lrg1 redujo el crecimiento celular independiente de anclaje usando un ensayo de formación de colonias de agar blando convencional. Se suspendieron células LL/2 a 6,7 x 104 células/ml en agarosa 0,5 % compuesta en DMEM complementado con FCS 10 % en presencia de IgG 500 nM, anticuerpo policlonal anti Lrg1 35 500 nM o solamente con medio. La suspensión se sembró en pocillos que estaban recubiertos con agarosa 1 % compuesta en DMEM. Se añadió medio y tratamiento correspondiente sobre la suspensión semisólida y se cambió semanalmente. El tamaño de las colonias se analizó después de 20 días usando software ImageJ. El bloqueo de Lrg1 dio como resultado una reducción significativa en el tamaño de las colonias en comparación con medio solo o controles de IgG irrelevantes (Figura 2). 40
Habiendo generado anticuerpo monoclonal (mAb) contra el LRG1 humano, se determinó a continuación si cualquiera de estos anticuerpos podría bloquear la proliferación de la línea celular de carcinoma epitelial de pulmón humano A549. La adición de un anticuerpo monoclonal, pero no un segundo, dio como resultado una reducción significativa de la proliferación in vitro de las células A549 como se evaluó por el ensayo de MTT (n = 3) (Figura 3). En este 45 experimento el medio de cultivo se complementó con mAb 100 nM y las células se mantuvieron en cultivo durante 5 días. El resultado muestra que el bloqueo funcional de Lrg1 conduce a una reducción en la tasa de crecimiento celular, lo que apoya además la idea de que la dirección a Lrg1 en cáncer puede tener valor terapéutico.
4. Lrg1 induce señalización de TGFβ canónica y no canónica 50
Para determinar si Lrg1 puede inducir rutas de señalización de TGFβ canónicas o no canónicas en líneas celulares epiteliales normales y derivadas de tumor se trataron células in vitro con diversas combinaciones de Lrg1 y TGFβ1. Las células se privaron de suero durante una noche y después se trataron con TGFβ 5 ng/ml o Lrg1 200 ng/ml o una combinación de ambos y a continuación después de 10-60 minutos se lisaron y se analizaron por transferencia de 55 Western. En la línea celular de adenocarcinoma mamario humano MDA MB 468, se descubrió que Lrg1 inducía fosforilación de Smad 1/5 (Figura 4a), lo que indica que la ruta de señalización canónica puede inducirse. Además, tanto en la línea celular epitelial mamaria humana MCF10A como en la línea celular de carcinoma epitelial de pulmón humano A549, se descubrió que Lrg1 inducía activación no canónica de la ruta de Rho/ROCK como se reveló por fosforilación de Thr18/Ser19 de cadena ligera de miosina (MLC) (Figura 4b y c) que es coherente con la 60 activación de EMT. El histograma muestra semicuantificación de transferencia de western para las células A549 (n = 3) usando software ImageJ.
5. Lrg1 induce señalización de TGFβ canónica y no canónica
65
Ya que se ha mostrado que Lrg1 induce señalización tanto canónica como no canónica en estas células se determinó a continuación si esto dio como resultado un cambio en la función celular. La función migratoria de células epiteliales mamarias humanas MCF10A se evaluó solamente en medio o en presencia de TGFβ 5 ng/ml, Lrg1 200 ng/ml o una combinación de ambos factores. Para determinar la migración, se empleó el ensayo de arañazo ampliamente usado (cierre de heridas) en el que se realizó un arañazo a través de una monocapa confluyente de células MCF10A con una punta de pipeta estéril. Se añadió medio nuevo con tratamientos correspondientes y se 5 registró el cierre del arañazo por células migratorias durante un período de 25 h. El tamaño del arañazo se midió después usando ImageJ. Se descubrió que la adición de Lrg1 inducía un aumento significativo en la tasa de cierre en comparación con células no tratadas (Figura 5a). TGFβ por sí solo no alteró la tasa de cierre pero en combinación con Lrg1 invirtió el efecto (n = 3). La direccionalidad de la migración celular se determinó después en células MCF10A. Las células se sembraron a baja confluencia (1x10
6. La expresión de Lrg1 modula poblaciones de células inmunitarias
