KR20200108915A - 항-cd73 항체 및 이것의 사용 - Google Patents

항-cd73 항체 및 이것의 사용 Download PDF

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레이 팡
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징우 장
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Abstract

항-CD73 항체 또는 이것의 단편이 제공된다. 그러므로 항체 또는 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3, 또는 이것들 ㄱ각각의 변종을 포함한다. 더 일반적으로는, 인간 CD73 단백질의 C-말단 절반, 예컨대 C-말단 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 특이성을 가진 항체 또는 이것의 단편이 기술된다. 이들 도메인에서 특이적 에피토프 아미노산은 Y345, D399, E400, R401 및 R480을 포함한다. 암과 같은 질환을 치료하고 진단하기 위해 항체 또는 이것의 단편을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

항-CD73 항체 및 이것의 사용{ANTI-CD73 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
항-CD73 항체 또는 이것의 단편이 제공된다. 그러므로 항체 또는 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3, 또는 이것들 각각의 변종을 포함한다. 더 일반적으로는, 인간 CD73 단백질의 C-말단 절반, 예컨대 C-말단 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 특이성을 가진 항체 또는 이것의 단편이 기술된다. 이들 도메인에서 특이적 에피토프 아미노산은 Y345, D399, E400, R401 및 R480을 포함한다. 암과 같은 질환을 치료하고 진단하기 위해 항체 또는 이것의 단편을 사용하는 방법이 또한 제공된다.
CD73, 분화 클러스터 73(cluster of differentiation 73)은 5'-뉴클레오티다제 (5'-NT) 또는 엑토-5'-뉴클레오티다제로도 알려져 있으며, AMP를 아데노신으로 전환시키는 역할을 하는 효소이다. CD73은 면역억제성 종양 환경에 기여하는 세포 외 아데노신의 형성에 촉매 작용한다. CD73은 간질 세포 및 여러 유형의 종양 세포, 뿐만 아니라 Treg, M2 Mφ 및 골수 유래 억제자 세포 (MDSC)에서 과발현된다.
전임상적 증거는 CD73 억제가 아데노신-매개된 림프구 억제를 방지하고, CD8+ 효과기 세포의 활성을 증가시키고, MDSC 및 Treg 둘 다를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 몇몇 항-CD73 항체가 잠재적인 항암제로서 개발되고 있지만, 임상적 사용에 대하여 승인된 것은 아무것도 없다.
본 명세서는 단독으로 또는 세포 상에 존재하든 인간 CD73 단백질에 대하여 높은 결합 친화도를 갖고 CD73의 효소 활성을 억제하는 강력한 활성을 가진 항-CD73 항체를 제공한다. 또한, 이들 항체의 결합은 CD73의 종양 세포 내재화를 유도하여, 세포 표면 상에서 CD73 활성의 추가의 감소를 유발할 수 있다. 또한 놀랍게도, 이들 항체의 1가 유닛, 예로서, Fab 단편은 전체 항체와 비슷한 효능을 갖는다. 하지만, 공지된 항-CD73 항체, 예컨대 Medimmune의 MEDI-9447은 이러한 특성을 갖고 있지 않다. 유사하게, 억제 효과를 나타내기 위해 세포 표면 상에서 고밀도의 CD73 발현을 필요로 하는 MEDI-9447 및 11F11과는 달리, 본 명세서의 항체는 상이한 수준의 세포 표면 발현시에도 완전한 CD73 억제에 도달할 수 있다. 본원에서 개시된 항체의 이 놀랍고 예상치 못한 성질들은 적어도 어느 정도는 CD73 단백질 상의 별도의 결합 부위에 기인한 것으로 생각된다. CD73 단백질의 N-말단 도메인에 결합하는 MEDI-9447 및 11F11과는 달리, 본원에서 개시된 항체는 C-말단 도메인, 및 더 구체적으로는 아미노산 잔기 Y345, D399, E400, R401 및 R480에 결합한다. 본원에서 개시된 항체의 이 성질들이 그것들을 치료적 및 진단적 사용에 대한 훌륭한 후보물질로 만든다.
그러므로, 본 명세서의 한 구체예에 따르면, 인간 CD73 단백질에 대한 특이성을 가지며 인간 CD73 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는 단리된 항체 또는 이것의 단편이 제공된다. 인간 CD73 단백질의 C-말단 부분은, 업계에 공지된 바와 같이, 잔기 337로부터 시작하여 238개의 아미노산 잔기를 포함하며, 서열 번호: 61에서 나타난 바와 같다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간 CD73 단백질의 C-말단 도메인 중 하나 이상에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간 CD73 단백질의 Y345, D399, E400, R401 및 R480으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 아미노산 잔기 중 적어도 두 개에 결합한다.
본 명세서의 한 구체예는 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함하는 항-CD73 항체 또는 이것의 단편을 제공한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입, 또는 더 구체적으로는, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 것이다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체이다. 한 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간화 항체이다.
일부 구체예에서, 인간 또는 인간화 항체 또는 이것의 단편은 카바트 넘버링(Kabat numbering)에 따라 (a) 위치 30에서 Thr, (b) 위치 44에서 Lys, (c) 위치 48에서 Met, (d) 위치 67에서 Ile, 및 (e) 위치 71에서 Arg, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 가진다. 일부 구체예에서, 인간 또는 인간화 항체 또는 이것의 단편은 카바트 넘버링에 따라 (a) 위치 5에서 Ser, (b) 위치 46에서 Pro, (c) 위치 47에서 Trp, (d) 위치 49에서 Ser, (e) 위치 70에서 Ser, 및 (f) 위치 71에서 Tyr, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 가진다.
그러므로 예시의 CD73 항체 또는 단편은 서열 번호: 7 및 9-13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 7 및 9-13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 가진 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 7 또는 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 8, 15-20 및 22-24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8, 15-20 및 22-24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다.
실험예 7에서 나타난 바와 같에, CDR 영역은 항-CD73 항체의 성질을 유지하거나 또는 심지어 그 성질을 개선하는 특정 아미노산 추가, 결실 또는 치환을 수용할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서는, 인간 CD73 단백질에 대한 특이성을 갖고 (a) 서열 번호: 1의 VH CDR1, 또는 서열 번호: 1의 위치 1, 2 또는 3에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변종; (b) 서열 번호: 2의 VH CDR2, 또는 서열 번호: 2의 위치 6, 7 또는 8에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 2의 변종; (c) 서열 번호: 3의 VH CDR3, 또는 서열 번호: 3의 위치 7 또는 8에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 3의 변종; (d) 서열 번호: 4의 VL CDR1, 또는 서열 번호: 4의 위치 3 또는 4에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변종; (e) 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 (f) 서열 번호: 6의 VL CDR3, 또는 서열 번호: 6의 위치 1, 2, 3 또는 4에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 6의 변종을 포함하는 단리된 항체 또는 이것의 단편이 제공된다.
일부 구체예에서, 인간 CD73 단백질에 대한 특이성을 갖고 (a) 서열 번호: 1의 VH CDR1, 또는 서열 번호: 1의 위치 1, 2 또는 3에서 단일 치환을 가진 서열 번호: 1의 변종; (b) 서열 번호: 2의 VH CDR2, 또는 서열 번호: 2의 위치 6, 7, 또는 8에서 단일 치환을 가진 서열 번호: 2의 변종; (c) 서열 번호: 3의 VH CDR3, 또는 서열 번호: 3의 위치 7 또는 8에서 단일 치환을 가진 서열 번호: 3의 변종; (d) 서열 번호: 4의 VL CDR1, 또는 서열 번호: 4의 위치 3 또는 4에서 단일 치환을 가진 서열 번호: 4의 변종; (e) 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 (f) 서열 번호: 6의 VL CDR3, 또는 서열 번호: 6의 위치 1, 2, 3 또는 4에서 단일 치환을 가진 서열 번호: 6의 변종을 포함하는 단리된 항체 또는 이것의 단편이 제공된다.
일부 구체예에서, 서열 번호: 1의 변종은 서열 번호: 26-29로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 2의 변종은 서열 번호: 30-36으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 3의 변종은 서열 번호: 37-41로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 4의 변종은 서열 번호: 42-45로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 6의 변종은 서열 번호: 46-56으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 일부 구체예에서는, 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 세포가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 환자에게 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 내막암, 식도암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종(lymphoma), 흑색종(melanoma), 췌장암, 전립선암, 및 갑상선암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암은 고체 종양이다.
일부 구체예에서, 방법은 환자에게 2차 암 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 2차 암 치료제는 면역 체크포인트(checkpoint) 억제자이다. 일부 구체예에서, 억제자는 예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4 (CTLA-4), 림프구-활성화 단백질 3 (LAG-3), 또는 이것들의 조합의 발현 또는 활성을 억제한다. 일부 구체예에서, 억제자는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구체예에서, 억제자는 펨브롤리쥬맙, 니볼루맙, J43, RMP1-14, 아테졸리쥬맙, 이필리무맙, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, (a) 시험관 내에서(in vitro) T 세포를 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편으로 처리하는 단계; 및 (b) 환자에게 처리된 T 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은, 단계 (a) 전에, 개체로부터 T 세포를 단리하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, T 세포는 환자로부터 단리된다. 일부 구체예에서, T 세포는 환자와 다른 공여체 개체로부터 단리된다. 일부 구체예에서, T 세포는 종양-침윤성 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합이다.
또한, 또 다른 구체예에서는, 샘플에서 CD73의 발현을 검출하는 방법이 제공되며, 항체 또는 이것의 단편이 CD73에 결합하는 조건 하에서 샘플을 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편과 접촉시키는 단계, 및 샘플에서 CD73의 발현을 나타내는 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 또한, 한 구체예에서는, 항-CD73 요법으로의 처리에 적합한 암 환자를 확인하는 방법이 제공되며, 암 환자로부터 세포를 단리하는 단계 및 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편으로 CD73 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
도 1은 재조합 인간 CD73 단백질으로의 101-Mu 항체의 결합을 나타낸다.
도 2는 인간 난소암 세포의 표면 상에서 재조합 인간 CD73 단백질로의 101-Mu 항체의 결합을 나타낸다.
도 3은 재조합 CD73 단백질로의 101-Mu 항체의 결합 역학을 나타낸다.
도 4는 101-Mu 항체가 CD73의 효소 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 5는 101-Mu 항체가 세포 표면 상에서 CD73의 효소 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 6은 IFN-γ의 생산으로 표시된 바와 같이, 101-Mu가 AMP-매개된 CD4+ T 세포 억제를 반전시켰음을 나타낸다.
도 7은 인간화 항체의 결합 역학을 나타낸다.
도 8은 인간화 항체가 세포 표면 CD73 단백질에 결합되었다는 것을 나타낸다.
도 9는 인간화 항체가 CD73 단백질의 효소 활성을 억제하였다는 것을 나타낸다.
도 10은 인간화 항체가 세포 표면 CD73 단백질의 효소 활성을 억제하였다는 것을 나타낸다.
도 11은 IFN-γ의 생산으로 표시된 바와 같이, 인간화 항체가 AMP-매개된 CD4+ T 세포 억제를 반전시켰다는 것을 나타낸다.
도 12는 수용성 및 세포 표면 CD73으로의 Hu101-28의 강력한 결합을 나타낸다.
도 13은 CD73으로의 Hu101-28의 결합이 CD73의 효소 활성을 효과적으로 차단한다는 것을 나타낸다.
도 14는 Hu101-28이 비-경쟁적으로 CD73 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 15는 CD73으로의 Hu101-28 결합이 CD73 내재화를 유도한다는 것을 나타낸다.
도 16은 Hu101-28이 T 세포 반응의 AMP-매개된 억제를 반전시킨다는 것을 나타낸다.
도 17은 Hu101-28이 T 세포 반응의 CD73+ 종양 세포-의약 처리된 억제를 반전시킨다는 것을 나타낸다.
도 18은 A375 제노그래프(xenograph) 모델의 종양에서 Hu101-28에 의한 생체 내(in vivo) CD73 효소적 억제를 나타내는 염색 이미지를 제공한다.
도 19는 Hu101-28이 종양 제노그래프 모델에서 단일요법 효험을 보였다는 것을 나타낸다.
도 20은 Hu101-28이 종양 성장을 억제하는데 있어서 항-PD-L1 항체와 시너지 작용한다는 것을 나타낸다.
도 21은 Hu101-28에 의한 cyno CD73의 결합 및 cyno CD73의 활성의 억제를 나타낸다.
도 22는 Hu101-28이 CD73으로의 결합에 대하여 MEDI-9447과 경쟁하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 23은 Hu101-28과 상호작용하는 CD73의 아미노산 잔기를 나열한다.
도 24는 Hu101-28 및 MEDI-9447의 에피토프를 도시한다.
도 25는 MEDI-9447과 비교하여 Hu101-28의 우수한 활성을 나타낸다.
도 26은 Hu101-28이 CD73의 발현 수준이 상이한 세포 상에서 CD73을 억제하는데 효과적이었다는 것을 나타낸다.
정의
용어 "하나의(a)" 또는 "하나의(an)" 실체물은 하나 이상의 상기 실체물을 지칭한다는 것을 알아야 한다; 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나의" (또는 "하나의"), "하나 이상의", 및 "적어도 하나의"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 단수형 "폴리펩타이드" 뿐만 아니라 복수형 "폴리펩타이드"를 포함하는 것으로 의도되고 아미드 결합 (펩타이드 결합으로도 알려져 있다)에 의해 선형으로 결합된 모노머 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬 들을 지칭하는데 사용되는 어떤 다른 용어도 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 중 어느 것을 대신해서, 또는 상기 용어 중 어느 것과도 교체 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 제한되는 것이 아니라 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 또는 비-자연 발생한 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하도록 의도된다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수도 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 그것은 화학적 합성을 포함한 어떠한 방식으로도 생성될 수 있다.
용어 "단리된"은 세포, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에 관하여 본원에서 사용된 바와 같이 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 각각 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 사용된 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구물질 또는 그 밖의 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드를 지칭한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 자연 발생되지 않으며 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것으로 여겨진다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 다른 세포 조직 단백질 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 폴리펩타이드를 지칭하는데 사용된다. 단리된 폴리펩타이드는 정제된 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련이 있기 때문에 자연적으로는 존재하지 않는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 형태를 의도하며, 이것의 비-제한적 예는 정상적으로는 함께 일어나지 않는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 조합함으로써 생성될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩타이드 또는 두 개의 핵산 분자 간의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수도 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 같은 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 상기 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 간 상동성의 정도는 서열에 의해 공유된 일치하거나 상동성인 위치의 수의 함수이다. "무관한" 또는 "비-상동성" 서열은 본 명세서의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성을 공유하지만, 그러나 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 또 다른 서열에 대하여 특정 퍼센트 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 가지며, 정렬될 때, 두 개의 서열을 비교하면 상기 퍼센트의 염기 (또는 아미노산)가 같다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology에서 기술된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 파라미터가 정렬에 사용된다. 한 가지 정렬 프로그램은 기본 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 구체적으로, 프로그램은 다음 기본 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술구 = 50개 서열; 분류 기준 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비-다중, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 지정된 퍼센트 상동성을 가지며 같거나 유사한 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 것들이다.
