CN116194483A - 使用抗cd73抗体的癌症治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于治疗癌症的方法和组合物。具体地，本公开涉及施用抗CD73抗体的方法，以及使用抗CD73抗体治疗个体中的癌症，优选HER2阳性胃腺癌或胃食管结合部腺癌的方法。

Description

使用抗CD73抗体的癌症治疗方法
相关应用的交叉引用
本申请要求2020年8月13日提交的美国临时申请号US 63/065,085的权益，其全文(包括任何附图)以引用方式并入本文。
对序列表的标引
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以创建于2021年8月5日、大小为79Ko的命名为“CD73-9 PCT SEQ LIST_ST25”的文件提供。将序列表的电子格式的信息全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于治疗癌症的方法和组合物。具体而言，本公开涉及施用抗CD73抗体的方法，以及使用抗CD73抗体治疗癌症的方法。
背景技术
CD73(胞外-5′-核苷酸酶)是一种70-kDa的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，通常在内皮细胞和造血细胞亚群上表达。CD73与CD39共同调节三磷酸腺苷(ATP)代谢。CD39(NTPDase-1)将ATP转化为AMP，其中仅痕量的ADP被释放，而CD73催化AMP转化为腺苷。
三磷酸腺苷(ATP)及其代谢物AMP和腺苷在细胞代谢、信号传导和免疫稳态中具有重要作用。细胞外三磷酸腺苷(ATP)响应于细胞死亡或细胞应激的释放起激活免疫应答的作用。然而，其代谢物腺苷具有免疫抑制活性。细胞外腺苷在癌组织中聚积，并构成了肿瘤免疫逃逸的重要机制。在其他作用中，肿瘤来源的腺苷通过腺苷酸环化酶激活的A2A受体显著抑制浸润效应T细胞。
CD73已被报道在一系列肿瘤细胞中表达，包括白血病、膀胱癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、食道癌和乳腺癌。CD73表达还与黑素瘤和乳腺癌中的促转移表型相关。据报道，使用结合鼠CD73的抗体的治疗可抑制小鼠乳腺肿瘤的生长和转移(Stagg等人(2010年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第104卷：第1547-1552页)。已表明A2A受体的基因缺失可诱导T细胞依赖性肿瘤排斥(Ohta等人(2006年)Proc NatlAcad Sci USA第103卷：第13132-13137页)。使用siRNA的敲低或CD73在肿瘤细胞上的过表达可调节肿瘤的生长和转移(Beavis等人(2013年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第110卷：第14711-14716页；Stagg等人(2010年)，同上；Jin等人(2010年)Cancer Res.，第70卷：第2245-2255页)。CD73-/-小鼠不受移植瘤和自发性肿瘤的影响(Stagg等人(2010年)CancerRes.，第71卷：第2892-2900页)。在人体内，CD73高表达已被证明是三阴性乳腺癌的不良预后因素(Loi等人，(201 3年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第110卷：第11091-11096页)。
抗CD73抗体的开发是复杂的。虽然CD73在肿瘤细胞上表达，但它也在免疫系统的不同细胞、特别是CD4和CD8 T细胞以及B细胞上表达。另一个复杂的因素是文献中描述的许多抗体的活性和作用模式差异很大。与CD73相关的许多初始报道利用了小分子抑制剂，这些小分子抑制剂可能缺乏特异性和/或可能对于体内研究而言毒性太大。关于抗CD73抗体的许多报道通常是能够由Fey受体结合的鼠同种型，因此难以将任何潜在的阻断作用与Fc介导的作用分开。最近，已经报道了多种治疗性抗CD73抗体。这些抗体中的一些抗体通过引起CD73的细胞内内化而发挥作用，另一些抗体则以不同程度的功效抑制膜结合的CD73，而且具有或不具有抑制可溶性CD73蛋白的能力。
在西方世界，约有12％-20％的胃癌患者过表达HER2癌基因(Jan B等人，J ClinPathol 2010年和Tanner M等人，Ann Oncol，2005年)。曲妥珠单抗与化疗组合被认为是晚期转移性HER2阳性疾病患者的一种选择。然而，与乳腺癌不同的是，在胃癌中，曲妥珠单抗的引入并没有改变自然病程，中位生存期几乎不超过一年。因此，需要为胃癌治疗提供最大功效的改进治疗方案。
发明内容
在一个实施方案中，本文提供了中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体用于治疗HER2阳性癌症的用途，该HER2阳性癌症任选地为胃腺癌或胃食管结合部腺癌，通过在表面表达HER2的肿瘤细胞来表征。
在一个实施方案中，本文提供了降低或抑制对其有需要的个体中的胃癌(例如，胃腺癌或胃食管结合部腺癌)的生长的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体和结合人HER2蛋白的抗体中的每一者。任选地，该方法还包括向该个体施用治疗有效量的化疗剂。在一个实施方案中，癌症是HER2阳性癌症。在一个实施方案中，肿瘤或癌症通过在表面表达HER2蛋白的肿瘤细胞来表征。在一个实施方案中，肿瘤或癌症通过包含在表面表达CD73蛋白的细胞的肿瘤基质来表征。
本文还提供了治疗对其有需要的个体中的癌症、尤其是胃癌的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体和结合人HER2蛋白的抗体中的每一者。任选地，该方法还包括向该个体施用治疗有效量的化疗剂。在一个实施方案中，肿瘤或癌症通过在表面表达HER2蛋白的肿瘤细胞来表征。在一个实施方案中，肿瘤或癌症通过包含在表面表达CD73蛋白的细胞的肿瘤基质来表征。
本文还提供了使患有癌症、尤其是胃癌的个体对使用结合人HER2蛋白的抗体的治疗敏感的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体。任选地，该方法还包括向该个体施用治疗有效量的结合人HER2蛋白的抗体。在一个实施方案中，中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体在结合人HER2蛋白的抗体施用的同一天和/或之前施用。
本文还提供了使患有癌症、尤其是胃癌的个体对使用结合人HER2蛋白的抗体和/或化疗剂的治疗敏感的方法，其中该个体正在用(或将要用)化疗剂和结合人HER2蛋白的抗体治疗，该方法包括向该个体施用中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体。在一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用结合人HER2蛋白的抗体和化疗剂。在一个实施方案中，中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体在结合人HER2蛋白的抗体施用的同一天和/或之前施用，任选地进一步在化疗剂施用的同一天和/或之前施用。
在任何实施方案中，抗CD73抗体的首次施用在抗HER2抗体首次施用之前发生。
在一个实施方案中，治疗包括多次施用抗HER2，以及多次施用抗CD73，其中抗CD73的每次施用在抗HER2施用之前1小时和7天之间发生。在一个实施方案中，治疗包括多次施用抗HER2抗体，以及多次施用抗CD73抗体，其中抗HER2抗体的每次施用在抗CD73抗体施用之后1小时至7天。例如，抗CD73抗体在抗HER2抗体施用的同一天(例如，在抗HER2抗体之前1小时-12小时)或之前一周内施用。在一个实施方案中，多次施用抗CD73抗体中的每次施用在抗HER2抗体施用的同一天(例如，在抗HER2抗体之前1小时-12小时)或之前约一周(例如，7天)发生。在一个实施方案中，多次施用抗HER2抗体中的每次施用在抗CD73抗体施用的同一天(例如，在抗CD73抗体施用之后1小时-12小时)或在抗CD73抗体施用之后约一周(例如，7天)发生。
在包含化疗剂的组合治疗的任何实施方案中，抗CD73抗体的首次施用可指定在化疗剂首次施用之前(例如，任选地进一步在抗HER2抗体首次施用之前)发生。
在一个实施方案中，治疗包括多次施用抗HER2抗体，多次施用化疗剂，以及多次施用抗CD73抗体，其中抗CD73抗体的每次施用在抗HER2抗体施用之前1小时和7天之间发生，并且进一步地，其中抗CD73抗体的每次施用在化疗剂施用之前1小时和7天之间发生。在一个实施方案中，治疗包括多次施用抗HER2抗体，多次施用化学治疗剂，以及多次施用抗CD73抗体，其中抗HER2抗体的每次施用在抗CD73抗体施用之后1小时至7天，并且其中化疗剂的每次施用在抗CD73抗体施用之后1小时至7天。例如，抗CD73抗体在化疗剂施用的同一天(例如，在化疗剂之前1小时-12小时)或之前一周内施用。在一个实施方案中，多次施用抗CD73抗体中的每次施用在化疗剂施用的同一天(例如，在化疗剂之前1小时-12小时)或之前约一周(例如，7天)发生。在一个实施方案中，多次施用化疗剂中的每次施用和多次施用抗HER2抗体中的每次施用在抗CD73抗体施用的同一天(例如，在抗CD73抗体施用之后1小时-12小时)或在抗CD73抗体施用之后约一周(例如，7天)发生。
任选地，多次施用抗HER2抗体以及多次施用抗CD73抗体在同一天发生。在一个实施方案中，抗HER2每三周一次皮下施用，并且抗CD73每三周一次施用，其中抗HER2和抗CD73在同一天施用。在一个实施方案中，抗HER2每三周一次静脉内施用，并且抗CD73每三周一次施用，其中抗HER2和抗CD73在同一天施用。
在一个实施方案中，多次施用化疗剂以及多次施用抗HER2抗体各自以交错的计划表每3周一次施用，使得抗HER2抗体和化疗剂不在同一天给药(例如，抗HER2抗体和化疗剂的施用间隔至少一周)，并且使得抗HER2抗体的每次施用和化疗剂的每次施用在抗CD73抗体施用之后1小时至7天。
在任何实施方案中，肿瘤或癌症通过在表面表达(例如，过表达)HER2蛋白的肿瘤细胞来表征。在一个实施方案中，肿瘤或癌症通过包含在表面表达CD73蛋白的细胞的肿瘤基质来表征。
在任何实施方案中，中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体能够特异性结合人CD73多肽。在一个实施方案中，抗体是抗体片段。在一个实施方案中，抗体是全长抗体。在一个实施方案中，抗体能够中和可溶性人CD73多肽的5′-胞外核苷酸酶活性。在一个实施方案中，抗体以二价方式结合CD73多肽二聚体；例如，当抗体以CD73多肽二聚体的10倍摩尔量提供时，其能够中和可溶性人CD73多肽的5′-胞外核苷酸酶活性。
在一个实施方案中，结合人HER2蛋白的抗体包含曲妥珠单抗的重链和轻链CDR1、2和3区。在一个实施方案中，根据Kabat编号确定CDR。在一个实施方案中，结合人HER2蛋白的抗体包含曲妥珠单抗的重链和轻链可变区。
在一个实施方案中，化疗剂是诱导ATP通过肿瘤细胞的细胞外释放的药剂，例如，化疗剂能够诱导免疫原性癌细胞死亡。在一个实施方案中，化疗剂是紫杉烷，例如紫杉醇或其类似物。在一个实施方案中，化疗剂是喜树碱类似物或其衍生物，例如SN-38、依喜替康或依喜替康衍生物(例如，DX-8951衍生物、DXd；参见Ogitano等人(2016年)Cancer Sci，第107卷(第2016期)：第1039-1046页)。在一个实施方案中，化疗剂(例如，紫杉醇)以游离化疗剂的形式(不与另一种药剂(例如，抗体或活性剂)缀合或共价结合)施用。在另一个实施方案中，化疗剂(例如，喜树碱类似物或衍生物)以抗体药物缀合物(ADC)(其中化疗剂与结合HER2蛋白的抗体缀合(例如，共价结合))的形式施用。
在一个方面，提供了治疗，该治疗包括向患有HER2阳性癌症(例如，胃癌)的个体施用中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体和结合人HER2蛋白的抗体，这些抗体任选地进一步与化疗剂(例如，紫杉烷)组合。在一个实施方案中，HER2阳性癌症是已知通常通过在肿瘤细胞表面的HER2表达来表征的癌症。在一个实施方案中，HER2阳性癌症是已知通常通过肿瘤或肿瘤环境中(例如，肿瘤细胞中或肿瘤基质组织中的细胞中)可溶性CD73蛋白和/或CD73表达细胞的存在来表征的癌症。在一个实施方案中，HER2阳性癌症通过HER2表达肿瘤细胞的存在来表征，例如，如通过使用抗HER2抗体的免疫组织化学(IHC)评估的，任选地，其中肿瘤包含与参考(例如，健康组织)相比数目或频率增加的HER2表达细胞和/或与参考(例如，健康组织)相比更强的HER2染色强度。在一个实施方案中，癌症通过肿瘤基质组织中CD73表达肿瘤细胞和/或表达CD73的细胞来表征，例如，如通过使用抗CD73抗体的免疫组织化学评估的，任选地，其中肿瘤包含与参考(例如，健康组织)相比数目或频率增加的CD73表达细胞和/或与参考(例如，健康组织)相比更强的CD73染色强度。
在一个实施方案中，患有HER2阳性癌症的个体用中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体、结合人HER2蛋白的抗体和诱导ATP通过肿瘤细胞的细胞外释放的化疗剂治疗，该化疗剂特别是诱导免疫原性癌细胞死亡的药剂或治疗(例如，紫杉烷药剂、紫杉醇)。
在另一方面，本文提供了治疗患有HER2阳性胃癌的个体的方法，其中该HER2阳性胃癌通过被确定为包含HER2表达细胞的肿瘤来表征，该方法包括向该个体施用用于结合并抑制人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的装置(或包含此类装置的药物)。任选地，能够结合并抑制人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体与结合人HER2蛋白的抗体组合施用，并且任选地进一步与诱导ATP通过肿瘤细胞的细胞外释放的化疗剂组合施用，该化疗剂特别是诱导免疫原性癌细胞死亡的药剂或治疗(例如，紫杉烷试剂、紫杉醇)。
在另一方面，本文提供了用结合CD73的抗体治疗患有癌症的个体的方法，改进包括鉴定患有通过被确定为包含HER2表达细胞的胃肿瘤来表征的HER2阳性胃癌的个体，以及向该个体施用能够结合并抑制人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体。任选地，能够结合并抑制人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体与结合人HER2蛋白的抗体组合施用，并且任选地进一步与诱导ATP通过肿瘤细胞的细胞外释放的化疗剂组合施用，该化疗剂特别是诱导免疫原性癌细胞死亡的药剂或治疗(例如，紫杉烷试剂、紫杉醇)。
在另一方面，本文提供了用结合CD73的抗体治疗患有癌症的个体的方法中，改进包括鉴定患有通过被确定为包含HER2表达细胞的胃肿瘤来表征的HER2阳性胃癌的个体，以及除了能够结合并抑制人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体之外，还向该个体施用结合人HER2蛋白的抗体，以及任选地进一步施用诱导ATP通过肿瘤细胞的细胞外释放的化疗剂，该化疗剂特别是诱导免疫原性癌细胞死亡的药剂或治疗(例如，紫杉烷试剂、紫杉醇)。
在本文的任何实施方案中，鉴定患有HER2阳性胃癌的个体可包括评估生物样品中的癌细胞是否表达HER2，如通过IHC和/或FISH确定的。
在本文的任何实施方案中，患有HER2阳性癌症的个体已接受使用诱导ATP通过肿瘤细胞的细胞外释放的化疗剂，特别是诱导免疫原性癌细胞死亡的药剂或治疗(例如，紫杉烷药剂、紫杉醇)的先前治疗(例如，至少一个先前疗程或治疗周期)。任选地，个体患有在这种先前治疗后复发的肿瘤或癌症。
在本文的任何实施方案中，患有HER2阳性癌症的个体已接受使用结合人HER2蛋白的抗体的先前治疗(例如，至少一个先前疗程或治疗周期)。任选地，个体患有在这种先前治疗后复发的肿瘤或癌症。
在其他方面，本公开提供了用于施用抗CD73抗体的有利的每2周一次或每3周一次的治疗方案；此类方案可尤其用于使用包含具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区的抗体，或其功能保守变体的治疗。在这种治疗方案中施用的抗CD73抗体可在与其他治疗剂(例如，化疗剂和/或抗HER2抗体)的组合治疗中施用或在不具有与其他治疗剂的组合治疗的情况下(以单一疗法形式)施用。在一个方面，提供了增强、加强或诱导个体中抗肿瘤免疫应答的方法，缓解个体中免疫抑制(例如，肿瘤介导的免疫抑制)的方法，中和肿瘤微环境中CD73的活性的方法，减少肿瘤微环境中腺苷的生成和/或浓度的方法，中和由肿瘤细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞和/或B细胞表达的CD73的活性的方法，加强个体中淋巴细胞(例如，T细胞)的活性或恢复淋巴细胞(例如，T细胞)的活性的方法，和/或缓解个体中腺苷介导的淋巴细胞(例如，T细胞)的活性抑制的方法，该方法包括向该个体施用本文公开的结合人CD73蛋白并中和其5′-胞外核苷酸酶活性的抗体(例如，包含具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区的抗体或抗体片段，或其功能保守变体)，其中该抗体(a)以1500mg-3600mg的固定剂量(不考虑体重或表面积)，任选地以1500mg的剂量，任选地以2400mg的剂量每两周一次，或(b)以2000mg-3000mg的固定剂量，任选地以2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg或3000mg的剂量每三周一次施用于该个体。
在一个方面，提供了治疗个体中的癌症的方法，该方法包括向该个体施用结合人CD73蛋白并中和其5′-胞外核苷酸酶活性的抗体，其中该抗体是包含具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区的抗体或抗体片段，或其功能保守变体，其中该抗体以1500mg-3600mg的固定剂量(不考虑体重或表面积)，任选地以1500mg的剂量，任选地以2400mg的剂量每两周一次，或以2000mg-3000mg的固定剂量，任选地以2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg或3000mg的剂量每三周一次施用于该个体。
这些方面在本文提供的说明书中更全面地描述，并且另外的方面、特征和优点将从本文提供的说明书中显而易见。
附图说明
图1左图：在诊断时(任何治疗前)胃原发性肿瘤中的CD73染色强度。堆叠柱示出了表达CD73的肿瘤细胞(TC)和基质细胞(SC)上的CD73强度评分的分布。强度评分为1至3。图1右图：在诊断时根据Her2状态的胃肿瘤细胞中的CD73表达。堆叠柱示出了肿瘤细胞上CD73比例评分的分布。统计分析：非参数Mann-Whitney检验(*p＝0.0343)。评分0＝无阳性细胞；评分1＝1％-9％的阳性细胞；评分2＝10％-50％的阳性细胞；评分3＝51％-80％的阳性细胞，评分4＝>80％的阳性细胞。
图2：新辅助化疗前后CD73表达胃肿瘤细胞的比较。堆叠柱(左图)示出了肿瘤细胞上CD73比例评分的分布，并且小提琴图(右图)示出了CD73+肿瘤细胞的百分比。评分0＝无阳性细胞；评分1＝1％-9％的阳性细胞；评分2＝10％-50％的阳性细胞；评分3＝51％-80％的阳性细胞，评分4＝>80％的阳性细胞。
图3：新辅助化疗前后CD73表达胃基质细胞的比较。堆叠柱(左图)示出了基质细胞上CD73比例评分的分布，并且小提琴图(右图)示出了CD73+基质细胞的百分比。评分0＝无阳性细胞；评分1＝1％-9％的阳性细胞；评分2＝10％-50％的阳性细胞；评分3＝51％-80％的阳性细胞，评分4＝>80％的阳性细胞。
图4：新辅助化疗前后CD73表达胃基质免疫细胞的比较。堆叠柱(左图)示出了基质免疫细胞上CD73比例评分的分布，并且小提琴(右图)示出了CD73+基质免疫细胞的百分比。评分0＝无阳性细胞；评分1＝1％-9％的阳性细胞；评分2＝10％-50％的阳性细胞；评分3＝51％-80％的阳性细胞，评分4＝>80％的阳性细胞。
图5A-图5C示出了T细胞增殖被所有抗CD73抗体恢复。图5A示出了T细胞亚群增殖的控制及AMP对其的抑制。图5B示出了H4+Lx抗体和亲本抗体HPLP恢复CD4+和CD8+T细胞增殖的功效。图5C示出了2H4+2Lx抗体(2H4+链与2L1、2L2、2L3或2L4链组合)和亲本抗体2HP2LP恢复CD4+和CD8+T细胞增殖的功效。数据表示为重复的平均值+/-标准偏差。
图6A和图6B显示由人源化变异体恢复的T细胞增殖分别在两个代表性人供体中可重现。示出了2H4+2Lx抗CD73抗体变体恢复CD4和CD8 T细胞增殖的功效。数据表示为重复的平均值+/-标准偏差。
图7显示CD4+T细胞增殖被ATP抑制，并用2H4+2Lx抗体变体恢复。如对两个代表性供体D795(图7，上图)和D664(图7，下图)测试的，通过100μM ATP控制CD4+T细胞增殖和抑制。数据表示为重复的平均值+/-标准偏差。
图8示出了抗CD73抗体的药代动力学/药效学模型。该模型包括：二室分布(从血液到外周)，其通过室间清除率(Q)以及中央和外周隔室的分布容积(分别为Vc和Vp)来表征；从中央隔室的一阶消除，其通过单个清除率参数CL来表征；从中央隔室的Michaelis-Menten可饱和消除，其通过Vmax和Km来表征。PD模型的CD73饱和水平根据Km预测，表示EC50(导致50％受体占有率的抗CD73抗体血清浓度)。
图9示出了在食蟹猴的非GLP和GLP毒理学研究中预测的和观察到的抗CD73抗体血清浓度的叠加。左图表示对来自非GLP毒理学研究的观察到的PK数据的模型拟合；右图示出了对来自GLP毒理学研究的观察到的PK数据的模型拟合；符号表示观察到的数据；实线表示模型预测。
图10A示出了针对每两周一次施用的预测的抗CD73抗体血清浓度-时间和CD73占有率-时间曲线。图10B示出了针对每三周一次施用的预测的抗CD73抗体血清浓度。左图示出了预测的人体内的抗CD73抗体PK。右图示出了预测的人体内的CD73受体占有率。ECs0是通过PK建模估计的Michaelis-Menten常数Km。根据EC50计算EC90。从下到上的线对应于递增剂量的抗CD73抗体。
具体实施方式
定义
如本说明书中所用，“一”或“一个”可指一个或多个。如权利要求中所用，当与字词“包括”一起使用时，字词“一”或“一个”可表示一个或多于一个。如本文所用，“另一个”可指至少第二个或更多。
在使用“包括”的情况下，其可任选地被“基本上由……组成”或“由……组成”代替。
由NT5E基因编码的人CD73，也被称为胞外-5′-核苷酸酶和5-prime-核糖核苷酸磷酸水解酶(EC 3.1.3.5)，表现出5′-核苷酸酶(特别是AMP-核苷酶、NAD-核苷酶和NMN-核苷酶)活性。CD73在中性pH下催化嘌呤5-prime单核苷酸向核苷的转化，优选的底物是AMP。这种酶由通过糖基磷脂酰肌醇键连接到质膜外表面结合的2个相同的70-kD亚基的二聚体组成。人CD73前蛋白(单体)的氨基酸序列(包括氨基酸1-26的信号序列)在Genbank中以登录号NP_002517示出(其全部公开内容以引用方式并入本文)，并且如下所示：
