JP2018503365A - 抗ｐｄ−１抗体およびその使用方法 - Google Patents

抗ｐｄ−１抗体およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合するアンタゴナイズ抗体およびそれを使用する方法を提供する。抗ＰＤ−１抗体は、がんおよび他の疾患を治療するために単独で、または他の治療剤と組み合わせて治療的に使用することができる。

Description

本発明は、ＰＤ−１に結合する抗体、例えば、全長抗体に関する。本発明はさらに、ＰＤ−１に対する抗体を含む組成物、および医薬として抗ＰＤ−１抗体を使用する方法に関する。ある特定の実施形態は、がんなどの過剰増殖性疾患を含めた様々な疾患を治療、予防、および／または診断するために抗ＰＤ−１抗体を使用する方法に関する。
ＰＤ−１は、活性化誘導アポトーシスを受けているＴ細胞株内で最初に同定された５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ上で発現される。ＰＤ−１のリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）である。
ＰＤ−１は、その細胞外領域内に単一ＩｇＶ様ドメインを含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１細胞質ドメインは、２つのチロシンを含有し、最も膜近位のチロシン（マウスＰＤ−１中のＶＡＹＥＥＬ）は、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ）内に位置している。ＰＤ−１上のＩＴＩＭの存在は、この分子が細胞質ホスファターゼの動員によって抗原受容体シグナル伝達を減弱させるように機能することを示す。ヒトおよびマウスＰＤ−１タンパク質は、４つの潜在的なＮ−グリコシル化部位の保存を伴った約６０％のアミノ酸同一性、およびＩｇ−Ｖドメインを確定する残基を共有する。細胞質領域内のＩＴＩＭおよびカルボキシ末端チロシンを囲繞するＩＴＩＭ様モチーフも、ヒトオルソログとマウスオルソログとの間で保存されている。
がん免疫療法は、細胞、および個別化された時間のかかる調製を使用する複雑な方法を伝統的に伴っている。最近、適応免疫系に送達される抑制シグナルの中断に基づくモノクローナル抗体ベースがん免疫療法が、既製の全身免疫療法の設定内で診療所において有望性を示した。しかし、がんのより安全でより有効な治療を得るための当技術分野における継続的な必要性が存在する。
ＰＤ−１と選択的に相互作用する抗体が提供される。ある特定の抗ＰＤ−１抗体は、がんを予防および／または治療するのにｉｎ ｖｉｖｏで有効であることが実証されている。有利には、本明細書に提供する抗ＰＤ−１抗体は、ヒト、カニクイザル、およびマウスＰＤ−１に結合する。また、有利には、本明細書に提供する抗ＰＤ−１抗体は、Ｔ細胞増殖を刺激するのにｉｎ ｖｉｖｏで有効である。
ＰＤ−１に特異的に結合し、ＰＤ−１の生物学的効果を防止または低減する単離アンタゴニスト抗体が本明細書に提供される。一部の実施形態では、アンタゴニスト抗体は、例えば、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり得る。本明細書に開示の発明は、ＰＤ−１に結合する抗体を対象とする。
一態様では、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合する単離アンタゴニスト抗体であって、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離アンタゴニスト抗体を提供する。
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３、４、５、もしくは６に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にない残基中に１つもしくはいくつかの保存的アミノ酸置換を有するバリアントを含み、かつ／あるいはＶＬ領域は、配列番号２、７、８、もしくは９に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１つもしくはいくつかのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３９に示した配列を含む軽鎖および／または配列番号２９もしくは３８に示した配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１１８３を有する発現ベクターによって産生されるＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１１８２を有する発現ベクターによって産生されるＶＬ領域を含む。
別の態様では、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合する単離抗体であって、配列番号１３、１４、または１５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１６、１７、２４、２５、２７、２８、３５、または３６のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１８、２３、２６、または３７に示したアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１０、２２、３０、または３２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１、２０、または３３に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１２、２１、３１、または３４に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、単離抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４Δｂ Ｓ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４Δｃ Ｓ２２８Ｐサブクラスのものである。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプのものであり、安定化されたヒンジ、例えば、Ｓ２２８Ｐを含む。
別の態様では、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合し、かつ本明細書に記載の抗体と同じＰＤ−１エピトープと競合し、かつ／またはそれに結合する単離抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に提供する抗ＰＤ−１抗体は、Ｔ細胞からのＩＦＮγおよび／またはＴＮＦ分泌を促進する。
一部の実施形態では、本明細書に提供する抗ＰＤ−１抗体は、Ｔ細胞の増殖を促進する。
一部の実施形態では、本明細書に提供する抗ＰＤ−１抗体は、腫瘍増殖を阻害する。
一部の実施形態では、本明細書に提供する抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１およびマウスＰＤ−１に結合する。
別の態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載のＰＤ−１抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＰＤ−１抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＰＤ−１抗体を組換え産生する単離宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で本明細書に記載の抗体を組換え産生する細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で、配列番号２９または３８に示したアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする核酸を含む細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、重鎖および軽鎖は、別個のベクター上でコードされる。他の実施形態では、重鎖および軽鎖は、同じベクター上でコードされる。
別の態様では、本発明は、対象における状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、状態は、がんである。一部の実施形態では、がんは、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、リンパ腫、白血病、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、絨毛癌、大腸がん、口腔がん、皮膚がん、および黒色腫からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平細胞頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣癌、肉腫、または再発もしくは難治性古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）を有する以前に治療された成人患者である。一部の実施形態では、がんは、白金耐性および／または白金難治性がん、例えば、白金耐性および／もしくは難治性卵巣がん、白金耐性および／もしくは／難治性乳がん、または白金耐性および／もしくは難治性肺がんなどであり得る。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、７、１４、２１、または２８日毎に１回投与される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、静脈内または皮下に投与される。
別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞の転移を阻害または防止する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ＰＤ−１発現腫瘍を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書の抗体は、対象において非経口的に投与することができる。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
一部の実施形態では、方法は、有効量の第２の治療剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は、例えば、クリゾチニブ、パルボシクリブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗４−１ＢＢ抗体、または第２のＰＤ−１抗体である。
それを必要とする対象におけるがんを治療し、または腫瘍増殖もしくは進行を阻害するための医薬の製造における本明細書に提供する抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体のいずれかの使用も提供される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、対象における体重増加を低減する。
それを必要とする対象におけるがんの治療における、または腫瘍増殖もしくは進行を阻害するための使用のための抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体も提供される。一部の実施形態では、がんは、例えば、限定することなく、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌を含む）、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、絨毛癌、大腸がん、口腔がん、皮膚がん、および黒色腫である。
別の態様では、本開示は、哺乳動物、特にヒトにおけるがんを治療するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強するための方法であって、ワクチンを受けている哺乳動物に、有効量の本開示によって提供される抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を投与するステップを含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、哺乳動物、特にヒトにおけるがんを治療するための方法であって、哺乳動物に、（１）がんの細胞に対する免疫応答を誘発することができる有効量のワクチン、および（２）有効量の本開示によって提供される抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を投与するステップを含む、方法を提供する。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置されたマウスの体重を要約するグラフを表す図である。 抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置されたマウスの体重を要約するグラフを表す図である。 抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置されたマウスの体重を要約するグラフを表す図である。 抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置されたマウスの体重を要約するグラフを表す図である。 抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置されたマウスの体重を要約するグラフを表す図である。 初代ヒト活性化Ｔ細胞に結合する抗ＰＤ−１抗体のＥ５０を要約するグラフを表す図である。 初代カニクイザル（ｃｙｎｏ）活性化Ｔ細胞に結合する抗ＰＤ−１抗体のＥ５０を要約するグラフを表す図である。 以下、すなわち、（ａ）抗体なし；（ｂ）アイソタイプ対照；（ｃ）ＥＨ１２．１；（ｄ）Ｃ１；（ｅ）Ｃ２；（ｆ）Ｃ３；（ｇ）ｍＡｂ１；（ｈ）ｍＡｂＸ；（ｉ）ｍＡｂ４；（ｊ）ｍＡｂ５；（ｋ）ｍＡｂ６；（ｌ）ｍＡｂ７；（ｍ）ｍＡｂ９；（ｎ）ｍＡｂ１０；（ｏ）ｍＡｂ１１；（ｐ）ｍＡｂ１４；（ｑ）ｍＡｂ１５；（ｒ）ｍＡｂ１６の通り処置された培養された活性化ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を要約する棒グラフを表す図である。 以下、すなわち、（ａ）抗体なし；（ｂ）アイソタイプ対照；（ｃ）ＥＨ１２．１；（ｄ）Ｃ１；（ｅ）Ｃ２；（ｆ）Ｃ３；（ｇ）ｍＡｂ１；（ｈ）ｍＡｂＸ；（ｉ）ｍＡｂ４；（ｊ）ｍＡｂ５；（ｋ）ｍＡｂ６；（ｌ）ｍＡｂ７；（ｍ）ｍＡｂ９；（ｎ）ｍＡｂ１０；（ｏ）ｍＡｂ１１；（ｐ）ｍＡｂ１４；（ｑ）ｍＡｂ１５；（ｒ）ｍＡｂ１６の通り処置された培養された活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を要約する棒グラフを表す図である。
ＰＤ−１に特異的に結合する抗体が本明細書に開示される。抗ＰＤ−１抗体を作製する方法、これらの抗体を含む組成物、および医薬としてこれらの抗体を使用する方法が提供される。抗ＰＤ−１抗体は、腫瘍進行を阻害するのに使用することができ、がんおよび／または他の疾患の予防および／または治療において使用することができる。
一般的な技法
本発明の実施では、別段の指定のない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣例的な技法を使用し、これらは、当技術分野の技術内である。このような技法は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などで完全に説明されている。
定義
以下の用語は、別段に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。その起源または派生の源によって、（１）その天然の状態でそれに付随する天然に付随するコンポーネントと付随していない、（２）同じ源、例えば、種、それが発現される細胞、ライブラリーなどに由来する他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）自然において存在しない分子（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）を指すものとしての用語「単離分子」。したがって、化学合成される、またはそれが天然に端を発する系と異なる細胞系内で発現される分子は、その天然に付随するコンポーネントから「単離されている」ことになる。分子は、当技術分野で周知の精製技法を使用して、単離によって天然に付随するコンポーネントを実質的に含まないようにすることもできる。分子の純度または均質性は、当技術分野で周知のいくつかの手段によってアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および当技術分野で周知の技法を使用するポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイすることができる。ある特定の目的に関して、より高い分解能を、ＨＰＬＣ、または精製のための当技術分野で周知の他の手段によってもたらすことができる。
「抗体」は、免疫グロブリン分子であって、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置した少なくとも１つの抗原認識部位によって標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書では、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別段の指定のない限り、特異的結合についてインタクト抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成も包含する。抗原結合部分としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖを含めた断片、ならびにポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドがある。抗体としては、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などがあり、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要クラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元構成は、周知である。
抗体の「可変領域」は、単独で、または組合せで抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野で公知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、３つの超可変領域としても公知の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。特に、ＣＤＲ領域の外側（すなわち、フレームワーク領域内）のアミノ酸残基において置換を有する、対象可変領域のバリアントが望まれる場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を対象可変領域と同じカノニカルクラスにおいてＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。
ある特定の実施形態では、ＣＤＲ、および抗体の結合部位を含む残基の同定の最終的な描写は、抗体の構造を解明し、かつ／または抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。ある特定の実施形態では、それは、Ｘ線結晶構造解析法などの当業者に公知の様々な技法のいずれかによって達成され得る。ある特定の実施形態では、分析の様々な方法を、ＣＤＲ領域を同定または近似するのに使用することができる。
Ｋａｂａｔ定義は、抗体における残基を番号付けるための標準であり、典型的にはＣＤＲ領域を同定するのに使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：２１４〜８を参照。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と同様であるが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、ある特定の構造ループ領域の位置を考慮に入れる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８３を参照。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐによって作製された統合された一式のコンピュータープログラムを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６：９２６８〜９２７２；「ＡｂＭ（商標），Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．を参照。ＡｂＭ定義は、ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．、３：１９４〜１９８におけるＳａｍｕｄｒａｌａら、１９９９、「Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」によって記載されたものなどの知識データベースおよびアブイニシオ法の組合せを使用して一次配列から抗体の三次構造をモデル化する。接触定義は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：７３２〜４５を参照。ＣＤＲの「コンホメーション定義」と本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密には従わないが、それにもかかわらず、これらは、特定の残基または残基の群が抗原結合に有意にインパクトを与えないという予測または実験的知見を踏まえると短くまたは長くされ得るが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重なることになる。本明細書において、ＣＤＲは、手法の組合せを含めて、当技術分野で公知の任意の手法によって定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができる。１つを超えるＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義され得る。
当技術分野で公知であるように、抗体の「定常領域」は、単独で、または組合せで、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を一般に含むポリクローナル抗体配合物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に向けられている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載の技法を使用して生成されるファージライブラリーから単離することもできる。本明細書において、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列など）である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、ＣＤＲに由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギなどのＣＤＲに由来する残基と置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見つからないが、抗体性能をさらに洗練および最適化するために含められる残基を含むことができる。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応し、かつ／または本明細書に開示のヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを指す。
用語「エピトープ」は、抗体の抗原結合領域の１つまたは複数において抗体によって認識および結合され得る分子の部分を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基群（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなることが多く、特定の３次元構造特性および特定の帯電特性を有する。一部の実施形態では、エピトープは、タンパク質エピトープであり得る。タンパク質エピトープは、線状または立体構造的であり得る。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用のポイントのすべては、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。「非線状エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原タンパク質内に非連続ポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。用語「抗原エピトープ」は、本明細書において、当技術分野で周知の任意の方法によって、例えば、慣例的なイムノアッセイによって判定される場合、抗体が特異的に結合することができる抗原の部分として定義される。抗原上の所望のエピトープが決定された後、例えば、本明細書に記載の技法を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。代わりに、発見プロセス中に、抗体の生成および特徴付けにより、望ましいエピトープについての情報を解明することができる。この情報から、次いで同じエピトープへの結合について、抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを実現するための手法は、競合および交差競合試験を行って、ＰＤ−１への結合を互いに競合または交差競合する抗体、例えば、抗原への結合を競合する抗体を見つけることである。
本明細書において、用語「ＰＤ−１」は、任意の形態のＰＤ−１、およびＰＤ−１の活性の少なくとも一部を保持するそのバリアントを指す。ヒトＰＤ−１への具体的な言及などによって異なって示されていない限り、ＰＤ−１は、すべての哺乳動物種の天然配列ＰＤ−１、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含む。１つの例示的なヒトＰＤ−１は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１５１１６（配列番号１）として見出される。
用語「アゴニスト」は、別の分子の生物活性または効果を促進する（すなわち、誘導し、引き起こし、増強し、または増大させる）物質を指す。用語アゴニストは、抗体などの受容体に結合する物質、および受容体に結合することなく（例えば、付随タンパク質を活性化することによって）受容体機能を促進する物質を包含する。
用語「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、受容体などの別の分子の生物活性または効果を防止、遮断、阻害、中和、または低減する物質を指す。
用語「アンタゴニスト抗体」は、標的に結合し、その標的の生物学的効果を防止または低減する抗体を指す。一部の実施形態では、この用語は、抗体であって、それが結合している標的、例えば、ＰＤ−１が生物学的機能を実施するのを防止する抗体を表すことができる。
本明細書では、「抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体」は、ＰＤ−１生物活性および／またはＰＤ−１によって媒介される下流事象（複数可）を阻害することができる抗体を指す。抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ−１によって媒介される下流事象、例えば、ＰＤ−Ｌ１結合と下流シグナル伝達、ＰＤ−Ｌ２結合と下流シグナル伝達、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞活性化の阻害、ＩＦＮ分泌の阻害、ＩＬ−２分泌の阻害、ＴＮＦ分泌の阻害、ＩＬ−１０の誘導、および抗腫瘍免疫応答の阻害などを含めたＰＤ−１生物活性を遮断、アンタゴナイズ、抑制、または低減する（有意にを含む任意の程度に）抗体を包含する。本発明の目的に関して、用語「抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体」（「アンタゴニストＰＤ−１抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体」、または「ＰＤ−１アンタゴニスト抗体」と互換的に呼ばれる）は、すべての以前に識別した用語、表題、および機能状態、ならびにＰＤ−１自体、ＰＤ−１生物活性、または生物活性の帰趨が、任意の意味のある程度おいて実質的に無効にされ、減少され、または中和される特性を包含することが明示的に理解されることになる。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ−１に結合し、抗腫瘍免疫応答を上方制御する。抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の例は、本明細書に提供される。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すのに本明細書で互換的に使用される。鎖は、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含むことができ、かつ／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義の中に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として存在し得ることが理解される。
当技術分野で公知であるように、本明細書で互換的に使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはこれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド、およびこれらの類似体などを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖をアセンブリーする前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドコンポーネントによって中断される場合がある。ポリヌクレオチドは、標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾することができる。他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）を有するもの、および荷電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結を有するもの（例えば、αアノマー核酸など）など、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の無修飾形態がある。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換え、標準的な保護基によって保護し、または活性化して追加のヌクレオチドへの追加の連結を準備することができ、または固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端ＯＨを、リン酸化し、またはアミンもしくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも、誘導体化して標準的な保護基にすることができる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−またはβ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含めた、当技術分野で一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し得る。１つまたは複数のホスホジエステル連結を、代替の連結基によって置き換えることができる。これらの代替の連結基としては、それだけに限らないが、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有してもよい置換もしくは非置換のアルキルである（１〜２０Ｃ））によって置き換えられている実施形態がある。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた、本明細書で参照されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
本明細書において、抗体は、平衡解離定数が、実施例７における本明細書に開示の方法によって測定した場合、２０ｎＭに等しい、またはそれ未満、好ましくは約６ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭ未満、最も好ましくは約０．２ｎＭ未満であるとき、ＰＤ−１「と相互作用する」。
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、このような特異的または優先的結合を判定する方法も当技術分野で周知である。分子は、それが特定の細胞または物質と、それが代替の細胞または物質と反応または会合するより、頻繁に、急速に、長い継続時間で、かつ／または大きい親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、それが他の物質に結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易に、かつ／または長い継続時間で結合する場合、標的に「特異的に結合し」、または「優先的に結合する」。例えば、ＰＤ−１エピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、抗体であって、それが他のＰＤ−１エピトープまたは非ＰＤ−１エピトープに結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易にかつ／または長い継続時間でこのエピトープに結合する、抗体である。例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合することができ、または結合しない場合があることも、この定義を読むことによって理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも要求しない（しかし、これは排他的結合を含み得る）。一般に、しかし必ずしもではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。
本明細書において、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、なおより好ましくは、少なくとも９８％純粋、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋である材料を指す。
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートの組込みのためのベクター（複数可）のレシピエントであり得る、またはそれであった個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、必ずしも元の親細胞と完全に同一（形態において、またはゲノムＤＮＡ補体において）でない場合がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（複数可）をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
当技術分野で公知であるように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域であっても、バリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びるように定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。当技術分野で公知であるように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体形態で存在し得る。
当技術分野で使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、好適なＲｃＲとして、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられ、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライスされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）があり、これらは、その細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ならびにｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１に総説されている。「ＦｃＲ」には、新生仔受容体、ＦｃＲｎも含まれ、これは、母体ＩｇＧの胎仔への移動を担う（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用する場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合と十分に同様の様式でエピトープに結合し、その結果、第１の抗体のその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能な程度に減少することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出可能な程度に減少する残された選択も、当てはまり得るが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体のそのエピトープへの結合を、その第２の抗体が第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が、他の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ程度であっても、より大きい程度であっても、またはより小さい程度であっても、検出可能な程度に阻害する場合、抗体は、これらのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合を互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合する抗体はともに、本発明によって包含されている。このような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書に提供する教示に基づいて、このような競合および／または交差競合する抗体が包含され、本明細書に開示の方法に有用であり得ることを理解するはずである。
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などがある。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合されることを必要とし、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然において見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって天然配列Ｆｃ領域のものと異なるが、それでも天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域内に約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書のバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、これらと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、これらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有することになる。
本明細書において、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果としては、それだけに限らないが、以下のうちの１つまたは複数がある：新生物もしくはがん性細胞の増殖の低減（またはその破壊）、新生物細胞の転移の阻害、腫瘍のサイズの縮小もしくは減少、がんの寛解、がんから生じる症状の減少、がんに罹患している者の生活の質の増大、がんを治療するのに要求される他の薬物療法の用量の減少、がんの進行の遅延、がんの治癒、および／またはがんを有する患者の生存期間の延長。
「緩和」は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を投与しないことと比較して、１つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。「緩和」は、症状の継続時間の短縮または低減も含む。
本明細書において、薬剤、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。より具体的な態様では、有効量は、疾患の症状を予防し、和らげ、もしくは緩和し、かつ／または治療されている対象の生存期間を延長する。予防的使用に関して、有益なまたは所望の結果としては、疾患、疾患の発達中に呈する、その合併症、および中間の病理学的表現型の生化学的、組織学的、および／または行動的症状を含めた、疾患のリスクの排除もしくは低減、重症度の軽減、または発症の遅延がある。治療的使用に関して、有益なまたは所望の結果としては、例えば、限定することなく、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、頭頸部がん、扁平細胞頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、絨毛癌、大腸がん、口腔がん、皮膚がん、および黒色腫を含めたがんなどの疾患の１つもしくは複数の症状の低減、疾患を治療するのに要求される他の薬物療法の用量の減少、別の薬物療法の効果の増強、ならびに／または患者におけるがんの進行の遅延などの臨床結果がある。有効投与量は、１回または複数の投与で投与することができる。本発明の目的に関して、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接的にまたは間接的に予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されているように、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬剤、化合物、または医薬組成物と併せて実現することができ、または実現されなくてもよい。したがって、「有効投与量」は、１種または複数の治療剤の投与という状況で考慮することができ、単剤は、１種または複数の他の作用物質と併せて、望ましい結果が実現され得る、または実現されている場合、有効量で与えられていると見なすことができる。
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、それだけに限らないが、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、競技動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットも含まれる。
本明細書において、「ベクター」は、宿主細胞内の対象とする１種または複数の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達し、好ましくは発現させることができるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に付随したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある特定の真核細胞がある。
本明細書において、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結されている。
本明細書において、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」として、活性成分と合わせたとき、成分に生物活性を保持させ、対象の免疫系と非反応性である任意の材料が挙げられる。例としては、それだけに限らないが、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤などのいずれかがある。エアロゾルまたは非経口投与用の好適な希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照）。
用語「ｋｏｎ」は、本明細書において、抗原への抗体の会合の速度定数を指す。具体的には、速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）ならびに平衡解離定数は、全長抗体および／またはＦａｂ抗体断片（すなわち、一価）、ならびにＰＤ−１を使用して測定される。
用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書において、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指す。
用語「ＫＤ」は、本明細書において、抗原−抗体相互作用の平衡解離定数を指す。
本明細書で「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象としている実施形態を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値範囲は、その範囲を画定する数値を含む。
用語「免疫効果細胞エンハンサー」または「ＩＥＣエンハンサー」は、哺乳動物の免疫エフェクター細胞の１つまたは複数のタイプの数、品質、または機能を増大させ、または増強することができる物質を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、細胞溶解性ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞がある。
用語「免疫モジュレーター」は、免疫応答（本明細書で定義される）、または宿主哺乳動物の自然、体液性、もしくは細胞免疫系の任意のコンポーネントの働きを変更する（例えば、阻害し、減少させ、増大させ、増強し、または刺激する）ことができる物質を指す。したがって、用語「免疫モジュレーター」は、本明細書で定義される「免疫効果細胞エンハンサー」および本明細書で定義される「免疫抑制細胞阻害剤」、ならびに哺乳動物の免疫系の他のコンポーネントに影響する物質を包含する。
用語「免疫応答」は、宿主哺乳動物の免疫系による特定の物質（抗原または免疫原など）に対する任意の検出可能な応答、例えば、自然免疫応答（例えば、トール受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞媒介免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞などのＴ細胞、および免疫系の非特異的細胞によって媒介される応答）、ならびに体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される応答、例えば、血漿、リンパ、および／または組織流体中への抗体の生成および分泌など）などを指す。
用語「免疫原性」は、アジュバントの存在または非存在下で、単独であっても、担体に連結されているときであっても、特定の抗原に対して、免疫応答を引き起こし、誘発し、刺激し、もしくは誘導し、または既存の免疫応答を改善し、増強し、増大させ、もしくは延長する、物質の能力を指す。
用語「免疫抑制細胞阻害剤」または「ＩＳＣ阻害剤」は、哺乳動物の免疫抑制細胞の数または機能を低減または抑制することができる物質を指す。免疫抑制細胞の例としては、調節性Ｔ細胞（「Ｔ ｒｅｇ」）、骨髄由来抑制細胞、および腫瘍関連マクロファージがある。
