KR102012113B1 - 항-pd-1 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1)과 결합하는 길항성 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 항-PD-1 항체는 치료상 단독으로 사용되거나 또는 다른 치료제와 조합하여 사용되어 암 및 다른 질환을 치료할 수 있다.

Description

항-PD-1 항체 및 그의 사용 방법 {ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}

본 발명은 PD-1과 결합하는 항체, 예를 들어, 완전한 길이의 항체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, PD-1에 대한 항체를 포함하는 조성물, 및 항-PD-1 항체를 의약으로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태는 과증식성 질환, 예컨대 암을 포함한 각종 질환의 치료, 예방 및/또는 진단을 위하여 항-PD-1 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

PD-1은 활성화 유도된 아폽토시스(apoptosis)를 진행하는 T 세포주에서 원래 확인되었던 50 내지 55 kDa 유형 I 막횡단 수용체이다. PD-1은 T 세포, B 세포, 및 대식세포 상에서 발현된다. PD-1에 대한 리간드는 B7 계열 구성원 PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)이다.

PD-1은 그의 세포외 영역 내에 단일 면역글로불린 (Ig) V-유사 도메인을 함유하는 Ig 슈퍼패밀리의 한 구성원이다. PD-1 세포질 도메인은 2개의 티로신을 함유하는데, 가장 막에 근접한 티로신 (마우스 PD-1 내의 VAYEEL)이 ITIM (면역-수용체 티로신 기반 억제성 모티프) 내에 위치한다. PD-1 상에 ITIM이 존재한다는 것은 이러한 분자가 세포질 포스파타제를 동원함으로써 항원 수용체 시그널링을 약화시키는 기능을 한다는 것을 표시한다. 인간 PD-1 단백질과 뮤린 PD-1 단백질은 약 60% 아미노산 동일성을 공유하는데, 4개의 잠재적 N-글리코실화 부위와, 상기 Ig-V 도메인을 규정하는 잔기가 보존된다. 세포질 영역 내의 ITIM 및 카르복시 말단 티로신을 둘러싸고 있는 ITIM-유사 모티프가 또한, 인간 오르소로그(orthologue)와 뮤린 오르소로그 간에 보존된다.

암 면역요법은 전통적으로, 세포를 사용하고 개별화되고 시간이 많이 소요되는 제제를 사용하는 복잡한 방법을 포함하였다. 최근에는, 적응 면역 체계에 전달되는 억제성 시그널의 중단에 근거한 모노클로날 항체-기반 암 면역요법이 시판품의 전신 면역요법의 환경 내의 클리닉에서 가능성을 나타냈다. 그러나, 암에 대한 보다 안전하고 효과적인 치료법을 수득하는 것이 관련 기술분야에서 지속적으로 요구되고 있다.

PD-1과 선택적으로 상호 작용하는 항체가 제공된다. 특정의 항-PD-1 항체가 암을 예방하고/하거나 치료하기 위하여 생체 내에서 유효한 것으로 입증된다. 유리하게, 본원에 제공된 항-PD-1 항체는 인간, 시노몰구스 원숭이, 및 마우스 PD-1과 결합한다. 또한 유리하게, 본원에 제공된 항-PD-1 항체는 T 세포 증식을 자극하기 위하여 생체 내에서 유요하다.

PD-1과 특이적으로 결합하고 PD-1의 생물학적 효과를 방지 또는 저하시키는 단리된 길항제 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 길항제 항체는, 예를 들어, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체일 수 있다. 본원에 개시된 본 발명은 PD-1과 결합하는 항체에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 PD-1과 특이적으로 결합하는 단리된 길항제 항체를 제공하는데, 이러한 항체는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 3, 서열식별번호: 4; 서열식별번호: 5; 및 서열식별번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH)의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1), VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 7; 서열식별번호: 8; 및 서열식별번호: 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.

일부 실시양태에서, VH 영역은 서열식별번호: 3, 4, 5, 또는 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에 있어서 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 수반한 변이체를 포함하고/하거나 VL 영역은 서열식별번호: 2, 7, 8, 또는 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에 있어서 1개 또는 여러 개의 아미노산 치환을 수반한 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 서열식별번호: 39에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 서열식별번호: 29 또는 38에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-121183을 수반한 발현 벡터에 의해 생성된 VH 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-121182를 수반한 발현 벡터에 의해 생성된 VL 영역을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-1과 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하는데, 여기서 이러한 항체는 서열식별번호: 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열식별번호: 16, 17, 24, 25, 27, 28, 35, 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열식별번호: 18, 23, 26, 또는 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열식별번호:10, 22, 30, 또는 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열식별번호: 11, 20, 또는 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열식별번호: 12, 21, 31, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.

일부 실시양태에서, 항체는 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG₁, IgG₂, IgG_2Δa, IgG₃, IgG₄, IgG_4Δb, IgG_4Δc, IgG₄ S228P, IgG_4Δb S228P, 및 IgG_4Δc S228P 하위부류의 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG4 이소형의 것이고, 안정화된 힌지(hinge), 예를 들어, S228P를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-1과 특이적으로 결합하고; 본원에 기재된 바와 같은 항체와 동일한 PD-1 에피토프와 경쟁하고/하거나 이와 결합하는 단리된 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체는 T 세포로부터의 IFNγ 및/또는 TNF 분비를 증진시켜 준다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체는 T 세포의 증식을 증진시켜 준다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체는 종양 성장을 억제한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체는 인간 PD-1 및 마우스 PD-1과 결합한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체의 치료상 유효량 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체를 재조합적으로 생산하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체가 생성되는 조건 하에, 이러한 항체를 재조합적으로 생산하는 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 항-PD-1 길항제 항체의 생성 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 29 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포주를, 이러한 항체가 생성되는 조건하에 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-PD-1 길항제 항체의 생성 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 상기 중쇄 및 경쇄는 별개의 벡터 상에 코딩된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 동일한 벡터 상에 코딩된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 유효량을, 특정 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 상기 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 병태는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 위의 암, 육종, 림프종, 백혈병, 두경부암, 흉선암, 상피암, 타액선암, 간암, 위암, 갑상선암, 폐암, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 백혈병, 다발성 골수종, 신세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 구강암, 피부암, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 기존에 치료받은 적이 있는, 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평 세포 두경부암 (SCHNC), 난소 암종, 육종, 또는 재발성 또는 불응성 고전적 호지킨(Hodgkin's) 림프종 (cHL)이 있는 성인 환자이다. 일부 실시양태에서, 암은 백금 저항성 및/또는 백금 불응성 암, 예컨대, 예를 들어, 백금 저항성 및/또는 불응성 난소암, 백금 저항성 및/또는 불응성 유방암, 또는 백금 저항성 및/또는 불응성 폐암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 0.5 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 3.0 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 7, 14, 21, 또는 28일마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 정맥내 또는 피하 투여된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양이 있는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암세포의 전이의 억제 또는 방지를 필요로 하는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 암세포의 전이를 억제 또는 방지하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-1 발현성 종양이 있는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본원의 항체는 특정 대상체에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 제2의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2의 치료제는, 예를 들어, 크리조티닙(crizotinib), 팔보시클립(palbociclib), 항-CTLA4 항체, 항-4-1BB 항체, 또는 제2의 PD-1 항체이다.

또한, 암의 치료를 필요로 하거나 또는 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에게서, 암을 치료하거나 또는 종양 성장 또는 진행을 억제시키기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, 본원에 제공된 항-PD-1 길항제 항체 중 임의의 것의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 상기 대상체에게서 체중 증가를 저하시킨다.

또한, 암의 치료를 필요로 하거나 또는 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에게서, 암을 치료하는데 사용하거나 또는 종양 성장 또는 진행을 억제시키기 위한 항-PD-1 길항제 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 암은, 예를 들어 위의 암, 육종, 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 두경부암, 흉선암, 상피암, 타액선암, 간암, 위암, 갑상선암, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐 암종포함), 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 백혈병, 다발성 골수종, 신세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 구강암, 피부암, 및 흑색종이지만, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암을 치료하기 위한 백신이 투여되는 포유류에게, 본 개시내용에 의해 제공된 항-PD-1 길항제 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유류, 특히 인간에게서 암을 치료하기 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증강시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 포유류에게 (1) 암세포에 대항하여 면역 반응을 유발시킬 수 있는 백신의 유효량 및 (2) 본 개시내용에 의해 제공된 항-PD-1 길항제 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유류, 특히 인간에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

도 1a는 항-PD-1 길항제 항체로 처리된 마우스의 체중을 요약한 그래프를 도시한 것이다.
도 1b는 항-PD-1 길항제 항체로 처리된 마우스의 체중을 요약한 그래프를 도시한 것이다.
도 1c는 항-PD-1 길항제 항체로 처리된 마우스의 체중을 요약한 그래프를 도시한 것이다.
도 1d는 항-PD-1 길항제 항체로 처리된 마우스의 체중을 요약한 그래프를 도시한 것이다.
도 1e는 항-PD-1 길항제 항체로 처리된 마우스의 체중을 요약한 그래프를 도시한 것이다.
도 2a는 1차 인간 활성화된 T 세포와 결합하는 항-PD-1 항체에 대한 EC50을 요약한 그래프를 도시한 것이다.
도 2b는 1차 시노 활성화된 T 세포와 결합하는 항-PD-1 항체에 대한 EC50을 요약한 그래프를 도시한 것이다.
도 3은 다음과 같이 처리된, 배양되고 활성화된 CD4 T 세포의 증식을 요약한 막대 그래프를 도시한 것이다: (a) 항체 없음; (b) 이소형 대조군; (c) EH12.1; (d) C1; (e) C2; (f) C3; (g) mAb1; (h) mAbX; (i) mAb4; (j) mAb5; (k) mAb6; (l) mAb7; (m) mAb9; (n) mAb10; (o) mAb11; (p) mAb14; (q) mAb15; (r) mAb16.
도 4는 다음과 같이 처리된, 배양되고 활성화된 CD8 T 세포의 증식을 요약한 막대 그래프를 도시한 것이다: (a) 항체 없음; (b) 이소형 대조군; (c) EH12.1; (d) C1; (e) C2; (f) C3; (g) mAb1; (h) mAbX; (i) mAb4; (j) mAb5; (k) mAb6; (l) mAb7; (m) mAb9; (n) mAb10; (o) mAb11; (p) mAb14; (q) mAb15; (r) mAb16.

본원에는 PD-1과 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다. 항-PD-1 항체의 제조 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체를 의약으로서 사용하는 방법이 제공된다. 항-PD-1 항체를 사용하여 종양 진행을 억제할 수 있고, 이를 암 및/또는 다른 질환의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다.

일반적인 기술

본 발명의 실시는 달리 표시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 수준 내인 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 [예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 완전히 설명된다.

정의

달리 표시되지 않는 한, 다음 용어는 다음 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다: 용어 "단리된 분자" (이 분자가, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체인 경우)는 그의 유래 기원 또는 공급원을 통하여, (1) 그의 천연 상태로 그를 수반하는 자연적으로 연합된 성분과 연합되지 않거나, (2) 동일한 공급원 (예를 들어, 종) 세포 (그로부터 발현된다), 라이브러리 등으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에 존재하지 않는 분자를 지칭한다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 또는 그것이 자연적으로 유래되는 시스템과 상이한 세포성 시스템에서 발현되는 분자는 그의 자연적으로 연합된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 특정 분자는 또한, 관련 기술분야에 널리 공지된 정제 기술을 이용하여 단리시킴으로써 자연적으로 연합된 성분이 실질적으로 없도록 할 수 있다. 분자 순도 또는 동질성은 관련 기술분야에 널리 공지된 수많은 수단에 의해 검정할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 샘플의 순도는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 상기 폴리펩티드를 가시화하기 위한 겔의 염색 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 검정할 수 있다. 특정의 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 수단을 이용함으로써 보다 고 해상도가 제공될 수 있다.

"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은, 상기 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라 달리 명시되지 않는 한, 특이적 결합을 놓고 무손상 항체와 경쟁하는 그의 임의의 항원 결합성 부분, 항원 결합성 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체 배치를 포괄한다. 항원 결합성 부분은, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, 도메인 항체 (dAb, 예를 들어 상어 및 낙타과 항체), 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체 (scFv), 맥시보디(maxibody), 미니보디(minibody), 인트라보디(intrabody), 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합성을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 특정 부분을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하고, 항체가 임의의 특별한 부류일 필요는 없다. 그의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 면역글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 부류 중 몇 가지는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 각각 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원적 입체 배치는 널리 공지되어 있다.

항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합하여, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역으로서 공지되기도 한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어지고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 특히 CDR 영역 외부의 (즉, 프레임워크 영역 내의) 아미노산 잔기에 있어서의 치환을 수반하는, 대상 가변 영역의 변이체가 요망되는 경우에는, 이러한 대상 가변 영역과 동일한 표준 부류의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역을, 상기 대상 가변 영역과 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987).

특정 실시양태에서, CDR의 결정적 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 이러한 항체의 구조를 해독하고/하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해독함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 각종 기술 중 임의의 것, 예컨대 X선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각종 분석 방법을 이용하여 CDR 영역을 확인하거나 또는 근사치를 낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 각종 분석 방법을 이용하여 CDR 영역을 확인하거나 또는 근사치를 낼 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, AbM 정의, 접촉 정의, 및 입체 형태적 정의를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

카바트 정의는 항체 내의 잔기를 넘버링하기 위한 표준이고 CDR 영역을 확인하기 위해 전형적으로 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8] 참조). 코티아 정의는 카바트 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정의 구조적 루프 영역의 위치를 고려한다 (예를 들어, 문헌 [Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17]; [Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83] 참조). AbM 정의는 항체 구조를 모델로 하는 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)에 의해 생성된 컴퓨터 프로그램의 통합 도구를 이용한다 (예를 들어, 문헌 [Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272]; ["AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.] 참조). AbM 정의는 지식 데이터베이스와 애초의 방법, 예컨대 문헌 (Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198)에 기재된 것과의 조합을 이용하여 1차 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델로 한다. 접촉 정의는 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 근거한다 (예를 들어, 문헌 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45] 참조). 본원에서 CDR의 "입체 형태적 정의"로서 지칭된 또 다른 접근방식에서, 이러한 CDR의 위치는 항원 결합성에 엔탈피 기여를 하는 잔기로서 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166] 참조). 또한 다른 CDR 경계 정의가 상기 접근방식 중의 하나를 엄격하게 따를 수는 없지만, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR의 적어도 특정 부분과 중복될 것이지만, 이들은 특별한 잔기 또는 잔기 군이 항원 결합성에 상당한 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 특정 CDR은 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근방식 (접근방식의 조합을 포함함)에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 이들 접근방식 중 임의의 것에 따라서 정의된 CDR을 활용할 수 있다. 2개 이상의 CDR을 함유하는 임의의 소정의 실시양태에 대해서, 이러한 CDR은 카바트, 코티아, 연장된, AbM, 접촉, 및/또는 입체 형태적 정의 중 임의의 것에 따라서 정의될 수 있다.

관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독으로 또는 조합하여, 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 방법에 의해 만들 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 파지(phage) 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 [예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합성 하위서열]인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게, 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기를, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로써 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 인간화 항체는 수용자 항체에서 발견되지 않거나 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않지만, 항체 성능을 추가로 정련 및 최적화시키기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성되고/되거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조한 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 이러한 인간 항체의 정의는 비-인간 항원 결합성 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특이적으로 배제한다.

용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭한다.

용어 "에피토프"는 항체의 항원 결합성 영역 중 하나 이상에서 이러한 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 그 부분을 지칭한다. 에피토프는 종종, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 집단으로 이루어지고 특이적 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖고 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형이거나 또는 입체 형태적일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호 작용하는 분자 (예컨대, 항체) 간의 상호 작용 지점 모두는 이러한 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. "비선형 에피토프" 또는 "입체 형태적 에피토프"는 이러한 에피토프에 대해 특이적인 항체와 결합하는 항원성 단백질 내의 비연속성 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원성 에피토프"는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어 통상적인 면역검정에 의해서 결정된 바와 같이, 항체와 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 특정 부분으로서 정의된다. 일단 항원 상의 목적하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본 명세서에 기재된 기술을 이용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생성시키는 것이 가능하다. 또 다른 한편으론, 디스커버리 과정 동안, 항체의 생성 및 특징 규명으로 인해, 바람직한 에피토프에 관한 정보를 밝혀낼 수 있다. 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합을 알아보기 위해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 한 접근방식은 PD-1과의 결합을 놓고 서로 경쟁하거나 또는 교차 경쟁하는 항체, 예를 들어 항원과의 결합을 놓고 경쟁하는 항체를 밝혀내기 위해 경쟁 및 교차 경쟁 연구를 수행하는 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "PD-1"은 임의의 형태의 PD-1, 및 PD-1의 활성을 적어도 일부 보유하고 있는 그의 변이체를 지칭한다. 인간 PD-1에 대한 구체적 언급과 같이, 상이하게 표시되지 않는 한, PD-1은 천연 서열 PD-1의 모든 포유류 종, 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 말 및 소를 포함한다. 하나의 예시적인 인간 PD-1이 유니프로트(Uniprot) 수탁 번호 Q15116 (서열식별번호: 1)으로서 밝혀졌다.

용어 "효능제"는 또 다른 분자의 생물학적 활성 또는 효과를 증진시키는 (즉, 유도시키거나, 유발시키거나, 증강시키거나 또는 증가시키는) 물질을 지칭한다. 용어 효능제는 수용체, 예컨대 항체와 결합하는 물질, 및 이와 결합하지 않고서도 (예를 들어, 관련 단백질을 활성화시킴으로써) 수용체 기능을 증진시키는 물질을 포괄한다.

용어 "길항제" 또는 "억제제"는 또 다른 분자, 예컨대 수용체의 생물학적 활성 또는 효과를 방지, 차단, 억제, 중화 또는 저하시키는 물질을 지칭한다.

용어 "길항제 항체"는 표적과 결합하고 이러한 표적의 생물학적 효과를 방지 또는 저하시키는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 이와 결합되는 표적, 예를 들어 PD-1이 생물학적 기능을 수행하지 못하게 하는 항체를 의미할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "항-PD-1 길항제 항체"는 PD-1 생물학적 활성 및/또는 PD-1에 의해 매개된 하류 현상(들)을 억제할 수 있는 항체를 지칭한다. 항-PD-1 길항제 항체는 PD-1 생물학적 활성 (이는 PD-1에 의해 매개된 하류 현상, 예컨대 PD-L1 결합성 및 하류 시그널링, PD-L2 결합성 및 하류 시그널링, T 세포 증식의 억제, T 세포 활성화의 억제, IFN 분비의 억제, IL-2 분비의 억제, TNF 분비의 억제, IL-10의 유도, 및 항-종양 면역 반응의 억제를 포함한다)을 어느 정도 (상당한 정도 포함) 차단, 길항, 억제 또는 저하시키는 항체를 포괄한다. 본 발명의 목적상, 용어 "항-PD-1 길항제 항체" (용어 "길항제 PD-1 항체", "길항제 항-PD-1 항체" 또는 "PD-1 길항제 항체"와 상호 교환 가능하다)는 앞서 확인된 용어, 표제, 및 기능적 상태 및 특징 모두를 포괄함으로써, PD-1 자체, PD-1 생물학적 활성, 또는 이러한 생물학적 활성에 따른 결과를 임의의 의미 있는 정도로 실질적으로 무효화시키거나, 감소시키거나 또는 중화시킨다는 것을 명쾌하게 이해해야 할 것이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 PD-1과 결합하고 항종양 면역 반응을 상향 조절한다. 항-PD-1 길항제 항체의 예가 본원에 제공되어 있다.

용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이 쇄는 선형 또는 분지될 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/있거나 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한, 자연적으로 또는 간섭에 의해, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형시킨 아미노산 쇄를 포괄한다. 또한 상기 정의 내에는, 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄로서 또는 연합 쇄로서 존재할 수 있는 것으로 이해된다.

관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호 교환적으로 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 쇄를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 쇄의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형물은, 예를 들어 "캡", 자연 발생적 뉴클레오티드 중 하나 이상을 유사체로 치환한 것, 뉴클레오티드간 변형물, 예컨대 전하를 띠지 않은 연쇄 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)를 수반한 변형물 및 전하를 띤 연쇄 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 수반한 변형물, 펜던트 모이어티(moiety), 예컨대, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 변형물, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 수반한 변형물, 킬레이트제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 변형물, 알킬화제를 함유하는 변형물, 변형된 연쇄 (예를 들어, 알파 아노머성 핵산 등)를 수반한 변형물뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 히드록실 기 중 임의의 것이, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호 기에 의해 보호될 수 있거나, 부가의 뉴클레오티드에 대한 부가의 연쇄를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티 또는 아민으로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있는데, 이는 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머성 당, 에피머성 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 포함한다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연쇄를 또 다른 연결성 기로써 대체할 수 있다. 이들 또 다른 연결성 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈") (여기서, R 또는 R'는 각각 독립적으로, H이거나 또는 에테르 (-O-) 연쇄를 임의로 함유하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다)에 의해 대체되는 실시양태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연쇄가 동일한 필요는 없다. 앞서의 설명은 본원에 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드 (RNA 및 DNA 포함)에 적용된다.

본원에 사용된 바와 같은, 항체는 본원의 실시예 7에 개시된 방법에 의해 측정된 바와 같이 평형 해리 상수가 20 nM 이하, 바람직하게 약 6 nM 미만, 보다 바람직하게 약 1 nM 미만, 가장 바람직하게 약 0.2 nM 미만인 경우에, PD-1과 "상호 작용한다".

특정 에피토프와 "우선적으로 결합"하거나 또는 "특이적으로 결합"하는 (본원에서 상호 교환적으로 사용된다) 항체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 결합 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특정 분자는 이것이 또 다른 세포 또는 물질과의 경우에서 보다 더 자주, 더 신속하게, 더 큰 지속성으로 및/또는 더 큰 친화도로 특별한 세포 또는 물질과 반응하거나 또는 연합되는 경우에 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 여겨진다. 특정 항체는 이것이 다른 물질과 결합하는 것 보다 더 큰 친화도, 결합 활성도로, 보다 용이하게 및/또는 더 큰 지속성으로 결합하는 경우에 특정 표적과 "특이적으로 결합"하거나 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, PD-1 에피토프와 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는, 다른 PD-1 에피토프 또는 비-PD-1 에피토프와 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합 활성도로, 더 용이하게 및/또는 더 큰 지속성으로 PD-1 에피토프와 결합하는 항체이다. 또한, 본 정의를 판독함으로써, 예를 들어 제1 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)가 제2 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 또는 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"이 반드시 독점적 결합을 요구하지는 않는다 (이러한 독점적 결합을 포함할 수도 있지만). 일반적으로, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미하지만, 반드시 그런 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같은, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물질이 없다), 보다 바람직하게 적어도 90% 순수한, 보다 바람직하게 적어도 95% 순수한, 보다 더 바람직하게 적어도 98% 순수한, 가장 바람직하게 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.

"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위해 벡터(들)에 대한 수용자일 수 있거나 또는 이러한 수용자였던 개개의 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 이러한 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래의 모 세포와 (형태학적 또는 게놈 DNA 보체 측면에서) 반드시 완벽하게 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체 내에서 형질감염된 세포를 포함한다.

관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이러한 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로, 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지 연장되는 것으로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로, 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 및 CH3을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.

관련 기술분야에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 언급한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 것이고 (감마 수용체), FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하는데, 이는 이들 수용체의 대립 유전자성 변이체, 및 교대로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")를 포함하는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 다음 문헌에서 고찰된다 (Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41). "FcR"은 또한, 모계 IgG를 태아에게 전이시키는 데에 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

항체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "경쟁하는"은 제1 항체 또는 그의 항원 결합성 부분이 제2 항체 또는 그의 항원 결합성 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프와 결합하여, 제1 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합에 따른 결과가 제2 항체의 부재 하에서의 제1 항체의 결합과 비교해서, 제2 항체의 존재하에서 검출 가능한 수준으로 감소되도록 하는 것을 의미한다. 제2 항체와 그의 에피토프와의 결합이 또한, 제1 항체의 존재하에서 검출 가능한 수준으로 감소되는 또 다른 방식도 이에 해당될 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다. 즉, 제2 항체가 제1 항체와 그의 각각의 에피토프와의 결합을 억제하지 않으면서, 제1 항체가 이러한 제2 항체와 그의 에피토프와의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드와의 결합을 검출 가능한 수준으로 억제하는 경우, 억제 정도가 동일한지, 보다 큰지 아니면 보다 적은지 간에, 이러한 항체는 그들의 각각의 에피토프(들)와의 결합을 놓고 서로 "교차 경쟁"하는 것으로 여겨진다. 경쟁적 항체와 교차 경쟁적 항체 둘 다가 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차 경쟁이 일어나는 기전 (예를 들어, 입체 장애, 입체 형태적 변화, 또는 공통의 에피토프 또는 그의 부분과의 결합)에 상관없이, 통상의 기술자는 본원에 제공된 교시에 근거하여, 이러한 경쟁적 및/또는 교차 경쟁적 항체가 포괄되고 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능을 보유하고 있다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합성; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성; 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로, Fc 영역을 결합성 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합해야만 하고, 이는 상기 항체 이펙터 기능을 평가하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 각종 검정을 이용하여 평가할 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함하지만, 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능을 보유하고 있다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게, 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 가장 바람직하게 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 보유할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, "치료"는 유리하거나 또는 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근 방식이다. 본 발명의 목적상, 유리하거나 또는 목적하는 임상 결과는 다음 중 한 가지 이상을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다: 신생물성 또는 암성 세포의 증식을 저하 (또는 파괴)하고/하거나, 신생물성 세포의 전이를 억제하고/하거나, 종양의 크기를 수축 또는 감소시키고/시키거나, 암의 차도가 있고/있거나, 암으로부터 비롯되는 증상을 저하시키고/시키거나, 암으로 인해 고통받는 환자의 삶의 질을 증가시키고/시키거나, 암을 치료하는 데 요구되는 다른 의약의 용량을 감소시키고/시키거나, 암의 진행을 지연시키고/시키거나 암 환자의 생존을 연장시킨다.

"완화시키는" 것은 항-PD-1 길항제 항체를 투여하지 않은 것과 비교해서 한 가지 이상의 증상을 개선시키거나 또는 약화시키는 것을 의미한다. "완화시키는" 것은 또한, 증상의 지속 기간을 단축시키거나 또는 감소시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 한 가지 이상의 유리하거나 또는 목적하는 결과를 가져다 주기에 충분한 양이다. 보다 구체적인 측면에서, 유효량은 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시켜 주고/주거나 치료받는 대상체의 생존을 연장시켜 준다. 예방적으로 사용하는 경우, 유리하거나 또는 목적하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상을 포함한 질환, 그의 합병증 및 질환의 발생 동안 제시되는 중간 병리학적 표현형에 따른 위험을 제거 또는 저하시키는 것, 그의 중증도를 약화시키는 것, 또는 그의 발병을 지연시키는 것을 포함한다. 치료적으로 사용하는 경우, 유리하거나 또는 목적하는 결과는 질환, 예컨대 예를 들어, 암, 예를 들어 위의 암, 육종, 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 두경부암, 편평 세포 두경부암, 흉선암, 상피암, 타액선암, 간암, 위암, 갑상선암, 폐암, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 백혈병, 다발성 골수종, 신세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 구강암, 피부암, 및 흑색종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암의 한 가지 이상의 증상을 저하시키고/시키거나, 이러한 질환을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 용량을 감소시키고/시키거나, 또 다른 의약의 효과를 증강시키고/시키거나 환자에게서 암의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여할 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 직접 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하기에 충분한 양이다. 임상 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 연계해서 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 한 가지 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있고, 단일 작용제는 이것이 한 가지 이상의 다른 작용제와 연계해서 목적하는 결과를 달성할 수 있거나 달성하는 경우에, 유효량으로 제공되는 것으로 간주될 수 있다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유류, 보다 바람직하게 인간이다. 포유류는 또한, 농장 동물 (예를 들어, 암소, 돼지, 말, 치킨 등), 스포츠 동물, 애완용 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "벡터"는 숙주 세포에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이들을 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 있는 그대로의 (naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 피막화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정의 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 증강인자일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사하고자 하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된다.

본원에 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에, 이러한 성분이 생물학적 활성을 보유할 수 있도록 해주고 대상체의 면역 체계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 그의 예는 표준 제약 담체 중 임의의 것, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 및 각종 유형의 습윤제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여용으로 바람직한 희석제는 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 정상 (0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "k_on"는 항원에 대한 항체의 연합을 위한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로 언급하면, 속도 상수 (k_on 및 k_off) 및 평형 해리 상수는 완전한 길이의 항체 및/또는 Fab 항체 단편 (즉, 1가) 및 PD-1을 사용하여 측정된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "k_off"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리를 위한 속도 상수를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "K_D"는 항체-항원 상호 작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.

본원에서 특정 값 또는 파라미터의 "약"에 대한 언급은 이러한 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 실시양태를 포함한다 (설명한다). 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치 범위는 이러한 범위를 규정하는 수를 포함한다.

용어 "면역-이펙터-세포 증강인자" 또는 "IEC 증강인자"는 포유류의 하나 이상의 유형의 면역 이펙터 세포의 수, 질 또는 기능을 증가 또는 증강시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 세포 용해성 CD8 T 세포, CD4 T 세포, NK 세포, 및 B 세포를 포함한다.

용어 "면역 조정제"는 숙주 포유류의 선천, 체액성 또는 세포성 면역 체계의 임의의 성분의 작동 또는 면역 반응 (본원에 정의된 바와 같음)을 변경 (예를 들어, 억제, 감소, 증가, 증강 또는 자극)할 수 있는 물질을 지칭한다. 따라서, 용어 "면역 조정제"는 본원에 정의된 바와 같은 "면역-이펙터-세포 증강인자" 및 본원에 정의된 바와 같은 "면역-억제성-세포 억제제"뿐만 아니라 포유류의 면역 체계의 다른 성분에 영향을 미치는 물질을 포괄한다.

용어 "면역 반응"은 숙주 포유류의 면역 체계에 의한 특별한 물질 (예컨대 항원 또는 면역원)에 대한 임의의 검출 가능한 반응, 예컨대 선천 면역 반응 [예를 들어, 톨(Toll) 수용체 시그널링 캐스케이드의 활성화], 세포 매개된 면역 반응 (예를 들어, T 세포, 예컨대 항원-특이적 T 세포, 및 면역 체계의 비-특이적 세포에 의해 매개된 반응), 및 체액성 면역 반응 (예를 들어, B 세포에 의해 매개된 반응, 예컨대 항체의 생성 및 혈장, 림프 및/또는 조직 유체 내로의 분비)을 지칭한다.

용어 "면역원성"은 면역 반응을 야기, 유발, 자극 또는 유도할 수 있는 특정 물질의 능력, 또는 아주반트의 존재 또는 부재하에, 단독으로 아니면 담체와 연계되든지 간에, 특별한 항원에 대항한 기존의 면역 반응을 개선, 증강, 증가 또는 연장시킬 수 있는 특정 물질의 능력을 지칭한다.

용어 "면역-억제성-세포 억제제" 또는 "ISC 억제제"는 포유류의 면역 억제성 세포의 수 또는 기능을 감소 또는 억제시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 면역 억제성 세포의 예는 조절성 T 세포 ("T regs"), 골수 세포 유래 억제인자 세포, 및 종양 관련 대식세포를 포함한다.

특정 물질을, 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 것과 관련하여, 용어 "피내 투여" 또는 "피내적으로 투여되는"은 상기 물질을 포유류의 피부의 진피 층 내로 전달하는 것을 지칭한다. 포유류의 피부는 표피 층, 진피 층, 및 피하 층으로 구성된다. 표피는 피부의 외층이다. 피부의 중간 층인 진피는 신경 종말, 땀샘 및 지방 분비선 (피지선), 모낭 및 혈관을 함유한다. 피하 층은 더 큰 혈관과 신경을 수용하는 지방과 결합 조직으로 구성된다. 피내 투여와 반대로, "피하 투여"는 특정 물질을 피하 층 내로 투여하는 것을 지칭하고, "국소 투여"는 특정 물질을 피부의 표면 상으로 투여하는 것을 지칭한다.

용어 "신생물성 장애"는 세포가 비정상적으로 높고 비제어된 속도로 증식하는 (이러한 속도는 주변 정상 조직의 증식 속도를 초과하고 이와 비협조적이다) 병태를 지칭한다. 이로써 통상적으로, "종양"으로서 공지된 고형 병변 또는 덩어리가 생긴다. 이러한 용어는 양성 및 악성 신생물성 장애를 포괄한다. 본 개시내용에서 용어 "암"과 상호 교환적으로 사용되는 용어 "악성 신생물성 장애"는 종양 세포가 신체 내의 다른 위치로 확산될 수 있는 능력 ("전이"로서 공지됨)을 특징으로 하는 신생물성 장애를 지칭한다. 용어 "양성 신생물성 장애"는 종양 세포가 전이될 수 있는 능력이 결여된 신생물성 장애를 지칭한다.

용어 "방지하는" 또는 "예방"은 (a) 특정 장애가 발생하지 못하게 하거나 또는 (b) 특정 장애의 발병 또는 특정 장애의 증상의 발병을 지연시키는 것을 지칭한다.

용어 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"는 종양 세포에 의해 특이적으로 발현되거나 또는 동일한 조직 유형의 비-종양 세포에 의해서 보다는 종양 세포에 의해서 더 높은 빈도 또는 밀도로 발현되는 항원을 지칭한다. 종양 관련 항원은 숙주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 항원일 수 있거나; 이들은 숙주에 의해 정상적으로 발현된 분자의 돌연변이되거나, 말단절단되거나, 미스폴딩되거나, 또는 달리 비정상적인 징후일 수 있거나; 이들은 정상적으로 발현되지만, 비정상적으로 높은 수준으로 발현된 분자와 동일할 수 있거나; 또는 이들은 비정상적인 맥락 또는 환경에서 발현될 수 있다. 종양 관련 항원은, 예를 들어, 단백질 또는 단백질 단편, 복합 탄수화물, 강글리오시드, 합텐, 핵산, 또는 이들 또는 다른 생물학적 분자의 임의의 조합일 수 있다.

용어 "백신"은 특정 포유류에서 특별한 항원에 대항하여 면역 반응을 유도시키기 위하여 이러한 포유류에게 투여하기 위한 면역원성 조성물을 지칭한다. 백신은 전형적으로, 면역 반응의 표적, 예컨대 질환 유발성 미생물 또는 종양 세포와 유사하거나 또는 이로부터 유래되는 작용제 ("항원" 또는 "면역원"으로서 공지됨)를 함유한다. 종양, 예컨대 암을 치료하고자 하는 백신은 전형적으로, 표적 종양 상에서 발견된 TAA로부터 유래되는 항원을 함유하고, 표적 종양 상의 TAA에 대항하여 면역원성을 유발시킬 수 있다.

용어 "백신 기반 면역요법 요법"은 백신을 하나 이상의 면역 조정제와 조합하여 투여하는 치료 요법을 지칭한다. 백신과 면역 조정제는 단일 제형으로 함께 투여하거나 또는 개별적으로 투여할 수 있다.

실시양태가 "포함하는"이란 언어와 함께 본원에 기재되는 모든 경우에, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.

본 발명의 측면 또는 실시양태를 대체물의 마쿠쉬(Markush) 군 또는 다른 집단과 관련해서 기재하는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 군뿐만 아니라 이러한 군의 개별적 각 구성원 및 주요 군의 가능한 모든 하위군 (또한, 상기 군 구성원 중 하나 이상이 존재하지 않은 주요 군)을 포괄한다. 본 발명은 또한, 청구된 본 발명의 군 구성원 중 임의의 것의 하나 이상을 명시적으로 배제하는 것을 예상한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분쟁이 생기는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "포함하는"은 명시된 정수 또는 정수의 군을 포함할 수 있지만 임의의 다른 정수나 정수의 군을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 용어 "예를 들어" 다음의 임의의 예(들)는 소모적이거나 제한적인 것을 의미하지 않는다.

예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되긴 하지만, 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 또한, 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 이러한 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이고, 제한적이지 않다.

항-PD-1 길항제 항체

본원에는 PD-1에 의해 매개된 하류 현상을 포함한 PD-1 생물학적 활성을 차단, 억제 또는 저하시키는 (상당히 저하시키는 것 포함) 항-PD-1 길항제 항체가 제공된다. 항-PD-1 길항제 항체는 다음 특징 중 임의의 하나 이상을 나타내야 한다: (a) PD-1과 결합하고 하류 시그널링 현상을 차단하는 특징; (b) PD-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 특징; (c) T 세포-매개된 면역 반응을 상향 조절하는 특징; (d) IFNγ 분비를 자극하는 특징; (e) TNF 분비를 자극하는 특징; (f) T 세포 증식을 증가시키는 특징; 및 (g) PD-1을 통한 억제성 시그널 변환을 저하시키는 특징.

본 발명의 목적상, 상기 항체는 바람직하게, PD-1 시그널링 기능을 억제하는 방식으로 PD-1과 상호 작용한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 영장류 PD-1과 특이적으로 결합한다.