Figure BDA0004113265860000111
在本文的上下文中，“中和CD73的酶活性”是指CD73的5′-核苷酸酶(5′-胞外核苷酸酶)活性被抑制的过程。这特别包括抑制CD73介导的腺苷生成，即抑制CD73介导的AMP向腺苷的分解代谢。这可例如在测量受试化合物直接或间接抑制AMP向腺苷转化的能力的无细胞测定中测量。在一个实施方案中，抗体制剂导致AMP向腺苷的转化降低至少50％、AMP向腺苷的转化降低至少70％或AMP向腺苷的转化降低至少80％，例如参考本文所述的测定。
在本说明书全文中，凡提及关于抗CD73抗体的“癌症治疗”或类似内容时，均是指：(a)治疗癌症的方法，该方法包括以允许治疗癌症的剂量(治疗有效量)，优选以如本文所指定的剂量(量)向对这种治疗有需要的个体、哺乳动物、特别是人施用(针对至少一种治疗)抗CD73抗体(优选在药学上可接受的载体材料中)的步骤；(b)抗CD73抗体用于治疗癌症的用途，或抗CD73抗体，该抗CD73抗体用于该治疗(特别是在人体内)；(c)抗CD73抗体用于制备用于治疗癌症的药物制剂的用途，使用抗CD73抗体制备用于治疗癌症的药物制剂的方法，该方法包括将抗CD73抗体与药学上可接受的载体混合，或包含有效剂量的适用于治疗癌症的抗CD73抗体的药物制剂；或(d)根据允许在本申请提交的国家获得授权的主题的a)、b)和c)的任何组合。
如本文所用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。根据重链中恒定结构域的类型，抗体被指定为五个主要类别(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)之一。这些类别中的若干个类别被进一步分成亚类或同种型，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50kDa-70kDa)。每条链的N末端定义了主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型为人们所熟知。IgG是示例性类别的本文所用抗体，因为它们是生理情况下最常见的抗体，并且因为它们最容易在实验室环境中制备。任选地，抗体是单克隆抗体。抗体的具体示例是人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或其他适合人类的抗体。“抗体”还包括本文所述抗体中的任何抗体的任何片段或衍生物。
术语“特异性结合”意指抗体可在竞争性结合测定中优选地结合结合配偶体，例如CD73，如使用重组形式的蛋白质、其中的表位或存在于分离的靶细胞表面上的天然蛋白质评估的。竞争性结合测定和用于确定特异性结合的其他方法在下文进一步描述并且是本领域熟知的。
当称抗体与特定单克隆抗体“竞争”时，其意指抗体在使用重组CD73分子或表面表达的CD73分子的结合测定中与单克隆抗体竞争。例如，如果在结合测定中受试抗体降低参考抗体与CD73多肽或表达CD73的细胞的结合，则称该抗体与参考抗体“竞争”。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka定义为1/Kd。用于确定mAb的亲和力的方法可见于Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988年)；Coligan等人编辑，Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc和WileyInterscience，N.Y.(1992年、1993年)；和Muller，Meth.Enzymol.第92卷：第589-601页(1983年)，这些文献的全部内容以引用方式并入本文。本领域熟知的用于确定mAb的亲和力的一种标准方法是使用表面等离子共振(SPR)筛选(诸如通过用BIAcoreTM SPR分析设备分析)。
在本文的上下文中，“决定簇”是指多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指抗原决定簇，并且是指抗原上抗体结合的面积或区域。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效阻断的氨基酸残基，即抗体“足迹”内的氨基酸残基。它是可与例如抗体或受体结合的复合抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可以是线性的或构象/结构的。术语“线性表位”定义为由在氨基酸的线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基构成的表位。术语“构象或结构表位”定义为由氨基酸残基构成的表位，这些氨基酸残基并非全部连续的，因此代表通过分子折叠而彼此接近的氨基酸的线性序列(二级、三级和/或四级结构)的分开部分。构象表位取决于3维结构。因此，术语“构象的”通常可与“结构的”互换使用。
关于CD73表达细胞，术语“耗竭”意指导致杀伤、消除、裂解或诱导这种杀伤、消除或裂解，从而对样品或受试者中存在的此类CD73表达细胞的数目产生负面影响的过程、方法或化合物。
术语“内化”可与“细胞内内化”互换使用，是指与将分子从细胞的细胞外表面易位至细胞的细胞内表面的过程相关的分子、生物化学和细胞事件。负责分子的细胞内内化的过程为人们所熟知，并且可尤其涉及细胞外分子(诸如激素、抗体和有机小分子)；膜相关分子(诸如细胞表面受体)；与细胞外分子(例如，与跨膜受体结合的配体或与膜相关分子结合的抗体)结合的膜相关分子的复合物的内化。因此，“诱导和/或增加内化”包括其中细胞内内化启动和/或细胞内内化的速率和/或程度增加的事件。
术语“药剂”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制备的提取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的药剂。
出于本文的目的，“人源化”或“人”抗体是指其中一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如，CDR)融合的抗体。此类抗体被设计成维持结合区所来源的非人抗体的结合特异性，但避免针对非人抗体的免疫反应。此类抗体可从已被“工程化”以响应于抗原攻击而产生特异性人抗体的转基因小鼠或其他动物获得(参见例如，Green等人(1994年)Nature Genet，第7卷：第13页；Lonberg等人(1994年)Nature，第368卷：第856页；Taylor等人(1994年)Int Immun，第6卷：第579页，这些文献的全部教导内容以引用方式并入本文)。完全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，所有这些方法都是本领域已知的(参见例如，McCafferty等人(1990年)Nature，第348卷：第552-553页)。人抗体也可以通过体外活化的B细胞生成(参见例如，美国专利号5567610和5229275，这些专利全文以引用方式并入本文)。
当用于本文时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人，1991年)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol1987年，第196卷：第901-917页)，或用于确定负责抗原结合的必需氨基酸的类似系统。通常，该区域中氨基酸残基的编号通过Kabat等人(同上)中所述的方法进行。短语诸如“Kabat位置”、“如Kabat中的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”在本文中是指针对重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。在使用Kabat编号系统时，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少的或额外的氨基酸，对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或向其中的插入。例如，重链可变结构域可包括在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入残基(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过对抗体序列与“标准”Kabat编号序列进行同源区比对确定给定抗体的残基的Kabat编号。
如本文所用，“框架”或“FR”残基是指抗体可变结构域中排除被定义为CDR的那些区域的区域。每个抗体可变结构域框架可被进一步细分为由CDR隔开的连续区域(FRI、FR2、FR3和FR4)。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”是指抗体重链的C末端片段，例如人γ(gamma)重链的约氨基酸(aa)230至约aa 450、或其在其他类型的抗体重链(例如，对于人抗体的α、δ、ε和μ)中的对应序列，或其天然存在的同种异型。除非另外指明，否则在本公开全文中使用普遍接受的免疫球蛋白的Kabat氨基酸编号(参见Kabat等人(1991年)Sequencesof Protein of Immunological Interest，第5版，United States Public HealthService，National Institute of Health，Bethesda，MD)。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指基本上或大体上不含在其天然状态下存在的通常伴随其的组分的物质。通常使用分析化学技术(诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)确定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要种类的蛋白质是基本上纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
在相对于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表示该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达在其他情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
在本文的上下文中，术语“结合”多肽或表位的抗体是指以特异性和/或亲和力结合所述决定簇的抗体。
在用于两个或多个多肽的序列之间的关系时，术语“同一性”或“同一的”是指多肽之间的序列相关程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的串之间的匹配数目确定的。“同一性”测量的是两条或更多条序列中较小序列之间的相同匹配的百分比，其中通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)处理空位比对(如有)。可易于通过已知方法计算相关多肽的同一性。此类方法包括但不限于Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988年；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993年；Computer Analysis ofSequence Data，Part 1，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994年；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987年；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M.StocktonPress，New York，1991年；和Carillo等人，SIAM J.Applied Math.，第48卷，第1073页(1988年)中所述的方法。
确定同一性的方法被设计成得到所测试序列之间的最大匹配。确定同一性的方法描述于可用的计算机程序中。确定两条序列之间的同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.，第12卷，第387页(1984年)；GeneticsComputer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.第215卷，第403-410页(1990年))。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源公开获得(BLAST Manual，Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等人，同上)。熟知的史密斯-沃特曼算法(SmithWaterman algorithm)也可用于确定同一性。
治疗方法
描述了可用于癌症的诊断、预后、监测和治疗的方法。在一个实施方案中，癌症通过在表面表达HER2的肿瘤细胞来表征，其中治疗包括向个体施用如本文所述的抗CD73抗体。在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有胃癌。在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有乳腺癌。在本文的任何实施方案中，胃癌可被表征为胃腺癌或胃食管或胃食管结合部腺癌。在任何实施方案中，癌症可被表征为HER2蛋白测试(或已测试)为阳性，任选地，其中癌症表达过量的HER2蛋白(HER2过表达)，任选地其中癌症表达低水平的HER2蛋白(低于过量的HER2表达或HER2过表达)。
如本文所示，根据胃癌中HER2状态的患者分层表明所有HER2+胃癌患者均具有CD73表达肿瘤，并且Her2+患者具有比Her2-患者更高百分比的CD73+肿瘤细胞。无论Her2状态如何，所有患者均具有CD73+基质细胞。此外，如本文所示，无论是在表达CD73的患者的百分比方面还是在CD73+肿瘤细胞的百分比方面，新辅助化学疗法(CT)均未显著改变CD73表达肿瘤细胞。然而，新辅助CT使具有CD73+基质细胞的患者的百分比从CT前的60％(n＝12/20)增加到CT后的95％(n＝19/20)。在CT前后，CD73表达基质细胞的百分比无显著差异(图15，右图)。CT使具有CD73+基质免疫细胞的患者的百分比从30％(n＝6/20)增加到70％(n＝14/20)。因此，抗CD73抗体可有利地用于先前已接受化疗剂治疗的个体。此外，化疗对CD73阳性样品中CD73表达细胞的百分比缺乏影响可表明抗CD73抗体的治疗方案和剂量(例如，设计成饱和CD73受体的剂量)将是有效的，包括与使用化疗剂的治疗组合施用的情况。
术语“HER2”(也称为HER2/neu、C-erbB-2和ErbB-2)代表“人表皮生长因子受体2”。HER2及其变体和同种型是位于染色体17q21上的编码具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白的原癌基因，是HER受体家族的成员，并且参与导致细胞生长和分化的信号转导途径。在胃癌和胃食管癌中，HER2过表达的频率在文献中差异很大。然而，由于肿瘤生物学的固有差异、HER2表达的瘤内异质性以及在胃肿瘤中常见的不完全膜染色，胃癌中的HER2测试不同于乳腺癌中的测试。
HER2状态通常通过免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)测定来评估。这两种方法可以是使用福尔马林固定和石蜡包埋的活检组织或手术标本，偶尔使用细胞学样品的实践。荧光原位杂交(FISH)被认为是金标准并且允许对HER2基因的拷贝数计数。然而，FISH具有较高的成本，因此IHC也被广泛使用，其中将通过IHC的3+评分视为HER2过表达，并对通过IHC的不确定(2+评分)病例进一步进行FISH。
用于评估HER2的肿瘤细胞表达的测定是本领域熟知的。FISH测定的示例包括HER2IQFISH pharmDx(安捷伦)或HER2 FISH pharmDxTM(丹科)、PathVysionTM HER-2 DNA ProbeKit II(雅培)，它们被设计成检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织中的HER-2/neu的扩增。示例性测定还包括FDA批准的SPoT-Light HER2 CISH测定。显色原位杂交(CISH)检测HER2基因扩增。该技术也被称为减影探针技术显色原位杂交，是用于观察乳腺癌细胞是否在细胞表面过表达HER2受体蛋白的测试。另一种广泛使用的HER2测定是HercepTestTM(美国丹科北美有限公司)，其为一种用于确定福尔马林固定、石蜡包埋的癌组织中的HER2蛋白过表达的半定量免疫组织化学测定。例如，表达低水平HER2的肿瘤可通过HercepTestTM以+1至+2的评分来鉴定。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有测试为HER2蛋白阳性的胃癌(例如，胃癌或胃食管或胃食管结合部癌)，任选地，其中该癌症过表达HER2蛋白(特别是由于HER2基因扩增)，例如肿瘤通过IHC中的3+评分来表征并且/或者通过FISH检测基因扩增呈阳性。在某些任选的实施方案中，肿瘤通过低水平的HER2蛋白(低于过量的HER2表达)来表征，例如肿瘤可通过IHC中的2+评分来表征并且通过FISH检测基因扩增呈阴性。在一个实施方案中，用中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体来治疗个体，该抗体与结合HER2多肽的抗体(例如，包含曲妥珠单抗的重链和轻链CDR或可变区的抗体)组合，任选地进一步与化疗剂组合。
在一些实施方案中，提供了治疗患有胃癌的个体中的肿瘤的方法，该方法包括：(a)评估该个体中的肿瘤(或肿瘤细胞)的HER2表达；以及(b)如果该个体患有通过HER2表达、任选地HER2过表达来表征的肿瘤(或肿瘤细胞)，则向该个体施用有效量的中和人CD73蛋白的5′-胞外核苷酸酶活性的抗体，该抗体任选地与有效量的结合HER2多肽的抗体(例如，包含曲妥珠单抗的重链和轻链CDR或可变区的抗体)组合，任选地进一步与化疗剂组合。
在一个实施方案中，通过HER2表达或HER2过表达来表征的肿瘤通过在FISH测定中HER2基因扩增呈阳性的结果来表征。在一个实施方案中，肿瘤通过IHC的2+或3+评分来表征。在一个实施方案中，肿瘤通过IHC的3+评分来表征。在一个实施方案中，HER2过表达肿瘤是通过IHC的3+评分来表征的肿瘤。在一个实施方案中，HER2表达或HER2过表达根据用于胃癌和胃食管结合部癌的HER2测试的ToGA FISH评分方案来确定(参见van Cutsem等人，Gastric Cancer.，2015年；第18卷(第3期)：第476-484页)。在一个示例中，HER2过表达通过至少6个信号/细胞核的HER2基因拷贝数来表征。在一个示例中，HER2过表达通过大于6个信号/细胞核的HER2基因拷贝数来表征。在另一个示例中，确定HER2信号与染色体17着丝粒信号的比率。例如，对于FISH扩增，DNA探针试剂盒可使用双色探针来确定HER2(橙色)和染色体17着丝粒(绿色)的拷贝数。在一个示例中，HER2过表达通过为至少2、任选地至少2.2或任选地大于2.2的HER2信号与染色体17着丝粒的比率来表征。
在一个实施方案中，用于本公开的组合治疗的结合HER2的抗体是不与细胞毒性剂缀合的人同种型(例如，人IgG1)抗体(例如，该抗体是“裸”抗体)。任选地，方法还包括向个体施用治疗有效量的化疗剂。
在另一个实施方案中，用于本公开的组合治疗的结合HER2的抗体是抗体药物缀合物(ADC)。例如，结合HER2的抗体可与细胞毒性剂缀合，该细胞毒性剂任选地为澳瑞他汀、美登木素生物碱(例如，DM1)或喜树碱(例如，喜树碱或依喜替康衍生物、DXd或SN38)；任选地，其中该ADC是恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)或德喜曲妥珠单抗(trastuzumabderuxtecan，DS-8201a)。
组合施用可包括不同剂型化合物同时施用，或化合物单独施用(例如，依次施用)。因此，CD73结合抗体和HER2结合抗体(以及任选地另外的化疗剂)可组合使用。抗CD73抗体和HER2结合抗体可被配制用于单独施用，并且可同时或依次施用。CD73结合抗体和HER2结合抗体还可与化疗剂(例如，拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、紫杉醇)组合使用。抗CD73抗体、HER2结合抗体和/或化疗剂可各自配制用于单独施用，并且可同时或依次施用，或当HER2结合抗体与化疗剂缀合(例如，共价结合)时，抗CD73抗体和HER2结合ADC可各自配制用于单独施用，并且可同时或依次施用。
在一些实施方案中，本公开的组合治疗包括至少一个疗程，其中对于每个疗程，施用多个(例如，两个、三个或四个)连续剂量的抗CD73抗体，并且施用多个(例如，两个、三个或四个)连续剂量的抗HER2抗体。任选地，治疗方案还包括施用多个(例如，两个、三个或四个)连续剂量的化疗剂(例如，紫杉烷)。
在一些实施方案中，本公开的组合治疗包括：
(a)多次(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的抗CD73抗体，任选地，其中抗CD73抗体每两周或三周一次施用；以及
(b)多次(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的抗HER2抗体，任选地，其中抗HER2抗体每周一次或每三周一次施用。在一个施用方案中，抗CD73抗体每两周一次施用，并且抗HER2抗体每三周一次施用。在另一个施用方案中，抗CD73抗体每三周一次施用，并且抗HER2抗体每三周一次施用，其中抗CD73抗体和抗HER2抗体在同一天施用。
在一些实施方案中，本公开的组合治疗包括：
(a)多次(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的抗CD73，任选地，其中抗CD73抗体每两周或三周一次施用；以及
(b)多次(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的化疗剂(例如，铂药剂、拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、喜树碱)，任选地，其中化疗剂每周一次或每三周一次施用。在一个示例性施用方案中，抗CD73抗体每三周一次施用，并且化疗剂每三周一次施用，其中抗CD73抗体和化疗剂在同一天施用。
在一些实施方案中，本公开的组合治疗包括：
(a)多次(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的抗CD73，任选地，其中抗CD73抗体每两周一次或每三周一次施用；
(b)多次(例如，至少两次、三次或四次)一定剂量的抗HER2抗体，任选地，其中抗HER2抗体每周一次或每三周一次施用；以及
(c)多次施用(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的化疗剂(例如，拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、喜树碱)，任选地，其中化疗剂每周一次或每三周一次施用。
