ES2929721T3 - Anticuerpos anti-PD-1 y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

El presente descubrimiento proporciona anticuerpos antagonizantes que se unen a la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y métodos para usar los mismos. Los anticuerpos anti-PD-1 se pueden usar terapéuticamente solos o en combinación con otras terapias para tratar el cáncer y otras enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-PD-1 y procedimientos de uso de los mismos
Campo
La presente invención se refiere a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa que se unen a PD-1. La invención se refiere además a composiciones que comprenden anticuerpos contra PD-1, y anticuerpos anti-PD-1 para su uso en procedimientos de tratamiento del cáncer.
Antecedentes
PD-1 es un receptor transmembrana de tipo I de 50-55 kDa que se identificó originalmente en una línea de células T sometidas a apoptosis inducida por activación. PD-1 se expresa en las células T, las células B y los macrófagos. Los ligandos de pD-1 son los miembros de la familia B7 PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (B7-DC).
PD-1 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) que contiene un único dominio tipo Ig V en su región extracelular. El dominio citoplásmico de PD-1 contiene dos tirosinas, con la tirosina más próxima a la membrana (VAYEEL en PD-1 de ratón) situada dentro de un ITIM (motivo inhibidor con base en tirosina de inmunorreceptor). La presencia de un ITIM en PD-1 indica que esta molécula funciona para atenuar la señalización del receptor de antígeno mediante el reclutamiento de fosfatasas citoplasmáticas. Las proteínas PD-1 humana y murina comparten aproximadamente 60 % de identidad de aminoácidos con la conservación de cuatro posibles sitios de N-glicosilación, y residuos que definen el dominio Ig-V. El ITIM en la región citoplasmática y el motivo similar al ITIM que rodea la tirosina carboxi-terminal también se conservan entre los ortólogos humanos y murinos.
La inmunoterapia contra el cáncer ha implicado tradicionalmente procedimientos complicados que utilizan células y preparaciones individualizadas y que requieren mucho tiempo. Recientemente, la inmunoterapia contra el cáncer con base en anticuerpos monoclonales, que se basa en la interrupción de las señales supresoras que se transmiten al sistema inmunitario adaptativo, se ha mostrado prometedora en la clínica dentro del marco de la inmunoterapia sistémica disponible. Sin embargo, existe una necesidad continua en la técnica de obtener tratamientos más seguros y eficaces para el cáncer.
El documentoWO2014/179664 divulga un polipéptido aislado de cadena pesada de inmunoglobulina y un polipéptido aislado de cadena ligera de inmunoglobulina que se une a una proteína PD-1.
Sumario
Se proporcionan anticuerpos que interactúan selectivamente con PD-1. Está demostrado que ciertos anticuerpos anti-PD-1 son eficaces in vivo para prevenir y/o tratar el cáncer. Ventajosamente, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento se unen a la PD-1 humana, de mono cinomolgo y de ratón. También ventajosamente, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento son eficaces in vivo para estimular la proliferación de células T.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos antagonistas aislados que se unen específicamente a PD-1 y evitan o reducen el efecto biológico de PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. La invención divulgada en el presente documento está dirigida a anticuerpos que se unen a PD-1.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad VH uno (CDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14 o 15, una VH Cd R2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17, 24, 25, 27, 28, 35 o 36, una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 18, 23, 26 o 37; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:10, 22, 30 o 32, una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, 20 o 33 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, 21, 31 o 34.
En algunas realizaciones, la región VH comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, 4, 5 o 6 y/o la región VL comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 7, 8 o 9. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 39 y/o una cadena pesada que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 29 o 38. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región VH producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-121183. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región VL producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-121182.
En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante. En algunas realizaciones, el anticuerpo es de la subclase humana IgG2, IgG2áa, IgG3, IgG4, IgG4áb, IgG4ác, IgG4 S228P, IgG4áb S228P, y IgG4ác S228P En algunas realizaciones, el anticuerpo es del isotipo IgG4 y comprende una bisagra estabilizada, por ejemplo, S228P.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-1 y compite y/o se une al mismo epítopo de PD-1 que los anticuerpos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento promueve la secreción de IFNy y/o TNF de las células T.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento promueve la proliferación de células T.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento inhibe el crecimiento del tumor.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento se une a la PD-1 humana y a la PD-1 de ratón.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo PD-1 como se describe en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo PD-1 como se describe en el presente documento. En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una célula huésped aislada que produce recombinantemente un anticuerpo PD-1 como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo antagonista anti-PD-1, comprendiendo el procedimiento: cultivar una línea celular que produce recombinantemente el anticuerpo como se describe en el presente documento bajo condiciones en las que se produce el anticuerpo; y recuperar el anticuerpo.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo antagonista anti-PD-1, comprendiendo el procedimiento : cultivar una línea celular que comprende ácido nucleico que codifica un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 29 o 38 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 39 bajo condiciones en las que se produce el anticuerpo; y recuperar el anticuerpo.
En algunos aspectos de la divulgación, las cadenas pesadas y ligeras se codifican en vectores separados. En otros aspectos, las cadenas pesadas y ligeras están codificadas en el mismo vector.
En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo anti-PD1 o la composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto que necesita el mismo. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, sarcoma, linfoma, leucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer tímico, cáncer epitelial, cáncer salival, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, glioma, leucemia, mieloma múltiple, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer oral, cáncer de piel y melanoma. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente adulto previamente tratado con melanoma localmente avanzado o metastásico, cáncer de cabeza y cuello de células escamosas (SCHNC), carcinoma de ovario, sarcoma o linfoma de Hodgkin clásico (cHL) recidivante o refractario. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser un cáncer resistente al platino y/o refractario al platino, tal como, por ejemplo, un cáncer de ovario resistente al platino y/o refractario, un cáncer de mama resistente al platino y/o refractario, o un cáncer de pulmón resistente al platino y/o refractario. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-1 se administra a una dosificación de aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, aproximadamente 3,0 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se administra una vez cada 7, 14, 21 o 28 días. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se administra por vía intravenosa o subcutánea.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que tiene un tumor, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para inhibir o prevenir la metástasis de las células cancerosas en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que necesita el mismo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para inducir la regresión tumoral en un sujeto que tiene un tumor que expresa PD-1, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica como se describe en el presente documento.
En algunos aspectos, el anticuerpo en el presente documento puede administrarse por vía parenteral en un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.
En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender además la administración de una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico. En algunos aspectos, el segundo agente terapéutico es, por ejemplo, crizotinib, palbociclib, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-4-1BB o un segundo anticuerpo PD-1.
También se divulga el uso de cualquiera de los anticuerpos antagonistas anti-PD-1 proporcionados en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer o para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que necesite el mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 reduce el aumento de peso del sujeto.
También se divulgan anticuerpos antagonistas anti-PD-1 para su uso en el tratamiento de un cáncer o para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que necesite el mismo. En algunas realizaciones, el cáncer es, por ejemplo sin limitación, cáncer gástrico, sarcoma, linfoma, linfoma de Hodgkin, leucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer tímico, cáncer epitelial, cáncer salival, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón (incluyendo, por ejemplo, carcinoma de pulmón no microcítico), cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, glioma, leucemia, mieloma múltiple, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer oral, cáncer de piel y melanoma.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un cáncer en un mamífero, particularmente un humano, cuyo procedimiento comprende administrar al mamífero que recibe la vacuna una cantidad eficaz de anticuerpo antagonista anti-PD-1 proporcionado por la presente divulgación.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar un cáncer en un mamífero, particularmente un humano, cuyo procedimiento comprende administrar al mamífero (1) una cantidad efectiva de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra las células del cáncer y (2) una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 proporcionado por la presente divulgación.
Breve descripción de las fiauras/dibuios
La Figura 1A muestra un gráfico que resume el peso corporal de los ratones tratados con el anticuerpo antagonista anti-PD-1.
La Figura 1B muestra un gráfico que resume el peso corporal de los ratones tratados con el anticuerpo antagonista anti-PD-1.
La Figura 1C muestra un gráfico que resume el peso corporal de los ratones tratados con el anticuerpo antagonista anti-PD-1.
La Figura 1D muestra un gráfico que resume el peso corporal de los ratones tratados con el anticuerpo antagonista anti-PD-1.
La Figura 1E muestra un gráfico que resume el peso corporal de los ratones tratados con el anticuerpo antagonista anti-PD-1.
La Figura 2A muestra un gráfico que resume EC50 de la unión del anticuerpo anti-PD-1 a las células T activadas humanas primarias.
La Figura 2B muestra un gráfico que resume EC50 para la unión del anticuerpo anti-PD-1 a las células T primarias cino activadas.
La Figura 3 muestra un gráfico de barras que resume la proliferación de células T CD4 activadas cultivadas y tratadas de la siguiente manera (a) sin anticuerpos; (b) control del isotipo; (c) EH12.1; (d) C1; (e) C2; (f) C3; (g) mAb1; (h) mAbX; (i) mAb4; (j) mAb5; (k) mAb6; (I) mAb7; (m) mAb9; (n) mAb10; (o) mAb11; (p) mAb14; (q) mAb15; (r) mAb16.
La Figura 4 muestra un gráfico de barras que resume la proliferación de células T CD8 activadas cultivadas y tratadas de la siguiente manera (a) sin anticuerpos; (b) control del isotipo; (c) EH12.1; (d) C1; (e) C2; (f) C3; (g) mAb1; (h) mAbX; (i) mAb4; (j) mAb5; (k) mAb6; (I) mAb7; (m) mAb9; (n) mAb10; (o) mAb11; (p) mAb14; (q) mAb15; (r) mAb16.
Descripción detallada
En el presente documento se divulgan anticuerpos que se unen específicamente a PD-1. Se proporcionan procedimientos de fabricación de anticuerpos anti-PD-1, composiciones que comprenden estos anticuerpos y procedimientos de uso de estos anticuerpos como medicamento. Los anticuerpos anti-PD-1 pueden utilizarse para inhibir la progresión de los tumores, y pueden utilizarse en la prevención y/o el tratamiento del cáncer y/o de otras enfermedades.
Técnicas generales
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican ampliamente en la literatura, como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987) Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987) Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988­ 1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
Definiciones
A menos que se indique lo contrario, se entenderá que los siguientes términos tienen los siguientes significados: el término "molécula aislada" se refiere a una molécula (cuando la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo) que, en virtud de su origen o fuente de derivación, (1) no está asociada con componentes naturalmente asociados que la acompañan en su estado nativo, (2) está sustancialmente libre de otras moléculas de la misma fuente, por ejemplo especie, célula de la que se expresa, biblioteca, etc., (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no se da en la naturaleza. Así, una molécula sintetizada químicamente, o expresada en un sistema celular diferente del sistema del que procede naturalmente, estará "aislada" de sus componentes naturalmente asociados. Una molécula también puede quedar sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados mediante el aislamiento, utilizando técnicas de purificación bien conocidas en la técnica. La pureza u homogeneidad de la molécula puede ensayarse por varios medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipéptido puede analizarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Para ciertos propósitos, se puede proporcionar una mayor resolución utilizando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.
Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a un objetivo, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, situado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término abarca no sólo los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también, a menos que se especifique lo contrario, cualquier porción de unión a antígeno de los mismos que compita con el anticuerpo intacto para la unión específica, las proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Las porciones de unión al antígeno incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 , Fd, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs, por ejemplo, anticuerpos de tiburón y camélidos), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos de fragmento variable de cadena única (scFv), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerposs, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión específica al antígeno al polipéptido. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o subclase de las mismas), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA1 y IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Como se sabe en la técnica, las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras consisten cada una en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables, y contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Si se desean variantes de una región variable del sujeto, en particular con sustitución en residuos de aminoácidos fuera de una región CDR (es decir, en la región marco), puede identificarse la sustitución de aminoácidos apropiada, preferentemente, la sustitución de aminoácidos conservadora, comparando la región variable del sujeto con las regiones variables de otros anticuerpos que contienen secuencias CDR1 y CDR2 en la misma clase canónica que la región variable del sujeto (Chothia y Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987).
En ciertas realizaciones, la delineación definitiva de una CDR y la identificación de los residuos que comprenden el sitio de unión de un anticuerpo se logra resolviendo la estructura del anticuerpo y/o resolviendo la estructura del complejo anticuerpo-ligando. En ciertas realizaciones, esto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tal como la cristalografía de rayos X. En ciertas realizaciones, se pueden emplear diversos procedimientos de análisis para identificar o aproximar las regiones CDR. En ciertas realizaciones, se pueden emplear diversos procedimientos de análisis para identificar o aproximar las regiones CDR. Algunos ejemplos de estos procedimientos son, pero no se limitan a, la definición de Kabat, la definición de Chothia, la definición de AbM, la definición de contacto y la definición conformacional.
La definición de Kabat es un estándar para la numeración de los residuos en un anticuerpo y se utiliza normalmente para identificar las regiones CDR. Véase, por ejemplo, Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8. La definición de Chothia es similar a la de Kabat, pero la definición de Chothia tiene en cuenta las posiciones de ciertas regiones estructurales de los bucles. Véase, por ejemplo, Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17 Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83. La definición de AbM utiliza un conjunto integrado de programas informáticos producidos por Oxford Molecular Group que modelan la estructura de los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; "AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. La definición de AbM modela la estructura terciaria de un anticuerpo a partir de la secuencia primaria utilizando una combinación de bases de datos de conocimiento y procedimientos ab initio, tales como los descritos por Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach", en PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198. La definición del contacto se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Véase, por ejemplo, MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45. En otro enfoque, denominado en el presente documento "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión del antígeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Otras definiciones de los límites de las CDR pueden no seguir estrictamente uno de los enfoques anteriores, pero sin embargo coincidirán con al menos una porción de las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o los hallazgos experimentales de que determinados residuos o grupos de residuos no tienen un impacto significativo en la unión al antígeno. Tal y como se utiliza en el presente documento, un CDR puede referirse a los CDR definidos por cualquier enfoque conocido en la técnica, incluyendo combinaciones de enfoques. Los procedimientos utilizados en el presente documento pueden utilizar las CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos enfoques. Para cualquier realización que contenga más de una CDR, las CDR pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendida, AbM, de contacto y/o conformacional.
Como se conoce en la técnica, una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por un procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495o por procedimientos de ADN recombinante tal como los descritos en la Patente de EE.UU. No. 4,816,567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos generadas mediante las técnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554por ejemplo. Tal como se utiliza en el presente documento, el anticuerpo "humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Preferentemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de un CDR del receptor se sustituyen por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como el ratón, la rata o el conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo.
Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha fabricado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos que se divulgan en el presente documento. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda residuos de unión al antígeno no humanos.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a los anticuerpos en los que las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.
El término "epítopo" se refiere a la porción de una molécula capaz de ser reconocida y unida por un anticuerpo en una o más de las regiones de unión al antígeno del anticuerpo. Los epítopos suelen consistir en una agrupación superficial de moléculas, tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. En algunas realizaciones, el epítopo puede ser un epítopo proteico. Los epítopos de las proteínas pueden ser lineales o conformacionales. En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula que interactúa (tal como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. Un "epítopo no lineal" o "epítopo conformacional" comprende polipéptidos (o aminoácidos) no contiguos dentro de la proteína antigénica a los que se une un anticuerpo específico del epítopo. El término "epítopo antigénico", tal y como se utiliza en el presente documento, se define como una porción de un antígeno a la que se puede unir específicamente un anticuerpo, tal y como se determina por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayos convencionales. Una vez determinado el epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos contra ese epítopo, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas en la presente memoria descriptiva. Alternativamente, durante el procedimiento de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede dilucidar información sobre epítopos deseables. A partir de esta información, es posible examinar competitivamente los anticuerpos para que se unan al mismo epítopo. Un enfoque para lograr esto es llevar a cabo estudios de competencia y competencia cruzada para encontrar anticuerpos que compitan o compitan entre sí para unirse a PD-1, por ejemplo, los anticuerpos compiten para unirse al antígeno.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "PD-1" se refiere a cualquier forma de PD-1 y variantes del mismo que conservan al menos parte de la actividad de PD-1. A menos que se indique lo contrario, como por ejemplo mediante una referencia específica a la PD-1 humana, la PD-1 incluye todas las especies de mamíferos de secuencia nativa PD-1, por ejemplo, humanos, caninos, felinos, equinos y bovinos. Un ejemplo de PD-1 humana se encuentra en el Número de Acceso Uniprot Q15116 (SEQ ID NO: 1).
El término "agonista" se refiere a una sustancia que promueve (es decir, induce, causa, mejora o aumenta) la actividad o el efecto biológico de otra molécula. El término agonista abarca sustancias que se unen al receptor, tal como un anticuerpo, y sustancias que promueven la función del receptor sin unirse a al mismo (por ejemplo, activando una proteína asociada).
El término "antagonista" o "inhibidor" se refiere a una sustancia que impide, bloquea, inhibe, neutraliza o reduce una actividad o efecto biológico de otra molécula, tal como un receptor.
El término "anticuerpo antagonista" se refiere a un anticuerpo que se une a un objetivo y evita o reduce el efecto biológico de ese objetivo. En algunas realizaciones, el término puede denotar un anticuerpo que impide que el objetivo, por ejemplo, PD-1, al que está unido realice una función biológica.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo antagonista de PD-1" se refiere a un anticuerpo que es capaz de inhibir la actividad biológica de PD-1 y/o los eventos descendentes mediados por PD-1. Los anticuerpos antagonistas de la PD-1 abarcan los anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (en cualquier grado, incluso de forma significativa) la actividad biológica de la PD-1, incluyéndolos eventos descendentes mediados por la PD-1, tal como la unión de la PD-L1 y la señalización descendente, la unión de la PD-L2 y la señalización descendente, la inhibición de la proliferación de células T, la inhibición de la activación de células T, la inhibición de la secreción de IFN, la inhibición de la secreción de IL-2, la inhibición de la secreción de TNF, la inducción de IL-10 y la inhibición de las respuestas inmunitarias antitumorales. Para efectos de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término "anticuerpo antagonista de PD-1" (denominado indistintamente "anticuerpo antagonista de PD-1", "anticuerpo de anti-PD-1 antagonista " o "anticuerpo antagonista de PD-1") abarca todos los términos, títulos y estados funcionales y características previamente identificados por los que la propia PD-1, una actividad biológica de PD-1, o las consecuencias de la actividad biológica, se anulan, disminuyen o neutralizan sustancialmente en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de PD-1 se une a PD-1 y regula una respuesta inmunitaria antitumoral. En el presente documento se proporcionan ejemplos de anticuerpos antagonistas anti-PD-1.
Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a cadenas de aminoácidos de cualquier longitud. La cadena puede ser lineal o ramificada, puede comprender aminoácidos modificados y/o puede estar interrumpida por no aminoácidos. Los términos también abarcan una cadena de aminoácidos que ha sido modificada de forma natural o por intervención; por ejemplo, la formación de enlaces disulfuro, la glicosilación, la lipidación, la acetilación, la fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o asociadas.
Como se sabe en la técnica, "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado a una cadena por la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como los nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de los nucleótidos puede impartirse antes o después del ensamblaje de la cadena. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse aún más después de la polimerización, por ejemplo, mediante la conjugación con un componente de etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, los "tapones", la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, las modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen elementos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como las formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilos normalmente presentes en los azúcares puede ser sustituido, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden ser conjugados a soportes sólidos. Los OH terminales 5' y 3' pueden estar fosforilados o sustituidos por aminas o por grupos orgánicos de cobertura de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos azúcares alfa- o betaanoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos abásicos de nucleósidos tal como ribosido de metilo. Uno o más enlaces fosfodiésteres pueden ser sustituidos por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces de un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.
Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo "interactúa con" PD-1 cuando la constante de disociación de equilibrio es igual o inferior a 20 nM, preferentemente inferior a aproximadamente 6 nM, más preferentemente inferior a aproximadamente 1 nM, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,2 nM, según se mide mediante los procedimientos divulgados en el presente documento en el Ejemplo 7.
Un anticuerpo que se "une preferentemente" o "se une específicamente" (utilizados indistintamente en el presente documento) a un epítopo es un término bien conocido en la técnica, y los procedimientos para determinar dicha unión específica o preferente también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula presenta una "unión específica" o una "unión preferente" si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia concreta que con otras células o sustancias alternativas. Un anticuerpo se "une específicamente" o "se une preferentemente" a un objetivo si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferentemente a un epítopo PD-1 es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que se une a otros epítopos PD-1 o a epítopos no PD-1. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o fracción o epítopo) que se une específica o preferentemente a un primer objetivo puede o no unirse específica o preferentemente a un segundo objetivo. Como tal, la "unión específica" o "unión preferente" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la vinculación significa la vinculación preferente.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a un material que tiene una pureza de al menos 50 % (es decir, libre de contaminantes), más preferentemente, al menos 90 % de pureza, más preferentemente, al menos 95 % de pureza, aún más preferentemente, al menos 98 % de pureza, y más preferentemente, al menos 99% de pureza.
Una "célula huésped" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de vectores para la incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células huésped incluyen la progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula madre original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido de esta invención.
Como se conoce en la técnica, el término "región Fc" se utiliza para definir una región terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana suele definirse para que se extienda desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el carboxilo-terminal de la misma. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3. Como se sabe en la técnica, una región Fc puede estar presente en forma dímera o monomérica.
Como se utiliza en la técnica, "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es el que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol, 9:457-92 Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34y de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587y Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
El término "competir", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de una manera suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de tal manera que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo afín disminuye de manera detectable en la presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo, puede ser el caso, pero no necesariamente. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su respectivo epítopo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando afín, ya sea en la misma, mayor o menor medida, se dice que los anticuerpos "compiten de forma cruzada" entre sí por la unión de sus respectivos epítopos. La presente invención abarca tanto los anticuerpos competidores como los de competencia cruzada. Independientemente del mecanismo por el que se produzca dicha competencia o competencia cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común o a una porción del mismo), el artesano experto apreciaría, con base en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que dichos anticuerpos competidores y/o de competencia cruzada están abarcado y pueden ser útiles para los procedimientos divulgados en el presente documento.
Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen la unión de C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento; la unión del receptor Fc; la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos; la fagocitosis; la regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y pueden evaluarse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo.
Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, pero que conserva al menos una función efectora de la región Fc de secuencia nativa. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido padre, por ejemplo, de una a diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente, de una a cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido padre. La variante de la región Fc en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido padre, y más preferentemente, al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferentemente, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) las células neoplásicas o cancerosas, inhibir la metástasis de las células neoplásicas, reducir o disminuir el tamaño de un tumor, la remisión del cáncer, la disminución de los síntomas resultantes del cáncer, el aumento de la calidad de vida de los enfermos de cáncer, la disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar el cáncer, el retraso de la progresión del cáncer, la curación de un cáncer, y/o prolongar la supervivencia de los pacientes que tienen cáncer.
"Mejorar" indica una disminución o mejora de uno o más síntomas en comparación con la no administración de un anticuerpo antagonista anti-PD-1. "Mejorar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.
Tal y como se utiliza en el presente documento, una "dosificación efectiva" o "cantidad efectiva" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar uno o más resultados beneficiosos o deseados. En aspectos más específicos, una cantidad eficaz previene, alivia o mejora los síntomas de la enfermedad, y/o prolonga la supervivencia del sujeto tratado. Para el uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen la eliminación o la reducción del riesgo, la disminución de la gravedad o el retraso del inicio de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como la reducción de uno o más síntomas de una enfermedad tal como, por ejemplo, cáncer, incluyendo, por ejemplo sin limitación, cáncer gástrico, sarcoma, linfoma, linfoma de Hodgkin, leucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello de células escamosas, cáncer tímico, cáncer epitelial, cáncer salival, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, glioma, leucemia, mieloma múltiple, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer oral, cáncer de piel y melanoma, disminuyendo la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, potenciando el efecto de otro medicamento y/o retrasando la progresión del cáncer en los pacientes. Una dosificación efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una dosificación efectiva de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosificación efectiva de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Así, una "dosificación efectiva" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes, puede lograrse o se logra un resultado deseable.
Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferentemente, un humano. Los mamíferos también incluyen, pero no se limitan a, los animales de granja (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, pollos, etc.), los animales de deporte, los animales de compañía, los primates, los caballos, los perros, los gatos, los ratones y las ratas.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "vector' significa una construcción capaz de liberar y, preferentemente, expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes condensadores catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tal como las células productoras.
Tal como se utiliza en el presente documento, "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de expresión está vinculada de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir.
Tal como se utiliza en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente retenga la actividad biológica y no sea reactivo con el sistema inmunológico del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar tal como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tal como la emulsión aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para la administración en aerosol o parenteral son la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la solución salina normal (0,9 %). Las composiciones que comprenden dichos portadores se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Editorial Mack, 2000).
El término "kon", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo a un antígeno. En concreto, se miden las constantes de velocidad (kon y koff) y las constantes de disociación de equilibrio utilizando anticuerpos de longitud completa y/o fragmentos de anticuerpos Fab (es decir, univalentes) y PD-1.
El término "koff ", tal como se utiliza aquí, se refiere a la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.
El término "Kd", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción referida a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X" Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
El término "potenciador de células inmunitarias efectoras" o "potenciador de IEC " se refiere a una sustancia capaz de aumentar o mejorar el número, la calidad o la función de uno o más tipos de células inmunitarias efectoras de un mamífero. Algunos ejemplos de células efectoras inmunitarias son las células T CD8 citolíticas, las células T CD4, las células NK y las células B.
El término "modulador inmunitario" se refiere a una sustancia capaz de alterar (por ejemplo, inhibir, disminuir, aumentar, potenciar o estimular) la respuesta inmunitaria (como se define en el presente documento) o el funcionamiento de cualquier componente del sistema inmunitario innato, humoral o celular de un mamífero huésped. Por lo tanto, el término "modulador inmunitario" abarca el "potenciador de células inmunes efectoras" tal como se define en el presente documento y el "inhibidor de células inmunosupresoras" tal como se define en el presente documento, así como la sustancia que afecta a otros componentes del sistema inmunitario de un mamífero.
El término "respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier respuesta detectable a una sustancia particular (tal como un antígeno o inmunógeno) por el sistema inmunitario de un mamífero huésped, tal como las respuestas inmunitarias innatas (por ejemplo, la activación de la cascada de señalización del receptor Toll), las respuestas inmunitarias mediadas por células (por ejemplo, respuestas mediadas por células T, tales como las células T específicas de antígeno, y células no específicas del sistema inmunitario), y las respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, respuestas mediadas por células B, tales como la generación y secreción de anticuerpos en el plasma, la linfa y/o los fluidos tisulares).
El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia para causar, provocar, estimular o inducir una respuesta inmunitaria, o para mejorar, potenciar, aumentar o prolongar una respuesta inmunitaria preexistente, contra un antígeno particular, ya sea sola o cuando está unida a un portador, en la presencia o ausencia de un adyuvante.
El término "inhibidor de células inmunosupresoras" o "inhibidor de ISC" se refiere a una sustancia capaz de reducir o suprimir el número o la función de las células inmunosupresoras de un mamífero. Algunos ejemplos de células inmunosupresoras son las células T reguladoras ("T regs"), las células supresoras derivadas de los mieloides y los macrófagos asociados a los tumores.
El término "administración intradérmica" o "administrado intradérmicamente", en el contexto de la administración de una sustancia a un mamífero, incluyendo un ser humano, se refiere a la entrega de la sustancia en la capa de la dermis de la piel del mamífero. La piel de un mamífero está compuesta por una capa de epidermis, una capa de dermis y una capa subcutánea. La epidermis es la capa externa de la piel. La dermis, que es la capa media de la piel, contiene terminaciones nerviosas, glándulas sudoríparas y sebáceas, folículos pilosos y vasos sanguíneos. La capa subcutánea está formada por grasa y tejido conectivo que alberga vasos sanguíneos y nervios de mayor tamaño. En cambio, en la administración intradérmica, la "administración subcutánea" se refiere a la administración de una sustancia en la capa subcutánea y la "administración tópica" se refiere a la administración de una sustancia en la superficie de la piel.
El término "trastorno neoplásico" se refiere a una condición en la que las células proliferan a una tasa anormalmente alta y descontrolada, la tasa excede y no está coordinada con la de los tejidos normales circundantes. Suele dar lugar a una lesión sólida o bulto conocido como "tumor" Este término abarca los trastornos neoplásicos benignos y malignos. El término "trastorno neoplásico maligno", que se utiliza indistintamente con el término "cáncer" en la presente divulgación, se refiere a un trastorno neoplásico caracterizado por la capacidad de las células tumorales de extenderse a otros lugares del cuerpo (conocido como "metástasis"). El término "trastorno neoplásico benigno" se refiere a un trastorno neoplásico en el que las células tumorales carecen de capacidad de metástasis.
El término "que previene" o "prevenir" se refiere a (a) evitar que se produzca un trastorno o (b) retrasar la aparición de un trastorno o la aparición de los síntomas de un trastorno.
El término "antígeno asociado a tumores" o "TAA" se refiere a un antígeno que se expresa específicamente por las células tumorales o que se expresa con una frecuencia o densidad mayor por las células tumorales que por las células no tumorales del mismo tipo de tejido. Los antígenos asociados a los tumores pueden ser antígenos no expresados normalmente por el huésped; pueden estar mutados, truncados, mal plegados o por el contrario ser manifestaciones anormales de moléculas normalmente expresadas por el huésped; pueden ser idénticos a moléculas normalmente expresadas pero expresadas a niveles anormalmente altos; o pueden expresarse en un contexto o medio anormal. Los antígenos asociados a los tumores pueden ser, por ejemplo, proteínas o fragmentos de proteínas, carbohidratos complejos, gangliósidos, haptenos, ácidos nucleicos o cualquier combinación de estas u otras moléculas biológicas.
El término "vacuna" se refiere a una composición inmunogénica para la administración a un mamífero para provocar una respuesta inmunitaria contra un antígeno particular en el mamífero. Una vacuna suele contener un agente (conocido como "antígeno" o "inmunógeno") que se asemeja al objetivo de la respuesta inmunitaria o se deriva de ella, tal como un microorganismo causante de una enfermedad o células tumorales. Una vacuna destinada al tratamiento de un tumor, ta; como por ejemplo un cáncer, suele contener un antígeno derivado de un TAA que se encuentra en el tumor objetivo y es capaz de provocar inmunogenicidad contra el TAA del tumor objetivo.
El término "régimen de inmunoterapia con base en vacunas" se refiere a un régimen terapéutico en el que se administra una vacuna en combinación con uno o más moduladores inmunitarios. La vacuna y los inmunomoduladores pueden administrarse juntos en una única formulación o administrarse por separado
Se entiende que dondequiera que las realizaciones se describan en el presente documento con el lenguaje "que comprende", de lo contrario se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
Cuando los aspectos o las realizaciones de la invención se describen en términos de un grupo de Markush u otra agrupación de alternativas, la presente invención abarca no sólo todo el grupo enumerado en su conjunto, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal, pero también el grupo principal ausente de uno o más de los miembros del grupo. La presente invención también contempla la exclusión explícita de uno o más de los miembros del grupo en la invención reivindicada.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Salvo que el contexto exija lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular Los ejemplos que siguen a los términos "por ejemplo" o "por ejemplo" no pretenden ser exhaustivos ni limitantes.
Anticuerpos antagonistas anti-PD-1
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos antagonistas de PD-1 que bloquean, suprimen o reducen (incluso reducen significativamente) la actividad biológica de PD-1, inlcuyendo los eventos descendentes mediados por PD-1. Un anticuerpo antagonista anti-PD-1 debe presentar una o más de las siguientes características: (a) se unen a PD-1 y bloquean los eventos de señalización descendentes; (b) bloquean la unión de PD-L1 a PD-1; (c) aumentan la respuesta inmunitaria mediada por células T; (d) estimulan la secreción de IFNy; (e) estimulan la secreción de TNF; (f) aumentan la proliferación de células T; y (g) reducen la transducción de señales inhibitorias a través de PD-1.
Para efectos de la presente divulgación, el anticuerpo reacciona preferentemente con PD-1 de manera que inhibe la función de señalización de PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 se une específicamente a la PD-1 de los primates.
Los anticuerpos útiles en la presente divulgación pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, de cadena única (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluyendo las variantes de glicosilación de los anticuerpos, las variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y los anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos pueden ser murinos, de rata, humanos o de cualquier otro origen (incluyendo los anticuerpos quiméricos o humanizados). En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
Los anticuerpos antagonistas anti-PD-1 pueden hacerse por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón son conocidas en la técnica y/o se describen en el presente documento.
Los anticuerpos antagonistas de PD-1 pueden identificarse o caracterizarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por los que se detecta y/o se mide la reducción, la mejora o la neutralización de la actividad biológica de PD-1. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de PD-1 se identifica incubando un agente candidato con PD-1 y monitorizando la unión y/o la reducción o neutralización de una actividad biológica de PD-1. El ensayo de unión puede realizarse con, por ejemplo, polipéptidos PD-1 purificados, o con células que expresan naturalmente (por ejemplo, diversas cepas), o transfectadas para expresar, polipéptidos PD-1. En una realización, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitiva, en el que se evalúa la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un anticuerpo antagonista de PD-1 conocido para la unión de PD-1. El ensayo puede realizarse en diversos formatos, incluyendo el formato ELISA. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de PD-1 se identifica incubando un anticuerpo candidato con PD-1 y monitorizando la unión.
Tras la identificación inicial, la actividad de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 candidato puede confirmarse y perfeccionarse aún más mediante bioensayos, conocidos para probar las actividades biológicas objetivo. En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo celular in vitro para caracterizar aún más un anticuerpo antagonista anti-PD-1 candidato. Por ejemplo, se incuba un anticuerpo candidato con células T humanas primarias, se añade PD-L1 y se monitoriza la secreción de IFNy. Como alternativa, se pueden utilizar bioensayos para examinar directamente a los candidatos.
Los anticuerpos antagonistas anti-PD-1 de la divulgación presentan una o más de las siguientes características: (a) se unen a PD-1 y bloquean los eventos de señalización descendentes; (b) bloquean la unión de PD-L1 a PD-1; (c) aumentan la respuesta inmunitaria mediada por células T; (d) estimulan la secreción de IFNy; (e) estimulan la secreción de TNF; (f) aumentan la proliferación de células T; (g) reducen la transducción de señales inhibitorias a través de PD-1; y (h) bloquean la unión de PD-L2 a PD-1. Preferentemente, los anticuerpos anti-PD-1 tienen dos o más de estas características. Más preferentemente, los anticuerpos tienen tres o más de las características. Más preferentemente, los anticuerpos tienen cuatro o más de las características. Más preferentemente, los anticuerpos tienen cinco o más de las características. Más preferentemente, los anticuerpos tienen seis o más de las características. Más preferentemente, los anticuerpos tienen siete o más de las características. Lo más preferentemente es que los anticuerpos tengan las ocho características.
Los anticuerpos antagonistas anti-PD-1 pueden caracterizarse utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento consiste en identificar el epítopo al que se une, o "mapeo de epítopos" Existen muchos procedimientos conocidos en la técnica para cartografiar y caracterizar la localización de los epítopos en las proteínas, incluyendo la resolución de la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, los ensayos de competencia, los ensayos de expresión de fragmentos de genes y los ensayos con base en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en Capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1999. En un ejemplo adicional, el mapeo de epítopos puede utilizarse para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo antagonista anti-PD-1. El mapeo de epítopos está disponible comercialmente en diversas fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Bajos). El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un único tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que puede no estar necesariamente contenido en un único tramo. Se pueden aislar o sintetizar (por ejemplo, de forma recombinante) péptidos de diferentes longitudes (por ejemplo, de al menos 4-6 aminoácidos) y utilizarlos para ensayos de unión con un anticuerpo antagonista anti-PD-1. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo antagonista anti-PD-1 puede determinarse en un cribado sistemático utilizando péptidos superpuestos derivados de la secuencia de PD-1 y determinando la unión por el anticuerpo antagonista anti-PD-1. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmentos de genes, el marco de lectura abierto que codifica la PD-1 se fragmenta al azar o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de la PD-1 con el anticuerpo que se va a analizar. Los fragmentos de genes pueden, por ejemplo, producirse por PCR y luego transcribirse y traducirse en proteínas in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. La unión del anticuerpo a los fragmentos de PD-1 marcados radiactivamente se determina entonces mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Algunos epítopos también pueden identificarse utilizando grandes bibliotecas de secuencias peptídicas aleatorias mostradas en la superficie de partículas de fago (bibliotecas de fago) o de levadura (visualización de levadura). Alternativamente, una biblioteca definida de fragmentos peptídicos superpuestos puede ser probada para la unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simples. En un ejemplo adicional, la mutagénesis de un antígeno, los experimentos de intercambio de dominios y la mutagénesis de barrido de alanina pueden realizarse para identificar los residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión del epítopo. Por ejemplo, se pueden realizar experimentos de mutagénesis de barrido de alanina utilizando una PD-1 mutante en la que varios residuos del polipéptido PD-1 han sido sustituidos por alanina. Al evaluar la unión del anticuerpo a la PD-1 mutante, se puede evaluar la importancia de los residuos particulares de la PD-1 para la unión del anticuerpo.
Otro procedimiento que puede utilizarse para caracterizar un anticuerpo antagonista anti-PD-1 es utilizar ensayos de competencia con otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno, es decir, diversos fragmentos de PD-1, para determinar si el anticuerpo antagonista anti-PD-1 se une al mismo epítopo que otros anticuerpos. Los ensayos de competencia son bien conocidos por los expertos en la técnica, incluso en formato ELISA.
La afinidad de unión (Kd) de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 a PD-1 puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 200 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 2 pM o aproximadamente 1 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 2 pM.
En consecuencia, la divulgación proporciona cualquiera de los siguientes, o composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) que comprenden un anticuerpo que tiene una secuencia parcial de cadena ligera y una secuencia parcial de cadena pesada como se encuentra en la Tabla 1, o variantes de la misma. En la Tabla 1, las secuencias subrayadas son secuencias CDR. En la Tabla 1, el Kd indica la afinidad por la PD-1 humana medida mediante resonancia de plasmón de superficie a 25 °C, a menos que se indique lo contrario.
Tabla 1: Secuencias de las re iones variables de los anticuer os anta onistas anti-PD-1
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La divulgación también proporciona porciones CDR de anticuerpos contra PD-1. La determinación de las regiones CDR es algo que está dentro de la técnica. Se entiende que, en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR de Kabat y Chothia (también denominadas "CDR combinadas" o "CDR ampliadas"). En otro enfoque, denominado en el presente documento "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión del antígeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. En general, las "Cd R conformacionales" incluyen las posiciones de los residuos en las CDR de Kabat y las zonas de Vernier que se restringen para mantener la estructura de bucle adecuada para que el anticuerpo se una a un antígeno específico. La determinación de las CDR conformacionales está bien dentro de la habilidad de la técnica. En algunas realizaciones, las CDR son las CDR de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR de Chothia. En otras realizaciones, las CDR son las CDR extendidas, las AbM, las conformacionales o las de contacto. En otras palabras, en las realizaciones con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de las CDR de Kabat, Chothia, extendidas, AbM, conformacionales, de contacto o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende tres CDR de una cualquiera de las regiones variables de la cadena pesada mostradas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende tres CDR de una cualquiera de las regiones variables de la cadena ligera mostradas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende tres CDR de una cualquiera de las regiones variables de la cadena pesada mostradas en la Tabla 1, y tres CDR de una cualquiera de las regiones variables de la cadena ligera mostradas en la Tabla 1.
La Tabla 2 proporciona ejemplos de secuencias CDR de anticuerpos antagonistas anti-PD-1 proporcionados en el presente documento.
Tabla 2. Anticuerpos antagonistas PD-1 (mAbs) y sus secuencias CDR de unión a antígeno de acuerdo con Kabat subra ado Chothia ne rita
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En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende tres CDR de cadena ligera y tres CDR de cadena pesada de la Tabla 2.
En la Tabla 3 se proporciona una alineación de las CDR de la cadena ligera de los anticuerpos anti-PD-1. Los residuos variables se muestran en negrita. Las secuencias de consenso de las CDR de las cadenas ligeras se proporcionan en la última fila de la Tabla 3.
Tabla 3. Alineación de las CDR de la cadena li era anti-PD-1
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En la Tabla 4 se proporciona una alineación de las CDR de la cadena pesada de los anticuerpos anti-PD-1. Los residuos variables se muestran en negrita. Las secuencias CDR de consenso de la cadena pesada se proporcionan en la última fila de la Tabla 4.
T l 4 Alin i n l DR l n ni-PD-1
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En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende tres CDR de cadena ligera de la Tabla 3 y tres CDR de cadena pesada de la Tabla 4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende la cadena pesada de longitud completa, con o sin la lisina terminal C, y/o la cadena ligera de longitud completa del anticuerpo antagonista anti-PD-1 mAb7 o mAb15. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de mAb7 (SEQ ID NO: 29) se muestra a continuación:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSS
LTNYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSTGTFAYWGQGTLV
TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 29)
La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de mAb7 sin la lisina terminal C (SEQ ID NO: 38) se muestra a continuación:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINVWRQAPGQGLEWMGNIYPGSS
LTNYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSTGTFAYWGQGTLV
TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:38)
La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa de mAb7 (SEQ ID NO: 39) se muestra a continuación:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQKPGQPPKLLIYWT
SYRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPHTFGGGTKVEIKRG
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE
QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID
NO: 39)
La divulgación también proporciona procedimientos para generar, seleccionar y fabricar anticuerpos antagonistas anti-PD-1. Los anticuerpos de esta invención pueden hacerse por procedimientos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden hacerse de forma recombinante y expresarse utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica.
En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden prepararse y seleccionarse mediante la tecnología de visualización de fagos. Véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nos. 5,565,332 5,580,7175,733,743y 6,265,150y Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994. Como alternativa, la tecnología de visualización de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V de los anticuerpos se clonan dentro del marco de un gen de la proteína de la cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Dado que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización de fagos puede realizarse en una variedad de formatos; para una revisión, véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993. Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de genes V para la visualización de fagos. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991clackson et al., aislaron un conjunto diverso de anticuerpos contra la oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados del bazo de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos y se pueden aislar anticuerpos contra una matriz diversa de antígenos (incluyendo los autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993. En una respuesta inmunitaria natural, los genes de los anticuerpos acumulan mutaciones a un ritmo elevado (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una mayor afinidad, y los linfocitos B que muestran inmunoglobulinas de superficie de alta afinidad se replican y diferencian preferentemente durante la posterior provocación de antígenos. Este procedimiento natural puede imitarse empleando la técnica conocida como "barajar en cadena" (Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992). En este procedimiento, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por visualización de fagos puede mejorarse sustituyendo secuencialmente los genes de la región V de la cadena pesada y ligera por repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes del dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo pM-nM. Una estrategia para hacer repertorios de anticuerpos fágicos muy grandes (también conocida como "la madre de todas las bibliotecas") ha sido descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993. La mezcla de genes también puede utilizarse para obtener anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, cuando el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares a las del anticuerpo de roedor de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se denomina "impronta de epítopos", el gen del dominio V de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos de roedores obtenidos mediante la técnica de presentación de fagos se reemplaza con un repertorio de genes del dominio V humano, creando quimeras roedor-humano. La selección sobre el antígeno tiene como resultado el aislamiento de las regiones variables humanas capaces de restablecer un sitio funcional de unión al antígeno, es decir, el epítopo gobierna (imprime) la elección de la pareja. Cuando se repite el procedimiento para sustituir el dominio V restante del roedor, se obtiene un anticuerpo humano (véase Publicación PCT No. WO 93/06213). A diferencia de la humanización tradicional de los anticuerpos de roedores mediante el injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen marco ni residuos de CDR de origen roedor.
En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden hacerse utilizando la tecnología del hibridoma. Se contempla que cualquier sujeto mamífero, incluyendo el ser humano, o las células productoras de anticuerpos del mismo pueden ser manipuladas para servir de base para la producción de líneas celulares de hibridoma de mamífero, incluyendo el humano. La ruta y el calendario de inmunización del animal huésped se ajustan generalmente a las técnicas establecidas y convencionales de estimulación y producción de anticuerpos, como se describe más adelante en el presente documento. Típicamente, el animal huésped es inoculado por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en el presente documento.
Los hibridomas pueden prepararse a partir de los linfocitos y las células de mieloma inmortalizadas utilizando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497 o modificada por Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982. En la hibridación se pueden utilizar las líneas de mieloma disponibles, incluyendo, pero sin limitarse a X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU. En general, la técnica consiste en fusionar células de mieloma y células linfoides utilizando un fusógeno tal como el polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, tal como el medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células parentales no hibridadas. Cualquiera de los medios descritos en el presente documento, complementado con o sin suero, puede utilizarse para cultivar hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, pueden utilizarse células B inmortalizadas por el VEB para producir los anticuerpos monoclonales PD-1 de la invención en cuestión. Los hibridomas u otras células B inmortalizadas se expanden y subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se analizan para determinar la actividad antiinmunógena mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).
Los hibridomas que pueden utilizarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células progenitoras de los hibridomas padres que producen anticuerpos monoclonales específicos para PD-1, o una parte de los mismos.
Los hibridomas que producen dichos anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo utilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse del medio de cultivo o de los fluidos corporales, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tal como la precipitación con sulfato de amonio, la electroforesis en gel, la diálisis, la cromatografía y la ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, puede eliminarse, por ejemplo, haciendo pasar la preparación por adsorbentes hechos con el inmunógeno unido a una fase sólida y eludiendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. Inmunización de un animal huésped con un polipéptido PD-1, o un fragmento que contenga la secuencia de aminoácidos objetivo conjugada con una proteína que sea inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo hemocianina de lapa de ojo de cerradura, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilos diferentes, puede dar lugar a una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales).
Si se desea, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 (monoclonal o policlonal) de interés puede ser secuenciado y la secuencia polinucleotídica puede ser clonada en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y ésta puede expandirse y congelarse para su uso futuro. La producción de anticuerpos monoclonales recombinantes en cultivo celular puede llevarse a cabo mediante la clonación de genes de anticuerpos de células B por medios conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112; Patente de EE. UU. No. 7,314,622.
En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos puede utilizarse para la manipulación genética con el fin de "humanizar" el anticuerpo o mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo. Los anticuerpos también pueden personalizarse para su uso, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos totalmente humanos pueden obtenerse utilizando ratones disponibles en el mercado que han sido diseñados para expresar proteínas de inmunoglobulina humanas específicas. Los animales transgénicos diseñados para producir una respuesta inmunitaria más deseable (por ejemplo, anticuerpos totalmente humanos) o más robusta también pueden utilizarse para generar anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de esta tecnología son Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y HuMAb-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).
Los anticuerpos pueden fabricarse de forma recombinante aislando primero los anticuerpos y las células productoras de anticuerpos de los animales hospedadores, obteniendo la secuencia genética y utilizando la secuencia genética para expresar el anticuerpo de forma recombinante en las células hospedadoras (por ejemplo, células CHO). Otro procedimiento que puede emplearse es expresar la secuencia de anticuerpos en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han divulgado procedimientos para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche. Véase, por ejemplo, Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001 Lonberg, N. y D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; y Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999. Los procedimientos para fabricar derivados de anticuerpos, por ejemplo, de dominio, de cadena única, etc., son conocidos en la técnica.