Se prepararon bazos de ratones C57/BL6 en suspensiones celulares individuales y se contaron en un hemocitómetro. Se aislaron células T sin tratamiento previo a partir de 1 x 108 células usando el kit de aislamiento de 20 células T CD4+ CD62L+ (Miltenyl Biotech). Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 x 106/ml y se estimularon con 1 μg/ml de anti CD3 soluble y 2 μg/ml de anti CD28 soluble con y sin la adición de 200 ng/ml de LRG-1 humano recombinante y se mantuvo a 37 ºC con CO2 5 %. Después de 5 días las células se tiñeron en superficie con respecto a CD4 (APC) y se tiñeron intracelularmente para factores de transcripción nuclear RORγt (PE) y FoxP3 (FITC). Se adquirieron datos en un FACSCalibur y se analizaron usando software FlowJo. 25
El tratamiento de los esplenocitos de ratón con Lrg1 redujo la población de células T CD4+ Th17 desde casi el 20 % hasta menos del 5 % (Figura 6). Estos datos demuestran por lo tanto que Lrg1 es capaz de modular células inmunitarias. En particular, los inventores han mostrado que Lrg1 modula los esplenocitos de ratón para reducir una población de células T que podrían atacar células cancerosas si estuvieran presentes esas células T. 30
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de la sangre completa de donantes sanos usando centrifugación de densidad de gradiente Ficoll-Histopaque. Se cultivaron PBMC en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,5 x 106 células/ml en RPMI Glutamax que contenía FBS inactivado por calor al 10 %, aminoácidos no esenciales 2 mM, piruvato sódico 2 mM, 2-mercaptoetanol 50 mM, penicilina 100 U/ml, 35 estreptomicina 100 μg/ml y gentamicina 50 μg/ml. Las células se trataron con Lrg1 humana recombinante 200 ng/ml y/o TGFβ1 humano 5 ng/ml y se mantuvieron a 37 ºC con CO2 5 %. Después de 4 días las células se recogieron y se lavaron una vez con PBS seguido de la adquisición de 20.000 células por muestra en un citómetro de flujo FACSCalibur. Se analizaron datos de FACS usando FSC frente a SSC usando software Flow Jo.
40
El tratamiento de las PBMC con TGFβ aumentó la población de células CD14+/CD11b+ de 0,362 % (control, Figura 7, panel superior izquierdo) a 1,23 % (Figura 7, panel superior derecho). El tratamiento de las PBMC con Lrg1 también aumentó la población de células CD14+/CD11b+ en comparación con la muestra de PBMC de control (hasta 1,79 %, Figura 7, panel inferior izquierdo). Sin embargo, el tratamiento de PBMC tanto con TGFβ como con Lrg1 aumentó la población de células CD14+/CD11b+ hasta 4,74 %. Estos datos ilustran que Lrg1 es capaz de modular 45 respuestas inmunitarias de una manera dependiente de TGFβ, y sugiere además que un tumor que produce Lrg1 (como se ha demostrado en el Ejemplo 1 anterior) sería capaz de modular la respuesta inmunitaria de un paciente mediante esta producción de Lrg1 (Figura 8a).
Se investigó a continuación el efecto que Lrg1 puede tener en el fenotipo de monocito/macrófago en el contexto de 50 la supervivencia y expansión tumoral. Los monocitos recogidos de células mononucleares de sangre periférica humana se trataron durante 48 h solamente con medio, TGFβ1, Lrg1 o TGFβ1+ Lrg1 y se determinó la expresión de HLA-DR por citometría de flujo. El tratamiento con Lrg1 200 ng/ml o una combinación de Lrg1 200 ng/ml y TGFβ1 5 ng/ml dio como resultado una reducción significativa en la expresión de HLA DR (Figura 8a). El porcentaje de células HLA DRhi se redujo y el porcentaje de células HLA DRlo aumentó en los macrófagos CD14+ tratados con Lrg-55 1 o Lrg-1+ TGFβ1 (Figura 8b). Esto es relevante para el cáncer ya que los macrófagos asociados a tumor (TAM) que expresan MHC de clase II bajo son inmunosupresores y promueven la angiogénesis tumoral. Una proporción pequeña de TAM también expresan Tie2 y bajos niveles de MHC de clase II, los denominados macrófagos que expresan Tie2 (TEM), y se ha descubierto que la supresión de TEM mejora en gran medida la eficacia de la terapia tumoral. Se ha investigado por lo tanto si la población de CD14+ HLA DRlo inducida en presencia de Lrg-1 a las 48 h 60 era tanto endoglina (CD105) como TIE2 positiva. La citometría de flujo reveló que la población de CD14+ HLA DRlo también expresaba endoglina (Figura 8c) y TIE2 (Figura 8d). La demostración de los inventores de que Lrg1 induce una población de macrófagos CD14+ que son HLADRlo, ENGhi, TIE2+ es coherente con la población de macrófagos protumorigénicos TAM/TEM.