在一些实施方案中，当抗HER2抗体与化疗剂缀合时，本公开的组合治疗方案可包括：
(a)多次(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的抗CD73，任选地，其中抗CD73抗体每两周一次或每三周一次施用；
(b)多次(例如，至少两次、三次或四次)施用一定剂量的抗HER2抗体化疗药物缀合物，任选地，其中抗HER2抗体化疗药物缀合物每三周一次施用。
在任何实施方案中，本公开的治疗包括至少4次、5次或6次施用抗CD73抗体。在任何实施方案中，根据本公开的方案的治疗包括至少4次、5次或6次施用抗HER2抗体。在任何实施方案中，根据本公开的治疗包括至少4次、5次或6次施用化疗剂。在任何实施方案中，根据本公开的方案的治疗包括至少6次施用抗CD73抗体，至少4次施用抗HER2抗体，以及任选地进一步至少4次施用化疗剂。
在任何实施方案中，抗CD73抗体的首次施用在抗HER2抗体和/或化疗剂首次施用之前发生。例如，抗CD73抗体的首次施用可在抗HER2抗体和/或化疗剂首次施用之前一周或两周发生。
在任何实施方案中，其中抗CD73抗体和抗HER2抗体在同一天施用，任选地，抗CD73抗体的施用在抗HER2抗体施用之前(例如，之前1小时-12小时)发生。在任何实施方案中，其中抗CD73抗体和化疗剂在同一天施用，任选地，抗CD73抗体的施用在化疗剂施用之前(例如，之前1小时-12小时)发生。
在治疗方法中，抗HER2抗体和抗CD73抗体可单独、一起或依次施用，或以混合物施用。在一些实施方案中，抗CD73抗体在抗HER2抗体之前施用。例如，抗CD73抗体可在抗HER2抗体施用之前约1小时至7或8天施用。在一些实施方案中，抗CD73抗体在抗HER2抗体施用之前约30分钟至约1周、约1小时至约1周、约1小时至约2小时、约1小时至约6小时、约1小时至约12小时、约2小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至1天或约1天至8天施用。在一些实施方案中，抗CD73抗体与抗HER2抗体同时施用。
在任何实施方案中，抗HER2抗体和/或化疗剂的施用在抗CD73抗体施用之后不超过约1周发生。例如，在方法包括多次施用一定剂量的抗HER2抗体以及多次施用一定剂量的抗CD73抗体的情况下，抗HER2抗体的每次施用可在抗CD73抗体施用的同一天或之后约1周(例如，7天、8天)发生。
在任何实施方案中，多次施用抗HER2抗体中的每次施用和化疗剂的每次施用在抗CD73抗体施用之后不超过14天或不超过约2周、任选地7天或约1周发生。在任何实施方案中，多次施用抗HER2抗体中的每次施用和多次施用化疗剂中的每次施用在抗CD73抗体施用之后14天或约2周、任选地7天或约1周内发生。
任选地，治疗被配置为使得抗HER2抗体的首次施用和/或化疗剂的首次施用在抗CD73抗体施用之后14天或约2周内施用发生，并且其中抗HER2抗体的每次后续(即第二次或再一次)施用和/或化疗剂的每次后续施用在抗CD73抗体施用的同一天施用，或在抗CD73抗体施用之后不超过7天(例如，1周)施用。
因此，在任何实施方案中，抗HER2抗体的每次后续(即第二次或再一次)施用和/或化疗剂的每次施用在抗CD73抗体施用的同一天施用，或在抗CD73抗体施用之后不超过8天或不超过8天(例如，约1周)施用。
在任何实施方案中，抗HER2抗体的每次后续(即第二次或再一次)施用在抗CD73抗体施用的同一天或之后7天或8天内或约1周内发生。在任何实施方案中，抗HER2抗体的每次施用在抗CD73抗体施用的同一天或之后不超过7天或8天或约1周发生。
在任何实施方案中，化疗剂的每次后续(即第二次或再一次)施用在抗CD73抗体施用的同一天或之后7天或8天内或约1周内发生。在任何实施方案中，化疗剂的每次施用在抗CD73抗体施用的同一天或之后不超过7天或8天或约1周发生。
因此，例如，抗CD73抗体可每两周一次施用，并且抗HER2抗体(和化疗剂，若使用)可每三周一次施用。示例性治疗方案包括每两周一次施用抗CD73抗体，每三周一次施用抗HER2抗体(和化疗剂，若使用)，其中抗HER2抗体(和化疗剂，若使用)的首次施用在抗CD73抗体首次施用之后约两周，或约两周内，例如15天内发生。
在任何实施方案中，个体可被表征为患有已在先前疗法后进展或复发或对先前疗法无反应的癌症，任选地进一步，其中该先前疗法包括施用化疗剂、任选地铂药剂(例如，顺铂)或紫杉烷药剂(例如，紫杉醇)。
在任何实施方案中，个体可被描述为患有已进展、复发或对使用结合HER2多肽的抗体(例如，包含曲妥珠单抗的重链和轻链CDR、可变区或多肽链的抗体)的先前治疗无反应的癌症。
在另一个示例中，抗CD73抗体可以达到循环中、任选地感兴趣的血管外组织(例如，肿瘤或肿瘤环境)中的浓度或维持其达特定时间段(例如，至少一周、两周、三周)的量施用，该浓度高于针对结合CD73表达细胞的EC50、任选地EC70或任选地EC90(例如，如通过滴定CD73表达细胞，例如MDA-MB-231细胞上的抗CD73抗体评估的)。任选地，所达到的浓度比结合CD73表达细胞的EC50、任选地EC70或任选地EC90高至少20％、50％或100％。
在另一个示例中，抗CD73抗体可以有效达到个体中的血药浓度和/或维持其达至少一周、任选地至少两周或三周和/或直至抗CD73抗体的后续施用的量施用，该血药浓度为针对抑制CD73介导的AMP向腺苷的分解代谢的至少EC50、任选地EC70、任选地大体上EC90(例如，通过定量AMP向腺苷的水解来评估MDA-MB-231或A375细胞中5′胞外核苷酸酶活性的中和)。在一个实施方案中，抗CD73抗体的量是有效实现针对抑制个体血管外组织中的CD73介导的AMP向腺苷的分解代谢的EC50、任选地EC70、任选地大体上EC90(或维持其任选地达至少一周，任选地两周)的量。
抗CD73抗体在本文中进一步描述。例如，具有本公开的抗体的重链和轻链CDR的抗体，例如具有47和48的相应重链和轻链氨基酸序列的抗体，或其功能保守变体，可以900mg-3000mg的剂量施用，任选地该抗体以至少900mg、任选地1500mg或至少1500mg、或任选地2400mg或至少2400mg的剂量施用。抗体可静脉内施用。
在另一个示例中，具有SEQ ID NO：42和43的重链和轻链可变区的重链和轻链CDR的抗体可以至少900mg、任选地1500mg或至少1500mg、或任选地2400mg或至少2400mg的剂量施用。抗体可静脉内施用。
在不与抗HER2抗体缀合时，化疗剂可以针对特定药剂的合适剂量施用。例如，可施用紫杉烷药剂。紫杉烷是包括紫杉醇和多西他赛的化疗剂，这些化疗剂通过使细胞微管稳定从而抑制细胞分裂而产生抗肿瘤活性。例如，紫杉醇可以175mg/m2体表面积的剂量通过3小时输注每3周一次施用。在一个任选的实施方案中，本公开的组合治疗包括在不存在基于铂的药剂(例如，顺铂、奥沙利铂、卡铂)(使用其的治疗)的情况下用化疗剂(例如紫杉烷、与抗HER抗体缀合的化疗剂)治疗。在一个任选的实施方案中，本公开的组合治疗包括在不存在蒽环霉素衍生物(例如，多柔比星、柔红霉素、表柔比星)(使用其的治疗)的情况下用化疗剂(例如紫杉烷、与抗HER抗体缀合的化疗剂)治疗。
在本文的任何实施方案中，本公开的治疗可指定为不存在与中和PD-1的抗体的组合治疗。术语“中和PD-1”是指这样的过程，其中PD-1的信号转导能力由于PD-1与其结合配偶体(诸如PD-L1或PD-L2)中的一种或多种配偶体相互作用而受到抑制。例如，中和PD-1的抗体可与人PD-1蛋白或PD-L1蛋白结合。示例包括帕博利珠单抗(商品名
Figure BDA0004113265860000231
)、阿替利珠单抗(商品名TecentriqTM)、度伐利尤单抗(商品名ImfinziTM)。
已经开发了若干种特异性结合人HER2(抗HER2)抗体的抗体，特别包括曲妥珠单抗。其他分子型HER2靶向抗体已经过测试或目前正进行测试，诸如帕妥珠单抗、马吉妥昔单抗和抗体-药物缀合物恩美曲妥珠单抗和德喜曲妥珠单抗。
在某些实施方案中，特别是对于胃癌的治疗，抗HER2抗体可例如静脉内或皮下每三周一次施用，其中在后续的连续治疗剂量之前进行(在静脉内施用的情况下)或不进行另外的负荷剂量施用。在任何实施方案中，任选地，抗HER2抗体的首次施用可以是负荷剂量，随后在一周后施用后续治疗剂量的抗HER2抗体，其中该后续治疗剂量每三周一次施用。例如，在第1天(第1周开始)，可用抗CD73抗体治疗个体；在第15天(第3周开始)，可用抗CD73抗体、负荷剂量的抗HER2抗体和化疗剂治疗个体；在第21天，可用治疗剂量的抗HER2抗体治疗个体；其中后续剂量的抗CD73抗体在先前施用抗CD73抗体之后每两周或三周一次施用，其中后续剂量的治疗剂量的抗HER2抗体在先前施用治疗剂量的抗HER2抗体之后每三周一次施用，并且其中后续剂量的化疗剂在先前施用化疗剂之后每三周一次施用。
抗HER2抗体在本文中进一步描述。例如，抗体可包含曲妥珠单抗的相应重链和轻链CDR、可变区或全长多肽链，以2mg/kg体重-8mg/kg体重(包括负荷剂量)、任选地2mg/kg体重-6mg/kg体重(用于治疗剂量)的剂量施用。当以人IgG1同种型的裸抗体(不与细胞毒性剂缀合)，诸如获批为HerceptinTM的抗体组合物存在时，此类抗体可以8mg/kg体重的负荷剂量(首次施用)通过90分钟输注施用，随后在一周后以6mg/kg体重的治疗剂量通过30分钟输注每3周一次施用。曲妥珠单抗(获批为HerceptinTM)也可通过每周施用(特别是对于乳腺癌)，例如以4mg/kg的初始剂量通过90分钟IV输注，随后以2mg/kg的后续周剂量通过30分钟IV输注来使用。曲妥珠单抗也已获批为HerceptinTM SC，其为一种适于皮下给药的制剂，并含有新型赋形剂(药物活性成分的载体)rHuPH20。rHuPH20(重组人透明质酸酶)可逆地分解在皮肤下细胞之间的组织中形成屏障的凝胶状物质(透明质酸)。HerceptinTMSC以5mL的总固定体积按600mg的固定剂量每三周一次施用，无负荷剂量，施用时间最长为5分钟。
在另一个示例中，将包含曲妥珠单抗的重链和轻链CDR、可变区或全长多肽链的抗体与细胞毒性剂缀合，从而将抗HER2和化疗剂组合为单个分子或组合物。这种ADC(例如，ADC德喜曲妥珠单抗(DS-8201；fam-trastuzumab deruxtecan-nxki；
Figure BDA0004113265860000241
第一三共株式会社))可以5.4mg/kg体重的剂量通过静脉输注每3周一次施用。ADC恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine；/>
Figure BDA0004113265860000251
基因泰克公司)可以3.6mg/kg体重的剂量通过静脉输注每3周一次施用。
本公开的治疗方案可有利地用于治疗通过肿瘤基质组织中CD73表达细胞的存在来表征的HER2阳性胃食管结合部腺癌。因此，CD73阳性癌症可通过肿瘤或肿瘤环境中CD73表达细胞的存在来表征。如本文所示，HER2表达肿瘤通过肿瘤基质中的CD73表达来表征。因此，患有胃腺癌或胃食管结合部腺癌的个体可在具有或不具有评估CD73在肿瘤微环境中的细胞上(例如，在内皮细胞和/或免疫细胞，例如B细胞、CD8 T细胞、幼稚CD8T细胞上)的表达的预先检测步骤的情况下，用本公开的治疗方案治疗。
任选地，治疗方法可包括检测来自个体的肿瘤的生物样品中(例如，癌组织、癌症附近或周围组织、癌症相邻组织、相邻的非肿瘤组织或正常相邻组织中)的CD73核酸或多肽的步骤。确定生物样品通过CD73多肽来表征(例如，包含CD73表达细胞)可表明患者患有可从抗CD73抗体和抗HER2抗体(以及任选地另外的化疗剂)的治疗获得很大益处的癌症。患有适于根据本公开的治疗的癌症的患者可被确定为患有通过在表面表达CD73、表达高水平(例如，与参考值相比，与健康个体相比，对应于用抗CD73药剂治疗反应差的个体的水平)的CD73或显示出高抗CD73抗体染色强度(例如，如通过IHC确定的)的细胞来表征的肿瘤基质。
在一个实施方案中，方法包括确定生物样品(例如，包含肿瘤和/或肿瘤基质组织)中CD73核酸或多肽的表达水平，并将该水平与对应于健康个体的参考水平进行比较。确定生物样品包含与参考水平相比增加的水平的表达CD73核酸或多肽的细胞表明患者患有可有利地用抗CD73抗体和抗HER2抗体(以及任选地另外的化疗剂)治疗(例如，可从其获得特定益处)的癌症。任选地，检测生物样品中的CD73多肽包括检测在恶性细胞、内皮细胞、T细胞和/或B细胞的表面上表达的CD73多肽。在一个示例中，CD73多肽将存在于从个体采集的肿瘤组织或肿瘤相邻组织样品(例如，组织活检)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的细胞上。
确定个体是否患有通过表达CD73多肽的细胞来表征的癌症可例如包括从个体获得包含来自癌症环境的细胞(例如，肿瘤或肿瘤相邻组织)的生物样品(例如，通过进行组织活检)，使这些细胞与特异性结合人CD73多肽的抗体接触，并检测这些细胞是否在其表面上表达CD73。任选地，确定个体是否具有表达CD73的细胞包括进行免疫组织化学测定。
在一个实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防对其有需要的个体中(例如，患有胃腺癌或胃食管结合部腺癌的受试者中)的HER2阳性胃癌的方法，该方法包括：
a)检测来自该个体的肿瘤组织样品中的CD73多肽(例如CD73表达细胞)，该肿瘤组织样品任选地包含肿瘤和/或肿瘤相邻组织，以及
b)在确定该肿瘤组织样品包含任选地与参考水平相比增加的水平的CD73多肽(例如，CD73表达细胞)后，向该个体施用抗CD73抗体和抗HER2抗体(以及任选地另外的化疗剂)。任选地，检测肿瘤组织样品中的CD73多肽或CD73表达细胞包括从个体获得包含肿瘤组织和/或肿瘤附近或周围组织(例如，肿瘤相邻组织、相邻的非肿瘤组织或正常相邻组织)的生物样品，并检测CD73多肽或CD73表达细胞的水平。CD73表达细胞可包括例如内皮细胞、肿瘤细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细胞。
在一个实施方案中，可评估HER2和CD73表达两者。例如，在一个实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防对其有需要的个体中(例如，患有胃腺癌或胃食管结合部腺癌的受试者中)的胃癌的方法，该方法包括：
a)检测在肿瘤环境中，任选地在肿瘤内和/或在肿瘤相邻组织内的CD73多肽(例如，CD73表达细胞)，
b)检测在肿瘤细胞上的HER2表达(例如，表达水平)，以及
c)在确定该肿瘤环境包含任选地与参考水平相比增加的水平的CD73(例如，CD73表达细胞)后，并且在检测到肿瘤细胞上的HER2表达(例如，过表达)后，向该个体施用抗CD73抗体和抗HER2抗体(以及任选地另外的化疗剂)。任选地，检测在肿瘤环境内的CD73多肽或CD73表达细胞包括从个体获得包含肿瘤组织和/或癌症附近或周围组织(例如，肿瘤相邻组织、相邻的非肿瘤组织或正常相邻组织)的生物样品，并检测CD73多肽或CD73表达细胞的水平。CD73表达细胞可包括例如内皮细胞、肿瘤细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细胞。任选地，检测在肿瘤细胞上的HER2表达(例如，过表达)包括检测在肿瘤细胞中的HER2过表达。任选地，检测HER2表达或HER2过表达肿瘤细胞包括从个体获得包含肿瘤组织的生物样品，并检测HER2多肽的表达水平，任选地如通过FISH(例如，增加的HER2基因拷贝数的存在)和/或通过IHC(例如，IHC测定中的3+评分)确定的。
在一个实施方案中，本公开的治疗方案可有利地用于治疗患有HER2阳性癌症并且已经接受使用化疗剂(例如，基于铂的药剂、卡铂、紫杉烷药剂、紫杉醇)的先前疗程的个体(或个体群体)。任选地，使用化疗剂的先前疗程已在前1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内完成。在一个实施方案中，在一个方面，本公开的治疗方案可被指定为不存在预先测试细胞中(例如，组织活检中；来自肿瘤基质的细胞中，肿瘤细胞上)的CD73表达的步骤。在一个实施方案中，提供了用于治疗或预防个体(或个体群体)中的胃癌的方法，该个体已接受使用化疗剂(例如铂药剂、卡铂、紫杉烷药剂、紫杉醇)的先前疗程，该方法包括：
a)检测任选地在肿瘤内和/或在相邻组织内的HER2表达肿瘤细胞，以及
b)在检测到HER2表达(例如，过表达)肿瘤细胞后，向个体施用抗CD73抗体和抗HER2抗体(以及任选地另外的化疗剂)。任选地，检测HER2表达或HER2过表达肿瘤细胞包括从个体获得包含癌症组织的生物样品，并检测HER2多肽的表达水平，任选地如通过FISH(例如，增加的HER2基因拷贝数的存在)和/或通过IHC(例如，IHC测定中的3+评分)确定的。
治疗的功效和/或治疗有效量可通过在评估癌症治疗中常用的各种终点来测量。示例性终点包括：延长生存期(包括OS和PFS)；导致客观缓解(包括CR或PR)；肿瘤消退、肿瘤重量或大小缩小、疾病进展时间更长、生存持续时间增加、PFS更长、OS率提高、缓解持续时间增加以及生活质量提高和/或癌症体征或症状改善。改进和/或功效可与其他治疗比较，例如与包括在不存在抗CD73抗体的情况下施用抗HER2抗体和/或化疗的治疗比较。
如本文所用，术语“疾病进展”(PD)是指以研究时的最小总和为参考(如果研究时基线总和是最小的，则包括基线总和)，靶病灶的直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加之外，总和还必须显示至少5mm的绝对增加。一个或多个新病灶的出现也被认为是进展。
如本文所用，术语“部分缓解”(PR)是指以基线总和直径为参考，靶病灶的直径总和减少至少30％。
如本文所用，术语“完全缓解”(CR)是指所有靶病灶的消失，其中任何靶淋巴结的短轴减小至<10mm。
如本文所用，术语“疾病稳定”(SD)是指以研究时的最小直径总和为参考，既没有足够缩小的以符合PR标准，也没有足够的增加以符合PD标准。
如本文所用，术语“客观缓解率”(ORR)等于根据RECIST1.1达到部分或完全缓解(PR+CR)的最佳总疗效的患者比例。
如本文所用，术语“总体生存”(OS)是指从诊断或治疗时起在限定时间段(诸如1年、5年等)内保持存活的患者的百分比。在一个优选的实施方案中，OS是指从研究中随机化的日期至因任何原因死亡的日期的时间。如果患者在随访期结束时存活或失访，则在已知患者存活的最后日期将OS数据删失。通过Kaplan-Meier方法评估总体生存，并且为每个治疗组中的中值OS提供95％置信区间(CI)。
如本文所用，术语“无进展生存”(PFS)是指患者保持存活而癌症没有进展或恶化。在本发明的一个优选方面，PFS被定义为从研究中随机化至首次影像学证实客观进展(如通过RECIST(版本1.1)定义的)或因任何原因死亡的时间。在没有报告先前进展的情况下死亡的患者将被认为已在其死亡当天出现了进展。没有进展或失访的患者将在其最后一次影像学肿瘤评估的当天被删失。
如本文所用，术语“疾病控制率”(DCR)是指缺乏疾病进展及其比率。它是指具有分类为CR、PR或SD的最佳总疗效的患者群体(特别是不包括具有PD的患者)，其中最佳总疗效是记录的从治疗开始直至PD的最佳疗效。
如本文所用，术语“临床获益率”是指分析时为SD或更好。SD或更好(即CR+PR+SD)的肿瘤缓解率定义为具有SD或更好的缓解(如通过RECIST1.1定义的)的患者比例。
如本文所用，术语“延长生存期”是指相对于i)未经治疗的患者、ii)在特定组合疗法中使用少于全部抗肿瘤剂治疗的患者或iii)对照治疗方案，治疗患者的OS或PFS增加。在治疗开始后或在癌症的最初诊断后监测生存期。
如本文所用，术语“最佳总疗效”是记录的从研究治疗开始直至客观进展最早或新治疗开始的最佳疗效，考虑到任何需要确认的情况。患者的最佳总疗效分配将取决于目标和非目标疾病两者的发现，并且还将考虑新病灶的出现。通过使用由研究者在试验过程中提供的评估疗效的算法计算最佳总疗效。
治疗癌症(例如，晚期胃腺癌或胃食管结合部腺癌)的示例性方法包括向对其有需要的患者同时、单独或依次施用有效量的抗人HER2抗体与有效量的抗人CD73抗体的组合，该抗人HER2抗体包含具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区，该抗人CD73抗体包含具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区；任选地，其中该抗人HER2抗体包含具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链；任选地，其中抗人CD73包含具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链。
结合HER2的抗体
结合HER2和阻断HER2信号传导以及限制HER2的可用膜分子的数目一直是若干种治疗方法的焦点。曲妥珠单抗(
Figure BDA0004113265860000293
罗氏公司)是鼠4D5的人源化形式，其结合HER2的近膜区域。曲妥珠单抗通过介导对其所结合的肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、通过引起HER2内化和降解以及通过抑制HER2二聚化来抑制MAPK和PI3K/Akt途径来发挥其抗增殖活性。曲妥珠单抗包含下文所示的重链和轻链可变区，并且以人IgG1同种型形式产生。曲妥珠单抗全长重链和轻链多肽链如下所示(SEQ ID NO：25和26)。抗HER2抗体的另一个示例是马吉妥昔单抗，其结合HER2上曲妥珠单抗结合的相同表位。马吉妥昔单抗具有SEQID NO：27和28所示的重链和轻链氨基酸序列(Kabat CDR加下划线)。
最近，已经开发了与不同化疗剂缀合的曲妥珠单抗。这些免疫缀合物或ADC特别包括恩美曲妥珠单抗(也称为PRO132365、RG3502、T-DM1、曲妥珠单抗MCC-DM1、
Figure BDA0004113265860000291
)、德喜曲妥珠单抗(也称为DS-8201、DS-8201 a、fam-trastuzumab deruxtecan-nxki、
Figure BDA0004113265860000292
)和曲妥珠单抗-杜卡马嗪(也称为SYD985、曲妥珠单抗vc-seco-DUBA、曲妥珠单抗缬氨酸-瓜氨酸-seco-杜卡霉素羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚)。德喜曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-杜卡马嗪和恩美曲妥珠单抗与曲妥珠单抗具有相同的重链和轻链可变区以及全长多肽链，但恩美曲妥珠单抗在曲妥珠单抗的重链上缺乏末端赖氨酸。德喜曲妥珠单抗(DS8201a)通过平均8个半胱氨酰残基的接头与德鲁替康，一种被称为DXd(DX-8951衍生物，DXd)的喜树碱或依喜替康衍生物缀合(参见Ogitano等人(2016年)Cancer Sci，第107卷(第2016期)第1039-1046页，其公开内容以引用方式并入本文)。德喜曲妥珠单抗可如美国专利号10195288和PCT公开号WO2019/044946中所述制备，它们的公开内容以引用方式并入本文。恩美曲妥珠单抗通过平均3-4个赖氨酰残基的不可切割的琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)与美登木素生物碱DM1缀合。曲妥珠单抗一杜卡马嗪通过平均2个或4个半胱氨酰残基的可切割接头N[2-(2-马来酰亚胺乙氧基)乙氧基羰基]-L-缬氨酰-L-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酰基与seco-DUBA缀合。
