MX2014010164A - Co-uso de un inhibidor de clusterina con un inhibidor de egfr para tratar cancer. - Google Patents

Abstract

La expresión y fosforilación de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es incrementada en células de cáncer tratadas con anticuerpos anti-clusterina. Tal tratamiento también es acompañado con la reaparición de un fenotipo epitelial de la célula de cáncer, como es determinado por una expresión de E-caderina incrementada en la superficie de células de cáncer. Los inhibidores de clusterina pueden inducir así la reversión del fenotipo epitelial a mesenquimal y restaurar la sensibilidad de células de cáncer a inhibidores de EGFR. Las combinaciones de un inhibidor de clusterina y un EGFR así como su uso en el tratamiento de cáncer también son provistas con la presente.

Description

CO-USO DE UN INHIBIDOR DE CLUSTERINA CON UN INHIBIDOR DE EGFR PARA TRATAR CANCER Campo de la invención La invención se refiere a la combinación de un inhibidor de clusterina con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) para su utilización en el tratamiento del cáncer. Más particularmente, la presente invención engloba el uso de un inhibidor de clusterina, tal como un anticuerpo anticlusterínico, para restaurar la sensibilidad de las células cancerosas a un inhibidor de EGFR o para potenciar el efecto del inhibidor de EGFR.

Antecedentes de la invención El desarrollo de la resistencia a la quimioterapia y la invasión de otros sitios secundarios son características comunes de las neoplasias malignas tumorales sólidas. Es algo muy conocido que el desarrollo de la resistencia a los agentes quimioterapéuticos está provocada por la sobreexpresión de proteínas implicadas en la resistencia a la apoptosis y a los fármacos. El proceso de invasión también está bastante bien documentado. La invasión tumoral está provocada por un aumento en la movilidad de las células tumorales y la expresión de los genes que provocan la degradación de las proteínas en la matriz extracelular. Se dispone de pruebas cada vez mayores de que la resistencia a la quimioterapia y la invasión tumoral puede que compartan un punto de partida común a través de un proceso biológico denominado transición epitelio-mesénquima (EMT, por sus siglas en inglés). Estudios recientes han demostrado que el factor de crecimiento transformante beta (TGFP) puede ser un mediador crucial de la EMT. A pesar de estos avances, se dispone de pocas vías terapéuticas para inhibir el desarrollo de la quimiorresistencia y la diseminación del cáncer a otros órganos. También ha aparecido en la bibliografía reciente que ciertas células tumorales que están experimentando EMT se desdiferencian y adquieren propiedades similares a las de las células madre (células madre cancerosas o CSC, por sus siglas en inglés). Como es el caso para las células madre normales, las CSC son intrínsecamente resistentes a la quimioterapia y a la radioterapia. Por lo tanto, la actuación sobre un regulador específico del mantenimiento de CSC y EMT representa una estrategia terapéutica muy prometedora para aumentar la respuesta a los agentes quimioterapéuticos y para prevenir la recidiva del cáncer.

Utilizando líneas celulares bien caracterizadas como modelos de EMT, se identificaron proteínas que se elevaron tras la inducción de EMT. Se descubrió que una de estas, una proteína secretada denominada clusterina (sCLU , por sus siglas en inglés) se estimulaba durante la EMT y podría, por si sola, promover el proceso de EMT (Lenferink et al. , 2009). Se generaron varios anticuerpos con una elevada afinidad que interaccionaban con sCLU, los cuales se analizaron mediante ensayos basados en células para determinar su capacidad de bloquear la EMT, aquellos anticuerpos que neutralizaron la EMT se unieron todos a la misma secuencia crítica de aminoácidos en la proteína sCLU. Este descubrimiento demostró que una región específica de sCLU era responsable de mediar en su actividad promotora de E T. Bloqueando el epítopo-EMT en sCLU, los anticuerpos, en particular un anticuerpo designado 16B5, podrían bloquear la EMT tal como lo ilustra el mantenimiento de la expresión en la membrana del marcador celular epitelial, cadherina-E, cuando se incubó con células cancerosas. Además, los estudios en animales de xenoinjertos en seres humanos que utilizaban cáncer de próstata y tumores cancerosos pancreáticos mostraron que el bloqueo de la actividad de sCLU asociada al tumor daba como resultado un aumento en la respuesta a los fármacos quimioterapéuticos habituales tales como docetaxel y gemcitabina, medido en función de una reducción significativa en el crecimiento tumoral. En conjunto, estos resultados demuestran que bloquear la EMT con un anticuerpo capaz de interaccionar con una región específica en sCLU dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral y un aumento en la respuesta a los fármacos citotóxicos (remítase a la solicitud internacional No. PCT/CA2006/001505 publicada con el No. WO2007/030930 y la solicitud internacional No. PCT/CA2010/0001882 publicada con el No. WO201 1/063523, cuyo contenido al completo se incorpora a la presente por referencia.

El carcinoma broncopulmonar es uno de los tipos más comunes de cáncer y la principal causa de mortalidad a nivel mundial, con más de un millón de casos diagnosticados anualmente y el carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) representa más de un 80% de todos los carcinomas broncopulmonares. A pesar de las mejoras recientes en las estrategias diagnósticas y terapéuticas, la mayoría de los pacientes se diagnostican cuando el NSCLC está avanzado y la supervivencia mediana sigue siendo baja (Adamo et al., 2009).

Unos de los objetivos más importantes en NSCLC es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un miembro de la familia ErbB de receptores tirosina-cinasas, que es un receptor de la membrana celular que juega un papel importante en la proliferación y supervivencia de las células cancerosas. Es una glucoproteína transmembrana grande que actúa como receptor para EGF y varios ligandos endógenos adicionales. Tiene tres dominios que consisten en una región extracelular, un dominio transmembrana y un dominio tirosina-cinasa (TK, por sus siglas en inglés) intracelular. Desde un punto de vista funcional, la unión del ligando a EGFR induce una dimerización del receptor que conlleva un cambio estructural que promueve la autofosforilación y activación del dominio TK intracelular. En consecuencia, la activación del EGFR influencia múltiples rutas de señalización posteriores, incluidas la proteína cinasa activada por mitógenos/Ras/Raf (MAPK, por sus siglas en inglés) y la ruta de la fosfatidilinositol-3'-cinasa (PI3K, por sus siglas en inglés)/Akt, que influencia la proliferación, invasividad, movilidad, supervivencia y apoptosis celulares (Shigematsu et al., 2005).

Aunque EGFR se expresa ubicuamente, a menudo está modificado en las células tumorales. Estas modificaciones incluyen la amplificación génica, sobreexpresión de ligandos y/o receptores y mutaciones activantes. La sobreexpresión o desregulación de EGFR o de sus ligandos primarios es característica de muchos tumores humanos sólidos, incluidos el carcinoma broncopulmonar. En NSCLC, entre un 43 y un 83% de los tumores sobreexpresan EGFR (Adamo et al., 2009). Varios agentes contra EGFR, tales como los anticuerpos monoclonales cuyo objetivo es el dominio extracelular o las moléculas de bajo peso molecular, son capaces de inhibir la actividad TK.

El estado de EGFR en el NSCLC metastásico y la respuesta a la quimioterapia es objeto de un gran debate. A pesar de la elevada proporción de tumores con un aumento en la expresión de EGFR, algunos estudios clínicos han mostrado que este es un elemento pronóstico deficiente de la respuesta de la terapia de primera línea (Barr et al., 2008). Además, a pesar de una respuesta suave pero significativa en pacientes tratados en primera línea con cisplatino, vinorelbina y cetuximab (anticuerpo monoclonal contra EGFR) en comparación con la quimioterapia sola, no se apreció correlación entre cetuximab y la sobreexpresión de EGFR (Mirshahidi y Hsueh, 2010). En conjunto, una abrumadora cantidad de resultados clínicos con inhibidores de EGRF en NSCLC mostraron que el estado del receptor no era importante en la terapia de primera línea hasta que un estudio reciente presentó resultados que mostraban que los pacientes con una expresión elevada de EGFR que se trataron con cetuximab y quimioterapia exhibieron un aumento en la supervivencia global en comparación con la quimioterapia sola (Pirker et al., 2012). A partir de estos resultados está claro que existen otros mecanismos que implican EGFR en tumores que influencian la respuesta de los pacientes con NSCLC respecto a los i nhibidores de EG FR .

