ES2908662T3

ES2908662T3 - Anticuerpos anti-CD73 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2908662T3
Application number: ES18733153T
Authority: ES
Inventors: Zhengyi Wang; Lei Fang; Bingshi Guo; Jingwu Zang
Original assignee: I Mab Biopharma US Ltd
Current assignee: I Mab Biopharma US Ltd
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2038-01-23
Also published as: WO2018137598A1; DK3383916T3; HUE058975T2; LT3383916T; ZA201904619B; KR20200108915A; SI3383916T1; PH12019550087A1; NZ753714A; CN109476755A; JP2020515508A; CA3045376A1; EP3383916A1; KR20180093088A; KR20190105122A; EP4050030A1; JP7206193B2; EP3383916B1; US20200332005A1; MX2019008758A

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-CD73 y usos de los mismos

Antecedentes

La CD73, grupo de diferenciación 73, también conocido como 5'-nucleotidasa (5'-NT) o ecto-5'nucleotidasa, es una enzima que sirve para convertir AMP en adenosina. La CD73 cataliza la formación de adenosina extracelular que contribuye al entorno tumoral inmunodepresor. La CD73 se sobreexpresa en células del estroma y múltiples tipos de células tumorales, así como en Tregs, M2 M9s y células supresoras procedentes de mieloides (MDSC, del inglés "myeloid derived suppressor cells").

La evidencia preclínica muestra que la inhibición de CD73 evitó la supresión de linfocitos mediada por adenosina, aumentó la actividad de las células efectoras CD8+ y redujo tanto las MDSC como los Treg. Se están desarrollando algunos anticuerpos anti-CD73 como posibles antineoplásicos, pero ninguno se ha aprobado para uso clínico. Geoghegan et al. (mAbs, vol. 8, n.° 3, 8 de febrero de 2016, páginas 454-467) proporciona un epítopo finamente mapeado al que se puede dirigir la inhibición selectiva, potente y no competitiva de CD73.

Sumario

La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y se une a uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y345, D399, E400, R401 y R480 de la proteína CD73 humana, preferentemente en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a al menos dos de los restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y345, D399, E400, R401 y R480, más preferentemente en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a cada uno de Y345, D399, E400, R401 y R480. La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y comprende:

(a) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1 o una variante de la SEQ ID NO: 1 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 1, 2 o 3 de la SEQ ID NO: 1;

(b) una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2 o una variante de la SEQ ID NO: 2 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 6, 7 u 8 de la SEQ ID NO: 2;

(c) una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3 o una variante de la SEQ ID NO: 3 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 7 u 8 de la SEQ ID NO: 3;

(d) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4 o una variante de la SEQ ID NO: 4 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 3 o 4 de la SEQ ID NO: 4;

(e) una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5; y

(f) una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6 o una variante de la SEQ ID NO: 6 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 1, 2, 3 o 4 de la SEQ ID NO: 6.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CD73 que tiene una afinidad de unión elevada a las proteínas CD73 humanas y que tiene actividades potentes que inhiben la actividad enzimática de CD73 ya sea solo o presente en una célula. Asimismo, la unión de estos anticuerpos puede inducir la internalización en células tumorales de CD73, lo que conduce a una mayor reducción de la actividad de CD73 en la superficie celular. También es sorprendente que, unidades monovalentes, por ejemplo, fragmentos Fab, de estos anticuerpos tengan potencias comparables a las de los anticuerpos completos. Sin embargo, anticuerpos anti-CD73 conocidos, tales como MEDI-9447 de Medimmune, no tienen dichas características. Del mismo modo, a diferencia de MEDI-9447 y 11F11 que requieren una elevada densidad de expresión de CD73 en la superficie celular para presentar su efecto de inhibición, los anticuerpos de la presente divulgación pueden alcanzar la inhibición completa de CD73 a diferentes niveles de expresión en la superficie celular. Se cree que estas propiedades sorprendentes e inesperadas de los anticuerpos divulgados actualmente se atribuyen, al menos en parte, al sitio de unión diferenciado en la proteína CD73. A diferencia de MEDI-9447 y 11F11 que se unen a los dominios aminoterminales de la proteína CD73, los anticuerpos divulgados actualmente se unen a los dominios carboxiterminales, y más particularmente a los restos de aminoácidos Y345, D399, E400, R401 y R480. Estas propiedades de los anticuerpos divulgados actualmente los convierten en candidatos superiores para usos terapéuticos y de diagnóstico.

De acuerdo con una realización de la presente divulgación, por lo tanto, se proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que tiene especificidad por una proteína CD73 humana y se une a uno o más restos de aminoácidos seleccionados de la porción carboxiterminal de la proteína CD73 humana. La porción carboxiterminal de la proteína CD73 humana, como se conoce en la materia, incluye 238 restos de aminoácidos a partir del resto 337, como se muestra en la SEQ ID NO: 61.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a uno o más de los dominios carboxiterminales de la proteína CD73 humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a al menos uno de los restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y345, D399, E400, R401 y R480 de la proteína CD73 humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a al menos dos de los restos de aminoácidos.

Una realización de la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CD73 o fragmento del mismo que comprende una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2, una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, una región Fc o la combinación de las mismas. En algunos aspectos, la región constante de cadena ligera es una región constante de la cadena k o A. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento del mismo es de un isotipo de IgG, IgM, IgA, IgE o IgD, o más particularmente, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humano. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo humanizado.

En algunas realizaciones, el anticuerpo humano o humanizado o fragmento del mismo tiene una región variable de cadena pesada que comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) Thr en la posición 30, (b) Lys en la posición 44, (c) Met en la posición 48, (d) Ile en la posición 67 y (e) Arg en la posición 71, de acuerdo con la numeración de Kabat y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo humano o humanizado o fragmento del mismo tiene una región variable de cadena ligera que comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) Ser en la posición 5, (b) Pro en la posición 46, (c) Trp en la posición 47, (d) Ser en la posición 49, (e) Ser en la posición 70 y (f) Tyr en la posición 71, de acuerdo con la numeración de Kabat y combinaciones de los mismos.

Por lo tanto, los ejemplos de anticuerpos o fragmentos de CD73 incluyen aquellos que tienen una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y 9 a 13, o un péptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y 9 a 13. En algunas realizaciones, una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o 9. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 15 a 20 y 22 a 24, o un péptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 15 a 20 y 22 a 24. En algunas realizaciones, una región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Como muestra el ejemplo experimental 7, las regiones CDR pueden albergar determinadas adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos que mantendrán o incluso mejorarán la propiedad del anticuerpo anti-CD73. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y comprende: (a) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1 o una variante de la SEQ ID NO: 1 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 1, 2 o 3 de la SEQ ID NO: 1; (b) una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2 o una variante de la SEQ ID NO: 2 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 6, 7 u 8 de la SEQ ID NO: 2; (c) una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3 o una variante de la SEQ ID NO: 3 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 7 u 8 de la SEQ ID NO: 3; (d) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4 o una variante de la SEQ ID NO: 4 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 3 o 4 de la SEQ ID NO: 4; (e) una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y (f) una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6 o una variante de la SEQ ID NO: 6 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 1, 2, 3 o 4 de la SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y comprende: (a) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1 o una variante de la SEQ ID NO: 1 que tiene una sola sustitución en la ubicación 1, 2 o 3 de la SEQ ID NO: 1; (b) una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2 o una variante de la SEQ ID NO: 2 que tiene una sola sustitución en la ubicación 6, 7 u 8 de la SEQ ID NO: 2; (c) una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3 o una variante de la SEQ ID NO: 3 que tiene una sola sustitución en la ubicación 7 u 8 de la SEQ ID NO: 3; (d) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4 o una variante de la SEQ ID NO: 4 que tiene una sola sustitución en la ubicación 3 o 4 de la SEQ ID NO: 4; (e) una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y (f) una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6 o una variante de la SEQ ID NO: 6 que tiene una sola sustitución la ubicación 1, 2, 3 o 4 de la SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26 a 29. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30 a 36. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37 a 41. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 4 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 42 a 45. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 6 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 46 a 56.

En algunas realizaciones, también se proporciona una composición que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporciona una célula aislada que comprende uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente divulgación.

En otra realización, la presente divulgación proporciona una composición para usar en un método para tratar el cáncer en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido.

En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al paciente un segundo agente terapéutico contra el cáncer. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico contra el cáncer es un inhibidor del punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, el inhibidor inhibe la expresión o actividad de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), ligando 1 de muerte programada (PD-L1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), proteína 3 de activación de linfocitos (LAG-3) o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en pembrolizumab, nivolumab, J43, RMP1-14, atezolizumab, ipilimumab y combinaciones de los mismos.

En un aspecto, se proporciona un método para el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesite, que comprende: (a) tratar un linfocito T, in vitro, con el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente divulgación; y (b) administrar el linfocito T tratado al paciente. En algún aspecto, el método comprende adicionalmente, antes de la etapa (a), aislar el linfocito T de un individuo.

En algunos aspectos, el linfocito T se aísla del paciente. En algunos aspectos, el linfocito T se aísla de un individuo donante diferente del paciente. En algunos aspectos, el linfocito T es un linfocito T infiltrante de tumores, un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+ o la combinación de los mismos.

En otro aspecto, también se proporciona un método para detectar la expresión de CD73 en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente divulgación en condiciones para que el anticuerpo o fragmento del mismo se una al CD73, y detectar la unión que indica la expresión de CD73 en la muestra. En un aspecto, incluso también se proporciona un método para identificar a un paciente con cáncer adecuado para el tratamiento con una terapia anti-CD73, que comprende aislar una célula del paciente con cáncer y detectar la presencia de una proteína CD73 con el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente divulgación.

Breve descripción de los dibujos

En la figura 1 se muestra la unión del anticuerpo 101-Mu a la proteína CD73 humana recombinante.

En la figura 2 se muestra la unión del anticuerpo 101-Mu a la proteína CD73 humana recombinante en la superficie de células de cáncer de ovario humano.

En la figura 3 se muestra la cinética de unión del anticuerpo 101-Mu a la proteína CD73 recombinante.

En la figura 4 se muestra que el anticuerpo 101-Mu inhibe la actividad enzimática de CD73.

En la figura 5 se muestra que el anticuerpo 101-Mu inhibe la actividad enzimática de CD73 en la superficie celular.

En la figura 6 se muestra que 101-Mu invirtió la supresión de linfocitos T CD4+ mediada por AMP, como lo indica la producción de IFN-y.

En la figura 7 se muestra la cinética de unión de los anticuerpos humanizados.

En la figura 8 se muestra que los anticuerpos humanizados se unieron a las proteínas CD73 de la superficie celular.

En la figura 9 se muestra que los anticuerpos humanizados inhibieron las actividades enzimáticas de las proteínas CD73.

En la figura 10 se muestra que los anticuerpos humanizados inhibieron las actividades enzimáticas de las proteínas CD73 de la superficie celular.

En la figura 11 se muestra que los anticuerpos humanizados revirtieron la supresión de linfocitos T CD4+ mediada por AMP, como lo indica la producción de IFN-y.

En la figura 12 se muestra la potente unión de Hu101-28 a CD73 soluble y de superficie celular.

En la figura 13 se muestra que la unión de Hu101-28 a CD73 bloquea de manera eficaz la actividad enzimática de CD73.

En la figura 14 se muestra que Hu101-28 inhibe de manera no competitiva la actividad de CD73.

En la figura 15 se muestra que la unión de Hu101-28 a CD73 induce la internalización de CD73.

En la figura 16 se muestra que Hu101-28 invierte la supresión mediada por AMP de las respuestas de linfocitos T.

En la figura 17 se muestra que Hu101-28 invierte supresión de las respuestas de linfocitos T medicada por células tumorales CD73+.

En la figura 18 se presenta una imagen de tinción que muestra la inhibición enzimática de CD73 in vivo mediante Hu101-28 en tumores del modelo xenográfico A375.

En la figura 19 se muestra que Hu101-28 presentó eficacia de monoterapia en el modelo de xenografía tumoral. En la figura 20 se muestra que Hu101-28 se sinergiza con el anticuerpo anti-PD-LI en la inhibición del crecimiento tumoral.

En la figura 21 se muestra la unión e inhibición de la actividad de CD73 de macaco mediante Hu101-28.

En la figura 22 se muestra que Hu101-28 no compite con MEDI-9447 por unirse a CD73.

En la figura 23 se enumeran los restos de aminoácidos de CD73 que interactúan con Hu101-28.

En la figura 24 se ilustran los epítopos de Hu101-28 y MEDI-9447.

En la figura 25 se muestran las actividades superiores de Hu101-28 en comparación con MEDI-9447.

En la figura 26 se muestra que Hu101-28 fue eficaz en la inhibición de CD73 en células con diferentes niveles de expresión de CD73.

Descripción detallada

Definiciones

Cabe señalar que el término "un" o "uno/a" se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, "un anticuerpo", se entiende que representa uno o más anticuerpos. De este modo, los términos "un" (o "uno/a"), "uno/a o más" y "al menos uno/a" se pueden utilizar indistintamente en el presente documento.

Como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" en singular así como "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no a una longitud específica del producto. Por lo tanto, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos", o cualquier otro término utilizado para referirse a una o más cadenas de dos o más aminoácidos, se incluye en la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede utilizarse en lugar de cualquiera de estos términos o indistintamente. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, que incluyen, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede proceder de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico determinada. Puede generarse de cualquier manera, incluyendo mediante síntesis química.

El término "aislado", como se utiliza en el presente documento con respecto a las células, ácidos nucleicos, tal como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN o ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. El término "aislado" como se utiliza en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de material celular, material vírico o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Además, se entiende que un "ácido nucleico aislado" incluye fragmentos de ácido nucleico que no se presentan de manera natural como fragmentos y que no se encontrarían en estado natural. El término "aislado" también se utiliza en el presente documento para referirse a células o polipéptidos que se aíslan de otras proteínas o tejidos celulares. Los polipéptidos aislados pretenden abarcar polipéptidos tanto purificados como recombinantes.