65
Los inventores han demostrado por lo tanto no solamente que Lrg1 es capaz de ejercer un efecto estimulante directo en células tumorales, particularmente proliferación de células tumorales, sino también que algunos tumores son capaces de producir su propio aporte endógeno de Lrg1. Además, los inventores han demostrado por primera vez que los tumores pueden ser capaces de modular la respuesta inmunitaria mediante expresión de Lrg1, haciendo a la dirección de la función de células inmunitarias en el ambiente tumoral mediante el antagonismo de la expresión de Lrg1 una terapia antineoplásica potencial. 5
Referencias
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10
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US 2005/0064516
WO 2008/092214 15
US 2007/0184503
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20
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Tabla 2: Expresión de Lrg1 y endoglina en líneas celulares epiteliales normales y tumorales humanas.
Línea celular
Descripción Lrg1 Secretado Endoglina
MCF10A
Línea celular epitelial mamaria humana S S
A549
Carcinoma de pulmón epitelial humano S S
MDA MB 468
Adenocarcinoma mamario humano N N
LL2
Carcinoma de pulmón de Lewis murino S N/D
Apéndice 1
Alineamiento de secuencias parcial de Lrg1 de ratón y humana, dispuesto para ilustrar las repeticiones ricas en 5 leucina (rojo) y los dominios C terminales altamente conservados (verde).
Apéndice 2
Humano 1 MSSWSRQRPK SPGGIQPHVS RTLFLLLLLA ASAWGVTLSP M SW Q L LL G S
Ratón 1 MVSWQHQGSL QDLKTCLART LFLLALL--- ----GRVSSL
Humano 41 KDCQVFRSDH GSSISCQPPA EIPGYLPADT VHLAVEFFNL K+C + +SGS++SCPEPLPADT 5 VHL+VEF
NL
Ratón 34 KECLILQSAE GSTVSCHGPT EFPSSLPADT VHLSVEFSNL
Humano 81 THLPANLLQG ASKLQELHLS SNGLESLSPE FLRPVPQLRV T LPA LQG L+ELHLS SN L++LSPE L
PVP+LR 10
Ratón 74 TQLPAAALQG CPGLRELHLS SNRLQALSPE LLAPVPRLRA
Humano 121 LDLTRNALTG LPPGLFQASA TLDTLVLKEN QLEVLEVSWL LDLTRNAL LPPGLF SA L TLVL+EN QL
+ WL
Ratón 114 LDLTRNALRS LPPGLFSTSA NLSTLVLREN QLREVSAQWL 15
Humano 161 HGLKALGHLD LSGNRLRKLP PGLLANFTLL RTLDLGENQL GL ALGHLD L+ N+L LP GLLA+ L TLDLG
N L
Ratón 154 QGLDALGHLD LAENQLSSLP SGLLASLGAL HTLDLGYNLL
Humano 201 ETLPPDLLRG PLQLERLHLE GNKLQVLGKD LLLPQPDLRY E+LP LLRGP +L+RLHLE GN+LQ L 20 LL
PQP LR
Ratón 194 ESLPEGLLRG PRRLQRLHLE GNRLQRLEDS LLAPQPFLRV
Humano 241 LFLNGNKLAR VAAGAFQGLR QLDMLDLSNN SLASVPEGLW LFLN N+L VA G+FQGL+ LDMLDLSNN 25
SL+S P GLW
Ratón 234 LFLNDNQLVG VATGSFQGLQ HLDMLDLSNN SLSSTPPGLW
Humano 281 ASLGQPNWDM RDGFDISGNP WICDQNLSDL YRWLQAQKDK A LG+P DM +DGFDIS NP WICD
NL+DL RWL A ++K
Ratón 274 AFLGRPTRDM QDGFDISHNP WICDKNLADL CRWLVANRNK 30
Humano 321 MFSQNDTRCA GPEAVKGQTL LAVAKSQ MFSQNDTRCA GPEA+KGQ L L VA+
Ratón 314 MFSQNDTRCA GPEAMKGQRL LDVAELGSL
La α-2-glucoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) mostró el mayor factor de cambio en los vasos retinianos remodelados. Secuencia de aminoácidos alineada de Lrg1 humana y de ratón. En rojo están las regiones de repeticiones ricas en 35 leucina y en verde está la región de dominio C terminal humana usada como un péptido de bloqueo.