Algunas características adicionales de EG FR q ue es probable que i nfluencien la respuesta de los inhibidores son aquellas que permiten la unión de moléculas de bajo peso molecular respecto a la actividad TK del receptor. Se han desarrollado y aprobado unos pocos indicados para el cáncer incluidos gefiti nib y eriotinib, dos moléculas de bajo peso molecular que mimetizan la unión de ATP a esta región y previenen de este modo la señalización intracelular. No se observó que ninguno de estos i nhibidores fuera activo en NSC LC como terapia de primera línea , pero se log raron respuestas clínicas significativas en un contexto de seg unda y tercera línea (M irshahidi y Hsueh, 2010) . De manera interesante, la sobreexpresión de EGFR no tuvo influencia en la respuesta de los pacientes pero se descubrió que las mutaciones activantes en EG FR y ciertos genes diferentes eran cruciales. Por ejem plo, se observó que las mutaciones activantes cond ucían a un aumento significativo en la supervivencia sin progresión en pacientes tratados con gefitinib (Costanzo et al. , 201 1 ) . Además, los pacientes con N SC LC tratados con eriotinib que tam bién presentaban m utaciones en un gen denom inado KRAS , no mostraron respuesta (Herbst y Sandler, 2008) . Por lo tanto , la selección del paciente es crucial para intentar entender si responderán a los inhibidores de EG FR TK.

Tal como se ha descrito anteriormente, la E MT puede tener una influencia tremenda en la manera en la que las células tumorales responderán a la terapia y la capacidad de las células cancerosas para permanecer como epiteliales es crucial para esta respuesta. En los estudios basados en células, las células que tienen un aumento de la expresión del marcador de células epiteliales, cadherina-E, son más sensibles a los inhibidores de EGFR (Barr et al., 2008). De acuerdo con estas observaciones, existe una correlación entre la expresión de la cadherina-E y la sensibilidad a erlotinib (Yauch er al., 2005). En el nivel tumoral, se ha mostrado que la restauración de la expresión de la cadherina-E aumenta la sensibilidad a los inhibidores de EGFR (Witta et al., 2006). Hasta la fecha, sin embargo, el nexo entre la EMT y el estado de EGFR en los ensayos clínicos no se ha examinado claramente. Sin embargo, dada la falta de correlación entre la sobreexpresión de EGFR y la respuesta a los inhibidores de EGFR y la influencia de las mutaciones de EGFR activantes sobre su respuesta, es probable que influencias adicionales, tal como la EMT, puedan estar implicadas directamente en aumentar la eficacia de los inhibidores de EGFR en pacientes con NSCLC.

Esta presente solicitud proporciona un método de tratamiento con un anticuerpo que bloquea la EMT inhibiendo sCLU en tumores que expresan EGFR. El estado de EGFR en estos tumores puede incluir amplificaciones del gen EGFR o amplificación en los ligandos de EGFR. Además, las células tumorales pueden incluir un aumento en la señalización autocrina a través de EGFR y las parejas proteicas de EGFR. El estado de EGFR también puede incluir mutaciones activantes en EGFR que provocan que el receptor exhiba un aumento de la actividad. En otra modalidad, los tumores pueden ser sensibles o resistentes a los inhibidores de EGFR, incluidos los anticuerpos monoclonales contra EGFR o los inhibidores con un bajo peso molecular que anulan la actividad de EG FR . Además, el estado de E GFR también puede incluir tumores que carecieron a priori de la expresión de EGFR que han readquirido EGFR .

Cuando las l íneas celulares NSCLC que expresan sCLU están expuestas al anticuerpo anticiusterlnico, tanto la expresión como la activación de EG FR aumentan . Paralelamente, en virtud de la inhibición de la EMT por parte del anticuerpo anticiusterlnico, las lineas celulares N SCLC también muestran un aumento en la expresión de la cadherina-E . En conjunto, los pacientes con NSCLC tratados con un inhibidor de clusterina junto con inhibidores de EG FR pueden mostrar un aumento en la respuesta respecto a los inhibidores de EGFR .

Breve descripción de la i nvención La presente invención se refiere generalmente a una combinación de un inhibidor de clusterina e inhibidores de EG F R para el tratamiento del cáncer.

Los métodos de la presente invención engloban la adm inistración de un inhibidor de clusterina capaz de inhibir la transición epitelio-mesénquima (EMT) y un inhibidor de EGFR a un individuo que lo necesite. También se puede adm inistrar un inhibidor de EG FR por separado, a la vez o secuencialmervte respecto al inhibidor de clusterina.

E l inhibidor de clusterina se puede administrar especialmente cuando se observa, detecta o sospecha resistencia a EGFR .

Los métodos de la presente i nvención tam bién comprenden administrar un inhibidor de clusterina para prevenir la resistencia a EGFR o para sensibilizar células cancerosas a un inhibidor de EGFR.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Líneas celulares de carcinoma broncopulmonar expresan clusterina. Esta figura muestra el análisis por RT-PCR de la expresión de mRNA de clusterina en varias líneas celulares derivadas de NSCLC (recuadro superior). Como control, también se amplificó el mRNA procedente de la actina (recuadro inferior) para garantizar las mismas cantidades de material de partida en cada reacción.

Figura 2. Líneas celulares de carcinoma broncopulmonar expresan clusterina (sCLU). Esta figura muestra la cuantificación de sCLU que se secreta por parte de las líneas celulares de carcinoma broncopulmonar. Se midieron las cantidades con una ELISA específica de sCLU y se expresaron en ng/mL.

Figura 3. h16B5 aumenta la expresión de la cadherina-E en líneas celulares de carcinoma broncopulmonar. Esta figura demuestra el aumento en el carácter epitelial de las células NSCLC A549 cuando se incubaron con el inhibidor de sCLU, h16B5. El recuadro izquierdo muestra las células incubadas con una IgG de control durante 48 h mientras que el recuadro derecho muestra células incubadas con h16B5 en condiciones idénticas.

Figura 4. El tratamiento de células NSCLC con h16B5 da como resultado un aumento en la expresión de EGFR. Se midió la expresión de EGFR en presencia del vehículo de control o h16B5 utilizando un anticuerpo específico para EGFR en lisados de células enteras preparados a partir de células A549 o H226.

Figura 5. El tratamiento de células NSCLC con h16B5 da como resultado un aumento en la fosforilación de EGFR. Se midió la fosforilación de EGFR en presencia del vehículo de control o h16B5 utilizando un anticuerpo específico para fosfotirosina en lisados de células enteras preparados a partir de células A549 o H226.

Figura 6. El tratamiento de células NSCLC con h16B5 da como resultado un aumento en la fosforilación de EGFR. Se midió la fosforilación de EGFR en presencia del vehículo de control, h16B5 o una IgG de control utilizando un anticuerpo específico para fosfotirosina en lisados de células enteras preparados a partir de células A549 o H226.

Figuras 7A-B. La combinación de h16B5 con erlotinib da como resultado un aumento en el efecto antitumoral. Se determinó la supervivencia de células cancerosas H1299 y H460 en presencia de una combinación de h16B5 con erlotinib en presencia o ausencia de una clusterina recombinante.

Descripción detallada de la invención Se sobreexpresó el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) en varios tipos de carcinomas epiteliales. La existencia de alteraciones genéticas EGFR puede hacer que los tumores sean más susceptibles a los inhibidores de EGFR. Sin embargo, los pacientes con una respuesta inicial a los inhibidores de EGFR-tirosina-cinasa (TKI) recaen en el transcurso promedio de un año. Aunque se ha mostrado que las eliminaciones en el exón 9 de EGFR o las mutaciones L858R dan como resultado un desenlace clínico favorable, los eventos moleculares secundarios tales como las mutaciones T790M, L747S y/o D761Y se asocian con la resistencia y la recidiva tumoral. Tanto la amplificación del receptor MET como la activación de la señalización IGFR que activan la ruta PI3/AKT independientemente de EGFR también han demostrado dar lugar a resistencia secundaria.

La solicitante ha llegado al descubrimiento inesperado de que la expresión y fosforilación de EGFR aumenta en las células cancerosas tratadas con un inhibidor de clusterina. El tratamiento de las células cancerosas con el inhibidor de clusterina también está acompañado por la reaparición de un fenotipo epitelial de las células cancerosas, tal como lo ilustra un aumento en la expresión de la cadherina-E en la superficie celular.

Por lo tanto, no solamente los inhibidores de clusterina pueden inducir la inversión del fenotipo EMT, también pueden restaurar la sensibilidad de las células cancerosas a los inhibidores de EGFR.

La presente invención se refiere generalmente a una combinación de un inhibidor de clusterina e inhibidores de EGFR para su utilización en el tratamiento del cáncer.

La combinación farmacéutica puede comprender en particular un inhibidor de clusterina asociado con un portador farmacéuticamente aceptable y un inhibidor de EGFR asociado con un portador farmacéuticamente aceptable.

