UA126571C2 - Антитіло до cd73 та його застосування - Google Patents

Антитіло до cd73 та його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA126571C2
UA126571C2 UAA201906244A UAA201906244A UA126571C2 UA 126571 C2 UA126571 C2 UA 126571C2 UA A201906244 A UAA201906244 A UA A201906244A UA A201906244 A UAA201906244 A UA A201906244A UA 126571 C2 UA126571 C2 UA 126571C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
zeg
tug
rgo
cancer
Prior art date
Application number
UAA201906244A
Other languages
English (en)
Inventor
Чженї Ван
Чженйи Ван
Лей Фан
Бінши Ґо
Бинши Го
Цзіну Цзан
Цзину Цзан
Original Assignee
Ай-Маб Байофарма Юес Лімітед
Ай-Маб Байофарма Юес Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ай-Маб Байофарма Юес Лімітед, Ай-Маб Байофарма Юес Лимитед filed Critical Ай-Маб Байофарма Юес Лімітед
Publication of UA126571C2 publication Critical patent/UA126571C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0031—Rectum, anus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла або його фрагмента, що специфічно зв’язується з CD73. Також заявлений винахід стосується способу застосування зазначеного антитіла або його фрагмента для лікування та діагностики раку.

Description

сОр7З (кластер диференціювання 73), також відомий як 5'--чуклеотидаза (5'-МТ) або екто-5'- нуклеотидаза, являє собою фермент, що перетворює АМФ у аденозин. СО73 каталізує утворення позаклітинного аденозину, що робить внесок у формування імуносупресивного оточення пухлини. СЮО7З надекспресується у клітинах строми та пухлинних клітинах різного типу, а також у клітинах Тгед, М2 Мф та супресорних клітинах мієлоїдного походження (МО5С).
Доклінічні дані показують, що інгібування СО7З3 запобігає аденозин-опосередкованій супресії лімфоцитів, збільшує активність СОв8-- ефекторних клітин та знижує активність як МОСС, так і
Тгед. У цей час розробляються декілька антитіл проти СО73З у якості потенційних протиракових агентів, однак жодне з них не схвалене для клінічного застосування.
Даний винахід забезпечує антитіло проти СО7З3, що має високу афінність зв'язування з більками СО7З3 людини та високу активність стосовно інгібування ферментативної активності
СО7З3 самого по собі або на клітині. Крім того, зв'язування цих антитіл може індукувати інтерналізацію СО7З пухлинними клітинами, що приводить до подальшого зниження активності
СО7З3 на поверхні клітини. Крім того, неочікувано, одновалентні одиниці, наприклад, Еар- фрагменти цих антитіл мають активність, порівнянну з активністю цілих антитіл. У той же час відомі антитіла проти СО73, наприклад, МЕОБІ-9447, розроблене Медіттипе, не мають таких характеристик. Аналогічно, на відміну від МЕ0І-9447 та 11Е11, для проявлення інгібуючого ефекту яких потрібна висока щільність експресії СЮО7З на поверхні клітин, антитіла згідно із даним винаходом можуть досягати повного інгібування СО7З при різних рівнях експресії на поверхні клітини. Вважається, що ці несподівані властивості антитіл згідно із даним винаходом щонайменше частково обумовлені іншим сайтом зв'язування з білюм СО73. На відміну від
МЕБ0І-9447 та 1111, що зв'язують М-кінцеві домени білюу СЮО7З, антитіла згідно із даним винаходом зв'язуються з С-кінцевими доменами та, конкретніше, з амінокислотними залишками
У345, 00399, Е400, 401 та К480. Властивості антитіл згідно із даним винаходом роблять їх чудовими кандидатами для терапевтичних та діагностичних варіантів застосування.
Таким чином, відповідно до одного варіанту реалізації даного винаходу запропоноване виділене антитіло або фрагмент антитіла, що мають специфічність по відношенню до білку
СОр7З людини та що зв'язуються з одним або більше амінокислотних залишків, вибраних у С- кінцевій області білью»у СЮО7З людини. С-кінцева частина білку СО7З людини, як відомо у даній галузі техніки, містить 238 амінокислотних залишків, починаючи із залишку 337, як показано у
ЗЕО ІЮО МО: 61.
У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з одним або більше із
С-кінцевих доменів білю»у СЮО7З людини. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з одним або більше з амінокислотних залишків, вибраних із групи, що складається з У345, 0399, Е400, 401 та МК480 білюу СО7З людини. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується щонайменше двома із зазначених амінокислотних залишків.
У одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване антитіло проти СО7З або його фрагмент, який містить СОКІ МН відповідно до БЕО ІЮ МО: 1, СОК2 МН відповідно до 5ЕО ІЮ
МО: 2, СОКЗ МН відповідно до 5ЕО І МО: 3, СОКІ1 Мі відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 4, СОК2 МІ. відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 5 та СОМЗ МІ відповідно до 5ЗЕО ІО МО: 6. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент може додатково містити константну область важкого ланцюгу, константну область легкого ланцюгу, Есо-область або їх комбінацію. У деяких варіантах реалізації константна область легкого ланцюгу може являти собою константну область каппа- або лямбда-ланцюгу. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент відноситься до ізотипу Ід, ДМ, ІдА, ІДЕ або Ідо, або, конкретніше, Іде, дог, доз або Ідсаі.
У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент являє собою химерне антитіло, гуманізоване антитіло або повністю людське антитіло. У одному варіанті реалізації антитіло або його фрагмент являє собою гуманізоване антитіло.
У деяких варіантах реалізації гуманізоване антитіло або антитіло людини або їх фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюгу, яка містить один або більше амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з: (а) Тиг у положенні 30, (Б) Гу у положенні 44, (с)
Меї у положенні 48, (4) Пе у положенні 67 та (є) Агд у положенні 71 відповідно до нумерації
Кабаї та їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації гуманізоване антитіло або антитіло людини або їх фрагмент містить варіабельну область легкого ланцюгу, яка містить один або більше амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з: (а) Зег у положенні 5, (Б) Рго у положенні 46, (с) Тгр у положенні 47, (4) Зег у положенні 70 та (І) Туг у положенні 71 відповідно до нумерації Кабаї та їх комбінацій.
Приклади антитіл проти СО7З3 або їх фрагментів включають антитіла або фрагменти 60 антитіл, які містять варіабельну область важкого ланцюгу, яка містить одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 7 та 9-13, або пептид, який має щонайменше 9095 ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 7 та 9-13. У деяких варіантах реалізації варіабельна область важкого ланцюгу містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7 або 9. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент містить варіабельну область легкого ланцюгу, яка містить одну або більше амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, яка складається з ЗЕБЕО ІЮО МО: 8, 15-20 та 22-24, або пептид, який має щонайменше 9095 ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 8, 15-20 та 22- 24. У деяких варіантах реалізації варіабельна область легкого ланцюгу містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8.
Як показано у експериментальному прикладі 7, ділянки СОК можуть містити додавання, делецію або заміну деяких амінокислот із збереженням або навіть покращенням властивостей антитіла проти СО73. Відповідно, у деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло або фрагмент антитіла, причому зазначене антитіло або фрагмент антитіла має специфічність до білю»у СО7З людини та містить: (аа СОКІ МН (ділянка СОКІ варіабельної області важкого ланцюгу) відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1 або варіанту ЗЕО ІЮО МО: 1, що містить одиночну заміну, делецію або інсерцію по положенню 1, 2 або З у 5ЕО ІЮ МО: 1; (в) СОК2 МН відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 2 або варіанту ЗЕО ІЮ МО: 1, що містить одиночну заміну, делецію або інсерцію по положенню 6, 7 або 8 у БЕО ІЮ МО: 2; (с) СОКЗ МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: З або варіанту БЕО ІЮ МО: 3, що містить одиночну заміну, делецію або інсерцію по положенню 7 або 8 у ЗЕО ІЮ МО: 3; (4) СОКІ МІ. відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 4 або варіанту БЕО ІЮ МО: 4, що містить одиночну заміну, делецію або інсерцію по положенню З або 4 у 5ЕО ІЮО МО: 4; (є) СОНК2
МІ. відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 5 та () СОКЗ Мі. відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 6 або варіанту ЗЕО ІЮ
МО: 6, що містить одиночну заміну, делецію або інсерцію по положенню 1, 2, З або 4 у 5БЕО ІЮ
МО: 6.
У деяких варіантах реалізації запропоноване виділене антитіло або його фрагмент, причому зазначене антитіло або фрагмент антитіла має специфічність по відношенню до білку СО7З3 людини та містить: (4) СОКІ МН відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 1 або варіанту ЗЕО ІО МО: 1, що містить одиночну заміну по положенню 1, 2 або З у БЕО ІЮ МО: 1; (5) СОК2 МН відповідно до
Зо ЗЕО ІЮО МО: 2 або варіанту 5БЕО ІО МО: 1, що містить одиночну заміну по положенню 6, 7 або 8 у
ЗЕО ІЮ МО: 2; (с) СОКЗ МН відповідно до 5ЕО ІЮО МО: З або варіанту ЗЕО ІЮО МО: 3, що містить одиночну заміну по положенню 7 або 8 у БЕО ІЮ МО: 3; (4) СОК!І Мі. відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 4 або варіанту БЕО ІЮ МО: 4, що містить одиночну заміну по положенню З або 4 у 5ЕО ІЮ МО: 4; (є) СОК2 Мі. відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 5 та (І) СОКЗ МІ. відповідно до 5ЕО ІО МО: 6 або варіанту
ЗЕО ІЮ МО: 6, що містить одиночну заміну по положенню 1, 2, З або 4 у БЕО ІО МО: 6.
У деяких варіантах реалізації варіант ЗЕО ІЮО МО: 1 вибраний з групи, яка складається з БЕО
І МО: 26-29. У деяких варіантах реалізації варіант 5ЕО ІЮО МО: 2 вибраний з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 30-36. У деяких варіантах реалізації варіант ЗЕО ІО МО: З вибраний з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 37-41. У деяких варіантах реалізації варіант БЕО ІЮ МО: 4 вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 42-45. У деяких варіантах реалізації варіант
ЗЕО ІЮО МО: 6 вибраний з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 46-56.
Крім того, у деяких варіантах реалізації запропонована композиція, яка містить антитіло або фрагмент антитіла відповідно до даного винаходу та фармацевтично прийнятний носій. Крім того, запропонована виділена клітина, яка містить один або більше полінуклеотидів, які кодують антитіло або його фрагмент відповідно до даного винаходу.
У ще одному варіанті реалізації даного винаходу запропонований спосіб лікування раку у пацієнта, який цього потребує, який включає введення пацієнту антитіла або його фрагменту відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах реалізації рак вибраний з групи, яка складається з раку сечового міхура, раку молочної залози, раку ободової та прямої кишки, раку ендометрію, раку стравоходу, раку голови та шиї, раку нирок, лейкозу, раку печінки, раку легень, лімфоми, меланоми, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози та раку щитоподібної залози. У деяких варіантах реалізації рак являє собою солідну пухлину.
У деяких варіантах реалізації спосіб додатково включає введення пацієнту другого агенту для лікування раку. У деяких варіантах реалізації другий агент для лікування раку являє собою інгібітор ключового компоненту (контрольної точки) імунної відповіді. У деяких варіантах реалізації зазначений інгібітор інгібує експресію або активність білку-1 запрограмованої загибелі клітин (РО-1), ліганду-1 білку запрограмованої загибелі клітин (РО-І 1), білку-4, асоційованого з цитотоксичними Т-лімфоцитами (СТІ А-4), білку-3 активації лімфоцитів (ГАС-3) або їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації інгібітор являє собою антитіло проти РО-1 або проти бо РО-Ї1. У деяких варіантах реалізації інгібітор вибирають з групи, яка складається з пембролізумабу, ніволумабу, 943, КМР 1-14, атезолізумабу, іпілімумабу та їх комбінацій.
У одному варіанті реалізації запропонований спосіб лікування раку у пацієнта, який цього потребує, який включає: (а) обробку Т-клітини іп міо антитілом або його фрагментом відповідно до даного винаходу; та (Б) введення обробленої Т-клітини пацієнту. У деяких варіантах реалізації спосіб, крім того, включає виділення Т-клітини з організму індивіду перед етапом (а).
У деяких варіантах реалізації Т-клітину виділяють з організму пацієнта. У деяких варіантах реалізації Т-клітину виділяють з організму індивіда-донора, що не є пацієнтом. У деяких варіантах реалізації Т-клітина є Т-лімфоцитом, який інфільтрує пухлину, СО4-- Т-клітиною, СО8ч-
Т-клітиною або їх комбінацією.
Крім того, у ще одному варіанті реалізації запропонований спосіб детектування експресії
СО73 у зразку, який включає здійснення контакту зразку з антитілом або його фрагментом відповідно до даного винаходу в умовах зв'язування антитіла або його фрагменту з СО7З та детектування зв'язування, що означає експресію СО7З у зразку. Крім того, у одному варіанті реалізації запропонований спосіб виявлення пацієнта з раком, що підходить для лікування із застосуванням терапевтичного засобу на основі антитіла проти СЮО7З3, який включає виділення клітини з організму пацієнта з раком та детектування присутності біль»л- СО7З3 за допомогою антитіла або його фрагменту відповідно до даного винаходу.
На фіг. 1 показане зв'язування антитіла 101-Ми з рекомбінантним білком СО7З людини.
На фіг. 2 показане зв'язування антитіла 101-Ми з рекомбінантним білююм СО73 людини на поверхні клітини раку яєчників людини.
На фіг. З показана кінетика зв'язування антитіла 101-Ми з рекомбінантним білком СО73.
На фіг. 4 показано, що антитіло 101-Ми інгібує ферментативну активність СЮО73.
На фіг. 5 показано, що антитіло 101-Ми інгібує ферментативну активність СЮО7З на поверхні клітини.
На фіг. 6 показано, що 101-Ми купірує АМФ-опосередковану супресію СО4-- Т-клітин, на що вказує вироблення ІФН-у.
На фіг. 7 показана кінетика зв'язування гуманізованих антитіл.
На фіг. 8 показано, що гуманізовані антитіла зв'язуються з білками СО7З поверхні клітин.
На фіг. 9 показано, що гуманізовані антитіла інгібували ферментативну активність білків
СО73.
На фіг. 10 показано, що гуманізовані антитіла інгібували ферментативну активність білків
СОр7З поверхні клітин.
На фіг. 11 показано, що гуманізовані антитіла купірують АМФ-опосередковану супресію бра Т-клітин, на що вказує вироблення ІФН-у.
На фіг. 12 показано ефективне зв'язування Ни101-28 з розчинним СО7З та СО7З поверхні клітин.
На фіг. 13 показано, що зв'язування Ни101-28 з СО7З3 ефективно блокує ферментативну активність СЮО7 3.
На фіг. 14 показано, що Ни101-28 неконкурентно інгібує активність СО73.
На фіг. 15 показано, що зв'язування Ни101-28 з СО73З індукує інтерналізацію СО73.
На фіг. 16 показано, що Ни101-28 купірує АМФ-опосередковану супресію Т-клітинної відповіді.
На фіг. 17 показано, що Ни101-28 купірує супресію Т-клітинної відповіді, опосередковану
СОр73: пухлинними клітинами.
На фіг. 18 представлені зображення зафарбовування, на яких показане інгібування ферменту СО73З іп мімо Ни101-28 у пухлинах у моделі ксенотрансплантату АЗ75.
На фіг. 19 показано, що Ни101-28 демонструвало ефективність як монотерапія у моделі ксенотрансплантату пухлини.
На фіг. 20 показано, що Ни101-28 синергічно діє з антитілом проти РО-11 при інгібуванні росту пухлини.
На фіг. 21 показано зв'язування та інгібування активності СО7З3 яванського макака Ни101-28.
На фіг. 22 показано, що Ни101-28 не конкурує з МЕ0ОІ-9447 за зв'язування з СО73.
На фіг. 23 приведений список амінокислотних залишків СО73, які взаємодіють з Ни101-28.
На фіг. 24 проілюстровані епітопи Ни101-28 та МЕОІ-9447.
На фіг. 25 показана більш висока активність Ни101-28 у порівнянні з МЕОІ-9447.
На фіг. 26 показано, що Ни101-28 ефективно інгібував СО73 на клітинах з різними рівнями експресії СО73.
Визначення
Слід зазначити, що форми однини, що відносяться до одного або більше об'єктів, 60 наприклад, "антитіла", являють собою одне або більше антитіл. Фактично, форми однини, а також терміни "один або більше" та " щонайменше, один" можна використовувати тут взаємозамінно.
Мається на увазі, що у даному документі термін «поліпептид» охоплює як форму однини «поліпептид», так і форму множини «поліпептиди» та відноситься до молекули, що складається з мономерів (амінокислот), лінійно зв'язаних амідними зв'язками (також відомими як пептидні зв'язки). Термін «поліпептид» відноситься до будь-якого ланцюга або ланцюгів із двох або більше амінокислот та не відноситься до продукту конкретної довжини. Таким чином, визначення «поліпептиду» включає пептиди, дипептиди, олігопептиди, «білок», «ланцюг амінокислот» або будь-який інший термін, використовуваний по відношенню до ланцюга або ланцюгів із двох або більше амінокислот, та термін «поліпептид» можна використовувати замість будь-якого із цих термінів або на рівних підставах з ними. Крім того, мається на увазі, що термін «поліпептид» відноситься до продуктів післяекспресійної модифікації поліпептиду, включаючи, без обмежень, глікозилювання, ацетилування, фосфорилювання, амідування, модифікацію відомими захисними/Олокувальними групами, протеолітичне розщеплення або модифікацію амінокислотами, що не зустрічаються у природі. Поліпептид може бути виділений із природного біологічного джерела або може продукуватися із застосуванням рекомбінантної технології однак він не обов'язково трансльований зі спеціалізованої нуклеотидної послідовності. Він може бути отриманий за будь-яким способом, у тому числі за допомогою хімічного синтезу.
У даному документі термін «виділений» використовується по відношенню до клітин, нуклеїнових кислот, наприклад, ДНК або РНК, відноситься до молекул, відділених від інших ДНК або РНК, відповідно, присутніх у природньому джерелі зазначеної макромолекули. Термін «виділений» у даному документі також відноситься до нуклеїнової кислоти або пептиду, що у значній мірі не містить клітинного матеріалу, вірусного матеріалу або культурального середовища при продукції з використанням технології рекомбінантних ДНК, або хімічних попередників або інших хімічних речовин при хімічному синтезі. Крім того, мається на увазі, що термін «виділена нуклеотидна кислота» включає фрагменти нуклеїнових кислот, які у природних умовах не зустрічаються у вигляді фрагментів і не були присутні б у природному стані. Крім того, термін «виділений» (ізольований) у даному документі відноситься до клітин або поліпептидів, виділених з інших клітинних білків або тканин. Мається на увазі, що виділені поліпептиди охоплюють як очищені, так і рекомбінантні поліпептиди.
У даному документі термін «рекомбінантний» сам по собі має відношення до поліпептидів або полінуклеотидів та має на увазі форму поліпептиду або полінуклеотиду, що не існує у природі, необмежуючий приклад якої можна створити шляхом об'єднання полінуклеотидів або поліпептидів, що звичайно не зустрічаються разом.
Терміни «гомологія» або «ідентичність» або «подібність» відносяться до подібності послідовності двох пептидів або двох молекул нуклеїнової кислоти. Гомологію можна визначити шляхом порівняння положень у кожній послідовності, які можна вирівняти для порівняння. Якщо положення у порівнюваних послідовностях зайняте тією ж самою основою або амінокислотою, тоді молекули є гомологічними по цьому положенню. Ступінь гомології між послідовностями є функцією кількості співпадаючих або гомологічних положень, загальних у зазначених послідовностей. «Неспоріднена» або «негомологічна» послідовність характеризується менш ніж 4095 ідентичністю, переважно менш ніж 2595 ідентичністю однієї з послідовностей відповідно до даного винаходу.
Полінуклеотид або область полінуклеотиду (або поліпептид або область поліпептиду), що характеризується деякою процентною часткою (наприклад, 60 95, 65 95, 70 У, 75 90, 80 Уо, 85 95, 90 95, 95 95, 98 95 або 99 95) «ідентичності послідовності» стосовно іншої послідовності, означає, що при вирівнюванні зазначена процентна частка основ (або амінокислот) однакова при порівнянні двох зазначених послідовностей. Це вирівнювання та процентну гомологію або ідентичність послідовності можна визначити з використанням програмного забезпечення, відомого у даній галузі техніки, наприклад, описаного у А!Єзибеї еї аї. еав5. (2007) Ситепі
РгоїосоЇ5 іп МоїІесшіаг Віоюду. Для вирівнювання переважно використовують параметри за замовчуванням. Однією із програм для вирівнювання є ВІ А5Т при використанні параметрів за замовчуванням. Зокрема, програми ВІА5ТМ та ВГАЗТР з використанням наступних параметрів за замовчуванням: Сепеїіс соде - в5іапаага; Пес - попе; 5ігтапа - роїй; сшой - 60; ехресі - 10;
Маїйїх - ВГОБИОМб62; Оезспріоп5 - 50 зедиепсев; зой Бу - НІСН 5СОВЕ; Оаїаразев - поп- гедипдапі СепВапк - ЕМВІ - БОБ) 4 РОВ я СепВапк СО Шапвіайопе - Змів5Ргоївіп
ЗРирдаїє - РІВ. Біологічно еквівалентними полінуклеотидами є полінуклеотиди, що характеризуються вищезгаданою конкретною процентною гомологією та які кодують 60 поліпептиди, які мають однакову або аналогічну біологічну активність.
Термін «еквівалентна нуклеїнова кислота або полінуклеотид» відноситься до нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність з певним ступенем гомології або ідентичністю послідовності стосовно нуклеотидної послідовності зазначеної нуклеїнової кислоти або її комплементарного ланцюгу. Мається на увазі, що гомолог дволанцюгової нуклеїнової кислоти включає нуклеїнові кислоти, що мають нуклеотидну послідовність, що характеризується певним ступенем гомології по відношенню одна до іншої або до комплементарних ланцюгів один іншого. У одному аспекті гомологи нуклеїнових кислот здатні гібридизуватися із зазначеною нуклеїновою кислотою або її комплементарним ланцюгом. Аналогічним чином, «еквівалентний поліпептид» відноситься до поліпептиду, що характеризується певним ступенем гомології або ідентичності послідовності стосовно амінокислотної послідовності еталонного поліпептиду. У деяких аспектах ідентичність послідовності становить щонайменше 7095, 7595, 8090, 8595, 9090, 9595, 9895 або 9995. У деяких аспектах еквівалентний поліпептид або полінуклеотид містить одне, два, три, чотири або п'ять додавань, делецій, замін та їх комбінацій у порівнянні з еталонним поліпептидом або полінуклеотидом. У деяких аспектах еквівалентна послідовність зберігає активність (наприклад, зв'язування епітопу) або структуру (наприклад, іонний зв'язок) еталонної послідовності.
Реакції гібридизації можна виконувати в умовах різної «твердості». У загальному випадку реакцію гібридизації низької твердості виконують при температурі приблизно 40 "С у приблизно 10 х 55С або розчині еквівалентної іонної сили/температури. Гібридизацію помірної твердості звичайно виконують при температурі приблизно 50 С у приблизно б х 55С, а реакцію гібридизації високої твердості звичайно виконують при температурі 60 "С у приблизно 1 х 555.
Реакції гібридизації також можна виконувати у «фізіологічних умовах», добре відомих фахівцеві у даній галузі техніки. Необмежуючий приклад фізіологічних умов являє собою температуру, іонну силу, рН та концентрацію Мд2", що звичайно зустрічаються у клітині.
Полінуклеотид складається зі специфічної послідовності чотирьох нуклеїнових основ: аденіну (А); цитозину (С); гуаніну (б); тиміну (Т); та урацилу (ОО) замість тиміну, якщо полінуклеотид являє собою РНК. Таким чином, термін «полінуклеотидна послідовність» являє собою буквене представлення молекули полінуклеотиду. Це буквене представлення можна ввести у бази даних у комп'ютері, що містить центральний процесор та що використовується
Зо для додатків у області біоінформатики, наприклад, функціональної геноміки та пошуку гомології.
Термін «поліморфізм» відноситься до одночасного існування більш ніж однієї форми гену або його фрагменту. Фрагмент гену, для якого існує щонайменше дві різні форми, тобто дві різні нуклеотидні послідовності, називають «поліморфною областю гену». Поліморфна область може являти собою одиночний нуклеотид, ідентичність якого відрізняється у різних алелях.
Терміни «полінуклеотид» та «олігонуклеотид» використовуються на рівних підставах та відносяться до полімерної форми нуклеотидів будь-якої довжини, як дезоксирибонуклеотидів, так і рибонуклеотидів або їх аналогів. Полінуклеотиди можуть мати будь-яку тривимірну структуру та виконувати будь-яку відому або невідому функцію. Нижче наведені необмежуючі приклади полінуклеотидів: ген або фрагмент гену (наприклад, зонд, праймер, маркер Е5Т або
ЗАСЕ), екзони, інтрони, матрична РНК (мРНК), транспортна РНК, рибосомна РНК, рибозими,
КДНК, дцРНК, міРНК, мікроРНК, рекомбінантні полінуклеотиди, розгалужені полінуклеотиди, плазміди, вектори, виділена ДНК будь-якої послідовності, виділена РНК будь-якої послідовності, нуклеотидні зонди та праймери. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, наприклад, метильовані нуклеотиди, та аналоги нуклеотидів. При їхній наявності, модифікації нуклеотидної структури можна здійснити до або після складання полінуклеотиду. Послідовність нуклеотидів може перериватися не-нуклеотидними компонентами. Полінуклеотид також може бути модифікований після полімеризації, наприклад, шляхом кон'югування з компонентом- міткою. Цей термін також відноситься як до дво-, так і до одноланцюгових молекул. Якщо інше не зазначене або не потрібно, будь-який варіант реалізації даного винаходу, що являє собою полінуклеотид, охоплює як дволанцюгову форму, так і кожну із двох комплементарних одноланцюгових форм, які свідомо або на основі прогнозу складають дволанцюгову форму.
Термін «кодувати» по відношенню до полінуклеотидів відноситься до полінуклеотиду, про який говорять, що він «кодує» поліпептид, якщо у нативній формі або у результаті маніпуляцій із застосуванням способів, добре відомих фахівцям у даній галузі техніки, його можна транскрибувати та/або транслювати з одержанням мРНК для поліпептиду та/або її фрагменту.
Антизначеннєвий ланцюг являє собою комплементарний ланцюг такої нуклеїнової кислоти, та з неї можна одержати кодуючу послідовність.
У даному документі термін «антитіло» або «антиген-зв'язувальний поліпептид» відноситься до поліпептиду або поліпептидного комплексу, що специфічно розпізнає антиген та зв'язується бо з ним. Антитіло може являти собою ціле антитіло та будь-який антиген-зв'язувальний фрагмент або одиночний ланцюг антитіла. Таким чином, термін «антитіло» включає будь-який білок або пептид, що містить молекулу, що містить щонайменше фрагмент молекули імуноглобуліну, що має біологічну активність зв'язування з антигеном. Приклади таких фрагментів включають ділянку, що визначає комплементарність (СОМ) важкого або легкого ланцюгу або їх ліганд- зв'язувальний фрагмент, варіабельну область важкого або легкого ланцюгу, константну область важкого або легкого ланцюгу, каркасну ділянку (ЕК) або будь-який їхній фрагмент, або щонайменше один фрагмент зв'язувального білку, але не обмежуються ними.
Терміни «фрагмент антитіла» або «антиген-зв'язувальний фрагмент» у даному документі являють собою фрагмент антитіла, наприклад, Е(ар)2, Е(аб)г, Раб, Рар, Ем, 5сЕм та т.п.
Незалежно від структури, фрагмент антитіла зв'язується з тим же антигеном, який розпізнає інтактне антитіло. Термін «фрагмент антитіла» включає аптамери, шпігельмери та діатіла.
Термін «фрагмент антитіла» також включає будь-який синтетичний білок або білок, отриманий за допомогою генної інженерії, що діє аналогічно антитілу, шляхом зв'язування зі специфічним антигеном з утворенням комплексу.
Термін «одноланцюговий варіабельний фрагмент» або "5сЕму" відноситься до гібридного білку варіабельних областей важкого (Мн) та легкого ланцюгів (Мі) імуноглобулінів. У деяких аспектах ці області з'єднані коротким пептидним лінкером, що містять від десяти до приблизно 25 амінокислот. Цей лінкер звичайно багатий гліцином (з метою гнучкості), а також серіном або треоніном (з метою розчинності), та може з'єднувати М-кінець Мн з С-кінцем Мі або навпаки. Цей білок зберігає специфічність вихідного імуноглобуліну, незважаючи на видалення константних областей та введення лінкеру. Молекули 5сЕм відомі у даній галузі та описані, наприклад, у патенті США 5892019.
Термін "антитіло" охоплює різні класи поліпептидів, які можуть відрізнятися з біохімічної точки зору. Фахівці у даній галузі техніки зрозуміють, що важкі ланцюги діляться на гама-, мю-, альфа-, дельта- або епсилон-ланцюги (у, Н, а, б, є), всередині яких існують підкласи (наприклад, у1-Оу4). Це є природою даного ланцюга, який визначає «клас» антитіла, наприклад, дос, ІЗ9М,
ІДА, до або ІдЧЕ, відповідно. Підкласи (ізотипи) імуноглобулінів наприклад, дон, Ід», Із, ІДС,
Ідс5 і т.д. добре вивчені та відомо, що вони характеризуються функціональною спеціалізацією.