用語「皮内投与」または「皮内に投与される」は、ヒトを含めた哺乳動物への物質の投与という状況で、哺乳動物の皮膚の真皮層中への物質の送達を指す。哺乳動物の皮膚は、表皮層、真皮層、および皮下層から構成される。表皮は、皮膚の外層である。真皮は、皮膚の中間層であり、神経終末、汗腺および油（皮脂線性）腺、毛嚢、ならびに血管を含有する。皮下層は、脂肪、ならびにより大きい血管および神経を収容する結合組織から構成される。皮内投与においてと対照的に、「皮下投与」は、皮下層内への物質の投与を指し、「局部投与」は、皮膚の表面上への物質の投与を指す。
用語「新生物障害」は、細胞が異常に高く制御されない速度、周囲の正常組織のものを超え、それと非協調的な速度で増殖する状態を指す。これは、通常、「腫瘍」として公知の固体病変部または塊をもたらす。この用語は、良性および悪性新生物障害を包含する。用語「悪性新生物障害」は、本開示では用語「がん」と互換的に使用され、腫瘍細胞の体内の他の場所に拡散する能力（「転移」として公知）によって特徴付けられる新生物障害を指す。用語「良性新生物障害」は、腫瘍細胞が転移する能力を欠く新生物障害を指す。
用語「予防すること」または「予防する」は、（ａ）障害が起こることを避けること、または（ｂ）障害の発症もしくは障害の症状の発症を遅延させることを指す。
用語「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」は、腫瘍細胞によって特異的に発現され、または同じ組織型の非腫瘍細胞によってより、腫瘍細胞によって高い頻度または密度で発現される抗原を指す。腫瘍関連抗原は、宿主によって通常発現されない抗原であり得、これらは、宿主によって通常発現される分子の突然変異された、トランケートされた、ミスフォールドされた、もしくは別段に異常な顕在化であり得、これらは、通常発現される分子と同一であり得るが、異常に高いレベルで発現され得、またはこれらは、異常である場面もしくは環境において発現され得る。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質もしくはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、またはこれらもしくは他の生物学的分子の任意の組合せであり得る。
用語「ワクチン」は、哺乳動物内の特定の抗原に対する免疫応答を誘発するための哺乳動物への投与のための免疫原性組成物を指す。ワクチンは、典型的には、病原微生物または腫瘍細胞などの免疫応答の標的に類似または由来する作用物質（「抗原」または「免疫原」として公知）を含有する。がんなどの腫瘍の治療のために意図されたワクチンは、典型的には、標的腫瘍上に見つかるＴＡＡに由来する抗原を含有し、標的腫瘍上のＴＡＡに対して免疫原性を誘発することができる。
用語「ワクチンベース免疫療法レジメン」は、ワクチンが１種または複数の免疫モジュレーターと組み合わせて投与される治療レジメンを指す。ワクチンおよび免疫モジュレーターは、単一製剤で一緒に投与されても、別個に投与されてもよい。
実施形態が言い回し「含む」を用いて本明細書で記載されている場合は必ず、「からなる」および／または「から本質的になる」の観点から記載される別段の類似の実施形態も提供されることが理解される。
本発明の態様または実施形態が選択肢のマーカッシュ群または他の分類の観点から記載される場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、群の各メンバーを個々に、および主群のすべての可能な亜群、また群メンバーの１つまたは複数を欠く主群を包含する。本発明は、請求項に係る発明における群メンバーのいずれかの１つまたは複数を明確に除外することも想定する。
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が支配する。本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと」などの変形は、述べた整数または整数の群を含めることを暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないことが理解されるであろう。脈絡による別段の要求のない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」に続く任意の例（複数可）は、網羅的または限定的であるように意味しない。
例示的な方法および材料を本明細書に記載するが、本明細書に記載のものと同様または等価な方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法、および例は、例示的であるだけであり、限定的であるように意図していない。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体
ＰＤ−１によって媒介される下流事象を含めたＰＤ−１生物活性を遮断、抑制、または低減する（有意に低減するを含む）抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体が本明細書に提供される。抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、以下の特性のうちの任意の１つまたは複数を呈するはずである：（ａ）ＰＤ−１に結合し、下流シグナル伝達事象を遮断し、（ｂ）ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断し、（ｃ）Ｔ細胞媒介免疫応答を上方制御し、（ｄ）ＩＦＮγ分泌を刺激し、（ｅ）ＴＮＦ分泌を刺激し、（ｆ）Ｔ細胞増殖を増大させ、（ｇ）ＰＤ−１による阻害性シグナル伝達を低減する。
本発明の目的に関して、抗体は、好ましくは、ＰＤ−１シグナル伝達機能を阻害する様式でＰＤ−１と反応する。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、霊長類ＰＤ−１に特異的に結合する。
本発明で有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に修飾された抗体を含めた、要求された特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を包含することができる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラ抗体もしくはヒト化抗体を含む）であり得る。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。ヒトおよびマウス抗体を生成するための一般的技法は、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して同定し、または特徴付けることができ、それによってＰＤ−１生物活性の低減、緩和、または中和が検出および／または測定される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、候補剤をＰＤ−１とともにインキュベートし、ＰＤ−１の結合および／または生物活性の付随的低減もしくは中和を監視することによって同定される。結合アッセイは、例えば、精製ＰＤ−１ポリペプチド（複数可）を用いて、またはＰＤ−１ポリペプチド（複数可）を天然に発現し（例えば、様々な系統）、もしくはこれらを発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて実施することができる。一実施形態では、結合アッセイは、競合的結合アッセイであり、この場合、候補抗体がＰＤ−１結合を公知の抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体と競合する能力が評価される。アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含めて様々な形式で実施することができる。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、候補抗体をＰＤ−１とともにインキュベートし、結合を監視することによって同定される。
最初に同定した後、候補抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の活性を、標的にされる生物活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および洗練することができる。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイが使用されて候補抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体がさらに特徴付けられる。例えば、候補抗体が初代ヒトＴ細胞とともにインキュベートされ、ＰＤ−Ｌ１が添加され、ＩＦＮγ分泌が監視される。代わりに、バイオアッセイを使用して、候補を直接スクリーニングすることができる。
本発明の抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、以下の特性の１つまたは複数を呈する：（ａ）ＰＤ−１に結合し、下流シグナル伝達事象を遮断し、（ｂ）ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断し、（ｃ）Ｔ細胞媒介免疫応答を上方制御し、（ｄ）ＩＦＮγ分泌を刺激し、（ｅ）ＴＮＦ分泌を刺激し、（ｆ）Ｔ細胞増殖を増大させ、（ｇ）ＰＤ−１による阻害性シグナル伝達を低減し、（ｈ）ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ２結合を遮断する。好ましくは、抗ＰＤ−１抗体は、これらの特徴の２つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、特徴の３つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、特徴の４つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、特徴の５つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、特徴の６つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、特徴の７つ以上を有する。最も好ましくは、抗体は、８つすべての特性を有する。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９の１１章に記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースアッセイを含めて、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングし、特徴付けるための多くの当技術分野で公知の方法がある。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体が結合する配列を求めることができる。エピトープマッピングは、様々な源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５、８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から商業的に利用可能である。エピトープは、線状エピトープであり得、すなわち、アミノ酸の単一ストレッチ内に含有され得、または必ずしも単一ストレッチ内に含有されていない場合がある、アミノ酸の３次元相互作用によって形成される立体構造エピトープであり得る。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドを、単離または合成し（例えば、組換えで）、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を用いた結合アッセイに使用することができる。別の例では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体が結合するエピトープは、ＰＤ−１配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体による結合を決定することによって、系統的なスクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＰＤ−１をコードするオープンリーディングフレームがランダムに、または特定の遺伝子構築によって断片化され、ＰＤ−１の発現断片の試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、放射性アミノ酸の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＣＲによって生成され、次いで転写され、およびタンパク質に翻訳され得る。次いで放射性標識ＰＤ−１断片への抗体の結合が、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。ある特定のエピトープは、ファージ粒子の表面上にディスプレイされたランダムペプチド配列の大きいライブラリー（ファージライブラリー）または酵母（酵母ディスプレイ）を使用することによっても同定することができる。代わりに重複ペプチド断片の定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイで試験抗体への結合について試験することができる。追加の例では、抗原の突然変異誘発、ドメイン交換実験、およびアラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、エピトープ結合に要求され、十分な、かつ／または必要な残基を同定することができる。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発実験は、ＰＤ−１ポリペプチドの様々な残基がアラニンで置き換えられた突然変異体ＰＤ−１を使用して実施することができる。突然変異体ＰＤ−１への抗体の結合を評価することによって、抗体結合に対する特定のＰＤ−１残基の重要性を評価することができる。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を特徴付けるのに使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわち、ＰＤ−１の様々な断片に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを使用して、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するか否かを決定することである。競合アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含めて当業者に周知である。
ＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の結合親和性（ＫＤ）は、約０．００１〜約２００ｎＭであり得る。一部の実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、または約１ｐＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれか未満である。
したがって、本発明は、以下のいずれか、または表１に見つかる部分的な軽鎖配列および部分的な重鎖配列を有する抗体、もしくはそのバリアントを含む組成物（医薬組成物を含む）を提供する。表１において、下線を引いた配列は、ＣＤＲ配列である。表１において、ＫＤは、別段に示されていない限り、２５℃で表面プラズモン共鳴を使用して測定したヒトＰＤ−１の親和性を示す。
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本発明は、ＰＤ−１に対する抗体のＣＤＲ部分も提供する。ＣＤＲ領域の決定は、当技術分野の技術の十分範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組合せであり得る（「組合せＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）ことが理解される。ＣＤＲの「コンホメーション定義」と本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。一般に、「立体構造ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、および抗体が特異的抗原に結合するための適切なループ構造を維持するために束縛されているバーニアゾーン内に残基位置を含む。立体構造ＣＤＲの決定は、当技術分野の技術の十分範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、拡張、ＡｂＭ、コンホメーション、または接触ＣＤＲである。言い換えれば、１つを超えるＣＤＲを有する実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、コンホメーション、接触ＣＤＲ、またはこれらの組合せのいずれかであり得る。
一部の実施形態では、抗体は、表１に示した重鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１に示した軽鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１に示した重鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲ、および表１に示した軽鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。
表２は、本明細書に提供する抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体のＣＤＲ配列の例を提供する。
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一部の実施形態では、抗体は、表２からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲを含む。
抗ＰＤ−１抗体に由来する軽鎖ＣＤＲのアラインメントを、表３に提供する。可変残基は、太字で示されている。コンセンサス軽鎖ＣＤＲ配列は、表３の最終行に提供されている。
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抗ＰＤ−１抗体に由来する重鎖ＣＤＲのアラインメントを表４に提供する。可変残基は、太字で示されている。コンセンサス重鎖ＣＤＲ配列は、表４の最終行に提供されている。
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一部の実施形態では、抗体は、表３からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび表４からの３つの重鎖ＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、抗体は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体ｍＡｂ７またはｍＡｂ１５のＣ末端リシンを含み、もしくは含まない全長重鎖、および／または全長軽鎖を含む。ｍＡｂ７全長重鎖（配列番号２９）のアミノ酸配列を以下に示す。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＹＰＧＳＳＬＴＮＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＳＴＧＴＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２９）
Ｃ末端リシンを含まないｍＡｂ７全長重鎖のアミノ酸配列（配列番号３８）を以下に示す。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＹＰＧＳＳＬＴＮＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＳＴＧＴＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３８）
ｍＡｂ７全長軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３９）を以下に示す。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＷＤＳＧＮＱＫＮＦＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＴＳＹＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＨＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３９）
本発明は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を生成、選択、および作製する方法も提供する。本発明の抗体は、当技術分野で公知の手順によって作製することができる。一部の実施形態では、抗体は、組換えで作製し、当技術分野で公知の任意の方法を使用して発現させることができる。
一部の実施形態では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって調製および選択することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜４５５、１９９４を参照。代わりに、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３、１９９０）を使用して、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子が、糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子、例えば、Ｍ１３またはｆｄなどの中にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体断片としてディスプレイされる。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体を機能的性質に基づいて選択すると、これらの性質を呈する抗体をコードする遺伝子も選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で実施することができる。総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４〜５７１、１９９３を参照。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの源を、ファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８、１９９１は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１〜５９７、１９９１またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５〜７３４、１９９３によって記載された技法に本質的に従って、ヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い割合で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化のいくつかが、より高い親和性を付与することになり、高親和性表面免疫グロブリンをディスプレイするＢ細胞が、後続の抗原チャレンジの間に選択的に複製および分化される。この自然過程は、「鎖シャッフリング」として公知の技法を使用することによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． １０：７７９〜７８３、１９９２）。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、非免疫化ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアントのレパートリー（レパートリー）で、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次置き換えることによって改善することができる。この技法により、ｐＭ〜ｎＭ範囲内の親和性を有する抗体および抗体断片の生成が可能になる。非常に大きいファージ抗体レパートリー（「マザーオブオールライブラリー」としても公知）を作製するためのストラテジーが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２２６５〜２２６６、１９９３によって記載されている。げっ歯類抗体からヒト抗体を導出するのに遺伝子シャフリングも使用することができ、この場合、ヒト抗体は、出発げっ歯類抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープ刷り込み」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技法によって得られるげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子がヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられ、げっ歯類−ヒトキメラが作り出される。抗原の選択により、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域が単離され、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（刷り込む）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにこのプロセスが繰り返されると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０６２１３を参照）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化と異なり、この技法は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基をまったく有さない完全ヒト抗体をもたらす。
一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して作製することができる。ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞を、ヒトを含めた哺乳動物およびハイブリドーマ細胞株を生成するための基盤として機能を果たすように操作することができることが企図されている。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは一般に、本明細書でさらに記載するように、抗体を刺激および生成するための確立された技法および慣例的な技法を踏まえている。一般に、宿主動物は、本明細書に記載するように、腹腔内、筋肉内、経口的、皮下、足底内、および／または皮内に、ある量の免疫原を接種される。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１、１９８２によって改良された一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を使用して、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。それだけに限らないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、およびｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡからのものを含めた利用可能な骨髄腫株を、ハイブリダイゼーションで使用することができる。一般に、この技法では、ポリエチレングリコールなどの融合剤を使用して、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を融合する。融合後、細胞は、融合培地から分離され、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的増殖培地内で増殖されて未ハイブリダイズ親細胞が排除される。血清の有無にかかわらず補充された、本明細書に記載の培地のいずれも、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するのに使用することができる。細胞融合技法の別の選択肢として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、対象発明のＰＤ−１モノクローナル抗体を生成することができる。ハイブリドーマまたは他の不死化Ｂ細胞は、必要に応じて、展開およびサブクローニングされ、慣例的なイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光イムノアッセイ）によって抗免疫原活性について上清がアッセイされる。
抗体源として使用され得るハイブリドーマは、ＰＤ−１に特異的なモノクローナル抗体、またはこれらの一部を産生するすべての誘導体、親ハイブリドーマの子孫細胞を包含する。
このような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、必要に応じて、慣例的な免疫グロブリン精製手順、例えば、硫安分画、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などによって、培地または体液から単離することができる。望まれない活性は、存在する場合、例えば、固相に付着した免疫原でできた吸着剤上に配合物を流し、免疫原から所望の抗体を溶出または放出することによって除去することができる。ＰＤ−１ポリペプチド、または免疫される種内で免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートした標的アミノ酸配列を含有する断片を用いて、二機能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を使用して、宿主動物を免疫化すると、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団を生じさせることができる。
必要に応じて、対象とする抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定し、次いで、ポリヌクレオチド配列をベクター中にクローン化し、発現または増殖させることができる。対象とする抗体をコードする配列を、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、次いで宿主細胞を展開し、将来使用するために凍結することができる。細胞培養物内での組換えモノクローナル抗体の生成は、当技術分野で公知の手段によって、Ｂ細胞から抗体遺伝子をクローニングすることによって実施することができる。例えば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２９、１１２、米国特許第７，３１４，６２２号を参照。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に使用して、抗体を「ヒト化」し、または抗体の親和性もしくは他の特性を改善することができる。抗体は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシにおいて使用するためにカスタマイズすることもできる。
一部の実施形態では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように遺伝子工学的に改変された市販のマウスを使用することによって、完全ヒト抗体を得ることができる。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）、またはよりロバストな免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体を生成するのに使用することができる。このような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
抗体は、宿主動物から抗体および抗体産生細胞を最初に単離し、遺伝子配列を得、遺伝子配列を使用して、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内で抗体を組換えで発現させることによって組換えで作製することができる。使用することができる別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニック乳内で抗体配列を発現させることである。植物または乳内で、組換えで抗体を発現させるための方法は、開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６、２００１、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５、１９９５ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７、１９９９を参照。抗体の誘導体、例えば、ドメイン、単鎖などを作製するための方法は、当技術分野で公知である。
イムノアッセイ、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーソーティング技法も、ＰＤ−１に対して特異的な抗体を単離するのに使用することができる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣例的な手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡなどの好適な源として機能を果たす。単離した後、発現ベクター（ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクターなど）内にＤＮＡを配置することができ、次いでこれらは、宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を他の方法で産生しない骨髄腫細胞などの中にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成が得られる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号を参照。ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を置換することによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１：６８５１、１９８４、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてもしくは一部を共有結合的に接合することによって、修飾することもできる。その様式で、本明細書のＰＤ−１モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
抗体断片は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解によって、上述した組換え法（すなわち、単一もしくは融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって生成することができる。抗体のポリペプチド、特に最大約５０アミノ酸のより短いポリペプチドは、化学合成によって好都合に作製される。化学合成の方法は、当技術分野で公知であり、商業的に利用可能である。例えば、抗体は、固相法を使用する自動ポリペプチドシンセサイザーによって生成することができる。米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第６，３３１，４１５号も参照。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１５、またはｍＡｂ１６の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする配列を含む。対象とする抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、次いで宿主細胞を展開し、将来使用するために凍結させることができる。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書でさらに記載されている。
本発明は、親和性成熟した実施形態を含む。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３、Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９〜３８１３、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９、Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０５８１８４）。
以下の方法は、抗体の親和性を調整し、ＣＤＲを特徴付けるのに使用することができる。抗体のＣＤＲを特徴付け、かつ／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更する（改善するなど）一方法は、「ライブラリースキャンニング突然変異誘発」と呼ばれた。一般に、ライブラリースキャンニング突然変異誘発は、以下のように働く。ＣＤＲ内の１つまたは複数のアミノ酸位置が、当技術分野で承認されている方法を使用して、２つ以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個など）のアミノ酸と置き換えられる。これにより、クローンの小ライブラリーが生成され（一部の実施形態では、分析されるアミノ酸位置毎に１つ）、それぞれは、２つ以上のメンバーの複雑性を有する（位置毎に２つ以上のアミノ酸が置換される場合）。一般に、ライブラリーは、天然（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリーから少数のクローン、例えば、約２０〜８０クローン（ライブラリーの複雑性に応じて）が、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングされ、結合性が増大した、同じ、減少した、またはまったくない候補が同定される。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野で周知である。結合親和性は、例えば、約２倍以上の結合親和性の差異を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）バイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）イムノアッセイ、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを使用して求めることができる。結合親和性は、適当なバイオアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は、出発抗体が比較的高い親和性、例えば、約１０ｎＭ以下のＫＤで既に結合する場合、特に有用である。
一部の実施形態では、ＣＤＲ内のすべてのアミノ酸位置が、当技術分野で承認されている突然変異誘発法（これらのいくつかを本明細書に記載する）を使用して、２０すべての天然アミノ酸で置き換えられる（一部の実施形態では、一つずつ）。これにより、クローンの小ライブラリーが生成され（一部の実施形態では、分析されるアミノ酸位置毎に１つ）、それぞれは、２０のメンバーの複雑性を有する（位置毎に２０個すべてのアミノ酸が置換される場合）。
一部の実施形態では、スクリーニングされるライブラリーは、２つ以上の位置に置換を含み、これらは、同じＣＤＲ内にあっても、２つ以上のＣＤＲ内にあってもよい。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含み得る。ライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含み得る。ライブラリーは、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ内に見つかる、３、４、５、またはそれ以上の位置に置換を含み得る。置換は、低冗長性コドンを使用して調製することができる。例えば、Ｂａｌｉｎｔら１９９３、Ｇｅｎｅ １３７（１）：１０９〜１８の表２を参照。
ＣＤＲは、重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ３および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ３であり得る。ＣＤＲは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、および／またはＶＬ ＣＤＲ３の１つまたは複数であり得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、拡張ＣＤＲ、ＡｂＭ ＣＤＲ、接触ＣＤＲ、またはコンホメーションＣＤＲであってもよい。
結合性が改善された候補を配列決定し、それによって、親和性を改善するＣＤＲ置換突然変異体（「改善された」置換とも呼ばれる）を同定することができる。結合する候補を配列決定し、それによって、結合性を保持するＣＤＲ置換を同定することもできる。
複数ラウンドのスクリーニングを行うことができる。例えば、結合性が改善された候補（それぞれは、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を含む）は、それぞれの改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が結合性の改善を示したＣＤＲ内のアミノ酸位置）で少なくとも元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する第２ライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択を以下でさらに論じる。
改善された結合性、同じ結合性、減少した結合性を有し、または結合性をまったく有さないクローンの頻度も、抗体−抗原複合体の安定性について各アミノ酸位置の重要性に関する情報を提供する限り、ライブラリースキャンニング突然変異誘発も、ＣＤＲを特徴付けるための手段を提供する。例えば、ＣＤＲの位置が、２０個すべてのアミノ酸に変更されたとき結合性を保持する場合、その位置は、抗原結合に必要とされそうにない位置として同定される。反対に、ＣＤＲの位置が、置換の小パーセンテージのみにおいて結合性を保持する場合、その位置は、ＣＤＲ機能に重要である位置として同定される。したがって、ライブラリースキャンニング突然変異誘発法により、多くの異なるアミノ酸（２０個すべてのアミノ酸を含む）に変更することができるＣＤＲ内の位置、および変更することができないか、または数種のアミノ酸に変更することができるだけであるＣＤＲ内の位置に関する情報が生成される。
親和性が改善された候補は、第２ライブラリー内で組み合わせることができ、このライブラリーは、改善されたアミノ酸、その位置における元のアミノ酸を含み、望まれる、または所望のスクリーニングもしくは選択法を使用して許容されるライブラリーの複雑性に応じて、その位置で追加の置換をさらに含むことができる。さらに、必要に応じて、隣接するアミノ酸位置は、少なくとも２つ以上のアミノ酸に対してランダム化することができる。隣接するアミノ酸をランダム化すると、突然変異体ＣＤＲ内の追加の立体構造的柔軟性を可能にすることができ、それはさらには、より多数の改善突然変異の導入を可能にし、または促進することができる。このライブラリーはまた、スクリーニングの第１ラウンドで親和性の改善を示さなかった位置で置換を含むことができる。
第２ライブラリーは、Ｋｉｎｅｘａ（商標）バイオセンサー分析を使用するスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む、選択のための当技術分野で公知の任意の方法を使用する選択を含めて、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、結合親和性が改善および／または変更されたライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択される。
本発明の抗ＰＤ−１抗体を発現させるために、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を、上述した方法のいずれかを使用して最初に得ることができる。様々な修飾、例えば、突然変異、欠失、および／または付加も、当業者に公知の標準方法を使用して、ＤＮＡ配列中に導入することができる。例えば、突然変異誘発は、ＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準方法を使用して実施することができ、ＰＣＲ媒介突然変異誘発では、突然変異したヌクレオチドがＰＣＲプライマー中に組み込まれ、その結果、ＰＣＲ産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異誘発を含有する。
本発明は、表１に示した可変領域、および表２、３、または４に示したＣＤＲに対する修飾を包含する。例えば、本発明は、これらの性質に有意に影響しない機能的に等価な可変領域およびＣＤＲを含む抗体、ならびに活性および／または親和性が増強され、もしくは減少したバリアントを含む。例えば、アミノ酸配列を突然変異させて、ＰＤ−１に対する所望の結合親和性を有する抗体を得ることができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野で日常の行為であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を有意に有害に変更しない、もしくはポリペプチドのそのリガンドに対する親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加、または化学的類似体の使用を有するポリペプチドがある。
アミノ酸配列挿入としては、１つの残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体がある。抗体分子の他の挿入バリアントには、血液循環中で抗体の半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
置換バリアントは、除去された抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基、およびその場所内に挿入された異なる残基を有する。置換突然変異誘発の最も大きな関心のある部位には超可変領域が含まれるが、フレームワーク変化も企図されている。保存的置換を、「保存的置換」の表題で表５に示す。このような置換が生物活性を変化させる場合、表５で「例示的な置換」と命名した、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載する、より実質的な変化を導入することができ、生成物をスクリーニングすることができる。
Figure 2018503365
抗体の生物学的性質の実質的な修飾は、（ａ）例えば、βシートもしくはヘリックスコンホメーションとしての置換範囲内のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対する置換の効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づいて群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷を有さない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に荷電した）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に荷電した）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのクラスのメンバーを別のクラスと交換することによって行われる。