Los métodos de la presente invención engloban la administración de un inhibidor de clusterina y un inhibidor de EGFR a un individuo que lo necesite. El inhibidor de EGFR se puede administrar por separado, a la vez o secuencialmente respecto al inhibidor de clusterina.

El inhibidor de clusterina se puede administrar especialmente cuando se observa, detecta o sospecha resistencia a EGFR.

Los métodos de la presente invención también comprenden administrar un inhibidor de clusterina para prevenir la resistencia a EGFR o para sensibilizar células cancerosas a un inhibidor de EGFR.

En un aspecto de la invención, el inhibidor de clusterina se puede administrar antes que el inhibidor de EGFR. Por ejemplo, el inhibidor de clusterina se puede administrar entre unas pocas horas y varios días o meses antes de la administración del inhibidor de EGFR. En otro aspecto de la invención, el inhibidor de clusterina también se puede administrar a la vez (p. ej., el mismo día) o entre cada tratamiento con el inhibidor de EGFR.

De acuerdo con la presente invención, el inhibidor de clusterina se puede administrar en múltiples dosis antes de la administración del inhibidor de EGFR, p. ej., a diario, en días alternos, una vez por semana, dos veces por semana, etc.

El método también puede comprender analizar la inversión de fenotipo epitelial a mesenquimatoso de las células cancerosas antes de la administración del inhibidor de EGFR. El estado de la E T se puede determinar, por ejemplo, midiendo los niveles de expresión de uno o más genes/proteínas seleccionados entre cadherina-E, RAB25, integrina beta 6, vimentina, ZEBI y SIPI.

Los inhibidores de clusterina se pueden identificar por su capacidad para perjudicar la expresión, secreción de clusterina o la actividad de clusterina .

Las modalidades ilustrativas de los inhibidores de clusterina incluyen aq uellos identificados, por ejem plo , por su capacidad para interferir con el efecto promotor de la E MT de la clusterina secretada (sCLU) o de TG F-ß. Por ejem plo, las células de carcinoma (p. ej . , 4T 1 : células de carcinoma de mama, DU 145: células de cáncer de próstata, etc.) se pueden tratar con un inh ibidor de clusterina putativo en presencia de TG F-ß o sCLU y se pueden evaluar m arcadores de la E MT tal como se describe posteriormente. Un com puesto putativo, que es capaz de incrementar la expresión de marcadores epiteliales y/o reducir la expresión de marcadores mesenquimatosos, se puede identificar como un inhibidor de clusterina adecuado.

Como alternativa, se puede evaluar la movilidad de las células de carcinoma en presencia del inhibidor de clusterina putativo. Por ejem plo, las células de carcinoma se pueden tratar con un inhibidor de clusterina putativo en presencia de TG F-ß o sCLU y se puede llevar a cabo un ensayo de cicatrización o un ensayo de movilidad con tinta negra tal como se describe, por ejem plo, en PCT/CA2006/001 505. Se puede identificar un compuesto putativo, el cual es capaz de inhibir o reducir la movilidad de las células de carcinoma en estos tipos de ensayos, como un inhibidor de clusterina adecuado. Se sobreentiende q ue se pueden utilizar otras técn icas para identificar inhibidores de clusterina adecuados.

Los inhibidores de clusterina englobados particularmente por la presente invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos anticlusterínicos o fragmentos de unión al antígeno de estos.

De acuerdo con la presente invención, los inhibidores de clusterina incluyen los anticuerpos anticlusterínicos o los fragmentos de unión al antígeno capaces de inhibir la EMT (p. ej., en las células de carcinoma).

Los marcadores moleculares de la EMT utilizados habitualmente incluyen, por ejemplo, una reducción de la expresión de cadherina-E, citoqueratina y ß-catenina (en la membrana) y/o un aumento de la expresión de Snail, Slug, Twist, ZEB1, ZEB2, cadherina-N, vimentina, a-actina del músculo liso, metaloproteinasas de la matriz, etc. (remítase, por ejemplo, a Kalluri y Weinberg, The Journal oí Clinical Investigation, 119(6), págs. 1420-1428; 2009; Fassina et al., Modern Pathology, 25; págs. 86-99; 2012; Lee eí al., JCB; 172; págs. 973-981; 2006). También se puede distinguir un fenotipo EMT mediante un aumento de la capacidad de migración, invasión o por la resistencia a anoikis/apoptosis. Por lo tanto, las células que están experimentando una transición epiteiio-mesénquima se pueden detectar mediante una reducción de los marcadores epiteliales y la aparición de marcadores mesenquimatosos o fenotipos EMT.

La expresión de los marcadores se puede determinar generalmente comparando su nivel de expresión celular (a nivel genético o a nivel proteico (p. ej., incluida la expresión en la superficie celular) en un estado en comparación con otro estado. Por ejemplo, se puede determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores específicos en células cancerosas en comparación con células no cancerosas. Como alternativa, se puede determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores específicos en las células cancerosas que son resistentes a un inhibidor de EGFR en comparación con las células cancerosas que son sensibles al inhibidor de EGFR. Además, se puede evaluar el nivel de expresión de uno o más marcadores específicos sobre los valores que son estadísticamente representativos de los controles.

Los individuos que se beneficiarían de un tratamiento de este tipo incluyen aquellos que tienen un carcinoma (es decir, carcinoma epitelial) incluido el cáncer de próstata, cáncer de mama (p. ej . , triple negativo o basaloide) , carcinoma endometrial, carcinoma ovárico, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, carcinoma de cabeza y cuello (p. ej., carcinoma escamoso de cabeza y cuello), carcinoma broncopulmonar (p. ej., carcinoma broncopulmonar no microcítico), cáncer pancreático, carcinoma de células renales, etc. (incluidas las formas metastásicas o avanzadas de estos tipos de cáncer).

Las modalidades ilustrativas de anticuerpos anticlusterínicos que se pueden utilizar para llevar a cabo la presente invención incluyen aquellos que son capaces de unirse a los aminoácidos 421 y 443 de la porción de extremo C de una subunidad ß de la clusterina humana. Las modalidades más particulares de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno englobadas por la presente invención incluyen aquellos descritos en la solicitud internacional No. PCT/CA2006/001505 publicada con el No. WO2007/030930 y la solicitud internacional No. PCT/CA2010/0001882 publicada con el No. WO2011/063523.

La presente invención engloba especialmente los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que tienen al menos una región determinante de la complementariedad (CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y/o CDRL3) idéntica a aquellas de los anticuerpos identificados como 16B5, 21B12, 20E11, 16C11 y 11E2. Más concretamente, la presente invención engloba especialmente los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que tienen una cadena ligera y/o una cadena pesada idéntica a aquellas de los identificados como 16B5, 21B12, 20E11, 16C11 y 11E2 (remítase también a PCT7CA2006/001505) o a aquellos identificados como 16B5 humanizado (h16B5), 21B12 humanizado (h21B12), consenso 1 de VL de h16B5, consenso 2 de VL de h16B5, consenso 3 de VL de h16B5, consenso 1 de VH de h16B5, consenso 2 de VH de h16B5, consenso 3 de VH de h16B5, consenso 1 de VL de h21B12, consenso 2 de VL de h21B12, consenso 3 de VL de h21B12, consenso 1 de VH de h21B12, consenso 2 de VH de h21B12 o consenso 3 de VH de h21B12 (remítase también a PCT/CA2010/0001882).

La secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y/o de la cadena ligera del anticuerpo identificado como 20E11, 16C11 y 11E2 se presentan en las SEQ ID Nos.: 62-67, donde se muestran en negrita las regiones determinantes de la complementariedad predichas.

Otras modalidades ilustrativas de los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno incluyen aquellas que pueden competir con los anticuerpos identificados en la presente.

La invención engloba anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos (aislados), así como también fragmentos de unión al antígeno que tengan las características que se describen en la presente. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que contienen permutaciones de las cadenas ligera y/o pesada entre un anticuerpo monoclonal, quimérico, humanizado o humano también se engloban en la presente.

Por lo tanto, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la presente invención pueden comprender aminoácidos de una región constante humana y/o aminoácidos de armazón de un anticuerpo humano.

El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, anticuerpos monoclonales o policlonales. El término "anticuerpo" también engloba anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos humanos normalmente están constituidos por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende regiones variables y regiones constantes. La región variable de la cadena ligera comprende 3 CDR, que se identifican en la presente como CDRL1, CDRL2 y CDRL3, flanqueadas por regiones de armazón. La región variable de la cadena pesada comprende 3 CDR, que se identifican en la presente como CDRH1, CDRH2 y CDRH3, flanqueadas por regiones de armazón.