Кваліфікований фахівець легко розрізняє модифіковані версії кожного із цих класів та ізотипів у світлі даного винаходу та, відповідно, входять у межі даного винаходу. Усі класи імуноглобулінів у явному вигляді входять у межі даного винаходу, та наступне обговорення буде у цілому присвячене класу дб молекул імуноглобулінів. Стосовно І|дс, стандартна молекула імуноглобуліну містить два ідентичні поліпептиди легкого ланцюгу з молекулярною масою приблизно 23000 дальтон, та два ідентичні поліпептиди важкого ланцюгу з молекулярною масою приблизно 53000-70000. Зазначені чотири ланцюги звичайно з'єднані дисульфідними зв'язками у "У"-конфігурацію, де легкі ланцюги згруповані з важкими ланцюгами, починаючи з горловини зазначеної "У"-конфігурації та далі по ходу варіабельної області.
Антитіла, антиген-зв'язувальні поліпептиди, їх варіанти або похідні відповідно до даного винаходу включають поліклональні, моноклональні, мультиспецифічні, гуманізовані, приматизовані або химерні антитіла або антитіла людини, одноланцюгові антитіла, епітоп- зв'язувальні фрагменти, наприклад, Бар, Бар'та Е(аб)2, Ба, Ем, одноланцюгові Ем (5сЕм), одноланцюгові антитіла, Ем з дисульфідними зв'язками (5йЕм), фрагменти, що містять МК- або
МН-домен, фрагменти, продуковані бібліотекою експресії Рар, та антиідіотипові (анти-іа) антитіла (включаючи, наприклад, анти-іЯ антитіла до антитіл ГІОНТ, описаних у даному документі), але не обмежуються ними. Імуноглобуліни або молекули антитіл згідно із даним винаходом можуть відноситися до будь-якого типу (наприклад, Ідс, ІДЕ, ІМ, дО, ІдА та Ід), класу (наприклад, ІдСІ, Ідс2, Ід, Ідс4, ІдДА1 та ІдАг) або підкласу молекул імуноглобулінів.
Легкі ланцюги класифікуються як каппа або лямбда (К, л). Важкий ланцюг кожного класу може зв'язуватися з каппа- або лямбда-легким ланцюгом. У загальному випадку легкий та важкий ланцюги ковалентно зв'язані один з іншим, та "хвостові" фрагменти двох важких ланцюгів з'єднані один з іншим за допомогою ковалентних дисульфідних зв'язків або нековалентних зв'язків, якщо імуноглобуліни одержують за допомогою гібридом, В-клітин або рекомбінантних клітин-хазяїв. У важкому ланцюзі амінокислотна послідовність іде від М-кінцевої області на роздвоєних кінцях У-конфігурації до С-кінцевої області у нижній частині кожного ланцюгу.
Як легкий, так і важкий ланцюг діляться на області, що мають структурну та функціональну гомологію. Терміни «константний» та «варіабельний» використовуються у функціональному значенні. У зв'язку із цим слід приймати до уваги, що варіабельні домени фрагментів як легкого (УК) та важкого (УН) ланцюгу визначають розпізнавання антигену та специфічність. І навпаки, бо константні домени легкого ланцюгу (СК) та важкого ланцюгу (СНІ, СН2 або СНЗ) надають антитілу важливі біологічні властивості, наприклад, секрецію, здатність проходити через плацентарний бар'єр, зв'язування з Ес-рецептором, зв'язування з комплементом і т.п. Згідно із прийнятою нумерацією, номера доменів константної області збільшуються у міру того, як вони стають більш дистальними від антиген-зв'язувального сайту або М-кінцевої області антитіла. М- кінцевий фрагмент являє собою варіабельну область, а С-кінцевий фрагмент являє собою константну область; СНЗ- та СК-домени фактично складають С-кінець важкого та легкого ланцюгу, відповідно.
Як зазначено вище, варіабельна область дозволяє антитілу специфічно розпізнавати та специфічно зв'язувати епітопи антигенів. Тобто МК-домен та МН-домен або набір ділянок, що визначають комплементарність, (СОМ) антитіла разом утворюють варіабельну область, яка визначає тривимірний антиген-зв'язувальний сайт. Ця четвертинна структура антитіла утворює антиген-зв'язувальний сайт, що присутній на кінці кожного плеча М-подібної структури.
Конкретніше, антиген-зв'язувальний сайт визначають три СОК на кожному з МН- та МК-ланцюгу (тобто СОК-НІ, СОВ-Н2, СОВ-НЗ, СОВ-11, СОВ-І2 та СОК-1І 3). У деяких випадках, наприклад, у деяких молекулах імуноглобулінів, отриманих з видів сімейства верблюдових або сконструйованих на основі імуноглобулінів верблюдових, повна молекула імуноглобуліну може складатися тільки з важких ланцюгів та не містити легких ланцюгів. Див., наприклад, Натегв-
Савіегтанп евї аї., Мате 363:446-448 (1993).
У природних антитілах шість «ділянок, що визначають комплементарність» або «СОК», присутніх у кожному антиген-зв'язувальному домені, являють собою короткі несуміжні послідовності амінокислот, специфічно розташовані з утворенням антиген-зв'язувального домену антитіла, оскільки антитіло передбачає утворення тривимірної конфігурації у водному середовищі. Інші амінокислоти у антиген-зв'язувальних доменах, які називаються «каркасними» ділянками, демонструють меншу міжмолекулярну мінливість. Каркасні ділянки здебільшого приймають конформацію рД-листку, а СОК утворюють петлі, які з'єднуються з В-листком та у деяких випадках входять до складу його структури. Таким чином, каркасні ділянки діють як каркас, що забезпечує розміщення СОК у потрібній орієнтації шляхом нековалентної взаємодії між ланцюгами. Антиген-зв'язувальний домен, утворений розміщеними СОК, визначає поверхню, комплементарну епітопу імунологічно реактивного антигену. Комплементарна
Зо поверхня стимулює нековалентне зв'язування антитіла з його епітопом. Амінокислоти, що складають СОК та каркасні ділянки, відповідно, легко може виявити фахівець у даній галузі техніки для будь-якої заданої варіабельної області важкого або легкого ланцюгу, оскільки вони точно визначені (див. "Зедиепсе5 ої Ргоїеіп5 ої Іттипо/одіса! Іпсегеб5і," Кабваї, Е., еї аї!., 0.5.
Оераптепі ої Неакй апа Нитап зегмісе5, (1983); та Споївіа апа Гек, 9. Мої. Віої., 196:901-917 (1987)).
Якщо існують два визначення терміну, використовувані та/або прийняті у даній галузі техніки, мається на увазі, що визначення даного терміну, використовуване у даному документі, включає всі такі значення, якщо зворотне не зазначене явно. Конкретним прикладом є використання терміну «ділянка, що визначає комплементарність» («СОК» для опису несуміжних антиген-зв'язувальних сайтів у межах варіабельної області поліпептидів важких та легких ланцюгів. Дана конкретна область описана у роботах Карбаї єї а!., 0.5. Оері. ої Неакп апа Нитап зегмісе5, "Зедцепсез ої Ргоїеіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіеге5/! (1983) ії Споїйіа еї аї., 9. Мої. Віо). 196:901-917 (1987), які повністю включені у даний документ за допомогою посилань.
Визначення СОК за Караї та Споїйіа включають набори амінокислотних залишків, які перекриваються при порівнянні один з іншим. Проте, мається на увазі, що застосування будь- якого визначення стосовно СОК антитіла або його варіантів знаходиться у межах зазначеного терміну відповідно до його визначення та використання у даному документі. Відповідні амінокислотні залишки, що складають СОК згідно з визначенням по кожному з вищенаведених посилань, наведені нижче у таблиці для порівняння. Точні номери залишків, що складають конкретний СОК, міняються залежно від послідовності та розміру СОК. Фахівці у даній галузі техніки можуть у робочому порядку визначити, які залишки складають конкретний СОК з урахуванням амінокислотної послідовності варіабельної області антитіла. 11111111 каваб777777/ 17717171 Спота.у/ З
Кабаї єї а. також задали систему нумерації для послідовностей варіабельних доменів, застосовну до будь-якого антитіла. Фахівець у даній галузі техніки може однозначно привласнити цю систему «нумерації Кабаї» будь-якої послідовності варіабельного домену, безвідносно до експериментальних даних, крім самої послідовності. У даному документі «нумерація Кабаї» відноситься до системи нумерації, заданої у роботі Кабаї еї а!., 0.5. Юері. ої
Неакй апа Нитап Зегмісе5, "Зедцепсе ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїодісаї! Іптеге5" (1983).
На додаток до вищевказаної таблиці, система нумерації Кабаї описує ділянки СОК у такий спосіб: СОВК-НІ починається приблизно у положенні амінокислоти 31 (тобто приблизно через 9 залишків після першого залишку цистеїну), містить приблизно 5-7 амінокислот та закінчується на наступному залишку триптофану. СОК-Н2 починається на п'ятнадцятому залишку після кінця
СОВ-НІ, містить приблизно 16-19 амінокислот та закінчується на наступному залишку аргініну або лізину. СОК-НЗ починається приблизно на тридцять третьому амінокислотному залишку після кінця СОК-Н2; містить 3-25 амінокислот та закінчується послідовністю М/-Сс-Х-О, де Х - будь-яка амінокислота. СОК-І 1 починається приблизно у положенні залишку 24 (тобто після залишку цистеїну); містить приблизно 10-17 амінокислот та закінчується на наступному залишку триптофану. СОК-12 починається приблизно на шістнадцятому залишку після кінця СОК-Ї 1 та містить приблизно 7 залишків. СОК-Ї З починається приблизно на тридцять третьому залишку після кінця СОМК-1Ї2 (тобто після залишку цистеїну), містить приблизно 7-11 залишків та закінчується послідовністю Е або М/-Сс-Х-0, де Х - будь-яка амінокислота.
Антитіла, описані у даному документі, можна одержати з організму будь-яких тварин, у тому числі птахів та ссавців. Антитіла переважно являють собою антитіла людини, миші, осла, кролика, кози, морської свинки, верблюда, лами, коні або курки. У ще одному варіанті реалізації варіабельна область може мати походження із хрящових риб (наприклад, акул).
У даному документі термін «константна область важкого ланцюгу» містить амінокислотні послідовності, що походять з важкого ланцюгу імуноглобуліну. Поліпептид, що містить константну область важкого ланцюгу, містить щонайменше один з: СНІ1-домену, шарнірного (наприклад, областей верхнього, середнього та/або нижнього шарніру) домену, СН2-домену,
СНЗ-домену або їх варіанту або фрагменту. Наприклад, антиген-зв'язувальний поліпептид для застосування у даному винаході може містити поліпептидний ланцюг, що містить СНІ -домен; поліпептидний ланцюг, що містить СНІ-домен, щонайменше фрагмент шарнірного домену, та
СНа2г-домен; поліпептидний ланцюг, що містить СНІі-домен та СНЗ-домен; поліпептидний ланцюг, що містить СН1І-домен, щонайменше фрагмент шарнірного домену, та СНЗ-домен, або поліпептидний ланцюг, що містить СНІ-домен, щонайменше фрагмент шарнірного домену,
СН2г-домен та СНЗ-домен. У ще одному варіанті реалізації поліпептид згідно із даним винаходом містить поліпептидний ланцюг, що містить СНЗ-домен. Крім того, у антитілі для застосування у даному винаході може бути відсутній щонайменше фрагмент СН2-домену (наприклад, СН2-домен може бути повністю або частково відсутнім). Як зазначено вище, фахівець у даній галузі техніки зрозуміє, що константну область важкого ланцюгу можна модифікувати таким чином, що її амінокислотна послідовність буде відрізнятися від природної молекули імуноглобуліну.
Константна область важкого ланцюгу антитіла, описаного у даному документі, може походити з різних молекул імуноглобулінів. Наприклад, константна область важкого ланцюгу поліпептиду може містити СНІ1І-домен, що походить з молекули Ідсі, та шарнірну область, що походить з молекули ІдбСз. У ще одному прикладі константна область важкого ланцюгу поліпептиду може містити шарнірну область, що частково походить з молекули Ідсі, та що частково походить з молекули ІдДОз. У ще одному прикладі фрагмент важкого ланцюгу може містити химерний шарнір, що походить частково з молекули Ідсі, та частково від молекули дося.
У даному документі термін «константна область легкого ланцюгу» містить амінокислотні послідовності, що походять з легкого ланцюгу антитіла. Константна область легкого ланцюгу переважно містить щонайменше один з константного каппа-домену або константного лямбда- домену. «Пара легкий ланцюг - важкий ланцюг» відноситься до сукупності легкого ланцюгу та важкого ланцюгу, які можуть утворювати димер за рахунок дисульфідного зв'язку між Сі - доменом легкого ланцюгу та СНІ1І-доменом важкого ланцюгу.
Як було зазначено раніше, субодинична структура та тривимірна конфігурація константних областей різних класів імуноглобулінів добре відомі. У даному документі термін «МН-домен» включає М-кінцевий варіабельний домен важкого ланцюгу імуноглобуліну, а термін «СНІ1- домен» включає перший (найбільш близький до М-кінця) домен константної області важкого бо ланцюгу імуноглобуліну. СНІ-домен розташований поруч із МН-доменом та з боку М-кінця від шарнірної області важкого ланцюгу молекули імуноглобуліну.
У даному документі термін «СН2-домен» включає фрагмент молекули важкого ланцюгу, який поширюється, наприклад, від приблизно 244 залишку до 360 залишку антитіла згідно із загальноприйнятими схемами нумерації (залишки 244-360, система нумерації Кабає та залишки 231-340, система нумерації ЄС; див. Кабаї еї аїІ.,, 0.5. Оері. ої Неайй апа Нитап зЗегмісев, "Бедциепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодісаї! Іпіеге5/! (1983). СН2-домен унікальний тим, що він не сполучений з іншим доменом безпосередньо. Замість цього між двома СН2-доменами інтактної нативної молекули до знаходяться два М-зв'язані розгалужені вуглеводні ланцюги. Крім того, добре задокументовано, що СНЗ-домен поширюється від СН2-домена до С-кінця молекули дО та містить приблизно 108 залишків.
У даному документі термін «шарнірна область» включає фрагмент молекули важкого ланцюгу, що з'єднує СНІ-домен з СН2-доменом. Ця шарнірна область містить приблизно 25 залишків та є гнучкою, що дозволяє двом М-кінцевим антиген-зв'язувальним областям рухатися незалежно. Шарнірні області можна розділити на три окремі домени: верхній, середній та нижній шарнірні домени (Коих еї аї., У. Іттипої 161:4083 (1998)).
У даному документі термін «дисульфідний зв'язок» включає ковалентний зв'язок, утворений між двома атомами сірки. Амінокислота цистеїн містить тіолову групу, яка може утворювати дисульфідний зв'язок або місток із другою тіоловою групою. У більшості природних молекул ЇдДО області СНІ та СК з'єднані дисульфідним зв'язком, а два важкі ланцюги з'єднані двома дисульфідними зв'язками по положеннях, що відповідають 239 та 242 залишкам згідно із системою нумерації Кабаї (положенням 226 або 229 згідно із системою нумерації ЄС).
У даному документі термін «химерне антитіло» означає будь-яке антитіло, у якому імунореактивна область або сайт отримані або походять із першого виду тварини, а константна область (яка може бути інтактною, частковою або модифікованою відповідно до даного винаходу) отримана з антитіла іншого виду тварини. У деяких варіантах реалізації область або сайт зв'язування мішені має нелюдське походження (наприклад, отриманий з організму миші або примата), а константна область отримана з антитіла людини.
У даному документі «відсоток гуманізації» розраховують, визначаючи кількість амінокислот у каркасній ділянці, які відрізняються (тобто відмінностей у ділянках, що не відносяться до СОК) між гуманізованим доменом та ембріональним доменом, віднімаючи цю кількість із загальної кількості амінокислот, а потім ділячи його на загальну кількість амінокислот та помножуючи на 100.
Слова «специфічно зв'язується» або «має специфічність до» у загальному випадку означають, що антитіло зв'язується з епітопом за допомогою свого антиген-зв'язувального домену та що зазначене зв'язування передбачає деяку комплементарність між антиген- зв'язувальним доменом та епітопом. Згідно із зазначеним визначенням, говорять, що антитіло «специфічно зв'язується» з епітопом, якщо воно зв'язується із зазначеним епітопом через свій антиген-зв'язувальний домен легше, ніж у випадку зв'язування з випадковим, неспецифічним епітопом. Термін «специфічність» використовується у даному документі для оцінки відносної афінності, з якою певне антитіло зв'язується з певним епітопом. Наприклад, можна вважати, що антитіло «А» має більш високу специфічність до даного епітопу, ніж антитіло «В», або можна сказати, що антитіло «А» зв'язується з епітопом «С» з більш високою специфічністю, ніж зі спорідненим епітопом «0».
У даному документі терміни «лікувати» та «лікування» відносяться як до терапевтичного лікування, так і до профілактичних або запобіжних заходів, причому їх метою є запобігання або уповільнення (ослаблення) небажаної фізіологічної зміни або порушення, наприклад, прогресування раку. Сприятливі або бажані клінічні результати включають, без обмеження, пом'якшення симптомів, зменшення ступеня захворювання, стабілізований (тобто, що не погіршується) стан захворювання, затримку або уповільнення прогресування захворювання, полегшення або тимчасове ослаблення хворобливого стану та ремісію (часткову або повну), як виявлювані (детектуємі), так і невиявлювані (недетектуємі). Термін «лікування» також може означати збільшення тривалості життя у порівнянні з очікуваною тривалістю життя за відсутності лікування. Особи, що потребують лікування, включають осіб, які вже страждають на стан або порушення, а також осіб, схильних до станів або порушень, або осіб, у яких цього стану або порушення слід запобігти.
Термін «суб'єкт» або «індивід» або «тварина» або «пацієнт» або «ссавець» позначає будь- якого суб'єкта, зокрема, суб'єкта-ссавця, для якого діагностика, прогнозування або терапія є бажаними. Суб'єкти-ссавці включають людей, свійських тварин, сільськогосподарських тварин та тварин, що утримуються у зоопарках, використовуваних у спортивних цілях або кімнатних 60 тварин, наприклад, собак, кішок, морських свинок, кроликів, щурів, мишей, коней, велику рогату худобу, корів і т.д.
У даному документі такі фрази як «пацієнт, що потребує лікування» або «суб'єкт, що потребує лікування» включають суб'єктів, наприклад, суб'єктів-ссавців, для яких введення антитіла або композиції згідно із даним винаходом може бути сприятливим, наприклад, для детектування, діагностичної процедури та/або лікування.
Антитіла проти СО7З3
У даному винаході запропоновані антитіла проти СО73 з високою афінністю та інгібувальною активністю відносно білюу СЮО7З людини. Зазначені антитіла можуть ефективно зв'язуватися як з вільним СО73, так і з СО7З на поверхні клітин. Зв'язування з білюоом СО7З на поверхні клітини може викликати інтерналізацію; це приводить до зниження експресії білку
СО73 на поверхні клітини, що знижує рівень позаклітинного аденозину та послабляє імуносупресивне оточення пухлини. Крім того, оскільки ці антитіла не конкурують із субстратом
АМФ за зв'язування з активним центром СО73, а діють алостерично або за допомогою інших неконкурентних механізмів, ці антитіла не заважають зв'язуванню СО7З із цими ендогенними субстратами АМФ, що обмежує потенційні небажані ефекти цих антитіл.
Крім того, як продемонстровано у експериментальних прикладах, ці антитіла мають деякі унікальні властивості, не спостережувані у відомих антитіл проти СО7З3, наприклад, МЕОІ-9447 виробництва Медіттипе. Як показано у прикладі 12, хоча МЕ0БІ-9447 та 1111 зв'язуються з М- кінцевими доменами білку СО73, цільові амінокислоти даних антитіл (наприклад, 345, 0399,
Е400, К401 та К480) знаходяться у С-кінцевих доменах.
Фермент СО73 складається з димеру двох ідентичних субодиниць масою 70 кДа, зв'язаних глікозилфосфатидилінозитним зв'язком із зовнішньою стороною плазматичної мембрани.
Кристалічні структури димерного СО73 людини дозволяють виявити інтенсивний конформаційний перехід між відкритою та закритою формами ферменту, який необхідний для належного функціонування ферменту. Поверхня контакту при димеризації утворена сС- кінцевими доменами. Якщо С-кінцеві домени залучені у інші види зв'язування, передбачається, що димеризація та/"або конформаційний перехід може блокуватися у результаті інгібування активності СО73. На відміну від цього, зв'язування з антитілом по М-кінцевим доменам може не приводити до таких ефектів.
Таким чином, передбачається, що якщо антитіла згідно із даним винаходом зв'язують білок
СО7З3 по його С-кінцевим доменам, вони можуть блокувати димеризацію білку та ефективно інгібувати його активність. Таким чином, антитіла згідно із даним винаходом більш кращі у порівнянні з раніше відомими антитілами проти СО73, які зв'язуються з М-кінцевими доменами.
Таким чином, відповідно до одного варіанту реалізації даного винаходу запропоноване виділене антитіло або фрагмент антитіла, що мають специфічність стосовно білку СО7З людини та що зв'язуються з одним або більше амінокислотними залишками, вибраними у С-кінцевій області білил СО73 людини. С-кінцева частина білью»у СО7З3 людини, як відомо у даній галузі техніки, містить 238 амінокислотних залишків, починаючи із залишку 337, як показано у 5ЕО ІЮ
МО: 61 у таблиці нижче.
Таблиця А
Послідовність СЮО7 3: в
ІВВАЕРММІ ГП ОАСООМОСТІМЕТУМКОАЕМАНЕММАІ ВУСАМАГЯМНЕРОМОМЕСПЕРІІ КЕАКЕРІЇ.
ЗАМІКАКОРІ АБОЇБИЇ МІ РУКМІ РУСОЕММСІМаУТ5КЕТРЕЇ ЗМРатТМІ МЕЕОЕІТАГОРЕМОКІ КТІ.
Білок МУМКІІАГанваРЕМОКЛАОКУВамМрУУУСаноімт РІ мУтТаМРРУЗКЕМРАСКУРЕРІМТ5ОРОВКУРУМОА со73 МЖАРОКУЇ СУХІ КІЕЄОЕВОММІЗЗНОМРІГІ.М55ІРЕОРБІКАВІМКУУВІКІ ОМУЗТОЕГ СаКТтІММІ 0055 людини | ОЗХСВЕВЕСММОМИСОАМІМММІВНТОЕМЕУМУМНУЗМСІ Мас СсІВ5РІОЕВММОТІПУМЕМІ ААМІРЕОССТ
ЕОІГМОЇ КаЗТІККАРЕНБУНАУСО5ТОЕРГ ОМОСІНМУМОЇ 6ВКРООВМУУКІ ОМІ СТКСВМРОМОРІ КМО
ЕМУКМІ-РМЕГАМОаСраТгРОМІКОЕ І АНОБарОБІМУМЗТМІВКМКМІУРАМЕСВІКЕЗТОаЗнНСНОБЕВІ.
ІЕСВІЛМАМІЕМІ МО
У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з одним або більше з
С-кінцевих доменів білю»у СЮО7З людини. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з одним або більше з амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з У345, 0399, Е400, 401 та МК480 білюу СО7З людини. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується 3 щонайменше двома із зазначених амінокислотних залишків.
У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345 та 0399. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше
У345 та Е400. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345 та К401. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше 0399 та Е400. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше 0399 та К401. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше 0399 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше Е400 та К401. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше Е400 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше К401 та К480.
У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, 0399 та Е400. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, 0399 та К401. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, 0399 та М480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, Е400 та К401. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, Е400 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, К401 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше 0399, Е400 та К401.
У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше 0399,
Е400 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше Е400, К401 та К480.
У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, р399, Е400 та К401. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, 0399, Е400 та МК480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, 0399, К401 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше У345, Е400, К401 та К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з щонайменше 0399, Е400, К401 та
К480. У деяких варіантах реалізації антитіло або його фрагмент зв'язується з кожним із залишків 345, 0399, Е400, К401 та К480.
У відповідності з одним варіантом реалізації даного винаходу запропоноване антитіло, яке містить варіабельні домени важкого ланцюгу та легкого ланцюгу з ділянками СОК, заданими у
ЗЕО І МО: 1-6.
Таблиця 1
Послідовності ділянок СОМ мосовз 0 фО0МУ55МРРТГ/7//////777777777777777777777777171Ї111116сС1
Як продемонстровано у експериментальних прикладах, антитіла миші, людини або гуманізовані антитіла, що містять ці ділянки СОЖК, мають потужну СО7З-зв'язувальну та інгібувальну активність. Подальше комп'ютерне моделювання показало, що деякі залишки у межах СОК можна модифікувати зі збереженням або поліпшенням властивостей антитіл. Такі залишки називають «гарячими точками»; вони виділені підкресленням у таблиці 1. У деяких варіантах реалізації антитіло проти СО7З згідно із даним винаходом містить СОК МН та МІ, перераховані у таблиці 1, з однією, двома або трьома додатковими модифікаціями. Такі модифікації можуть являти собою додавання, делеції або заміни амінокислот.
У деяких варіантах реалізації модифікація являє собою заміну у не більш ніж одному положенні гарячої точки у кожній з СОК. У деяких варіантах реалізації модифікація являє собою заміну у одному, двох або трьох таких положеннях гарячої точки. У одному варіанті реалізації модифікація являє собою заміну у одному з положень гарячої точки. У деяких варіантах реалізації такі заміни є консервативними замінами. "Консервативна амінокислотна заміна» є заміною, при якій амінокислотний залишок заміняють амінокислотним залишком, що містить аналогічний бічний ланцюг. У даній галузі техніки визначені сімейства амінокислотних залишків, що містять подібні бічні ланцюги, у тому числі основні бічні ланцюги (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотні бічні ланцюги (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незаряджені полярні бічні ланцюги (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серін, треонін, тирозин, цистеїн), неполярні бічні ланцюги (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалужені бічні ланцюги (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичні бічні ланцюги (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, амінокислотний залишок, що не є незамінною амінокислотою, у складі поліпептиду імуноглобуліну переважно заміщають іншим амінокислотним залишком з того ж сімейства бічного ланцюга. У ще одному варіанті реалізації ланцюг амінокислот можна замінити структурно аналогічним ланцюгом, що відрізняється порядком та/або складом членів сімейства бічного ланцюгу.
Необмежуючі приклади консервативних амінокислотних замін приведені нижче у таблиці, де бальний показник подібності, що дорівнює 0 або вище, вказує на консервативну заміну між двома амінокислотами.
Таблиця 2
Матриця подібності амінокислот сісіРІЗІТА ТО | ЕєЇМІО | ніІкКІвВУ М | се ММ м -81-71|-6|2|6 5 -71|-71|4|5|з| 3121 6|4| 5| 210 0 | 17 мо 5|Ї5|з3|3 3 4| 4 2| 4|0| 415 2| 2г| лІлІ7 ло
ЕЕ 4|5|Ї5|з3|4 3 6|5| 4| 5| 2| 5 4|л7|0|1|219.ЙДЦ -161|4/|3|3|2 2 4|з3/|з3|2| 2г| 3 3|2|4|2|16| ДЦ - 1123 2г|л|т110 1 2|2|2г|2|2г| г 2|14|2|5 мі 513 2г|2г|л1 1 3 2г|о|чл|2г|0101|2|6!Ї
МІ 2а|л7|л7|л7|010 1 2|2г|2г|2|2г| г 2|14 в 4/|з3|0|0|2 1 л|7|0|1І2|316! | | Її Її к/5іІ2гіліо|л о 010111, 110151 | | 1 її 1 ні зіІг2гіо|ліл т л 111|2|316!ї 1 | Її 1 717717 1 о 5І7|0|л1|0 чл 2І2|1114| | її 1 1 ї71717177171711 м 4|0|7|1 101 0121112| | Її її 1 7171711
Е 51070100 0314| | Її Її її 71 1 7171711 о 511,70 |01014| | Її Її Її 7 717171 ті е2а|о 01111133 | ЇЇ її 7171711
А 2|1|1111121 | її ї171771Т з 01111111 7 1 1 11717711
РІ З|І716Ї Її 7 1 17171 в з/І5! ЇЇ її її Її її 11111 1 се,
Таблиця З
Консервативні амінокислотні заміни
Конкретні приклади СОМ з підходящими замінами представлені у 5ЕО ІЮО МО: 26-56 прикладу 7. Таким чином, у деяких варіантах реалізації антитіло відповідно до даного винаходу містить СОКІ МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1 або будь-якої з 26-29. У деяких варіантах реалізації антитіло відповідно до даного винаходу містить СОК2 МН відповідно до БЕО ІЮ МО: 2 або будь-якої з 30-36. У деяких варіантах реалізації антитіло відповідно до даного винаходу містить СОКЗ МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1 або будь-якої з 37-41. У деяких варіантах реалізації антитіло відповідно до даного винаходу містить СОК1 Мі. відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 4 або будь-якої з 42-45. У деяких варіантах реалізації антитіло відповідно до даного винаходу містить СОК2 МІ. відповідно до ЗЕО ІО МО: 5. У деяких варіантах реалізації антитіло відповідно до даного винаходу містить СОКЗ МІ. відповідно до 5ЕО ІО МО: 6 або будь-якої з 46-56.
У деяких варіантах реалізації антитіло або фрагмент антитіла містить не більше однієї, не більше двох або не більше трьох із вищезазначених замін. У деяких варіантах реалізації антитіло або фрагмент антитіла містить СОК1 МН відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 1 або будь-якої з
ЗЕО ІЮ МО: 26-29, СОК2 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 2, СОВЗ МН відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 3,
СОКІ1 Мі відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 4, СОМК2 Мі відповідно до ЗЕО ІО МО: 5 та СОКЗ МІ відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 6.
У деяких варіантах реалізації антитіло або фрагмент антитіла містить СОМК1 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1, СОК2 МН відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 2 або будь-якої з БЕО ІЮ МО: 30-36, СОВЗ
МН відповідно до 5ХЕО ІЮ МО: 3, СОР1 Мі. відповідно до 5ЗЕО ІЮ МО: 4, СОР2 МІ. відповідно до
ЗЕО ІЮО МО: 5 та СОКЗ МІ. відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 6.