曲妥珠单抗重链可变区
Figure BDA0004113265860000301
曲妥珠单抗轻链可变区
Figure BDA0004113265860000302
曲妥珠单抗重链
Figure BDA0004113265860000311
曲妥珠单抗轻链
Figure BDA0004113265860000312
马吉妥昔单抗重链
Figure BDA0004113265860000313
马吉妥昔单抗轻链
Figure BDA0004113265860000314
抑制CD73的抗体
可根据本文所述的组合治疗方法使用的示例性抗CD73抗体包括结合人CD73多肽的抗体或抗体片段，该人CD73多肽包含人来源的VH和VL框架(例如，FRI、FR2、FR3和FR4)。在一个方面，抗体或抗体片段包含：HCDR1(重链CDR1)，该HCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列SYNMY；HCDR2(重链CDR2)，该HCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列YIDPYNGGSSYNQKFKG，任选地进一步，其中SEQ ID NO：12的位置13处的谷氨酰胺残基(Q)可被亮氨酸残基(L)取代，其中SEQ ID NO：12的位置14处的赖氨酸残基(K)可被苏氨酸残基(T)取代；HCDR3(重链CDR3)，该HCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列GYNNYKAWFAY，任选地进一步，其中SEQ ID NO：13的位置3处的天冬酰胺残基(N)可被甘氨酸残基(G)取代；LCDR1(轻链CDR1)，该LCDR1包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列KASQSVTNDVA，任选地进一步，其中SEQ ID NO：14的位置7处的苏氨酸残基(T)可被丝氨酸残基(S)取代；LCDR2(轻链CDR2)，该LCDR2包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列YASNRYT，任选地，其中SEQ ID NO：15的位置4处的天冬酰胺残基(N)可被苏氨酸(T)取代；和LCDR3(轻链CDR3)，该LCDR3包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列QQDYSSLT。
在一个实施方案中，HCDR2包含式I的氨基酸序列：
Y-l-D-P-Y-N-G-G-S-S-Y-N-Xaa1-Xaa2-F-K-G(SEQ ID NO：3)，或其亚序列，其中Xaa1是Q(谷氨酰胺)或L(亮氨酸)，并且其中Xaa2是K(赖氨酸)或T(苏氨酸)。
在一个实施方案中，HCDR3包含式II的氨基酸序列：
G-Y-Xaa1-N-Y-K-A-W-F-A-Y(SEQ ID NO：4)，或其亚序列，其中Xaa1是N(天冬氨酸)或G(甘氨酸)。
在一个实施方案中，LCDR1包含式III的氨基酸序列：
K-A-S-Q-S-V-Xaa1-N-D-V-A(SEQ ID NO：5)，
或其亚序列，其中Xaa1是T(苏氨酸)或S(丝氨酸)。
在一个实施方案中，LCDR2包含式IV的氨基酸序列：
Y-A-S-Xaa1-R-Y-T(SEQ ID NO：6)，
或其亚序列，其中Xaa1是T(苏氨酸)或N(天冬氨酸)。
在一个方面，用于本文治疗方法的结合人CD73多肽的抗体包含：HCDRI，该HCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列SYNMY；HCDR2，该HCDR2包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列YIDPYNGGSSYNLTFKG；HCDR3，该HCDR3包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列GYGNYKAWFAY；LCDR1，该LCDR1包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列KASQSVSNDVA；LCDR2，该LCDR2包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列YASTRYT；LCDR3，该LCDR3包含如SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列QQDYSSLT。
在一个方面，用于本文治疗方法的结合人CD73多肽的抗体包含：HCDR1，该HCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列SYNMY；HCDR2，该HCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列YIDPYNGGSSYNQKFKG；HCDR3，该HCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列GYNNYKAWFAY；LCDR1，该LCDR1包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列KASQSVTNDVA；LCDR2，该LCDR2包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列YASNRYT；LCDR3，该LCDR3包含如SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列QQDYSSLT。
在一个实施方案中，抗体包含来自人亚组IGHV1-3(任选地以及IGHJ4)的重链框架，任选地IGHV1-3是IGHV1-3*01。在一个实施方案中，人源化抗体包含来自人亚组IGKV1-33(任选地以及IGKJ2)，任选地来自IGKV1-33*01的轻链框架。
抗体还可包含跨人重链和/或轻链框架的一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代，以例如增强抗体的亲和力、稳定性或其他性质。
抗CD73抗体的VH和VL氨基酸序列的示例示于实施例2(示出了H4+链，并且2H4+2Lx抗体参见表3)，并且L1-L4链参见表1。
在一个方面，用于本文治疗方法的抗CD73抗体或抗体片段包含：
(a)CDR-H1，该CDR-H1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)CDR-H2，该CDR-H2包含SEQ ID NO：3、8或12的氨基酸序列；
(c)CDR-H3，该CDR-H3包含SEQ ID NO：4、9或13的氨基酸序列；
(d)CDR-L1，该CDR-L1包含SEQ ID NO：5、10或14的氨基酸序列；
(e)CDR-L2，该CDR-L2包含SEQ ID NO：6、11或15的氨基酸序列；
(f)CDR-L3，该CDR-L3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；以及
(g)人重链和轻链框架序列。
在一个实施方案中，抗体包含来自人亚组IGHV1-3以及IGHJ4的重链框架，任选地，抗体包含IGHV1-3*01以及IGHJ4。在一个实施方案中，人源化抗体包含来自人亚组IGKV1-33(任选地IGKV1-33*01)以及IGKJ2的轻链框架。
任选地，人框架包含一个或多个突变(例如，回复突变)以引入存在于非人哺乳动物(例如，小鼠)中特定位置的残基。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置2处的氨基酸是异亮氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置30处的氨基酸是丙氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置48处的氨基酸是异亮氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置69处的氨基酸是亮氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置73处的氨基酸是赖氨酸。
在一个实施方案中，VH包含Kabat位置2处的异亮氨酸残基、位置30处的丙氨酸、位置48处的异亮氨酸、位置69处的亮氨酸和位置73处的赖氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat轻链位置67处的氨基酸是酪氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat轻链位置60处的氨基酸是丝氨酸或天冬氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat轻链位置2处的氨基酸是缬氨酸或异亮氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat轻链位置87处的氨基酸是酪氨酸或苯丙氨酸。
在一个实施方案中，VL包含Kabat位置67处的酪氨酸残基、位置60处的丝氨酸、位置2处的异亮氨酸和位置87处的酪氨酸。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置28处的氨基酸是苏氨酸(T)。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置
66处的氨基酸是精氨酸(R)。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置
67处的氨基酸是缬氨酸(V)。
在本文任何实施方案的一个方面，Kabat重链位置71处的氨基酸是精氨酸(R)。
使用Kabat编号系统(Kabat等人(1991年)Sequences of Protein ofImmunological Interest，第5版，United States Public Health Service，NationalInstitute of Health，Bethesda，MD)描述本文VH和VL结构域中的位置。
在一个方面，抗CD73抗体包含与SEQ ID NO：37或42的VH结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性)的VH结构域。
在一个方面，抗CD73抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO：33-36或43-46中任一者的VL结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性)的VL结构域。
在一个方面，抗CD73抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO：42的VH结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性)的VH结构域，以及与SEQ ID NO：43-46中任一者的VL结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性，或100％同一性)的VL结构域。
在一个方面，抗CD73抗体或抗体片段包含与H4+L1抗体的SEQ ID NO：38的重链具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性)的重链。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含与H4+L1抗体的SEQ ID NO：39的轻链具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性)的轻链。
在一个方面，抗CD73抗体或抗体片段包含与2H4+2L1抗体的SEQ ID NO：47的重链具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性)的重链。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含与2H4+2L1抗体的SEQ IDNO：48的轻链具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性)的轻链。
在一个方面，抗CD73抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个方面，抗CD73抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的轻链。
在其他方面，根据本发明的治疗方法使用的抗CD73抗体可具有重链和轻链CDR1、2和3(例如，如根据Kabat编号确定的)，或来源于另一种合适的抗CD73抗体的重链和轻链可变区。
CD73二聚体的每个亚基由两个结构域组成：N末端结构域(残基27-317，编号参考Knapp等人(2012年))和C末端结构域(残基337-549)，其中CD73的较大N末端结构域含有金属离子结合位点并且具有四层a/b-b-b-a结构，包括两个夹心混合b片层。C末端结构域含有底物结合位点和二聚化界面，并具有四层结构的组分a/b-b-a-b。这两个结构域通过包含小铰链区的单螺旋(残基318-336)连接，这使得酶能够进行大的结构域运动，从而在开放和闭合构象之间转换。在闭合构象中观察到的活性位点位于N末端和C末端结构域之间的界面处，并且由这两个结构域的残基形成。参见例如，Knapp等人(2012年)Structure，第20卷，第2161-2173页，其公开内容以引用方式并入本文。
特别感兴趣的一类合适的抗CD73抗体以缺乏在以前的抗CD73抗体中观察到的“钩状效应”抗体，诸如11E1、6E1、3C12和8C7(参见WO2016/055609，Innate Pharma，其公开内容以引用方式并入本文)为代表。据报道缺乏钩状效应的其他示例性抗CD73抗体包括抗体350、356、358、373(例如373.A)、374、376、377、379或Hu101-28(参见WO2018/237157和WO2018137598，其公开内容以引用方式并入本文)。钩状效应是指抗CD73抗体在抑制可溶性二聚体蛋白形式的CD73时有呈现假阳性的倾向。如在W02016/055609中所讨论的，当以远超CD73二聚体的量测试时，被认为引起CD73二聚体的交联而非真正抑制酶活性的此类抗CD73抗体丧失抑制CD73的能力。抗体诸如11E1、6E1、3C12和8C7抑制可溶性CD73的酶活性(通过二价地结合一个CD73二聚体)，并且能够用作细胞膜结合的CD73的特别有效的非竞争性抑制剂(不依赖于内化)(参见PCT公开号WO2016/055609)。鉴于能够基本上完全中和CD73(例如，在肿瘤基质中)，这些抗体可以有利地使用，特别是与诱导肿瘤基质中CD73的表达相关的化疗剂组合和/或与抗HER2抗体组合用于治疗方案中。
抗体优选结合存在于在细胞(包括肿瘤细胞)表面表达的CD73上的表位，并抑制CD73酶(例如，在细胞表面表达的膜结合的CD73蛋白)的酶(胞外-5′核苷酸酶)活性。在一个实施方案中，这些抗体可用作纯的CD73阻断抗体，例如，它们抑制在细胞表面表达的膜结合CD73蛋白的酶活性，而基本上不结合Fey受体和/或基本上不将ADCC导向CD73表达细胞。任选地，抗体保留Fc结构域并保留与人FcRn的结合。
在一个方面，抗CD73抗体可结合CD73上的表位，该表位不仅在未结合底物时存在于CD73上，而且在结合底物(例如，天然底物，诸如AMP或结合活性位点的抑制剂或其他化合物，诸如AMP类似物腺苷5′-(α，β-亚甲基)二磷酸(APCP))时也存在于CD73上。在一个方面，抗CD73抗体不与CD73的底物竞争结合CD73多肽。CD73的底物的示例包括例如天然底物，诸如AMP或结合活性位点的抑制剂或其他化合物，诸如AMP类似物腺苷5′-(α，β-亚甲基)二磷酸(APCP)。
在一个方面，抗CD73抗体用作变构抑制剂，并且以二聚体内结合模式以完整全长抗体和CD73二聚体之间的1∶1化学计量比结合CD73。在一个方面，抗CD73抗体能够结合CD73多肽并将其限制在AMP不能被水解的中间状态(在开放(非活性)和封闭(活性，底物结合)状态之间)。
在一个实施方案中，当CD73以可溶性重组CD73蛋白的形式存在时，抗体抑制CD73的酶活性，例如当抗体处于它们不能形成低聚物的环境/构型时，例如当它们以远超CD73多肽二聚体的摩尔量(例如，至少10倍、20倍、100倍等)提供时，抗体能够抑制可溶性人二聚体CD73多肽的酶活性。因为残余的CD73酶活性可导致足够的腺苷产生以介导免疫抑制作用，所以高水平的抗体介导的酶阻断有利于介导治疗效果。
此类抗体的示例描述于本文以及PCT公开号W02016/055609(例如，抗体11E1、6E1、3C12和8C7)中。抗体11E1、6E1、3C12和8C7丧失与在残基K136(参考SEQ ID NO：1的CD73多肽)处具有取代的CD73突变体的结合。抗体11E1、6E1、3C12和8C7也丧失与在残基A99、E129、K133、E134和A135(参考SEQ ID NO：1的CD73多肽)处具有取代的突变体以及在残基K97、E125、Q153和K330(参考SEQ ID NO：1的CD73多肽)处具有取代的突变体的结合。抗体的其他示例可结合SEQ ID NO：1的残基131-162，特别是氨基酸残基L131、K136、S155、L157、K162、K330(参考SEQ ID NO：1的CD73多肽)的区段。
抗体11E1、6E1、3C12和8C7是以二聚体内模式结合CD73二聚体的抗体的示例，与以二聚体间模式相互作用的其他抗体相反，这些抗体将CD73酶限制在AMP不能被水解的非活性状态。在PCT公开号W02016/055609和W02016/131950中提供了使用可溶性CD73的测定，这些测定其可用于鉴定此类CD73功能阻断抗体。在一个方面，抗CD73抗体是在公开本发明的申请的提交日可获得的或以其他方式已知的任何抗体，或其保留结合CD73和抑制CD73的酶活性的能力的抗体片段(例如，包含重链和轻链CDR的片段)。
因此，抗体可以是CD73多肽的变构抑制剂，例如抗体结合在细胞(包括但不限于肿瘤细胞)表面表达的人CD73多肽，并抑制CD73多肽的酶(胞外-5′核苷酸酶)活性，而不影响CD73多肽的底物结合CD73多肽的能力。
本文描述了当CD73以CD73二聚体的形式存在时结合CD73上存在于同一表面上的表位的示例性抗体，例如，可能允许抗体二价地结合一个CD73二聚体，该抗体以二聚体内结合模式以完整全长抗体和CD73二聚体之间的1∶1化学计量比结合CD73。鉴于与配体结合的CD73的结合，当CD73与AMP(例如在上游ADP和/或AMP在治疗之前以显著水平存在的肿瘤环境中)结合时，本文所述的抗体可用于与CD73结合。肿瘤微环境可通过任何合适的参数(例如高水平的ADP(例如由濒死细胞产生)、AMP、腺苷)，通过CD73表达或CD73表达细胞的存在或水平，通过腺苷受体表达或腺苷受体表达细胞的存在或水平来表征。因此，肿瘤环境中的CD73分子可以是底物结合构象，并且除了非底物结合的CD73之外，还结合并抑制底物结合的细胞CD73(例如，与底物诸如AMP一起预温育的表达CD73的细胞)的能力可提供更强的体内抑制CD73的能力。任选地，可在治疗之前评估肿瘤环境中的ADP或AMP(和/或ATP或腺苷)的水平。这些抗体对于在肿瘤样品中具有显著水平(例如，与参考相比的高水平)的ADP、AMP、ATP或腺苷的个体的治疗可具有特别的优势。
示例性抗体可结合在细胞表面表达的人CD73多肽，并抑制CD73多肽的酶(胞外-5′核苷酸酶)活性，其中该抗体能够二价地结合单个CD73多肽二聚体(可溶性CD73多肽二聚体或由细胞表达的CD73多肽二聚体)。任选地，该抗体以第一抗原结合结构域结合该二聚体内的第一CD73多肽，并以第二抗原结合结构域结合第二CD73多肽。
示例性抗体可结合在细胞表面表达的人CD73多肽，并抑制CD73多肽的酶(胞外-5′核苷酸酶)活性，其中该抗体能够结合处于底物结合构象的CD73多肽。
可针对抗CD73抗体抑制CD73酶活性的能力，特别是阻断CD73的5′-核苷酸酶活性和减少通过CD73表达细胞的腺苷的产生，进而恢复淋巴细胞的活性并且/或者减轻腺苷介导的淋巴细胞的抑制的能力对其进行评估和选择。
抗体抑制CD73酶活性的能力可在使用重组可溶性人CD73(二聚体形式)和AMP的无细胞测定中来测试，其中直接(例如，通过测量底物和产物，即AMP、腺苷和/或磷酸盐)或间接检测AMP向腺苷的转化(和/或其抑制)。在一个示例中，在受试化合物与重组CD73一起温育之前和之后，通过HPLC检测AMP和/或腺苷。重组CD73描述于例如WO2016/055609和WO2016/131950中。
抗体的抑制活性还可以许多其他方式中的任一种方式来评估。例如，在间接测定中，使用基于荧光素酶的试剂(例如，可获自Promega的CellTiter-
Figure BDA0004113265860000391
系统)来检测AMP的消失情况。测定中的荧光素酶反应被AMP抑制。向反应中加入CD73酶降解AMP，并减轻抑制，产生可检测的信号。
使用可溶性CD73的测定可有利地涉及在抗体以远超CD73多肽二聚体的摩尔量(例如，10倍、20倍、50倍、100倍等)提供的条件下的测试。当以远超酶的摩尔量提供时，抗CD73抗体将不再能够形成抗体和CD73二聚体的多聚体复合物；然后可以选择保留对CD73酶活性的抑制的抗体。
抗体抑制CD73的5′-胞外核苷酸酶酶活性的能力也可另选地或除此之外在细胞测定(使用表达CD73的细胞)中测试。有利地，可首先在无细胞测定中测试或筛选抗体以鉴定阻断酶活性的抗体，从而降低选择通过引起CD73内化而抑制CD73的抗体的可能性，然后在细胞测定中以纯化抗体的形式测试。细胞测定可如WO2016/055609中所示进行。例如，将CD73表达细胞系(例如，MDA-MB-231细胞系)在存在抗CD73抗体的情况下接种在平底96孔板中并温育。将AMP加入到细胞中并于4℃温育(以避免CD73下调)。然后将板离心并将上清液转移至平底96孔培养板。然后定量由AMP向腺苷的水解产生的游离磷酸盐。在存在抗体的情况下，AMP向腺苷的水解的减少表明该抗体抑制了细胞CD73。
在一个实施方案中，抗体制剂使CD73多肽的酶活性降低至少50％，优选地使CD73多肽(例如，可溶性同源二聚体CD73多肽；细胞表达的CD73)的酶活性降低至少60％、70％或80％。
还可在间接测定中针对抗体调节淋巴细胞活性的能力，例如减轻腺苷介导的淋巴细胞活性的抑制或引起淋巴细胞活性的活化的能力测量其活性。这可例如使用细胞因子释放测定来解决。在另一个示例中，可在间接测定中评估抗体调节淋巴细胞增殖的能力。
可测试抗体内化或诱导CD73下调的能力，例如通过内化或诱导CD73从细胞表面脱落。抗CD73抗体是否在结合哺乳动物细胞上的CD73后内化，或者CD73多肽是否经历细胞内内化(例如，在由抗体结合后)可通过各种测定来确定，这些测定包括例如WO2016/055609中所述的测定，其公开内容以引用方式并入本文。