용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 또는 이것의 보체의 뉴클레오타이드 서열과 특정한 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 지칭한다. 이중 가닥 핵산의 상동체는 보체와 특정한 정도의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 포함하도록 의도된다. 한 양태에서, 핵산의 상동체는 핵산 또는 그 보체에 혼성체화할 수 있다. 유사하게, "동등한 폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 특정한 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 가진 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 양태에서, 서열 동일성은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 양태에서, 동등한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 하나, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 추가, 결실, 치환 및 이것들의 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 동등한 서열은 참조 서열의 활성 (예로서, 에피토프-결합) 또는 구조 (예로서, 염-다리(salt-bridge))를 보유한다.
혼성체화 반응은 상이한 "엄중도(stringency)"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 저 엄중도 혼성체화 반응은 약 10 x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액에서 약 40℃에서 수행된다. 중등 엄중도 혼성체화는 전형적으로 약 50℃에서 약 6 x SSC에서 수행되고, 고 엄중도 혼성체화 반응은 일반적으로 약 60℃에서 약 1 x SSC에서 수행된다. 혼성체화 반응은 또한 당업자에게 널리 공지된 "생리학적 조건" 하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비-제한적 예는 세포에서 보통 발견되는 온도, 이온 강도, pH 및 Mg2+의 농도이다.
폴리뉴클레오타이드는 네 개의 뉴클레오타이드 염기의 특이적인 서열로 구성된다: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때에는 티민 대신에 우라실 (U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳 방식의 표현이다. 이 알파벳 방식의 표현은 중앙 처리 장치를 가진 컴퓨터의 데이터베이스로 입력되어 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학 용도로 사용될 수 있다. 용어 "다형성"은 유전자 또는 그 일부의 한 가지 이상의 형태의 공존을 지칭한다. 적어도 두 개의 상이한 형태, 즉, 두 개의 상이한 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 유전자의 일부는 "유전자의 다형성 영역"이라고 불린다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오타이드일 수 있으며, 그 정체성은 상이한 대립 형질이 상이하다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 교체 가능하게 사용되며 어떠한 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이것의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 공지된 것이든 공지되지 않은 것이든 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며 임의의 기능을 수행할 수도 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 전령 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 이전에 또는 이후에 제공될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리머화 이후, 예컨대 라벨링 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 더 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중 및 단일 가닥 분자 둘 다를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 명세서의 어떠한 구체예도 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 형성하는 것으로 공지되거나 예측되는 두 개의 상보적인 단일 가닥 형태 둘 다를 포함한다.
용어 "암호화하다"는 폴리뉴클레오타이드에 적용되는 바와 같이 천연 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 그 단편에 대한 mRNA를 생산하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 경우 폴리펩타이드를 "암화화한다"고 하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 안티센스(antisense) 가닥은 이러한 핵산의 보체이고 암호화 서열은 그것들로부터 추정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하고 그것에 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 지칭한다. 항체는 전체 항체 및 이것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 따라서 용어 "항체"는 항원으로의 결합의 생물학적 활성을 가진 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 것들의 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이것의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 이것들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 일부, 예컨대 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 같은 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"은 압타머(aptamer), 거울상 압타머(spiegelmer), 및 디아바디를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특이적 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사한 작용을 하는 임의의 합성에 의해 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.
"단일-사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 양태에서, 상기 영역은 10 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드와 연결된다. 링커는 유연성을 위해 글리신, 뿐만 아니라 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, VH의 N-말단과 VL의 C-말단, 또는 그 반대를 연결할 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다. ScFv 분자는 업계에 공지되어 있으며, 예로서, US 특허 5,892,019에 기술되어 있다.
용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 분류의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta), 또는 엡실론(epsilon) (γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며 그것들 중에서 몇몇 하위분류 (예로서, γ1-γ4)를 갖는다는 것을 인정할 것이다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 항체의 "분류"를 결정하는 것이 이 사슬의 특징이다. 면역글로불린 하위분류 (아이소타입), 예로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, 등은 잘 특성화되어 있고 기능적 특수화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 각각의 이들 분류 및 아이소타입의 변형된 버전은 본 명세서를 고려하여 당업자에게 쉽게 식별 가능하며, 따라서, 본 명세서의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 분류는 명확하게 본 명세서의 범위 내에 있으며, 다음 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 분류에 관한 것이다. IgG에 관해, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 대략 23,000 달톤의 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000 달톤의 두 개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 네 개의 사슬은 전형적으로 이황화 결합에 의해 "Y" 구성형태로 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역까지 계속되는 중쇄를 둘러싸고 있다.
본 명세서의 항체, 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변종, 또는 유도체는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예로서, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일-사슬 Fv (scFv), 단일-사슬 항체, 이황화-결합된 Fv (sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 및 항-이디오타입(idiotypic) (항-Id) 항체 (예로서, 본원에서 개시된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 어떠한 유형 (예로서, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류 (예로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) 또는 하위분류일 수도 있다.
경쇄는 카파 또는 람다 (Κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수도 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 두 개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마(hybridoma), B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 공유 이황화 결합 또는 비-고유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구성형태의 분기형(forked) 단부의 N-말단에서 각 사슬의 맨 아래의 C-말단까지 계속된다.
경쇄 및 중쇄 둘 다는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나누어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이 점에 있어서, 경쇄 (VK) 및 중쇄 (VH) 사슬 부분 둘 다의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 알 수 있다. 반대로, 경쇄 (CK) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성(transplacental mobility), Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 관례상 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단로부터 더 멀어짐에 따라 불변 영역 도메인의 넘버링(numbering)이 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분에서는 불변 영역이다; CH3 및 CK 도메인은 실제로는 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기 나타난 바와 같이, 가변 영역은 항체를 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이에 특이적으로 결합시킨다. 즉, 항체의 VK 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브세트는 조합되어 3차원 항원-결합 부위을 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이 4차 항체 구조는 Y의 각각의 아암(arm)의 단부에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로, 항원-결합 부위는 VH 및 VK 사슬 각각의 세 개의 CDR로 한정된다 (즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3). 어떤 경우에는, 예로서, 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린에 기초하여 조작된 특정 면역글로불린 분자에서, 완전 면역글로불린 분자는 경쇄 없이 중쇄로만 구성될 수도 있다. 예로서, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 참조.
자연 발생 항체에서, 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 여섯 개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 3차원 구성형태를 취하는 경우에 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는 짧은, 비-인접한 서열의 아미노산이다. "프레임워크" 영역으로 불리는, 항원-결합 도메인에서 나머지 아미노산은 더 적은 분자 간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 대부분 β-시트 입체구조를 취하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프(loop)를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬 간, 비-공유 상호작용에 의해 올바를 배향으로 CDR을 위치시키는 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 작용을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적 표면은 동족 에피토프로의 항체의 비-공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 그것들이 정확하게 한정되었기 때문에, 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대하여 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987) 참조).
업계에서 사용되고 및/또는 받아들여지는 용어의 정의가 둘 이상인 경우, 용어의 정의는 본원에서 사용된 바와 같이, 명백하게 반대로 언급되지 않는 한, 이러한 모든 의미를 포함하도록 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접한 항원 조합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 이 특정한 영역은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)에 의해 기술되었다 (이것들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). Kabat 및 Chothia에 따른 CDR 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그 변종의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 한정되고 사용된 바와 같이 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 각각의 상기 인용된 참고문헌에 의해 한정된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표에서 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기의 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
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Kabat et al.은 또한 어떤 항체에도 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의한다. 당업자는 서열 그 자체를 넘어서 어떠한 실험 데이터에도 의존하지 않으면서, "카바트 넘버링"의 이 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 분명하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카바트 넘버링"은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
상기 표에 더하여, 카바트 넘버링 시스템은 다음과 같이 CDR 영역을 기술한다: CDR-H1은 대략 아미노산 31 (즉, 첫 번째 시스테인 잔기 이후의 대략 9개의 잔기)에서 시작하고, 대략 5-7개의 아미노산을 포함하고, 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-H2는 CDR-H1이 끝난 후 15번째 잔기에서 시작하고, 대략 16-19개의 아미노산을 포함하고, 그 다음 아르기닌 또는 리신 잔기에서 끝난다. CDR-H3은 CDR-H2가 끝난 후 대략 33번째 아미노산 잔기에서 시작하고; 3-25개의 아미노산을 포함하고; 서열 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다. CDR-L1은 대략 잔기 24에서 (즉, 시스테인 잔기 이후) 시작하고; 대략 10-17개의 잔기를 포함하고; 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-L2는 CDR-L1이 끝난 후 대략 16번째 잔기에서 시작하고 대략 7개의 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2가 끝난 후 대략 33번째 잔기에서 (즉, 시스테인 잔기 이후) 시작하고; 대략 7-11개의 잔기를 포함하고 서열 F 또는 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다.
본원에서 개시된 항체는 조류 및 포유동물을 포함한 어떤 동물 기원으로부터 유래될 수도 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 쥐, 당나귀, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 기원이 콘드릭토이드(condricthoid) (예를 들어, 상어로부터)일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상부, 중간, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이것의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 항원-결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 항체는 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, 모든 CH2 도메인 또는 이것의 일부)가 결여될 수도 있다. 상기 제시된 바와 같이, 중쇄 불변 영역이 자연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다.
본원에서 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 IgGl 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 부분적으로는 IgGl 분자로부터 유래되고, 부분적으로는 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgGl 분자로부터 유래되고 및 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인 사이의 이황화 결합을 통해 다이머를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 컬렉션을 지칭한다.
앞서 언급된 바와 같이, 다양한 면역글로불린 분류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구성형태는 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 첫 번째 (가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대하여 아미노 말단에 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "CH2 도메인"은 통상적인 넘버링 계획을 사용하여, 예로서, 항체의 대략 잔기 244에서 잔기 360까지 연장된 중쇄 분자의 일부를 포함한다 (잔기 244 내지 360, 카바트 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 참조). CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 두 개의 N-결합된 분지형 탄수화물 사슬이 온전한 천연 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 또한 CH3 도메인이 IgG 분자의 CH2 도메인에서 C-말단까지 연장되고 대략 108개의 잔기를 포함한다는 것이 잘 기록되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하고 유연하며, 따라서 두 개의 N-말단 항원-결합 영역을 독립적으로 이동시킨다. 힌지 영역은 세 개의 별개의 도메인, 상부, 중간, 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "이황화 결합"은 두 개의 황 원자 사이에서 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 함께 이황화 결합 또는 이황화물 다리를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 이황화 결합에 의해 결합되고 두 개의 중쇄는 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242에 상응하는 위치 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 두 개의 이황화 결합에 의해 결합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻어지거나 유래되고 불변 영역 (온전하거나, 부분적이거나 또는 본 명세서에 따라 변형될 수도 있다)이 제2 종으로부터 얻어지는 임의의 항체를 의미할 것이다. 특정 구체예에서 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 영장류)으로부터 유래되고 불변 영역은 인간으로부터 유래된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "퍼센트 인간화"는 인간화 도메인 및 생식세포 계열 도메인 간의 프레임워크 아미노산 차이 (즉, 비-CDR 차이)의 수를 결정하고, 총 아미노산 수에서 상기 수를 뺀 다음, 그것을 총 아미노산 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다.
"특이적으로 결합하다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖는다"는 일반적으로 항체가 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에서 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체가 항원-결합 도메인을 통해 무작위의 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 에피토프에 결합할 때 항체는 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정량화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대하여 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대하여 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적(prophylactic) 또는 예방적(preventative) 조치 둘 다를 지칭하며, 그 목적은 원치않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 진행을 예방하거나 둔화시키기 (줄이기) 위한 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출 가능하든 검출 불가능하든, 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 병의 차도 (일부든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예상된 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은 이미 병태 또는 장애에 걸린 것들, 뿐만 아니라 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 것들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 것들을 포함한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법이 필요한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농경용 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소, 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료를 필요로 하는 환자" 또는 "치료를 필요로 하는 대상체"와 같은 구절은, 예로서, 검출, 진단 절차 및/또는 치료에 사용된 본 명세서의 항체 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.
항-CD73 항체
본 명세서는 인간 CD73 단백질에 대하여 높은 친화도 및 억제 활성을 가진 항-CD73 항체를 제공한다. 항체는 유리 CD73 및 세포 표면 상의 CD73 둘 다에 효과적으로 결합할 수 있다. 세포 표면 상의 CD73 단백질에 결합되면, 결합은 내재화를 촉발시킬 수 있으며, 세포 외 아데노신 및 면역억제성 종양 환경을 감소시키는 CD73 단백질의 세포 표면 발현을 감소시킨다. 또한, 이들 항체는 CD73의 활성 부위에 결합하는데 있어서 AMP 기질과 경쟁하지 않지만 알로스테릭하게(allosterically) 또는 다른 비-경쟁적 메커니즘을 통해 작용하기 때문에, 이들 항체는 이들 항체의 잠재적 부작용을 제한하는 이들 내인성 AMP 기질과의 CD73 결합을 방해하지 않는다.
이에 더하여, 실험예에서 입증된 바와 같이, 이들 항체는 공지된 항-CD73 항체, 예컨대 Medimmune의 MEDI-9447로 관찰되지 않는 몇 가지 독특한 성질을 나타냈다. 실시예 12에서 나타난 바와 같이, MEDI-9447 및 11F11은 CD73 단백질의 N-말단 도메인에 결합하는 한편, 본 항체의 표적 아미노산 (예로서, Y345, D399, E400, R401 및 R480)은 C-말단 도메인에 있다.
CD73 효소는 원형질막의 외부 표면으로의 글리코실 포스파티딜 이노시톨 결합에 의해 결합된 두 개의 동일한 70-kD 서브유닛의 다이머로 이루어진다. 다이머 인간 CD73의 결정 구조는 효소의 적절한 기능에 필요한 효소의 개방 및 폐쇄 형태 사이의 광범위한 입체구조적 전환를 나타낸다. 다이머화 계면은 C-말단 도메인에 의해 형성된다. C-말단 도메인이 다른 결합에 포함될 때, 다이머화 및/또는 입체구조적 전환이 차단되어 CD73 활성의 억제를 초래할 것으로 예상된다. 그에 반해, N-말단 도메인에 의한 항체로의 결합은 이러한 효과가 없을 수도 있다.
그러므로, 본원에서 개시된 항체가 C-말단 도메인에서 CD73 단백질에 결합할 때, 그것들은 단백질의 다이머화를 차단하고 그 활성을 효과적으로 억제할 것으로 예상된다. 그러므로, 본원에서 개시된 항체는 N-말단 도메인에 결합하는, 이전에 공지된 항-CD73 항체보다 훨씬 더 우수하다.
그러므로, 본 명세서의 한 구체예에 따르면, 인간 CD73 단백질에 대하여 특이성을 갖고 인간 CD73 단백질의 C-말단 부분으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는 단리된 항체 또는 이것의 단편이 제공된다. 업계에 공지된 바와 같이, 인간 CD73 단백질의 C-말단 부분은, 하기 표의 서열 번호: 61에서 나타난 바와 같이, 잔기 337에서 시작하여 238개의 아미노산 잔기를 포함한다.