본 발명에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합성 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 특정 항체 부분 (예를 들어, 도메인 항체)을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 및 요구된 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체 배치 (항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체 포함)를 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원 (키메라 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.

항-PD-1 길항제 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 만들 수 있다. 인간 및 마우스 항체를 생성하기 위한 일반적 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.

항-PD-1 길항제 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 확인하거나 그 특징을 규명할 수 있음으로써, PD-1 생물학적 활성의 저하, 완화 또는 중화를 검출하고/하거나 측정한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 후보 작용제를 PD-1과 함께 인큐베이션하고, PD-1의 결합성 및/또는 PD-1의 생물학적 활성의 부수적인 저하 또는 중화를 모니터링함으로써 확인한다. 결합 검정은, 예를 들어 정제된 PD-1 폴리펩티드(들)를 이용하여 수행하거나 또는 PD-1 폴리펩티드(들)를 자연적으로 발현하는 세포 (예를 들어, 각종 균주) 또는 PD-1 폴리펩티드(들)를 발현하도록 형질감염시킨 세포를 이용하여 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 검정은 PD-1 결합을 놓고 공지된 항-PD-1 길항제 항체와 경쟁할 수 있는 후보 항체의 능력을 평가하는 경쟁적 결합 검정이다. 이러한 검정은 ELISA 포맷을 포함한 각종 포맷으로 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 후보 항체를 PD-1과 함께 인큐베이션하고, 결합을 모니터링함으로써 확인한다.

초기 확인 후, 후보 항-PD-1 길항제 항체의 활성을, 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물학적 검정에 의해 추가로 확증 및 제련할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내 세포 검정을 이용하여 후보 항-PD-1 길항제 항체를 추가로 명확히 규명한다. 예를 들어, 후보 항체를 1차 인간 T 세포와 함께 인큐베이션하고, PD-L1을 부가하며, IFNγ 분비를 모니터링한다. 또 다른 한편으론, 생물학적 검정을 이용하여 후보물을 직접적으로 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 항-PD-1 길항제 항체는 다음 특징 중 하나 이상을 나타낸다: (a) PD-1과 결합하고 하류 시그널링 현상을 차단하는 특징; (b) PD-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 특징; (c) T 세포-매개된 면역 반응을 상향 조절하는 특징; (d) IFNγ 분비를 자극하는 특징; (e) TNF 분비를 자극하는 특징; (f) T 세포 증식을 증가시키는 특징; (g) PD-1을 통한 억제성 시그널 변환을 저하시키는 특징; 및 (h) PD-1에 대한 PD-L2 결합을 차단하는 특징. 바람직하게, 항-PD-1 항체는 이들 특색 중 2가지 이상을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 이들 특색 중 3가지 이상을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 이들 특색 중 4가지 이상을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 이들 특색 중 5가지 이상을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 이들 특색 중 6가지 이상을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 이들 특색 중 7가지 이상을 갖는다. 가장 바람직하게, 상기 항체는 8가지 특징 모두를 갖는다.

항-PD-1 길항제 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 그 특징을 규명할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 항체와 결합하는 에피토프를 확인하는 것이거나 또는 "에피토프 맵핑"이다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 명확히 규명하기 위해 관련 기술분야에 공지된 많은 방법이 있는데, 이는, 예를 들어 문헌 (Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999)에 기재된 바와 같은, 항체-항원 복합체의 결정 구조를 해독하는 방법, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함한다. 부가 예에서는, 에피토프 맵핑을 이용하여 항-PD-1 길항제 항체와 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프 맵핑은 각종 공급처, 예를 들어 펩스캔 시스템즈 (Pepscan Systems; 네덜란드 PH 렐리스타트 8219 에델헤르트베크 15)로부터 시판되고 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 연장물에 함유된 에피토프, 또는 반드시 단일 연장물에 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3차원 상호 작용에 의해 형성된 입체 형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이 (예를 들어, 적어도 4 내지 6개의 아미노산 길이)의 펩티드를 단리 또는 합성할 수 있고 (예를 들어, 재조합적으로 합성함), 이를 항-PD-1 길항제 항체와의 결합 검정에 사용할 수 있다. 또 다른 예에서, 항-PD-1 길항제 항체와 결합하는 에피토프는 PD-1 서열로부터 유래된 중복 펩티드를 사용하고 항-PD-1 길항제 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적으로 스크리닝하는 데에서 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, PD-1을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특이적 유전적 구축에 의해 단편화하고, PD-1의 발현된 단편과 시험하고자 하는 항체의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해 생성된 다음, 방사성 아미노산의 존재하에 시험관 내에서 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 PD-1 단편에 대한 상기 항체의 결합성은 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정한다. 파지 입자 (파지 라이브러리) 또는 효모 (효모 디스플레이)의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리를 이용함으로써 특정의 에피토프를 또한 확인할 수 있다. 또 다른 한편으론, 중복 펩티드 단편의 규정된 라이브러리를 대상으로 하여, 간단한 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합성에 관하여 시험할 수 있다. 부가의 예에서는, 항원의 돌연변이 유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여, 에피토프 결합을 위해 요구되고/되거나, 이에 충분하며/하거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, PD-1 폴리펩티드의 각종 잔기를 알라닌으로 대체시킨 돌연변이체 PD-1를 이용하여 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 실험을 수행할 수 있다. 돌연변이체 PD-1에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합성에 대한 특별한 PD-1 잔기의 중요성을 평가할 수 있다.

항-PD-1 길항제 항체를 명확히 규명하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법은 항-PD-1 길항제 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프와 결합하는 지를 결정하기 위하여, 동일한 항원, 즉 PD-1의 각종 단편과 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 이용하는 것이다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는데, ELISA 포맷을 포함한다.

PD-1에 대한 항-PD-1 길항제 항체의 결합 친화도 (K_D)는 약 0.001 내지 약 200 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 약 2 pM, 또는 약 1 pM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM 중 임의의 것 미만이다.

따라서, 본 발명은 다음 중 임의의 것, 또는 표 1에서 발견되는 바와 같은 부분 경쇄 서열 및 부분 중쇄 서열, 또는 그의 변이체를 갖는 항체를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다. 표 1에서, 밑줄친 서열은 CDR 서열이다. 표 1에서, K_D는 달리 표시되지 않는 한, 25℃에서 표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정된 바와 같이 인간 PD-1에 대한 친화도를 표시한다.

<표 1>

항-PD-1 길항제 항체의 가변 영역 서열

본 발명은 또한, PD-1에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다. CDR 영역의 결정은 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트와 코티아 CDR의 조합 ("조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"로 일컬어지기도 한다)일 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 CDR의 "입체 형태적 정의"로서 지칭된 또 다른 접근방식에서, 이러한 CDR의 위치는 항원 결합성에 엔탈피 기여를 하는 잔기로서 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166] 참조). 일반적으로, "입체 형태적 CDR"은 항체가 특이적 항원과 결합하는 데 적당한 루프 구조를 유지하기 위하여 제한되는 버니어 구역(Vernier zone)과 카바트 CDR 내의 잔기 위치를 포함한다. 입체 형태적 CDR의 결정은 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 연장된, AbM, 입체 형태적, 또는 접촉 CDR이다. 다시 말해서, 2개 이상의 CDR을 수반하는 실시양태에서, 이러한 CDR은 카바트, 코티아, 연장된, AbM, 입체 형태적, 접촉 CDR, 또는 그의 조합 중 임의의 것일 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 항체는 표 1에 제시된 중쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 표 1에 제시된 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 표 1에 제시된 중쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR, 및 표 1에 제시된 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 3개의 CDR을 포함한다.

표 2는 본원에 제공된 항-PD-1 길항제 항체의 CDR 서열의 예를 제공한다.

<표 2>

카바트 (밑줄침) 및 코티아 (볼드체)에 따르는 항-PD-1 길항제 항체 (mAb) 및 그의 항원 결합성 CDR 서열

일부 실시양태에서, 항체는 표 2로부터의 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.

항-PD-1 항체로부터의 경쇄 CDR의 정렬이 표 3에 제공된다. 가변 잔기는 볼드체로 제시된다. 컨센서스 경쇄 CDR 서열이 표 3의 마지막 열에 제공된다.

<표 3>

항-PD-1 경쇄 CDR의 정렬

항-PD-1 항체로부터의 중쇄 CDR의 정렬이 표 4에 제공된다. 가변 잔기는 볼드체로 제시된다. 컨센서스 중쇄 CDR 서열이 표 4의 마지막 열에 제공된다.

<표 4>

항-PD-1 중쇄 CDR의 정렬

일부 실시양태에서, 항체는 표 3으로부터의 3개의 경쇄 CDR 및 표 4로부터의 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 항-PD-1 길항제 항체 mAb7 또는 mAb15의 완전한 길이의 중쇄 (C-말단 리신을 수반하거나 또는 수반하지 않는다), 및/또는 완전한 길이의 경쇄를 포함한다. mAb7 완전한 길이의 중쇄의 아미노산 서열 (서열식별번호: 29)이 다음에 제시된다:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSLTNYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 29).

C-말단 리신을 수반하지 않는 mAb7 완전한 길이의 중쇄의 아미노산 서열 (서열식별번호: 38)이 다음에 제시된다:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSLTNYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (서열식별번호: 38).

mAb7 완전한 길이의 경쇄의 아미노산 서열 (서열식별번호: 39)이 다음에 제시된다:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQKPGQPPKLLIYWTSYRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPHTFGGGTKVEIKRGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 39).

본 발명은 또한, 항-PD-1 길항제 항체의 생성, 선별 및 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 관련 기술분야에 공지된 과정에 의해 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 재조합적으로 만들 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 발현시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 제조 및 선별할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994] 참조). 또 다른 한편으론, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990])을 사용하여, 면역시키지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 외피 단백질 유전자 내로 동일 프레임 내에서 클로닝시키고, 파지 입자의 표면 상에서 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 섬유상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 근거하여 선별하게 되면, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별할 수도 있다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성들 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있으며, 이들에 대한 고찰은, 예를 들어 다음 문헌을 참조할 수 있다 (Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993). V-유전자 절편의 몇 가지 공급원을 파지 디스플레이를 위해 사용할 수 있다. 문헌 (Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991)에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 항원 (자기 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 본질적으로, 문헌 ([Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993])에 기재된 기술에 따라서 단리시킬 수 있다. 자연 면역 반응에서는, 항체 유전자가 돌연변이를 고속으로 축적한다 (체세포 과돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 보다 높은 친화도를 부여할 것이고, 고 친화도 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 우선적으로 복제되며, 후속 항원 시험감염 동안 분화된다. 이러한 자연적 과정은 "연쇄 셔플링(chain shuffling)"으로서 공지된 기술을 이용함으로써 모방될 수 있다 (Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는, 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 면역되지 않은 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생적 변이체의 레퍼토리로 순차적으로 대체시킴으로써 개선될 수 있다. 이러한 기술로 인해, pM 내지 nM 범위의 친화도를 나타내는 항체 및 항체 단편이 생성될 수 있다. 극대형 파지 항체 레퍼토리 ("최대의 라이브러리"로서 공지되기도 함)를 제조하기 위한 전략은 문헌 (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993)에 기재되어 있다. 유전자 셔플링을 또한 사용하여 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도시킬 수 있는데, 이러한 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도와 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"으로서 지칭되기도 하는 상기 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자를 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체시키면, 설치류-인간 키메라 집단이 창출된다. 항원에 기초하여 선별하면, 기능적 항원 결합 부위를 복원할 수 있는 인간 가변 영역이 단리되는데, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우한다 (영향을 미친다). 나머지 설치류 V 도메인을 대체시키기 위해 상기 과정을 반복하는 경우, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공개 번호 WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 상기 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 전혀 없는 완전한 인간 항체를 제공해 준다.

일부 실시양태에서, 하이브리도마 기술을 이용하여 항체를 만들 수 있다. 인간을 포함한 임의의 포유류 대상체 또는 그로부터의 항체 생산 세포를, 포유류 (인간 포함) 하이브리도마 세포주의 생성을 위한 기준으로서 제공되도록 조작할 수 있는 것으로 고려된다. 숙주 동물의 면역 경로 및 스케줄은 일반적으로, 본원에 추가로 기재되는 바와 같은, 항체 자극과 생성을 위해 정립된 통상적인 기술에 따른다. 전형적으로, 숙주 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 것을 포함한, 특정 양의 면역원을 복강내, 근육내, 경구, 피하, 발바닥내, 및/또는 피내 접종한다.

하이브리도마는 문헌 (Kohler, B. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497)의 일반적 체세포 혼성화 기술을 이용하거나 또는 문헌 (Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982)에 의해 변형된 바와 같이, 림프구 및 불멸화 골수종 세포로부터 제조할 수 있다. X63-Ag8.653 및 솔크 인스티튜트, 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute, Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)로부터의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 입수 가능한 골수종 세포주를 상기 혼성화에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합 유도제를 이용하거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포와 림프계 세포를 융합시키는 것을 포함한다. 이러한 융합 후, 상기 세포를 융합 배지로부터 분리시키고, 선택적 성장 배지, 예컨대 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장시켜 혼성화되지 않은 모 세포를 제거한다. 혈청으로 보충시켰거나 보충시키지 않은, 본원에 기재된 배지 중 임의의 것을, 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위해 사용할 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본 발명의 PD-1 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 하이브리도마 또는 다른 불멸화 B-세포를 필요에 따라, 확장하고 서브클로닝하며, 상등액을 대상으로 하여 통상적인 면역검정 과정 (예를 들어, 방사성 면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 관하여 검정한다.

항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 모든 유도체, PD-1에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 모 하이브리도마의 자손 세포, 또는 그의 특정 부분을 포괄한다.

이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 과정을 이용하여 시험관 내에서 또는 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 필요에 따라, 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예컨대 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리할 수 있다. 존재하는 경우, 원하지 않는 활성은, 예를 들어 고체 상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 전반에 걸친 제조를 실행하고, 이러한 면역원으로부터 목적하는 항체를 용출 또는 방출시킴으로써 제거할 수 있다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬 기이다)을 이용하여, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제와 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 PD-1 폴리펩티드 또는 그의 단편으로 숙주 동물을 면역시키면, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체) 집단이 산출될 수 있다.

필요에 따라, 관심 항-PD-1 길항제 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 서열 분석할 수 있고, 그 다음 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열을 숙주 세포 내의 벡터에 유지시킨 다음, 이러한 숙주 세포를 나중의 사용을 위해 확장 및 동결시킬 수 있다. 세포 배양물 중에서 재조합 모노클로날 항체를 생성시키는 것은 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터 항체 유전자를 클로닝함으로써 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112]; 미국 특허 번호 7,314,622 참조).

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 또는 항체의 친화도 또는 다른 특징을 개선시키기 위한 유전자 조작을 위해 사용될 수 있다. 항체는, 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에 사용하기 위한 맞춤형일 수도 있다.

일부 실시양태에서, 완전한 인간 항체는 특이적 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작시킨 시판용 마우스를 이용함으로써 수득할 수 있다. 보다 바람직한 항체 (예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 보다 강건한 면역 반응을 생성하도록 설계되는 트랜스제닉(transgenic) 동물이 또한, 인간화 또는 인간 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 제노마우스(Xenomouse™) [압제닉스, 인크. (Abgenix, Inc.; 미국 캘리포니아주 프리몬트)로부터 입수됨] 및 HuMAb-마우스(HuMAb-Mouse®) 및 TC 마우스™ [메다렉스, 인크. (Medarex, Inc.; 미국 뉴저지주 프린스턴)로부터 입수됨]이다.

항체는 먼저, 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생산 세포를 단리하고, 유전자 서열을 수득하며, 이러한 유전자 서열을 이용하여 항체를 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 재조합적으로 발현시킴으로써 재조합적으로 만들 수 있다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 항체 서열을 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 우유에서 발현시키는 것이다. 항체를 식물 또는 우유에서 재조합적으로 발현시키는 방법은 개시되었다 (예를 들어, 문헌 [Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001]; [Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995]; 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999] 참조). 항체의 유도체, 예를 들어 도메인, 단일 쇄 등을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

면역검정 및 유동 세포계수법 분류 기술, 예컨대 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)을 또한 이용하여, PD-1에 대해 특이적인 항체를 단리시킬 수 있다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 이용하여 (예를 들어, 이러한 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열 분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 단리되면, 그 DNA를 발현 벡터 (예컨대 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내로 놓아둘 수 있고, 이어서 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462 참조). DNA는 또한, 예를 들어 코딩 서열을 상동 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로 치환시키거나 (문헌 [Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]) 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 방식으로, 본원의 PD-1 모노클로날 항체의 결합 특이성을 지닌 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.

항체 단편은 항체의 단백질 분해적 또는 다른 분해에 의해, 상기 언급된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생성시킬 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50개 이하의 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조한다. 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 시판되고 있다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 이용하는 자동화 폴리펩티드 합성기에 의해 생성될 수 있었다 (또한, 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415 참조).

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb7, mAb8, mAb9, mAb10, mAb11, mAb12, mAb13, mAb14, mAb15, 또는 mAb16의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열을 숙주 세포 내의 벡터에 유지시킨 다음, 이러한 숙주 세포를 나중의 사용을 위해 확장 및 동결시킬 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재되어 있다.

본 발명은 친화성 성숙된 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화성 성숙된 항체는 관련 기술분야에 공지된 과정에 의해 생성될 수 있다 ([Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896]; 및 PCT 공개 번호 WO2004/058184).

항체의 친화도를 조정하고 CDR을 명확히 규명하기 위한 다음 방법을 사용할 수 있다. 항체의 CDR을 명확히 규명하고/하거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경 (예컨대 개선)시키는 한 가지 방식이 "라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발"로 일컬어진다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발은 다음과 같이 수행된다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치를, 관련 기술분야에서 승인된 방법을 이용하여 2개 이상 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 아미노산으로 대체시킨다. 이로써, (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 하나의) 소형 클론 라이브러리가 생성되는데, (2개 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우) 각각은 2개 이상의 구성원의 복잡한 특징을 수반한다. 일반적으로, 이러한 라이브러리는 또한, 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 소수의 클론, 예를 들어 약 20 내지 80개의 클론 (라이브러리의 복잡성에 좌우된다)을 대상으로 하여, 표적 폴리펩티드 (또는 다른 결합성 표적)에 대한 결합 친화도에 관하여 스크리닝하고, 결합성이 증가되거나, 동일하거나, 감소되거나 또는 전혀 없는 후보를 확인한다. 결합 친화도를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 결합 친화도는, 예를 들어 약 2배 이상의 결합 친화도 상의 차이를 검출해 주는 비아코어(Biacore™) 표면 플라스몬 공명 분석, 키넥사(Kinexa®) 바이오센서, 신틸레이션 근접 검정, ELISA, ORIGEN® 면역검정, 형광 켄칭, 형광 전이, 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 결정할 수 있다. 결합 친화도는 또한, 적합한 생물학적 검정을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 출발 항체가 이미 비교적 고 친화도, 예를 들어 약 10 nM 이하의 K_D로 결합하는 경우에는 비아코어™가 특히 유용하다.

일부 실시양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치를, 관련 기술분야에서 승인된 돌연변이 유발 방법 (이중 일부가 본원에 기재되어 있다)을 이용하여 20개 모든 자연 아미노산으로 대체시킨다 (일부 실시양태에서는, 한번에 하나씩 대체시킨다). 이로써, (일부 실시양태에서는, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 하나의) 소형 클론 라이브러리가 생성되는데, (20개 모든 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우) 각각은 20개 구성원의 복잡한 특징을 수반한다.

일부 실시양태에서, 스크리닝하고자 하는 라이브러리는 동일한 CDR 내이거나 2개 이상의 CDR 내일 수 있는 2개 이상의 위치에서 치환을 포함한다. 따라서, 라이브러리는 하나의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 3, 4, 5, 또는 그 초과의 위치에서 치환을 포함할 수 있는데, 이러한 위치는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견된다. 이러한 치환은 낮은 중복성 코돈을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Balint et al., 1993, Gene 137(1):109-18]의 표 2 참조).

이러한 CDR은 중쇄 가변 영역 (VH) CDR3 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR3일 수 있다. CDR은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 연장된 CDR, AbM CDR, 접촉 CDR, 또는 입체 형태적 CDR일 수 있다.

개선된 결합성을 지닌 후보를 서열 분석함으로써, 개선된 친화성을 가져다 주는 CDR 치환 돌연변이체 (또한, "개선된" 치환으로 일컬어짐)를 확인할 수 있다. 결합되는 후보를 또한 서열 분석함으로써, 결합성을 보유하고 있는 CDR 치환을 확인할 수 있다.

여러 차례의 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합성을 지닌 후보 (각각 하나 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다)는 또한, 각각의 개선된 CDR 위치 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합성을 나타낸 CDR 내의 아미노산 위치)에서 적어도 원래의 아미노산과 치환된 아미노산을 함유하는 제2의 라이브러리를 설계하는 데 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선별은 다음에 추가로 논의된다.

개선된 결합성, 동일한 결합성 또는 감소된 결합성을 나타내거나 결합성을 전혀 나타내지 않는 클론의 빈도가 또한, 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각 아미노산 위치의 중요성과 관련된 정보를 제공하는 한에 있어서는, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발이 또한, CDR을 명확히 규명하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 특정 위치가 20개 모든 아미노산으로 변한 경우에도 결합성을 보유한다면, 이러한 위치는 항원 결합을 위해 요구될 것 같지 않은 위치로서 확인된다. 이와는 반대로, CDR의 특정 위치가 단지 적은 비율의 치환으로 결합성을 보유한다면, 이러한 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발 방법에 의해, 상이한 많은 아미노산 (20개 모든 아미노산 포함)으로 변할 수 있는 CDR 내의 위치와, 변할 수 없거나 또는 소수의 아미노산으로만 변할 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 얻을 수 있다.

개선된 친화성을 지닌 후보는 개선된 아미노산, 그 위치에서 원래의 아미노산을 포함하는 제2의 라이브러리에서 조합될 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선별 방법을 이용하여 허용되거나 또는 요망되는 라이브러리의 복잡성에 따라서 그 위치에서 부가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 인접한 아미노산 위치가 적어도 2개 이상의 아미노산으로 무작위 배정될 수 있다. 인접한 아미노산의 무작위 배정으로 인해, 돌연변이체 CDR 내에서 부가의 입체 형태적 유연성이 허용될 수 있고, 이는 결국, 보다 다수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 촉진시킬 수 있다. 상기 라이브러리는 또한, 제1 라운드의 스크리닝에서는 개선된 친화성을 나타내지 않았던 위치에서 치환을 포함할 수 있다.

제2의 라이브러리를 대상으로 하여, 키넥사™ 바이오센서 분석을 이용하는 스크리닝, 및 선별을 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이 포함)을 이용하는 선별을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 개선되고/되거나 변경된 결합 친화성을 지닌 라이브러리 구성원에 관하여 스크리닝하거나 선별한다.

본 발명의 항-PD-1 항체를 발현하기 위하여, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 단편을 먼저, 상기 언급된 방법 중 임의의 것을 이용하여 수득할 수 있다. 각종 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실 및/또는 부가를, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 DNA 서열 내로 도입할 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이 유발은 표준 방법, 예컨대 PCR-매개된 돌연변이 유발을 이용하여 수행할 수 있는데, 이러한 방법에서는 돌연변이된 뉴클레오티드를 PCR 프라이머 내로 혼입하여, PCR 생성물이 목적하는 돌연변이 또는 부위 지정 돌연변이 유발을 함유하도록 한다.

본 발명은 표 1에 제시된 가변 영역 및 표 2, 3 또는 4에 제시된 CDR에 대한 변형을 포괄한다. 예를 들어, 본 발명은 항체의 특성에 상당한 영향을 미치지 않는, 기능상 등가의 가변 영역 및 CDR을 포함하는 항체뿐만 아니라 증강되거나 또는 감소된 활성 및/또는 친화성을 갖는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열을 돌연변이시켜 PD-1에 대한 목적하는 결합 친화성을 지닌 항체를 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 관련 기술분야에서 일상적으로 실시되는 것이므로, 본원에 상세히 기재할 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 상당히 유해하게 변화시키지 않거나 또는 폴리펩티드의 그의 리간드에 대한 친화성을 성숙 (증강)시키는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 수반하는 폴리펩티드를 포함한다.

아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기부터 수 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그와 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환시 항체의 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.

치환 변이체는 항체 분자 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 가장 관심있는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경 또한 고려된다. 보존적 치환이 "보존적 치환"이란 표제 하에 표 5에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 인해 생물학적 활성 상의 변화가 발생한다면, 표 5에 제시되거나 또는 아미노산 부류를 참조로 하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 "예시적인 치환"으로 표시된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 그 생성물을 스크리닝할 수 있다.

<표 5>

아미노산 치환

항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 β-시트 또는 나선 입체 형태로서 유지시키는 데에 대한 그의 효과, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키는 데에 대한 그의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 데에 대한 그의 효과 면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 자연 발생적 잔기는 공통의 측쇄 특성에 근거하여 다음 군으로 나눈다:

(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 전하를 수반하지 않은 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성 (음 전하를 띰): Asp, Glu;

(4) 염기성 (양 전하를 띰): Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환시킴으로써 이루어진다.

예를 들어, 만들어질 수 있는 한 가지 유형의 치환은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 내의 하나 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대 제한 없이 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-표준 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 이러한 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 내에서 또는 불변 영역 내에서 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 시스테인은 표준이다. 항체의 적당한 입체 형태를 유지시키는 데 관여하지 않은 임의의 시스테인 잔기는 또한, 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적인 교차 결합을 방지시킬 수 있다. 반대로, 특히 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우에, 시스테인 결합(들)을 이러한 항체에 부가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.

항체는 또한, 예를 들어 이러한 항체의 결합 특성을 변경시키기 위해, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 변형될 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 1개 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 예를 들어, PD-1에 대한 항체의 K_D를 증가 또는 감소시키기 위해, k_off를 증가 또는 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 CDR 영역 중 하나 이상에서 돌연변이가 이루어질 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.] 참조).

변형 또는 돌연변이는 또한, 항-PD-1 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/09560 참조). 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한, 항체의 면역원성을 변경시키거나, 또 다른 분자에 대한 공유적 또는 비-공유적 결합을 위한 부위를 제공하거나, 또는 보체 고정, FcR 결합성 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성과 같은 특성을 변경시키기 위해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 프레임워크 영역 또는 불변 영역 내에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 1개 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 프레임워크 영역 또는 불변 영역 내에서 이루어진다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 중 임의의 하나 이상에서 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.

변형은 또한, 글리코실화 및 비-글리코실화 폴리펩티드뿐만 아니라 다른 번역 후 변형, 예컨대 예를 들어 상이한 당을 이용한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 수반한 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 그의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). 면역글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 미치고 (문헌 [Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318]; [Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180]), 당단백질의 제시된 3차원적 표면 및 입체 형태에 영향을 미칠 수 있는, 이러한 당단백질의 부분들 간의 분자내 상호 작용에 영향을 미친다 (Jefferis and Lund, 상기 참조; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). 올리고사카라이드는 또한, 소정의 당단백질이 특이적 인식 구조에 근거하여 특정 분자를 표적으로 하는 데 제공될 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라시클린-조절된 발현을 이용하여 CHO 세포에 의해 생성된 항체가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).

항체의 글리코실화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시킨 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적 글리코실화 부위를 창출시켜 준다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

글리코실화 부위를 항체에 부가하는 것은 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우에는) 상기 언급된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행된다. 이러한 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 원래의 항체 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기에 의해 치환시킴으로써 만들 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

항체의 글리코실화 패턴은 또한, 기초가 되는 뉴클레오티드 서열을 변경시키지 않으면서 변경될 수 있다. 글리코실화는 대개, 항체를 발현시키기 위해 사용된 숙주 세포에 좌우된다. 잠재적 치료제로서의 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현을 위해 사용된 세포 유형이 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴 상의 변이가 예상될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조).

숙주 세포를 선택하는 것 이외에도, 항체의 재조합 생성 동안 글리코실화에 영향을 미치는 요인은 성장 방식, 배지 제형, 배양물 밀도, 산소화, pH, 정제 도식 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생성에 관여한 특정의 효소를 도입하거나 또는 과발현시키는 것을 포함한, 특별한 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경시키는 각종 방법이 제안되었다 (미국 특허 번호 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H (엔도 H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 이용하여, 당단백질로부터 효소적으로 제거할 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드를 프로세싱하는 데 있어서 결함이 있도록 유전적으로 조작할 수 있다. 이들 및 유사한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

다른 변형 방법은 관련 기술분야에 공지된 커플링 기술을 이용하는 것을 포함하는데, 이는 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 면역검정을 위해 표지를 부착시키기 위한 변형을 사용할 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 관련 기술분야에 정립된 과정을 이용하여 만들고, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 이용하여 스크리닝할 수 있는데, 이중 일부는 다음 및 본 실시예에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, Fc는 인간 IgG₂ 또는 인간 IgG₄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 다음 돌연변이를 포함하는 IgG₄의 불변 영역을 포함한다 (문헌 [Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593]): E233F234L235에서 P233V234A235 (IgG_4Δc)로의 돌연변이 (여기서, 넘버링은 야생형 IgG₄를 참조한 것이다). 또한 또 다른 실시양태에서, Fc는 인간 IgG₄ E233F234L235에서 결실 G236을 수반한 P233V234A235 (IgG_4Δb)이다. 일부 실시양태에서 Fc는 힌지 안정화 돌연변이 (S228에서 P228로의 돌연변이)를 함유하는 임의의 인간 IgG₄ Fc (IgG₄, IgG_4Δb 또는 IgG_4Δc)이다 (Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19). 다른 실시양태에서, Fc는 A330P331에서 S330S331로의 돌연변이 (IgG_2Δa) (여기서, 아미노산 잔기는 야생형 IgG₂ 서열을 참조하여 넘버링된다)를 함유하는 인간 IgG₂일 수 있다 (Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624).

일부 실시양태에서, 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대한 증가되거나 감소된 결합 친화성을 지닌 변형된 불변 영역을 포함하거나, 면역학적으로 불활성 또는 부분 불활성, 예를 들어 보체 매개된 용해를 촉발시키지 않거나, 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않거나 또는 미세신경교세포를 활성화시키지 않거나; 또는 다음 중 임의의 하나 이상에서 (변형되지 않은 항체와 비교해서) 저하된 활성을 갖는다: 보체 매개된 용해를 촉발시키는 활성, ADCC를 자극하는 활성, 또는 미세신경교세포를 활성화시키는 활성. 불변 영역의 상이한 변형을 이용하여 이펙터 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참조). 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 (Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; PCT 공개 번호 WO99/058572)에 기재된 바와 같이 변형시킨다.

일부 실시양태에서, 항체 불변 영역은 Fc 감마 수용체와 보체 및 면역 체계와의 상호 작용을 피하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 항체를 제조하기 위한 기술은 WO 99/58572에 기재되어 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체를 인간의 임상 시험과 치료에 사용하는 경우에 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 보다 유사하도록 조작할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,997,867 및 5,866,692 참조).

또한 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화를 위해 아글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 올리고사카라이드 부착 잔기를 돌연변이시키고/시키거나 불변 영역 내의 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 잔기를 플랭킹함으로써 N-연결된 글리코실화를 위해 아글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은, 예를 들어 A, Q, K, 또는 H로 돌연변이될 수 있다 (문헌 [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998] 참조). 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화를 위해 아글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대, 효소 PNGase에 의해 탄수화물을 제거한다) 또는 글리코실화 결핍성 숙주 세포에서 발현시킴으로써 N-연결된 글리코실화를 위해 아글리코실화될 수 있다.

다른 항체 변형은 PCT 공개 번호 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형시킨 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지시된 결합성 도메인 이외에도, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 전부 또는 일부와 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이들 항체는 상당한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-매개된 파괴를 촉발시키지 않으면서 표적 분자와 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb와 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로, 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인에 근거한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증성 및 다른 불리한 반응을 피하기 위하여, 만성 항체 요법에 사용하기 특히 적합하다.

일부 실시양태에서, 항체는 변형되지 않은 항체와 비교해서, FcRn에 대한 증가된 결합 친화성 및/또는 증가된 혈청 반감기를 갖는 변형된 불변 영역을 포함한다.

"생식세포 계열화"로서 공지된 과정에서는, VH 및 VL 서열 내의 특정의 아미노산을, 생식세포 계열 VH 및 VL 서열에서 자연적으로 발견되는 것과 매칭되도록 돌연변이시킬 수 있다. 특히, VH 및 VL 서열 내의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 항체를 투여하는 경우에 면역원성의 위험을 저하시키기 위해 생식세포 계열 서열과 매칭되도록 돌연변이시킬 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 생식세포 계열 DNA 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, "Vbase" 인간 생식세포 계열 서열 데이터베이스 참조; 또한, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242]; [Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836] 참조).

만들어질 수 있는 또 다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 잠재적 단백질 분해적 부위를 제거하는 것이다. 이러한 부위는 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 내에 또는 불변 영역 내에 존재할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환과 단백질 분해적 부위의 제거는 항체 생성물 내에서의 이질성의 위험을 감소시킬 수 있으므로, 그의 동질성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 유형의 아미노산 치환은 아스파라긴과 글리신 잔기 중 하나 또는 둘 다를 변경시킴으로써, 잠재적 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 또 다른 예에서는, 본 발명의 항-PD-1 항체의 중쇄의 C-말단 리신을 절단할 수 있다. 본 발명의 각종 실시양태에서, 항-PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로, 시그널 서열을 포함할 수 있다.

일단 본 발명의 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득하면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 완전한 길이의 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서는, VL-코딩 또는 VH-코딩 DNA 단편을 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동적으로 연결시킨다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"이란 상기 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 동일 프레임을 유지하도록 하기 위해 이들 2개의 DNA 단편을 연결시키는 것을 의미한다.

VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를, 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 완전한 길이의 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG₁ 또는 IgG₂ 불변 영역이다. 이러한 IgG 불변 영역 서열은 상이한 개체들 간에 존재하는 것으로 공지된 각종 대립 유전자 또는 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17) 중 임의의 것일 수 있다. 이들 동종이형은 IgG1 불변 영역 내의 자연 발생적 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 CH1 중쇄 불변 영역은 상기 중쇄 유전자 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.

VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는, 이러한 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결시킴으로써 완전한 길이의 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체들 간에 발생하는 것으로 공지된 각종 대립 유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3) 중 임의의 것일 수 있다. 람다 불변 영역은 상기 3가지 람다 유전자 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.

scFv 유전자를 창출하기 위하여, VH-코딩 DNA 단편과 VL-코딩 DNA 단편을, VH 서열과 VL 서열이 연속되는 단일 쇄 단백질로서 발현될 수 있고 VL 영역과 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되도록 이러한 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편과 작동적으로 연결시킨다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554] 참조). 연결성 펩티드의 한 예는 (GGGGS)₃ (서열식별번호: 19)인데, 이는 하나의 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 간의 대략 3.5 nm를 메워준다. 다른 서열의 링커를 설계하고 사용하였다 (Bird et al., 1988, 상기 참조). 링커는 궁극적으로, 부가 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체로의 부착을 위해 변형시킬 수 있다. 단일 쇄 항체는 단지 단일 VH와 VL을 사용한 경우에는 1가일 수 있거나, 2개의 VH와 VL을 사용한 경우에는 2가일 수 있거나, 또는 2개 초과의 VH와 VL을 사용한 경우에는 다가일 수 있다. PD-1 및 또 다른 분자와 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체를 생성시킬 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성시킬 수 있다. scFv를 합성 생성하는 경우에는, 자동화 합성기를 사용할 수 있다. scFv를 재조합 생성하는 경우에는, 이러한 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드를 적합한 진핵성 숙주 세포, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포, 또는 적합한 원핵성 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 내로 도입할 수 있다. 관심 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일상적인 조작, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 라이게이션에 의해 만들 수 있다. 이로써 생성되는 scFv는 관련 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 단리시킬 수 있다.

다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아보디가 또한 포괄된다. 디아보디는 VH와 VL이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝짓기하여 2개의 항원 결합 부위를 창출시키는 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참조).

2개의 공유적으로 연결된 항체를 포함하는 이종-접합체 항체가 또한, 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 항체는 면역 체계 세포가 불필요한 세포를 표적으로 하고 (미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하기 위해 사용되어 왔다 (PCT 공개 번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089). 이종-접합체 항체는 임의의 편리한 가교 결합 방법을 이용하여 만들 수 있다. 적합한 가교 결합제 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 기재되어 있다.

키메라 또는 하이브리드 항체는 또한, 가교 결합제가 관여하는 방법을 포함한, 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.

본 발명은 또한, 본원에 개시된 항체로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 또 다른 폴리펩티드와 연결된 본 발명의 항-PD-1 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체를 만들 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체의 가변 도메인만이 상기 폴리펩티드와 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드와 연결되는 반면, 항-PD-1 항체의 VL 도메인은, VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호 작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 연합되는 제2 폴리펩티드와 연결된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, VH 도메인은 이러한 VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호 작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다. 이어서, VH-링커-VL 항체를 관심 폴리펩티드와 연결시킨다. 또한, 2개 (또는 그 초과의) 단일 쇄 항체가 서로 연결되는 융합 항체가 창출될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 쇄 상에 2가 또는 다가 항체를 창출시키고자 하는 경우 또는 이중특이적 항체를 창출시키고자 하는 경우에 유용하다.