У деяких варіантах реалізації антитіло або фрагмент антитіла містить СОМК1 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1, СОК2 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 2, СОКЗ МН відповідно до 5ЕО ІЮО МО: З або будь-якої з БЕО ІЮ МО: 37-41, СОКІ1 Мі. відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 4, СОК2 Мі. відповідно до
ЗЕО ІЮО МО: 5 та СОКЗ МІ. відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 6.
У деяких варіантах реалізації антитіло або фрагмент антитіла містить СОМК1 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1, СОК2 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 2, СОКЗ МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 3,
СОКІ Мі. відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 4 або будь-якої з БЕО ІЮ МО: 42-45, СОМ2 МІ. відповідно до
ЗЕО ІЮО МО: 5 та СОКЗ МІ. відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 6.
Зо У деяких варіантах реалізації антитіло або фрагмент антитіла містить СОК1 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1, СОК2 МН відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 2, СОКЗ МН відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 3,
СОКІ1 Мі відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 4, СОМК2 Мі відповідно до 5ЕО ІО МО: 5 та СОКЗ М відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 6 або будь-якої з ЗЕО ІЮ МО: 46-56.
Необмежуючі приклади МН представлені у ЗЕО ІЮ МО: 7 та 9-13, серед яких 5ЕО ІЮ МО: 10 являє собою МН миші, а 5ЕО ІЮО МО: 7, 9 та 11-13 - гуманізовані послідовності. Крім того, серед гуманізованих МН ЗЕО ІО МО: 7, 9 та 12-13 містять одну або більше зворотних мутацій до версії миші. Аналогічним чином, необмежуючі приклади МІ. (УК) представлені у ЗЕО ІЮ МО: 8, 15-20 та 22-24. ЗБО ІЮ МО: 15 являє собою послідовність миші, ЗЕО ІЮ МО: 16 та 22 - спочатку модифіковані гуманізовані послідовності, показані у прикладах. ЗЕО ІЮО МО: 8, 17-20 та 22-24 являють собою гуманізовані МІ. із зворотними мутаціями.
Показано, що зворотні мутації корисні для збереження деяких характеристик антитіл проти
СО73. Відповідно, у деяких варіантах реалізації антитіла проти СО7З3 відповідно до даного винаходу, зокрема, антитіла людини або гуманізовані антитіла, містять одну або більше зворотних мутацій. У деяких варіантах реалізації зворотна мутація у МН (тобто включена амінокислота у зазначеному положенні) являє собою одну або більше мутацій, вибраних з (а)
ТАиг у положенні 30, (Б) Гу5 у положенні 44, (с) Меї у положенні 48, (а) Пе у положенні 67 та (є)
Агд у положенні 71 відповідно до нумерації Кабаї та їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації зворотна мутація у МІ. являє собою одну або більше мутацій, вибраних з (а) Зег у положенні 5, (Б) Рго у положенні 46, (с) Тгр у положенні 47, (а) Зег у положенні 70 та (ї) Туг у положенні 71 відповідно до нумерації Кабаї та їх комбінації.
У деяких варіантах реалізації антитіло проти СО7З відповідно до даного винаходу містить
МН відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 7 або будь-якої з 9-13, МІ відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 8 або будь- якої з 15 -20 та 22-24, або їх відповідні біологічні еквіваленти. Біологічний еквівалент УН або МІ. являє собою послідовність, яка містить задані амінокислоти та яка має 8095, 8595, 9095, 95905,
9895 або 9995 загальну ідентичність послідовності. Біологічний еквівалент 5ЕО ІЮ МО: 7, таким чином, може являти собою МН, яка має 8095, 8595, 9095, 9595, 9895 або 9995 загальну ідентичність послідовності по відношенню до 5ЕО ІЮ МО: 7, але яка зберігає СОК (5ЕО І МО: 1-6 або їх варіанти), та, необов'язково, зберігає одну або більше або всі зворотні мутації.
У одному варіанті реалізації МН містить амінокислотну послідовність БХЕО ІЮ МО: 7, а МІ. містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8. У одному варіанті реалізації МН містить амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 9, а Мі. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 8.
Крім того, фахівець у даній галузі техніки зрозуміє, що антитіла, описані у даному документі, можна модифікувати таким чином, що їх амінокислотна послідовність буде відрізнятися від природного зв'язувального поліпептиду, з якого вони отримані. Наприклад, поліпептид або амінокислотна послідовність, що походить із зазначеного білку, можуть бути подібні, наприклад, можуть мати певну процентну ідентичність по відношенню до вихідної послідовності, наприклад, можуть бути на бО9б, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095, 9595, 9895 або 9995 ідентичні вихідній послідовності.
У деяких варіантах реалізації антитіло містить амінокислотну послідовність або одну або більше груп, у нормі не асоційованих з антитілом. Типові модифікації докладно описані нижче.
Наприклад, антитіло згідно із даним винаходом може містити послідовність гнучкого лінкеру або може бути модифіковане шляхом додавання функціональної групи (наприклад, ПЕГ, лікарської речовини, токсину або мітки).
Антитіла, їх варіанти або похідні згідно із даним винаходом включають похідні, модифіковані, наприклад, шляхом ковалентного приєднання до антитіла молекули будь-якого типу, таким чином, що ковалентне приєднання не перешкоджає зв'язуванню антитіла з епітопом. Як приклад (але не з метою обмеження), антитіла можна модифікувати, наприклад, шляхом глікозилювання, ацетилування, ПЕГілювання, фосфорилювання, амідування, модифікації відомими захисними/блокувальними групами, протеолітичного розщеплення, приєднання до клітинного ліганду або іншого білку і т.д. Будь-яку із численних хімічних модифікацій можна виконати за допомогою відомих методик, включаючи специфічне хімічне розщеплення, ацетилування, формілювання, метаболічний синтез тунікаміцину і т.д., але не
Зо обмежуючись ними. Крім того, антитіла можуть містити одну або більше некласичних амінокислот.
У деяких варіантах реалізації антитіла можуть бути кон'юговані з терапевтичними агентами, проліками, пептидами, білками, ферментами, вірусами, ліпідами, модифікаторами біологічної відповіді, фармацевтичними агентами або ПЕГ.
Антитіла можуть бути кон'юговані або поєднані з терапевтичним агентом, який може включати детектуємі мітки, наприклад, радіоактивні мітки, імуномодулятор, гормон, фермент, олігонуклеотид, фотоактивний терапевтичний або діагностичний агент, цитотоксичний агент, який може являти собою лікарську речовину або токсин, контрастний агент для УЗД, нерадісоактивну мітку, їх комбінацію та інші подібні агенти, відомі у даній галузі техніки.
Антитіла можуть бути мічені детектованою міткою шляхом їхнього приєднання до хемілюмінесцентної сполуки. Потім присутність антиген-зв'зувального поліпептиду, міченого хемілюмінесцентною міткою, визначають шляхом детектування наявності люмінесценції, що виникає у ході хімічної реакції. Приклади особливо корисних хемілюмінесцентних сполук-міток являють собою люмінол, ізолюмінол, складний ефір акридинію, імідазол, сіль та оксалатний ефір акридинію.
Крім того, антитіла можна мітити атомами металу, здатними до флуоресценції, наприклад, 15222Еу, або інших металів сімейства лантаноїдів. Ці метали можна приєднати до антитіла з використанням груп, що утворюють хелати З металами, наприклад, діетилентриамінпентаоцтової кислоти (ДТПА) або етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА).
Методики кон'югування різних груп до антитіла добре відомі, див., наприклад, Агпоп еї аї., "Мопосіопаї! Апііродіе5 Еог Іттипоїагдеїіпуд ОЇ Огид5 Іп Сапсег Тпегару", у Мопосіопа! Апіїроадіе5
Апа Сапсег ТНегару, Веївтейй еї аї. (ед5.), рр. 243-56 (АІап В. І і55, Іпс. (1985); НеїЇб5ітот еї аї., "Апіїродіез Бог Огид Оеїїмегу", у СопігоПейа Огид Оеїїмегу (2па Еа.), Кобріпзоп еї аї., (еавз.), Магсеї реккег, Іпс., рр. 623- 53 (1987); ТПпогре, "Апіроду Саїтіег5 ОЇ Сушюохіс Адепів Іп Сапсег Тпегару:
А Кеміем/", у Мопосіопа! Апіїбодієз "84: Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріїсайопв5, Ріпопега еї аї. (еав5.), рр. 475-506 (1985); "Апаїубзі5, Кезий5, Апа Ешште Ргозресіме ОЇ Те Тнегарешіс О5е ОЇ
КаадіоїареІедй Апіїбоду Іп Сапсег Тпегару", у Мопосіопа! Апіїрбодіез Бог Сапсег Оеїесіоп Апа
ТНегару, ВаїЇдміп еї аї. (еа5.), Асадетіс Ргев55 рр. 303-16 (1985), та Тпогре еї аї., "Ппе Ргераганоп
Апа Суююхіс Ргорепіез ОЇ Апіїроду-Тохіп Сопіидаїев", Іттипої. Кем. (52:119-58 (1982)). 60 Полінуклеотиди, що кодують антитіла, та способи одержання антитіл
У даному винаході також запропоновані виділені полінуклеотиди або молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла, їх варіанти та похідні згідно із даним винаходом. Приклади полінуклеотидів включають 5ЕО ІЮ МО: 57-60. Полінуклеотиди згідно із даним винаходом можуть кодувати цілі варіабельні області важкого та легкого ланцюгу антиген-зв'язувальних поліпептидів, їх варіантів та похідних на одній і тій же молекулі полінуклеотиду або на окремих молекулах полінуклеотидів. Крім того, полінуклеотиди згідно із даним винаходом можуть кодувати фрагменти варіабельних областей важкого та легкого ланцюгу антиген-зв'язувальних поліпептидів, їх варіантів та похідних на одній і тій же молекулі полінуклеотиду або на окремих молекулах полінуклеотидів.
Способи одержання антитіл добре відомі у даній галузі техніки та описані у даному документі. У деяких варіантах реалізації як варіабельні, так і константні області антиген- зв'язувальних поліпептидів згідно із даним винаходу мають повністю людське походження.
Повністю людські антитіла можна одержати, використовуючи методики, описані у даній галузі техніки та у даному документі. Наприклад, повністю людські антитіла проти специфічного антигену можна одержати шляхом введення антигену у організм трансгенної тварини, модифікованої з метою продукції таких антитіл у відповідь на антигенну стимуляцію, причому ендогенні локуси зазначеної тварини відключені. Типові методики, які можна застосовувати для одержання таких антитіл описані у патентах США 6150584; 6458592; 6420140, повністю включених у даний документ за допомогою посилань.
У деяких варіантах реалізації отримані антитіла не викликають шкідливої імунної відповіді у тварини, що піддається лікуванню, наприклад, у людини. У одному варіанті реалізації антиген- зв'язувальні поліпептиди, їх варіанти або похідні згідно із даним винаходом модифікують для зниження їх імуногенності з використанням методик, визнаних у даній галузі техніки. Наприклад, антитіла можна гуманізувати, приматизувати, деімунізувати або одержати химерні антитіла.
Антитіла цих типів походять із антитіла тварини, що не є людиною, звичайно від антитіла миші або примата, та зберігають антиген-зв'язувальні властивості вихідного антитіла, однак є менш імуногенними для людей. Цього можна досягти різними способами, включаючи (а) повну трансплантацію варіабельних доменів нелюдського походження на константні області антитіла людини з одержанням химерних антитіл; (б) трансплантацію щонайменше фрагменту однієї або більше ділянок, що визначають комплементарність (СОК), нелюдського походження на каркасні та константні області антитіла людини зі збереженням або без збереження найважливіших каркасних залишків; або (с) повну трансплантацію варіабельних доменів нелюдського походження, але з їхнім маскуванням за рахунок секції, подібної послідовності антитіла людини, за допомогою заміни поверхневих залишків. Такі способи описані у роботах Могттізоп еї аї., Ргос.
Май. Асад. осі. ОБА 57:6851-6855 (1984); Моїгтізоп єї аїЇ.,, Адм. Іттипої. 4465-92 (1988);
Метовеуеєп єї а!., Зсіеєпсе 239:1534-1536 (1988); Радіап, Моїес. Іттип. 25:489-498 (1991); Радіап,
Моїес. Іттип. 31:169-217 (1994), та патентах США Мо 5585089, 5693761, 5693762 та 6190370, усі з яких повністю включені у даний документ за допомогою посилань.
Для зниження імуногенності антитіла також можна використовувати деїмунізацію. У даному документі термін «деїмунізація» включає зміну антитіла шляхом модифікації Т-клітинних епітопів (див., наприклад, публікації міжнародних патентних заявок Мо УМО/9852976 А1 та
УММО/0034317 А2). Наприклад, аналізують послідовності варіабельних областей важкого ланцюгу та легкого ланцюгу вихідного антитіла та становлять «карту» Т-клітинних епітопів людини кожної М-області із вказівкою місця розташування епітопів відносно ділянок, що визначають комплементарність (СОК), та інших ключових залишків у межах послідовності. Окремі Т-клітинні епітопи з карти Т-клітинних епітопів аналізують із метою виявлення альтернативних амінокислотних замін низького ризику з точки зору зміни активності остаточного антитіла.
Конструюють діапазон альтернативних послідовностей варіабельних областей важкого ланцюгу та легкого ланцюгу, що містять комбінації амінокислотних замін, а потім ці послідовності вбудовують у ряд зв'язувальних поліпептидів. Звичайно одержують від 12 до 24 варіантних антитіл та тестують їх на предмет зв'язування та/або функції. Потім клонують повні гени важкого та легкого ланцюгів, що містять модифіковані варіабельні області та константні області людини, у експресуючих векторах, та отримані плазміди вбудовують у лінії клітин для продукції повного антитіла. Потім антитіла порівнюють за допомогою відповідних біохімічних та біологічних аналізів та виявляють оптимальний варіант.
Специфічність зв'язування антиген-зв'язувальних поліпептидів згідно із даним винаходом можна визначити за допомогою аналізів іп міго, наприклад, імунопреципітації, радіоїмуноаналізу (КІА) або твердофазного імуноферментного аналізу (твердофазного ІФА).
У якості альтернативи, методики, описані для продукції одноланцюгових одиниць (патент 60 США Мо 4694778; Віга, Зсіепсе 242:423-442 (1988); Нивюп еї аї., Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА
55:5879- 5883 (1988); та Умага еї аїЇ., Маїшге 334:544-554 (1989)), можна пристосувати для продукції одноланцюгових одиниць згідно із даним винаходом. Одноланцюгові одиниці утворюються при приєднанні фрагментів важкого та легкого ланцюгу Ем-області через амінокислотний місток, що приводить до одержання одноланцюгового гібридного пептиду. Крім того, можна використовувати методики зборки функціональних Ему-фрагментів у Е. соїї (ЗКеїгта еї а!І., Зсієпсе 242: 1038-1041 (1988)).
Приклади методик, які можна використовувати для продукції одноланцюгових Ем (5сЕм) та антитіл, включають методики, описані у патентах США Мо 4946778 та 5258498; Нивогп еї аї.,
Меїподвз іп Епгутоїоду 203:46-88 (1991); 5пи еї аї., Ргос. Маї). сі. ОБА 90:1995-1999 (1993); та
ЗКета єї аїЇ., Зсівєпсе 240:1038-1040 (1988). Для деяких варіантів застосування, включаючи застосування антитіл іп мімо у організмі людини та аналізи детектування іп міго, може бути кращим використання химерних або гуманізованих антитіл або антитіл людини. Химерне антитіло являє собою молекулу, у якій різні фрагменти антитіла походять із різних видів тварин, наприклад, антитіла, що містять варіабельну область, що походять з моноклонального антитіла миші, та константну область імуноглобуліну людини. У даній галузі техніки відомі способи одержання химерних антитіл. Див., наприклад, Моггізоп, Зсієпсе 229:1202 (1985); ОЇ еї аї.,
Віоїеснпіднев 4:214 (1986); СіПез єї аї., У. Іттипої. Меїнод5 125:191-202 (1989); патенти США Мо 5807715, 4816567 і 4816397, які повністю включені у даний документ за допомогою посилань.
Гуманізовані антитіла являють собою молекули антитіл, що походять з антитіл видів тварин, що не є людиною, що зв'язують бажаний антиген, та які містять одну або більше ділянок, що визначають комплементарність (СОК), антитіла тварини, що не є людиною, та каркасні області з молекули імуноглобуліну людини. Часто каркасні залишки у людських каркасних ділянках можна заміняти відповідним залишком з антитіла-донора СОК з метою модифікації, переважно поліпшення зв'язування з антигеном. Ці каркасні заміни виявляють за способами, добре відомими у даній галузі техніки, наприклад, шляхом моделювання взаємодій СОК та каркасних залишків для виявлення каркасних залишків, важливих для зв'язування з антигеном, та порівняння послідовностей з метою виявлення незвичайних каркасних залишків у певних положеннях. (Див., наприклад, Ойееп еї аїЇ.,, патент США Мо 5585089; Кіесптапп еї аї., Майшге 332:323 (1988), повністю включені у даний документ за допомогою посилань). Антитіла можна гуманізувати із використанням різних методик, відомих у даній галузі техніки, включаючи, наприклад, трансплантацію СОК (ЕР 239400; публікацію РСТ УМО 91/09967; патенти США Мо 5225539, 5530101 і 5585089), облицювання або зміну поверхні (ЕР 592,106; ЕР 519,596; Радіап,
Моїіесшаг Іттипоіоду 28(4/5):489-498 (1991); БщапісКа єї аї., Ргоївїп Епаіпеєегіпу 7(6):805-814 (1994); Кодизка. єї аї., Ргос. Май). сі. ОБА 91:969-973 (1994)), та перекомбінування ланцюгів (патент США Мо 5565332), повністю включений у даний документ за допомогою посилання).
Повністю людські антитіла особливо бажані для терапевтичного лікування пацієнтів-людей.
Антитіла людини можна одержати за допомогою різних способів, відомих у даній галузі техніки, включаючи способи фагового дисплея з використанням бібліотек антитіл, отриманих з послідовностей імуноглобулінів людини. Див. також патенти США Мо 4444887 та 4716111; та публікації РСТ УМО 98/46645, УМО 98/50433, УМО 98/24893, УМО 98/16654, УМО 96/34096, УМО 96/33735 і МО 91/10741; кожна з яких повністю включена у даний документ за допомогою посилання.
Антитіла людини також можна одержувати з використанням трансгенних мишей, нездатних експресувати функціональні ендогенні імуноглобуліни, але здатних експресувати гени імуноглобуліну людини. Наприклад, комплекси генів важкого або легкого ланцюгу імуноглобуліну людини можна вбудувати у ембріональні стовбурові клітини миші випадковим чином або за допомогою гомологічної рекомбінації. У якості альтернативи, варіабельну область, константну область та О-область людини можна вбудувати у ембріональні стовбурові клітини миші на додаток до генів важкого та легкого ланцюгу людини. Гени важкого або легкого ланцюгу імуноглобуліну миші можна зробити нефункціональними окремо або одночасно шляхом вбудовування локусів імуноглобуліну людини шляхом гомологічної рекомбінації. Зокрема, гомозиготна делеції УН-області запобігає ендогенній продукції антитіл. Модифіковані ембріональні стовбурові клітини розмножують та вводять шляхом мікроін'єкції у бластоцисти, одержуючи химерних мишей. Потім химерних мишей схрещують, одержуючи гомозиготне потомство, яке експресує антитіла людини. Трансгенних мишей імунізують зворотним антигеном звичайним чином, наприклад, використовуючи повнорозмірний бажаний поліпептид- мішень або його фрагмент. Моноклональні антитіла проти антигену можна одержати з імунізованих трансгенних мишей з використанням звичайної гібридомної технології. Трансгени імуноглобулінів людини, які несуть трансгенні миші, реаранжуються під час диференціювання 60 В-клітин та надалі піддають перемиканню класу та соматичним мутаціям. Таким чином,
використання зазначеної методики дозволяє продукувати терапевтично придатні антитіла Ідс,
ІДА, І9М та ІЗЕ. Огляд цієї технології продукції антитіл людину див. у Гопрегуд апа Низ7аг Іпі.
Вему. Іттипої. 73:65-93 (1995). Докладне обговорення цієї технології продукції антитіл людини та моноклональних антитіл людини та протоколів продукції таких антитіл див., наприклад, у публікаціях РСТУМО 98/24893; УМО 96/34096; УМО 96/33735; патентах США Мо 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318 та 5939598, повністю включених у даний документ за допомогою посилань. Крім того, до виробництва антитіл людини проти обраного антигену з використанням технології, аналогічної вищеописаній, можна залучати такі компанії, як АБдепіх, Іпс. (Фримонт, штат Каліфорнія, США) та СсСепРіагт ( Сан-Хосе, штат Каліфорнія,
США).
Повністю людські антитіла, що розпізнають зворотний епітоп, також можна одержати за допомогою методики, яка називається «спрямованим відбором». У даному підході вибране моноклональне антитіло тварини, що не є людиною, наприклад, антитіло миші, використовують для керування відбором повністю людського антитіла, що розпізнає той же епітоп. (дезрег5 еї а!., Віо/Гесппоіїоду 72:899-903 (1988). Див. також патент США Ме 5565332, повністю включений у даний документ за допомогою посилання.)
У ще одному варіанті реалізації ДНК, що кодує бажані моноклональні антитіла, легко виділити та секвенувати за допомогою стандартних процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, здатних специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіл миші). Кращим джерелом такої ДНК слугують виділені та субклоновані клітини гібридоми. Після виділення ДНК можна помістити у експресуючі вектори, які потім трансфікують у прокаріотичні або еукаріотичні клітини-хазяї, наприклад, клітини Е. соїї, клітини СО5 мавпи, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) або клітини мієломи, які у інших умовах не продукують імуноглобулінів. Конкретніше, виділену ДНК (яка може бути синтетичною, як описано у даному документі) можна використовувати для клонування послідовностей константних та варіабельних областей для виробництва антитіл, як описано у Мем/тап еї аї., патенті США Мо 5658570, поданого 25 січня 1995 р., включеному у даний документ за допомогою посилання. По суті це передбачає виділення РНК із обраних клітин, перетворення її у кКДНК та ампліфікацію за допомогою ПЛР із використанням Ід-специфічних праймерів.
Зо Підходящі праймери для цієї мети також описані у патенті США Мо 5658570. У докладному обговоренні, наведеному нижче, трансформовані клітини, які експресують бажане антитіло, можна вирощувати у відносно великих кількостях для забезпечення клінічних та комерційних поставок імуноглобулінів.
Крім того, при використанні звичайної технології рекомбінантних ДНК один або більше СО антиген-зв'язувальних поліпептидів згідно із даним винаходом можна вставити у каркасні області, наприклад, у каркасні області людини для гуманізації антитіла тварини, що не є людиною. Каркасні області можуть бути природними або консенсусними каркасними областями та, переважно, каркасними областями людини (список каркасних областей людини див., наприклад, у Споїпіа еї аї., у. Мої. Віої. 278:457-479 (1998)). Полінуклеотид, отриманий шляхом об'єднання каркасних ділянок та СОК, переважно кодує антитіло, що специфічно зв'язується із щонайменше одним епітопом бажаного поліпептиду, наприклад, ГІЗНТ. Переважно одну або більше амінокислотних замін можна зробити у каркасних ділянках, та ці амінокислотні заміни переважно поліпшують зв'язування антитіла з його антигеном. Крім того, такі способи можна застосовувати для одержання амінокислотних замін або делецій одного або більше залишків цистеїну у варіабельній області що брало участь в утворенні внутрішньоланцюгового дисульфідного зв'язку для одержання молекул антитіл без одного або більше внутрішньоланцюгових дисульфідних зв'язків. Інші зміни полінуклеотидів входять до складу даного винаходу та відомі фахівцям у даній галузі техніки.
Крім того, можна застосовувати методики, розроблені для продукції «химерних антитіл» (Моїтізоп еї аї., Ргос. Май). Асай. сі. ОБА:851-855 (1984); Меибегдег єї аї!., Маїште 372:604-608 (1984); ТаКеда єї аї., Маште 314:452-454 (1985)) шляхом сплайсингу генів молекули антитіла миші, що має відповідну антигенну специфічність, разом з генами молекули антитіла людини, що має відповідну біологічну активність. У даному документі химерне антитіло являє собою молекулу, у якій різні фрагменти походять із антитіл різних видів тварин, наприклад, молекулу, що містить варіабельну область, що походить з моноклонального антитіла миші, та константну область імуноглобуліну людини.
Ще один високоефективний засіб одержання рекомбінантних антитіл описаний у роботі
Мемлтап, Віоїесппоїоду 10: 1455-1460 (1992). Конкретно, ця методика дозволяє одержувати приматизовані антитіла, що містять варіабельні домени мавпи та константні послідовності 60 людини. Це джерело повністю включене у даний документ за допомогою посилання. Крім того,
ця методика також описана у часто цитованих патентах США Мо 5658570, 5693780 та 5756096, кожен з яких включений у даний документ за допомогою посилання.
У якості альтернативи, лінії клітин, які продукують антитіло, можна відбирати та культивувати з використанням методик, добре відомих фахівцям. Такі методики описані у різних лабораторних настановах та первинних публікаціях. У зв'язку із цим методики, що підходять для застосування у даному винаході, описані у монографії Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоїіоду, Соїїдап еї аї!., Ед5., Стееп Рибіїзпіпуд Авз5осіаїе5 апа Уміїеу-Іпіегвсіепсе, Чопп УМПеу апа боп5, Мем/ МоїКк (1991), повністю включеній у даний документ за допомогою посилання разом з додатковими матеріалами.
Крім того, фахівцям у даній галузі техніки відомі стандартні методики, які можна використовувати для введення мутацій у нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло згідно із даним винаходом, включаючи сайт-специфічний мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез, які приводять до одержання амінокислотних замін, але не обмежуються ними. Варіанти (включаючи похідні) переважно кодують менше 50 амінокислотних замін, менше 40 амінокислотних замін, менше 30 амінокислотних замін, менше 25 амінокислотних замін, менше амінокислотних замін, менше 15 амінокислотних замін, менше 10 амінокислотних замін, менше 5 амінокислотних замін, менше 4 амінокислотних замін, менше З амінокислотних замін або менше 2 амінокислотних замін у порівнянні з еталонною варіабельною областю важкого ланцюгу, СОБ-НІ, СОВ-Н2, СОВ-НЗ, варіабельною областю легкого ланцюгу, СОБ-І 1, СОВ-І 2 20 або СОР-І3. У якості альтернативи можна ввести випадкові мутації протягом усієї кодуючої послідовності або її частини, наприклад, шляхом насичуючого мутагенезу та виконати скринінг біологічної активності серед отриманих мутантів з метою виявлення мутантів, що зберігають активність.
Способи лікування
Як описано у даному документі, антитіла, варіанти або похідні відповідно до даного винаходу можна застосовувати у різних способах лікування та діагностики.
Даний винахід додатково відноситься до терапевтичних способів на основі антитіл, що включають введення антитіл згідно із даним винаходом пацієнтові, наприклад, тварині, ссавцеві та людині для лікування одного або більше розладів або станів, описаних у даному документі.
Терапевтичні сполуки згідно із даним винаходом включають антитіла згідно із даним винаходом (включаючи їх варіанти та похідні, описані у даному документі) та нуклеїнові кислоти або полінуклеотиди, що кодують антитіла згідно із даним винаходом (включаючи їх варіанти та похідні, описані у даному документі), але не обмежуються ними.
Крім того, антитіла згідно із даним винаходом можна використовувати для лікування або пригнічення раку. Як представлено вище, СО7З може надекспресуватися у пухлинних клітинах.
СО73, що має пухлинне походження, може функціонувати як ектгофермент, який продукує позаклітинний аденозин, який стимулює ріст пухлини за рахунок обмеження протипухлинного Т- клітинного імунітету за допомогою сигнального шляху рецептору аденозину. Результати, отримані з використанням низькомолекулярних інгібіторів або моноклональних антитіл, мішенню яких є СЮО7З у моделях пухлин у мишей, вказують, що терапевтичний засіб, мішенню якого є СО7З3, являє собою важливу альтернативу та реалістичний підхід до ефективного контролю пухлинного росту. Зокрема, він сприяє дії терапевтичних засобів на основі Т-клітин, підсилюючи механізми адаптивної імунної відповіді, що може підсилювати дію Т-лімфоцитів, які інфільтрують пухлину, та приводить до поліпшення виживаності у пацієнтів з раком.
Відповідно, у деяких варіантах реалізації запропоновані способи лікування раку у пацієнта, який цього потребує. У одному варіанті реалізації спосіб передбачає введення пацієнту ефективної кількості антитіла відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах реалізації щонайменше одна з ракових клітин (наприклад, клітин строми) у пацієнта надекспресує СО73.
Необмежуючі приклади раку включають рак сечового міхура, рак молочної залози, рак ободової та прямої кишки, рак ендометрію, рак стравоходу, рак голови та шиї, рак нирок, лейкоз, рак печінки, рак легких, лімфому, меланому, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози та рак щитоподібної залози.
Клітинні терапевтичні засоби, та, конкретніше, терапевтичні засоби на основі Т-клітин з химерним антигенним рецептором (САК) також запропоновані у даному винаході. Можна використовувати підходящу Т-клітину, яка вступає у контакт із антитілом проти СО7З згідно із даним винаходом (або, у якості альтернативи, сконструйовану з метою експресії антитіла проти
СО згідно із даним винаходом). Після такого контакту або конструювання Т-клітину можна ввести пацієнтові з раком, який потребує лікування. У пацієнта з раком може бути рак будь- якого типу, описаного у даному документі. Т-клітина може являти собою, наприклад, Т- 60 лімфоцит, який інфільтрує пухлину, СЮО4- Т-клітину, СЮОв8я Т-клітину або їх комбінацію, без обмежень.