La expresión "fragmento de unión al antígeno", tal como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que mantienen la capacidad de unirse a un antígeno (p. ej., KAAG1, una forma secretada de KAAG1 o sus variantes). Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser ejecutada por fragmentos de un anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de unión englobados en la expresión "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VL, VH, CL y CHi; (i¡) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CHi; (¡v) un fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que está constituido por un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad aislada (CDR), p. ej., CDR3 de VH. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estén codificados por genes diferentes, estos se pueden unir utilizando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que permita prepararlos como una cadena polipeptídica única en la que las regiones VL y VH se apareen para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); remítase, p. ej., a Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena única queden englobados en la expresión "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo. Además, los fragmentos de unión al antígeno incluyen proteínas de fusión de la inmunoglobulina del dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido del dominio de unión (tal como una región variable de la cadena pesada, una región variable de la cadena ligera o una región variable de la cadena pesada fusionada con una región variable de la cadena ligera mediante un péptido conector) que está fusionado con un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2. La región bisagra se puede modificar reemplazando uno o más residuos de cisteína por residuos de serina para evitar la dimerización. Tales proteínas de fusión de la inmunoglobulina del dominio de unión se describen adicionalmente en US 2003/01 18592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica y los fragmentos se analizan para determinar su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

Un sitio de unión al antígeno típico está constituido por las regiones variables formadas por el apareamiento de una inmunoglobulina de cadena ligera y una inmunoglobulina de cadena pesada. La estructura de las regiones variables del anticuerpo es muy uniforme y exhibe estructuras muy similares. Normalmente, estas regiones variables están constituidas por regiones de armazón (FR, por sus siglas en inglés) relativamente homólogas intercaladas con tres regiones hipervariables denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La actividad de unión global del fragmento de unión al antígeno está determinada a menudo por la secuencia de las CDR. Las FR suelen desempeñar una función en el posicionamiento y el alineamiento adecuados en tres dimensiones de las CDR para una unión al antigeno óptima.

Los anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de la presente invención se pueden originar, por ejemplo, a partir de un ratón, una rata o cualquier otro mamífero o a partir de otras fuentes tales como a través de tecnologías de DNA recombinante.

Otro inhibidor de clusterina puede incluir, por ejemplo, y sin carácter limitante, siRNA (p. ej., cuyo objetivo es el RNA de la clusterina) y antisentido (p. ej., cuyo objetivo es el RNA de la clusterina).

Las modalidades ilustrativas de inhibidores antisentido incluyen, por ejemplo, aquellas descritas en la patente de EE. UU. No. 7.569.551 (cuyo contenido al completo se incorpora a la presente por referencia) e incluyen especialmente OGX-011 (también conocido como custirsen sodio, OncoGenex, remítase también a la SEQ ID NO.:61).

La modalidad ilustrativa de inhibidores de EGFR incluye inhibidores de tirosina-cinasa tales como, por ejemplo, gefitinib, erlotinib, imatinib, lapatinib o semazinib. Otras modalidades ilustrativas de inhibidores de EGFR incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales tales como cetuximab, panitumumab, nimotuzumab o metuzumab.

Otros individuos que se beneficiarían del tratamiento con combinaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen aquellos que tienen un tumor que es resistente a uno o más inhibidores de EGFR. Tales individuos se pueden seleccionar antes de la administración de la combinación farmacéutica.

La resistencia a EGFR se puede determinar evaluando parámetros clínicos tales como la recidiva tumoral o midiendo marcadores moleculares de resistencia, p. ej., mutaciones, amplificaciones en EGFR o en la ruta EGFR (rutas SRC/FAK, fosfatidilinositol-3-cínasa/AKT, fosfolipasa C, RAS/MAPK, etc.) y/o marcadores de la EMT.

Por lo tanto, análisis de la resistencia a un inhibidor de EGFR puede incluir determinar la presencia de una mutación en EGFR (p. ej., mutación en el dominio tirosina-cinasa, mutaciones por truncamiento, Inserciones) o determinar la amplificación de EGFR.

Las expresiones "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéutico", tal como se utilizan en la presente, son conocidas en la técnica e incluyen, sin carácter limitante, tampón de fosfato 0.01-0.1 M o 0.05 M o solución salina al 0.8%. De forma adicional, tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son propilengllcol, polletilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas/alcohólicas, incluidos los medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, cloruro sódico y dextrosa, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de nutrientes y fluidos, reponedores de electrolitos tales como los basados en la dextrosa de Ringer y similares. También puede haber conservadores y otros aditivos presentes tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, adherentes, gases inertes y similares.

Los experimentos descritos en la presente se llevaron a cabo con una forma humanizada de 16B5 (h16B5).

Ejemplos Ejemplo 1 Las líneas celulares NSCLC expresan sCLU Los autores desearon determinar si la clusterina se expresaba en líneas celulares derivadas de tumores NSCLC. Como primer paso, se preparó el RNA total de cada línea celular y se utilizó como un molde para preparar cDNA con oligonucleótidos cebados aleatoriamente. Se llevó a cabo RT-PCR utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica con oligonucleótidos específicos del gen humano de la clusterina. El cebador 5' (ogs1788) está codificado por la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO:57 y el cebador 3' (ogs1721) está codificado por la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO:58. El producto de PCR tiene una longitud de 1412 pb. Como un control para la cantidad de RNA total en cada reacción, se llevó a cabo una reacción de RT-PCR paralela con oligonucleótidos específicos para el gen constitutivo humano de la actina. El cebador 5' (ogs387) está codificado por la secuencia que se muestra en la SEQ I D N0.59 y el cebador 3' (ogs965) está codificado por la secuencia que se muestra en la SEQ I D N O:60. El producto de PCR tiene una longitud de 746 pb. Tal como se m uestra en la Figura 1 , todas las líneas celulares de NSCLC analizadas excepto una contuvieron mRNA que codificaba clusterina, el cual se detectó a diferentes niveles. Tal como se esperaba, la acti na estuvo presente en todas las muestras de RNA lo que indica que hubo una cantidad aproximadamente igual de RNA total de partida en cada reacción de RT-PCR . Las l íneas celulares utilizada en este análisis fueron: carril 1 , A549; carril 2, EKVX; carril 3, HOP-62; carri l 4, HOP-92; carril 5, H322M ; carril 6, H226; carril 7, H23; carril 8, H460; y carril 9, H522.

Se determinó en paralelo si las líneas celulares N SC LC secretaban sCLU . Las células A549, H226 , H292 , H460 y H 1 299 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del prod uctor. Tras varios d ias de cultivo, y cuando las células habían alcanzado la confluencia, se recogió el medio acondicionado de cada l inea celular para su análisis. Se adquirió un kit de ELI SA comercial (BioVendor LLC , Candler, NC) diseñado para medir la clusterina humana y se llevó a cabo el análisis de acuerdo con las i nstrucciones del fabricante. Tal como se muestra en la tabla de la Figura 2, las cinco muestras de medio contuvieron niveles de sCLU com prendidos entre 1 3.6 ng/mL y más de 100 ng/mL, con la excepción de la línea celular H226 que tuvo niveles inferiores a 10 ng/mL.

En conjunto, estos resultados muestran que las líneas celulares cancerosas derivadas de pacientes con NSCLC secretan sCLU en abundancia y tienen el potencial de responder a los anticuerpos, tales como h16B5, para inhibir la actividad inductora de la EMT de sCLU.

Ejemplo 2 La incubación de células NSCLC con h16B5 conlleva un aumento de la expresión del marcador celular epitelial, cadherina-E Los autores también examinaron la expresión de la cadherina-E monitorizando su expresión en la superficie de células A549 utilizando inmunofluorescencia. Resumiendo, las células se sembraron en cubreobjetos y se incubaron con una IgG de control o h16B5 con una concentración de 10 pg/mL durante 48 h. Tras esta incubación, se fijaron las células con paraformaldehído y se incubaron con un anticuerpo murino contra la cadherina-E humana (fabricante) durante 1 h. Después de lavar, las células con cadherina-E teñida se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con Rhodamine Red-X. Los portaobjetos se montaron y se visualizó la tinción de cadherina-E específica mediante microscopía de fluorescencia. Tal como se muestra en la Figura 3, las células A549 tiene una expresión baja de cadherina-E sobre su superficie celular y la incubación durante 48 h con una IgG no específica no incrementó el nivel de esta proteína (remítase al recuadro izquierdo). Por el contrario, la incubación de las células con h16B5 provocó un aumento marcado en la intensidad de la tinción de la cadherina-E sobre la superficie de las células A549 (remítase al recuadro derecho). Esto indica que el carácter epitelial de las células es muy elevado.