일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2, 7, 8, 또는 9에 제시된 가변 경쇄 영역의 적어도 10개의 연속되는 아미노산 및/또는 서열식별번호: 3, 4, 5, 또는 6에 제시된 가변 중쇄 영역의 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개의 연속되는 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개의 연속되는 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 2 및 3, 7 및 3, 8 및 3, 8 9 및 3, 2 및 4, 7 및 4, 8 및 4, 9 및 4, 2 및 5, 7 및 5, 8 및 5, 9 및 5, 2 및 6, 7 및 6, 8 및 6, 및 9 및 6으로부터 선택된 서열 쌍 중 임의의 것에 제시된 바와 같은, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또한 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질은 하나 이상의 항체, 및 천연 분자에서는 이에 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 상동 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 "태그", 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 태그는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

융합 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합적으로 창출될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 재조합 방법을 이용하여 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조 및 발현함으로써 만들어지지만, 이들은 예를 들어, 화학적 합성을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 다른 수단에 의해 제조될 수도 있다.

다른 실시양태에서, 다른 변형된 항체는 항-PD-1 항체를 코딩하는 핵산 분자를 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, "카파 보디" (문헌 [Ill et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57]), "미니보디" (문헌 [Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9]), "디아보디" (상기 문헌 [Holliger et al.] 참조), 또는 "야누신(Janusin)" (문헌 [Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659] 및 [Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52])은 본 명세서의 교시에 따라서 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 지닌 이중특이적 항체, 모노클로날 항체는 본원에 개시된 항체를 이용하여 제조할 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참조). 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 항원 결합성 단편은 하이브리도마의 융합에 의해 또는 Fab' 단편을 연결시킴으로써 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321], [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553] 참조). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 근거하였는데, 이들 두 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). 또한, 이중특이적 항체는 "디아보디" 또는 "야누신"으로서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 PD-1의 2개의 상이한 에피토프와 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 변형된 항체는 본원에 제공된 항-PD-1 항체로부터의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 이용하여 제조한다.

이중특이적 항체를 제조하기 위한 한 가지 접근방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 영역 서열과 융합시킨다. 이러한 융합은 바람직하게, 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 수반한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하고, 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물을 코딩하는 DNA, 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 3개 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서 3개 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는 데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 인해 고 수율이 초래되는 경우 또는 이러한 비가 특별히 중요하지 않는 경우에 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

한 가지 접근 방식에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암(arm)에 제1 결합 특이성을 지닌 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2의 결합 특이성을 제공한다)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 1/2에만 면역글로불린 경쇄를 수반하는 상기 비대칭 구조는 목적하는 이중특이적 화합물을 불필요한 면역글로불린 쇄 조합물로부터 분리하는 것을 촉진시켜 준다. 이러한 접근방식은 PCT 공개 번호 WO 94/04690에 기재되어 있다.

본 발명은 또한, 고체 지지체 (예컨대, 비오틴 또는 아비딘)와의 커플링을 촉진시켜 주는 작용제와 접합된 (예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 편의상, 이들 방법이 본원에 기재된 PD-1 결합성 및/또는 길항제 실시양태 중 임의의 것에 적용된다는 이해와 함께 일반적으로 항체에 대해 언급될 것이다. 접합은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 이들 성분을 연결시키는 것을 지칭한다. 이러한 연결 (이는 일반적으로, 이들 성분을 적어도 투여를 위해 근접하게 연합하여 고정시키는 것이다)은 임의의 수많은 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 작용제와 항체가 각각, 다른 것과 반응할 수 있는 치환기를 보유하는 경우에는, 이들 작용제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들어, 하나의 것 상에서의 친핵기, 예컨대 아미노 또는 술프히드릴 기는 다른 것 상에서의 카르보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드와 반응할 수 있거나 또는 우수한 이탈기 (예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.

항체는 상이한 많은 담체와 결합될 수 있다. 담체는 활성이고/이거나 불활성일 수 있다. 널리 공지된 담체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 자연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철석(magnetite)을 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적상 가용성이거나 불용성일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체를 결합시키는 데 적합한 다른 담체를 알고 있거나 또는 일상적인 실험을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 담체는 폐, 심장 또는 심장 판막을 표적으로 하는 모이어티를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지화 작용제, 예컨대 형광성 분자, 방사성 분자, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 표지와 연결시킬 수 있다. 일반적으로 (직접 또는 간접적으로) 시그널을 제공하는 표지가 관련 기술분야에 공지되어 있다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편 및 변형된 항체를 포함한 항체 중 임의의 것, 예컨대 예를 들어, 이펙터 기능 장애를 나타내는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것의 제조 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 과정에 의해 제조 및 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다: 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb7, mAb8, mAb9, mAb10, mAb11, mAb12, mAb13, mAb14, mAb15, mAb16, 및 mAb17, 또는 PD-1을 길항시킬 수 있는 능력을 갖는 그의 임의의 단편 또는 일부.

임의의 상기 서열과 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한, 본 발명에 의해 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 부가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질과 연결될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.

폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자와 비교해서 감소되지 않도록 하는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 변이체는 바람직하게, 천연 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%의 동일성, 보다 바람직하게 적어도 약 80%의 동일성, 보다 더 바람직하게 적어도 약 90%의 동일성, 가장 바람직하게 적어도 약 95%의 동일성을 나타낸다.

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 이들 두 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 다음에 기재되는 바와 같이 최대 상응도를 위해 정렬된 경우에 동일하다면, "동일한" 것으로 여겨진다. 두 서열 간의 비교는 전형적으로, 이들 서열을 비교 윈도(window) 전반에 걸쳐 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인 및 비교함으로써 수행한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 윈도"는 적어도 약 20개의 연속되는 위치의 절편, 통상적으로 30 내지 약 75개, 또는 40 내지 약 50개의 연속되는 위치의 절편을 지칭하는데, 여기서는 서열을 동일한 수의 연속되는 위치의 참조 서열과, 이 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에, 비교할 수 있다.

비교를 위해 서열을 최적으로 정렬시키는 것은 디폴트(default) 파라미터를 이용하여, 생물 정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene®) 스위트 중의 메그얼라인(MegAlign®) 프로그램 (DNASTAR®, 인크.; 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 수행할 수 있다. 이 프로그램은 다음 참고 문헌에 기재된 몇 가지 정렬 도식을 구체화한다 (Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730).

바람직하게, "서열 동일성의 비율 (%)"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도 전반에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 결정하는데, 여기서 비교 윈도 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일정 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교해서 20% 이하, 통상적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 이러한 비율 (%)은 매칭된 위치의 수를 산출하기 위해 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하고, 이와 같이 매칭된 위치의 수를 참조 서열 내의 총 위치 수 (즉, 윈도 크기)로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 비율 (%)을 산출함으로써 계산한다.

변이체는 또한, 또는 또 다른 한편으론, 천연 유전자, 또는 그의 특정 부분 또는 보체와 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 중간 수준의 엄격한 조건하에, 천연 항체 (또는 상보성 서열)를 코딩하는 자연 발생적 DNA 서열과 혼성화할 수 있다.

적합한 "중간 수준의 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액 중에서 미리-세척하고; 50℃ 내지 65℃ 하에, 5 X SSC를 밤새 혼성화한 다음; 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 65℃ 하에 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.

본원에 정의된 바와 같은 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 이용하는 조건; (2) 혼성화 동안 42℃ 하에 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 750 mM 염화나트륨, 75 mM 소듐 시트레이트를 수반한 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)을 수반한 50% (v/v) 포름아미드를 이용하는 조건; 또는 (3) 42℃ 하에 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 소듐 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르츠 (Denhardt) 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 이용하고, 42℃ 하에 0.2 x SSC (염화나트륨/소듐 시트레이트)에서 세척하고 55℃ 하에 50% 포름아미드로 세척한 다음, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 고 엄격성 세척을 수행하는 조건이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 요인들을 수용하는 데 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식하고 있을 것이다.

유전 암호의 축중에 따른 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 최소한의 상동성을 보유하고 있다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용빈도 상의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립 유전자는 본 발명의 범위 내에 있다. 대립 유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경되는 내인성 유전자이다. 이로써 생성되는 mRNA와 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 대립 유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법, 또는 PCR을 이용하여 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세히 기재될 필요는 없다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공된 서열을 이용할 수 있고 목적하는 DNA 서열을 생성시키기 위한 상업적 DNA 합성기를 이용할 수 있다.

재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에는, 목적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이러한 벡터를 궁극적으로, 본원에 추가로 논의되는 바와 같이 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 세포는 직접적인 흡수, 세포내 이입, 형질감염, F-짝짓기 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환시킨다. 일단 도입되면, 이러한 외인성 폴리뉴클레오티드를 비-통합된 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 세포 내에 유지시킬 수 있거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합시킬 수 있다. 이로써 증폭된 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야 내에서 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989] 참조).

또 다른 한편으론, PCR은 DNA 서열을 재생시킬 수 있다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202 뿐만 아니라 문헌 (PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994)에 기재되어 있다.

RNA는 적절한 벡터 중의 단리된 DNA를 이용하고, 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 이때 예를 들어, 상기 문헌 ([Sambrook et al., 1989] 참조)에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.

적합한 클로닝 벡터를 표준 기술에 따라서 구축할 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 입수 가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택할 수 있다. 선택된 클로닝 벡터가 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라서 다양할 수 있긴 하지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로, 자기 복제할 수 있는 능력을 가질 수 있고/있거나, 특별한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 상기 벡터를 함유하는 클론을 선별하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 수반할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀(shuttle) 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터가 상업적 판매인, 예컨대 바이오래드(BioRad), 스트라테젠(Strategene), 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수 가능하다.

발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제 가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이는 발현 벡터가 에피솜(episome)으로서 또는 염색체성 DNA의 절대 필요한 요소로서 숙주 세포에서 복제 가능해야만 한다는 것을 암시한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로, 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 그에 제한되지 않을 수 있다: 시그널 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어성 요소 (예컨대, 프로모터, 증강인자 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 제어성 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 통상적으로 요구된다.

관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 이용하는 형질감염; 미소발사체 충격; 리포펙션(lipofection); 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염체, 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 포함한, 적절한 수많은 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 도입되는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종, 숙주 세포의 특색에 좌우될 것이다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포는 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리할 목적으로 사용될 수 있다. 포유류 숙주 세포의 비-제한적 예는 COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (또한, PCT 공개 번호 WO 87/04462 참조). 적합한 비-포유류 숙주 세포는 원핵 생물 [예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스 (B. subtillis)] 및 효모 [예컨대, 에스. 세레비사에 (S. cerevisae), 에스. 폼베 (S. pombe); 또는 케이. 락티스 (K. lactis)]를 포함한다. 바람직하게, 숙주 세포는 이러한 숙주 세포에 존재하는 경우, 상응하는 관심 내인성 항체 또는 단백질의 수준보다 약 5배 이상, 보다 바람직하게 10배 이상, 보다 더 바람직하게 20배 이상 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. PD-1 또는 PD-1 도메인에 대한 특이적 결합을 알아보기 위하여 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역검정 또는 FACS에 의해 수행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포를 확인할 수 있다.

발현 벡터를 사용하여 항-PD-1 길항제 항체의 발현을 지시할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발현 벡터를 투여하여 생체 내에서 외인성 단백질의 발현을 수득하는 것을 잘 알고 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471 참조). 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여 (주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터를 통한 투여 포함), 및 국소 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감 신경 줄기 또는 신경절, 또는 관상 동맥, 심방, 심실, 또는 심장막에 직접 투여한다.

발현 벡터, 또는 서브게놈성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화 전달을 또한 사용할 수 있다. 수용체-매개된 DNA 전달 기술이, 예를 들어 문헌 (Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338)에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국부 투여하는 경우에 약 100 ng 내지 약 200 mg의 범위의 DNA로 투여한다. 유전자 요법 프로토콜 동안 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 2 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 농도 범위의 DNA를 사용할 수도 있다. 치료 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달할 수 있다. 이러한 유전자 전달 비히클은 바이러스 기원 또는 비-바이러스 기원일 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51]; [Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845]; [Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148] 참조). 이러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유류 또는 이종 프로모터를 이용하여 유도시킬 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적 또는 조절성일 수 있다.

목적하는 폴리뉴클레오티드를 전달하고 이를 목적하는 세포에서 발현하기 위한 바이러스-기반 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스-기반 벡터 [예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 삼림열 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 강(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)], 및 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 문헌 (Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147)에 기재된 바와 같은 사멸 아데노바이러스와 연결된 DNA의 투여를 이용할 수도 있다.

비-바이러스 전달 비히클 및 방법을 이용할 수도 있는데, 이는 사멸 아데노바이러스 단독과 연결되거나 연결되지 않은 다가 양이온성 축합 DNA (예를 들어, 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147] 참조); 리간드-연결된 DNA (예를 들어, 문헌 [Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985] 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 있는 그대로의 DNA를 이용할 수도 있다. 예시적인 있는 그대로의 DNA 도입 방법은 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국 특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기재되어 있다. 부가의 접근방식이 문헌 ([Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411] 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581])에 기재되어 있다.

조성물

본 발명은 또한, 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 유효량을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 예뿐만 아니라 제제화하는 방법이 또한, 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 PD-1 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 PD-1을 인식한다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 촉발시킬 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 불필요하거나 바람직하지 못한 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 촉발시키지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 항체의 하나 이상의 CDR(들) (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 일부 실시양태에서, 6개 모든 CDR)을 포함한다.

상기 조성물은 2개 이상의 항-PD-1 항체 (예를 들어, PD-1의 상이한 에피토프를 인식하는 PD-1 항체의 혼합물)를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 2개 이상의 항-PD-1 항체, 또는 PD-1의 상이한 에피토프와 결합하는 상이한 종의 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 PD-1의 상이한 변이체를 인식하는 항-PD-1 항체의 혼합물을 포함한다.

본 발명에 사용된 조성물은 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다 (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트란 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제가 본원에 추가로 기재되어 있다.

항-PD-1 항체 및 그의 조성물은 또한, 작용제들의 유효성을 증강시키고/시키거나 보충하기 위해 제공되는 다른 작용제와 연계해서 사용될 수 있거나, 또는 이러한 다른 작용제와 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 항체 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

PD-1에 의해 매개된 병태를 예방 또는 치료하는 방법

본 발명의 항체 및 항체 접합체는 치료적 처치 방법 및 진단적 처치 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 적용에 유용하다.

한 측면에서, 본 발명은 암의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 특정 대상체에게서 암을 치료하는 방법은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체 중 임의의 것을 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 식도암, 위암, 교모세포종, 신경교종, 뇌종양, 두경부암, 신장암, 폐암, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 간암, 자궁암, 뼈암, 백혈병, 림프종, 육종, 혈액암, 갑상선암, 흉선암, 안암, 및 피부암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체 또는 PD-1 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 종양은 PD-L1 발현성 종양이다. 다른 실시양태에서, 종양은 PD-L1을 발현하지 않는다. 다른 실시양태에서, 암세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체 중 임의의 것을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 암세포의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 종양의 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체 중 임의의 것을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 종양의 퇴행을 유도하는 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, 암을 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 항체는 검출 가능한 모이어티, 예컨대 조영제 및 효소-기질 표지로 표지시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체는 또한, 생체내 진단 검정, 예컨대 생체내 영상화 (예를 들어, PET 또는 SPECT), 또는 염색 시약에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체를 부가 형태의 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 부가 형태의 요법은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법, 및/또는 부가의 면역요법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 부가의 항암 요법이다.

본원에 기재된 모든 방법과 관련하여, 항-PD-1 길항제 항체에 대한 언급은 또한, 하나 이상의 부가 작용제를 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 적합한 부형제, 예컨대 제약상 허용되는 부형제 (완충제 포함)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 사용될 수 있거나 또는 다른 치료 방법과 조합하여 사용될 수 있다.

항-PD-1 길항제 항체는 임의의 적합한 경로를 통해서 특정 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 예는 이용 가능한 기술을 제한하는 것이 아니라 이의 예시라는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해해야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 공지된 방법에 따라서, 예컨대 정맥내 투여, 예를 들어 거환으로서 또는 일정 기간에 걸쳐 연속적으로 주입하거나, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 경피, 피하, 관절내, 설하, 활막내, 취입을 통하여, 척추강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 대상체에게 투여한다. 투여는 전신, 예를 들어 정맥내 투여이거나 또는 국소성일 수 있다. 액상 제형을 위한 시판용 분무기 (제트 분무기 및 초음파 분무기 포함)가 투여에 유용하다. 액상 제형은 직접 분무할 수 있고, 동결건조된 분말은 재구성한 후에 분무할 수 있다. 또 다른 한편으론, 항-PD-1 길항제 항체는 플루오로카본 제형 및 계측된 용량 흡입기를 이용하여 에어로솔화할 수 있거나, 또는 동결건조되고 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 부위 특이적 또는 표적화 국소 전달 기술을 통하여 투여한다. 부위 특이적 또는 표적화 국소 전달 기술의 예는 항-PD-1 길항제 항체의 각종 이식형 데포 공급원, 또는 국소 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 유치(indwelling) 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외막 랩, 션트(shunt) 및 스텐트(stent), 또는 다른 이식형 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사 또는 직접 적용을 포함한다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568 참조).

항-PD-1 길항제 항체의 각종 제형이 투여에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 항-PD-1 길항제 항체는 순수하게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체 및 제약상 허용되는 부형제는 각종 제형 내에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 약리학상 유효한 물질의 투여를 촉진시켜 주는 비교적 불활성 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 점조도를 제공할 수 있거나 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 다양한 삼투압을 위한 염, 피막화제, 완충제, 및 피부 침투 증강제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 부형제 뿐만 아니라 비경구 및 비-비경구 약물 전달을 위한 제형이 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]에 제시되어 있다.

일부 실시양태에서, 이들 작용제는 주사에 의한 투여 (예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)용으로 제제화된다. 따라서, 이들 작용제는 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특별한 투여량 요법, 즉 용량, 시기 및 반복은 특별한 개체, 및 그러한 개체의 병력에 좌우될 것이다.

항-PD-1 길항제 항체는 주사 (예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 것을 포함한, 임의의 적합한 방법을 이용하여 투여할 수 있다. 항-PD-1 항체는 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 국소적으로 또는 흡입을 통하여 투여할 수 있다. 일반적으로, 항-PD-1 항체를 투여하는 경우, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적상, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서, 약 3 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg, 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 것이다. 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 및 약 25 mg/kg의 투여량을 사용할 수 있다. 병태에 따라서 수일에 걸쳐 또는 그 보다 더 길게 반복해서 투여하는 경우에는, 증상의 목적하는 억제가 일어나거나 또는 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료를 지속하여, 예를 들어 암과 연관된 증상을 저하시킨다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다. 투여 요법 (사용된 항-PD-1 길항제 항체 포함)은 시간이 경과함에 따라 다양할 수 있다.

본 발명의 목적상, 항-PD-1 길항제 항체의 적절한 투여량은 이용된 항-PD-1 길항제 항체 (또는 그의 조성물), 치료하고자 하는 증상의 유형 및 중증도, 작용제가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 병력 및 상기 작용제에 대한 반응, 투여된 작용제에 대한 환자의 청소율, 및 담당의의 재량에 좌우될 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적하는 결과를 달성시켜 주는 투여량에 도달할 때까지 항-PD-1 길항제 항체를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 걸쳐 다양할 수 있다. 실험적 고려 사항, 예컨대 반감기가 일반적으로, 투여량을 결정하는 데 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역 체계와 화합성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전한 인간 항체를 이용하여, 이러한 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역 체계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 요법의 과정에 따라 결정 및 조정할 수 있으며, 반드시는 아니지만 일반적으로, 증상의 치료 및/또는 억제 및/또는 완화 및/또는 지연에 근거한다. 또 다른 한편으론, 항-PD-1 길항제 항체의 지속적인 연속적 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속적인 방출을 달성하기 위한 각종 제형 및 장치는 관련 기술분야에 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 길항제 항체에 대한 투여량은 길항제 항체를 1회 이상 투여한 개체에게서 실험적으로 결정될 수 있다. 항-PD-1 길항제 항체의 증분 투여량이 개체에게 제공된다. 효능을 평가하기 위하여, 질환의 지표를 추적할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라서 항-PD-1 길항제 항체를 투여하는 것은, 예를 들어 수용자의 생리학적 병태, 투여 목적이 치료적인지 아니면 예방적인지의 여부, 및 통상의 실행자에게 공지된 다른 요인들에 따라서 연속적이거나 또는 간헐적일 수 있다. 항-PD-1 길항제 항체의 투여는 본질적으로, 미리 선택된 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나 또는 일련의 간격을 둔 용량 투여일 수 있다.

일부 실시양태에서, 2개 이상의 항-PD-1 길항제 항체가 존재할 수 있다. 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 그 초과의 상이한 길항제 항체가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이들 항-PD-1 길항제 항체는 서로에 대해 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가질 수 있다. 항-PD-1 길항제 항체는 또한, 다른 항체 및/또는 다른 요법과 연계해서 사용될 수 있다. 항-PD-1 길항제 항체는 또한, 작용제들의 유효성을 증강시키고/시키거나 보충하기 위해 제공되는 다른 작용제와 연계해서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 하나 이상의 부가 치료제의 투여와 조합하여 투여될 수 있다. 이들은 화학요법제, 백신, CAR-T 세포-기반 요법, 방사선 요법, 시토카인 요법, 백신, 항-PD-1 이중특이적 항체, 다른 면역억제성 경로의 억제제, 혈관형성의 억제제, T 세포 활성화제, 대사 경로의 억제제, mTOR 억제제, 아데노신 경로의 억제제, 티로신 키나제 억제제 [인리타(inlyta), ALK 억제제 및 수니티닙(sunitinib)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다], BRAF 억제제, 후성적 변형제, Treg 세포 및/또는 골수세포 유래 억제인자 세포의 억제제 또는 고갈제, JAK 억제제, STAT 억제제, 시클린 의존성 키나제 억제제, 생물학적 치료제 (VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, 다른 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB, 및 ICOS에 대한 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다), 면역원 [예를 들어, 약화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포, 예컨대 종양 유래 항원 또는 핵산이 펄스된 수지상 세포, 면역 자극성 시토카인 (예를 들어, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극성 시토카인 (예컨대 GM-CSF이지만, 이에 제한되지 않는다)을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포]의 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 엔디인 항생제 [예를 들면, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 phiI1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)] 참조); 디네미신 (디네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), PEG화 리포솜 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 독세탁셀; 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 언급된 제제 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERM)가 포함되는데, 이는 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 [파레스톤(Fareston)]; 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트, 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸, 레트로졸 및 아나스트로졸; 및 항안드로겐제, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 언급된 제제 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 면역 체크포인트 조정제를 표적으로 하는 하나 이상의 다른 치료제, 예컨대, 예를 들어 제한 없이 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1(CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS, CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, CD39-CD73-아데노신 경로 (A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CCR4, CCR8, CCR5, VEGF 경로, CSF-1, 또는 선천 면역 반응 조정제를 표적으로 하는 작용제와 연계해서 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는, 예를 들어, 항-PD-L1 길항제 항체, 예컨대 예를 들어, BMS-936559 (MDX-1105) 및 MPDL3280A; 항-PD-1 길항제 항체, 예컨대 예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 피딜리주맙; 항-CTLA-4 길항제 항체, 예컨대 예를 들어 이필리무맙; 항-LAG-3 길항제 항체, 예컨대 BMS-986016 및 IMP701; 항-TIM-3 길항제 항체; 항-B7-H3 길항제 항체, 예컨대 예를 들어 MGA271; 항-VISTA 길항제 항체; 항-TIGIT 길항제 항체; 항-CD28 길항제 항체; 항-CD80 항체; 항-CD86 항체; 항-B7-H4 길항제 항체; 항-ICOS 효능제 항체; 항-CD28 효능제 항체; 선천 면역 반응 조정제 (예를 들어, TLRs, KIR, NKG2A), 및 IDO 억제제와 연계해서 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 4-1BB (CD137) 효능제, 예컨대, 예를 들어, PF-05082566 또는 BMS-663513과 연계해서 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 OX40 효능제, 예컨대, 예를 들어, 항-OX-40 효능제 항체와 연계해서 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 GITR 효능제, 예컨대, 예를 들어, 항-GITR 효능제 항체, 예컨대, 예를 들어 제한 없이 TRX518과 연계해서 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 IDO 억제제와 연계해서 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 시토카인 요법, 예컨대, 예를 들어 제한 없이 IL-15, CSF-1, MCSF-1 등과 연계해서 사용된다.

일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 하나 이상의 다른 치료용 항체, 예컨대, 예를 들어 제한 없이, CD19, CD22, CD40, CD52, 또는 CCR4를 표적으로 하는 항체와 연계해서 사용된다.

일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 요법은 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 작용제 치료에 앞서 또는 치료 후에 수행될 수 있다. 다른 작용제 및/또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 개별적으로 투여하는 실시양태에서는 일반적으로, 각각의 전달 사이에 상당한 기간이 소요되지 않았으므로, 본 발명의 작용제와 조성물이 대상체에 대해 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 보장될 것이다. 이러한 경우, 서로 약 12 내지 24시간 내에, 및 보다 바람직하게 서로 약 6 내지 12시간 내에 양식 둘 다를 투여할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황하에서, 각각의 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과되는 경우에는, 투여 기간을 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체 조성물은 크리조티닙, 팔보시클립, 젬시타빈, 시클로포스파미드, 플루오로우라실, FOLFOX, 폴린산, 옥살리플라틴, 악시티닙, 수니티닙 말레이트, 토파시티닙, 베바시주맙, 리툭시맙, 및 트라즈투주맙으로부터 선택된 제2의 작용제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 조성물은 수술, 방사선 요법, 화학요법, 표적화 요법, 면역요법, 호르몬 요법, 혈관형성 억제 및 완화 치료로 이루어진 군으로부터 선택된 전통적인 요법을 추가로 포함하는 치료 요법과 조합된다.

암에 대한 백신-기반 면역요법 요법에 있어서의 PD-1 항체의 용도

일부 특별한 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 치료하기 위한 백신이 투여된 포유류에게, 본 개시내용에 의해 제공된 항-PD-1 길항제 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 포유류, 특히 인간에게서 암을 치료하기 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증강시키는 방법을 제공한다. 일부 다른 특별한 실시양태에서, 본 개시내용은 포유류에게 (1) 암세포에 대항하여 면역 반응을 유발시킬 수 있는 백신의 유효량 및 (2) 본 개시내용에 의해 제공된 항-PD-1 길항제 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유류, 특히 인간에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 포유류에서 신생물성 장애를 치료하는 방법과, 상기 본원에 기재된 포유류에서 신생물성 장애를 치료하기 위하여 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증강시키는 방법은 집합적으로, "암에 대한 백신 기반 면역요법 요법" (또는 "암에 대한 VBIR")로서 지칭된다.

암에 대한 VBIR에서는, 백신이 임의의 형태 또는 제형, 예컨대 (i) 세포 기반 백신, (ii) 서브유닛 백신, (iii) 단백질 기반 백신, (iv) 펩티드 기반 백신, 또는 (v) 핵산 기반 백신 (예컨대, DNA 기반 백신, RNA 기반 백신, 플라스미드 기반 백신, 또는 바이러스 벡터 기반 백신)으로 존재할 수 있다.

본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR은 임의의 유형의 암에 대해 적용 가능할 수 있다. 구체적인 암의 예는 다음을 포함한다: 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 위암, 위장암, 신장암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 방광암, 유방암, 및 두경부암.

암을 치료하기 위해 의도된 백신은 전형적으로, 표적 종양 세포 상에 발현되거나 또는 이러한 종양 세포에 의해 발현된 특별한 TAA에 대항하여 면역 반응을 유발시킬 수 있는 항원 (펩티드, 단백질, 세포 성분, 전체 세포, 또는 펩티드 기반 항원을 코딩하는 핵산 분자의 형태)을 함유한다. 많은 TAA가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 공지된 TAA의 예는 다음을 포함한다: 전립선암의 경우 PSA, PSCA, 및 PSMA; 결장직장암의 경우 CEA, MUC-1, Ep-CAM, 5T4, hCG-b, K-ras, 및 TERT; 난소암의 경우 CEA, Muc-1, p53, 메소텔린, 서바이빈, 및 NY-ESO-1; 비소세포 폐암의 경우 Muc-1, 5T4, WT-1, TERT, CEA, EGF-R 및 MAGE-A3; 신세포 암종의 경우 5T4; 및 췌장암의 경우 Muc-1, 메소텔린, K-Ras, 아넥신 A2, TERT, 및 CEA. 일부 특별한 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR에 사용된 백신은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(1) PSA, PSCA, PSMA, CEA, MUC-1, TERT, 메소텔린, EGF-R, 또는 MAGE-A3으로부터 선택된 TAA에 대항하여 면역 반응을 유발시킬 수 있는 백신;

(2) PSA, PSCA, PSMA, CEA, MUC-1, TERT, 메소텔린, EGF-R, 또는 MAGE-A3으로부터 선택된 TAA로부터 유래된 펩티드 항원을 함유하는 백신; 및

(3) 펩티드 항원을 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 백신 (여기서, 펩티드 항원은 PSA, PSCA, PSMA, CEA, MUC-1, TERT, 메소텔린, EGF-R, 또는 MAGE-A3으로부터 선택된 TAA로부터 유래된다).

또한 다른 특별한 실시양태에서, 백신은 PSA로부터 유래된 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드, PSCA로부터 유래된 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드, 또는 PSMA로부터 유래된 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 함유한다.

구체적 실시양태에서, 핵산 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(1) 서열식별번호: 42의 인간 PSMA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

(2) 서열식별번호: 42의 아미노산 15-750을 포함하는 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

(3) 서열식별번호: 43의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변성 변이체를 포함하는 핵산 분자;

(4) 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변성 변이체를 포함하는 핵산 분자;

(5) 서열식별번호: 45의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변성 변이체를 포함하는 핵산 분자;

(6) 서열식별번호: 46의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변성 변이체를 포함하는 핵산 분자;

(7) 서열식별번호: 47의 인간 PSA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

(8) 서열식별번호: 47의 아미노산 25-261을 포함하는 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

(9) 서열식별번호: 48의 인간 PSCA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

(10) (i) 서열식별번호: 42의 인간 PSMA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드, (ii) 서열식별번호: 47의 인간 PSA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드, 및 (iii) 서열식별번호: 48의 인간 PSCA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

(11) (i) 서열식별번호: 42의 아미노산 15-750을 포함하는 면역원성 폴리펩티드, (ii) 서열식별번호: 47의 아미노산 25-261을 포함하는 면역원성 폴리펩티드, 및 (iii) 서열식별번호: 48의 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.

전립선 관련 항원으로부터 유래된 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 플라스미드 또는 벡터의 형태일 수 있다. 이러한 플라스미드의 한 예가 서열식별번호: 46의 핵산 구축물 (플라스미드 458로서 지칭되기도 함)이다. 인간 PSMA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드를 발현하는 벡터의 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 44에 제시된다 (벡터 AdC68W로서 지칭되기도 함). 인간 PSMA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드, 인간 PSA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드, 및 인간 PSCA로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드를 발현하는 벡터의 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 45 및 벡터 인간 PSMA (벡터 AdC68W-734)에 제시된다. 인간 PSMA, PSA, 및 PSCA로부터 유래된 각종 면역원성 폴리펩티드, 이러한 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물 (플라스미드 및 벡터 포함), 및 상기 면역원성 폴리펩티드 및 핵산 구축물 (플라스미드 458, 및 벡터 AdC68W 및 AdC68W-734 포함)의 제조 방법이 국제 출원 공보 WO2013/164754 및 WO 2015/063647 (이들 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 개시된다.

한 측면에서, 본 발명은 PD-1과 특이적으로 결합하는 단리된 길항제 항체를 제공하는데, 여기서 이러한 항체는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4; 서열식별번호: 5; 및 서열식별번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH)의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1), VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 7; 서열식별번호: 8; 및 서열식별번호: 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.

본 개시내용에 개시된 임의의 항-PD-1 길항제 항체는 암에 대한 VBIR에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 길항제 항체는 VH 영역 및/또는 VL 영역을 포함하는데, 여기서 VH 영역은 서열식별번호: 3, 4, 5, 또는 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에서 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 수반하는 변이체를 포함하고; VL 영역은 서열식별번호: 2, 7, 8, 또는 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에서 1개 또는 여러 개의 아미노산 치환을 수반하는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 서열식별번호: 39에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 서열식별번호: 29 또는 38에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 특별한 실시양태에서, 상기 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-121183을 갖는 발현 벡터에 의해 생성된 VH 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-121182를 갖는 발현 벡터에 의해 생성된 VL 영역을 포함한다.

본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR은 (본 개시내용에 의해 제공된 PD-1 길항제 항체에 덧붙여) 하나 이상의 다른 면역 조정제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 다른 면역 조정제는 면역-이펙터-세포 증강인자 ("IEC 증강인자") 또는 면역-억제성-세포 억제제 ("ISC 억제제")일 수 있다. 부가의 IEC 증강인자 또는 부가의 ISC 억제제는 단독으로 사용될 수 있거나 또는 암에 대한 VBIR과 조합하여 사용될 수 있다. 부가의 IEC 증강인자 및 부가의 ISC 억제제는 또한, 암에 대한 VBIR과 조합하여 함께 사용될 수 있다.

ISC 억제제의 부류의 예는 단백질 키나제 억제제, 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제, 포스포디에스테라제 유형 5 (PDE5) 억제제, 및 DNA 가교결합제를 포함한다. COX-2 억제제의 예는 셀레콕십 및 로페콕십을 포함한다. PDE5 억제제의 예는 아바나필, 로데나필, 미로데나필, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 우데나필, 및 자프리나스트를 포함한다. DNA 가교결합제의 예는 시클로포스파미드이다. 용어 "단백질 키나제 억제제"는 단백질 키나제의 선택적 또는 비-선택적 억제제로서 작용하는 임의의 물질을 지칭한다. 암에 대한 VBIR에 사용하기 적합한 특이적 단백질 키나제 억제제의 예는 라파티닙, AZD 2171, ET18OCH 3, 인디루빈-3'-옥심, NSC-154020, PD 169316, 퀘르세틴, 로스코비틴, 트리시리빈, ZD 1839, 5-아이오도투베르시딘, 아다포스틴, 알로이신, 알스테르파울론, 아미노게니스테인, API-2, 아피제닌, 아륵티제닌, ARRY-334543, 악시티닙 (AG-013736), AY-22989, AZD 2171, 비스인돌릴말레이미드 IX, CCl-779, 켈레리트린, DMPQ, DRB, 에델포신, ENMD-981693, 에릅스타틴 유사체, 에를로티닙, 파수딜, 제피티닙 (ZD1839), H-7, H-8, H-89, HA-100, HA-1004, HA-1077, HA-1100, 히드록시파수딜, 켄파울론, KN-62, KY12420, LFM-A13, 루테올린, LY294002, LY-294002, 말로톡신, ML-9, MLN608, NSC-226080, NSC-231634, NSC-664704, NSC-680410, NU6102, 올로모우신, 옥신돌 I, PD 153035, PD 98059, 프롤리드진, 피세아타놀, 피크로포도필린, PKI, PP1, PP2, PTK787/ZK222584, PTK787/ZK-222584, 푸르발라놀 A, 라파문, 라파마이신, Ro 31-8220, 로틀레린, SB202190, SB203580, 시롤리무스, SL327, SP600125, 스타우로스포린, STI-571, SU1498, SU4312, SU5416, SU5416 (세막사닙), SU6656, SU6668, syk 억제제, TBB, TCN, 티르포스틴 AG 1024, 티르포스틴 AG 490, 티르포스틴 AG 825, 티르포스틴 AG 957, U0126, W-7, 워트만닌, Y-27632, 작티마 (ZD6474), ZM 252868, 세피티닙 (이레사.RTM.), 수니티닙 말레이트 (SUTENT; SU11248), 에를로티닙 (TARCEVA; OSI-1774), 라파티닙 (GW572016; GW2016), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006), 이마티닙 (글리벡.RTM.; STI571), 다사티닙 (BMS-354825), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA; ZD6474), 및 닐로티닙을 포함한다.