Los inmunoensayos y las técnicas de clasificación por citometría de flujo, tal como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), también pueden emplearse para aislar anticuerpos que sean específicos para PD-1.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión (tal como los vectores de expresión divulgados en Publicación PCT No. W o 87/04462), que a continuación se transfectan en células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen proteínas de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Véase, por ejemplo, Publicación PCT No. WO 87/04462. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal PD-1.
Los fragmentos de anticuerpos pueden producirse por degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, por procedimientos recombinantes (es decir, polipéptidos simples o de fusión) como se ha descrito anteriormente o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se fabrican convenientemente por síntesis química. Los procedimientos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, un anticuerpo podría ser producido por un sintetizador automatizado de polipéptidos que emplee el procedimiento de fase sólida. Véase también, Patente de EE. UU. Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 6,331,415.
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica la cadena pesada y/o las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb7, mAb8, mAb9, mAb10, mAb11, mAb12, mAb13, mAb14, mAb15 o mAb16. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede entonces expandirse y congelarse para su uso futuro. En el presente documento se describen con más detalle los vectores (incluyendo los vectores de expresión) y las células huésped.
La divulgación incluye realizaciones maduradas por afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos madurados por afinidad pueden producirse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783 Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155 Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9 Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896y Publicación PCT No. WO2004/058184).
Los siguientes procedimientos pueden utilizarse para ajustar la afinidad de un anticuerpo y para caracterizar una CDR. Una forma de caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o alterar (por ejemplo, mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, tal como un anticuerpo, se denomina "mutagénesis de exploración de biblioteca". En general, la mutagénesis de barrido de biblioteca funciona de la siguiente manera. Una o más posiciones de aminoácidos en la CDR se sustituyen por dos o más (tales como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) aminoácidos utilizando procedimientos reconocidos en la técnica. Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una por cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de dos o más miembros (si se sustituyen dos o más aminoácidos en cada posición). Generalmente, la biblioteca también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (no sustituido). Un pequeño número de clones, por ejemplo, aproximadamente 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la biblioteca), de cada biblioteca se examinan para ver la afinidad de unión al polipéptido objetivo (u otro objetivo de unión), y se identifican los candidatos con aumento, igual, disminución o sin unión. Los procedimientos para determinar la afinidad de unión son bien conocidos en la técnica. La afinidad de unión puede determinarse utilizando, por ejemplo, el análisis de resonancia de plasmón superficial Biacore™, que detecta diferencias en la afinidad de unión de aproximadamente 2 veces o más, el biosensor Kinexa®, los ensayos de proximidad de centelleo, ELISA, el inmunoensayo ORIGEN®, la desactivación por fluorescencia, la transferencia por fluorescencia y/o la visualización de levadura. La afinidad de unión también se puede comprobar mediante un bioensayo adecuado. Biacore™ es particularmente útil cuando el anticuerpo de partida ya se une con una afinidad relativamente alta, por ejemplo, un Kd de aproximadamente 10 nM o inferior.
En algunas realizaciones, cada posición de aminoácido en una CDR se sustituye (en algunas realizaciones, una a la vez) con los 20 aminoácidos naturales utilizando procedimientos de mutagénesis reconocidos en la técnica (algunos de los cuales se describen en el presente documento). Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una por cada posición de aminoácido que se analice), cada una con una complejidad de 20 miembros (si se sustituyen los 20 aminoácidos en cada posición).
En algunas realizaciones, la biblioteca que se va a examinar comprende sustituciones en dos o más posiciones, que pueden estar en la misma CDR o en dos o más CDR. Así, la biblioteca puede incluir sustituciones en dos o más posiciones de una CDR. La biblioteca puede incluir la sustitución en dos o más posiciones en dos o más CDR. La biblioteca puede comprender la sustitución en 3, 4, 5 o más posiciones, encontrándose dichas posiciones en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. La sustitución puede prepararse utilizando codones de baja redundancia. Véase, por ejemplo, la Tabla 2 de Balint et al., 1993, Gene 137(1 ):109-18.
La CDR puede ser la región variable de la cadena pesada (VH) CDR3 y/o la región variable de la cadena ligera (VL) CDR3. La CDR puede ser una o más de VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, y/o VL CDR3. La CDR puede ser una CDR de Kabat, una CDR de Chothia, una CDR extendida, una CDR de AbM, una CDR de contacto o una CDR conformacional.
Los candidatos con una unión mejorada pueden ser secuenciados, identificando así un mutante de sustitución de CDR que resulta en una afinidad mejorada (también denominada una sustitución "mejorada"). Los candidatos que se unen también pueden ser secuenciados, identificando así una sustitución de CDR que mantiene la unión.
Pueden realizarse múltiples rondas de cribado. Por ejemplo, los candidatos (cada uno de los cuales comprende una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de una o más CDR) con unión mejorada también son útiles para el diseño de una segunda biblioteca que contenga al menos el aminoácido original y el aminoácido sustituido en cada posición de CDR mejorada (es decir, la posición de aminoácido en la CDR en la que un mutante de sustitución mostró una unión mejorada). La preparación y el cribado o la selección de esta biblioteca se analizan más adelante.
La mutagénesis de exploración de bibliotecas también proporciona un medio para caracterizar una CDR, en la medida en que la frecuencia de clones con una unión mejorada, la misma unión, una unión disminuida o ninguna unión también proporciona información relativa a la importancia de cada posición de aminoácido para la estabilidad del complejo anticuerpo-antígeno. Por ejemplo, si una posición de la CDR retiene la unión cuando se cambian los 20 aminoácidos, esa posición se identifica como una posición que probablemente no sea necesaria para la unión del antígeno. Por el contrario, si una posición de la CDR conserva la unión en sólo un pequeño porcentaje de sustituciones, esa posición se identifica como una posición importante para la función de la CDR. Así, los procedimientos de mutagénesis de barrido de bibliotecas generan información sobre las posiciones de las CDR que pueden cambiarse por muchos aminoácidos diferentes (incluyendo todos los 20 aminoácidos), y las posiciones de las CDR que no pueden cambiarse o que sólo pueden cambiarse por unos pocos aminoácidos.
Los candidatos con afinidad mejorada pueden combinarse en una segunda biblioteca, que incluye el aminoácido mejorado, el aminoácido original en esa posición, y puede incluir además sustituciones adicionales en esa posición, dependiendo de la complejidad de la biblioteca que se desee, o que se permita utilizando el procedimiento de cribado o selección deseado. Además, si se desea, la posición del aminoácido adyacente puede ser aleatoria para al menos dos o más aminoácidos. La aleatorización de aminoácidos adyacentes puede permitir una flexibilidad conformacional adicional en la CDR mutante, lo que a su vez puede permitir o facilitar la introducción de un mayor número de mutaciones de mejora. La biblioteca también puede incluir sustituciones en posiciones que no mostraron una mejor afinidad en la primera ronda de cribado.
La segunda biblioteca se cribará o seleccionará en busca de miembros de la biblioteca con afinidad de unión mejorada y/o alterada utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo el cribado mediante el análisis de biosensores Kinexa™, y la selección mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para la selección, incluyendo el despliegue de fagos, el despliegue de levaduras y el despliegue de ribosomas.
Para expresar los anticuerpos anti-PD-1 de la presente divulgación, los fragmentos de ADN que codifican las regiones VH y v L pueden obtenerse primero utilizando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. También se pueden introducir diversas modificaciones, por ejemplo, mutaciones, supresiones y/o adiciones en las secuencias de ADN utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la mutagénesis puede llevarse a cabo mediante procedimientos estándar, tales como la mutagénesis mediada por PCR, en la que los nucleótidos mutados se incorporan a los cebadores de la PCR de manera que el producto de la PCR contenga las mutaciones deseadas o la mutagénesis dirigida al sitio.
La divulgación abarca las modificaciones de las regiones variables mostradas en la Tabla 1 y las CDR mostradas en las Tablas 2, 3 o 4. Por ejemplo, la invención incluye anticuerpos que comprenden regiones variables y CDR funcionalmente equivalentes que no afectan significativamente a sus propiedades, así como variantes que tienen una actividad y/o afinidad mayor o menor. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede mutarse para obtener un anticuerpo con la afinidad de unión a PD-1 deseada. La modificación de los polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en el presente documento. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más supresiones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente la actividad funcional, o que maduran (mejoran) la afinidad del polipéptido por su ligando, o el uso de análogos químicos.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo-terminal que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasequencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo terminal Nl o el anticuerpo fusionado a una etiqueta epitópica. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión con el extremo N o C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media del anticuerpo en la circulación sanguínea.
Las variantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones del marco. Las sustituciones conservadoras figuran en el cuadro 5 bajo el epígrafe "sustituciones conservadoras" Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 5, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos pueden ser examinados.
Tabla 5: Sustituciones de aminoácidos
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(continuación)
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Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la espina dorsal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja p o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos con base en las propiedades comunes de las cadenas laterales:
(1) No polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) Polar sin cargo: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) Ácido (con carga negativa): Asp, Glu;
(4) Básico (con carga positiva): Lys, Arg;
(5) Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.
Las sustituciones no conservadoras se realizan intercambiando un miembro de una de estas clases por otro.
Un tipo de sustitución, por ejemplo, que puede realizarse es cambiar una o más cisteínas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, por otro residuo, tal como, sin limitación, alanina o serina. Por ejemplo, puede haber una sustitución de una cisteína no canónica. La sustitución puede realizarse en una región CDR o marco de un dominio variable o en la región constante de un anticuerpo. En algunas realizaciones, la cisteína es canónica. Cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo también puede ser sustituido, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el entrecruzamiento aberrante. A la inversa, se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, especialmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv.
Los anticuerpos también pueden ser modificados, por ejemplo, en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unión y/o la especificidad. En algunas realizaciones, no se realizan más de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de un dominio CDR. En otras realizaciones, no se realizan más de una a tres sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de un dominio CDR. Por ejemplo, se puede realizar una mutación en una o más de las regiones CDR para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo para PD-1, para aumentar o disminuir la koff, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. y Ausubel et al., supra.
También puede realizarse una modificación o mutación en una región marco o región constante para aumentar la vida media de un anticuerpo anti-PD-1. Véase, por ejemplo, Publicación PCT No. WO 00/09560. También puede realizarse una mutación en una región marco o constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio de unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades tales como la fijación del complemento, la unión al FcR y la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos. En algunas realizaciones, no se realizan más de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de la región marco o la región constante. En otras realizaciones, no se realizan más de una a tres sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de la región marco o la región constante. De acuerdo con la divulgación, un solo anticuerpo puede tener mutaciones en una o más de las CDR o regiones marco del dominio variable o en la región constante.
Las modificaciones también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos están glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Inmunol. 65:111-128 Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Inmunol. 32:1311-1318 Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína, que puede afectar a la conformación y a la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (Jefferis y Lund, supra Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una determinada glicoproteína a ciertas moléculas con base en estructuras de reconocimiento específicas. También se ha informado de que la glicosilación de los anticuerpos afecta a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, se informó de que los anticuerpos producidos por células CHO con expresión regulada por tetraciclina de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bisecante, han mejorado la actividad ADCC (Umana et al., 1999, Nature Biotech.
17:176-180).
La glicosilación de los anticuerpos está típicamente ligada a N o a O. El término "ligado a N" se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptidas asparagina-X serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glucosilación ligada al O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glucosilación ligados a O).
El patrón de glicosilación de los anticuerpos también puede ser alterado sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula huésped utilizada para expresar el anticuerpo. Dado que el tipo de célula utilizado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, los anticuerpos, como potenciales terapéuticos, rara vez es la célula nativa, cabe esperar variaciones en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).
Además de la elección de las células huésped, los factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación de los medios, la densidad de cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y otros similares. Se han propuesto diversos procedimientos para alterar el patrón de glicosilación conseguido en un organismo huésped concreto, incluyendo la introducción o sobreexpresión de ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (Patente de EE. UU. No.
5,047,335 5,510,261 y 5,278,299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, pueden eliminarse enzimáticamente de la glicoproteína, por ejemplo, utilizando endoglicosidasa H (Endo H), N-glicosidasa F, endoglicosidasa F1, endoglicosidasa F2, endoglicosidasa F3. Además, la célula huésped recombinante puede ser modificada genéticamente para que sea defectuosa en el procesamiento de ciertos tipos de polisacáridos. Estas y otras técnicas similares son bien conocidas en la técnica.
Otros procedimientos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Las modificaciones pueden utilizarse, por ejemplo, para la fijación de etiquetas para el inmunoensayo. Los polipéptidos modificados se fabrican mediante procedimientos establecidos en la técnica y pueden ser examinados mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación y en los Ejemplos.
En algunas realizaciones, el Fc puede ser IgG2 humana o IgG4 humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de IgG4 que comprende las siguientes mutaciones (Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593): E233F234L235 a P233V234A235 (IgG4ác), en la que la numeración es con referencia a la IgG4 de tipo silvestre. En otra realización, el Fc es IgG4 humana E233F234L235 a P233V234A235 con eliminación G236 (IgG4 áb). En algunas realizaciones, el Fc es cualquier Fc de IgG4 humana (IgG4 , IgG4áb o IgG4ác) que contiene la mutación estabilizadora de bisagra S228 a P228 (Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19). En otras realizaciones, el Fc puede ser una IgG2 humana que contenga la mutación A330P331 a S330S331 (IgG2á a ), en la que los residuos de aminoácidos se numeran con referencia a la secuencia IgG2 de tipo silvestre. Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada que ha aumentado o disminuido la afinidad de unión a un receptor Fc gamma humano, es inmunológicamente inerte o parcialmente inerte, por ejemplo no desencadena la lisis mediada por el complemento, no estimula la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), o no activa la microglía; o tiene actividades reducidas (en comparación con el anticuerpo no modificado) en una o más de las siguientes: desencadenar la lisis mediada por el complemento, estimular la ADCC, o activar la microglía. Se pueden utilizar diferentes modificaciones de la región constante para conseguir un nivel y/o una combinación óptimos de funciones efectoras. Véase, por ejemplo, Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995 Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996 Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000 Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989y Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. En algunas realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624 Publicación PCT No. WO99/058572.
En algunas realizaciones, la región constante de un anticuerpo puede ser modificada para evitar la interacción con el receptor Fc gamma y los sistemas de complemento e inmunitario. Las técnicas para la preparación de dichos anticuerpos se describen en el documento WO 99/58572. Por ejemplo, la región constante puede diseñarse para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmunitaria si el anticuerpo se utiliza en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nos. 5,997,867 y 5,866,692.
En otras realizaciones, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N. En algunas realizaciones, la región constante se aglutina para la glicosilación ligada a N mediante la mutación del residuo de unión del oligosacárido y/o de los residuos flanqueantes que forman parte de la secuencia de reconocimiento de la glicosilación N en la región constante. Por ejemplo, el sitio N297 de glicosilación N puede mutarse a, por ejemplo, A, Q, K o H. Véase, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989y Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. En algunas realizaciones, la región constante se aglutina para la glicosilación ligada a N. La región constante puede ser aglicosilada para la glicosilación ligada a N enzimáticamente (tal como la eliminación de carbohidratos por la enzima PNGasa), o por expresión en una célula huésped deficiente en glicosilación.
Otras modificaciones de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados como se describe en la Publicación PCT No. WO 99/58572. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula objetivo, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a toda o parte de una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula objetivo sin desencadenar una lisis significativa dependiente del complemento, o una destrucción mediada por células del objetivo. En algunas realizaciones, el dominio efector es capaz de unirse específicamente a FcRn y/o FcYRIlb. Suelen basarse en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de esta manera son particularmente adecuados para su uso en la terapia crónica de anticuerpos, para evitar reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas a la terapia convencional de anticuerpos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada que tiene una mayor afinidad de unión al FcRn y/o una mayor vida media en suero en comparación con el anticuerpo no modificado.
En un procedimiento conocido como "germlineado", ciertos aminoácidos en las secuencias VH y VL pueden ser mutados para coincidir con los que se encuentran naturalmente en las secuencias VH y VL de la línea germinal. En particular, las secuencias de aminoácidos de las regiones marco en las secuencias VH y VL pueden mutarse para que coincidan con las secuencias de la línea germinal para reducir el riesgo de inmunogenicidad cuando se administra el anticuerpo. Las secuencias de ADN de la línea germinal de los genes humanos VH y VL son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "Vbase"; véase también Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798y Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836).
Otro tipo de sustitución de aminoácidos que puede realizarse es para eliminar sitios proteolíticos potenciales en el anticuerpo. Dichos sitios pueden ocurrir en una región CDR o marco de un dominio variable o en la región constante de un anticuerpo. La sustitución de los residuos de cisteína y la eliminación de los sitios proteolíticos pueden disminuir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpos y aumentar así su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácidos consiste en eliminar los pares asparagina-glicina, que forman sitios potenciales de desamidación, alterando uno o ambos residuos. En otro ejemplo, se puede escindir la lisina terminal C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención. En diversas realizaciones de la invención, las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anti-PD-1 pueden incluir opcionalmente una secuencia de señal.
Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL de la presente invención, estos fragmentos de ADN pueden manipularse aún más mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpos de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica Vl o VH se enlaza operativamente con otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "operativamente enlazado", tal como se utiliza en este contexto, significa que los dos fragmentos de ADN se unen de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.
El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa mediante la unión operativa del ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante la amplificación estándar por PCR. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante IgG1, IgG2 , IgGs , IgG4 , IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo más preferible es una región constante IgG1 o IgG2. La secuencia de la región constante de IgG puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos que se conocen entre los distintos individuos, tales como Gm(1), Gm(2), Gm(3) y Gm(17). Estos alotipos representan la sustitución natural de aminoácidos en las regiones constantes de la IgG1. En el caso de un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede estar unido operativamente a otra molécula de ADN que codifica únicamente la región constante CH1 de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada CH1 puede derivarse de cualquiera de los genes de la cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera Fab) mediante la unión operativa del ADN que codifica VL con otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante la amplificación estándar por PCR. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. La región constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos que se sabe que se dan entre diferentes individuos, tales como Inv(1), Inv(2) e Inv(3). La región constante lambda puede derivarse de cualquiera de los tres genes lambda.
Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se enlazan operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, de manera que las secuencias VH y VL pueden expresarse como una proteína contigua de cadena única, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (Véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423-426 Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 McCafferty y otros, 1990, Nature 348:552-554. Un ejemplo de péptido de enlace es (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 19), que hace de puente de aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxi de una región variable y el extremo amino de la otra región variable. Se han diseñado y utilizado enlazadores de otras secuencias (Bird et al., 1988, supra). Los enlazadores pueden, a su vez, modificarse para realizar funciones adicionales, tales como la fijación de fármacos o la sujeción a soportes sólidos. El anticuerpo de cadena simple puede ser monovalente, si se utiliza una sola VH y VL, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL. Se pueden generar anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unen específicamente a PD-1 y a otra molécula. Las variantes de cadena única pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, se puede introducir un plásmido adecuado que contenga el polinucleótido que codifica scFv en una célula huésped adecuada, ya sea eucariótica, tal como la levadura, la planta, el insecto o las células de mamífero, o procariótica, tal como E. coli. Los polinucleótidos que codifican scFv de interés pueden hacerse mediante manipulaciones rutinarias tal como la ligadura de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.
También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123).
Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente, también están dentro del alcance de la invención. Dichos anticuerpos se han utilizado para dirigir las células del sistema inmunitario hacia las células no deseadas (Patente EE.UU No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (Publicación PCT Nos. WO 91/00360 y WO 92/200373 documento EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Los agentes y técnicas de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en Patente de EE.UU No. 4,676,980.
Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos de química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Algunos ejemplos de reactivos adecuados para este fin son el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.
La divulgación también abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones, puede hacerse un anticuerpo de fusión que comprenda todo o una porción de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención unido a otro polipéptido. En otra realización, sólo los dominios variables del anticuerpo anti-PD-1 están enlazados al polipéptido. En otra realización, el dominio VH de un anticuerpo anti-PD-1 está vinculado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-PD-1 está vinculado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de manera que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí para formar un sitio de unión al antígeno. En otra realización preferida, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazador de manera que los dominios VH y VL puedan interactuar entre sí. El anticuerpo VH-enlazados- VL se une entonces al polipéptido de interés. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que se unen dos (o más) anticuerpos de cadena única. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una sola cadena polipeptídica, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico.
En algunas realizaciones, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la región de cadena ligera variable mostrada en la SEQ ID NO: 2, 7, 8 o 9 y/o al menos 10 aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 3, 4, 5 o 6. En otras realizaciones, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de la cadena ligera variable y/o al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de la cadena pesada variable. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada, como se muestra en cualquiera de los pares de secuencias seleccionadas de entre las SEQ ID NO: 2 y 3, 7 y 3, 8 y 3, 89 y 3, 2 y 4, 7 y 4, 8 y 4, 9 y 4, 2 y 5, 7 y 5, 8 y 5, 9 y 5, 2 y 6, 7 y 6, 8 y 6, y 9 y 6. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una o más CDR. En otras realizaciones, el polipéptido de fusión comprende VH CDR3 y/o VL CDR3. A efectos de esta invención, una proteína de fusión contiene uno o más anticuerpos y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región. Las secuencias heterólogas ejemplares incluyen, pero no se limitan a una "etiqueta" tal como una etiqueta FLAG o una etiqueta 6His. Las etiquetas son bien conocidas en la técnica.
Un polipéptido de fusión puede crearse por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, sintética o recombinantemente. Típicamente, las proteínas de fusión de esta invención se hacen preparando y expresando un polinucleótido que las codifica utilizando los procedimientos recombinantes descritos en el presente documento, aunque también pueden prepararse por otros medios conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la síntesis química.
En otras realizaciones, pueden prepararse otros anticuerpos modificados utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-PD-1. Por ejemplo, los "cuerpos Kappa" (III et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57), "Minicuerpos" (Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9), "Diabodies" (Holliger et al., supra), o "Janusins" (Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659 y Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52) pueden prepararse utilizando técnicas biológicas moleculares estándar siguiendo las enseñanzas de la especificación.
Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes, pueden prepararse utilizando los anticuerpos divulgados en el presente documento. Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos biespecíficos o fragmentos de unión a antígenos mediante la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Inmunol. 79:315-321, Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basaba en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulinas de cadena pesada-cadena ligera, con las dos cadenas pesadas de diferente especificidad (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formarse como "diacuerpos" o "Janusins" En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico se une a dos epítopos diferentes de PD-1. En algunas realizaciones, los anticuerpos modificados descritos anteriormente se preparan utilizando uno o más de los dominios variables o regiones CDR de un anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento.
De acuerdo con un enfoque para fabricar anticuerpos biespecíficos, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de la región constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, esté presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las relaciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las realizaciones donde las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da lugar a altos rendimientos o cuando las relaciones no son especialmente significativas.
En un enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada de inmunoglobulina híbrida-cadena ligera (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas. Este enfoque se describe en Publicación PCT No. WO 94/04690.
La presente divulgación también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos conjugados (por ejemplo, enlazados) a un agente que facilita el acoplamiento a un soporte sólido (tal como la biotina o la avidina). Para simplificar, se hará referencia en general a los anticuerpos, entendiendo que estos procedimientos se aplican a cualquiera de las realizaciones de unión a PD-1 y/o antagonistas descritas en el presente documento. La conjugación se refiere generalmente al enlazado de estos componentes como se describe en el presente documento. EL enlazado (que generalmente es la fijación de estos componentes en asociación próxima, al menos para la administración) puede lograrse de cualquier manera. Por ejemplo, una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo de salida (por ejemplo, un haluro) en el otro.