Como se utiliza en el presente documento, el término "recombinante" en lo que se refiere a polipéptidos o polinucleótidos se refiere a una forma del polipéptido o polinucleótido que no existe de forma natural, un ejemplo no limitante del cual puede crearse mediante la combinación de polinucleótidos o polipéptidos que normalmente no se encontrarían juntos.

"Homología" o "identidad" o "similitud" se refieren a la similitud de la secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear a efectos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El grado de homología entre secuencias depende del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40 % de identidad, aunque preferentemente menos del 25 % de identidad, con una de las secuencias de la presente divulgación.

Un polinucleótido o región polinucleotídica (o un polipéptido o región polipeptídica) tiene un determinado porcentaje (por ejemplo, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 %) de "identidad de secuencia" con otra secuencia significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas informáticos conocidos en la materia, por ejemplo los descritos en Ausubel et al., eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. Preferentemente, se usan parámetros predeterminados para la alineación. Un programa de alineación es BLAST, que utiliza parámetros predeterminados. En particular, los programas son b La STN y BLASTP, que utilizan los parámetros predeterminados siguientes: Código genético= estándar; filtro = ninguno; hebra = ambas; umbral = 60; expectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificación por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundantes, GenBank EMBL DDBJ PDB traducciones de CDS de GenBank SwissProtein SPupdate PIR. Los polinucleótidos biológicamente equivalentes son aquellos que tienen el porcentaje de homología especificado anteriormente y que codifican un polipéptido que tiene la misma actividad biológica o una similar.

La expresión "un ácido nucleico o polinucleótido equivalente" se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene un determinado grado de homología, o identidad de secuencia, con la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico o complemento del mismo. Se pretende que un homólogo de un ácido nucleico bicatenario incluya ácidos nucleicos que tengan una secuencia de nucleótidos que tenga un determinado grado de homología con el complemento del mismo. En un aspecto, los homólogos de ácidos nucleicos son capaces de hibridar con el ácido nucleico o complemento del mismo. Del mismo modo, "un polipéptido equivalente" se refiere a un polipéptido que tiene un determinado grado de homología, o identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia. En algunos aspectos, la identidad de secuencia es al menos aproximadamente el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 %. En algunos aspectos, el polipéptido o polinucleótido equivalente tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco adiciones, eliminaciones, sustituciones y sus combinaciones de las mismas en comparación con el polipéptido o polinucleótido de referencia. En algunos aspectos, la secuencia equivalente conserva la actividad (por ejemplo, unión a epítopo) o estructura (por ejemplo, puente salino) de la secuencia de referencia.

Las reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de diferente "rigurosidad". En general, se lleva a cabo una reacción de hibridación de baja rigurosidad a aproximadamente 40 °C en aproximadamente 10* SSC o una solución de fuerza iónica/temperatura equivalente. Normalmente se realiza una hibridación de rigurosidad moderada a aproximadamente 50 °C en aproximadamente 6* SSC y, en general, se realiza una reacción de hibridación de alta rigurosidad a aproximadamente 60 °C en aproximadamente 1 * SSC. Las reacciones de hibridación también se pueden realizar en "condiciones fisiológicas" que son bien conocidas por los expertos en la materia. Un ejemplo no limitante de una condición fisiológica es la temperatura, la fuerza iónica, el pH y la concentración de Mg2+ normalmente encontrada en una célula.

Un polinucleótido está compuesto por una secuencia específica de cuatro bases de nucleótidos: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) por timina cuando el polinucleótido es ARN. Por lo tanto, la expresión "secuencia polinucleotídica" es la representación alfabética de una molécula polinucleotídica. Esta representación alfabética puede introducirse en bases de datos en un ordenador que tenga una unidad central de procesamiento y usarse para aplicaciones bioinformáticas tales como genómica funcional y búsqueda de homología. El término "polimorfismo" se refiere a la coexistencia de más de una forma de un gen o porción del mismo. Una porción de un gen del cual hay al menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias de nucleótidos diferentes, se conoce como una "región polimórfica de un gen". Una región polimórfica puede ser un solo nucleótido, cuya identidad difiere en diferentes alelos.

Los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento génico (por ejemplo, una sonda, cebador, marcador EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, ARNbc, ARNip, miARN, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si está presente, pueden impartirse modificaciones a la estructura de los nucleótidos antes o después del ensamblaje del polinucleótido. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de marcaje. El término también se refiere a moléculas bicatenarias y monocatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización de la presente divulgación que sea un polinucleótido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas complementarias monocatenarias conocidas o previstas para formar la forma bicatenaria.

El término "codificar", tal como se aplica a los polinucleótidos, se refiere a un polinucleótido que se dice que "codifica" un polipéptido si, en su estado natural o cuando se manipula por métodos bien conocidos por los expertos en la materia, puede transcribirse y/o traducirse para producir el ARNm del polipéptido y/o un fragmento del mismo. La hebra antisentido es el complemento de dicho ácido nucleico y la secuencia codificante puede deducirse de ella.

Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo" o "polipéptido de unión a antígeno" se refiere a un polipéptido o un complejo polipeptídico que reconoce de manera específica y se une a un antígeno. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo completo y cualquier fragmento de unión a antígeno o una sola cadena del mismo. Por lo tanto, el término "anticuerpo" incluye cualquier proteína o molécula que contiene péptidos que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene actividad biológica de unión al antígeno. Ejemplos de tales incluyen, pero sin limitación, una región determinante de la complementariedad (CDR, del inglés "complementarity determining region") de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando de la misma, una región variable de cadena pesada o cadena ligera, una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región marco (FR, del inglés "framework region") o cualquier parte de la misma, o al menos una porción de una proteína de unión.

Las expresiones "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión a antígeno", como se utiliza en el presente documento, es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que reconoce el anticuerpo inalterado. La expresión "fragmento de anticuerpo" incluye aptámeros, spiegelmers y diacuerpos. La expresión "fragmento de anticuerpo" también incluye cualquier proteína sintética o genomodificada, que actúa como un anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo.

Un "fragmento variable monocatenario" o "scFv" se refiere a una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (V^h) y ligera (V^l) de inmunoglobulinas. En algunos aspectos, las regiones se conectan con un enlazador peptídico corto de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. El enlazador puede ser rico en glicina para su flexibilidad, así como en serina o treonina para conferir solubilidad y puede conectar el extremo N de la V^hcon el extremo C de la V^lo viceversa. Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y de la introducción del enlazador. Las moléculas ScFv son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5.892.019.

El término anticuerpo abarca varias clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir de manera bioquímica. Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (Y, m, a, 8 o e) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1 a y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), p. ej., IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgG, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la materia en vista de la presente divulgación y, por consiguiente, están dentro del alcance de la presente divulgación. Todas las clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la presente divulgación, el siguiente análisis se dirigirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulinas. Con respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina convencional comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos con un peso molecular de aproximadamente 23.000 dalton y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos con un peso molecular de 53.000 a 70.000. Normalmente, las cuatro cadenas están unidas mediante enlaces disulfuro en una configuración "Y" en donde las cadenas ligeras rodean las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Los anticuerpos, polipéptidos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la divulgación incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de unión a epítopos, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio VK o Vh , fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos LIGHT divulgados en el presente documento). Las moléculas de inmunoglobulina o de anticuerpo de la divulgación pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k o A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera k o A. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas de manera covalente entre sí, y las regiones de la "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, linfocitos B o células hospedadoras modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo C en la parte inferior de cada cadena.

Las cadenas tanto ligeras como pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan de manera funcional. En este sentido, se apreciará que los dominios variables de porciones tanto de cadena ligera (VK) como pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad antigénica. A la inversa, los dominios constantes de la cadena ligera (CK) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes, tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se encuentran más distantes del sitio de unión a antígeno o del extremo amino del anticuerpo. La porción aminoterminal es una región variable y la porción carboxiterminal es una región constante; los dominios CH3 y CK comprenden, de hecho, el extremo carboxilo de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Tal como se indica anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca de manera selectiva y se una de manera específica a epítopos en antígenos. Es decir, el dominio VK y el dominio VH, o un subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria de anticuerpo forma el sitio de unión a antígeno presente al extremo de cada brazo de la Y. De manera más específica, el sitio de unión a antígeno está definido por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VK (es decir, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3). En algunos casos, por ejemplo, determinadas moléculas de inmunoglobulina procedentes de especies de camélidos o genomanipuladas a partir de inmunoglobulinas de camélidos, una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir únicamente en cadenas pesadas, sin cadenas ligeras. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).

En los anticuerpos de origen natural, las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión a antígeno son secuencias de aminoácidos cortas y no contiguas que se posicionan de manera específica para formar el dominio de unión a antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión a antígeno, denominados regiones "marco", muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Por lo tanto, las regiones marco actúan formando un armazón que posibilita el posicionamiento de las CDR en la orientación correcta mediante interacciones intercadena no covalentes. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo afín. Los aminoácidos que forman las CDR y las regiones marco, respectivamente, pueden identificarse fácilmente para cualquier región variable de cadena pesada o ligera por un experto habitual en la materia, ya que se han definido de manera precisa (véase "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

En el caso de que existan dos o más definiciones de un término que se utilice y/o acepte dentro de la materia, la definición del término tal como se utiliza en el presente documento pretende incluir todos esos significados a menos que se indique de manera explícita otra cosa. Un ejemplo específico es el uso de la expresión "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Las definiciones de CDR de acuerdo con Kabat y Chothia incluyen superposición o subconjuntos de restos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo se encuentre dentro del alcance del término tal como se define y usa en el presente documento. Los restos de aminoácidos adecuados que abarcan las CDR tal como se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen en la tabla a continuación a modo de comparación. El número exacto de restos que abarca una CDR particular variará dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar de manera rutinaria qué restos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para las secuencias del dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Una persona normalmente versada en la materia puede asignar de manera unívoca este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin basarse en cualquier dato experimental más allá de la secuencia en sí. Como se utiliza en el presente documento, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983).

Además de la tabla anterior, el sistema numérico de Kabat describe las regiones CDR de la siguiente manera: la CDR-H1 comienza aproximadamente en el aminoácido 31 (es decir, aproximadamente 9 restos después del primer resto de cisteína), incluye aproximadamente de 5 a 7 aminoácidos y termina en el siguiente resto de triptófano. La CDR-H2 comienza en el decimoquinto resto después del final de la CDR-H1, incluye aproximadamente de 16 a 19 aminoácidos y termina en el siguiente resto de arginina o lisina. La CDR-H3 comienza aproximadamente en el trigésimo tercer resto de aminoácido después del final de la CDR-H2; incluye de 3 a 25 aminoácidos; y termina en la secuencia W-G-X-G, donde X es cualquier aminoácido. La CDR-L1 comienza aproximadamente en el resto 24 (es decir, después de un resto de cisteína); incluye aproximadamente de 10 a 17 restos; y termina en el siguiente resto de triptófano. La CDR-L2 comienza aproximadamente en el decimosexto resto después del final de la CDR-L1 e incluye aproximadamente 7 restos. La CDR-L3 comienza aproximadamente en el trigésimo tercer resto después del final de la CDR-L2 (es decir, después de un resto de cisteína); incluye aproximadamente de 7 a 11 restos y termina en la secuencia F o W-G-X-G, donde X es cualquier aminoácido.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden ser de cualquier origen animal, incluidos pájaros y mamíferos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de burro, de conejo, de cabra, de cobaya, de camello, de llama, de caballo o de pollo. En otra realización, la región variable puede ser de origen condrictoides (por ejemplo, de tiburones).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región constante de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos procedentes de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una región constante de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (p. ej., región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento de los mismos. Por ejemplo, un polipéptido de unión a antígeno para usar en la divulgación puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH3, o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido de la divulgación comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Asimismo, un anticuerpo para usar en la divulgación puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (p. ej., todo o parte de un dominio CH2). Como se ha expuesto anteriormente, un experto en la materia entenderá que la región constante de cadena pesada puede modificarse de manera que varíe en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de origen natural.

La región constante de cadena pesada de un anticuerpo divulgado en el presente documento puede proceder de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una región constante de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 procedente de una molécula de IgG1 y una región bisagra procedente de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una región constante de cadena pesada puede comprender una región bisagra procedente, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica procedente, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región constante de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos procedentes de la cadena ligera del anticuerpo. Preferentemente, la región constante de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio k constante o un dominio A constante.

Un "par de cadena ligera-cadena pesada" se refiere a la colección de una cadena ligera y una cadena pesada que pueden formar un dímero a través de un enlace disulfuro entre el dominio CL de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

Como se ha indicado previamente, las estructuras de las subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "dominio VH" incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y la expresión "dominio CH1" incluye el primer dominio de región constante (el más amino terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio c H l es adyacente al dominio VH y es amino terminal a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el resto 244 al resto 360 de un anticuerpo usando esquemas de numeración convencionales (restos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y restos 231 a 340, sistema de numeración EU; véase Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983). El dominio CH2 es exclusivo ya que no está emparejado de forma cercana con otro dominio. Más bien, dos cadenas de hidratos de carbono ramificadas unidas a N se interponen entre los dos dominios CH2 de una IgG natural e inalterada. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el extremo carboxiterminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 restos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 restos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión a antígeno aminoterminales se muevan de manera independiente. Las regiones bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG de origen natural, las regiones CH1 y CK están unidas mediante un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas mediante dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 utilizando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración de EU).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo quimérico" significará cualquier anticuerpo en donde la región o el sitio inmunorreactivo se obtiene o procede de una primera especie y la región constante (que puede estar inalterada, parcial o modificada de acuerdo con la presente descripción) se obtiene de una segunda especie. En determinadas realizaciones, la región o el sitio de unión diana será de una fuente no humana (p. ej., ratón o primate) y la región constante será humana.