Ejemplo 3 La inhibición de sCLU con h16B5 provoca un aumento en la expresión y fosforilación de EGFR en las células NSCLC En este ejemplo, los autores examinaron si la inhibición de la E T utilizando h16B5 daba como resultado algún efecto sobre el estado de EGFR en líneas celulares de NSCLC. Con el fin de abordar esta cuestión, se optimizaron las condiciones para medir la expresión y fosforilación del receptor en estas células. Se sabe que EGFR se fosforita muy rápidamente tras las exposición a sus ligandos, incluido EGF. En paralelo con esta fosforilación, se internaliza y se recicla el receptor y se pierde su presencia en la superficie celular. Para este análisis se seleccionaron dos líneas celulares, A549 y H226, que secretan niveles relativamente elevados de sCLU. Se sembraron las células en placas multipocillo y se trataron durante 48 h con 10 pg/mL de h16B5, 10 pg/mL de vehículo o IgG de control, PBS. Tras esta incubación, se trataron las células con EGF (10 ng/mL), se recolectaron las células en diferentes momentos y se convirtieron en Usados. Estos Usados se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de nailon y se utilizaron en inmunoelectrotransferencia para examinar la expresión o fosforilación de EGFR. Para medir la expresión de EGFR, se utilizó un anticuerpo comercializado denominado clon 1005 (Santa Cruz, Biotech, Santa Cruz, CA) mientras que la fosforilación de EGFR se monitorizó con un anticuerpo antifosfotirosínico denominado clon 4G10 (Millipore, Etobicoke, ON). Tal como se muestra en la Figura 4, las células A549 que se trataron con el vehículo de control durante 48 h y a continuación con EGFR mostraron una disminución en la expresión de EGFR, tal como se esperaba, que se restauró rápidamente tras 10 min (recuadro superior: compare el carril 1 con el carril 2). Por el contrario, las células A549 tratadas con el anticuerpo anti-sCLU h16B5 protegieron a las células frente a la degradación del receptor inducida por EGF (recuadro superior: compare el carril 5 con el carril 6). Para controlar la cantidad de proteína en cada carril, se volvió a realizar una transferencia a la membrana con un anticuerpo antiactínico (clon AC-15, Sigma, Oakville, ON), el cual se expresó de manera equitativa entre las diferentes muestras separadas en el gel. Se examinó H226, la otra línea celular NSCLC, utilizando la misma estrategia (recuadro inferior) y los resultados que se observaron fueron similares a aquellos observados con células A549. En este caso, la degradación de EGFR inducida por EGF fue incluso más pronunciada cuando las células se trataron con el control durante 48 h (recuadro inferior, carriles 1-4). En el caso de las células tratadas con h16B5, no se observó descenso en EGFR (recuadro inferior, carriles 5-8). De nuevo, esto muestra que la inhibición de sCLU con un anticuerpo da como resultado el mantenimiento de la expresión de EGFR. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que las células deberían mostrar un aumento de sensibilidad a los inhibidores de EGFR.

También se examinó la activación de EGFR en estas células. En este caso, se realizaron transferencias a las membranas con un anticuerpo que interacciona únicamente con la forma tirosina-fosforilada del receptor. En las células A549, no se observó fosforilación de EGFR en ausencia de EGF (remítase a la Figura 5, recuadro superior, carril 1 y carril 5) tal como se esperaba. Sin embargo, cuando las células se trataron con EGF, se detectó la aparición de residuos de tirosina fosforilados, incluso tras 2 min (recuadro superior, carril 2 y carril 6). Las células que se trataron con h16B5 durante 48 h mostraron una mayor cantidad de residuos de tirosina fosforilados en el EGFR en comparación con las células que se dejaron sin tratar. Esta diferencia en la fosforilación de EGFR se reprodujo en las células H226 (remítase a la Figura 5, recuadro inferior, compare los carriles 2-4 con los carriles 6-8). Como un control adicional, las células A549 también se trataron con un anticuerpo de control durante 48 h antes de ser expuestas a EGF (Figura 6). De nuevo, el cambio en la cantidad de fosforilación de EGFR se observó únicamente en las células que se trataron con h16B5 (compare los carriles 2, 3 (control) y 8, 9 (IgG) con los carriles 5, 6 (H16B5)).

En conjunto, los resultados de los autores muestran que bloquear la EMT en las células de carcinoma broncopulmonar influencia el estado de EGFR en estas células. En concreto, la inhibición de la actividad inductora de la EMT de sCLU con un anticuerpo monoclonal, tal como h16B5, es uno de los mecanismos por los cuales se altera el estado de EGFR en estas células cancerosas. Los autores han mostrado que las células de carcinoma broncopulmonar que se trataron con h16B5 han aumentado la expresión de cadherina-E y, por lo tanto, son más epiteliales. La combinación de un aumento en la sensibilidad de EGFR con la inhibición de la EMT bloqueando sC LU con un anticuerpo, se espera que aumente la eficacia de los inhibidores de EGFR . Finalmente, se espera que cualesquiera células cancerosas q ue expresen EGFR y experimenten EMT respondan a un inhibidor de sCLU , tal como un anticuerpo monoclonal, de modo similar a las células de carcinoma broncopulmonar.

Ejem plo 4 Un método para incrementar la sensibilidad de las células cancerosas a los inhibidores de EGFR en presencia de h 16B5 La inhibición de la E MT en células cancerosas bloq ueando sCLU con un anticuerpo anticlusterínico conlleva un aumento en la expresión de EGFR en la superficie de las células o un aumento en la fosforilación de EGF R o am bos. Por lo tanto, se espera que los i nhibidores de EG FR tengan una mayor eficacia en condiciones en las que la E MT es inhibida con inhibidores de cl usterina.

Por ejem plo, las l íneas celulares cancerosas se siembran en placas multipocillo y cuando están cerca de la confluencia, se tratan las células con un anticuerpo anticlusterínico (p. ej . , h 1 6B5) para inhibir la E MT. Puede ser útil inducir la EMT a priori con i nductores conocidos tales como sCLU , TGFp\ ligandos de EGFR tales como EGF u otras moléculas sim ilares.

El inhibidor de EG FR (p. ej. , anticuerpos monoclonales que bloquean la unión del ligando al receptor o que evitan la dimerización de EGFR, inhibidores de TK, etc.) también se añade a los pocilios bien junto con el anticuerpo anticlusterínico o más tarde (p. ej., unas pocas horas más tarde). En algunos casos, el inhibidor de EGFR se puede añadir a los pocilios antes que el anticuerpo anticlusterínico.

El inhibidor de EGFR se puede añadir con concentraciones diferentes comprendidas en el intervalo entre un fmol/L y cien micromol/L. Para determinar si la citotoxicidad de los inhibidores de EGFR aumenta cuando se inhibe sCLU con h16B5, se determinó el número de células restantes utilizando protocolos habituales tales como ensayos de proliferación, ensayos de invasión, ensayos de apoptosis o ensayos de migración. Las células cancerosas apropiadas para este ensayo incluyen células cancerosas resistentes al inhibidor de EGFR o células cancerosas que expresan EGFR natural, EGFR que contiene mutaciones activantes, amplificaciones génicas de EGFR y otras situaciones en las que el estado de EGFR pueda estar alterado.

La combinación del inhibidor de clusterina y el inhibidor de EGFR también se puede estudiar in vivo en modelos bien establecidos de cáncer. Por ejemplo, las líneas celulares cancerosas humanas que expresan EGFR se inyectan en ratones inmunodeficientes y se permite que crezcan hasta que se implantan xenoinjertos tumorales. Se trataron los animales con un anticuerpo anticlusterínico (p. ej., 16B5, h16B5 u otro) para bloquear la EMT combinado con un inhibidor de EGFR (administrado simultánea o secuencialmente). Se monitorizó el crecimiento de los tumores por diversos métodos que incluyen mediciones del tamaño directas con instrumentos tales como un compás calibrador. Otros métodos utilizados para medir el crecimiento tumoral incluyen la fluorescencia o bioluminiscencia en el caso en que las células tumorales se modifiquen genéticamente para expresar moléculas fluorescentes o bioluminiscentes. En otro caso, el crecimiento tumoral se podría monitorizar utilizando estrategias de barrido por tomografía computarizada (CT, por sus siglas en inglés) o tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés). En estos ensayos, el inhibidor de clusterina y el inhibidor de EGFR se pueden administrar repetidamente por diversas vías que incluyen la vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratumoral u oral. Las dosis típicas podrán estar comprendidas en el intervalo entre 1 microgramo/kg y 100 mg/kg.

En función de la aplicación de este método, será posible demostrar que el tratamiento de un agente que bloquea la EMT, tal como 16B5, h16B5 u otro, combinado con un inhibidor de EGFR dará como resultado un efecto antitumoral intensificado en comparación con cualquier agente administrado por separado.