Información de secuencia
Secuencias de Lrg1 humana 40
SEQ ID NO: 1 - Secuencia de ADN de Lrg1 humana
[La secuencia que codifica la proteína de SEQ ID NO: 2 está en negrita y subrayada dentro de SEQ ID NO: 1 a continuación] 45
SEQ ID NO: 2 - Secuencia de Aminoácidos de Lrg1 humana
[Las secuencias de SEQ ID NOS: 3-5 están en negrita y subrayadas dentro de SEQ ID NO: 2 a 5 continuación]
SEQ ID NO: 3-5 - Secuencias de Aminoácidos de Péptidos dentro de Lrg1 10
SEQ ID NO: 3 - Aminoácidos 1 – 24 de Lrg1 humana del Apéndice 2 (L94-117 del Apéndice 3)
L1-24/L94-117: LQELHLSSNGLESLSPEFLRPVPQ
15
SEQ ID NO: 4 - Aminoácidos 169-192 de Lrg1 humana del Apéndice 2 (L262-285 del Apéndice 3)
L169-192/L262-285: LDMLDLSNNSLASVPEGLWASLGQ
SEQ ID NO: 5 - Aminoácidos 227-252 de Lrg1 humana del Apéndice 2 (L320-345 del Apéndice 3) 20
L227-252/L320-345: KMFSQNDTRCAGPEAVKGQTLLAVAK

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un antagonista de la alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para uso en el tratamiento de un cáncer que no depende de la vasculoproliferación para el crecimiento o que no es sensible al tratamiento con un agente antiangiogénico o antivasculoproliferativo, comprendiendo el antagonista un anticuerpo que se une con Lrg1, un 5 ARN bicatenario que se dirige a ARN de Lrg1, un ARN antisentido que se dirige a ARN de Lrg1, un aptámero que se une con Lrg1 o un péptido o peptidomimético que compite con Lrg1 de longitud completa y por lo tanto bloquea la función de Lrg1.
  2. 2. Un antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, que actúa en células no vasculares. 10
  3. 3. Un antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el antagonista regula negativamente la proliferación de células neoplásicas.
  4. 4. Un antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el antagonista de Lrg1 tiene al 15 menos un efecto adicional en células neoplásicas seleccionado de:
    (a) regulación negativa de la migración de células neoplásicas;
    (b) regulación negativa de interacciones célula-célula entre células neoplásicas;
    (c) regulación negativa de la expresión de genes neoplásicos por células neoplásicas; y 20
    (d) bloqueo del cambio de TGFβ de un factor anti a uno prooncogénico para células neoplásicas.
  5. 5. Un antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el antagonista:
    (a) regula negativamente la migración de células neoplásicas; 25
    (b) regula negativamente las interacciones célula-célula entre células neoplásicas;
    (c) regula negativamente la expresión de genes neoplásicos por células neoplásicas; o
    (d) bloquea el cambio de TGFβ de un factor anti a uno prooncogénico para células neoplásicas.
  6. 6. Un antagonista de alfa-2-glucoproteína 1 rica en leucina (Lrg1) para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el 30 que el tratamiento del cáncer es mediante un efecto en la función de células inmunitarias en ambiente tumoral.