일부 특별한 실시양태에서, 티로신 키나제 억제제는 수니티닙 말레이트, 소라페닙 토실레이트, 또는 악시티닙이다. 수텐트(SUTENT)란 상표명으로 화이자 인크.(Pfizer Inc.)에 의해 판매되는 수니티닙 말레이트는 화학적으로, N-[2-(디에틸아미노)에틸]-5-[(Z)-(5-플루오로-1,2-디히드록시-2-옥소-3H-인돌-3-일리딘)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복사미드를 수반한 부탄디오산, 히드록시-, (2S)-, 화합물 (1:1)로서 기재된다. 이러한 화합물, 그의 합성, 및 특별한 다형체가 미국 특허 번호 6,573,293에 기재되어 있다. 수니티닙 말레이트는 절제 불가능한 국소 진행성 또는 전이성 질환이 있는 환자에게서 위장 간질 종양, 진행성 신세포 암종, 및 잘 분화된 진행성의 췌장 신경 내분비 종양을 치료하는 것으로 미국에서 승인되었다. 인간의 경우 위장 간질 종양 (GIST) 및 진행성 신세포 암종 (RCC)에 대한 수니티닙 말레이트의 권장 용량은 1일 1회 경구 투여되는 50 mg인데, 4주 동안 치료를 진행한 다음 2주 동안 치료를 중단하는 스케줄로 수행된다 (스케줄 4/2). 췌장 신경 내분비 종양에 대한 수니티닙 말레이트의 권장 용량은 1일 1회 경구 투여되는 37.5 mg이다. 암에 대한 VBIR에서는, 수니티닙 말레이트를 단일 용량 또는 다수 용량으로 경구 투여할 수 있다. 전형적으로, 수니티닙 말레이트는 2주, 3주, 4주 또는 그 초과하여 연속해서 투여하기 위해 전달된 다음, 약 1주 또는 2주간은 수니티닙 말레이트를 전혀 투여하지 않는 "치료 중단" 기간을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 용량은 약 4주 동안 투여하고, 2주간은 중단한다. 인간에게 경구 투여되는 수니티닙 말레이트의 유효량은 전형적으로, 1일 1명당 40 mg 미만, 예컨대 1일 1명당 37.5, 31.25, 25, 18.75, 12.5, 또는 6.25 mg이다. 일부 실시양태에서, 수니티닙 말레이트는 1일 1명당 1 내지 25 mg의 범위로 경구 투여한다. 일부 다른 실시양태에서, 수니티닙 말레이트는 1회 용량당 1명당 6.25, 12.5, 또는 18.75 mg으로 경구 투여한다. 다른 투여량 요법 및 변동이 예측 가능하며 의사의 지도를 통해 결정될 것이다.

넥사바르(NEXAVAR)란 상표명으로 판매되는 소라페닙 토실레이트는 화학명 4-(4-{3-[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]우레이도}페녹시)-N-메틸피리딘-2-카르복사미드를 갖는다. 이는 원발성 신장암 (진행성 신세포 암종) 및 진행성 원발성 간암 (간세포 암종)을 치료하는 것으로 미국에서 승인되었다. 1일 권장 용량은 1일 2회 경구 투여되는 400 mg이다. 본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR에서는, 경구 투여되는 소라페닙 토실레이트의 유효량이 전형적으로, 1일 1명당 400 mg 미만이다. 일부 실시양태에서, 경구 투여되는 소라페닙 토실레이트의 유효량은 1일 1명당 10 내지 300 mg의 범위 내이다. 일부 다른 실시양태에서, 경구 투여되는 소라페닙 토실레이트의 유효량은 1일 1명당 10 내지 200 mg, 예컨대 1일 1명당 10, 20, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 또는 200 mg이다.

인리타(INLYTA)란 상표명으로 판매되는 악시티닙은 화학명 (N-메틸-2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일술파닐]-벤자미드를 갖는다. 이는 이전의 한 가지 전신 요법의 실패 후 진행성 신세포 암종을 치료하는 것으로 승인된다. 출발 용량은 1일 2회 경구 투여되는 5 mg이다. 용량 조정은 개개인의 안전성과 내약성에 근거하여 이루어질 수 있다. 본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR에서는, 경구 투여되는 악시티닙의 유효량이 전형적으로, 1일 2회 5 mg 미만이다. 일부 다른 실시양태에서, 경구 투여되는 악시티닙의 유효량은 1일 2회 1 내지 5 mg이다. 일부 다른 실시양태에서, 경구 투여되는 악시티닙의 유효량은 1일 2회 1, 2, 3, 4, 또는 5 mg이다.

본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR에 사용될 수 있는 IEC 증강인자의 예는 TNFR 효능제, CTLA-4 길항제, TLR 효능제, 다른 PD-1 길항제 (예컨대, BMS-936558 및 항-PD-1 항체 CT-011), 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 리간드 1 (PD-L1) 길항제 (예컨대, BMS-936559), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3) 길항제, 및 T 세포 면역글로불린- 및 뮤신-도메인-함유 분자-3 (TIM-3) 길항제를 포함한다. TNFR 효능제의 예는 OX40, 4-1BB (예컨대 BMS-663513), GITR (예컨대 TRX518), 및 CD40의 효능제를 포함한다. 특이적 CD40 효능제의 예가 본원의 다음에 상세히 기재된다.

특정의 다른 실시양태에서, 부가의 면역 조정제는 항-CD40 효능제 항체이다. 이러한 항체는 인간, 인간화 또는 부분-인간 키메라 항-CD40 항체일 수 있다. 특이적 항-CD40 모노클로날 항체의 예는 G28-5, mAb89, EA-5 또는 S2C6 모노클로날 항체, 및 CP870893을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 항-CD40 효능제 항체는 CP870893 또는 다세투주맙 (SGN-40)이다.

CP-870,893은 항종양 요법으로서 임상적으로 연구되어 왔던 완전한 인간 효능작용 CD40 모노클로날 항체이다. CP870,893의 구조와 제조는 WO2003040170에 개시되는데, 여기서 항체 CP870,893은 항체 "21.4.1"로서 확인된다. CP-870,893의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 WO2003040170에서 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 48에 각각 제시될 뿐만 아니라 표 7에 제시된다. 임상 시험에서는, CP870,893을 일반적으로 주입당 0.05 내지 0.25 mg/kg의 범위의 용량으로 정맥내 주입함으로써 투여한다. 본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR에서는, CP-870,893을 피내, 피하 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 상기 요법에서 투여될 CP870893의 유효량은 일반적으로 0.2 mg/kg 미만, 전형적으로 0.01 mg 내지 0.15 mg/kg, 또는 0.05 내지 0.1 mg/kg의 범위이다.

다세투주맙 (SGN-40 또는 huS2C6으로서 공지되기도 함; CAS 번호 88-486-59-9)은 무통성 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종 및 다발성 골수종에 대한 임상 시험에서 연구되어 왔던 또 다른 항-CD40 효능제 항체이다. 본 개시내용에 의해 제공된 암에 대한 VBIR에서는, 다세투주맙을 피내, 피하 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 투여될 다세투주맙의 유효량은 일반적으로 16 mg/kg 미만, 전형적으로 0.2 mg 내지 14 mg/kg, 또는 0.5 내지 8 mg/kg, 또는 1 내지 5 mg/kg의 범위이다.

또한 다른 실시양태에서, 부가의 면역 조정제는 항-CTLA-4 길항제이다. 적합한 항-CTLA-4 길항제의 예는 항-CTLA-4 항체 (예컨대 인간 항-CTLA-4 항체, 마우스 항-CTLA-4 항체, 포유류 항-CTLA-4 항체, 인간화 항-CTLA-4 항체, 모노클로날 항-CTLA-4 항체, 폴리클로날 항-CTLA-4 항체, 키메라 항-CTLA-4 항체, 항-CTLA-4 도메인 항체), 및 공동 자극성 경로를 효능작용시키는 CTLA-4의 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 CTLA-4 억제제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙이다.

이필리무맙 [예르보이(YERVOY)로서 판매됨; MEX-010, MDX-101, 또는 그의 CAS 등록 번호 477202-00-9로써 공지되기도 함]은 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (모든 목적상 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 항체 10DI로서 개시된다. 이필리무맙을 포함하는 제약 조성물의 예가 PCT 공개 번호 WO 2007/67959에 제공된다. 이필리무맙은 절제 불가능하거나 또는 전이성 흑색종을 치료하는 것으로 미국에서 승인되었다. 본 발명에 의해 제공된 방법에서는, 이필리무맙을 피내 또는 피하 투여할 수 있다. 국소적으로 투여되는 이필리무맙의 유효량은 전형적으로, 1명당 1회 용량당 5 내지 200 mg의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙의 유효량은 1명당 1회 용량당 10 내지 150 mg의 범위이다. 일부 특별한 실시양태에서, 이필리무맙의 유효량은 1명당 1회 용량당 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 mg이다.

트레멜리무맙 (CP-675,206으로서 공지되기도 함)은 완전한 인간 IgG2 모노클로날 항체이고 CAS 번호 745013-59-6을 갖는다. 트레멜리무맙은 미국 특허 번호 6,682,736 (모든 목적상 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 항체 11.2.1로서 개시된다. 본 발명에 의해 제공된 암에 대한 VBIR에서는, 트레멜리무맙을 정맥내, 피내 또는 피하 투여할 수 있다. 피내 또는 피하 투여되는 트레멜리무맙의 유효량은 전형적으로, 1명당 1회 용량당 5 내지 200 mg의 범위이다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙의 유효량은 1명당 1회 용량당 10 내지 150 mg의 범위이다. 일부 특별한 실시양태에서, 트레멜리무맙의 유효량은 1명당 1회 용량당 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 mg이다.

또한 다른 실시양태에서, 부가의 면역 조정제는 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이다. 용어 "톨-유사 수용체 효능제" 또는 "TLR 효능제"는 톨-유사 수용체 (TLR)의 효능제로서 작용하는 화합물을 지칭한다. 이는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, 및 TLR11의 효능제 또는 그의 조합물을 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 TLR 효능제는 작은 유기 분자와 큰 생물학적 분자 둘 다를 포함한다. 작은 분자 TLR 효능제의 예는 4-아미노-알파, 알파, 2-트리메틸-1H-이미다조[4,5-c]쿠몰린-1-에탄올, N-(2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시-}에틸)-N-메틸모르폴린-4-카르복사미드, 1-(2-아미노-2-메틸프로필)-2-(에톡시메틸-)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아르닌, N-[4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸]메탄술폰아미드, N-[4-(4-아미노-2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸]메탄술폰아미드, 및 이미퀴모드를 포함한다. 본 개시내용에 의해 제공된 방법 또는 요법에 특히 유용한 일부 TLR 효능제가 고찰 문헌에 논의된다 (Folkert Steinhagen, et al.: TLR-based immune adjuvants. Vaccine 29 (2011): 3341-3355). 일부 실시양태에서, TLR 효능제는 TLR9 효능제, 특히 CpG 올리고뉴클레오티드 (또는 CpG.ODN)이다. CpG 올리고뉴클레오티드는 시토신에 이어 포스페이트 결합에 의해 연결된 구아닌을 함유하는 짧은 핵산 분자인데, 여기서 시토신의 피리미딘 환은 메틸화되지 않는다. 본 개시내용에 의해 제공된 방법에 유용한 특별한 CpG 올리고뉴클레오티드의 예는 다음을 포함한다:

5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' (CpG 7909; 서열식별번호: 49);

5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3' (CpG 24555; 서열식별번호: 50); 및

5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3' (CpG 10103; 서열식별번호: 51).

합성 24량체 단일 가닥인 CpG7909은 단독 요법으로서 암을 치료하고 화학요법제와 조합하여 암을 치료하기 위하여 광범위하게 연구되어 왔을 뿐만 아니라 암 및 감염성 질환에 대항한 백신을 위한 아주반트로서 조사되어 왔다. 본 개시내용에 의해 제공된 방법에서는, CpG7909를 근육 내로 주사하거나 또는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 투여할 수 있다. 핵산 기반 백신, 예컨대 DNA 백신과 함께 사용하기 위하여, CpG를 백신과 함께 단일 제형으로 공동 제제화할 수 있고 전기천공과 연계해서 근육내 주사함으로써 투여할 수 있다. 근육내, 피내 또는 피하 투여하기 위한 CpG7909의 유효량은 전형적으로, 1회 용량당 10 μg 내지 10 mg의 범위 내이다. 일부 실시양태에서, CpG7909의 유효량은 1회 용량당 0.05 mg 내지 14 mg의 범위 내이다. 일부 특별한 실시양태에서, CpG7909의 유효량은 1회 용량당 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 05 내지 1 mg이다. CpG 24555 및 CpG 10103을 포함한 다른 CpG 올리고뉴클레오티드는 유사한 방식 및 용량 수준으로 투여될 수 있다.

암에 대한 VBIR에서는, 상기 항-PD-1 길항제, 백신, 및 부가의 면역 조정제를 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 백신은 항-PD-1 길항제 항체와 관련해서는 순차적으로 투여하지만, 하나 이상의 부가의 면역 조정제와 관련해서는 동시에 (예를 들어, 혼합물로) 투여한다. 핵산 백신을 CpG와 조합하여 투여하는 경우에는, 이러한 백신과 CpG가 단일 제형 내에 함유될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공동 제형 (혼합물) 내의 상기 핵산 백신과 CpG는 전기천공과 조합하여 근육내 주사함으로써 투여한다.

제형

본 발명에 따라서 사용된 항-PD-1 길항제 항체의 치료 제형은 목적하는 순도를 갖는 항체를 임의로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000])와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이는 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물 (글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.

항-PD-1 길항제 항체를 함유하는 리포솜은 관련 기술분야에 공지된, 예컨대 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증강된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜, 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 산출시킨다.

활성 성분은 또한, 예를 들어 액적형성(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)])에 개시되어 있다.

지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)], 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 7-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미세구), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 예를 들어, 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다. 항-PD-1 길항제 항체 치료 조성물은 일반적으로, 멸균성 유입 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알 내에 놓아둔다.

본 발명에 따르는 조성물은 단위 투여 형태, 예컨대 경구, 비경구 또는 직장 투여용, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여용의, 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 과립제, 용제 또는 현탁제, 또는 좌제일 수 있다.

고형 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위하여, 주요 활성 성분을 제약 담체, 예를 들어 통상적인 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약 희석제, 예를 들어 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 그의 무독성의 제약상 허용되는 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고형의 예비 제형 조성물을 형성시킨다. 이들 예비 제형 조성물을 균질한 것으로서 지칭하는 경우, 이는 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 균일하게 분포되어 이러한 조성물이 동등하게 유효한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제 및 캅셀제로 용이하게 세분될 수 있다는 것을 의미한다. 이어서, 이러한 고형 예비 제형 조성물을, 본 발명의 활성 성분을 약 0.1 내지 약 500 mg 함유하는 상기 언급된 유형의 단위 투여 형태로 세분한다. 신규 조성물의 정제 또는 환제를 코팅하거나 또는 달리 화합시켜, 장시간 작용의 이점을 제공해 주는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 성분과 외부 투여 성분을 포함할 수 있는데, 후자는 전자 위를 덮는 외피의 형태이다. 두 성분은 위(stomach)에서의 붕괴를 견디게 해주는 작용을 하고 내부 성분이 무손상 상태로 십이지장 내로 통과되게 해주거나 또는 방출 지연될 수 있도록 해주는 장내 층에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장내 층 또는 코팅에 각종 물질을 사용할 수 있는데, 이러한 물질은 수많은 중합체성 산, 및 중합체성 산과 쉘락(shellac), 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면 활성제는 특히, 비이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 [예를 들어, 트윈(Tween™) 20, 40, 60, 80 또는 85] 및 다른 소르비탄 [예를 들어 스판(Span™) 20, 40, 60, 80 또는 85]을 포함한다. 표면 활성제를 수반한 조성물은 편리하게, 0.05 내지 5%의 표면 활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 필요에 따라, 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클을 부가할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

적합한 에멀션은 시판용 지방 에멀션, 예컨대 인트라리피드(Intralipid™), 리포신(Liposyn™), 인포누트롤(Infonutrol™), 리포푼딘(Lipofundin™) 및 리피피산(Lipiphysan™)을 이용하여 제조할 수 있다. 활성 성분을 미리 혼합된 에멀션 조성물에 용해시킬 수 있거나 또는 또 다른 한편으론, 이를 오일 (예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 참깨유, 옥수수유 또는 아몬드유)에 용해시킬 수 있고, 인지질 (예를 들어, 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합시 에멀션이 형성된다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스를 부가하여, 에멀션의 긴장성을 조정할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 적합한 에멀션은 전형적으로, 20% 이하의 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀션은 0.1 내지 1.0 ㎛, 특히 0.1 내지 0.5 ㎛의 지방 비말을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0의 범위의 pH를 가질 수 있다.

에멀션 조성물은 항-PD-1 길항제 항체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두유, 계란 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조될 수 있다.

흡입 또는 취입용 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 그의 혼합물 중의 용제 및 현탁제, 및 산제를 포함한다. 액상 또는 고형 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위한 경구 또는 비내 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게 멸균성의 제약상 허용되는 용매 중의 조성물은 기체의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무되는 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 또는 이러한 분무 장치를 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착시킬 수 있다. 용제, 현탁제 또는 산제 조성물은 제형을 적절한 방식으로 전달시켜 주는 장치로부터, 바람직하게 경구 또는 비내 투여될 수 있다.

키트

본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 중 임의의 것 또는 모두를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 항-PD-1 길항제 항체를 포함하는 하나 이상의 용기, 및 본원에 기재된 본 발명의 방법 중 임의의 것에 따르는 사용 설명서를 포함한다. 일반적으로, 이러한 사용 설명서는 상기 언급된 치료적 처치를 위하여 항-PD-1 길항제 항체를 투여하는 것에 관한 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트가 제공된다. 특정 실시양태에서, 이러한 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기와 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 다를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 및 다중 챔버의 예비-충진된 주사기 [예를 들어, 액체 주사기 및 리오시린지(lyosyringe)]를 함유하는 키트가 포함된다.

일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 항-PD-1 항체의 사용에 관한 설명서는 일반적으로, 의도한 처치에 대한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 상기 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다수-용량 패키지) 또는 소단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 설명서는 전형적으로, 표지 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 작성된 설명서이지만, 기계-판독 가능한 설명서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 수반된 설명서) 또한 허용된다.

본 발명의 키트는 적합하게 패키징되어 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 자르(jar), 유연 패키징 [예를 들어, 밀폐 마일라(Mylar) 또는 비닐 봉지] 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특이적 장치, 예컨대 흡입기, 비내 투여용 장치 (예를 들어, 분무기) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 항-PD-1 항체이다. 용기는 제2의 제약상 활성제를 추가로 포함할 수 있다.

키트는 임의로, 부가 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 정상적으로, 키트는 특정 용기와, 이러한 용기 상에 있거나 이와 연합된 표지 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.

생물학적 기탁

본 발명의 대표적인 물질은 2014년 4월 29일에 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 유니버서티 불러바드 10801)에 기탁하였다. ATCC 수탁 번호 PTA-121182를 갖는 벡터 msb7-LC는 mAb7 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 수탁 번호 PTA-121183을 갖는 벡터 mab7-HC는 mAb7 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 기탁은 특허 절차 및 그에 따른 (부다페스트 조약) 규칙상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양의 유지를 보장한다. 상기 기탁은 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC에 의해 입수 가능하고, 어느 것이든 먼저 도래하는 관련 미국 특허의 허여시 또는 임의의 미국 또는 외래 특허 출원의 공표시 대중에게 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 제한 없는 입수 가능성을 보증하고, 35 U.S.C. § 122에 따라서 그에 대한 권리가 있는 미국 특허 상표 감독관 및 그에 따르는 감독관의 규칙 (886 OG 638을 특별히 참조한 37 C.F.R. § 1.14 포함)에 의해 결정된 것에 대한 자손의 입수 가능성을 보증하는, 화이자 인크.와 ATCC 간의 합의에 따른 것이다.

본 출원의 수탁자는 기탁시의 상기 물질의 배양물이 적합한 조건하에 배양될 경우에 사멸하거나 분실되거나 또는 파괴되어야 한다면, 이 물질을 동일한 다른 것으로 즉시 대체하고 고지할 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수 가능성은 특허법에 따라서 임의의 정부의 권한에 따라 부여된 권리에 위반하여 본 발명을 실시할 수 있는 라이센스로서 해석되는 것은 아니다.

다음 실시예는 단지 예시 목적으로 제공된 것이고, 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외에도, 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.

실시예

실시예 1: IFN -γ 및 TNF 분비에 대한 항-PD-1 항체의 효과

본 실시예는 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 IFN-γ 및 TNF 분비에 대한 항-PD-1 항체의 효과를 예시한 것이다.

전혈 (스탠퍼드 대학 혈액 은행)로부터 단리된 1차 인간 T 세포를, CD14+ 골수 세포로부터의 IL-4 및 GM-CSF를 사용하여 미리 분화시켰던, 고 수준의 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 동종이계 수지상 세포 (DC)에 의해 활성화시켰다. 본 연구에서는, 다음 항체를 사용하였다: 이소형 대조군 (IgG4 카파 힌지 안정화됨), 항-PD-1 길항제 항체 C1, 항-PD-1 길항제 항체 C2, 항-PD-1 길항제 항체 C3, EH12.1 [BD 바이오사이언스(Biosciences) 마우스 항-인간 항-PD-1 항체, 마우스 이소형 IgG1 카파], mAb7-G4, mAb15-G4, mAb-AAA, mAb15-AAA (G4 = IgG4 힌지 안정화됨; AAA = FcγR과 결합하지 않은 돌연변이체 IgG1). 항체를 다음 농도에서 시험하였다: 0, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml.

MLR 검정을 위하여, 배양물을 1:10 DC:T 세포의 비에서 삼중으로 96 웰 플레이트에서 시험 또는 대조군 항체와 함께 인큐베이션하고, 5% CO₂를 수반한 37℃ 하에 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 상등액을 제5일에 수거하고, 다음 인간 분석물을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 인간 가용성 단백질 플렉스 세트 시스템 키트 (BD 바이오사이언스, cat #558265)를 사용하여 세포계수 비드 어레이 (CBA)를 이용하여 시토카인을 측정하였다: IFNγ (BD 바이오사이언스, cat #558269), TNF (BD 바이오사이언스, cat #558273). 간략하게 언급하면, 96 웰 필터 플레이트 [밀리포어(Millipore), cat #MSBVN1250]를 세척 완충제 (BD 바이오사이언스 독점적 공식)으로 세척하고, 진공 다기관에 의해 흡인시켰다. 키트에 의해 제공된 표준물과 샘플을 검정 희석제 (BD 바이오사이언스 독점적 공식)에서 희석시키고, 이를 포획 비드 (포획 비드는 별개의 형광으로 코팅된 특이적 가용성 단백질에 대한 항체로 코팅된 비드이다)를 수반한 플레이트에 부가하였다. 플레이트 진탕기를 이용하여 플레이트를 500 rpm 하에 5분 동안 혼합하고, 실온하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검출 시약 [피코에리트린 (PE)-접합된 항체, k로써 제공됨]을 상기 플레이트에 부가하고, 플레이트를 5분 동안 혼합하였다. 플레이트를 실온하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세척 완충제로 5분 동안 세척하고, 샘플을 BD 포르테사(Fortessa) 플랫폼 상에서 취득하였다. FCAP 어레이 v3 (BD)을 이용하여 데이터를 분석하였다. MLR 검정의 결과가 다음 표 6A 및 B에 제시된다. 표 6A는 IFNγ 수준 (pg/ml)을 나타내고, 표 6B는 TNF 수준 (pg/ml)을 나타낸다. 데이터는 생물학적 삼중치의 평균 ± S.E.M으로서 제시된다. 샘플은 하나의 MLR 실험을 대표한다.

<표 6A>

IFNγ 분비

<표 6B>

TNF 분비

활성화된 T 세포를 항-PD-1 길항제 항체로 처리하면, 이소형 대조군과 비교해서 IFNγ 수준이 증가하였다 (표 6A). 예를 들어, 0.1 μg/ml mAb15-G4 및 mAb7-G4로 처리하면, 각각 4728.295 ± 2.035 pg/ml 및 8567.203 ± 2085.826 pg/ml의 IFNγ 수준이 초래되었다. 1 μg/ml mAb15-G4 및 mAb7-G4로 처리하면, 각각 8893.595 ± 365.125 pg/ml 및 11876.86 ± 1259.788 pg/ml의 IFNγ 수준이 초래되었다. 10 μg/ml mAb15-G4 및 mAb7-G4로 처리하면, 각각 7790.95 ± 1700.012 pg/ml 및 11794.82 ± 1827.243 pg/ml의 IFNγ 수준이 초래되었다. 이와는 대조적으로, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml 이소형 대조군으로 처리하면, 각각 3760 ± 367.4262 pg/ml, 3693.972 ± 1033.879 pg/ml, 및 3525.655 ± 744.676 pg/ml의 IFNγ 수준이 초래되었다.

활성화된 T 세포를 항-PD-1 길항제 항체로 처리하면, 이소형 대조군과 비교해서 TNF 수준이 증가하였다 (표 6B). 예를 들어, 0.1 μg/ml mAb15-G4 또는 mAb7-G4로 처리하면, 각각 743.1167 ± 56.75547 pg/ml 및 730.47 ± 33.35488 pg/ml의 TNF 수준이 초래되었다. 1 μg/ml mAb15-G4 및 mAb7-G4로 처리하면, 각각 686.32 ± 45.63348 pg/ml 및 793.05 ± 21.19019 pg/ml의 TNF 수준이 초래되었다. 10 μg/ml mAb15-G4 또는 mAb7-G4로 처리하면, 각각 798.853 ± 9.14366 pg/ml 및 930.623 ± 16.0494 pg/ml의 TNF 수준이 초래되었다. 이와는 대조적으로, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml 이소형 대조군으로 처리하면, 각각 407.4133 ± 49.58195 pg/ml, 486.7167 ± 4.4241 pg/ml, 및 501.17 ± 5.033334 pg/ml의 TNF 수준이 초래되었다.

이들 결과는 항-PD-1 항체 mAb7 및 mAb15가 적어도 항-PD-1 항체 C1, C2, 및 C3과 마찬가지로 또는 이러한 항체보다 더 우수하게, T 세포로부터의 IFNγ 및 TNF 분비를 자극한다는 것을 입증해 준다.

제2의 MLR 연구를 수행하여 T 세포 활성화에 대한 더 낮은 항체 농도의 효과를 시험하였다. 전혈로부터 단리된 1차 인간 T 세포를 상기 언급된 바와 같이 활성화시켰다. 다음 항체를 제2의 연구에서 시험하였다: mAb7 (G4), mAb15 (G4), C1 (G4), EH12.1, 및 G4 이소형 대조군. 항체를 다음 농도에서 시험하였다: 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/ml. MLR 검정을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. 그 결과가 다음 표 7A 및 7B에 요약된다.

<표 7A>

IFNγ 분비

<표 7B>

TNF 분비

활성화된 T 세포를 항-PD-1 길항제 항체로 처리하면, 이소형 대조군과 비교해서 IFNγ 수준이 증가하였다 (표 7A). 항체를 수반하지 않은 배양물에서는, IFNγ 수준이 901.453 ± 216.472 pg/ml였다. 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml 이소형 대조군 항체가 제공된 배양물에서는, IFNγ 수준이 각각 558.9629 ± 489.4828 pg/ml, 753.3767 ± 291.6092 pg/ml, 1074.37 ± 324.2031 pg/ml, 1667.96 ± 144.7286 pg/ml, 1867.96 ± 282.7461 pg/ml, 2501.293 ± 220.1829 pg/ml였다. 이와는 대조적으로, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml mAb7 (G4)로 처리된 배양물에서는, IFNγ 수준이 각각 2082.07 ± 720.9931 pg/ml, 3062.09 ± 370.2791 pg/ml, 5067.823 ± 111.4903 pg/ml, 7082.667 ± 1336.082 pg/ml, 11928.81 ± 1457.723 pg/ml, 11862.13 ± 800.586 pg/ml였다. 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml mAb15 (G4)로 처리된 배양물에서는, IFNγ 수준이 각각 1678.27 ± 233.82 pg/ml, 1410.758 ± 439.9474 pg/ml, 4734.49 ±322.2087 pg/ml, 5416 ± 1054.075 pg/ml, 9140.337 ± 1320.499 pg/ml, 및 10992.13 ± 1008.533 pg/ml였다.

활성화된 T 세포를 항-PD-1 길항제 항체로 처리하면, 이소형 대조군과 비교해서 TNF 수준이 증가하였다 (표 7B). 항체를 수반하지 않은 배양물에서는, TNF 수준이 365.523 ± 84.6607 pg/ml였다. 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml 이소형 대조군 항체로 처리된 배양물에서는, TNF 수준이 각각 452.7133 ± 62.85 pg/ml, 282.9287 ± 56.77266 pg/ml, 310.9144 ± 21.7811 pg/ml, 358.948 ± 81.09122 pg/ml, 338.1107 ± 46.88385 pg/ml, 및 331.008 ± 31.35559 pg/ml였다. 이와는 대조적으로, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml mAb7 (G4)로 처리된 배양물에서는, TNF 수준이 각각 227.6 ± 50.63436 pg/ml, 394.4233 ± 30.47005, 452.65 ± 30.64335 pg/ml, 1089.377 ± 174.7824 pg/ml, 1583.52 ± 267.2131 pg/ml, 및 1419.88 ± 108.711 pg/ml였다. 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml mAb15 (G4)가 제공된 배양물에서는, TNF 수준이 각각 494.7967 ± 48.1810 pg/ml, 489.2333 ± 30.63302 pg/ml, 593.34 ± 65.87622 pg/ml, 811.16 ± 89.50238 pg/ml, 1143.54 ± 136.3954 pg/ml, 및 1109.063 ± 57.70232 pg/ml였다.

이들 결과는 항-PD-1 항체 mAb7 및 mAb15가 PD-1 시그널링을 차단시키고 1차 인간 T 세포로부터의 IFNγ 및 TNF 분비를 증진시킨다는 것을 입증해준다.

실시예 2: T 세포 증식에 대한 항-PD-1 항체의 효과

본 실시예는 T 세포 증식에 대한 항-PD-1 항체의 효과를 예시한 것이다.

본 연구에서는, T 세포 증식을 MLR 검정에서 측정하였는데, 여기서는 T 세포를 항-PD-1 길항제 또는 이소형 대조군 항체의 존재하에 배양하였다.

MLR을 위하여, 전혈 (스탠퍼드 대학 혈액 은행으로부터 수득됨)로부터 단리된 1차 인간 T 세포를, CD14+ 골수 세포로부터의 IL-4 및 GM-CSF를 사용하여 미리 분화시켰던, 고 수준의 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 동종이계 수지상 세포 (DC)에 의해 활성화시켰다. 두 가지 실험을 수행하였다.

첫 번째 실험에서는, mAb7 (IgG4 카파 힌지 안정화됨), mAb15 (IgG4 카파 힌지 안정화됨), C1, EH12.1 및 이소형 대조군을 비교하였다. 두 번째 실험에서는, 클론 mAb7, mAb15, C2, EH12.1 및 이소형 대조군을 비교하였다. 양 실험에서는 항체를 다음 농도로 부가하였다: 0, 0.0001; 0.001; 0.01; 0.1; 1 및 10 μg/ml.

양 실험을 위하여, 배양물을 1:10 DC:T 세포의 비에서 삼중으로 96 웰 플레이트에서 항체와 함께 인큐베이션하고, 5% CO₂를 수반한 37℃ 하의 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 제5일에, 수거하기 전에 웰당 1 μCi의 [³H]-티미딘으로 18시간 동안 펄스하였다. 이어서, 하비스터(Harvester)96 [톰텍 라이프 사이언스(Tomtec Life Sciences)]을 이용하여 플레이트를 DNA 특이적 여과지 [펄킨 엘머(Perkin Elmer)] 상에 수거하였다. 방사성 표지된 필터를 베타 신틸레이션 액체 (펄킨 엘머)로 덮고, 마이크로베타(Microbeta®) 계수기 플레이트 (펄킨 엘머)에서 판독하였다. 티미딘 혼입을 분당 계수치 (CPM)로서 분석하였다. 그 결과가 삼중치의 평균 ± SEM으로서 제시된다.

<표 8A>

<표 8B>

활성화된 T 세포를 0.01 μg/ml 이상 농도의 항-PD-1 길항제 항체로 처리하면, 이소형 대조군과 비교해서 T 세포 증식이 상당히 증가하였다 (표 8A 및 8B).

예를 들어, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml mAb7로 처리하면, 각각 365625.3 ± 30171.07 CPM, 380054.3 ± 9774.328 CPM, 392256.7 ± 15341.19 CPM, 및 372889.7 ± 14826.49 CPM의 티미딘 혼입 속도가 초래되었다 (표 8B). 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml mAb15-G4 및 mAb7로 처리하면, 각각 317377 ± 31915.29 CPM, 360226.3 ± 1802.69 CPM, 421229 ± 27865.13 CPM, 및 323441.3 ± 64476.55 CPM의 티미딘 혼입 속도가 초래되었다 (표 8B). 이와는 대조적으로, 0.01, 0.1, 1, 또는 10 μg/ml 이소형 대조군으로 처리하면, 각각 278072.3 ± 32671.62 CPM, 268939.7 ± 12332.06 CPM, 241164 ± 13776.81 CPM, 및 231897.7 ± 25865.95 CPM의 티미딘 혼입 속도가 초래되었다 (표 8B).

이들 결과는 항-PD-1 항체 mAb7 및 mAb15가 PD-1 시그널링을 차단시키고 1차 인간 T 세포의 증식을 증진시킨다는 것을 입증해준다.

실시예 3: GvHD의 마우스 모델에서 항-PD-1 항체의 효과

본 실시예는 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 마우스 모델에서 T 세포 증식 및 체중 손실에 대한 항-PD-1 항체의 효과를 예시한 것이다.

NOD-scid-IL-2 수용체 감마 쇄 기능없는(null) (NSG) 마우스를 본 연구에 사용하여 생체 내에서 T 세포 증식에 대한 항-PD-1 길항제 항체의 효과를 시험하였다. NSG 마우스에는 T 세포 및 B 세포가 결여되고 손상된 NK 세포를 갖고 있기 때문에, 인간 세포를 고도로 생착시키는 것이 용이하게 달성된다. 인간 PBMC를 이들 마우스에 생착시키는 경우, 인간 T 세포 증식이 일어나서 GvHD를 유도시킨다. GvHD는 숙주 뿐만 아니라 인간 세포의 골수세포 구획과 관련이 있다. 초기 단계에서는 인간 림프구의 대규모 증식이 혈액에서 관찰될 수 있고, 이어서 이들 세포가 마우스 기관, 예컨대 간, 비장, 신장, 내장 등으로 고도로 침윤되어, 마우스의 체중 손실뿐만 아니라 피부 병변, 곱사병, 및 사망을 초래할 수 있다. 상기 모델의 중증도는 공여자 PBMC에 좌우되고, 공여자들 간에 상이할 수 있다.

본 연구에서는, 다음 항-PD-1 길항제 항체를 사용하였다: mAb7 (인간 IgG4 힌지 안정화됨 또는 AAA), mAb15 (인간 IgG4 힌지 안정화됨), C1, C2, 및 C3. 음성 대조군의 경우에는, 이소형 대조군 인간 IgG4 힌지 안정화된 항체를 사용하였다. 피콜(Ficoll) 구배를 이용하여, 전혈 (스탠퍼드 대학 혈액 은행)로부터 1차 인간 PBMC를 단리하였다. 10⁷개의 인간 PBMC를 NSG 마우스 [8주생 암컷; 잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories)] 내로 주사하였다. 제0일에, 체중을 근거로 하여 마우스를 무작위로 배정하고, PBMC를 정맥내 주사하였다. 실험 1 내지 4의 경우에는, 제2일 및 제8일에 항체를 10 mg/kg으로 복강내 투여하였다. 실험 5의 경우에는, 제2일 및 제8일에 항체를 1 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 복강내 투여하였다. 표 9에는 각 실험에 사용된 항체가 요약되어 있다.

<표 9>

실험 1 내지 5에서 사용된 항체

체중을 주기적으로 측정하였다. 그 결과가 도 1a 내지 1e에 요약되어 있다. 마우스를 주기적으로 출혈시켜 T 세포 증식을 평가하였다. 항-PD-1 항체로 처리하면, 체중 손실의 속도로써 측정된 바와 같이 질환 과정이 가속화되었다. 대조군 마우스와 비교해서, 항-PD-1 길항제 항체로 처리된 마우스는 더 신속한 체중 손실을 나타내었다 (도 1a-1e).

인간 T 세포의 증식은 마커 (클론 HI30; BD 바이오사이언스)로서 CD45를 사용하여 유동 세포계수법에 의해 측정하였다. 유동 세포계수법 결과가 하기 표 10에 요약되어 있다. T 세포 증식은 이소형 대조군으로 처리된 마우스에서 보다 항-PD-1 길항제 항체로 처리된 마우스에서 더 높았다. 보다 높은 비율 (%)의 CD45는 보다 고 수준의 CD45 세포의 증식을 표시하므로, 더 중증인 GvHD를 나타낸다.

실험 1에서는, CD45 양성 혈액 세포의 비율 (%)이 대조군 마우스에서 63.86%였다 (표 10). 이와는 대조적으로, 항-PD-1 항체 mAb7, mAb15, C1, 또는 mAb7-AA로 처리된 마우스에서 CD45 양성 혈액 세포의 비율 (%)은 각각 80.34%, 77.62%, 77.26% 및 76.9%였다 (표 10).

<표 10>

시험된 동물에서, CD45의 존재에 의해 측정된 바와 같은 T 세포 증식

요약하면, 항-PD-1 항체로 처리된 마우스는 이소형 대조군으로 처리된 마우스와 비교해서 더 신속한 체중 손실을 나타냈고 T 세포 증식이 증가하였다. 이들 결과는 항-PD-1 항체로 처리하면 생체 내에서 인간 T 세포의 증식이 자극된다는 것을 입증해준다.