在一个示例中，当抗体处于它们不能形成低聚物的环境/构型时，例如当它们以远超CD73多肽二聚体的摩尔量(例如，至少10倍、20倍、100倍等)提供时，可针对抑制可溶性人二聚体CD73多肽的酶活性的能力来选择抗体。当抗体以远超CD73多肽二聚体的摩尔量提供时，通过引起低聚化起作用的抗体不能抑制CD73。这些抗体还结合CD73上的表位，当CD73在细胞表面表达时该表位被保留。通过使用该测定，还可鉴定二价地结合单个CD73二聚体的抗体；此类抗体可在体内外在CD73表达细胞中具有改善的CD73结合和CD73阻断活性。然后在使用纯化抗体的细胞酶活性测定中测试通过这些方法鉴定的抗体，并发现这些抗体中和细胞CD73的酶活性。主要通过诱导内化来抑制CD73或与细胞CD73丧失显著结合的抗体效力较低并且不能中和酶活性，最多只能部分抑制细胞中CD73的酶活性。
由这些抗体结合的CD73上的表位存在于如由一系列细胞(例如，癌细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细胞、转染细胞)表达的CD73多肽上，并且以如通过流式细胞术确定的高亲和力结合。例如，抗体可通过针对与在表面表达CD73多肽的细胞的结合的EC50(如通过流式细胞术确定的)来表征，该EC50与本文所述的抗CD73抗体(例如，6E1)的EC50相当，或比其高不超过2-log、任选地1-log，或不超过5μg/mL、任选地不超过2μg/mL、不超过1μg/mL、不超过0.5μg/mL、不超过0.1μg/mL或不超过0.05μg/mL。在一个实施方案中，细胞是在表面表达CD73的细胞。在一个实施方案中，细胞是在表面内源性表达CD73的细胞，例如癌细胞。
在一个实施方案中，CD73中和抗体可通过能够使CD73的细胞5′-胞外核苷酸酶活性降低至少60％、75％或80％来表征。在一个实施方案中，中和CD73的抗体的可通过针对CD73的5′-胞外核苷酸酶活性的抑制的EC50来表征，该EC50与本文所述的抗体的EC50相当或不超过其，比本文所述的抗CD73抗体(例如，6E1)的EC50高不超过2-log，任选地1-log，或不超过1μg/mL、任选地不超过0.5μg/mL、任选地不超过0.2μg/mL。
任选地，通过定量AMP向腺苷的水解来评估MDA-MB-231细胞中5′胞外核苷酸酶活性的中和，从而确定细胞表达的CD73的5′-胞外核苷酸酶活性的抑制(参见例如，WO2016/055609的实施例5)。
在一个实施方案中，抗体特异性结合细胞表面的人CD73，并且能够中和细胞CD73(细胞表达的CD73)的5′-胞外核苷酸酶活性。在一个实施方案中，抗体特异性结合细胞表面的人CD73并中和其5′-胞外核苷酸酶活性，并且在结合CD73后不内化到CD73表达细胞中，例如，抗体不需要针对CD73的多聚化和随后的内化的CD73中和活性。在一个实施方案中，抗体是非耗竭抗体，例如Fc沉默抗体。抗体能够中和溶液中二聚体人CD73多肽的5′-胞外核苷酸酶活性，而且不依赖于CD73多肽和抗CD73抗体的低聚物的诱导。
在一个方面，抗体特异性结合与AMP一起预温育的细胞表面的人CD73，并且能够中和其5′-胞外核苷酸酶活性。任选地，通过定量AMP向腺苷的水解来评估MDA-MB-231细胞中5′胞外核苷酸酶活性的中和，从而确定5′-胞外核苷酸酶活性的中和(参见例如，WO2016/055609的实施例5)。
任选地，抗CD73抗体可结合存在于可溶性CD73和在细胞表面表达的CD73上的共有抗原决定簇。
任选地，当CD73活性位点未被底物(例如，AMP、APCP)占据/未与其结合时，并且当CD73活性位点被底物(例如，AMP、APCP)占据/与其结合时，抗CD73抗体结合CD73上存在的共有抗原决定簇。
在一个方面，抗CD73抗体结合CD73二聚体内的每条CD73多肽链内的抗原决定簇，例如，其中这些抗原决定簇存在于CD73二聚体的共有表面上。
在一个方面，抗CD73抗体与在区段158-171中的残基和/或在区段206-211中的残基处具有氨基酸取代的CD73多肽，例如在V170、K206和N211(参考SEQ ID NO：1)中的任何一个或多个残基处具有氨基酸取代的CD73多肽的结合降低。
在一个方面，抗CD73抗体与在区段65-83中的残基和/或在区段157-172中的残基(参考SEQ ID NO：1)处具有氨基酸取代的CD73多肽的结合降低。
在一个方面，抗CD73抗体结合CD73上的表位，该表位包含残基K136(参考SEQ IDNO：1)。
在一个方面，抗CD73抗体结合CD73上的表位，该表位包含选自K97、E125、Q153和K330(参考SEQ ID NO：1)的残基中的一个、两个、三个或四个残基。
在一个方面，抗CD73抗体结合CD73上的表位，该表位包含选自A99、E129、K133、E134和A135(参考SEQ ID NO：1)的残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基。
在一个方面，抗CD73抗体结合CD73上的表位，该表位包含选自Y345、D399、E400、R401和R480(参考SEQ ID NO：1)的残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基。
在一个方面，抗CD73抗体至少部分地结合人CD73蛋白(例如，CD73同源二聚体蛋白)上的氨基酸残基的结构域或区段，该结构域或区段包含氨基酸残基K97、A99、E125、E129、K133、E134、A135、K136、Q153和K330(参考SEQ ID NO：1)。在一个方面，抗XD73抗体结合XD73上的表位，该表位包含选自K97、A99、E125、E129、K133、E134、A135、K136、Q153和K330(参考SEQ ID NO：1)的残基中的至少一个、两个、三个、四个或五个或更多个残基。
在一个方面，抗XD73抗体与在残基K136(参考SEQ ID NO：1)处具有突变的CD73多肽的结合降低；任选地，突变CD73多肽具有突变K136A。
在一个方面，抗CD73抗体与在选自K97、E125、Q153和K330(参考SEQ ID NO：1)的残基处具有突变的CD73多肽的结合降低；任选地，突变CD73多肽具有突变K97A、E125A、Q153A和/或K330A(例如，K97A、E125A和K330A；K97A、E125A和/或Q153A)。
在一个方面，抗CD73抗体与在选自A99、E129、K133、E134和A135(参考SEQ ID NO：1)的残基处具有突变的CD73多肽的结合降低；任选地，突变CD73多肽具有突变A99S、E129A、K133A、E134N和A135S。
在一个方面，抗CD73抗体结合CD73上的表位，该表位包含选自L131、K136、S155、L157、K162和K330(参考SEQ ID NO：1)的残基中的一个、两个、三个、四个、五个或六个残基。
在一个方面，抗CD73抗体与在选自L131、K136、S155、L157和K162(参考SEQ ID NO：1)的一个或多个(或全部)残基处具有突变的CD73多肽的结合降低。
在一个方面，抗CD73抗体与在选自L131、K136、S155、L157、K162和K330(参考SEQID NO：1)的一个或多个(或全部)残基处具有突变的CD73多肽的结合降低。
在一个方面，抗CD73抗体与在选自Y345、D399、E400、R401和R480(参考SEQ ID NO：1)一个或多个(或全部)残基处具有突变的CD73多肽的结合降低。
在一个方面，抗CD73抗体竞争结合由抗体11E1、8C7、3C12、6E1、373.A和/或Hu101-28(例如，其与具有该抗体的重链和轻链CDR或可变区的抗体竞争结合CD73多肽上的表位)结合的CD73上的表位。
在本文任何实施方案的一个方面，抗原结合化合物与单克隆抗体11E1、8C7、3C12和/或6E1(例如，其与具有11E1、8C7、3C12或6E1中的任一者的重链和轻链CDR或可变区的抗体竞争结合CD73多肽)结合同一表位和/或竞争结合CD73多肽上的表位。在一个实施方案中，抗原结合化合物与选自以下项的抗体结合相同表位和/或竞争结合CD73多肽上的表位：
(a)具有SEQ ID NO：49和50的相应VH和VL区的抗体(6E1)；
(b)具有SEQ ID NO：51和52的相应VH和VL区的抗体(11E1)；
(c)具有SEQ ID NO：53和54的相应VH和VL区的抗体(8C7)；和
(d)具有SEQ ID NO：55和56的相应VH和VL区的抗体(3C12)。
在一个实施方案中，抗CD73抗体结合包含一个、两个或三个氨基酸残基的表位，这些氨基酸残基选自由11E1、6E1、3C12或8C7结合的CD73上的氨基酸残基。
在本文任何实施方案的一个方面，抗体可具有重链和/或轻链，该重链和/或轻链具有选自11E1、6E1、3C12、8C7、373(例如，373.A)或Hu101-28的抗体的相应重链和/或轻链的一个、两个或三个CDR。
抗体11E1、6E1、3C12、8C7、373.A和Hu101-28的重链和轻链可变区的氨基酸序列列于表A中。在一个具体的实施方案中，本公开提供了与单克隆抗体11E1、6E1、3C12、8C7、373.A或Hu101-28结合相同或基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，该抗体包含抗体11E1、6E1、3C12、8C7、373.A或Hu101-28的高变区。在本文的任何实施方案中，抗体11E1、6E1、3C12、8C7、373.A或Hu101-28可通过氨基酸序列和/或编码氨基酸序列的核酸序列来表征。根据一个实施方案，抗体可包含11E1、6E1、3C12、8C7、373.A或Hu101-28的重链可变区的三个CDR(例如，根据Kabat、Chothia或IGMT编号)。还提供了单克隆抗体，该单克隆抗体还包含11E1、6E1、3C12、8C7、373.A或Hu101-28的可变轻链可变区或相应11E1、6E1、3C12、8C7、373.A或Hu101-28抗体的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个CDR(例如，根据Kabat、Chothia或IGMT编号)。任选地，该轻链或重链CDR中的任何一个或多个CDR可含有一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体11E1、6E1、3C12、8C7、373.A或Hu101-28的抗原结合区的部分或全部抗原结合区的轻链和/或重链可变区中的任一者与人IgG类型的免疫球蛋白恒定区、任选地人恒定区、任选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型融合。在一个实施方案中，人恒定区任选地还包含氨基酸取代以降低效应子功能(结合人Fey受体)。在一个实施方案中，人恒定区(任选地铰链区)任选地还包含氨基酸取代以增加或诱导CD73的细胞内内化。
在本文任何实施方案的另一方面，重链和轻链的CDR 1、2和/或3中的任一者可通过其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或表征为具有与特定CDR或CDR集(例如以SEQ ID NO列出)具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在任何抗体中，例如11E1、8C7、3C12或6E1，特定可变区和CDR序列可包含序列修饰，例如取代(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个序列修饰)。在一个实施方案中，重链和轻链的CDR 1、2和/或3包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其中所取代的残基是存在于人来源的序列中的残基。在一个实施方案中，取代是保守修饰。保守序列修饰是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入抗体。保守氨基酸取代通常是氨基酸残基被具有类似物理化学性质的侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。特定的可变区和CDR序列可包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。当进行取代时，优选的取代将是保守修饰。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可使用本文所述的测定测试改变的抗体的保留功能(即本文所示的性质)。
具有表A中所示的VH和VL序列的抗体的HCDR1、2、3和LCDR1、2、3可以任选地指定为全部(或各自，独立地)是Kabat编号系统、Chothia编号系统、IMGT编号系统或任何其他合适的编号系统的HCDR和LCDR。加下划线和加粗的序列表示Kabat CDR。
表A
Figure BDA0004113265860000461
在一个实施方案中，可制备抗CD73抗体，使得它们基本上不与人Fey受体(例如，CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64中的任一者或多者)结合。此类抗体可包含已知不与Fey受体结合或与其结合程度低的各种重链的恒定区。另选地，不包含(或包含部分)恒定区的抗体片段(诸如F(ab′)2片段)可用于避免Fc受体结合。可根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包括例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。此外，通常可使用任何抗体IgG同种型，其中Fc部分被修饰(例如，通过引入1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代)以最大程度降低或消除与Fc受体的结合(参见例如，WO 03/101485，其公开内容以引用方式并入本文)。测定诸如评估Fc受体结合是本领域熟知的，并描述于例如WO 03/101485中。
在一个实施方案中，抗CD73抗体可在Fc区中包含产生与效应细胞具有最小相互作用的“Fc沉默”抗体的一个或多个特定突变。沉默效应子功能可通过抗体的Fc区中的突变获得，并且已在本领域中描述：N297A突变、LALA突变(Strohl，W.，2009年，Curr.Opin.Biotechno1.，第20卷(第6期)：第685-691页)；和D265A(Baudino等人，2008年，J.Immunol.，第181卷：第6664-6669页)。还参见Heusser等人，W02012/065950，其公开内容以引用方式并入本文。在一个实施方案中，抗体在铰链区中包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体是IgG1或IgG2，并且包含在残基233-236、任选地233-238(EU编号)处的一个、两个或三个取代。在一个实施方案中，抗体是IgG4，并且包含在残基327、330和/或331(EU编号)处的一个、两个或三个取代。沉默Fc IgG1抗体的示例是在IgG1Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变的LALA突变体。Fc沉默突变的另一个示例是在残基D265处或在D265和P329处的突变，例如，如在IgG1抗体中用作DAPA(D265A、P329A)突变(US6,737,056)。另一种沉默IgG1抗体包含在残基N297处的突变(例如，N297A、N297S突变)，该突变产生非糖基化/非糖基化抗体。其他沉默突变包括：在残基L234和G237处的取代(L234A/G237A)；在残基S228、L235和R409处的取代(S228P/L235E/R409K、T、M、L)；在残基H268、V309、A330和A331处的取代(H268Q/V309L/A330S/A331S)；在残基C220、C226、C229和P238处的取代(C220S/C226S/C229S/P238S)；在残基C226、C229、E233、L234和L235处的取代(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A)；在残基K322、L235和L235处的取代(K322A/L234A/L235A)；在残基L234、L235和P331处的取代(L234F/L235E/P331S)；在残基234、235和297处的取代；在残基E318、K320和K322处的取代(L235E/E318A/K320A/K322A)；在残基处的取代(V234A、G237A、P238S)；在残基243和264处的取代；在残基297和299处的取代；使得由EU编号系统定义的残基233、234、235、237和238包含选自PAAAP、PAAAS和SAAAS的序列(参见WO2011/066501)的取代。
在一个实施方案中，抗CD73抗体可在Fc区中包含一个或多个特异性突变。例如，这种抗体可包含人IgG1来源的Fc结构域，该Fc结构域包含在Kabat残基234、235、237、330和/或331处的突变。这种Fc结构域的一个示例包含在Kabat残基L234、L235和P331处的取代(例如，L234A/L235E/P331S或L234F/L235E/P331S)。这种Fc结构域的另一个示例包含在Kabat残基L234、L235、G237和P331(例如，L234A/L235E/G237A/P331S)处的取代。这种Fc结构域的另一个示例包含在Kabat残基L234、L235、G237、A330和P331(例如，L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)处的取代。在一个实施方案中，抗体包含任选地为人IgG1同种型的Fc结构域，该Fc结构域包含：L234X1取代、L235X2取代和P331X3取代，其中X1是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X2是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，并且X3是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基；任选地，其中X1是丙氨酸或苯丙氨酸或其保守取代；任选地，其中X2是谷氨酸或其保守取代；任选地，其中X3是丝氨酸或其保守取代。在另一个实施方案中，抗体包含任选地为人IgG1同种型的Fc结构域，该Fc结构域包含：L234X1取代、L235X2取代、G237X4取代和P331X4取代，其中X1是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X2是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X3是除甘氨酸以外的任何氨基酸残基，并且X4是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基；任选地，其中X1是丙氨酸或苯丙氨酸或其保守取代；任选地，其中X2是谷氨酸或其保守取代；任选地，X3是丙氨酸或其保守取代；任选地，X4是丝氨酸或其保守取代。在另一个实施方案中，抗体包含任选地为人IgG1同种型的Fc结构域，该Fc结构域包含：L234X1取代、L235X2取代、G237X4取代、G330X4取代和P331X5取代，其中X1是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X2是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X3是除甘氨酸以外的任何氨基酸残基，X4是除丙氨酸以外的任何氨基酸残基，并且X5是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基；任选地，其中X1是丙氨酸或苯丙氨酸或其保守取代；任选地，其中X2是谷氨酸或其保守取代；任选地，X3是丙氨酸或其保守取代；任选地，X4是丝氨酸或其保守取代；任选地，X5是丝氨酸或其保守取代。
在此处使用的缩略符号中，格式是：野生型残基：多肽中的位置：突变残基，其中残基位置根据Kabat的EU编号来表示。
在一个实施方案中，抗CD73抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含以下氨基酸序列或与其具有至少90％、95％或99％同一性但保留在Kabat位置234、235和331处的氨基酸残基(加下划线)的氨基酸序列：
Figure BDA0004113265860000491
在一个实施方案中，抗CD73抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含以下氨基酸序列或与其具有至少90％、95％或99％同一性但保留在Kabat位置234、235和331处的氨基酸残基(加下划线)的氨基酸序列：
Figure BDA0004113265860000501
在一个实施方案中，抗CD73抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含以下氨基酸序列或与其具有至少90％、95％或99％同一性但保留在Kabat位置234、235、237、330和331处的氨基酸残基(加下划线)的氨基酸序列：
Figure BDA0004113265860000502
在一个实施方案中，抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含以下氨基酸序列或与其具有至少90％、95％或99％同一性但保留在Kabat位置234、235、237和331处的氨基酸残基(加下划线)的序列：
Figure BDA0004113265860000511
Fc沉默抗体不产生ADCC活性或产生低ADCC活性，这意味着Fc沉默抗体表现出低于50％特异性细胞裂解的ADCC活性。优选地，抗体基本上缺乏ADCC活性，例如，Fc沉默抗体表现出低于5％或低于1％的ADCC活性(特异性细胞裂解)。Fc沉默抗体还可导致在CD73表达细胞的表面缺乏FcyR介导的CD73的交联。
在一个实施方案中，抗CD73抗体在重链恒定区中具有在选自以下项的残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个残基处的取代：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331和409(重链恒定区中的残基根据Kabat的EU编号进行编号)。在一个实施方案中，抗体包含在残基234、235和322处的取代。在一个实施方案中，抗体包含在残基234、235和331处的取代。在一个实施方案中，抗体包含在残基234、235、237和331处的取代。在一个实施方案中，抗体包含在残基234、235、237、330和331处的取代。在一个实施方案中，Fc结构域是人IgG1亚型的。氨基酸残基根据Kabat的EU编号来指示。