  7. 7. Un antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que:
    (a) dicho antagonista reduce el porcentaje de células CD14 positivas CD11b positivas dentro de una población 35 de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en comparación con un control en el que no se administra el antagonista; y/o
    (b) dicho antagonista aumenta el porcentaje de células T CD4 RORγt positivas a en comparación con un control en el que no se administra el antagonista.
    40
  8. 8. Un antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho antagonista bloquea la interacción entre:
    (a) Lrg1 y receptor de TGFβ II (TGFβRII); y/o
    (b) Lrg1 y TGFβ y/o 45
    (c) Lrg1 y una quinasa de tipo receptor de activina (ALK) y/o
    (d) Lrg1 y endoglina; y/o
    (e) Lrg1 y betaglucano; y/o
    (f) Lrg1 y una proteína morfogenética del hueso (BMP); y/o
    (g) Lrg1 y un receptor de proteína morfogenética del hueso (BMPR); y/o 50
    (h) ALK y BMPR y/o
    (i) Lrg1 y receptor de tipo activina II (ACVRII); y/o
    (j) endoglina y ALK; y/o
    (k) ALK y BMPR; y/o
    (l) ALK y TGFβRII, en señalización de TGFβ o BMP, 55
    opcionalmente en el que dicho bloqueo por dicho antagonista:
    (i) reduce la interacción entre endoglina y Lrg1 y modula de este modo la interacción entre la ALK y el receptor de TGFβ II (TGFβRII); y/o 60
    (ii) reduce la interacción entre betaglucano y Lrg1, y modula de este modo la interacción entre la ALK y el TGFβRII; y/o
    (iii) altera la formación de un complejo de BMP, BMPR y ALK, o la señalización por dicho complejo; y/o
    (iv) altera la señalización de TGFβ no canónica; y/o
    (v) altera la formación de un complejo de BMP, ACVRII y ALK, o la señalización por dicho complejo. 65
  9. 9. Un antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:
    (a) el ARN bicatenario antagonista es un ARN de interferencia corto (ARNip) o microARN (miARN); o
    (b) el péptido antagonista es un fragmento de Lrg1, preferentemente que comprende una o más de las 5 secuencias L1-24 (SEQ ID NO: 3), L169-192 (SEQ ID NO: 4) y L227-252 (SEQ ID NO: 5) o una parte de las mismas, que además preferentemente comprende o consiste en los aminoácidos 227-252 de Lrg1.
  10. 10. Un anticuerpo antagonista para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal. 10
  11. 11. Un anticuerpo monoclonal antagonista para uso de acuerdo con la reivindicación 10, que reconoce específicamente un epítopo dentro de la secuencia de L1-24 (SEQ ID NO: 3), L169-192 (SEQ ID NO: 4) o L227-252 (SEQ ID NO: 5) de Lrg1, opcionalmente que reconoce específicamente un epítopo dentro de L227-252 (SEQ ID NO: 5) de Lrg1. 15
  12. 12. Un antagonista de Lrg1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso en combinación con:
    (a) otro producto terapéutico antineoplásico, opcionalmente 20
    en el que el otro producto terapéutico antineoplásico se selecciona de un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento y un anticuerpo monoclonal antineoplásico; y/o
    (b) un compuesto antiangiogénico, preferentemente en el que el compuesto antiangiogénico es un antagonista de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un antagonista de angiopoyetina, un antagonista del factor de crecimiento placentario (PLGF), un antagonista de endoglina, un antagonista de CD160 o un antagonista de 25 quinasa de tipo receptor de activina 1 (ALK1), en el que además preferentemente dicho antagonista de VEGF es un anticuerpo anti VEGF.
  13. 13. Un antagonista de Lrg1 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:
    30
    (a) el antagonista de Lrg1 es para uso en el tratamiento de un cáncer que se selecciona de mieloma, leucemia, tumor de cerebro, tumor de mama, tumor de riñón, tumor colorrectal, tumor de pulmón, tumor de próstata, tumores de cabeza y cuello, tumor de estómago, tumor pancreático, tumor de piel, tumor del cuello uterino, tumor de hueso, tumor ovárico, tumor testicular y tumores del hígado; y/o
    (b) el antagonista de Lrg1 es para administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, 35 intraperitoneal, subcutánea, espinal, parenteral, tópica, epidérmica, subdural, intracraneal, ventricular o mucosa.
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