En este ejemplo, los autores demuestran que la respuesta de las células cancerosas a los inhibidores de EGFR se puede aumentar cuando se administran combinados con un inhibidor de sCLU, tal como h16B5. Dos líneas celulares NCSLC, H12299 y H460, que se sabe que expresan EGFR natural (Akashi et al., 2008) se trataron bien con sCLU (0.25 Mg/ml), bien con TGF (2 nM) o con la combinación de ambas proteínas durante 48 h antes de estimular la EMT. Tras esta inducción, se trataron las células con eriotinib (20 µ?) durante 96 h y se determinó el número de células utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CelITiter-Glo® (Promega, Madison, Wl) . Como control, células adicionales no se indujeron con sCLU o TGFp. Tal como se muestra en la Figura 7A, las células H 1299 fueron más sensibles a eriotinib que las células H460. La combinación de eriotinib con h 16B5 dio como resultado una disminución adicional en el número de células (un 10.2% y un 13.8% menos de células H 1 299 y H460, respectivamente) lo que indica que el bloqueo de la actividad de la sCLU expresada endógenamente (remítase a la Figura 2) intensificó la capacidad de eriotinib para destruir células de carcinoma broncopulmonar con EGFR. Los autores también compararon la respuesta de eriotinib en células que se indujeron para que experimentaran la EMT con sCLU o TGF . Tal como se muestra en la Figura 7B, la estimulación de la EMT no cambió la respuesta de las células a eriotinib. Sin embargo, el descenso en el número de células fue mayor en presencia de h16B5 en estas condiciones en comparación con las células que no estaban experimentado la EMT (un 16.1 % y un 24.0% para células H 1299 y H460 respectivamente) . Esto indica que el aumento de la respuesta a eriotinib es mayor en las células cuando se inhibe la EMT. Cabe observar que el aumento en la respuesta a eriotinib fue mayor en células H460, que son más resistentes a este inhibidor de EGFR. Este último resultado ilustra el potencial de la inhibición de sCLU con h16B5 como una estrategia para tratar pacientes con carcinoma broncopulmonar que han adquirido resistencia a los inhibidores de EGFR.

Ejemplo 5 Combinación farmacéutica para su uso en otras indicaciones para el cáncer La línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 , de la que se sabe que es triple negativa (es decir, carencia de la expresión de los receptores de estrógeno y progesterona y ausencia de la expresión de HER2) o basaloide se trató con un anticuerpo anticlusterínico combinado con gefitinib o con gefitinib solo. Se midió el crecimiento celular a lo largo de un periodo de varios días mediante ensayos habituales.

Este experimento muestra que la combinación del anticuerpo anticlusterínico con gefitinib es más eficaz inhibiendo el crecimiento de las células tumorales que el gefitinib solo (datos que no se muestran).

Se pueden estudiar otras combinaciones de inhibidores de clusterina y/o inhibidores de EGFR utilizando técnicas similares a aquellas descritas en los Ejemplos 1-5.

Breve descripción del listado de secuencias SEQ ID NO.:1 16B5 CDRH1: GFNIKDIY H SEQ ID NO.:2 16B5 CDRH2: RIDPAYGNTKYDPKFQG SEQ ID NO.:3 16B5 CDRH3: RYDTA DY SEQ ID NO.:4 16B5 CDRL1: KSSQSLLNSRTRKNYLA SEQ ID N0.:5 16B5 CDRL2: WASTRES SEQ ID N0.:6 16B5 CDRL3: KQSYNLWT SEQ ID N0.:7 Región variable de la cadena pesada de h16B5 humanizado QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDIYMHWVQQAPGKGLE WMGRIDPAYGNTKYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA RRYDTAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO.:8 Región variable de la cadena ligera de 16B5 humanizado DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKP GQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQS YNLWTFGQGTKLEIK SEQ ID NO.:9 Secuencias completas de la cadena pesada de inmunoglobulina para h16B5 QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDIYMHWVQQAPGKGLE WMGRIDPAYGNTKYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA rRYDTAMDYwgqgtlvtvsSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCN VDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVL TVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO.:10 Secuencias completas de la cadena ligera de inmunoglobulina para h16B5 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKP GQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQS YNLWTFGQGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO.:11 21B12 CDRH1: GYTFTNYGMH SEQ ID NO.:12 21B12 CDRH2: WINTYTGEPTYADDFKG SEQ ID NO.:13 21B12 CDRH3: DGFLYFFDY SEQ ID NO.:14 21B12 CDRL1: KSSQSLLYSSNQKNYLA SEQ ID NO..15 21B12 CDRL2: WASTRES SEQ ID NO.:16 21B12 CDRL3: QQYYIYPRT SEQ ID NO.:17 Región variable de la cadena pesada de h21B12 humanizado QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGL EWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARdGFLYFFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N0.:18 Región variable de la cadena ligera de h21B12 humanizado DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKP GQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQY YIYPRTFGQGTKLEIK SEQ ID NO.:19 Secuencias completas de la cadena pesada de inmunoglobulina para h21B12 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGL EWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARdGFLYFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQT YTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREE TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO.:20 Secuencias completas de la cadena ligera de inmunoglobulina para h21B12 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKP GQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQY YIYPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA C EVTHQGLSSPVTKSFN RG EC S EQ I D N0. :21 Secuencia com pleta de nucleótidos de la cadena pesada de h 16B5 ATGGACTGGACCTGGCGGATCCTGTTCCTGGTGGCCGCTGCTAC CGGCACCCACGCCCAGGTG CAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGA AGAAGCCTGGCGCCACCGTCAAGATCAGCTGCAAGGTGTCCGGCTTCA ACATCAAGGACATCTACATGCACTGGGTGCAGCAGGCTCCAGG CAAGG GACTGGAGTGGATGGGCCGGATCGACCCTGCCTACGGCAACACCAAGT ACGACCCTAAGTTCCAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACACCTCCA CCGACACCGCCTACATGGAACTGTCCTCCCTGCGGTCCGAGGACACCG CCGTGTACTACTGCGCCCGGAGATACGACACCGCCATGGATTACTGGG G CCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTG CAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGT GTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAG G TCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CATAATGCCAAGA CAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTTGTGCACCAG GACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAG GCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCC ATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT CAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGA CGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTG GCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCA CAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO.:22 Secuencia completa de nucteótidos de la cadena pesada de h21B12 ATGGACTGGACCTGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTAC CGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCTCCGAGCTGAA GAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACAC CTTCACCAACTACGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGACAGGG ACTGGAATGGATGGGCTGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCTACCTA CGCCGACGACTTCAAGGGCAGATTCGTGTTCTCCCTGGACACCTCCGT GTCCACCGCCTACCTGCAGATCTCCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGGACGGCTTCCTGTACTTCTTCGACTACTGG GGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCT TCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCG CCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAG TGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTG CCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAG TGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCA CAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTG CGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGT GTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACC CCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAG GTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAG ACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAG TGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCT CTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTC CCTCCCGCGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGG TGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACG GCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGA CGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTG GCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA S EQ I D NO. :23 Secuencia com pleta de nucleótidos de la cadena ligera de h 16B5 ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATC TCCGGCGCCTACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCCCTG GCCGTGTCCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAG TCCCTGCTGAACTCCCGGACCCGGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAG CAGAAGCCTGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACC CGGGAGTCCGGCGTGCCTGACCGGTTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCAC CGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGT GTACTACTGCAAGCAGTCCTACAACCTGTGGACCTTCGGCCAGGGCAC CAAGCTGGAGATCAAGCGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC TGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGA CAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACG CCTGCGAAGTCACCCATCAG GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG S EQ I D NO . :24 Secuencia com pleta de nucleótidos de la cadena ligera de h21 B 1 2 ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATC TCTGGCGCCTACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCTCTG GCTGTGTCCCTGGGCGAGCGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAG TCCCTGCTGTACTCCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGC AGAAGCCTGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCC GG GAATCTGGCGTG CCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCG ACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGT ACTACTGCCAGCAGTACTACATCTACCCTCGGACCTTCGGCCAGGGCAC CAAGCTGGAAATCAAG CGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTC CCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCG GCACCGCCTCTGTGGTGTGC CTGCTGAACAACTTCTACCCCCGG GAGGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAG GACTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCA AGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACC AGGGCCTGTCCTCTCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCT GA S EQ I D NO. :25 (VL 16B5 m urino) DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQK PGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQ SYNLWTFGGGTKLEFK SEQ ID NO.:26 (VL h16B5 consensol) DIVMXQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKP GQXPKLLIYWASTRESGVPDRFXGSGSGTDFTLTISSXQAEDXAVYYC QS YNLWTFGXGTKLEXK; X corresponde a una sustitución de un aminoácido en comparación con el aminoácido correspondiente del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO.:25.