У деяких варіантах реалізації пацієнт із раком самостійно виділяв(ла) Т-клітину зі свого організму. У деяких варіантах реалізації Т-клітина надана донором або банком клітин. При виділенні Т-клітини з організму пацієнта з раком можна мінімізувати небажані імунні реакції.
Додаткові захворювання або стани, асоційовані з підвищеною виживаністю клітин, які можна лікувати, запобігати, діагностувати та/або прогнозувати з використанням антитіл або їх варіантів та похідних згідно із даним винаходом включають прогресування та/або метастазування злоякісних новоутворень та пов'язаних з ними порушень, наприклад, лейкозу (у тому числі гострих лейкозів (наприклад, гострого лімфобластного лейкозу, гострого мієлоцитарного лейкозу (включаючи мієлобластний, промієлоцитарний, мієломоноцитарний, моноцитарний лейкоз та еритролейкоз) та хронічних лейкозів (наприклад, хронічного мієлоцитарного (гранулоцитарного) лейкозу та хронічного лімфоцитарного лейкозу)), справжньої поліцитемії, лімфом (наприклад, хвороби Ходжкіна та неходжкінських лімфом), множинної мієломи, макроглобулінемії Вальденстрема, хвороби важких ланцюгів та щільних пухлин, включаючи, у числі іншого, саркоми та карциноми, наприклад, фібросаркому, міксосаркому, ліпосаркому, хондросаркому, остеогенну саркому, хордому, ангіосаркому, ендотеліосаркому, лімфангіосаркому, дімфангіоендотеліосаркому, синовіому, мезотеліому, саркому Юінга, лейоміосаркому, рабдоміосаркому, карциному товстої кишки, рак підшлункової залози, рак молочної залози, рак яєчників, рак передміхурової залози, плоскоклітинну карциному, базальноклітинну карциному, аденокарциному, карциному потових залоз, карциному сальних залоз, папілярну карциному, папілярні аденокарциноми, цистаденокарциному, медулярний рак, бронхогенну карциному, нирковоклітинну карциному, гепатому, карциному жовчного протоку, хоріокарциному, семіному, ембріональну карциному, пухлину Вільма, рак шейки матки, пухлину яєчок, карциному легень, дрібноклітинну карциному легень, карциному сечового міхура, епітеліальну карциному, гліому, астроцитому, медулобластому, краніофарингіому, епендимому, пінеалому, гемангіобластому, невриному слухового нерву, олігодендрогліому, менангіому, меланому, нейробластому та ретинобластому, але не обмежуються ними.
Конкретне дозування та схема лікування будь-якого конкретного пацієнта залежить від різних факторів, у тому числі конкретних використовуваних антитіл, їх варіантів та похідних, віку, маси тіла, загального стану здоров'я, статі та харчування пацієнта, а також часу введення, швидкості виведення, комбінації лікарських засобів та важкості конкретного захворювання, що піддається лікуванню. Експертна оцінка таких факторів медичними працівниками входить у звичайні навички фахівця у даній галузі техніки. Кількість також залежить від індивідуальних особливостей пацієнта, що піддається лікуванню, шляху введення, типу складу, характеристик використовуваної сполуки, важкості захворювання та бажаного ефекту. Використовувану кількість можна визначити за допомогою фармакологічних та фармакокінетичних принципів, добре відомих у даній галузі техніки.
Способи введення антитіл, їх варіантів включають інтрадермальне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне, підшкірне, інтраназальне, епідуральне та пероральне введення, але не обмежуються ними. Антиген-зв'язувальні поліпептиди або їх композиції можна вводити будь-яким зручним шляхом, наприклад, шляхом вливання або болюсної ін'єкції, шляхом всмоктування через епітеліальні або шкірно-слизуваті оболонки (наприклад, слизувату порожнини рота, слизувату заднього проходу або кишечнику і т.д.) та можна вводити разом з іншими біологічно активними агентами. Таким чином, фармацевтичні композиції, що містять антиген-зв'язувальні поліпептиди згідно із даним винаходом, можна вводити перорально, ректально, парентерально, інтрацистернально, інтравагінально, внутрішньочеревинно, зовнішньо (у вигляді порошків, мазей, крапель або трансдермального пластиру), букально або у вигляді перорального або назального аерозолю.
Термін «парентеральний» у даному документі відноситься до режимів введення, що включають внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоочеревинну, внутрішньогрудинну, підшкірну та внутрішньосуглобну ін'єкцію та вливання.
Введення може бути системним або місцевим. Крім того, може бути бажаним введення антитіл згідно із даним винаходом у центральну нервову систему за будь-яким підходящим шляхом, включаючи внутрішньошлуночкову або інтратекальну ін'єкцію; внутрішньошлуночкову ін'єсцію можна полегшити за допомогою внутрішньошлуночкового катетеру, наприклад, приєднаного до резервуару, наприклад, резервуару Оммайя. Крім того, можна використовувати пульмональне введення, наприклад, за допомогою інгалятору або розпилювача та складу з агентом, що сприяє утворенню аерозолю.
Може бути бажаним місцеве введення антиген-зв'язувальних поліпептидів або композицій 60 згідно із даним винаходом у область, яка потребує лікування; цього можна досягти, наприклад
(але не з метою обмеження), шляхом місцевого вливання під час хірургічної операції, зовнішнього нанесення, наприклад, у комбінації з рановою пов'язкою після хірургічної операції, шляхом ін'єкції за допомогою катетера, супозиторію або імплантату, причому зазначений імплантат являє собою пористий, непористий або желеподібний матеріал, у тому числі мембрани, наприклад, сіаластикові мембрани або волокна. При введенні білку, у тому числі антитіла згідно із даним винаходом, слід стежити за тим, щоб використовувати матеріали, які не абсорбують білок.
У ще одному варіанті реалізації антиген-зв'язувальний поліпептид або композицію можна доставляти у везикулах, зокрема, у ліпосомах (див. І апдег, 1990, Зсіепсе 249:1527-1533; Тгєаї еї аї., іп Гірозотев іп Ше Тнегару ої Іп'єсіби5 Різєазе апа Сапсег, І оре7-Вегезівіп апа РіаІег (єд5.), Гі55, Мем МоїКк, рр. 353-365 (1989); І оре2-Вегевівїп, іріа., рр. 317-327; див. головним чином там же).
У ще одному варіанті реалізації антиген-зв'язувальний поліпептид або композицію можна доставляти у системі з контрольованим вивільненням. У одному варіанті реалізації можна використовувати насос (див. 5ейоп, 1987, СКС Стії. Неї. Віотейд. Епд. 14:201; Виспмаїйа еї аї., 1980, Бигдегу 88:507; Зацаек еї аїЇ., 1989, М. Епої. У. Ме4а. 321:574). У ще одному варіанті реалізації можна використовувати полімерні матеріали (див. Меадіса! Арріїсайоп5 ої СопігоПеа
Веїєазе, Іапдег апа МУїзе (єдв.), САС Рге5., Воса Ваїоп, Ріа. (1974); Сопігоїей Огид
Віоамайаріїйу, Огид Ргодисі Оезідп апа Репоптапсе, Зтоїеп апа Ваї! (едв.), ММієу, Мем/ Мої (1984); Капдег апа Реррав, у., 1983, Масготої. сі. Кем. Масготої. Спет. 23:61; див. також Гему еї а!І., 1985, 5сієпсе 228:190; Юигіпуд єї аІ., 1989, Апп. Мешйгої. 25:351; Ноуага еї аї., 1989, 9.
Меийгозигуд. 71:105). У ще одному варіанті реалізації поблизу мішені терапевтичного засобу, наприклад, головного мозку, можна помістити систему з контрольованим вивільненням, таким чином, що потрібно вводити тільки частину системної дози (див., наприклад, сСооазоп, іп
Меадіса! Арріїсайопе ої СопігоПей ВРеїєазе, зирга, моіЇ. 2, рр. 115-138 (1984)). Інші системи з контрольованим вивільненням обговорюються у огляді І апдег (1990, Зсіеєпсе 249:1527-1533).
У конкретному варіанті реалізації де композиція згідно із даним винаходом містить нуклеїнову кислоту або полінуклеотид, що кодує білок, нуклеїнову кислоту можна вводити іп мімо з метою стимуляції експресії кодуємого білку шляхом конструювання його у складі відповідного вектору для експресії нуклеїнових кислот та введення таким чином, що він стає внутрішньоклітинним, наприклад, з використанням ретровірусного вектору (див. патент США Мо 4980286) або шляхом прямої ін'єкції або з використанням бомбардування мікрочастинками (наприклад, за допомогою генної пушки; Віоїїєтїє, ЮиропО, або покриття ліпідами або рецепторами клітинної поверхні або трансфікуючими агентами, або шляхом введення його у зв'язку з гомеобоксо-подібним пептидом, що свідомо проникає у ядро (див., наприклад, чоїїйої еї аІ,, 1991, Рос. Маї. Асай. сі. ОСОБА 88:1864-1868) і т.д. У якості альтернативи, нуклеїнову кислоту можна ввести всередину клітини та вбудувати у ДНК клітини-хазяїна для експресії шляхом гомологічної рекомбінації.
Кількість антитіл згідно із даним винаходом, яка може бути ефективна у лікуванні, пригніченні та профілактиці запального, імунного або злоякісного захворювання, порушення або стану, можна визначити за допомогою стандартних клінічних методик. Крім того, можна, необов'язково, застосовувати аналізи іп мійго, що полегшують визначення оптимального діапазону дози. Точна доза, застосовувана у складі, також залежить від шляху введення та важкості захворювання, порушення або стану, та її слід вибирати згідно з оцінкою практикуючого фахівця та з урахуванням обставин кожного пацієнта. Ефективні дози можна екстраполювати на основі кривих доза-відповідь, отриманих іп мійго або у тест-системах на основі тваринних моделей.
У якості загальної пропозиції, дозування антиген-зв'язувальних поліпептидів згідно із даним винаходом, що вводиться пацієнтові, звичайно становить від 0,1 мг/кг до 100 мг/кг маси тіла пацієнта, від 0,1 мг/кг до 20 мг/кг маси тіла пацієнта або від 1 мг/кг до 10 мг/кг маси тіла пацієнта. Звичайно антитіла людини мають більш тривалий час напівжиття у організмі людини у порівнянні з антитілами інших видів через імунну відповідь на чужорідні поліпептиди. Таким чином, часто можна використовувати більш низькі дозування та менш часте введення. Крім того, дозування та частоту введення антитіл згідно із даним винаходом можна зменшити за рахунок посилення поглинання та проникнення антитіл у тканині (наприклад, у головний мозок) за допомогою модифікацій, наприклад, ліпідування.
Способи лікування інфекційного або злоякісного захворювання, стану або порушення, що включають введення антитіла, його варіанту або похідної згідно із даним винаходом звичайно тестують іп міїго, а потім іп мімо у відповідній моделі тварини на предмет бажаної терапевтичної бо або профілактичної активності перед застосуванням на людях. Підходящі тваринні моделі, у тому числі трансгенні тварини, добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Наприклад, аналізи іп міго для демонстрації терапевтичного ефекту антиген-зв'язувального поліпептиду, описаного у даному документі, включають дію антиген-зв'язувального поліпептиду на лінію клітин або зразок тканини пацієнта. Дія антиген-зв'язувального поліпептиду на лінію клітин та/або зразок тканини можна визначити з використанням методик, відомих фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, аналізів, описаних у інших частинах даного документа. Відповідно до даного винаходу аналізи іп міїго, які можна застосовувати для визначення того, чи показане введення специфічного антиген-зв'язувального поліпептиду, включають аналізи у культурі клітин іп міїго, у яких зразок тканини пацієнта вирощують у культурі, піддають дії або іншим способом обробляють сполукою та спостерігають дію такої сполуки на зразок тканини.
Відомі різні системи доставки, які можна застосовувати для введення антитіла згідно із даним винаходом або полінуклеотиду, що кодує антитіло згідно із даним винаходом, наприклад, інкапсулювання у ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати сполуку, рецептор-опосередкований ендоцитоз (див., наприклад, УМи апа Уми, 1987, 9. ВіоІ. Снет. 262:4429-4432), конструювання нуклеїнової кислоти у складі ретровірусного або іншого вектору і т.д.
У додатковому варіанті реалізації композицію згідно із даним винаходом вводять у комбінації із протипухлинним агентом, противірусним агентом, антибактеріальним агентом або антибіотиком або протигрибковими агентами. Будь-який із цих агентів, відомих у даній галузі техніки, можна вводити у композиціях згідно із даним винаходом.
У ще одному варіанті реалізації композиції відповідно до даного винаходу вводять у комбінації з хіміотерапевтичним агентом. Хіміотерапевтичні агенти, які можна вводити з композиціями відповідно до даного винаходу, включають похідні антибіотиків (наприклад, доксорубіцин, блеоміцин, даунорубіцин та дактиноміцин); антиестрогени (наприклад, тамоксифен); антиметаболіти (наприклад, фторурацил, 5-РО, метотрексат, флоксуридин, інтерферон альфа-2о0, глутамінову кислоту, плікаміцин, меркаптопурин та 6б-тіогуанін); цитотоксичні агенти (наприклад, кармустин, ВСМИ, ломустин, ССМИ, арабінозид цитозину, циклофосфамід, естрамустин, гідроксисечовину, прокарбазин, мітоміцин, бусульфан, цисплатин та сульфат вінкристину); гормони (наприклад, медроксипрогестерон, натрій-фосфат
Зо естрамустину, етинілестрадіол, естрадіол, ацетат мегестролу, метилтестостерон, дифосфат діетилстильбестролу, хлортрианізен та тестолактон); похідні азотистого іприту (наприклад, мефален, хлорамбуцил, мехлоретамін (азотистий іприт) та тіотепу); стероїди та комбінації (наприклад, натрій-фосфат бетаметазону); та інші агенти (наприклад, дикарбазин, аспарагіназу, мітотан, сульфат вінкристину, сульфат вінбластину та етопозид), але не обмежуються ними.
У додатковому варіанті реалізації композиції відповідно до даного винаходу вводять у комбінації з цитокінами. Цитокіни, які можна вводити з композиціями відповідно до даного винаходу, включають ІЛ-2, ІЛ-3, ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-7, ІЛ-10, ІЛ-12, ІЛ-13, ІЛ-15, антитіло проти сра40, СО40Ї. та ФНО-а, але не обмежуються ними.
У додаткових варіантах реалізації композиції відповідно до даного винаходу вводять у комбінації з іншими терапевтичними або профілактичними схемами, наприклад, променевою терапією.
Комбіновані терапевтичні засоби
Крім того, у даному винаході запропоновані комбіновані терапевтичні засоби, які включають застосування одного або більше антитіл проти СО7З3 відповідно до даного винаходу разом з другим опротираковим (хіміотерапевтичним) агентом. Хіміотерапевтичні агенти можна підрозділяти відповідно до їх механізму дії, наприклад, на наступні групи: -антиметаболіти/протиракові агенти, наприклад, аналоги піримідину флоксуридин, капецитабін та цитарабін; -аналоги пурину, антагоністи фолату та споріднені інгібітори; -антипроліферативні/"антимітотичні агенти, включаючи природні продукти, наприклад, алкалоїди барвінку (вінбластин, вінкристин), та агенти, які руйнують мікротрубочки, наприклад, таксан (паклітаксел, доцетаксел), вінбластин, нокодазол, епотилони, вінорелбін (МАМЕЇ! ВІМЕФ) та епіподофілотоксини (етопозид, теніпозид); -агенти, які пошкоджують ДНК, наприклад, актиноміцин, амсакрин, бусульфан, карбоплатин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамід, (СУТОХАМФ), дактиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, епірубіцин, іфосфамід, мелфалан, мерхлоретамін, мітоміцин, мітоксантрон, нітрозосечовину, прокарбазин, таксол, таксотер, теніпозид, етопозид та триетилентіофосфорамід; -антибіотики, наприклад, дактиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, ідарубіцин, бо антрацикліни, мітоксантрон, блеоміцини, плікаміцин (мітраміцин) та мітоміцин;
-ферменти, наприклад, І -аспарагіназу, яка системно метаболізує І-аспарагін та позбавляє від нього клітини, нездатні синтезувати власний аспарагін; -антитромбоцитарні агенти; -антипроліферативні/антимітотичні алкілуючі агенти, наприклад, похідні азотистого іприту, циклофосфамід та аналоги (мелфалан, хлорамбуцил, гексаметилмеламін та тіотепу), алкілпохідні нітрозосечовини (кармустин) та аналоги, стрептозоцин та триазени (дакарбазин); -антипроліферативні/антимітотичні антиметаболіти, наприклад, аналоги фолієвої кислоти (метотрексат); -координаційні комплекси платини (цисплатин, оксаліплатин та карбоплатин), прокарбазин, гідроксисечовину, мітотан та аміноглутетимід; -гормони, аналоги гормонів (естроген, тамоксифен, гозерелін, бікалутамід та нілутамід) та інгібітори ароматази (летрозол та анастрозол); -антикоагулянти, наприклад, гепарин, синтетичні солі гепарину та інші інгібітори тромбіну; -фібринолітики, наприклад, активатор плазміногену тканинного типу, стрептокіназу, урокіназу, аспірин, дипіридамол, тиклопідин та клопідогрель; -антиміграційні агенти; -антисекреторні агенти (брефелдин); -імунодепресанти - такролімус, сіролімус, азатіоприн та мікофенолат; -сполуки (ТМР-470, геністеїн) та інгібітори факторів росту (інгібітори фактору росту ендотелію судин та інгібітори фактору росту фібробластів); -блокатори рецептору ангіотензину, донори оксиду азоту; -антисмислові олігонуклеотиди; -антитіла, наприклад, трастузумаб та ритуксимаб; -інгібітори клітинного циклу та індуктори диференціювання, наприклад, третиноїн; -інгібітори, інгібітори топоїзомерази (доксорубіцин, даунорубіцин, дактиноміцин, еніпозид, епірубіцин, етопозид, ідарубіцин, іринотекан, мітоксантрон, топотекан та іринотекан) та кортикостероїди (кортизон, дексаметазон, гідрокортизон, метилпреднізолон, преднізон та преднізолон); -інгібітори кіназ сигнальних шляхів факторів росту;
Зо -індуктори дисфункції; -токсини, наприклад, холерний токсин, рицин, екзотоксин Рхейдотопав, аденілатциклазний токсин ВогаєїейНа репив5і5, дифтерійний токсин та активатори каспази; -та хроматин.
Додаткові приклади хіміотерапевтичних агентів включають: -алкілуючі агенти, наприклад, тіотепу та циклофосфамід (СУТОХАМФ); -алкілсульфонати, наприклад, бусульфан, імпросульфан та піпосульфан; -азиридини, наприклад, бензодопу, карбоквон, метуредопу та уредопу; -етиленіміни та метиламеламіни, у тому числі алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід та триметилмеламін; -ацетогеніни, особливно буллатацин та буллатацинон; -камптотецин, включаючи синтетичний аналог топотекан; -бріостатин; -калістатин; -00-1065, включаючи його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин та бізелезин; -криптофіцини, зокрема, криптофіцин 1 та криптофіцин 8; -доластатин; -дуокарміцин, включаючи синтетичні аналоги КУУ-2189 та СВІ-ТМІ; -елеутеробін; -панкратистатин; -саркодиктиїн; -спонгістатин; -похідні азотистого іприту, наприклад, хлорамбуцил, хлорнафазин, циклофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід та урациловий іприт; -похідні нітрозосечовини, наприклад, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин та ранімустин; -антибіотики, наприклад, ендінові антибіотики (наприклад, каліхеміцин, особливо каліхеміцин гама-і! та каліхеміцин фі-І1), динеміцин, у тому числі динеміцин А, бісфосфонати, наприклад, клодронат, еспераміцин, неокарциностатин-хромофор та споріднені бо хромопротеїнові енедиїнові антибіотики-хромофори, аклациномізини, актиноміцин, антраміцин,
азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карцинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, б-діазо-5-оксо-Ї-норлейцин, доксорубіцин (включаючи морфоліндоксорубіцин, ціанморфоліндоксорубіцин, 2-піроліндоксорубіцин та дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, наприклад, мітоміцин С, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, порфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; -антиметаболіти, наприклад, метотрексат та 5-фторурацил (5-Е)); -аналоги фолієвої кислоти, наприклад, демоптерин, метотрексат, птероптерин та триметрексат; -аналоги пурину, наприклад, флударабін, б-меркаптопурин, тіамніприн, тіогуанін; -аналоги піримідину, наприклад, анцитабін, азацитидин, б-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксиуридин, доксифлуридин, еноцитабін та флоксуридин; -андрогени, наприклад, калустерон, дромостанолону пропіонат, епітіостанол, мепітіостан та тестолактон; -антиадреналові агенти, наприклад, аміноглутетимід, мітотан та трилостан; -компенсатори фолієвої кислоти, наприклад, фолінієву кислоту; -трихотецени, особливо токсин Т-2, верракурин А, роридин А та ангвідин; -таксоїди, наприклад, паклітаксел (ТАХОЇ Ф) та доцетаксел (ТАХОТЕКЕФ); -аналоги платини, наприклад, цисплатин та карбоплатин; -ацеглатон; альдофосфамідглікозид; амінолевулінову кислоту; енілураціл; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатрексат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елформітин; еліптинію ацетат; епотилон; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лейковорин; лонідамін; майтанзиноїди, наприклад, майтанзин, та анзамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; фторпіримідин; фолінієву кислоту; подофілінову кислоту; 2-етилгідразид; прокарбазин; полісахарид-К (РБК); разоксан; ризоксин; сизофуран; спірогерманій; тенуазонієву кислоту; триазиквон; 2,22"-трихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбазин; манномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ага-С"); циклофосфамід; тиотепу; хлорамбуцил; гемцитабін (ЗЕМ2АНКФ); 6-
Зо тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; вінбластин; платину; етопозид (МР-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін (МАМЕЇ ВІМЕФ); новантрон; теніпозид; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселоду; ібандронат; СРТ-11; інгібітор топоїзомерази КЕ5 2000; дифторметилорнітин (ОЕМО); ретиноїди, наприклад, ретиноєву кислоту; капецитабін; РОЇ РІК (фторурацил, лейковорин та іринотекан); -та фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої із вишезазначених сполук.
Крім того, визначення "хіміотерапевтичного агенту" включає антагоністи гормонів, наприклад, антиестрогени та селективні модулятори рецепторів естрогенів (ЗЕКМ), інгібітори ароматази, антиандрогени та фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої із вищевказаних сполук, що регулюють або інгібують дію гормонів на пухлини.
Приклади антиестрогенів та 5ЕКМ включають, наприклад, тамоксифен (у тому числі
МОГ МАОЕХ"М), ралоксифен, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен,
Гм117018, онапристон та тореміфен (РАКЕБЗТОМЄ).
Інгібітори ароматази регулюють продукцію естрогенів у наднирковиках. Приклади включають 4(5)-імідазоли, аміноглутетимід, ацетат мегестролу (МЕСАСЕ?), екземестан, форместан, фадрозол, ворозол (КІМІЗОКУ), летрозол (РЕМАКАЗ) та анастрозол (АКІМІОЕХЗУ).
Приклади антиандрогенів включають флутамід, нілутамід, бікалутамід, лейпролід та гозерелін.
Приклади хіміотерапевтичних агентів також включають антиангіогенні агенти, у тому числі ретиноєву кислоту та її похідні, 2-метоксиестрадіол, АМСІО5ТАТІМУ, ЕМОО5ТАТІМЕ, сурамін, скваламін, тканинний інгібітор металопротеїнази-1, тканинний інгібітор металопротеїнази-2, інгібітор-1 активатору плазміногену, інгібітор-2 активатору плазміногену, хрящовий інгібітор, паклітаксел (наб-паклітаксел), тромбоцитарний фактор 4, сульфат протаміну (клупеїн), сульфатовані похідні хітину (отримані із панцирів краба-стригуна), сульфатований полісахаридно-пептидоглікановий комплекс (5р-ро), ставроспорин, модулятори метаболізму матриксу, у тому числі аналоги проліну ((І-азетидин-2-карбонову кислоту (ГАСА)), цис- гідроксипролін, а,І-3,4-дегідропролін, тіапролін, с,а-дипіридил, бета-амінопропіонітрилу фумарат, 4-пропіл-5-(4-піридиніл)-2(3п)-оксазолон, метотрексат, мітоксантрон, гепарин, інтерферони, 2 макроглобулін сироватки, інгібітор металопротеїнази-3 курки (СПІМР-3), хімостатин, тетрадекасульфат бета-циклодекстрину, епонеміцин, фумагілін, тіомалат золота- бо натрію, а-пеніциламін, бета-1-антиколагеназу сироватки, альфа-2-антиплазмін, бісантрен,
лобензарит динатрію, динатрієва сіль п-2-карбоксифеніл-4-хлорантронілової кислоти або "ССА", талідомід, ангіостатичний стероїд, карбоксиаміноїмідазол та інгібітори металопротеїназ, наприклад, ВВ-94, але не обмежуються ними. Інші антиангіогенні агенти включають антитіла, переважно моноклональні антитіла проти ангіогенних факторів росту: бета-ФРФ, альфа-ФРФ,
ФРФ-5, ізоформ ФРЕС, ФРЕС-С, ФРГ/ФР та Апд-1/Апа-2.
Приклади хіміотерапевтичних агентів також включають протифіброзні агенти, у тому числі такі сполуки, як бета-амінопропіонітрил (ВАРМ), а також сполуки, описані у патенті США Мо 4965288 (Раїїгеутанп, еї а1.), який відноситься до інгібіторів лізилоксидази та їх застосування для лікування захворювань та станів, асоційованих з патологічним накопиченням колагену, та у патенті США Мо 4997854 (Кадап еї аїІ.), який відноситься до сполук, які інгібують ОХ, для лікування різних патологічних фіброзних станів, включених у даний документ за допомогою посилання, але не обмежуються ними. Інші типові інгібітори описані у патенті США Мо 4943593 (Райгеутап сеї а!), який відноситься до таких сполук, як 2-ізобутил-З-фтор-, хлор- або бромаліламін, патентах США Ме 5021456 (Райеутап еї а!.), 5059714 (Райеутанп еї аі.), 5120764 (Мссагівпу єї аІ.), 5182297 (Райгеутап еї аї.), 5252608 (Райгеутап еї а)ї.), які відносяться до 2-(1- нафтилоксиметил)-3-фтораліламіну, та публікації патенту США Мо 2004/0248871 (Рагіапеї еї а1.), які включені у даний документ за допомогою посилання.
Типові антифіброзні агенти також включають первинні аміни, що реагують із карбонільною групою активного центру лізилоксидаз, та, конкретніше, аміни, які після зв'язування з карбонільною групою, утворюють продукт, стабілізований резонансом, наприклад, наступні первинні аміни: етиленамін, гідразин, фенілгідразин та їх похідні; семікарбазид та похідні сечовини; амінонітрили, наприклад, ВАРМ або 2-нітроетиламін; ненасичені або насичені галогеновані аміни, наприклад, 2-брометиламін, 2-хлоретиламін, 2-трифторетиламін, 3- бромпропіламін та р-галобензиламіни; та лактон селенгомоцистеїну.
Інші антифіброзні агенти являють собою агенти, які утворюють хелати з міддю, здатні або не здатні проникати у клітину. Типові сполуки включають непрямі інгібітори, які блокують альдегідні похідні, які утворюються при окисному дезамінуванні лізильних та гідроксильних залишків лізилоксидазами. Приклади включають тіоламіни, зокрема, Ю-пеніциламін та його аналоги, наприклад, 2-аміно-5-меркапто-5-метилгексанову кислоту, р-2-аміно-3З-метил-3-((2-
Зо ацетамідетил)дитіо)бутанову кислоту, р-2-аміно-3-метил-3-((2-аміноетил)дитіо)бутанову кислоту, 4-(р-1-диметил-2-аміно-2-карбоксиетил)дитіо)-бутансульфурат натрію, 2- ацетамідетил-2-ацетамідетантіолсульфанат та тригідрат 4-меркаптобутансульфінату натрію.
Приклади хіміотерапевтичних агентів також включають імунотерапевтичні агенти, включаючи терапевтичні антитіла, які підходять для лікування пацієнтів, але не обмежуючись ними. Деякі приклади терапевтичних антитіл включають симтузумаб, абаговомаб, адекатумумаб, афутузумаб, алемтузумаб, алтумомаб, аматуксимаб, анатумомаб, арцитумомаб, бавітуксимаб, бестумомаб, бевацизумаб, біватузумаб, блінатумомаб, брентуксимаб, сантузумаб, катумаксомаб, цетуксимаб, цитатузумаб, циксутумумаб, кліватузумаб, конатумумаб, даратумумаб, дрозитумаб, дуліготумаб, дусигітумаб, детумомаб, дацетузумаб, далотузумаб, екромексимаб, елотузумаб, енситуксимаб, ертумаксомаб, етарацизумаб, фарлетузумаб, фіклатузумаб, фігітумумаб, фланвотумаб, футуксимаб, ганітумаб, гемтузумаб, гірентуксимаб, глембатумумаб, ібритумомаб, іговомаб, імгатузумаб, індатуксимаб, інотузумаб, інтетумумаб, іпілімумаб, іратумумаб, лабетузумаб, лексатумумаб, лінтузумаб, лорвотузумаб, лукатумумаб, мапатумумаб, матузумаб, мілатузумаб, мінретумомаб, мітумомаб, моксетумомаб, нарнатумаб, наптумомаб, нецитумумаб, німотузумаб, нофетумомаб, окаратузумаб, офатумумаб, оларатумаб, онартузумаб, опортузумаб, ореговомаб, панітумумаб, парсатузумаб, патритумаб, пемтумомаб, пертузумаб, пінтумомаб, притумумаб, ракотумомаб, радретумаб, рилотумумаб, ритуксимаб, робатумумаб, сатумомаб, сибротузумаб, силтуксимаб, солітомаб, такатузумаб, таплітумомаб, тенатумомаб, тепротумумаб, тигатузумаб, тоситумомаб, трастузумаб, тукотузумаб, ублітуксимаб, велтузумаб, ворсетузумаб, вотумумаб, залутумумаб,
СС49 та ЗЕ8. Ритуксимаб можна застосовувати для лікування рефрактерних В-клітинних злоякісних захворювань, у тому числі лімфоми пограничної зони, МУМ, ХЛЛ та дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми. Комбінація ритуксимабу та хіміотерапевтичних агентів є особливо ефективною.