Los anticuerpos pueden unirse a muchos portadores diferentes. Los portadores pueden ser activos y/o inertes. Algunos ejemplos de portadores conocidos son polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, vidrio, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble a efectos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros portadores adecuados para la unión de anticuerpos, o podrán determinarlos mediante experimentación rutinaria. En algunas realizaciones, el portador comprende una fracción que se dirige al pulmón, al corazón o a la válvula del corazón.
Un anticuerpo o polipéptido de la presente divulgación puede estar vinculado a un agente de etiquetado tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otra etiqueta conocida en la técnica. Se conocen etiquetas en la técnica que generalmente proporcionan (directa o indirectamente) una señal.
Polinucleótidos, vectores y células huésped
La divulgación también proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos y anticuerpos modificados descritos en el presente documento, tal como, por ejemplo, anticuerpos que tienen una función efectora deteriorada. En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para hacer cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Los polinucleótidos pueden fabricarse y expresarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. En consecuencia, la divulgación proporciona polinucleótidos o composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden polinucleótidos, que codifican cualquiera de los siguientes: los anticuerpos mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb7, mAb8, mAb9, mAb10, mAb11, mAb12, mAb13, mAb14, mAb15, mAb16, y mAb17 o cualquier fragmento o parte de los mismos que tienen la capacidad de antagonizar PD-1.
Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de estas secuencias también se incluyen en la presente divulgación. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNhn, que contienen intrones y se corresponden con una molécula de ADN de manera unívoca, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones de manera que la inmunoreactividad del polipéptido codificado no disminuye, en relación con una molécula inmunoreactiva nativa. El efecto sobre la inmunoreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en el presente documento. Las variantes exhiben preferentemente al menos aproximadamente 70 % de identidad, más preferentemente, al menos aproximadamente 80 % de identidad, aún más preferentemente, al menos aproximadamente 90 % de identidad, y más preferentemente, al menos aproximadamente 95 % de identidad con una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo nativo o un fragmento del mismo.
Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan normalmente comparando las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, o 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima.
La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede realizarse utilizando el programa MegAlign® de la suite de software bioinformático Lasergene® (DNASTAR®, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington d C Vol. 5, Suppl. 3, pp.
345-358 Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153 Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17 Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105 Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425 Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Preferentemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, brechas) del 20 por ciento o menos, generalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia.
Las variantes pueden también, o alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen nativo, o una porción o complemento del mismo. Dichas variantes polinucleotídicas son capaces de hibridarse bajo condiciones moderadamente estrictas con una secuencia de ADN natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).
Unas "condiciones moderadamente estrictas" adecuadas incluyen el prelavado en una solución de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridación a 50 °C-65 °C, 5 X SSC, durante toda la noche; seguido de dos lavados a 65 °C durante 20 minutos con cada una de las soluciones 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contienen 0,1 % SDS.
Tal como se utiliza en el presente documento, las "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad" son aquellas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecil sulfato de sodio 0,1 % a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizador, tal como la formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino 0,1 % de /Ficoll 0,1% /polivinilpirrolidona 0,1de /tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M ), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS 0,1 % y sulfato de dextrano 10 % a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida 50 % a 55°C, seguidos de un lavado de alta intensidad consistente en 0,1 x SSC con EDTA a 55 °C. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
Los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido tal como el descrito en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en la presente divulgación. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento están dentro del alcance de la presente divulgación. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, aunque no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse mediante técnicas estándar (tal como la hibridación, la amplificación y/o la comparación de secuencias en bases de datos).
Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden obtenerse mediante síntesis química, procedimientos recombinantes o PCR. Los procedimientos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en el presente documento. Un experto en la técnica puede utilizar las secuencias proporcionadas en el presente documento y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.
Para preparar polinucleótidos utilizando procedimientos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada puede insertarse en un vector adecuado, y el vector, a su vez, puede introducirse en una célula huésped adecuada para su replicación y amplificación, como se explica más adelante. Los polinucleótidos pueden insertarse en las células huésped por cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede aislarse de la célula huésped por procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989.
Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es bien conocida en la técnica y se describe en la Patente de EE. UU. Nos. 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 y 4,683,202así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
El ARN puede obtenerse utilizando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN se puede aislar utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, como se expone en Sambrook et al., 1989, supra, por ejemplo.
Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándar, o pueden seleccionarse de entre un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula huésped que se pretenda utilizar, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer un único objetivo para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden llevar genes para un marcador que pueda utilizarse en la selección de clones que contengan el vector. Algunos ejemplos adecuados son los plásmidos y los virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ADN de fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Strategene e Invitrogen.
Se proporcionan además vectores de expresión. Los vectores de expresión generalmente son construcciones polinucleotídicas replicables que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. Se da por supuesto que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped, ya sea como episomas o como parte integrante del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, los plásmidos, los vectores virales, incluyendo los adenovirus, los virus adeno-asociados, los retrovirus, los cósmidos y los vectores de expresión divulgados en Publicación PCT No. WO 87/04462. Los componentes del vector generalmente pueden incluir, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos adecuados de control transcripcional (tales como promotores, potenciadores y terminadores). Para la expresión (es decir, la traducción), también suelen ser necesarios uno o más elementos de control de la traducción, tal como los sitios de unión al ribosoma, los sitios de iniciación de la traducción y los codones de parada.
Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped por cualquiera de un número de medios apropiados, incluyendo la electroporación, la transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; el bombardeo de microproyectos; la lipofección; y la infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso tal como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.
La divulgación también proporciona células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Para aislar los genes que codifican el anticuerpo, el polipéptido o la proteína de interés, puede utilizarse cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogo. Ejemplos no limitantes de células huésped de mamíferos incluyen, pero no se limitan a las células COS, HeLa y CHO. Véase también Publicación PCT No. W o 87/04462. Las células huésped no mamíferas adecuadas incluyen procariotas (tales como E. coli o B. subtillis) y levaduras (tales como S. cerevisae, S. pombe; o K. lactis). Preferentemente, las células huésped expresan los ADNc a un nivel aproximadamente 5 veces mayor, más preferentemente, 10 veces mayor, incluso más preferentemente, 20 veces mayor que el del correspondiente anticuerpo endógeno o proteína de interés, si está presente, en las células huésped. El cribado de las células huésped para una unión específica a PD-1 o a un dominio PD-1 se realiza mediante un inmunoensayo o FACS. Se puede identificar una célula que sobreexprese el anticuerpo o la proteína de interés.
Se puede utilizar un vector de expresión para dirigir la expresión de un anticuerpo antagonista anti-PD-1. Un experto en la técnica está familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nos. 6,436,908 6,413,942y 6,376,471. La administración de los vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, incluyendo la inyección, la administración oral, la administración con pistola de partículas o con catéter, y la administración tópica. En otra realización, el vector de expresión se administra directamente en el tronco o ganglio simpático, o en una arteria coronaria, aurícula, ventrículo o pericardio.
También puede utilizarse la entrega dirigida de composiciones terapéuticas que contengan un vector de expresión o polinucleótidos subgenómicos. Las técnicas de entrega de ADN mediadas por receptores se describen, por ejemplo, en Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202 Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994 Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621 Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542 Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 1990, 87:3655 Wu et al., J. Biol. Chem, 1991, 266:338. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para su administración local en un protocolo de terapia génica. Durante un protocolo de terapia génica también pueden utilizarse intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 500 pg y de aproximadamente 20 pg a aproximadamente 100 pg de a Dn . Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos pueden administrarse utilizando vehículos de administración de genes. El vehículo de entrega de genes puede ser de origen viral o no viral (véase en general, Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51 Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845 Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185y Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148). La expresión de estas secuencias codificantes puede inducirse utilizando promotores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificadora puede ser constitutiva o regulada.
Los vectores basados en virus para la entrega de un polinucleótido deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los vehículos virales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los retrovirus recombinantes (véase, por ejemplo, Publicación PCT Nos. WO 90/07936 WO 94/03622 WO 93/25698 WO 93/25234 WO 93/11230 WO 93/10218 WO 91/02805 Patente de EE.UU. Nos. 5, 219,740 y 4,777,127 Patente del Reino Unido No. 2,200,651y Patente EP No. 0345242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores del virus Sindbis, el virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), el virus del río Ross (ATc C VR-373; ATCC VR-1246) y el virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y vectores del virus adeno-asociado (AAV) (véase, por ejemplo Publicación PCT Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; el documento WO 93/19191; el documento WO 94/28938; y el documento WO 95/11984 y el documento WO 95/00655). La administración de ADN ligado a adenovirus muertos como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147 también puede emplearse.
También se pueden emplear vehículos y procedimientos de entrega no virales, incluyendo, pero sin limitarse a ello, el ADN condensado policíclico unido o no al adenovirus muerto solo (véase, por ejemplo, Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147); ADN ligado a ligandos (véase, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985); vehículos de entrega de células eucariotas (véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5,814,482 Publicación PCT Nos. WO 95/07994, WO 96/17072 WO 95/30763y W o 97/42338) y la neutralización o fusión de la carga nucleica con las membranas celulares. También se puede emplear el ADN desnudo. Se describen procedimientos ejemplares de introducción de ADN desnudo en la Publicación PCT No. WO 90/11092 y en Patente de EE. UU. No. 5,580,859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de entrega de genes se describen en la Patente de EE. UU. No. 5,422,120; Publicación PCT Nos. WO 95/13796; el documento WO 94/23697; el documento WO 91/14445; y el documento EP 0524968. Otros enfoques se describen en Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411 y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581.
Composiciones
La divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento. También se describen en el presente documento ejemplos de tales composiciones, así como la forma de formularlas. En algunas realizaciones, la composición comprende uno o más anticuerpos PD-1. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 reconoce a PD-1. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo humano. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una región constante que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria deseada, tal como la lisis mediada por anticuerpos o la ADCC. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una región constante que no desencadena una respuesta inmunitaria no deseada o indeseable, tal como la lisis mediada por anticuerpos o la ADCC. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una o más CDR del anticuerpo (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco o, en algunas realizaciones, las seis CDR).
Se entiende que las composiciones pueden comprender más de un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, una mezcla de anticuerpos PD-1 que reconocen diferentes epítopos de PD-1). Otras composiciones ejemplares comprenden más de un anticuerpo anti-PD-1 que reconoce los mismo epítopos, o diferentes especies de anticuerpos anti-PD-1 que se unen a diferentes epítopos de PD-1. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden una mezcla de anticuerpos anti-PD-1 que reconocen diferentes variantes de PD-1.
La composición utilizada en la presente divulgación puede comprender además portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metilo o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o los dextranos; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína)., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen además en el presente documento.
El anticuerpo anti-PD-1 y las composiciones del mismo también pueden usarse junto con, o administrarse por separado, simultánea o secuencialmente con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.
La divulgación también proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden cualquiera de los polinucleótidos de la invención. En algunas realizaciones, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo como se describe en el presente documento. En otra realización, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento.
Procedimientos para prevenir o tratar afecciones mediadas por PD-1
Los anticuerpos y los conjugados de anticuerpos de la presente divulgación son útiles en diversas aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de tratamiento terapéutico y procedimientos de tratamiento de diagnóstico.
En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar un cáncer. En algunas realizaciones, el procedimiento para tratar un cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto que necesita el mismo, una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende cualquiera de los anticuerpos PD-1 descritos en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, los cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, glioblastoma, glioma, tumor cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de útero, cáncer de huesos, leucemia, linfoma, sarcoma, cáncer de sangre, cáncer de tiroides, cáncer tímico, cáncer de ojos y cáncer de piel. En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto, que comprende la administración al sujeto que necesita el mismo, de una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos PD-1 o los conjugados de anticuerpos PD-1 como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor que expresa PD-L1. En otras realizaciones, el tumor no expresa PD-L1. En otras realizaciones, se proporciona un procedimiento para inhibir la metástasis de las células cancerosas en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que necesita el mismo, una cantidad eficaz de una composición que comprende cualquiera de los anticuerpos PD-1 descritos en el presente documento. En otras realizaciones, se proporciona un procedimiento para inducir la regresión de un tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que necesita el mismo una cantidad eficaz de una composición que comprende cualquiera de los anticuerpos PD-1 descritos en el presente documento.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar, diagnosticar y/o controlar un cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos PD-1 descritos en el presente documento pueden ser marcados con una fracción detectable, tal como un agente de imagen y una etiqueta de sustrato enzimático. Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo, tal como la obtención de imágenes in vivo (por ejemplo, PET o SPECT), o un reactivo de tinción.
En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden además un paso de tratamiento de un sujeto con una forma adicional de terapia. En algunas realizaciones, la forma adicional de terapia es una terapia adicional contra el cáncer que incluye, pero no se limita a, quimioterapia, radiación, cirugía, terapia hormonal y/o inmunoterapia adicional.
Con respecto a todos los procedimientos descritos en el presente documento, la referencia a los anticuerpos antagonistas anti-PD-1 también incluye composiciones que comprenden uno o más agentes adicionales. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, talescomo excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo tampones, que son bien conocidos en la técnica. La presente invención puede utilizarse sola 0 en combinación con otros procedimientos de tratamiento.
El anticuerpo antagonista anti-PD-1 puede administrarse a un sujeto por cualquier vía adecuada. Debería ser evidente para un experto en la técnica que los ejemplos descritos en el presente documento no pretenden ser limitativos, sino ilustrativos de las técnicas disponibles. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 se administra a un sujeto de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa, por ejemplo, en forma de bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, transdérmica, subcutánea, intraarticular, sublingual, intrasinovial, por insuflación, intratecal, oral, por inhalación o tópica. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, intravenosa, o localizada. Los nebulizadores disponibles en el mercado para formulaciones líquidas, incluyendo los nebulizadores de chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para su administración. Las formulaciones líquidas pueden nebulizarse directamente y el polvo liofilizado puede nebulizarse tras su reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 puede ser aerosolizado usando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis medida, o inhalado como un polvo liofilizado y molido.
En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-PD-1 se administra a través de técnicas de administración local específica o dirigida. Entre los ejemplos de técnicas de administración local específica o dirigida se incluyen diversas fuentes de depósito implantables del anticuerpo antagonista anti-PD-1 o catéteres de administración local, tales como catéteres de infusión, catéteres permanentes o catéteres de aguja, injertos sintéticos, envolturas adventicias, derivaciones y mallas extensibles u otros dispositivos implantables, portadores específicos del lugar, inyección directa o aplicación directa. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT No. W o 00/53211 y la Patente de EE. UU. No. 5,981,568.
Pueden utilizarse diversas formulaciones de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 para su administración. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 puede administrarse puro. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden estar en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estabilizadores, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración en la piel. Los excipientes, así como las formulaciones para la administración de medicamentos parenterales y no parenterales, se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20va Edición. Ediciones Mack, 2000.
En algunas realizaciones, estos agentes están formulados para su administración por inyección (por ejemplo, por vía intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En consecuencia, estos agentes pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares. El régimen de dosificación concreto, es decir, la dosis, el momento y la repetición, dependerá de cada persona y de su historial médico.
Un anticuerpo antagonista anti-PD-1 puede ser administrado usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo por inyección (por ejemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, etc.). Los anticuerpos anti-PD-1 también pueden administrarse por vía tópica o por inhalación, como se describe en el presente documento. En general, para la administración de anticuerpos anti-PD-1, una dosis inicial candidata puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. Para los efectos de la presente invención, una dosificación diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, 30 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Por ejemplo, pueden utilizarse dosis de aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg. En administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas o hasta que se alcanzan niveles terapéuticos suficientes, por ejemplo, para reducir los síntomas asociados al cáncer. El progreso de esta terapia se puede controlar fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluyendo el anticuerpo antagonista anti-PD-1 utilizado) puede variar con el tiempo.
Para los efectos de la presente divulgación, la dosificación adecuada de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 dependerá del anticuerpo antagonista anti-PD-1 (o de sus composiciones) empleado, del tipo y la gravedad de los síntomas que se van a tratar, de si el agente se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, del historial clínico del paciente y de su respuesta al agente, del índice de eliminación del paciente para el agente administrado y de la discreción del médico que lo atiende. Por lo general, el médico administrará un anticuerpo antagonista anti-PD-1 hasta alcanzar una dosificación que logre el resultado deseado. La dosis y/o la frecuencia pueden variar a lo largo del tratamiento. Las consideraciones empíricas, tales como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunitario humano, tales como los anticuerpos humanizados o los anticuerpos totalmente humanos, pueden utilizarse para prolongar la vida media del anticuerpo y evitar que éste sea atacado por el sistema inmunitario del huésped. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse a lo largo de la terapia, y generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o la supresión y/o la mejora y/o el retraso de los síntomas. Alternativamente, pueden ser apropiadas las formulaciones de liberación continúa sostenida de anticuerpos antagonistas anti-PD-1. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida.
En una realización, las dosis de un anticuerpo antagonista pueden determinarse empíricamente en individuos que han recibido una o más administraciones de un anticuerpo antagonista. Los individuos reciben dosificaciones incrementales de un anticuerpo antagonista anti-PD-1. Para evaluar la eficacia, se puede seguir un indicador de la enfermedad.
La administración de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y de otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas.
En algunas realizaciones, puede haber más de un anticuerpo antagonista anti-PD-1. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco anticuerpos antagonistas diferentes. En general, esos anticuerpos antagonistas de la PD-1 pueden tener actividades complementarias que no se afectan mutuamente. Un anticuerpo antagonista anti-PD-1 también puede utilizarse junto con otros anticuerpos y/o otras terapias. Un anticuerpo antagonista anti-PD-1 también puede utilizarse junto con otros agentes que sirven para potenciar y/o complementar la eficacia de los mismos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 puede administrarse en combinación con la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos incluyen, pero no se limitan a, la administración de un agente quimioterapéutico, una vacuna, una terapia con base en células T CAR, radioterapia, una terapia de citoquinas, una vacuna, un anticuerpo biespecífico anti-PD-1, un inhibidor de otras vías inmunosupresoras, un inhibidor de la angiogénesis, un activador de células T un inhibidor de una vía metabólica, un inhalador de mTOR, un inhibidor de una vía de adenosina, un inhibidor de tirosina quinasa, incluyendo pero sin limitarse a inlyta, inhibidores de ALK y sunitinib, un inhibidor de BRAF, un modificador epigenético, un inhibidor o depletor de células Treg y/o de células supresoras derivadas de mieloides, un inhibidor de JAK, un inhibidor de STAT, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, un agente bioterapéutico (incluyendo, pero sin limitarse a, los anticuerpos contra VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, otros receptores de factores de crecimiento, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB e ICOS), un agente inmunógeno (por ejemplo, células cancerosas atenuadas, antígenos tumorales, células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas pulsadas con antígenos o ácidos nucleicos derivados del tumor, citoquinas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF), y células transfectadas con genes que codifican citoquinas inmunoestimulantes tales como, pero no limitadas al GM-CSF). Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se encuentran los agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquilsulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calilistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) criptofecinas (en particular criptofcina 1 y criptofecina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo losanálogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clorafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y mostaza uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedición (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma1l y calicheamicina phil1, véase, por ejemplo Agnew, Chem. Ed. Intl. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bifosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos antibióticos relacionados enediina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), doxorubicina liposomal pegilada, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de las purinas tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina análogos de las pirimidinas tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotílica; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; razoxano; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, la verracurina A, la roridina A y la anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y doxetaxel; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos del platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas en los tumores, tales como los antiestrógenos y los moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (SERM), que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol, exemestano, formestano, fadrozol, vorozol, letrozol y anastrozol; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-PD-1 se utiliza junto con uno o más agentes terapéuticos dirigidos a un modulador del punto de control inmunitario, tales como, por ejemplo, sin limitación, un agente dirigido a PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1(CD66a ), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2,, vía CD39-CD73-adenosina (A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CCR4, CCR8, CCR5, vía VEGF, CSF-1, o un modulador de la respuesta inmunitaria innata. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-PD-1 se utiliza junto con, por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-PD-L1 tal como, por ejemplo, BMS-936559 (MDX-1105) y MPDL3280A; un anticuerpo antagonista anti-PD-1 tal como, por ejemplo, nivolumab, pembrolizumab y pidilizumab; un anticuerpo antagonista anti-CTLA-4 tal como, por ejemplo, ipilimumab; un anticuerpo antagonista anti-LAG-3 tal como, por ejemplo, BMS-986016 e IMP701 un anticuerpo antagonista antiTIM-3; un anticuerpo antagonista anti-B7-H3 tal como, por ejemplo, MGA271; un anticuerpo antagonista anti-VISTA; un anticuerpo antagonista anti-TIGIT; un anticuerpo anti-CD28; un anticuerpo anti-CD80; un anticuerpo anti-CD86; un anticuerpo antagonista anti-B7-H4; un anticuerpo agonista anti-ICOS; un anticuerpo agonista anti-CD28; un modulador de la respuesta inmunitaria innata (por ejemplo, TLRs, KIR, NKG2A), y un inhibidor de IDO. En algunas realizaciones, se utiliza un anticuerpo antagonista anti-PD-1 junto con un agonista 4-1BB (CD137) tal como, por ejemplo, PF-05082566 o BMS-663513. En algunas realizaciones, se utiliza un anticuerpo antagonista anti-PD-1 junto con un agonista OX40 tal como, por ejemplo, un anticuerpo agonista anti-OX-40. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-PD-1 se utiliza junto con un agonista GITR tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR tal como, por ejemplo, sin limitación, TRX518. En algunas realizaciones, se utiliza un anticuerpo antagonista anti-PD-1 junto con un inhibidor de IDO. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-PD-1 se utiliza junto con una terapia de citoquinas tal como, por ejemplo, sin limitación, IL-15, CSF-1, MCSF-1, etc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-PD-1 se utiliza junto con uno o más anticuerpos terapéuticos, tales como, por ejemplo, sin limitación, un anticuerpo dirigido a CD19, CD22, CD40, CD52 o CCR4.
En algunas realizaciones, la terapia con anticuerpos anti-PD-1 puede preceder o seguir el tratamiento con otro agente en intervalos que van desde minutos hasta semanas. En las realizaciones en las que los otros agentes y/o las proteínas o los polinucleótidos se administran por separado, uno se aseguraría generalmente de que no transcurriera un período de tiempo significativo entre cada entrega, de manera que el agente y la composición de la presente invención aún pudieran ejercer un efecto combinado ventajoso sobre el sujeto. En tales casos, se contempla que se pueden administrar ambas modalidades con un intervalo de aproximadamente 12-24 horas y, más preferentemente, con un intervalo de aproximadamente 6-12 horas. Sin embargo, en algunas situaciones, puede ser deseable prolongar significativamente el período de administración, cuando transcurren desde varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) hasta varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las respectivas administraciones.
En algunas realizaciones, una composición de anticuerpos antagonistas anti-PD-1 comprende un segundo agente seleccionado entre crizotinib, palbociclib, gemcitabina, ciclofosfamida, fluorouracilo, FOLFOX, ácido folínico, oxaliplatino, axitinib, malato de sunitinib, tofacitinib, bevacizumab, rituximab y traztuzumab.
En algunas realizaciones, una composición de anticuerpos anti-PD-1 se combina con un régimen de tratamiento que comprende además una terapia tradicional seleccionada del grupo que consiste en: cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia orientada, inmunoterapia, terapia hormonal, inhibición de la angiogénesis y cuidados paliativos.