例えば、行うことができる１つのタイプの置換は、別の残基、例えば、限定することなく、アラニンまたはセリンなどに化学反応性であり得る、抗体中の１つまたは複数のシステインを変更することである。例えば、非カノニカルシステインの置換が存在し得る。置換は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域内、または抗体の定常領域内で行うことができる。一部の実施形態では、システインは、カノニカルである。抗体の適切なコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般にセリンと置換することができる。反対に、システイン結合（複数可）を、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、抗体の安定性を改善するために抗体に付加することができる。
抗体は、例えば、抗体の結合性を変更するために、例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内で修飾することもできる。可変領域内の変化は、結合親和性および／または特異性を変更し得る。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。例えば、ＰＤ−１に対する抗体のＫＤを増減し、ｋｏｆｆを増減し、または抗体の結合特異性を変更するために、ＣＤＲ領域の１つまたは複数内で突然変異を行うことができる。部位特異的突然変異誘発における技法は、当技術分野で周知である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照。
修飾または突然変異をフレームワーク領域または定常領域内で行って、抗ＰＤ−１抗体の半減期を延ばすこともできる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９５６０号を参照。フレームワーク領域または定常領域内での突然変異を行って、抗体の免疫原性を変更し、別の分子への共有結合性もしくは非共有結合性結合のための部位を提供し、または補体結合、ＦｃＲ結合、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの性質を変更することもできる。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内で行われる。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内で行われる。本発明によれば、単一抗体は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域の任意の１つまたは複数内、または定常領域内に突然変異を有することができる。
修飾には、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに他の翻訳後修飾、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などを有するポリペプチドも含まれる。抗体は、これらの定常領域内の保存位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ、１５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０）、ならびにコンホメーションに影響し得る糖タンパク質の部分と、糖タンパク質の提示された三次元表面との分子内相互作用（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）に影響する。オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づいて、ある特定の分子に所与の糖タンパク質を向ける機能を果たすこともできる。抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響することも報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）がテトラサイクリンにより発現制御されるＣＨＯ細胞によって産生される抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。
抗体のグリコシル化は、一般に、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分がアスパラギン側鎖に酵素的結合するための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１種の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用することができる。
グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列を、これが上述したトリペプチド配列の１つまたは複数を含有するように変更することによって好都合には達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位に関して）。変更は、元の抗体の配列への、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によっても行うことができる（Ｏ結合型グリコシル化部位に関して）。
抗体のグリコシル化パターンも、基本的なヌクレオチド配列を変更することなく変更することができる。グリコシル化は、抗体を発現させるのに使用される宿主細胞に大部分は依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現に使用される細胞型は、まれにネイティブ細胞であるので、抗体のグリコシル化パターンのバリエーションが予期され得る（例えば、Ｈｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
宿主細胞の選択に加えて、抗体を組換え生産する間にグリコシル化に影響する要因としては、増殖モード、培地配合、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキームなどがある。オリゴ糖生成に関与するある特定の酵素の導入または過剰発現を含めて、特定の宿主生物体内で実現されるグリコシル化パターンを変更するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、同第５，５１０，２６１号、および同第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、またはある特定のタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、ある特定のタイプの多糖のプロセシングにおいて欠陥のあるように遺伝子工学的に改変することができる。これらの技法および同様の技法は、当技術分野で周知である。
修飾の他の方法には、それだけに限らないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含めた、当技術分野で公知のカップリング技法の使用が含まれる。修飾は、例えば、イムノアッセイ用標識の結合に使用することができる。修飾ポリペプチドは、当技術分野で確立した手順を使用して作製され、当技術分野で公知の標準アッセイを使用してスクリーニングすることができる。これらのアッセイのいくつかを以下および実施例で記載する。
一部の実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４であり得る。一部の実施形態では、抗体は、以下の突然変異を含むＩｇＧ４の定常領域を含む（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０、５８５〜５９３）：番号付けが野生型ＩｇＧ４を参照している、Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｃ）。さらに別の実施形態では、Ｆｃは、欠失Ｇ２３６を伴ったＥ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５への変異を含むヒトＩｇＧ４である。一部の実施形態では、Ｆｃは、Ｓ２２８からＰ２２８へのヒンジ安定化突然変異を含有する任意のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、またはＩｇＧ４Δｃ）である（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５、９〜１９）。他の実施形態では、Ｆｃは、アミノ酸残基が野生型ＩｇＧ２配列を参照して番号付けされる、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への突然変異（ＩｇＧ２Δａ）を含有するヒトＩｇＧ２であり得る。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＦｃγ受容体に対する結合親和性が増大もしくは減少した修飾定常領域を含み、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性であり、例えば、補体媒介溶解を誘発せず、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激せず、もしくはミクログリアを活性化せず、または以下、すなわち、補体媒介溶解の誘発、ＡＤＣＣの刺激、もしくはミクログリアの活性化のうちの任意の１つもしくは複数において活性が低減している（無修飾抗体と比較して）。エフェクター機能の最適レベルおよび／または組合せを実現するために、定常領域の異なる修飾を使用することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９〜３２４、１９９５；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜９ １５７：４９６３〜４９６９、１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４、２０００；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５〜２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／０５８５７２に記載されているように修飾される。
一部の実施形態では、抗体定常領域を修飾して、Ｆｃγ受容体と補体および免疫系との相互作用を回避することができる。このような抗体を調製するための技法は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されている。例えば、抗体がヒトにおける臨床試験および治療で使用される場合、定常領域をヒト定常領域により類似しているように遺伝子工学的に改変して、免疫応答を回避することができる。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照。
さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化の代わりに非グリコシル化されている。一部の実施形態では、定常領域は、オリゴ糖付着残基および／または定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるフランキング残基を突然変異させることによって、Ｎ結合型グリコシル化の代わりに非グリコシル化されている。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、例えば、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異され得る。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５〜２６０１、１９８９、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化について非グリコシル化されている。定常領域は、酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去するなど）、またはグリコシル化欠損宿主細胞内の発現によって、Ｎ結合型グリコシル化について非グリコシル化されていてもよい。
他の抗体修飾には、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５８５７２号に記載されたように修飾された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部に実質的に相同のアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の著しい補体依存性溶解または細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子に結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは一般に、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このようにして修飾された抗体は、慣例的な抗体療法に対する炎症反応および他の拒絶反応を回避するための長期抗体療法で使用するのに特に適している。
一部の実施形態では、抗体は、無修飾抗体と比較してＦｃＲｎに対する結合親和性の増大および／または血清半減期の増大を有する修飾定常領域を含む。
「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」として公知のプロセスでは、ＶＨおよびＶＬ配列中のある特定のアミノ酸を突然変異させて、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列中に天然に見つかるものとマッチさせることができる。特に、抗体が投与されるときの免疫原性のリスクを低減するために、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を突然変異させて、生殖系列配列とマッチさせることができる。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、当技術分野で公知である（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照；Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６も参照）。
行うことができる別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。このような部位は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域内または抗体の定常領域内に存在し得る。システイン残基を置換し、タンパク質分解部位を除去すると、抗体生成物中の不均質性のリスクを減少させ、したがってその均質性を増大させることができる。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的なアミド分解部位を形成するアスパラギン−グリシン対を、これらの残基の一方または両方を変更することによって排除することである。別の例では、本発明の抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端リシンを切断することができる。本発明の様々な実施形態では、抗ＰＤ−１抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を任意選択により含む場合がある。
本発明のＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によってさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡ断片は、抗体定常領域などの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片、または可動性リンカーに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結した」は、本脈絡において使用する場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が接合されていることを意味するように意図されている。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域とすることができるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、異なる個体の中で存在することが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプ、例えば、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）などのいずれかであり得る。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換を代表する。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかに由来し得る。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域とすることができる。κ定常領域は、異なる個体の中で存在することが知られている様々な対立遺伝子、例えば、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）のいずれかであり得る。λ定常領域は、３種のλ遺伝子のいずれかに由来し得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すために、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡ断片は、可動性リンカーをコードする別の断片に、ＶＨおよびＶＬ配列が、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーによって接合された連続した単鎖タンパク質として発現され得るように作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４を参照）。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１９）であり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間のおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーも設計および使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、上記）。リンカーは、次に、追加の機能、例えば、薬剤の結合または固体支持体への結合などのために修飾することができる。単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用される場合、一価であり得、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合、二価であり得、または２つを超えるＶＨおよびＶＬが使用される場合、多価であり得る。ＰＤ−１および別の分子に特異的に結合する二重特異性抗体または多価抗体を生成することができる。単鎖バリアントは、組換えで、または合成的に生成することができる。ｓｃＦｖの合成生成のために、自動シンセサイザーを使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適当なプラスミドを、酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物の適当な宿主細胞内に導入することができる。対象とするｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの慣例的な操作によって作製することができる。結果として生じるｓｃＦｖは、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離することができる。
ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬが、単一ポリペプチド鎖上であるが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させることができず、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出すリンカーを使用して発現される、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３を参照）。
２つの共有結合的に接合された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を望まれない細胞に向けるのに（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染を治療するために（ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９１／０００３６０および同第９２／２００３７３号；ＥＰ０３０８９）使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製することができる。適当な架橋剤および架橋技法は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤を伴うものを含めて、合成タンパク質化学の公知の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的用の適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）がある。
本発明は、本明細書に開示の抗体に由来する１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含する。一部の実施形態では、別のポリペプチドに連結された本発明の抗ＰＤ−１抗体のすべてまたは一部を含む融合抗体を作製することができる。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結される。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体のＶＨドメインは、第１ポリペプチドに連結され、一方、抗ＰＤ−１抗体のＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができる様式で第１ポリペプチドと会合する第２ポリペプチドに連結される。別の好適な実施形態では、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるように、リンカーによってＶＬドメインから分離される。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、対象とするポリペプチドに連結される。さらに、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結された融合抗体を作り出すことができる。これは、単一ポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合、有用である。
一部の実施形態では、配列番号２、７、８、もしくは９に示した可変軽鎖領域の少なくとも１０の連続したアミノ酸、および／または配列番号３、４、５、もしくは６に示した可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２と３、７と３、８と３、８ ９と３、２と４、７と４、８と４、９と４、２と５、７と５、８と５、９と５、２と６、７と６、８と６、および９と６の中から選択される配列対のいずれかに示された軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、１つまたは複数のＣＤＲ（複数可）を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＶＨ ＣＤＲ３および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含む。本発明の目的に関して、融合タンパク質は、１種または複数の抗体、および天然分子内に結合されていない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列、または別の領域からの相同配列を含有する。例示的な異種配列としては、それだけに限らないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」がある。タグは、当技術分野で周知である。
融合ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、合成的に、または組換えで作り出すことができる。一般に、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載の組換え法を使用して、これらをコードするポリヌクレオチドを調製し、発現させることによって作製されるが、これらは、例えば、化学合成を含めた当技術分野で公知の他の手段によっても調製することができる。
他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体コード核酸分子を使用して他の修飾抗体を調製することができる。例えば、「カッパボディ」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１０：９４９〜５７）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：５３０３〜９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、上記）、または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３６５５〜３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補遺）、７：５１〜５２）を、本明細書の教示に従って、標準的な分子生物学的技法を使用して調製することができる。
例えば、二重特異性抗体、すなわち、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体を、本明細書に開示の抗体を使用して調製することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照）。例えば、二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７〜１５５３を参照。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２本の重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７〜５３９）。さらに、二重特異性抗体を「ダイアボディ」または「ジャヌシン」として形成することができる。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＤ−１の２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、上述した修飾抗体は、本明細書に提供する抗ＰＤ−１抗体に由来する可変ドメインまたはＣＤＲ領域の１つまたは複数を使用して調製される。
二重特異性抗体を作製するための一手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とのものである。融合物の少なくとも１つの中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好適である。免疫グロブリン重鎖融合物および必要に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター内に挿入され、適当な宿主生物体内にコトランスフェクトされる。これは、構築物内で不等比の３本のポリペプチド鎖が使用されると収率が最適になる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互の比率の調整に大きな柔軟性をもたらす。しかし、少なくとも２本のポリペプチド鎖が等比で発現されると収率が高くなる場合、または比が特に重要でない場合、２本、または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクター内に挿入することが可能である。
一手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム内の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム内のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖を有する非対称構造は、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進する。この手法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０４６９０に記載されている。
本発明は、固体支持体へのカップリングを促進する作用物質（ビオチンまたはアビジンなど）にコンジュゲートした（例えば、連結した）抗体を含む組成物も提供する。単純性のために、これらの方法が本明細書に記載のＰＤ−１結合および／またはアンタゴニストの実施形態のいずれかに適用されるという理解で、一般に、抗体に言及する。コンジュゲーションは一般に、本明細書に記載のこれらのコンポーネントを連結することを指す。連結（これは一般に、少なくとも投与のために、近接会合でこれらのコンポーネントを固定することである）は、任意の数の方法で実現され得る。例えば、作用物質と抗体との直接反応は、それぞれが他方の置換基と反応することができる置換基を有する場合、可能である。例えば、一方上の求核基、例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基などは、他方上のカルボニル含有基、例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物など、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができる。
抗体は、多くの異なる担体に結合することができる。担体は、活性および／または不活性であり得る。周知の担体の例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびに磁鉄鉱がある。担体の性質は、本発明の目的に関して可溶性または不溶性であり得る。当業者は、結合抗体用の他の適当な担体が分かり、または日常の実験を使用してこのようなものを確認することができるであろう。一部の実施形態では、担体は、肺、心臓、または心臓弁を標的にする部分を含む。
本発明の抗体またはポリペプチドは、標識化剤、例えば、蛍光性分子、放射性分子、または当技術分野で公知の任意の他の標識などに連結され得る。一般にシグナルをもたらす（直接的にまたは間接的に）標識は、当技術分野で公知である。
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の抗体断片および修飾抗体を含めた抗体、例えば、エフェクター機能が損なわれた抗体などのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順によって作製し、発現させることができる。したがって、本発明は、以下：抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１５、ｍＡｂ１６、およびｍＡｂ１７、またはＰＤ−１をアンタゴナイズする能力を有するその任意の断片もしくは部分のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドまたは医薬組成物を含めた組成物を提供する。
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても、二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）であっても、ＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコード配列または非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材に連結されていてもよいが、その必要はない。
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、抗体またはその断片をコードする内因性配列）を含むことができ、またはこのような配列のバリアントを含むことができる。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫反応性が天然の免疫反応性分子と比べて減少しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書に記載するように評価することができる。バリアントは、好ましくは、自然抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を呈する。
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載するように、最大対応に関してアラインメントされたとき同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、少なくとも約２０の連続した位置、通常３０〜約７５、または４０〜約５０のセグメントを指し、この中で１つの配列を同じ数の連続した位置の参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントさせた後に比較することができる。
比較するための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）一式内のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、デフォルトのパラメータを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されたいくつかのアラインメントスキームを具現する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ． １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ． ４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６〜７３０。
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって求められ、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列内で起こる位置の数を求めてマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照配列（すなわち、ウィンドウサイズ）内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
バリアントは、加えて、または代わりに、天然遺伝子またはその部分もしくは相補鎖に実質的に相同である。このようなポリヌクレオチドバリアントは、自然抗体（または相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
適当な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション、その後の０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。
本明細書において、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを使用し、（２）ハイブリダイゼーションの間に、４２℃で、ホルムアミド、例えば、０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液などの変性剤を使用し、または（３）４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％のホルムアミド中での洗浄、その後の５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を伴った、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を使用するものである。当業者は、プローブ長などの要因に対応するために、必要に応じてどのように温度、イオン強度などを調整するかを認識するであろう。
遺伝コードの縮退の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを当業者が理解することになる。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小の相同性を持つ。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図されている。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの１つまたは複数の突然変異、例えば、欠失、付加、および／または置換などの結果として変更されている内因性遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準技法（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を生成するために、本明細書に提供する配列、および市販のＤＮＡシンセサイザーを使用することができる。
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書でさらに論じるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適当なベクター中に挿入することができ、ベクターを次に、複製および増幅のために適当な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって宿主細胞内に挿入することができる。細胞は、直接取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合、または電気穿孔により、外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入された後、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持し、または宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照。
代わりに、ＰＣＲにより、ＤＮＡ配列の複製が可能になる。ＰＣＲ技術は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号、および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
ＲＮＡは、適切なベクター中で単離ＤＮＡを使用し、適当な宿主細胞内にこれを挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写される場合、次いで、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に示されているように、当業者に周知の方法を使用してＲＮＡを単離することができる。
適当なクローニングベクターを標準技法によって構築することができ、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用されるように意図された宿主細胞によって変更することができるが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有することになり、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一標的を有することができ、かつ／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカー用遺伝子を担持することができる。適当な例としては、プラスミドならびに細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターがある。これらの、および多くの他のクローニングベクターは、市販供給業者、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能ポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体部分として宿主細胞内で複製可能でなければならないことが暗示されている。適当な発現ベクターとしては、それだけに限らないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクター（複数可）がある。ベクターコンポーネントとして一般に、それだけに限らないが、以下、すなわちシグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適当な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）の１つまたは複数を挙げることができる。発現（すなわち、翻訳）のために、１つまたは複数の翻訳制御エレメント、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなども通常必要とされる。
対象とするポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、この場合、ベクターは、ワクシニアウイルスなどの感染性病原体である）を含めたいくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、宿主細胞の特徴に依存することになることが多い。
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、対象とする抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定例としては、それだけに限らないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞がある。ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号も参照。適当な非哺乳動物宿主細胞としては、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）、および酵母（Ｓ．セレビサエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）など）がある。好ましくは、宿主細胞は、存在する場合、宿主細胞中の対象とする、対応する内因性抗体またはタンパク質のレベルより、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＰＤ−１またはＰＤ−１ドメインへの特異的結合のための宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによって行われる。対象とする抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
発現ベクターを抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の直接発現に使用することができる。当業者は、ｉｎ ｖｉｖｏで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号、同第６，４１３，９４２号、および同第６，３７６，４７１号を参照。発現ベクターの投与としては、注入、経口投与、粒子銃もしくはカテーテル挿入投与、および局部投与を含めた局所投与または全身投与がある。別の実施形態では、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜内に直接投与される。
発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達も使用することができる。受容体媒介ＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２、Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２１、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９：５４２、Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７：３６５５、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコールの局所投与に関して、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲内で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲も、遺伝子療法プロトコールの間に使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源であっても、非ウイルス起源であってもよい（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１、Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、５：８４５、Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５、およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、６：１４８を参照）。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であってもよく、または制御されてもよい。
所望のポリヌクレオチドを送達し、所望の細胞内で発現させるためのウイルス系ベクターは、当技術分野で周知である。例示的なウイルス系ビヒクルとしては、それだけに限らないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号、同第ＷＯ９４／０３６２２号、同第ＷＯ９３／２５６９８号、同第ＷＯ９３／２５２３４号、同第ＷＯ９３／１１２３０号、同第ＷＯ９３／１０２１８号、同第ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照）、アルファウイルス系ベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ならびにベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、同第ＷＯ９３／０３７６９号、同第ＷＯ９３／１９１９１号、同第ＷＯ９４／２８９３８号、同第ＷＯ９５／１１９８４号、および同第ＷＯ９５／００６５５を参照）がある。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載された死滅アデノウイルスに連結したＤＮＡの投与も使用することができる。
それだけに限らないが、死滅アデノウイルス単独に連結した、または連結していないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７９９４号、同第ＷＯ９６／１７０７２号、同第ＷＯ９５／３０７６３号、および同第ＷＯ９７／４２３３８号を参照）、ならびに核電荷中和または細胞膜との融合を含めた、非ウイルス送達ビヒクルならびに方法も使用することができる。裸のＤＮＡも使用することができる。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号、および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３７９６号、同第ＷＯ９４／２３６９７号、同第ＷＯ９１／１４４４５号、およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。追加の手法は、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。