Типові терапевтичні антитіла можна додатково мітити або об'єднувати з радіоізотопними частинками, наприклад, індієм-111, ітрієм-90 або йодом- 131.
У одному варіанті реалізації додатковий терапевтичний агент являє собою алкілуючий агент - похідну азотистого іприту. Необмежуючі приклади алкілуючих агентів - похідних азотистого іприту включають хлорамбуцил. бо У одному варіанті реалізації сполуки та композиції, описанні у даному документі, можна використовувати або об'єднувати з одним або більше додатковими терапевтичними агентами.
Зазначені один або більше терапевтичних агентів включають інгібітор АБІ, активовану СОС- кіназу (АСК), рецептор аденозину А2В (А2В), кіназу, яка регулює сигнальний шлях апоптозу (АЗК), аврора-кіназу, тирозинкіназу Брутона (ВТК), ВЕТ-бромодомен (ВКО), наприклад, ВКОЯ4, с-Кії, с-Меї, СОК-активуючу кіназу (САК), кальмодулін-залежну протеїнкіназу (СамкК), циклін- залежну кіназу (СОК), казеїнкіназу (СК), рецептор з дискоїдиновим доменом (0ОК), рецептори епідермального фактору росту (ЕСЕК), кіназу фокальної адгезії (БАК), ЕЙ-3, ЕУМ, кіназу глікогсенсинтази (5З5К), НСК, гістондеацетилазу (НОАС), ІКК, наприклад, ІкКкКреє, ізоцитратдегідрогеназу (ІОН), наприклад, ІОНІ, янус-кіназу ФАК), КОК, лімфоцитспецифічну протеїнтирозинкіназу (І СК), білок лізилоксидази, білок, подібний до лізилоксидази (ОХ), І УМ, металопротеазу матриксу (ММР), МЕК, мітоген-активовану протеїнкіназу (МАРК), МЕКУ, МРМ-
АЇ К, кіназу р38, тромбоцитарний фактор росту (ТФР), кіназу фосфорилази (РК), роіо-подібну кіназу (РІК), фосфатидилінозит-3-кіназу (РІЗК), протеїнкіназу (РК), наприклад, протеїнкіназу А,
В та/або С, РУК, тирозинкіназу селезінки (УК), серін/треонінкіназу ТРІ2, серін/треонінкіназу
ЗТК, білок передачі сигналу та активатор транскрипції (5ТАТ), ЗКС, серін/треонінпротеїнкіназу (ТВК), наприклад, ТВКІ1, ТІЕ, тирозинкіназу (ТК), рецептор фактору росту ендотелію судин (МЕСЕК), ХЕЗ або будь-яку їх комбінацію, але не обмежуються ними.
Інгібітори А5К включають інгібітори АБК1. Приклади інгібіторів АБК1Т включають інгібітори, описані у ЛО 2011/008709 (Сйеай 5сіепсез) та УМО 2013/112741 (Сієай Зсіепсе5), але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів ВТК включають ібрутиніб, НМ71224, ОМО-4059 та СС-292, але не обмежуються ними.
Інгібітори СОК включають інгібітори ООКІ та/або 0ОК2. Приклади інгібіторів. СОК включають інгібітори, описані у МО 2014/047624 (Сіїєай бсіеєпсе5), 05 2009/0142345 (Такеда
Ріпаптасешіса!), 05 2011/0287011 (Опсотей РНаптасешісаіє), УМО 2013/027802 (Спидаї
РПпагтасеціїсаї) та УМО 2013/034933 (Ітрегіа! Іппомайіоп5), але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів НАС включають прациностат та панобіностат, але не обмежуються ними.
Інгібітори ЗАК включають ЧЗАКІ, ЗЧАК2 та/або ЗАКЗ. Приклади інгібіторів "АК включають
Зо філготиніб, руксолітиніб, федратиніб, тофацитиніб, барицитиніб, леставртиніб, пакритиніб,
ХІ 019, А2О1480, ІМСВО39110, І 2784544, ВМ5911543 та М5018, але не обмежуються ними.
Інгібітори ГОХІ. включають інгібітори ГОХІ1, ГОХІ2, І ОХІ З, І ОХІ 4 та/або І ОХІ 5. Приклади інгібіторів ГОХІ. включають антитіла, описані у УМО 2009/017833 (Атгтевіо Віозсіепсе5), але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів ЇОХІ2 включають інгібітори, описані у УМО 2009/017833 (Агтевюо
Віозсіеєпсе5), МО 2009/035791 (Аттезію Віозсіепсе5) та УМО 2011/097513 (Сійеаа Віоіодісв5), але не обмежуються ними.
Інгібітори ММР включають інгібітори ММР з 1 по 10. Приклади інгібіторів ММРО включають маримастат (8В-2516), ципемастат (Ко 32-3555) та інгібітори, описані у УМО 2012/027721 (Сіїєай
Зсіепсе5), але не обмежуються ними.
Інгібітори РІЗК включають інгібітори РІЗКУ, РІЗКО, РІЗКД, РІЗКа та/або загальний інгібітор
РІЗК. Приклади інгібіторів РІЗК включають вортманнін, ВКМ120, СН5132799, ХІ 756 та 50С- 0980, але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів РІЗКУ включають 25ТК474, АБ252424, І 294002 та Т100115, але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів РІЗКО включають РІЗК ІІ, ТОК-1202, АМО-319, й45К2269557, Х-339, Х- 414, ВРБОЗ0О, КАВНА141, ХІ 499, ОХМ1114А, ІРІ-145, ІРІ-443 та сполуки, описані у УМО 2005/113556 (ІСО5), МО 2013/052699 (Сіїєай Саїївіода), УМО 2013/116562 (Сіївєай Саїївіюда), УМО 2014/100765 (СсСієай Саїївіода), УМО 2014/100767 (Сіїеай Саїїзіода) та МО 2014/201409 (Сйеаа 5сіепсев5), але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів РІЗКВ включають 55К2636771, ВАМ 10824391 та ТОХ221, але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів РІЗКа включають бупарлісиб, ВАХ 80-6946, ВУ 719, РХ-866, НС7604,
МІ М1117, М/Х-037, АЕ2А-129 та РА799, але не обмежуються ними.
Приклади загальних інгібіторів РІЗК включають І У294002, ВЕ27235, ХІ 147 (БАК245408) та 2000-0941, але не обмежуються ними.
Приклади інгібіторів ЗУК включають таматиніб (К406), фостаматиніб (788), РЕТО62607,
ВАМУ-61-3606, ММР-ОАВ 205 АА, К112, К343 та сполуки, описані у патенті США Мо 8450321 (Сієай Соппесііїси), але не обмежуються ними. бо Мішенню ТК! можуть являться рецептори епідермального фактору роста (ЕОЕК) та рецептори фактору роста фібробластів (ФРФ), тромбоцитарного фактору росту (ТФР) та фактору роста ендотелію судин (ФРЕС). Приклади ТКІ, мішенню яких є ЕСЕК, включають гефітиніб та ерлотиніб, але не обмежуються ними. Сунітиніб є необмежуючим прикладом ТКІ, мішенню якого є рецептори ФРФ, ТФР та ФРЕС.
Комбінації з інгібітором ключового компоненту імунної відповіді
У деяких варіантах реалізації антитіла проти СО7З відповідно до даного винаходу можна застосовувати разом з інгібітором ключового компоненту імунної відповіді. Ключові компоненти імунної відповіді являють собою молекули імунної системи, які включають (костимулюючі молекули) або виключають сигнал. Багато видів раку захищаються від імунної системи, інгібуючи сигнал Т-клітин. Інгібітор ключового компонента імунної відповіді може допомогти зупинити такий захисний механізм клітин. Мішенню інгібітору ключового компонента імунної відповіді може бути будь-яка або будь-які з наступних молекул ключових компонентів - РО-1,
РО-І1, СТІ А-4, І дО-3 (також відомого як СО223), СО028, СО122, 4-188 (також відомого як
СО0137) або ВТГА (також відомого як СО272).
Білок-1 запрограмованої загибелі Т-клітин (РО-1) являє собою трансмембранний білок, який знаходиться на поверхні Т-клітин, який при зв'язуванні з лігандом-1 білку запрограмованої загибелі Т-клітин (РО-І1) на пухлинних клітинах приводить до супресії активності Т-клітин та зниження цитотоксичності, опосередкованої Т-клітинами. Таким чином, РО-1 та РО-І1 є інгібіторами імунної системи або «вимикачами» ключового компоненту імунної відповіді. Типові інгібітори РО-1 включають, без обмежень, ніволумаб (Орадїімо) (ВМ5-936558), пембролізумаб (Кеуїгида), підилізумаб, АМР-224, МЕ0ІО680 (АМР-514), РОВООТ, МРОЇ 3280А, МЕ0І4736, ВМ5- 936559 та М5ВО0010718С.
Ліганд-1 білку запрограмованої загибелі клітин (РО-1І1), також відомий як кластер диференціювання 274 (СО274) або гомолог-1 В7 (В7-НІ) являє собою білок, який у людей кодує ген СО274. Необмежуючі приклади інгібіторів РО-Ї1 включають атезолізумаб (Тесепігід), дурвалумаб (МЕ0І4736), авелумаб (М580010718С), МРОІ 3280А, ВМ5935559 (МОХ-1105) та
АМР-224.
СТІ А-4 являє собою білковий рецептор, який пригнічує імунну систему. Необмежуючі приклади інгібіторів СТІ А-4 включають іпілімумаб (Уегмсу) (також відомий як ВМ5-734016, МОХ-
Зо 010, МОХ-101) та тремелімумаб (раніше відомий як тицілімумаб, СР-675206).
Ген З активації лімфоцитів (ГАС-3) є рецептором ключового компоненту імунної відповіді на поверхні клітин, що пригнічує імунну відповідь за рахунок дії на Тгед, а також прямого впливу на
СОВ8-- Т-клітини. Інгібітори ГАС-3 включають, без обмежень, І АС525 та/або ВМ5-986016.
СОр28 конститутивно експресується на майже всіх СО4-- Т-клітинах та приблизно на половині всіх СО8 Т-клітин та стимулює розмножені Т-клітин. Необмежуючі приклади інгібіторів СО28 включають ТОМ1412.
СО0122 посилює проліферацію ефекторних СОвж- Т-клітин. Необмежуючі приклади включають МКТК-214. 4-188 (також відомий як СО137) залучений у проліферацію Т-клітин. Відомо, що СО137- опосредованний сигнальний шлях також захищає Т-клітини та, зокрема, СО8- Т-клітини від загибелі клітин, індукованої активацією. РЕ-05082566, урелумаб (ВМ5-663513) та ліпокалін є прикладами інгібіторів СО137.
При використанні будь-якого із вищезазначених терапевтичних засобів антитіло проти СО7З можна вводити одночасно або окремо від іншого протиракового агенту. При окремому введенні антитіло проти СЮО7З можна вводити до або після іншого протиракового агенту.
Способи діагностики
Надекспресія СЮО7З спостерігається у деяких зразках пухлин, та пацієнти із клітинами, які надекспресують СО73, з великою ймовірністю будуть реагувати на терапевтичні засоби на основі антитіл проти СО7З згідно із даним винаходом. Відповідно, антитіла згідно із даним винаходом також можна використовувати у діагностичних або прогностичних цілях.
Зразок, який переважно містить клітину, можна одержати з організму пацієнта, який може бути пацієнтом з раком або пацієнтом, для якого бажано виконати діагностику. Клітина може являти собою клітину пухлинної тканини або блоку пухлини, зразку крові, зразку сечі або будь- якого зразку з організму пацієнта. При необов'язковій передпідготовці зразку зразок можна інкубувати із антитілом згідно із даним винаходом в умовах, що дозволяють антитілу взаємодіяти з білюоюм СО73, потенційно присутнім у зразку. Для детектування наявності білку
СО73 у зразку можна застосовувати такі способи, як твердофазний ІФА, що повністю використовують переваги антитіла проти СО73.
Наявність більюу СЮО7З у зразку (необов'язково у певній кількості або концентрації) можна 60 використовувати для діагностики раку, у якості вказівки на те, що пацієнт підходить для лікування із застосуванням антитіла, або у якості вказівки на те, що пацієнт реагував (або не реагував) на лікування раку. Для прогностичного способу детектування виконують один, два або більшу кількість разів на певних стадіях після ініціації лікування раку для вказівки на хід лікування.
Композиції
У даному винаході також запропоновані фармацевтичні композиції. Така композиція містить ефективну кількість антитіла та фармацевтично прийнятний носій. У деяких варіантах реалізації композиція додатково містить другий протираковий агент (наприклад, інгібітор ключового компоненту імунної відповіді).
У конкретному варіанті реалізації термін «фармацевтично прийнятний» позначає схвалений нормативно-правовим агентством федерального уряду або уряду штату або наведений у
Фармакопеї США або іншій загальновизнаній фармакопеї для застосування у тварин та, конкретніше, у людини. Крім того, «фармацевтично прийнятний носій» у загальному випадку являє собою нетоксичний твердий, напіврідкий або рідкий наповнювач, розріджувач, матеріал для інкапсуляції або допоміжний склад будь-якого типу.
Термін «носій» відноситься до розріджувача, ад'юванту, допоміжної речовини або середовища-носія, з яким вводять терапевтичний засіб. Такі фармацевтичні носії можуть являти собою стерильні рідини, наприклад, воду та масла, включаючи масла нафти, рослинного, тваринного або синтетичного походження, наприклад, арахісове масло, соєве масло, мінеральне масло, кунжутне масло і т.п. Вода є кращим носієм при внутрішньовенному введенні фармацевтичної композиції. Сольові розчини та водні розчини декстрози та гліцерину також можна використовувати у якості рідких носіїв, зокрема, для ін'єкційних розчинів. Підходящі фармацевтичні допоміжні речовини включають крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, борошно, крейду, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, гліцерин, пропіленгліколь, воду, етанол і т.п. За необхідності композиція також може містити невеликі кількості зволожувачів або емульгаторів або рн- буферних агентів, наприклад, ацетатів, цитратів або фосфатів. Крім того, передбачене застосування антибактеріальних агентів, наприклад, бензилового спирту або метилпарабенів; антиоксидантів, наприклад, аскорбінової кислоти або бісульфіту натрію; хелатоутворюючі агенти, наприклад, етилендіамінтетраоцтову кислоту; та агенти для регулювання тонічності, наприклад, хлорид натрію або декстрозу. Ці композиції можуть мати вигляд розчинів, суспензій, емульсій, таблеток, пігулок, капсул, порошків, складів з уповільненим вивільненням і т.п.
Композицію можна скласти у вигляді супозиторію з використанням традиційних зв'язувальних речовин та носіїв, наприклад, тригліцеридів. Склади для перорального застосування можуть містити стандартні носії, наприклад, маніт, лактозу, крохмаль, стеарат магнію, сахарин-натрій, целюлозу, карбонат магнію і т.д. фармацевтичного ступеню чистоти. Приклади підходящих фармацевтичних носіїв описані Е. МУ. Магііп у Кетіпдіоп'є Рпаптасешііса! 5сіепсе5, включеному у даний документ за допомогою посилання. Така композиція може містити терапевтично ефективну кількість антиген-зв'язувального поліпептиду, переважно у очищеній формі, разом з підходящою кількістю носія для одержання форми для належного введення пацієнтові. Склад повинен відповідати способу введення. Вихідний препарат можна помістити у ампули, одноразові шприци або флакони для багаторазового приймання зі скла або пластику.
У одному варіанті реалізації композицію складають відповідно до звичайних процедур у вигляді фармацевтичної композиції, пристосованої для внутрішньовенного введення людям.
Звичайно композиції для внутрішньовенного введення являють собою розчини у стерильному ізотонічному водному буфері. За необхідності композиція також може містити солюбілізуючий агент та місцевий анестетик, наприклад, лігнокаїн, для ослаблення болю у області ін'єкції. У загальному випадку інгредієнти вводять роздільно або у суміші один з іншим у складі лікарської форми, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату у герметичному контейнері, наприклад, ампулі або саше із вказівкою кількості активного агента.
Якщо композиція призначена для введення за допомогою вливання, її можна розлити у пляшку для вливання, що містить стерильну воду або фізіологічний розчин фармацевтичного ступеня чистоти. Якщо композицію вводять за допомогою ін'єкції, можна надати ампулу зі стерильною водою для ін'єкцій або фізіологічним розчином для змішування інгредієнтів перед введенням.
Сполуки згідно із даним винаходом можна скласти у нейтральній формі або формі солі.
Фармацевтично прийнятні солі включають солі, утворені аніонами, наприклад, соляної, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислот і т.д., та солі, утворені катіонами, наприклад, гідроксидами натрію, калію, амонію, кальцію, заліза (ІІ), ізопропіламіну, триетиламіну, 2- етиламінетанолу, гістидину, прокаїну і т.д. 60 ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Клоновані антитіла миші 101-Ми
У даному прикладі описаний процес одержання моноклонального антитіла миші проти СО7З3 людини з використанням гібридомної технології. Білок СО73 людини одержували з використанням рекомбінантної лінії клітин СНОКТ, які експресують СО7З (С073-СНОКТ). Для одержання моноклональних антитіл миші проти СО7З людини 6-3 тижневих самок мишей
ВАЇ В/с спочатку імунізували 1,5 х 107 клітин СО73-СНОКТІ. На 14 та 33 день після першої імунізації імунізованих мишей повторно імунізували 1,5 х 107 клітин СО73-СНОКІ. Для відбору мишей, які продукують антитіла, що зв'язуються з білюоом СО73, сироватку імунізованих мишей аналізували за допомогою твердофазного ІФА. Коротко, титраційні мікропланшети покривали білюм СО7З людини у концентрації 1 мкг/мл у РВЗ у об'ємі 100 мкл/лунку при кімнатній температурі (КТ) протягом ночі, а потім блокували 100 мкл/лунку 596 БСА. У кожну лунку вносили розведення плазми імунізованих мишей та інкубували протягом 1-2 годин при КТ.
Планшети промивали РВЗ/Тмееп та потім інкубували з антитілом проти до миші, кон'югованим з пероксидазою хріну (ПХ) протягом 1 години при КТ. Після промивання планшети проявляли субстратом АВТЗ та аналізували на спектрофотометрі при ОГ, рівній 405 нм. Мишей з достатніми титрами дос проти СО7З вдруге імунізували 50 мкг білюу СЮО73-Ес людини на 54 день після імунізації. Отриманих мишей використовували для злиття клітин. Супернатанти гібридом тестували на предмет наявності (до проти СО7З за допомогою твердофазного ІФА. Виявили вісім різних клонів гібридом, серед яких 101- Ми вибрали для подальшого аналізу.
Послідовність МН 101- Ми показано у таблиці 6 як ЗЕО ІЮ МО: 10, а послідовність МІ. - у таблиці 7 як ЗЕО ІО МО: 15. Відповідні послідовності ДНК показано у таблиці 10 як 5ЕО ІЮО МО: 57 та 58.
Приклад 2. Зв'язування 101-Ми з СО7З
У даному прикладі протестували зв'язування мАт миші 101-Ми проти СО73 людини з рекомбінантним білком СО7З3 людини (1 мкг/мл у 100 мкл) самим по собі або на поверхні клітин залежно від дози у ході твердофазного ІФА.
Титраційні мікропланшети покрили рекомбінантним білюм СО73 людини (Моморгоїеїп) у концентрації 1 мкг/мл у РВЗ протягом 2 год при кімнатній температурі (КТ). Після покриття антигеном лунки блокували РВЗ/0,0595 Тмееп (РВЗТ) з 195 БСА протягом 1 год при КТ. Після промивання лунок РВ5ЗТ у лунки додавали різні концентрації антитіл проти СО73З та інкубували
Зо протягом 1 год при КТ. Для детектування зв'язування антитіл додавали вторинні антитіла проти
Ес мишії, кон'юговані із ПХ (Чдаск5оп Іттипо Кезеагсі), а потім додавали флуорогенні субстрати (Коспе). Між усіма етапами інкубування лунки планшета тричі промивали РВ5Т. Флуоресценцію вимірювали на планшет-рідері ТЕСАМ Зресігайсог. мАті людини проти СО73 використовували у якості позитивного контролю. мАт1 одержували відповідно до послідовності, описаної у И52016/0194407. Результати для порівняння представлені на фіг. 1, де показано, що ЕС5О для 101-Ми становить 0,08 нМ, а ЕС5О для мАт!1 становить 0,03 НМ.
На фіг. 2 показані результати аналізу зв'язування з використанням лінії клітин раку яєчників людини (клітин ЗК-ОМ-3), які ендогенно експресують СО7З людини на поверхні. Після інкубування із зазначеними антитілами клітини зафарбовували різними концентраціями контрольного дО, антитіла миші проти СО7З (101-Ми) та еталонного антитіла (мАт1) при 42С протягом 30 хвил. Потім клітини тричі промивали РВ5 з наступним інкубуванням з АРС-міченим специфічним антитілом проти Ес миші (Іпмігодеп) при 4 "С протягом 30 хвил. Зв'язування вимірювали з використанням РАСзЗсСапіо (Весіоп-ОісКіп5оп). Як і на фіг. 1, на цих фігурах показано, що 101-Ми мало еквівалентну афінність зв'язування з СО73З у порівнянні з мАт1 (ЕС5О для 101-Ми становила 0,54 нм; ЕС50 для мАт1 становила 0,30 нм).
На фіг. З наведені графіки кінетики зв'язування 101-Ми та мАті з рекомбінантним СО73 людини (рекомбінантний СО7З людини використовували як аналізовану сполуку у послідовних концентраціях (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 нМ)). Аналіз кінетики зв'язування антитіла з антигеном виконували з використанням системи Віасоге Т200 за допомогою підходу на основі захоплення антитіла людини. до проти Ес миші іммобілізували на сенсорному чипі СМ5 згідно з інструкціями виробника. Тестоване антитіло вводили та захоплювали іммобілізованим Ід проти Ес людини. Потім окремо вводили послідовні концентрації антигену та реєстрували профіль зв'язування для кожної концентрації аналізованого антигену, відповідно. Систему аналізу регенерували шляхом ін'єкції 10 мМ гліцин-НСІ, рН 1,5 на 30 секунд. Рухомий буфер являв собою НВ5О-ЕР- (10 мМ НЕРЕ5, рН 7,4, 150 мМ Масі, З мМ ЕДТА та 0,0595 Р20).
Температура аналізу становила 25 "С, час асоціації та дисоціації дорівнював 180 та 600 секунд, відповідно. Дані Віасоге апроксимували за допомогою програмного забезпечення Віасоге Т200 емаІчайоп 1.0 відповідно до моделі зв'язування 1:11 з метою розрахунків констант швидкості бо асоціації (Ка) та дисоціації (Ка), а також константи рівноваги (Ко). На додаток до фіг. З деякі зведені дані представлені нижче у таблиці.
Приклад 3. Інгібування ферментативної активності СО7З за рахунок 101-Ми
У даному прикладі тестували здатність антитіла 101-Ми інгібувати ферментативну активність СЮО7 3.
Рекомбінантний білок СЮО7З людини (0,3 мкг/мл) інкубували у 96-лункових плоскодонних мікропланшетах у присутності різних доз антитіла проти СО7З або ізотипових контрольних Ат.
Планшети інкубували протягом 15 хвил. при 37 "С. Потім у кожну лунку додавали АТФ (100 мкм) та АМФ (100 мкм) та інкубували протягом ще 30 хвил. при 37 "С. У лунки додавали СеїїПіег-С1о, що містить люциферазу (Рготеда), та вимірювали інгібування випромінювання світла за допомогою люмінометру (МоїІесшціаг Оемісе).
Відомо, що надлишок АМФ блокує АТФ-залежну активність люциферази. Додавання СО73, який каталізує продукцію аденозину та неорганічного фосфату з АМФ, відновлювало люциферазну активність та випромінювання світла. Таким чином, антитіло, що блокує ферментативну активність СО73, може знижувати випромінювання світла. Процентну ферментативну активність оцінювали згідно з описом, наведеним нижче: Залишкову активність
СО73 розраховували у такий спосіб: (С0О73АтАТФіАМФ)-(АТФААМФІУ(СО73-АТФІАМФ)- (АТФААМФ)"100. Графік результатів наведений на фіг. 4, на якому показано, що на відміну від негативного контрольного ІдС, 101-Ми інгібувало ферментативну активність СО7З залежно від дози (ІС50 - 3,89 НМ).
СО7З-експресуючі клітини ЗК-ОМУ-3 висівали на 9б-лунковий планшет у кількості 1 х 105 клітин на лунку у присутності різних доз Ат проти СО7З або ізотипових контрольних Ат.
Планшети інкубували протягом 15 хвил. при 37 "С. У кожну лунку додавали АМФ (100 мкМ) та інкубували протягом 1 год. при 37 "С. Супернатанти збирали у новий 96-лунковий планшет та додавали АТФ до кінцевої концентрації 100 мкМ. Додавали реагент СейПТйетг-сІо (Рготеда) у співвідношенні 1:11 та визначали ферментативну активність клітинного СО73, вимірюючи випромінювання світла на люмінометрі (МоїІесціаг Оемісе). Процентну ферментативну активність оцінювали згідно з описом, наведеним нижче: Залишкову активність СО7З розраховували у
Зо такий спосіб: (Клітини ЗК-ОУ-3кАтАТФІіАМФ)-(АТФААМФ)/(клітини ЗК-ОМ-3-АТФІААМФ)- (АТФААМФ)"100. Графік результатів наведений на фіг. 5, на якому показано, що на відміну від негативного контрольного ІдС, 101-Ми інгібувало ферментативну активність СЮО7З залежно від дози (ІС50 - 4,62 НМ).
Приклад 4. Усунення АМФ-опосередкованої супресії СО4-- Т-клітин за рахунок 101-Ми
У даному прикладі тестували здатність антитіла усувати АМФ-опосередковану супресію
Сраях Т-клітин.
Сбр4.- Т-клітини людини очищали від МІК за допомогою позитивного відбору з використанням мікрогранул з СО4 людини (Мійепуії Віоїесп). Виділені СО4- Т-клітини стимулювали з використанням заздалегідь іммобілізованого антитіла проти СОЗ (2 мкг/мл) та розчинного антитіла проти СО28 (1 мкг/мл) у присутності або за відсутності АМФ (500 мкМ).
Послідовні розведення антитіл проти СО7З та контрольних (дб додавали у кожну лунку, культивували протягом 72 год, та супернатант аналізували на предмет наявності ІФН- у за допомогою твердофазного ІФА. Як показано на фіг. 6, 101-Ми збільшувало продукцію ІФН-у
Срах клітинами залежно від дози, у той час як контроль не виявляв значимого впливу.
Приклад 5. Гуманізація 101-Ми
У вищенаведених прикладах показано, що антитіло 101-Ми є потужним інгібітором ферментативної активності СО7З та може повністю усувати імунодепресивний вплив аденозину на активацію Т-клітин. Відповідно, це антитіло вибрали як основу для гуманізації.
Гени варіабельної області 101-Ми використовували для створення гуманізованого МАт. МН та МК 101-МИ порівнювали з доступною базою даних послідовностей генів Їд людини з метою виявлення максимально співпадаючих ембріональних послідовностей генів Ід людини.
Найближчі збіги серед послідовностей людини для легкого ланцюгу являли собою гени А10/)КА (конструкція 1) та І 6/)К4 (конструкція 2), а для важкого ланцюгу - ген МН4-В/)Нб. Потім сконструювали послідовності гуманізованих варіабельних доменів, де СОК1Т (5ЕО ІЮО МО.4), 2 (ЗЕБЕО ІЮО МО.5) та З (ЗЕО ІО МО.6б) легкого ланцюгу 101-МО трансплантували на каркасні послідовності відповідних генів легкого ланцюгу, а послідовності СОК1 (5ЕО ІЮ МО.1), 2 (ЗЕО ІЮ
МО.2) та З (5ЕО ІЮ МО.3) МН 101-МО трансплантували на каркасні послідовності відповідного гену МН.
Потім генерували ЗО-модель із метою визначення наявності положень у каркасних ділянках, де заміна амінокислоти миші на амінокислоту людини могла впливати на зв'язування та/або конформацію СОЖК. Виявлені корисні зворотні мутації, а також пептидні послідовності, що містять такі мутації, показані нижче у таблицях (виділені підкресленням).