Uso de los anticuerpos PD-1 en regímenes de inmunoterapia con base en vacunas para el cáncer
En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un cáncer en un mamífero, particularmente un humano, cuyo procedimiento comprende administrar al mamífero que recibe la vacuna una cantidad eficaz de anticuerpo antagonista anti-PD-1 proporcionado por la presente divulgación. En algunas otras realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar un cáncer en un mamífero, particularmente un humano, cuyo procedimiento comprende administrar al mamífero (1) una cantidad eficaz de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra las células del cáncer y (2) una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista anti-PD-1 proporcionado por la presente divulgación. El procedimiento de tratamiento de un trastorno neoplásico en un mamífero y el procedimiento de mejora de la inmunogenicidad o del efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un trastorno neoplásico en un mamífero descritos en el presente documento se denominan colectivamente "regímenes de inmunoterapia con base en vacunas para el cáncer" (o "VBIR para el cáncer").
En el VBIR para el cáncer, la vacuna puede estar en cualquier forma o formulaciones, tales como (i) vacunas con base en células, (ii) vacunas de subunidades, (iii) vacunas con base en proteínas, (iv) vacunas con base en péptidos, o (v) vacunas con base en ácidos nucleicos (tales como vacunas con base en ADN, vacunas con base en ARN, vacunas con base en plásmidos, o vacunas con base en vectores virales).
El VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación puede ser aplicable para cualquier tipo de cánceres. Algunos ejemplos de cánceres específicos son: cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma multiforme, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de mama y cáncer de cabeza y cuello.
Las vacunas destinadas a tratar cánceres suelen contener un antígeno (en forma de péptido, proteína, componente celular, célula completa o una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno con base en péptidos) que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un tAa particular expresado en o por las células del tumor objetivo. Se conocen muchos TAA en la técnica. Entre los ejemplos de TAA conocidos se encuentran: PSA, PSCA y PSMA para el cáncer de próstata; CEA, MUC-1, Ep-CAM, 5T4 , hCG-b, K-ras y TERT para el cáncer colorrectal; CEA, Muc-1, p53, mesotelina, Survivin y NY-ESO-1 para el cáncer de ovario; Muc-1, 5t 4, WT-1, TERT, CEA, EGF-R y MAGE-A3 para el cáncer de pulmón de células no pequeñas; 5T4 para el carcinoma de células renales; y Muc-1, mesotelina, K-Ras, Annexin A2, TERT y CEA para el cáncer de páncreas. En algunas realizaciones particulares, la vacuna utilizada en el VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en:
(1) una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un TAA seleccionado entre PSA, PSCA, PSMA, CEA, MUC-1, TERT, mesotelina, EGF-R o MAGE-A3;
(2) una vacuna que contiene un antígeno peptídico derivado de un TAA seleccionado entre PSA, PSCA, PSMA, CEA, MUC-1, TERT, mesotelina, EGF-R o MAGE-A3; y
(3) una vacuna que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno peptídico, en la que el antígeno peptídico se deriva de un TAA seleccionado entre PSA, PSCA, PSMA, CeA, MUC-1, TERT, mesotelina, e Gf -R o MAGE-A3.
En otras realizaciones particulares, la vacuna contiene una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos inmunógenos derivados del PSA, uno o más polipéptidos inmunógenos derivados del PSCA, o uno o más polipéptidos inmunógenos derivados del PSMA.
En una realización específica, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:
(1) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico derivado del PSMA humano de la SEQ ID NO:42;
(2) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico que comprende los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO:42;
(3) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43, o una variante degenerada del mismo;
(4) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 44, o una variante degenerada del mismo;
(5) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 45, o una variante degenerada del mismo;
(6) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 46, o una variante degenerada del mismo;
(7) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico derivado del PSA humano de la SEQ ID NO:47;
(8) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico que comprende los aminoácidos 25-261 de la SEQ ID NO:47;
(9) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico derivado del PSCA humano de la SEQ ID NO:48;
(10) una molécula de ácido nucleico que codifica (i) un polipéptido inmunógeno derivado del PSMA humano de la SEQ ID NO:42, (ii) ) un polipéptido inmunógeno derivado del PSA humano de la SEQ ID NO:47, y (iii) un polipéptido inmunógeno derivado del PSCA humano de la SEQ ID NO:48; y
(11) una molécula de ácido nucleico que codifica (i) un polipéptido inmunogénico que comprende los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO:42, (ii) un polipéptido inmunogénico que comprende los aminoácidos 25-261 de la SEQ ID NO:47, y (iii) un polipéptido inmunogénico de la SEQ ID NO:48.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos inmunogénicos derivados de antígenos asociados a la próstata pueden estar en forma de plásmidos o vectores. Un ejemplo de dicho plásmido es el constructo de ácido nucleico de s Eq ID NO:46 (también denominado plásmido 458). La secuencia de nucleótidos de un vector que expresa un polipéptido inmunogénico derivado del PSMA humano se establece en la SEQ ID NO:44 (también denominado vector AdC68W). La secuencia de nucleótidos de un vector que expresa un polipéptido inmunogénico derivado del PSMA humano, un polipéptido inmunogénico derivado del PSA humano y un polipéptido inmunogénico derivado del PSCA humano se establece en la SEQ ID NO:45 y un vector PSMA humano (vector AdC68W-734). Diversos polipéptidos inmunogénicos derivados de PSMA, PSA y PSCA humanos, constructos de ácido nucleico (incluyendo plásmidos y vectores) que codifican dichos polipéptidos inmunogénicos, y procedimientos para preparar los polipéptidos inmunogénicos y los constructos de ácido nucleico, incluyendo el plásmido 458, y el vector AdC68W y AdC68W-734, se divulgan en las publicaciones de solicitudes internacionales WO2013/164754 y WO 2015/063647.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad VH uno (CDR1), VH CDR2 y VH CDR3 de la VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3 de la VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO: 8; y SEQ ID NO: 9.
Cualquier anticuerpo antagonista anti-PD-1 divulgado en la presente divulgación puede utilizarse en el VBIR para el cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-PD-1 comprende una región VH y/o una región VL, en el que la región VH comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, 4, 5 o 6, o una variante con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos en residuos que no están dentro de una CDR, y en la que la región VL comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 7, 8 o 9, o una variante de la misma con una o varias sustituciones de aminoácidos en aminoácidos que no están dentro de una CDR. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 39 y/o una cadena pesada que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 29 o 38. En algunas realizaciones particulares, el anticuerpo comprende una región VH producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-121183. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región VL producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-121182.
El VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación puede comprender además uno o más moduladores inmunitarios (además del anticuerpo antagonista de PD-1 proporcionado por la presente divulgación). Los otros moduladores inmunitarios pueden ser un potenciador de células inmunitarias efectoras ("potenciador IEC") o un inhibidor de células inmunitarias supresoras ("inhibidor ISC"). El potenciador adicional de la IEC o el inhibidor adicional de la ISC pueden utilizarse solos en combinación con el VBIR para el cáncer. El potenciador adicional del IEC y el inhibidor adicional del ISC también pueden utilizarse juntos en combinación con el VBIR para el cáncer.
Ejemplos de clases de inhibidores de ISC incluyen inhibidores de proteína quinasa, inhibidores de ciclooxigenasa-2 (COX-2), inhibidores de fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5) y agentes de entrecruzamiento de ADN. Algunos ejemplos de inhibidores de la COX-2 son el celecoxib y el rofecoxib. Algunos ejemplos de inhibidores de la PDE5 son el avanafilo, el lodenafilo, el mirodenafilo, el sildenafilo, el tadalafilo, el vardenafilo, el udenafilo y el zaprinast. Un ejemplo de agentes de entrecruzamiento del ADN es la ciclofosfamida. El término "inhibidor de la proteína quinasa" se refiere a cualquier sustancia que actúe como inhibidor selectivo o no selectivo de una proteína quinasa. Ejemplos de inhibidores específicos de la proteína quinasa adecuados para su uso en el VBIR para el cáncer incluyen Lapatinib, AZD 2171, ET18OCH 3, Indirubin-3'-oxime, NSC-154020, PD 169316, Quercetina, Roscovitina, Triciribina, ZD 1839, 5-lodotubercidina, Adaphostin, Aloisine, Alsterpaullone, Aminogenistein, API-2, Apigenin, Arctigenina, ARRY-334543, Axitinib (AG-013736), AY-22989, AZD 2171, Bisindolilmaleimida IX, CCI-779, Queleritrina, DMPQ, DRB, Edelfosina, ENMD-981693, Análogo de la erbstatina, Erlotinib, Fasudil, Gefitinib (ZD1839), H-7, H-8, H-89, HA-100, HA-1004, HA-1077, HA-1100, Hidroxifasudil, Kenpaullona, KN-62, KY12420, LFM-A13, Luteolina, LY294002, LY-294002, Mallotoxina, ML-9, MLN608, NSC-226080, NSC-231634, NSC-664704, NSC-680410, NU6102, Olomoucina, Oxindol I, PD 153035, PD 98059, Phloridzin, Piceatannol, Picropodophyllin, PKI, PP1, PP2, PTK787/ZK222584, PTK787/ZK-222584, Purvalanol A, Rapamune, Rapamycin, Ro 31-8220, Rottlerin, SB202190, SB203580, Sirolimus, SL327, SP600125, Estaurosporina, STI-571, SU1498, SU4312, SU5416, SU5416 (Semaxanib), SU6656, SU6668, inhibidor de syk, TBB, TCN, Tyrphostin AG 1024, Tyrphostin AG 490, Tyrphostin AG 825, Tyrphostin AG 957, U0126, W-7, Wortmannin, Y-27632, Zactima (ZD6474), ZM 252868. gefitinib (Iressa.RTM.), malato de sunitinib (SUTENT; SU11248), erlotinib (TARCEVA; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (Gleevec.RTM.; STI571), dasatinib (BMS-354825), leflunomida (SU101), vandetanib (ZACTIMA; ZD6474) y nilotinib.
En algunas realizaciones particulares, el inhibidor de la tirosina quinasa es malato de sunitinib, tosilato de sorafenib o axitinib. El malato de sunitinib, comercializado por Pfizer Inc. con el nombre comercial de SUTENT, se describe químicamente como ácido butanedioico, hidroxi-, (2S)-, compuesto con W-[2-(diet¡lam¡no)etil]-5-[(Z)-(5-fluoro-1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilidina)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida (1:1). El compuesto, su síntesis y los polimorfos particulares se describen en la Pat. de EE. UU. No. 6,573,293. El malato de sunitinib ha sido aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento del tumor del estroma gastrointestinal, el carcinoma de células renales avanzado y los tumores neuroendocrinos pancreáticos progresivos y bien diferenciados en pacientes con enfermedad localmente avanzada o metastásica no resecable. La dosis recomendada de malato de sunitinib para el tumor del estroma gastrointestinal (TEGI) y el carcinoma de células renales (CCR) avanzado en humanos es de 50 mg por vía oral una vez al día, en un esquema de 4 semanas de tratamiento seguidas de 2 semanas de descanso (esquema 4/2). La dosis recomendada de malato de sunitinib para los tumores neuroendocrinos pancreáticos es de 37,5 mg por vía oral una vez al día. En el VBIR para el cáncer, el malato de sunitinib puede administrarse por vía oral en una dosis única o en dosis múltiples. Por lo general, el malato de sunitinib se administra durante dos, tres, cuatro o más dosis semanales consecutivas, seguidas de un período de "descanso" de aproximadamente 1 o 2 semanas, o más, en el que no se administra malato de sunitinib. En una realización, las dosis se administran durante aproximadamente 4 semanas, con 2 semanas de descanso. La cantidad eficaz de malato de sunitinib administrada por vía oral a un ser humano suele ser inferior a 40 mg por persona y día, tal como 37,5, 31,25, 25, 18,75, 12,5 o 6,25 mg por persona y día. En algunas realizaciones, el malato de sunitinib se administra por vía oral en un intervalo de 1 a 25 mg por persona y día. En algunas otras realizaciones, el malato de sunitinib se administra por vía oral en un intervalo de 6,25, 12,5 o 18,75 mg por persona y por dosis. Son previsibles otros regímenes de dosificación y variaciones, que se determinarán mediante la orientación del médico.
El tosilato de sorafenib, que se comercializa con el nombre comercial NEXAVAR, tiene el nombre químico de 4-(4-{3-[4-Cloro-3-(trifluorometil)fenil]ureido}fenoxi)-N-metilpiridina-2-carboxamida. Está aprobado en Estados Unidos para el tratamiento del cáncer primario de riñón (carcinoma de células renales avanzado) y del cáncer primario de hígado avanzado (carcinoma hepatocelular). La dosis diaria recomendada es de 400 mg por vía oral dos veces al día. En el VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación, la cantidad efectiva de tosilato de sorafenib administrada por vía oral es típicamente inferior a 400 mg por persona y día. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva de tosilato de sorafenib administrada por vía oral está en el intervalo de 10 - 300 mg por persona y día. En algunas otras realizaciones, la cantidad eficaz de tosilato de sorafenib administrada por vía oral está entre 10 - 200 mg por persona y día, tal como 10, 20, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 o 200 mg por persona y día.
Axitinib, que se comercializa bajo el nombre comercial INLYTA, tiene el nombre químico de(N-Metii-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinilo)-1H-indazol-6-ilsulfanil]-benzamida. Está aprobado para el tratamiento del carcinoma de células renales avanzado tras el fracaso de una terapia sistémica previa. La dosis inicial es de 5 mg por vía oral dos veces al día. Se puede ajustar la dosis con base en la seguridad y la tolerabilidad individuales. En el VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación, la cantidad efectiva de axitinib administrada por vía oral es típicamente inferior a 5 mg dos veces al día. En algunas otras realizaciones, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral es de entre 1 y 5 mg dos veces al día. En otras realizaciones, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral es de 1, 2, 3, 4 o 5 mg dos veces al día.
Ejemplos de potenciadores de CEI que pueden utilizarse en el VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación incluyen agonistas de t Nf R, antagonistas de CTLA-4, agonistas de TLR, otros antagonistas de PD-1 (tales como BMS-936558 y el anticuerpo anti-PD-1 CT-011), antagonistas de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-L1) (tales como BMS-936559), antagonistas del gen de activación de linfocitos 3 (LAG3) y antagonistas de la molécula que contiene inmunoglobulina y mucina de células T -3 (TIM-3). Los ejemplos de agonistas del TNFR incluyen agonistas del OX40, 4-1BB (tal como Bm S-663513), GITR (tal como TRX518) y CD40. Los ejemplos de agonistas específicos de CD40 se describen en detalle a continuación.
En algunas otras realizaciones, el modulador inmunitario adicional es un anticuerpo agonista anti-CD40. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD40 humano, humanizado o parcialmente humano. Algunos ejemplos de anticuerpos monoclonales específicos anti-CD40 son el G28-5, el mAb89, el anticuerpo monoclonal EA-5 o el S2C6, y el CP870893. En una realización particular, el anticuerpo agonista anti-CD40 es CP870893 o dacetuzumab (SGN-40).
El CP-870,893 es un anticuerpo monoclonal CD40 agonista totalmente humano que ha sido investigado clínicamente como terapia antitumoral. La estructura y la preparación del CP870.893 se describen en el documento W02003040170en el que el anticuerpo CP870,893 se identifica como anticuerpo "21.4.1". Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera del CP-870.893 se exponen en la SEQ ID NO: 46 y la SEQ ID NO: 48, respectivamente, así como en la Tabla 7, en el documento W02003040170. En los ensayos clínicos, el CP870,893 se administró por infusión intravenosa a dosis que generalmente oscilaban entre 0,05 y 0,25 mg/kg por infusión. En el VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación, el CP-870.893 puede administrarse por vía intradérmica, subcutánea o tópica. La cantidad eficaz de CP870893 que debe administrarse en el régimen es generalmente inferior a 0,2 mg/kg, típicamente en el intervalo de 0,01 mg - 0,15 mg/kg, o 0,05 - 0,1 mg/kg.
Dacetuzumab (también conocido como SGN-40 o huS2C6; Número CAS 88-486-59-9) es otro anticuerpo agonista anti-CD40 que se ha investigado en ensayos clínicos para linfomas indolentes, linfomas difusos de células B grandes y mieloma múltiple. En el VBIR para el cáncer proporcionado por la presente divulgación, el dacetuzumab puede administrarse por vía intradérmica, subcutánea o tópica. La cantidad efectiva de dacetuzumab que se va a administrar es generalmente inferior a 16 mg/kg, típicamente en el intervalo de 0,2 mg - 14 mg/kg, o 0,5 -8 mg/kg, o 1 - 5 mg/kg.
En otras realizaciones, el modulador inmunitario adicional es un antagonista anti CTLA-4. Ejemplos de antagonistas de CTLA-4 adecuados incluyen los anticuerpos anti-CTLA-4 (tales como anticuerpos humanos anti-CTLA-4, anticuerpos de ratón anti-CTLA-4, anticuerpos de mamífero anti-CTLA-4, anticuerpos humanizados anti-CTLA-4, anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4, anticuerpos policlonales anti-CTLA-4, anticuerpos quiméricos anti-CTLA-4, anticuerpos de dominio anti-CTLA-4) y los inhibidores de CTLA-4 que agonizan la vía coestimuladora. En algunas realizaciones, el inhibidor de CTLA-4 es Ipilimumab o Tremelimumab.
Ipilimumab (comercializado como YERVOY; también conocido como MEX-010, MDX-101, o por su registro CAS No.
477202-00-9) se divulga como anticuerpo 10DI en Publicación PCT No. WO 01/14424. Los ejemplos de composición farmacéutica que comprende Ipilimumab se proporcionan en la Publicación PCT No. WO 2007/67959. Ipilimumab está aprobado en Estados Unidos para el tratamiento del melanoma irresecable o metastásico. En los procedimientos proporcionados por la presente invención, el ipilimumab puede administrarse por vía intradérmica o subcutánea. La cantidad eficaz de Ipilimumab administrada localmente suele ser del orden de 5 a 200 mg/dosis por persona. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva de Ipilimumab está en el intervalo de 10 - 150 mg/dosis por persona y por dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de ipilimumab es de aproximadamente 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 mg/dosis por persona.
Tremelimumab (también conocido como CP-675.206) es un anticuerpo monoclonal IgG2 totalmente humano y tiene el Número CAS 745013-59-6. El tremelimumab se divulga como anticuerpo 11.2.1 en Patente de EE. UU. No: 6,682,736. En el VBIR para el cáncer proporcionado por la presente invención, el Tremelimumab puede administrarse por vía intravenosa, intradérmica o subcutánea. La cantidad eficaz de Tremelimumab administrada por vía intradérmica o subcutánea puede estar típicamente en el intervalo de 5 a 200 mg/dosis por persona. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva de Tremelimumab está en el intervalo de 10 - 150 mg/dosis por persona y por dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de Tremelimumab es de aproximadamente 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 mg/dosis por persona.
En otras realizaciones, el modulador inmunitario adicional es un agonista del receptor tipo Toll (TLR). El término "agonista del receptor tipo Toll" o "agonista del TLR" se refiere a un compuesto que actúa como agonista de un receptor tipo Toll (TLR). Esto incluye agonistas de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 y TLR11 o una combinación de los mismos.
Los agonistas de TLR útiles en el procedimiento de la presente divulgación incluyen tanto pequeñas moléculas orgánicas como grandes moléculas biológicas. Entre los ejemplos de agonistas de TLR de molécula pequeña se incluyen 4-amino-alfa, alfa,2-trimetil-IH-imidazo[4,5-c]qumolin-I-etanol, N-(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-IH-imidazo[4,5-c]quinolin-I-il]etoxi-}etil)-N-metilmorfolina-4-carboxamida, I~(2~amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil-)-IH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-arnina, N-[4-(4-amino-2-etil-IH-imidazo[4,5- c]quinolin-I-il)butil]metanosulfonamida, N-[4-(4-amino-2-propil-IH-imidazo[4,5-c]quinolin-I-yl)butil]metanosulfonamida, y imiquimod. Algunos agonistas de TLR particularmente útiles en los procedimientos o el régimen proporcionado por la presente divulgación se discuten en el artículo de revisión: Folkert Steinhagen, et al.: TLR-based immune adjuvants. Vaccine 29 (2011): 3341-3355. En algunas realizaciones, los agonistas de TLR son agonistas de TLR9, particularmente oligonucleótidos CpG (o CpG.ODN). Un oligonucleótido CpG es una molécula corta de ácido nucleico que contiene una citosina seguida de una guanina unida por un enlace fosfato en el que el anillo de pirimidina de la citosina no está metilado. Los ejemplos de oligonucleótidos CpG particulares útiles en los procedimientos proporcionados por la presente divulgación incluyen:
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' (CpG 7909; SEQ ID NO:49);
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3' (CpG 24555; SEQ ID NO:50); y
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3' (CpG 10103; SEQ ID NO:51).
El CpG7909, un monocomponente sintético de 24 polímeros, ha sido ampliamente investigado para el tratamiento del cáncer como monoterapia y en combinación con agentes quimioterapéuticos, así como adyuvante para vacunas contra el cáncer y enfermedades infecciosas. En los procedimientos proporcionados por la presente divulgación, CpG7909 puede administrarse por inyección en el músculo o por cualquier otro procedimiento adecuado. Para su uso con una vacuna con base en ácidos nucleicos, tal como una vacuna de ADN, un CpG puede coformularse con la vacuna en una única formulación y administrarse por inyección intramuscular acoplada a la electroporación. La cantidad efectiva de CpG7909 por administración intramuscular, intradérmica o subcutánea suele estar en el intervalo de 10 pg/dosis -10 mg/dosis. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva de CpG7909 está en el intervalo de 0,05 mg - 14 mg/dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad efectiva de CpG7909 es de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 05 1 mg/dosis. Otros oligonucleótidos CpG, incluyendo el CpG 24555 y el CpG 10103, pueden ser administrados de manera similar y en niveles de dosis similares.
En el VBIR para el cáncer, el antagonista anti-PD-1, la vacuna y los moduladores inmunitarios adicionales pueden administrarse simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, una vacuna se administra secuencialmente con respecto al anticuerpo antagonista anti-PD-1, pero simultáneamente (por ejemplo, en una mezcla) con respecto a uno o más moduladores inmunitarios adicionales. En los casos en que una vacuna de ácido nucleico se administra en combinación con un CpG, la vacuna y el CpG pueden estar contenidos en una única formulación y administrarse juntos por cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, la vacuna de ácido nucleico y CpG en una coformulación (mezcla) se administra por inyección intramuscular en combinación con la electroporación.
Formulaciones
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo antagonista anti-PD-1 utilizado de acuerdo con la presente divulgación se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo con el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20va Ed. Mack Publishing, 2000), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes tales como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metilo o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidinala arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono tales como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Los liposomas que contienen el anticuerpo antagonista anti-PD-1 se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985) Hwang, et al., Proc. Acad. Nat. Sci. USA 77:4030 (1980); y Pat. de EE. UU. Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se divulgan en la Patente de EE. UU. No. 5,013,556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado.
Los principios activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20va Ed. Mack Publishing (2000).
Pueden prepararse preparados de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrófobosque contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se encuentran los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), los polilactidos (Patente de EE. UU. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones que se utilicen para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones terapéuticas de anticuerpos anti-PD-1 se colocan generalmente en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Las composiciones de acuerdo con la presente divulgación pueden estar en formas de dosificación unitarias tales como tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para administración oral, parenteral o rectal, o administración por inhalación o insuflación.