任选地，在本文的任何实施方案中，抗CD73抗体可通过本文所述的抗体、其重链和/或轻链、CDR或可变区中的任一者的功能保守变体来表征。“功能保守变体”是其中蛋白质或抗体中的给定氨基酸残基已被改变，而不改变多肽的总体构象和功能的变体，包括但不限于用具有相似性质(例如，极性、氢键合、电势、酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸置换氨基酸。蛋白质中除了表明为保守的氨基酸之外的氨基酸可有所不同，使得功能相似的任何两种蛋白质之间的蛋白质百分比或氨基酸序列相似性可有所不同，并且可以是例如70％至99％，如根据比对方案(诸如通过聚类方法)确定的，其中相似性基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包括与其所比较的天然或亲本蛋白(例如重链或轻链，或其CDR或可变区)具有至少60％、优选至少75％、更优选至少85％、再优选至少90％、甚至更优选至少95％的氨基酸同一性(如通过BLAST或FASTA算法确定的)，并且具有相同或基本上相似的性质或功能的多肽。在一个实施方案中，抗体包含为抗体11E1、6E1、3C12或8C7的重链可变区的功能保守变体的重链可变区，以及为相应11E1、6E1、3C12或8C7抗体的轻链可变区的功能保守变体的轻链可变区。在一个实施方案中，抗体包含为抗体11E1、6E1、3C12或8C7的与本文公开的人重链恒定区、任选地人IgG4恒定区、任选地修饰的IgG(例如，IgG1)恒定区，例如本文公开的恒定区融合的重链可变区的功能保守变体的重链，以及为相应11E1、6E1、3C12或8C7抗体的与人Cκ轻链恒定区融合的轻链可变区的功能保守变体的轻链。
试剂盒和制剂
任何活性剂(例如，抗CD73抗体、抗HER2抗体或化疗剂)可被指定为包含在组合物(诸如药学上可接受的组合物)和试剂盒中。药学上可接受的组合物通常将包含一种或多种另外的成分，这些成分可以是促进组合物的配制、递送、稳定性或其他特性的活性成分或非活性成分(例如，各种载体)。
在另一个实施方案中，提供了包含治疗有效量的抗CD73的药物制剂，该药物制剂用于治疗患有胃癌(任选地胃腺癌或胃食管结合部腺癌)的受试者，其中该受试者患有HER2阳性的癌症，并且其中该药物制剂与抗HER2抗体以及任选地另外的化疗剂(例如，紫杉醇)组合施用(例如，以与其的组合治疗施用)。在另一个实施方案中，提供了包含治疗有效量的抗HER2抗体的药物制剂，该药物制剂用于治疗患有胃癌(任选地胃腺癌或胃食管结合部腺癌)的受试者，其中该受试者患有HER2阳性癌症，并且其中该药物制剂与抗CD73抗体以及任选地另外的化疗剂(例如，紫杉醇)组合施用(例如，以与其的组合治疗施用)。
如本文所用，术语“药物组合物”或“治疗组合物”是指当适当地施用于受试者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的本公开的至少一种抑制剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指适于实现或增强本公开的一种或多种药剂的递送的一种或多种制剂材料。
在一些实施方案中，本文公开的药剂可与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂一起配制为药物组合物。在某些实施方案中，此类药物组合物适于使用本领域已知的方法通过任何一种或多种施用途径施用于人或非人动物。术语“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种无毒材料。此类制剂可常规地含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体和任选的其他治疗剂。此类药学上可接受的制剂还可含有适于在人体内施用的相容固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。可用于本文所述制剂的其他考虑的载体、赋形剂和/或添加剂包括例如矫味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂诸如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐抗衡离子(诸如钠)等。适用于本文所述制剂的这些和其他已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如，如“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，第21版，Lippincott Williams和Wilkins(2005年)和“Physician′s Desk Reference”，第60版，Medical Economics，Montvale，N.J.(2005年)中所列的。可选择适于期望或要求的给药方式、溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本公开的制剂是基本上不含内毒素和/或相关热原物质的无热原制剂。内毒素包括被限制在微生物内部并且仅当微生物被分解或死亡时才释放的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的诱导发热的热稳定物质(糖蛋白)。如果向人施用，这两种物质都会引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害作用，即使是少量的内毒素也必须从静脉给药的药物溶液中去除。美国食品药品监督管理局(“FDA”)设定了静脉内药物施用的单个一小时时段内每剂量每千克体重5个内毒素单位(EU)的上限(TheUnited States Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum，第26卷(第1期)：第223页(2000年)。在某些实施方案中，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。
当用于体内施用时，本公开的制剂应当是无菌的。本公开的制剂可通过各种灭菌方法灭菌，这些方法包括例如无菌过滤或辐射。可根据如“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，第21版，Lippincott Williams和Wilkins(2005年)中所述的常规药物实践配制注射用无菌组合物。
在一些实施方案中，可配制治疗组合物用于特定的施用途径，诸如口服、经鼻、经肺、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或非肠道施用。如本文所用，术语“非肠道施用”和“不经肠道施用”是指除肠内和局部施用(通常通过注射)之外的施用模方式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。抑制剂和其他活性物质可在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合(参见例如，美国专利号7,378,110、7,258,873和7,135,180；美国专利申请公开号2004/0042972和2004/0042971)。
还提供了试剂盒，例如包括以下物质的试剂盒：
(i)含有抗CD73抗体的药物组合物，
(ii)含有抗CD73、抗HER2以及任选地另外的化疗剂(例如，紫杉烷、紫杉醇)的药物组合物，或
(iii)含有抗CD73抗体的第一药物组合物和含有抗HER2抗体的第二药物组合物以及任选地另外的含有化疗剂(例如，紫杉烷、紫杉醇)的第三药物组合物，或
(iv)含有抗CD73抗体，以及施用该抗CD73抗体与抗HER2抗体以及任选地另外的化疗剂(例如，紫杉烷、紫杉醇)的说明书的药物组合物，或
(v)含有抗HER2抗体，以及施用PD-1中和剂与抗CD73抗体以及任选地另外的化疗剂(例如，紫杉烷、紫杉醇)的说明书的药物组合物。
药物组合物可任选地指定为包含药学上可接受的载体。抗CD73抗体、抗HER2抗体和化疗剂可任选地指定为以适用于本文的任何方法的治疗有效量存在。试剂盒任选还可包括说明书(例如，包含施用日程)，以允许实践者(例如，医生、护士或患者)将其中所含的组合物施用于患有癌症的患者(例如患有HER2阳性的胃腺癌或胃食管结合部腺癌的患者，或患有肿瘤细胞具有低或中水平的HER2表达的胃腺癌或胃食管结合部腺癌的患者，或患有肿瘤细胞具有HER2过表达的胃腺癌或胃食管结合部腺癌的患者)。在任何实施方案中，试剂盒任选地可包括根据本公开的治疗方案施用CD73抗体、抗HER2抗体和任选的化疗剂的说明书。试剂盒还可包括注射器。
任选地，试剂盒包括单剂量药物组合物的多个包装(每个包装含有有效量的抗CD73抗体、抗HER2抗体和任选的化疗剂)，以根据上文提供的方法进行单次施用。试剂盒中还可包括施用药物组合物所必需的仪器或装置。例如，试剂盒可提供含有一定量的抗CD73抗体或抗HER2抗体的一个或多个预填充注射器。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗罹患宫颈癌的人类患者中的癌症或肿瘤的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)一定剂量的抗CD73抗体，该抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO：42中任一项所示的序列的重链可变区的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及具有SEQ ID NO：43所示的序列的轻链可变区的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；和/或
(b)一定剂量的抗HER2抗体，任选地一定剂量的以下抗体，该抗体包含曲妥珠单抗的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域，任选地具有SEQ ID NO：23中所示的序列的重链可变区的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及具有SEQ ID NO：24中所示的序列的轻链可变区的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；和/或
(c)任选地，和一定剂量的化疗剂、任选地一定剂量的紫杉烷、任选地一定剂量的紫杉醇；和/或
(d)任选地，根据本文所述的任何方法使用该抗CD73抗体、该抗HER抗体和/或该化疗剂的说明书。
在一些实施方案中，抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的轻链，抗HER2抗体是曲妥珠单抗或包含具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链，并且化疗剂是紫杉醇。在一些实施方案中，抗CD73抗体以固定剂量(不考虑体重，例如至少900mg、任选地1500mg或至少1500mg、或任选地2400mg或至少2400mg的固定剂量)每两周一次施用。在一些实施方案中，抗CD73抗体以固定剂量(例如2000mg和3000mg之间的固定剂量，例如2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg或3000mg的固定剂量)每三周一次施用。在一些实施方案中，抗HER2抗体以3mg/kg体重-6mg/kg体重、任选地6mg/kg体重-8mg/kg体重(例如，6mg/kg体重或8mg/kg体重)的剂量每三周一次静脉内施用(任选地，其中抗HER2抗体的首次施用是在开始6mg/kg的每3周一次施用之前一周施用8mg/kg的负荷剂量)，并且化疗剂包含以175mg/m2体表面积的固定剂量施用的紫杉醇。在一些实施方案中，抗HER2抗体以4mg/kg的初始剂量静脉内施用，随后以2mg/kg的周剂量静脉内施用。在一些实施方案中，抗HER2抗体以600mg的固定剂量每三周一次皮下施用。
在一个实施方案中，抗CD73抗体和抗HER2抗体(和任选的化疗剂)以以下剂量施用：
(a)(i)900mg-3600mg，任选地1500mg-3600mg，任选地1500mg-2400mg，任选地900mg、1500mg或2400mg的抗CD73抗体，每2周一次，和(ii)3mg/kg体重-6mg/kg体重(例如，5mg/kg体重-6mg/kg体重或6mg/kg体重)的抗HER2抗体，每3周一次，任选地，其中抗HER2抗体的首次施用在(例如，8mg/kg体重的)负荷剂量的抗HER2抗体施用之后一周；
(b)(i)900mg-3600mg，任选地1500mg-3600mg，任选地1500mg-2400mg，任选地900mg、1500mg或2400mg的抗CD73抗体，每2周一次，和(ii)600mg的固定剂量的抗HER2抗体(例如，HerceptinTM SC)，每3周一次皮下施用；
(c)(i)2000mg-3000mg，任选地2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg或3000mg的固定剂量的抗CD73抗体，每三周一次，和(ii)3mg/kg体重-6mg/kg体重(例如，5mg/kg体重-6mg/kg体重或6mg/kg体重)的抗HER2抗体，每3周一次，任选地，其中抗HER2抗体的首次施用在(例如，8mg/kg体重的)负荷剂量的抗HER2抗体施用之后一周；
(d)(i)2000mg-3000mg，任选地2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg或3000mg的固定剂量的抗CD73抗体，每三周一次，和(ii)600mg的固定剂量的抗HER2抗体(例如，HerceptinTM SC)，每3周一次皮下施用；
(e)(i)900mg-3600mg，任选地1500mg-3600mg，任选地1500mg-2400mg，任选地900mg、1500mg或2400mg的抗CD73抗体，每2周一次，(ii)3mg/kg体重-6mg/kg体重(例如，5mg/kg体重-6mg/kg体重或6mg/kg体重)的抗HER2抗体，每3周一次，任选地，其中抗HER2抗体的首次施用在(例如，8mg/kg体重的)负荷剂量的抗HER2抗体施用之后一周，和(iii)175mg/m2体表面积的紫杉醇，每三周一次施用；
(f)(i)1500mg的抗CD73抗体，每2周一次，和(ii)6mg/kg体重的抗HER2抗体，每3周一次，任选地，其中抗HER2抗体的首次施用在(例如，8mg/kg体重的)负荷剂量的抗HER2抗体施用之后一周；
(g)(i)1500mg的抗CD73抗体，每2周一次，(ii)6mg/kg体重的抗HER2抗体，每3周一次，任选地，其中抗HER2抗体的首次施用在(例如，8mg/kg体重的)负荷剂量的抗HER2抗体施用之后一周，和(iii)175mg/m2体表面积的紫杉醇，每三周一次施用；
(h)(i)2400mg的抗CD73抗体，每2周一次，和(ii)6mg/kg体重的抗HER2抗体，每3周一次，任选地，其中抗HER2抗体的首次施用在(例如，8mg/kg体重的)负荷剂量的抗HER2抗体施用之后一周；或
(i)(i)2400mg的抗CD73抗体，每2周一次，(ii)6mg/kg体重的抗HER2抗体，每3周一次，任选地，其中抗HER2抗体的首次施用在(例如，8mg/kg体重的)负荷剂量的抗HER2抗体施用之后一周，和(iii)175mg/m2体表面积的紫杉醇，每三周一次施用。
在不限制本公开的情况下，出于说明的目的，本文描述了本发明的多个实施方案。
实施例
方法
人胃癌样品的免疫染色
在Ventana Benchmark Ultra上进行CD73免疫染色。简言之，将5pm厚的FFPE切片脱蜡，并使用CC1在100℃进行64分钟的抗原修复。然后，将在发现抗体稀释剂中稀释至1g/mL的抗CD73抗体在37℃施加1小时，并使用ULTRAVIEW-RT显示。福尔马林固定的hCD73细胞团在每轮IHC中用作阴性和阳性对照。对肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞进行免疫染色分析，记录表达CD73的细胞的百分比。然后将这些百分比表示为比例评分，如下所示：0＝无阳性细胞；1＝<10％阳性细胞；2＝10％-50％阳性细胞；3＝51％-80％阳性细胞；4＝>80％阳性细胞。
还将肿瘤细胞和基质细胞上的CD73染色的半定量强度记录为0、1+、2+和3+。对于肿瘤细胞上的CD73，还计算了H评分。计算在每个染色强度水平下的细胞百分比，最后使用以下公式指定H评分：[1×(％细胞1+)+2×(％细胞2+)+3×(％细胞3+)]。
最终评分在0至300范围内，得到了给定肿瘤样品中较高强度膜染色的更高相对权重。还记录了作为染色阳性对照的内皮细胞上的CD73表达。
重组huCD73的克隆、制备和纯化
分子生物学
使用以下引物：TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTGTCCCCGAGCCGCGCG(SEQ ID NO：20)(正向)和CCGCCCCGACTCTAGAtcaGTGATGGTGATGATGGTGcttgatccgaccttcaactg(SEQ IDNO：21)(反向)从MIAPACA-2cDNA克隆huCD73蛋白。然后使用InFusion克隆系统将纯化的PCR产物克隆到表达载体中。将6×His标签添加到蛋白质的C末端部分以进行纯化步骤。
克隆的huCD73的氨基酸序列：
Figure BDA0004113265860000581
huCD73蛋白的表达和纯化
在验证克隆的序列后，将细胞进行核转染，然后将制备库进行亚克隆以获得产生huCD73蛋白的细胞克隆。收集在辊中生长的huCD73克隆的上清液，用Ni-NTA柱纯化，用250mM咪唑洗脱。然后将纯化的蛋白质上样到S200尺寸排阻色谱柱上。在用于酶活性测定的Tris 20mM pH7.5、NaCl 120mM和CaCl2 4mM缓冲液中配制对应于二聚体的纯化蛋白，同时向配制缓冲液中补加20％甘油。
评估重组CD73蛋白上的Ab KD的SPR分析
于25℃在BiacoreTM T200设备上进行SPR测量。将Protein-A(GE Healthcare)固定在传感器芯片CM5(GE Healthcare)上。芯片表面用EDC/NHS(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(BiacoreTM，GE Healthcare)活化。将Protein-A在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH5.6)中稀释至10μg/mL，并进样直至达到适当的固定水平(即2000RU)。使用100mM乙醇胺pH8(BiacoreTM，GE Healthcare)对剩余活化基团进行失活。根据制造商推荐的标准捕获-动力学方案(BiacoreTM，GE Healthcare kinetic wizard)进行亲和性研究。将1.23nM至300nM范围内的人重组可溶性CD73蛋白的系列稀释液依次注射到捕获的抗CD73抗体上，并在再生前解离10分钟。使用1∶1动力学结合模型拟合整个传感图集。计算二价亲和力和动力学缔合和解离速率常数。
评估抗体对抗CD73的识别的流式细胞术分析
将重悬于FCSB中105个MDA-MB-231细胞分布在圆底96孔微孔板中(50pL/孔)。将一定剂量范围的抗CD73 mAb加入板中，并将细胞于+5±3℃温育1小时。通过于4℃以400g旋转板3分钟，将细胞用FCSB洗涤三次。将在FCSB中稀释的PE缀合的山羊F(ab′)2抗人IgG(H+L)二级Ab加入细胞中，并将板于+5±3℃再温育30分钟。如上所述将细胞洗涤三次并在流式细胞仪上分析。
将荧光强度的中值相对于mAb浓度作图，并使用GraphPad PrismTM程序计算EC50。
使用重组人或食蟹猴CD73的体外酶测定
简言之，将重组人或食蟹猴CD73在存在一定剂量范围的抗CD73或同种型对照mAb的情况下在白色96孔平底微孔板中温育。将板于+37±1℃温育1小时。向每个孔中加入ATP(12.5μM)和AMP(125μM)，并将板于+37±1℃再温育30分钟。将含有荧光素酶/荧光素的CellTiter-GloTM(Promega)加入孔中，将板于室温避光温育5分钟，并使用EnspireTM设备(Perkin Elmer)测量发射光。
条件：
·ATP+AMP：最大荧光素酶抑制(100％)
·CD73+ATP+AMP：无荧光素酶抑制(0％)
使用GraphPad Prism7TM软件将残余酶活性相对于抗CD73 Ab浓度作图。
T细胞增殖测定
从健康供体获得外周血，并以Ficoll梯度分离单核细胞。淋巴细胞进一步以52％PercollTM梯度富集(细胞团)并用2μM CellTraceTM Violet(赛默飞世尔)染色。将5×104至1×105个染色细胞分布在96孔圆底板中，于37℃与抗CD73 Ab一起温育1小时，并通过加入抗CD3/抗CD28包被的珠子活化3至5天。通过加入200μM AMP实现对T细胞增殖的抑制。通过流式细胞术通过定量增殖T细胞上的染料稀释来评估T细胞增殖和Ab阻断AMP的免疫抑制作用的能力。使用GraphPad PrismTM软件将增殖T细胞的百分比相对于抗CD73 Ab浓度作图。对来自健康供体或癌症患者的全PBMC进行一些实验；方案如上所述，不同的是通过加入0.5mM至1mM ATP实现T细胞抑制。
为了比较供体或患者，使用下式将T细胞增殖归一化：
Figure BDA0004113265860000601
同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)测定
以Ficoll梯度分离来自健康供体的单核细胞，并使用CD14微珠(MiltenyiBiotec)通过免疫磁性选择纯化单核细胞。通过在存在GM-CSF(400ng/mL)和IL-4(20ng/mL)的情况下培养5-7天，使单核细胞分化为树突细胞(MoDC)。在DC回收的当天，通过非CD4+T细胞的免疫磁性耗竭(美天旎生物技术公司)纯化来自同种异体供体的CD4+T细胞，并用CellTraceTM Violet染色。将DC(104个细胞/孔)和T细胞(5×104个细胞/孔)在存在一定剂量范围的抗huCD73 Ab和固定剂量的ATP的情况下在96孔圆底微孔板中混合。如针对T细胞增殖测定所述评估T细胞增殖和Ab逆转ATP介导的抑制的能力。
实施例1：胃癌中的CD73和HER2表达
对于在胃癌队列中的该研究，研究了下列肿瘤样品：共60个来自诊断时的原发性肿瘤的手术样品，其中10个手术样品来自原发性肿瘤，10个手术样品来自首次复发时的相关转移，20个是诊断时的组织活检，20个是新辅助化疗(表柔比星、顺铂和5-FU)后的相应肿瘤的手术样品。
在诊断时(在任何治疗之前)，在83％的患者(n＝50/60)中发现CD73在肿瘤细胞(TC)上表达，其中各患者的表达CD73的肿瘤细胞的百分比为5％至80％不等。肿瘤细胞上的染色主要在细胞的顶端水平(腔部分)极化。95％的患者具有CD73表达基质细胞(SC)，其中CD73表达基质细胞的百分在1％至50％范围内。仅5％的患者具有CD73表达肿瘤内免疫细胞(n＝3/60)，而78％的患者具有CD73表达基质内免疫细胞，其中CD73+的百分比在1％至20％的范围内。
肿瘤细胞上CD73的H评分为0至210不等，其中中值评分为37.5(图1，左图)。
根据Her2状态的CD73表达
根据Her2状态分析肿瘤细胞和基质细胞上的CD73表达。将通过IHC染色评估的Her2评分表示为1+、2+、3+，并通过FISH评估Her2基因的扩增。针对数据分析，并根据病理学家的意见，仅当患者的“用于分析的Her2状态(-/+)”通过IHC记录为3+时，患者才被认为是Her2阳性。