실시예 4: 항-PD-1 항체의 결합성

본 실시예는 활성화된 인간 T 세포 및 시노몰구스 원숭이 (시노) T 세포 상에서의 항-PD-1 항체 결합성을 예시한 것이다.

제조업자의 프로토콜 [밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec); 130-096-353]에 따라서 인간 PAN T 세포 단리 키트를 이용하여 PBMC (스탠퍼드 대학 혈액 은행)로부터 1차 인간 T 세포를 단리하였다. 시노 PBMC는 바이오레클레메이션(Bioreclamation) IVT로부터 구입하고, PAN T 세포는 제조업자 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 130-091-993)에 따라서 비-인간 영장류 PAN T 세포 단리 키트를 이용하여 단리하였다. 세포 확장 및 활성화를 위한 DYNABEADS™ 인간 T-활성화제 CD3/CD28 [라이프 테크놀로지(Life Technologies); 11131D]을 이용하여 인간 T 세포를 3일 동안 활성화시켰다. 사용된 비드 대 세포의 비는 각각 1:1 비드:T 세포였다. 제조업자 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 130-092-919)에 따라서 비-인간 영장류, T 세포 활성화/확장 키트를 이용하여 시노 T 세포를 3일 동안 활성화시켰다. 사용된 비드 대 세포의 비는 각각 1:1 비드:T 세포였다. 3일 배양물을 수거한 후, 자기력을 이용하여 활성화된 T 세포로부터 비드를 분리시켰다. 세포를 세척하고, 이를 FACS 완충제 (2% FBS 포함) 및 인간 Fc 수용체 결합 억제제 [애피메트릭스 이바이오사이언스(Affymetrix eBioscience) cat. no. 16-9161-73]와 함께 인큐베이션하였다. 시노 세포의 경우에는 Fc 차단 시약 (BD 바이오사이언스 cat. no. 564765)을 사용하였다. 세포를 실온하에 10분 동안 인큐베이션한 다음, 죽은 세포를 배제하기 위하여 살아있는/죽은 색으로 5분 더 염색하였다 (UV 여기를 위한, LIVE/DEAD® 고정 가능한 블루 죽은 세포 염색 키트; 카탈로그 # A10346). 항-PD-1 항체를 부가하고 (항-PD-1 클론의 농축물을 10 μg/ml 내지 0 μg/ml로 출발하여 1:3의 일련의 희석비로 세포 상에서 인큐베이션하였다), 1x10⁶개 세포를 총 100 μl로 각 반응에 사용하였으며, 세포를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충제로 세척하여 1차 항체의 접근을 제거하고, 항-인간 [알로피코시아닌 (APC)와 접합된 애피니푸어(AffiniPure) F(ab')₂ 단편 당나귀 항-인간 IgG (H+L) 2차; cat. no. 709-136-149]과 인큐베이션하였다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고, BD LSR포르테사 세포 분석기 (BD 바이오사이언스, cat. no. 647465)를 이용하여 판독할 때까지 얼음 상에 유지시켰다. 플로조(FlowJo™) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과가 도 2a 및 2b에 요약되어 있다.

도 2a는 인간 활성화된 세포와 결합하는 항-PD-1 항체에 대해 측정된 EC50을 도시한 것이고, 도 2b는 시노 활성화된 세포와 결합하는 항-PD-1 항체에 대해 측정된 EC50을 도시한 것이다. 항-PD-1 항체 mAb7 및 C1은 유사한 EC50으로 활성화된 T 세포와 결합한다 (도 2a 및 2c).

실시예 5: 항-PD-1 항체에 의한 PD-L1 결합의 억제

본 실시예는 항-PD-1 항체에 의한 PD-1 리간드 (PD-L1) 결합의 억제를 예시한 것이다.

제조업자의 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 130-096-353)에 따라서 인간 PAN T 세포 단리 키트를 이용하여 PBMC (스탠퍼드 대학 혈액 은행)로부터 1차 인간 T 세포를 단리하였다. 시노몰구스 원숭이 PBMC는 바이오레클레메이션 IVT로부터 구입하고, PAN T 세포는 제조업자 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 130-091-993)에 따라서 비-인간 영장류 PAN T 세포 단리 키트를 이용하여 단리하였다. 세포 확장 및 활성화를 위한 DYNABEADS™ 인간 T-활성화제 CD3/CD28 (라이프 테크놀로지; 11131D)을 이용하여 인간 T 세포를 3일 동안 활성화시켰다. 사용된 비드 대 세포의 비는 각각 1:1이었다. 제조업자 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 130-092-919)에 따라서 비-인간 영장류, T 세포 활성화/확장 키트를 이용하여 시노 T 세포를 3일 동안 활성화시켰다. 사용된 비드 대 세포의 비는 각각 1:1이었다. 3일 배양물을 수거한 후, 자기력을 이용하여 활성화된 T 세포로부터 비드를 분리시켰다. 세포를 세척하고, 이를 FACS 완충제 (2% FBS 포함) 및 인간 Fc 수용체 결합 억제제 (애피메트릭스 이바이오사이언스; cat. no. 16-9161-73)와 함께 인큐베이션하였다. 시노 세포의 경우에는 Fc 차단 시약 (BD 바이오사이언스; cat. no. 564765)을 사용하였다. 세포를 실온하에 10분 동안 인큐베이션한 다음, 죽은 세포를 배제하기 위하여 살아있는/죽은 색으로 5분 더 염색하였다 (UV 여기를 위한, LIVE/DEAD® 고정 가능한 블루 죽은 세포 염색 키트; cat. no. A10346). 인간 재조합 PD-L1 Fc (R&D 시스템즈, cat. no. 156-B7) 또는 완충제 단독을 10 ng/ml 하에 세포와 함께 인큐베이션하였다. 각각의 리간드를 개별적으로 인큐베이션하고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 항-PD-1 항체와 함께 인큐베이션하며 (항-PD-1 클론의 농축물을 1 μg/ml 내지 0 μg/ml로 출발하여 1:3의 일련의 희석비로 세포 상에서 인큐베이션하였다), 1x10⁶개 세포를 총 100 μl로 각 반응에 사용하고, 세포를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충제로 세척하여 1차 항체의 접근을 제거하고, 알로피코시아닌 (APC)과 접합된 항-인간 카파 (라이프 테크놀로지; cat. no. MH10515)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 염색한 다음, 세척하고, BD LSR포르테사 세포 분석기 (BD 바이오사이언스, cat. no. 647465)를 이용하여 판독할 때까지 얼음 상에 유지시켰다. 플로조™ 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하고, 살아있는 세포 상에서 염색한 APC의 평균 형광 강도 (MFI) 및 기하 평균 (Geo.M)을 플로조™ 소프트웨어에서 계산하였다. 기하 평균 계산 후, 그래프PD 프리즘(GraphPD Prism) 소프트웨어를 이용하여 IC50을 계산하였다. 그 결과가 다음 표 11 및 12에 요약되어 있다.

<표 11>

인간 T 세포 상에서 PD-1과 결합하는 PD-L1의 항-PD-1 차단

<표 12>

시노 T 세포 상에서 PD-1과 결합하는 PD-L1의 항-PD-1 차단

이들 결과는 항-PD-1 항체 mAb7 및 C1이 유사한 IC50으로 인간 및 시노 T 세포와 결합하는 PD-L1을 억제한다는 것을 입증해 준다.

실시예 6: T 세포 증식에 대한 항-PD-1 항체의 효과

본 실시예는 T 세포 증식에 대한 항-PD-1 항체의 효과를 예시한 것이다. 세포 확장 및 활성화를 위한 DYNABEADS™ 인간 T-활성화제 CD3/CD28 (라이프 테크놀로지; 11131D)을 이용하여 CD4 및 CD8 [올셀(AllCells), LLC]을 2일 동안 활성화시켰다. PD-1을 유도시키기 위해 사용된 비드 대 세포의 비는 각각 1:1이었다. 제2일에, 배양물을 수거하고, 자기력을 이용하여 활성화된 T 세포로부터 비드를 분리하였다. 이어서, 세포를 PD-L1 발현성 수지상 세포 상에서 활성화시키고, 세포를 1:10 DC:T 세포의 비에서 삼중으로 96 웰 플레이트에서 1 μg/ml 하의 상이한 항-PD-1 클론과 함께 인큐베이션하고, 5% CO₂를 수반한 37℃ 하의 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 제3일에, 수거하기 전에 배양물을 웰당 1 μCi의 [³H]-티미딘으로 18시간 동안 펄스하였다. 이어서, 하비스터96 (톰텍 라이프 사이언스)을 이용하여 플레이트를 DNA 특이적 여과지 (펄킨 엘머) 상에 수거하였다. 방사성 표지된 필터를 베타 신틸레이션 액체 (펄킨 엘머)로 덮고, 마이크로베타® 계수기 플레이트 (펄킨 엘머)에서 판독하였다. 티미딘 혼입을 분당 계수치 (CPM)로서 분석하였다. 그 결과가 도 3 및 4에서 삼중치의 평균 ± SEM으로서 제시된다.

실시예 7: 인간화 항-PD-1 항체와 상호 작용하는 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 PD-1의 동역학 및 친화도 결정

본 실시예는 인간, 시노, 또는 마우스 PD-1에 대한 항-PD-1 항체의 결합성을 예시한 것이다.

달리 언급되지 않는 한 25℃에서 표지 없는 바이오센서 상에서 모든 상호 작용 분석을 수행하였다. 표면 플라스몬 공명 바이오센서 [바이오래드™로부터의 프로테온(ProteOn)-XPR™, 및 GE 라이프 사이언스로부터의 비아코어 2000™ 및 비아코어 T200™]를 사용하여 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1을 연구하였고, 바이오층 간섭계 바이오센서 [옥텟(Octet)-레드384, 포르테바이오/폴(Fortebio/Pall) 라이프 사이언스]를 사용하여 마우스 PD-1을 연구하였다. 프로테온 실험을 PBS pH 7.4 + 0.01% 트윈-20 (PBST) 실행 완충제에서 수행하였다. 비아코어 실험을 10 mM 헤페스(Hepes) pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20 (HBST+)에서 수행하였고, 옥텟 실험을 1 g/l BSA를 수반한 HBST+에서 수행하였다. 프로테온 데이터는 프로테온 매니저 소프트웨어에서 처리하였고, 비아코어 데이터는 비아이벨류에이션(Biaevaluation)에서 처리하였으며, 옥텟 데이터는 대조군 소프트웨어에서 제로로 간단히 정렬하였다. SPR 데이터는 이중 참조하였고 (문헌 [Myszka, 1999, J Mol Recognit 12(5):279-284]), 운동 속도 상수의 비로부터 평형 해리 상수인 K_D (K_D = k_d/k_a)를 결정하기 위하여 간단한 랑뮈르(Langmuir) 모델에 포괄적으로 피팅하였다.

무 보정 농도 분석 ( CFCA )

고정화된 IgG를 이용한 동역학 실험에서 분석물로서 사용하기 위한 인간 PD-1 (hPD-1) 단량체 [시노 바이오로직칼즈(Sino Biologicals), cat. no. 10377-H08H]의 활성 농도는 CM5 센서 칩이 장착된 비아코어 T200™ 상에서 CFCA 검정을 이용하여 실험적으로 결정하였다. 이들 실험을 위한 표면을 제조하기 위하여, 고성능 (대략 12,000 RU)의 mAb15 hIgG4 (또는 일부 실험에서는, 경쟁인자 항체 C2-hIgG1)를 유동 세포 2 상으로 아민-커플링시켜, 유동 세포 1이 블랭크가 되도록 하여 (어떠한 IgG도 수반하지 않는, 단지 "활성화되고 차단됨") 참조 표면을 제공하였다. hPD-1 샘플을 낮은 유속 (5 μl/min)과 높은 유속 (100 μl/min) 둘 다에서 36초 동안 0.1, 1, 및 10 μg/ml의 공칭 농도로 주사하였다. 2:1 v/v 피어스(Pierce) IgG 용출 완충제 (pH 2.8):4 M NaCl의 칵테일을 이용하여 표면을 재생시켰다. 데이터를 T200 소프트웨어 내의 CFCA 도구에서 분석하여 hPD-1 분석물에 대한 겉보기 활성 값을 유도하였는데, 이는 적절한 흡광 계수를 이용하여 280 nm 하의 흡광도에 의해 결정된 바와 같이, 그의 "공칭" 단백질 농도를 "활성" 단백질 농도로 정정하기 위해 사용하였다. 일부 로트가 32% 활성인 것으로 밝혀졌지만, 다른 것은 100% 활성이었다.

아민 커플링된 mAb7 , mAb15 , C1, C2, C3, 및 C4 mAb와 결합하는 인간 PD-1 (hPD-1)의 동역학 분석

GLC 센서 칩이 장착된 프로테온-XPR36 (바이오래드™; 미국 캘리포니아주 허큘리스)을 사용하여, PBST 실행 완충제 중의 아민 커플링된 항-hPD-1 mAb (mAb7, mAb15, C1, C2, C3, 및 C4)의 패널과 결합하는 hPD-1 단량체의 동역학 및 친화도를 결정하였다. 이들 실험을 위한 표면을 3 단계로 제조하였다: (1) 수중 최종 0.8 mM EDC 및 0.2 mM 술포-NHS 하의 활성화 시약의 신선하게 제조된 혼합물을 이용하여, 리간드 채널을 2분 동안 최소한으로 활성화시키는 단계; (2) IgG를 10 mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 중의 15 μg/ml 하에 3분 동안 커플링시키는 단계; 및 (3) 과도한 반응성 에스테르를 3분 동안 1 M 에탄올아민 HCl pH 8.5으로 차단시키는 단계. 커플링된 IgG의 최종 수준은 400 RU 내지 1157 RU의 범위였다. hPD-1 단량체를, 실험에 따라서 30, 44 또는 36 nM의 최고 "활성" 농도를 수반한 3배 희석 시리즈로서 "분석물" 채널을 따라 원샷 동역학 방식으로 주사하였다 (Bravman et al., 2006, Anal Biochem 358(2):281-288). 연합 및 해리 시간은 각각 3분 및 20분이었고, 모든 분석물을 이중 결합 사이클로 주사하였다. 2:1 v/v 피어스 IgG 용출 완충제 (pH 2.8):4 M NaCl의 칵테일을 이용하여 표면을 재생시켰다.

<표 13>

아민 커플링된 IgG와 결합하는 hPD-1 단량체의 동역학 분석

hPD-1 단량체와 mAb7 및 mAb15의 상호 작용은 허용된 해리 단계 내에서 결합 반응에서 눈에 띄는 감소를 나타내지 않았으므로, 그의 k_d 및 K_D 값에 근거하여 상한치를 정하였는데, 그의 k_d 및 K_D 값에 근거하여 상한치를 정하기 위하여 "5% 규칙" (문헌 [Katsamba et al, 2008, Anal Biochem 352(2):208-221])을 적용하였다. N = 2는 상이한 칩 상에서 2가지 독립적인 실험을 지칭한다.

시노몰구스 원숭이 PD-1에 대한 mAb7 및 mAb15의 교차 반응

CM4 센서 칩이 장착된 비아코어 2000™ 및 HBST+ 실행 완충제를 이용하여, hPD-1-hFc1 (R&D 시스템즈 cat. no. 1086PD)과 시노PD-1-hFc1 (사내에서 제조됨) 둘 다에 대한 재조합 정제된 Fab 단편 (mAb7 및 mAb15)의 결합 동역학을 결정하였다. 항-hFc 폴리클로날 항체를 상기 칩과 아민 커플링시키고, 이를 사용하여 유동 세포 2 및 3 상에 대략 90 RU hPD-1-hFc1 및 125 RU 시노PD-1-hFc1을 포획하여, 유동 세포 1이 블랭크가 되도록 하여 (있는 그대로의 항-hFc 포획 표면) 참조 채널을 제공하였다. 재조합 정제된 Fab를, 신선하게 포획된 PD-1-hFc1 융합 단백질 전반에 걸쳐 0, 10, 및 100 nM 하의 분석물로서 2분 동안 주사하여, 15분 해리 시간을 허용하였다. 75 mM 인산을 이용하여 포획 표면을 재생시키고, mAb7 Fab 샘플을 이중 결합 사이클로 주사하였다. 모든 Fab/PD-1 복합체는 매우 안정적이어서, 상기 상호 작용은 상기 허용된 해리 시간 내에 그의 결합 반응에서 눈에 띄는 어떠한 감소도 나타내지 않았으므로, k_d 및 K_D 값에 근거한 상한치를 정하기 위해 "5% 규칙" (문헌 [Katsamba et al., 2008])을 적용하였다.

<표 14>

hPD-1-hFc1 및 시노PD-1-hFc1 융합 단백질에 대한 mAb7 및 mAb15 Fab의 친화도 결정

mAb15 , mAb7 , 및 C3에 대한 hPD -1 결합 친화도의 온도 의존성

CM4 센서 칩이 장착된 비아코어 T200™을 이용하여, 아민 커플링된 항-hFc 폴리클로날 항체를 통하여 낮은 수준으로 포획되었던 hIgG4 분자 (mAb15, mAb7, 및 C3)의 패널과 결합하는 hPD-1 단량체의 동역학 및 친화도를 결정하였다. hIgG4 mAb를 개별적 유동 세포 상에서 10 μg/ml으로 포획하여, 유동 세포 1이 블랭크가 되도록 하여 참조 표면 (있는 그대로의 포획 표면)으로서 제공하였다. hPD-1을 0, 10, 및 100 nM의 활성 농도로 3분 동안 주사하여 18분 해리 단계를 허용하였다. 각 결합 사이클 후 75 mM 인산을 이용하여 포획 표면을 재생시켰다.

<표 15>

항-hFc-포획된 hIgG4 분자에 대한 분석물로서 결합하는 hPD-1 단량체의 동역학 분석

마우스-PD-1에 대한 mAb7의 교차 반응

스트렙타비딘 센서 팁이 장착된 옥텟-레드384를 사용하여, 마우스 PD-1이 mAb7과 결합하는 지의 여부를 결정하였다. 검정의 검출 민감도를 증가시키기 위하여 결합 활성도 경향의 검정 포맷을 선택하였다. 센서를 비오티닐화 항-인간 카파 폴리클로날로 코팅하고, 10 μg/ml 하의 hIgG4 항-hPD-1 mAb (mAb7, C1, C2, 및 C3)의 패널을 포획하기 위해 사용하는데; 각각의 mAb가 8개 센서 상에 포획되었다. 양성 대조군으로서, 8개의 스트렙타비딘 센서를 항-마우스 PD-1 항체인 비오티닐화 J43 (이바이오사이언스)으로 코팅하였다. 각각의 mAb-코팅된 센서를 다음 분석물에 노출시켰다: 완충제, 1 μM 결합 부위 마우스 PD-1-hFc, 1 μM 결합 부위 hPD-1-hFc (양성 대조군) 또는 1 μM 결합 부위 hGHR-hFc (음성 대조군). 모든 재조합 Fc-융합 단백질은 R&D 시스템즈로부터 유래되었다. 따라서, 각각의 분석물/mAb 상호 작용을 이중 센서 상에서 시험하였다.

항-PD-1 항체 C1, C2, 및 C3은 마우스-PD-1-hFc1과 결합하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 항-PD-1 항체 mAb7은 마우스-PD-1-hFc1과 약하게 결합하였다 (데이터는 제시되지 않음). 시험된 모든 항-PD-1 항체는 hPD-1-hFc와 결합하였다. 이들 결과는 mAb7이 마우스 PD-1과 약하게 교차 반응성인 반면, C1, C2, 및 C3은 마우스 PD-1과 교차 반응성이 아니라는 것을 입증해 준다.

실시예 8: 항-PD-1 항체를 이용한 암 치료

이는 암을 치료하기 위한 본 발명의 항-PD-1 항체의 용도를 예시하는 예측 실시예이다.

조직학적으로 확증되었고, 기존에 치료받은 적이 없는, 측정 가능한 전이성 결장직장암이 있는 환자가 항-PD-1 항체를 이용한 치료에 선별되었다. 환자는 2가지 치료군 중 하나에 배정된다: 화학요법 + 위약 또는 화학요법 + mAb7. 동적 무작위화 알고리즘이 전체 및 다음 범주 각각 내에서 균형을 이루기 위해 활용된다: 연구 센터, 기준선 ECOG 수행 상태 (0 대 ≥1), 원발성 질환의 부위 (결장 대 직장), 및 전이성 부위의 수 (1 대 >1). 화학요법 치료는 각 8주 주기의 처음 6주 동안 매주 투여하였다. 화학요법은 연구가 완료되거나 (96주) 또는 질환이 진행될 때까지 지속된다. mAb7 5 mg/kg 또는 위약을 2주마다 투여한다. 화학요법 치료의 결과로서 완전 반응이 확인되었거나 또는 허용되지 않은 독성을 경험한 mAb7 아암의 환자는 화학요법을 중단하고 1차 치료로서 mAb7 단독 투여를 계속할 수 있다. mAb7 군에 무작위로 배정된 환자들만이 2차 치료의 구성 요소로서 mAb7을 투여받을 수 있다. 연구를 완료한 후, 사망, 추적 조사 실패 또는 연구 종료까지 4개월마다 임의의 후속 치료 및 생존을 위해 환자를 추적한다.

적절한 방사선 촬영 기술, 전형적으로 나선형 CT 스캐닝을 이용하여 8주 주기마다 기준선 및 완료 시점에서 환자에게 종양 상태의 평가를 진행할 것이다. 종양 반응 또는 진행은 고형 종양의 반응 평가 기준을 활용하는 조사관과 독립적인 방사선 시설 (IRF) 둘 다에 의해 결정될 것이다 [Therasse et al. (2000)]. IRF 평가는 치료 과제 또는 조사자 평가에 대한 지식 없이 수행될 것이다. 또한, 환자는 기준선과 질병 진행까지 각 치료 주기 이전에 결장직장암 환자의 삶의 질 (QOL)을 평가하기 위한 검증된 도구인 암 요법-결장직장 (FACT-C)의 기능적 평가 (버전 4)를 완료할 것이다 [Ward et al. (1999) Qual . Life Res. 8: 181-195].

부작용, 실험실 시험 결과 및 활력 징후 측정 보고서를 통해 안전성을 평가한다. 부작용 및 비정상적인 실험실 결과는 국립 암 연구소 공통 독성 기준 (NCI-CTC), 버전 2를 사용하여 분류된다. 사전 지정된 안전성 조치는 특별한 관심의 4가지 부작용 (고혈압, 단백뇨, 혈전증 및 출혈)을 포함한다.

1차 성과 측정은 전반적인 생존 기간이다. 2차 성과 측정은 질환 진행이 없는 생존, 객관적 반응률 (완전 및 부분), 반응 지속 기간 및 FACT-C QOL 스코어 변경을 포함한다. 생존 지속 기간은 무작위 배정에서부터 사망까지의 시간으로서 정의된다. 분석 당시 살아 있던 환자의 경우, 생존 지속 기간은 마지막 접촉 일에 검열될 것이다. 질환 진행이 없는 생존은 무작위 배정에서부터 초기 질환 진행 또는 연구 중 사망까지의 시간으로서 정의되는데, 이러한 사망은 연구용 약물 또는 화학요법의 마지막 투여 후 30일 이내에 임의의 원인으로 인해 사망한 것으로 정의된다. 분석 당시 질환 진행이 없이 살아있는 환자의 경우, 질환 진행이 없는 생존은 마지막 종양 평가시, 또는 기준선 정립 후 평가가 수행되지 않은 경우에는 제1일 (연구 치료 첫째 날)에 검열될 것입니다. 객관적 반응의 분석에서는, 종양 평가를 수반하지 않은 환자가 비 반응자로서 분류된다. 질환 진행 및 반응 분석은 IRF 평가에 근거한다. 삶의 질에 있어서의 변화는 무작위 배정에서부터 결장암 특이적 FACT-C 하위 점수 (CCS) 기준선에서 ≥ 3 포인트 감소 초기, 질환 진행 또는 연구 중 사망까지의 기간으로서 정의된 QOL의 악화 시점 (TDQ)으로서 분석된다. TDQ는 기준선으로부터의 변화에 대한 TOI-C (CCS, 물리적 및 기능적 웰빙의 합) 및 전체 FACT-C에 대해서도 결정될 것이다.

실시예 9: 항-PD-1 항체를 이용한 암 치료

본 실시예는 암을 치료하기 위한 본 발명의 항-PD-1 항체의 용도를 예시한 것이다.

본 실시예에서의 연구는 기존에 치료한 적이 있는 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평 세포 두경부암 (SCHNC), 난소 암종, 육종, 또는 재발성 또는 불응성 고전적 호지킨 림프종 (cHL)이 있는 성인 환자에게 정맥내 투여된 항-PD-1 모노클로날 항체 mAb7의 제1상, 개방 표지, 다중 센터, 다수 용량, 용량 확대, 안전성, PK 및 PD 연구이다. 이러한 연구 프로토콜이 하기 표 16에 요약되어 있다.

<표 16>

시험 대상 환자 기준: - 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, SCCHN, 난소암, 육종, 또는 재발성 또는 불응성 cHL의 조직학적 또는 세포학적 진단; - 환자는 재발성 또는 전이성 질환에 대해 표준 진료와 연구용 요법 둘 다를 포함하여 적어도 1회 내지 5회 이하의 선행 치료를 받아야 한다; - RECIST 버전 1.1로써 정의된 바와 같은 적어도 하나의 측정 가능한 병변, 또는 (cHL의 경우) 기존에 방사선 조사된 적이 없는 악성 림프종에 대한 반응 기준으로써 정의된 바와 같은 적어도 1개의 플루오르데옥시글루코스 양전자 방출 단층 촬영 (FDG PET) 아비드 [도빌(Deauville) 4/5] 측정 가능한 병변 > 1.5 cm; - 파트 1B 확장 및 모든 파트 2 코호트의 경우: 환자는 사전 치료를 받고 치료 생검에 동의하였다; - 적당한 신장, 간, 골수 기능 시험 제외 환자 기준 - 활성 뇌 또는 연수막 전이; - 안구 흑색종; - 활성, 공지되거나 또는 의심되는 자가 면역 질환. 백반증, 유형 I 당뇨병, 호르몬 대체만을 필요로 하는 자가 면역 병태로 인한 잔여 갑상선 기능 저하증, 전신 치료가 필요 없는 건선, 또는 외부 트리거의 부재하에 재발할 것으로 예상되지 않는 병태의 환자가 등록할 수 있다. 면역억제 요법을 필요로 하는 이전의 면역결핍증 또는 장기 이식의 진단, - 파트 2의 경우: PD 1 또는 PD L1 항체로 사전 치료. - 이전의 면역 조정 요법 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제제, 공동 자극제 등)과 관련이 있는 것으로 간주되고 면역억제 요법을 필요로 하는 등급 3≥의 면역 매개된 AE (약물 관련 및 시토카인 방출 증후군을 고려할 때 AST/ALT 상승 포함)의 병력.

ORR (객관적 반응률) 환자의 수는 질환 진행이나 24개월 이하까지 허용되지 않은 독성이 나타날때까지 6주마다 및 기준선에서 측정될 것이다.

실시예 9: 인간 및 시노몰구스 원숭이 1차 T 세포에서 항-PD-1 항체의 길항 작용 활성

본 실시예는 인간 및 시노몰구스 원숭이 1차 T 세포에서 항-PD-1 항체의 활성을 예시한 것이다.

본 연구에서는, 혼합 림프구 반응 (MLR)을 이용하여 항-PD-1 모노클로날 항체 mAb7의 길항작용 활성을 시험관 내에서 조사하였다. 1차 T 세포를 인간 및 시노몰구스 원숭이-말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리하였다. mAb7 노출 후, 스타필로코칼 엔테로톡신 (Staphylococcal enterotoxin) B (SEB) 초항원으로 활성화된 시노몰구스 원숭이-혈액을 이용하는 시토카인 방출 검정 및 인간 및 시노몰구스 원숭이에 대한 MLR을 이용하여 상이한 활성화 조건하에 시험관 내에서 세포 증식 및 시토카인 분비를 평가하였다.

방법

인간 T 림프구

인간 연막을 스탠퍼드 혈액 센터 (미국 캘리포니아주 스탠퍼드)로부터 구입하고, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 희석하며, PBMC의 단리를 위하여 피콜 전반에 층을 이루게 하였다. hu-PBMC를 PBS로 4회 세척하고, 제조업자의 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 기재된 바와 같이 음성 선별을 수반한 인간 특이적 Pan T 세포 단리 키트를 이용하여 T 림프구를 단리하였다.

시노몰구스 원숭이 T 림프구

신선한 시노몰구스 원숭이-PBMC를 바이오레클레메이션 IVT (미국 뉴욕주 뉴욕)로부터 구입하고, PBS로 2회 세척하였다. 제조업자의 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 기재된 바와 같이 음성 선별을 수반한 비-인간 영장류 특이적 pan T 세포 단리 키트를 이용하여 T 림프구를 단리하였다.

고 수준의 PD-L1을 발현하는 인간 수지상 세포의 생성

인간 연막을 스탠퍼드 혈액 센터 (미국 캘리포니아주 스탠퍼드)로부터 구입하고, PBS로 희석하며, hu-PBMC의 단리를 위하여 피콜 전반에 층을 이루게 하였다. hu-PBMC를 PBS로 4회 세척하고, 제조업자의 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 기재된 바와 같이 양성 선별을 수반한 인간 특이적 분화 클러스터 14 (CD14) 세포 단리 키트를 이용하여 CD14⁺ 단핵구를 단리하였다. 이어서, 세포를, 10% 태아 소 혈청 (FBS)이 보충된 완전 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지에서 7일 동안 5 x 10⁵개 세포/mL로 시딩하였다. 배양물을 제0일, 제2일 및 제5일에 재조합 인간 (rh-) IL-4 (1000 U/mL) (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미니애폴리스) 및 rh-과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF) (rh-GMCSF) (500 U/mL) (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미니애폴리스)로 보충시켰다. 미숙한 DC를 수거하고, 세척하며 제7일에 계수하였다. 각 제제의 샘플을 대상으로 하여, LSR포르테사™ 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하는 유동 세포계수법에 의해 r-피코에리트린 (RPE) 표지된 항-hu-PD-L1 (이바이오사이언스/애피매트릭스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 사용하여 PD-L1 발현에 관하여 시험하였다.

고 수준의 PD-L1을 발현하는 시노몰구스 원숭이 수지상 세포의 생성

신선한 시노몰구스 원숭이-PBMC를 바이오레클레메이션 IVT (미국 뉴욕주 뉴욕)로부터 구입하고, PBS로 2회 세척하였다. 제조업자의 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 기재된 바와 같이 양성 선별을 수반한 비-인간 영장류 특이적 CD14 세포 단리 키트를 이용하여 CD14+ 단핵구를 단리하였다. 이어서, 세포를, 10% FBS가 보충된 완전 RPMI 1640 배지에서 7일 동안 5 x 10⁵개 세포/mL로 시딩하였다. 배양물을 제0일, 제2일 및 제5일에 rhIL-4 (1000 U/mL) (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미니애폴리스) 및 rh-GMCSF (500 U/mL) (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미니애폴리스)로 보충시켰다. 미숙한 DC를 수거하고, 세척하며 제7일에 계수하였다. 각 제제의 샘플을 대상으로 하여, LSR포르테사™ 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 유동 세포계수법에 의해 RPE 표지된 항-hu-PD-L1 (이바이오사이언스/애피매트릭스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 사용하여 PD-L1 발현에 관하여 시험하였다.

고 수준의 인간 PD-L1을 발현하는 제코 ( JeKo )-1-Luc-그린 형광성 단백질 세포 클론의 생성

제코-1 세포주 (외투 세포 림프종)를 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC; 미국 버지니아주 매너서스)로부터 구입하였다. 제코-1-luc-2A-GFP 세포주는 제조업자의 프로토콜에 따라서 블라스티시딘 마커 (AMSBIO, LVP323, 1 x 10E⁷개 입자/200 μL)를 수반한 바이시스트론(bicistronic) 시스템을 통하여 반딧불이 루시페라제 (luc2A) 및 그린 형광성 단백질 (GFP)을 개별적으로 발현하는 렌티바이러스 입자를 사용하는 형질도입 과정에 의해 화이자 (Pfizer; 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 생산되었다. 제코-1 세포를 펠릿화하고, 20% FBS 배지를 수반한 RPMI에서 1 x 10⁶개 세포/mL가 되도록 희석하였다. 렌티바이러스 입자를 0.5 mL 세포당 50 μL 바이러스의 비로 상기 희석된 세포에 부가하였다. hu-PD-L1을 발현하는 제코-1 세포주를 생성하기 위하여, hu-PD-L1 cDNA를 맞춤 합성하고, 이를 라이프 테크놀로지 (미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 의한 복제 발현 벡터 (pcDNA3.1) 내로 클로닝하였다. hu-PDL-1을 안정적으로 발현하는 제코-1-Luc-GFP 세포주는 제조업자의 프로토콜 [론자(Lonza); 미국 메릴랜드주 워커스빌]에 따라서 사용된 아막사(Amaxa®) 뉴클레오펙터 시스템 (론자; 미국 메릴랜드주 워커스빌) 및 키트 V를 이용하여 전기천공함으로써 화이자 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 생산하였다. 이어서, 세포를 250 μg/mL 히그로마이신의 존재하에 2주 동안 성장시킨 다음, BD FACSAria™ II 세포 분류기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 세포 분류함으로써 선별하였다. 세포의 분류는 알로피코시아닌 (APC) 표지로 직접 표지시킨 항-hu-PD-L1 항체 클론 MIH-1 (애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 이용하여 수행하였다. 양성 클론을 확장하고, 이를 대상으로 하여, 유동 세포계수법 (LSR포르테사™ 분석기, BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여 높은 PD-L1 발현에 관하여 시험하였다. 단일 분류된 세포로부터 생성되었고 고 수준의 PD-L1 발현을 함유한 클론을 선별하였다.

항체의 생성

의약품 안전성 시험실시기준 (GLP) 물질 (로트 번호 STL0005717)을 이용하여 mAb7을 CHO 세포 [파르마슈티칼 사이언스, 화이자 인크. (미국 미주리주 세인트 루이스)]에서 생성하였고, 이를 20 mM 히스티딘, 85 mg/mL 수크로스, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트-80, 0.05 mg/mL 디소듐 EDTA, pH 5.5 완충제에 공급하였다. 내독소를 ≤0.01 EU/mg로서 측정하였다.

모든 시험관내 검정에 사용된 대조군 항체는 IgG4-HG 프레임워크 (MAB7과 동일한 프레임워크) 내로 클로닝된 항-소 헤르페스 바이러스였다. 대조군 항체는 화이자 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 로트 번호 4945로 생성되었고, ≤0.3 EU/mg 내독소를 수반하였다.

이전의 특허에서 공개되고 MAB7을 위해 사용된 것과 유사한 IgG4-HG 프레임워크에서 발현된 서열로부터 2개의 항-hu-PD-1 항체를 생성하였다. 이들 항체는 화이자 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 생성하였고, 양성 대조군 1 및 양성 대조군 2 (각각 로트 번호 5053 및 4255)로서 지정되었다. 측정된 내독소는 각각 ≤0.13 EU/mg 및 ≤0.056 EU/mg였다.

고 수준의 PD-L1을 발현하는 수지상 세포를 이용한 인간 검정

프로토콜은 문헌 (Kruisbeek et al., 2004)에서 일부 변형을 수반하여 각색되었다. 분화된 1차 hu-DC를 제7일에 수거하고, T 세포 활성화에 필요한 공동 자극성 시그널 및 고 수준의 PD-L1 발현에 관하여 유동 세포계수법에 의해 검증하였으며; 마커는 CD80 및 CD86을 포함하였다 [BD 바이오사이언스 (미국 캘리포니아주 산호세)로부터 구입된 항체]. 세포를 계수하고; RS2000 X선 기계 [래드소스 (Radsource; 미국 테네시주 브렌트우드)]를 사용하여 3000 방사선 단위 (rads)로 조사하여, DC가 시토카인을 분비하지 못하게 하지만 T 세포에 대한 Ag 제시 지지체로서만 기능하도록 하였다. 따라서, 상기 검정의 성과는 T 세포에 의해서만 유도되었다. 제7일에, 동종이계 공여자로부터 신선하게 단리된 hu-T 세포를 수거하였다. T 세포를 상이한 농도의 mAb7, 음성 및 양성 대조군 항체, 또는 배지 단독 (기준선 반응을 평가하기 위함)의 존재하에 10:1의 비 하에 조사된 DC로 플레이팅하였다 (최적의 검정 조건은 200 μL 배양물 중에서 2 x 10⁴개의 DC와 함께 인큐베이션된 2 x 10⁵개의 T 세포로서 결정되었다). 모든 조건을 96-웰 편평한 바닥 조직 배양물 처리된 플레이트 [피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific; 미국 펜실베니아주 피츠버그)]에서 플레이팅하였다. 실험들 간의 인간 혈청 가변성을 방지하기 위하여 혈청 무함유 X-비보(vivo)15 배지 (론자; 미국 메릴랜드주 워커스빌)를 이용하여 세포를 배양하였다. 배양물을 5% CO₂를 수반하여 37℃ 하에 5일 동안 인큐베이션하였다. 제5일에, 상등액을 수집하고; 제조업자의 프로토콜에 따라서 세포계수 비드 어레이 (CBA) (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 시토카인 농도를 측정하였다. 유동 세포계수법 (LSR포르테사™ 분석기, BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여 데이터를 획득하고, BD FCAP 어레이 소프트웨어 버전 3.0 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. 1 μCi의 3H 메틸 적정된 티미딘 (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)을 각 웰에 부가함으로써 증식을 병행 배양물에서 측정하고, 16 내지 18시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 이어서, 배양물을 데옥시리보핵산 (DNA) 혼입 필터 (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬) 상에 수거하고; 세포 증식의 지수를 제공하는 삼중수소의 티미딘 혼입은 마이크로베타2 기계 (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)를 이용하여 분당 계수치 (cpm)로서 측정하였다.