Para preparar composiciones sólidas tales como comprimidos, el ingrediente activo principal se mezcla con un portador farmacéutico, por ejemplo, ingredientes convencionales para la elaboración de comprimidos, tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo, agua, para formar una composición sólida de preformulación que contenga una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, se quiere decir que el ingrediente activo se dispersa uniformemente en la composición, de modo que ésta puede subdividirse fácilmente en formas de dosificación unitarias igualmente eficaces, tales como comprimidos, píldoras y cápsulas. Esta composición sólida de preformulación se subdivide entonces en formas de dosificación unitarias del tipo descrito anteriormente que contienen desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente divulgación. Los comprimidos o píldoras de la nueva composición pueden estar recubiertos o compuestos de otra manera para proporcionar una forma de dosificación que ofrezca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o píldora puede comprender un componente de dosificación interior y otro exterior, este último en forma de sobre sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o se retrase su liberación. Para dichas capas o recubrimientos entéricos pueden utilizarse diversos materiales, entre los que se incluyen varios ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.
Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como los polioxietilenosorbitanos (por ejemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 u 85) y otros sorbitanos (por ejemplo, Span™ 20, 40, 60, 80 u 85). Las composiciones con un agente tensioactivo comprenderán convenientemente entre 0,05 y 5 % de agente tensioactivo, y pueden estar entre 0,1 y 2,5 %. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo, manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si es necesario.
Las emulsiones adecuadas pueden prepararse utilizando emulsiones grasas disponibles en el mercado, tales como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El ingrediente activo puede disolverse en una composición de emulsión premezclada o, alternativamente, puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendras) y formarse una emulsión al mezclarse con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas suelen contener hasta 20 % de aceite, por ejemplo, entre 5 y 20 %. La emulsión grasa puede comprender gotas de grasa de entre 0,1 y 1,0 pm, en particular 0,1 y 0,5 pm, y tener un pH en el intervalo de 5,5 a 8,0.
Las composiciones en emulsión pueden ser las preparadas mezclando un anticuerpo antagonista anti-PD-1 con Intralipid™ o sus componentes (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).
Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, como se ha indicado anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía oral o nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes preferentemente estériles y aceptables desde el punto de vista farmacéutico pueden nebulizarse mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente desde el dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebulización puede estar conectado a una máscara facial, una tienda de campaña o una máquina de respiración de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, en suspensión o en polvo pueden administrarse, preferentemente por vía oral o nasal, a partir de dispositivos que administren la formulación de forma adecuada.
Kits
La divulgación también proporciona kits que comprenden alguno o todos los anticuerpos descritos en el presente documento. Los kits de la divulgación incluyen uno o más envases que comprenden un anticuerpo antagonista anti-PD-1 descrito en el presente documento e instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de la divulgación descritos en el presente documento. En general, estas instrucciones comprenden una descripción de la administración del anticuerpo antagonista anti-PD-1 para los tratamientos terapéuticos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, se proporcionan kits para producir una unidad de administración de dosis única. En ciertas realizaciones, el kit puede contener un primer recipiente con una proteína seca y un segundo recipiente con una formulación acuosa. En ciertas realizaciones, se incluyen kits que contienen jeringas prellenadas de una o varias cámaras (por ejemplo, jeringas para líquidos y liosirios).
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Las instrucciones relativas al uso de un anticuerpo anti-PD-1 generalmente incluyen información sobre la dosificación, el esquema de dosificación y la vía de administración para el tratamiento previsto. Los envases pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención suelen ser instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables las instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, las instrucciones transportadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico).
Los kits de la presente divulgación se presentan en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas de plástico o Mylar selladas), y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El contenedor también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo anti-PD-1. El recipiente puede contener además un segundo agente farmacéutico activo.
Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales, tales como topes e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un contenedor y una etiqueta o inserto en el paquete o asociado con el contenedor.
Depósito biológico
Los materiales representativos de la presente divulgación fueron depositados en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, EE.UU, el 29 de abril de 2014. El vector msb7-LC con número de acceso ATCC PTA-121182 es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera de mAb7, y el vector mab7-HC que tiene número de acceso ATCC PTA-121183 es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada de mAb7. Los depósitos se realizaron en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y su Reglamento (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del yacimiento durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Pfizer, Inc. y el ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la emisión de la patente de EE.UU. pertinente o tras la puesta a disposición del público de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o extranjera, lo que ocurra primero, o de una solicitud de patente extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a quien el Comisionado de Patentes y Marcas de EE.UU. determine que tiene derecho a ella de acuerdo con el 35 U.S.C. § 122 y las normas del Comisionado en virtud del mismo (incluyendo el 37 C.F.R. § 1.14 con especial referencia al 886 o G 638).
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera o se perdiera o destruyera al ser cultivado bajo condiciones adecuadas, los materiales serán sustituidos rápidamente, previa notificación, por otro igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Efecto del anticuerpo anti-PD-1 en la secreción de ¡FN-v y TNF
Este ejemplo ilustra el efecto del anticuerpo anti-PD-1 sobre la secreción de IFN-y y TNF en un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR).
Células T humanas primarias aisladas de sangre completa (banco de sangre de la Stanford University) fueron activadas por células dendríticas (DC) alogénicas que expresaban altos niveles de PD-L1 y PD-L2, que fueron previamente diferenciadas usando IL-4 y GM-CSF de células mieloides CD14+. En este estudio, se utilizaron los siguientes anticuerpos: control de isotipo (IgG4 kappa estabilizada con bisagra), anticuerpo C1 anti-PD-1 antagonista, anticuerpo C2 anti-PD-1 antagonista, anticuerpo C3 anti-PD-1 antagonista, EH12.1 (anticuerpo anti-PD-1 anti humano de ratón de BD Biosciences, isotipo de ratón IgG1 Kappa), mAb7-G4, mAb15-G4, mAb-AAA, mAb15-AAA (G4 = IgG4 estabilizado con bisagra; AAA = IgG1 mutante que no se une a FcyR ). Los anticuerpos se probaron en las siguientes concentraciones: 0, 0,1, 1 o 10 pg/ml).
Para el ensayo de MLR, los cultivos se incubaron con el anticuerpo de prueba o de control en placas de 96 pocillos por triplicado en relaciones de 1:10 DC: T y se incubaron en un incubador humidificado a 37 °C con 5 % de CO2. Los sobrenadantes se cosecharon en el día 5 y las citocinas se midieron con el Matriz de Microesferas Citométricas (CBA) utilizando el kit Sistema Flexible de Proteínas Solubles Humanas (BD Biosciences, catálogo no.558265) de acuerdo con el protocolo del fabricante con los siguientes analitos humanos: IFNy (BD Biosciences, catálogo no.558269), TNF (BD Biosciences, catálogo #558273). Brevemente, las placas de filtro de 96 pocillos (Millipore, catálogo no.MSBVN1250) se lavaron con tampón de lavado (fórmula patentada por BD Biosciences) y se aspiraron mediante un colector de vacío. Los estándares proporcionados por el kit y las muestras se diluyeron en Diluyente de Ensayo (fórmula propia de BD Biosciences) y se añadieron a las placas con Perlas de Captura (las perlas de captura son perlas recubiertas con anticuerpos para una proteína soluble específica recubierta con una fluorescencia distintiva). Las placas se mezclaron durante 5 minutos a 500rpm utilizando un agitador de placas, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió a las placas el reactivo de detección (anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE), proporcionado por el k) y se mezclaron las placas durante 5 minutos. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se utilizó un Tampón de lavado durante 5 minutos, y las muestras se adquirieron en las plataformas Fortessa de BD. Los datos se analizaron con la FCAP Array v3 (BD). Los resultados de la prueba MLR se muestran en las Tablas 6A y B siguientes. La Tabla 6A muestra los niveles de IFNy (en pg/ml), y la Tabla 6B los niveles de TNF (en pg/ml). Los datos se presentan como un promedio ± S.E.M de triplicados biológicos. Las muestras son representativas de un experimento de MLR.
Tabla 6A: Secreción de IFNy
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Tabla 6B: Secreción de TNF
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El tratamiento de células T activadas con anticuerpos antagonistas anti-PD-1 resultó en un aumento de los niveles de IFNy en comparación con el control de isotipo (Tabla 6A). Por ejemplo, el tratamiento con 0,1 pg/ml de mAb15-G4 y mAb7-G4 dio lugar a un nivel de IFNy de 4728,295 ± 2,035 pg/ml y 8567,203 ± 2085,826 pg/ml, respectivamente. El tratamiento con 1 pg/ml de mAb15-G4 y mAb7-G4 dio lugar a un nivel de IFNy de 8893,595 ± 365,125 pg/ml y 11876,86 ± 1259,788 pg/ml, respectivamente. El tratamiento con 10 pg/ml de mAb15-G4 y mAb7-G4 dio lugar a un nivel de IFNy de 7790,95 ± 1700,012 pg/ml y 11794,82 ± 1827,243 pg/ml, respectivamente. En cambio, el tratamiento con 0,1, 1 o 10 pg/ml de control de isotipo dio lugar a niveles de IFNy de 3760 ± 367,4262 pg/ml, 3693,972 ± 1033,879 pg/ml y 3525,655 ± 744,676 pg/ml, respectivamente.
El tratamiento de células T activadas con anticuerpos antagonistas anti-PD-1 resultó en un aumento de los niveles de TNF en comparación con el control de isotipo (Tabla 6B). Por ejemplo, el tratamiento con 0,1 pg/ml de mAb15-G4 o mAb7-G4 dio lugar a un nivel de TNF de 743,1167 ± 56,75547 pg/ml y 730,47 ± 33,35488 pg/ml, respectivamente. El tratamiento con 1 pg/ml de mAb15-G4 y mAb7-G4 dio lugar a un nivel de TNF de 686,32 ± 45,63348 pg/ml y 793,05 ± 21,19019 pg/ml, respectivamente. El tratamiento con 10 pg/ml de mAb15-G4 o mAb7-G4 dio lugar a un nivel de TNF de 798,853 ± 9,14366 pg/ml y 930,623 ± 16,0494 pg/ml, respectivamente. En cambio, el tratamiento con 0,1, 1 o 10 pg/ml de control de isotipo dio lugar a niveles de TNF de 407,4133 ± 49,58195 pg/ml, 486,7167 ± 4,4241 pg/ml y 501,17 ± 5,033334 pg/ml, respectivamente.
Estos resultados demuestran que los anticuerpos mAb7 y mAb15 anti-PD-1 estimulan la secreción de IFNy y TNF de las células T al menos tan bien o mejor que los anticuerpos C1, C2 y C3 anti-PD-1.
Se realizó un segundo estudio de MLR para probar el efecto de concentraciones más bajas de anticuerpos en la activación de células T. Las células T humanas primarias aisladas de la sangre total se activaron como se ha descrito anteriormente. En el segundo estudio se probaron los siguientes anticuerpos: mAb7 (G4), mAb15 (G4), C1 (G4), EH12.1 y control de isotipo G4. Los anticuerpos se probaron en las siguientes concentraciones: 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 pg/ml. El ensayo MLR se realizó como se ha descrito anteriormente. Los resultados se resumen en las Tablas 7A y 7B.
Tabla 7A: Secreción de IFN
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(continuación)
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Tabla 7B: Secreción de TNF
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El tratamiento de células T activadas con anticuerpos antagonistas anti-PD-1 resultó en un aumento de los niveles de IFNy en comparación con el control de isotipo (Tabla 7A). En los cultivos sin anticuerpos, el nivel de IFNy fue de 901,453 ± 216,472 pg/ml. En los cultivos a los que se les administró 0,0001,0,001,0,01,0,1, 1 o 10 pg/ml de anticuerpo de control del isotipo, los niveles de IFNy fueron de 558,9629 ±, 489,4828 pg/ml, 753,3767 ± 291,6092 pg/ml, 1074,37 ± 324,2031 pg/ml, 1667,96 ± 144,7286 pg/ml, 1867,96 ± 282,7461 pg/ml, 2501,293 ± 220,1829 pg/ml, respectivamente. En cambio, en los cultivos tratados con 0,0001,0,001,0,01,0,1, 1 o 10 pg/ml de mAb7 (G4), los niveles de IFNy fueron de 2082,07 ± 720,9931 pg/ml, 3062.09 ± 370,2791 pg/ml, 5067,823 ± 111,4903 pg/ml, 7082,667 ± 1336,082 pg/ml, 11928,81 ± 1457,723 pg/ml, 11862,13 ± 800,586 pg/ml, respectivamente. En los cultivos tratados con 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 o 10 pg/ml de mAb15 (G4), los niveles de IFNy fueron de 1678,27 ± 233,82 pg/ml, 1410,758 ± 4399474 pg/ml, 4734,49 ± 322,2087 pg/ml, 5416 ± 1054,075 pg/ml, 9140,337 ± 1320,499 pg/ml, y 10992,13 ± 1008,533 pg/ml, respectivamente.
El tratamiento de células T activadas con anticuerpos antagonistas anti-PD-1 resultó en un aumento de los niveles de TNF en comparación con el control de isotipo (Tabla 7B). En los cultivos sin anticuerpos, el nivel de TNF fue de 365,523 ± 84,6607 pg/ml. En los cultivos tratados con 0,0001, 0,001,0,01,0,1, 1 o 10 pg/ml de anticuerpo de control del isotipo, los niveles de TNF fueron de 452,7133 ± 62,85 pg/ml, 2829287 ± 56,77266 pg/ml, 310,9144 ± 21,7811 pg/ml, 358,948 ± 81,09122 pg/ml, 338,1107 ± 46,88385 pg/ml y 331,008 ± 31,35559 pg/ml, respectivamente. En cambio, en los cultivos tratados con 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 o 10 pg/ml de mAb7 (G4), los niveles de TNF fueron de 227,6 ± 50,63436 pg/ml, 3944233 ± 30,47005, 452,65 ± 30,64335 pg/ml, 1089,377 ± 174,7824 pg/ml, 1583,52 ± 267,2131 pg/ml y 1419,88 ± 108,711 pg/ml, respectivamente. En los cultivos que recibieron 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 o 10 pg/ml de mAb15 (G4), los niveles de TNF fueron de 494,7967 ± 48,1810 pg/ml, 489,2333 ± 30,63302 pg/ml, 593,34 ± 65,87622 pg/ml, 811,16 ± 89,50238 pg/ml, 1143,54 ± 136,3954 pg/ml y 1109,063 ± 57,70232 pg/ml, respectivamente.
Estos resultados demuestran que los anticuerpos mAb7 y mAb15 anti-PD-1 bloquean la señalización de PD-1 y promueven la secreción de IFNy y TNF de células T humanas primarias.
Ejemplo 2: Efecto de los anticuerpos anti-PD-1 en la proliferación de células T
Este ejemplo ilustra el efecto de los anticuerpos anti-PD-1 en la proliferación de células T.
En este estudio, la proliferación de células T se midió en un ensayo MLR en el que se cultivaron células T en presencia de anticuerpos antagonistas anti-PD-1 o de control de isotipo.
Para la MLR, se activaron células T humanas primarias aisladas de sangre completa (obtenidas del banco de sangre de la Stanford University) con células dendríticas (DC) alogénicas que expresaban altos niveles de PD-L1 y PD-L2, que fueron previamente diferenciadas usando IL-4 y GM-CSF de células mieloides CD14+. Se realizaron dos experimentos.
En el primer experimento, se compararon mAb7 (IgG4 kappa estabilizada con bisagra), mAb15 (IgG4 kappa estabilizada con bisagra), C1, EH12.1 y el control de isotipo. En el segundo experimento, se compararon los clones mAb7, mAb15, C2, EH12.1 y el control de isotipo. En ambos experimentos se añadieron anticuerpos a las siguientes concentraciones : 0, 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1; 1 y 10 pg/ml.
Para ambos experimentos, los cultivos se incubaron con el anticuerpo en placas de 96 pocillos por triplicado en relaciones de 1:10 células DC:T y se incubaron en incubadora humidificada a 37 °C con 5 %CÜ2. En el día 5, los cultivos se pulsaron durante 18 horas con 1 pCi por pocillo de [3H]-timidina antes de la cosecha. A continuación, las placas se cosecharon en papeles de filtro específicos para ADN (Perkin Elmer) utilizando Harvester96 (Tomtec Life Sciences). Los filtros radiomarcados se cubrieron con líquido de centelleo beta (Perkin Elmer) y se leyeron en placas contadoras Microbeta® (Perkin Elmer). La incorporación de timidina se analizó como recuentos por minuto (CPM). Los resultados se muestran como media de triplicados ± SEM.
Tabla 8A
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Tabla 8B
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El tratamiento de células T activadas con anticuerpos antagonistas anti-PD-1 a una concentración de 0,01 pg/ml o mayor dio como resultado un aumento significativo de la proliferación de células T en comparación con el control de isotipo (Tablas 8A y 8B),
Por ejemplo, el tratamiento con 0,01, 0,1, 1, o 10 pg/ml de mAb7 resultó en tasas de Incorporación de timidina de 365625,3 ± 30171,07 CPM, 380054,3 ± 9774,328 CPM, 392256,7 15341,19 CPM, y 372889,7 14826,49 CPM, respectivamente (Tabla 8B). El tratamiento con 0,01, 0,1, 1 o 10 pg/ml de mAb15-G4 y mAb7 dio lugar a tasas de incorporación de timidina de 317377 ± 31915,29 CPM, 360226,3 ± 1802,69 CPM, 421229 ± 27865,13 CPM y 323441,3 64476,55 CPM, respectivamente (Tabla 8B). Por el contrario, el tratamiento con 0,01, 0,1, 1 o 10 pg/ml de control de isotipo dio lugar a tasas de incorporación de timidina de 278072,3 ± 32671,62 CPM, 268939,7 ± 12332,06 CPM, 241164 ± 13776,81 CPM y 231897,7 25865,95 CPM, respectivamente (Tabla 8B).
Estos resultados demuestran que los anticuerpos mAb7 y mAb15 anti-PD-1 bloquean la señalización de PD-1 y promueven la proliferación de células T humanas primarias.
Ejemplo 3: Efecto de los anticuerpos anti-PD-1 en un modelo de ratón de GvHD
Este ejemplo ilustra el efecto de los anticuerpos anti-PD-1 sobre la proliferación de células T y la pérdida de peso corporal en un modelo de ratón de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD).
En este estudio se utilizaron ratones NOD-scid-IL-2 de cadena gamma nula (NSG) para probar los efectos de los anticuerpos antagonistas anti-PD-1 en la proliferación de células T in vivo. Dado que los ratones NSG carecen de células T y B y tienen las células NK deterioradas, se consigue fácilmente un elevado injerto de células humanas. Cuando las p Bm C humanas se injertan en estos ratones, se produce una proliferación de células T humanas que induce la GvHD. La GvHD afecta tanto al compartimento mieloide del huésped como a las células humanas. Se puede observar una proliferación masiva de linfocitos humanos en la sangre en las primeras etapas, seguida de una gran infiltración de estas células en los órganos del ratón, tales como el hígado, el bazo, el riñón, el intestino, etc., lo que provoca la pérdida de peso corporal de los ratones, así como lesiones en la piel, espalda encorvada y la muerte. La gravedad de los modelos depende de las PBMC del donante, y puede diferir entre donantes.
En este estudio, se utilizaron los siguientes anticuerpos antagonistas de PD-1: mAb7 (IgG4 humana estabilizada con bisagra o AAA), mAb15 (IgG4 humana estabilizada con bisagra), C1, C2 y C3. Para el control negativo, se utilizó un anticuerpo humano IgG4 estabilizado con bisagra como control de isotipo. Las PBMC humanas primarias se aislaron de la sangre total (banco de sangre de la Stanford University), utilizando el gradiente de Ficoll. Se inyectaron 107 PBMC humanas en ratones NSG (hembras de 8 semanas, Jackson Laboratories). En el día 0, los ratones fueron asignados al azar con base en su peso corporal y se les inyectaron PBMC por vía intravenosa. Para los experimentos 1-4, el día 2 y el día 8 se administraron anticuerpos por vía intraperitoneal a 10 mg/kg. Para el experimento 5, el día 2 y el día 8, se administraron anticuerpos por vía intraperitoneal a 1 mg/kg o 10 mg/kg. La Tabla 9 resume los anticuerpos utilizados en cada experimento.
Tabla 9: Anticuer os utilizados en los ex erimentos 1-5
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El peso corporal se midió periódicamente. Los resultados se resumen en las Figuras 1A-1E. Los ratones fueron sangrados periódicamente para evaluar la proliferación de células T. El tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 aceleró el curso de la enfermedad según la tasa de pérdida de peso corporal. En comparación con los ratones de control, los ratones tratados con el anticuerpo antagonista anti-PD-1 tuvieron una pérdida de peso corporal más rápida (Figuras 1A-1E).
La proliferación de las células T humanas se midió por citometría de flujo utilizando CD45 como marcador (clon HI30; BD Biosciences). Los resultados de la citometría de flujo se resumen en la Tabla 10. La proliferación de células T fue mayor en los ratones tratados con el anticuerpo antagonista anti-PD-1 que en los ratones tratados con el control del isotipo. Un mayor porcentaje de CD45 indica un mayor nivel de proliferación de las células CD45 y, por tanto, una GvHD más grave.
En el Experimento 1, el porcentaje de células sanguíneas positivas para CD45 fue del 63,86 % en los ratones de control (Tabla 10). En cambio, el porcentaje de células sanguíneas positivas para CD45 en los ratones tratados con el anticuerpo mAb7, mAb15, C1 o mAb7-AA anti-PD-1 fue del 80,34 %, 77,62 %, 77,26 % y 76,9 %, respectivamente (Tabla 10).
T l 1 Pr lif r i n l l T m i r l r n i D4 nim l r
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continuación
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En sumario, los ratones tratados con el anticuerpo anti-PD-1 tuvieron una pérdida de peso corporal más rápida y una mayor proliferación de células T en comparación con los ratones tratados con el control del isotipo. Estos resultados demuestran que el tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 estimula la proliferación de células T humanas in vivo.
Ejemplo 4: Unión de anticuerpos anti-PD-1
Este ejemplo ilustra la unión del anticuerpo anti-PD-1 en células T humanas activadas y en células T de mono cinomolgo (cyno).
Se aislaron células T humanas primarias a partir de PBMC (banco de sangre de la Stanford University) utilizando un kit de aislamiento de células T PAN humanas de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec; 130-096­ 353). Las PBMC cínicas se compraron a (BioreclamationIVT), y las células T PAN se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células T PAN de primates no humanos de acuerod con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec; 130-091-993). Las células T humanas se activaron durante 3 días con DYNABEADS™ human T-Activator CD3/CD28 para la expansión y activación celular (Life Technologies ; 11131D). La relación de microesferas y células utilizadas fue de 1:1 microesfera:célula T, respectivamente. Las células T Cyno se activaron durante 3 días utilizando el Kit de Activación/Expansión de Células T, primate no humano de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec; 130-092-919). La relación entre las perlas y las células utilizadas fue de 1:1 perla: Célula T; respectivamente. Después de 3 días se cosecharon los cultivos y se separaron las perlas de las células T activadas utilizando la fuerza magnética. Las células se lavaron y se incubaron con el tampón FACS (que incluye FBS 2 % ) y con el inhibidor de la unión del Receptor Fc humano ( Affymetrix eBioscience catálogo # 16-9161-73). Para las células cyno se utilizó el reactivo Fc Block (BD Biosciences catálogo no. 564765). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se tiñeron con color vivo-muerto para excluir las células muertas (LIVE/DEAD® Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, para excitación UV; catálogo no. A10346) durante otros 5 minutos. Se añadieron anticuerpos anti PD-1 (las concentraciones de los clones anti-PD-1 se incubaron sobre las células en relaciones de dilución en serie de 1:3 empezando por 10 pg/ml - 0 pg/ml). Se utilizaron 1*106 células en cada reacción en un total de 100 pl y las células se incubaron en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con tampón FACS para eliminar el acceso de los anticuerpos primarios y se incubaron con anticuerpos humanos (Fragmento AffiniPure F(ab')2 de Asno Anti-Humano IgG (H+L) secundario conjugado con aloficocianina (APC); catálogo no. 709-136-149). Las células se tiñeron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron y se mantuvieron en hielo hasta su lectura con el analizador celular BD LSRFortessa, (BD Biosciences, catálogo no. 647465). Los datos se analizaron con el software FlowJo™. Los resultados se resumen en las Figuras 2A y 2B.