組成物
本発明は、有効量の本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む医薬組成物も提供する。このような組成物の例および製剤化方法も、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、組成物は、１種または複数のＰＤ−１抗体を含む。他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１を認識する。他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ヒト抗体である。他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、所望の免疫応答、例えば、抗体媒介溶解またはＡＤＣＣなどを誘発することができる定常領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、望まれない、または望ましくない免疫応答、例えば、抗体媒介溶解またはＡＤＣＣなどを誘発しない定常領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または一部の実施形態では、６つすべてのＣＤＲなど）を含む。
組成物は、１種を超える抗ＰＤ−１抗体（例えば、ＰＤ−１の異なるエピトープを認識するＰＤ−１抗体の混合物）を含み得ることが理解される。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する１種を超える抗ＰＤ−１抗体、またはＰＤ−１の異なるエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体の異なる種を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＤ−１の異なるバリアントを認識する抗ＰＤ−１抗体の混合物を含む。
本発明で使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）をさらに含むことができる。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸など；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含むことができる。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書でさらに記載されている。
抗ＰＤ−１抗体およびその組成物はまた、作用物質の有効性を増強および／または補完するように機能を果たす他の作用物質と併せて使用し、または別個に、同時に、もしくは順次投与することができる。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む、医薬組成物を含めた組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
ＰＤ−１によって媒介される状態を予防または治療するための方法
本発明の抗体および抗体コンジュゲートは、それだけに限らないが、治療的処置方法および診断的処置方法を含めた、様々な用途で有用である。
一態様では、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、対象におけるがんを治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＰＤ−１抗体のいずれかを含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）を投与するステップを含む。本明細書において、がんとしては、それだけに限らないが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、大腸がん、食道がん、胃がん、神経膠芽腫、神経膠腫、脳腫瘍、頭頸部がん、腎がん、肺がん、口腔がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、子宮がん、骨がん、白血病、リンパ腫、肉腫（ｓａｃｒｃｏｍａ）、血液がん、甲状腺がん、胸腺がん、眼がん、および皮膚がんがある。一部の実施形態では、対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＰＤ−１抗体またはＰＤ−１抗体コンジュゲートを含む有効量の組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を発現しない。他の実施形態では、対象におけるがん細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＰＤ−１抗体のいずれかを含む有効量の組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。他の実施形態では、対象における腫瘍の退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＰＤ−１抗体のいずれかを含む有効量の組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。
別の態様では、がんを検出、診断、および／または監視する方法が提供される。例えば、本明細書に記載のＰＤ−１抗体は、造影剤および酵素−基質標識などの検出可能部分で標識することができる。本明細書に記載の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング（例えば、ＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴ）などのｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイ、または染色試薬に使用することもできる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、追加の形態の療法で対象を治療するステップをさらに含む。一部の実施形態では、追加の形態の療法は、それだけに限らないが、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、および／または追加の免疫療法を含めた追加の抗がん療法である。
本明細書に記載のすべての方法に関して、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体への言及は、１種または複数の追加の作用物質を含む組成物も含む。これらの組成物は、当技術分野で周知である、緩衝剤を含めた薬学的に許容できる賦形剤などの適当な賦形剤をさらに含み得る。本発明は、単独で、または治療の他の方法と組み合わせて使用することができる。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、任意の適当な経路を介して対象に投与することができる。本明細書に記載の例は、利用可能な技法を限定するように意図されておらず、例示するものであるように意図されていることが当業者に明らかであるはずである。したがって、一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、公知の方法、例えば、ボーラスのような静脈内投与、またはある時間にわたる持続注入によるもの、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液包内や、ガス注入を介した、クモ膜下、経口、吸入、または局部的の経路によるものなどに合わせて対象に投与される。投与は、全身的、例えば、静脈内投与であっても、局在的であってもよい。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた液体製剤用市販噴霧器は、投与に有用である。液体製剤を直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末を再構成後に噴霧することができる。代わりに、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を使用してエアロゾル化することができ、凍結乾燥し、粉砕した粉末として吸入することができる。
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、部位特異的、または標的化局所的送達技法を介して投与される。部位特異的、または標的化局所的送達技法の例としては、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の様々な移植可能なデポー源、または局所的送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、もしくはニードルカテーテルなど、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントもしくは他の埋め込み型デバイス、部位特異的担体、直接注入、または直接塗布がある。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の様々な製剤が投与のために使用され得る。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、そのまま投与することができる。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体および薬学的に許容できる賦形剤は、様々な製剤中に存在し得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当技術分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を促進する相対的に不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは粘稠度を与え、または希釈剤として作用することができる。適当な賦形剤としては、それだけに限らないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変更するための塩、封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透エンハンサーがある。非経口および非腸管外の（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物送達用賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に示されている。
一部の実施形態では、これらの作用物質は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化される。したがって、これらの作用物質は、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および繰り返しは、特定の個体およびその個体の医療歴に依存することになる。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）によってを含めて、任意の適当な方法を使用して投与することができる。抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に記載するように、局部的に、または吸入を介して投与することもできる。一般に、抗ＰＤ−１抗体の投与に関して、最初の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明の目的に関して、一般的な１日投与量は、上述した要因に応じて、約３μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上のいずれかの範囲となり得る。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの投与量を使用することができる。状態に応じて数日間またはそれ以上にわたって投与を繰り返すことに関して、治療は、症状の所望の抑制が起こるまで、または例えば、がんに関連した症状を低減するのに十分な治療レベルが実現されるまで持続される。この療法の進行は、慣例的な技法およびアッセイによって容易に監視される。投薬レジメン（使用される抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を含む）は、経時的に変更することができる。
本発明の目的に関して、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の適切な投与量は、使用される抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体（またはその組成物）、治療される症状のタイプおよび重症度、作用物質が予防目的または治療目的に投与されるか否か、以前の療法、患者の病歴および作用物質に対する応答、投与される作用物質の患者のクリアランス速度、ならびに主治医の自由裁量に依存する。一般に、臨床医は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を、投与量が所望の結果を実現するものに到達するまで投与する。用量および／または頻度は、治療の過程にわたって変更することができる。半減期などの経験的な考慮事項は一般に、投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト免疫系と適合した抗体、例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などを、抗体の半減期を延ばし、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防止するために使用することができる。投与の頻度は、療法の過程にわたって決定および調整することができ、症状の治療および／または抑制および／または緩和および／または遅延に必ずではないが一般に基づく。代わりに、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の持続的連続的放出製剤が適切となり得る。徐放を実現するための様々な製剤およびデバイスが当技術分野で公知である。
一実施形態では、アンタゴニスト抗体の投与量は、アンタゴニスト抗体の１つまたは複数の投与を与えられた個体において経験的に決定され得る。個体は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の漸増投与量を与えられる。有効性を評価するために、疾患の指標をフォローすることができる。
本発明の方法による抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理的条件、投与の目的が治療的であるか、または予防的であるか、および熟練した開業医に公知の他の要因に応じて、連続的であっても、断続的であってもよい。抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の投与は、予め選択された時間にわたって本質的に連続的であってもよく、または間隔を置いた一連の投薬におけるものであってもよい。
一部の実施形態では、１種を超える抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体が存在する場合がある。少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる、またはそれ超のアンタゴニスト抗体が存在し得る。一般に、これらの抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、互いに悪影響しない相補的な活性を有し得る。抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、他の抗体および／または他の療法と併せて使用することもできる。抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、作用物質の有効性を増強および／または補完するように機能を果たす他の作用物質と併せて使用することもできる。
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、１種または複数の追加の治療剤の投与と組み合わせて投与することができる。これらとしては、それだけに限らないが、化学療法剤、ワクチン、ＣＡＲ−Ｔ細胞ベース療法、放射線療法、サイトカイン療法、抗ＰＤ−１二重特異性抗体、他の免疫抑制経路の阻害剤、血管新生の阻害剤、Ｔ細胞活性化因子、代謝経路の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤（ｉｎｈｉｔｏｒ）、アデノシン経路の阻害剤、それだけに限らないが、インライタ、ＡＬＫ阻害剤、およびスニチニブを含めたチロシンキナーゼ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、エピジェネティック調節剤、Ｔｒｅｇ細胞および／または骨髄由来抑制細胞の阻害剤または枯渇薬、ＪＡＫ阻害剤、ＳＴＡＴ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、生物治療剤（それだけに限らないが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ−４０Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびＩＣＯＳに対する抗体を含む）、免疫原性剤（例えば、減弱がん性細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸をパルスした樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）、およびそれだけに限らないが、ＧＭ−ＣＳＦなどの免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞）の投与がある。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）など；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなど；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールオメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９、およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンファイＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６（１９９４）を参照；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団（ｃｈｒｏｍｏｍｏｐｈｏｒｅｓ））、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；抗代謝産物、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクォン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサミトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２、２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、または誘導体がある。例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ファレストン）を含めた抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などの腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤；副腎におけるエストロゲン生成を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、およびアナストロゾールなど；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、または誘導体も含まれる。
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、免疫チェックポイントモジュレーターを標的にする１種または複数の他の治療剤、例えば、限定することなく、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ８、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ２２６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ４、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｈ１）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、４−ＢＢＬ、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０）、ＳＬＡＭＦ２（ＣＤ４８）、ＳＬＡＭＦ３（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４、ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ５（ＣＤ８４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ）、ＳＬＡＭＣＦ７（ＣＳ１）、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＡＭＦ９（ＣＤ２Ｆ）、ＣＤ２８、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１−３ＡＳ、ＣＥＡＣＡＭ３Ｃ２、ＣＥＡＣＡＭ１−１５、ＰＳＧ１−１１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｃ１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｓ、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｌ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＣＲ２、ＣＤ３９−ＣＤ７３−アデノシン経路（Ａ２ＡＲ）、ＢＴＫ、ＴＩＫ、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ５、ＶＥＧＦ経路、ＣＳＦ−１、または自然免疫応答モジュレーターを標的にする作用物質などと併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体、例えば、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）およびＭＰＤＬ３２８０Ａなど；抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブなど；抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体、例えば、イピリムマブなど；抗ＬＡＧ−３アンタゴニスト抗体、例えば、ＢＭＳ−９８６０１６およびＩＭＰ７０１など；抗ＴＩＭ−３アンタゴニスト抗体；抗Ｂ７−Ｈ３アンタゴニスト抗体、例えば、ＭＧＡ２７１など；抗ＶＩＳＴＡアンタゴニスト抗体；抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アンタゴニスト抗体；抗ＣＤ８０抗体；抗ＣＤ８６抗体；抗Ｂ７−Ｈ４アンタゴニスト抗体；抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アゴニスト抗体；自然免疫応答モジュレーター（例えば、ＴＬＲ、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ）、ならびにＩＤＯ阻害剤と併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、例えば、ＰＦ−０５０８２５６６またはＢＭＳ−６６３５１３などと併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、例えば、抗ＯＸ−４０アゴニスト抗体などのＯＸ４０アゴニストと併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体など、例えば、限定することなくＴＲＸ５１８などと併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、ＩＤＯ阻害剤と併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、サイトカイン療法、例えば、限定することなく、ＩＬ−１５、ＣＳＦ−１、ＭＣＳＦ−１などと併せて使用される。
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、１種または複数の他の治療抗体、例えば、限定することなく、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ５２、またはＣＣＲ４を標的にする抗体などと併せて使用される。
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体療法は、数分〜数週間の範囲の間隔によって他の作用物質治療に先行し、またはそれに続く場合がある。他の作用物質および／またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドが別個に投与される実施形態では、一般に、著しい時間がそれぞれの送達間で経過せず、その結果本発明の作用物質および組成物が依然として対象に有利に組み合わされた効果を発揮することができることを保証するはずである。このような場合では、両モダリティーを互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に投与することができることが企図される。いくつかの状況では、投与の時間を大きく延長することが望ましい場合があるが、この場合、数日（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）がそれぞれの投与間で経過する。
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体組成物は、クリゾチニブ、パルボシクリブ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、フォルフォックス、ホリン酸、オキサリプラチン、アキシチニブ、スニチニブリンゴ酸塩、トファシチニブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブ（ｔｒａｚｔｕｚｕｍａｂ）から選択される第２の作用物質を含む。
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体組成物は、手術、放射線療法、化学療法、標的療法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、および緩和ケアからなる群から選択される伝統的な療法をさらに含む治療レジメンと組み合わされる。
がんのワクチンベース免疫療法レジメンにおけるＰＤ−１抗体の使用
一部の特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物、特にヒトにおけるがんを治療するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強するための方法であって、ワクチンを受けている哺乳動物に、有効量の本開示によって提供される抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を投与するステップを含む、方法を提供する。一部の他の特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物、特にヒトにおけるがんを治療するための方法であって、哺乳動物に、（１）有効量のがんの細胞に対して免疫応答を誘発することができるワクチン、および（２）有効量の本開示によって提供される抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を投与するステップを含む、方法を提供する。哺乳動物における新生物障害を治療する方法、および上記で本明細書に記載の哺乳動物における新生物障害を治療するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強する方法は、「がんのワクチンベース免疫療法レジメン」（または「がんのＶＢＩＲ」）と総称して呼ばれる。
がんのＶＢＩＲでは、ワクチンは、任意の形態または製剤、例えば、（ｉ）細胞ベースワクチン、（ｉｉ）サブユニットワクチン、（ｉｉｉ）タンパク質ベースワクチン、（ｉｖ）ペプチドベースワクチン、または（ｖ）核酸ベースワクチン（ＤＮＡベースワクチン、ＲＮＡベースワクチン、プラスミドベースワクチン、もしくはウイルスベクターベースワクチンなど）などであり得る。
本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲは、任意のタイプのがんに適用可能であり得る。具体的ながんの例としては、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、胃がん、消化器がん、腎がん（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん、肝がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎がん（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、多形性神経膠芽腫、子宮頸がん、膀胱がん、乳がん、および頭頸部がんがある。
がんの治療を意図されたワクチンは、典型的には、標的腫瘍の細胞上でまたはその細胞によって発現される特定のＴＡＡに対する免疫応答を誘発することができる抗原（ペプチド、タンパク質、細胞コンポーネント、全細胞、またはペプチドベース抗原をコードする核酸分子の形態での）を含有する。多くのＴＡＡが当技術分野で公知である。公知のＴＡＡの例としては、前立腺がんについてＰＳＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＭＡ；結腸直腸がんについてＣＥＡ、ＭＵＣ−１、Ｅｐ−ＣＡＭ、５Ｔ４、ｈＣＧ−ｂ、Ｋ−ｒａｓ、およびＴＥＲＴ；卵巣がんについてＣＥＡ、Ｍｕｃ−１、ｐ５３、メソテリン、サバイビン、およびＮＹ−ＥＳＯ−１；非小細胞肺がんについてＭｕｃ−１、５Ｔ４、ＷＴ−１、ＴＥＲＴ、ＣＥＡ、ＥＧＦ−Ｒ、およびＭＡＧＥ−Ａ３；腎細胞癌について５Ｔ４；ならびに膵がんについてＭｕｃ−１、メソテリン、Ｋ−Ｒａｓ、アネキシンＡ２、ＴＥＲＴ、およびＣＥＡがある。一部の特定の実施形態では、本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲにおいて使用されるワクチンは、
（１）ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＴＥＲＴ、メソテリン、ＥＧＦ−Ｒ、またはＭＡＧＥ−Ａ３から選択されるＴＡＡに対して免疫応答を誘発することができるワクチン；
（２）ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＴＥＲＴ、メソテリン、ＥＧＦ−Ｒ、またはＭＡＧＥ−Ａ３から選択されるＴＡＡに由来するペプチド抗原を含有するワクチン；および
（３）ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＴＥＲＴ、メソテリン、ＥＧＦ−Ｒ、またはＭＡＧＥ−Ａ３から選択されるＴＡＡに由来するペプチド抗原をコードする核酸分子を含有するワクチン
からなる群から選択される。
さらに他の特定の実施形態では、ワクチンは、ＰＳＡに由来する１種もしくは複数の免疫原性ポリペプチド、ＰＳＣＡに由来する１種もしくは複数の免疫原性ポリペプチド、またはＰＳＭＡに由来する１種もしくは複数の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子を含有する。
特定の実施形態では、核酸分子は、
（１）配列番号４２のヒトＰＳＭＡに由来する免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子；
（２）配列番号４２のアミノ酸１５〜７５０を含む免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子；
（３）配列番号４３のヌクレオチド配列またはその縮重バリアントを含む核酸分子；
（４）配列番号４４のヌクレオチド配列またはその縮重バリアントを含む核酸分子；
（５）配列番号４５のヌクレオチド配列またはその縮重バリアントを含む核酸分子；
（６）配列番号４６のヌクレオチド配列またはその縮重バリアントを含む核酸分子；
（７）配列番号４７のヒトＰＳＡに由来する免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子；
（８）配列番号４７のアミノ酸２５〜２６１を含む免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子；
（９）配列番号４８のヒトＰＳＣＡに由来する免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子；
（１０）（ｉ）配列番号４２のヒトＰＳＭＡに由来する免疫原性ポリペプチド；（ｉｉ）配列番号４７のヒトＰＳＡに由来する免疫原性ポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号４８のヒトＰＳＣＡに由来する免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子；ならびに
（１１）（ｉ）配列番号４２のアミノ酸１５〜７５０を含む免疫原性ポリペプチド、（ｉｉ）配列番号４７のアミノ酸２５〜２６１を含む免疫原性ポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号４８の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群から選択される。
前立腺関連抗原に由来する１種または複数の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子は、プラスミドまたはベクターの形態であり得る。このようなプラスミドの例は、配列番号４６の核酸コンストラクトである（プラスミド４５８とも呼ばれる）。ヒトＰＳＭＡに由来する免疫原性ポリペプチドを発現するベクターのヌクレオチド配列は、配列番号４４に示されている（ベクターＡｄＣ６８Ｗとも呼ばれる）。ヒトＰＳＭＡに由来する免疫原性ポリペプチド、ヒトＰＳＡに由来する免疫原性ポリペプチド、およびヒトＰＳＣＡに由来する免疫原性ポリペプチドを発現するベクターのヌクレオチド配列は、配列番号４５に示されており、ベクターヒトＰＳＭＡ（ベクターＡｄＣ６８Ｗ−７３４）である。ヒトＰＳＭＡ、ＰＳＡ、およびＰＳＣＡに由来する様々な免疫原性ポリペプチド、このような免疫原性ポリペプチドをコードする核酸コンストラクト（プラスミドおよびベクターを含む）、ならびに免疫原性ポリペプチドならびにプラスミド４５８、ならびにベクターＡｄＣ６８ＷおよびＡｄＣ６８Ｗ−７３４を含めた核酸コンストラクトを調製するための方法は、国際出願公開第ＷＯ２０１３／１６４７５４号ならびに同第ＷＯ２０１５／０６３６４７号に開示されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
一態様では、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合する単離アンタゴニスト抗体であって、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離アンタゴニスト抗体を提供する。
本開示で開示される任意の抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を、がんのＶＢＩＲにおいて使用することができる。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体は、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号３、４、５、もしくは６に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にない残基中に１つもしくはいくつかの保存的アミノ酸置換を有するバリアントを含み、ＶＬ領域は、配列番号２、７、８、もしくは９に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１つもしくはいくつかのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３９に示した配列を含む軽鎖および／または配列番号２９もしくは３８に示した配列を含む重鎖を含む。一部の特定の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１１８３を有する発現ベクターによって産生されるＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１１８２を有する発現ベクターによって産生されるＶＬ領域を含む。
本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲは、１種または複数の他の免疫モジュレーターをさらに含み得る（本開示によって提供されるＰＤ−１アンタゴニスト抗体に加えて）。他の免疫モジュレーターは、免疫効果細胞エンハンサー（「ＩＥＣエンハンサー」）または免疫抑制細胞阻害剤（「ＩＳＣ阻害剤」）であり得る。追加のＩＥＣエンハンサーまたは追加のＩＳＣ阻害剤は、がんのＶＢＩＲと組み合わせて単独で使用することができる。追加のＩＥＣエンハンサーおよび追加のＩＳＣ阻害剤は、がんのＶＢＩＲと組み合わせて一緒に使用することもできる。
ＩＳＣ阻害剤のクラスの例としては、プロテインキナーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）阻害剤、およびＤＮＡ架橋剤がある。ＣＯＸ−２阻害剤の例としては、セレコキシブおよびロフェコキシブがある。ＰＤＥ５阻害剤の例としては、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィル、およびザプリナストがある。ＤＮＡ架橋剤の例は、シクロホスファミドである。用語「プロテインキナーゼ阻害剤」は、プロテインキナーゼの選択的または非選択的阻害剤として作用する任意の物質を指す。がんのＶＢＩＲにおいて使用するのに適した具体的なプロテインキナーゼ阻害剤の例としては、ラパチニブ、ＡＺＤ２１７１、ＥＴ１８ＯＣＨ３、インジルビン−３’−オキシム、ＮＳＣ−１５４０２０、ＰＤ１６９３１６、ケルセチン、ロスコビチン、トリシリビン、ＺＤ１８３９、５−ヨードツベルシジン、アダホスチン、アロイシン、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＲＲＹ−３３４５４３、アキシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）、ＡＹ−２２９８９、ＡＺＤ２１７１、ビスインドリルマレイミドＩＸ、ＣＣｌ−７７９、ケレリトリン、ＤＭＰＱ、ＤＲＢ、エデルホシン、ＥＮＭＤ−９８１６９３、エルブスタチン類似体、エルロチニブ、ファスジル、ゲフィチニブ（ＺＤ１８３９）、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ルテオリン、ＬＹ２９４００２、ＬＹ−２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＭＬＮ６０８、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシンドールＩ、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ９８０５９、フロリジン、ピセアタンノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＰＴＫ７８７／ＺＫ−２２２５８４、プルバラノールＡ、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ５４１６、ＳＵ５４１６（セマキサニブ）、ＳＵ６６５６、ＳＵ６６６８、ｓｙｋ阻害剤、ＴＢＢ、ＴＣＮ、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、Ｕ０１２６、Ｗ−７、ワートマニン、Ｙ−２７６３２、ザクティマ（ＺＤ６４７４）、ＺＭ２５２８６８、ゲフィチニブ（イレッサ．ＲＴＭ．）、スニチニブリンゴ酸塩（ＳＵＴＥＮＴ；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、イマチニブ（グリベック．ＲＴＭ．；ＳＴＩ５７１）、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ；ＺＤ６４７４）、およびニロチニブがある。
一部の特定の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブリンゴ酸塩、ソラフェニブトシル酸塩、またはアキシチニブである。スニチニブリンゴ酸塩は、商標名ＳＵＴＥＮＴの下でＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．によって販売されており、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリジン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドとのブタン二酸、ヒドロキシ−、（２Ｓ）−化合物（１：１）として化学的に記述される。この化合物、その合成、および特定の多形は、米国特許第６，５７３，２９３号に記載されている。スニチニブリンゴ酸塩は、切除不能な局所進行または転移性疾患を有する患者における消化管間質腫瘍、進行腎細胞癌、および進行性高分化型膵神経内分泌腫瘍の治療のために米国において承認された。ヒトに対する消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）および進行腎細胞癌（ＲＣＣ）のためのスニチニブリンゴ酸塩の推奨用量は、５０ｍｇであり、治療に４週間、その後の２週間のオフのスケジュール（スケジュール４／２）で１日１回経口服用される。膵神経内分泌腫瘍のためのリンゴ酸スニチニブの推奨用量は、３７．５ｍｇであり、１日１回経口服用される。がんのＶＢＩＲでは、スニチニブリンゴ酸塩は、単回用量または複数回用量で経口投与することができる。典型的には、スニチニブリンゴ酸塩は、２、３、４、またはそれ超の連続した毎週用量について送達され、その後、スニチニブリンゴ酸塩が送達されない約１もしくは２週間またはそれ超の「オフ」期間が続く。一実施形態では、用量は、約４週間送達され、２週間のオフを伴う。ヒトに経口投与されるスニチニブリンゴ酸塩の有効量は、典型的には、１日当たり１人当たり４０ｍｇ未満、例えば、１日当たり１人当たり３７．５、３１．２５、２５、１８．７５、１２．５、または６．２５ｍｇなどである。一部の実施形態では、スニチニブリンゴ酸塩は、１日当たり１人当たり１〜２５ｍｇの範囲内で経口投与される。一部の他の実施形態では、スニチニブリンゴ酸塩は、１用量当たり１人当たり６．２５、１２．５、または１８．７５ｍｇの範囲内で経口投与される。他の投薬レジメンおよびバリエーションも予見でき、医師のガイダンスによって決定されることになる。
ソラフェニブトシル酸塩は、商標名ＮＥＸＡＶＡＲの下で販売されており、４−（４−｛３−［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド｝フェノキシ）−Ｎ−メチルピリド−イン−２−カルボキサミドである化学名を有する。これは、原発性腎がん（進行腎細胞癌）および進行原発性肝がん（肝細胞癌）の治療のために米国で承認されている。推奨一日用量は、４００ｍｇであり、１日２回経口服用される。本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲでは、経口投与されるソラフェニブトシル酸塩の有効量は、典型的には、１日当たり１人当たり４００ｍｇ未満である。一部の実施形態では、経口投与されるソラフェニブトシル酸塩の有効量は、１日当たり１人当たり１０〜３００ｍｇの範囲内である。いくつかの他の実施形態では、経口投与されるソラフェニブトシル酸塩の有効量は、１日当たり１人当たり１０〜２００ｍｇの間、例えば、１日当たり１人当たり１０、２０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００ｍｇなどである。
アキシチニブは、商標名ＩＮＬＹＴＡの下で販売されており、（Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドである化学名を有する。これは、１つの先の全身療法の失敗後の進行腎細胞癌の治療のために承認されている。出発用量は、１日２回経口的に５ｍｇである。用量調整は、個体の安全性および耐容性に基づいて行うことができる。本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲでは、経口投与されるアキシチニブの有効量は、典型的には１日２回５ｍｇ未満である。いくつかの他の実施形態では、経口投与されるアキシチニブの有効量は、１日２回１〜５ｍｇの間である。一部の他の実施形態では、経口投与されるアキシチニブの有効量は、１日２回１、２、３、４、または５ｍｇの間である。
本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲにおいて使用され得るＩＥＣエンハンサーの例としては、ＴＮＦＲアゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、他のＰＤ−１アンタゴニスト（ＢＭＳ−９３６５５８および抗ＰＤ−１抗体ＣＴ−０１１など）、プログラム細胞死タンパク質１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）アンタゴニスト（ＢＭＳ−９３６５５９など）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）アンタゴニスト、ならびにＴ細胞免疫グロブリン−およびムチン−ドメイン含有分子−３（ＴＩＭ−３）アンタゴニストがある。ＴＮＦＲアゴニストの例としては、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＢＭＳ−６６３５１３など）、ＧＩＴＲ（ＴＲＸ５１８など）、およびＣＤ４０のアゴニストがある。具体的なＣＤ４０アゴニストの例は、以下で本明細書に詳細に記載されている。
ある特定の他の実施形態では、追加の免疫モジュレーターは、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体である。抗体は、ヒト、ヒト化、または部分ヒトキメラ抗ＣＤ４０抗体であり得る。具体的な抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の例としては、Ｇ２８−５、ｍＡｂ８９、ＥＡ−５、またはＳ２Ｃ６モノクローナル抗体、およびＣＰ８７０８９３がある。特定の実施形態では、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体は、ＣＰ８７０８９３またはダセツズマブ（ＳＧＮ−４０）である。