分析表明所有Her2+患者均具有CD73表达肿瘤细胞(图1，右图)。Her2+患者(n＝7)的数量低于Her2-(n＝30)，然而Her2+患者具有显著更高百分比的CD73+肿瘤细胞(图1，右图)。CD73表达基质细胞不随Her2状态而变化。
综上所述，根据Her2状态的患者分层表明所有Her2+患者均具有CD73表达肿瘤，并且Her2+患者具有比Her2-显著更高百分比的CD73+肿瘤细胞。无论Her2状态如何，所有患者均具有CD73+基质细胞。
新辅助化疗前后胃肿瘤中CD73表达的比较
在新辅助化疗(CT)之前来自原发性肿瘤的组织活检和新辅助化疗(表柔比星、顺铂和5-FU)之后的肿瘤切除之间进行了CD73表达比较。
无论在表达CD73的患者的百分比(图2，左图)还是CD73+肿瘤细胞的百分比(图2，右图)方面，新辅助CT均未显著改变CD73表达肿瘤细胞。然而，新辅助CT使具有CD73+基质细胞的患者的百分比从CT前的60％(n＝12/20)增加到CT后的95％(n＝19/20)(图3，左图)。在CT前后，CD73表达基质细胞的百分比无显著差异(图3，右图)。CT使具有CD73+基质免疫细胞的患者的百分比从30％(n＝6/20)增加到70％(n＝14/20)(图4，左图)。对CD73+基质免疫细胞百分比的进一步分析表明，当该百分比最初较高时，CT倾向于降低该百分比，而当该百分比最初为阴性时，CT诱导免疫细胞上的CD73(图4，右图)。
实施例2：人源化抗CD73抗体的设计
如2020年4月20日提交的共同未决的PCT申请号PCT/EP2020/060955(其公开内容以引用方式并入本文)中所述，基于观察到以二聚体内结合模式以在完整全长抗体和CD73二聚体之间的1∶1化学计量比结合CD73的鼠抗体来制备人源化抗CD73抗体。
简言之，通过将来自人亚组IGHV1-3*01的重链框架(FR1、FR2、FR3)以及IGHJ4*01(FR4)引入VH，并将来自人亚组IGKV1-33*01的轻链框架(FR1、FR2、FR3)以及IGKJ2*01(FR4)引入VL来修饰抗体。
对于第一组人源化抗体，设计了四条不同的人源化重链和四条不同的人源化轻链。具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的第一重链变体(H1)具有V2I和T73K取代。具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的第二重链(H2)变体具有取代V2I、T28A、R71V和T73K。具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的第三重链变体(H3)具有取代V2I、T28A、M48I、R66K、V67A、R71V和T73K。具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的第四重链变体(H4)具有取代V2I、T28A、T30A、M48I、R66K、V67A、I69L、R71V和T73K。取代根据Kabat进行编号。
具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的第一轻链变体(L1)具有取代S67Y。具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的第二轻链(L2)变体具有取代S60D和S67Y。具有SEQ IDNO：35所示的氨基酸序列的第三轻链变体(L3)具有取代I2V、S60D和S67Y。具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的第四轻链变体(L4)具有取代I2V、S60D、S67Y和Y87F。取代根据Kabat进行编号。
相应的重链(表1中的“H”链)和轻链(表1中的“L”链)可变区的氨基酸序列如下表1所示。
表1
Figure BDA0004113265860000631
制备具有下表2中所示的重链和轻链组合的抗体。
表2
Figure BDA0004113265860000632
Figure BDA0004113265860000641
出乎意料的是，研究表明流式细胞术滴定与抑制CD73酶活性的效力之间没有直接相关性。有趣的是，虽然H1、H2、H3和H4变体在SPR测定以及CD73表达细胞的流式细胞术中基于对CD73重组蛋白的结合亲和力基本上是不可区分的，但是H2和H3变体在功能测定中在恢复T细胞增殖的能力方面的效力低于H4变体。一种可能性是引入H2和H3框架中的不利于抑制CD73的效力(但对CD73的结合亲和力无不利性)的突变被引入H4变体框架中的突变补偿。因此，设计了在重链框架和/或CDR残基中具有取代的新变体。基于这些观察，在H2、H3和H4链中进行的取代被分类为：被认为对功能至关重要的残基、可能不影响功能的残基、对功能产生负面影响的残基和恢复功能的残基。
设计了一种新的重链变体(被称为“H4+”，具有如下所示的氨基酸序列(SEQ IDNO：37；氨基酸取代加粗，Kabat CDR加下划线))，并将其与L1、L2、L3和L4轻链(分别为SEQID NO：33、34、35和36)组合以生成四种新抗体，即H4+L1、H4+L2、H4+L3和H4+L4。
H4+VH：
Figure BDA0004113265860000642
包含具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代的人IgG1 Fc结构域的全长H4+重链的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0004113265860000643
H4+L1抗体含有包含人Cκ结构域的L1轻链，其全长序列如下所示：
Figure BDA0004113265860000644
为了研究相同的框架取代将如何影响重链和轻链CDR具有差异的抗体，制备了另一系列的四种抗体，这些抗体具有共有重链和四条不同轻链中的一条轻链。命名为“2H4+”的共有重链在HCDR2中的Kabat位置59(Q59)处具有谷氨酰胺(即，L59Q取代，与H4+链相比)，在HCDR2中的Kabat残基60(K60)处具有赖氨酸(即T60K取代，与H4+链相比)，并且在HCDR3中的Kabat位置97(N97)处具有天冬酰胺(即，G97N取代，与H4+链相比)。命名为2L1、2L2、2L3和2L4的四条轻链分别具有与L1、L2、L3和L4链相同的框架残基，但它们的CDR与L1-L4链的不同，不同之处在于在LCDR1中的Kabat位置30处存在苏氨酸(T30)(即S30T取代，与L1-L4链相比)，以及在LCDR2中的Kabat残基53(N53)处存在天冬酰胺(即，T53N取代，与L1-L4链相比)。
所得的四种新抗体命名为2H4+2L1、2H4+2L2、2H4+2L3和2H4+2L4(重链和轻链的组合参见下表4，各条链的氨基酸序列参见下表3)。用命名为2HP和2LP的重链和轻链可变区(参见下表3)制备具有鼠框架中CDR的亲本抗体。
表3
Figure BDA0004113265860000661
表4
mAb参考 VH VL
2H4+L1 2H4+(SEQ ID NO：42) 2L1(SEQ ID NO：43)
2H4+L2 2H4+(SEQ ID NO：42) 2L2(SEQ ID NO：44)
2H4+L3 2H4+(SEQ ID NO：42) 2L3(SEQ ID NO：45)
2H4+L4 2H4+(SEQ ID NO：42) 2L4(SEQ ID NO：46)
2HP2LP 2HP(SEQ ID NO：40) 2LP(SEQ ID NO：41)
所有抗体制备为具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代的人IgG1同种型，以减少Fc受体结合。
包含具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代的人IgG1 Fc结构域的全长2H4+重链的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0004113265860000671
包含人Cκ结构域的抗体的全长2L1轻链的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0004113265860000672
实施例3：在用重组CD73蛋白的体外酶测定中的新变体的研究
将人源化变体与亲本抗体抑制重组CD73蛋白的酶活性的功效进行比较。简言之，当ATP和CTG底物混合时，测量高水平的发光。当向反应混合物中加入AMP时，CTG反应被抑制，导致发光降低。在存在水解AMP的重组人CD73蛋白的情况下，发光水平恢复。
实施例2中制备的所有新的人源化变体均有效地抑制CD73蛋白的活性。
H4+Lx抗体与它们的亲本抗体一样有效。此外，与H4+Lx变体相比，所有2H4+2Lx(2H4+L1、2H4+L2、2H4+L3和2H4+L4)变体均显示CD73抑制的效力增加。2H4+2Lx变体抑制CD73活性的功效与亲本2HP2LP抗体的功效相似。
用不同浓度的CD73蛋白(50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL)进行另一项实验。本实验的目的是研究人源化抗体阻断大量CD73蛋白的活性的能力。同样地，2H4+2Lx变体与亲本2HP2LP抗体一样有效。
实施例4：新变体对食蟹猴CD73蛋白的功效的研究
用2H1 Lx和2H4+2Lx变体对重组rec cyCD73蛋白进行实验。实验条件与对人蛋白的实验相同，不同的是使用的cyCD73蛋白的浓度(400ng/mL)。
人源化变体阻断cyCD73蛋白的酶活性的功效与亲本(嵌合)抗体的功效相同。
实施例5：在T细胞增殖测定中的新变体的研究
测试不同抗体的人源化变体恢复被AMP抑制的T细胞增殖的能力。简言之，从EFS(抗凝剂：柠檬酸盐)获得来自健康供体(HD)的外周血，并以Ficoll梯度分离单核细胞。淋巴细胞以在PBS溶液中制备的52％Percoll梯度进一步富集。将细胞用Cell Trace染料染色。将染色的细胞分布在96孔圆底板中，于+37±1℃与抗huCD73 Ab一起温育1小时，并通过加入抗CD3/抗CD28珠子(珠子与细胞比率＝1∶4)活化3至5天。通过加入AMP(800μM)实现对T细胞增殖的抑制。通过流式细胞术通过定量增殖T细胞上的染料稀释来评估T细胞增殖和Ab阻断AMP的免疫抑制作用的能力。
图5A示出了AMP对T细胞增殖的抑制作用。所有人源化变体均有效地阻断AMP对T细胞增殖的抑制作用(图5B和图5C)。尽管大多数人源化变体在逆转AMP介导的T细胞抑制中通常似乎与它们的嵌合亲本抗体一样有效，但2H4+2Lx变体是所有变体中最有效的，并且出乎意料地，它们甚至比亲本2HP2LP抗体更有效地阻断AMP的抑制作用。
实施例6：在用两个人供体的T细胞增殖测定中的新变体的比较研究
根据先前获得的结果，在另一系列的T细胞增殖实验中进一步表征2H4+2Lx人源化变体。
图6A和图6B分别示出了在使用来自两个健康供体的细胞的T细胞增殖测定中获得的结果。如先前观察到的，2H4+2Lx变体均比亲本2HP2LP更有效地恢复T细胞增殖(图6A和图6B，右图)。在不同的2H4+2Lx变体之间没有观察到明显的差异。因此，同样地，2H4+2Lx变体比亲本2HP2LP抗体更有效地阻断AMP的抑制作用。
综上所述，在T细胞增殖测定中获得的结果表明，具有H4+链框架的人源化变体是最有效的抗体变体，并且2H4+2Lx变体总体上在所有抗体中具有最大的效力。
实施例7：在同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)测定中的新变体的研究
在同种异体MLR中测试2H4+2Lx抗体变体，以确认先前在T细胞增殖测定中获得的结果。简言之，通过Ficoll密度梯度富集来自健康人供体的PBMC，并通过阳性免疫磁性选择(美天旎生物技术公司)纯化单核细胞。通过在存在GM-CSF(400ng/mL)和IL-4(10ng/mL)的情况下培养5-7天，使单核细胞分化为树突细胞(DC)。在DC回收的当天，通过非CD4+T细胞的免疫磁性耗竭(美天旎生物技术公司)纯化来自同种异体供体的CD4+T细胞，并用CellTrace染料染色。将DC和T细胞在存在一定剂量范围的抗huCD73 mAb和固定剂量的100μMATP的情况下在96孔圆底微孔板中混合。然后在共培养6天后评估T细胞增殖和mAb逆转ATP介导的抑制的能力。通过加入100μM的ATP(其被CD39降解为ADP和AMP)抑制T细胞增殖，如图7中针对两个人供体样品所示。
如图7，左图所示，通过加入ATP抑制T细胞增殖。T细胞增殖在存在抗CD73抗体的情况下恢复(中图和右图)。所有2H4+2Lx人源化变体均能够以与亲本2HP2LP抗体相当或比其更好的功效恢复T细胞增殖。在这些情况下，所有2H4+2Lx变体均比亲代2HP2LP更有效地恢复T细胞增殖。这些结果与使用AMP作为抑制剂的T细胞增殖测定中获得的结果一致。
总而言之，在H4+和2H4+可变区中引入的取代以及在L1和2L1链(以及L2、L3、L4、2L2、2L3、2L4链)中引入的取代似乎恢复了(甚至改善了)它们的亲本鼠抗体的重要功能性质，还具有人框架区，因此在人体内具有较低的免疫原性风险。2H4+2Lx抗体是所有抗体中最有效的。
实施例8：抗CD73抗体的人剂量预测
建立PK/PD模型以表征2H4+2L1抗CD73抗体(SEQ ID NO：47的重链和SEQ ID NO：48的轻链)的血清浓度与血液中CD73占有率之间的关系。首先，使用来自食蟹猴的非GLP和GLP毒理学研究的数据建立PK模型以描述抗CD73抗体血清浓度。
使用二室模型对治疗性mAb的药代动力学进行建模(Deng等人，2011年，MAbs，第3卷(第1期)：第61-66页)。基于食蟹猴的临床前PK结果，预期抗CD73抗体在人体内显示类似于其他治疗性mAb的PK性质(化合物特异性靶点介导的药物处置(TMDD)除外)。该TMDD效应可通过在模型中加入另外的非线性消除建模(Wang等人，2016年，Biopharm.Drug Dispos.，第37卷：第51-65页)。开发了具有从中央隔室的平行一阶(线性)和可饱和(非线性，Michaelis-Menten)消除的二室模型，以充分描述在重复IV施用于食蟹猴后所观察到的抗CD73抗体的PK，如图8所示。
在非GLP和GLP毒理学研究中预测的和观察到的抗CD73抗体浓度的叠加如图9所示。图A表示对从非GLP毒理学研究观察到的PK数据的模型拟合；图B示出了对来自GLP毒理学研究的观察到的PK数据的模型拟合；符号表示观察到的数据；实线表示模型预测。
将针对食蟹猴开发的PK模型用于人PK预测。在食蟹猴中进行的两个抗CD73抗体毒理学研究中，发现抗CD73抗体的线性PK参数接近于文献(Deng等人，2011年)中描述的NHP研究中发现的参数，不同的是清除率(CL)更高。因此，将人的IgG1 PK参数用于预测人PK的线性组分(清除率和化合物特异性TMDD除外)。
PD模型的CD73饱和水平根据Km预测，表示EC50(导致50％受体占有率的抗CD73抗体血清浓度)。
相对于每两周一次施用的建议临床剂量的预测的人PK和CD73受体占有率曲线如图10A所示(线从下至上对应于递增剂量)。相对于每三周一次施用的不同剂量的预测的人PK和CD73受体占有率曲线如图10B所示(线从下至上对应于递增剂量)。
预测100mg的起始剂量具有32.5μg/mL的Cmax，其低于42.3μg/mL的EC90(90％的目标饱和度)，通过来自PK模型的Michaelis Menten常数Km估算。在该100mg的起始剂量下，预测在Cmax时具有约90％的CD73占有率，在下一次给药前恢复至0。
此外，在100mg(每2周一次)的起始剂量下，预测抗CD73抗体浓度在下一次给药前恢复至低于50ng/mL。在人血清(IC50＝12.3ng/mL)、A375肿瘤细胞(IC50＝34ng/mL)、MDA-MB231肿瘤细胞(IC50＝126.8ng/mL)和对AMP抑制的CD4+和CD8+T细胞上T细胞增殖的恢复(IC50分别为8.1ng/mL和7.7ng/mL)的体外测定中，该浓度介导低于100％的酶抑制。该浓度也类似于或低于抗CD73抗体结合CD73+肿瘤细胞的EC50值和抗CD73抗体对重组可溶性人CD73的亲和力。这进一步表明起始剂量将导致在下一次给药前CD73丧失完全饱和。
当每两周一次施用时，预计前三个递增剂量100mg、300mg和900mg导致在下一次给药前CD73占有率低于80％，在下一次给药前抗CD73抗体浓度低于EC90。当每两周一次施用时，预计两个最高剂量水平1500mg和2400mg在整个治疗期间将CD73占有率维持在90％以上。
实施例9：抗CD73与用曲妥珠单抗的化疗组合治疗晚期实体瘤患者的I期首次人体 研究
2H4+2L1抗CD73抗体(IPH5301)是人源化IgG1拮抗剂单克隆抗体，具有功能沉默的Fc结构域。它特异性结合CD73，并被设计成通过抑制肿瘤微环境中细胞上表达的CD73的酶活性来增强抗肿瘤免疫应答。与目前正在进行临床试验的其他靶向CD73的药剂相比，临床前模型已显示出分化和优越的体外活性。这是研究IPH5301的首次人体临床试验。
主要目的是评价IPH5301与用或不用曲妥珠单抗的化疗组合治疗所选晚期实体瘤患者的安全性和最大耐受剂量(MTD)/临床II期推荐剂量(RP2D)。次要目的包括评估IPH5301与用或不用曲妥珠单抗的化疗组合的初步临床活性。
该研究将纳入患有无法治愈的晚期和/或转移性癌症、符合紫杉醇和曲妥珠单抗治疗(队列2)的条件、对先前全身治疗的数量没有限制的患者。将纳入患有HER2阳性乳腺癌或胃癌的患者。入组资格基于如局部测定的HER2+过表达(通过免疫组织化学测定为+3或通过FISH测定为阳性)。允许在晚期情况下使用紫杉醇、卡铂和/或曲妥珠单抗的先前治疗，除非患者在先前治疗的前3个月内出现疾病进展。
IPH5301的五个递增剂量水平将如下评估：(100mg、300mg、900mg、1 500mg和2400mg)。所有患者将在第1天(第1周)接受单独的IPH5301。在第15天(第3周开始)，将化疗和曲妥珠单抗如下加入到IPH5301中：
-紫杉醇(175mg/m2，3小时输注)，每3周一次，以及
-曲妥珠单抗(8mg/kg体重负荷剂量，90分钟输注，然后6mg/kg，每3周一次，30分钟)。
无论受试剂量如何，IPH5301将在1小时内以静脉注射的方式施用，随后是曲妥珠单抗，然后是化学疗法。化疗(与曲妥珠单抗组合)最多给予6个周期。在此期间，无论剂量水平如何，IPH5301将每两周一次施用。在6个周期结束时未显示疾病进展证据的患者可继续接受针对HER2阳性队列的IPH5301和曲妥珠单抗(两者均每3周一次施用)，只要患者获得临床益处即可。
序列表
<110> 先天制药公司
<120> 使用抗CD73抗体的癌症治疗方法
<130> CD73-9 PCT
<150> US 63/065,085
<151> 2020-08-13
<160> 60
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu
20 25 30
His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu
50 55 60
Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr
85 90 95
Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala
100 105 110
Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile
115 120 125
Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr
165 170 175
Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val
180 185 190
Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys
195 200 205
Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu
210 215 220
Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val
225 230 235 240
Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys
245 250 255
Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly
260 265 270
Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly
275 280 285
Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His
290 295 300
Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile
305 310 315 320
Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr
325 330 335
Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met
355 360 365
Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val
370 375 380
Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro
405 410 415
Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys
420 425 430
Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys
450 455 460
Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg
465 470 475 480
Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile
485 490 495
Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys
500 505 510
Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val
515 520 525
Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly
530 535 540
Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu
545 550 555 560
Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln
565 570
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 2