La Figura 2A muestra EC50 medida para la unión del anticuerpo anti-PD-1 a las células activadas humanas, y la Figura 2B muestra EC50 medida para la unión del anticuerpo anti-PD-1 a las células cyno activadas. Los anticuerpos anti-PD-1 mAb7 y C1 se unen a las células T activadas con EC50 similar (Figuras 2A y 2C).
Ejemplo 5: Inhibición de la unión de PD-L1 por el anticuerpo anti-PD-1
Este ejemplo ilustra la inhibición de la unión del ligando PD-1 (PD-L1) por el anticuerpo anti-PD-1.
Se aislaron células T humanas primarias a partir de PBMC (banco de sangre de la Stanford University) utilizando el kit de aislamiento de células T PAN humanas de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec; 130-096­ 353). Las PBMC de mono cinomolgo se compraron a (BioreclamationIVT), y las células T PAN se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células T PAN de primates no humanos de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec; 130-091-993). Las células T humanas se activaron durante 3 días con DYNABEADS™ human T- Activator CD3/CD28 (para la expansión y activación celular, Life Technologies; 11131D). La relación entre las perlas y las células utilizadas fue de 1:1, respectivamente. Las células T Cyno se activaron durante 3 días utilizando el Kit de Activación/Expansión de Células T, primate no humano de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec; 130-092-919). La relación entre las perlas y las células utilizadas fue de 1:1, respectivamente. Después de 3 días se cosecharon los cultivos y se separaron las perlas de las células T activadas utilizando la fuerza magnética. Las células se lavaron y se incubaron con el tampón FACS (que incluye FBS 2 % ) y un inhibidor de la unión del receptor Fc humano (Asymetrix eBioscience; catálogo no. 16-9161-73). Para las células cyno se utilizó el reactivo Fc Block (BD Biosciences; catálogo no. 564765). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se tiñeron con color vivo-muerto para excluir las células muertas (LIVE/DEAD® Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, para excitación UV; catálogo no. A10346) durante otros 5 minutos. El PD-L1 Fc recombinante humano (R&D Systems, catálogo no. 156-B7) o el tampón solo se incubó con las células a 10 ng/ml. Cada ligando fue incubado por separado y se incubó en hielo durante 30 minutos. A continuación, se lavaron las células y se incubaron con anticuerpos anti PD-1 (las concentraciones de los clones anti-PD-1 se incubaron en la célula en relaciones de dilución en serie de 1:3, empezando por 1 pg/ml - 0 pg/ml). Se utilizaron 1*106 células en cada reacción en un total de 100 pl y las células se incubaron en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con tampón FACS para eliminar el acceso de los anticuerpos primarios y se incubaron con anti kappa humano conjugado con aloficocianina (APC) (Life Technologies; catálogo no. MH10515). Las células se tiñeron durante 30 minutos en hielo, luego se lavaron y se mantuvieron en hielo hasta la lectura con el analizador celular BD LSRFortessa, (BD Biosciences, catálogo no.
647465). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo™ y se calcularon la intensidad media de fluorescencia (MFI) y las medias geométricas (Geo.M) de la tinción de APC en células vivas en el software FlowJo™. Tras el cálculo de la media de Geo se calcularon los IC50 utilizando el software GraphPD Prism. Los resultados se resumen en las Tablas 11 y 12.
Tabla 11: Blo ueo anti-PD-1 de la unión de PD-L1 a PD-1 en células T humanas
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Tabla 12: Blo ueo anti-PD-1 de la unión de PD-L1 a PD-1 en células T c no
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Estos resultados demuestran que los anticuerpos mAb7 y C1 anti-PD-1 inhiben la unión de PD-L1 a las células T humanas y cyno con una IC50 similar.
Ejemplo 6: Efecto del anticuerpo anti-PD-1 en la proliferación de células T
Este ejemplo ilustra el efecto del anticuerpo anti-PD-1 en la proliferación de células T. Los CD4 y CD8 (AllCells, LLC) se activaron durante 2 días con DYNABEADS™ human T-Activator CD3/CD28 (o expansión y activación celular (Life Technologies; 11131D). La relación entre las perlas y las células utilizadas fue de 1:1; respectivamente para inducir la PD-1. Al día 2, se cosecharon los cultivos y se separaron las perlas de las células T activadas mediante fuerza magnética. A continuación, las células se activaron en las células dendríticas que expresan PD-L1 y se incubaron con diferentes clones anti-PD-1 a 1 pg/ml en placas de 96 pocillos por triplicado en relaciones de 1:10 d C: T y se incubaron en un incubador humidificado a 37 °C con 5 % de CO2. El día 3, los cultivos fueron pulsados durante 18 h con 1 pCi por pocillo de [3H]-timidina antes de la cosecha. A continuación, las placas se cosecharon en papeles de filtro específicos para el ADN (PerkinElmer) utilizando Harvester96 (Tomtec Life Sciences). Los filtros radiomarcados se cubrieron con líquido de centelleo beta (Perkin Elmer) y se leyeron en placas contadoras Microbeta® (Perkin Elmer). La incorporación de timidina se analizó como recuentos por minuto (CPM). Los resultados se muestran como media de triplicados ± SEM en las Figuras 3 y 4.
Ejemplo 7: Determinación cinética y de afinidad de la PD-1 humana, de mono cinom olgo y de ratón que interactúa con anticuerpos anti-PD-1 humanizados
Este ejemplo ilustra la unión de anticuerpos anti-PD-1 a PD-1 humana, cyno o de ratón.
Todos los análisis de interacción se realizaron en biosensores sin etiqueta a 25 °C, a menos que se indique lo contrario. Se utilizaron biosensores de resonancia de plasmón superficial (ProteOn-XPR™ de BioRad™, y Biacore 2000™ y Biacore T200™ de GE Life Sciences) para estudiar la PD-1 humana y de mono cinomolgo y un biosensor de interferometría de biocapa (Octet-Red384, Fortebio/Pall Life Sciences) para estudiar la PD-1 de ratón. Los experimentos de ProteOn se realizaron en el tampón de funcionamiento PBS pH 7,4 0,01 % Tween-20 (PBST). Los experimentos de Biacore se realizaron en Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 0,05 % (HBST+) y los experimentos de Octet se realizaron en HBST+ con 1 g/l de BSA. Los datos de ProteOn se procesaron en el softWare ProteOn Manager, los datos de Biacore se procesaron en Biaevaluation y los datos de Octet simplemente se alinearon a cero en el software de control. Los datos de SPR se referenciaron dos veces (Myszka, 1999, J Mol Recognit12(5):279-284) y se ajustaron globalmente a un modelo simple de Langmuir para determinar la constante de disociación de equilibrio, Kd , a partir de la relación de las constantes de velocidad cinética (Kd = kd/ka ).
Análisis de concentración sin calibración (CFCA)
La concentración activa del monómero de PD-1 humana (hPD-1) (Sino Biologicals, catálogo no. 10377-H08H) para su uso como analito en los experimentos cinéticos con IgGs inmovilizadas se determinó empíricamente utilizando un ensayo CFCA en un Biacore T200™ equipado con chip sensor CM5. Para preparar las superficies para estos experimentos, se acopló con amina una alta capacidad (aproximadamente 12.000 RU) de mAb15 hIgG4 (o en algunos experimentos, el anticuerpo competidor C2-hlgG1) en la celda de flujo 2, dejando la celda de flujo 1 en blanco (sólo "activada y bloqueada", sin ninguna IgG) para proporcionar una superficie de referencia. Las muestras de hPD-1 se inyectaron a concentraciones nominales de 0,1, 1 y 10 pg/ml durante 36 segundos a caudales bajos (5 pl/min) y altos (100 pl/min). Las superficies se regeneraron con un cóctel de tampón de elución 2:1 v/v Pierce IgG (pH 2,8):NaCl 4 M. Los datos se analizaron en la herramienta CFCA del software T200 para obtener un valor de actividad aparente para el analito hPD-1, que se utilizó para corregir su concentración de proteína "nominal", determinada por la absorbancia a 280 nm con el coeficiente de extinción apropiado, en una concentración de proteína "activa". Algunos lotes tenían 32 % de actividad, mientras que otros tenían 100 %.
Análisis cinético de la unión de PD-1 humana (hPD-1) a mAb7, mAb15, C1, C2, C3 y C4, mAbs acoplados a aminas
Se utilizó un ProteOn-XPR36 equipado con chips de sensores GLC (BioRad™, Hercules, CA), para determinar la cinética y la afinidad de la unión del monómero hPD-1 a un panel de mAbs anti-hPD-1 acoplados con aminas (mAb7, mAb15, C1, C2, C3 y C4) en tampón de ejecución PBST. Las superficies para estos experimentos se prepararon en tres pasos; (1) los canales de ligando se activaron mínimamente durante dos minutos utilizando una mezcla recién preparada de los reactivos de activación a 0,8 mM EDC y 0,2 mM sulfo-NHS finales en agua, (2) las IgGs se acoplaron durante tres minutos a 15 pg/ml en acetato de sodio 10 mM pH 4,5, y (3) el exceso de ésteres reactivos se bloqueó durante tres minutos con HCl de etanolamina 1 M pH 8,5. Los niveles finales de IgG acoplada oscilaron entre 400 RU a 1157 RU. El monómero hPD-1 se inyectó en un modo cinético de un solo disparo (Bravman et al., 2006, Anal Biochem 358(2):281-288) a lo largo de los canales del "analito" como una serie de dilución triple con concentraciones "activas" máximas de 30, 44 o 36 nM, dependiendo del experimento. Los tiempos de asociación y disociación fueron de 3 min y 20 min, respectivamente, y todos los analitos se inyectaron en ciclos de unión duplicados. Las superficies se regeneraron con un cóctel de tampón de elución 2:1 v/v Pierce IgG (pH 2,8):NaCl 4 M.
Tabla 13: Análisis cinético de la unión del monómero hPD-1 a las I Gs aco ladas con aminas
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Las interacciones del monómero hPD-1 con mAb7 y mAb15 no mostraron un decaimiento visible en la respuesta de unión dentro de la fase de disociación permitida, por lo que se puso un límite superior a sus valores de k d y KD , y de acuerdo con la "regla del 5 %" (Katsamba et al, 2008, Anal Biochem 352(2):208-221) se aplicó para poner un límite superior a sus valores de kd y Kd . N = 2 se refiere a dos experimentos independientes en diferentes chips.
Reacción cruzada de mAb7 y mAb15 a la PD-1 del mono cinomolgo
La cinética de unión de los fragmentos Fab purificados recombinantes (mAb7 y mAb15) tanto a hPD-1-hFc1 (R&D systems catálogo no. 1086PD) como a cynoPD-1-hFc1 (preparado internamente) se determinó utilizando un Biacore 2000™ equipado con un chip sensor CM4 y tampón de funcionamiento HBST+. Un anticuerpo polic lonal anti-hFc se acopló con amina al chip y se utilizó para capturar aproximadamente 90 RU de hPD-1-hFc1 y 125 RU de cynoPD-1-hFc1 en las células de flujo 2 y 3, dejando la célula de flujo 1 en blanco (superficie de captura anti-hFc desnuda) para proporcionar un canal de referencia. Se inyectaron Fabs recombinantes purificados durante dos minutos como analito a 0, 10 y 100 nM sobre proteínas de fusión PD-1-hFc1 recién capturadas, permitiendo un tiempo de disociación de 15 minutos. Las superficies de captura se regeneraron con ácido fosfórico 75 mM y las muestras de mAb7 Fab se inyectaron en ciclos de unión duplicados. Todos los complejos Fab/PD-1 eran muy estables, de manera que ninguna de las interacciones mostraba un decaimiento visible en sus respuestas de unión dentro del tiempo de disociación permitido, por lo que se aplicó la "regla del 5%" (Katsamba et al, 2008) para poner un límite superior a sus valores de kd y KD .
Tabla 14: Determinación de la afinidad de los Fabs de mAb7 y mAb15 hacia las proteínas de fusión hPD-1-hFc1 y c noPD-1-hFc1
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Dependencia de la temperatura de la afinidad de unión de hPD-1 hacia mAb15. mAb7 y C3
Se utilizó un Biacore T200™ equipado con un chip sensor CM4 para determinar la cinética y las afinidades de la unión del monómero hPD-1 a un panel de moléculas hIgG4 (mAb15, mAb7 y C3) que se capturaron a niveles bajos mediante un anticuerpo policlonal anti-hFc acoplado con aminas. Los hIgG4 mAbs se capturaron a 10 pg/ml en celdas de flujo individuales, dejando la celda de flujo 1 en blanco para que sirviera como superficie de referencia (superficie de captura desnuda). La hPD-1 se inyectó a concentraciones activas de 0, 10 y 100 nM durante tres minutos permitiendo una fase de disociación de 18 minutos. Las superficies de captura se regeneraron con ácido fosfórico 75 mM después de cada ciclo de unión.
Tabla 15: Análisis cinético de la unión del monómero hPD-1 como analito a moléculas de hIgG4 capturadas con anti-hFc
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(continuación)
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Reacción cruzada de mAb7 con PD-1 de ratón
Se utilizó un Octet-Red384 equipado con puntas sensoras de estreptavidina para determinar si la PD-1 de ratón se une a mAb7. Se eligió un formato de ensayo propenso a la avidez para aumentar la sensibilidad de detección del ensayo. Los sensores se recubrieron con un anticlonal kappa humano biotinilado y se utilizaron para capturar un panel de hIgG4 anti-hPD-1 mAbs (mAb7, C1, C2 y C3) a 10 pg/ml; cada mAb se capturó en ocho sensores. Como control positivo, se recubrieron ocho sensores de estreptavidina con J43 biotinilado (eBioSciences), un anticuerpo anti-ratón PD-1. Cada sensor recubierto de mAb se expuso a los siguientes analitos: tampón, sitios de unión de 1 pM de PD-1-hFc de ratón, sitios de unión de 1 pM de hPD-1-hFc (control positivo) o sitios de unión de 1 pM de hGHR-hFc (control negativo). Todas las proteínas de fusión Fc recombinantes eran de R&D systems. Por lo tanto, cada interacción analito/mAb se probó en sensores duplicados.
Los anticuerpos C1, C2 y C3 anti-PD-1 no se unieron a la PD-1-hFc1 de ratón-(datos no mostrados). El anticuerpo mAb7 anti-PD-1 se unió débilmente al PD-1-hFc1 de ratón (datos no mostrados). Todos los anticuerpos anti-PD-1 probados se unieron al hPD-1-hFc. Estos resultados demuestran que mAb7 es débilmente reactivo con la PD-1 de ratón, mientras que C1, C2 y C3 no son reactivos con la PD-1 de ratón.
Ejemplo 8: Tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-PD-1
Este es un ejemplo profético que ilustra el uso de los anticuerpos anti-PD-1 de la presente invención para tratar el cáncer.
Los pacientes con cáncer colorrectal metastásico confirmados histológicamente, no tratados previamente y medibles, se seleccionan para el tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1. Los pacientes son asignados a uno de los dos grupos de tratamiento: quimioterapia más placebo o quimioterapia más mAb7. Se utiliza un algoritmo de aleatorización dinámica para lograr el equilibrio general y dentro de cada una de las siguientes categorías: centro de estudio, estado de rendimiento ECOG basal (0 vs ^1), lugar de la enfermedad primaria (colon vs. recto), y número de sitios metastásicos (1 vs. >1). El tratamiento de quimioterapia se administra semanalmente durante las primeras 6 semanas de cada ciclo de 8 semanas. La quimioterapia se mantiene hasta la finalización del estudio (96 semanas) o la progresión de la enfermedad. Se administra mAb7 5 mg/kg o placebo cada 2 semanas. Los pacientes del brazo de mAb7 que tengan una respuesta completa confirmada o que hayan experimentado una toxicidad inaceptable como resultado del tratamiento con quimioterapia podrán interrumpir la quimioterapia y seguir recibiendo mAb7 solo como tratamiento de primera línea. Sólo los pacientes asignados aleatoriamente al grupo de mAb7 pueden recibir mAb7 como componente del tratamiento de segunda línea. Después de completar el estudio, los pacientes son seguidos para cualquier tratamiento posterior y la supervivencia cada 4 meses hasta la muerte, la pérdida de seguimiento, o la terminación del estudio.
Los pacientes serán sometidos a una evaluación del estado del tumor al inicio y al final de cada ciclo de 8 semanas utilizando técnicas radiográficas apropiadas, típicamente una tomografía computarizada en espiral. La respuesta del tumor, o la progresión, será determinada tanto por el investigador como por un centro radiológico independiente (IRF) utilizando los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos. Therasse et al. (2000). La evaluación del IRF se realizará sin conocimiento de la asignación del tratamiento o de la evaluación del investigador. Además, los pacientes completarán la Evaluación Funcional de la Terapia del Cáncer-Colorrectal (FACT-C), versión 4, un instrumento validado para evaluar la calidad de vida (QOL) en pacientes con cáncer colorrectal, al inicio y antes de cada ciclo de tratamiento hasta la progresión de la enfermedad. Ward et al. (1999) Qual. Life Res. 8: 181-195.
La seguridad se evalúa a partir de los informes de eventos adversos, resultados de pruebas de laboratorio y mediciones de signos vitales. Los acontecimientos adversos y los resultados anormales de laboratorio se clasifican utilizando los Criterios Comunes de Toxicidad del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC), versión 2. Las medidas de seguridad preespecificadas incluyen cuatro acontecimientos adversos de especial interés (hipertensión, proteinuria, trombosis y hemorragia).
La medida de resultado primaria es la duración de la supervivencia global. Las medidas de resultado secundarias incluyen: la supervivencia libre de progresión, la tasa de respuesta objetiva (completa y parcial), la duración de la respuesta y el cambio en la puntuación de FACT-C QOL. La duración de la supervivencia se define como el tiempo transcurrido desde la aleatorización hasta la muerte. Para los pacientes vivos en el momento del análisis, la duración de la supervivencia se censurará en la fecha del último contacto. La supervivencia libre de progresión se define como el tiempo que transcurre desde la aleatorización hasta la primera de las dos situaciones de progresión de la enfermedad o muerte en el estudio, definida como la muerte por cualquier causa dentro de los 30 días siguientes a la última dosis de fármaco o quimioterapia del estudio. Para los pacientes vivos sin progresión de la enfermedad en el momento del análisis, la supervivencia libre de progresión se censurará en su última evaluación del tumor, o en el día 1 (el primer día de tratamiento del estudio) si no se realizó ninguna evaluación posterior a la línea de base. En el análisis de la respuesta objetiva, los pacientes sin evaluaciones tumorales se clasifican como no respondedores. Los análisis de la progresión de la enfermedad y la respuesta se basan en las evaluaciones del IRF. El cambio en la calidad de vida se analiza como tiempo hasta el deterioro de la QOL (TDQ), definido como el tiempo transcurrido desde la aleatorización hasta la primera ^ disminución de 3 puntos desde el inicio en la puntuación de la subescala FACT-C específica del cáncer de colon (CCS), la progresión de la enfermedad o la muerte en el estudio. También se determinará el TDQ para el TOI-C (suma de CCS, bienestar físico y funcional) y el FACT-C total para los cambios desde la línea de base.
Ejemplo 9: Tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-PD-1
Este ejemplo ilustra el uso de los anticuerpos anti-PD-1 de la presente invención para tratar el cáncer.
El estudio de este ejemplo es un estudio de fase 1, abierto, multicéntrico, de dosis múltiples, de escalada de dosis, seguridad, PK y PD del anticuerpo monoclonal mAb7 anti-PD-1 administrado por vía intravenosa en pacientes adultos previamente tratados con melanoma localmente avanzado o metastásico, cáncer de cabeza y cuello de células escamosas (SCHNC), carcinoma de ovario, sarcoma o linfoma de Hodgkin clásico (cHL) recidivante o refractario. El protocolo del estudio se resume en la Tabla 16.
Tabla 16
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Criterios de inclusión: - Diagnóstico histológico o citológico de melanoma localmente avanzado o metastásico, SCCHN, cáncer de ovario, sarcoma, o cHL recidivante o refractario: -El paciente debe haber recibido al menos 1 y no más de 5 líneas de tratamiento previas para la enfermedad recurrente o metastásica, incluyendo tanto las terapias estándar como las de investigación. -Al menos una lesión medible según la definición de RECIST versión 1.1, o (para cHL) al menos una lesión medible ávida de tomografía por emisión de positrones con fluordeoxiglucosa (FDG PET) (Deauville 4/5) según la definición de los Criterios de Respuesta para el Linfoma Maligno que no haya sido irradiada previamente. -Para la expansión de la Parte 1B y todas las cohortes de la Parte 2: el paciente ha dado su consentimiento para someterse a una biopsia antes y durante el tratamiento. -Función renal, hepática y de médula ósea adecuadas Criterios de exclusión - Metástasis cerebrales o leptomeníngeas activas. -Melanoma ocular -Enfermedad autoinmune activa, conocida o sospechada. Se permite la inscripción de pacientes con vitíligo, diabetes mellitus de tipo I, hipotiroidismo residual debido a una afección autoinmune que sólo requiere sustitución hormonal, psoriasis que no requiere tratamiento sistémico o trastornos que no se espera que reaparezcan en ausencia de un desencadenante externo. Diagnóstico de inmunodeficiencia previa o de trasplante de órgano que requiera terapia inmunosupresora, -Para la Parte 2: tratamiento previo con un anticuerpo PD 1 o PD L1. -Antecedentes de EA inmunomediados de grado >3 (incluyendo elevaciones de AST/ALT que se consideraron relacionadas con el fármaco y síndrome de liberación de citoquinas) que se consideraron relacionados con un tratamiento inmunomodulador previo (por ejemplo, inhibidores de puntos de control inmunitarios, agentes coestimulantes, etc.) y que requirieron un tratamiento inmunosupresor.
El número de pacientes con ORR (Tasa de Respuesta Objetiva) se medirá al inicio y cada seis semanas hasta la progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable hasta 24 meses.
Ejemplo 9: Actividad antagónica de anticuerpos anti-PD-1 en células T primarias de humanos y de monos cinomolgo
Este ejemplo ilustra la actividad de los anticuerpos anti-PD-1 en células T primarias humanas y de mono cinomolgo,
En este estudio, las actividades antagonistas del anticuerpo monoclonal mAb7 anti-PD-1 se examinaron in vitro utilizando una reacción de linfocitos mixtos (MLR). Se aislaron células T primarias a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de humanos y de monos cinomolgo. T ras la exposición a mAb7, se evaluó la proliferación celular y la secreción de citoquinas in vitro en diferentes condiciones de activación, utilizando una MLR para humanos y monos cinomolgo y un ensayo de liberación de citoquinas utilizando sangre de monos cinomolgo activada con el superantígeno enterotoxina estafilocócica B (SEB).
Procedimientos
Linfocitos T humanos
Se adquirió una capa leucocitaria humana del Stanford Blood Center (Stanford, CA), se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se colocó una capa de Ficoll para el aislamiento de las PBMC. Las hu-PBMC se lavaron 4 veces con PBS y se aislaron los linfocitos T utilizando un kit de aislamiento de células T Pan específicas de humanos con selección negativa como se describe en el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, San Diego, CA).
Linfocitos T de mono Cinomolgo
Las PBMC de mono cinomolgo frescas se compraron a Bioreclamation IVT (Nueva York, NY) y se lavaron dos veces con PBS. Los linfocitos T se aislaron utilizando un kit de aislamiento de células T específicas para primates no humanos con selección negativa como se describe en el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, San Diego, CA).