제코 -1-PD-L1 발현성 세포주를 이용한 인간 검정

본 검정은 5:1 비의 T 세포 대 제코-1-PD-L1 세포주를 이용하여 수행하였는데, 이는 이러한 비가 제5일에 시토카인 분비를 포획하기 위한 보다 이상적인 접근 방식을 제공하기 때문이다. 따라서, 각 웰을 4 x 10⁴개 제코-1-PD-L1을 수반하여 2 x 10⁵개 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 제5일에, 상등액을 수집하고; 제조업자의 프로토콜에 따라서 CBA (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 시토카인 농도를 측정하였다. 이러한 세포주는 매우 적은 양의 공동 자극성 분자 (CD80 및 CD86)를 발현하므로, 항체 처리 후에 증강된 증식은 매우 약하다. 이와는 대조적으로, IL-2를 포함한 시토카인 분비는 강력하므로, mAb7 처리 후에 시토카인 분비를 측정할 수 있지만, T 세포 증식은 그렇지 못하다.

고 수준의 PD-L1을 발현하는 수지상 세포를 이용한 시노몰구스 원숭이 검정

분화된 DC를 제7일에 수거하고; T 세포 활성화에 필요한 공동 자극성 시그널 및 고 수준의 PD-L1 발현에 관하여 유동 세포계수법 [LSR포르테사™ 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용함]에 의해 검증하였으며; 마커는 CD80 및 CD86을 포함하였다 [BD 바이오사이언스 (미국 캘리포니아주 산호세)로부터 구입된 항체]. 세포를 계수하고; RS2000 X선 기계 (래드소스; 미국 테네시주 브렌트우드)를 사용하여 3000 rads로 조사하였다. 동종이계 공여자로부터 신선하게 단리된 시노몰구스 원숭이 T 세포를 수거하였다. T 세포를 상이한 농도의 mAb7, 음성 및 양성 대조군 항체, 또는 배지 단독 (기준선 반응을 평가하기 위함)의 존재하에 10:1의 T 세포 대 DC의 비를 이용하여 조사된 DC로 플레이팅하였다 (2 x 10⁵개의 T 세포를 200 μL 배양물 중에서 2 x 10⁴개의 DC와 함께 인큐베이션한 경우의 최적의 검정). 모든 조건을 96-웰 편평한 바닥 조직 배양물 처리된 플레이트 (피셔 사이언티픽; 미국 펜실베니아주 피츠버그)에서 플레이팅하였다. 실험들 간의 혈청 가변성을 방지하기 위하여 혈청 무함유 X-비보 15 배지 (론자; 미국 메릴랜드주 워커스빌)를 이용하여 세포를 배양하였다. 배양물을 5% CO₂를 수반하여 37℃ 하에 5일 동안 인큐베이션하였다. 제5일에, 상등액을 수집하고; 제조업자의 프로토콜에 따라서 CBA (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 시토카인 농도를 측정하였다. 유동 세포계수법 (LSR포르테사™ 분석기, BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여 데이터를 획득하고, BD FCAP 어레이 소프트웨어 버전 3.0 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. 이와 동시에 유사한 배양물에서, 1 μCi의 3H 메틸 적정된 티미딘 (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)을 각 웰에 부가하고; 세포를 16 내지 18시간 동안 추가로 배양하여 증식을 측정하였다. 배양물을 DNA 혼입 필터 글래스 프린트 필터메이트 A (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬) 상에 수거하고, 세포 증식의 지수를 제공하는 삼중수소의 티미딘 혼입은 마이크로베타2 기계 (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)를 이용하여 cpm으로서 측정하였다.

초항원 자극 ( 스타필로코칼 엔테로톡신 B)에 의해 유도된 시노몰구스 원숭이 혈액으로부터의 시토카인 방출

시노몰구스 원숭이로부터 전혈을 수집하였고; 225 μL의 혈액을, 조직 배양물 처리된 96 웰 플레이트 (피셔 사이언티픽; 미국 펜실베니아주 피츠버그) 내로 등분하였다. 샘플을 0.1 내지 100 μg/mL 범위의 농도에서 mAb7 또는 이소형-매칭된 음성 대조군 항체의 존재하에 5% CO₂ 중에서 37℃ 하에 이중으로 인큐베이션하였다. 항체를 부가한지 1시간 후에, 샘플을 0.1 μg/mL SEB [톡식 테크놀로지 (Toxic Technologies; 미국 플로리다주 새러소타)]로 자극하고, 배양물을 3일 동안 인큐베이션하였다. 제3일에, 혈장을 수거하고, 풀링하며, -80℃ 하에 동결시켰다. 해동된 혈청 샘플 중의 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α의 농도를, MSD 면역검정 플레이트 [메소 스케일 다이아그노스틱스 (Meso Scale Diagnostics; 미국 메릴랜드주 록빌)] 및 MSD 디스커버리 워크벤치 소프트웨어 (버전 4.0.12)를 수반한 MSD 판독기 (모델 1200)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 이중으로 측정하였다. 이러한 이중치의 평균이 보고되었다.

결과

인간 1차 T 세포 상에서 mAb7의 길항작용 활성

1차 인간 T 세포를 MLR에서 PD L1을 발현하는 동종이계 hu-DC로 활성화시킨 경우, mAb7는 용량 의존적 방식으로 T 세포 증식 (삼중수소의 티미딘 혼입에 의해 측정됨) 및 T 세포 활성화 (염증 유발성 시토카인 분비에 의해 측정됨)를 증가시켰다. T 세포를 mAb7 (10 μg/mL)로 처리하면, 음성 대조군 항체 (10 μg/mL)를 이용한 처리와 비교해서 T 세포 증식이 2.5배 이하 증가되었다. IFN-γ 및 TNF-α 수준은 음성 대조군 항체와 비교해서 각각 8배 및 5배 이하 증가되었다. IFN-γ 증가는 TNF-α 증가보다 탁월하였다. IL-2 발현은 이들 배양물에서 검출되지 않았다. 동종이계 항원 제시 세포로서 종양 세포주 제코 1 PD-L1을 사용하여 1차 인간 T 세포를 MLR에서 활성화시킨 경우, mAb7은 음성 대조군 항체와 비교해서 IFN-γ (2.5배 이하), TNF-α (2배 이하), 및 IL-2 (5배 이하) 분비의 용량 의존적 증가를 유도시켰다. 이러한 검정에서 mAb7의 효과는 양성 대조군 항체 둘 다를 이용하여 수득된 데이터와 유사하였다. 이들 조건 하에서는 증가된 T 세포 증식이 관찰되지 않았다. 세포 증식은 최소한이었는데, 1차 DC에 의해 매개된 MLR과 비교해서 CD80 및 CD86에 의해 약한 시그널이 제공되었다. IL-10, IL-4, IL-17A 및 IL-6은 상기 언급된 모든 검정에서 최소한 수준이 검출되거나 전혀 검출되지 않았다.

시노몰구스 원숭이 1차 T 세포 상에서 mAb7의 길항작용 활성

용액 중에 있는 경우, hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 대한 mAb7의 결합 친화도는 동역학 배제 검정 (키넥사)에서 극히 유사하였다 (인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 각각에 대한 KD = 23 및 28 pM). 인간 PD-1 및 시노몰구스 원숭이 PD-1을 발현하는 세포 상에서의 mAb7의 EC50이 또한 유사하였다. 상이한 시노몰구스 원숭이들로부터 단리된 T 세포 및 DC를 사용한 MLR 기능적 검정에서는, mAb7이 T 세포 증식과 활성화를 용량 의존적 방식으로 유도시켰다 (삼중수소의 티미딘 혼입에 의해 측정됨). 이러한 효과는 양성 대조군 (항체 1 및 항체 2)을 이용한 경우에도 관찰되었지만, 음성 대조군 항체를 이용한 경우에는 그렇지 못하였다. mAb7은 또한, 시토카인 분비, 즉 IFN-γ 및 TNF-α 분비를, 음성 대조군 항체를 이용한 처리와 비교해서 5배 및 3배 이하 증강시켰다. IL-2 발현은 이들 배양물에서 검출되지 않았다. 0.1 μg/mL의 SEB 초항원으로 3일 동안 자극시킨 시노몰구스 원숭이 전혈을 사용하는 상이한 시토카인-방출 검정에서는, mAb7 (0.1 내지 100 μg/mL)이 음성 대조군 항체와 비교해서 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α 분비를 더 크게 유도시켰다.

MLR 연구를 이용하여, T 세포가 활성화되는 종양 미세환경과 유사하고 PD-L1을 발현하는 동종이계 DC 또는 종양 세포의 존재하에 고 수준의 PD-1을 발현하는 시험관내 환경을 창출시켰다. PD-1/PD-L1 상호 작용은 추가의 T 세포 증식 및 시토카인 방출을 억제한다. 이들 MLR에서 항-PD-1 항체를 부가하면 T 세포 활성화가 복원되었고, PD-1/PD-L1 축의 차단에 기인하여 증식 및 시토카인 분비, 특히 IFN-γ 분비가 증가되었다.

mAb7은 고 수준의 PD-L1을 발현하는 동종이계 세포 (DC 또는 제코 1 PD-L1 세포주)와 함께 배양되는 경우에, 인간 T 세포에 의한 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2의 분비 및 증식을 가속화시켰다. 이와는 대조적으로, 배지 단독과 유사한 것으로 입증된 음성 대조군 항체는 이들 효과를 증강시키지 못하였다. 유사하게, mAb7은 시노몰구스 원숭이-MLR 시스템에서 T 세포 증식, IFN-γ 및 TNF-α 분비를 증강시켰을 뿐만 아니라 초항원 SEB를 이용하여 시노몰구스 원숭이 전혈로부터의 시토카인 방출을 증강시켰다.

이들 결과는 항-PD-1 항체 mAb7이 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 및 인터류킨 (IL)-2를 포함한 염증 유발성 시토카인의 분비와 T 세포 증식을 증강시켰다는 것을 입증해준다. 이들 활성은 1차 인간 T 세포와 시노몰구스 원숭이 T 세포 둘 다에서 관찰되었다.

실시예 10: 이식편 대 숙주 질환에서 항-PD-1 항체의 효과

본 실시예는 hu-PBMC로 전이된 NSG 마우스에서 제노-aGvHD 모델을 이용하여 생체내 T 세포 활성화 및 확장에 대한 항-PD-1 항체의 효과를 예시한 것이다.

본 연구에서는, 생체내 T 세포 활성화 및 확장에 대한 항-PD-1 항체 mAb7의 효과를, hu-말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 이용하여 비-비만 당뇨병 (NOD), 중증 결합 면역결핍증 (SCID), 인터류킨 2 수용체 감마 기능없는 (IL2rγ^null) (NSG) 마우스에서 제노 급성 이식편 대 숙주 질환 (aGvHD) 모델에서 연구하였다.

8 내지 10주 생의 면역기능저하 NSG 암컷 마우스 (군당 5마리) (정식 명칭, NOD, Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ)는 잭슨 라보라토리 (Jackson Laboratory; 미국 메인주 바 하버)로부터 구입하였다. 모든 동물은 기관내 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라서 화이자 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에 있는 병원체 없는 시설에서 사육하였다.

인간 연막을 스탠퍼드 혈액 센터 (미국 캘리포니아주 스탠퍼드)로부터 구입하고, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 희석하며, PBMC의 단리를 위하여 피콜 전반에 층을 이루게 하였다. PBMC를 PBS로 2회 세척하였다. 제조업자의 프로토콜 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 표시된 바와 같이 염화암모늄-칼륨 (ACK) 용해 완충제를 이용하여 적혈구 (RBC)를 용해시켰다. RBC 용해 후, 세포를 한번 더 세척하고 5 x 10⁷개 세포/mL로 PBS에 희석시켰다.

제노-aGvHD의 유도를 위하여, NSG 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 hu-PBMC를 정맥내 주사하였다. 각 마우스에게 200 μL의 PBS 중의 1 x 10⁷개 세포를 제공하였다. 모든 실험에서는, 매주 3회 마우스의 체중을 재고; 체중 감소, 구부린 자세, 헝클어진 털, 감소된 이동성 및 일부 경우에, 설사를 포함한 제노-aGvHD-유사 증상의 출현에 관하여 모니터링하였다. 체중이 20% 감소되거나 또는 2일에 걸쳐 1일 1 g씩 감소된 후에 마우스를 안락사시켰는데; 이러한 시점이 생존 시간으로서 기록되었다. mAb7, 음성 대조군 항체, 및 양성 대조군 항체는 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 생성시켰다.

NSG 마우스를 1 킬로그램당 0.1 내지 10 밀리그램 (mg/kg)의 범위의 용량으로 음성 대조군 항체, 양성 대조군 항체, 또는 mAb7로 처리하였다. hu-PBMC 전이 후 제2 및 제8일에 적절한 비히클을 이용하여 항체를 마우스에게 투여하였다. 항체 투여 경로는 복강내 (ip)였다.

hu-PBMC가 이식된 마우스로부터 말초 혈액, 비장, 및 간을 수거하였다. 각 기관으로부터의 단일 세포 현탁액을 다음과 같이 제조하였다: 말초 혈액을 수집하고, ACK-용해 완충제를 이용하여 RBC를 용해시키며 PBS로 세척하였다. 비장 및 간은 주사기 플런저의 뒷면을 사용하여 70 μM 필터를 통해 세포를 침연시키기 위해 기계적으로 균질화시키고, PBS로 1회 세척하였다. RBC를 용해시키고, 세포를 2회 더 세척하며, 70 μM 필터를 통해 다시 침연시켰다. 이 단계에서는, 비장 세포가 준비되었다. 간으로부터 백혈구를 단리하기 위하여, 30% 내지 80% 하의 퍼콜(Percoll) 구배 (퍼콜® 플러스, GE 헬스케어(Healthcare) 바이오사이언스; 미국 펜실베니아주 피츠버그)를 이용하여 단일 세포 현탁액이 층을 이루게 하고 이를 대상으로 하여 고속 원심분리를 수행하였다. 중간 층으로부터 백혈구를 수거하고 PBS로 2회 세척하였다. 모든 단일 세포 현택액을 계수하고 각 샘플로부터 1 x 10⁶개의 세포를 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)에 사용하였다. 인간 시토카인 분비 검정의 경우에는, 제조업자의 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 기재된 바와 같이, 양성 선별에 의해 마우스 특이적 CD45 세포 단리 키트를 이용하여 마우스 CD45⁺ 세포를 고갈시켜 시토카인-분비가 인간 면역 세포 단독으로부터 비롯되었다는 것을 보장하였다. 세포를 계수하고, 각 샘플로부터의 1 x 10⁶개의 세포를 상기 검정에 사용하였다.

말초 혈액, 비장, 및 간으로부터의 단일 세포 현탁액을 제노-aGvHD 마우스로부터 수득하였다. 샘플당 총 1 x 10⁶개의 세포를, 빛으로부터 보호하에 4℃에서 30분 동안, 2% 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 1 x PBS를 포함한 FACS 완충제 중의 적절한 형광 표지된 모노클로날 항체의 혼합물과 함께 인큐베이션한 다음, 세포를 FACS 완충제로 세척하였다. 키엘(Kiel) 67 단백질 (Ki67, 증식성 세포를 측정하기 위함)의 세포내 염색을 위하여, 제조업자의 프로토콜에 따라서 세포내 고정 및 투과화 완충제 세트 (애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 이용하여 표면 염색 후 세포를 고정시켰다. 세포내 염색은 암실에서 4℃ 하에 30분 동안 수행하였다. 염색이 끝날 무렵, 샘플을 세척하고, BD LSR 포르테사™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 다색 유동 세포계수법을 수행하였다. 플로조 소프트웨어 (플로조 LLC; 미국 오리건주 애슐랜드)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. 세포 표면 분자의 인식을 위하여 상이한 조합으로 사용된 항체는 다음과 같다: 항-hu-CD45 퍼시픽 블루 (PB) 또는 암시안(Amcyan), 항-마우스 CD45-브릴리언트 바이올렛 (BV)-711, 항-hu-CD3-PerCPCy5.5, 항-hu-CD8 피코에리트린-Cy7 (PE-Cy7) 또는 BV-786, 항-hu-CD4-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 또는 BV-650, 항-hu-PD-1 (클론 EH12.1) BV-786 또는 PE, 항-hu-PD-1 (클론 MIH-4) PE 또는 FITC, 항-hu-Ki67 알로피코시아닌 (APC) [모든 항체는 BD 바이오사이언스 (미국 캘리포니아주 산호세)로부터 구입하였다], 항-hu-PD-L1 (PE 애피매트릭스-이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 및 살아있는/죽은 염색을 위한 블루 형광 반응성 염료 (라이프 테크놀로지; 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드).

비장 및 간으로부터 인간 CD45 강화된 집단의 단일 세포 현탁액을 (마우스 CD45 고갈 후) 제노-aGvHD 마우스로부터 수득하였다. 샘플당 총 1 x 10⁶개의 세포를 200 μL X-비보 15 배지 중에서 편평한 바닥 조직 배양물 처리된 96-웰 플레이트 (피셔 사이언티픽; 미국 펜실베니아주 피츠버그)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 자극되지 않은 채로 두거나, 또는 낮은 자극 조건으로서 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 10 ng/mL 및 이오노마이신 (이오노) 125 ng/mL으로 자극하거나 또는 높은 자극 조건으로서 PMA 50 ng/mL 및 이오노마이신 1 μg/mL으로 자극하였다 [둘 다 시그마-올드리치 (Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트루이스)로부터 수득하였다]. 배양물을 5% CO₂ 중 37℃ 하에 8시간 동안 인큐베이션하여 최대 시토카인 분비를 보장하였다. 상등액을 수집하고, 제조업자의 프로토콜에 따라서 인간 시토카인에 대해 특이적인 세포계수 비드 어레이 (CBA) (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 인간 시토카인 농도를 측정하였다. 유동 세포계수법 (LSR포르테사™ 분석기, BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여 데이터를 획득하고, FCAP 어레이™ 소프트웨어 버전 3.0 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. Hu-IFN-γ, hu-TNF-α, 및 hu-IL-2 비드 어레이 키트는 BD 바이오사이언스 (미국 캘리포니아주 산호세)로부터 구입하고, 이들이 마우스 시토카인과 교차 반응하지 않았다는 것을 확증하였다.

모든 분석은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) (그래프패드 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 이용하여 2-방식 아노바(ANOVA) 또는 독립적 샘플 t-시험을 이용하여 평균을 비교하는 것을 포함하였다. p ≤0.05의 값이 통계상 유의적인 것으로 간주되었다. 생착 데이터는 평균의 표준 오차 (sem)를 포함한 평균 농도로서 숫자로 묘사된다.

NSG 면역기능저하 마우스를 항-PD-1 항체 mAb7로 처리하면 체중 손실이 가속화되였고 (표 17), 이러한 모델에서 통상적으로 관찰되는 다른 질환 징후, 예컨대 구부린 자세, 헝클어진 털, 감소된 이동성 및 일부 경우에, 설사가 유도되었다. 이러한 모델에서는, 전이 후 제20일과 제30일 사이에 체중 손실이 가속화되는 것으로 예상된다 (예를 들어, 문헌 [Schroeder and DiPersio, 2011] 참조). mAb7 및 양성 대조군 1 및 2로 처리하면 제노-aGvHD 증상이 가속화되었기 때문에, 초기 시점에 마우스를 안락사시켜야만 하고 생존 곡선을 수득할 수 없었으므로; 체중 손실이 1차 성과 측정이다. 첫 번째 실험에서는, 마우스를 0.1, 1, 및 10 mg/kg의 mAb7 또는 10 mg/kg의 음성 대조군 항체로 처리하였다. 표 17에서는, 제0일과 비교해서 제23일에 처리군들 간의 체중 차이를 정규화함으로써 체중 손실을 계산하였다. 그 값은 군당 5마리 마우스의 평균 ± sem을 표시한다.

<표 17>

마우스를 hu-PBMC 전이 후 제2일 및 제8일에 상기 표시된 항체로 처리하였다. 체중 손실이 제23일에 대조군에서 명백하긴 하였지만, hu-PBMC 전이 후 제10일 내지 제11일에 시작하여 항-PD-1 항체 mAb7 처리군 모두로부터의 개별 마우스에서 체중 손실과 질환 진행이 검출되었다. 1 mg/kg 처리군과 10 mg/kg 처리군 둘 다에서는, 체중 손실이 음성 대조군 처리군과 비교해서 제14일 내지 제23일에 유의성에 도달하였다 (p≤0.0001). 제23일에는, 1 mg/kg 처리군과 10 mg/kg 처리군에서 15% 체중 손실이 검출되었고, 0.1 mg/kg 처리군에서는 7.9% 체중 손실이 검출되었다 (표 17).

말초 혈액, 간, 및 비장의 FACS 분석 결과, 대조군과 비교해서 mAb7 처리군에서 hu-CD45 양성 세포 및 hu-CD3 양성 T 세포의 비율 (%)이 증가하였다는 것이 입증되었다. 비장으로부터의 대표적인 데이터는 또한, 음성 대조군 항체 처리군과 비교해서 mAb7에서 hu-CD8 양성 T-세포 계수치가 증가하였고, (약간 덜한 정도로) hu-CD4 양성 T-세포 계수치가 증가하였다는 것을 나타내었다. 유사한 증가가 또한, 간 및 혈액 내에서의 hu-T 세포 계수치에서 인지되었다. T 세포 상의 증가가 인간 T 세포에 대한 mAb7의 결합을 통한 PD-1의 차단에 기인하였는 지의 여부를 평가하기 위하여, mAb7의 결합과 경쟁하는 PD-1에 대한 상업적 항체 (클론 EH12.1)로 T 세포를 염색하였다. 모든 기관으로부터의 mAb7-처리된 림프구 (FACS에 의해 분석됨)는 EH12.1와의 결합을 전혀 나타내지 않았다. mAb7로 처리된 T 세포가 여전히 PD-1을 발현한다는 것을 확증하기 위하여, T 세포와의 결합을 놓고 mAb7과 부분적으로 경쟁하는 상이한 항-hu-PD-1 클론 (클론 MIH4)으로 T 세포를 염색하였다. 그 결과는 mAb7로 처리된 T 세포가 MIH4와 부분적으로 결합하였다는 것을 나타내므로; 이는 PD-1이 처리된 T 세포 상에서 발현되었고 mAb7에 의한 PD-1 차단이 명백하였다는 것을 표시한다 (데이터는 제시되지 않음; 화이자 내부 기록에서 유지 관리됨). 비장 내에서, T 세포 (hu-CD3 양성) 상에서, 또는 비-hu-T 세포 (hu-CD3 음성) 상에서의 hu-PD-L1 발현에 관해서는 검출 가능한 변화가 전혀 관찰되지 않았다. 림프구 증식에 대한 마커인 Ki67은 비장 중간 패널에서 음성 대조군 처리군과 비교해서 PF-0681591 처리군으로부터의 hu-CD3 양성 세포에서 상승되었다. 유사한 결과가 혈액 및 간에서 관찰되었다.

제노-aGvHD 동안 시토카인 방출에 대한 mAb7의 효과를 조사하기 위하여, hu-CD45 양성 세포 (간 및 비장으로부터 유래됨)를 마우스 CD45 양성 세포로부터 추가로 단리하였다. 이어서, 이들 림프구를 PMA와 이오노마이신의 혼합물 (2가지 농도: 저 농도 대 고 농도로 존재함)로 처리하거나 또는 37℃ 하에 8시간 동안 처리되지 않은 채로 두었다. 시토카인 분비를 CBA에 의해 상등액에서 측정하였다 (표 18). 자극없이는 검출 가능한 시토카인을 수득하지 못하였다 (표 18). mAb7 처리 후, hu-IFN-γ, hu-IL-2, 및 hu-TNF-α는 대조군과 비교해서 마우스 비장 구획과 간 구획 둘 다로부터 단리된 인간 림프구에서 상승되었다. 약한 생체외 자극 조건하에서는, mAb7 처리된 T 세포가 hu-IFN-γ 분비를, 음성 대조군으로부터 단리된 T 세포보다 상당히 더 높은 수준으로 증가시켰다 (p≤0.05). 강력한 생체외 자극 조건 하에서는, 모든 시토카인이 모든 군에서 유도되었지만, 음성 대조군으로부터 단리된 T 세포와 비교해서 mAb7 처리된 T 세포에서 추가로 증가되었다. 표 18은 각 군에서 5마리 상이한 마우스로부터 수집된 데이터를 나타낸다. 표 18에서, mAb7 대 음성 대조군을 비교하는 독립표본 t-시험에서 * p<0.05, ** p<0.01; aGvHD = 급성 이식편 대 숙주 질환; Hu = 인간; IFN-γ = 인터페론 감마; IL-2 = 인터류킨-2; Ino = 이오노마이신; N = 수; ns = 유의적이지 않음; P = P 값; PMA = 포르볼 미리스테이트 아세테이트; TNFα = 종양 괴사 인자 알파; 제노 = 이종.

<표 18>

이들 결과는 제노-aGvHD를 항-PD-1 항체 mAb7로 처리하면, 체중 손실, T 세포 증식, 및 인터페론 감마 (IFN-γ) 및 인터류킨-2 (IL-2)를 포함한 시토카인 분비 증가에 의해 측정된 바와 같이, NSG 마우스에서 제노-aGvHD 발생이 가속화되었다는 것을 입증해준다.

실시예 11: 항-PD-1 항체의 특징 규명

본 실시예는 표면 수용체 PD-1을 발현하는 세포 상에서 항-PD-1 항체 mAb7의 결합 친화도, 특이성, 및 리간드 차단 활성을 예시한 것이다.

mAb7, 음성 대조군 항체, 및 양성 대조군 항체가 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 생성되었다. 피코에리트린 (PE) 또는 브릴리언트 바이올렛 (BV)-786으로 일차 표지된 항-hu-PD-1 항체 클론 EH12.1, 및 동일한 염료로 표지된 이소형 대조군 항체는 BD 바이오사이언스 (미국 캘리포니아주 산호세)로부터 구입하였다. PE-표지된 항-마우스 PD-1 클론 J43 및 항-햄스터 IgG 이소형 대조군 항체는 애피메트릭스/이바이오사이언스 (미국 캘리포니아주 샌디에이고)로부터 구입하였다. 비오티닐화 hu-PD-L1 및 비오티닐화 hu-PD-L2 (CD273)는 ACRO 바이오시스템즈 (ACRO Biosystems; 미국 델라웨어주 뉴어크)로부터 구입하였다. 시노몰구스 원숭이 PD-L1 및 PD-L2는 크리에이티브 바이오마트(Creative BioMart®) 재조합 단백질 (미국 뉴욕주 셜리)로부터 구입하였고, 둘 다는 제조업자의 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이 알렉사 플루오르(Alexa Fluor®) 647 단백질 표지화 키트 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 이용하여 알렉사 플루오르® 647 염료로 사내에서 표지시켰다. 시노몰구스 원숭이 PD-L1 및 PD-L2를 대상으로 하여, 시노몰구스 원숭이 PD-1 발현성 세포주와의 결합에 관하여 시험하였다. 래트- 및 마우스-PD-L1-Fc-태그 (C-말단에서 인간 IgG1의 Fc 영역)는 크리에이티브 바이오마트® 재조합 단백질 (미국 뉴욕주 셜리)로부터 구입하였다. 비오티닐화 PD-L1 및 PD-L2의 검출은 스트렙타비딘 PE 또는 알로피코시아닌 (APC) (애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 이용하여 달성되었다. 래트 또는 마우스-PD-L1의 검출은 APC 표지된 Fc 감마 (Fcγ) 단편 특이적 당나귀-항-인간 애피니푸어 F(ab')₂ IgG [잭슨 임뮤노리서치 라보라토리즈 인크. (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)]를 이용하여 달성되었다.

일시적 형질감염을 위한 벡터

Hu-PD-1 발현 플라스미드 (pCMV6-진입 벡터 중)는 오리젠 테크놀로지, 인크. (OriGene Technologies, Inc; 미국 메릴랜드주 록빌), 카탈로그 번호 RC210364/수탁 번호 NM_005018로부터 구입하였다.

마우스-PD-1 발현 플라스미드 (pCMV6-진입 벡터 중)는 오리젠 테크놀로지, 인크. (미국 메릴랜드주 록빌), 카탈로그 번호 MR227347/수탁 번호 NM_008798로부터 구입하였다. 시노몰구스 원숭이-PD-1은 라이프 테크놀로지 (미국 캘리포니아주 샌디에이고), 로트 번호 1482149/수탁 번호 EF443145에 의해 코돈 최적화되고 합성되었다. 이를, C-말단 FLAG 태그를 C-말단에 부가한 마우스 카파 분비 시그널 서열과 동일 프레임 내에 있는, 독점적 화이자 (미국 캘리포니아주 샌프란시스코) 시토메갈로바이러스 (CMV) 기반 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다.

래트-PD-1 데옥시리보핵산 (DNA)은 수탁 번호 NM_001106927로부터의 서열에 따라서 맞춤 합성하고, 이를 라이프 테크놀로지 (미국 캘리포니아주 샌디에이고), 로트 번호 1598305로부터의 발현 벡터 pEF1V5-His의 BamHI-NotI 부위 내로 클로닝하였다.

안정적 형질감염을 위한 PD-1 발현 벡터

Hu-PD-1 DNA는 수탁 번호 NM_005018로부터의 서열에 따라서 맞춤 합성하고, 이를 인비트로젠 발현 벡터 pEF1V5-His B; 로트 번호 513478의 BamHI-NotI 부위 내로 클로닝하였다.

시노몰구스 원숭이-PD-1 DNA는 수탁 번호 EF443145에 따라서 맞춤 합성하고, 이를 인비트로젠 발현 벡터 pEF1V5-His B, 로트 번호 1482149의 BamHI-NotI 부위 내로 클로닝하였다.

마우스-PD-1 DNA는 수탁 번호 NM_008798에 따라서 맞춤 합성하고, 이를 인비트로젠 발현 벡터 pEF1V5-His B, 로트 번호 1513476의 BamHI-NotI 부위 내로 클로닝하였다.

모든 벡터는 합성하고, 이를 라이프 테크놀로지 (미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 의해 인비트로젠 발현 벡터 pEF1V5-His B 내로 클로닝하였다. 모든 벡터는 세포외 도메인, 막 도메인, 및 시토졸 도메인을 포함한 완전한 PD-1 서열을 함유한다. 모든 벡터는 PD-1의 C-말단에서 V5-6His 에피토프 태그를 코딩하였다. G418 술페이트 항생제를 이용한 선별을 위하여 네오마이신 내성 유전자가 각 벡터 내에 포함되었다.

HEK -293T 세포주를 이용한 일시적 형질감염

HEK-293T 세포는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC®; 미국 버지니아주 매너서스)으로부터 구입하고, 세포는 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 x 페니실린/스트렙토마이신 (Pen/Strep)이 보충된 둘벡코 변형된 이글 배지 (DMEM) [코닝 셀그로 (Corning CellGro; 미국 버지니아주 매너서스)]에서 유지시킨 다음, 37℃ 하에 6% 이산화탄소 (CO₂)에서 성장시켰다. 형질감염시키기 하루 전날, 세포를 트립신 처리하고, T75 플라스크 (피셔 사이언티픽; 미국 펜실베니아주 피츠버그)당 4 x 10⁶개의 세포로 플레이팅하였다. 형질감염 당일에는, 미리 가온시킨, 항생제가 없는 성장 배지가 기존 배지를 대체하였고, 세포를 6% CO₂ 중에서 37℃ 하에 2시간 더 인큐베이션하였다. 발현 벡터 또는 비어 있는(empty) 벡터 (10 μg)를 1.5 mL OptiMEM 배지 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 부가하였다. 이어서, 리포펙타민 2000 시약 (20 μl) (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 또 다른 1.5 ml OptiMEM에 부가하였다. 그 다음, 플라스미드 OptiMEM 튜브와 리포펙타민 OptiMEM 튜브를 함께 혼합하고, 실온하에 25분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, OptiMEM 혼합물을 적절한 배양 플라스크에 적가하고, 이 플라스크를 6% CO₂ 중에서 37℃ 하에 밤새 정치시켜 두었다. 그 다음 날, 배지를 상기 플라스크로부터 꺼내고, 완전 성장 배지로 대체하였다. 형질감염시킨지 48시간 후, 스템프로 액큐타제(StemPro Accutase) (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 이용하여 세포를 수거함으로써, PD-1 표면 발현에 영향을 미치지 않고서도 배양 표면으로부터 세포를 온호하게 제거할 수 있게 되었다. 이어서, 세포를 대상으로 하여 항체 결합성 분석과 형광 활성화 세포 분류법 (FACS) 분석을 수행하였다.

저캇 ( Jurkat ) 세포주를 이용한 안정적 형질감염

저캇 세포주 (클론 E6-1-TIB-152™, ATCC®; 미국 버지니아주 매너서스)를 사용하여 hu- 및 시노몰구스 원숭이-PD-1을 안정적으로 발현시켰다. 아막사 뉴클레오트랜스펙터 시스템 (론자; 미국 메릴랜드주 워커스빌)을 통한 전기천공을 이용하여 세포주를 생성시켰다. 제조업자의 프로토콜 (론자; 미국 메릴랜드주 워커스빌)에 의해 지시된 바와 같이 키트 V를 이용하여 화이자 (미국 캘리포니아주 샌프란시스코)에서 형질감염을 수행하였다. 세포를 10% FBS 및 1 x L-글루타민 (라이프 테크놀로지, 미국 캘리포니아주 샌디에이고)이 보충된, 성장 배지 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI)-1640에서 0.3 내지 1.0 x 10⁶개 세포/ml의 밀도로 5% CO₂ 중에서 37℃ 하에 유지시켰다. 각각의 벡터에 대하여, 2 μg/mL를 사용하여 2 x 10⁶개 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를, 안정적으로 형질감염된 세포의 선별 및 유지를 위하여 2주 동안 G418 술페이트 (600 μg/mL)의 존재하에 성장시켰다. 장기간 오염을 방지하기 위하여, 1 x Pen/Strep를 상기 배지에 부가하였다. 세포를 1:200의 희석율로 배양함으로써 단일 세포 클론을 선별하였다 (G418 술페이트 항생제가 보충된 200 μL 완전 배지 중 1개의 세포). 고 수준의 hu- 또는 시노몰구스 원숭이-PD-1을 발현하는 클론을 선별하기 위하여, PE-표지된-항-hu-PD-1 클론 EH12.1을 유동 세포계수법 검정에 사용하였다. BD LSR포르테사™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 샘플을 수집하였다. 플로조 소프트웨어 (플로조 LLC; 미국 오리건주 애슐랜드)를 이용하여 데이터 분석 및 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하였다. 검정 개발을 위하여 높은 MFI를 수반한 세포주를 선택하였다.