Таблиця З
Зворотні мутації МН та послідовності МН із зворотними мутаціями:
Конструкція МН: МН4А-Б/ЮНб6
МН 101-Ми
МН.1 101-Ми Трансплантовані СОК
МН.Та 101-Ми МВ
МН.16 101-Ми М71В, М671
МН.1с 101-Ми МН, М671, ІЛ8М
УНн.та 101-Ми М718, М671І, І48М, 5307, с144К
Таблиця 4
Зворотні мутації МК та послідовності МК із зворотними мутаціями (конструкція 1):
Конструкція 1 МК: АТО/КА
МК 101-Ми
МК.1 101-Ми Трансплантовані СОК
МК.Та 101-Ми Ех, 0705
МК.16 101-Ми Е71У, 0705, К495
МК.1Те 101-Ми Е71У, 0705, К495, І 46Р, І 4ЛУ
Ук.ла 101-Ми Е71У, 0705, К495, 1 46Р, І 47, 55
Таблиця 5
Зворотні мутації МК та послідовності МК із зворотними мутаціями (конструкція 1):
Конструкція 2 УК: І.6/9УКА
МК.2 101-Ми Трансплантовані СОК
МК.2а 101-Ми Ех, 0705
МУК.2р 101-Ми Е71У, 0705, К495, ІБ8М
МК.2с 101-Ми Е71У, 0705, К495, І 46Р, І 4ЛУ, 155, А435, ІБ8М
Таблиця 6
Гуманізовані УН та гуманізовані МН із зворотними мутаціями:
Назва (ЗЕО І Послідовності
МО:
Мо за 1234
Кабаї 1234567890123456789012345678901А234567890123456789
МН 101-Ми РМОГОЕБаРИОЇ МКРБОБІ І ТСБУТаУІТЗаУУММУМІВОЕРЕМКІ ЕМ МО (10) ЕМОГ ОЕБОРОЇ МКРБЗЕТІ 5І ТСАУБИаУБІЗБЗИаММММУМІВОРРОКаї ЕУЛС
МН.1 ОО 101- ЕМОГ ОЕБОРОЇ МКРБЗЕТІ 5І ТСАУБИаУБІЗБЗИаММММУМІВОРРОКаї ЕУЛС
Ми (11) ЕМОГ ОЕБОРОЇ МКРБЗЕТІ 5І ТСАУБИаУБІЗБЗИаММММУМІВОРРОКаї ЕУЛС
МНАЛА 101- ЕМО ОБЗОР МКРБЗЕТІ 5І ТСАУБИамУБІЗЗСУ УМ ММІВОРРОКа! ЕУМОа
Ми (9) ЕМОГ ОЕБОРОЇ МКРБЗЕТІ 5І ТСАУЗИаУБІТЗаУМУММУМІВОРРОККІ ЕМ МО
МУН.18 101- ОМОГОЕБаРОИЇ МКРБЗЕТІ ЗІ ТСАУЗаУБІЗЗИаМУММСУМВОРРОКИЕУЛСИ
Зо
Ми (12)
МН.16 101-
Ми (13)
МН.10 101-
Ми (7)
Уна-вунб 14
Мо за
Кабаї оте зетво
Ми 012345678901234567890123456789012А8С34567890123456
МНИА 101- Ма а5МамимМРБІ КЗАВІЗІТАОТ5ОКМОЕРІ КІ МЗЕМТТЕОТАТУМСАВОУ
Ми ММмаа5МаммМРБІ КЗАМТІЗМОТЗКМОНЕБІ КІ ЗБЕБМТААОТАУУУСАВОУ
Мнв 101- ММмУвавмМмамуМРБІ КЗАМТІЗАОТЗКМОЕ5І КІ 55 ТААОТАМУМСАВОУ
Ми мМмаа5МаммМРБІ КЗВІТІЗАОТЗКМОЕ5БІ КІ 554 ТААОТАУУУСАВОУ мн 104- мМмаазмМамМРБІ КЗАІТІЗАОТОКМОЕ5І КІ 55М ТААОТАУУУСАВОУ
Ми мМмаа5МаммМРБІ КЗВІТІЗАОТЗКМОЕ5БІ КІ 554 ТААОТАУУУСАВОУ мно 103- ЗІУНЗазтгуУмММРБІ КЗАМТІЗМОТЗКМОНЕБІ КІ ЗБМТААОТАМУУСАВ--
Ми
Уна-вунвб
Мо за
Кабаї
МН 101-Ми
УНЯо101- о
Ми 7890АВС1234567890123
МНАА 101- рАУУЕА ООДЮУМСОС,СТОУТУ5о
Ми рАУУЕАГ ООМСсСОоСаТТУТУ55 унів 101- рАУУЕАГ ООМСсСОоСаТТУТУ55
Ми рАУУЕАГ ООМСсСОоСаТТУТУ55 ун 101- рАУУЕАГ ООМСсСОоСаТТУТУ55
Ми рАУУЕАГ ООМСсСОоСаТТУТУ55 ун 101- --- -жмс5:оаттУ55
Ми
Уна-вунвб
Напівжирний шрифт: ділянки СОЕК; підкреслений шрифт: зворотні мутації
Таблиця 7
Гуманізовані УК та гуманізовані УК із зворотними мутаціями (конструкція 1): 12345
Мо за Кабаї 123456789012345678901234567890123456789012345678901
МК 101-Ми (15) ОЇМІ БОБРАЇЇ БАБРОЕКУТМТСВАЗЗАУМ-УМНУМООКРИаЗЗРКРУІЗАТ
МК.1 101-Ми (16) ЕІМГТО5РОРОБМУМТРКЕКМТІТСВАЗЗАУМ-ХМНУ УООКРООБРКІ ПКАТ
МКЛА 101-Ми (17) ЕІМГТО5РОРОБМУМТРКЕКМТІТСВАЗЗАУМ-ХМНУ УООКРООБРКІ ПКАТ
МК.1в 101-Ми (18) ЕІМГТО5РОРОБУМТРКЕКМТІТСВАЗЗАУМ-ХМНУ УООКРООБРКИИ ІЗАТ
МК.10 101-Ми (19) ЕІММГТО5РОБРОЗУТРКЕКМТІ ТСВАЗЗАУМ-УМНУМООКРООЗРКРУІЗАТ
МК.1О 101-Ми (20) ЕМІ ЗХО5БРОРОЗМТРКЕКМТІ ТСВАЗБЗАУМ-УЮМНУ МООКРООЗРКРУУІЗАТ
АТОЛКА (21) ЕІМГТО5РОБРОЗМТРКЕКМТІТСААБОБВІСЗІ НМ МООКРООЗРКИ ІКМА
Мо за Кабаї 67890
МК 101-Ми 234567890123456789012345678901234567890123456789012
МК.1 101-Ми ЗМІ АБИ МРАНЕЗОЗОЗОТ5У5І ТІЗАМЕТЕСААТУУСООСМУ5ЗМРРТРССИТ
МКЛА 101-Ми ЗМІ АБаУРОАЕЗОаБЗОБОТОЕТІ ТІМ ЕАЕОААТУУСООМ55МРРТЕСС,ИтТт
МК.1В 101-Ми ЗМІ АБауРОНЕЗОБЗОБОТОУТІ ТІМ ЕАЕОААТУУСООМ55МРРТЕСО,Ит
МК.16 101-Ми ЗМІ АБауРОНЕЗОБЗОБОТОУТІ ТІМ ЕАЕОААТУУСООМ55МРРТЕСО,Ит
МК.10 101-Ми ЗМІ АБамРЗАЕЗОаБЗОаБОа ТУТ ТІМ ЕАЕСААТУУСООМУЗЗМРРТРССИИаТ
А10/Ка ЗМІ АБауРОНЕЗОБЗОБОТОУТІ ТІМ ЕАЕОААТУУСООМ55МРРТЕСО,Ит
ЗОБЕЗаУРЗНАЕЗОаЗавзатовтІ ТІМ ЕАЕРААТУМС-------- гсаат
Мо за Кабаї 34567
МК 101-Ми
КІ ЕК
МК.1 101-Ми КУЕІК
МКЛА 101-Ми
КМЕІК
МК.1В 101-Ми
КМЕІК
МК.16 101-Ми
КМЕІК
МК.10 101-Ми дІО/ІКА КМЕїК
КМУЕІК
Напівжирний шрифт: ділянки СОЕК; підкреслений шрифт: зворотні мутації
Таблиця 8
Гуманізовані УК та гуманізовані УК із зворотними мутаціями (конструкція 2):
Назва (ЗЕО ІС МО:) 12345
Мо за Кабаї 123456789012345678901234567890123456789012345678901
МК 101-Ми (15) ОЇМІ БОБРАЇЇ БАБРОЕКУТМТСВАЗЗАУМ-УМНУМООКРИаЗЗРКРУІЗАТ
МК.2 101-Ми (22) ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАЗЗАУМ-ХМНУУООКРИаОАРАГ МАТ
МК.О2А 101-Ми (23) ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАЗЗАУМ-ХМНУУООКРИаОСАРАГ МАТ
УК.28 101-Ми (24) ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАЗЗАУМ-ХЮМНУУООКРИаОАРАП ІЗАТ
МК.20 101-Ми (8) ЕІМІ БОБРАТІ 5І 5РЕЕВАТІ БСВАЗЗАУМ-УМНУУООКРИООБРАРУЛЗАТ
І в/ука (25) ЕІМГТО5РАТІ 5І ЗРОЕВАТІ БСВАБОБЗУ5ЗЗМ АММООКРИИОАРВАВГІМОА
Мо за Кабаї 67890
Мк 101-Ми 234567890123456789012345678901234567890123456789012
МК.2 101-Ми ЗМІ АБИ МРАНЕЗОЗОЗОТ5У5І ТІЗАМЕТЕСААТУУСООСМУ5ЗМРРТРССИТ
МК А 101-Ми ЗМІ АБИ РАНЕЗИаБаБаИаТОвТІ ТІ ЕРЕОЕАУУУСООМ55МРРТЕРССИСИТ ков 101-Ми ЗМІ АБИ РАНЕЗИаБИаБатемУтІ ТІ ЕРЕОБЕАУУУСООМ55МРРТЕРССИСИТ
УкКОос 101-Ми ЗМІ АБИ МРАНЕЗОЗИаБИТОМТІ ТІЗ5І ЕРЕОЕАУУУСОСОМУЗЗМРРТРОССИТ
І в//КА ЗМІ АБИ МРАНЕЗОЗИаБИТОМТІ ТІЗ5І ЕРЕОЕАУУУСОСОМУЗЗМРРТРОССИТ
ЗМААТтТаіРАВЕЗОЗаЗИаТОЕТТІЗОІ ЕРЕОЕБАМУМО------ - - --Ра« ,о ат
Мо за Кабаї 34567
МК 101-Ми
КІ ЕК
МК.2 101-Ми КУЕІК
МК.О2А 101-Ми
КМЕІК
УК.2В8 101-Ми
КМЕІК
МК.20 101-Ми
І в/кА кмЕК
КМУЕІК
Напівжирний шрифт: ділянки СОК; підкреслений шрифт: зворотні мутації
Гени гуманізованих МН та УК продукували синтетично та відповідно клонували у вектори, які містять гамма 1- та каппа-константні домени людини. Спряження УН та УК людини дозволило створити ряд гуманізованих антитіл, перерахованих нижче у таблиці.
Таблиця 9
Гуманізовані антитіла 101-Ми 101-Ми 101-Ми 101-Ми 101-Ми 101-Ми 101-Ми | 101-Ми
Ом, Ни101-1 | Ни101-2 | Ни101-3 | Ни101-4 | Ни101-17 | Ни101-21 | Ни101-25 ОО
СКМ Нит01-5 | нит01-6 | нит01-7 | нит01-8 | ни101-18.) Ни101-22 | Ни101-26 ЩІ ом Ни101-9 | Ни101-10 | Нит01-11 | Ни101-12 | Ни101-19 | Ни101-23 нива!
СКМ Ни101-13 | Ни101-14 | Ни101-15 | Ни101-16 | Ни101-20 | Ни101-24 ниютав 101-Ми химера
У таблиці 10 показані декілька прикладів нуклеотидних послідовностей, які кодують області
МН та Мі антитіл 101-МО та Ни101-28.
Таблиця 10
Нуклеотидні послідовності
Се 0000 пе вАТатТАСАССТТСАсаАда,атоА,апАоСстТаасстСаТаАААССТТСТСАстТо тотТатстсТсАССТастТСТатсСАСТааСТАСТОСАТСАССАСТОСТТАТТ
АстааААСстТапАТССааСАСТТССАСаАААСАААСТааААТавАтацвоас
МН 101-Ми 57 ТАСАТААДАСТАСОЯССОИТАССААТаасСтТАСААСССАТСТСТСААДАДИтса
САТСТОСАТСАСТОСОаСАСАСАТСТААЧААССАС ТП ТТоСТОАдасСтТаА
АТТоТатОаАСТАСТаДасСАСАСАССТАСАТАТТАСТатасСАДОаАаАСТАТ вАТааТТАСТАСОдАааСстотТасаСадстасасйТСААаСААССТСАсСТСАС
СаТсСТоСтТСА
САААТТаттсототТоССАаТатсТоСАасСААтТоСсТатстасСАТСТОоСАСсСасапА
СААСатСсАСААТаАСсттасСсаа,асвсассСсАастоАСаТаТАААТТАСАТОаСАСТ сватАсСсАаСАаАдасСсСсАааАТСТССССАААСССТасАТТТСТасСсСАСА
МІ. 101-Ми 58 | ТССААсСста,астстасаатосста7астсасттсастассаатааатоТас
САССТСОТТАСТСОТСТСАСААТтТАааСАСАСТАпАаАСТаААаАТастассА
СсТтТАТТАСТОаССАасСсАатТасАаТтАаТААСССАСССАса т саавА;,аааваса
АССААССТастаАААТААДА сАдапТАсАдастСсАасасАаатСаавАсСтааЙСсСТаТАААССТСТаАСАС тстатстстТсАсстТасастатстсТаасСтТАСТОСАТСАССАСТОасаТтТТАТТ
АстааААстТапАтТоСааСАа,аСсСТСАадпАААдаАдаСстааААтТасАтасвиас
МН Ни101- Ба ТАСАТСААСТАСЯССИвИТАаСААТаасСтТАСААСССАТСТСТСАДААС,СТСа 28 САТСАССАТСТСТАааСсАСАСАТСТААЧААССАИаТ ТТ ТоССтТадАдастад тста,атадстТасСстТасСсСОпАСАСсАастататАТТАСТатасСААСаАсСАСТАТ вАТаСсСТТАСТАСОаАдАДаСстТотасаСаАастасвааТСАдасААССАСАИТСАС
СаТсСТоСтТСА
САААТТаттстоТоССАаТтсТоСАаСААСсСсСсТатоттаТатстоСАваааА сАд,апаСсСАСсАСсТатсттасАад,аавасСссСАастосАСатаТАААТТАСАТОаСАСТ
МІ нНи101- сватТАсСсАаСАаАдасССАааАСАаТССССАаАСССТасАТТТСТасССАСА 28 ТоСААДАССТОССТІсТаОСАсСТоСсСстТастоасттолатасаатаватстаа
САССТСТТАСАСТСТСАСААТТАаСсАасСсТаслХасСсСАЧААаАТтСасСсСа татАТАСТаССсАааСАаатТапАсТАаТатААСССАССсСсАсаИаттсссАааавааса
АССААСИатТтасьдьААТСААА
Приклад 6. Тестування гуманізованих антитіл
У даному прикладі тестували гуманізовані антитіла на предмет їх афінності зв'язування та інгібувальної активності. Процедури тестування аналогічні описаним у прикладах 1-4, результати представлені на фіг. 7-11.
Для аналізу зв'язування використовували систему Віасоге 1200 з використанням підходу на основі захоплення антитіла людини. ЇдС проти Ес людини іммобілізували на сенсорному чипі
СМ5 згідно з інструкціями виробника. Тестоване антитіло вводили та захоплювали іммобілізованим дос проти Ес людини. Потім окремо вводили послідовні концентрації антигену та реєстрували профіль зв'язування для кожної концентрації аналізованого антигену, відповідно. Систему аналізу регенерували шляхом ін'єкції 10 мМ гліцин-НСІ, рН 1,5 на 30 секунд. Рухомий буфер являв собою НВ5З-ЕР- (10 мМ НЕРЕФ5, рн 7,4, 150 мМ Масі, З мм ЕДТА та 0,0595 Р20). Температура аналізу становила 25 "С, час асоціації та дисоціації дорівнював 180 та 600 секунд, відповідно. Дані Віасоге апроксимували за допомогою програмного забезпечення
Віасоге Т200 емаїІчайоп 1.0 відповідно до моделі зв'язування 1:1 з метою розрахунків констант швидкості асоціації (Ка) та дисоціації (Ка), а також константи рівноваги (Ко).
Серед усіх протестованих антитіл Ни101-25 та Ни101-28 демонстрували максимальну афінність зв'язування (див. фіг. 7 та таблицю, наведену нижче); їх використовували для подальшого аналізу.
Клітини лінії раку яєчників людини (клітини 5К-ОМ-3), які ендогенно експресують на поверхні
СО073 людини, зафарбовували різними концентраціями контрольного ідо, химерного антитіла проти СО7З (101-Ми-химерне, або 101-Спі) та гуманізованих антитіл проти СО7З (Ни101-25 та
Ни101-28) при 4 "С впродовж 30 хвил. Потім клітини тричі промивали РВ5 з наступним інкубуванням з АРС-міченим специфічним антитілом проти Бс людини (Іпмігодеп) при 4 "С впродовж 30 хвил. Зв'язування вимірювали з використанням РГАСзЗсСапіо (Весіоп-Оіскіп5оп), результати представлені на фіг. 8 (див. також таблицю, приведену нижче).
Рекомбінантний білок СЮО7З людини (0,3 мкг/мл) інкубували у 96-лункових плоскодонних мікропланшетах у присутності різних доз антитіла проти СО7З або ізотипових контрольних Ат.
Зо Планшети інкубували протягом 15 хвил. при 37 "С. Потім у кожну лунку додавали АТФ (100
МКМ) та АМФ (100 мкМ) та інкубували протягом ще 30 хвил. при 37 "С. У лунки додавали
СеПТіег-СіІо, що містить люциферазу (Рготеда), та вимірювали інгібування випромінювання світла за допомогою люмінометру (Моїіесціаг Оемісе). Відомо, що надлишок АМФ блокує АТФ- залежну активність люциферази. Додавання СО73, який каталізує продукцію аденозину та неорганічного фосфату з АМФ, відновлювало люциферазну активність та випромінювання світла. Таким чином, антитіло, що блокує ферментативну активність СЮО7З3, може знижувати випромінювання світла. Процентну ферментативну активність оцінювали згідно з описом, наведеним нижче: Залишкова активність сО73: (СО073АтАТФІАМФ)- (АТФААМФУ(СО73-АТФІАМФ)-(АТФІААМФ)100.
На фіг. 9 показано, що усі три протестованих антитіла демонстрували сильну інгібувальну активність (див. також таблицю, приведену нижче). 11111111 с5оснму | Максоінгібуваннясб),д//-/-/-
На фіг. 10 показані результати тестування інгібування ферментативної активності СЮО7З гуманізованими антитілами. СО7З-експресуючі клітини ЗК-ОМ-3 висівали на 96-лунковий планшет у кількості 1 х 105 клітин на лунку у присутності різних доз Ат проти СО7З3 або ізотипових контрольних Ат. Планшети інкубували протягом 15 хвил. при 37. У кожну лунку додавали АМФ (100 мкМ) та інкубували протягом 1 год при 37. Супернатанти збирали у новий 9б-лунковий планшет та додавали АТФ до кінцевої концентрації 100 мкМ. Додавали реагент
СеПТлекн-СіІо (Рготеда) у співвідношенні 1:1 та визначали ферментативну активність клітинного
СО73, вимірюючи випромінювання світла на люмінометрі (МоїЇесшціаг Оемісе). Процентну ферментативну активність оцінювали згідно з описом, наведеним нижче: Залишкова активність сор73: (Клітини ЗК-ОУ-31АтАТФААМФ)-(АТФІААМФ) клітини ЗК-ОМ-34АТФІАМФ)- (АТФААМФ)"100. Результати показані на фіг. 10 та нижче у таблиці та демонструють потужну інгібуючу дію цих антитіл. 11111111 ас5о(нМу | Максоінгібування(30уїїд /-/:
Для тестування здатності антитіл усувати АМФ-опосередковану супресію СО4-- Т-клітин бра Т-клітини людини очищали від МПК за допомогою позитивного відбору з використанням мікрогранул з СО4 людини (Мійепуі Віоїесп). Виділені СО4- Т-клітини стимулювали з використанням заздалегідь іммобілізованого антитіла проти СОЗ (2 мкг/мл) та розчинного антитіла проти СО28 (1 мкг/мл) у присутності або за відсутності АМФ (500 мкМ). Послідовні розведення антитіл проти СО7З3 та контрольних (9 додавали у кожну лунку, культивували протягом 72 год, та супернатант аналізували на предмет наявності ІФН-у за допомогою твердофазного ІФА. Як показано на фіг. 11, усі три протестовані антитіла усували АМФ- опосередковану супресію СО4-- Т-клітин залежно від дози.
Приклад 7. Комп'ютерне моделювання подальших змін та оптимізації гуманізованих антитіл
Вважалося, що деякі амінокислотні залишки у СОК-ділянках або каркасних ділянках можна змінити з метою подальшого поліпшення або збереження активності та/або стабільності антитіл. Варіанти тестували з використанням комп'ютерного інструмента (мМесіогмМТіІ, доступного на сайті м/млу.ері.ас.икЛооі5/твза/сіивіаю/), стосовно їхніх структурних, конформаційних та функціональних властивостей, та перспективні послідовності (у межах СОК-ділянок) перераховані нижче у таблицях.
Таблиця 11
СОК МН та МІ. та їх варіанти, які підходять для включення у гуманізовані антитіла:
мосовз 0 фООМУ5еМРРТ77777777777777777771111111111171ї111111111116ссСсСсС
Підкреслений шрифт: залишки при мутаціях у «гарячих точках» та їх заміни
Приклад 8. Ни101-28 являє собою антитіло проти СО73З з подвійним механізмом дії
У даному прикладі показано, що Ни101-28 має подвійний механізм дії. Воно не тільки блокує ферментативну активність СО7З неконкурентним чином, але й індукує інтерналізацію СО7З клітинної поверхні.
Зв'язування білків СЮО7З3 тестували з використанням розчинного СЮО7З та СО7З клітинної поверхні, результати показані на фіг. 12. На лівій панелі використовували 100 мкл розчину, що містить рекомбінантний СО7З3 людини (2 мкг/мл), у аналізі зв'язування на основі твердофазного
ІФА, та на діаграмі показане зв'язування Ни101-28. На правій панелі клітини лінії карциноми яєчників людини (5К-0МУ-3) зафарбовували різними концентраціями Ни101-28 та аналізували поверхневе зв'язування за допомогою проточної цитометрії. Як показано, ЕС5о у тестах становила 88,7 пМ та 0,67 нМ, відповідно, що підкреслює високу афінність антитіла.
Потім тестували здатність Ни101-28 блокувати активність СО73. Рекомбінантний СО73 людини (0,3 нг/мл) інкубували з Ни101-28 протягом 15 хвил. Потім додавали АТФ (100 М) та
АМФ (100 М) ще на 30 хвил. Додавали СеїЇГйег-Сіо (Рготеда) та вимірювали інгібування випромінювання світла за допомогою люмінометру. Як показано на фіг. 13, лівій панелі, ІСво у розчині становила 2,84 нМ. Стосовно СО73, що знаходився на клітинах, клітини 5К-ОМУ-3 або
МОА-МВ-231 (1 х 105 клітин) інкубували з Ни101-28 протягом 15 хвил., а потім послідовно додавали АМФ (100 ММ) та АТФ (100 (ММ) з наступним інкубуванням протягом 1 год. Додавали
СейПТег-Сіо (Рготеда) та вимірювали інгібування випромінювання світла за допомогою люмінометру. Як показано на фіг. 13, правій панелі, ІСво становила 2,52 нМ та 8,21 нМ для 5К-
ОМ-3 та МОА-МВ-231, відповідно.
Подальші експерименти показали, що Ни101-28 не конкурувало із субстратом АМФ за зв'язування з активним центром, але діяло алостерично або за рахунок інших неконкурентних механізмів, що більш переважно з погляду уникнення необхідності конкурувати із множинними ендогенними субстратами АМФ. Як показано на фіг. 14, збільшення концентрації субстрату
АМФ не запобігало гідролізу за рахунок Ни101-28, що вказувало на дію Ни101-28 як
Зо неконкурентного інгібітору. На противагу цьому, інгібувальну активність АДФ можна подолати, збільшивши концентрацію субстрату для усунення зв'язування АДФ із активним центром.
Цікаві та несподівані дані показані на фіг. 15. Інтерналізацію СО7З після зв'язування з
Ни101-28 демонстрували, вимірюючи рівень СО73З на клітинній поверхні проточною цитометрією або життєздатність клітин МОА-МВ-231 після зв'язування Ни309 у присутності вторинного антитіла, кон'югованого з токсином. У порівнянні з дО, який не змінював рівень СО7З на поверхні клітини, Ни101-28 приводило до більш ніж половинного зниження рівня СО7З3 на поверхні клітини протягом 6 годин (ліва панель), та навіть ще більш вираженого знищення клітин (права панель).
Таким чином, вищеописані експерименти продемонстрували, що Ни101-28 має подвійний механізм дії (МоА): неконкурентно блокує ферментативну активність СО73 та індукує інтерналізацію СО7З клітинної поверхні.
Приклад 9. Ни101-28 повністю усуває супресію СО4" та СО8: Т-клітинної відповіді, опосередковану АМФ або пухлинними клітинами
У даному прикладі показано, що Ни101-28 повністю усуває супресію СО4: та СО8: Т- клітинної відповіді, опосередковану АМФ або пухлинними клітинами. бра: або СОр8: Т-клітини людини мітили СЕЗЕ та стимулювали антитілами проти СОЗ/С028 у присутності або за відсутності АМФ. Ни101-28 додавали у культуру на 72 год. Супернатант культури аналізували на предмет продукції ІФН-д за допомогою твердофазного ІФА. На фіг. 16, лівій панелі, Ни101-28 збільшувало продукцію ІФН-гама у СО4- клітинах залежно від дози.
Аналогічним чином, як показано на правій панелі, Ни101-28 збільшувало продукцію ІФН-гама у
СО8: клітинах залежно від дози.
Для тестування впливу Ни101-28 на супресію Т-клітинної відповіді, опосередковану пухлинними клітинами, СО7З-експресуючі клітини ЗК-ОМ-3 обробляли мітоміцином С та спільно культивували з очищеними СО4- або СО8: Т-клітинами у присутності антитіл проти СОЗ/С028.
Ни101-28 додавали у культуру на 72 год., супернатант культури аналізували на предмет продукції І?ФН-гама за допомогою твердофазного ІФА. Як показано на фіг. 17, лівій панелі,
Ни101-28 збільшувало продукцію ІФН-гама у СО4: клітинах залежно від дози. Аналогічним чином, як показано на правій панелі, Ни101-28 збільшувало продукцію ІФН-гама у СО8- клітинах залежно від дози.
Приклад 10. Ни101-28 пригнічує ріст пухлини
У даному прикладі продемонстровано, що Ни101-28 ефективно пригнічувало активність пухлинного СЮО7З, що приводило до інгібування росту пухлини при монотерапії або комбінованій терапії.
Ферментативну активність СО7З3 іп мімо вимірювали ферментативним гістохімічним способом у пухлинах моделі ксенотрансплантату АЗ75, результати фарбування показані на фіг. 18. Коричневе фарбування вказує на присутність активного СО7З, у той час як відсутність коричневого фарбування вказувала на інгібування ферментативної активності СО7З антитілом.
Виконували збір пухлин моделі ксенотрансплантату АЗ375, оброблених Ни101-28 або контрольним Ідс, результати показали, що активність СО7З3 у зрізах пухлини значно знижувалася при обробці Ни101-28 у порівнянні із групою контрольного до.
Ефективність застосування Ни101-28 у якості монотерапії також оцінювали у моделі ксенотрансплантату пухлини. Клітини меланоми АЗ75 та МПК людини трансплантували МБО
Зо мишам з імунодефіцитом. У день трансплантації мишам з пухлинами вводили різні дози Ни101- 28 або контрольного ЇдДо шляхом внутрішньочеревної ін'єкції раз на два дні. Як показано на фіг. 19, Ни101-28 стійко пригнічувало ріст пухлини залежно від дози.
Виконали оцінку комбінаторного впливу Ни101-28 та антитіла проти РО-11. Клітини НСС827 трансплантували М5ОС мишам. Коли об'єм пухлини досягав 100-150 мму, мишам з пухлинами вводили свіжовиділені МПК людини за допомогою ін'єкції у хвостову вену, а потім лікували тварин контрольним до, тільки антитілом проти РО-І1, тільки Ни101-28 та антитілом проти РО-
Ї1 у комбінації з Ни101-28 у зазначених дозах раз на два дні, починаючи від дня трансплантації
МПК. На фіг. 20 показаний синергічний ефект Ни101-28 та антитіла проти РО-І 1.
Приклад 11. Ни101-28 перехресно реагує з СО7З яванського макака
У даному прикладі показано, що гуманізоване антитіло Ни101-28 перехресно реагувало з
СОр7З яванського макака та мало прийнятний профіль ФК та безпеки у пошуковому клінічному дослідженні.
На фіг. 21 показане зв'язування та інгібування активності СО7З яванського макака за рахунок Ни101-28. Ни101-28 мало порівнянну ефективність зв'язування та інгібування активності СЮО7З яванського макака у порівнянні з СО7З людини у біохімічному аналізі іп міго за відсутності зв'язування Ни101-28 з СО7З гризунів. Ці результати підтримують використання яванського макака як модель для неклінічного дослідження при оцінці токсичності, ФК та ТК
Ни101-28.
Приклад 12. Ни101-28 зв'язується з С-кінцевими доменами СО7З
У даному прикладі показано, що одне з гуманізованих антитіл, Ни101-28, зв'язувалося із С- кінцевими доменами білку СО73, на відміну від відомих антитіл проти СО-73, що зв'язуються з
М-кінцевими доменами.
Оцінку епітопів антитіл проти СО7З виконували за допомогою конкурентного твердофазного
ІФА. Білок СО7З ЕСО та Ни101-28 заздалегідь інкубували, а потім додавали з біотинільованим
МЕОІ-9447 (Медіттипе), що детектується антитілом зі стрептавідином-ПХ. Результат показав, що додавання біотинільованого К9447 не викликало конкуренції зі зв'язування Ни101-28, що вказувало на розташування обох антитіл у епітопах, які не перекриваються (фіг. 22). У якості контролю, додавання біотинільованого МЕЮОІ-9447 могло приводити до конкуренції за зв'язування із самим собою. бо Для виявлення епітопу Ни101-28 одержали бібліотеку клонів варіантів СО7З з мутаціями єдиної амінокислоти. Зв'язування Бар Ни101-28 з кожним варіантом у бібліотеці визначали у двох повторах за допомогою високопродуктивної проточної цитометрії. Для кожного варіанту
СО73 будували графік середнього значення зв'язування залежно від експресії СО73 (представленого за реакційною здатністю контролю) та виявляли на діаграмі критичні залишки.