Figure pat00002
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간 CD73 단백질의 C-말단 도메인 중 하나 이상에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간 CD73 단백질의 Y345, D399, E400, R401 및 R480으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 아미노산 잔기 중 적어도 두 개에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345 및 D399에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345 및 E400에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345 및 R401에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 D399 및 E400에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 D399 및 R401에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 D399 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 E400 및 R401에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 E400 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 R401 및 R480에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, D399, 및 E400에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, D399, 및 R401에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, D399, 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, E400, 및 R401에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, E400, 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, R401 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 D399, E400, 및 R401에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 D399, E400, 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 E400, R401 및 R480에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, D399, E400, 및 R401에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, D399, E400, 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, D399, R401 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 Y345, E400, R401 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 적어도 D399, E400, R401 및 R480에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 Y345, D399, E400, R401 및 R480 각각에 결합한다.
본 명세서의 한 구체예에 따르면, 서열 번호: 1-6에서 한정된 CDR 영역을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 제공된다.
Figure pat00003
실험예에서 입증된 바와 같이, 이들 CDR 영역을 함유하는 항체는, 마우스, 인간화 또는 키메라에 관계없이, 강력한 CD73 결합 및 억제 활성을 갖고 있었다. 추가의 컴퓨터 모델링은 CDR 내 특정 잔기가 항체의 성질을 보유하거나 개선하도록 변형될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 잔기는 "핫 스팟(hot spot)"이라고 불리며 이것은 표 1에서 밑줄 그어져 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항-CD73 항체는 표 1에서 나열된 바와 같이 VH 및 VL CDR을 포함하며, 하나, 두 개 또는 세 개의 추가 변형을 갖는다. 이러한 변형은 아미노산의 추가, 결실 또는 치환일 수도 있다.
일부 구체예에서, 변형은 각각의 CDR의 하나 이하의 핫 스팟 위치에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 변형은 하나, 두 개 또는 세 개의 이러한 핫 스팟 위치에서의 치환이다. 한 구체예에서, 변형은 핫 스팟 위치 중 하나에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 이러한 치환은 보존적 치환이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄 (예로서, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예로서, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄 (예로서, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예로서, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예로서, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄 (예로서, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 업계에서 한정되어 있다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드의 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 같은 측쇄 패밀리의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산의 스트링(string)은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있다.
보존적 아미노산 치환의 비-제한적 예는 하기 표에서 제공되며, 0 이상의 유사성 점수는 두 개의 아미노산 간의 보존적 치환을 나타낸다.
Figure pat00004
[표 3]
Figure pat00005
적합하게 치환된 CDR의 구체적인 예는 실시예 7의 서열 번호: 26-56에서 제공된다. 일부 구체예에서, 그러므로, 본 명세서의 항체는 서열 번호: 1 또는 26-29 중 어느 하나의 VH CDR1을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항체는 서열 번호: 2 또는 30-36 중 어느 하나의 VH CDR2를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항체는 서열 번호: 1 또는 37-41 중 어느 하나의 VH CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항체는 서열 번호: 4 또는 42-45 중 어느 하나의 VL CDR1을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항체는 서열 번호: 5의 VL CDR2를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항체는 서열 번호: 6 또는 46-56 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 상기 치환 중 하나 이하, 둘 이하, 또는 셋 이하를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 26-29 중 어느 하나의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 30-36 중 어느 하나의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 37-41 중 어느 하나의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 42-45 중 어느 하나의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 46-56 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함한다.
VH의 비-제한적 예는 서열 번호: 7 및 9-13에서 제공되며, 이것들 중에서 서열 번호: 10은 마우스 VH이고, 서열 번호: 7, 9, 및 11-13은 인간화 VH이다. 또한, 인간화 VH 중에서, 서열 번호: 7, 9 및 12-13은 마우스 버전으로의 하나 이상의 역돌연변이를 포함한다. 유사하게, VL (VK)의 비-제한적 예는 서열 번호: 8, 15-20 및 22-24에서 제공된다. 서열 번호: 15는 마우스 서열이고, 서열 번호: 16 및 22는 예에서 나타난 바와 같이 원래 유래된 인간화 서열이다. 서열 번호: 8, 17-20 및 22-24는 역돌연변이된 인간화 VL이다.
역돌연변이는 항-CD73 항체의 특정 특성을 보유하는데 유용한 것으로 나타난다. 따라서, 일부 구체예에서는, 본 명세서의 항-CD73 항체, 특히 인간 또는 인간화 항-CD73 항체는 역돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, VH 역돌연변이 (즉, 명시된 위치에서 아미노산을 포함함)는, 카바트 넘버링에 따라, (a) 위치 30에서 Thr, (b) 위치 44에서 Lys, (c) 위치 48에서 Met, (d) 위치 67에서 Ile, 및 (e) 위치 71에서 Arg, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 구체예에서, VL 역돌연변이는, 카바트 넘버링에 따라, (a) 위치 5에서 Ser, (b) 위치 46에서 Pro, (c) 위치 47에서 Trp, (d) 위치 49에서 Ser, (e) 위치 70에서 Ser, 및 (f) 위치 71에서 Tyr, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다.
일부 구체예에서, 본 명세서의 항-CD73 항체는 서열 번호: 7, 또는 9-13 중 어느 하나의 VH, 서열 번호: 8, 또는 15-20 및 22-24 중 어느 하나의 VL, 또는 그것들 각각의 생물학적 등가물을 포함한다. VH 또는 VL의 생물학적 등가물은 지정된 아미노산을 포함하는 한편 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열이다. 그러므로, 서열 번호: 7의 생물학적 등가물은 서열 번호: 7에 대하여 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖지만 CDR (서열 번호: 1-6 또는 그것들의 변종)을 보유하고, 선택적으로는 역돌연변이 중 하나 이상, 또는 모두를 보유하는 VH일 수도 있다.
한 구체예에서, VH는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는다. 한 구체예에서, VH는 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는다.
또한 항체는 본원에서 개시된 바와 같이 그것들이 유래된 자연 발생 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 달라지도록 변형될 수도 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 유사할 수도 있으며, 예로서, 시작 서열에 대하여 특정 퍼센트 동일성을 가질 수도 있으며, 예로서 그것은 시작 서열과 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일할 수도 있다.
특정 구체예에서, 항체는 항체와 정상적으로 회합되지 않은 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적 변형은 하기 더 상세히 기술된다. 예를 들어, 본 명세서의 항체는 유연한 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티 (예로서, PEG, 약물, 독소, 또는 라벨)를 추가하도록 변형될 수 있다.
본 명세서의 항체, 이것의 변종, 또는 유도체는, 즉, 공유 부착이 항체를 에피토프에 결합하는 것으로부터 방지하도록 항체로의 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함한다. 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 항체는, 예로서, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 세포 리간드 또는 그 밖의 단백질로의 결합, 등에 의해 변형될 수 있다. 많은 화학적 변형 중 어느 것도, 제한되는 것은 아니지만, 특이적인 화학적 분열, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성, 등을 포함하는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 함유할 수도 있다.
일부 구체예에서, 항체는 치료제, 프로드러그(prodrug), 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변경인자, 약품, 또는 PEG에 컨쥬게이션될 수도 이TEk.
항체는 치료제에 컨쥬게이션되거나 융합될 수도 있으며, 이것은 검출 가능한 라벨, 예컨대 방사성 라벨, 면역조절물질, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 광활성 치료제 또는 진단제, 약물 또는 독소일 수도 있는 세포독성제, 초음파 증강제, 비-방사성 라벨, 이것들의 조합 및 업계에 공지된 그 밖의 이러한 작용제를 포함할 수도 있다.
항체는 그것을 화학 발광 화합물에 커플링시킴으로써 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 그 다음에 화학 발광-태그된(tagged) 항원-결합 폴리펩타이드의 존재가 화학 반응의 과정 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학 발광 라벨링 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 쎄로마틱(theromatic) 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.
항체는 또한 형광 발광 방출 금속, 예컨대 152Eu, 또는 란탄 계열 중 다른 것을 사용하여 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜트아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA)으로서 이러한 금속 킬레이트 기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 다양한 모이어티를 항체에 컨쥬게이션하기 위한 기술은 널리 공지되어 있으며, 예로서, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)) 참조.
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체 제조 방법
본 명세서은 또한 본 명세서의 항체, 그 변종 또는 유도체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자가 제공된다. 폴리뉴클레오타이드의 예는 서열 번호: 57-60을 포함한다. 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드는 같은 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 그 변종 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수도 있다. 추가적으로, 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드는 같은 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 그 변종 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부를 암호화할 수도 있다.
항체를 제조하는 방법은 업계에 널리 공지되어 있고 본원에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 가변 및 불변 영역 둘 다는 완전한 인간이다. 완전한 인간 항체는 업계에 설명된 기술을 사용하여 및 본원에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원 공격에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 그 내인성 유전자좌(loci)가 손상된 트랜스제닉 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적 기술은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140에서 기술된다 (이것들은 그 전문이 참고로 포함된다).
특정 구체예에서, 제조된 항체는 처리되는 동물에서, 예로서, 인간에서 해로운 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 한 구체예에서, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드, 그 변종, 또는 유도체는 업계에서 인식되어 잇는 기술을 사용하여 면역원성을 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 인간화, 영장류화, 탈면역화될 수 있거나, 또는 키메라 항체가 제조될 수 있다. 이들 유형의 항체는 모체 항체의 항원-결합 성질을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하지만, 인간에서 덜 면역원성인 비-인간 항체, 전형적으로 쥐 또는 영장류 항체로부터 유래된다. 이것은 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역으로 이식하여 키메라 항체를 생성하는 단계; (b) 중요한 프레임워크 잔기를 보유하거나 보유하지 않으면서 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 중 하나 이상의 적어도 일부를 인간 프레임워크 및 불변 영역으로 이식하는 단계; 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 그것들을 "클로킹(cloaking)"하는 단계를 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수도 있다. 이러한 방법은 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,190,370에 개시되어 있다 (이것들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).
탈면역화는 또한 항체의 면역원성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "탈면역화"는 T-세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변화를 포함한다 (예로서, 국제 출원 공개 번호 WO/9852976 A1 및 WO/0034317 A2 참조). 예를 들어, 시작 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 분석되고, 상보성 결정 영역 (CDR) 및 서열 내의 그 밖의 주요 잔기에 관하여 에피토프의 위치를 나타내는 각각의 V 영역의 인간 T-세포 에피토프 "맵(map)"이 생성된다. 최종 항체의 활성이 변할 위험이 적은 대안의 아미노산 치환을 확인하기 위해 T-세포 에피토프 맵의 개개의 T-세포 에피토프가 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 다양한 대안의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 설계되고 이들 서열은 다양한 결합 폴리펩타이드에 순차적으로 포함된다. 전형적으로 12 내지 24개의 변종 항체가 생성되어 결합 및/또는 기능에 대하여 테스트된다. 그 다음에 변형된 가변 및 인간 불변 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현 벡터로 클로닝되고 후속 플라스미드가 전체 항체의 생산을 위해 세포주로 도입된다. 그 다음에 항체는 적절한 생화학적 및 생물학적 검정으로 비교되고, 최적의 변종이 확인된다.
본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 결합 특이성은 시험관 내 검정, 예컨대 면역침강법, 방사성 면역 검정 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다.
대안으로, 단일-사슬 유닛의 생산에 대하여 설명된 기술 (미국 특허 번호 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989))은 본 명세서의 단일-사슬 유닛을 생산하기 위해 조정될 수 있다. 아미노산 다리를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 결합시킴으로써 단일-사슬 유닛이 형성되어, 단일-사슬 융합 펩타이드를 생성한다. 대장균(E. coli)에서 기능적 Fv 단편의 조립 기술이 또한 사용될 수 있다 (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
단일-사슬 Fv (scFv) 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에 기술된 것들을 포함한다. 인간에서 항체의 생체 내 사용 및 시험관 내 검출 검정을 포함한 일부 용도에 대하여, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 업계에 공지되어 있다. 예로서, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397 참조 (이것들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).
인간화 항체는 비-인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 가진 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터 유래된 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원-결합을 변화시키고, 바람직하게는 이것을 개선하도록 CDR 공여체 항체의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 업계에 널리 공지된 방법에 의해, 예로서, 항원-결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예로서, Queen et al., 미국 특허 번호 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) 참조 (이것들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)). 항체는, 예를 들어, CDR-이식 (EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332 (이것은 그 전문이 참고로 포함된다))을 포함하는 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
완전한 인간 항체는 인간 환자의 치료적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함한, 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 참조 (이것들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).
인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수도 있다. 대안으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수도 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별도로 또는 이와 동시에 비-기능적이 될 수도 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포가 확장되고 배반포(blastocyst)로 미량주사되어 키메라 마우스를 생산한다. 그 다음에 키메라 마우스는 교배되어 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생산한다. 트랜스제닉 마우스는 정상적인 방식으로 선택된 항원, 예로서, 원하는 표적 폴리펩타이드 모두 또는 그 일부로 면역화된다. 항원에 대한 단클론성 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻어질 수 있다. 트랜스제닉 마우스가 가지고 있는 인간 면역글로불린 이식 유전자는 B-세포 분화 중에 재배열되고, 그 이후에 종류 변환(분류 switching) 및 체세포 돌연변이된다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이 기술의 개요에 대해서는, Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995) 참조. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생산하기 위한 이 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해서는, 예로서, PCT 공개 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 번호 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 및 5,939,598 참조 (이것은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 이에 더하여, Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) 및 GenPharm (San Jose, Calif.)과 같은 회사들이 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 종사한다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 또한 "유도 선택(guided selection)"이라고 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서 선택된 비-인간 단클론성 항체, 예로서, 마우스 항체는 같은 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하는데 사용된다 (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 참조 (이것은 그 전문이 참고로 포함된다)).
또 다른 구체예에서, 원하는 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예로서, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수도 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 역할을 한다. 단리되면, DNA는 발현 벡터로 배치된 다음, 달리 면역글로불린을 생산하지 않는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포로 트랜스펙션될 수도 있다. 더 특별하게는, 단리된 DNA (이것은 본원에서 기술된 바와 같이 합성될 수도 있다)는 Newman et al., 1995년 1월 25일에 출원된 미국 특허 번호 5,658,570 (이것은 본원에 참고로 포함된다)에서 기술된 바와 같이 제조 항체에 대한 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수도 있다. 근본적으로, 이것은 선택된 세포로부터의 RNA 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이 목적에 적합한 프라이머는 또한 미국 특허 번호 5,658,570에서 기술된다. 하기 더 상세히 논의된 바와 같이, 원하는 항체를 발현하는 형절전환된 세포는 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급원을 제공하기 위해 비교적 대량으로 성장할 수도 있다.
추가적으로, 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 CDR 중 하나 이상이 프레임워크 영역 내에, 예로서, 인간 프레임워크 영역으로 삽입되어 비-인간 항체를 인간화할 수도 있다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 공통 프레임워크 영역, 및 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수도 있다 (예로서, 인간 프레임워크 영역의 목록에 대해서는 Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드는 원하는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 예로서, LIGHT를 암호화한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환은 프레임워크 영역 내에서 이루어질 수도 있고, 바람직하게는, 아미노산 치환은 항원으로의 항체의 결합을 개선한다. 추가적으로, 이러한 방법은 하나 이상의 사슬 내 이황화 결합이 결여된 항체 분자를 생성하기 위해 사슬 내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 제조하는데 사용될 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 다른 변화는 본 명세서에 및 해당 기술분야 내에 포함된다.