Como se utiliza en el presente documento, el "porcentaje de humanización" se calcula mediante la determinación del número de diferencias de aminoácidos del marco (es decir, diferencia no CDR) entre el dominio humanizado y el dominio de la línea germinal, restando ese número del número total de aminoácidos, y después dividiéndolo por el número total de aminoácidos y multiplicándolo por 100.

Por "se une de manera específica" o "tiene especificidad por", se entiende en general que un anticuerpo se une a un epítopo a través de su dominio de unión a antígeno y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une de manera específica" a un epítopo cuando se une a dicho epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno, con mayor facilidad que a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se usa en el presente documento para calificar la afinidad relativa con la que un anticuerpo concreto se une a un epítopo concreto. Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad por un epítopo que el anticuerpo "B", o puede decirse que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene por el epítopo relacionado "D".

Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como la progresión del cáncer. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, una patología estabilizada (es decir, que no empeora), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o atenuación de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o el trastorno, así como aquellos propensos a tener la afección o el trastorno, o aquellos en los que se quiera prevenir la afección o el trastorno.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que se desea un diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos, animales domésticos, animales de granja y animales de zoológico, de deportes o mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas y así sucesivamente.

Como se utiliza en el presente documento, expresiones tales como "a un paciente que necesita tratamiento" o "un sujeto que necesita tratamiento" incluyen sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiaría de la administración de un anticuerpo o composición de la presente divulgación utilizada, por ejemplo, para la detección, para un procedimiento de diagnóstico y/o para un tratamiento.

Anticuerpos anti-CD73

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-CD73 con elevada afinidad y actividad inhibidora sobre la proteína CD73 humana. Los anticuerpos pueden unirse de manera eficaz tanto a CD73 libre como a CD73 en las superficies celulares. Una vez unido a una proteína CD73 en la superficie celular, la unión puede desencadenar la internalización, dando como resultado una reducción de la expresión en la superficie celular de la proteína CD73 que reduce la adenosina extracelular y el entorno tumoral inmunodepresor. Asimismo, como estos anticuerpos no compiten con el sustrato de AMP en la unión al sitio activo de CD73, sino que actúan de forma alostérica o a través de otros mecanismos no competitivos, estos anticuerpos no interfieren con la unión de CD73 con estos sustratos endógenos de AMP, lo que limita los posibles efectos adversos de estos anticuerpos.

Además, como se demuestra en los ejemplos experimentales, estos anticuerpos presentaron algunas propiedades únicas que no se observaron con anticuerpos anti-CD73 conocidos, tales como MEDI-9447 de Medimmune. Como se muestra en el ejemplo 12, mientras que MEDI-9447 y 11F11 se unen a los dominios aminoterminales de la proteína CD73, los aminoácidos diana de los presentes anticuerpos (por ejemplo, Y345, D399, E400, R401 y R480) están en los dominios carboxiterminal.

La enzima CD73 consiste en un dímero de dos subunidades idénticas de 70 kD unidas mediante un enlace glucosilfosfatidilinositol a la cara externa de la membrana plasmática. Las estructuras cristalinas de la CD73 dimérica humana revelan un extenso cambio conformacional entre una forma abierta y una cerrada de la enzima, que es necesaria para el correcto funcionamiento de la enzima. La interfaz de dimerización está formada por los dominios carboxiterminales. Cuando los dominios carboxiterminales están implicados en otros enlaces, se contempla que la dimerización y/o el cambio conformacional se bloquearán dando como resultado la inhibición de la actividad de CD73. La unión a un anticuerpo por los dominios aminoterminales, por el contrario, podría no tener dichos efectos.

Por lo tanto, se contempla que cuando los anticuerpos divulgados actualmente se unen a la proteína CD73 en sus dominios carboxiterminales, bloquearán la dimerización de la proteína e inhibirán de manera eficaz su actividad. Los anticuerpos actualmente divulgados, por lo tanto, son muy superiores a los anticuerpos anti-CD73 previamente conocidos, que se unen a los dominios aminoterminales.

De acuerdo con una realización de la presente divulgación, por lo tanto, se proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que tiene especificidad por una proteína CD73 humana y se une a uno o más restos de aminoácidos seleccionados de la porción carboxiterminal de la proteína CD73 humana. La porción carboxiterminal de la proteína CD73 humana, como se conoce en la materia, incluye 238 restos de aminoácidos a partir del resto 337, como se muestra en la SEQ ID NO: 61 en la siguiente tabla.

Tabla A. Secuencia de CD73:

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345 y D399. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345 y E400. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345 y R401. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a D399 y E400. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a D399 y R401. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a D399 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a E400 y R401. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a E400 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a R401 y R480.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, D399 y E400. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, D399 y R401. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, D399 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, E400 y R401. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, E400 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, R401 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a D399, E400 y R401. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a D399, E400 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a E400, R401 y R480.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, D399, E400 y R401. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, D399, E400 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, D399, R401 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a Y345, E400, R401 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al menos a D399, E400, R401 y R480. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a cada uno de Y345, D399, E400, R401 y R480.

De acuerdo con una realización de la presente divulgación, se proporciona un anticuerpo que incluye los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera con las regiones CDR como se definen en las SEQ ID NO: 1 a 6.

T l 1 n i l r i n DR

Como se demuestra en los ejemplos experimentales, los anticuerpos que contenían estas regiones CDR, ya sean de ratón, humanizados o quiméricos, tenían potentes actividades inhibidoras y de unión a CD73. El modelado adicional por ordenador indicó que determinados restos dentro de la CDR se pueden modificar para conservar o mejorar la propiedad de los anticuerpos. Dichos restos se denominan "puntos calientes" que se subrayan en la tabla 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 de la presente divulgación incluye las CDR de VH y VL que se enumeran en la tabla 1, con una, dos o tres modificaciones más. Dichas modificaciones pueden ser adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos.

En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución en no más de una posición de punto caliente de cada una de las CDR. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución en una, dos o tres de dichas posiciones de puntos calientes. En una realización, la modificación es una sustitución en una de las posiciones de puntos calientes. Dichas sustituciones, en algunas realizaciones, son sustituciones conservadoras.

Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que se reemplaza el resto de aminoácido por un resto de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. Se han definido en la materia familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina y histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales p-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Por lo tanto, se reemplaza preferentemente un resto de aminoácido no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. En otra realización, puede reemplazarse una serie de aminoácidos por una serie estructuralmente similar que difiere en orden y/o composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.

En la siguiente tabla se proporcionan ejemplos no limitativos de sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde una puntuación de similitud de 0 o superior indica una sustitución conservadora entre los dos aminoácidos.

Tabla 2. Matriz de similitud de aminoácidos

Tabla 3. Sustituciones conservadoras de aminoácidos

Se proporcionan ejemplos específicos de CDR con sustituciones adecuadas en las SEQ ID NO: 26 a 56 del ejemplo 7. En algunas realizaciones, por lo tanto, un anticuerpo de la presente divulgación incluye una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1 o una cualquiera de 26 a 29. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación incluye una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2 o una cualquiera de 30 a 36. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación incluye una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 1 o una cualquiera de 37 a 41. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación incluye una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4 o una cualquiera de 42 a 45. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación incluye una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación incluye una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6 o una cualquiera de 46 a 56.

En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento del mismo incluye no más de una, no más de dos o no más de tres de las sustituciones anteriores. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo incluye una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1 o una cualquiera de las SEQ ID NO: 26 a 29, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2, una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo incluye una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2 o una cualquiera de las SEQ ID NO: 30 a 36, una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo incluye una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2, una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3 o una cualquiera de las SEQ ID NO: 37 a 41, una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo incluye una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2, una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4 o una cualquiera de las SEQ ID NO: 42 a 45, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo incluye una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 2, una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6 o una cualquiera de las SEQ ID NO: 46 a 56.

Se proporcionan ejemplos no limitantes de VH en las SEQ ID NO: 7 y 9 a 13, de las cuales la SEQ ID NO: 10 es la VH ratón y las SEQ ID NO: 7, 9 y 11 a 13 son humanizadas. Asimismo, entre las VH humanizadas, las SEQ ID NO: 7, 9 y 12 a 13 incluyen una o más retromutaciones a la versión de ratón. Del mismo modo, se proporcionan ejemplos no ^{limitantes de}Vl ^{(VK) en las SEQ ID NO: 8, 15 a 20 y 22 a 24. La SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ratón, las SEQ}ID NO: 16 y 22 son las secuencias humanizadas originalmente derivadas como se muestra en los ejemplos. Las SEQ ID NO: 8, 17 a 20 y 22 a 24 son VL humanizadas con retromutaciones.

Se muestra que las retromutaciones son útiles para conservar determinadas características de los anticuerpos anti-CD73. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la presente divulgación, en particular los humanos o humanizados, incluyen una o más de las retromutaciones. En algunas realizaciones, la retromutación de VH (es decir, el aminoácido incluido en la posición especificada) es una o más seleccionadas de (a) Thr en la posición 30, (b) Lys en la posición 44, (c) Met en la posición 48, (d) Ile en la posición 67 y (e) Arg en la posición 71, de acuerdo con la numeración de Kabat y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la retromutación de VL es una o más seleccionadas de (a) Ser en la posición 5, (b) Pro en la posición 46, (c) Trp en la posición 47, (d) Ser en la posición 49, (e) Ser en la posición 70 y (f) Tyr en la posición 71, de acuerdo con la numeración de Kabat y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD73 de la presente divulgación incluye una VH de SEQ ID NO: 7 o una cualquiera de 9 a 13, una VL de SEQ ID NO: 8 o una cualquiera de 15 a 20 y 22 a 24 o sus respectivos equivalentes biológicos. Un equivalente biológico de una VH o VL es una secuencia que incluye los aminoácidos designados mientras tiene una identidad de secuencia global del 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 %. Un equivalente biológico de la SEQ ID NO: 7, por lo tanto, puede ser una VH que tenga una identidad de secuencia global del 80 %, ^{el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % con la SEQ ID}nO: ^{7 pero conserva las CDR (SEQ ID NO: 1 a 6 o sus}variantes), y opcionalmente conserva una o más, o todas, las retromutaciones.

En una realización, la VH tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En una realización, la VH tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Un experto en la materia también entenderá que los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden modificarse de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión de origen natural del que proceden. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o de aminoácidos procedente de una proteína designada puede ser similar, por ejemplo, tener un determinado porcentaje de identidad con la secuencia inicial, por ejemplo, puede ser el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia inicial.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos o una o más fracciones normalmente no asociados con un anticuerpo. Las modificaciones ilustrativas se describen con más detalle a continuación. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede comprender una secuencia enlazadora flexible o puede modificarse para añadir una fracción funcional (por ejemplo, PEG, un fármaco, una toxina o un marcador).

Los anticuerpos, variantes o derivados del mismo de la divulgación incluyen derivados que se modifican, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de modo que dicha unión covalente no impide la unión del anticuerpo al epítopo. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los anticuerpos se pueden modificar, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, que incluyen, aunque no de forma limitativa, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, los anticuerpos pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden conjugarse con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, productos farmacéuticos o PEG.

Los anticuerpos pueden conjugarse o fusionarse con un agente terapéutico, que puede incluir marcadores detectables tales como marcadores radiactivos, un inmunomodulador, una hormona, una enzima, un oligonucleótido, un agente terapéutico o de diagnóstico fotoactivo, un agente citotóxico, que puede ser un fármaco o una toxina, un agente potenciador de ultrasonido, un marcador no radiactivo, una combinación de los mismos y otros agentes conocidos en la materia.

Los anticuerpos se pueden marcar de manera detectable mediante el acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. A continuación, se determina la presencia del polipéptido de unión a antígeno marcado con quimioluminiscencia mediante la detección de la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio theromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Los anticuerpos también se pueden marcar de manera detectable con metales que emiten fluorescencia tales como 152Eu u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales se pueden unir al anticuerpo utilizando grupos quelantes de metales como el ácido dietilentriaminopentacético (DTPA) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTa ). Las técnicas para conjugar varias fracciones a un anticuerpo son bien conocidas, véanse, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., págs. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press págs. 303-16 (1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)).

Polinucleótidos que codifican los anticuerpos y métodos para preparar los anticuerpos

La presente divulgación también proporciona polinucleótidos aislados o moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, variantes o derivados del mismo de la divulgación. Los ejemplos de polinucleótidos incluyen las SEQ ID NO: 57 a 60. Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden codificar las regiones variables completas de cadena pesada y ligera de los polipéptidos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos en la misma molécula polinucleotídica o en moléculas polinucleotídicas separadas. Además, los polinucleótidos de la presente divulgación pueden codificar porciones de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los polipéptidos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos en la misma molécula polinucleotídica o en moléculas polinucleotídicas separadas.

Los métodos para preparar anticuerpos son bien conocidos en la materia y se describen en el presente documento. En determinadas realizaciones, las regiones tanto variable como constante de los polipéptidos de unión a antígeno de la presente divulgación son completamente humanas. Los anticuerpos completamente humanos pueden fabricarse con técnicas descritas en la materia y como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos completamente humanos contra un antígeno específico mediante la administración del antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero cuyos loci endógenos se han desactivado. Se describen ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para producir dichos anticuerpos en las patentes de EE. UU.: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos preparados no provocarán una respuesta inmunitaria perjudicial en el animal a tratar, por ejemplo, en un ser humano. En una realización, los polipéptidos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la divulgación se modifican para reducir su inmunogenia con técnicas reconocidas en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser humanizados, primatizados, desinmunizados o se pueden preparar anticuerpos quiméricos. Estos tipos de anticuerpos proceden de un anticuerpo no humano, normalmente, un anticuerpo murino o de primate, que conserva o conserva sustancialmente las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo parental, pero que es menos inmunogénico en seres humanos. Esto puede lograrse mediante numerosos métodos, que incluyen (a) injertar los dominios variables no humanos completos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos; (b) injertar al menos una parte de una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas en regiones marco y constantes humanas con o sin retención de restos estructurales clave; o (c) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero "vistiéndolos" con una sección de tipo humano mediante el reemplazo de restos superficiales. Dichos métodos se divulgan en Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994) y las patentes de EE. UU. n.°: 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.190.370.