Ser Tyr Asn Met Tyr
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X = Gln或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X = Lys或Thr
<400> 3
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Xaa Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = Asp或Gly
<400> 4
Gly Tyr Xaa Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X = Thr或Ser
<400> 5
Lys Ala Ser Gln Ser Val Xaa Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X = Thr或Asn
<400> 6
Tyr Ala Ser Xaa Arg Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 7
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 8
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 9
Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 10
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 11
Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 12
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 13
Gly Tyr Asn Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 14
Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 15
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 16
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 16
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 17
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 19
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 20
tacgactcac aagcttgccg ccaccatgtg tccccgagcc gcgcg 45
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 21
ccgccccgac tctagatcag tgatggtgat gatggtgctt gatccgacct tcaactg 57
<210> 22
<211> 553
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu
20 25 30
His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu
50 55 60
Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr
85 90 95
Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala
100 105 110
Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile
115 120 125
Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr
165 170 175
Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val
180 185 190
Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys
195 200 205
Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu
210 215 220
Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val
225 230 235 240
Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys
245 250 255
Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly
260 265 270
Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly
275 280 285
Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His
290 295 300
Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile
305 310 315 320
Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr
325 330 335
Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met
355 360 365
Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val
370 375 380
Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro
405 410 415
Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys
420 425 430
Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys
450 455 460
Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg
465 470 475 480
Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile
485 490 495
Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys
500 505 510
Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val
515 520 525
Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly
530 535 540
Arg Ile Lys His His His His His His
545 550
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Val Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 28
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 29
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 30
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 31
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 32
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Met Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Asp Phe Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Ala Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 59
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Asn Gly Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Asp Ala Tyr Tyr Glu Ala Leu Asp Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 60
Glu Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Pro Trp Ile Ser
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (42)

1.一种治疗个体中的HER2阳性胃腺癌或胃食管结合部腺癌的方法，所述方法包括向所述个体施用结合人CD73蛋白并中和其5′-胞外核苷酸酶活性的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合人CD73蛋白的抗体用于与结合人HER2蛋白的抗体的组合治疗中。
3.一种治疗个体中的胃腺癌或胃食管结合部腺癌的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的以下中的每一者：结合人CD73蛋白并中和其5′-胞外核苷酸酶活性的抗体和结合人HER2蛋白的抗体。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合人CD73蛋白的抗体用于与化疗剂的组合治疗中。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括施用：(i)所述结合人CD73蛋白的抗体，每两周一次或每三周一次，(ii)所述结合人HER2蛋白的抗体，每周一次或每3周一次。
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括施用：(i)所述结合人CD73蛋白的抗体，每两周一次或每三周一次，(ii)所述结合人HER2蛋白的抗体，每三周一次，和(iii)紫杉醇，每3周一次。
7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中负荷剂量的结合人HER2蛋白抗体的抗体在结合人HER2蛋白的抗体的首次每三周一次施用之前一周施用。
8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体患有通过在表面处表达HER2的肿瘤细胞来表征的癌症。
9.一种治疗对有需要的个体中的HER2阳性癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的以下中的每一者：(i)结合人CD73蛋白并中和其5′-胞外核苷酸酶活性的抗体和(ii)结合人HER2蛋白的抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述HER2阳性癌症是胃腺癌或胃食管结合部腺癌。
11.根据权利要求8或9所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的化疗剂，任选地，其中所述化疗剂是紫杉烷，任选地紫杉醇。
12.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症，所述癌症是如通过IHC或FISH确定的HER2阳性癌症。
13.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括施用：
(i)结合人CD73蛋白的抗体，每两周一次或每三周一次，(ii)结合人HER2蛋白的抗体，每周一次或每3周一次。
14.根据权利要求9-1 3中任一项所述的方法，其中所述治疗包括施用：
(i)结合人CD73蛋白的抗体，每两周一次或每三周一次，(ii)结合人HER2蛋白的抗体，每3周一次，和(iii)化疗剂，任选地，其中所述化疗剂是紫杉烷，任选地紫杉醇。
15.根据上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括多次施用结合人CD73蛋白的抗体，以及多次施用结合人HER2蛋白的抗体，其中所述多次施用结合人HER2蛋白的抗体中的每次施用在抗CD73抗体施用之后发生。
16.根据上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括多次施用结合人CD73蛋白的抗体，以及多次施用化疗剂，其中所述多次施用化疗剂中的每次施用在抗CD73抗体施用之后发生。
17.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多次施用结合人HER2蛋白的抗体中的每次施用在结合人CD73蛋白的抗体施用之后一小时和约一周之间发生。
18.根据上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括多次施用结合人CD73蛋白的抗体，以及多次施用结合人HER2蛋白的抗体，其中所述多次施用结合人HER2蛋白的抗体中的每次施用在结合人CD73蛋白的抗体施用的同一天或在结合人CD73蛋白的抗体施用之后7天发生。
19.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多次施用化疗剂中的每次施用在结合人CD73蛋白的抗体之后一小时和约一周之间发生.。
20.根据上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括多次施用结合人CD73蛋白的抗体，以及多次施用化疗剂，其中所述多次施用化疗剂中的每次施用在结合人CD73蛋白的抗体施用的同一天或在结合人CD73蛋白的抗体施用之后7天发生。
21.一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用结合人CD73蛋白并中和其5′-胞外核苷酸酶活性的抗体，其中所述抗体是包含具有SEQ ID NO：43、44、45或46中任一项的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区的抗体或抗体片段，其中所述抗体(a)以1500mg-3000mg的固定剂量(不考虑体重或表面积)，任选地以1500mg的剂量，任选地以2400mg的剂量每2周一次或(b)以2000mg-3000mg的固定剂量，任选地以2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg或3000mg的剂量每3周一次施用于所述个体。
22.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括多次施用结合人HER2蛋白的抗体，多次施用化疗剂，以及多次施用结合人CD73蛋白的抗体，其中抗HER2抗体的每次施用在结合人CD73蛋白的抗体施用之后1小时至7天，并且任选地进一步，其中化疗剂的每次施用在结合人CD73蛋白的抗体施用之后1小时至7天。
23.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括向所述个体施用：
(i)结合人CD73蛋白的抗体，所述抗体(a)以1500mg-3000mg的剂量每2周一次或(b)以2000mg-3000mg的剂量每三周一次施用，和
(ii)结合人HER2蛋白的抗体，所述抗体以3mg/kg体重-6mg/kg体重的剂量通过静脉内施用或以600mg的剂量通过皮下施用每3周一次施用，和任选地
(iii)紫杉醇，所述紫杉醇以175mg/m2体表面积的剂量每3周一次施用。
24.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括向所述个体施用：
(i)结合人CD73蛋白的抗体，所述抗体(a)以1500mg-3000mg的剂量每2周一次或(b)以2000mg-3000mg的剂量每三周一次施用，和
(ii)结合人HER2蛋白的抗体，所述抗体以8mg/kg的负荷剂量施用，随后在一周后以6mg/kg体重的治疗剂量每3周一次施用；和任选地，
(iii)紫杉醇，所述紫杉醇以175mg/m2体表面积的剂量每3周一次施用。
25.一种治疗个体中的HER2阳性癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用：
(i)结合人CD73蛋白的抗体，(a)以1500mg-3000mg的剂量每2周一次或(b)以2000mg-3000mg的剂量每三周一次施用，和
(ii)结合人HER2蛋白的抗体，以3mg/kg体重-6mg/kg体重的剂量通过静脉内施用或以600mg的剂量通过皮下施用每3周一次施用，和任选地
(iii)紫杉醇，所述紫杉醇以175mg/m2体表面积的剂量每3周一次施用。
26.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中负荷剂量的抗HER2抗体在抗HER2抗体的首次每3周一次施用之前一周施用。
27.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中(例如，负荷剂量的)结合人HER2蛋白的抗体的首次施用和紫杉醇的首次施用在结合人CD73蛋白的抗体首次给药之后两周发生。
28.一种治疗个体中的HER2阳性癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用：
(i)结合人CD73蛋白并中和其5′-胞外核苷酸酶活性的抗体，(a)以1500mg-3000mg的剂量每2周一次或(b)以2000mg-3000mg的剂量每三周一次施用，和
(ii)结合人HER2蛋白的抗体，所述抗体以8mg/kg的负荷剂量施用，随后在一周后以6mg/kg体重的治疗剂量每3周一次施用；和任选地，
(iii)紫杉醇，所述紫杉醇以175mg/m2体表面积的剂量每3周一次施用。
29.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括向所述个体施用：
(i)结合人CD73蛋白的抗体，(a)以1500mg或2400mg的剂量每2周一次或(b)以2000mg-3000mg的剂量每三周一次施用，和
(ii)结合人HER2蛋白的抗体，以3mg/kg体重-6mg/kg体重的剂量每3周一次施用，和任选地
(iii)紫杉醇，以175mg/m2体表面积的剂量每3周一次施用。
30.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括向所述个体施用：
(i)结合人CD73蛋白的抗体，(a)以1500mg或2400mg的剂量每2周一次或(b)以2000mg-3000mg的剂量每三周一次施用，和
(ii)结合人HER2蛋白的抗体，以8mg/kg的负荷剂量施用，随后在一周后以6mg/kg体重的治疗剂量每3周一次施用；和任选地，
(iii)紫杉醇，以175mg/m2体表面积的剂量每3周一次施用。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中(例如，负荷剂量的)结合人HER2蛋白的抗体的首次施用和紫杉醇的首次施用在结合人CD73蛋白的抗体首次给药之后两周发生。
32.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合人CD73蛋白的抗体、结合人HER2蛋白的抗体和/或化疗剂是静脉内施用的。
33.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合人CD73蛋白的抗体和所述结合人HER2蛋白的抗体被配制用于单独施用。
34.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HER2阳性癌症是乳腺癌、胃腺癌或胃食管结合部腺癌。
35.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体已接受使用化疗剂的先前疗程。
36.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体已接受使用结合人HER2蛋白的抗体的先前疗程。
37.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中在相对于所述结合人CD73蛋白的抗体与包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型CD73多肽之间的结合的每种情况下，所述抗体与包含突变A99S、E129A、K133A、E134N、A135S和K136A(参考SEQ ID NO：1)的突变CD73多肽的结合降低。
38.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合人CD73蛋白的抗体是包含具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区的抗体或抗体片段，或其功能保守变体。
39.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合人HER2蛋白的抗体是包含具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区的抗体或抗体片段。
40.一种治疗晚期胃腺癌或胃食管结合部腺癌的方法，所述方法包括向对有需要的患者同时、单独或依次施用有效量的结合人HER2蛋白的抗体与有效量的结合人CD73蛋白的抗体的组合，所述结合人HER2蛋白的抗体包含具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区，所述结合人CD73蛋白的抗体包含具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区。
41.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合人HER2蛋白的抗体包含具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链。
42.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合人CD73蛋白的抗体包含具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链。
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