ＣＰ−８７０，８９３は、抗腫瘍療法として臨床的に調査されている完全ヒトアゴニストＣＤ４０モノクローナル抗体である。ＣＰ８７０，８９３の構造および調製は、ＷＯ２００３０４０１７０に開示されており、この中で抗体ＣＰ８７０，８９３は、抗体「２１．４．１」として識別されている。ＣＰ−８７０，８９３の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６および配列番号４８に、ならびにＷＯ２００３０４０１７０の表７に示されている。臨床試験では、ＣＰ８７０，８９３は、一般に注入１回当たり０．０５〜０．２５ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量で静脈内注入によって投与された。本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲにおいて、ＣＰ−８７０，８９３は、皮内、皮下、または局部的に投与することができる。レジメンにおいて投与されるＣＰ８７０８９３の有効量は、一般に０．２ｍｇ／ｋｇ未満、典型的には０．０１ｍｇ〜０．１５ｍｇ／ｋｇまたは０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
ダセツズマブ（ＳＧＮ−４０またはｈｕＳ２Ｃ６としても公知；ＣＡＳ番号８８−４８６−５９−９）は、緩慢性リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫のための臨床試験において調査されている別の抗ＣＤ４０アゴニスト抗体である。本開示によって提供されるがんのＶＢＩＲにおいて、ダセツズマブは、皮内、皮下、または局部的に投与することができる。投与されるダセツズマブの有効量は、一般に１６ｍｇ／ｋｇ未満、典型的には０．２ｍｇ〜１４ｍｇ／ｋｇまたは０．５〜８ｍｇ／ｋｇ、または１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
さらに他の実施形態では、追加の免疫モジュレーターは、抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニストである。適当な抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの例としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体（ヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体、マウス抗ＣＴＬＡ−４抗体、哺乳動物抗ＣＴＬＡ−４抗体、ヒト化抗ＣＴＬＡ−４抗体、モノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体、ポリクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体、キメラ抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＴＬＡ−４ドメイン抗体など）、および共刺激経路をアゴナイズするＣＴＬＡ−４の阻害剤がある。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブまたはトレメリムマブである。
イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹとして販売されている；ＭＥＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１としても、またはそのＣＡＳ登録番号４７７２０２−００−９によっても公知）は、その全体においてかつすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号において抗体１０ＤＩとして開示されている。イピリムマブを含む医薬組成物の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／６７９５９号において提供されている。イピリムマブは、切除不能または転移性黒色腫の治療のために米国で承認されている。本発明によって提供される方法では、イピリムマブは、皮内または皮下に投与することができる。局所的に投与されるイピリムマブの有効量は、１人当たり５〜２００ｍｇ／用量の範囲内である。一部の実施形態では、イピリムマブの有効量は、１用量当たり１人当たり１０〜１５０ｍｇ／用量の範囲内である。一部の特定の実施形態では、イピリムマブの有効量は、１人当たり約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｍｇ／用量である。
トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６としても公知）は、完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であり、ＣＡＳ番号７４５０１３−５９−６を有する。トレメリムマブは、その全体においてかつすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，６８２，７３６号において抗体１１．２．１として開示されている。本発明によって提供されるがんのＶＢＩＲにおいて、トレメリムマブは、静脈内、皮内、または皮下に投与することができる。皮内または皮下に投与されるトレメリムマブの有効量は、典型的には１人当たり５〜２００ｍｇ／用量の範囲内である。一部の実施形態では、トレメリムマブの有効量は、１用量当たり１人当たり１０〜１５０ｍｇ／用量の範囲内である。一部の特定の実施形態では、トレメリムマブの有効量は、１人当たり約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｍｇ／用量である。
さらに他の実施形態では、追加の免疫モジュレーターは、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。用語「トール様受容体アゴニスト」または「ＴＬＲアゴニスト」は、トール様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストとして作用する化合物を指す。これには、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、およびＴＬＲ１１、またはこれらの組合せのアゴニストが含まれる。
本発明の方法において有用なＴＬＲアゴニストには、低有機分子および大生物学的分子の両方が含まれる。低分子ＴＬＲアゴニストの例としては、４−アミノ−アルファ、アルファ，２−トリメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］クモリン（ｑｕｍｏｌｉｎ）−１−エタノール、Ｎ−（２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ−｝エチル）−Ｎ−メチルモルホリン−４−カルボキサミド、１−（２−アミノ−２−メチルプロピル）−２−（エトキシメチル−）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アルニン（ａｒｎｉｎｅ）、Ｎ−［４−（４−アミノ−２−エチル−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］メタンスルホンアミド、Ｎ−［４−（４−アミノ−２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］メタンスルホンアミド、およびイミキモドがある。本開示によって提供される方法またはレジメンにおいて特に有用ないくつかＴＬＲアゴニストは、総説：Ｆｏｌｋｅｒｔ Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎら：ＴＬＲ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２９（２０１１）：３３４１〜３３５５に論じられている。一部の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９アゴニスト、特にＣｐＧオリゴヌクレオチド（またはＣｐＧ．ＯＤＮ）である。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、シトシンのピリミジン環がメチル化されていないリン酸結合によって連結されたシトシンその後のグアニンを含有する短い核酸分子である。本開示によって提供される方法において有用な特定のＣｐＧオリゴヌクレオチドの例としては、
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（ＣｐＧ７９０９；配列番号４９）；
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（ＣｐＧ２４５５５；配列番号５０）；および
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（ＣｐＧ１０１０３；配列番号５１）がある。
ＣｐＧ７９０９、合成２４ｍｅｒ一本鎖は、単剤療法として、化学療法剤ならびにがんおよび感染疾患に対するワクチンのアジュバントと組み合わせてがんを治療するために広範に調査されている。本開示によって提供される方法では、ＣｐＧ７９０９は、筋肉内への注射または任意の他の適当な方法によって投与することができる。ＤＮＡワクチンなどの核酸ベースワクチンとともに使用するために、ＣｐＧを単一製剤でワクチンとともに共製剤化し、電気穿孔と一緒にされた筋肉内注射によって投与することができる。筋肉内、皮内、または皮下投与によるＣｐＧ７９０９の有効量は、典型的には１０μｇ／用量〜１０ｍｇ／用量の範囲内である。一部の実施形態では、ＣｐＧ７９０９の有効量は、０．０５ｍｇ〜１４ｍｇ／用量の範囲内である。一部の特定の実施形態では、ＣｐＧ７９０９の有効量は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１ｍｇ／用量である。ＣｐＧ２４５５５およびＣｐＧ１０１０３を含めた他のＣｐＧオリゴヌクレオチドも、同様の様式および用量レベルで投与することができる。
がんのＶＢＩＲにおいて、抗ＰＤ−１アンタゴニスト、ワクチン、および追加の免疫モジュレーターは、同時にまたは順次投与することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体に関して順次投与されるが、１種または複数の追加の免疫モジュレーターに関して同時に（例えば、混合物で）投与される。核酸ワクチンがＣｐＧと組み合わせて投与される場合では、ワクチンおよびＣｐＧを単一製剤中に閉じ込め、任意の適当な方法によって一緒に投与することできる。一部の実施形態では、共製剤（混合物）中の核酸ワクチンおよびＣｐＧは、電気穿孔と組み合わせて筋肉内注射によって投与される。
製剤
本発明によって使用される抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の治療製剤は、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、所望の程度の純度を有する抗体を、任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００）と混合することによって、貯蔵用に調製することができる。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸など；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含むことができる。
抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号、および同第４，５４４，５４５号に記載されたものなどの、当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生じるように、規定孔サイズのフィルターを通して押し出される。
活性成分は、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）内で、またはマクロエマルジョン内で、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入することもできる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示されている。
徐放配合物を調製することができる。徐放配合物の適当な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）など、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。治療用抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体組成物は一般に、滅菌したアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアル内に入れられる。
本発明による組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくはガス注入による投与のための単位剤形、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤もしくは懸濁剤、または坐剤などであり得る。
錠剤などの固体組成物を調製するために、主な活性成分は、薬学的担体、例えば、慣例的な錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはガムなど、および他の薬学的希釈剤、例えば、水と混合されて、本発明の化合物、または無毒性の薬学的に許容できるその塩の均質な混合物を含有する固体予備製剤組成物が形成される。これらの予備製剤組成物が均質であるという場合、活性成分が組成物全体にわたって均等に分散されており、その結果、組成物が同様に有効な単位剤形、例えば、錠剤、丸剤、およびカプセル剤などに容易にさらに分割され得ることを意味する。次いで、この固体予備製剤組成物は、約０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上述したタイプの単位剤形にさらに分割される。新規組成物の錠剤または丸剤は、持続性作用の利点をもたらす剤形を提供するために、被覆または他の方法で調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投与および外側投与コンポーネントを含むことができ、後者は、前者の上の外被の形態である。２つのコンポーネントは、胃内での崩壊に耐える機能を果たし、内側コンポーネントがインタクトで十二指腸内に入り、または放出が遅延されることを可能にする腸溶性層によって分離することができる。様々な材料を、このような腸溶性層または被覆に使用することができ、このような材料には、多数のポリマー酸ならびにシェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料とのポリマー酸の混合物が含まれる。
適当な表面活性剤としては、特に、非イオン性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）、および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）などがある。表面活性剤を含む組成物は、好都合には、０．０５〜５％の間の表面活性剤を含むことになり、０．１〜２．５％の間であり得る。必要であれば、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルを添加することができることが理解されるであろう。
適当なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などを使用して調製することができる。活性成分を、予備混合エマルジョン組成物中に溶解させることができ、または代わりに、活性成分を、油（例えば、ダイズ油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、または扁桃油）、ならびにリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、またはダイズレシチン）および水と混合して形成されたエマルジョン中に溶解させることができる。エマルジョンの張性を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが理解されるであろう。適当なエマルジョンは一般に、最大２０％の油、例えば、５〜２０％の間の油を含有することになる。脂肪エマルジョンは、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの間の脂肪滴を含み、５．５〜８．０の範囲内のｐＨを有することができる。
エマルジョン組成物は、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはそのコンポーネント（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されるものであり得る。
吸入またはガス注入用組成物は、薬学的に許容できる水性溶媒もしくは有機溶媒、またはこれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末を含む。液体または固体組成物は、上記に示した適当な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物は、局所的または全身的効果のために、経口呼吸経路または鼻呼吸経路によって投与される。好ましくは滅菌した薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、ガスを使用して霧状化することができる。霧状化溶液は、噴霧器から直接吸い込むことができ、または噴霧器をフェイスマスク、テント、もしくは間欠的陽圧呼吸機に取り付けてもよい。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから、好ましくは経口的または経鼻的に投与することができる。
キット
本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれかまたはすべてを含むキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を含む１つまたは複数の容器、および本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従って使用するための指示書を含む。一般に、これらの指示書は、上述した治療的処置のための抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の投与の記述を含む。一部の実施形態では、キットは、単回用量投与ユニットを生成するために提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。ある特定の実施形態では、シングルおよびマルチチャンバー型プレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含有するキットが含まれる。
一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗ＰＤ−１抗体の使用に関する指示書は、一般に、意図された治療のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、マルチドーズパッケージ）、またはサブユニット用量のものであり得る。本発明のキット内に供給される指示書は、一般に、ラベルまたは添付文書（例えば、キット内に含まれる紙シート）での書面による指示書であるが、機械可読な指示書（例えば、磁気または光記憶ディスクで携帯される指示書）も許容できる。
本発明のキットは、適当な包装内にある。適当な包装としては、それだけに限らないが、バイアル、ボトル、広口瓶、フレキシブル包装（例えば、密封されたマイラーバッグまたはビニール袋）などがある。特定のデバイス、例えば、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザ）、またはミニポンプなどの注入デバイスなどと組み合わせて使用するためのパッケージも企図されている。キットは、滅菌したアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器も、滅菌したアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、抗ＰＤ−１抗体である。容器は、第２医薬活性剤をさらに含むことができる。
キットは、追加のコンポーネント、例えば、緩衝液および解釈情報などを任意選択により提供することができる。通常、キットは、容器、および容器上の、またはこれに付随したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
生物学的寄託
本発明の代表的な材料は、２０１４年４月２９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１１８２を有するベクターｍｓｂ７−ＬＣは、ｍＡｂ７軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１１８３を有するベクターｍａｂ７−ＨＣは、ｍＡｂ７重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその下の規定（ブダペスト条約）の条項下で行った。これにより、寄託日から３０年間、寄託物の生存培養が保証される。寄託物は、ブダペスト条約の条項、ならびにＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの契約の対象であって、関係する米国特許の発行の後、または米国もしくは外国特許出願の公共への公開の後のいずれか早い方に、公共に寄託物の培養の子孫の永続的および非制限的利用可能性を保証し、米国特許法第１２２条およびこれに準じた長官規則（８８６ＯＧ６３８を特に参照して連邦規則法典第３７巻第１．１４条を含む）によって、米国特許商標庁長官が権利を有すると決定したものへの子孫の利用可能性を保証する、契約の対象の下でＡＴＣＣによって利用可能にされることになる。
本願の代理人は、寄託した材料の培養物が、適当な条件下で培養されたとき、死滅し、または失われ、もしくは破壊された場合、通知された後、材料を別の同じものに即座に置き換えることに同意している。寄託した材料の利用可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って付与された権利に違反した本発明の実施のライセンスと解釈されるべきでない。
以下の実施例は、例示的な目的だけのために提供されており、本発明の範囲を決して限定するように意図されていない。実際に、本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の様々な修正形態が、前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に入る。
（実施例１）
ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ分泌に対する抗ＰＤ−１抗体の効果
本実施例は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ分泌に対する抗ＰＤ−１抗体の効果を例示する。
全血（スタンフォード大学血液銀行）から単離した初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ１４＋骨髄細胞に由来するＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを使用して以前に分化された高レベルのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現する同種樹状細胞（ＤＣ）によって活性化した。本試験では、以下の抗体を使用した：アイソタイプ対照（ＩｇＧ４κヒンジ安定化）、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体Ｃ１、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体Ｃ２、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体Ｃ３、ＥＨ１２．１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓマウス抗ヒト抗ＰＤ−１抗体、マウスアイソタイプＩｇＧ１κ）、ｍＡｂ７−Ｇ４、ｍＡｂ１５−Ｇ４、ｍＡｂ−ＡＡＡ、ｍＡｂ１５−ＡＡＡ（Ｇ４＝ＩｇＧ４ヒンジ安定化；ＡＡＡ＝ＦｃγＲに結合しない突然変異体ＩｇＧ１）。抗体を以下の濃度：０、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌで試験した。
ＭＬＲアッセイに関して、培養物を、１：１０のＤＣ：Ｔ細胞の比で、三つ組みで９６ウェルプレート中で試験または対照抗体とともにインキュベートし、加湿したインキュベーター内で、３７℃で５％のＣＯ２とともにインキュベートした。上清を５日目に回収し、以下のヒト分析物に対して製造者のプロトコールに従ってヒト可溶性タンパク質Ｆｌｅｘ Ｓｅｔシステムキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５８２６５）を使用して、細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用してサイトカインを測定した：ＩＦＮγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５８２６９）、ＴＮＦ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５８２７３）。簡単に言えば、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＳＢＶＮ１２５０）を洗浄緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ独自の配合）で洗浄し、真空マニホールドによって吸引した。キットによって提供された標準物質および試料をアッセイ希釈剤（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ独自配合）中に希釈し、捕捉ビーズ（別個の蛍光で被覆された特定の可溶性タンパク質に対する抗体で被覆されたビーズである）を有するプレートに添加した。プレートを、プレートシェーカーを使用して５００ｒｐｍで５分間混合し、室温で１時間インキュベートした。検出試薬（フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体、ｋによって提供された）をプレートに添加し、プレートを５分間混合した。プレートを室温で２時間インキュベートした。次いで緩衝液で５分間洗浄した。試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａプラットフォーム上で得た。データを、ＦＣＡＰアレイｖ３（ＢＤ）を使用して分析した。ＭＬＲアッセイの結果を以下の表６ＡおよびＢに示す。表６Ａは、ＩＦＮγレベル（ｐｇ／ｍｌでの）を示し、表６Ｂは、ＴＮＦレベル（ｐｇ／ｍｌでの）を示す。データは、生物学的な三つ組の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして提示されている。試料は、１つのＭＬＲ実験の代表である。
Figure 2018503365
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活性化Ｔ細胞を抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置すると、アイソタイプ対照と比較してＩＦＮγレベルが増大した（表６Ａ）。例えば、０．１μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５−Ｇ４およびｍＡｂ７−Ｇ４で処置すると、それぞれ４７２８．２９５±２．０３５ｐｇ／ｍｌおよび８５６７．２０３±２０８５．８２６ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγレベルがもたらされた。１μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５−Ｇ４およびｍＡｂ７−Ｇ４で処置すると、それぞれ８８９３．５９５±３６５．１２５ｐｇ／ｍｌおよび１１８７６．８６±１２５９．７８８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγレベルがもたらされた。１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５−Ｇ４およびｍＡｂ７−Ｇ４で処置すると、それぞれ７７９０．９５±１７００．０１２ｐｇ／ｍｌおよび１１７９４．８２±１８２７．２４３ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγレベルがもたらされた。対照的に、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照で処置すると、それぞれ３７６０±３６７．４２６２ｐｇ／ｍｌ、３６９３．９７２±１０３３．８７９ｐｇ／ｍｌ、および３５２５．６５５±７４４．６７６ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγレベルがもたらされた。
活性化Ｔ細胞を抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置すると、アイソタイプ対照と比較してＴＮＦレベルが増大した（表６Ｂ）。例えば、０．１μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５−Ｇ４またはｍＡｂ７−Ｇ４で処置すると、それぞれ７４３．１１６７±５６．７５５４７ｐｇ／ｍｌおよび７３０．４７±３３．３５４８８ｐｇ／ｍｌのＴＮＦレベルがもたらされた。１μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５−Ｇ４およびｍＡｂ７−Ｇ４で処置すると、それぞれ６８６．３２±４５．６３３４８ｐｇ／ｍｌおよび７９３．０５±２１．１９０１９ｐｇ／ｍｌのＴＮＦレベルがもたらされた。１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５−Ｇ４またはｍＡｂ７−Ｇ４で処置すると、それぞれ７９８．８５３±９．１４３６６ｐｇ／ｍｌおよび９３０．６２３±１６．０４９４ｐｇ／ｍｌのＴＮＦレベルがもたらされた。対照的に、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照で処置すると、それぞれ４０７．４１３３±４９．５８１９５ｐｇ／ｍｌ、４８６．７１６７±４．４２４１ｐｇ／ｍｌ、および５０１．１７±５．０３３３３４ｐｇ／ｍｌのＴＮＦレベルがもたらされた。
これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７およびｍＡｂ１５が、抗ＰＤ−１抗体Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３と少なくとも同様に、またはこれらより良好にＴ細胞からのＩＦＮγおよびＴＮＦ分泌を刺激することを実証する。
第２のＭＬＲ試験を行って、Ｔ細胞活性化に対するより低い抗体濃度の効果を試験した。全血から単離した初代ヒトＴ細胞を上述の通り活性化した。以下の抗体：ｍＡｂ７（Ｇ４）、ｍＡｂ１５（Ｇ４）、Ｃ１（Ｇ４）、ＥＨ１２．１、およびＧ４アイソタイプ対照を第２の試験で試験した。以下の濃度：０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、および１０μｇ／ｍｌで抗体を試験した。ＭＬＲアッセイを上述の通り行った。結果を以下の表７Ａおよび７Ｂに要約する。
Figure 2018503365
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活性化Ｔ細胞を抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置すると、アイソタイプ対照と比較してＩＦＮγレベルが増大した（表７Ａ）。抗体を含まない培養物では、ＩＦＮγレベルは、９０１．４５３±２１６．４７２ｐｇ／ｍｌであった。０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体を与えた培養物では、ＩＦＮγレベルは、それぞれ５５８．９６２９±４８９．４８２８ｐｇ／ｍｌ、７５３．３７６７±２９１．６０９２ｐｇ／ｍｌ、１０７４．３７±３２４．２０３１ｐｇ／ｍｌ、１６６７．９６±１４４．７２８６ｐｇ／ｍｌ、１８６７．９６±２８２．７４６１ｐｇ／ｍｌ、２５０１．２９３±２２０．１８２９ｐｇ／ｍｌであった。対照的に、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ７（Ｇ４）で処置した培養物では、ＩＦＮγレベルは、それぞれ２０８２．０７±７２０．９９３１ｐｇ／ｍｌ、３０６２．０９±３７０．２７９１ｐｇ／ｍｌ、５０６７．８２３±１１１．４９０３ｐｇ／ｍｌ、７０８２．６６７±１３３６．０８２ｐｇ／ｍｌ、１１９２８．８１±１４５７．７２３ｐｇ／ｍｌ、１１８６２．１３±８００．５８６ｐｇ／ｍｌであった。０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５（Ｇ４）で処置した培養物では、ＩＦＮγレベルは、それぞれ１６７８．２７±２３３．８２ｐｇ／ｍｌ、１４１０．７５８±４３９．９４７４ｐｇ／ｍｌ、４７３４．４９±３２２．２０８７ｐｇ／ｍｌ、５４１６±１０５４．０７５ｐｇ／ｍｌ、９１４０．３３７±１３２０．４９９ｐｇ／ｍｌ、および１０９９２．１３±１００８．５３３ｐｇ／ｍｌであった。
活性化Ｔ細胞を抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置すると、アイソタイプ対照と比較してＴＦＮレベルが増大した（表７Ｂ）。抗体を含まない培養物では、ＴＮＦレベルは、３６５．５２３±８４．６６０７ｐｇ／ｍｌであった。０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体で処置した培養物では、ＴＮＦレベルは、それぞれ４５２．７１３３±６２．８５ｐｇ／ｍｌ、２８２．９２８７±５６．７７２６６ｐｇ／ｍｌ、３１０．９１４４±２１．７８１１ｐｇ／ｍｌ、３５８．９４８±８１．０９１２２ｐｇ／ｍｌ、３３８．１１０７±４６．８８３８５ｐｇ／ｍｌ、および３３１．００８±３１．３５５５９ｐｇ／ｍｌであった。対照的に、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ７（Ｇ４）で処置した培養物では、ＴＮＦレベルは、それぞれ２２７．６±５０．６３４３６ｐｇ／ｍｌ、３９４．４２３３±３０．４７００５ｐｇ／ｍｌ、４５２．６５±３０．６４３３５ｐｇ／ｍｌ、１０８９．３７７±１７４．７８２４ｐｇ／ｍｌ、１５８３．５２±２６７．２１３１ｐｇ／ｍｌ、および１４１９．８８±１０８．７１１ｐｇ／ｍｌであった。０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５（Ｇ４）を与えた培養物では、ＴＮＦレベルは、それぞれ４９４．７９６７±４８．１８１０ｐｇ／ｍｌ、４８９．２３３３±３０．６３３０２ｐｇ／ｍｌ、５９３．３４±６５．８７６２２ｐｇ／ｍｌ、８１１．１６±８９．５０２３８ｐｇ／ｍｌ、１１４３．５４±１３６．３９５４ｐｇ／ｍｌ、および１１０９．０６３±５７．７０２３２ｐｇ／ｍｌであった。
これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７およびｍＡｂ１５が、ＰＤ−１シグナル伝達を遮断し、初代ヒトＴ細胞からのＩＦＮγおよびＴＮＦ分泌を促進することを実証する。
（実施例２）
Ｔ細胞増殖に対する抗ＰＤ−１抗体の効果
本実施例は、Ｔ細胞増殖に対する抗ＰＤ−１抗体の効果を例示する。
本試験では、Ｔ細胞増殖をＭＬＲアッセイで測定し、このアッセイでは、Ｔ細胞を抗ＰＤ−１アンタゴニストまたはアイソタイプ対照抗体の存在下で培養した。
ＭＬＲに関して、全血（スタンフォード大学血液銀行から得た）から単離した初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ１４＋骨髄細胞に由来するＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを使用して以前に分化された高レベルのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現する同種樹状細胞（ＤＣ）によって活性化した。２つの実験を行った。
第１の実験では、ｍＡｂ７（ＩｇＧ４κヒンジ安定化）、ｍＡｂ１５（ＩｇＧ４κヒンジ安定化）、Ｃ１、ＥＨ１２．１、およびアイソタイプ対照を比較した。第２の実験では、クローンｍＡｂ７、ｍＡｂ１５、Ｃ２、ＥＨ１２．１、およびアイソタイプ対照を比較した。両実験において、抗体を以下の濃度：０、０．０００１；０．００１；０．０１；０．１；１、および１０μｇ／ｍｌで添加した。
両実験に関して、培養物を、１：１０のＤＣ：Ｔ細胞の比で、三つ組みで、９６ウェルプレート中で抗体とともにインキュベートし、加湿したインキュベーター内で、３７℃で５％のＣＯ２とともにインキュベートした。５日目に、培養物を１ウェル当たり１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンで１８時間パルスした後、回収した。次いでプレートを、ハーベスター９６（Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＤＮＡ特異的濾紙（ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上に回収した。放射標識フィルターをベータシンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で覆い、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）カウンタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。チミジン取り込みを１分当たりのカウント（ＣＰＭ）として分析した。結果を三つ組の平均±ＳＥＭとして示す。
Figure 2018503365
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活性化Ｔ細胞を０．０１μｇ／ｍｌ以上の濃度の抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置すると、アイソタイプ対照と比較してＴ細胞増殖が有意に増大した（表８Ａおよび８Ｂ）。
例えば、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ７で処置すると、それぞれ３６５６２５．３±３０１７１．０７ＣＰＭ、３８００５４．３±９７７４．３２８ＣＰＭ、３９２２５６．７±１５３４１．１９ＣＰＭ、および３７２８８９．７±１４８２６．４９ＣＰＭのチミジン取り込み率がもたらされた（表８Ｂ）。０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５−Ｇ４およびｍＡｂ７で処置すると、それぞれ３１７３７７±３１９１５．２９ＣＰＭ、３６０２２６．３±１８０２．６９ＣＰＭ、４２１２２９±２７８６５．１３ＣＰＭ、および３２３４４１．３±６４４７６．５５ＣＰＭのチミジン取り込み率がもたらされた（表８Ｂ）。対照的に、０．０１、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照で処置すると、それぞれ２７８０７２．３±３２６７１．６２ＣＰＭ、２６８９３９．７±１２３３２．０６ＣＰＭ、２４１１６４±１３７７６．８１ＣＰＭ、および２３１８９７．７±２５８６５．９５ＣＰＭのチミジン取り込み率がもたらされた（表８Ｂ）。
これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７およびｍＡｂ１５が、ＰＤ−１シグナル伝達を遮断し、初代ヒトＴ細胞の増殖を促進することを実証する。
（実施例３）
ＧｖＨＤのマウスモデルにおける抗ＰＤ−１抗体の効果
本実施例は、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）のマウスモデルにおけるＴ細胞増殖および体重減少に対する抗ＰＤ−１抗体の効果を例示する。
ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ−２受容体γ鎖ヌル（ＮＳＧ）マウスを本試験で使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞増殖に対する抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体の効果を試験した。ＮＳＧマウスは、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠き、損なわれたＮＫ細胞を有するので、ヒト細胞の高い生着が容易に実現される。ヒトＰＢＭＣがこれらのマウス中に生着されるとき、ヒトＴ細胞増殖が起こり、ＧｖＨＤを誘導する。ＧｖＨＤは、宿主およびヒト細胞の骨髄区画を伴う。ヒトリンパ球の大量増殖が早期に血液中で見ることができ、その後マウス臓器、例えば、肝臓、脾臓、腎臓、腸などへのこれらの細胞の高い浸潤が続き、マウスの体重減少、ならびに皮膚病変、丸まった背中、および死をもたらす。モデルの重症度は、ドナーＰＢＭＣに依存し、ドナー間で異なり得る。
本試験では、以下の抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体：ｍＡｂ７（ヒトＩｇＧ４ヒンジ安定化、またはＡＡＡ）、ｍＡｂ１５（ヒトＩｇＧ４ヒンジ安定化）、Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３を使用した。陰性対照に関して、アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ４ヒンジ安定化抗体を使用した。初代ヒトＰＢＭＣを、フィコール勾配を使用して全血（スタンフォード大学血液銀行）から単離した。１０７個のヒトＰＢＭＣをＮＳＧマウス（生後８週の雌、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に注射した。０日目に、マウスを体重に基づいてランダム化し、ＰＢＭＣを静脈内に注射した。実験１〜４に関して、２日目および８日目に、抗体を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。実験５に関して、２日目および８日目に、抗体を１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。表９は、それぞれの実験で使用した抗体を要約するものである。
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体重を定期的に測定した。結果を図１Ａ〜１Ｅに要約する。マウスを定期的に採血してＴ細胞増殖を評価した。抗ＰＤ−１抗体で処置すると、体重減少の速度によって測定した場合、疾患過程が加速した。対照マウスと比較して、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置したマウスは、より急速な体重減少を有した（図１Ａ〜１Ｅ）。
ヒトＴ細胞の増殖を、マーカーとしてＣＤ４５（クローンＨＩ３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーによって測定した。フローサイトメトリーを表１０で以下に要約する。Ｔ細胞増殖は、アイソタイプ対照で処置したマウスより抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体で処置したマウスにおいて高かった。より高いパーセンテージのＣＤ４５は、ＣＤ４５細胞の増殖のより高いレベル、したがってより重度のＧｖＨＤを示す。
実験１では、ＣＤ４５陽性血液細胞のパーセンテージは、対照マウスにおいて６３．８６％であった（表１０）。対照的に、抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７、ｍＡｂ１５、Ｃ１、またはｍＡｂ７−ＡＡで処置したマウスにおけるＣＤ４５陽性血液細胞のパーセンテージは、それぞれ８０．３４％、７７．６２％、７７．２６％、および７６．９％であった（表１０）。
Figure 2018503365
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要約すると、抗ＰＤ−１抗体で処置したマウスは、アイソタイプ対照で処置したマウスと比較して、より急速な体重減少およびＴ細胞増殖の増大を有した。これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体で処置すると、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＴ細胞の増殖が刺激されることを実証する。
（実施例４）
抗ＰＤ−１抗体の結合
本実施例は、活性化ヒトＴ細胞およびカニクイザル（カニクイザル（ｃｙｎｏ））Ｔ細胞に対する抗ＰＤ−１抗体結合を例示する。
初代ヒトＴ細胞を、製造者プロトコールに従ってヒトＰＡＮ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９６−３５３）を使用してＰＢＭＣ（スタンフォード大学血液銀行）から単離した。カニクイザルＰＢＭＣは、（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）から購入し、ＰＡＮ Ｔ細胞は、製造者プロトコールに従って非ヒト霊長類ＰＡＮ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９１−９９３）を使用して単離した。ヒトＴ細胞を、細胞展開および活性化のためのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）ヒトＴ−活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１１１３１Ｄ）で３日間活性化した。使用したビーズと細胞の比は、それぞれ１：１のビーズ：Ｔ細胞であった。カニクイザルＴ細胞を、製造者プロトコールに従ってＴ細胞活性化／展開キット、非ヒト霊長類（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９２−９１９）を使用して３日間活性化した。使用したビーズと細胞の比は、それぞれ１：１のビーズ：Ｔ細胞であった。３日後、培養物を回収し、ビーズを、磁力を使用して活性化Ｔ細胞から分離した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳを含む）およびヒトＦｃ受容体結合阻害剤（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１６−９１６１−７３）で洗浄およびインキュベートした。カニクイザルに関して、細胞にＦｃ Ｂｌｏｃｋ試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６４７６５）を使用した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、次いで死細胞を除外するためのライブデッドカラー（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、ＵＶ励起用；カタログ＃Ａ１０３４６）でさらに５分間染色した。抗ＰＤ−１抗体を添加し（緒濃度の抗ＰＤ−１クローンを１０μｇ／ｍｌ〜０μｇ／ｍｌで出発して１：３の連続希釈比で細胞によってインキュベートした）、１×１０６細胞を合計１００μｌ中のそれぞれの反応において使用し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、過剰の一次抗体を除去し、抗ヒト（アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で二次コンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；カタログ番号７０９−１３６−１４９）とともにインキュベートした。細胞を氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号６４７４６５）を使用して読み取るまで氷上に保った。データをＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して分析した。結果を図２Ａおよび２Ｂに要約する。