형질감염 후 48시간에, hu-, 시노몰구스 원숭이-, 마우스- 또는 래트-PD-1 벡터, 또는 비어 있는 벡터로 형질감염시킨 HEK-293T 세포를 수거하였다. mAb7을 이용하여 결합하기 이전에, 각각의 특이적 형질감염으로부터의 세포를 상업적 항체 또는 리간드로 시험하여, 적절한 PD-1 수용체가 세포 표면 상에 고도로 발현되었다는 것을 보장하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이의 경우에는, 교차 반응성 상업적 항-PD-1 항체 (클론 EH12.1)를 사용하였다. 마우스의 경우에는, 상업적 항-마우스-PD-1 항체 (클론 J43)를 사용하였다. 래트의 경우에는, 래트-PD-L1 리간드를 사용하였다 (상업적 래트 교차 반응성 항-PD-1 항체는 입수 가능하지 않았기 때문이다). 적절한 PD-1 발현을 확증한 후, 세포를 계수하고, 2 x 10⁵개 세포를 hu-Fc 수용체 결합 억제제 기능적 등급 혼합물 (1 μg/1 x 10⁶개 세포 하에서 Fc-γ 수용체 차단; 애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)과 함께 20분 동안 인큐베이션하고, 살아있는/죽은 염색을 위해 사용된 블루 형광성 반응성 염료를 혼합물 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 부가하였다. mAb7 또는 음성 대조군 (1 내지 0.00001 μg/mL) 항체의 일련의 희석물을 세포 혼합물에 부가한 다음, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있었다. 이어서, 세포를 세척하고, APC-표지된-당나귀-항-인간-애피니푸어 F(ab')₂ 단편 IgG, Fcγ 특이적 2차 항체 (1:100 희석도) (잭슨 임뮤노리서치 라보라토리즈 인크.; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)을 상기 혼합물에 가한 후, 세포를 얼음 상에서 30분 더 인큐베이션하였다. 데이터를 BD LSR포르테사™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세) 상에서 취득하고, 플로조 소프트웨어 (플로조 LLC; 미국 오리건주 애슐랜드)를 이용하여 분석하였다.

hu-, 시노몰구스 원숭이-, 또는 마우스-PD-1 수용체로 형질감염시킨 안정적 저캇 세포 클론을 생성시켰다. 각 종으로부터 이들 검정을 위해 선택된 PD-1 세포 클론은 유사한 양의 PD-1 수용체를 발현하였다 (대략 400,000개 수용체/세포; 수용체는 이들 세포주의 생성 동안 미리 정량화하였다). 적절한 PD-1 발현을 확증한 후, 세포를 계수하고, 2 x 10⁵개 세포를 hu-Fc 수용체 결합 억제제 기능적 등급 혼합물 (1 μg/1 x 10⁶개 세포 하에서 Fc-γ 수용체 차단; 애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)과 함께 20분 동안 인큐베이션하고, 살아있는/죽은 염색을 위해 사용된 블루 형광성 반응성 염료를 혼합물 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 부가하였다. mAb7, 양성 대조군 1, 양성 대조군 2, 또는 음성 대조군 항체 (IgG4 프레임워크를 이용한다)의 일련의 희석물 (1:3)을 상기 세포 혼합물에 부가한 다음, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있었다. 이어서, 세포를 세척하고, APC-표지된-당나귀-항-인간-애피니푸어 F(ab')₂ 단편 IgG, Fcγ 특이적 2차 항체 (1:100 희석도) (잭슨 임뮤노리서치 라보라토리즈 인크.; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)을 상기 혼합물에 가한 후, 세포를 얼음 상에서 30분 더 인큐베이션하였다. 데이터를 BD LSR포르테사™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세) 상에서 취득하였다. 플로조 소프트웨어 (플로조 LLC; 미국 오리건주 애슐랜드)를 이용하여 분석을 수행하고, 기하 평균을 계산하였다. 그래프 패드 프리즘 (로그 효능작용 대 반응 [결합])을 이용하여 EC₅₀ 값을 계산하였다.

고 수준의 PD-1 수용체를 발현하는 활성화된 T 세포를 생성시켰다. 상업적 시약 (인간 및 시노몰구스 원숭이의 경우에는, 항-hu-PD-1 클론 EH12.1이고, 마우스-PD-1의 경우에는 항-마우스-PD-1 클론 J43이며, 래트-PD-1의 경우에는 래트-PD-L1이다)을 이용하여 각각의 종으로부터 수득된, T 세포에 대한 적절한 PD-1 발현을 확증하였다. 세포를 계수하고, 1 x 10⁶개 세포를 hu-Fc 수용체 결합 억제제 기능적 등급 혼합물 (1 μg/1 x 10⁶개 세포 하에서 Fc-γ 수용체 차단; 애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)과 함께 20분 동안 인큐베이션하고, 살아있는/죽은 염색을 위해 사용된 블루 형광성 반응성 염료를 혼합물 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 부가하였다. mAb7의 일련의 희석물 (희석도 1:3)을 상기 세포 혼합물에 부가한 다음, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있었다. 이어서, 세포를 세척한 후, APC-표지된-당나귀-항-인간-애피니푸어 F(ab')₂ 단편 IgG, Fcγ 특이적 2차 항체 (1:100 희석도) (잭슨 임뮤노리서치 라보라토리즈 인크.; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 가하고, 세포를 얼음 상에서 30분 인큐베이션하였다. 데이터를 BD LSR포르테사™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세) 상에서 취득하였다. 플로조 소프트웨어 (플로조 LLC; 미국 오리건주 애슐랜드)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. 기하 평균을 계수하고, 그래프 패드 프리즘 (로그 효능작용 대 반응 [결합])을 이용하여 EC₅₀ 값을 계산하였다.

고 수준의 hu-PD-1을 발현하는 안정적 저캇 세포 클론을 본 검정에 선택하였다. 20 μg/mL의 비오티닐화-hu-PD-L1 또는 비오티닐화-hu-PD-L2는 이러한 세포주 상에서 모든 PD-1 수용체를 포화시켰다 (결합 적정 검정을 예고한 후). 따라서, 이러한 농도가 본 발명자들의 연구에서 최적의 농도로서 선택되었다. hu-PD-1 발현성 저캇 세포 (2 x 10⁵개)를 hu-Fc 수용체 결합 억제제 기능적 등급 혼합물 (1 μg/1 x 10⁶개 세포 하에서 Fc-γ 수용체 차단; 애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)과 함께 20분 동안 인큐베이션하고, 살아있는/죽은 염색을 위해 사용된 블루 형광성 반응성 염료를 혼합물 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 또한 부가하였다. 비오티닐화-hu-PD-L1 또는 비오티닐화-hu-PD-L2를 상기 세포에 20 μg/mL으로 부가한 직후, mAb7, 양성 대조군 1, 양성 대조군 2, 또는 음성 대조군 항체의 일련의 희석물 (모두 IgG4 주쇄 내에서 1:3 일련의 희석도)을 부가하였다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있었따. 이어서, 세포를 세척하고, PE 스트렙타비딘 (1:100 희석도) (애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 부가하고, 세포를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있었다. 이어서, 데이터를 BD LSR포르테사™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세) 상에서 취득하고, 플로조 소프트웨어 (플로조 LLC; 미국 오리건주 애슐랜드)를 이용하여 분석하며, 기하 평균을 계산하였다. 그래프 패드 프리즘 (로그 억제제 대 반응 [결합])을 이용하여 IC50 값을 계산하였다.

저캇 세포를 고 수준의 hu- 또는 시노몰구스 원숭이-PD-1 수용체로 안정적으로 형질감염시켰다. 시노몰구스 원숭이-PD-1 수용체를 발현하는 세포 (대략 400,000개 수용체/세포)를 본 검정에 선택하였다. 이들 세포를 이용하여 시노몰구스 원숭이-PD-L1 및 PD-L2 결합성을 시험하였는데, 그 결과는 20 μg/mL의 시노몰구스 원숭이 PD-L1 또는 PD-L2가, 상기 세포주와 결합될 때 상이한 농도 (50 ng/mL 내지 50 μg/mL)의 이들 리간드에 관하여 시험된 기하 평균을 근거로 하여 모든 PD-1 수용체를 포화시키기에 충분하였다는 것을 나타냈다. 시노몰구스 원숭이-PD-1 발현성 저캇 세포 (2 x 10⁵개)를 hu-Fc 수용체 결합 억제제 기능적 등급 혼합물 (1 μg/1 x 10⁶개 세포 하에서 Fc-γ 수용체 차단; 애피메트릭스/이바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)과 함께 20분 동안 인큐베이션하고, 살아있는/죽은 염색을 위해 사용된 블루 형광성 반응성 염료를 혼합물 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 부가하였다. 알렉사-플루오르®-647-시노몰구스 원숭이 PD-L1 또는 알렉사-플루오르®-647 시노몰구스 원숭이 PD-L2를 상기 세포에 20 μg/mL으로 부가한 직후, 상이한 농도의 mAb7, 양성 대조군 1, 양성 대조군 2, 또는 음성 대조군 항체 (IgG4 주쇄를 이용함, 1:3 일련의 희석도)를 부가하였다. 이어서, 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있었다. 세척한 후, 데이터를 BD LSR포르테사™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세) 상에서 취득하였다. 플로조 소프트웨어 (플로조 LLC; 미국 오리건주 애슐랜드)를 이용하여 데이터 분석을 수행하고, 기하 평균을 계산하였다. 그래프 패드 프리즘 (로그 억제제 대 반응 [결합])을 이용하여 IC50 값을 계산하였다.

스탠퍼드 혈액 센터 (미국 캘리포니아주 스탠퍼드)로부터 구입된 인간 연막을 PBS로 희석시키고, PBMC의 단리를 위하여 피콜 전반에 층을 이루게 하였다. PBMC를 PBS로 4회 세척하였다. 제조업자의 프로토콜 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 표시된 바와 같이 ACK 용해 완충제를 이용하여 RBC를 용해시켰다. RBC 용해 후, 세포를 한번 더 세척하고 5 x 10⁷개 세포/mL로 PBS에 희석시켰다. PBMC의 절반을 계수하고 동결 배지 (10% 디메틸 술폭시드 [DMSO]를 수반한 90% FBS)에서 동결시키고, 나머지 세포를 대상으로 하여 T 세포 정제를 수행하였다. 잔여 PBMC로부터, 제조업자의 프로토콜 (밀테니 바이오텍; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 기재된 바와 같이 음성 선별을 수반한 hu-특이적 Pan T 세포 단리 키트를 이용하여 T 림프구를 단리하였다.

ADCC 검정을 위하여, 신선하게 단리된 T 세포 (표적 세포)를 계수하고, 1 x 10⁶개 T 세포/mL를 혈청 무함유 X-비보 15 배지 (론자; 미국 메릴랜드주 워커스빌)에서 배양하며, 항-CD3 및 항-CD28 [T 세포 확장 및 활성화를 위한 디나비즈® 인간 T-활성화제 CD3/CD28 (라이프 테크놀로지; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)] 및 100 U/mL의 재조합-인간 (rh)-IL-2 (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미니애폴리스)로 코팅된 비드를 이용하여 자극하였다. 배양물을 5% CO₂ 중에서 37℃ 하에 72시간 동안 인큐베이션하였다. T 세포 활성화가 48시간 시점에 도달할 때, PBMC (동일한 공여자로부터 유래된 이펙터 세포)를 해동시키고, 계수한 다음, 10% FBS를 수반한 완전 RPMI-1640 배지에서 총 18 내지 24시간 동안 rh-IL-2 (50 U/mL 내지 5 x 10⁶개 세포/배양물 mL)로 자극하였다. 검정 당일에는, 양 세포 유형을 계수하고, 유동 세포계수법에 의해 시험하여 적절한 활성화를 보장하였다. T 세포에 대해서는, 고 수준의 PD-1의 발현을 조사하였고, PBMC에 대해서는, ADCC를 매개하는 수용체 CD16, CD32, 및 CD64 (각각 Fc-감마 수용체-[FcγR] III [a 및 b], FcγRIIa, FcγRI)의 발현 수준을 조사하였다. 세포를, 항체: mAb7 (IgG4 및 IgG1 프레임워크), 및 양성 대조군 항체를 부가한 후, 편평한 바닥 96-웰 조직 배양물 처리된 플레이트 (피셔 사이언티픽; 미국 펜실베니아주 피츠버그)에서 5:1 이펙터 대 표적 비 (이것이 최적의 비율이기 때문이다)로 플레이팅하였다. 모든 항체를 0.01 내지 100 μg/mL의 농도 하에 시험하였다 (1:10 일련의 희석도). 최대 용해를 평가하기 위한 표적 세포 단독, 이펙터 세포 단독, 및 항체의 부가를 수반하지 않으면서 5:1의 이펙터 대 표적 비를 포함한, 검정 대조군을 부가하였다. 검정 플레이트를 5% CO₂ 중에서 37℃ 하에 4시간 동안 인큐베이션하였다. 제조업자의 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이 시토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 [프로메가(Promega) US; 미국 위스콘신주 매디슨]을 이용하여 데이터를 분석하였다. 이러한 검정은 세포 용해시 방출되는 안정적 시토졸 효소인 락테이트 데히드로게나제 (LDH)를 정량적으로 측정하였다. 세포독성의 %는 다음과 같이 측정되었다: 100 x (실험적 LDH 방출 [OD490]/최대 LDH 방출 [OD490]). 표적 세포 단독 (T 세포)을 화학적으로 용해시켜 최대 사멸을 수득한 경우에 최대 LDH 방출이 계산되었다.

hu-, 시노몰구스 원숭이-, 마우스-, 및 래트-PD-1과 결합할 수 있는 mAb7의 능력은 일시적으로 형질감염된 HEK-293T 세포주, 1차 활성화된 T 세포, 및 hu-PD-1 또는 시노몰구스 원숭이- 및 마우스-PD-1로 안정적으로 형질감염된 저캇 세포를 포함하는, 유동 세포계수법 (FACS) 세포 기반 결합 검정을 이용하여 평가하였다. mAb7은 hu-PD-1과 시노몰구스 원숭이-PD-1 둘 다와 고 친화도로 결합하였고, 이들 2가지 종에 대한 유사한 EC₅₀ 값을 나타냈다 (이들 이소형에 대한 아미노산 서열은 분석된 종 중 가장 유사한 것이다). 그 데이터가 표 19, 20, 및 21에 요약되어 있다. 마우스-PD-1과의 결합은 고 농도의 mAb7에서만 달성되었는데, 이는 생물학적으로 관련이 없으며 친화성 성숙 과정 때문일 수 있다. 형질감염된 세포 또는 활성화된 1차 T 세포를 이용하는 경우에는 래트-PD-1에 대한 mAb7의 결합이 전혀 검출되지 않았다 (표 19).

<표 19>

FACS에 의한 1차 나이브(naive) 및 활성화된 T 세포 상에서의 mAb7 결합성

<표 20>

개개의 인간 및 시노몰구스 원숭이로부터 PD-1을 발현하는 것으로 수득된 활성화된 1차 T 세포에 대한 mAb7 결합성 (EC50)

표 20에서, 각각의 수는 상이한 공여자에 대한 mAb7 결합성에 관한 EC₅₀ 값을 나타낸다. 하단 열은 평균 ± sem을 나타낸다. sem = 표준 오차 평균.

<표 21>

인간 PD-1 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1을 수반한 안정적으로 형질감염된 저캇 세포주에 대한 mAb7 결합성 (EC50)

표 21에서, 각각의 수는 단일 실험에서 mAb7 결합성에 관한 EC₅₀ 값을 나타낸다. *은 평균 ± sem을 표시한다. mAb (IgG4) = IgG4 프레임워크를 수반한 모노클로날 항체; PD-1 = 프로그램된 사멸-1; sem = 표준 오차 평균.

hu-PD-1과 시노몰구스 원숭이-PD-1 둘 다에 대한 mAb7 결합성은 상이한 세포 기반 검정 시스템을 이용하여 조사하였다. 모든 시스템에서는, 상기 결합성이 양 종에서 고 친화도와 특이성을 수반하는 것으로 밝혀졌다. hu- 또는 시노몰구스 원숭이-PD-1을 발현하는 HEK-293T 일시적으로 형질감염된 세포주를 이용하면, mAb7은 MFI에 의해 표시된 바와 같이 유사한 결합 패턴을 나타내었다. 비어 있는 벡터 (비히클)로 형질감염된 모 세포주에서는 최소한의 결합이 관찰되거나 결합이 전혀 관찰되지 않았다.

활성화된 hu- 및 시노몰구스 원숭이-1차 T 세포에 대한 mAb7 결합성의 EC₅₀ 값은 세포 표면에서의 PD-1 발현 및 세포 생존력이 최적일 때, 활성화 후 72시간에 결정되었다 (표 19). EC₅₀ 값은 각각의 종의 2가지 상이한 공여자에 대하여 계산되었다 (표 20). hu-활성화된 T 세포와 시노몰구스 원숭이-활성화된 T 세포 둘 다에서는, 낮은 EC₅₀ 값이 수득되었고, EC₅₀ 값은 2가지 종 간에 근접한 것으로 밝혀졌는데, 각각 51.04 ± 5.07 pM 및 85.34 ± 11.73 pM였다 (평균 ± 표준 오차 평균 [sem]). 기준선 값 이상에서 음성 대조군 항체와의 결합은 관찰되지 않았다.

hu-PD-1 수용체를 최소한으로 발현하는 저캇 T 세포주를 이용하여, 안정적으로 형질감염된 hu-PD-1, 시노몰구스 원숭이-PD-1, 및 마우스-PD-1 세포주를 생성시켰다. 세포주를 서브클로닝하고, 고 수준의 hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이-PD-1 수용체를 발현하는 클론을 선별하였다 (세포당 대략 400,000개의 PD-1 수용체가 수득된 가장 높은 발현이었다). 이러한 시스템에서는, mAb7이 hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이-PD-1 수용체에 대하여 높은 친화도를 나타내었다. 상기 2가지 종에 대한 EC₅₀ 값은 1차 활성화된 T 세포 데이터와 유사하였는데 (표 21); hu-PD-1에 대한 EC₅₀은 64.725 ± 1.89이고, 시노몰구스 원숭이-PD-1에 대한 EC₅₀은 222.55 ± 41.3이다. 시노몰구스 원숭이-PD-1 발현성 세포에 대한 EC₅₀ 값은 2회의 실험 실행 사이에서 인간 EC₅₀ 값보다 더 가변적이었다. 2가지 종에 대한 데이터는 임의의 소정의 반복에서 사용된 양성 대조군 항체를 이용하여 수득된 데이터와 유사하였다 (표 21). 음성 대조군 항체는 실험 반복 중 어떠한 것에서도 기준선 값 이상의 결합을 나타내지 않았다. PD-L1 및 PD-L2 리간드가 PD-1 수용체와 상호 작용하는 것을 차단할 수 있는 mAb7의 능력을 PD-1-형질감염된 저캇 세포주 (hu-PD-1 또는 시노몰구스 원숭이-PD-1 중 하나를 발현함)에서 조사하였다. 이러한 검정에서는, 세포를 상이한 농도 하의 표지되지 않은 mAb7과 인큐베이션한 후에 포화 농도 하의 표지된 리간드와 함께 인큐베이션하였다. 표 22에 제시된 바와 같이, mAb7은 PD-L1 및 PD-L2 리간드가 PD-1 수용체와 결합하는 것을 용량 의존적 방식으로 억제하였다. PD-1에 대한 양성 대조군 항체는 거의 동등한 수준의 억제를 나타내었다. mAb7의 IC50은 hu-PD-1과 시노몰구스 원숭이-PD-1 간에 거의 동등한 수준이었다 (hu-PD-L1 및 hu-PD-L2에 대해서는, 각각 880.15 ± 289.85 및 1058 ± 355.4이고; 시노몰구스 원숭이-PD-L1 및 시노몰구스 원숭이-PD-L2에 대해서는, 각각 942.9 ± 110.1 및 839 ± 89.5이다). IC₅₀ 값의 요약이 표 22에 제공된다. 표 22에서, 각각의 수는 단일 실험에서 mAb7에 관한 IC₅₀ 값을 나타내고; *은 평균 ± sem을 표시하며; ‡은 괄호 안의 반복 수를 표시하고; mAb IgG4 = IgG4 프레임워크를 수반한 모노클로날 항체; PD-1 = 프로그램된 사멸-1; PD-L1 = 프로그램된 사멸-리간드 1; PD-L2 = 프로그램된 사멸-리간드 2; sem = 표준 오차 평균.

<표 22>

안정적으로 형질감염된 저캇 세포주 시스템을 이용하여 PD-L1 및 PD-L2에 대한 인간 PD-1 또는 시노몰구스 원숭이-PD-1 결합성의 차단을 위한 억제성 농도 (IC₅₀; pM)

mAb7은 보체 성분 1, q 하위구성분 (C1q) 및 CD64에 대한 약한 결합성을 나타내었다. C1q 및 CD64 (IgG4 프레임워크의 경우)는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 ADCC 각각에 대한 잠재적 대용물인 것으로 간주되었다. 시험관 내에서 T 세포의 사멸을 유도시킬 수 있는 mAb7의 능력의 결여를 추가로 연구하기 위하여, 고 수준의 PD-1 수용체를 발현하는 활성화된 T 세포 (표적 세포) 및 고 수준의 Fcγ 수용체를 발현하는 PBMC (이펙터 세포)를 이용하여 ADCC 검정을 수행하였다. 2명의 건강한 공여자로부터 세포를 선별하였다. mAb7 (그의 원래의 IgG4 프레임워크에서)은 양 공여자에서 최소한의 ADCC 활성을 나타내었다. ADCC 활성의 결여는 IgG4 프레임워크에서 항-PD-1 양성 대조군 항체에 의해 나타난 활성에 따른 것이었고, 둘 다는 음성 대조군 IgG4 항체와 유사하였다. 항-PD-1 (mAb7 또는 양성 대조군 항-PD-1 항체)을, 더 강력한 ADCC를 유도시키는 것으로 공지되어 있는 인간 IgG1 프레임워크에서 평가한 경우에는, 항-PD-1이 IgG4 프레임워크 내에 있는 경우보다 4배 이하로 더 높게 ADCC를 유도시켰다. 표적 세포 단독 (T 세포)을 화학적으로 용해시켜 최대 사멸 (사멸은 검정 계산에 따라서 각각의 공여자에 대한 100% 용해로서 추정되었다)을 수득한 경우에 최대 LDH 방출을 계산하였다. IgG1 프레임워크를 이용한 T 세포 용해는 활성화된 T 세포 상에서의 PD-1의 수준에 상응한데 (공여자 1의 PD-1 발현뿐만 아니라 용해는 공여자 2의 것보다 더 높다), 이는 검정의 정확도를 확증시켜 준다.

이들 결과는 항-PD-1 항체 mAb7이, 시험 시스템에 따라서 46 내지 270 pM의 범위의 EC₅₀ 값으로 세포 상에 발현된 hu- 및 시노몰구스 원숭이-PD-1 수용체와 고 친화도로 결합한다는 것을 입증시켜 준다. mAb7은 생리학적 농도에서 마우스-PD-1을 발현하는 세포 또는 래트-PD-1을 발현하는 세포와 결합하지 않았다. mAb7은 PD-L1 및 PD-L2 리간드가 세포 표면 PD-1 수용체와 상호 작용하는 것을 차단시켰는데; IC50 값은 500 내지 1000 pM의 범위였고, 이는 리간드 결합을 통하여 유도된 PD-1 기능을 차단하는 데 있어서의 그의 높은 길항작용 기능을 표시한다. mAb7은 그의 IgG4 프레임워크에서, 최소한의 항체-유도된 세포독성을 촉발시키거나 항체-유도된 세포독성을 전혀 촉발시키지 않았는데, 이는 IgG4 항체 특성과 일치한다.

실시예 12: 표지 없는 바이오센서 및 ELISA를 이용하여 PD-1, FcRn , FcγR , 및 C1Q와 결합하는 항-PD-1 항체 mAb7의 특징 규명

본 실시예는 SPR 바이오센서를 이용하여 독성학 연구와 관련된 각종 종으로부터의 재조합 정제된 PD-1에 대한 mAb7의 시험관내 결합 친화도를 예시한 것이다. FCGR 및 FcRn에 개입할 수 있는 mAb7의 Fc 영역의 능력을 또한 SPR에 의해 시험하여, 이것이 이소형-매칭된 대조군의 특성과 일치하는 특성을 나타냈다는 것을 확증하였다. ELISA에 의해서, mAb7 및 이소형-매칭된 대조군을 대상으로 하여, 인간 C1q와의 결합성에 관하여 검정하였다. PD-1과 그의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2 간의 결합 상호 작용을 차단시킬 수 있는 mAb7의 능력을 또한, 표지 없는 바이오센서에 의해 시험하여 그의 작용 기전을 뒷받침해주었다.

모든 동역학 및 친화도 실험은 달리 언급되지 않는 한, 인산염 완충 식염수 (PBS) + 0.01% 트윈 20 실행 완충제 중에서 25℃ 하에 수행하였다. 동역학 연구는 NLC (뉴트라비딘 코팅된) 칩이 장착된 SPR 프로테온 XPR36 바이오센서 (바이오래드; 미국 캘리포니아주 허큘리스) 상에서 수행되었다. 상기 프로테온을 또한 사용하여, 참조 표준으로서 mAb7에 대항한 적정을 통하여 hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이-PD-1 분석물의 활성 농도를 결정하였다. 여기서 사용된 단백질 분석물의 농도는 "활성" 또는 "공칭" 값을 지칭한다. 인간 Fc 감마 수용체 (hu-FCGR) I, 인간 신생아 Fc 수용체 (hu-FcRn) (로트 번호 R3091), 및 시노몰구스 원숭이-신생아 Fc 수용체 (시노몰구스 원숭이-FcRn) (로트 번호 JCR)의 활성 농도는, CM5 센서 칩이 장착된 비아코어 T200 (GE 라이프 사이언스; 미국 매사추세츠주 말버러) 상에서 무 보정 농도 분석 (CFCA) 실험을 이용하여 결정되었다. 다른 모든 분석물은, 적절한 흡광 계수를 이용하여 A280 nm에서의 흡광도에 의해 결정된 바와 같은 그들의 공칭 농도로 사용하였다. 오토샘플러가 장착된 키넥사 기기 3000 또는 3200 [사피다인(Sapidyne)]을 사용하여 실온 (대략 23℃)에서 용액 친화도를 결정하였다. 2차 검출 항체를 제조업자의 지시에 따라서 디라이트(DyLight) 650 (피어스 바이오테크놀로지; 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드)으로 표지시켰다. 면역글로불린 G (IgG) 비오티닐화는 제조업자의 지시에 따라서 EZ-링크™ 술포-NHS-LC-LC-비오틴 (피어스 바이오테크놀로지; 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드)을 이용하여 등몰 비의 링커:IgG에서 수행되었다. 달리 언급되지 않는 한, 피어스 IgG 용출 완충제 (pH 2.8)/4 M 염화나트륨 (NaCl)의 2:1 v/v 혼합물을 포함하는 "피어스/염" 칵테일을 이용하여, 고정화된 IgG를 재생시켰다.

mAb7에 대한 hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이-PD-1 (둘 다 His-태그부착된 단량체)의 결합 상호 작용은 PBS + 0.01% 트윈 20의 실행 완충제 및 PBS + 0.01% 트윈 20 + 1 g/l 소 혈청 알부민 (BSA)의 샘플 완충제에서 키넥사 방법을 이용하여 용액 중에서 결정되었다. 2가지 상이한 검정 포맷을 이용하였다. 첫 번째 검정 포맷에서는, mAb7을 일정한 농도의 hu-PD-1 (공칭 200, 400, 또는 4000 pM) 내로 적정하고, 샘플이 평형에 도달할 수 있게 하였다. 항-hu-PD-1 모노클로날 항체 mAb7 (비-의약품 안전성 시험실시기준 (GLP) 조건 [로트 번호 R5432] 하에 사내에서 제조됨)로 코팅시킨 (흡착에 의함) 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA) 비드 상에 유리 hu-PD-1을 포획하였다. 이어서, 비드 포획된 hu-PD-1을 0.5 μg/mL 디라이트-표지된 항-His mAb (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미니애폴리스)로 검출하였다. 두 번째 검정 포맷에서는, hu-PD-1 또는 시노몰구스 원숭이-PD-1을 일정한 농도의 mAb7 (20, 50, 100, 또는 500 pM) 내로 적정하고, 이들 혼합물을 평형시킬 수 있었다. 유리 mAb7과는 특이적으로 결합하지만 PD-1-포화된 mAb7과는 그렇지 않은 차단제 항-이디오타입 마우스 항-mAb7 mAb 1699.1H6으로 흡착시킨 PMMA 비드 상에 유리 mAb7을 포획하였다. 이어서, 비드 포획된 mAb7을 디라이트 표지된 염소 항-hu-IgG (H + L) (잭슨 임뮤노리서치 인크.; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 검출하였다. 모든 적정은 실험에 따라서 1 nM 내지 10 nM의 범위 내에 있는 상부 공칭 결합 부위 농도를 변화시키는 12번 2배 희석 시리즈로서 제조하였다. 샘플을 48시간 이하 동안 평형 상태로 두었고 실험 당 주사 용적을 조정하여 0.7 V 내지 1.9 V 범위의 전체 시그널을 수득하였다. 모든 샘플을 이중 주기로 주사하였다. 분석 소프트웨어의 N-곡선 도구를 사용하여 상호 작용 당 4가지 이하의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 포괄적으로 분석하고, mAb7의 농도를 참조 농도로서 사용하는 간단한 이분자 모델에 맞춘다. 포괄적인 분석은 K_D와 PD-1의 겉보기 활성 결합 부위 농도에 대한 최적의 값 (및 95% 신뢰 구간)을 보고한다.

용액 중의 mAb7에 대한 hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이-PD-1의 결합 친화도는 키넥사 검정을 이용하여 연구한 경우에 서로 구별할 수 없었고; 23℃에서의 겉보기 평형 해리 상수 (K_D) 값은 hu-PD-1 (반대의 검정 배향으로 연구한 경우)에 대해서 17 pM 또는 23 pM인 것으로 결정되었고, 시노몰구스 원숭이-PD-1에 대해서는 28 pM인 것으로 결정되었는데; 이들 3개 값은 통계상 서로 구별할 수 없었다. 이들 값은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 바이오센서 측정에 의해 반복되어, 25℃에서 hu-PD-1에 대한 42 pM의 K_D 값 및 시노몰구스 원숭이-PD-1에 대한 69 pM의 K_D 값이 산출되었고, 37℃에서는 hu-PD-1에 대한 109 pM의 K_D 값 및 시노몰구스 원숭이-PD-1에 대한 115 pM의 K_D 값이 산출되었다. mAb7은 0.9 μM의 K_D 값으로 마우스-PD-1과 결합하였고, SPR 동역학 분석을 이용하여 0.5 μM 하에 시험한 경우에는 래트-PD-1에 대한 결합이 검출되지 않았다. 표지 없는 바이오센서를 이용하여, mAb7가 hu-PD-1이 그의 자연 리간드인 인간 프로그램된 사멸-리간드 1 (hu-PD-L1) 및 인간 프로그램된 사멸-리간드 2 (hu-PD-L2)와 결합하는 것을 차단시킨다는 것을 입증하였다. SPR을 추가로 이용하여, mAb7이 이소형-매칭된 대조군과 동일한 동역학 및 특이성으로 인간 종과 시노몰구스 원숭이 종 둘 다로부터의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 일정 범위의 단편 결정화 가능한 (Fc) 감마 수용체 (FCGR)와 결합하였다는 것을 확증하였다. ELISA에 의해서는, mAb7이 보체 성분 1, q 하위구성분 (C1q)과 무시할만한 수준의 결합을 나타냈는데, 이는 이소형-매칭된 대조군의 행동과 일치한다. 전반적으로, mAb7은 hu-PD-1과 시노몰구스 원숭이-PD-1 둘 다와는 높은 결합 친화도 및 특이성으로 결합하지만, 마우스-PD-1에 대해서는 낮은 친화도로 결합하고 래트-PD-1에 대해서는 무시할만한 수준의 결합을 나타냈다.

표 23에는 mAb7과 각종 종으로부터의 PD-1의 상호 작용 분석에 대해 수득된 동역학 및 친화도 데이터가 요약되어 있다. mAb7은 키넥사 방법을 이용하여 23℃ 하의 용액 중에서 상호 작용을 측정한 경우에 통계상 구별할 수 없는 겉보기 친화도로 hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이-PD-1과 결합하였고; 겉보기 K_D 값은 hu-PD-1 (2개의 반대 검정 배향으로 연구한 경우)에 대해서 17 pM 및 23 pM이었고, 시노몰구스 원숭이-PD-1에 대해서는 28 pM이었다. 키넥사 값은 SPR에 의해 수행된 동역학 측정에 의해 보강되었는데, 이는 25℃에서 hu-PD-1에 대한 42 ± 11 pM (n = 10)의 겉보기 K_D 값 및 시노몰구스 원숭이-PD-1에 대한 69 ± 24 pM (n = 10)의 겉보기 K_D 값을 제공하였다. 37℃에서 SPR 측정한 결과, 25℃에서보다 2배 더 약한 친화도가 나타났는데; 37℃에서의 K_D 값은 hu-PD-1의 경우 109 ± 8 pM (n = 15)이고, 시노몰구스 원숭이-PD-1의 경우에는 115 ± 15 pM (n = 8)인 것으로 결정되었다. mAb7은 25℃에서 SPR에 의해 측정된 경우에 0.9 ± 0.1 μM (n = 5)의 겉보기 K_D로 마우스 PD-1과 결합하였는데, 이는 hu-PD-1에 대해서 보다 20,000배 더 약한 친화도에 상응한다. 25℃에서 SPR에 의해 0.5 μM 하에 시험된 경우에는 래트-PD-1에 대한 결합이 전혀 검출되지 않았지만, 래트-PD-1 단백질은 양성 대조군, 마우스-PD-L1 및 마우스-PD-L2와의 명백한 결합을 통하여 활성인 것으로 확증되었다. 키넥사 측정에 대한 K_D 값은 N 개의 독립적인 실험에 대한 포괄적 분석의 최적 적합도와 95% 신뢰 구간을 나타내지만, SPR 측정에 대한 K_D 값은 프로테온 NLC 센서 칩 상에서 n 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 표 23에서, h 또는 hu = 인간; k_a = 연합 속도 상수; k_d = 해리 속도 상수; K_D = 평형 해리 상수; 키넥사 = 동역학 배제 검정; mAb = 모노클로날 항체; Ms = 초당 몰; n = 수; ND = 결정되지 않음; PD-1 = 프로그램된 사멸-1; s = 초; SPR = 표면 플라스몬 공명; Temp = 온도; * mAb7과 hu-PD-1의 상호 작용은 문헌 [Bee et al., 2012]에 기재된 바와 같이 2개의 반대 검정 배향으로 연구되었다.

<표 23>

PF 06801591과 인간 PD-1, 시노몰구스 원숭이 PD-1, 및 마우스 PD-1의 상호 작용에 관하여 수득된 동역학 및 친화도 상수의 요약

표 24에는 인간과 시노몰구스 원숭이 둘 다로부터의 FCGR 및 FcRn을 포함하여 일정 범위의 Fc 수용체 전반에 걸쳐 mAb7에 대한 결합 동역학 및 특이성이 이소형-매칭된 이소형 대조군, hu-IgG4에 대하여 예상된 값을 반복하였다는 것을 보여준다. 예를 들어, mAb7은 이소형 대조군에 대한 177 ± 71 pM (n = 4)과 비교해서 25℃에서 146 ± 42 pM (n = 14)의 겉보기 K_D 값 (평균 ± 표준 편차)으로 hu-FCGRI와 결합하였다. 모든 다른 상호 작용은 약한 친화도를 특징으로 한다 (K_D 값 약 1 μM 이상). 동역학 분석은 FCGR의 경우에는 pH 7.4에서 및 FcRn의 경우에는 pH 5.9에서 프로테온 NLC 칩 상에서 수행하였다. 표 24에서, CD = 분화 클러스터; cy = 시노몰구스 원숭이; FCGR = Fc 감마 수용체; FcRn = 신생아 Fc 수용체; hu = 인간; k_a = 연합 속도 상수; k_d = 해리 속도 상수; K_D = 평형 해리 상수; Ms = 초당 몰; n = 수; s = 초.

<표 24>

또한, mAb7은 ELISA에 의해 C1q와 간신히 결합하였는데, 이는 이소형-매칭된 대조군, hu-IgG4의 행동과 일치한다 (데이터는 제시되지 않음). 그의 결합성은 인간 면역글로불린 G2 (hu-IgG2)의 낮은 결합성보다 훨씬 더 낮았다. 이와는 대조적으로, 양성 대조군인 hu-IgG1 및 인간 면역글로불린 G3 (hu-IgG3)은 높은 결합 시그널을 제공하였다. SPR 및 옥텟 바이오센서와 상이한 검정 포맷 (예비 혼합 검정 포맷과 고전적인 샌드위치 검정 포맷 둘 다) 둘 다를 이용하여, mAb7이, hu-PD-1이 그의 자연 리간드인 hu-PD-L1 및 hu-PD-L2와 결합하는 것을 차단시켰다는 것이 입증되었다.

이들 데이터는 mAb7이 고 친화도와 고 특이성으로 hu-PD-1과 결합한다는 것을 입증시켜 준다. 키넥사 방법을 이용하여 23℃ 하의 용액 중에서 측정된 경우, mAb7은 hu-PD-1 (대체 검정 배향으로 연구된 경우)에 대한 17 pM 및 23 pM 및 시노몰구스 원숭이-PD-1에 대한 28 pM의 통계상 구별할 수 없는 겉보기 K_D 값으로 hu-PD-1 및 시노몰구스 원숭이-PD-1과 결합하였다. mAb7은 마우스-PD-1과는 20,000배 더 약한 친화도 (25℃에서 SPR에 의한 0.9 μM의 겉보기 K_D)를 나타냈고, 0.5 μM 하에 시험된 경우에는 래트-PD-1과는 검출 가능한 결합이 없었다. mAb7 및 이소형-매칭된 대조군 hu-IgG4는 25℃에서 SPR에 의해 측정된 경우에, hu- 및 시노몰구스 원숭이-Fc 수용체의 패널에 대항하여 시험될 때 유사한 동역학 및 특이성으로 결합되었다. mAb7은 ELISA에 의해 시험된 경우에 무시할만한 시그널로 hu-C1q와 결합하였는데, 이는 hu-IgG4 이소형 대조군과 일치하고, 그의 결합성은 hu-IgG2의 결합성보다 훨씬 더 낮았다. mAb7이, hu-PD-1이 그의 자연 리간드인 hu-PD-L1 및 hu-PD-L2와 결합하는 것을 차단시킨다는 것이 입증되었다.