También se puede utilizar desinmunización para reducir la inmunogenia de un anticuerpo. Como se utiliza en el presente documento, el término "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo para modificar epítopos de linfocitos T (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes internacionales n.°: WO/9852976 A1 y w O/0034317 A2). Por ejemplo, se analizan secuencias variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo inicial y se crea un "mapa" de epítopos de linfocitos T humanos de cada región V que muestra la ubicación de los epítopos en relación con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y otros restos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de linfocitos T individuales del mapa de epítopos de linfocitos T se analizan para identificar sustituciones de aminoácidos alternativas con un bajo riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseña una serie de secuencias variables pesadas y variables ligeras alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan posteriormente en una serie de polipéptidos de unión. Normalmente, se generan entre 12 y 24 variantes de anticuerpos y se analiza su unión y/o función. Los genes completos de cadena pesada y ligera que comprenden regiones constantes humanas y variables modificadas se clonan después en vectores de expresión y los plásmidos posteriores se introducen en estirpes celulares para la producción de anticuerpos completos. A continuación, los anticuerpos se comparan en ensayos bioquímicos y biológicos adecuados, y se identifica la variante óptima.

La especificidad de unión de los polipéptidos de unión a antígeno de la presente divulgación se puede determinar mediante ensayos in vitro tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

De manera alternativa, técnicas descritas para la producción de unidades monocatenarias (patente de EE. UU. n.° 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879-5883 (1988); y Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) se pueden adaptar para producir unidades monocatenarias de la presente divulgación. Las unidades monocatenarias se forman mediante la unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un péptido de fusión monocatenario. También pueden utilizarse técnicas para el ensamblaje de los fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).

Los ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para producir Fvs monocatenarios (scFv) y anticuerpos incluyen los descritos en las patentes de EE. UU. n.° 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de los anticuerpos en seres humanos y los ensayos de detección in vitro, puede ser preferible utilizar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las distintas porciones del anticuerpo proceden de distintas especies animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable procedente de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la materia. Véanse, p. ej., Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); y las patentes de EE. UU. n.° 5.807.715; 4.816.567; y 4,816397.

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo procedentes de un anticuerpo de especie no humana que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana. Con frecuencia, los restos del marco en las regiones marco humanas se sustituirán con el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente, mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones de la región marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo, mediante la modelización de las interacciones de la CDR y restos marco para identificar los restos marco importantes para la unión a antígeno y la comparación de secuencias para identificar los restos marco poco habituales en posiciones particulares. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., la patente de EE. UU. n.° 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).) Los anticuerpos se pueden humanizar con diversas técnicas conocidas en la materia, que incluyen, por ejemplo, el injerto de CDR (documento EP 239.400; publicación PCT WO 91/09967; y las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), remodelación o acondicionamiento de superficie (documentos EP 592.106; EP 519596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. u Sa 91:969-973 (1994)), y transposición de cadenas (Patente de Ee . UU. n.° 5.565.332).

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse mediante diversos métodos conocidos en la materia que incluyen métodos de presentación en fagos usando bibliotecas de anticuerpos procedentes de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse también, las patentes de EE. UU. n.° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana pueden introducirse de manera aleatoria o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. De manera alternativa, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes humanos de cadena pesada y ligera. Los genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada de ratón pueden volverse no funcionales por separado o de manera simultánea con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la eliminación homocigótica de la región JH impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se crían para producir una descendencia homocigota que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una parte de un polipéptido diana deseado. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener de los ratones transgénicos inmunizados con tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana hospedados por los ratones transgénicos se redisponen durante la diferenciación de los linfocitos B y experimentan posteriormente cambio de clase y mutación somática. Por lo tanto, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995). Para una descripción detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y los protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; y las patentes de EE. UU. n.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; y 5.939.598. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, California) y GenPharm (San Jose, California) pueden participar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado con una tecnología similar a la descrita anteriormente.

También se pueden generar anticuerpos completamente humanos que reconozcan un epítopo seleccionado con una técnica denominada como "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). Véanse también, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332).

En otra realización, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales deseados se aísla fácilmente y se secuencia con procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse de manera específica a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma aisladas y subclonadas sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras procariotas o eucariotas, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen inmunoglobulinas. Más particularmente, el ADN aislado (que puede ser sintético, tal como se describe en el presente documento) puede utilizarse para clonar secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos tal como se describen en Newman et al., patente de EE. UU. n.° 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995. De manera esencial, esto implica la extracción de ARN de las células seleccionadas, la conversión en ADNc y la amplificación mediante PCR usando cebadores específicos de Ig. También se describen cebadores adecuados para este fin en la patente de EE. UU. n.° 5.658.570. Como se discutirá con más detalle a continuación, las células transformadas que expresan el anticuerpo deseado pueden cultivarse en cantidades relativamente elevadas para proporcionar suministros clínicos y comerciales de la inmunoglobulina.

Además, usando técnicas rutinarias de ADN recombinante, una o más de las CDR de los polipéptidos de unión a antígeno de la presente divulgación, pueden insertarse dentro de las regiones del marco, por ejemplo, en regiones marco humanas para humanizar un anticuerpo no humano. Las regiones marco pueden ser regiones marco de origen natural o de consenso, y preferentemente regiones marco humanas (véase, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol.

278:457-479 (1998) para una lista de regiones marco humanas). Preferentemente, el polinucleótido generado mediante la combinación de las regiones marco y las CDR codifica un anticuerpo que se une de manera específica a al menos un epítopo de un polipéptido deseado, por ejemplo, LIGHT. Preferentemente, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones marco y, preferentemente, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo a su antígeno. Además, dichos métodos se pueden utilizar para hacer sustituciones o eliminaciones de aminoácidos de uno o más restos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracatenarios. Otras alteraciones del polinucleótido están comprendidas en la presente divulgación y dentro de la habilidad de la materia.

Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) mediante el empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón, de especificidad antigénica adecuada, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica adecuada. Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las distintas porciones proceden de distintas especies animales, tales como las que tienen una región variable procedente de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana.

Incluso otro medio altamente eficaz para generar anticuerpos recombinantes se divulga por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). De manera específica, esta técnica da como resultado la generación de anticuerpos primatizados que contienen dominios variables de mono y secuencias constantes humanas. Además, esta técnica también se describe en las patentes de EE. UU. n.° 5.658.570, 5.693.780 y 5.756.096.

De manera alternativa, pueden seleccionarse estirpes celulares productoras de anticuerpos y cultivarse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas técnicas se describen en una serie de manuales de laboratorio y de publicaciones primarias. En este sentido, las técnicas adecuadas para usar en la divulgación como se han descrito anteriormente se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates y Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, Nueva York (1991).

Además, las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia se pueden utilizar para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la presente divulgación, que incluyen, pero sin limitación, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que dan como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, las variantes (incluidos los derivados) codifican sustituciones de menos de 50 aminoácidos, sustituciones de menos de 40 aminoácidos, sustituciones de menos de 30 aminoácidos, sustituciones de menos de 25 aminoácidos, sustituciones de menos de 20 aminoácidos, sustituciones de menos de 15 aminoácidos, sustituciones de menos de 10 aminoácidos, sustituciones de menos de 5 aminoácidos, sustituciones de menos de 4 aminoácidos, sustituciones de menos de 3 aminoácidos o sustituciones de menos de 2 aminoácidos en relación con la región variable de cadena pesada de referencia, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, región variable de cadena ligera, CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3. De manera alternativa, las mutaciones se pueden introducir de manera aleatoria a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación y se pueden seleccionar los mutantes resultantes respecto a su actividad biológica para identificar los mutantes que conservan la actividad.

Métodos de tratamiento

Como se describe en el presente documento, los anticuerpos, variantes o derivados de la presente divulgación pueden utilizarse en determinados tratamientos y métodos de diagnóstico.

La presente divulgación se dirige además a terapias basadas en anticuerpos que implican la administración de los anticuerpos de la divulgación a un paciente tal como un animal, un mamífero y un ser humano para tratar uno o más de los trastornos o afecciones descritas en el presente documento. Los compuestos terapéuticos de la divulgación incluyen, pero sin limitación, anticuerpos de la divulgación (que incluyen variantes y derivados de los mismos como se describe en el presente documento) y ácidos nucleicos o polinucleótidos que codifican anticuerpos de la divulgación (que incluyen variantes y derivados de los mismos como se describe en el presente documento).

Los anticuerpos de la divulgación también se pueden utilizar para tratar o inhibir el cáncer. Según lo dispuesto anteriormente, CD73 puede sobreexpresarse en células tumorales. La CD73 procedente de un tumor puede funcionar como una ectoenzima para producir adenosina extracelular, que promueve el crecimiento tumoral al limitar la inmunidad de los linfocitos T antitumorales a través de la señalización del receptor de adenosina. Los resultados con inhibidores de moléculas pequeñas, o anticuerpos monoclonales dirigidos a CD73 en modelos de tumores murinos, indican que la terapia dirigida con CD73 es una alternativa importante y un enfoque realista para el control eficaz del crecimiento tumoral. En particular, ayuda a la terapia basada en linfocitos T al mejorar la maquinaria de respuesta inmunitaria adaptativa, lo que puede aumentar la función de los linfocitos T infiltrantes de tumores y conducir a una mejor supervivencia en pacientes con cáncer.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, se proporcionan composiciones para usar en métodos para tratar un cáncer en un paciente que lo necesite. El método, en una realización, implica administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente divulgación. En algunas realizaciones, al menos una de las células cancerosas (por ejemplo, células del estroma) en el paciente sobreexpresa CD73.

Los ejemplos no limitantes de cánceres se incluyen cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.

También se proporcionan en la presente divulgación terapias celulares y más específicamente terapias de linfocitos T con receptor quimérico para el antígeno (CAR). Se puede utilizar un linfocito T adecuado, que se pone en contacto con un anticuerpo anti-CD73 de la presente divulgación (o, de manera alternativa, se genomanipula para expresar un anticuerpo anti-CD73 de la presente divulgación). Tras dicho contacto o genomanipulación, el linfocito T puede entonces introducirse a un paciente con cáncer que necesita un tratamiento. El paciente con cáncer puede tener un cáncer de cualquiera de los tipos divulgados en el presente documento. El linfocito T puede ser, por ejemplo, un linfocito T infiltrante de tumores, un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+ o la combinación de los mismos, sin limitación.

En algunos aspectos, el linfocito T se aisló del propio paciente con cáncer. En algunos aspectos, el linfocito T se proporcionó por un donante o de un banco de células. Cuando el linfocito T se aísla del paciente con cáncer, las reacciones inmunitarias no deseadas pueden minimizarse.

Las enfermedades o afecciones adicionales asociadas con una mayor supervivencia celular, que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con los anticuerpos o variantes o derivados de los mismos de la divulgación incluyen, pero sin limitación, progresión y/o metástasis de tumores malignos y trastornos relacionados tales como la leucemia (que incluyen leucemias agudas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (que incluye mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada y tumores sólidos que incluyen, pero sin limitación, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.

Una dosificación y régimen de tratamiento específico para cualquier paciente concreto dependerán de una variedad de factores, que incluyen los anticuerpos particulares, variante o derivado del mismo utilizado, la edad del paciente, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta y el momento de la administración, la tasa de excreción, la combinación farmacológica y la intensidad de la enfermedad particular a tratar. El juicio de dichos factores por parte de los cuidadores médicos está dentro de la experiencia ordinaria en la materia. La cantidad también dependerá del paciente individual a tratar, la vía de administración, el tipo de formulación, las características del compuesto utilizado, la intensidad de la enfermedad y el efecto deseado. La cantidad utilizada se puede determinar mediante principios farmacológicos y farmacocinéticos bien conocidos en la materia.

Los métodos de administración de los anticuerpos, variantes o derivados incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los polipéptidos o composiciones de unión a antígeno pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos de unión a antígeno de la divulgación pueden administrarse por vía oral, por vía rectal, por vía parenteral, por vía intracistémica, por vía intravaginal, por vía intraperitoneal, por vía tópica (en forma de polvos, pomadas, gotas o parche transdérmico), por vía bucal o como un aerosol oral o nasal.

El término "parenteral", como se utiliza en el presente documento, se refiere a modos de administración que incluyen inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular.

La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir los anticuerpos de la divulgación en el sistema nervioso central mediante cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. Se puede emplear también la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y formulación con un agente de formación de aerosol.

Puede ser deseable administrar los polipéptidos de unión a antígeno o composiciones de la divulgación de manera local en la zona que necesite tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local durante una cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunto, con un apósito para heridas después de la cirugía, mediante inyección, mediante un catéter, mediante un supositorio o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso o no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Preferentemente, cuando se administra una proteína, incluyendo un anticuerpo, de la divulgación, debe prestarse atención en usar materiales que no absorban la proteína.

En otra realización, el polipéptido de unión a antígeno o la composición se pueden administrar en una vesícula, en particular, un liposoma (véase Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; véase generalmente ibid).

En aún otra realización, el polipéptido de unión a antígeno o la composición se pueden administrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede utilizar una bomba (véanse Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg.

71:105). En aún otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad con la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo por tanto solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). En la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533, se mencionan otros sistemas de liberación controlada.

En un aspecto específico donde la composición de la divulgación comprende un ácido nucleico o polinucleótido que codifica una proteína, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, mediante su construcción como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y su administración de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retrovírico (véase la patente de EE. UU. n.° 4.980.286) o mediante inyección directa o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont) o mediante el recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección o mediante su administración en asociación con un péptido de tipo homeocaja que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. De manera alternativa, se puede introducir un ácido nucleico de manera intracelular e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para su expresión, mediante recombinación homóloga.