이에 더하여, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자의 유전자와 함께, 마우스 항체 분자의 유전자를 스플라이싱(splicing)함으로써, 적절한 항원 특이성의 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))이 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 것이다.
하지만 재조합 항체를 생성하기 위해 또 다른 고도로 효율적인 수단이 Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)에 의해 개시된다. 구체적으로, 이 기술은 원숭이 가변 도메인 및 인간 불변 서열을 함유하는 영장류화 항체를 생성시킨다. 이 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 더욱이, 이 기술은 공동으로 양도된 미국 특허 번호 5,658,570, 5,693,780 및 5,756,096 (이것들 각각은 본원에 참고로 포함된다)에서 기술되어 있다.
대안으로, 항체-생산 세포주는 당업자에게 널리 공지되어 있는 기술을 사용하여 선택되고 배양될 수 있다. 이러한 기술은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 간행물에 기술되어 있다. 이 점에 있어서, 하기 기술된 바와 같이 본 명세서에서의 사용에 적합한 기술은 Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)에서 기술되어 있다 (이것은 부록을 포함하여 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).
추가적으로, 당업자에게 공지되어 있는 표준 기술은 본 명세서의 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있으며, 아미노산 치환을 초래하는 부위-특이적 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 변종 (유도체 포함)은 참조 가변 중쇄 영역, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 가변 경쇄 영역, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3에 관하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 암호화한다. 대안으로, 돌연변이는 암호화 서열 모두 또는 일부를 따라, 예컨대 포화 돌연변이 유발에 의해 무작위로 도입될 수 있고, 결과로 생성된 돌연변이는 활성을 보유한 돌연변이를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
치료 방법
본원에서 기술된 바와 같이, 본 명세서의 항체, 변종 또는 유도체는 특정 치료 및 진단 방법에서 사용될 수 있다.
본 명세서는 본원에서 기술된 장애 또는 병태 중 하나 이상을 치료하기 위해 환자, 예컨대 동물, 포유동물, 및 인간에게 본 명세서의 항체를 투여하는 것을 포함하는 항체-기반 요법과 더 관련이 있다. 본 명세서의 치료적 화합물은 본 명세서의 항체 (본원에서 기술된 바와 같이 이것의 변종 및 유도체 포함) 및 본 명세서의 항체를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드 (본원에서 기술된 바와 같이 이것의 변종 및 유도체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 항체는 또한 암을 치료하거나 억제하는데 사용될 수 있다. 상기 제공된 바와 같이, CD73은 종양 세포에서 과발현될 수 있다. 종양-유래 CD73은 세포 외 아데노신을 생산하기 위한 엑토-효소로서 기능할 수 있으며, 이것은 아데노신 수용체 신호를 통해 항종양 T-세포 면역력을 제한함으로써 종양 성장을 촉진한다. 쥐 종양 모델에서 소분자 억제제, 또는 단클론성 항체 표적화 CD73로의 결과는 표적화된 CD73 요법이 종양 성장의 효과적인 제어에 대한 중요한 대안이고 현실적인 접근법이라는 것을 나타낸다. 특히, 그것은 후천적 면역 반응 기작을 향상시킴으로써 T-세포-기반 요법을 돕는데, 이것은 종양-침윤성 T 림프구의 기능을 증가시킬 수도 있고, 암 환자에서 생존의 개선을 유발할 수도 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은, 한 구체예에서는, 환자에게 본 명세서의 항체의 유효량을 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 환자의 암 세포 (예로서, 간질 세포) 중 적어도 하나는 CD73을 과발현한다.
암의 비-제한적 예는 방광암, 유방암, 결장직장암, 내막암, 식도암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 및 갑상선암을 포함한다.
세포 요법, 및 구체적으로는 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법이 또한 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서의 항-CD73 항체와 접촉된 (또는 대안으로 본 명세서의 항-CD73 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 T 세포가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작시, T 세포는 치료가 필요한 암 환자에게 도입될 수 있다. 암 환자는 본원에서 개시된 바와 같이 어떤 유형의 암에 걸릴 수도 있다. T 세포는 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 종양-침윤성 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, T 세포는 암 환자 자신으로부터 단리되었다. 일부 구체예에서, T 세포는 공여체에 의해 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. T 세포가 암 환자로부터 단리될 때, 원치않는 면역 반응은 최소화될 수 있다.
본 명세서의 항체 또는 그 변종, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예측될 수도 있는, 증가된 세포 생존과 관련된 추가적인 질환 또는 병태는 악성 종양 및 관련 장애, 예컨대 백혈병 (급성 백혈병 (예로서, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병 (골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병(erythroleukemia) 포함) 포함) 및 만성 백혈병 (예로서, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성 다혈구증(polycythemia vera), 림프종 (예로서, 호지킨 질환(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 질환(non-Hodgkin's disease)), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's 마크로글로불린emia), 중쇄 질환, 및 제한되는 것은 아니지만, 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종(squamous cell carcinoma), 기저세포 암종(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 한선 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 유두상 선암종(papillary adenocarcinoma), 낭선종(cystadenocarcinoma), 수질 암종(medullary carcinoma), 기관지 암종(bronchogenic carcinoma), 신장세포 암종, 간세포암(hepatoma), 담관 암종, 융모암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 태생성 암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 속귀신경집종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 수막종(meningioma), 흑색종, 신경아세포종(neuroblastoma) 및 망막아종(retinoblastoma)과 같은 육종 및 암종을 포함하는 고체 종양의 진행, 및/또는 전이를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
임의의 특정 환자에 특이적인 투약 및 치료 양생법은 사용된 특정 항체, 그 변종 또는 유도체, 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 및 식단, 및 투여 시기, 배설률, 약물 조합, 및 치료되고 있는 특정 질환의 심각도를 포함하는 다양한 인자에 따라 다를 것이다. 의료 간병인에 의한 이러한 인자의 판단은 업계의 기술 범위 내에 있다. 양은 또한 치료되어야 하는 개개의 환자, 투여 경로, 제제의 유형, 사용된 화합물의 특성, 질환의 심각도, 및 원하는 효과에 따라 달라질 것이다. 사용된 양은 업계에 널리 공지된 약리학적 및 약동학적 원칙에 의해 결정될 수 있다.
항체, 변종의 투여 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 어떤 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사(bolus injection), 상피 또는 점막피부 라이닝(lining) (예로서, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수도 있고 그 밖의 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드를 함유하는 약학적 조성물은 경구로, 직장으로, 비경구로, 수조내로, 질내로, 복강내로, 국부적으로 (분말, 연고, 점적제 또는 경피 패치에 의해), 볼로, 또는 구강 또는 비강 스프레이로서 투여될 수도 있다.
용어 "비경구"는 본원에서 사용된 바와 같이 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 지칭한다.
투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 본 명세서의 항체를 심실내 및 척추강내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계로 도입하는 것이 바람직할 수도 있다; 심실내 주사는, 예를 들어, 레저버(reservoir), 예컨대 Ommaya 레저버에 부착된 심실내 카테터(catheter)에 의해 촉진될 수도 있다. 폐 투여는 또한, 예로서, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제가 들어있는 제제의 사용에 의해 이용될 수 있다. 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물을 처리를 필요로 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있다; 이것은, 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 수술 중 국소적 주입, 예로서, 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부적 도포, 주사, 카테터, 좌제, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 막, 예컨대 실라스틱 막(sialastic membrane), 또는 섬유를 포함한 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 재료로 이루어져 있다. 바람직하게는, 항체를 포함한, 본 명세서의 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의해야 한다.
또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다 (Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조; 일반적으로 같은 내용 참조).
또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수도 있다 (Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 또 다른 구체예에서, 폴리머 재료가 사용될 수 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 참조; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조). 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 치료 표적, 즉, 뇌에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신적 용량의 일부만을 필요로 한다 (예로서, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 그 밖의 제어된 방출 시스템은 Langer에 의한 검토에서 논의된다 (1990, Science 249:1527-1533).
본 명세서이 조성물이 단백질을 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 특정 구체예에서, 핵산은 생체 내에서 암호화된 단백질의 발현을 촉진하기 위해 그것을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고 그것이 세포 내에 있도록 그것을 투여함으로써, 예로서, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해 (미국 특허 번호 4,980,286 참조), 또는 직접적인 주사에 의해, 또는 극미립자 충격법 (예로서, 유전자 총(gene gun); Biolistic, Dupont)의 사용에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션제로 코팅함으로써, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스(homeobox)-유사 펩타이드에 결합된 상태로 그것을 투여함으로써 (예로서,Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 참조), 등에 이해 투여될 수 있다. 대안으로, 핵산은 세포 내로 도입되고, 상동 재조합에 의해, 발현용 숙주 세포 DNA 내에 포함될 수 있다.
염증, 면역 또는 악성 질환, 장애 또는 질병의 치료, 억제 및 예방에 효과적인 본 명세서의 항체의 양은 표준 임상 기술로 결정될 수 있다. 이에 더하여, 시험관 내 검정은 선택적으로 최적의 투약 범위를 확인하는 것을 돕는데 이용될 수도 있다. 제제에서 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환, 장애 또는 질병의 심각도에 따라 다를 것이고, 의사의 판단 및 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수도 있다.
일반적인 제안으로서, 환자에게 투여된 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 투약량은 전형적으로 환자의 체중의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 환자의 체중의 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 또는 환자의 체중의 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래의 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 인간 신체 내에서 다른 종의 항체보다 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 더 작은 투약량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 또한, 본 명세서의 항체의 투여의 투약량 및 빈도는 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투 (예로서, 뇌로)를 향상시킴으로써 감소될 수도 있다.
본 명세서의 항체, 그 변종, 또는 유도체의 투여를 포함한, 감염성 또는 악성 질환, 질병 또는 장애를 치료하는 방법은 전형적으로 시험관 내에서 테스트된 다음, 인간에서 사용하기 전에, 허용 가능한 동물 모델의 생체 내에서 원하는 치료적 또는 예방적 활성에 대하여 테스트된다. 트랜스제닉 동물을 포함한 적합한 동물 모델은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유용성을 입증하기 위한 시험관 내 검정은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과는 본원 내 다른 곳에서 개시된 검정들과 같은 당업자에게 공지되어 있는 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 따르면, 특이적 항원-결합 폴리펩타이드의 투여가 지시되는지를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관 내에서 검정은 환자 조직 샘플이 배양물에서 성장하고 화합물에 노출되거나 다른 방식으로 화합물이 투여되는 시험관 내 세포 배양 검정을 포함하고, 조직 샘플에 대한 이러한 효과가 관찰된다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며 본 명세서의 항체 또는 본 명세서의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는데 사용될 수 있으며, 예로서, 리포솜 내 캡슐화, 극미립자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포 내 섭취 (예로서, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 그 밖의 벡터의 일부로서 핵산의 구성, 등이 있다.
추가의 구체예에서, 본 명세서의 조성물은 항신생물제, 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항생제 또는 항진균제와 조합하여 투여된다. 업계에 공지된 이들 작용제 중 어느 것도 본 명세서의 조성물 중에서 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 명세서의 조성물은 화학치료제와 조합하여 투여된다. 본 명세서의 조성물과 함께 투여될 수도 있는 화학치료제는 항생제 유도체 (예로서, 독소루비신, 블레오마이신, 다우노루비신, 및 닥티노마이신); 항에스트로겐제 (예로서, 타목시펜); 항대사물질 (예로서, 플루오로우라실, 5-FU, 메토트렉세이트, 플록슈리딘, 인터페론 알파-2b, 글루탐산, 플리카마이신, 메르캅토퓨린, 및 6-티오구아닌); 세포독성제 (예로서, 카르무스틴, BCNU, 로무스틴, CCNU, 시토신 아라비노시드, 사이클로포스파미드, 에스트라무스틴, 하이드록시유레아, 프로카르바진, 미토마이신, 부설판, 씨스-플라틴, 및 빈크리스틴 설페이트); 호르몬 (예로서, 메드록시프로게스테론, 에스트라무스틴 인산나르튬, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올, 메게스트롤 아세테이트, 메틸테스토스테론, 디에틸스틸베스트롤 다이포스페이트, 클로로트리아니센, 및 테스토락톤); 질소 머스타드 유도체 (예로서, 메팔렌, 코람부실, 메클로레타민 (질소 머스타드) 및 티오테파); 스테로이드 및 조합 (예로서, 베타메타손 인산나트륨); 및 기타 (예로서, 다이카르바진, 아스파라기나제, 미토탄, 빈크리스틴 설페이트, 빈블라스틴 설페이트, 및 에토포시드)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 명세서의 조성물은 사이토카인과 조합하여 투여된다. 본 명세서의 조성물과 함께 투여될 수도 있는 사이토카인은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, 항-CD40, CD40L, 및 TNF-α를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 명세서의 조성물은, 예를 들어, 방사선 요법과 같은 그 밖의 치료적 또는 예방적 양생법과 조합하여 투여된다.
조합 요법
제2 항암제 (화학치료제)와 함께 본 명세서의 항-CD73 항체 중 하나 이상의 사용을 포함하는 조합 요법이 또한 제공된다. 화학치료제는 작용 메커니즘에 의해, 예를 들어, 다음 군으로 분류될 수도 있다:
- 항대사물질/항암제, 예컨대 피리미딘 유사체 플록슈리딘, 카페시타빈, 및 시타라빈;
- 퓨린 유사체, 폴레이트 안타고니스트, 및 관련 억제자;
- 천연물, 예컨대 빈카 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴) 및 미소관, 예컨대 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론, 비노렐빈 (NAVELBINE®), 및 에피포도필록톡신 (에토포시드, 테니포시드)을 포함한 항증식제/세포분열억제제;
- DNA 손상제, 예컨대 액티노마이신, 암사크린, 부설판, 카르보플라틴, 클로람부실, 씨스플라틴, 사이클로포스파미드 (CYTOXAN®), 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이포스파미드, 멜팔란, 메르클로레타민, 미토마이신, 미톡산트론, 나이트로소유레아, 프로카르바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포시드, 에토포시드, 및 트리에틸렌티오포스포르아미드;
- 항생제, 예컨대 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 아이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신), 및 미토마이신;
- 효소, 예컨대 전신적으로 L-아스파라긴에 대사작용하고 자체의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 박탁하는 L-아스파라기나제;
- 항혈소판제;
- 항증식성/세포분열억제성 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드 사이클로포스파미드 및 유사체 (멜팔란, 클로람부실, 헥사메틸멜라민, 및 티오테파), 알킬 나이트로소유레아 (카르무스틴) 및 유사체, 스트렙토조신, 및 트리아젠 (다카르바진);
- 항증식성/세포분열억제성 항대사성물질, 예컨대 폴산 유사체 (메토트렉세이트);
- 백금 배위결합 복합체 (씨스플라틴, 옥실로플래티님, 및 카르보플라틴), 프로카르바진, 하이드록시유레아, 미토탄, 및 아미노글루테티미드;
- 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 바이칼루타미드, 및 닐루타미드), 및 아로마타제 억제자 (레트로졸 및 아나스트로졸);
- 항응고제, 예컨대 헤파린, 합성 헤파린 염, 및 그 밖의 트롬빈 억제자;
- 피브린 용해제, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제, 유로키나제, 아스피린, 다이피리다몰, 티클로피딘, 및 클로피도그렐;
- 이동억제제;
- 항분비제 (브레벨딘);
- 면역억제제 타크롤리무스, 시롤리무스, 아자티오프린, 및 마이코페놀레이트;
- 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제자 (혈관 내피 성장 인자 억제자 및 섬유아세포 성장 인자 억제자);
- 안지오텐신 수용체 차단제, 산화질소 공여체;
- 안티센스 올리고뉴클레오타이드;
- 항체, 예컨대 트라스투쥬맙 및 리툭시맙;
- 세포 주기 억제자 및 분화 유도 물질, 예컨대 트레티노인;
- 억제자, 토포아이소머라제 억제자 (독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 아이다루비신, 이리노테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 및 이리노테칸), 및 코르티코스테로이드 (코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 및 프레드니솔론);
- 성장 인자 신호 전달 키나제 억제자;
- 기능 장애 유도 물질;
- 독소, 예컨대 콜레라(Cholera) 독소, 리신, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 아데닐레이트 사이클라제 독소, 디프테리아 독소, 및 카스파제 활성화제;
- 및 크로마틴.