Критичні залишки для зв'язування СО73З - Раб (виділені червоним) виявляли як залишки, мутації у яких давали негативний результат стосовно тесту зв'язування Рар, але позитивний стосовно контрольних мАт. Середні значення (та діапазони) реакційної здатності до зв'язування перераховані для критичних залишків, зазначених на екранах, та показані на фіг. 23. Ни309 зв'язувалося з С-кінцевою областю СО73 по епітопу 345, 0399, Е400, 401 та 480 (візуалізовано на фіг. 24, верхня ліва панель), у той час як МЕОІ-9447 зв'язувалося з М-кінцевою областю (див. порівняння на фіг. 24).
Вважалося, що унікальні зв'язувальні властивості Ни101-28 обумовлюють його чудовий профіль інгібування СО73З у порівнянні з відомими антитілами. Це продемонстроване на фіг. 25.
На верхньому порівнянні показано, що Ни101-28 демонструвало повне інгібування активності
СО73 без «ефекту високої дози», у той час як МЕ0БІ-9447 у високих дозах демонструвало значний «ефект високої дози». На нижній порівняльній панелі бар Ни101-28 демонстрував ефективність інгібування активності СО73, порівнянну з повним Ідс, у той час як баб МЕ0І-9447 не інгібував розчинний СО73.
Це вказує на те, що для інгібування СО7З потрібне зв'язування по обох сайтах зв'язування на повному антитілі МЕ0ОІ-9447, у той час як для Ни101-28 достатньо одновалентного зв'язування. Запропонували гіпотезу, що МЕОІ-9447 зв'язувалося із двома різними димерами
СОр7З для прояву інгібувальної активності, а для Ни101-28 така вимога відсутня. Для перевірки цієї гіпотези протестували інгібувальний вплив Ни101-28 з використанням клітин з різними рівнями експресії СО73. Як показано на фіг. 26, Ни101-28 могло досягати повного інгібування активності СО7З на клітинах, які експресують на поверхні різні рівні СЮО73З, у тому числі клітинах з низьким рівнем експресії, де відстань між молекулами СО73, імовірно, буде значною.
Межі даного винаходу не обмежуються конкретними описаними варіантами реалізації, які слід розглядати як одиночну ілюстрацію окремих аспектів даного винаходу, та будь-які функціонально еквівалентні композиції та способи входять у межі даного винаходу. Для фахівця очевидно, що у способи та композиції згідно із даним винаходом можна внести різні модифікації та зміни, не виходячи за межі сутності винаходу. Таким чином, мається на увазі, що даний винахід включає модифікації та зміни даного винаходу за умови, що вони відповідають сутності прикладеної формули винаходу та її еквівалентів.
Усі публікації та патентні заявки, згадані у даному документі, повністю включені у даний документ за допомогою посилання тією самою мірою, як якби було спеціально зазначене, що кожна окрема публікація або патентна заявка включені у даний документ за допомогою посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» І-МАВ «120» АНТИТІЛА ПРОТИ СО73 ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ -1305» 541 М/-250265-М02 -1405 РСТ/СМ2018/073746 -1415 23.01.2017 -1505 РСТ/СМ2017/072445 «1515» 24.01.2017 -160» 61 «170» Версія Раїепнп 3.5 «21051 «21156 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 1 зЗег Спіу Туг Туг Тр Авп 15 «21052 60 «211516
«212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «40052
Тугп Пе Авп Туг Спу СПу Зег Авп Сіпу Туг Авп Рго 5ег Геи Гуз Зег 151015 «2105 3 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» З
Азр Туг Авр Ага Туг Туг Сім Аа І єи Ар Ар 1510 «2105 4 «211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 4
Аг Аа 5ег 5ег Ага Маї Азп Туг Меї Нів 1510 «21055 «21157 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 5
Аа Тниг 5ег Авп І єи Аа 5ег 15 «21056 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 6
Сп Сп Тгр б5ег 5ег Авп Рго Рго ТНг 15 -2105 7 «2115 120 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 7
Спи Маї Сій Ї ви Сіп СП бег Спу Рго Сту І єи Маї Гуз Рго бег Спи 151015
Тип єи Зег І еи Тнг Суз Аа Маї бег Спіу Туг Зег Пе Тиг Зег Спу 20 25 30
Туг Туг Ттр Азп Тр Іе Ага ап Рго Рго Сту Гуз Гуз І еи Спи Тр 35 40 45
Меї Спу Туг Пе Авп Туг Спу Спчу Зег Авп Сіпу Туг Авп Рго 5ег Гей 50 55 60
Гуз 5ег Аго Пе Тпг Пе 5ег Агу Авр ТНг Зег Гуз Авзп Сп Ріє Зег 60 65 70 75 80
Ї еи Гуз І єи Зег 5ег Ма! ТНг Аа Аа Авр Тнг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ар Туг Азр Аа Туг Туг Сім Аа І єи Авр Авр Ттр Сіпу Сп 100 105 110
Спу Тит Тнг Маї Тнг Маї 5Зег Зег 115120 «2105» 8 «2115106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 8
Стпм Пе Маї І єи бег Сп бег Рго АЇа ТНг І єи 5ег І єи бег Рго Сіу 151015
Сім Ага Аа Тиг Геи Зег Суз Агу Аїа 5ег Зег Агу Маї Азп Туг Меї
Ні Тгтр Туг ап Сп Гув Рго Стпу Сіп Зег Рго Агу Рго Тгр Пе Зег 20 Аа Тниг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго Аа Ага РнНе 5ег Сіу 5ег 60
Сіу Зег Спу ТНг Зег Туг ТАг ГГ єи ТНг Пе Зег 5ег ГГ еи Спи Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аїа Маї Туг Туг Сувз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 25 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 9 «2115 120 30 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 9 35 Сі Маї Сіп Геи Сп СПми Бег СПу Рго Спу Геи Маї Гув Рго Бег Спи 151015
Тип єи Зег Гей Тнг Суз Аа Маї бег Спіу Туг Зег Пе бег Зег Спу 20 25 30
Туг Туг Ттр Азп Тр Іе Ага ап Рго Рго Спу Гуз Спу Геи Сім Тгтр 40 35 40 45
Пе Спу Туг Пе Азп Туг Спу Спу бег Авп Спу Туг Авп Рго 5ег І єи 50 55 60
Гуз Зег Агу Маї ТАг Пе Зег Агу Авр Тпг Зег Гуз Авзп Сп Ріє Зег 65 70 75 80 45 Ї еи Гуз І єи Зег 5ег Ма! ТНг Аа Аа Авр Тнг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ар Туг Азр Аа Туг Туг Сім Аа І єи Авр Авр Ттр Сіпу Сп 100 105 110
Сіу Ти Тнг Маї ТАиг ма! Зег Зег 50 115120 210510 «2115 120 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність 55 «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 10
Ар Маї Сіп Ї ей Сп Спи бег Спу Рго Су І еи Маї Гуз Ро 5ег Сп 151015 бо зегі ви Бег І еи Тиг Сув Зег Ма! Тиг Спу Туг Зег Пе Тиг 5ег Спу
20 25 30
Туг Туг Ттр Азп Тр Іе Ага Сіп РНе Рго Спу Авп Гуз Гей Си Тгтр 35 40 45
Меї Спу Туг Пе Авп Туг Спу Спчу Зег Авп Сіпу Туг Авп Рго 5ег Гей 50 55 60
Гуз 5ег Аго Пе Зег Пе ТАг Агу Авр Тиг Зег Гуз Авзп Сп Рпе Ріе 65 70 75 80
Ї еи Гуз І єи Азп 5ег Ма! Тнг Тнг Спи Азвр ТАг Аа Тнг Туг Туг Сув 85 90 95
Аа Агу Ар Туг Азр Аа Туг Туг Си Аа І ви Ар Авр Тгр Стпу Сп 100 105 110
Сіу ТНг Зег Ма! Тниг Маї Зег Зег 115120 «2105 11 «2115 120 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 11
Спи Маї Сій Ї ви Сіп СП бег Спу Рго Сту І єи Маї Гуз Рго бег Спи 151015
Тип єи Зег Гей Тнг Суз Аа Маї бег Спіу Туг Зег Пе бег Зег Спу 20 25 30
Туг Туг Тгтр Азп Тр Іе Ага ап Рго Рго Спу Гуз СПУ Гей Сім Тгтр 35 40 45
Пе Спу Туг Пе Азп Туг Спу Спу бег Авп Спу Туг Авп Рго 5ег І єи 50 55 60
Гуз Зег Агу Маї ТАг Пе Зег Ма! Азр Тнг 5ег Гуз Авп Сп Рпе 5ег 65 70 75 80
Ї еи Гуз І єи Зег 5ег Ма! ТНг Аа Аа Азр Тнг Аа Маї Туг Туг Сув 85 90 95
Аа Агу Ар Туг Азр Аа Туг Туг Си Аа І ви Ар Авр Тгр Стпу Сп 100 105 110
Сіу Ти Тнг Маї ТАиг ма! Зег Зег 115120 «2105 12 «2115 120 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 12
Спи Маї Сій Ї ви Сіп СП бег Спу Рго Сту І єи Маї Гуз Рго бег Спи 151015
Тип єи Зег Гей Тнг Суз Аа Маї бег Спіу Туг Зег Пе бег Зег Спу 20 25 30
Туг Туг Ттр Азп Тр Іе Ага ап Рго Рго Спу Гуз Спу Геи Сім Тгтр 35 40 45
Пе Спу Туг Пе Азп Туг Спу Сіу Зег Авп Сіу Туг Авп Рго 5ег І ви 50 55 60
Гуз 5ег Аго Пе Тпг Пе 5ег Агу Авр ТНг Зег Гуз Авзп Сп Ріє Зег 65 70 75 80
Ї еи Гуз І єи Зег 5ег Ма! ТНг Аа Аа Авр Тнг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ар Туг Азр Аа Туг Туг Си Аа І ви Ар Авр Тр Су Сп 100 105 110
Сіу Ти Тнг Маї ТАиг ма! Зег Зег 115120 бо 2105 13
«2115 120 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 13
Спи Маї Сій Ї ви Сіп СП бег Спу Рго Сту І єи Маї Гуз Рго бег Спи 151015
ТАгІ єи Зег І еи ТНг Суз Аа Маї бег Спіу Туг Зег Пе бег Зег Спу 20 25 30
Туг Туг Ттр Азп Тр Іе Ага ап Рго Рго Спу Гуз Спу Геи Сім Тгтр 35 40 45
Меї Спу Туг Пе Авп Туг Спу Спчу Зег Авп Сіпу Туг Авп Рго 5ег Гей 50 55 60
Гуз 5ег Аго Пе Тиг Пе Зег Агу Авр ТНг Зег Гу Авп ап Ре 5Зег 65 70 75 80
Ї еи Гуз І єи Зег 5ег Ма! ТНг Аа Аа Авр Тнг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95
Аа Агу Ар Туг Азр Аа Туг Туг Си Аа І ви Ар Авр Тгр Стпу Сп 100 105 110
Сіу Ти Тнг Маї ТАиг ма! Зег Зег 115120 «2105 14 2115109 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 14
Сп Маї Сій Ї ви Сіп СП бег Спу Рго Сту І єи Маї Гуз Рго бег Спи 151015
Тип єи Зег Гей Тнг Суз Аа Маї бег Спіу Туг Зег Пе бег Зег Спу 20 25 30
Туг Туг Ттр Сту Тгр Іе Ага ап Рго Рго Стпу Гуз СпПу Гей Сім Ттр 35 40 45
Пе СпПу Зег Пе Туг Ні ег Спу Зег Тиг Туг Туг Авп Рго зе" І єи 50 55 60
Гуз Зег Агу Маї ТАг Пе Зег Ма! Азр Тнг 5ег Гуз Авп Сп Рпе 5ег 65 70 75 80
Ї еи Гуз І єи Зег 5ег Ма! ТНг Аа Аа Авр Тнг Аа Маї Туг Туг Сув 85 90 95
Аа Агу Тр Стпу Сіп Спу Те Тнг Ма! ТАиг Ма! Бег Зег 100 105 «210515 «2115 106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 15
Сп Пе Маї І єи бег Сп бег Рго Аїйа Іе І єи Зег Аа 5ег Рго Спу 151015
Сім Гуз Ма! Тиг Меї Тиг Суз Аго Аа 5ег Зег Агу Маї Азп Туг Меї 20 25 30
Ні Тгтр Туг ап Сп Гуз Рго Стпу бег Зег Рго Гуз Рго Тр Пе Бег 35 40 45
Аа Тниг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго Аа Ага РнНе 5ег Сіу 5ег 50 55 60
Спу бБег Спу ТНг 5ег Туг Зег І єи ТНг Пе бег Агу Маї Спи Тнк Спи бо 65 70 75 80
Азр Аїа Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Геи Спи Пе Гув 100 105 «2105 16 «2115 106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 16
Сп Пе Маї Г еи Тнг Сп бег Рго Азр РНє Сп 5ег Маї Тне Рго І ув 151015 сій Гуз Ма! Ти Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег Зег Агу Маї Авп Туг Меї
Ні Тгтр Туг ап Сип Гув Рго Ар ап Зег Рго Гуз І еи І еи Пе Гув
Аа Тниг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне бег Спіу 5ег 60 20 сСіу Зег Спу Тиг Азр РНе Тнг Геи ТАг Пе Авп 5ег Геи Спи Аа Спи 65 70 75 80
Азр Аїа Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 25 100 105 «210517 «2115 106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 17
Сіш Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Авр РНе Сп 5Зег Маї Тнг Рго Гув 151015 35 сій Гуз Ма! Ти Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег Зег Агу Маї Авп Туг Меї 20 25 30
Ні Тгтр Туг ап Сип Гув Рго Ар ап Зег Рго Гуз І еи І еи Пе Гув 35 40 45
Аа Тниг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне бег СПУ бег 40 50 55 60 сСіу Зег Спу ТНг Зег Туг ТАг ГГ еи ТНг Пе Авп 5ег І ви Спи Аа Си 65 70 75 80
Азр Аїа Аа Тнг Туг Туг Суз Сп Сп Тр бег 5ег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95 45 Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 2105 18 «2115 106 «212» БІЛОК 50 «213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 18
Сіш Пе Ма! Геи ТАг Сіп 5ег Рго Авр РНеє Сп 5ег Ма! Тнг Рго Гув 55 151015 сій Гуз Ма! Ти Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег Зег Агу Маї Авп Туг Меї 20 25 30
Ні Тгтр Туг ап Сп Гув Рго Ар ап Зег Рго Гуз І еи І еи Пе Зег 35 40 45 60 Аа Тниг 5ег Авп І ви Аа 5ег Сіпу Маї Рго Зег Агу Ре Бег Спу Зег
50 55 60 сСіу Зег Сіу ТНг Зег Туг ТАг І еи Тнг Пе Авп 5ег І ви Спи Аа Си 65 70 75 80
Азр Аїа Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 19 «2115 106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 19
Сіш Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Авр РНе Сп 5Зег Маї Тнг Рго Гув 151015 сій Гуз Ма! Ти Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег Зег Агу Маї Авп Туг Меї
Ні Тгтр Туг ап Ссіп Гуз Рго Ар ап Зег Рго Гуз Рго Тгр Пе Зег 20 35 40 45
Аа Тниг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне бег СПУ бег 50 55 60 сСіу Зег Спу ТНг Зег Туг ТАг ГГ еи ТНг Пе Авп 5ег І ви Спи Аа Си 65 70 75 80 25 Азр Аїа Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «-2105» 20 30 «2115 106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 20
Сіш Пе Маї Геи Зег Сип 5ег Рго Авр Ріє Сп 5ег Маї ТНиг Рго Гуз 151015 сій Гуз Ма! Ти Пе Тнг Суз Агу Аа 5ег Зег Агу Маї Азп Туг Меї 20 25 30
Ні Тгтр Туг ап Ссіп Гуз Рго Ар ап Зег Рго Гуз Рго Тгр Пе Зег 35 40 45
Аа Тниг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго 5ег Агу Рне бег СПУ бег 50 55 60 сСіу Зег Спу ТНг Зег Туг ТАг ГГ еи ТНг Пе Авп 5ег І ви Спи Аа Си 65 70 75 80
Азр Аїа Аа Тиг Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 -2105 21 «2115 98 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 21
Сіш Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Авр РНе ап Зег Ма! Тниг Рго Гув 151015
Сіи Гуз Ма! Тит Пе Тнг Суз Ага Аа Зег Сіп Зег Пе Сіу Зег Зег бо 20 25 30
І еи Ніз Тр Туг Сп Сп Гуз Рго Авр Сп 5ег Рго Гуз Геи І ви Пе 35 40 45
Гуз Туг Аіа 5ег Сіп Зег РНе Зег Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 50 55 60
Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе Авп 5ег І еи См Аїа 65 70 75 80
Сім Авр Аа Аа ТАг Туг Туг Су Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи 85 90 95
Пе Гу «2105 22 «2115 106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 22
Сі Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Аа ТНг Гей Зег І и Зег Рго Спу 151015
Сім Ага Аа Тиг Геи Зег Суз Агу Аїа 5ег Зег Агу Маї Азп Туг Меї 20 25 30
Ні Тгтр Туг ап Ссіп Гуз Рго Стпу Сп Аа Рго Ага ГГ еи І єи Пе Туг 35 40 45
Аа Тнг Зег Авп І єи Аа Зег С1у Пе Рго Аа Агу Рне 5ег Сіу Зег 50 55 60 сСіу Зег Спу Тиг Азр Ріе Тнг Геи ТАг Пе Зег Зег І єи Си Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аїа Маї Туг Туг Сувз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 23 «2115 106 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 23
Сі Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Аа ТНг Гей Зег І и Зег Рго Спу 151015
Сім Ага Аа Тиг Геи Зег Суз Агу Аїа 5ег Зег Агу Маї Азп Туг Меї 20 25 30
Ні Тгтр Туг ап Ссіп Гуз Рго Стпу Сп Аа Рго Ага ГГ еи І єи Пе Туг 35 40 45
Аа Тниг 5ег Авп І єи Аа 5ег Спу Пе Рго Аа Агу Рпе Зег СПу Бег 60
Сіу Зег Спу ТНг Зег Туг ТАг І еи Тнг Пе Зег 5ег Гей Спи Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аїа Маї Туг Туг Суз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 50 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «210» 24 «2115 106 55 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 24 60 Сі Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Аа ТНг Гей 5ег І еи Зег Рго Спіу
Сім Ага Аа Тиг Геи Зег Суз Агу Аїа 5ег Зег Агу Маї Азп Туг Меї 20 25 30
Ні Тгтр Туг ап Сп Гув Рго Стпу Сп Аа Рго Ага Г еи І єи Пе 5ег 35 40 45
Аа Тниг бег Авп І єи Аа Зег Сіу Маї Рго Аа Ага РнНе 5ег Сіу 5ег 50 55 60
Сіу Зег Сіу Тиг Зег Туг ТАг І и Тнг Пе Зег 5ег ГГ еи Спи Рго Спи 65 70 75 80
Азр Ре Аїа Маї Туг Туг Сувз Сп Сп Тгр Зег Зег Авп Рго Рго ТНг 85 90 95
Рпе Спу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 25 «2115 98 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 25
Сі Пе Маї Геи Тит Сп Зег Рго Аа ТНг Гей Зег І и Зег Рго Спу 151015
Сім Ага Аа Тиг ГГ еи 5ег Суз Агу Аїа 5ег Сп Зег Ма! Зег Зег Туг 20 25 30
Ї еи Аїа Тр Туг Сіп Сп Гув Рго Стпу Сп Айа Рго Аго І єи Геи Пе 35 40 45
Туг Авр Аа 5ег Азп Аго Аа Тпг С1у Пе Рго Аїа Ага РНе 5ег Спу 50 55 60 зЗег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бЗег 5ег І єи Спи Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Рпе Сіу Спу Спу Тиг Гуз Маї Спи 85 90 95
Пе Гу «-2105 26 «-21156 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 26
Тиг ау Туг Тут Тгтр Авп 15 «2105 27 «-21156 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 27
Суз Сіпу Туг Туг Тгтр Авп 15 -2105» 28 «-21156 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 28 бо зЗег Аа Туг Туг Тр Авп
«2105» 29 «-21156 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 29 зЗег Рго Туг Туг Тр Авп «210» 30 «211516 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність 15 «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 30
Тугп Пе Авп Туг Стпу Аа Зег Азп Стіу Туг Авп Рго 5ег І єи Гув5 Зег 151015 -2105 31 «211516 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 31
Туг Пе Авп Туг Спу Рго Бег Авп сту Туг Азп Рго 5ег І єи Гув Бег 151015 «2105 32
Зо «211516 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 32
Тугп Пе Авп Туг Спу СПу Тиг Авп Сту Туг Авп Рго з5ег І єи Гу зег 151015 «2105» 33 «211516 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 33
Тугп Пе Авп Туг Спу СПу Суз Авп Сіу Туг Авп Рго зег ГГ еи Гуз Зег 151015 «2105» 34 «211516 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 34
Тугп Пе Авп Туг Спу СПу Зег Авр Су Туг Авп Рго 5ег Геи Гуз Зег 151015 «2105» 35 «211516 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність 60 «220»
«223» Синтетичний конструкт «4005» 35
Туг Пе Авп Туг Спу СПу Зег СИПми СПу Туг Авп Рго з5ег Гей Гуз Зег 151015 «2105 36 «211516 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 36
Тугп Пе Авп Туг Спу СПу Зег Сп Спу Туг Авп Рго Зег І єи Гув Зег 151015 -2105 37 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 37
Ар Туг Азр Аа Туг Туг А5р Аа І еи Ар Азр 1510 -2105» 38 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 38
Зо Азр Туг Авр Ага Туг Туг Сп Аа І еи Авр Ар 1510 2105» 39 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 39
Ар Туг Азр Аа Туг Туг Авп Аа І еи Азр Азр 1510 «2105» 40 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 40
Азр Туг Авр Аа Туг Туг Спи Спу Геи Авр Авр 1510 «2105 41 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 41
Азр Туг Авр Ага Туг Туг Спи Сувз Геи Авр Ар 1510 «2105» 42 60 «211510
«212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 42
Аг Аа Тнг 5ег Ага Маї Авп Туг Меї Нів 1510 «2105 43 «211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 43
Аг Аа Суз 5ег Агу Маї Азп Туг Меї Нів 1510 «210» 44 «211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 44
Аг Аа 5ег Тнг Ага Маї Авп Туг Меї Нів 1510 «2105» 45 «211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 45
Аг Аа 5ег Суз Агу Маї Азп Туг Меї Ніб 1510 «2105» 46 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 46
Авп Сп Ттр 5ег 5ег Азп Рго Рго ТНг 15 «2105 47 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 47
Азр Сп Тр Зег 5ег Авп Рго Рго ТНг 15 «2105» 48 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 48 60 Сім Сп Тгр бег 5ег Авп Рго Рго ТНг
«2105» 49 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 49
Сіп Авп Тр бег Зег Авп Рго Рго Тиг 2105 50 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність 15 «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 50
Сп Авр Тр бег Зег Авп Рго Рго Тиг 15 «2105 51 «-21159 «212» БІЛОК -213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 51
Сп Сім Тгр бег Зег Авп Рго Рго ТНг 15 «2105 52
Зо «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 52
Сп Сп Тук бег Зег Авп Рго Рго ТНг 15 -2105 53 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 53
Сіп Сп Тер Тйг Зег Авп Рго Рго ТНг 15 «2105» 54 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 54
Сп Сп Тгтр Суз бег Азп Рго Рго Тиг 15 2105 55 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність 60 «220»
«223» Синтетичний конструкт «4005 55
Сіп Сп Тер Зег ТАг Авп Рго Рго ТНг 15 «2105 56 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 56
Сіп Сп Тер Зег Сув Авп Рго Рго Тиг «2105 57 15 «2115 360 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 57 дадіасадс Ннсаддадіс аддассіддс сісдідааас сісісадіс ісідісісіс 60 ассідсісід ісасіддсіа сіссаїсасс адщдодгнаї! асіддаасід даїссддсад 120 шессаддаа асааасюдда адддащдодас іасаїааасі асдасодіад сааюдсіас 180 аасссаїсіс Ісаааацдісу даїсіссаїс асісдддаса саїсіаадаа ссадншс 240 сідаадсіда ансідщас їасідаддас асадсіасаї апасідідс аададасіаї 300 даюдодйасі асдаадсіс!ї ддасдасідд ддісааддаа ссісадісас сдісіссіса 360 -2105 58 «2115 318 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 58 сааацнойс ісісссадіс іІссадсааїс сідісідсаї сіссадддда дааддісаса 60
З5 ащдасідса ддадссадсіс асдідіааа! їасаюсасі ддїассадса даадссадда 120
Іссіссссса аасссіддаї Нсідссаса іссаассідд сісіддаді сссідсісдс 180 нпсадщадса діддвдісідо дассіснас ісісісасаа Надсададі ададасідаа 240 даюсідсса спанасід ссадсадідо адіадіаасс сасссасдїї сддадчддад9а 300 ассаадсідд аааіаааа 318 2105 59 «2115 360 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005» 59 дадаїасадс псаддацдіє аддассіддс сісдідааас сисідадас ісідісісіс 60 ассідсасід ісісіддсіа сіссаїсасс адддйнай асіддаасю даїссддсаяд 120 ссіссаддаа адаадсюда адчдаюодас їасаїсаасі асдасодіад сааддсіас 180 аасссаїсіс Ісаааацдісу даїсассаїс ісіадддаса саїсіаадаа ссадішсс 240 сідаадсіда днсідідас дсідссдас асадсіюї апйасідідс аададасіаї 300 даюдсйасі асдаадсісї ддасдасідд ддісааддаа ссасадісас сдісіссіса 360 2105» 60 «2115 318 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «400» 60 60 дааайцонс ісісссадіс Іссадсаасс сідісісіі сіссадддда дчадддссаса 60 сідісндса дддссадсіс асдщіаааї їіасаюдсасі ддіассадса даадссадда 120 садіссссса дасссіддаї сідссаса іссаассідд снсіддаді сссідсісдс 180 нпсадщодса діддвдісідо дассіснас асісісасаа Падсадссі ддадссадаа 240 дашсдсса ідіанасід ссадсадідо адіадіаасс сасссасоай сддаддчада 300 ассаадодіда аааїсааа 318 «2105 61 «2115 574 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний конструкт «4005 61
Меї Суз Рго Агу Аїа Аа Ага Аа Рго Аіа Тнгі ей ей ей Аа І еи 151015
Су Аїа Маї І єи Тр Рго Аїа Аїа Сту Аа Ттр Си І ви ТНг Пе Гей
Ні ТНг Азп Ар Маї Нів 5ег Ага ГГ еи Спи Сп ТАг Зег Сім Авр Зег зЗег Гуз Суз Маї Авп Аа 5ег Агу Су Меї Спу Стпу Маї Аа Ага Гей 20 50 55 60
Рпе Тнг Гуз Маї Сп Стп Пе Агу Ага Аїа Спи Рго Авп Маї ГІ еи І єи 65 70 75 80
І еи Азр Аа Сіу Авр Сп Туг Сип Спу Тг Пе Тер Ре Тнг Ма! Туг 85 90 95 25 Гуз Спу Аіа Спи Маї Аа Ні5 Ріє Меї Авп Аа І єм Ага Туг Авр Аа 100 105 110
Меї Аїйа ГІ еи Сіу Авп Ні Спи Рне Азр Авп Сіу Ма! Спи СИу І єи Пе 115120 125
Сім Рго І єи І єи Гуз См Аа Гуз РНе Рго Іе І єи 5ег Аа Азп ЇІе 30 130 135 140
Гуз Аа Гуз Сіу Рго І єи Аа 5ег Сп Пе Зег СПу І еи Туг Гей Рго 145150 155160
Туг Гуз Маї І еи Рго Маї Спіу Азр Сім Маї Ма! Спу Пе Маї Спу Туг 165 170 175 35 Тиг Зег Гуз Спи Тнг Рго РНе Геи Зег Авп Рго Стпу ТАг Авп ГГ еи Маї 180 185 190
Ріе Сіи Авр Сі Пе Тнг Ага Гей Сп Рго Спи Маї Азр Гуз І єи ГГ ув 195 200 205
Тип єи Азп Маї Авп І уз Пе Іе Аа І єи Стпу Ні бег Сіу Рпе Спи 40 210 215 220
Меї Агзр Гуз І єи Іе Аа Сіп Гуз Маї Агу Сіпу Ма! Авр Маї Маї Маї 225230 235 240
Сіу Спу Нів 5ег Авп Тиг РНе І єи Туг ТНг Спу Авп Рго Рго 5ег Гуз 245 250 255 45 Си Маї Рго Аїа Сіу Гуз Туг Рго Ре Пе Маї Тнг Зег Авр Авр Спу 260 265 270
Ага Гуз Маї Рго Маї Маї Сип Аїа Туг АІа Ре Су Гуз Туг І еи Спу 275280 285
ТугГеи Гуз Пе Си РНе Азр Спи Агу Стпу Авзп Маї Пе Зег Зег Нів 290 295 300
Сіу Авзп Рго Іе І еи ГГ еи Авзп Зег Бе"! Пе Рго Спи Авр Рго 5ег Пе 305 310 315 320
Гуз АІа Азр Пе Авп Гуз Тр Ага Іе Гуз Геи Авр Азп Туг 5ег ТНг 325 330 335
Сіп Сі Гей Спу Гув Тк Пе Маї Туг Геи Азр Спу Зег Зег Сп Бег 340 345 350
Суз Агу РНе Аг Сім Суз Авп Меї Спу Авп І еи Пе Сувз Авр Аа Меї 355 360 365
Пе Авп Авп Авт І єи Ага Ні ТАг Авр Сім Меї Рне Тр Авп Ні Маї бо 370 375 380 зЗег Меї Суз ІПе Гей Авп Спу Спу СПу Пе Агу 5ег Рго Пе Авр Си 385 390 395 400
Агу Авп Азп ау Тпг Пе Тиг Тгр Сім Авп Гей Аїа Аа Маї І еи Рго 405 410 415
Рпе Спу Спу Тиг Рне Авр Г єи Маї Сіп Гей Гуз Спу Зег ТНгГеи Гув 420 425 430
І уз АІа РНе Си Нів 5ег Маї Ніз Агу Туг Сіу Сіп бег ТНг Спіу СИПи 435 440 445
Рпє І еи Сп Маї Сіу Спу Пе Ніз Маї Ма! Туг Ав5р Гей Зег Агу Гуз 450 455 460
Рго Стпу Азр Аго Маї мМаї Гуз Геи Азвр Маї! І єи Суз ТАиг Гуз Суз Аг9 465 470 475 480 маї Рго 5Бег Туг Авр Рго І єи Гуз Меї Авр Сіи Маї Туг Гуз Ма! Пе 485 490 495
І еи Рго Авп Ріє І єи Аа Авп Сіпу Спу А5р Сіу Ре СіІп Меї Пе Гув 500 505 510
Азр Си Г еи ГГ еи Ага Нів Авр 5ег Сіу Авр Сп Авр Пе Авп Маї Маї 515520 525 зЗег ТНг Тут Пе Зег Гуз Меї І уз Ма! Пе Туг Рго Айїа Маї Спи Спу 530 535 540
Ага Пе Гу РНе Зег Тпг Спу Зег Ні Суз Нів Спу Зег РНе 5ег І єи 545 550 555 560
Пе РНе Г еи 5ег І еи Тгр Аа Ма! Пе Рне Маї Геи Туг Сп

Claims (8)

565 570 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло або його фрагмент, де зазначене антитіло або його фрагмент має специфічність до білка СО7З людини та містить: Зо варіабельну область важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 7 або 9, та варіабельну область легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8.