실시예 13: 항-PD-1 항체와 항-OX40 항체를 이용한 조합 치료

본 실시예는 결장암에 대한 마우스 모델에서 항-OX40 항체와 조합하여 항-PD-1 항체를 이용한 치료의 효과를 예시한 것이다.

본 연구를 위하여, C57B6/J 암컷 마우스 (6 내지 8주 생)에게 MC-38 뮤린 결장 종양 (등급 III 선암종)을 5x10⁵개 세포/마우스로 피하 접종하였다. 제10일에, 마우스를 무작위로 배정하고, 10 mg/kg 항-마우스-PD-1 및 1 mg/kg 항-마우스-OX-40으로 처리를 시작하였다. 처리는 항-OX40 항체 (1 mg/kg)의 경우에는 제10일, 제12일 및 제14일에 복강내 투여하고; 항-PD-1 항체 (10 mg/kg)의 경우에는 제10일, 제12일, 제14일, 제17일, 제23일 및 제25일에 복강내 투여하였다. 종양 용적을 1주 2회 측정하였다. 본 연구는 제34일에 종결되었다. 단일 시점에서 각각의 2개 군 간의 평균을 비교하기 위하여 2-방식 아노바를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 그 결과가 표 25에 요약되어 있다. 표 25에서, 값은 표시된 날에 군당 평균 8마리 마우스의 종양 용적 ± (표준 오차 평균) sem을 표시하고; N = 군당 마리수; mm² = 입방 밀리미터. 이소형 대조군은 항-OX40의 경우 1 mg/kg에서 및 항-PD-1의 경우 10 mg/kg에서 각 항체의 적절한 이소형을 포함하였다.

<표 25>

항-PD-1 항체와 항-OX40 항체를 이용한 처리 후 MC38 보유 마우스에서의 종양 용적

제24일에 시작하여, 모든 항-PD-1 항체 및/또는 항-OX-40 항체 처리군은 대조군과 비교해서 상당히 더 작은 종양 용적을 나타냈다 (표 25). 제24일에는, 조합 (항-PD-1 항체 + 항-OX40 항체) 처리군이 이소형 대조군과 비교해서 p≤0.0001의 유의성을 나타냈지만, 각각의 단일 항체 처리는 대조군과 비교해서 p≤0.01의 유의성을 나타냈다. 제34일에는, 모든 처리군이 대조군과 비교해서 p≤0.0001의 유의성을 나타냈다. 제34일에는, 조합 처리군이 항-PD-1 항체 단독 처리군 또는 항-OX-40 항체 단독 처리군과 비교해서 차이를 나타냈다. 이들 결과는 항-PD-1 항체와 항-OX40 항체 둘 다로 처리하면, 하나의 항체 단독을 이용한 처리와 비교해서 종양 성장이 느려졌다는 것을 입증해 준다.

실시예 14: 활성화된 T 세포 상에서 PD-1의 발현에 대한 백신의 효과

본 실시예는 항-CTLA4 모노클로날 항체 트레멜리무맙 (체크포인트 억제제)의 존재하에 CD3⁺CD4 (표 26) 및 CD3⁺CD8 T 세포 (표 27) 상에서 PD-1의 발현에 대한 인간 전립선 특이적 막 항원 (PSMA)을 발현하는 DNA 기반 백신의 효과를 예시한 것이다.

생체내 연구 과정. 중국 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaques)의 3개 군 (n=8/군)을 본 연구에 사용하였다. 군 1 및 2의 동물에게는 인간 PSMA의 아미노산 15-750을 코딩하는 AdC68 아데노바이러스 벡터 (서열식별번호: 44)를 함유하는 백신 (총 용량 2e11 VP에서)을 근육내 주사한 반면, 군 3의 동물에게는 백신을 접종하지 않았다. AdC68 아데노바이러스 벡터의 완전한 서열이 서열식별번호: 44에 제공된다. 또한, 백신 접종 직후, 군 2의 동물을 50 mg 항-CTLA4 모노클로날 항체 트레멜리무맙으로 피하 주사함으로써 처리하였다. 백신 접종하기 전 (프리) 및 후에 각 동물로부터의 전혈 샘플을 제9일, 제15일 및 제29일에 수집하고, 유동 세포계수법에 의해 CD3⁺CD4 및 CD3⁺CD8 T 세포를 발현하는 PD-1의 빈도에 관하여 분석하였다.

CD3+ CD4 및 CD8 T 세포 표현형검사. 신선하게 수집된 전혈 상에서 다색 유동 세포계수법 분석을 수행함으로써 백혈구 집단을 표현형 검사하였다. 간략하게 언급하면, 전혈을 실온에서 20분 동안 CD3-V500 (클론 SP34-2), CD4-BV605 (클론 L200), CD8-APC.H7 (클론 SK1), PD1-AF488 [클론 EH12.2H7, 바이오레전드(Biolegend)], PDL1-BV421 (클론 MIH1), Lag3-PE.Cy7 [클론 11E3, 노부스(Novus)], CD69-PE.텍사스 레드(Texas Red) [클론 TP1.553, 베크만 쿨터(Beckman Coulter)], TIM3-APC (클론 344823, R&D 시스템즈), CD20-PE.Cy5.5 (클론 2H7, 이바이오사이언스), CD14-AF700 (클론 M5E2), CD16-PE.Cy5 (클론 3G8), CD56-PerCP.Cy5.5 (클론 B159), 및 CD11c-PE (클론 SHCL3)를 함유하는 항체 칵테일로 염색하였다. 모든 항체는 달리 표시되지 않는 한 BD로부터 구입하였다. 샘플을 RBC 용해 완충제 (BD)로 처리하고, 세척하며, 50 ml의 액체 계수 비드 (BD)와 혼합하며, LSR 포르테사 (BD) 상에 획득하였다. 그 데이터는 플로조 [트리 스타 인크. (Tree Star Inc.; 미국)]를 이용하여 분석하였다. CD3⁺CD4 T 세포 상에서의 PD-1 발현 결과가 표 26에 제시되고, CD3⁺CD8 T 세포 상에서의 PD-1 발현 결과가 표 27에 제시된다. 백신 접종 후 9일에 PD-1의 유도가 관찰되었고, 백신 접종 후 제29일 정도에 나이브 동물 (군 3)에서 관찰된 수준으로 결정되었다. 이들 결과는 항-CTLA4 항체와 함께 제공된 백신 벡터가 비-인간 영장류 내의 CD3⁺ CD4 및 CD8 T 세포 상에서 PD-1 발현을 유발시킬 수 있다는 것을 표시한다.

<표 26>

시노몰구스 마카크에서 CD3⁺CD4 T 세포 상에서의 PD-1 발현 동역학

<표 27>

시노몰구스 마카크에서 CD3⁺CD8 T 세포 상에서의 PD-1 발현 동역학

실시예 15. 인간 PSMA를 발현하는 백신에 의해 유도된 항원-특이적 T-세포 반응에 대한 항-PD-1 항체의 효과

본 실시예는 시노몰구스 마카크에서 인간 PSMA를 발현하는 AdC68 아데노바이러스 벡터를 함유하는 백신에 의해 유도된 IFNγ CD4 및 CD8 T-세포 반응에 대한 항-PD1 항체의 효과를 예시한 것이다.

세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정. 간략하게 언급하면, 개개의 동물로부터의 PBMC를 각각의 항원의 전체 서열 전반에 걸쳐 11개 아미노산 정도가 중복되는 15량체 펩티드 라이브러리로부터의 펩티드의 풀 (각 펩티드 2 μg/ml)과 함께 공동 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 하에 약 16시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 염색하여 CD8⁺ T 세포로부터의 세포내 IFNγ 발현을 검출하고 고정시켰다. 세포를 유동 세포계수기 상에서 획득하였다. 반응의 빈도는 백만개 CD8⁺ T 세포당 IFNγ CD8⁺ T 세포의 수에 대해 정규화하였는데, 펩티드를 함유하지 않은 디메틸 술폭시드 대조군 웰 내에서의 반응은 공제하였다. 표에서의 항원 특이적 반응은 상응하는 항원 특이적 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다.

생체내 연구 과정. 간략하게 언급하면, 중국 시노몰구스 마카크의 5개 군 (n=8/군)에게 2e11 VP의 총 용량으로 인간 PSMA (hPSMA)의 아미노산 15-750을 코딩하는 AdC68 아데노바이러스 (서열식별번호: 44)를 함유하는 백신을 근육내 주사하였다. 군 2, 4 및 5에서의 백신 접종 직후에, 50 mg 항-CTLA4 모노클로날 항체 트레멜리무맙 및/또는 항-PD-1 모노클로날 항체 mAb7을 10 mg/kg으로 피하 (군 3 및 4) 또는 정맥내 (군 5) 투여하였다. PBMC를 각 동물로부터 단리하고, ICCS 검정을 수행하여 인간 PSMA 특이적 IFNγ CD4 (제9일 또는 제29일) 또는 CD8 T-세포 반응 (제29일)을 측정하였다. 완전한 길이의 인간 PSAM의 아미노산 서열이 서열식별번호: 42에 제공된다. 인간 PSMA의 아미노산 15-750을 발현하는 AdC68 아데노바이러스 벡터의 서열이 서열식별번호: 44에 제공된다.

결과. 그 결과가 표 29, 30, 및 31에 제시된다. 데이터는 항-CTLA4와 항-PD-1 둘 다가 개별적으로, 백신에 의해 유도된 IFNγ CD4 및 CD8 T-세포 반응의 빈도를 증가시킬 수 있다는 것을 입증해준다.

<표 28>

항원-특이적 IFNγ T-세포 반응을 유도시키기 위해 ELISpot 및 ICCS 검정에 사용된 펩티드 풀에 관한 펩티드 서열 정보

<표 29>

제9일에 백신에 의해 유도된 IFNγ CD8 T-세포 반응

<표 30>

제9일에 백신에 의해 유도된 IFNγ CD4 T-세포 반응

<표 31>

제29일에 백신에 의해 유도된 IFNγ CD4 T-세포 반응

실시예 16. 인간 전립선 특이적 막 항원 ( PSMA ), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 및 전립선 특이적 항원 (PSA)을 공동 발현하는 백신에 의해 유도된 IFNγ T-세포 반응에 대한 항-PD-1 항체의 효과

생체내 연구 과정. 간략하게 언급하면, 중국 시노몰구스 마카크의 3개 군 (n=4/군)을 본 연구에 사용하였다. 군 1의 동물에게는 비히클을 근육내 주사하였다. 군 2의 동물에게는 항-PD-1 모노클로날 항체 mAb7을 20 mg/kg으로 피하 투여하였다. 군 3의 동물은 6e11 VP의 총 용량으로, 3개의 인간 전립선 관련 항원 (PSMA, PSCA 및 PSA)을 공동 발현하는 AdC68 아데노바이러스 벡터 (벡터 AdC68W-734)를 함유하는 백신으로 처리한 직후, 150 mg 항-CTLA4 항체 트레멜리무맙 및 20 mg/kg의 항-PD-1 모노클로날 항체 mAb7을 피하 주사하였다. 주사한지 28일 후, 동물을 비히클 (군 1), 항-PD-1 모노클로날 항체 mAb7 20 mg/kg으로 피하 (군 2) 또는 전기천공에 의해 전달된 3개의 인간 전립선암 항원 (PSMA, PSCA 및 PSA)을 발현하는 DNA 플라스미드 (플라스미드 458)로 부스팅한 직후에, 150 mg 항-CTLA4 및 항-PD-1 모노클로날 항체 20 mg/kg (군 3)를 피하 주사하였다. 프라임 제1 주사 후 43일에, PBMC를 각 동물로부터 단리하고, ELISPOT 검정을 수행하여 PSMA, PSCA, 및 PSA 특이적, IFNγ T-세포 반응을 측정하였다.

본 연구에 사용된 벡터 AdC68W-734의 완전한 서열이 본 개시내용의 서열식별번호: 45 및 국제 출원 공보 WO2015/063647의 서열식별번호: 63에 제공된다. 벡터 AdC68W-734의 구축이 또한 WO2015/063647에 기재되어 있는데, 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다. AdC68W-734 벡터 및 플라스미드 458은 각각 (1) 서열식별번호: 42의 서열을 갖는 인간 PSMA의 아미노산 15-750을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, (2) 서열식별번호: 47의 서열을 갖는 인간 PSA의 아미노산 25-261을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 (3) 서열식별번호: 48의 완전한 길이의 인간 PSCA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

IFNγ ELISPOT 검정. 간략하게 언급하면, 개개의 동물로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 각각의 항원의 전체 서열 전반에 걸쳐 11개 정도의 아미노산이 중복되는 15량체 펩티드 라이브러리로부터의 펩티드의 풀 (각 펩티드 2 μg/ml)과 함께 이중으로 공동 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 하에 약 16시간 동안 인큐베이션한 다음, 제조업자의 지시에 따라서 세척하고 전개하였다. IFNγ 스폿 형성성 세포 (SFC)의 수를 CTL 판독기로 계수하였다. 이중치의 평균을 계산하고, 펩티드를 함유하지 않은 음성 대조군 웰의 반응을 공제하였다. 이어서, SFC 계수치를 정규화하여 1e6 PBMC당 반응을 기재하였다. 표에서 항원 특이적 반응은 상응하는 항원 특이적 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다.

결과. 표 33에 제시되는 ELISpot 결과는, 항-PD-1 항체 및 항-CTLA4 항체를 수반한 백신이 피하 접종된 동물은 적어도 하나의 전립선암 항원에 대한 IFNγ T-세포 반응에 있어서 강력한 증가를 나타냈지만, 비히클 군 (군 1) 또는 항-PD-1 항체 단독이 투여된 군 (군 2)에서는 이들 항원에 대한 IFNγ T-세포 반응이 없었다는 것을 입증해 준다.

<표 32>

항원-특이적 IFNγ T-세포 반응을 유도시키기 위해 ELISpot 및 ICCS 검정에 사용된 펩티드 풀에 관한 펩티드 서열 정보

<표 33>

시노몰구스 마카크에서 백신에 의해 유도된 항원-특이적 IFNγ ELISpot T-세포 반응에 대한 항-PD-1 항체의 효과

개시된 교시가 각종 적용, 방법, 키트 및 조성물을 참조로 하여 기재되긴 하였지만, 각종 변화 및 변형이 본원의 교시 및 다음 청구된 발명으로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 전술된 실시예는 개시된 교시를 보다 잘 예시하기 위해 제공된 것이고, 본원에 제시된 교시의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 교시가 이들 예시적인 실시양태 측면에서 기재되긴 하였지만, 통상의 기술자는 이들 예시적인 실시양태의 수많은 변동 및 변형이 과도한 실험없이도 가능하다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 이러한 모든 변동 및 변형은 본 교시의 범위 내에 있다.

본원에 인용된 모든 참고 문헌 (특허, 특허 출원, 서류, 텍스트 북 등 포함), 및 이미 그렇지 않은 정도까지 그에 인용된 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 포함된 문헌 및 유사한 물질 중 하나 이상 (정의된 용어, 용어 활용, 기재된 기술 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)이 본 출원과 상이하거나 상반되는 경우에는, 본 출원이 우선한다.

전술된 설명 및 실시예는 본 발명의 특정의 구체적 실시양태를 상세히 열거한 것이고, 본 발명자들에 의해 고려된 최상의 방식을 기재한 것이다. 그러나, 전술된 내용을 아무리 텍스트에 상세히 나타낼 수 있다 하더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가에 따라서 해석되어야 한다는 것을 인지할 것이다.

ATCC PTA-121183 20140429 ATCC PTA-121182 20140429

SEQUENCE LISTING <110> RINAT NEUROSCIENCE CORP. <120> ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> PC72121A <150> US 62/089,658 <151> 2014-12-09 <150> US 62/242,750 <151> 2015-10-16 <150> US 62/251,973 <151> 2015-11-06 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg 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gcggccacag ggacagctgg gtgttcggcg gcatcgaccc acagtctggc 1140 gccgctgtgg tgcacgagat cgtgcggtcc ttcggaaccc tgaagaaaga gggatggcgc 1200 cccagaagga ccatcctgtt cgccagctgg gacgccgagg aattcggcct gctgggatcc 1260 accgagtggg ccgaggaaaa ctccaggctg ctgcaggaac gcggcgtcgc ctacatcaac 1320 gccgactcct ccatcgaggg caactacacc ctgagggtgg actgcacccc cctgatgtac 1380 tccctggtgc acaacctgac caaagagctg aagtcccccg acgagggctt cgagggcaag 1440 tccctgtacg agtcctggac caagaagtcc ccatcccccg agttctccgg catgcccagg 1500 atctccaagc tgggctccgg caacgacttc gaggtgttct tccagaggct gggaatcgcc 1560 tccggcaggg ccagatacac caagaactgg gagacaaaca agttctccgg ataccccctg 1620 taccactccg tgtacgaaac ctacgagctg gtggaaaagt tctacgaccc catgttcaag 1680 taccacctga ccgtggccca agtccgcgga ggcatggtgt tcgagctggc caactccatc 1740 gtgctgccct tcgactgcag agactacgcc gtggtgctga ggaagtacgc cgacaaaatc 1800 tactccatct ccatgaagca cccccaggaa atgaagacct actccgtgtc cttcgactcc 1860 ctgttctccg ccgtgaagaa tttcaccgag atcgcctcca agttcagcga gaggctgcag 1920 gacttcgaca agtccaaccc aatcgtgctg aggatgatga acgaccagct gatgttcctg 1980 gaaagggcct tcatcgaccc cctgggcctg ccagacagac ccttctacag gcacgtgatc 2040 tacgccccat cctcccacaa caaatacgcc ggcgagtcct tccccggcat ctacgatgcc 2100 ctgttcgaca tcgagtccaa ggtggacccc tccaaggcct ggggcgaagt gaagaggcaa 2160 atctacgtgg ccgccttcac agtgcaagcc gctgccgaaa ccctgtccga ggtggcc 2217 <210> 44 <211> 33562 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60 aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120 gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180 tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240 aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300 gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360 gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420 tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttactactg taatagtaat caattacggg 480 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 540 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 600 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 660 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 720 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 780 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 840 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 900 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 960 cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 1020 tgtccctatc agtgatagag atctccctat cagtgataga gagtttagtg aaccgtcaga 1080 tccgctaggg taccgcgatc accatggcta gcgccagacg ccccagatgg ctgtgtgctg 1140 gcgctctggt gctggctggc ggcttcttcc tgctgggctt cctgttcggc tggttcatca 1200 agtcctccaa cgaggccacc aacatcaccc ccaagcacaa catgaaggcc tttctggacg 1260 agctgaaggc cgagaatatc aagaagttcc tgtacaactt cacccagatc ccccacctgg 1320 ccggcaccga gcagaacttc cagctggcca agcagatcca gtcccagtgg aaagagttcg 1380 gcctggactc cgtggaactg gcccactacg acgtgctgct gtcctacccc aacaagaccc 1440 accccaacta catctccatc atcaacgagg acggcaacga aatcttcaac acctccctgt 1500 tcgagccccc acccccaggc tacgagaacg tgtccgacat cgtgccccca ttctccgcct 1560 tcagtccaca aggcatgccc gagggcgacc tggtgtacgt gaactacgcc aggaccgagg 1620 acttcttcaa gctggaacgc gacatgaaga tcaactgctc cggcaagatc gtgatcgcca 1680 gatacggcaa ggtgttcagg ggcaacaaag tgaagaacgc ccagctggct ggggccaagg 1740 gcgtgatcct gtactccgac cccgccgact acttcgcccc aggcgtgaag tcctaccccg 1800 acggatggaa cctgccaggc ggcggagtgc agaggggcaa catcctgaac ctgaacggcg 1860 ctggcgaccc cctgacccca ggatacccag ccaacgagta cgcctacaga agaggaatcg 1920 ccgaggccgt gggcctgccc tctatcccag tgcaccccat cggctactac gacgcccaga 1980 aactgctgga aaagatgggc ggctccgccc cacccgactc ctcttggaga ggctccctga 2040 aggtgcccta caacgtgggc ccaggcttca ccggcaactt ctccacccag aaagtgaaga 2100 tgcacatcca ctccaccaac gaagtgacca ggatctacaa cgtgatcggc accctgagag 2160 gcgccgtgga acccgacaga tacgtgatcc tgggcggcca cagggacagc tgggtgttcg 2220 gcggcatcga cccacagtct ggcgccgctg tggtgcacga gatcgtgcgg tccttcggaa 2280 ccctgaagaa agagggatgg cgccccagaa ggaccatcct gttcgccagc tgggacgccg 2340 aggaattcgg cctgctggga tccaccgagt gggccgagga aaactccagg ctgctgcagg 2400 aacgcggcgt cgcctacatc aacgccgact cctccatcga gggcaactac accctgaggg 2460 tggactgcac ccccctgatg tactccctgg tgcacaacct gaccaaagag ctgaagtccc 2520 ccgacgaggg cttcgagggc aagtccctgt acgagtcctg gaccaagaag tccccatccc 2580 ccgagttctc cggcatgccc aggatctcca agctgggctc cggcaacgac ttcgaggtgt 2640 tcttccagag gctgggaatc gcctccggca gggccagata caccaagaac tgggagacaa 2700 acaagttctc cggatacccc ctgtaccact ccgtgtacga aacctacgag ctggtggaaa 2760 agttctacga ccccatgttc aagtaccacc tgaccgtggc ccaagtccgc ggaggcatgg 2820 tgttcgagct ggccaactcc atcgtgctgc ccttcgactg cagagactac gccgtggtgc 2880 tgaggaagta cgccgacaaa atctactcca tctccatgaa gcacccccag gaaatgaaga 2940 cctactccgt gtccttcgac tccctgttct ccgccgtgaa gaatttcacc gagatcgcct 3000 ccaagttcag 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ttgaatgatt cgaactagtt cctgaggtaa atccaagcca gccatgataa 33540 agagctcgcg cagagcgccc tccaccggca ttcttaagca caccctcata attccaagat 33600 attctgctcc tggttcacct gcagcagatt gacaagcgga atatcaaaat ctctgccgcg 33660 atccctgagc tcctccctca gcaataactg taagtactct ttcatatcct ctccgaaatt 33720 tttagccata ggaccaccag gaataagatt agggcaagcc acagtacaga taaaccgaag 33780 tcctccccag tgagcattgc caaatgcaag actgctataa gcatgctggc tagacccggt 33840 gatatcttcc agataactgg acagaaaatc gcccaggcaa tttttaagaa aatcaacaaa 33900 agaaaaatcc tccaggtgga cgtttagagc ctcgggaaca acgatgaagt aaatgcaagc 33960 ggtgcgttcc agcatggtta gttagctgat ctgtagaaaa aacaaaaatg aacattaaac 34020 catgctagcc tggcgaacag gtgggtaaat cgttctctcc agcaccaggc aggccacggg 34080 gtctccggcg cgaccctcgt aaaaattgtc gctatgattg aaaaccatca cagagagacg 34140 ttcccggtgg ccggcgtgaa tgattcgaca agatgaatac acccccggaa cattggcgtc 34200 cgcgagtgaa aaaaagcgcc cgaggaagca ataaggcact acaatgctca gtctcaagtc 34260 cagcaaagcg atgccatgcg gatgaagcac aaaattctca ggtgcgtaca aaatgtaatt 34320 actcccctcc tgcacaggca gcaaagcccc cgatccctcc aggtacacat acaaagcctc 34380 agcgtccata gcttaccgag cagcagcaca caacaggcgc aagagtcaga gaaaggctga 34440 gctctaacct gtccacccgc tctctgctca atatatagcc cagatctaca ctgacgtaaa 34500 ggccaaagtc taaaaatacc cgccaaataa tcacacacgc ccagcacacg cccagaaacc 34560 ggtgacacac tcaaaaaaat acgcgcactt cctcaaacgc ccaaaactgc cgtcatttcc 34620 gggttcccac gctacgtcat caaaacacga ctttcaaatt ccgtcgaccg ttaaaaacgt 34680 cacccgcccc gcccctaacg gtcgcccgtc tctcagccaa tcagcgcccc gcatccccaa 34740 attcaaacac ctcatttgca tattaacgcg cacaaaaagt ttgaggtata ttattgatga 34800 tgg 34803 <210> 46 <211> 7182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60 agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120 agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180 tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240 tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300 ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360 tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420 aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480 aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540 aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600 aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660 tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720 ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780 ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840 tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900 acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960 ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020 aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080 cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140 cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200 tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260 ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320 actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380 tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440 accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500 gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560 atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620 ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680 gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740 actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800 ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860 tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920 tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980 gaacatggct agcattgtgg gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt 2040 gcttgtggcc tctcgtggca gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt 2100 cctcacagct gcccactgca tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagctt 2160 gtttcatcct gaagacacag gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct 2220 ctacgatatg agcctcctga agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagccacga 2280 cctcatgctg ctccgcctgt cagagcctgc cgagctcacg gatgctgtga aggtcatgga 2340 cctgcccacc caggagccag cactggggac cacctgctac gcctcaggct ggggcagcat 2400 tgaaccagag gagttcttga ccccaaagaa acttcagtgt gtggacctcc atgttatttc 2460 caatgacgtg tgtgcgcaag ttcaccctca gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtgctgg 2520 acgctggaca gggggcaaaa gcacctgctc gggtgattct gggggcccac ttgtctgtaa 2580 tggtgtgctt caaggtatca cgtcatgggg cagtgaacca tgtgccctgc ccgaaaggcc 2640 ttccctgtac accaaggtgg tgcattaccg gaagtggatc aaggacacca tcgtggccaa 2700 ccccggatcc gaaggtaggg gttcattatt gacctgtgga gatgtcgaag aaaacccagg 2760 acccgctagc aaggctgtgc tgcttgccct gttgatggca ggcttggccc tgcagccagg 2820 cactgccctg ctgtgctact cctgcaaagc ccaggtgagc aacgaggact gcctgcaggt 2880 ggagaactgc acccagctgg gggagcagtg ctggaccgcg cgcatccgcg cagttggcct 2940 cctgaccgtc atcagcaaag gctgcagctt gaactgcgtg gatgactcac aggactacta 3000 cgtgggcaag aagaacatca cgtgctgtga caccgacttg tgcaacgcca gcggggccca 3060 tgccctgcag ccggctgccg ccatccttgc gctgctccct gcactcggcc tgctgctctg 3120 gggacccggc cagctaggat cccagaccct gaactttgat ctgctgaaac tggcaggcga 3180 tgtggaaagc aacccaggcc caatggcaag cgcgcgccgc ccgcgctggc tgtgcgctgg 3240 ggcgctggtg ctggcgggtg gcttctttct cctcggcttc ctcttcgggt ggtttataaa 3300 atcctccaat gaagctacta acattactcc aaagcataat atgaaagcat ttttggatga 3360 attgaaagct gagaacatca agaagttctt atataatttt acacagatac cacatttagc 3420 aggaacagaa caaaactttc agcttgcaaa gcaaattcaa tcccagtgga aagaatttgg 3480 cctggattct gttgagctgg cacattatga tgtcctgttg tcctacccaa ataagactca 3540 tcccaactac atctcaataa ttaatgaaga tggaaatgag attttcaaca catcattatt 3600 tgaaccacct cctccaggat atgaaaatgt ttcggatatt gtaccacctt tcagtgcttt 3660 ctctcctcaa ggaatgccag agggcgatct agtgtatgtt aactatgcac gaactgaaga 3720 cttctttaaa ttggaacggg acatgaaaat caattgctct gggaaaattg taattgccag 3780 atatgggaaa gttttcagag gaaataaggt taaaaatgcc cagctggcag gggccaaagg 3840 agtcattctc tactccgacc ctgctgacta ctttgctcct ggggtgaagt cctatccaga 3900 tggttggaat cttcctggag gtggtgtcca gcgtggaaat atcctaaatc tgaatggtgc 3960 aggagaccct ctcacaccag gttacccagc aaatgaatat gcttataggc gtggaattgc 4020 agaggctgtt ggtcttccaa gtattcctgt tcatccaatt ggatactatg atgcacagaa 4080 gctcctagaa aaaatgggtg gctcagcacc accagatagc agctggagag gaagtctcaa 4140 agtgccctac aatgttggac ctggctttac tggaaacttt tctacacaaa aagtcaagat 4200 gcacatccac tctaccaatg aagtgacaag aatttacaat gtgataggta ctctcagagg 4260 agcagtggaa ccagacagat atgtcattct gggaggtcac cgggactcat gggtgtttgg 4320 tggtattgac cctcagagtg gagcagctgt tgttcatgaa attgtgagga gctttggaac 4380 actgaaaaag gaagggtgga gacctagaag aacaattttg tttgcaagct gggatgcaga 4440 agaatttggt cttcttggtt ctactgagtg ggcagaggag aattcaagac tccttcaaga 4500 gcgtggcgtg gcttatatta atgctgactc atctatagaa ggaaactaca ctctgagagt 4560 tgattgtaca ccgctgatgt acagcttggt acacaaccta acaaaagagc tgaaaagccc 4620 tgatgaaggc tttgaaggca aatctcttta tgaaagttgg actaaaaaaa gtccttcccc 4680 agagttcagt ggcatgccca ggataagcaa attgggatct ggaaatgatt ttgaggtgtt 4740 cttccaacga cttggaattg cttcaggcag agcacggtat actaaaaatt gggaaacaaa 4800 caaattcagc ggctatccac tgtatcacag tgtctatgaa acatatgagt tggtggaaaa 4860 gttttatgat ccaatgttta aatatcacct cactgtggcc caggttcgag gagggatggt 4920 gtttgagctg gccaattcca tagtgctccc ttttgattgt cgagattatg ctgtagtttt 4980 aagaaagtat gctgacaaaa tctacagtat ttctatgaaa catccacagg aaatgaagac 5040 atacagtgta tcatttgatt cacttttttc tgcagtaaag aattttacag aaattgcttc 5100 caagttcagt gagagactcc aggactttga caaaagcaac ccaatagtat taagaatgat 5160 gaatgatcaa ctcatgtttc tggaaagagc atttattgat ccattagggt taccagacag 5220 gcctttttat aggcatgtca tctatgctcc aagcagccac aacaagtatg caggggagtc 5280 attcccagga atttatgatg ctctgtttga tattgaaagc aaagtggacc cttccaaggc 5340 ctggggagaa gtgaagagac agatttatgt tgcagccttc acagtgcagg cagctgcaga 5400 gactttgagt gaagtagcct aaagatctgg gccctaacaa aacaaaaaga tggggttatt 5460 ccctaaactt catgggttac gtaattggaa gttgggggac attgccacaa gatcatattg 5520 tacaaaagat caaacactgt tttagaaaac ttcctgtaaa caggcctatt gattggaaag 5580 tatgtcaaag gattgtgggt cttttgggct ttgctgctcc atttacacaa tgtggatatc 5640 ctgccttaat gcctttgtat gcatgtatac aagctaaaca ggctttcact ttctcgccaa 5700 cttacaaggc ctttctaagt aaacagtaca tgaaccttta ccccgttgct cggcaacggc 5760 ctggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa cccccactgg ctggggcttg gccataggcc 5820 atcagcgcat gcgtggaacc tttgtggctc ctctgccgat ccatactgcg gaactcctag 5880 ccgcttgttt tgctcgcagc cggtctggag caaagctcat aggaactgac aattctgtcg 5940 tcctctcgcg gaaatataca tcgtttcgat ctacgtatga tctttttccc tctgccaaaa 6000 attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 6060 ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg aattctgcat 6120 taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 6180 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6240 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6300 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 6360 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 6420 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6480 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6540 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 6600 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6660 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 6720 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 6780 tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 6840 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6900 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6960 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 7020 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 7080 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 7140 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tc 7182 <210> 47 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly 1 5 10 15 Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30 Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45 Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu 65 70 75 80 Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe 85 90 95 Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125 Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln 130 135 140 Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile 145 150 155 160 Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu 165 170 175 His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val 180 185 190 Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr 195 200 205 Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln 210 215 220 Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro 225 230 235 240 Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr 245 250 255 Ile Val Ala Asn Pro 260 <210> 48 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln 1 5 10 15 Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn 20 25 30 Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys 35 40 45 Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys 50 55 60 Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly 65 70 75 80 Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly 85 90 95 Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu 115 120 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21

Claims (43)

1. PD-1과 특이적으로 결합하고;
   서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4; 서열식별번호: 5; 및 서열식별번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH)의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1), VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및
   서열식별번호: 2; 서열식별번호: 7; 서열식별번호: 8; 및 서열식별번호: 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL
   을 포함하는, 단리된 길항제 항체.
2. 제1항에 있어서,
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
   서열식별번호 13, 14, 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
   을 포함하는, 단리된 길항제 항체.
3. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 3, 4, 5, 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 단리된 길항제 항체.
4. 제3항에 있어서, 서열식별번호: 2, 7, 8, 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 길항제 항체.
5. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 3, 4, 5, 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열식별번호: 2, 7, 8, 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 길항제 항체.
6. 제5항에 있어서, 서열식별번호: 29 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 길항제 항체.
7. 제5항에 있어서, 불변 영역을 포함하는, 단리된 길항제 항체.
8. 제7항에 있어서, IgG₂, IgG_2Δa, IgG₄, IgG_4Δb, IgG_4Δc, IgG₄ S228P, IgG_4Δb S228P, 및 IgG_4Δc S228P로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형을 갖는, 단리된 길항제 항체.
9. 제7항에 있어서, 불변 영역이 IgG₄ S228P인, 단리된 길항제 항체.
10. 제1항에 있어서, 항체의 각각의 CDR이, 카바트 정의, 코티아 정의, 카바트 정의와 코티아 정의의 조합, AbM 정의, 또는 CDR의 접촉 정의에 따라서 정의되는 것인, 단리된 길항제 항체.
11. 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 단리된 항-PD-1 항체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포로부터의 IFNγ 및/또는 TNF 분비를 증진시키는, 단리된 항체.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 증식을 증진시키는, 단리된 항체.
14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 성장을 억제하는, 단리된 항체.
15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 PD-1 및 마우스 PD-1과 결합하는, 단리된 항체.
16. 제15항에 있어서, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 25℃에서 0.73 nM의 친화도로 인간 PD-1과 결합하는, 단리된 항체.
17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는, 단리된 세포주.
18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는, 단리된 핵산.
19. 제18항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
20. 제19항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.
22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 재조합적으로 생산하는 세포주를, 항체가 생산되는 조건하에 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-PD-1 길항제 항체의 생산 방법.
23. 서열식별번호: 29 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포주를, 항체가 생산되는 조건하에 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-PD-1 길항제 항체의 생산 방법.
24. 제23항에 있어서, 항체의 중쇄 및 경쇄가 별개의 벡터 상에서 코딩되는 것인 방법.
25. 제23항에 있어서, 항체의 중쇄 및 경쇄가 동일한 벡터 상에서 코딩되는 것인 방법.
26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
27. 제26항의 제약 조성물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 키트.
28. 개체에서 암과 연관된 한 가지 이상의 증상이 완화되도록 하기 위해 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
29. 제28항에 있어서, 암이 위암, 육종, 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 두경부암, 편평 세포 두경부암, 흉선암, 상피암, 타액선암, 간암, 갑상선암, 폐암, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 다발성 골수종, 신세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 구강암, 피부암, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
30. 제28항에 있어서, 개체가 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평 세포 두경부암 (SCHNC), 난소 암종, 육종, 또는 재발성 또는 불응성 고전적 호지킨 림프종 (cHL)이 있는, 기존에 치료받은 성인 환자인 제약 조성물.
31. 제28항에 있어서, 항체가 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 투여량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
32. 제31항에 있어서, 항체가 7, 14, 21, 또는 28일마다 1회 투여되는 것인 제약 조성물.
33. 제32항에 있어서, 항체가 정맥내 또는 피하 투여되는 것인 제약 조성물.
34. 제28항에 있어서, 유효량의 제2의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
35. 제34항에 있어서, 제2의 치료제가 항-CTLA4 항체, 항-4-1BB 항체, 제2의 PD-1 길항제, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 티로신 키나제 억제제, 및 ALK 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
36. 제35항에 있어서, 티로신 키나제 억제제가 악시티닙(axitinib) 또는 팔보시클립(palbociclib)인 제약 조성물.
37. 제35항에 있어서, ALK 억제제가 수니티닙(sunitinib) 또는 크리조티닙(crizotinib)인 제약 조성물.
38. (1) 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체, 및 (2) 암세포에 대항하여 면역 반응을 유발시킬 수 있는 유효량의 백신을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
39. 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암을 치료하기 위하여 대상체에게 투여된 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증강시키기 위한 제약 조성물.
40. 제38항에 있어서, 암이 유방암, 위암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
41. 제38항에 있어서, 유효량의 하나 이상의 다른 면역 조정제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
42. 제41항에 있어서, 다른 면역 조정제가 단백질 키나제 수용체 억제제, CTLA-4 길항제, CD40 효능제, 및 TLR9 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
43. 삭제

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