화학치료제의 추가의 예는 다음을 포함한다:
- 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드 (CYTOXAN®);
- 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판, 및 피포설판;
- 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보큐온, 메튜레도파, 및 유레도파;
- 알프레타민, 트라이에킬렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트라이메밀로로멜라민을 포함한 에밀레루민 및 메밀라멜라민;
- 아세토게닌, 특히 불라타신 및 불라타시논;
- 합성 유사체 토포테칸을 포함한 캄포토테신;
- 브리오스타틴;
- 칼리스타틴;
- 아도젤레신, 카르젤레신, 및 비젤레신 합성 유사체를 포함한 CC-1065;
- 크립토피신, 특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8;
- 돌라스타틴;
- 합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI를 포함한 듀오카르마이신;
- 엘레유테로빈;
- 판크라티스타틴;
- 사코딕티인;
- 스폰지스타틴;
- 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 사이클로포스파미드, 에스트라무스틴, 아이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드;
- 나이트로소유레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포레무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴;
- 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예로서, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마II 및 칼리키아마이신 phiI1), 디네마이신 A를 포함한 디네마이신, 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트, 에스페라미신, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소 단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카라니노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 아이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, ??라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신;
- 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU);
- 폴산 유사체, 예컨대 데모프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트;
- 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌;
- 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록슈리딘;
- 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스토락톤;
- 항아드레날린제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 및 트릴로스탄;
- 폴산 첨가액, 예컨대 프롤린산;
- 트리코테센, 특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A, 및 안귀딘;
- 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀 (TAXOL®) 및 도세탁셀 (TAXOTERE®);
- 백금 유사체, 예컨대 씨스플라틴 및 카르보플라틴;
- 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 헤스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지큐온; 엘포름틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시유레아; 렌티난; 류코보린; 로니다민; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 나이트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 플루오로피리미딘; 폴린산; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; 다당류-K (PSK); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아조산; 트라이아지큐온; 2,2',2''-트라이큐오로트라이에밀아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오페타; 클로람부실; 젬시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 아이포스파미드; 미트록산트론; 반크리스틴; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 제올로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제자 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DFMO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; FOLFIRI (플루오로우라실, 류코보린, 및 이리노테칸);
- 및 상기 중 어느 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체.
또한 항호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 효소 아로마타제의 억제자, 항-안드로겐, 및 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 상기 중 어느 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 "화학치료제"의 정의에 포함된다.
항에스트로겐제 및 SERM의 예는, 예를 들어, 타목시펜 (NOLVADEX™ 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (FARESTON®)을 포함한다.
효소 아로마타제의 억제자는 부신에서 에스트로겐 생산을 조절한다. 예는 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (MEGACE®), 엑스메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸 (RIVISOR®), 레트로졸 (FEMARA®), 및 아나스트로졸 (ARIMIDEX®)을 포함한다.
항안드로겐제의 예는 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프로드, 및 고세렐린을 포함한다.
화학치료제의 예는 항신생혈관제, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 레티노산 및 그 유도체, 2-메톡시에스트라디올, ANGIOSTATIN®, ENDOSTATIN®, 수라민, 스쿠알라민, 메탈로프로테이나제-1의 조직 억제자, 메탈로프로테이나제-2의 조직 억제자, 플라스미노겐 활성화제 억제자-1, 플라스미노겐 활성화제 억제자-2, 연골-유래 억제자, 파클리탁셀 (nab-파클리탁셀), 혈소판 인자 4, 프로타민 설페이트 (클루페인), 황산화 키틴질 유도체 (대게 껍질로부터 제조됨), 황산화 다당류 펩티도글리칸 복합체 (sp-pg), 스타우로스포린, 매트릭스 대사의 조절자, 예컨대 프롤린 유사체 ((1-아제티딘-2-카르복실산 (LACA)), 씨스하이드록시프롤린, d,I-3,4-데하이드로프롤린, 티아프롤린, α,α'-다이피리딜, 베타-아미노프로피오나이트릴 퓨마레이트, 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3h)-옥사졸론, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 헤파린, 인터페론, 2 마크로글로불린-혈청, 메탈로프로테이나제-3의 닭 억제자 (ChIMP-3), 키모스타틴, 베타-사이클로덱스트린 테트라데카설페이트, 에포네마이신, 푸마길린, 금 나트륨 티오말레이트, d-페니실라민, 베타-1-안티콜라게나제-혈청, 알파-2-안티플라스민, 비산트렌, 로벤자리트 이나트륨, n-2-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 이나트륨 또는 "CCA", 탈리도미드, 혈관형성 억제성 스테로이드, 카르복시 아미노이미다졸, 및 메탈로프로테이나제 억제자, 예컨대 BB-94를 포함한다. 그 밖의 항신생혈관제는 이들 혈관형성성 성장 인자에 대한 항체, 바람직하게는 단클론성 항체를 포함한다: 베타-FGF, 알파-FGF, FGF-5, VEGF 아이소폼, VEGF-C, HGF/SF, 및 Ang-1/Ang-2.
화학치료제의 예는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 화합물, 예컨대 베타-아미노프로프리오니트릴 (BAPN), 뿐만 아니라 리실 옥시다제의 억제자 및 콜라겐의 비정상적인 침착에 관련된 질환 및 병태의 치료에서 그것들의 사용에 관한 미국 특허 번호: 4,965,288 (Palfreyman, et al.) 및 다양한 생리학적 섬유증 상태의 치료를 위해 LOX를 억제하는 화합물에 관한 미국 특허 번호: 4,997,854 (Kagan et al.)에서 개시된 화합물을 포함하는 항섬유증제를 포함한다 (이것들은 본원에 참고로 포함된다). 추가의 예시적 억제자는 2-아이소부틸-3-플루오로-, 클로로-, 또는 브로모-알릴아민과 같은 화합물에 관한 미국 특허 번호: 4,943,593 (Palfreyman et al.), 미국 특허 번호: 5,021,456 (Palfreyman et al.), 5,059,714 (Palfreyman et al.), 5,120,764 (Mccarthy et al.), 5,182,297 (Palfreyman et al.), 2-(1-나프틸옥시메밀)-3-플루오로알릴아민에 관한 5,252,608 (Palfreyman et al.), 및 미국 공개 번호: 2004/0248871 (Farjanel et al.)에 기술되어 있다 (이것들은 본원에 참고로 포함된다).
예시적 항섬유증제는 또한 리실 옥시다제의 활성 부위의 카르보닐 기와 반응하는 1차 아민, 및 더 구체적으로는 카르보닐과 결합한 후, 다음 1차 아민과 같이, 공명에 의해 안정화된 생성물을 생산하는 것들을 포함한다: 에밀렌마민, 하이드라진, 페닐하이드라진, 및 그 유도체; 세미카르바지드 및 유레아 유도체; 아미노나이트릴, 예컨대 BAPN 또는 2-나이트로에틸아민; 불포화 또는 포화 할로아민, 예컨대 2-브로모-에틸아민, 2-클로로에틸아민, 2-트라이플루오로에틸아민, 3-브로모프로필아민 및 p-할로벤질아민; 및 셀레노호모시스테인 락톤.
그 밖의 항섬유증제는 세포에 침투하거나 또는 침투하지 않는 구리 킬레이트화제이다. 예시적 화합물은 리실 옥시다제에 의한 리실 및 하이드록시리실 잔기의 산화적 탈아미노화에서 기원하는 알데하이드 유도체를 차단하는 간접적 억제자를 포함한다. 예는 티올아민, 특히 D-페니실라민, 및 그 유사체, 예컨대 2-아미노-5-메르캅토-5-메틸헥산산, D-2-아미노-3-메틸-3-((2-아세트아미도에틸)디티오)부탄산, p-2-아미노-3-메틸-3-((2-아미노에틸)디티오)부탄산, 나트륨-4-((p-1-디메틸-2-아미노-2-카르복시에틸)디티오)부탄 설퍼레이트, 2-아세트아미도에틸-2-아세트아미도에탄티올 설파네이트, 및 나트륨-4-메르캅토부탄설피네이트 트라이하이드레이트를 포함한다.
화학치료제의 예는 또한 제한되는 것이 아니라 환자를 치료하는데 적합한 치료적 항체를 포함하는 면역치료제를 포함한다. 치료적 항체의 몇몇 예는 심투쥬맙, 아바고보맙, 아데카투무맙, 아푸투쥬맙, 알렘투쥬맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베바시쥬맙, 비바투쥬맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투쥬맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 시타투쥬맙, 식수투무맙, 클리바투쥬맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두시기투맙, 데투모맙, 다세투쥬맙, 달로투쥬맙, 에크로멕시맙, 엘로투쥬맙, 엔시툭시맙, 에르투막소맙, 에타라시쥬맙, 팔레투쥬맙, 피클라투쥬맙, 피기투무맙, 플라보투맙, 푸툭시맙, 가니투맙, 젬투쥬맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 임가투쥬맙, 인다툭시맙, 이노투쥬맙, 인테투무맙, 이필리무맙, 이라투무맙, 라베투쥬맙, 렉사투무맙, 린투쥬맙, 로르보투쥬맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투쥬맙, 밀라투쥬맙, 민레투모맙, 미투모맙, 목세투모맙, 나르나투맙, 납투모맙, 네시투무맙, 니모투쥬맙, 노페투모맙, 아카라투쥬맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오나르투쥬맙, 오포르투쥬맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 파르사투쥬맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페르투쥬맙, 핀투모맙, 프리투무맙, 라코타모맙, 라드레투맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 사투모맙, 시브로투쥬맙, 실툭시맙, 솔리토맙, 타카투쥬맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테프로투무맙, 티가투쥬맙, 토시투모맙, 트라스투쥬맙, 투코투쥬맙, 우블리툭시맙, 벨투쥬맙, 보르세투쥬맙, 보투무맙, 잘루투무맙, CC49, 및 3F8을 포함한다. 리툭시맙은 변연부(marginal-zone) 림프종, WM, CLL 및 소형 림프구성 림프종을 포함한 무통 B-세포 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 리툭시맙과 화학치료제의 조합이 특히 효과적이다.
예시된 치료적 항체는 인듐-111, 이트륨-90, 또는 요오드-131과 같은 방사성 동위원소 입자로 더 라벨링되거나 이것과 조합될 수도 있다.
한 구체예에서, 추가적인 치료제는 질소 머스타드 알킬화제이다. 질소 머스타드 알킬화제의 비제한적 예는 클로람부실을 포함한다.
한 구체예에서, 본원에서 기술된 화합물 및 조성물이 사용되거나 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합될 수도 있다. 하나 이상의 치료제는 Abl의 억제자, 활성화된 CDC 키나제 (ACK), 아데노신 A2B 수용체 (A2B), 아폽토시스(apoptosis) 신호-조절 키나제 (ASK), 오로아 키나제(Auroa kinase), 브루톤 타이로신 키나제 (Bruton's tyrosine kinase; BTK), BET-브로모도메인 (BRD), 예컨대 BRD4, c-Kit, c-Met, CDK-활성화 키나제 (CAK), 칼모듈린-의존적 단백질 키나제 (CaMK), 사이클린-의존적 키나제 (CDK), 카세인 키나제 (CK), 디스코이딘 도메인 수용체 (DDR), 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 병소 유착 키나제 (FAK), Flt-3, FYN, 글리코겐 신타제 키나제 (GSK), HCK, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), IKK, 예컨대 IKKβε, 아이소시트레이트 데하이드로게나제 (IDH), 예컨대 IDH1, 야누스 키나제 (Janus kinase; JAK), KDR, 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK), 리실 옥시다제 단백질, 리실 옥시다제-유사 단백질 (LOXL), LYN, 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), MEK, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK), NEK9, NPM-ALK, p38 키나제, 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 포스포릴라제 키나제 (PK), 폴로-유사 키나제 (polo-like kinase; PLK), 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K), 단백질 키나제 (PK), 예컨대 단백질 키나제 A, B, 및/또는 C, PYK, 비장 타이로신 키나제 (SYK), 세린/트레오닌 키나제 TPL2, 세린/트레오닌 키나제 STK, 신호 전달 및 전사 (STAT), SRC, 세린/트레오닌-단백질 키나제 (TBK), 예컨대 TBK1, TIE, 타이로신 키나제 (TK), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), YES, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
ASK 억제자는 ASK1 억제자를 포함한다. ASK1 억제자의 예는 WO 2011/008709 (Gilead Sciences) 및 WO 2013/112741 (Gilead Sciences)에서 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
BTK 억제자의 예는 이브루티닙, HM71224, ONO-4059, 및 CC-292를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
DDR 억제자는 DDR1 및/또는 DDR2의 억제자를 포함한다. DDR 억제자의 예는 WO 2014/047624 (Gilead Sciences), US 2009/0142345 (Takeda Pharmaceutical), US 2011/0287011 (Oncomed Pharmaceuticals), WO 2013/027802 (Chugai Pharmaceutical), 및 WO 2013/034933 (Imperial Innovations)에서 개시된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
HDAC 억제자의 예는 프라시노스타트 및 파노비노스타트를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다
JAK 억제자는 JAK1, JAK2, 및/또는 JAK3을 억제한다 JAK 억제자의 예는 필고티닙, 룩소리티닙, 페드라티닙, 토파시티닙, 바리시티닙, 레스타우르티닙, 파크리티닙, XL019, AZD1480, INCB039110, LY2784544, BMS911543, 및 NS018을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
LOXL 억제자는 LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4, 및/또는 LOXL5의 억제자를 포함한다. LOXL 억제자의 예는 WO 2009/017833에서 기술된 항체 (Arresto Biosciences)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
LOXL2 억제자의 예는 WO 2009/017833 (Arresto Biosciences), WO 2009/035791 (Arresto Biosciences), 및 WO 2011/097513 (Gilead Biologics)에서 기술된 항체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
MMP 억제자는 MMP1 내지 10의 억제자를 포함한다. MMP9 억제자의 예는 마리마스타트 (BB-2516), 시페마스타트 (Ro 32-3555), 및 WO 2012/027721에서 기술된 것들 (Gilead Biologics)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3K 억제자는 PI3Kγ, PI3Kδ, PI3Kβ, PI3Kα, 및/또는 pan-PI3K의 억제자를 포함한다. PI3K 억제자의 예는 워르트만닌, BKM120, CH5132799, XL756, 및 GDC-0980을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kγ 억제자의 예는 ZSTK474, AS252424, LY294002, 및 TG100115를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kδ 억제자의 예는 PI3K II, TGR-1202, AMG-319, GSK2269557, X-339, X-414, RP5090, KAR4141, XL499, OXY111A, IPI-145, IPI-443, 및 WO 2005/113556 (ICOS), WO 2013/052699 (Gilead Calistoga), WO 2013/116562 (Gilead Calistoga), WO 2014/100765 (Gilead Calistoga), WO 2014/100767 (Gilead Calistoga), 및 WO 2014/201409 (Gilead Sciences)에서 기술된 화합물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kβ 억제자의 예는 GSK2636771, BAY 10824391, 및 TGX221을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kα 억제자의 예는 부파를리십, BAY 80-6946, BYL719, PX-866, RG7604, MLN1117, WX-037, AEZA-129, 및 PA799를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
pan-PI3K 억제자의 예는 LY294002, BEZ235, XL147 (SAR245408), 및 GDC-0941을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
SYK 억제자의 예는 타마티닙 (R406), 포스타마티닙 (R788), PRT062607, BAY-61-3606, NVP-QAB 205 AA, R112, R343, 및 미국 특허 번호 8,450,321 (Gilead Connecticut)에서 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
TKI는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 수용체를 표적화할 수 있다. EGFR을 표적화하는 TKI의 예는 제피티닙 및 에를로티닙을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 수니티닙은 FGF, PDGF, 및 VEGF에 대한 수용체를 표적화하는 TKI의 비-제한적 예이다.