La cantidad de los anticuerpos de la divulgación que serán eficaces en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria, inmunitaria o maligna se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Además, pueden emplearse de manera opcional ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos óptimos de dosificación. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad, trastorno o condición, y debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba de modelos in vitro o animales.

Como regla general, la dosis administrada a un paciente de los polipéptidos de unión a antígeno de la presente divulgación es normalmente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente, entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, o entre 1 mg/kg y 10 mg/kg del peso corporal del paciente. En general, los anticuerpos humanos tienen una semivida más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos extraños. Por lo tanto, a menudo son posibles dosis más bajas de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente. Asimismo, la dosificación y la frecuencia de administración de los anticuerpos de la divulgación pueden reducirse mejorando la captación y la penetración tisular (por ejemplo, en el cerebro) de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.

Los métodos para tratar una enfermedad, condición o trastorno infeccioso o maligno que comprenden la administración de un anticuerpo, variante o derivado del mismo de la divulgación se prueban normalmente in vitro y después in vivo en un modelo animal aceptable, para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de usarlos en seres humanos. Los modelos animales adecuados, que incluyen animales transgénicos, son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los ensayos in vitro para demostrar la utilidad terapéutica del polipéptido de unión a antígeno descrito en el presente documento incluyen el efecto de un polipéptido de unión a antígeno en una estirpe celular o una muestra de tejido de un paciente. El efecto del polipéptido de unión a antígeno en la estirpe celular y/o la muestra de tejido se puede determinar utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia, tales como los ensayos divulgados en otra parte del presente documento. De acuerdo con la divulgación, los ensayos in vitro que se pueden utilizar para determinar si está indicada la administración de un polipéptido de unión a antígeno específico, incluyen ensayos de cultivos celulares in vitro en los que se cultiva una muestra de tejido del paciente, y se expone a un compuesto, o se le administra de otro modo, y se observa el efecto de dicho compuesto en la muestra de tejido.

Se conocen varios sistemas de administración y se pueden utilizar para administrar un anticuerpo de la divulgación o un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la divulgación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que pueden expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), la construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico u otro, etc.

En una realización adicional, las composiciones de la divulgación se administran en combinación con un agente antineoplásico, un agente antivírico, agente antibacteriano o antibiótico o agentes antifúngicos. Cualquiera de estos agentes conocidos en la materia puede administrarse en las composiciones de la presente divulgación.

En otra realización, las composiciones de la divulgación se administran en combinación con un agente quimioterápico. Los agentes quimioterápicos que se pueden administrar con las composiciones de la divulgación incluyen, pero sin limitación, derivados de antibióticos (por ejemplo, doxorrubicina, bleomicina, daunorrubicina y dactinomicina); antiestrógeno (por ejemplo, tamoxifeno); antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo, 5-FU, metotrexato, floxuridina, interferón a-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina y 6-tioguanina); agentes citotóxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfano, cisplatino y sulfato de vincristina); hormonas (por ejemplo, medroxiprogesterona, fosfato sódico de estramustina, etinilestradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno y testolactona); derivados de la mostaza nitrogenada (por ejemplo, mefaleno, corambucilo, mecloretamina (mostaza nitrogenada) y tiotepa); esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato sódico de betametasona); y otros (por ejemplo, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina y etopósido).

En una realización adicional, las composiciones de la divulgación se administran en combinación con citocinas. Las citocinas que se pueden administrar con las composiciones de la divulgación incluyen, pero sin limitación, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, anti-CD40, CD40L y TNF-a.

En realizaciones adicionales, las composiciones de la divulgación se administran en combinación con otros regímenes terapéuticos o profilácticos, tales como, por ejemplo, radioterapia.

Terapias de combinación

También se proporcionan terapias de combinación, que incluyen el uso de uno o más de los anticuerpos anti-CD73 de la presente divulgación junto con un segundo agente antineoplásicos (quimioterápicos). Los agentes quimioterápicos pueden clasificarse por su mecanismo de acción en, por ejemplo, los siguientes grupos:

- antimetabolitos/agentes antineoplásicos tales como los análogos de pirimidina floxuridina, capecitabina y citarabina;

- análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados;

- agentes antiproliferativos/antimitóticos incluyendo productos naturales tales como alcaloides de la vinca (vinblastina y vincristina) y microtúbulos tales como taxano (paclitaxel y docetaxel), vinblastina, nocodazol, epotilonas, vinorelbina (NAVELBINE®) y epipodofilotoxinas (etopósido y tenipósido);

- Agentes que dañan el ADN tales como actinomicina, amsacrina, busulfano, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida (CYTOXAN® ), dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, ifosfamida, melfalán, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, procarbazina, taxol, taxotere, tenipósido, etopósido y trietilentiofosforamida;

- antibióticos tales como dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) y mitomicina;

- enzimas tales como L-asparaginasa que metaboliza de manera sistémica L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina;

- agentes antiplaquetarios;

- agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tales como mostazas nitrogenadas, ciclofosfamida y análogos (melfalán, clorambucilo, hexametilmelamina y tiotepa), alquil nitrosoureas (carmustina) y análogos, estreptozocina y triazenes (dacarbazina);

- antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato);

- complejos de coordinación de platino (cisplatino, oxiloplatino y carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano y aminoglutetimida;

- hormonas, análogos de hormonas (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida y nilutamida) e inhibidores de la aromatasa (letrozol y anastrozol);

- anticoagulantes tales como heparina, sales sintéticas de heparina y otros inhibidores de trombina;

- agentes fibrinolíticos tales como el activador tisular del plasminógeno, estreptocinasa, urocinasa, aspirina, dipiridamol, ticlopidina y clopidogrel;

- agentes antimigratorios;

- agentes antisecretores (breveldin);

- inmunodepresores tacrolimus, sirólimus, azatioprina y micofenolato;

- compuestos (TNP-470, genisteína) e inhibidores del factor de crecimiento (inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular e inhibidores del factor de crecimiento de fibroblastos);

- bloqueantes del receptor de angiotensina, donantes de óxido nítrico;

- oligonucleótidos antisentido;

- anticuerpos tales como trastuzumab y rituximab;

- inhibidores del ciclo celular e inductores de diferenciación tales como tretinoína;

- inhibidores, inhibidores de la topoisomerasa (doxorrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, enipósido, epirrubicina, etopósido, idarrubicina, irinotecán, mitoxantrona, topotecán e irinotecán) y corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona y prednisolona);

- inhibidores de cinasa de transducción de señal del factor de crecimiento;

- inductores de disfunción;

- toxinas tales como toxina del cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de adenilato ciclasa de Bordetella pertussis, toxina diftérica y activadores de caspasa;

- y cromatina.

Ejemplos adicionales de agentes quimioterápicos incluyen:

- agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®);

- alquilsulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán;

- aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa;

- emileruminas y memilamelaminas que incluyen alfretamina, triemilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforamida y trimemilolomelamina;

- acetogeninas, especialmente bulatacina y bulatacinona;

- una camptotecina, que incluye el análogo sintético topotecán;

- briostatina;

- calistatina;

- CC-1065, que incluye sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina;

- criptoficinas, en particular criptoficinas 1 y criptoficina 8;

- dolastatina;

- duocarmicina, que incluye los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI;

- eleuterobina;

- pancratistatina;

- una sarcodictina;

- espongistatina;

- mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y mostaza de uracilo;

- nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, foremustina, lomustina, nimustina y ranimustina;

- antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina y II y caliqueamicina Olí, dinemicina que incluye dinemicina A, bisfosfonatos tales como clodronato, una esperamicina, cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos del antibiótico enediina de la cromoproteína relacionada, aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carrninomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (que incluye morfolinodoxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolin-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorrubicina;

- antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU);

- análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina y trimetrexato;

- análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, y tioguanina;

- análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina y floxuridina;

- andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana y testolactona; - antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano;

- reponedor de ácido fólico tal como ácido folínico;

- tricotecenos, en especial la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina;

- taxoides tales como paclitaxel (TAXOL®) y docetaxel (TAXOTERE®);

- análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino;

- aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; hestrabucilo; bisantreno;

edatraxato; defofamina; demecolcina; diacicuona; elformtina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; leucovorina; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; fluoropirimidina; ácido folínico; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; polisacárido-K (PSK); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triacicuona; 2,2',2"triclorotriemilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiopeta; clorambucilo; gemcitabina (GEMZAr®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitroxantrona; vancristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeoloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DFMO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; FOLFIRI (fluorouracilo, leucovorina e irinotecán);

- y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

También se incluyen en la definición de "agente quimioterápico" los agentes antihormonales tales como los antiestrógenos y los moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (SERM, del inglés "selective estrogen receptor modulators"), inhibidores de la enzima aromatasa, antiandrógenos y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en los tumores.

Los ejemplos de antiestrógenos y SERM incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (que incluye NOLVADEX™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FARESTON®).

Los inhibidores de la enzima aromatasa regulan la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales. Los ejemplos incluyen 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGACE®), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (RIVISOR®), letrozol (FEMARA®) y anastrozol (ARIMIDEX®).

Los ejemplos de antiandrógenos incluyen flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina.

Los ejemplos de agentes quimioterápicos también incluyen agentes antiangiogénicos que incluyen, pero sin limitación, ácido retinoide y derivados del mismo, 2-metoxiestradiol, ANGIOSTATIN®, ENDOSTATIN®, suramina, escualamina, inhibidor tisular de metaloproteinasa-1, inhibidor tisular de metaloproteinasa-2, inhibidor-1 del activador de plasminógeno, inhibidor-2 del activador del plasminógeno, inhibidor derivado de cartílago, paclitaxel (nab-paclitaxel), factor plaquetario 4, sulfato de protamina (clupeína), derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de cáscaras de cangrejo de las nueves), complejo de peptidoglucano de polisacárido sulfatado (sppg), estaurosporina, moduladores del metabolismo de la matriz que incluyen los análogos de prolina ((ácido l-azetidina-2-carboxílico (LACA)), cishidroxiprolina, d,I-3,4-dehidroprolina, tiaprolina, a,a'-dipiridilo, fumarato de p-aminopropionitrilo, 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3h)-oxazolona, metotrexato, mitoxantrona, heparina, interferones, 2 suero de macroglobulina, inhibidor de metaloproteinasa-3 de pollo (ChIMP-3), quimostatina, tetradecasulfato de p-ciclodextrina, eponemicina, fumagilina, tiomalato de oro y sodio, d-penicilamina, suero de p-1-anticolagenasa, a-2-antiplasmina, bisantreno, lobenzarit disódico, disodio del ácido n-2-carboxifenil-4-cloroantrónico o "CCA", talidomida, esteroide angiostático, carboxi aminoimidazol e inhibidores de metaloproteinasas tales como BB-94. Otros agentes antiangiogénicos incluyen anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales contra estos factores de crecimiento angiogénicos: p-FGF, a-FGF, FGF-5, isoformas de VEGF, VEGF-C, HGF/SF y Ang-1/Ang-2.

Los ejemplos de agentes quimioterápicos también incluyen agentes antifibróticos que incluyen, pero sin limitación, los compuestos tales como p-aminoproprionitrilo (BAPN), así como los compuestos divulgados en la patente de EE. UU. n.°: 4.965.288 (Pafreyman, et al.) en relación con los inhibidores de la lisil oxidasa y su uso en el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con la deposición anormal de colágeno y la patente de EE. UU. N.°: 4.997.854 (Kagan et al.) en relación con compuestos que inhiben LOX para el tratamiento de diversos estados fibróticos patológicos. Inhibidores ilustrativos adicionales se describen en la patente de EE. UU. N.°: 4.943.593 (Pafreyman et al.) en relación con compuestos tales como 2-isobutil-3-fluoro-, cloro-, o bromo-alilamina, las patentes de EE. UU. N.°: 5.021.456 (Palfreyman et al.), 5.059.714 (Palfreyman et al.), 5.120.764 (Mccarthy et al.), 5.182.297 (Palfreyman et al.), ^{5.252.608 (Palfreyman et al.) en relación con 2-(1-naftiloximemil)-3-fluoroalilamina, y la publicación de}Ee. ^{UU. N.°:}2004/0248871 (Farjanel et al.).

Los ejemplos de agentes antifibróticos también incluyen las aminas primarias que reaccionan con el grupo carbonilo del sitio activo de las lisil oxidasas, y más particularmente aquellas que producen, después de unirse con el carbonilo, un producto estabilizado por resonancia, tal como las siguientes aminas primarias: emilenamina, hidrazina, fenilhidrazina y sus derivados; semicarbazida y derivados de urea; aminonitrilos tales como BAPN o 2-nitroetilamina; haloaminas insaturadas o saturadas tales como 2-bromo-etilamina, 2-cloroetilamina, 2-trifluoroetilamina, 3-bromopropilamina y p-halobencilaminas; y selenohomocisteína lactona.

Otros agentes antifibróticos son agentes quelantes de cobre que penetran o no en las células. Los compuestos ilustrativos incluyen inhibidores indirectos que bloquean los derivados de aldehido que se originan a partir de la desaminación oxidativa de los restos de lisil e hidroxilisil por parte de las lisil oxidasas. Los ejemplos incluyen las tiolaminas, en particular D-penicilamina, y sus análogos tales como ácido 2-amino-5-mercapto-5-metilhexanoico, ácido D-2-amino-3-metil-3-((2-acetamidoetil)ditio)butanoico, ácido p-2-amino-3-metil-3-((2-aminoetil)ditio)butanoico, -4-((p-1-dimetil-2-amino-2-carboxietil)ditio)butano sulfurato sódico, sulfanato de 2-acetamidoetil-2-acetamidoetanotiol y trihidrato de 4-mercaptobutanosulfinato de sodio.