SEQ ID NO.:27 (VL 6B5 consenso2) DIVMXa1QSPXa2SLAVSXa3GEXa4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQXa8PKLLIYWASTRESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXa10 QAEDXa11AVYYCKQSYNL-WTFGXa12GTKLEXa13K Xa1 es un aminoácido hidrófilo neutro tal como, por ejemplo, T o S; Xa2 es D o S; Xa3 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, L o A; Xa4 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, R o K; Xa5 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, A o V; Xa6 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, I o M; Xa7 es N o S; Xa8 es P o S; Xa9 es un aminoácido hidrófilo neutro tal como, por ejemplo, S o T; Xa 0 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, L o V; Xaii es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o L; Xai2 es Q o G y; Xa13 es I o F.

SEQ ID NO.:28 (VL h16B5 consenso3) DIVMXa1QSPXa2SLAVSXa3GEXa4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQXa8PKLLIYWASTRESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXa10 QAEDXa1iAVYYCKQSYNL-WTFGXa12GTKLEXai3K Xa1 es T o S; Xa2 es D o S; Xa3 es L o A; Xa4 es R o K; Xa5 es A o V; Xae es I o ; Xa7 es N o S; Xa8 es P o S; Xa9 es S o T; Xa10 es L o V; Xaii es V o L; Xai2 es Q o G y Xai3 es I o F.

SEQ ID NO.:29 (VH 16B5 murino) EVQLQQSGAELVKPGASVRLSCTTSGFNIKDIYMHWVKQRPEQGLE WIGRIDPAYGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCA RRYDTAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO.:30 (VH h16B5 consensol) XVQLXQSGAEXXKPGAXVXXSCXXSGFNIKDIYMHWVXQXPXXGLEWXGR IDPAYGNTKYDPKFQGXXTITADTSXXTAYXXLSSLXSEDTAVYYCARRYD TAMDYWGQGTXVTVSS; X corresponde a una sustitución de un aminoácido en comparación con el aminoácido correspondiente del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO.:29.

SEQ ID NO.:31 (VH h16B5 consenso2) Xb1VQLXb2QSGAEXb3Xb4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8Xb9SGFNIKDIYMH WVXb1oQXbiiPXbi2X i3GLEWXb14GRIDPAYGNTKYDP FQGXb15Xb16TITAD TSXb17Xbi8TAYXb19Xb20LSSLXb21SEDTAVYYCARRYDTAMDYWGQGTXb22 VTVSS; Xbi es Q o E; Xb2 es V o Q; b3 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o L; Xb4 es K o V; Xb5 es un aminoácido hidrófilo neutro tal como, por ejemplo, T o S; Xb6 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, K o R; Xb7 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, I o L; Xb8 es K o T; Xb9 es V o T; Xbio es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, Q o K; Xb es A o R; Xbi2 es G o E; Xbi3 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, K o Q; Xbi es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, M o l; Xbi5 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, R o K; X i6 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o A; Xbi7 es un aminoácido hidrófilo neutro tal como, por ejemplo, T o Xbi8 es, por ejemplo, D o N; Xbi9 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, M o L; Xb2o es E o Q; Xb2i es R o T; y Xb22 es L o S.

SEQ ID NO.:32 (VH h16B5 consenso3) Xb1VQLXb2QSGAEXb3Xb4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8Xb9SGFNIKDIYMH WVXb10QXb11PXb12Xb13GLEWXb14GRIDPAYGNTKYDPKFQGXb15Xb16TITAD TSXb17Xb18TAYXb19Xb20LSSLXb21SEDTAVYYCARRYDTAMDYWGQGTXb22 VTVSS; Xbi es Q o E; Xb2 es V o Q; Xb3 es V o L; Xb4 es K o V; Xb5 es T o S; Xb6 es K o R; Xb7 es I o L; Xb8 es K o T; Xb9 es V o T; Xb10 es Q o K; Xb es A o R; Xb12 es G o E; Xb13 es K o Q; Xbi4 es M o I; X 5 es R o K; Xbi6 es V o A;«X 17 es T o S; Xbie es D o N; Xb 9 es M o L; X 20 es E o Q; Xb21 es R o T y Xb22 es L o S.

SEQ ID NO.:33 (VL 21B12 murino) DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRP GQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQY YIYPRTFGGGTKLEIK SEQ ID NO.:34 (VL h21B12 consensol) DIVMXcQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQX PGQXPKLLIYWASTRESGVPDRFXGSGSGTDFTLTISSXXAEDXAVYYCQQ YYIYPRTFGXGTKLEIK X corresponde a una sustitución de un aminoácido en comparación con el aminoácido correspondiente del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO.:33.

SEQ ID NO.:35 (VL h21B12 consenso2) DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEXc4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNY LAWYQQXcePGQXc9PKLLIYWASTRESGVPDRFXc1oGSGSGTDFTLTISSXc iiXci2AEDXci3AVYYCQQYYIYPRTFGXc14GTKLEIK; Xc1 es un aminoácido hidrófilo neutro tal como, por ejemplo, T o S; XC2 es D o S; Xc3 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, L o V; XC4 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, R o K; Xc5 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, A o V; XC6 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, I o M; Xc7 es N o S; XC8 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, K o R; Xc9 es P o S; Xc10 es un aminoácido hidrófilo neutro tal como, por ejemplo, S o T; Xcii es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, L o V; Xc12 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, Q o K; XC13 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o L y; XC14 es Q o G.

SEQ ID NO.:36 (VL h21B12 consenso3) DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEXc4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNY LAWYQQXc8PGQXc9PKLLIYWASTRESGVPDRFXc10GSGSGTDFTLTISSXc XdzAEDXdaAVYYCQQYYIYPRTFGXc-uGTKLEIK; Xc1 es T o S; Xc2 es D o S; Xc3 es L o V; Xc4 es R o K; Xc5 es A o V; Xc6 es I o M; Xc7 es N o S; XcB es K o R; Xc9 es P o S; X cío es S o T; Xcii es L o V; Xc12 es Q o K; Xc13 es V o L y X ci4 es Q o G.

SEQ ID NO.:37 (VH 21B12 murino) QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMHWVKQAPGKGLK WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCA RDGFLYFFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO.:38 (VH h21B12 consensol) QXQLVQSGXELKKPGXXVKXSCKASGYTFTNYGMHWVXQAPGXGL XWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXFSLXTSXSTAYLQIXXLKXEDTAXYXC ARDGFLYFFDYWGQGTXXTVSS X corresponde a una sustitución de un aminoácido en comparación con el aminoácido correspondiente del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO.:37.

SEQ ID NO.:39 (VH h21B12 consenso2) QXd1QLVQSGXd2ELKKPGXd3Xd4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6 QAPGXd7GLXd8WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXd9FSLXd10TSXd11STAYL QIXd12Xd13LKXd14EDTAXd15YXdi6CARDGFLYFFDYWGQGTXd17Xd18TVSS; Xd1 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o I; Xd2 es S o P; Xd3 es A o E; Xd4 es un aminoácido hidrófilo neutro tal como, por ejemplo, S o T; Xd5 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o I; Xd6 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, R o K; Xd7 es un aminoácido básico tal como, por ejemplo, Q o K; Xd8 es E o K; Xd9 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o A; Xdio es un aminoácido ácido tal como, por ejemplo, D o E; Xd11 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o A; Xd12 es S o N; Xd13 es S o N Xdi4 es A o N Xd15 es V o T; Xd16 es un aminoácido aromático tal como, por ejemplo, Y o F; Xdi7 es L o T; y Xd18 es un aminoácido hidrófobo tal como, por ejemplo, V o L.

SEQ ID NO.:40 (VH h21B12 consenso3) QXd1QLVQSGXd2ELKKPGXd3Xd4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6 QAPGXd7GLXd8WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXd9FSLXd10TSXd11STAYL QIXd12Xd13LKXd14EDTAXd15YXdi6CARDGFLYFFDYWGQGTXd17Xd18TVSS; Xd1 es V o I; Xd2 es S o P; Xd3 es A o E; Xd4 es S o T; Xd5 es V o I; Xd6 es R o K; Xd7 es Q o K; Xd8 es E o K; Xd9 es V o A; Xdi0 es D o E; Xd11 es V o A; Xd12 es S o N; Xd13 es S o N; Xd14 es A o N; Xd15 es V o T;«Xdie es Y o F; Xd17 es L o T y Xd18 es V o L.