면역 체크포인트 억제자와의 조합
본 명세서의 항-CD73 항체는, 일부 구체예에서는, 면역 체크포인트 억제자와 함께 사용될 수 있다. 면역 체크포인트는 신호 (동시-자극 분자)를 올리거나 신호를 낮추는 면역 시스템의 분자이다. 많은 암은 T 세포 신호를 억제함으로써 스스로를 면역 시스템으로부터 보호한다. 면역 체크포인트 억제자는 세포에 의한 이러한 보호적 메커니즘을 중단시키는 것을 도울 수 있다. 면역 체크포인트 억제자는 다음 체크포인트 분자, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3 (CD223으로도 알려져 있음), CD28, CD122, 4-1BB (CD137로도 알려져 있음), 또는 BTLA (CD272로도 알려져 있음) 중 임의의 하나 이상을 표적화할 수도 있다.
예정된 T 세포 사멸 1 (PD-1)은 T 세포의 표면 상에서 발견되는 막관통 단백질이이며, 종양 세포 상의 예정된 T 세포 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합될 때, T 세포 활성의 억제 및 T 세포-매개된 세포독성의 감소를 초래한다. 따라서, PD-1 및 PD-L1은 면역 하향-조절자이거나 또는 면역 체크포인트 "오프 스위치(off switch)"이다. PD-1 억제자의 예는, 제한되는 것이 아니라, 니볼루맙, (Opdivo) (BMS-936558), 펨브롤리쥬맙 (Keytruda), 피딜리쥬맙, AMP-224, MEDI0680 (AMP-514), PDR001, MPDL3280A, MEDI4736, BMS-936559 및 MSB0010718C를 포함한다.
분화 클러스터 274 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1)로도 알려져 있는 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1)은 인간에서 CD274 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. PD-L1 억제자의 비-제한적 예는 아테졸리쥬맙 (Tecentriq), 두르발루맙 (MEDI4736), 아벨루맙 (MSB0010718C), MPDL3280A, BMS935559 (MDX-1105) 및 AMP-224를 포함한다.
CTLA-4는 면역 시스템을 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA-4 억제자의 비-제한적 예는 이필리무맙 (Yervoy) (BMS-734016, MDX-010, MDX-101로도 알려져 있음) 및 트레멜리무맙 (예전에는 티실리무맙, CP-675,206)을 포함한다.
림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3)는 세포 표면상의 면역 체크포인트 수용체이고 Tregs에 대한 작용 뿐만 아니라 CD8+ T 세포에 대한 직접적인 효과에 의해 면역 반응을 억제하는 작용을 한다. LAG-3 억제자는, 제한되는 것이 아니라, LAG525 및 BMS-986016을 포함한다.
CD28은 거의 모든 인간 CD4+ T 세포 및 모든 CD8 T 세포의 대략 절반에서 구성적으로 발현되고 T 세포 확장을 유도한다. CD28 억제자의 비-제한적 예는 TGN1412를 포함한다.
CD122는 CD8+ 효과기 T 세포의 증식을 증가시킨다. 비-제한적 예는 NKTR-214를 포함한다.
4-1BB (CD137로도 알려져 있음)는 T-세포 증식에 수반된다. CD137-매개된 신호는 또한 활성화-유도된 세포 사멸로부터 T 세포, 및 특히, CD8+ T 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. PF-05082566, 유렐루맙 (BMS-663513) 및 리포칼린은 CD137 억제자의 예이다.
상기 조합 처리 중 어느 것에 대해서도 항-CD73 항체는 다른 항암제와 동시에 또는 별도로 투여될 수 있다. 별도로 투여될 때, 항-CD73 항체는 다른 항암제 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다.
진단 방법
CD73의 과발현은 특정 종양 샘플에서 관찰되고, CD73-과발현 세포를 가진 환자는 본 명세서의 항-CD73 항체로의 처리에 반응성일 가능성이 크다. 따라서, 본 명세서의 항체는 또한 진단적 및 예후적 목적으로 사용될 수 있다.
바람직하게는 세포를 포함하는 샘플은 환자로부터 얻어질 수 있으며, 상기 환자는 암 환자 또는 진단을 요구하는 환자일 수 있다. 세포는 종양 조직 또는 종양 블록, 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 환자의 임의의 샘플의 세포이다. 샘플의 선택적 전처리시, 샘플은 항체가 샘플에 잠재적으로 존재하는 CH73 단백질과 상호작용하는 조건 하에서 본 명세서의 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 샘플에서 CD73 단백질의 존재를 검출하기 위해, 항-CD73 항체를 이용하는, ELISA와 같은 방법이 사용될 수 있다.
샘플에서 CD73 단백질의 존재 (선택적으로 양 또는 농도로)는 환자가 항체로의 처리에 적합하다는 지표로서, 또는 환자가 암 치료에 반응하였다는 (또는 반응하지 않았다는) 지표로서 암의 진단에 사용될 수 있다. 예후적 방법을 위해서, 검출은 치료의 진행을 나타내기 위해 암 치료의 시작시 특정 스테이지에서 1회, 2회 또는 그 이상 실행될 수 있다.
조성물
본 명세서는 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 항암제 (예로서, 면역 체크포인트 억제자)를 더 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 동물, 및 더 구체적으로는 인간에서의 사용에 대하여 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 그 밖의 일반적으로 인식되는 약전에 나열되어 있음을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로는 비-독성 고체, 반고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제제 보조물일 것이다.
용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클(vehicle)을 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 또는 오일일 수 있으며, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함한다. 물은 약학적 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 특히 주사용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수도 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크(talc), 나트륨 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 필요한 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 및 장성 조절을 위한 작용제, 예컨대 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로스가 또한 구상된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 바인더 및 담체, 예컨대 트라이글리세리드와 함께 좌제로서 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산 마그네슘, 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin에 기술되어 있으며, 본원에 참고로 포함된다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 맞춰야 한다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다회수 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 인간에게 정맥내 투여에 맞춰 조정된 약학적 조성물로서 일상적인 과정에 따라 제제화된다. 전형적으로는, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 버퍼 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분은 별도로 공급되거나 단위 투약 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 사세(sachette)와 같이 밀봉된 용기 내에 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여될 경우, 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유한 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 명세서의 화합물은 중성 또는 염 형태로서 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 음이온으로 형성된 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2 철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
실시예
실시예 1. 쥐 항체 101-Mu의 클로닝
이 실시예는 하이브리도마 기술을 사용하여 항-인간-CD73 마우스 단클론성 항체를 제조하는 공정을 기술한다. 인간 CD73 단백질을 CD73을 발현하는 재조합 CHOK1 세포주 (CD73-CHOK1)를 사용하여 제조하였다. 인간 CD73에 대한 마우스 단클론성 항체를 생성하기 위해, 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스를 먼저 1.5 Х 107 CD73-CHOK1 세포로 면역화하였다. 최초 면역화 후 제14 일 및 제33 일에, 면역화된 마우스를 1.5 Х 107 CD73- CHOK1 세포로 재면역화하였다. CD73 단백질에 결합하는 항체를 생산하는 마우스를 선택하기 위해서, 면역화된 마우스의 혈청을 ELISA로 테스트하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1 μg/ml, 100μl/웰의 인간 CD73 단백질로 실온 (RT)에서 밤새도록 코팅한 다음, 100μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 면역화된 마우스의 혈장의 희석액을 각 웰이 추가하였고 RT에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 ABTS 기질로 현상하고 OD 405nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 항-CD73 IgG의 충분한 역가를 가진 마우스를 면역화 후 제54 일에 50ug 인간 CD73-Fc 단백질로 부스팅하였다(boost). 결과로 생성된 마우스를 융합에 사용하였다. 하이브리도마 상층액을 ELISA로 항-CD73 IgG에 대하여 테스트하였다. 8개의 상이한 하이브리도마 클론을 확인하였으며, 그 중에서도 101-Mu를 추가의 분석을 위해 선택하였다. 101-MU의 VH 서열은 표 6에서 서열 번호: 10으로 나타나 있고, VL 서열은 표 7 및 서열 번호: 15에 나타나 있다. 상응하는 DNA 서열은 표 10에서 서열 번호: 57 및 58로 나타난다.
실시예 2. CD73으로의 101-Mu의 결합
이 실시예는, 단독으로 또는 세포 표면 상에서, 재조합 인간 CD73 단백질 (1 ug/ml@100 ul)로의 마우스 항-CD73 mAb 101-Mu의 ELISA 결합의 용량 반응을 테스트한다.
재조합 인간 CD73 단백질 (Novoprotein)을 PBS 중의 1 ug/ml로 실온 (RT)에서 2h 동안 미세역가 플레이트에 코팅하였다. 항원을 코팅한 후 웰을 RT에서 1h 동안 1% BSA를 함유한 PBS/0.05% Tween (PBST)으로 블로킹하였다. PBST로 웰을 세척한 후, 상이한 농도의 항-CD73 항체를 웰이 추가하였고 RT에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 결합 항체의 검출을 위해, 마우스 Fc에 대한 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 (Jackson Immuno Research)를 추가한 후 이어서, 형광원성 기질 (Roche)을 추가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에, 플레이트의 웰을 PBST로 3회 세척하였다. 형광 발광을 TECAN Spectrafluor 플레이트 판독기로 측정하였다.
인간 항-CD73, mAb1을 양성 대조군으로 사용하였다. mAb1을 US2016/0194407에 개시된 순서에 따라 생성하였다. 비교 결과는 도 1에서 제공되며, 101-Mu에 대한 EC50은 0.08 nM로 mAb1에 대한 EC50은 0.03 nM로 나타난다.
도 2는 표면 상에서 인간 CD73을 내인성으로 발현하는 인간 난소암 세포주 (SK-OV-3 세포)를 사용한 결합 검정의 결과를 나타낸다. 지시된 항체와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 상이한 농도의 IgG 대조군, 마우스 항-CD73 (101-Mu) 및 참조 항체 (mAb1)로 염색하였다. 그 다음에, 세포를 PBS로 3회 세척한 후 이어서, 4℃에서 30분 동안 APC-라벨링된 항-마우스 Fc 특이적 항체 (Invitrogen)와 함께 인큐베이션하였다. 결합을 FACSCanto (Becton-Dickinson)를 사용하여 측정하였다. 도 1과 유사하게, 이 도면은 101-Mu가 mAb1과 CD73에 대하여 동등한 결합 친화도를 가진다는 것을 나타낸다 (101-Mu에 대하여, EC50은 0.54 nM이었고; mAb1에 대하여, EC50은 0.30 nM이었다).
도 3은 재조합 인간 CD73과의 101-Mu 및 mAb1의 결합 역학을 플롯팅한다 (재조합 인간 CD73을 일련의 농도 (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM)를 가진 피분석물로서 설정하였다). 항원으로의 항체의 결합 역학 검정을 인간 항체 캡쳐 접근법을 통해 Biacore T200 시스템을 사용하여 수행하였다. 항-마우스 Fc IgG를 제조사의 지시에 따라 CM5 센서 칩 상에 고정하였다. 테스트 항체를 주사하였고 고정된 항-인간 Fc IgG로 캡쳐하였다. 그 다음에 일련의 농도의 항원을 개별적으로 주사하였고, 각 농도의 항원 피분석물에 대한 결합 프로파일을 기록하였다. 검정 시스템을 10 mM 글리신-HCl pH 1.5의 주사에 의해 30초 동안 재생시켰다. 러닝 버퍼는 HBS-EP+ (10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% P20)였다. 검정 온도는 25℃였고, 결합 및 해리 시간은 각각 180 및 600초였다. Biacore 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 1.0을 사용하여 1:1 결합 모델에 따라 조정하여 결합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수 뿐만 아니라 평형 상수 (KD)를 계산하였다. 도 3에 더하여, 몇몇 요약 데이터가 하기 표에서 제공된다.
Figure pat00006
실시예 3. 101-Mu에 의한 CD73 효소 활성의 억제
이 실시예는 101-Mu 항체가 CD73의 효소 활성을 억제하는 능력을 테스트한다.
재조합 인간 CD73 단백질 (0.3 ug/ml)을 상이한 용량의 항-CD73 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재 하에 96-웰 평평한 바닥 마이크로플레이트에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 ATP (100 uM) 및 AMP (100 uM)를 각 웰이 추가하였고 37℃에서 추가의 30분 동안 인큐베이션하였다. 루시퍼라제-함유 CellTiter-Glo (Promega)를 웰에 추가하였고 광 방출 억제를 광도계 (Molecular Device)로 측정하였다.
AMP의 초과량은 ATP-의존적 루시퍼라제 활성을 차단하는 것으로 알려져 있다. AMP에 촉매 작용하여 아데노신 및 무기 포스페이트를 생산하는 CD73의 추가는 루시퍼라제 활성 및 광 방출을 회복시킨다. 따라서, CD73의 효소 활성을 차단하는 항체는 광 방출을 감소시킬 수 있다. 효소 활성의 퍼센트를 하기 기술된 바와 같이 평가한다: 잔류 CD73 활성을 다음과 같이 계산하였다: (CD73+Ab+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(CD73+ATP+AMP)-(ATP+AMP)*100. 결과는 도 4에서 플롯팅되며, 이것은 음성 대조군 IgG와 달리, 101-Mu가 CD73 효소 활성을 용량 의존적으로 억제한다는 것을 나타낸다 (IC50 = 3.89 nM).