図２Ａは、ヒト活性化細胞への抗ＰＤ−１抗体結合について測定したＥＣ５０を示し、図２Ｂは、カニクイザル活性化細胞への抗ＰＤ−１抗体結合について測定したＥＣ５０を示す。抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７およびＣ１は、同様のＥＣ５０で活性化Ｔ細胞に結合する（図２Ａおよび２Ｃ）。
（実施例５）
抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−Ｌ１結合の阻害
本実施例は、抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）結合の阻害を例示する。
初代ヒトＴ細胞を、製造者プロトコールに従ってヒトＰＡＮ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９６−３５３）を使用してＰＢＭＣ（スタンフォード大学血液銀行）から単離した。カニクイザルＰＢＭＣは、（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）から購入し、ＰＡＮ Ｔ細胞は、製造者プロトコールに従って非ヒト霊長類ＰＡＮ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９１−９９３）を使用して単離した。ヒトＴ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）ヒトＴ−活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（細胞展開および活性化用、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１１１３１Ｄ）で３日間活性化した。使用したビーズと細胞の比は、それぞれ１：１であった。カニクイザルＴ細胞を、製造者プロトコールに従ってＴ細胞活性化／展開キット、非ヒト霊長類（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９２−９１９）を使用して３日間活性化した。使用したビーズと細胞の比は、それぞれ１：１であった。３日後、培養物を回収し、ビーズを、磁力を使用して活性化Ｔ細胞から分離した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ ＦＢＳを含む）およびヒトＦｃ受容体結合阻害剤（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１６−９１６１−７３）で洗浄およびインキュベートした。カニクイザルに関して、細胞にＦｃ Ｂｌｏｃｋ試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６４７６５）を使用した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、次いで死細胞を除外するためのライブデッドカラー（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、ＵＶ励起用；カタログ＃Ａ１０３４６）でさらに５分間染色した。ヒト組換えＰＤ−Ｌ１ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５６−Ｂ７）または緩衝液単独を、１０ｎｇ／ｍｌで細胞とともにインキュベートした。それぞれのリガンドを別個にインキュベートし、氷上で３０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、抗ＰＤ−１抗体とともにインキュベートし（緒濃度の抗ＰＤ−１クローンを１μｇ／ｍｌ〜０μｇ／ｍｌで出発して１：３の連続希釈比で細胞によってインキュベートした）、１×１０６細胞を合計１００μｌ中のそれぞれの反応において使用し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、過剰の一次抗体を除去し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコンジュゲートされた抗ヒトκ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号ＭＨ１０５１５）とともにインキュベートした。細胞を氷上で３０分間染色し、次いで洗浄し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号６４７４６５）を使用して読み取るまで氷上に保った。データをＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して分析し、生細胞に対するＡＰＣ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）および幾何平均（Ｇｅｏ．Ｍ）を、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して計算した。幾何平均（ｇｅｏ ｍｅａｎ）を計算した後、ＩＣ５０をＧｒａｐｈＰＤ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。結果を以下の表１１および１２に要約する。
Figure 2018503365
Figure 2018503365
これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７およびＣ１が、同様のＩＣ５０でヒトおよびカニクイザルＴ細胞へのＰＤ−Ｌ１結合を阻害することを実証する。
（実施例６）
Ｔ細胞増殖に対する抗ＰＤ−１抗体の効果
本実施例は、Ｔ細胞増殖に対する抗ＰＤ−１抗体の効果を例示する。ＣＤ４およびＣＤ８（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＬＬＣ）を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）ヒトＴ−活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（または細胞展開および活性化（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１１１３１Ｄ））を用いて２日間活性化した。使用したビーズと細胞の比は、ＰＤ−１を誘導するためにそれぞれ１：１であった。２日目に、培養物を回収し、ビーズを、磁力を使用して活性化Ｔ細胞から分離した。次いで細胞をＰＤ−Ｌ１発現樹状細胞上で活性化し、細胞を、１：１０のＤＣ：Ｔ細胞の比で、三つ組みで、９６ウェルプレート中で１μｇ／ｍｌの異なる抗ＰＤ−１クローンとともにインキュベートし、加湿したインキュベーター内で、３７℃で５％のＣＯ２とともにインキュベートした。３日目に、培養物を１ウェル当たり１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンで１８時間パルスした後、回収した。次いでプレートを、ハーベスター９６（Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＤＮＡ特異的濾紙（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上に回収した。放射標識フィルターをベータシンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で覆い、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）カウンタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。チミジン取り込みを１分当たりのカウント（ＣＰＭ）として分析した。結果を図３および４において三つ組の平均±ＳＥＭとして示す。
（実施例７）
ヒト化抗ＰＤ−１抗体と相互作用するヒト、カニクイザル、およびマウスＰＤ−１の速度論的および親和性決定
本実施例は、ヒト、カニクイザル、またはマウスＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体の結合を例示する。
すべての相互作用分析は、別段の明言のない限り、２５℃で、無標識バイオセンサーで実施した。表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢｉｏＲａｄ（商標）製ＰｒｏｔｅＯｎ−ＸＰＲ（商標）、ならびにＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（商標）およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（商標））を使用して、ヒトならびにカニクイザルＰＤ−１を試験し、バイオレイヤー干渉法バイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ−Ｒｅｄ３８４、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ／Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してマウスＰＤ−１を試験した。ＰｒｏｔｅＯｎ実験は、ＰＢＳ ｐＨ７．４＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）ランニング緩衝液中で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ実験は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＨＢＳＴ＋）中で実施し、Ｏｃｔｅｔ実験は、１ｇ／ｌのＢＳＡを含むＨＢＳＴ＋中で実施した。ＰｒｏｔｅＯｎデータは、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアで処理し、Ｂｉａｃｏｒｅデータは、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎで処理し、Ｏｃｔｅｔデータは、制御ソフトウェアでゼロに対して単に整列させた。ＳＰＲデータを二重参照し（Ｍｙｓｚｋａ、１９９９、Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ、１２（５）：２７９〜２８４）、単純ラングミュアモデルに包括的にフィッティングして、速度論的速度定数の比（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）から平衡解離定数、ＫＤを決定した。
キャリブレーションフリー濃度分析（ＣＦＣＡ）
ＩｇＧを固定化した速度論的実験における分析物として使用するためのヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）モノマー（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号１０３７７−Ｈ０８Ｈ）の活性濃度を、ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（商標）でＣＦＣＡアッセイを使用して経験的に決定した。これらの実験のための表面を準備するために、大容量（およそ１２，０００ＲＵ）のｍＡｂ１５ ｈＩｇＧ４（または一部の実験では、競合抗体Ｃ２−ｈＩｇＧ１）をフローセル２上にアミン結合させ、フローセル１をブランクのままにして（いずれのＩｇＧも用いずに単に「活性化およびブロックした」）、参照表面を提供した。ｈＰＤ−１試料を、低（５μｌ／分）および高（１００μｌ／分）流量の両方で、３６秒間０．１、１、および１０μｇ／ｍｌの名目上の濃度で注入した。２：１ｖ／ｖのＰｉｅｒｃｅ ＩｇＧ溶出緩衝液（ｐＨ２．８）：４Ｍ ＮａＣｌのカクテルで表面を再生した。データをＴ２００ソフトウェアのＣＦＣＡツールで分析してｈＰＤ−１分析物の見かけ上の活性値を導出し、これを使用して、適切な吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度によって判定したその「名目上の」タンパク質濃度を「活性」タンパク質濃度に補正した。一部のロットは、３２％活性であることが判明し、一方、他のロットは、１００％活性であった。
アミン結合ｍＡｂ７、ｍＡｂ１５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４、ｍＡｂへのヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）結合の速度論的分析
ＧＬＣセンサーチップを備えたＰｒｏｔｅＯｎ−ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ（商標）Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ＰＢＳＴランニング緩衝液中でのアミン結合抗ｈＰＤ−１ ｍＡｂのパネル（ｍＡｂ７、ｍＡｂ１５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）へのｈＰＤ−１モノマー結合の速度論および親和性を判定した。これらの実験のための表面を３つのステップで準備した；（１）水中の最終０．８ｍＭのＥＤＣおよび０．２ｍＭのスルホ−ＮＨＳでの活性化試薬の新たに調製した混合物を使用して、リガンドチャネルを２分間最小限で活性化し、（２）ＩｇＧを、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５中、１５μｇ／ｍｌで３分間結合させ、（３）過剰の反応性エステルを、１ＭのエタノールアミンＨＣｌ ｐＨ８．５で３分間ブロックした。結合したＩｇＧの最終レベルは、４００ＲＵ〜１１５７ＲＵの範囲であった。ｈＰＤ−１モノマーを、実験に応じて、３０、４４、または３６ｎＭの最高「活性」濃度を伴う３倍希釈系列として「分析物」チャネルに沿って、ワンショットキネティックモード（Ｂｒａｖｍａｎら、２００６、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、３５８（２）：２８１〜２８８）で注入した。会合および解離時間は、それぞれ３分および２０分であり、すべての分析物を、二つ組の結合サイクルで注入した。表面を、２：１ｖ／ｖのＰｉｅｒｃｅ ＩｇＧ溶出緩衝液（ｐＨ２．８）：４ＭのＮａＣｌのカクテルで再生した。
Figure 2018503365
ｈＰＤ−１モノマーのｍＡｂ７およびｍＡｂ１５との相互作用は、許容された解離相内で結合応答の目に見える減衰を示さず、したがって、「５％規則」（Ｋａｔｓａｍｂａら、２００８、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５２（２）：２０８〜２２１）を適用してこれらのｋｄおよびＫＤ値の上限に設けたことに従って、上限をこれらのｋｄおよびＫＤ値に設けた。Ｎ＝２は、異なるチップ上の２つの独立した実験を指す。
ｍＡｂ７およびｍＡｂ１５のカニクイザルＰＤ−１との交差反応
組換え精製Ｆａｂ断片（ｍＡｂ７およびｍＡｂ１５）のｈＰＤ−１−ｈＦｃ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１０８６ＰＤ）およびカニクイザルＰＤ−１−ｈＦｃ１（社内で調製）の両方への結合速度論を、ＣＭ４センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ ２０００（商標）およびＨＢＳＴ＋ランニング緩衝液を使用して判定した。抗ｈＦｃポリクローナル抗体をチップにアミン結合させ、フローセル１をブランクのままして（裸の抗ｈＦｃ捕捉表面）参照チャネルを提供して、フローセル２および３上でおよそ９０ＲＵのｈＰＤ−１−ｈＦｃ１および１２５ＲＵのカニクイザルＰＤ−１−ｈＦｃ１を捕捉するのに使用した。組換え精製Ｆａｂを、１５分の解離時間を許容して、新たに捕捉されたＰＤ−１−ｈＦｃ１融合タンパク質上に０、１０、および１００ｎＭで分析物として２分間注入した。捕捉表面を、７５ｍＭのリン酸を使用して再生し、ｍＡｂ７ Ｆａｂ試料を二つ組の結合サイクルで注入した。すべてのＦａｂ／ＰＤ−１複合体は、非常に安定であり、その結果、相互作用のいずれも、許容された解離時間内でこれらの結合応答におけるいずれの目に見える減衰も示さず、「５％規則」（Ｋａｔｓａｍｂａら、２００８）を適用して、これらのｋｄおよびＫＤ値に上限を設けた。
Figure 2018503365
ｍＡｂ１５、ｍＡｂ７、およびＣ３に対するｈＰＤ−１結合親和性の温度依存性
ＣＭ４センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（商標）を使用してアミン結合抗ｈＦｃポリクローナル抗体を介して低レベルで捕捉されたｈＩｇＧ４分子のパネル（ｍＡｂ１５、ｍＡｂ７、およびＣ３）へのｈＰＤ−１モノマー結合の速度論および親和性を判定した。ｈＩｇＧ４ ｍＡｂを、フローセル１を参照表面（裸の捕捉表面）として機能を果たすようにブランクのままにして、個々のフローセル上で１０μｇ／ｍｌで捕捉した。ｈＰＤ−１を、１８分の解離相を許容して３分間０、１０、および１００ｎＭの活性濃度で注入した。捕捉表面を、それぞれの結合サイクル後に７５ｍＭのリン酸を用いて再生した。
Figure 2018503365
ｍＡｂ７のマウス−ＰＤ−１との交差反応
ストレプトアビジンセンサーチップを備えたＯｃｔｅｔ−Ｒｅｄ３８４を使用して、マウスＰＤ−１がｍＡｂ７に結合するか否かを判定した。結合活性プローン（ａｖｉｄｉｔｙ−ｐｒｏｎｅ）アッセイフォーマットを選択してアッセイの検出感度を増大させた。センサーをビオチン化抗ヒトκポリクローナルで被覆し、１０μｇ／ｍｌでｈＩｇＧ４抗ｈＰＤ−１ｍＡｂ（ｍＡｂ７、Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３）のパネルを捕捉するのに使用し、それぞれのｍＡｂを８個のセンサーで捕捉した。陽性対照として、８個のストレプトアビジンセンサーをビオチン化Ｊ４３（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、抗マウスＰＤ−１抗体で被覆した。それぞれのｍＡｂ被覆センサーを以下の分析物；緩衝液、１μＭの結合部位マウスＰＤ−１−ｈＦｃ、１μＭの結合部位ｈＰＤ−１−ｈＦｃ（陽性対照）、または１μＭの結合部位ｈＧＨＲ−ｈＦｃ（陰性対照）に曝露した。すべての組換えＦｃ−融合タンパク質は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ製であった。したがって、それぞれの分析物／ｍＡｂ相互作用を二つ組のセンサーで試験した。
抗ＰＤ−１抗体Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３は、マウス−ＰＤ−１−ｈＦｃ１に結合しなかった（データを示さず）。抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７は、マウス−ＰＤ−１−ｈＦｃ１に弱く結合した（データを示さず）。試験したすべての抗ＰＤ−１抗体は、ｈＰＤ−１−ｈＦｃに結合した。これらの結果は、ｍＡｂ７は、マウスＰＤ−１と弱く交差反応性であり、一方、Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３は、マウスＰＤ−１と交差反応性でないことを実証する。
（実施例８）
抗ＰＤ−１抗体を用いたがんの治療
これは、がんを治療するための本発明の抗ＰＤ−１抗体の使用を例示する預言的実施例である。
組織学的に確認され、以前に治療されていない測定可能な転移性結腸直腸がんを有する患者を、抗ＰＤ−１抗体を用いた治療のために選択する。患者を２つの処置群：化学療法とプラセボまたは化学療法とｍＡｂ７の一方に割り当てる。動的ランダム化アルゴリズムを利用して、全体的に、かつ以下のカテゴリー：試験センター、ベースラインＥＣＯＧパフォーマンスステータス（０対≧１）、原発性疾患の部位（結腸対直腸）、および転移部の数（１対＞１）のそれぞれの中でバランスを実現する。化学療法処置を、それぞれの８週間サイクルの最初の６週間、毎週投与する。化学療法を、試験完了（９６週間）または疾患進行まで継続する。ｍＡｂ７ ５ｍｇ／ｋｇまたはプラセボを２週間毎に投与する。化学療法処置の結果として完全奏功が確認された、または容認できない毒性を経験したｍＡｂアームにおける患者は、化学療法を中断させられ、ファーストライン処置としてｍＡｂ７単独を受け続ける。ｍＡｂ７群にランダム化されている患者のみが、セカントライン処置のコンポーネントとしてｍＡｂ７を受けることができる。試験を完了した後、患者を、死までの４カ月毎の任意の後続の処置および生存時間、経過観察の喪失、または試験の終結について追跡する。
患者は、適切な放射線透過写真術による技法、典型的にはスパイラルＣＴスキャニングを使用して、ベースライン時および８週間サイクルごとの完了時に腫瘍状態の評価を受ける。腫瘍応答または進行は、固形腫瘍における応答評価基準を利用して研究者および独立放射線学施設（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ＩＲＦ）の両方によって判定される。Ｔｈｅｒａｓｓｅら、（２０００）。ＩＲＦ評価は、処置割り当てまたは研究者評価の知識なしで実施される。さらに、患者は、ベースライン時および疾患進行までのそれぞれの処置サイクルの前に、がん療法の機能的評価−結腸直腸（ＦＡＣＴ−Ｃ）、バージョン４、結腸直腸がん患者における生活の質（ＱＯＬ）を評価するための有効な手段を完了する。Ｗａｒｄら（１９９９）、Ｑｕａｌ．Ｌｉｆｅ Ｒｅｓ． ８：１８１〜１９５。
安全性は、有害事象、実験室試験結果、およびバイタルサイン測定の報告から評価される。有害事象および異常な実験室結果は、国立がん研究所共通毒性基準（ＮＣＩ−ＣＴＣ）、バージョン２を使用して分類される。予め指定された安全性尺度は、特に興味深い４つの有害事象（高血圧、タンパク尿症、血栓形成、および出血）を含む。
一次転帰尺度は、全生存期間の継続時間である。二次転帰尺度は、無増悪生存期間、客観的反応速度（完全および部分的な）、応答継続時間、およびＦＡＣＴ−Ｃ ＱＯＬスコアの変化を含む。生存時間継続時間は、ランダム化から死までの時間として定義される。分析の時に生存している患者に関して、生存時間の継続時間は、最終接触の日付で検閲される。無増悪生存期間は、ランダム化から疾患進行の早期、または治験薬または化学療法の最後の用量の３０日以内の任意の原因からの死として定義される、試験上の死までの時間として定義される。分析の時に疾患進行を伴うことなく生存している患者に関して、無増悪生存期間は、彼らの最後の腫瘍評価、またはベースライン後評価が実施されなかった場合１日目（試験処置の最初の日）で検閲される。客観的反応の分析において、腫瘍評価を伴わない患者は、ノンレスポンダーとして分類される。疾患進行および応答分析は、ＩＲＦ評価に基づく。生活の質の変化は、ランダム化から結腸がん特定のＦＡＣＴ−Ｃサブスケールスコア（ＣＣＳ）のベースラインからの３ポイント以上の減少、疾患進行、または試験上の死のうちの最も早いものまでの時間の長さとして定義される、ＱＯＬの劣化までの時間（ＴＤＱ）として分析される。ＴＤＱは、ＴＯＩ−Ｃ（ＣＣＳの和、身体的および機能的な健康）およびベースラインからの変化の総ＦＡＣＴ−Ｃについても判定される。
（実施例９）
抗ＰＤ−１抗体を用いたがんの治療
本実施例は、がんを治療するための本発明の抗ＰＤ−１抗体の使用を例示する。
本実施例における試験は、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平細胞頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣癌、肉腫、または再発もしくは難治性古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）を有する以前に治療された成人患者における静脈内投与される抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ｍＡｂ７の第１相、非盲検、多施設、複数回用量、用量漸増、安全性、ＰＫ、およびＰＤ試験である。試験プロトコールを表１６で以下に要約する。
Figure 2018503365
試験対象患者基準：局所進行性もしくは転移性黒色腫、ＳＣＣＨＮ、卵巣がん、肉腫、または再発もしくは難治性ｃＨＬの組織学的または細胞学的診断：− 患者は、標準ケアおよび治験療法の両方を含む再発性または転移性疾患の少なくとも１かつ５以下の事前ラインの療法を受けていたものとする。− ＲＥＣＩＳＴ バージョン１．１によって定義される少なくとも１つの測定可能な病変部、または（ｃＨＬについて）以前に照射されていなかった悪性リンパ腫の応答基準によって定義される、１．５ｃｍ超の少なくとも１つのフルオロデオキシグルコースポジトロン放出断層撮影（ＦＤＧ ＰＥＴ）の強い（Ｄｅａｕｖｉｌｌｅ ４／５）測定可能な病変部。− パート１Ｂ展開およびすべてのパート２コホートに関して：患者は、処置前および処置中生検を受けることに同意している。− 十分な腎臓、肝臓、骨髄機能除外基準 − 活性な脳または軟膜転移。− 眼黒色腫 − 活性な、既知の、または疑わしい自己免疫疾患。白斑、Ｉ型糖尿病、ホルモン置換を必要とするだけである自己免疫状態に起因する残存甲状腺機能低下症、全身的治療を必要としない乾癬、または外部誘因の非存在下で再発することが予期されない状態を有する患者は、登録することが許容される。免疫抑制療法を必要とする先の免疫不全の診断または臓器移植、− パート２に関して：ＰＤ１またはＰＤ Ｌ１抗体を用いた先の治療。− 先の免疫調節療法（例えば、免疫チェックポイント阻害剤、共刺激剤など）に関連しており、免疫抑制療法が要求されると考えられた３以上のグレードの免疫媒介ＡＥ（薬剤が関連していると考えられたＡＳＴ／ＡＬＴ上昇およびサイトカイン放出症候群を含む）の履歴。
ＯＲＲ（客観的反応率）を有する患者の数は、ベースライン時、および最大で２４カ月まで、疾患進行または容認できない毒性まで６週間毎に測定される。
（実施例１０）
ヒトおよびカニクイザル初代Ｔ細胞における抗ＰＤ−１抗体のアンタゴニスト活性
本実施例は、ヒトおよびカニクイザル初代Ｔ細胞における抗ＰＤ−１抗体の活性を例示する。
本試験では、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ｍＡｂ７のアンタゴニスト活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した。初代Ｔ細胞をヒトおよびカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。ｍＡｂ７曝露後、細胞増殖ならびにサイトカイン分泌を、ヒトおよびカニクイザルのＭＬＲならびにブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）超抗原で活性化されたカニクイザル血液を使用するサイトカイン放出アッセイを使用して、異なる活性化条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。
方法
ヒトＴリンパ球
ヒトバフィーコートをスタンフォード血液センター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ）から購入し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で希釈し、ＰＢＭＣを単離するためにフィコール上に層状に重ねた。ｈｕ−ＰＢＭＣをＰＢＳで４回洗浄し、Ｔリンパ球を、製造者のプロトコールに記載の負の選択とともにヒト特異的Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離した。
カニクイザルＴリンパ球
新鮮なカニクイザル−ＰＢＭＣをＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から購入し、ＰＢＳで２回洗浄した。Ｔリンパ球を、製造者のプロトコールに記載の負の選択とともに非ヒト霊長類特異的ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離した。
高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現するヒト樹状細胞の生成
ヒトバフィーコートをスタンフォード血液センター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ）から購入し、ＰＢＳで希釈し、ｈｕ−ＰＢＭＣを単離するためにフィコール上に層状に重ねた。ｈｕ−ＰＢＭＣをＰＢＳで４回洗浄し、分化１４（ＣＤ１４＋）単球のクラスターを、製造者のプロトコールに記載の正の選択とともにヒト特異的ＣＤ１４細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離した。次いで細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した完全Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で７日間、５×１０５細胞／ｍＬで播種した。０、２、および５日目に、培養物に組換えヒト（ｒｈ−）ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびｒｈ−顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ｒｈ−ＧＭＣＳＦ）（５００Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を補充した。未成熟ＤＣを７日目に回収、洗浄、およびカウントした。それぞれの調製物の試料を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用するフローサイトメトリーによって、ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）標識抗ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してＰＤ−Ｌ１発現について試験した。
高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現するカニクイザル樹状細胞の生成
新鮮なカニクイザルＰＢＭＣをＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から購入し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ１４＋単球を、製造者のプロトコールに記載の正の選択とともに非ヒト霊長類特異的ＣＤ１４細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離した。次いで細胞を、１０％のＦＢＳを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で７日間、５×１０５細胞／ｍＬとして播種した。０、２、および５日目に、培養物にｒｈＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）およびｒｈ−ＧＭＣＳＦ（５００Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を補充した。未成熟ＤＣを７日目に回収、洗浄、およびカウントした。それぞれの調製物の試料を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用するフローサイトメトリーによって、ＲＰＥ標識抗ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してＰＤ−Ｌ１発現について試験した。
高レベルのヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＪｅＫｏ−１−Ｌｕｃ−緑色蛍光タンパク質細胞クローンの生成
ＪｅＫｏ−１細胞株（マントル細胞リンパ腫）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＪｅＫｏ−１−ｌｕｃ−２Ａ−ＧＦＰ細胞株を、形質導入プロセスによってＰｆｉｚｅｒ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）において生成した。このプロセスは、製造者のプロトコールに従ってブラストサイジンマーカー（ＡＭＳＢＩＯ、ＬＶＰ３２３、２００μＬ当たり１×１０Ｅ７粒子）を含むバイシストロニック系によって個々にホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ２Ａ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルス粒子を使用した。ＪｅＫｏ−１細胞をペレット化し、２０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。レンチウイルス粒子は、細胞０．５ｍＬ当たりウイルス５０μＬの比で希釈した細胞に添加した。ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１を発現するＪｅＫｏ−１細胞株を生成するために、ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１ ｃＤＮＡをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によってカスタム合成し、一般的な発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）中にクローニングした。ｈｕ−ＰＤＬ−１を安定に発現するＪｅＫｏ−１−Ｌｕｃ−ＧＦＰ細胞株を、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）および製造者のプロトコールに従って使用したＫｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して電気穿孔によってＰｆｉｚｅｒ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）において生成した。次いで細胞を２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンの存在下で２週間増殖させ、次いでＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して細胞選別によって選択した。細胞の選別は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識を直接標識した抗ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１抗体クローンＭＩＨ−１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて行った。陽性クローンを展開し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析装置、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して高ＰＤ−Ｌ１発現について試験した。単一の選別された細胞から生成し、高レベルのＰＤ−Ｌ１発現を含有したクローンを選択した。
抗体の生成
ｍＡｂ７を、優良試験所規範（ＧＬＰ）材料（ロット番号ＳＴＬ０００５７１７）を使用してＣＨＯ細胞（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）内で生成し、２０ｍＭのヒスチジン、８５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート−８０、０．０５ｍｇ／ｍＬの二ナトリウムＥＤＴＡ、ｐＨ５．５の緩衝液中に提供した。エンドトキシンを≦０．０１ＥＵ／ｍｇとして測定した。
すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用した対照抗体は、ＩｇＧ４−ＨＧフレームワーク（ＭＡＢ７と同じフレームワーク）中にクローニングされた抗ウシヘルペスウイルスであった。対照抗体は、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ロット番号４９４５で生成し、≦０．３ＥＵ／ｍｇのエンドトキシンを伴った。
２種の抗ｈｕ−ＰＤ−１抗体を以前の特許で公開された配列から生成し、ＭＡＢ７に使用したものと類似するＩｇＧ４−ＨＧフレームワーク内で発現させた。抗体は、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）で生成し、陽性対照１および陽性対照２と命名した（それぞれロット番号５０５３および４２５５）。測定されたエンドトキシンは、それぞれ≦０．１３ＥＵ／ｍｇおよび≦０．０５６ＥＵ／ｍｇであった。
高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する樹状細胞を使用するヒトアッセイ
プロトコールは、いくつかの改変を用いてＫｒｕｉｓｂｅｅｋら、２００４から適応させた。分化初代ｈｕ−ＤＣを、７日目に回収し、Ｔ細胞活性化に必要な高レベルのＰＤ−Ｌ１発現および共刺激シグナルについてフローサイトメトリーによって検証した。マーカーは、ＣＤ８０およびＣＤ８６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡから購入した抗体）を含んでいた。細胞をカウントし、ＲＳ２０００Ｘ線装置（Ｒａｄｓｏｕｒｃｅ、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、ＴＮ）を使用して３０００放射線単位（ラド）で照射して、ＤＣがＴ細胞に対するＡｇ提示担体としてのみ機能することを除き、サイトカインを分泌することを防止した。したがって、アッセイの成果は、Ｔ細胞によってのみ誘導された。７日目に、同種ドナーから新たに単離したｈｕ−Ｔ細胞を回収した。Ｔ細胞を、異なる濃度のｍＡｂ７、陰性および陽性対照抗体、または培地単独（ベースライン反応を評価するための）の存在下で１０：１の比で照射されたＤＣとともに蒔いた（最適なアッセイ条件は、培養液２００μＬ中で２×１０４ＤＣとともにインキュベートした２×１０５Ｔ細胞と判定された）。すべての条件を９６ウェル平底組織培養処置プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）中に蒔いた。細胞は、無血清Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して培養して、実験間のヒト血清ばらつきを防止した。培養物を、５％のＣＯ２とともに３７℃で５日間インキュベートした。５日目に、上清を収集し、サイトカイン濃度を製造者のプロトコールに従って細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して測定した。データは、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析装置、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して取得し、データ分析は、ＢＤ ＦＣＡＰアレイソフトウェアバージョン３．０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施した。増殖を、１μＣｉの３Ｈ メチル滴定チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を各ウェルに添加することによって並行培養で測定し、１６〜１８時間さらにインキュベートした。次いで培養物をデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）組込みフィルター（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で回収し、細胞増殖の指標をもたらしたトリチウム標識チミジン組込みを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して１分間当たりのカウント（ｃｐｍ）として測定した。
ＪｅＫｏ１−ＰＤ−Ｌ１発現細胞株を使用するヒトアッセイ
このアッセイは、５：１の比のＴ細胞とＪｅＫｏ−１−ＰＤ−Ｌ１細胞株を使用して実施し、その理由は、この比が、５日目にサイトカイン分泌物を捕捉するのにより理想的な手法をもたらしたためである。したがって各ウェルを４×１０４のＪｅＫｏ−１−ＰＤ−Ｌ１と一緒に２×１０５Ｔ細胞とともにインキュベートした。５日目に、上清を収集し、サイトカイン濃度を製造者のプロトコールに従ってＣＢＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して測定した。この細胞株は、非常に適度の量の共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）を発現し、したがって増殖の増強は、抗体処置の後に非常に穏やかである。対照的に、ＩＬ−２を含めたサイトカイン分泌物は、ロバストであり、それによって、ｍＡｂ７処置後にサイトカイン分泌の測定を可能にし、Ｔ細胞増殖の測定を可能にしない。
高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する樹状細胞を使用するカニクイザルアッセイ
分化ＤＣを７日目に回収し、Ｔ細胞活性化に必要な高ＰＤ−Ｌ１発現および共刺激シグナルについてフローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析装置、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡを使用する）によって検証した。マーカーは、ＣＤ８０およびＣＤ８６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ製の抗体）を含んでいた。細胞をカウントし、ＲＳ２０００Ｘ線装置（Ｒａｄｓｏｕｒｃｅ、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、ＴＮ）を使用して３０００ラドで照射した。同種ドナーから新たに単離したカニクイザルＴ細胞を回収した。Ｔ細胞を、異なる濃度のｍＡｂ７、陰性および陽性対照抗体、またはベースライン反応を評価するための培地単独の存在下で１０：１のＴ細胞とＤＣの比を使用して照射されたＤＣとともに蒔いた（２×１０５Ｔ細胞を培養液２００μＬ中で２×１０４ＤＣとともにインキュベートしたとき最適なアッセイ条件）。すべての条件を９６ウェル平底組織培養処置プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）中に蒔いた。細胞は、無血清Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して培養して、実験間の血清ばらつきを防止した。培養物を、５％のＣＯ２とともに３７℃で５日間インキュベートした。５日目に、上清を収集し、サイトカイン濃度を製造者のプロトコールに従ってＣＢＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して測定した。データは、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析装置、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して取得し、データ分析は、ＢＤ ＦＣＡＰアレイソフトウェアバージョン３．０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施した。同時にかつ同様の培養液中で、１μＣｉの３Ｈメチル滴定チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を各ウェルに添加した。細胞を１６〜１８時間さらに培養して増殖を測定した。培養物をＤＮＡ組込みフィルターＧｌａｓｓ Ｐｒｉｎｔｅｄ ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で回収し、細胞増殖の指標をもたらすトリチウム標識チミジン組込みを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してｃｐｍとして測定した。
超抗原刺激（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）によって誘導されるカニクイザル血液からのサイトカイン放出
カニクイザルからの全血を収集した。血液２２５μＬを組織培養処理９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）中にアリコートした。試料を、０．１〜１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でｍＡｂ７またはアイソタイプマッチ陰性対照抗体の存在下で５％のＣＯ２中で、３７℃で、二つ組でインキュベートした。抗体を添加して１時間後に、試料を０．１μｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｔｏｘｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）で刺激し、培養物を３日間インキュベートした。３日目に、血漿を回収し、プールし、−８０℃で凍結させた。解凍した血清試料中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αの濃度を、ＭＳＤイムノアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）およびＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（バージョン４．０．１２）を伴うＭＳＤ Ｒｅａｄｅｒ（モデル１２００）を使用して、製造者のプロトコールに従って二つ組で測定した。二つ組の平均を報告した。
結果
ヒト初代Ｔ細胞に対するｍＡｂ７のアンタゴニスト活性
初代ヒトＴ細胞をＰＤ Ｌ１を発現する同種ｈｕ−ＣＤとのＭＬＲで活性化したとき、ｍＡｂ７は、用量依存的な様式でＴ細胞増殖（トリチウム標識チミジン組込みによって測定した）およびＴ細胞活性化（炎症促進性サイトカイン分泌によって測定した）を増大させた。ｍＡｂ７（１０μｇ／ｍＬ）でのＴ細胞の処置は、陰性対照抗体（１０μｇ／ｍＬ）での処置に対して最大で２．５倍のＴ細胞増殖の増大をもたらした。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αレベルは、陰性対照抗体と比較したとき、それぞれ最大で８および５倍増大した。ＩＦＮ−γ増大は、ＴＮＦ−α増大より優れていた。ＩＬ−２発現は、これらの培養物中で検出されなかった。初代ヒトＴ細胞を同種抗原提示細胞として腫瘍細胞株ＪｅＫｏ１ ＰＤ−Ｌ１を使用してＭＬＲで活性化したとき、ｍＡｂ７は、陰性対照抗体と比較してＩＦＮ−γ（最大で２．５倍）、ＴＮＦ−α（最大で２倍）、およびＩＬ−２（最大で５倍）分泌の用量依存的な増大を誘導した。このアッセイにおけるｍＡｂ７の効果は、両方の陽性対照抗体で得たデータと類似していた。Ｔ細胞増殖の増大は、これらの条件下で観察されなかった。細胞増殖は、初代ＤＣによって媒介されるＭＬＲと比較して、ＣＤ８０およびＣＤ８６によってもたらされる弱いシグナルを伴って最小限であった。ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ、およびＩＬ−６は、上述したすべてのアッセイにおいて最小限〜非検出であった。
カニクイザル初代Ｔ細胞に対するｍＡｂ７のアンタゴニスト活性