Los ejemplos de agentes quimioterápicos también incluyen agentes inmunoterápicos que incluyen, sin limitación, anticuerpos terapéuticos adecuados para tratar pacientes. Algunos ejemplos de anticuerpos terapéuticos incluyen simtuzumab, abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzumab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomab, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49 y 3F8. Se puede utilizar rituximab para tratar cánceres de linfocitos B indolentes, que incluyen el linterna de la zona marginal, WM, LLC y linterna de linfocitos pequeños. Una combinación de rituximab y agentes de quimioterapia es especialmente eficaz.

Los anticuerpos terapéuticos ejemplificados pueden marcarse adicionalmente o combinarse con una partícula de radioisótopo tal como indio-111, itrio-90 o yodo-131.

En una realización, el agente terapéutico adicional es un agente alquilante de mostaza nitrogenada. Los ejemplos no limitantes de agentes alquilantes de mostaza nitrogenada incluyen clorambucilo.

En una realización, los compuestos y composiciones descritos en el presente documento pueden utilizarse o combinarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El uno o más agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, un inhibidor de Abl, CDC cinasa activada (ACK), receptor de adenosina A2B (A2B), cinasa reguladora de la señal de apoptosis (ASK), auroa cinasa, tirosina cinasa de Bruton (BTK), BET-bromodominio (BRD) tal como BRD4, c-Kit, c-Met, cinasa activadora de CDK (CAK), proteína cinasa dependiente de calmodulina (CaMK), cinasa dependiente de ciclina (CDK), caseína cinasa (CK), receptor de dominio de discoidina (DDR), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), cinasa de adhesión focal (FAK), Flt-3, FYN, glucógeno sintasa cinasa (GSK), HCK, histona desacetilasa (HDAC), IKK tal como IKKp£, isocitrato deshidrogenasa (IDH) tal como IDH1, Janus cinasa (JAK), KDR, proteína tirosina cinasa específica de linfocitos (LCK), proteína lisil oxidasa, proteína similar a la lisiloxidasa (LOXL), LYN, metaloproteasa de matriz (MMP), Me K, proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK), NEK9, NPMALK, cinasa p38, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), fosforilasa cinasa (PK), cinasa de tipo polo (PLK), fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K), proteína cinasa (PK) tal como proteína cinasa A, B y/o C, PYK, tirosina cinasa de bazo (SYK), serina/treonina cinasa TPL2, serina/treonina cinasa STK, transducción y transcripción de señales (STAT), SRC, serina/treonina-proteína cinasa (TBK) tal como TBK1, TIE, tirosina cinasa (TK), receptor del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGFR), YES o cualquier combinación de los mismos.

Los inhibidores de ASK incluyen inhibidores de ASK1. Los ejemplos de inhibidores de ASK1 incluyen, pero sin limitación, los descritos en el documento WO 2011/008709 (Gilead Sciences) y el documento WO 2013/112741 (Gilead Sciences).

Los ejemplos de inhibidores de BTK incluyen, pero sin limitación, ibrutinib, HM71224, ONO-4059 y CC-292.

Los inhibidores de DDR incluyen inhibidores de DDR1 y/o DDR2. Los ejemplos de inhibidores de DDR incluyen, pero sin limitación, los divulgados en los documentos WO 2014/047624 (Gilead Sciences), US 2009/0142345 (Takeda Pharmaceutical), US 2011/0287011 (Oncomed Pharmaceuticals), w O 2013/027802 (Chugai Pharmaceutical) y WO 2013/034933 (Imperial Innovations).

Los ejemplos de inhibidores de HDAC incluyen, pero sin limitación, pracinostat y panobinostat.

Los inhibidores de JAK inhiben JAK1, JAK2 y/o JAK3. Los ejemplos de inhibidores de JAK incluyen, pero sin limitación, filgotinib, ruxolitinib, fedratinib, tofacitinib, baricitinib, lestaurtinib, pacritinib, XL019, AZD1480, INCB039110, LY2784544, BMS911543 y NS018.

Los inhibidores de LOXL incluyen inhibidores de LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4 y/o LOXL5. Los ejemplos de inhibidores de LOXL incluyen, pero sin limitación, los anticuerpos descritos en el documento WO 2009/017833 (Arresto Biosciences).

Los ejemplos de inhibidores de LOXL2 incluyen, pero sin limitación, los anticuerpos descritos en los documentos WO 2009/017833 (Arresto Biosciences), WO 2009/035791 (Arresto Biosciences) y W o 2011/097513 (Gilead Biologics).

Los inhibidores de MMP incluyen inhibidores de MMP1 a 10. Los ejemplos de inhibidores de MMP9 incluyen, pero sin limitación, marimastat (BB-2516), cipemastat (Ro 32-3555) y los descritos en el documento WO 2012/027721 (Gilead Biologics).

Los inhibidores de PI3K incluyen inhibidores de PI3Ky, PI3K8, PI3Kp, PI3Ka y/o pan-PI3K. Los ejemplos de inhibidores de PI3K incluyen, pero sin limitación, wortmanina, b Km 120, CH5132799, XL756 y GDC-0980.

Los ejemplos de inhibidores de PI3Ky incluyen, pero sin limitación, ZSTK474, AS252424, LY294002 y TG100115.

Los ejemplos de inhibidores de PI3K8 incluyen, pero sin limitación, PI3K II, TGR-1202, AMG-319, GSK2269557, X-339, X-414, RP5090, KAR4141, XL499, OXY111A, IPI-145, IPI-443 y los compuestos descritos en los documentos WO 2005/113556 (ICOS), WO 2013/052699 (Gilead Calistoga), WO 2013/116562 (Gilead Calistoga), WO 2014/100765 (Gilead Calistoga), WO 2014/100767 (Gilead Calistoga) y WO 2014/201409 (Gilead Sciences).

Los ejemplos de inhibidores de PI3Kp incluyen, pero sin limitación, GSK2636771, BAY 10824391 y TGX221.

Los ejemplos de inhibidores de PI3Ka incluyen, pero sin limitación, buparlisib, BAY 80-6946, BYL719, PX-866, RG7604, MLN1117, WX-037, AEZA-129 y PA799.

Los ejemplos de inhibidores pan-PI3K incluyen, pero sin limitación, LY294002, BEZ235, XL147 (SAR245408) y GDC-0941.

Los ejemplos de inhibidores de SYK incluyen, pero sin limitación, tamatinib (R406), fostamatinib (R788), PRT062607, BAY-61-3606, NVP-QAB 205 AA, R112, R343 y los descritos en la patente de EE. UU. N.°: 8.450.321 (Gilead Connecticut).

Los TKI pueden dirigirse a los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y a los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Los ejemplos de TKI que se dirigen a EGFR incluyen, pero sin limitación, gefitinib y erlotinib. Sunitinib es un ejemplo no limitante de un TKI que se dirige a los receptores para FGF, PDGF y VEGF.

Combinación con el inhibidor del punto de control inmunitario

Los anticuerpos anti-CD73 de la presente divulgación se pueden utilizar, en algunas realizaciones, junto con un inhibidor del punto de control inmunitario. Los puntos de control inmunitarios son moléculas en el sistema inmunitario que activan una señal (moléculas coestimuladoras) o la rechazan. Muchos cánceres se protegen del sistema inmunitario mediante la inhibición de la señal de los linfocitos T. Un inhibidor del punto de control inmunitario puede ayudar a detener dicho mecanismo de protección por parte de las células. Un inhibidor del punto de control inmunitario puede dirigirse a una o más de las siguientes moléculas del punto de control, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3 (también conocida como CD223), CD28, CD122, 4-1BB (también conocida como CD137) o BTLA (también conocida como CD272).

La muerte programada de linfocitos T 1 (PD-1) es una proteína transmembrana que se encuentra en la superficie de los linfocitos T, que, cuando se une al ligando 1 de muerte programada de linfocitos T (PD-L1) en células tumorales, da como resultado la supresión de la actividad de los linfocitos T y la reducción de la citotoxicidad mediada por los linfocitos T. Por lo tanto, PD-1 y PD-L1 son reguladores inmunitarios a la baja o "interruptores de apagado" del punto de control inmunitario. Los ejemplos de inhibidores de PD-1 incluyen, sin limitación, nivolumab, (Opdivo) (BMS-936558), pembrolizumab (Keytruda), pidilizumab, AMP-224, MEDI0680 (AMP-514), PDR001, MPDL3280A, MEDI4736, BMS-936559 y MSB0010718C.

El ligando de muerte programada 1 (PD-L1), también conocido como grupo de diferenciación 274 (CD274) u homólogo 1 de B7 (B7-H1), es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen CD274. Los ejemplos no limitantes del inhibidor de PD-L1 incluyen atezolizumab (Tecentriq), durvalumab (MEDI4736), avelumab (MSB0010718C), MPDL3280A, BMS935559 (MDX-1105) y AMP-224.

CTLA-4 es un receptor de proteína que regula a la baja el sistema inmunitario. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de CTLA-4 incluyen ipilimumab (Yervoy) (también conocido como BMS-734016, MDX-010, MDX-101) y tremelimumab (anteriormente ticilimumab, CP-675.206).

El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) es un receptor del punto de control inmunitario en la superficie celular que funciona para suprimir una respuesta inmunitaria mediante la acción en los Treg, así como mediante los efectos directos en los linfocitos T CD8+. Los inhibidores de LAG-3 incluyen, sin limitación, LAG525 y BMS-986016.

CD28 se expresa de manera constitutiva en casi todos los linfocitos T CD4+ humanos y en alrededor de la mitad de todos los linfocitos T CD8, lo que favorece la expansión de los linfocitos T. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de CD28 incluyen TGN1412.

CD122 aumenta la proliferación de los linfocitos T efectores CD8+. Los ejemplos no limitantes incluyen NKTR-214.

4-1BB (también conocido como CD137) está implicado en la proliferación de linfocitos T. También se sabe que la señalización mediada por CD137 protege los linfocitos T y, en particular, los linfocitos T CD8+ de muerte celular inducida por activación. PF-05082566, urelumab (BMS-663513) y lipocalina son ejemplos de inhibidores de CD137.

Para cualquiera de los tratamientos de combinación anteriores, el anticuerpo anti-CD73 se puede administrar de manera simultánea o por separado del otro agente antineoplásico. Cuando se administran por separado, el anticuerpo anti-CD73 se puede administrar antes o después del otro agente antineoplásico.

Métodos de diagnóstico

Se observa sobreexpresión de CD73 en determinadas muestras de tumores, y los pacientes que tienen células que sobreexpresan CD73 probablemente respondan a los tratamientos con los anticuerpos anti-CD73 de la presente divulgación. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden utilizar con fines de diagnóstico y pronóstico.

Se puede obtener una muestra que preferentemente incluya una célula de un paciente, que puede ser un paciente con cáncer o un paciente que desea un diagnóstico. La célula es una célula de un tejido tumoral o de un bloque tumoral, una muestra de sangre, una muestra de orina o cualquier muestra del paciente. Tras el tratamiento previo opcional de la muestra, la muestra se puede incubar con un anticuerpo de la presente divulgación en condiciones que permitan que el anticuerpo interactúe con una proteína CD73 posiblemente presente en la muestra. Se pueden utilizar métodos tales como ELISA, aprovechando el anticuerpo anti-CD73, para detectar la presencia de la proteína CD73 en la muestra.

Se puede utilizar la presencia de la proteína CD73 en la muestra (opcionalmente con la cantidad o concentración) para el diagnóstico de cáncer, como indicación de que el paciente es adecuado para un tratamiento con el anticuerpo, o como indicación de que el paciente ha respondido (o no) a un tratamiento contra el cáncer. Para un método de pronóstico, la detección se puede hacer de una vez, dos veces o más, en determinadas etapas, al inicio de un tratamiento contra el cáncer para indicar el progreso del tratamiento.

Composiciones

La presente divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo y un vehículo aceptable. En algunas realizaciones, la composición incluye además un segundo agente antineoplásico (por ejemplo, un inhibidor del punto de control inmunitario).

En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que se ha aprobado por parte de un organismo de control del gobierno federal o estatal, o que está listada en la Farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de forma general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. Asimismo, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" generalmente será un relleno sólido, semisólido o líquido sólido no tóxico, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH tales como acetatos, citratos o fosfatos. También se prevén agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos convencionales, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de unión a antígeno, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o frascos multidosis hechos de vidrio o plástico.

En una realización, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. En general, los ingredientes se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.

Las composiciones de la divulgación se pueden formular en sus formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como las derivadas de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y aquellas formadas con cationes tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

Ejemplos

Ejemplo 1. Clonación de un anticuerpo murino 101-Mu

Este ejemplo describe el proceso de preparación de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD73 humana usando la tecnología de hibridoma. La proteína CD73 humana se preparó utilizando la estirpe celular CHOK1 recombinante que expresa CD73 (CD73-CHOK1). Para generar anticuerpos monoclonales de ratón contra CD73 humana, se inmunizaron primero ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad con 1,5 * 10⁷células CD73-CHOK1. Los días 14 y 33 después de la primera inmunización, los ratones inmunizados se volvieron a inmunizar con 1,5 * 10⁷células CD73-CHOK1. Para seleccionar ratones que produzcan anticuerpos que se unan a la proteína CD73, se analizaron los sueros de los ratones inmunizados mediante ELISA. En resumen, las placas de microvaloración se recubrieron con proteína CD73 humana a 1 pg/ml en PBS, 100 pl/pocillo a temperatura ambiente (TA) durante la noche, después se bloquearon con 100 pl/pocillo de BSA al 5 %. A cada pocillo se añadieron diluciones de plasma de ratones inmunizados y se incubaron durante 1 a 2 horas a TA. Las placas se lavaron con PBS/Tween y después se incubaron con anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a TA. Después del lavado, las placas se revelaron con sustrato ABTS y se analizaron mediante espectrofotómetro a una DO de 405 nm. Los ratones con valores suficientes de IgG anti-CD73 se reforzaron con 50 pg de proteína CD73-Fc humana el día 54 después de la inmunización. Los ratones resultantes se utilizaron para fusiones. Los sobrenadantes de hibridoma se analizaron para detectar IgG anti-CD73 mediante ELISA. Se identificaron ocho clones de hibridomas diferentes, entre los cuales se seleccionó 101-Mu para el análisis posterior. La secuencia VH de 101-MU se muestra en la tabla 6 como la SEQ ID NO: 10 y la secuencia VL se muestra en la tabla 7 y la SEQ ID NO: 15. Las secuencias de ADN correspondientes se muestran en la tabla 10 como las SEQ ID NO: 57 y 58.