CD73을 발현하는 SK-OV-3 세포를 상이한 용량의 항-CD73 Ab 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재 하에 96-웰 플레이트에 웰 당 1 x 105개 세포로 평판배양하였다. 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. AMP (100 uM)를 각 웰에 추가하였고 37℃에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 새로운 96-웰 플레이트로 수거하였고 ATP를 최종 농도 100 uM로 추가하였다. CellTiter-Glo 시약 (Promega)을 1:1로 추가하였고 광 방출 광도계 (Molecular Device)를 측정함으로써 세포 CD73 효소 활성을 결정하였다. 효소 활성의 퍼센트를 하기 기술된 바와 같이 평가한다: 잔류 CD73 활성을 다음과 같이 계산하였다: (SK-OV-3 세포+Ab+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(SK-OV-3 세포+ATP+AMP)-(ATP+AMP)*100. 결과는 도 5에서 플롯팅되며, 이것은 음성 대조군 IgG와 달리, 101-Mu가 CD73 효소 활성을 용량 의존적으로 억제한다는 것을 나타낸다 (IC50 = 4.62 nM).
실시예 4. 101-Mu에 의한 AMP-매개된 CD4+ T 세포 억제의 반전
이 실시예는 항체가 AMP-매개된 CD4+ T 세포 억제를 반전시키는 능력을 테스트한다. 인간 CD4+ T 세포를 인간 CD4 마이크로비드 (Miltenyi Biotech)를 사용한 양성 선택에 의해 PBMC로부터 정제하였다. 단리된 CD4+ T 세포를 AMP (500 μM)의 존재 또는 부재 하에 사전 코팅된 항-CD3 항체 (2 μg/ml) 및 가용성 항-CD28 항체 (1 ug/ml)로 자극하였다. 항-CD73 항체 및 대조군 IgG의 단계 희석액을 각 웰에 추가하였고 72 hr 동안 배양한 다음 상층액을 ELISA로 IFN-γ에 대하여 분석하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 101-Mu는 CD4+ 세포의 IFN-γ 생산을 용량 의존적으로 증가시키는 한편, 대조군은 아무련 영향이 없었다.
실시예 5. 101-Mu의 인간화
상기 실시예는 101-Mu 항체가 CD73 효소 활성의 강력한 억제자이고 T 세포 활성화에 대한 아데노신의 면역억제 효과를 완전히 반전시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 항체를 인간화의 기초로서 선택하였다.
101-Mu 가변 영역 유전자를 이용하여 인간화 MAb를 생성하였다. 전체적으로 가장 잘 매칭되는 인간 생식세포 계열 Ig 유전자 서열을 확인하기 위해서 101-MU의 Rhe VH 및 VK를 이용 가능한 인간 Ig 유전자 서열의 데이터베이스와 비교하였다. 경쇄에 대하여, 가장 가까운 인간 매치는 A10/Jk4 (디자인 1) 및 L6/Jk4 (디자인 2) 유전자이고, 중쇄에 대하여 가장 가까운 인간 매치는 VH4-B/JH6 유전자였다. 인간화된 가변 도메인 서열을 디자인하였으며 101-MU 경쇄의 CDR1 (서열 번호:4), 2 (서열 번호:5) 및 3 (서열 번호:6)을 매칭된 경쇄 유전자의 프레임워크 서열로 이식하였고, 101-MU VH의 CDR1 (서열 번호:1), 2 (서열 번호:2), 및 3 (서열 번호:3) 서열을 매칭된 VH 유전자의 프레임워크 서열로 이식하였다.
그 다음에 마우스 아미노산을 인간 아미노산으로 대체하는 것이 결합 및/또는 CDR 입체구조에 영향을 줄 수 있는 임의의 프레임워크 위치가 존재하는지를 결정하기 위해 3D 모델을 생성하였다. 확인된 유용한 역돌연변이, 뿐만 아니라 이러한 돌연변이를 포함하는 펩타이드 서열은 하기 표에서 나타난다 (밑줄).
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
볼드체: CDR 영역; 밑줄: 역돌연변이
Figure pat00011
볼드체: CDR 영역; 밑줄: 역돌연변이
Figure pat00012
볼드체: CDR 영역; 밑줄: 역돌연변이
인간화 VH 및 VK 유전자를 합성에 의해 생산한 다음 각각 인간 감마 1 및 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 벡터로 클로닝하였다. 인간 VH 및 인간 VK의 쌍은 하기 표에서 나열된 바와 같이 많은 인간화 항체를 생성하였다.
Figure pat00013
표 10은 101-MU 및 Hu101-28 항체의 VH 및 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 몇몇 예를 나타낸다.
Figure pat00014
실시예 6. 인간화 항체의 테스트
이 테스트는 결합 친화도 및 억제 활성에 관하여 인간화 항체를 테스트하였다. 테스트 과정은 실시예 1-4에서 기술된 것과 유사하고, 결과는 도 7-11에서 제공된다.
결합 검정을 위해서, 인간 항체 캡쳐 접근법을 통해 Biacore T200 시스템을 사용하였다. 항-인간 Fc IgG를 제조사의 지시에 따라 CM5 센서 칩 상에 고정하였다. 테스트 항체를 주사하였고 고정된 항-인간 Fc IgG로 캡쳐하였다. 그 다음에 일련의 농도의 항원을 개별적으로 주사하였고, 각 농도의 항원 피분석물에 대한 결합 프로파일을 기록하였다. 검정 시스템을 10 mM 글리신-HCl pH 1.5의 주사에 의해 30초 동안 재생시켰다. 러닝 버퍼는 HBS-EP+ (10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% P20)였다. 검정 온도는 25℃였고, 결합 및 해리 시간은 각각 180 및 600초였다. Biacore 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 1.0을 사용하여 1:1 결합 모델에 따라 조정하여 결합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수 뿐만 아니라 평형 상수 (KD)를 계산하였다.
테스트된 모든 항체 중에서도, Hu101-25 및 Hu101-28이 가장 높은 결합 친화도를 나타냈고 (도 7 및 하기 표 참조) 후속 분석에 사용하였다.
Figure pat00015
표면 상에서 인간 CD73을 내인성으로 발현하는 인간 난소암 세포주 (SK-OV-3 세포)를 상이한 농도의 IgG 대조군, 키메라 항-CD73 (101-Mu-키메라, 또는 101-Chi) 및 인간화 항-CD73 항체 (Hu101-25 및 Hu101-28)로 ℃에서 30분 동안 염색하였다. 그 다음에, 세포를 PBS로 3회 세척한 후 이어서, APC-라벨링된 항-인간 Fc 특이적 항체 (Invitrogen)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 결합을 FACSCanto (Becton-Dickinson)를 사용하여 측정하였고, 그 결과는 도 8에서 제공된다 (하기 표 참조).
Figure pat00016
재조합 인간 CD73 단백질 (0.3 ug/ml)을 상이한 용량의 항-CD73 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재 하에 96-웰 평평한 바닥 마이크로플레이트에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 ATP (100 uM) 및 AMP (100 uM)를 각 웰에 추가하였고 37℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 루시퍼라제-함유 CellTiter-Glo (Promega)를 웰에 추가하였고 광도계 (Molecular Device)로 광 방출 억제를 측정하였다. AMP의 초과량은 ATP-의존적 루시퍼라제 활성을 차단하는 것으로 알려져 있다. AMP에 촉매 작용하여 아데노신 및 무기 포스페이트를 생산하는 CD73의 추가는 루시퍼라제 활성 및 광 방출을 회복시킨다. 따라서, CD73의 효소 활성을 차단하는 항체는 광 방출을 감소시킬 것이다. 효소 활성의 퍼센트를 하기 기술된 바와 같이 평가한다: 잔류 CD73 활성: (CD73+Ab+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(CD73+ATP+AMP)-(ATP+AMP)*100.
도 9는 테스트된 세 개의 항체 모두가 강력한 억제 활성을 나타냈다는 것을 보여준다 (하기 표 참조).
Figure pat00017
도 10은 인간화 항체에 의한 CD73 효소 활성의 억제의 테스트 결과를 나타낸다. CD73을 발현하는 SK-OV-3 세포를 상이한 농도의 항-CD73 Ab 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재 하에 웰 당 1 x 10^5 세포로 96-웰 플레이트에 평판배양하였다. 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. AMP (100 uM)를 각 웰에 추가하였고 37℃에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 새로운 96-웰 플레이트로 수거하였고 ATP를 최종 농도 100 uM로 추가하였다. CellTiter-Glo 시약 (Promega)을 1:1로 추가하였고 광 방출 광도계 (Molecular Device)를 측정함으로써 세포 CD73 효소 활성을 결정하였다. 효소 활성의 퍼센트를 하기 기술된 바와 같이 평가한다: 잔류 CD73 활성: (SK-OV-3 세포+Ab+ATP+AMP)-(ATP+AMP)/(SK-OV-3 세포+ATP+AMP)-(ATP+AMP)*100. 결과는 도 10 및 하기 표에서 나타나며, 이들 항체에 의한 강력한 억제 효과를 입증한다.
Figure pat00018
항체가 AMP-매개된 CD4+ T 세포 억제를 반전시키는 능력을 테스트하기 위해서, 인간 CD4+ T 세포를 인간 CD4 마이크로비드 (Miltenyi Biotech)를 사용한 양성 선택에 의해 PBMC로부터 정제하였다. 단리된 CD4+ T 세포를 AMP (500 μM)의 존재 또는 부재 하에 사전 코팅된 항-CD3 항체 (2 μg/ml) 및 가용성 항-CD28 항체 (1 ug/ml)로 자극하였다. 항-CD73 항체 및 대조군 IgG의 단계 희석액을 각 웰에 추가하였고 72 hr 동안 배양한 다음 상층액을 ELISA로 IFN-γ에 대하여 분석하였다. 도 11에서 나타난 바와 같이, 테스트된 세 개의 항체 모두 CD4+ 세포의 AMP-매개된 억제를 용량 의존적으로 반전시켰다.
실시예 7. 인간화 항체의 추가의 변화 및 최적화의 컴퓨터 시뮬레이션
CDR 영역 또는 프레임워크 영역 내 특정 아미노산 잔기가 항체의 활성 및/또는 안정성을 더 개선하거나 보유하도록 변화될 수 있다는 것을 고려하였다. 변종을 그것들의 구조적, 입체구조적 및 기능적 성질에 관하여 컴퓨터 도구 (VectorNTI, www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/에서 이용 가능함)로 테스트하였고, 조짐을 보이는 것들 (CDR 영역 내에서)을 하기 표에서 나열한다.
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
밑줄: 핫스팟 돌연변이 잔기 및 그것들의 대체물
실시예 8. Hu101-28은 이중-메커니즘 항-CD73 항체이다.
이 실시예는 Hu101-28이 이중 작용 메커니즘을 가진다는 것을 나타낸다. 그것은 비-경쟁적 방식으로 CD73의 효소 활성을 차단할 뿐만 아니라 세포 표면 CD73의 내재화를 유도한다.
CD73 단백질의 결합을 가용성 세포 표면 CD73으로 테스트하였고, 그 결과는 도 12에서 나타난다. 왼쪽 패널에서, 재조합 인간 CD73 (2 μg/ml)을 함유하는 용액 100 μl를 ELISA 결합 검정에 사용하였고, 차트는 상기 Hu101-28을 나타낸다. 오른쪽 패널에서, 인간 난소 암종 세포주 (SK-OV-3)를 상이한 농도의 Hu101-28로 염색하였고 유동 세포분석법에 의해 표면 결합에 대하여 분석하였다. 나타난 바와 같이, 테스트의 EC50은 각각 88.7 pM 및 0.67 nM이었으며, 항체의 높은 친화도를 강조한다.
그 다음에, CD73 활성을 차단하는 Hu101-28의 능력. 재조합 인간 CD73 (0.3 mg/ml)을 Hu101-28과 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 ATP (100 mM) 및 AMP (100 mM)를 추가로 30분 동안 추가하였다. CellTiter-Glo (Promega)를 추가하였고 광 방출 억제를 광도계로 측정하였다. 도 13, 왼쪽 패널에서 나타난 바와 같이, 용액의 IC50은 2.84 nM이었다. 세포-발견된 CD73에 관하여, SK-OV-3 또는 MDA-MB-231 세포 (1 x 10^5 세포)를 Hu101-28과 함께 15분 동안 인큐베이션한 후 이어서, AMP (100 mM) 및 ATP (100 mM)를 순차적으로 추가하고 1 hr 동안 추가로 인큐베이션하였다. CellTiter-Glo (Promega)를 추가하고 광 방출 억제를 광도계로 측정하였다. 도 13, 오른쪽 패널에서 나타난 바와 같이, IC50은 SK-OV-3 및 MDA-MB-231에 대하여 각각 2.52 nM 및 8.21 nM이었다.
추가의 실험은 Hu101-28이 활성 부위에 결합하는 AMP 기질과 경쟁하는 것이 아니라 알로스테릭하게 또는 다수의 내인성 AMP 기질과 경쟁할 필요성을 회피한다는 측면에서 더 바람직한 그 밖의 비-경쟁적 메커니즘을 통해 작용한다는 것을 나타냈다. 도 14에서 나타난 바와 같이, AMP 기질 농도의 증가는 Hu101-28에 의한 가수분해의 억제를 방지하지 않으며, Hu101-28이 비-경쟁적 억제자로서 작용한다는 것을 나타낸다. 그에 반해, ADP의 억제 활성은 활성 부위에 결합하는 ADP보다 우세하도록 기질의 농도를 증가시킴으로써 극복될 수 있다.
도 15에서 놀라운 예상치 못한 발견이 나타난다. 유동 세포분석법에 의한 세포 표면 CD73 수준 또는 독소-컨쥬게이션된 2차 항체의 존재 하에 Hu309 결합 후 MDA-MB-231 세포 생존률을 측정함으로써 Hu101-28 결합시 CD73의 내재화를 입증하였다. 세포 표면 CD73 수준을 변화시키지 않은 IgG와 비교하여, Hu101-28은 6시간 내에 세포 표면 CD73 수준의 절반 초과를 감소시켰고 (왼쪽 패널), 및 훨씬 더 많은 세포를 죽이는 (오른쪽 패널) 결과를 초래하였다.
그러므로, 상기 실험은 Hu101-28이 이중 작용 메커니즘 (MoA)을 가진다는 것을 입증한다: 비-경쟁적 방식으로 CD73의 효소 활성의 차단 및 세포 표면 CD73의 내재화의 유도.
실시예 9. Hu101-28은 AMP 또는 CD4 + 및 CD8 + T 세포 반응의 종양 세포-매개된 억제를 완전히 반전시킨다.
이 실시예는 Hu101-28이 AMP 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 종양 세포-매개된 억제를 완전히 반전시킨다는 것을 나타낸다.