溶液中にあるときのｍＡｂ７のｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１への結合親和性は、速度論的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）において非常に同様であった（それぞれヒトおよびカニクイザルＰＤ−１についてＫＤ＝２３および２８ｐＭ）。ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１を発現する細胞に対するｍＡｂ７のＥＣ５０も同様であった。異なるカニクイザルから単離したＴ細胞およびＤＣを使用したＭＬＲ機能アッセイでは、ｍＡｂ７は、用量依存様式でＴ細胞増殖および活性化を誘導した（トリチウム標識チミジン組込みによって測定した）。この効果は、陽性対照（抗体１および抗体２）でも観察されたが、陰性対照抗体で観察されなかった。ｍＡｂ７は、サイトカイン分泌（すなわち、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）も、陰性対照抗体での処置と比較して、最大で５倍および３倍増強した。ＩＬ−２発現は、これらの培養物中に検出されなかった。０．１μｇ／ｍＬのＳＥＢ超抗原で３日間刺激されたカニクイザル全血を使用する異なるサイトカイン放出アッセイでは、ｍＡｂ７（０．１〜１００μｇ／ｍＬ）は、陰性対照抗体と比較したとき、より大きくＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−α分泌を誘導した。
ＭＬＲ試験を使用して、Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１を発現する同種ＤＣまたは腫瘍細胞の存在下で活性化され、高レベルのＰＤ−１を発現している腫瘍微小環境に類似しているｉｎ ｖｉｔｒｏ設定を作り出した。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用は、さらなるＴ細胞増殖およびサイトカイン放出を阻害する。これらのＭＬＲにおいて抗ＰＤ−１抗体を添加すると、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の遮断に起因して、Ｔ細胞活性化が回復し、増殖およびサイトカイン分泌、特にＩＦＮ−γが増大した。
ｍＡｂ７は、高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する同種細胞（ＤＣまたはＪｅＫｏ１ ＰＤ−Ｌ１細胞株）とともに培養したとき、ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＦＮ−α、およびＩＬ−２の増殖および分泌を加速した。対照的に、培地単独と同様であることを証明した陰性対照抗体は、これらの効果を増強しなかった。同様に、ｍＡｂ７は、カニクイザル−ＭＬＲ系におけるＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α分泌を増強し、超抗原ＳＥＢを使用するカニクイザル全血からのサイトカイン放出を増強した。
これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７が、Ｔ細胞増殖、ならびにインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン（ＩＬ）−２を含めた炎症促進性サイトカイン分泌を増強したことを実証する。これらの活性は、初代ヒトおよびカニクイザルＴ細胞の両方において観察された。
（実施例１１）
移植片対宿主疾患における抗ＰＤ−１抗体の効果
本実施例は、ｈｕ−ＰＢＭＣを移植されたＭＳＧマウスにおける異種−ａＧｖＨＤモデルを使用するｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化および展開に対する抗ＰＤ−１抗体の効果を例示する。
本試験では、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化および展開に対する抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７の効果を、ｈｕ−末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する非肥満糖尿病性（ＮＯＤ）、重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、インターロイキン２受容体γヌル（ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ）（ＮＳＧ）マウスにおける異種急性移植片対宿主疾患（ａＧｖＨＤ）モデルにおいて試験した。
年齢８〜１０週の免疫無防備状態ＮＳＧ雌マウス（１群当たり５匹）（公式名称、ＮＯＤ、Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。すべての動物を、施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）に従ってＰｆｉｚｅｒ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）における病原体フリー施設に収容した。
ヒトバフィーコートをスタンフォード血液センター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ）から購入し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で希釈し、ＰＢＭＣを単離するためにフィコール上に層状に重ねた。ＰＢＭＣをＰＢＳで２回洗浄した。赤血球（ＲＢＣ）を、製造者のプロトコールに示されたように塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して溶解させた。ＲＢＣ溶解後、細胞を再び洗浄し、１ｍＬ当たり５×１０７細胞でＰＢＳ中に希釈した。
異種−ａＧｖＨＤの誘導のために、ＮＳＧマウスにｈｕ−ＰＢＭＣを、尾静脈を介して静脈内注射した。それぞれのマウスは、ＰＢＳ ２００μＬ中の１×１０７細胞を受けた。すべての実験において、マウスを毎週３回秤量し、体重減少、猫背の姿勢、波立った毛、機動性の低減、および一部の場合では、下痢症を含めた異種−ａＧｖＨＤ様症状の出現について監視した。マウスを、２０％の体重の喪失または２日にわたる１ｇ／日の喪失後に安楽死させ、この時点を生存時間として記録した。ｍＡｂ７、陰性対照抗体、および陽性対照抗体を、実施例１０で上述した通り生成した。
ＮＳＧマウスを、１キログラム当たり０．１〜１０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の間の用量範囲で、陰性対照抗体、陽性対照抗体、またはｍＡｂ７で処置した。抗体を、ｈｕ−ＰＢＭＣ移植後２日目および８日目に適切なビヒクルを使用してマウスに投与した。抗体投与の経路は、腹腔内（ｉｐ）であった。
末梢血、脾臓、および肝臓を、ｈｕ−ＰＢＭＣを移植されたマウスから回収した。それぞれの臓器からの単一細胞懸濁液を以下の通り調製した：末梢血を収集し、ＲＢＣを、ＡＣＫ−溶解緩衝液を使用して溶解させ、ＰＢＳで洗浄した。脾臓および肝臓を、シリンジプランジャーの後部を使用して機械的にホモジナイズして、細胞を７０μｍフィルターに通してマセレートし、ＰＢＳで１回洗浄する。ＲＢＣを溶解させ、細胞をさらに２回洗浄し、７０μｍフィルターに通して再びマセレートする。この段階で、脾臓細胞は、準備ができていた。肝臓から白血球を単離するために、単一細胞懸濁液を３０％〜８０％のパーコール勾配（Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して層状に重ね、高速遠心分離にかけた。白血球を中間層から回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。すべての単一細胞懸濁液をカウントし、各試料からの１×１０６細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）のために使用した。ヒトサイトカイン分泌アッセイに関して、マウスＣＤ４５＋細胞を、製造者のプロトコールに記載されたように正の選択によるマウス特異的ＣＤ４５細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して枯渇させて、サイトカイン分泌がヒト免疫細胞単独からであったことを保証した。細胞をカウントし、各試料からの１×１０６細胞をアッセイにおいて使用した。
末梢血、脾臓、および肝臓からの単一細胞懸濁液を異種−ａＧｖＨＤマウスから得た。１試料当たり合計１×１０６細胞を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する１×ＰＢＳを含むＦＡＣＳ緩衝液中で適切な蛍光標識モノクローナル抗体の混合物とともに、光からの保護下で、４℃で３０分間インキュベートし、次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。Ｋｉｅｌ６７タンパク質（Ｋｉ６７、増殖中の細胞を測定するため）の細胞内染色のために、細胞を製造者のプロトコールに従ってＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して表面染色した後に固定した。細胞内染色は、暗所で、４℃で３０分間実施した。染色の最後に、試料を洗浄し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用してマルチカラーフローサイトメトリーに付した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して行った。細胞表面分子を認識するために異なる組合せで使用した抗体は、抗ｈｕ−ＣＤ４５パシフィックブルー（ＰＢ）またはＡｍｃｙａｎ、抗マウスＣＤ４５−ブリリアントバイオレット（ＢＶ）−７１１、抗ｈｕ−ＣＤ３−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、抗ｈｕ−ＣＤ８フィコエリトリン−Ｃｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）またはＢＶ−７８６、抗ｈｕ−ＣＤ４−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはＢＶ−６５０、抗ｈｕ−ＰＤ−１（クローンＥＨ１２．１）ＢＶ−７８６またはＰＥ、抗ｈｕ−ＰＤ−１（クローンＭＩＨ−４）ＰＥまたはＦＩＴＣ、抗ｈｕ−Ｋｉ６７アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ製抗体）、抗ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１（ＰＥ−Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびライブ／デッド染色のための青色蛍光反応性染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）であった。
脾臓および肝臓からのヒトＣＤ４５強化集団の単一細胞懸濁液を、異種−ａＧｖＨＤマウスから得た（マウスＣＤ４５枯渇後）。１試料当たり合計１×１０６細胞を、平底組織培養処理９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）内でＸ−ｖｉｖｏ １５培地２００μＬ中でインキュベートした。次いで細胞を未刺激のままにし、または低刺激条件としてホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１０ｎｇ／ｍＬおよびイオノマイシン（ｉｏｎｏ）１２５ｎｇ／ｍＬ、もしくは高刺激条件としてＰＭＡ ５０ｎｇ／ｍＬおよびイオノマイシン１μｇ／ｍＬで刺激した（ともにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得た）。培養物を５％のＣＯ２中で、３７℃で８時間インキュベートして、最大サイトカイン分泌を保証した。上清を収集し、ヒトサイトカイン濃度を、製造者のプロトコールに従ってヒトサイトカインに特異的な細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して測定した。データは、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析装置、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して取得し、データ分析は、ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙ（商標）ソフトウェアバージョン３．０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施した。Ｈｕ−ＩＦＮ−γ、ｈｕ−ＴＮＦ−α、およびｈｕ−ＩＬ−２ビーズアレイキットをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入し、これらは、マウスサイトカインと交差反応しないことが確認された。
すべての分析は、独立試料ｔ−検定を使用する平均の比較、またはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用する２元配置ＡＮＯＶＡを伴った。≦０．０５の値は、統計的に有意と見なした。生着データは、平均の標準誤差（ｓｅｍ）を含む平均濃度として図に表されている。
ＮＳＧ免疫不全マウスを抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７で処置すると、体重減少が加速され（表１７）、このモデルにおいて一般に見られる他の疾患徴候、例えば、猫背の姿勢、波立った毛、機動性の減少、および一部の場合では、下痢症などが誘導された。このモデルでは、体重減少は、移植後２０日目から３０日目の間で加速することが予期される（例えば、ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＤｉＰｅｒｓｉｏ、２０１１を参照）。ｍＡｂ７ならびに陽性対照１および２で処置すると、異種−ａＧｖＨＤ症状が加速されたので、マウスをより早期の時点で安楽死させなければならず、生存曲線を得ることができなかった。したがって体重減少は、一次転帰測定であった。第１の実験では、マウスを０．１、１、および１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ７、または１０ｍｇ／ｋｇの陰性対照抗体で処置した。表１７において、体重減少を０日目に対して２３日目の処置群間の体重差異を正規化することによって計算した。値は、１群当たり５匹のマウスの平均±ｓｅｍを示す。
Figure 2018503365
マウスをｈｕ−ＰＢＭＣ移植後２日目および８日目に示した抗体で処置した。体重減少は、２３日目に対照群において明らかとなったが、体重減少および疾患進行は、ｈｕ−ＰＢＭＣ移植後１０〜１１日目に開始してすべての抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７処置群からの個々のマウスにおいて検出された。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ処置群の両方において、体重減少は、陰性対照処置群と比較したとき、１４〜２３日目の間に有意性に到達した（ｐ≦０．０００１）。２３日目に、１５％の体重減少が１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ処置群において検出され、７．９％の体重減少が０．１ｍｇ／ｋｇ処置群において検出された（表１７）。
末梢血、肝臓、および脾臓のＦＡＣＳ分析は、対照群に対してｍＡｂ７処置群においてｈｕ−ＣＤ４５陽性細胞およびｈｕ−ＣＤ３陽性Ｔ細胞のパーセンテージの増大を実証した。脾臓からの代表的なデータも、陰性対照抗体処置群に対してｍＡｂ７においてｈｕ−ＣＤ８陽性Ｔ細胞数およびｈｕ−ＣＤ４陽性Ｔ細胞数（しかしより少ない程度に）の増大を示した。同様の増大は、肝臓および血液中のｈｕ−Ｔ細胞数においても認められた。Ｔ細胞の増加がｍＡｂ７のヒトＴ細胞への結合によるＰＤ−１の遮断に起因したものであったか否かを評価するために、Ｔ細胞をｍＡｂ７の結合を競合するＰＤ−１に対する市販の抗体（クローンＥＨ１２．１）で染色した。すべての臓器からのｍＡｂ７処置リンパ球は（ＦＡＣＳによって分析した）、ＥＨ１２．１への結合を示さなかった。ｍＡｂ７で処置されたＴ細胞が依然としてＰＤ−１を発現することを確認するために、Ｔ細胞を、Ｔ細胞への結合をｍＡｂ７と部分的に競合する異なる抗ｈｕ−ＰＤ−１クローン（クローンＭＩＨ４）で染色した。結果は、ｍＡｂ７で処置されたＴ細胞がＭＩＨ４に部分的に結合し、したがってＰＤ−１が処置されたＴ細胞上で発現されることを示し、ｍＡｂ７によるＰＤ−１遮断が明白であることを示した（データを示さず、Ｐｆｉｚｅｒ内部記録に維持されている）。検出可能な変化は、Ｔ細胞（ｈｕ−ＣＤ３陽性）上、または非ｈｕ−Ｔ細胞（ｈｕ−ＣＤ３陰性）上の脾臓におけるｈｕ−ＰＤ−Ｌ１発現について観察されなかった。Ｋｉ６７、リンパ球増殖のマーカーは、脾臓において陰性対照処置群に対してＰＦ−０６８１５９１−処置群からのｈｕ−ＣＤ３陽性細胞内で上昇した（中央パネル）。同様の結果が血液および肝臓において見られた。
異種−ａＧｖＨＤ中のサイトカイン放出に対するｍＡｂ７の効果を検査するために、ｈｕ−ＣＤ４５陽性細胞（肝臓および脾臓からの）をマウスＣＤ４５陽性細胞からさらに単離した。次いでこれらのリンパ球を３７℃で８時間ＰＭＡおよびイオノマイシンの混合物で処置し（２つの濃度：低対高で）、または未処置のままにした。サイトカイン分泌をＣＢＡによって上清中で測定した（表１８）。検出可能なサイトカインは、刺激なしで得られなかった（表１８）。ｍＡｂ７処置後、ｈｕ−ＩＦＮ−γ、ｈｕ−ＩＬ−２、およびｈｕ−ＴＮＦ−αは、対照群と比較してマウス脾臓および肝臓区画の両方から単離したヒトリンパ球において上昇した。弱いｅｘ ｖｉｖｏ刺激条件下で、ｍＡｂ７処置Ｔ細胞は、ｈｕ−ＩＦＮ−γ分泌を陰性対照群から単離したＴ細胞のものより有意に高いレベルまで増大させた（ｐ≦０．０５）。強いｅｘ ｖｉｖｏ刺激条件下で、すべてのサイトカインが、すべての群において誘導されたが、陰性対照から単離したＴ細胞と比較したｍＡｂ７処置Ｔ細胞内でさらに増大した。表１８は、それぞれの群中の５匹の異なるマウスから収集したデータを示す。表１８において、ｍＡｂ７対陰性対照群を比較する対応のないｔ−検定において＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ａＧｖＨＤ＝急性移植片対宿主疾患；Ｈｕ＝ヒト；ＩＦＮ−γ＝インターフェロンγ；ＩＬ−２＝インターロイキン−２；Ｉｎｏ＝イオノマイシン；Ｎ＝数；ｎｓ＝有意でない；Ｐ＝Ｐ値；ＰＭＡ＝ホルボールミリステートアセテート；ＴＮＦα＝腫瘍壊死因子α；Ｘｅｎｏ＝異種。
Figure 2018503365
これらの結果は、異種−ａＧｖＨＤを抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７で処置すると、体重減少、Ｔ細胞増殖、およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含めたサイトカイン分泌の増大によって測定した場合、ＮＳＧマウスにおける異種−ａＧｖＨＤ発達が加速したことを実証する。
（実施例１２）
抗ＰＤ−１抗体の特徴付け
本実施例は、表面受容体ＰＤ−１を発現する細胞に対する抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７の結合親和性、特異性、およびリガンド遮断活性を例示する。
ｍＡｂ７、陰性対照抗体、および陽性対照抗体を、実施例１０で上述した通り生成した。フィコエリトリン（ＰＥ）またはブリリアントバイオレット（ＢＶ）−７８６で一次標識された抗ｈｕ−ＰＤ−１抗体クローンＥＨ１２．１、および同じ色素で標識されたアイソタイプ対照抗体をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。ＰＥ−標識抗マウス ＰＤ−１クローンＪ４３および抗ハムスターＩｇＧアイソタイプ対照抗体をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ビオチン化ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１およびビオチン化ｈｕ−ＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３）をＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）から得た。カニクイザルＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）から購入し、製造者のプロトコールによって指示された通りＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タンパク質標識キット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７色素で、両方を社内で標識した。カニクイザルＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２をカニクイザルＰＤ−１発現細胞株への結合について試験した。ラットおよびマウス−ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｔａｇｓ（Ｃ末端におけるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域）を、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）から購入した。ビオチン化ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の検出は、ストレプトアビジンＰＥまたはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実現した。ラットまたはマウス−ＰＤ−Ｌ１の検出は、ＡＰＣ標識Ｆｃガンマ（Ｆｃγ）断片特異的ロバ抗ヒトａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用して実現した。
一過性トランスフェクションのためのベクター
Ｈｕ−ＰＤ−１発現プラスミド（ｐＣＭＶ６−エントリーベクター中）をＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、カタログ番号ＲＣ２１０３６４／受託番号ＮＭ＿００５０１８から購入した。
マウス−ＰＤ−１発現プラスミド（ｐＣＭＶ６−エントリーベクター中）をＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、カタログ番号ＭＲ２２７３４７／受託番号ＮＭ＿００８７９８から購入した。カニクイザル−ＰＤ−１は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ロット番号１４８２１４９／受託番号ＥＦ４４３１４５によってコドン最適化および合成された。これを、Ｃ末端にＣ末端ＦＬＡＧタグを付加したマウスκ分泌シグナル配列とインフレームで独自のＰｆｉｚｅｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベース発現プラスミド中にクローニングした。
ラット−ＰＤ−１デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を受託番号ＮＭ＿００１１０６９２７からの配列に従ってカスタム合成し、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製発現ベクターｐＥＦ１Ｖ５−Ｈｉｓ、ロット番号１５９８３０５のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位中にクローニングした。
安定なトランスフェクションのためのＰＤ−１発現ベクター
Ｈｕ−ＰＤ−１ ＤＮＡを受託番号ＮＭ＿００５０１８からの配列に従ってカスタム合成し、ＩｎＶｉｔｒｏＧｅｎ発現ベクターｐＥＦ１Ｖ５−Ｈｉｓ Ｂ；ロット番号５１３４７８のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位中にクローニングした。
カニクイザル−ＰＤ−１ ＤＮＡを受託番号ＥＦ４４３１４５に従ってカスタム合成し、ＩｎＶｉｔｒｏＧｅｎ発現ベクターｐＥＦ１Ｖ５−Ｈｉｓ Ｂ、ロット番号１４８２１４９のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位中にクローニングした。
マウス−ＰＤ−１ ＤＮＡを受託番号ＮＭ＿００８７９８に従ってカスタム合成し、ＩｎＶｉｔｒｏＧｅｎ発現ベクターｐＥＦ１Ｖ５−Ｈｉｓ Ｂ、ロット番号１５１３４７６のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位中にクローニングした。
すべてのベクターは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって合成され、ＩｎＶｉｔｒｏＧｅｎ発現ベクターｐＥＦ１Ｖ５−Ｈｉｓ Ｂ中にクローニングされた。すべてのベクターは、細胞外ドメイン、膜ドメイン、および細胞質ゾルドメインを含む完全なＰＤ−１配列を含有する。すべてのベクターは、ＰＤ−１のＣ末端でＶ５−６Ｈｉｓエピトープタグをコードした。ネオマイシン耐性遺伝子を、Ｇ４１８硫酸塩抗生物質を使用して選択するためにそれぞれのベクター中に含めた。
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を使用する一過性トランスフェクション
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ（商標）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入し、細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＧｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中に維持し、６％の二酸化炭素（ＣＯ２）中で、３７℃で増殖させた。トランスフェクションの１日前に、細胞をトリプシン処理し、Ｔ７５フラスコ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）１つ当たり４×１０６細胞で蒔いた。トランスフェクションの日に、予熱した抗生物質フリー増殖培地に古い培地と取り替え、細胞を６％のＣＯ２中３７℃で２時間さらにインキュベートした。発現ベクターまたは空ベクター（１０μｇ）をＯｐｔｉＭＥＭ培地１．５ｍＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に添加した。次いでリポフェクタミン２０００試薬（２０μｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を別のＯｐｔｉＭＥＭ １．５ｍｌに添加した。次いでプラスミドＯｐｔｉＭＥＭおよびリポフェクタミンＯｐｔｉＭＥＭ管を一緒に混合し、室温で２５分間インキュベートした。次いでＯｐｔｉＭＥＭ混合物を適切な培養フラスコに滴下して添加し、フラスコを６％のＣＯ２中３７℃で一晩放置した。翌日、培地をフラスコから取り出し、完全増殖培地に置き換えた。トランスフェクションして四十八（４８）時間後に、細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ−Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して回収し、それによって細胞をＰＤ−１表面発現に影響することなく培養表面から穏やかに取り出すことを可能にした。次いで細胞を抗体結合および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析に付した。
ジャーカット細胞株を使用する安定なトランスフェクション
ジャーカット細胞株（クローンＥ６−１−ＴＩＢ−１５２（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用してｈｕおよびカニクイザル−ＰＤ−１を安定に発現させた。細胞株を、Ａｍａｘａ ｎｅｃｌｕｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を介して電気穿孔を使用して生成した。トランスフェクションは、製造者のプロトコールによって指示された通りＫｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用してＰｆｉｚｅｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）において実施した。細胞を、０．３〜１．０×１０６細胞／ｍｌの間の密度で、５％ＣＯ２中３７℃で１０％のＦＢＳおよび１×Ｌ−グルタミンを補充した増殖培地Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＲＰＭＩ）−１６４０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で維持した。ベクターのそれぞれについて、２×１０６細胞をトランスフェクトするのに２μｇ／ｍＬを使用した。トランスフェクション後、細胞を、安定トランスフェクション細胞の選択および維持のために２週間Ｇ４１８硫酸塩（６００μｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた。長期の汚染を防止するために、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを培地に添加した。単一細胞クローンを、１：２００（Ｇ４１８硫酸塩抗生物質を補充した完全培地２００μＬ中１細胞）の希釈液中で細胞を培養することによって選択した。高いｈｕまたはカニクイザル−ＰＤ−１を発現するクローンを選択するために、ＰＥ標識抗ｈｕ−ＰＤ−１クローンＥＨ１２．１をフローサイトメトリーアッセイにおいて使用した。試料を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して収集した。データ分析および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して計算した。高いＭＦＩを有する細胞株をアッセイ進展のために選択した。
ｈｕ−、カニクイザル−、マウス−、もしくはラット−ＰＤ−１ベクター、または空ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション後４８時間において回収した。ｍＡｂ７と結合させる前に、それぞれの特定のトランスフェクションからの細胞を市販抗体またはリガンドを用いて試験して、適切なＰＤ−１受容体が細胞表面上で高度に発現されたことを保証した。ヒトおよびカニクイザルに関して、交差反応性の市販の抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．１）を使用した。マウスに関して、市販の抗マウス−ＰＤ−１抗体（クローンＪ４３）を使用した。ラットに関して、ラット−ＰＤ−Ｌ１リガンドを使用した（利用可能な市販のラット交差反応性抗ＰＤ−１抗体がないため）。適切なＰＤ−１発現を確認した後、細胞をカウントし、２×１０５細胞をｈｕ−Ｆｃ受容体結合阻害剤機能グレード混合物（１μｇ／１×１０６細胞のＦｃγ受容体ブロック、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに２０分間インキュベートし、ライブ／デッド染色に使用される青色蛍光反応性染料を混合物に添加した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ｍＡｂ７または陰性対照（１〜０．００００１μｇ／ｍＬ）抗体の連続希釈液を細胞混合物に添加し、次いで氷上で１時間インキュベートさせた。次いで細胞を洗浄し、ＡＰＣ標識ロバ−抗ヒト−ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ＩｇＧ、Ｆｃγ特異的（１：１００希釈液）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を混合物に添加し、その後、細胞を氷上でさらに３０分間インキュベートした。データをＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。
ｈｕ−、カニクイザル−、またはマウス−ＰＤ−１受容体をトランスフェクトされた安定なジャーカット細胞クローンを生成した。それぞれの種からこれらのアッセイのために選択したＰＤ−１細胞クローンは、同様の量のＰＤ−１受容体を発現した（約４００，０００受容体／細胞；受容体は、これらの細胞株の生成中に以前に定量化した）。適切なＰＤ−１発現を確認した後、細胞をカウントし、２×１０５細胞をｈｕ−Ｆｃ受容体結合阻害剤機能グレード（１μｇ／１×１０６細胞のＦｃγ受容体ブロック、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに２０分間インキュベートし、ライブ／デッド染色に使用される青色蛍光反応性染料を混合物に添加した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ｍＡｂ７、陽性対照１、陽性対照２、または陰性対照抗体（ＩｇＧ４フレームワークを使用する）の連続希釈液（１：３）を細胞混合物に添加し、次いで氷上で１時間インキュベートさせた。次いで細胞を洗浄し、ＡＰＣ標識ロバ−抗ヒト−ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ＩｇＧ、Ｆｃγ特異的（１：１００希釈液）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を混合物に添加し、次いで細胞を氷上でさらに３０分間インキュベートした。データをＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で取得した。分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して行い、幾何平均を計算した。ＥＣ５０値を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌｏｇアゴニスト対応答［結合］）を使用して計算した。
高レベルのＰＤ−１受容体を発現する活性化Ｔ細胞を生成した。適切なＰＤ−１発現を、市販の試薬（ヒトおよびカニクイザルについて抗ｈｕ−ＰＤ−１クローンＥＨ１２．１、マウス−ＰＤ−１について抗マウス−ＰＤ−１クローンＪ４３、ならびにラット−ＰＤ−１についてラット−ＰＤ−Ｌ１）を使用してそれぞれの種から得たＴ細胞について確認した。細胞をカウントし、１×１０６細胞をｈｕ−Ｆｃ受容体結合阻害剤機能グレード（１μｇ／１×１０６細胞のＦｃγ受容体ブロック、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに２０分間インキュベートし、ライブ／デッド染色に使用される青色蛍光反応性染料を混合物に添加した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ｍＡｂ７の連続希釈液（１：３の希釈）を細胞混合物に添加し、次いで氷上で１時間インキュベートさせた。次いで細胞を洗浄した後、ＡＰＣ標識ロバ−抗ヒト−ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ＩｇＧ、Ｆｃγ特異的二次抗体（１：１００の希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を添加し、細胞を氷上でさらに３０分間インキュベートした。データをＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で取得した。データ分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して行った。幾何平均をカウントし、ＥＣ５０値を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌｏｇアゴニスト対応答［結合］）を使用して計算した。
高レベルのｈｕ−ＰＤ−１を発現する安定なジャーカット細胞クローンをアッセイのために選択した。二十（２０）μｇ／ｍＬのビオチン化ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１またはビオチン化ｈｕ−ＰＤ−Ｌ２は、この細胞株上のすべてのＰＤ−１受容体を飽和させた（結合滴定アッセイを予見した後）。したがって、この濃度を本発明者らの試験における最適濃度として選択した。Ｈｕ−ＰＤ−１発現ジャーカット細胞（２×１０５）をｈｕ−Ｆｃ受容体結合阻害剤機能グレード（１μｇ／１×１０６細胞のＦｃγ受容体ブロック、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに２０分間インキュベートし、ライブ／デッド染色に使用される青色蛍光反応性染料を同様に混合物に添加した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ビオチン化ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１またはビオチン化ｈｕ−ＰＤ−Ｌ２を２０μｇ／ｍＬで細胞に添加し、直後にｍＡｂ７、陽性対照１、陽性対照２、または陰性対照抗体の連続希釈液を添加した（すべてＩｇＧ４骨格中かつ１：３の連続希釈液中）。細胞を氷上で１時間インキュベートさせた。次いで細胞を洗浄し、ＰＥストレプトアビジン（１：１００希釈液）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートさせた。次いでデータをＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析し、幾何平均を計算した。ＩＣ５０値をＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌｏｇ阻害剤対応答［結合］）を使用して計算した。
ジャーカット細胞に高レベルのｈｕまたはカニクイザル−ＰＤ−１受容体を安定にトランスフェクトした。カニクイザル−ＰＤ−１受容体を発現する細胞（約４００，０００受容体／細胞）をこのアッセイのために選択した。カニクイザル−ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２結合を、これらの細胞を使用して試験し、結果は、２０μｇ／ｍＬのカニクイザル−ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２は、この細胞株に結合しているとき異なる濃度（５０ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ）のこれらのリガンドについて試験した幾何平均に基づいてすべてのＰＤ−１受容体を飽和させるのに十分であることを示した。カニクイザル−ＰＤ−１発現ジャーカット細胞（２×１０５）をｈｕ−Ｆｃ受容体結合阻害剤機能グレード（１μｇ／１×１０６細胞のＦｃγ受容体ブロック、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに２０分間インキュベートし、ライブ／デッド染色に使用される青色蛍光反応性染料を混合物に添加した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−６４７−カニクイザルＰＤ−Ｌ１またはＡｌｅｘａ−−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−６４７−カニクイザルＰＤ−Ｌ２を２０μｇ／ｍＬで細胞に添加し、直後に異なる濃度のｍＡｂ７、陽性対照１、陽性対照２、または陰性対照抗体を添加した（ＩｇＧ４骨格を使用して、１：３の連続希釈液中）。次いで細胞を氷上で１時間インキュベートさせた。洗浄後、細胞をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で取得した。データ分析をＦｌｏｗｊｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して行い、幾何平均を計算した。ＩＣ５０値をＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌｏｇ阻害剤対応答［結合］）を用いて計算した。
スタンフォード血液センター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ）から購入したヒトバフィーコートを、ＰＢＳで希釈し、ＰＢＭＣを単離するためにフィコール上に層状に重ねた。ＰＢＭＣをＰＢＳで４回洗浄した。ＲＢＣを、製造者のプロトコールに示されたようにＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して溶解させた。ＲＢＣ溶解後、細胞を再び洗浄し、１ｍＬ当たり５×１０７細胞でＰＢＳ中に希釈した。ＰＢＭＣの半分をカウントし、凍結培地（１０％のジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］を伴う９０％のＦＢＳ）中に凍結させ、残っている細胞をＴ細胞精製に付した。
残っているＰＢＭＣから、Ｔリンパ球を、製造者のプロトコールに記載の負の選択とともにｈｕ特異的Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離した。
ＡＤＣＣアッセイに関して、新たに単離したＴ細胞（標的細胞）をカウントし、１ｍＬ当たり１×１０６Ｔ細胞を無血清Ｘ−ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で被覆したビーズ（Ｔ細胞展開および活性化のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））および１００Ｕ／ｍＬの組換えヒト（ｒｈ）−ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して刺激した。培養物を５％のＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。Ｔ細胞活性化が４８時間の時点に到達したとき、ＰＢＭＣ（同じドナーに由来するエフェクター細胞）を解凍し、カウントし、次いで１０％のＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で合計１８〜２４時間、ｒｈ−ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ〜５×１０６細胞／培養液１ｍＬ）で刺激した。アッセイの日に、両細胞型をカウントし、フローサイトメトリーによって試験して適切な活性化を保証した。Ｔ細胞について、高ＰＤ−１の発現を検査し、ＰＢＭＣについて、ＡＤＣＣを媒介する受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２、およびＣＤ６４（それぞれＦｃ−γ受容体−［ＦｃγＲ］ＩＩＩ［ａおよびｂ］、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ）の発現レベルを検査した。抗体：ｍＡｂ７（ＩｇＧ４およびＩｇＧ１フレームワーク）、および陽性対照抗体を添加した後、平底９６ウェル組織培養処理プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）中に５：１のエフェクターと標的の比（これが最適な比であったので）で細胞を蒔いた。すべての抗体を０．０１〜１００μｇ／ｍＬの濃度で（１：１０の連続希釈液で）試験した。最大溶解を評価するための標的細胞単独、エフェクター細胞単独、および抗体を添加しない５：１の比のエフェクターと標的を含むアッセイ対照を添加した。アッセイプレートを、５％のＣＯ２中３７℃で４時間インキュベートした。データを、製造者のプロトコールによって指示された通りＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＳ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して分析した。アッセイにより、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、細胞溶解すると放出される安定な細胞質内酵素が定量的に測定された。細胞傷害性のパーセント（％）を、＝１００×（実験的なＬＤＨ放出［ＯＤ４９０］／最大ＬＤＨ放出［ＯＤ４９０］）として測定した。最大ＬＤＨ放出は、標的細胞単独（Ｔ細胞）細胞が化学的に溶解して最大殺傷を得たとき計算した。
ｍＡｂ７のｈｕ−、カニクイザル−、マウス−、およびラット−ＰＤ−１に結合する能力を、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株、初代活性化Ｔ細胞、ならびにｈｕ−ＰＤ−１またはカニクイザル−およびマウス−ＰＤ−１を安定にトランスフェクトされたジャーカット細胞を含んでいたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）細胞ベース結合アッセイを使用して評価した。ｍＡｂ７は、高親和性でｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１の両方に結合し、２種について同様のＥＣ５０値を示した（これらのアイソフォームのアミノ酸配列は、分析した種のうちで最も同様である）。データを表１９、２０、および２１に要約する。マウス−ＰＤ−１への結合は、生物学的に無関係であり、親和性成熟プロセスに起因し得る高濃度のｍＡｂ７においてのみ実現された。ｍＡｂ７の結合は、トランスフェクション細胞または活性化初代Ｔ細胞を使用したとき、ラット−ＰＤ−１について検出されなかった（表１９）。
Figure 2018503365
Figure 2018503365
表２０において、それぞれの数値は、異なるドナーへのｍＡｂ７結合のＥＣ５０値を表す。最下行は、平均±ｓｅｍを表す。ｓｅｍ＝平均の標準誤差。
Figure 2018503365
表２１において、それぞれの数値は、単一実験におけるｍＡｂ７結合についてのＥＣ５０値を表す。＊平均±ｓｅｍを表す。ｍＡｂ（ＩｇＧ４）＝ＩｇＧ４フレームワークを有するモノクローナル抗体；ＰＤ−１＝プログラム死−１；ｓｅｍ＝平均の標準誤差。
ｈｕ−およびカニクイザル−ＰＤ−１の両方へのｍＡｂ７結合を、異なる細胞ベースアッセイシステムを使用して検査した。すべてのシステムにおいて、結合は、両方の種において高い親和性および特異性を伴うものであることが判明した。ｈｕ−またはカニクイザル−ＰＤ−１を発現したＨＥＫ−２９３Ｔ一過性トランスフェクション細胞株を使用して、ｍＡｂ７は、ＭＦＩによって示されたものと同様の結合パターンを示した。最小限の結合〜結合なしが、空ベクター（ビヒクル）をトランスフェクトした親細胞株において観察された
活性化ｈｕ−およびカニクイザル−初代Ｔ細胞へのｍＡｂ７結合のＥＣ５０値を、細胞表面上のＰＤ−１発現および細胞生存能が最適であった活性化後７２時間において判定した（表１９）。ＥＣ５０値は、それぞれの種の２つの異なるドナーについて計算した（表２０）。ｈｕ−およびカニクイザル−活性化Ｔ細胞の両方において、低ＥＣ５０値が得られ、ＥＣ５０値は、２つの種間で近い、それぞれ５１．０４±５．０７ｐＭおよび８５．３４±１１．７３ｐＭ（平均±平均の標準誤差［ｓｅｍ］）ことが判明した。結合は、陰性対照抗体についてベースライン値を超えて観察されかった。