SEQ ID NO.: 41 (modelo humano de 16B5VL) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNSKNYLAWYQQKP GQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQY YSTPYSFGQGTKLEIK SEQ ID NO.: 42 (modelo humano de 16B5VH) QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGL EWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARIPLFGRDHWGQGTLVTVSR SEQ ID NO.: 43 (modelo humano de 21B12VL) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNSKNYLAWYQQKP GQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQY YSTPYS FGQGTKLEIK SEQ ID NO.: 44 (modelo humano de 21B12VH) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGL EWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARDWGQGTLVTVSSVATIDENWFDP SEQ ID NO.:45 16B5 CDRH1 (versión más corta): GFNIKDIY SEQ ID NO.:46 16B5 CDRH2 (versión más corta): IDPAYGNT SEQ ID NO.:47 16B5 CDRH3 : ARRYDTAMDY SEQ ID NO.:48 16B5 CDRL1 (versión más corta): QSLLNSRTRKNY SEQ ID NO.:49 16B5 CDRL2 (versión más corta): WAS SEQ ID NO.:50 16B5 CDRL3: KQSYNLWT SEQ ID N0.:51 21B12 CDRH1: GYTFTNYG SEQ ID NO.:52 21B12 CDRH2: INTYTGEP SEQ ID NO.:53 21B12 CDRH3: X3X4DGFLYFFDY X3 es A; X4 es R; o X3 y X4 están fuera de CDRH3 SEQ ID NO.:54 21B12 CDRL1: QSLLYSSNQKNY SEQ ID NO.:55 21B12 CDRL2: WAS SEQ ID NO.:56 21B12 CDRL3: QQYYIYPRT SEQ ID NO.:57 GAGCAGAGCGCTATAAATACG SEQ ID NO.:58 CACGGTCTCCATAAATTTAGG SEQ ID NO.:59 TTGCGGCCGCAATACAATGAGCTGCGTGTGGC SEQ ID NO.:60 GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG SEQ ID N0.:61 cadena antisentido de clusterina :5'- CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT-3' SEQ ID NO.: 62 (cadena ligera variable de 20E11) DIVLTLSPASLAVSLGQRATISCRASQSVNSSNYSYMHWYQQKPGQ PPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTHFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEI PWTFGGGTKLEIK SEQ ID NO.:63 (cadena pesada variable de 20E11) QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLK WMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCA RTGSSGYFDCWGQGTTLTVSS SEQ ID NO.:64 (cadena ligera variable Gr1 de 11E2) ENVLTQSPAIMSASPGEKVT TCSASSSVSYMHWYQQKSSTSPKL WIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISS EAEDVATYYCFQGSGYPFT FGSGTKLEIK SEQ ID NO.:65 (cadena ligera variable GR2 de 11E2) DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLI HYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLLRTFG GGTKLEIK SEQ ID NO.:66 (cadena pesada variable de 11E2) EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYN NWVKQNNGKSL EWIGNIDPYYGTPNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYC ALNSLLRLNAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO.:67 (cadena pesada variable de 16C11) EVQLQQSGPELGKPGASVKISCKASGYSFTGYNMYWVKQSHRKSL EWIGYIDPYNGDTSYNQKSKGKATLTADRSSSTAYMHLNSLTSEDSGIYYC ARGAYGSSYAYWGQGTLVAVSA Referencias Lenferink, A. E., C. Cantin, et al. (2009). "Transcriptome profiling of a TGF-beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition reveáis extracellular clusterin as a target for therapeutic antibodies." Oncogene 29:831.

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Claims (34)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de clusterina y un inhibidor de EGFR.

2. La combinación farmacéutica de la reivindicación 1, donde el inhibidor de clusterina es capaz de inhibir la transición epitelio-mesénquima.

3. La combinación farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, donde el inhibidor de clusterina es un anticuerpo anticlusterínico o un fragmento de unión al antígeno de este.

4. La combinación farmacéutica de la reivindicación 3, donde el anticuerpo anticlusterínico o fragmento de unión al antígeno se une a los aminoácidos 421-443 de una porción del extremo C de una subunidad ß de la clusterina humana.

5. La combinación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el inhibidor de EGFR es un inhibidor de tirosina-cinasa o un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de unión al antígeno de este.

6. La combinación farmacéutica de la reivindicación 5, donde el inhibidor de tirosina-cinasa es gefitinib, erlotinib, imatinib, lapatinib o semazinib.

7. La combinación farmacéutica de la reivindicación 5, donde el inhibidor de tirosina-cinasa es gefitinib.

8. La combinación farmacéutica de la reivindicación 5, donde el anticuerpo es cetuximab, panitumumab, nimotuzumab o metuzumab.

9. Un método para tratar un carcinoma que comprende administrar un inhibidor de clusterina y un inhibidor de EGFR a un individuo que tiene, o se sospecha que tiene, un carcinoma.

10. El método de la reivindicación 9, donde el inhibidor de clusterina es capaz de inhibir la transición epitelio-mesénquima (EMT).

1 1 . El método de la reivindicación 9 o 10, donde el inhibidor de clusterina es un anticuerpo anticlusterínico o un fragmento de unión al antígeno de este.

12. El método de la reivindicación 1 1 , donde el anticuerpo anticlusterínico o fragmento de unión al antígeno se une a los aminoácidos 421 -443 de una porción del extremo C de una subunidad ß de la clusterina humana.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde el inhibidor de EGFR es un inhibidor de tirosina-cinasa o un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de unión al antígeno de este.

14. El método de la reivindicación 13, donde el inhibidor de tirosina-cinasa es gefitinib, erlotinib, imatinib, lapatinib o semazinib.

15. El método de la reivindicación 13, donde el inhibidor de tirosina-cinasa es gefitinib.

16. El método de la reivindicación 13, donde el anticuerpo es cetuximab, panítumumab, nimotuzumab o metuzumab.

17. El método de la reivindicación 9, donde el inhibidor anticlusterínico y el inhibidor de EGFR se administran secuencialmente.

18. El método de la reivindicación 16, donde el inhibidor anticlusterínico se administra antes que el inhibidor de EGFR.

19. El método de la reivindicación 9, donde el inhibidor anticlusterínico se administra simultáneamente con el inhibidor de EGFR.

20. El método de la reivindicación 9, que comprende analizar la inversión de un fenotipo epitelial a mesenquimatoso de las células de carcinoma antes de la administración del inhibidor de EGFR.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-20, donde el carcinoma es carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma endometrial, carcinoma ovárico, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, carcinomas de cabeza y cuello, carcinoma broncopulmonar, cáncer pancreático o carcinoma de células renales.

22. El método de la reivindicación 21, donde el carcinoma de mama es un cáncer de mama triple negativo o un cáncer de mama basaloide.

23. El método de la reivindicación 21, donde el carcinoma broncopulmonar es un carcinoma broncopulmonar no microcítico.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-23, donde el carcinoma comprende células caracterizadas por ser resistentes a un inhibidor de EGFR.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-23, donde el carcinoma comprende células que expresan marcadores de la EMT.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-25, donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este comprende una región determinante de la complementariedad tal como se expone en las SEQ ID NO.:1, SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:4, SEQ ID N0.:5, SEQ ID N0.:6, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46, SEQ ID NO.:47, SEQ ID NO.:48, SEQ ID NO.:49 o SEQ ID NO.:50.

27. El método de la reivindicación 26, donde el anticuerpo o región de unión al antígeno comprende una CDRH1 como la que se expone en la SEQ ID NO.: 1, una CDRH2 como la que se expone en la SEQ ID NO.:2 y una CDRH3 como la que se expone en la SEQ ID NO.:3.

28. El método de la reivindicación 26, donde el anticuerpo o región de unión al antígeno comprende una CDRH1 como la que se expone en la SEQ ID NO.: 45, una CDRH2 como la que se expone en la SEQ ID NO.:46 y una CDRH3 como la que se expone en la SEQ ID NO.:47.

29. El método de la reivindicación 27 o 28, donde el anticuerpo o región de unión al antígeno comprende una CDRL1 como la que se expone en la SEQ ID NO.:4, una CDRL2 como la que se expone en la SEQ ID NO.:5, una CDRL3 como la que se expone en la SEQ ID NO.:6.

30. El método de la reivindicación 27 o 28, donde el anticuerpo o región de unión al antígeno comprende una CDRL1 como la que se expone en la SEQ ID NO.:48, una CDRL2 como la que se expone en la SEQ ID NO.:49 y una CDRL3 como la que se expone en la SEQ ID NO.:50.

31. La utilización de la combinación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para el tratamiento del carcinoma.

32. La utilización de la combinación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la producción de un medicamento para el tratamiento del carcinoma.

33. Un kit que comprende un inhibidor de clusterina y un inhibidor de EGFR.

34. El kit de la reivindicación 33, donde el inhibidor de clusterina es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este.