인간 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 CFSE로 라벨링하였고 AMP의 존재 또는 부재 하에 항-CD3/CD28 항체로 자극하였다. Hu101-28을 72 hr 동안 배양물에 추가하였다. 배양 상층액을 ELISA로 IFN-γ의 생산에 대해 분석하였다. 도 16, 왼쪽 패널에서, Hu101-28은 CD4+ 세포에서 IFN-감마의 생산을 용량 의존적으로 증가시켰다. 유사하게는, 오른쪽 패널에서 나타난 바와 같이, Hu101-28은 CD8+ 세포에서 IFN-감마의 생산을 용량 의존적으로 증가시켰다.
T 세포 반응의 종양 세포-매개된 억제에 대한 Hu101-28의 영향을 테스트하기 위해, CD73을 발현하는 SK-OV-3 세포를 미토마이신 C로 처리하였고 항-CD3/CD28 항체의 존재 하에 정제된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포와 동시-배양하였다. Hu101-28을 72 hr 동안 배양물에 추가하였고 상층액을 ELISA로 IFN-감마의 생산에 대하여 분석하였다. 도 17, 왼쪽 패널에서 나타난 바와 같이, Hu101-28은 CD4+ 세포에서 IFN-감마의 생산을 용량 의존적으로 증가시켰다. 유사하게는, 오른쪽 패널에서 나타난 바와 같이, Hu101-28은 CD8+ 세포에서 IFN-감마의 생산을 용량 의존적으로 증가시켰다.
실시예 10. Hu101-28은 종양 성장을 억제한다.
이 실시예는 Hu101-28이 종양-유래된 CD73 활성의 억제에 효과적이며, 단일- 또는 조합-처리에 의한 종양 성장의 억제를 유도한다는 것을 입증한다.
생체 내 CD73 효소 활성을 A375 제노그래프 모델의 종양에서 효소 조직화학법으로 측정하였고 염색 결과는 도 18에서 나타난다. 갈색은 활성 CD73의 존재를 나타내는 반면, 갈색의 결핍은 CD73 효소 활성이 항체에 의해 억제되었다는 것을 나타낸다. Hu101-28 또는 IgG 대조군-처리된 A375 이종 이식 모델의 종양을 획득하였고 결과는 종양 절편에서의 CD73 활성이 IgG 대조군과 비교하여 Hu101-28 처리에 의해 유의하게 감소되었다는 것을 나타냈다.
Hu101-28의 단일요법 효험을 또한 종양 이종이식 모델에서 평가하였다. A375 흑색종 세포 및 인간 PBMC를 NSG 면역결핍 마우스로 이식하였다. 이식 날에, 상이한 용량의 Hu101-28 또는 IgG 대조군을 종양-함유 마우스에 복강내 주사로 격일마다 1회 투여하였다. 도 19에서 나타난 바와 같이, Hu101-28은 종양 성장을 용량 의존적으로 및 지속적으로 억제하였다.
Hu101-28 및 항-PD-L1 항체의 조합 효과를 평가하였다. HCC827 세포를 NSG 마우스로 이식하였다. 종양 부피가 100-150mm3에 도달했을 때, 신선하게 단리된 인간 PBMC를 꼬리 정맥 주사로 종양-함유 마우스에 투여하였고 그 이후에 PBMC 이식일에 시작하여 격일마다 표시된 용량으로 IgG 대조군, PD-L1 항체 단독, Hu101-28 단독 및 PD-L1 항체 플러스 Hu101-28을 처리하였다. 도 20은 Hu101-28 및 항-PD-L1 항체 간의 시너지 효과를 나타낸다.
실시예 11. Hu101-28은 Cyno CD73과 교차 반응한다.
이 실시예는 인간화 항체 Hu101-28이 cyno CD73과 교차 반응하고 시험적 전임상 연구에서 허용 가능한 PK 및 안전성 프로파일을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 21은 Hu101-28의 결합 및 Hu101-28에 의한 cyno CD73 활성의 억제를 나타낸다. Hu101-28은 시험관 내 생화학적 검정을 통해 인간 CD73와 비교하여 결합 및 cyno CD73 활성의 억제에 있어서 비슷한 효능을 나타내는 한편 Hu101-28은 설치류 CD73에 결합하지 않는다. 이 결과는 Hu101-28의 독성, PK 및 TK를 평가하기 위한 비-임상적 연구 모델에서 cyno 원숭이의 사용을 지지한다.
실시예 12. Hu101-28은 CD73에 대한 C-말단 도메인에 결합한다.
이 실시예는 인간화 항체, Hu101-28 중 하나가 N-말단 도메인에 결합하는 공지된 항-CD-73 항체와는 다른 CD73 단백질의 C-말단 도메인에 결합한다는 것을 나타낸다.
CD73 항체의 에피토프 결합을 경쟁적 ELISA로 평가하였다. CD73 ECD 단백질 및 Hu101-28을 사전 인큐베이션한 다음 스트렙타비딘-HRP 항체에 의해 검출되는 비오티닐화된 MEDI-9447 (Medimmune)과 함께 추가하였다. 결과는 비오티닐화된 R9447의 추가가 Hu101-28의 결합과 정쟁하지 않으며 두 항체 모두 비-중첩 에피토프 빈(bin)에 위치한다는 것을 나타냈다 (도 22). 대조군으로서, 비오티닐화된 MEDI-9447의 추가는 자체 결합에 대하여 경쟁할 수 있다.
Hu101-28의 에피토프를 확인하기 위해서, 단일 아미노산-돌연변이된 CD73 변종의 클론의 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리에서 각각의 변종으로의 Hu101-28 Fab의 결합을 고산출량 유동 세포분석법으로 2배수로 결정하였다. 각각의 CD73 변종에 대하여, 평균 결합 값을 차트 상에서 CD73 발현 (대조군 반응성으로 표현됨)의 함수로서 플롯팅하였고 임계 잔류물을 차트로부터 확인하였다. CD73 Fab 결합에 대한 임계 잔류물 (빨간색으로 요약됨)을 돌연변이가 테스트 Fab 결합에 대하여 음성이지만, 대조군 MAb에 대해서는 양성인 것으로 확인하였다. 평균 결합 반응성 (및 범위)를 스크리닝에서 확인된 임계 잔류물에 대하여 나열하였고, 도 23에서 나타낸다. Hu309는 Y345, D399, E400, R401 및 R480의 에피토프에서 CD73의 C-말단에 결합하는 한편 (도 24에서 볼 수 있음, 왼쪽 상단 패널) MEDI-9447은 N-말단에 결합한다 (도 24의 비교 참조).
Hu101-28의 독특한 결합 성질이 공지된 항체와 비교하여 우수한 CD73 억제 프로파일을 유발한다는 것을 고려하였다. 이것은 도 25에서 입증되었다. 상단 비교는 Hu101-28이 "후크 현상(hook effect)" 없이 CH73 활성의 완전한 억제를 나타내는 한편 MEDI-9447은 고용량에서 유의한 "후크 현상"을 입증하였다는 것을 보여준다. 하단 비교 패널에서, Hu101-28 Fab는 CD73 활성 억제에 있어서 전체 IgG과 비슷한 효능을 나타내는 한편 MEDI-9447 Fab는 가용성 CD73을 억제하지 않았다.
이는 CD73 억제가 전체 MEDI-9447 항체 상의 두 결합 부위 모두의 결합을 필요로 하는 한편 Hu101-28에 의한 1가 결합이 충분하다는 것을 시사한다. MEDI-9447은 두 개의 상이한 CD73 다이머에 결합하여 억제 활성을 나타내고 Hu101-28은 이러한 요건을 갖지 않는다고 가정하였다. 이 가정을 테스트하기 위해서, Hu101-28의 억제 효과를 상이한 수준으로 CD73을 발현하는 세포로 테스트하였다. 도 26에서 나타난 바와 같이, Hu101-28은, CD73 분자가 서로 멀리 떨어져 있을 가능성이 큰 경우 낮은 발현을 가진 것들을 포함하는, 표면 상에서 상이한 수준의 CH73을 발현하는 세포 상에서 CD73 활성의 완전한 억제에 도달할 수 있었다.
* * *
본 명세서는 기술된 구체적인 구체예에 의해 범위가 제한되는 것이 아니며 이것은 본 명세서의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도되고, 기능적으로 동등한 어떠한 조성물 또는 방법도 본 명세서의 범위 내에 있다. 본 명세서의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 명세서는 본 개시물의 변형 및 변화를 커버하도록 의도되며 단 그것들은 첨부된 청구범위 및 그 등가물의 범위 내에 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것과 같은 정도로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> I-MAB <120> ANTI-CD73 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 54LW-250265-WO2 <140> PCT/CN2018/073746 <141> 2018-01-23 <150> PCT/CN2017/072445 <151> 2017-01-24 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Asn Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Asp Tyr Asp Ala Tyr Tyr Glu Ala Leu Asp Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Arg Ala Ser Ser Arg Val Asn Tyr Met His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 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caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc acgtgtaaat tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttctgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa ttagcagagt agagactgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 318 <210> 59 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 gaggtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctgagac tctgtctctc 60 acctgcgctg tctctggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 cctccaggaa agaagctgga atggatgggc tacatcaact acggcggtag caatggctac 180 aacccatctc tcaaaagtcg gatcaccatc tctagggaca catctaagaa ccagttttcc 240 ctgaagctga gttctgtgac tgctgccgac acagctgtgt attactgtgc aagagactat 300 gatgcttact acgaagctct ggacgactgg ggtcaaggaa ccacagtcac cgtctcctca 360 <210> 60 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 gaaattgttc tctcccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccaca 60 ctgtcttgca gggccagctc acgtgtaaat tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 cagtccccca gaccctggat ttctgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac actctcacaa ttagcagcct ggagccagaa 240 gatttcgccg tgtattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 61 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu 20 25 30 His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser 35 40 45 Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu 50 55 60 Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu 65 70 75 80 Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr 85 90 95 Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala 100 105 110 Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile 115 120 125 Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile 130 135 140 Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro 145 150 155 160 Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr 165 170 175 Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val 180 185 190 Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys 195 200 205 Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu 210 215 220 Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val 225 230 235 240 Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys 245 250 255 Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly 260 265 270 Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly 275 280 285 Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His 290 295 300 Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile 305 310 315 320 Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr 325 330 335 Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser 340 345 350 Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met 355 360 365 Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val 370 375 380 Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu 385 390 395 400 Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro 405 410 415 Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys 420 425 430 Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu 435 440 445 Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys 450 455 460 Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg 465 470 475 480 Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile 485 490 495 Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys 500 505 510 Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val 515 520 525 Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly 530 535 540 Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu 545 550 555 560 Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln 565 570

Claims (50)

  1. 단리된 항체 또는 이것의 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 단편은 인간 CD73 단백질에 대한 특이성을 갖고 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것의 단편.
  2. 제1 항에 있어서, 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  3. 제1 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  4. 제1 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  5. 제4 항에 있어서, 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  7. 제6 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  8. 제6 항에 있어서, 카바트 넘버링에 따라:
    (a) 위치 30에서 Thr,
    (b) 위치 44에서 Lys,
    (c) 위치 48에서 Met,
    (d) 위치 67에서 Ile, 및
    (e) 위치 71에서 Arg 및 이것들의 조합
    으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  9. 제6 항에 있어서, 카바트 넘버링에 따라,
    (a) 위치 5에서 Ser,
    (b) 위치 46에서 Pro,
    (c) 위치 47에서 Trp,
    (d) 위치 49에서 Ser,
    (e) 위치 70에서 Ser, 및
    (f) 위치 71에서 Tyr, 및 이것들의 조합
    으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 7 및 9-13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 7 및 9-13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  11. 제1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 7 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 8, 15-20 및 22-24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8, 15-20 및 22-24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  13. 제1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  14. 단리된 항체 또는 이것의 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 단편은 인간 CD73 단백질에 대하여 특이성을 갖고 인간 CD73 단백질의 C-말단 절반으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는, 단리된 항체 또는 이것의 단편.
  15. 제14 항에 있어서, 인간 CD73 단백질의 C-말단 도메인 중 하나 이상에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  16. 제14 항에 있어서, 인간 CD73 단백질의 Y345, D399, E400, R401 및 R480로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  17. 제16 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 중 적어도 두 개에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  18. 제16 항에 있어서, Y345, D399, E400, R401 및 R480 각각에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  19. 제14 항에 있어서, 인간 CD73 단백질에 결합하는 VH 및 VL의 단 하나의 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  20. 제19 항에 있어서, 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  21. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  22. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 세포.
  23. 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제23 항에 있어서, 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 내막암, 식도암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 및 갑상선암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23 항에 있어서, 암은 고체 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23 항에 있어서, 환자에게 2차 암 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26 항에 있어서, 2차 암 치료제는 면역 체크포인트 억제자인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27 항에 있어서, 억제자는 예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4 (CTLA-4), 림프구-활성화 단백질 3 (LAG-3), 또는 이것들의 조합의 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28 항에 있어서, 억제자는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29 항에 있어서, 억제자는 펨브롤리쥬맙, 니볼루맙, J43, RMP1-14, 아테졸리쥬맙, 이필리무맙, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 시험관 내에서, T 세포를 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편으로 처리하는 단계; 및
    (b) 처리된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31 항에 있어서, 단계 (a) 전에, 개체로부터 T 세포를 단리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32 항에 있어서, T 세포는 환자로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32 항에 있어서, T 세포는 환자와 다른 공여체 개체로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제31 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 종양-침윤성 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 샘플에서 CD73의 발현을 검출하는 방법으로서, 항체 또는 이것의 단편이 CD73에 결합하는 조건 하에서 샘플을 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편과 접촉시키는 단계, 및 샘플에서 CD73의 발현을 나타내는 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 항-CD73 요법으로 처리에 적합한 암 환자를 확인하는 방법으로서, 암 환자로부터 세포를 단리하는 단계 및 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편으로 CD73 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 단리된 항체 또는 이것의 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 단편은 인간 CD73 단백질에 대하여 특이성을 가지고
    (a) 서열 번호: 1의 VH CDR1, 또는 서열 번호: 1의 위치 1, 2 또는 3에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변종;
    (b) 서열 번호: 2의 VH CDR2, 또는 서열 번호: 2의 위치 6, 7 또는 8에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 2의 변종;
    (c) 서열 번호: 3의 VH CDR3, 또는 서열 번호: 3의 위치 7 또는 8에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 3의 변종;
    (d) 서열 번호: 4의 VL CDR1, 또는 서열 번호: 4의 위치 3 또는 4에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변종;
    (e) 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및
    (f) 서열 번호: 6의 VL CDR3, 또는 서열 번호: 6의 위치 1, 2, 3 또는 4에서 단일 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 6의 변종
    을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것의 단편.
  39. 제38 항에 있어서, 서열 번호: 1의 변종은 서열 번호: 26-29로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  40. 제38 항에 있어서, 서열 번호: 2의 변종은 서열 번호: 30-36으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  41. 제38 항에 있어서, 서열 번호: 3의 변종은 서열 번호: 37-41로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  42. 제38 항에 있어서, 서열 번호: 4의 변종은 서열 번호: 42-45로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  43. 제38 항에 있어서, 서열 번호: 6의 변종은 서열 번호: 46-56으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  44. 제38 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  45. 제44 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  46. 제44 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  47. 제46 항에 있어서, 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  48. 제38 항 내지 제47 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  49. 제38 항 내지 제48 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  50. 제38 항 내지 제48 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 세포.
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