Ejemplo 2. Unión de 101-Mu a CD73

Este ejemplo analiza la respuesta a la dosis de la unión ELISA del AcM de ratón 101-Mu anti-CD73 a la proteína CD73 humana recombinante (1 pg/ml@100 pl), ya sea sola o en superficies celulares.

La proteína CD73 humana recombinante (Novoproteína) se revistió a 1 pg/ml en PBS en placas de microvaloración durante 2 h a temperatura ambiente (TA). Después de recubrir con el antígeno, los pocillos se bloquearon con PBS/Tween al 0,05 % (PBST) con BSA al 1 % durante 1 h a TA. Después de lavar los pocillos con PBST, se añadieron diferentes concentraciones de anticuerpos anti-CD73 al pocillo y se incubaron durante 1 a TA. Para la detección de los anticuerpos de unión, se añadieron los anticuerpos secundarios conjugados con HRP contra Fc de ratón (Jackson Immuno Research), seguido de la adición de sustratos fluorogénicos (Roche). Entre todas las etapas de incubación, los pocillos de la placa se lavaron tres veces con PBST. La fluorescencia se midió en un lector de placas TECAN Spectrafluor.

Un anti-CD73 humana, AcM1, se utilizó como control positivo. El AcM1 se generó de acuerdo con la secuencia divulgada en el documento US2016/0194407. Los resultados comparativos se presentan en la figura 1, que muestra una CE⁵⁰para 101-Mu como 0,08 nM y una CE⁵⁰para AcM1 como 0,03 nM.

En la figura 2 se muestran los resultados de un ensayo de unión utilizando una estirpe de células de cáncer de ovario humano (células SK-OV-3) que expresan de manera endógena CD73 humana en la superficie. Después de la incubación con los anticuerpos indicados, las células se tiñeron con diferentes concentraciones de IgG de control, anti-CD73 (101-Mu) de ratón y el anticuerpo de referencia (AcM1) a 4 °C durante 30 min. Posteriormente, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de incubación con anticuerpo específico anti-Fc de ratón marcado con APC (Invitrogen) a 4 °C durante 30 min. La unión se midió utilizando un FACSCanto (Becton-Dickinson). Como en la figura 1, estas cifras muestran que 101-Mu tiene una afinidad de unión equivalente a CD73 como AcM1 (Para 101-Mu, CE⁵⁰fue 0,54 nM; para AcM1, CE⁵⁰fue 0,30 nM).

La figura 3 traza la cinética de unión de 101-Mu y AcM1 con CD73 humana recombinante (la CD73 humana recombinante se estableció como un analito con concentraciones en serie (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 nM)). El ensayo de cinética de unión del anticuerpo al antígeno se realizó utilizando el sistema Biacore T200 a través de un enfoque de captura de anticuerpos humanos. La IgG anti-Fc de ratón se inmovilizó en el chip sensor CM5 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo de prueba se inyectó y capturó por la IgG anti-Fc humano inmovilizada. Y después se inyectaron de manera individual concentraciones en serie del antígeno, y se registró el perfil de unión para cada concentración de analito de antígeno, respectivamente. El sistema de ensayo se regeneró mediante inyección de Glicina-HCl 10 mM pH 1,5 durante 30 segundos. El tampón de ejecución fue HBS-EP+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y P20 al 0,05 %). La temperatura de ensayo fue de 25 °C y el tiempo de asociación y disociación de 180 y 600 segundos, respectivamente. Los datos de Biacore se ajustaron utilizando el programa informático de evaluación Biacore T200 1.0 de acuerdo con el modelo de unión 1:1 para calcular las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd), así como la constante de equilibrio (KD). Además de la figura 3, algunos datos resumidos se presentan en la siguiente tabla.

Ejemplo 3. Inhibición de la actividad enzimática de CD73 por 101-Mu

Este ejemplo analiza la capacidad del anticuerpo 101-Mu para inhibir la actividad enzimática de CD73.

La proteína CD73 humana recombinante (0,3 jg/m l) se incubó en microplacas de fondo plano de 96 pocilios en presencia de diferentes dosis de anti-CD73 o Ac de control de isotipo. Las placas se incubaron durante 15 min a 37 °C. A continuación, se añadieron ATP (100 j M) y AMP (100 j M) a cada pocillo y se incubaron durante otros 30 min a 37 °C. Se añadió CellTiter-Glo (Promega) que contenía luciferasa a los pocillos y se midió la inhibición de la emisión de luz mediante un luminómetro (Molecular Device).

Se sabe que el exceso de AMP bloquea la actividad de la luciferasa dependiente de ATP. La adición de CD73 que cataliza AMP para producir adenosina y fosfato inorgánico restaura la actividad de la luciferasa y la emisión de luz. Por lo tanto, los anticuerpos que bloquean la actividad enzimática de CD73 pueden disminuir la emisión de luz. El porcentaje de actividad enzimática se evalúa como se describe a continuación: La actividad residual de CD73 se calculó como: (CD73+Ac+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(CD73+ATP+AMP)-(ATP+AMP) * 100. Los resultados se representan en la figura 4, que muestra que, a diferencia del control negativo IgG, 101-Mu inhibió de forma dependiente de la dosis la actividad enzimática de CD73 (CI⁵⁰= 3,89 nM).

Las células SK-OV-3 que expresan CD73 se sembraron en placas de 96 pocillos a 1 * 10⁵células por pozo en presencia de diferentes dosis de Ac anti-CD73 o Ac de control de isotipo. Las placas se incubaron durante 15 min a 37 °C. Se añadió AMP (100 j M) a cada pocillo y se incubó durante 1 h a 37 °C. Los sobrenadantes se recogieron en una nueva placa de 96 pocillos y se añadió ATP hasta una concentración final de 100 j M. Se añadió reactivo CellTiter-Glo (Promega) 1:1 y se determinó la actividad enzimática de CD73 celular mediante medición con el luminómetro de emisión de luz (Molecular Device). El porcentaje de actividad enzimática se evalúa como se describe a continuación: La actividad residual de CD73 se calculó como: (Células SK-OV-3+Ac+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(Células SK-OV-3+ATP+AMP)-(ATP+AMP) * 100. Los resultados se representan en la figura 5, que muestra que, a diferencia del control negativo IgG, 101-Mu inhibió de forma dependiente de la dosis la actividad enzimática de CD73 (CI⁵⁰= 4,62 nM).

Ejemplo 4. Reversión de la supresión de linfocitos T CD4+ mediada por AMP mediante 101-Mu

Este ejemplo analiza la capacidad del anticuerpo para revertir la supresión de linfocitos T CD4+ mediada por AMP.

Los linfocitos T CD4+ humanos se purificaron a partir de PBMC mediante selección positiva utilizando microperlas de CD4 humanas (Miltenyi Biotech). Los linfocitos T CD4+ aislados se estimularon con anticuerpo anti-CD3 recubierto previamente (2 pg/ml) y anticuerpo anti-CD28 soluble (1 pg/ml) en presencia o ausencia de AMP (500 |jM). Se añadieron diluciones en serie de anticuerpos anti-CD73 e IgG de control a cada pocillo y se cultivaron durante 72 h y el sobrenadante se analizó para IFN-y mediante ELISA. Como se muestra en la figura 6, 101-Mu aumentó de forma dependiente de la dosis la producción de IFN-y de las células CD4+, mientras que el control no tuvo impacto relevante.

Ejemplo 5. Humanización de 101-Mu

Los ejemplos anteriores muestran que el anticuerpo 101-Mu es un potente inhibidor de la actividad enzimática de CD73 y puede revertir completamente el efecto inmunodepresor de la adenosina en la activación de linfocitos T. Por consiguiente, el anticuerpo se seleccionó como base para la humanización.

Los genes de la región variable de 101-Mu se emplearon para crear un AcM humanizado. Las VH y VK de 101-MU se compararon con la base de datos disponible de secuencias de genes de Ig humana para identificar las secuencias génicas de Ig de línea germinal humana que mejor coinciden en general. Para la cadena ligera, las coincidencias humanas más cercanas fueron los genes A10/Jk4 (diseño 1) y L6/Jk4 (diseño 2), y para la cadena pesada la coincidencia humana más cercana fue el gen VH4-B/JH6. A continuación, se diseñaron secuencias de dominio variable humanizadas en las que las CDR1 (SEQ ID NO: 4), 2 (SEQ ID NO: 5) y 3 (SEQ ID NO: 6) de la cadena ligera de 101-MU se injertaron en las secuencias marco de los genes de cadena ligera coincidentes, y las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2) y 3 (SEQ ID NO: 3) de la VH de 101-MU se injertaron en secuencias marco del gen de VH coincidente.

A continuación, se generó un modelo 3D para determinar si había alguna posición marco en la que la sustitución del aminoácido de ratón por el aminoácido humano pudiera afectar la unión y/o la conformación de las CDR. Las retromutaciones útiles identificadas, así como secuencias peptídicas que incluyen dichas mutaciones, se muestran en las siguientes tablas (subrayadas).

T l R r m i n H n i H n l r r m i n s:

Ta l 4 R r m i n K n i K n l r r m i n i ñ 1):

T l R r m i n K n i K n l r r m i n i ñ 1

T l H h m niz H h m niz n r r m i n

continuación

T l K h m niz K h m niz n r r m i n i ñ 1

T l K h m niz K h m niz n r r m i n i ñ 2

Los genes de VH y VK humanizados se produjeron de manera sintética y después se clonaron respectivamente en vectores que contenían los dominios constantes y 1 humano y k humano. El emparejamiento de la VH humana y la VK humana creó una serie de anticuerpos humanizados que se enumeran en la siguiente tabla.

Tabla 9. Anticuer os humanizados

La tabla 10 muestra algunos ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican las regiones VH y VL de los anticuerpos 101-MU y Hu101-28.

Tabla 10. Secuencias de nucleótidos

Ejemplo 6. Análisis de los anticuerpos humanizados

Este ejemplo analizó los anticuerpos humanizados en términos de su afinidad de unión y actividades inhibidoras. Los procedimientos de análisis son similares a los descritos en los ejemplos 1 a 4 y los resultados se presentan en las figuras 7 a 11.

Para el ensayo de unión, se utilizó el sistema Biacore T200 a través del enfoque de captura de anticuerpos humanos. La lgG anti-Fc humano se inmovilizó en el chip sensor CM5 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo de prueba se inyectó y capturó por la IgG anti-Fc humano inmovilizada. Y después se inyectaron de manera individual concentraciones en serie de antígeno, y se registró el perfil de unión para cada concentración de analito de antígeno, respectivamente. El sistema de ensayo se regeneró mediante inyección de Glicina-HCl 10 mM pH 1,5 durante 30 segundos. El tampón de ejecución fue HBS-EP+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y P20 al 0,05 %). La temperatura de ensayo fue de 25 °C y el tiempo de asociación y disociación de 180 y 600 segundos, respectivamente. Los datos de Biacore se ajustaron utilizando el programa informático de evaluación Biacore T200 1.0 de acuerdo con el modelo de unión 1:1 para calcular las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd), así como la constante de equilibrio (KD).

Entre todos los anticuerpos analizados, Hu101-25 y Hu101-28 mostraron la mayor afinidad de unión (véase la figura 7 y la tabla a continuación) y se utilizaron para análisis posteriores.

La estirpe celular de cáncer de ovario humano (células SK-OV-3) que expresaba de manera endógena CD73 humana en la superficie se tiñó con diferentes concentraciones de control de IgG, anticuerpos anti-CD73 quiméricos (101-Muquimérico o 101-Qui) y anti-CD73 humanizados (Hu101-25 y Hu101-28) a °C durante 30 min. Posteriormente, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de incubación con anticuerpo específico anti-Fc humano marcado con APC (Invitrogen) a 4 °C durante 30 min. La unión se midió usando un FACSCanto (Becton-Dickinson) y los resultados se presentan en la figura 8 (véase también la tabla a continuación).

La proteína CD73 humana recombinante (0,3 pg/ml) se incubó en microplacas de fondo plano de 96 pocillos en presencia de diferentes dosis de anti-CD73 o Ac de control de isotipo. Las placas se incubaron durante 15 min a 37 °C. A continuación, se añadieron ATP (100 pM) y AMP (100 pM) a cada pocillo y se incubaron durante otros 30 min a 37 °C. Se añadió CellTiter-Glo (Promega) que contenía luciferasa a los pocillos y se midió la inhibición de la emisión de luz mediante un luminómetro (Molecular Device). Se sabe que el exceso de AMP bloquea la actividad de la luciferasa dependiente de ATP. La adición de CD73 que cataliza AMP para producir adenosina y fosfato inorgánico restaura la actividad de la luciferasa y la emisión de luz. Por lo tanto, los anticuerpos que bloquean la actividad enzimática de CD73 disminuirán la emisión de luz. El porcentaje de actividad enzimática se evalúa como se describe a continuación: Actividad residual de CD73: (CD73+Ac+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(CD73+ATP+AMP)-(ATP+AMP) x 100.

En la figura 9 se muestra que los tres anticuerpos analizados presentaron fuertes actividades inhibidoras (véase también la tabla a continuación).