ｈｕ−ＰＤ−１受容体を最小限で発現するジャーカットＴ細胞株を使用して、安定にトランスフェクトされたｈｕ−ＰＤ−１、カニクイザル−ＰＤ−１、およびマウス−ＰＤ−１細胞株を生成した。細胞株をサブクローニングし、高レベルのｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１受容体を発現するクローンを選択した（１細胞当たり約４００，０００ＰＤ−１受容体が得られた最高の発現であった）。このシステムでは、ｍＡｂ７は、ｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１受容体に対して高親和性を示した。２つの種についてのＥＣ５０値は、初代活性化Ｔ細胞データと同様であった（表２１）；ｈｕ−ＰＤ−１についてＥＣ５０＝６４．７２５±１．８９およびカニクイザル−ＰＤ−１について２２２．５５±４１．３。カニクイザル−ＰＤ−１発現細胞のＥＣ５０値は、２つ実験作業間でヒトＥＣ５０値よりばらついた。２つの種のデータは、任意の所与の繰り返しにおいて使用した陽性対照抗体で得たデータと同様であった（表２１）。陰性対照抗体は、実験的繰り返しのいずれにおいてもベースライン値を超えて結合を呈さなかった。ＰＤ−１受容体との相互作用からＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンドを遮断するｍＡｂ７の能力を、ＰＤ−１−トランスフェクションジャーカット細胞株（ｈｕ−ＰＤ−１またはカニクイザル−ＰＤ−１を発現する）において検査した。このアッセイでは、細胞を、異なる濃度の未標識ｍＡｂ７とともにインキュベートした後、飽和濃度の標識リガンドとともにインキュベートした。表２２に示したように、ｍＡｂ７は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンドを用量依存的な様式でＰＤ−１受容体への結合から阻害した。ＰＤ−１の陽性対照抗体は、同等の阻害を示した。ｍＡｂ７のＩＣ５０は、ｈｕ−とカニクイザル−ＰＤ−１との間で同等であった（ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１およびｈｕ−ＰＤ−Ｌ２についてそれぞれ８８０．１５±２８９．８５および１０５８±３５５．４；ならびにカニクイザル−ＰＤ−Ｌ１およびカニクイザル−ＰＤ−Ｌ２についてそれぞれ９４２．９±１１０．１および８３９±８９．５）。ＩＣ５０値の概要を表２２に提供する。表２２において、それぞれの数値は、単一実験でのｍＡｂ７のＩＣ５０値を表す；＊平均±ｓｅｍを示す；‡括弧内で繰り返し数を示す；ｍＡｂ ＩｇＧ４＝ＩｇＧ４フレームワークを有するモノクローナル抗体；ＰＤ−１＝プログラム死−１；ＰＤ−Ｌ１＝プログラム死−リガンド１；ＰＤ−Ｌ２＝プログラム死−リガンド２；ｓｅｍ＝平均の標準誤差。
Figure 2018503365
ｍＡｂ７は、補体コンポーネント１、ｑサブコンポーネント（Ｃ１ｑ）、およびＣＤ６４に対して弱い結合を示した。Ｃ１ｑおよびＣＤ６４（ＩｇＧ４フレームワークの）は、それぞれ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）およびＡＤＣＣの潜在的なサロゲートであると考えられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞の殺傷を誘導するｍＡｂ７の能力の欠如をさらに調査するために、ＡＤＣＣアッセイを、高レベルのＰＤ−１受容体を発現する活性化Ｔ細胞（標的細胞）および高レベルのＦｃγ受容体を発現したＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を用いて実施した。細胞は、２人の健康なドナーから選択した。ｍＡｂ７（その元のＩｇＧ４フレームワーク中）は、両ドナーにおいて最小限のＡＤＣＣ活性を示した。ＡＤＣＣ活性の欠如は、ＩｇＧ４フレームワーク中の抗ＰＤ−１陽性対照抗体が呈した活性と一致し、両方は、陰性対照ＩｇＧ４抗体と同様であった。抗ＰＤ−１（ｍＡｂ７または陽性対照抗ＰＤ−１抗体）を、より強いＡＤＣＣを誘導することが公知であるヒトＩｇＧ１フレームワークにおいて評価したとき、抗ＰＤ−１は、抗体がＩｇＧ４フレームワーク中にあるとき、最大で４倍高いＡＤＣＣを誘導した。最大ＬＤＨ放出を、標的細胞単独（Ｔ細胞）を化学的に溶解させて最大殺傷を得たとき計算した（殺傷は、アッセイ計算によってそれぞれのドナーについて１００％溶解と推定した）。ＩｇＧ１フレームワークを使用するＴ細胞溶解は、活性化Ｔ細胞上のＰＤ−１のレベルに対応し（ドナー１のＰＤ−１発現および溶解は、ドナー２より高い）、アッセイの精度を確認する。
これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７が、試験システムに応じて４６〜２７０ｐＭの間の範囲のＥＣ５０を伴って、細胞上で発現されるｈｕ−およびカニクイザル−ＰＤ−１受容体に高親和性で結合することを実証する。ｍＡｂ７は、生理的濃度においてマウス−ＰＤ−１またはラットＰＤ−１を発現する細胞に結合しなかった。ｍＡｂ７は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンドが細胞表面ＰＤ−１受容体と相互作用するのを遮断した。ＩＣ５０値は、５００〜１０００ｐＭの範囲であり、リガンド結合を介して誘導されるＰＤ−１機能の遮断におけるその高いアンタゴニスト機能を示した。そのＩｇＧ４フレームワークにおけるｍＡｂ７は、最小限〜なしの抗体誘導細胞傷害性を誘発した。それは、ＩｇＧ４抗体の性質と一致する。
（実施例１３）
標識フリーバイオセンサーおよびＥＬＩＳＡを使用するＰＤ−１、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲ、およびＣ１Ｑへの抗ＰＤ−１抗体ｍＡｂ７結合の特徴付け
本実施例は、ＳＰＲバイオセンサーを使用する毒性学試験に関連した様々な種に由来する組換え精製ＰＤ−１に対するｍＡｂ７のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合親和性を例示する。ＦＣＧＲおよびＦｃＲｎにエンゲージするｍＡｂ７のＦｃ領域の能力もＳＰＲによって試験して、それがアイソタイプマッチ対照のものと一致する性質を呈することを確認した。ＥＬＩＳＡによって、ｍＡｂ７およびアイソタイプマッチ対照を、ヒトＣ１ｑへの結合についてアッセイした。ＰＤ−１のそのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との結合相互作用を遮断するｍＡｂ７の能力も、標識フリーバイオセンサーによって試験してその作用機序を支持した。
すべての速度論的および親和性実験は、別段の明言のない限り、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０ランニング緩衝液中２５℃で行った。速度論的試験は、ＮＬＣ（ニュートラビジン被覆）チップを備えたＳＰＲ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で実施した。ＰｒｏｔｅＯｎは、参照標準としてのｍＡｂ７に対する滴定を介してｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１分析物の活性濃度を判定するのにも使用した。ここで使用したタンパク質分析物の濃度は、「活性な」または「名目上の」値を指す。ヒトＦｃγ受容体（ｈｕ−ＦＣＧＲ）Ｉ、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈｕ−ＦｃＲｎ）（ロット番号Ｒ３０９１）、およびカニクイザル−新生仔Ｆｃ受容体（カニクイザル−ＦｃＲｎ）（ロット番号ＪＣＲ）の活性濃度を、ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）でキャリブレーションフリー濃度分析（ＣＦＣＡ）実験を使用して判定した。すべての他の分析物は、適切な吸光係数を用いたＡ２８０ｎｍの吸光度によって判定されたこれらの名目上の濃度で使用した。溶液親和性は、オートサンプラーを備えたＫｉｎＥｘＡ機器３０００または３２００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）を使用して室温（およそ２３℃）で判定した。二次検出抗体を、製造者の指示に従ってＤｙＬｉｇｈｔ ６５０（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ．）で標識した。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ビオチン化は、製造者の指示に従ってＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して等モル比のリンカー：ＩｇＧで実施した。別段の明言のない限り、固定化されたＩｇＧは、Ｐｉｅｒｃｅ ＩｇＧ溶出緩衝液（ｐＨ２．８）／４Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の２：１ｖ／ｖ混合物を含む「Ｐｉｅｒｃｅ／塩」カクテルで再生した。
ｍＡｂ７に対するｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１（ともにＨｉｓ−タグ付きモノマー）の結合相互作用を、ＰＢＳ＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０のランニング緩衝液およびＰＢＳ＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０＋１ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の試料緩衝液中でＫｉｎＥｘＡ法を使用して溶液中で判定した。２つの異なるアッセイフォーマットを使用した。第１のアッセイフォーマットでは、ｍＡｂ７を滴定して一定濃度のｈｕ−ＰＤ−１（名目上の２００、４００、または４０００ｐＭ）にし、試料を平衡状態に到達させた。遊離ｈｕ−ＰＤ−１を、抗ｈｕ−ＰＤ−１モノクローナル抗体ｍＡｂ７（非優良試験所規範（ＧＬＰ）条件下で社内で調製した［ロット番号Ｒ５４３２］）で被覆されていた（吸着によって）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ上に捕捉した。次いでビーズに捕捉されたｈｕ−ＰＤ−１を０．５μｇ／ｍＬのＤｙｌｉｇｈｔ標識抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で検出した。第２のアッセイフォーマットでは、ｈｕ−ＰＤ−１またはカニクイザル−ＰＤ−１を滴定して一定濃度のｍＡｂ７（２０、５０、１００、または５００ｐＭ）にし、これらの混合物を平衡化させた。遊離ｍＡｂ７を、遊離ｍＡｂ７に特異的に結合するがＰＤ−１飽和ｍＡｂ７に特異的に結合しないブロッカー抗イディオタイプマウス抗ｍＡｂ７ ｍＡｂ １６９９．１Ｈ６を吸着したＰＭＭＡビーズ上に捕捉した。次いでビーズに捕捉されたｍＡｂ７を、Ｄｙｌｉｇｈｔ標識ヤギ抗ｈｕ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で検出した。すべての滴定は、実験に応じて範囲１ｎＭ〜１０ｎＭ内に入るように最高名目上結合部位濃度を変更して１２メンバーの２倍希釈系列として調製した。試料を最大で４８時間平衡化し、注射量を、範囲０．７Ｖ〜１．９Ｖ内に入った総シグナルを与えるように１実験当たりで調整した。すべての試料は、二つ組のサイクルで注射した。１相互作用当たり最大で４つの独立した実験からのデータを、分析ソフトウェアのＮ曲線ツールを使用して包括的に分析し、単純な二分子モデルにフィッティングし、この場合、ｍＡｂ７の濃度を参照濃度として使用した。大域解析は、ＰＤ−１のＫＤおよび見かけ上の活性結合部位濃度について最良フィット値（および９５％の信頼区間）を報告する。
溶液中のｍＡｂ７に対するｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１の結合親和性は、ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用して試験したとき互いに区別不能であり；２３℃での見かけ上の平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｈｕ−ＰＤ−１について１７ｐＭまたは２３ｐＭ（反対のアッセイ方向で試験したとき）、およびカニクイザル−ＰＤ−について２８ｐＭと判定され；これらの３つの値は、互いに統計的に区別不能であった。これらの値は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー測定によって再現され、それは、２５℃でｈｕ−ＰＤ−１について４２ｐＭおよびカニクイザル−ＰＤ−１について６９ｐＭならびに３７℃でｈｕ−ＰＤ−１について１０９ｐＭおよびカニクイザル−ＰＤ−１について１１５ｐＭのＫＤ値を生じた。ｍＡｂ７は、０．９μＭのＫＤ値でマウス−ＰＤ−１に結合し、ＳＰＲ速度論的分析を用いて０．５μＭで試験したとき、ラット−ＰＤ−１に対して結合は検出されなかった。標識フリーバイオセンサーを使用して、ｍＡｂ７が、ｈｕ−ＰＤ−１がその天然リガンド、ヒトプログラム死−リガンド１（ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１）、およびヒトプログラム死−リガンド２（ｈｕ−ＰＤ−Ｌ２）に結合するのを遮断することを実証した。ＳＰＲをさらに使用して、ｍＡｂ７が、アイソタイプマッチ対照と同じ速度論および特異性でヒトおよびカニクイザル種の両方に由来する一連の断片結晶性（Ｆｃ）γ受容体（ＦＣＧＲ）および新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することを確認した。ＥＬＩＳＡによって、ｍＡｂ７は、アイソタイプマッチ対照の挙動と一致して、補体コンポーネント１、ｑサブコンポーネント（Ｃ１ｑ）への無視できる結合を示した。全体的に、ｍＡｂ７は、高い結合親和性および特異性でｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１の両方に結合するが、マウス−ＰＤ−１に対して低い親和性およびラット−ＰＤ−１に対して無視できる結合を有する。
表２３は、ｍＡｂ７の様々な種に由来するＰＤ−１との相互作用分析について得られた速度論的および親和性データを要約するものである。ｍＡｂ７は、これらの相互作用をＫｉｎＥｘＡ方法を使用して２３℃で溶液中で測定したとき、統計的に区別不能な見かけ上の親和性でｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１に結合し；見かけ上のＫＤ値は、ｈｕ−ＰＤ−１について１７ｐＭおよび２３ｐＭ（２つの反対のアッセイ方向で試験したとき）ならびにカニクイザル−ＰＤ−１について２８ｐＭであった。ＫｉｎＥｘＡ値は、ＳＰＲによって実施した速度論的測定によって確認され、それは、ｈｕ−ＰＤ−１について４２±１１ｐＭ（ｎ＝１０）およびカニクイザル−ＰＤ−１について６９±２４ｐＭ（ｎ＝１０）の２５℃での見かけ上のＫＤ値を与えた。３７℃でのＳＰＲ測定は、２５℃でのものより１／２弱い親和性を示し；３７℃でのＫＤ値は、ｈｕ−ＰＤ−１について１０９±８ｐＭ（ｎ＝１５）およびカニクイザル−ＰＤ−１について１１５±１５ｐＭ（ｎ＝８）であると判定された。ｍＡｂ７は、ＳＰＲによって２５℃で測定したとき、０．９±０．１μＭ（ｎ＝５）の見かけ上のＫＤでマウスＰＤ−１に結合し、ｈｕ−ＰＤ−１についてのものより１／２０，０００弱い親和性に対応した。ＳＰＲによって２５℃で、０．５μＭで試験したとき、ラット−ＰＤ−１について結合は検出されなかったが、ラット−ＰＤ−１タンパク質は、陽性対照、マウス−ＰＤ−Ｌ１、およびマウス−ＰＤ−Ｌ２へのこれらの明らかな結合を介して活性であることが確認された。ＫｉｎＥｘＡ測定についてのＫＤ値は、Ｎ回の独立した実験の大域解析の最良フィットおよび９５％信頼区間を表し、一方、ＳＰＲ測定についてのＫＤ値は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＮＬＣセンサーチップでのｎ回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。表２３において、ｈまたはｈｕ＝ヒト；ｋａ＝会合速度定数；ｋｄ＝解離速度定数；ＫＤ＝平衡解離定数；ＫｉｎＥｘＡ＝速度論的排除アッセイ；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；Ｍｓ＝１秒当たりのモル；ｎ＝数；ＮＤ＝判定せず；ＰＤ−１＝プログラム死−１；ｓ＝秒；ＳＰＲ＝表面プラズモン共鳴；Ｔｅｍｐ＝温度；＊ｈｕ−ＰＤ−１とのｍＡｂ７の相互作用は、Ｂｅｅら、２０１２に記載されたように２つの反対のアッセイ方向で試験した。
Figure 2018503365
表２４は、ヒトおよびカニクイザルの両方に由来するＦＣＧＲおよびＦｃＲｎを含めた一連のＦｃ受容体に対するｍＡｂ７についての結合速度論および特異性は、アイソタイプマッチアイソタイプ対照、ｈｕ−ＩｇＧ４について予期される値を再現したことを示す。例えば、ｍＡｂ７は、アイソタイプ対照についての１７７±７１ｐＭ（ｎ＝４）と比較して１４６±４２ｐＭ（ｎ＝１４）の２５℃での見かけ上のＫＤ値（平均±標準偏差）でｈｕ−ＦＣＧＲＩに結合した。すべての他の相互作用は、弱い親和性（約１μＭまたはそれ超のＫＤ値）によって特徴付けられた。速度論的分析は、ＦＣＧＲについてｐＨ７．４およびＦｃＲｎについてｐＨ５．９で、ＰｒｏｔｅＯｎ ＮＬＣチップで実施した。表２４において、ＣＤ＝分化のクラスター；ｃｙ＝カニクイザル；ＦＣＧＲ＝Ｆｃγ受容体；ＦｃＲｎ＝新生仔Ｆｃ受容体；ｈｕ＝ヒト；ｋａ＝会合速度定数；ｋｄ＝解離速度定数；ＫＤ＝平衡解離定数；Ｍｓ＝１秒当たりのモル；ｎ＝数；ｓ＝秒。
Figure 2018503365
さらに、ｍＡｂ７は、アイソタイプマッチ対照、ｈｕ−ＩｇＧ４の挙動と一致して、ＥＬＩＳＡによってＣｌｑにかろうじて結合する（データを示さず）。その結合は、ヒト免疫グロブリンＧ２（ｈｕ−ＩｇＧ２）の低い結合より低くさえあった。対照的に、陽性対照、ｈｕ−ＩｇＧ１、およびヒト免疫グロブリンＧ３（ｈｕ−ＩｇＧ３）は、高い結合シグナルを与えた。ＳＰＲおよびＯｃｔｅｔバイオセンサーの両方ならびに異なるアッセイフォーマット（ともにプレミックスおよび古典的なサンドイッチアッセイフォーマット）を使用して、ｍＡｂ７は、ｈｕ−ＰＤ１の天然リガンド、ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１およびｈｕ−ＰＤ−Ｌ２へのｈｕ−ＰＤ１結合を遮断することが実証された。
これらのデータは、ｍＡｂ７がｈｕ−ＰＤ−１に対して高親和性および高特異性で結合することを実証する。ＫｉｎＥｘＡ法を使用して２３℃で溶液中で測定したとき、ｍＡｂ７は、ｈｕ−ＰＤ−１について１７ｐＭおよび２３ｐＭ（交互のアッセイ方向で試験したとき）、ならびにカニクイザル−ＰＤ−１について２８ｐＭの統計的に区別不能な見かけ上のＫＤ値でｈｕ−ＰＤ−１およびカニクイザル−ＰＤ−１に結合した。ｍＡｂ７は、マウス−ＰＤ−１に対して１／２０，０００弱い親和性（ＳＰＲによって２５℃で０．９μＭの見かけ上のＫＤ）および０．５μＭで試験したときラット−ＰＤ−１への検出可能な結合なしを示した。ｍＡｂ７およびアイソタイプマッチ対照ｈｕ−ＩｇＧ４は、ＳＰＲによって２５℃で測定した場合、ｈｕ−およびカニクイザル−Ｆｃ受容体のパネルに対して試験したとき、同様の速度論および特異性で結合した。ｍＡｂ７は、ｈｕ−ＩｇＧ４アイソタイプ対照と一致して、ＥＬＩＳＡによって試験したとき、無視できるシグナルでｈｕ−Ｃｌｑに結合し、その結合は、ｈｕ−ＩｇＧ２のものより低くさえあった。ｍＡｂ７は、ｈｕ−ＰＤ−１がその天然リガンド、ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１、およびｈｕ−ＰＤ−Ｌ２への結合することを遮断することが実証された。
（実施例１４）
抗ＰＤ−１抗体および抗ＯＸ４０抗体を用いた組合せ療法
本実施例は、大腸がんについてのマウスモデルにおける抗ＯＸ４０抗体と組み合わせた抗ＰＤ−１抗体での処置の効果を例示する。
本試験のために、Ｃ５７Ｂ６／Ｊ雌マウス（生後６〜８週）の皮下に、５×１０５細胞／マウスでＭＣ−３８マウス結腸腫瘍（グレードＩＩＩ腺癌）を接種した。１０日目に、マウスをランダム化し、１０ｍｇ／ｋｇの抗マウス−ＰＤ−１および１ｍｇ／ｋｇの抗マウス−ＯＸ−４０で処置を始めた。処置は、抗ＯＸ４０抗体（１ｍｇ／ｋｇ）について、１０、１２、および１４日目に、ならびに抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）について１０、１２、１４、１７、２３、および２５日目にｉ．ｐ．投与した。腫瘍体積を週２回測定した。試験は、３４日目に終わらせた。統計分析を、２元配置ＡＮＯＶＡを使用して実施して、単一時点でそれぞれの２つの群間で平均を比較した。結果を表２５に要約する。表２５において、値は、示された日における腫瘍体積、１群当たり８匹のマウスの平均±（平均の標準誤差）ｓｅｍを示す；Ｎ＝１群当たりの数、ｍｍ２＝立方ミリメートル。アイソタイプ対照は、抗ＯＸ４０について１ｍｇ／ｋｇおよび抗ＰＤ−１について１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれの抗体の適切なアイソタイプを含んでいた。
Figure 2018503365
２４日目から始まって、すべての抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＯＸ−４０抗体処置群は、対照群と比較したとき、有意により小さい腫瘍体積を示した（表２５）。２４日目に、組合せ（抗ＰＤ−１抗体と抗ＯＸ４０抗体）処置群は、アイソタイプ対照群と比較したとき、ｐ≦０．０００１の有意性を示した一方、それぞれの単一抗体処置は、対照群と比較したとき、ｐ≦０．０１の有意性を示した。３４日目に、すべての処置群は、対照群と比較したとき、ｐ≦０．０００１の有意性を示した。３４日目に、組合せ処置群は、抗ＰＤ−１抗体単独処置群または抗ＯＸ−４０抗体単独処置群と比較したとき、差異を示した。これらの結果は、抗ＰＤ−１抗体および抗ＯＸ４０抗体の両方を用いた処置は、いずれかの抗体単独を用いた処置と比較したとき、腫瘍増殖を減速させたことを実証する。
（実施例１５）
活性化Ｔ細胞上のＰＤ−１の発現に対するワクチンの効果
本実施例は、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体トレメリムマブ（チェックポイント阻害剤）の存在下でのＣＤ３＋ＣＤ４（表２６）およびＣＤ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞（表２７）上のＰＤ−１の発現に対するヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現するＤＮＡベースワクチンの効果を例示する。
ｉｎ ｖｉｖｏ Ｓｔｕｄｙ手順。３つの群のチャイニーズカニクイザル（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（ｎ＝８／群）を試験で使用した。群１および２中の動物に、ヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０をコードするＡｄＣ６８アデノウイルスベクター（配列番号４４）を含有するワクチンを筋肉内注射し（２ｅ１１ ＶＰの合計用量で）、一方、群３中の動物は、ワクチン接種を受けなかった。ＡｄＣ６８アデノウイルスベクターの完全な配列は、配列番号４４に提供されている。さらに、ワクチン接種直後に、群２中の動物を、皮下注射によって抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体トレメリムマブ５０ｍｇで処置した。ワクチン接種前（Ｐｒｅ）および後のそれぞれの動物からの全血試料を、９、１５、および２９日目に収集し、フローサイトメトリーによってＰＤ−１発現ＣＤ３＋ＣＤ４およびＣＤ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度について分析した。
ＣＤ３＋ ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞フェノタイピング。白血球集団を、新たに収集した全血に対してマルチカラーフローサイトメトリー分析を実施することによってフェノタイピングした。簡単に言えば、全血を、ＣＤ３−Ｖ５００（クローンＳＰ３４−２）、ＣＤ４−ＢＶ６０５（クローンＬ２００）、ＣＤ８−ＡＰＣ．Ｈ７（クローンＳＫ１）、ＰＤ１−ＡＦ４８８（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＤＬ１−ＢＶ４２１（クローンＭＩＨ１）、Ｌａｇ３−ＰＥ．Ｃｙ７（クローン１１Ｅ３、Ｎｏｖｕｓ）、ＣＤ６９−ＰＥ．テキサスレッド（クローンＴＰ１．５５３、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＴＩＭ３−ＡＰＣ（クローン３４４８２３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ２０−ＰＥ．Ｃｙ５．５（クローン２Ｈ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１４−ＡＦ７００（クローンＭ５Ｅ２）、ＣＤ１６−ＰＥ．Ｃｙ５（クローン３Ｇ８）、ＣＤ５６−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５（クローンＢ１５９）、およびＣＤ１１ｃ−ＰＥ（クローンＳＨＣＬ３）を含有する抗体カクテルで、室温で２０分間染色した。すべての抗体は、別段に示されていない限りＢＤから購入した。試料を、ＲＢＣ溶解緩衝液（ＢＤ）で処理し、洗浄し、ビーズをカウントする液体（ＢＤ）５０ｍｌと混合し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）で取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
ＣＤ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞上のＰＤ−１発現の結果を表２６に提示し、ＣＤ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ−１発現の結果を表２７に提示する。ＰＤ−１の誘導が、ワクチン接種して９日後に観察され、ワクチン接種後２９日目までにナイーブ動物（群３）において見られるレベルまで消散した。これらの結果は、抗ＣＴＬＡ４抗体と一緒に与えられたワクチンベクターは、非ヒト霊長類においてＣＤ３＋ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ−１発現を誘発することができることを示す。
Figure 2018503365
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（実施例１６）
ヒトＰＳＭＡを発現するワクチンによって誘導される抗原特異的Ｔ細胞応答に対する抗ＰＤ−１抗体の効果
本実施例は、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）においてヒトＰＳＭＡを発現するＡｄＣ６８アデノウイルスベクターを含有するワクチンによって誘導されるＩＦＮγ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答に対する抗ＰＤ１抗体の効果を例示する。
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ。簡単に言えば、個々の動物からのＰＢＭＣを、各ペプチド２μｇ／ｍｌで、それぞれの抗原の全配列に及ぶ１１アミノ酸重複する１５ｍｅｒペプチドライブラリーからのペプチドのプールとともに共インキュベートした。プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で約１６時間インキュベートした。次いで細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞からの細胞内ＩＦＮγ発現を検出するために染色し、固定した。細胞をフローサイトメーターで取得した。応答の頻度を、ペプチドを含有しなかったジメチルスルホキシド対照ウェル中の応答を差し引いて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞１００万個当たりのＩＦＮγ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数に正規化した。表中の抗原特異的応答は、対応する抗原特異的ペプチドプールに対する応答の和を表す。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験手順。簡単に言えば、５つの群のチャイニーズカニクイザル（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（ｎ＝８／群）に、２ｅ１１ ＶＰの総用量でヒトＰＳＭＡ（ｈＰＳＭＡ）のアミノ酸１５〜７５０をコードするＡｄＣ６８アデノウイルス（配列番号４４）を含有するワクチンを筋肉内注射した。群２、４、および５におけるワクチン接種の直後に、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体トレメリムマブ５０ｍｇを皮下注射し、かつ／または抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ｍＡｂ７を１０ｍｇ／ｋｇで皮下（群３および４）もしくは静脈内（群５）に与えた。ＰＢＭＣをそれぞれの動物から単離し、ＩＣＣＳアッセイに付してヒトＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγＣＤ４（９日目もしくは２９日目）またはＣＤ８ Ｔ細胞応答（２９日目）を測定した。全長ヒトＰＳＡＭのアミノ酸配列は、配列番号４２に提供されている。ヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０を発現するＡｄＣ６８アデノウイルスベクターの配列は、配列番号４４に提供されている。
結果。結果を表２９、３０、および３１に提示する。データは、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１の両方は個々に、ワクチンによって誘導されるＩＦＮγ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答の頻度を増大させることができることを実証した。
Figure 2018503365
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（実施例１７）
ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を共発現するワクチンによって誘導されるＩＦＮγ Ｔ細胞応答に対する抗ＰＤ−１抗体の効果
ｉｎ ｖｉｖｏ試験手順。簡単に言えば、３つの群のチャイニーズカニクイザル（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（ｎ＝４／群）を試験で使用した。群１の動物にビヒクルを筋肉内注射した。群２の動物に、２０ｍｇ／ｋｇで皮下に抗ＰＤ−１モノクローナル抗体 ｍＡｂ７を投与した。群３の動物を、６ｅ１１ ＶＰの総用量で３種のヒト前立腺関連抗原（ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＡ）を共発現するＡｄＣ６８アデノウイルスベクター（ベクターＡｄＣ６８Ｗ−７３４）を含有するワクチンで処置し、直後に抗ＣＴＬＡ４抗体トレメリムマブ１５０ｍｇおよび２０ｍｇ／ｋｇでの抗−ＰＤ−１モノクローナル抗体ｍＡｂ７を皮下注射した。注射して２８日後に、動物を、ビヒクル（群１）、２０ｍｇ／ｋｇで皮下に抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ｍＡｂ７（群２）、または電気穿孔によって送達される３種のヒト前立腺がん抗原（ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＡ）を発現するＤＮＡプラスミド（プラスミド４５８）でブーストし、直後に抗ＣＴＬＡ４ １５０ｍｇおよび２０ｍｇ／ｋｇでの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を皮下注射した（群３）。最も重要な最初の注射の４８日後に、ＰＢＭＣをそれぞれの動物から単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに付してＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＡ特異的ＩＦＮγ Ｔ細胞応答を測定した。
試験で使用したベクターＡｄＣ６８Ｗ−７３４の完全な配列は、本開示の配列番号４５および国際出願公開第ＷＯ２０１５／０６３６４７号の配列番号６３に提供されている。ベクターＡｄＣ６８Ｗ−７３４の構築もＷＯ２０１５／０６３６４７に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれている。ＡｄＣ６８Ｗ−７３４ベクターおよびプラスミド４５８はそれぞれ、（１）配列番号４２の配列を有するヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０をコードするヌクレオチド配列、（２）配列番号４７の配列を有するヒトＰＳＡのアミノ酸２５〜２６１をコードするヌクレオチド配列、および（３）配列番号４８の全長ヒトＰＳＣＡをコードするヌクレオチドを含む。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。簡単に言えば、個々の動物からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、各ペプチド２μｇ／ｍｌで、それぞれの抗原の全配列に及ぶ１１アミノ酸重複する１５ｍｅｒペプチドライブラリーからのペプチドのプールとともに二つ組で共インキュベートした。プレートを、製造者の指示に従って、３７℃、５％のＣＯ２で約１６時間インキュベートし、次いで洗浄および現像した。ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＣＴＬリーダーでカウントした。二つ組の平均を計算し、ペプチドを含有しなかった陰性対照ウェルの応答を差し引いた。次いでＳＦＣカウントを正規化して１ｅ６ ＰＢＭＣ１個当たりの応答を記述した。表中の抗原特異的応答は、対応する抗原特異的ペプチドプールに対応する応答の和を表す。
結果。表３３に提示されているＥＬＩＳｐｏｔ結果は、皮下の抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体でワクチンを受けた動物は、少なくとも１種の前立腺がん抗原に対するＩＦＮγ Ｔ細胞応答のロバストな増大を呈した一方、ビヒクル群（群１）または抗ＰＤ−１抗体単独を投与された群（群２）においてこれらの抗原に対するＩＦＮγ Ｔ細胞応答は存在しなかったことを実証する。
Figure 2018503365
Figure 2018503365
開示される教示を、様々な用途、方法、キット、および組成物を参照して記載してきたが、様々な変更および改変を、本明細書の教示および以下の請求項に係る発明から逸脱することなく行うことができることが理解されるであろう。上記の実施例は、開示される教示をより良好に例示するために提供されており、本明細書に提示した教示の範囲を限定するように意図されていない。本教示をこれらの例示的な実施形態の観点から記載してきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数のバリエーションおよび改変が、過度の実験を伴うことなく可能であることを容易に理解するであろう。すべてのこのようなバリエーションおよび改変は、本教示の範囲内である。
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用したすべての参考文献、ならびにこれらに引用された参考文献は、これらが既に組み込まれていない程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が、それだけに限らないが、定義された用語、用語の使用法、記載した技法などを含めて、本願と異なる、または矛盾する場合には、本願が支配する。
上記の記載および実施例は、本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らが企図するベストモードを記述する。しかし、どんなに詳細に上記のことが本文中に現れる場合があっても、本発明を多くの方法で実践することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。

Claims (43)

  1. ＰＤ−１に特異的に結合し、
    配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに
    配列番号２、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む、単離アンタゴニスト抗体
  2. 配列番号１３、１４、または１５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１６、１７、２４、２５、２７、２８、３５、または３６のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１８、２３、２６、または３７に示したアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１０、２２、３０、または３２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１、２０、または３３に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１２、２１、３１、または３４に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  3. 配列番号３、４、５、もしくは６に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にない残基中に１つもしくはいくつかの保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＶＨを含む、請求項１または２に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  4. 配列番号２、７、８、もしくは９に示したアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１つもしくはいくつかのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＶＬを含む、請求項３に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  5. 配列番号３、４、５、または６に示したアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２、７、８、または９に示したアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  6. 配列番号２９または３８に示したアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  7. 定常領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  8. ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４Δｂ Ｓ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４Δｃ Ｓ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項７に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  9. 定常領域がＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐである、請求項７に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  10. 抗体のそれぞれのＣＤＲが、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せ、ＡｂＭ定義、または接触定義によって定義される、請求項１に記載の単離アンタゴニスト抗体。
  11. ＰＤ−１に特異的に結合し、請求項１に記載の抗体とＰＤ−１への結合を競合し、かつ／または請求項１に記載の抗体によって認識されるＰＤ−１上のエピトープと同じ、もしくはそれと重複するエピトープに結合する単離アンタゴニスト抗体。
  12. 配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号２３に示したアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１０に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２０に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、単離抗ＰＤ−１抗体。
  13. Ｔ細胞からのＩＦＮγおよび／またはＴＮＦ分泌を促進する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離抗体。
  14. Ｔ細胞の増殖を促進する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離抗体。
  15. 腫瘍増殖を阻害する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離抗体。
  16. ヒトＰＤ−１およびマウスＰＤ−１に結合する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離抗体。
  17. 表面プラズモン共鳴によって測定される場合、２５℃で約０．７３ｎＭの親和性でヒトＰＤ−１に結合する、請求項１６に記載の単離抗体。
  18. 請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体を産生する単離細胞株。
  19. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離核酸。
  20. 請求項１９に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  21. 請求項２０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  22. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ。
  23. 抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体を組換え産生する細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法。
  24. 抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で、配列番号２９または３８に示したアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする核酸を含む細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法。
  25. 抗体の重鎖および軽鎖が、別個のベクターでコードされる、請求項２４に記載の方法。
  26. 抗体の重鎖および軽鎖が、同じベクターでコードされる、請求項２４に記載の方法。
  27. 請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
  28. 請求項２７に記載の医薬組成物を含む、がんを治療するためのキット。
  29. それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法であって、個体に、有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体または請求項２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、その結果、がんに関連した１つまたは複数の症状が、個体において緩和される、方法。
  30. がんが、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、頭頸部がん、扁平細胞頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、絨毛癌、大腸がん、口腔がん、皮膚がん、および黒色腫からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 個体が、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平細胞頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣癌、肉腫、または再発もしくは難治性古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）を有する、以前に治療された成人患者である、請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 抗ＰＤ−１抗体が、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 抗ＰＤ−１抗体が、７、１４、２１、または２８日毎に１回投与される、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法
  34. 抗ＰＤ−１抗体が、静脈内または皮下に投与される、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 有効量の第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 第２の治療剤が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗４−１ＢＢ抗体、第２のＰＤ−１アンタゴニスト、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、およびＡＬＫ阻害剤からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. チロシンキナーゼ阻害剤が、アキシチニブまたはパルボシクリブである、請求項３６に記載の方法。
  38. ＡＬＫ阻害剤が、スニチニブまたはクリゾチニブである、請求項３６に記載の方法。
  39. それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法であって、対象に（１）有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体または請求項２７に記載の医薬組成物、および（２）有効量のがんの細胞に対して免疫応答を誘発することができるワクチンを投与するステップを含む、方法。
  40. がんを治療するために対象に投与されるワクチンの免疫原性または治療効果を増強するための方法であって、ワクチンを受けている対象に、有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体または請求項２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  41. がんが、乳がん、胃がん、肝がん、肺がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、および結腸直腸がんから選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 対象に有効量の１種または複数の他の免疫モジュレーターを投与するステップをさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
  43. 他の免疫モジュレーターが、プロテインキナーゼ受容体阻害剤、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、およびＴＬＲ９アゴニストからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
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