2. Антитіло або його фрагмент за п. 1, яке додатково містить константну область важкого ланцюга, константну область легкого ланцюга, Ес-область або їх комбінацію.
3. Антитіло або його фрагмент за п. 1, яке відрізняється тим, що константна область легкого ланцюга являє собою константну область каппа- або лямбда-ланцюга.
4. Антитіло або його фрагмент за п. 1, яке відрізняється тим, що антитіло або його фрагмент належить до ізотипу Ідс, І9М, ІдА, ЧЕ або Ідо.
5. Антитіло або його фрагмент за п. 4, яке відрізняється тим, що ізотип являє собою Ідс1, ІЧо2, (ДОЗ або Іде.
6. Антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що антитіло або його фрагмент являє собою химерне антитіло, гуманізоване антитіло або повністю людське антитіло.
7. Антитіло або його фрагмент за п. 6, яке відрізняється тим, що антитіло або його фрагмент являє собою гуманізоване антитіло.
8. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-7 та фармацевтично прийнятний носій.
9. Виділена клітина, яка містить один або більше полінуклеотидів, які кодують антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-7.
10. Спосіб лікування раку у пацієнта, який цього потребує, який включає введення пацієнту антитіла або його фрагменту за будь-яким з пп. 1-7.
11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що рак вибраний з групи, яка складається з раку сечового міхура, раку молочної залози, раку ободової та прямої кишки, раку ендометрію, раку стравоходу, раку голови та шиї, раку нирок, лейкозу, раку печінки, раку легень, лімфоми, меланоми, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози та раку щитоподібної залози.
12. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що рак являє собою солідну пухлину.
13. Спосіб за п. 10, який додатково включає введення пацієнту другого агента для лікування раку.
14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що зазначений другий агент для лікування раку є 60 інгібітором ключового компонента імунної відповіді.
15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що зазначений інгібітор інгібує експресію або активність білка-1ї запрограмованої загибелі клітин (РО-1), ліганду-ї білка запрограмованої загибелі клітин (РО-І1), білка-4, асоційованого з цитотоксичними Т-лімфоцитами (СТІ А-4), білка-3 активації лімфоцитів (ГАС-3) або їх комбінацій.
16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що інгібітор являє собою антитіло проти РО-1 або проти РО-І 1.
17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що інгібітор вибраний з групи, яка складається з пембролізумабу, ніволумабу, 943, КМР 1-14, атезолізумабу, іпілімумабу та їх комбінацій.
18. Спосіб лікування раку у пацієнта, який цього потребує, який включає: (а) обробку Т-клітини /л умйго антитілом або його фрагментом за будь-яким з пп. 1-7; та (Б) введення обробленої Т-клітини пацієнту.
19. Спосіб за п. 18, який додатково включає виділення Т-клітини з організму індивіда перед етапом (а).
20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що Т-клітину виділяють з організму пацієнта.
21. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що Т-клітину виділяють з організму індивіда- донора, що не є пацієнтом.
22. Спосіб за будь-яким з пп. 18-21, який відрізняється тим, що Т-клітина є Т-лімфоцитом, який інфільтрує пухлину, СО4-- Т-клітиною, СО8-- Т-клітиною або їх комбінацією.
23. Спосіб детектування експресії СО7З у зразку, який включає здійснення контакту зразку з антитілом або його фрагментом за будь-яким з пп. 1-7 в умовах зв'язування антитіла або його фрагменту з СО7З та детектування зв'язування, що вказує на експресію СО7З у зразку.
24. Спосіб виявлення пацієнта з раком, який підходить для лікування із застосуванням терапевтичного засобу на основі антитіла проти СО73, який включає виділення клітини з організму пацієнта з раком та детектування присутності білка СО73 за допомогою антитіла або його фрагменту за будь-яким з пп. 1-7. Зв'язування з рекомбінантним СОУ 4 - 101-Ми -- МАТ З Ф Ф 2 чі -2 о 1 -3 -2 -1 о 1 2 фіг. 1 Гоа концентрації (НМ) ! Зв'язування 3 СО73 на поверхні клітин 100 пи Я Контроль ще ен 11Ми шо ВО й -- МАТ ж Мо бо ж е й сою о Я 20 і 0 х й (З г х І га . -2 но 0 1 2 я Цоа концентрації (нм) ФІГ. а во 101-Ми ше р ї й !
о. о утекти тттнттттеннннтннннннтннннннннннннннн в ; ша Ди --0 о 200 «00 вою в0о 0000 200, во МАТ
55 . 0 4 я о о а п з 7 у У тою ет як юн ЕВ КАК ЖААМАК КІ Ж Кен то В го: Тк 5 житт ння пня нн нка тест : -2о в що «в вда о 000 150ю к дктивністе рекомбінантного СЮ УЗ 5 -- ів : - 101-Ми - 100 . 8 мя ш Е Е Е ж о -2 о 2 4 - ше ФІГ. 4 од концентрації (нм)
т Активність клітинного СО7З Е о х -У- р "а - 101-Ми Е і 5 5 в в ва : х б о т е г 4 о 1 2 З (ос коні ц ФІГ. 5 -о9у концентрації (М) Продукція ІФН-У 2000 ФІГ. 6 1500 ! я мож х | НЯ р й- 1000 | сани К ! жу р СК Б во с БЯ Я ВЯ Б Що з и З Б Я Б КУ КУ о - ЯК . КО ВОЯКИ БО ти о о « і й хо з Ям 5 «У ху пн ст о ч 7 о (мкг/мл) 101-Ми (мкг/мл)
Зв'язування з рекомбінантним СО7З відповідно до ППР і ! -й : с-ще в ню ще зо «бо Об о мюо о) фо пмфМ спиємтюю о пишотиши ВШ ТЩИ ТОМУ, ПМИЛММИ ОМЖТИМИ «ІТ Хо хі б 340 Боба : в ри і во « Е Ми101-28 | ко Бк І ай ! ФГ Зв'язування з СОУЗ на поверхні клітин ' «в : 100 м во -- 101-СВІ 80 снів чек нНи101-25 х ДЯ я Ної101-28 Ж й БООбо- й а во ли
Б. і к й ; А о ФІГ. 5 «г в о з 2 Год концентрації (ні)
Активність рекомбінантного СОЇ
: -5- 101-спі д Пн з яко Но101-25 8 І : - Ни101-28 во х х є 5 Зо у 5 м о ' нн -2 4 о 1 2 З ФІГ. 9 і о9у концентрації (нм) Активність клітинного СЛ 120 а -- 101-СНі Е ва яв Ни101-25 ї -- Ни101-28 С 8 60 т 8 8 30 в її я о ще " а о 1 2 з ФІГ. 10 ГЛо9 концентрації (НМ) Продукція ІФН-жх з ФІГ. 11 - З ез рере а ге ее ща М хі 1 Я, Я Не . п М ЕК ; БІ у кяКЯрив КК ! ВА аа ЧА КАК амер вне БАНКАМ о МОВ ВН КІВ с еф зо Фв з ове Фа» хе з ха є 7 301-сСНі низої-25 Ни1т01-28 жалі
Зкизування МИТО 28 З но чненнМ СЕМЯ За язуєзнна НЕ ШН- ЗВ з кнівинами ЯК АК Я
Б. й мк сою ж ВЕ й сш ; ФФохтнновннни ОО НЯ Ї дей хіро НА ВЕНІ-КВ ' Ж і - Б кі па й жа - ; в- ; еко Е Я: ще Ба Е ; й а ше я и Ук фасон НН лапа фараон, ї -ї в В В 8 с. ї 2 ле концен в ісо концентвац ін ние ооо еВ ни Кс жд ви ж в зе жевою Ку я Ва і х чі ; зе ВЕС х , х х, ер. : я ; й - І : КУ «у а хх х Ж З 2 ї з х : Ко омана а лоді женвркт ух сн : нУМиІЕ шоком нзмаовнжою без Ж : д нання цнраая се ан : х ін» Хаккщркх як че Моорум: з фак «дн. МОЗМ : жі Т ча й 8 ча Б Мін шо : й Ку ї й; Вей : 5 ях Б. : х В соовй Ф заджджжаклясс і з й : зак : за? монннння 5 : ва ей ФІГ. 14 зве : Зафарбовування 2073 на єнкваржні клі Життєздатність: клітин після інтерналізації СОУ тою т з - і о ХЕЗ то -- ЩО З в -к нет ек . яко оком 25 що в. Б а " х я КЕ є : З вою я яв Е ви з я є зів: Згеал : Жокоцентрацію (вх) ФІГ. 1 М ДК феаютпниа кідоонідх У Така мідхнудм ТеевхуєюєкА му Макух ВХ зу Ж і - дО Б - «х Я. я т "и шк ОКОМ со уоппопочва і Бе - ІЕЕ БЕК Я бах ож Мі ВаОЯ за ІЙ! м. В х чо Е ОО м Фо вояк я ох ВО я пін НАВННК ОО ЧАР ТВАНАТ Ко. Ше о ккхууухюкиюиихюих - уххкхаеюььььх Мк йо КРЕМ МУК хижих Ки і УК 0ОЖМУМИХУЮ ву ФІГ ТВ
Шомоска зустрі СОМ конк я сина куммтури КО Тамуюи як я Ту КЕ пюсдутко мя с ж ї З хе КЗ. що г; х КУ яз З КУ є їх 4 хо ХЕ Ж: С ка х з КЗ КУ хі У КУ ж ол з ХУ КУ ї КЗ КУ з КУ ХУ че :4 х Х ! ши і - В МИ В НЕ У ОС ВВА Й КИ нн ни сення а мжісуюоюч 0 друк " а «уїтяюмю 0 ММ М ікохх с т ФІ 1; Оброблені иа - 1 Оброблені КО 2. Туя Ва я В МОВ от: еВ кв тоном еко хо що Он ве ОО ОА КО В Ех оо ще пе вх о ши а б З ММК ек и: 0 КОМИ У АХ АВК УМ их ; ОО В МОН а Кт у ОО их о КВ о А КВ МК КА В ОМ: ЗК оце ШЕ ОО 5 Ма я Ж пу Кн М ОН хи сх ХОМ ик, КАХ КЕ в БО и ОО Око к. о КК НН МК де ОН М У У Сх КУ о хо З ОКА у Ох КМ пе Кох Спроблени мо Урі Я Серет На ОВ А Й Сюройляюв МУ КН-ЯЯ- З ЛЕК ин 00 ПЕ Ин. 0 ПОКИ В ЖЕ ОК М М М НН М М НН М М Я СКК КК ДПК КК АК У КО дн зн ко ВО ПЕК М ПИЛКИ НМ ОК НН В ПЕД В Я М ОО ОЗ НН НН Я аа ї й ех те се хе м-н і Кок Но аВї яю, З о дня; - 5 і ни де ВЖК Я НОКИ ОВ Хаелят, З Я дея Б як я й " З ш ї : ЗУ с х я кож 5 ШЕ й в) не хветв сфрнкм ж зво ї я К Е; з ї Її КЕНЕ КВ ни ї й й це з г яйї КУ й і пед фу З ї зніс ня зво г « а в ш В Е я кн пікля обрайян жо ши
Ж . оон ФІГ пе ненковрннья х Я Го ї з ее ВК звик у і а тку Пд лях І : да «до ше ном І ей й х сооанях Х дю Як вехректм к «в ЖЕ олноннюнюяомюння 0 МНС ооверннння КО жав внз и и хім ї ї дей І Ї є Ка й за днк ом обнютнх Дін бок піуовкоє Ї ВЕ й І Е які диф 7 ї Ї по Я назше вх захи му Х Е дя х ї і тая бе і і і з « х І і ке зач пак іти і дин фонові ххх» чу їх т Шонекомовуюн дин ке нійке г
ФІ.
нь "7 не т | ях жо фу апа кр КМ ї лоді рр снах стання Бо МОВ Кз неве Вое И ОКХ Бокхван КЗ Жов ФІ Конкуренція з МЕВОНМАЯТ 2-89 204 роя шк фея они
8. З | и є МНН,
0.55 мн ки - оо МИНМИ. С сннннщШ - «до ; в з ке я У а ек Ген Б ж ФІГ. 22 мутшн ниюзавнвьне мА. ; М 0000 На пана й Е х ! 1 5 до ія і ОюА 0 ар 00090406 0 14209) ох | Зб) 000 884цо 0 паєйа)
Ва. | ЦО 000 зоря зво га) іо вава 00 -0еюр 00 яз 652
ФІГ. 23
UAA201906244A 2017-01-24 2018-01-23 Антитіло до cd73 та його застосування UA126571C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2017072445 2017-01-24
PCT/CN2018/073746 WO2018137598A1 (en) 2017-01-24 2018-01-23 Anti-cd73 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126571C2 true UA126571C2 (uk) 2022-11-02

Family

ID=62978102

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201906244A UA126571C2 (uk) 2017-01-24 2018-01-23 Антитіло до cd73 та його застосування

Country Status (29)

Country Link
US (2) US10584169B2 (uk)
EP (2) EP4050030A1 (uk)
JP (1) JP7206193B2 (uk)
KR (3) KR20180093088A (uk)
CN (2) CN109476755B (uk)
AU (2) AU2018213549B2 (uk)
BR (1) BR112019012040A2 (uk)
CA (1) CA3045376C (uk)
CL (1) CL2019001756A1 (uk)
CO (1) CO2019006657A2 (uk)
DK (1) DK3383916T3 (uk)
EA (1) EA201991099A1 (uk)
ES (1) ES2908662T3 (uk)
HR (1) HRP20220629T1 (uk)
HU (1) HUE058975T2 (uk)
IL (2) IL267942B (uk)
LT (1) LT3383916T (uk)
MX (1) MX2019008758A (uk)
MY (1) MY188386A (uk)
NZ (1) NZ753714A (uk)
PE (1) PE20191208A1 (uk)
PH (1) PH12019550087A1 (uk)
PL (1) PL3383916T3 (uk)
PT (1) PT3383916T (uk)
RS (1) RS63195B1 (uk)
SI (1) SI3383916T1 (uk)
UA (1) UA126571C2 (uk)
WO (1) WO2018137598A1 (uk)
ZA (1) ZA201904619B (uk)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110023337B (zh) 2016-10-11 2024-01-05 艾吉纳斯公司 抗lag-3抗体及其使用方法
CN112384515A (zh) 2018-02-27 2021-02-19 因赛特公司 作为a2a/a2b抑制剂的咪唑并嘧啶和三唑并嘧啶
BR112020017382A2 (pt) 2018-03-09 2021-01-26 Agenus Inc. anticorpos anti-cd73 e métodos de uso dos mesmos
MA52940A (fr) 2018-05-18 2021-04-28 Incyte Corp Dérivés de pyrimidine fusionnés utilisés en tant qu'inhibiteurs de a2a/a2b
US11034771B2 (en) 2018-07-25 2021-06-15 I-Mab Biopharma Us Limited Anti-CD73 anti-PD-L1 bispecific antibodies
MX2021005396A (es) * 2018-11-12 2021-07-06 Jiangsu Hengrui Medicine Co Anticuerpo anti-cd73, fragmento de union a antigeno y aplicacion del mismo.
MX2021008094A (es) 2019-01-11 2021-09-21 Omeros Corp Metodos y composiciones para el tratamiento del cancer.
CN111499747B (zh) * 2019-01-11 2022-03-18 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种抗cd73单克隆抗体及其应用
CN111434688A (zh) * 2019-01-11 2020-07-21 上海开拓者生物医药有限公司 Cd73抗体及其制备方法和应用
TWI829857B (zh) 2019-01-29 2024-01-21 美商英塞特公司 作為a2a / a2b抑制劑之吡唑并吡啶及三唑并吡啶
AU2020256098A1 (en) * 2019-03-29 2021-10-28 Arcus Biosciences, Inc. Treatment of cancer utilizing an identified adenosine fingerprint
WO2020244606A1 (zh) * 2019-06-06 2020-12-10 北京加科思新药研发有限公司 对cd73具有特异性的结合分子及其用途
CN112111008B (zh) * 2019-06-19 2024-04-30 海正生物制药有限公司 抗cd73抗体及其应用
CN112300279A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 针对抗cd73抗体和变体的方法和组合物
EP3999545A4 (en) * 2019-08-21 2023-09-13 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd ANTI-CD73 ANTIBODIES AND USE THEREOF
EP4025605A1 (en) 2019-09-06 2022-07-13 Symphogen A/S Anti-cd73 antibodies
CA3161717A1 (en) * 2019-11-15 2021-05-20 Dana LORD Biparatopic cd73 antibodies
CN115135341A (zh) * 2020-01-03 2022-09-30 因赛特公司 抗cd73抗体及其用途
KR20220137013A (ko) 2020-01-03 2022-10-11 인사이트 코포레이션 Cd73 억제제 및 a2a/a2b 아데노신 수용체 억제제 병용 요법
US11692038B2 (en) * 2020-02-14 2023-07-04 Gilead Sciences, Inc. Antibodies that bind chemokine (C-C motif) receptor 8 (CCR8)
US20230174665A1 (en) * 2020-04-09 2023-06-08 Aprilbio Co., Ltd. Monoclonal Antibodies and Antigen Binding Fragments Thereof for Suppressing CD73 Immune Checkpoint and Uses Thereof
IL297426A (en) * 2020-04-22 2022-12-01 Akeso Biopharma Inc Anti-cd73 antibody and its use
CA3183102A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 Biotheus Inc. Anti-cd73 antibody and use thereof
AU2021297856A1 (en) 2020-06-22 2023-02-02 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-CD73 antibody and use thereof
JP2023537115A (ja) 2020-08-13 2023-08-30 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム 抗ｃｄ７３抗体を使用する癌処置方法
WO2022083049A1 (zh) * 2020-10-19 2022-04-28 中山康方生物医药有限公司 抗cd73的抗体及其用途
TW202222840A (zh) * 2020-12-11 2022-06-16 大陸商上海華奧泰生物藥業股份有限公司 Ｃｄ７３的抗原結合蛋白及其應用
EP4271384A1 (en) 2020-12-29 2023-11-08 Incyte Corporation Combination therapy comprising a2a/a2b inhibitors, pd-1/pd-l1 inhibitors, and anti-cd73 antibodies
CN116615458A (zh) * 2020-12-30 2023-08-18 天境生物科技(上海)有限公司 抗cd73抗体的制剂
JP2024505600A (ja) 2021-02-03 2024-02-06 モーツァルト セラピューティクス， インコーポレイテッド 結合剤およびそれを使用する方法
CN112552406B (zh) * 2021-02-24 2021-05-11 吴江近岸蛋白质科技有限公司 抗人cd73抗体
JP2024516581A (ja) * 2021-02-24 2024-04-16 蘇州近岸蛋白質科技股▲ふん▼有限公司 抗ヒトｃｄ７３抗体およびその適用
CN112574313B (zh) * 2021-02-25 2021-05-11 吴江近岸蛋白质科技有限公司 抗cd73抗体及其用途
EP4349867A1 (en) * 2021-05-28 2024-04-10 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd Specific binding protein targeting pd-l1 and cd73
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
TW202400242A (zh) * 2022-03-14 2024-01-01 大陸商上海華奧泰生物藥業股份有限公司 抗體藥物偶聯物及其應用
WO2023201267A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US5182297A (en) 1988-02-25 1993-01-26 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US4965288A (en) 1988-02-25 1990-10-23 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US5059714A (en) 1988-02-25 1991-10-22 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US4943593A (en) 1988-02-25 1990-07-24 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US5021456A (en) 1988-02-25 1991-06-04 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US5252608A (en) 1988-02-25 1993-10-12 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US5120764A (en) 1988-11-01 1992-06-09 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US4997854A (en) 1989-08-25 1991-03-05 Trustees Of Boston University Anti-fibrotic agents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in-situ using adjacently positioned diamine analogue substrates
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
ATE387495T1 (de) 1996-12-03 2008-03-15 Amgen Fremont Inc Vollkommen humane antikörper die egfr binden
TR199902553T2 (xx) 1997-04-14 2000-03-21 Micromet Gesellschaft F�R Biomedizinische Forschung Mbh �nsan v�cuduna kar�� antijen resept�rlerinin �retimi i�in yeni metod ve kullan�mlar�.
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2290485C (en) 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
AU8619698A (en) 1997-07-25 1999-02-16 Ban C. H. Tsui Devices, systems and methods for determining proper placement of epidural catheters
ES2278463T3 (es) 1998-12-08 2007-08-01 Biovation Limited Metodo para reducir la inmunogenicidad de proteinas.
AU777970C (en) * 1999-05-07 2006-08-17 F. Hoffman-La Roche Ag Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
FR2828206B1 (fr) 2001-08-03 2004-09-24 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire et le genie tissulaire
CA2566609C (en) 2004-05-13 2012-06-26 Icos Corporation Quinazolinones as inhibitors of human phosphatidylinositol 3-kinase delta
US20090142345A1 (en) 2005-03-15 2009-06-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Prophylactic/therapeutic agent for cancer
EP2078732B1 (en) * 2006-07-10 2015-09-16 Fujita Health University Method of identifying a candidate diagnostic or therapeutic antibody using flow cytometry
JP5312459B2 (ja) 2007-08-02 2013-10-09 ジリード バイオロジクス，インク． Ｌｏｘおよびｌｏｘｌ２阻害剤ならびにこれらの使用
US7982016B2 (en) 2007-09-10 2011-07-19 Amgen Inc. Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin
US8652843B2 (en) 2008-08-12 2014-02-18 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. DDR1-binding agents and methods of use thereof
US8450321B2 (en) 2008-12-08 2013-05-28 Gilead Connecticut, Inc. 6-(1H-indazol-6-yl)-N-[4-(morpholin-4-yl)phenyl]imidazo-[1,2-A]pyrazin-8-amine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as a SYK inhibitor
TWI625121B (zh) 2009-07-13 2018-06-01 基利科學股份有限公司 調節細胞凋亡信號之激酶的抑制劑
SG183174A1 (en) 2010-02-04 2012-09-27 Gilead Biologics Inc Antibodies that bind to lysyl oxidase-like 2 (loxl2) and methods of use therefor
NZ606880A (en) 2010-08-27 2015-01-30 Gilead Biologics Inc Antibodies to matrix metalloproteinase 9
US9550835B2 (en) 2011-08-23 2017-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-DDR1 antibody having anti-tumor activity
GB201115529D0 (en) 2011-09-08 2011-10-26 Imp Innovations Ltd Antibodies, uses and methods
WO2013052699A2 (en) 2011-10-04 2013-04-11 Gilead Calistoga Llc Novel quinoxaline inhibitors of pi3k
UY34573A (es) 2012-01-27 2013-06-28 Gilead Sciences Inc Inhibidor de la quinasa que regula la señal de la apoptosis
WO2013116562A1 (en) 2012-02-03 2013-08-08 Gilead Calistoga Llc Compositions and methods of treating a disease with (s)-4 amino-6-((1-(5-chloro-4-oxo-3-phenyl-3,4-dihydroquinazolin-2-yl)ethyl)amino)pyrimidine-5-carbonitrile
WO2014047624A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 Gilead Sciences, Inc. Anti-ddr1 antibodies
ES2685568T3 (es) 2012-12-21 2018-10-10 Gilead Calistoga Llc Inhibidores de la isoquinolinona o quinazolinona fosfatidilinositol 3-quinasa
PT2941426T (pt) 2012-12-21 2018-07-18 Gilead Calistoga Llc Quinazolinonas aminoalquis de pirimidina substituída como inibidores de fosfatidilinositol 3-quinase
CN104211814A (zh) * 2013-05-29 2014-12-17 三星电子株式会社 用于消耗靶膜蛋白的组合物
SI3008053T1 (en) 2013-06-14 2018-06-29 Gilead Calistoga Llc PHOSPHATIDYLINOSITOL 3-KINATE INHIBITORS
CN106852149B (zh) 2014-10-10 2021-08-27 依奈特制药公司 Cd73阻断
WO2016131950A1 (en) * 2015-02-20 2016-08-25 Innate Pharma Cd73 blockade
BR112017009398A2 (pt) 2014-11-10 2018-05-15 Medimmune Ltd moléculas de ligação específicas para cd73 e seus usos
GB2538120A (en) * 2014-11-11 2016-11-09 Medimmune Ltd Therapeutic combinations comprising anti-CD73 antibodies and uses thereof
DK3221346T3 (da) 2014-11-21 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer omfattende modificerede konstante områder af tungkæden
TWI758928B (zh) 2014-11-21 2022-03-21 美商必治妥美雅史谷比公司 抗cd73抗體及其用途
CN109154611B (zh) 2015-12-09 2022-04-08 科尔沃斯制药股份有限公司 人源化抗cd73抗体
CN110785187B (zh) 2017-06-22 2024-04-05 诺华股份有限公司 针对cd73的抗体分子及其用途
BR112020017382A2 (pt) 2018-03-09 2021-01-26 Agenus Inc. anticorpos anti-cd73 e métodos de uso dos mesmos

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018137598A1 (en) 2018-08-02
DK3383916T3 (da) 2022-03-28
HUE058975T2 (hu) 2022-09-28
LT3383916T (lt) 2022-06-10
ZA201904619B (en) 2022-05-25
KR20200108915A (ko) 2020-09-21
SI3383916T1 (sl) 2022-06-30
PH12019550087A1 (en) 2020-06-01
NZ753714A (en) 2023-03-31
CN109476755A (zh) 2019-03-15
JP2020515508A (ja) 2020-05-28
CA3045376A1 (en) 2018-08-02
EP3383916A1 (en) 2018-10-10
KR20180093088A (ko) 2018-08-20
KR20190105122A (ko) 2019-09-11
EP4050030A1 (en) 2022-08-31
JP7206193B2 (ja) 2023-01-17
EP3383916B1 (en) 2022-02-23
US20200332005A1 (en) 2020-10-22
MX2019008758A (es) 2019-09-11
RS63195B1 (sr) 2022-06-30
US10584169B2 (en) 2020-03-10
EP3383916A4 (en) 2019-09-11
CN112279918A (zh) 2021-01-29
HRP20220629T1 (hr) 2022-06-24
US20190256598A1 (en) 2019-08-22
CO2019006657A2 (es) 2019-06-28
MY188386A (en) 2021-12-07
EA201991099A1 (ru) 2020-03-23
IL290842A (en) 2022-04-01
IL267942A (en) 2019-09-26
KR102156199B1 (ko) 2020-09-17
US11613577B2 (en) 2023-03-28
AU2018213549B2 (en) 2022-02-03
IL267942B (en) 2022-04-01
BR112019012040A2 (pt) 2019-11-12
CA3045376C (en) 2022-08-30
PE20191208A1 (es) 2019-09-10
PT3383916T (pt) 2022-03-30
ES2908662T3 (es) 2022-05-03
CN109476755B (zh) 2020-12-04
PL3383916T3 (pl) 2023-06-12
AU2022202847A1 (en) 2022-05-19
AU2018213549A1 (en) 2019-06-06
CL2019001756A1 (es) 2019-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126571C2 (uk) Антитіло до cd73 та його застосування
US20210171628A1 (en) Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
UA126905C2 (uk) Антитіло до pd-l1 та його застосування
UA125918C2 (uk) Антитіла проти pd-l1 та варіанти їх застосування
US8394377B2 (en) Methods for treating cancer using combination therapy
CA3065301A1 (en) Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
US20210147537A1 (en) Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
UA122961C2 (uk) Спосіб лікування суб’єкта, який має рецидивуючий або рефрактерний гострий лімфобластний лейкоз
US20230279112A1 (en) Methods of treating cancer using antibodies and molecules that bind to btn1a1 or btn1a1-ligands
CN113196061A (zh) 肉瘤样肾癌的诊断和治疗方法
US20200131266A1 (en) Methods of treating cancer using antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1
EA043570B1 (ru) Антитела против cd73 и их применение
WO2011082187A1 (en) Methods for modulating a pdgf-aa mediated biological response