En la figura 10 se muestran los resultados de analizar la inhibición de la actividad enzimática de CD73 mediante los anticuerpos humanizados. Se sembraron células SK-OV-3 que expresan CD73 en una placa de 96 pocillos a 1 x 105 células por pocillo en presencia de diferentes dosis de Ac anti-CD73 o Ac de control de isotipo. Las placas se incubaron durante 15 min a 37 °C. Se añadió AMP (100 pM) a cada pocillo y se incubó durante 1 h a 37 °C. Los sobrenadantes se recogieron en una nueva placa de 96 pocillos y se añadió ATP hasta una concentración final de 100 pM. Se añadió reactivo CellTiter-Glo (Promega) 1:1 y se determinó la actividad enzimática de CD73 celular mediante medición con el luminómetro de emisión de luz (Molecular Device). El porcentaje de actividad enzimática se evalúa como se describe a continuación: Actividad residual de CD73: (Células SK-OV-3+Ac+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(Células SK-OV-3+ATP+AMP)-(ATP+AMP) x 100. Los resultados se muestran en la figura 10 y la tabla a continuación, que muestra potentes efectos inhibidores por parte de estos anticuerpos.

Para analizar la capacidad de los anticuerpos para revertir la supresión de linfocitos T CD4+ mediada por AMP, los linfocitos T CD4+ humanos se purificaron a partir de PBMC mediante selección positiva utilizando microperlas de CD4 humanas (Miltenyi Biotech). Los linfocitos T CD4+ aislados se estimularon con anticuerpo anti-CD3 recubierto previamente (2 pg/ml) y anticuerpo anti-CD28 soluble (1 pg/ml) en presencia o ausencia de AMP (500 pM). Se añadieron diluciones en serie de anticuerpos anti-CD73 e IgG de control a cada pocillo y se cultivaron durante 72 h y el sobrenadante se analizó para IFN-y mediante ELISA. Como se muestra en la figura 11, los tres anticuerpos analizados revirtieron de manera dependiente de la dosis la supresión mediada por AMP de los linfocitos T CD4+.

Ejemplo 7. Simulación por ordenador de mayor variación y optim ización de los anticuerpos humanizados

Se contempló que determinados restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR o las regiones marco podrían cambiarse para mejorar más o retener la actividad y/o estabilidad de los anticuerpos. Se analizaron variantes, con una herramienta computacional (VectorNTI, disponible en www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/), con respecto a su estructura, propiedades conformacionales y funcionales, y aquellas (dentro de las regiones CDR) que mostraron promesas se enumeran en las tablas a continuación.

Tabla^ 11. CDR de VH VL sus variantes adecuadas ara su inclusión en anticuer os humanizados:

continuación

Ejemplo 8. Hu101-28 es un anticuerpo anti-CD73 de doble mecanismo

Este ejemplo muestra que Hu101-28 tiene mecanismos de acción doble. No solo bloquea la actividad enzimática de CD73 de manera no competitiva sino que también induce la internalización de CD73 en la superficie celular.

La unión de proteínas CD73 se analizó con CD73 soluble y de superficie celular, y los resultados se muestran en la figura 12. En el panel de la izquierda, se utilizaron 100 pl de una solución que contenía CD73 humana recombinante (2 pg/ml) en un ensayo de unión ELISA y el gráfico muestra Hu101-28. En el panel de la derecha, la estirpe celular de carcinoma de ovario humano (SK-OV-3) se tiñó con diferentes concentraciones de Hu101-28 y se analizó la unión a la superficie mediante citometría de flujo. Como se muestra, la CE50 en las pruebas fueron 88,7 pM y 0,67 nM, respectivamente, subrayando la afinidad elevada del anticuerpo.

A continuación, la capacidad de Hu101-28 para bloquear las actividades de CD73. Se incubó CD73 humana recombinante (0,3 pg/ml) con Hu101-28 durante 15 min. A continuación, se añadieron ATP (100 pM) y AMP (100 pM) durante otros 30 min. Se añadió CellTiter-Glo (Promega) y se midió la inhibición de la emisión de luz mediante un luminómetro. Como se muestra en la figura 13, panel izquierdo, la CI50 en la solución fue 2,84 nM. Con respecto al CD73 encontrado en células, se incubaron células SK-OV-3 o MDA-MB-231 (1 * 105 células) con Hu101-28 durante 15 min seguido de la adición secuencial de AMP (100 pM) y ATP (100 pM) con incubación adicional durante 1 h. Se añadió CellTiter-Glo (Promega) y se midió la inhibición de la emisión de luz mediante un luminómetro. Como se muestra en la figura 13, panel derecho, la CI50 fue de 2,52 nM y 8,21 nM para SK-OV-3 y MDA-MB-231, respectivamente.

Otros experimentos demostraron que Hu101-28 no competía con la unión del sustrato de AMP al sitio activo, sino que actuaba de manera alostérica o a través de otros mecanismos no competitivos, lo que es más preferido en términos de evitar la necesidad de competir con múltiples sustratos de AMP endógenos. Como se muestra en la figura 14, el aumento de la concentración de sustrato de AMP no impidió la inhibición de la hidrólisis por Hu101-28, lo que indica que Hu101-28 actuó como un inhibidor no competitivo. En cambio, la actividad inhibidora de ADP se puede superar mediante el aumento de la concentración de sustrato para superar la unión de ADP al sitio activo.

Un descubrimiento sorprendente e inesperado que se muestra en la figura 15. La internalización de CD73 tras la unión de Hu101-28 se demostró mediante la medición de los niveles de CD73 en la superficie celular mediante citometría de flujo o la viabilidad de las células MDA-MB-231 tras la unión de Hu309 en presencia de un anticuerpo secundario conjugado con toxina. En comparación con IgG que no cambió el nivel de CD73 en la superficie celular, Hu101-28 dio como resultado una disminución de más de la mitad del nivel de CD73 en la superficie celular en 6 horas (panel izquierdo) y una destrucción celular aún más significativa (panel derecho).

Los experimentos anteriores, por lo tanto, demuestran que Hu101-28 tiene mecanismos de acción dobles (MoA): bloqueo de la actividad enzimática de CD73 de manera no competitiva e inducción de la internalización de CD73 en la superficie celular.

Ejemplo 9. Hu101-28 revierte completamente la supresión de respuestas de los linfocitos T CD4+ y CD8+ mediada por células tumorales o AMP

Este ejemplo muestra que Hu101-28 revirtió completamente la supresión de las respuestas de los linfocitos T CD4+ y CD8+ mediada por células tumorales y AMP.

Se marcaron linfocitos T CD4+ o CD8+ humanos con CFSE y se estimularon con anticuerpos anti-CD3/CD28 en presencia o ausencia de AMP. Se añadió Hu101-28 al cultivo durante 72 h. El sobrenadante del cultivo se analizó para determinar la producción de IFN-y mediante ELISA. En la figura 16, panel izquierdo, Hu101-28 aumentó de manera dependiente de la dosis la producción de IFN-y en las células CD4+. Del mismo modo, como se muestra en el panel derecho, Hu101-28 aumentó de manera dependiente de la dosis la producción de IFN-y en las células CD8+.

Para analizar el impacto de Hu101-28 en la supresión de la respuesta de los linfocitos T mediada por células tumorales, se trataron células SK-OV-3 que expresan CD73 con mitomicina C y se cultivaron de manera conjunta con linfocitos T CD4+ o CD8+ en presencia de anticuerpos anti-CD3/CD28. Se añadió Hu101-28 al cultivo durante 72 h y se analizó el sobrenadante para determinar la producción de IFN-y mediante ELISA. Como se muestra en la figura 17, panel izquierdo, Hu101-28 aumentó de manera dependiente de la dosis la producción de IFN-y en las células CD4+. Del mismo modo, como se muestra en el panel derecho, Hu101-28 aumentó de manera dependiente de la dosis la producción de IFN-y en las células CD8+.

Ejemplo 10. Hu101-28 suprime el crecim iento tumoral

Este ejemplo demuestra que Hu101-28 es eficaz en la supresión de la actividad de CD73 derivada de tumores, lo que conduce a la inhibición del crecimiento tumoral mediante un tratamiento único o combinado.

Se midió la actividad enzimática de CD73 in vivo mediante histoquímica enzimática en tumores del modelo xenógrafo A375 y los resultados de la tinción se muestran en la figura 18. Un color marrón indica la presencia de CD73 activa, mientras que la carencia de color marrón indica que la actividad enzimática de CD73 estaba inhibida por el anticuerpo. Se recogieron los tumores del modelo de xenoinjerto A375 tratado con Hu101-28 o control con IgG y los resultados mostraron que la actividad de CD73 en secciones tumorales se redujo de manera significativa con el tratamiento con Hu101-28 en comparación con el grupo control con IgG.

La eficacia de la monoterapia de Hu101-28 también se evaluó en un modelo de xenoinjerto tumoral. Se injertaron células de melanoma A375 y PBMC humanas en ratones inmunodeficientes NSG. El mismo día del injerto, se administraron diferentes dosis de Hu101-28 o control con IgG a los ratones portadores de tumores mediante inyección intraperitoneal una vez cada dos días. Como se muestra en la figura 19, Hu101-28 suprimió el crecimiento tumoral de forma sostenida y dependiente de la dosis.

Se evaluó el efecto combinatorio de Hu101-28 y un anticuerpo anti-PD-LI. Se injertaron células HCC827 en ratones NSG. Cuando el volumen tumoral alcanzó de l0o a 150 mm3, se administraron PBMC humanas recién aisladas a los ratones portadores de tumores mediante inyección en la vena de la cola y posteriormente se trataron con control con IgG, anticuerpo PD-L1 solo, Hu101-28 solo y anticuerpo PD-L1 más H u l0 l-28 en las dosis indicadas cada dos días a partir del día del trasplante de PBMC. En la figura 20 se muestra un efecto sinérgico entre Hu101-28 y el anticuerpo anti-PD-LI.

Ejemplo 11. Hu101-28 reacciona de manera cruzada con CD73 de macaco

Este ejemplo muestra que el anticuerpo humanizado Hu101-28 reacciona de manera cruzada con CD73 de macaco y ejerce un PK y un perfil de seguridad aceptables en el estudio preclínico exploratorio.

En la figura 21 se muestra la unión e inhibición de la actividad de CD73 de macaco mediante Hu101-28. Hu101-28 ejerció una potencia comparable en la unión e inhibición de la actividad de CD73 de macaco en comparación con la de CD73 humana a través del ensayo bioquímico in vitro mientras que no hay unión de Hu101-28 a CD73 de roedor. Estos resultados respaldan el uso de macaco para el modelo de estudio no clínico para evaluar la toxicidad, PK y TK de Hu101-28.

Ejemplo 12. Hu101-28 se une a los dom inios carboxiterm inales de CD73

Este ejemplo muestra que uno de los anticuerpos humanizados, Hu101-28, se une a los dominios carboxiterminales de la proteína CD73 que difiere de los anticuerpos anti-CD-73 conocidos que se unen a los dominios aminoterminales.

El agrupamiento de epítopos de los anticuerpos CD73 se evaluó mediante ELISA de competición. La proteína CD73 ECD y Hu101-28 se preincubaron y después se añadió MEDI-9447 biotinilado (Medimmune) detectado por un anticuerpo de estreptavidina-HRP. Los resultados mostraron que la adición de R9447 biotinilado no compitió con la unión de Hu101-28, lo que indica que ambos anticuerpos se colocaron en un contenedor de epítopos que no se superponen. (Figura 22). Como control, la adición de MEDI-9447 biotinilado podría competir con la autounión.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende además una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, una región Fc o la combinación de las mismas.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está humanizado.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 3, en donde la región variable de cadena pesada comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a) Thr en la posición 30,

(b) Lys en la posición 44,

(c) Met en la posición 48,

(d) Ile en la posición 67 y

(e) Arg en la posición 71, de acuerdo con la numeración de Kabat y combinaciones de los mismos.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 3 o 4, en donde la región variable de cadena ligera comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a) Ser en la posición 5,

(b) Pro en la posición 46,

(c) Trp en la posición 47,

(d) Ser en la posición 49,

(e) Ser en la posición 70 y

(f) Tyr en la posición 71, de acuerdo con la numeración de Kabat y combinaciones de los mismos.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde:

(i) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y 9 a 13, preferentemente en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o 9; y

(ii) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 15 a 20 y 22 a 24, preferentemente en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

7. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a cada uno de Y345, D399, E400, R401 y R480.

8. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de bloquear la dimerización de la proteína CD73 al unirse a la proteína CD73.

9. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es un anticuerpo biespecífico.

10. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición de la reivindicación 10, para usar en el tratamiento de un cáncer.

12. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.

13. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o composición para usar de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o composición se va a administrar en combinación con un segundo agente terapéutico contra el cáncer, preferentemente en donde el segundo agente terapéutico contra el cáncer es un inhibidor del punto de control inmunitario, más preferentemente en donde el inhibidor del punto de control inmunitario inhibe la expresión o actividad de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), el ligando 1 de muerte programada (PD-L1), la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), la proteína 3 de activación de linfocitos (LAG-3) o combinaciones de las mismas.

14. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene especificidad por una proteína CD73 humana y comprende:

(e) una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5; y

(f) una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 6 o una variante de la SEQ ID NO: 6 que tiene una sola sustitución, eliminación o inserción en la ubicación 1,2, 3 o 4 de la SEQ ID NO: 6, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno invierte completamente la supresión de las respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ mediada por AMP.

15. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 14, en donde:

(i) la variante de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26 a 29;

(ii) la variante de la SEQ ID NO: 2 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30 a 36;

(iii) la variante de la SEQ ID NO: 3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37 a 41;

(iv) la variante de la SEQ ID NO: 4 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 42 a 45; y/o (v) la variante de la SEQ ID NO: 6 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 46 a 56.