Generación de células dendríticas humanas que expresan altos niveles de PD-L1
Se adquirió una capa leucocitaria y humana del Stanford Blood Center (Stanford, CA), se diluyó con PBS y se colocó una capa de Ficoll para el aislamiento de las hu-PBMC. Las hu-PBMC se lavaron 4 veces con PBS y se aislaron los monocitos del clúster de diferenciación 14 (CD14+) utilizando un kit de aislamiento de células humanas específicas CD14 con selección positiva, como se describe en el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, San Diego, CA). A continuación, las células se sembraron a 5 *105 células/ml en un medio completo del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complementado con de suero bovino fetal 10 % (FBS) durante 7 días. Los cultivos se complementaron con IL-4 humana recombinante (rh-) (1000 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) y con factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (g Mc SF) (rh-GMCSF) (500 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) en los días 0, 2 y 5. Las DC inmaduras fueron cosechadas, lavadas y contadas el día 7. Se analizó una muestra de cada preparación para determinar la expresión de PD-L1 utilizando anti-hu-PD-L1 marcado con r-ficoeritrina (eBioscience/Affymatrix, San Diego, CA) mediante citometría de flujo utilizando un analizador LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA).
Generación de células dendríticas de mono Cinomolgo que expresan altos niveles de PD-L1
Las PBMC de mono cinomolgo frescas se compraron a Bioreclamation IVT (Nueva York, NY) y se lavaron dos veces con PBS. Los monocitos CD14+ se aislaron utilizando un kit de aislamiento de células CD14 específico para primates no humanos con selección positiva como se describe en el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotech, San Diego, CA). A continuación, las células se sembraron en forma de 5 x105 células/ml en un medio RPMI 1640 completo suplementado con FBS 10 % durante 7 días. Los cultivos se complementaron con rhlL-4 (1000 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis) y rh-GMCSF (500 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) en los días 0, 2 y 5. Las DC inmaduras fueron cosechadas, lavadas y contadas el día 7. Se analizó una muestra de cada preparación para determinar la expresión de PD-L1 utilizando anti-hu-PD-L1 marcado con RPE (eBioscience/Affymatrix, San Diego, CA) mediante citometría de flujo utilizando un analizador LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA).
Generación de clones celulares de JeKo-1-Luc-proteína verde fluorescente que expresan altos niveles de PD-L1 humana
La línea celular JeKo-1 (un linfoma de células del manto) se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). La línea celular JeKo-1-luc-2A-GFP se produjo en Pfizer (South San Francisco, CA) mediante un procedimiento de transducción en el que se utilizaron partículas lentivirales que expresaban individualmente la luciferasa de luciérnaga (luc2A) y la proteína verde fluorescente (GFP) a través de un sistema bicistrónico con un marcador de blasticidina (AMSBIO, LVP323, 1 x 10E7 partículas por 200 pl) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células JeKo-1 se pelaron y se diluyeron a 1 x106 células/ml en medio RPMI con FBS 20 %. Las partículas lentivirales se añadieron a las células diluidas en una relación de virus 50 pl por células 0,5 ml. Para generar una línea celular JeKo-1 que expresara hu-PD-L1, se sintetizó a medida el ADNc de hu-PD-L1 y se clonó en un vector de expresión genérico (pcDNA3.1) de Life Technologies (San Diego, CA). En Pfizer (South San Francisco, CA) se produjo una línea celular JeKo-1-Luc-GFP que expresaba de forma estable hu-PDL-1 mediante electroporación utilizando el sistema Amaxa® Nucleofector (Lonza, Walkersville, MD) y se utilizó el Kit V de acuerdo con el protocolo del fabricante (Lonza, Walkersville, MD). A continuación, las células se cultivaron en presencia de 250 pg/ml de higromicina durante 2 semanas y luego se seleccionaron mediante clasificación celular utilizando el clasificador celular BD FACSAria™ II (BD Biosciences, San José, CA). La clasificación de las células se llevó a cabo con el clon MIH-1del anticuerpo antihu-PD-L1 (Affymetrix/eBioscience, San Diego, CA) marcado directamente con la etiqueta de aloficocianina (APC). Los clones positivos se expandieron y se comprobó la alta expresión de PD-L1 mediante citometría de flujo (analizador LSRFortessa™, BD Biosciences, San José, CA). Se seleccionaron los clones que se generaron a partir de células individuales clasificadas y que contenían altos niveles de expresión de PD-L1.
Generación de anticuerpos
El mAb7 se generó en células CHO (Pharmaceutical Sciences, Pfizer Inc, Saint Louis, MO) utilizando material de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP) (lote No STL0005717) y se proporcionó en un tampón de histidina 20 mM, sacarosa 85 mg/ml, polisorbato-800,2 mg/ml, EDTA disódico 0,05 mg/ml, pH 5,5. La endotoxina se midió como <0,01 EU/mg.
El anticuerpo de control utilizado en todos los ensayos in vitro fue un anti-virus del herpes bovino clonado en un marco IgG4-HG (el mismo marco que MAB7). El anticuerpo de control se generó en Pfizer (South San Francisco, CA), lote No. 4945, con endotoxina <0,3 EU/mg.
Se generaron dos anticuerpos anti-hu-PD-1 a partir de secuencias publicadas en patentes anteriores y se expresaron en el marco IgG4-HG parecido al utilizado para MAB7. Los anticuerpos se generaron en Pfizer (South San Francisco, CA) y se designaron como control positivo 1 y control positivo 2 (lote No. 5053 y 4255, respectivamente). La endotoxina medida fue <0,13 EU/mg y <0,056 EU/mg, respectivamente.
Ensayo en humanos que usan células dendríticas que expresan altos niveles de PD-L1
El protocolo fue adaptado de Kruisbeek et al, 2004, con algunas modificaciones. Las hu-DC primarias diferenciadas se cosecharon el día 7 y se verificaron mediante citometría de flujo para comprobar los altos niveles de expresión de PD-L1 y las señales coestimuladoras necesarias para la activación de las células T; los marcadores incluían CD80 y CD86 (anticuerpos adquiridos en BD Bioscience, San José, CA). Se contaron las células y se irradiaron a 3.000 unidades de radiación (rads) utilizando una máquina de rayos X RS2000 (Radsource, Brentwood, TN) para evitar que las DC secreten citoquinas y funcionen únicamente como soporte de presentación de Ag para las células T. Por lo tanto, el resultado del ensayo sólo fue inducido por las células T. En el día 7, se cosecharon células T hu recién aisladas de donantes alogénicos. Las células T se colocaron en placas con las DC irradiadas en una relación de 10:1 (las condiciones óptimas del ensayo se determinaron como 2 *105 células T incubadas con 2 *104 DC en cultivos de 200 |jl) en presencia de diferentes concentraciones de mAb7, anticuerpos de control negativo y positivo, o medios solos (para evaluar la reacción de línea de base). Todas las condiciones se colocaron en placas de fondo plano de 96 pocillos tratadas para el cultivo de tejidos (Fisher Scientific Pittsburg, PA). Las células se cultivaron con medios X-vivo15 sin suero (Lonza, Walkersville, MD) para evitar la variabilidad del suero humano entre los experimentos. Los cultivos se incubaron a 37 °C con CO2 5 % de durante 5 días. En el Día 5, se recogieron los sobrenadantes y se midieron las concentraciones de citoquinas utilizando una matriz de perlas citométricas (CBA) (BD Biosciences, San José, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos se adquirieron mediante citometría de flujo (analizador LSRFortessa™, BD Biosceinces, San José, CA) y el análisis de datos se realizó utilizando el software b D FCAP Array Versión 3.0 (BD Biosceinces, San José, CA). La proliferación se midió en cultivos paralelos añadiendo 1 jC i de timidina titulada con metilo 3H (Perkin Elmer, Waltham, MA) a cada pocillo y se incubó durante 16 a 18 horas. A continuación, los cultivos se cosecharon en filtros de incorporación de ácido desoxirribonucleico (ADN) (Perkin Elmer, Waltham, MA), y la incorporación de timidina tritiada proporcionó un índice de proliferación celular medido como recuentos por minuto (cpm) utilizando la máquina MicroBeta2 (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Ensayo en humanos utilizando una línea celular que expresa JeKo1-PD-L1
Este ensayo se realizó utilizando una relación de 5:1 de células T con respecto a la línea celular JeKo-1-PD-L1, ya que esta relación proporcionó un enfoque más ideal para capturar la secreción de citoquinas en el Día 5. Así, en cada pocillo se incubaron 2 *105 células T con 4 *104 JeKo-1-PD-L1. El Día 5, se recogieron los sobrenadantes y se midieron las concentraciones de citoquinas utilizando CBA (BD Biosciences, San José, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Esta línea celular expresa una cantidad muy modesta de moléculas coestimuladoras (CD80 y CD86), por lo que el aumento de la proliferación es muy leve tras el tratamiento con anticuerpos. En cambio, la secreción de citoquinas, incluyendo la IL-2, es robusta, lo que permite medir la secreción de citoquinas tras el tratamiento con mAb7 y no la proliferación de células T.
Ensayo con monos cinomolgo utilizando células dendríticas que expresan altos niveles de PD-L1
Las DC diferenciadas se cosecharon el Día 7 y se verificaron por citometría de flujo (usando el analizador LSRFortessa™, BD Biosceinces, San Jose, CA) para la alta expresión de PD-L1 y las señales coestimuladoras necesarias para la activación de las células T; los marcadores incluyeron CD80 y CD86 (anticuerpos de BD Bioscience, San Jose, CA). Se contaron las células y se irradiaron a 3000 rads utilizando la máquina de rayos X RS2000 (Radsource, Brentwood, TN). Se cosecharon células T de mono cinomolgo recién aisladas de donantes alogénicos. Las células T se colocaron en placas con las DC irradiadas utilizando una relación de 10:1 de células T a las DC (ensayo óptimo cuando se incubaron 2 *105 células T con 2 *104 DC en 200 j l de cultivo) en presencia de diferentes concentraciones de mAb7, anticuerpos de control negativo y positivo, o medios solos para evaluar la reacción de referencia. Todas las condiciones se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo plano con tratamiento de cultivo de tejidos (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Las células se cultivaron con medios X-vivo15 sin suero (Lonza, Walkersville, MD) para evitar la variabilidad del suero entre los experimentos. Los cultivos se incubaron a 37 °C con CO25 % de durante 5 días. El Día 5, se recogieron los sobrenadantes y se midieron las concentraciones de citoquinas utilizando CBA (BD Biosciences, San José, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos se adquirieron mediante citometría de flujo (analizador LSRFortessa™, BD Biosceinces San Jose, CA), y el análisis de datos se realizó con el software BD FCAP Array Versión 3.0 (BD Biosciences, San Jose, CA). Al mismo tiempo y en cultivos similares, se añadió a cada pocillo 1 pCi de timidina titulada con metilo 3H (Perkin Elmer, Waltham, MA); las células se siguieron cultivando durante 16 a 18 horas para medir la proliferación. Los cultivos se cosecharon en filtros de incorporación de ADN Glass Printed filtermate A (Perkin Elmer, Waltham, MA) y la incorporación de timidina tritiada, que proporciona un índice de proliferación celular, se midió como cpm utilizando la máquina MicroBeta2 (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Liberación de citoquinas en la sangre del mono Cinomolgo inducida por la estimulación de un superantígeno (enterotoxina estafilocócica B)
Se recolectó sangre entera del mono cinomolgo; se alicuotaron 225 pl de sangre en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Las muestras se incubaron por duplicado a 37 °C en CO25 % en presencia de mAb7 o de un anticuerpo de control negativo de isotipo similar en concentraciones que iban de 0,1 a 100 pg/ml. Una hora después de la adición del anticuerpo, las muestras se estimularon con 0,1 pg/ml de SEB (Toxic Technologies, Sarasota, FL) y los cultivos se incubaron durante 3 días. El día 3, se recogió el plasma, se agrupó y se congeló a -80 °C. Las concentraciones de IFN-y, IL-2 y TNF-a en las muestras de suero descongeladas se midieron por duplicado de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando placas de inmunoensayo MSD (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) y un lector MSD (modelo 1200) con el software MSD Discovery Workbench (versión 4.0.12). Se comunicaron las medias de los duplicados.
Resultados
Actividad antagónica de mAb7 sobre células T primarias humanas
Cuando se activaron células T humanas primarias en MLR con hu-DC alogénicas que expresaban PD L1, mAb7 aumentó la proliferación de células T (medida por la incorporación de timidina tritiada) y la activación de células T (medida por la secreción de citoquinas proinflamatorias) de manera dependiente de la dosis. El tratamiento de las células T con mAb7 (10 pg/ml) produjo un aumento de la proliferación de células T de hasta 2,5 veces con respecto al tratamiento con un anticuerpo de control negativo (10 pg/ml). Los niveles de IFN-y y TNF-a aumentaron hasta 8 y 5 veces, respectivamente, en comparación con el anticuerpo de control negativo. El aumento del IFN-y fue superior al del TNF-a. No se detectó la expresión de IL-2 en estos cultivos. Cuando se activaron células T humanas primarias en MLR, utilizando la línea celular tumoral JeKo 1 PD-L1 como células presentadoras de antígeno alogénicas, mAb7 indujo un aumento dependiente de la dosis de la secreción de IFN-y (hasta 2,5 veces), TNF-a (hasta 2 veces) e IL-2 (hasta 5 veces) en comparación con el anticuerpo de control negativo. El efecto de mAb7 en este ensayo se asemejó a los datos obtenidos con ambos anticuerpos de control positivo. No se observó un aumento de la proliferación de células T bajo estas condiciones. La proliferación celular fue mínima con una débil señal proporcionada por CD80 y CD86 en comparación con la MLR mediada por las DC primarias. La IL-10, la IL-4, la IL-17A y la IL-6 fueron mínimas o no se detectaron en todos los ensayos descritos anteriormente.
Actividad antagonista de mAb7 sobre las células T primarias de los monos cinomologo
La afinidad de unión de mAb7, cuando está en solución, a la hu-PD-1 y a la PD-1 de mono cinomolgo fue muy similar en el ensayo cinético de exclusión (KinExA) (KD = 23 y 28 pM para la PD-1 de humano y de mono cinomolgo, respectivamente). La EC50 de mAb7 en células que expresan PD-1 humana y PD-1 de mono cinomolgo también fue similar. En un ensayo funcional de MLR que utilizó células T y DC aisladas de diferentes monos cinomolgo, mAb7 indujo la proliferación y activación de células T de forma dependiente de la dosis (medida por incorporación de timidina tritiada). Este efecto también se observó con el control positivo (anticuerpo 1 y anticuerpo 2) pero no con el anticuerpo de control negativo. mAb7 también aumentó la secreción de citoquinas (es decir, IFN-y y TNF-a, hasta 5 veces y 3 veces, en comparación con el tratamiento con el anticuerpo de control negativo. No se detectó la expresión de IL-2 en estos cultivos. En un ensayo diferente de liberación de citoquinas utilizando sangre total de mono cinomolgo estimulada con 0,1 pg/ml de superantígeno SEB durante 3 días, mAb7 (0,1-100 pg/ml) indujo una mayor secreción de IFN-y, IL-2 y TNF-a en comparación con el anticuerpo de control negativo.
Los estudios de MLR se utilizaron para crear un escenario in vitro que se asemeja al microambiente tumoral donde las células T se activan y expresan altos niveles de PD-1 en presencia de las DC alogénicas o células tumorales que expresan PD-L1. La interacción PD-1/PD-L1 inhibe la proliferación de células T y la liberación de citocinas. La adición de anticuerpos anti-PD-1 en estas MLR restauró la activación de las células T y el aumento de la proliferación y la secreción de citocinas, especialmente IFN-y, debido al bloqueo del eje PD-1/ PD-L1.
mAb7 aceleró la proliferación y la secreción de IFN-y, TNF-a e IL-2 por parte de las células T humanas cuando se cultivaron con células alógenas que expresaban altos niveles de PD-L1 (las DC o línea celular JeKo 1 PD-L1). Por el contrario, el anticuerpo de control negativo, que resultó similar al medio solo, no potenció estos efectos. De manera similar, mAb7 mejoró la proliferación de células T, la secreción de IFN-y y TNF-a en el sistema MLR del mono cinomolgo, así como también mejoró la liberación de citoquinas de la sangre completa del mono cinomolgo utilizando el superantígeno SEB.
Estos resultados demuestran que el anticuerpo mAb7 anti-PD-1 aumentó la proliferación de células T y la secreción de citoquinas proinflamatorias, incluyendo el interferón-gamma (IFN-y), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) y la interleucina (IL)-2. Estas actividades se observaron tanto en células T primarias de humanos como de monos cinomolgo.
Ejemplo 10: Efecto de los anticuerpos anti-PD-1 en la enfermedad de injerto contra huésped
Este ejemplo ilustra el efecto de los anticuerpos anti-PD-1 sobre la activación y expansión de las células T in vivo utilizando un modelo de xeno-aGvHD en ratones NSG transferidos con hu-PBMCs.
En este estudio, se estudió el efecto del anticuerpo mAb7 anti-PD-1 sobre la activación y expansión de las células T in vivo en un modelo xeno de enfermedad aguda de injerto contra huésped (aGvHD) en ratones diabéticos no obesos (NOD), con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) y con receptor gamma de interleucina 2 nulo (IL2rynul°) (NSG), utilizando células mononucleares de sangre hu-periférica (PBMC).
Se adquirieron ratones hembra NSG inmunocomprometidos (5 por grupo) de 8 a 10 semanas de edad (nombre formal, NOD, Cg-PrkdCscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Todos los animales fueron alojados en una instalación libre de patógenos en Pfizer (South San Francisco, CA) de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
La capa leucocitaria humana se adquirió en el Stanford Blood Center (Stanford, CA), se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se colocó sobre Ficoll para el aislamiento de las PBMC. Las PBMC se lavaron 2 veces con PBS. Los glóbulos rojos (RBC) se lisaron utilizando el tampón de lisado de amonio-cloruro-potasio (ACK) como se indica en el protocolo del fabricante (Life Technologies; San Diego, CA). Tras la lisis de los RBC, las células se lavaron una vez más y se diluyeron en PBS a 5 * 107 células por ml.
Para la inducción de la xeno-aGvHD, los ratones NSG fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena de la cola con hu-PBMCs. Cada ratón recibió 1 * 107 células en 200 pl de PBS. En todos los experimentos, se pesó a los ratones 3 veces por semana y se les monitorizó para detectar la aparición de síntomas similares a los de xeno-aGvHD, incluyendo pérdida de peso, postura encorvada, pelaje erizado, movilidad reducida y, en algunos casos, diarrea. A los ratones se les practico la eutanasia después de la pérdida del 20 % del peso corporal o la pérdida de 1 g/día durante 2 días; este punto de tiempo se registró como el tiempo de supervivencia. Los anticuerpos mAb7, de control negativo y de control positivo se generaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 9.
Los ratones NSG fueron tratados con anticuerpos de control negativo, anticuerpos de control positivo o mAb7, en dosis que oscilaban entre 0,1-10 miligramos por kilogramo (mg/kg). Los anticuerpos se administraron a los ratones con el vehículo apropiado el Día 2 y el Día 8 después de la transferencia de hu-PBMC. La vía de administración de los anticuerpos fue intraperitoneal (ip).
Se cosechó sangre periférica, bazos e hígados de ratones trasplantados con hu-PBMCs. Las suspensiones unicelulares de cada órgano se prepararon de la siguiente manera: Se recogió sangre periférica y los glóbulos rojos se les aplico lisis con el tampón de lisado ACK y se lavaron con PBS. Los bazos e hígados se homogeneizaron mecánicamente utilizando la parte posterior de un émbolo de jeringa para macerar las células a través de un filtro de 70 pM y se lavaron una vez con PBS. Se les aplicó lisis a los glóbulos rojos y las células se lavaron 2 veces más y se maceraron de nuevo a través del filtro de 70 pM. En esta etapa, las células del bazo estaban listas. Para aislar los leucocitos del hígado, las suspensiones de células individuales se estratificaron utilizando un gradiente de Percoll de 30 % a 80 % (Percoll® Plus, GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) y se sometieron a una centrifugación de alta velocidad. Los leucocitos se recogieron de la capa intermedia y se lavaron dos veces con PBS. Se contaron todas las suspensiones de células individuales y se utilizaron 1 * 106 células de cada muestra para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Para los ensayos de secreción de citocinas humanas, se eliminaron las células CD45+ de ratón utilizando un kit de aislamiento de células CD45 específicas de ratón mediante selección positiva, tal como se describe en el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, San Diego, CA), para garantizar que la secreción de citocinas procediera únicamente de células inmunitarias humanas. Se contaron las células y se utilizaron 1 * 106 células de cada muestra en el ensayo.
Se obtuvieron suspensiones celulares individuales de sangre periférica, bazos e hígados de ratones con xeno-aGvHD. Un total de 1 * 106 células por muestra se incubaron durante 30 minutos a 4 °C protegidas de la luz con una mezcla de anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia apropiados en tampón FACS que incluía 1 * PBS que contenía 2 % de suero bovino fetal (FBS); a continuación, las células se lavaron con tampón FACS. Para la tinción intracelular de la proteína Kiel 67 (Ki67, para medir las células en proliferación), las células se fijaron después de la tinción de superficie utilizando Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set (Affymetrix/eBioscience, San Diego, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La tinción intracelular se realizó durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. Al final de la tinción, las muestras se lavaron y se sometieron a citometría de flujo multicolor utilizando el analizador celular BD LSR Fortessa™ (BD Biosciences, San José, CA). Los análisis de datos se realizaron con el software FlowJo (FLOWJO LLC, Ashland, OR). Los anticuerpos utilizados en diferentes combinaciones para el reconocimiento de las moléculas de la superficie celular fueron: anti-hu-CD45 Pacific Blue (PB) o Amcyan, antiratónCD45-Brilliant Violet (BV)-711, anti-hu-CD3-PerCPCy5.5, anti-hu-CD8 ficoeritrina-Cy7 (PE-Cy7) o BV-786, isotiocianato anti-hu-CD4-fluoresceína (FITC) o BV-650, anti-hu-PD-1 (clon EH12.1) BV-786 o PE, anti-hu-PD-1 (clon MIH-4) PE o FITC, aloficocianina anti-hu-Ki67 (APC) (todos los anticuerpos de BD Biosciences, San Jose, CA), antihu-PD-L1 (PE-Affymatrix-eBioscience, San Diego, CA) y colorante reactivo fluorescente azul para la tinción de vivo/muerto (Life Technologies, Grand Island, NY).
Se obtuvieron suspensiones de células individuales de la población humana enriquecida con CD45 de bazos e hígados de ratones con xeno-aGvHD (después del agotamiento de CD45 en ratones). Se incubó un total de 1 x 106 células por muestra en placas de 96 pocillos de fondo plano tratadas para cultivo de tejidos (Fisher Scientific; Pittsburg, PA) en 200 pl de medio X-vivo 15. A continuación, las células se dejaron sin estimular o se estimularon con acetato de miristato de forbol (PMA) 10 ng/ml y ionomicina (iono) 125 ng/ml, como condición de estimulación baja, o PMA 50 ng/ml y ionomicina 1 pg/lL como la condición de estimulación alta (ambos obtenidos de Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Los cultivos se incubaron durante 8 horas a 37 °C en 5 % de CO2 para asegurar la máxima secreción de citoquinas. Se recogieron los sobrenadantes y se midieron las concentraciones de citoquinas humanas utilizando una matriz de perlas citométricas (CBA) específica para citoquinas humanas (BD Biosciences, San José, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos se adquirieron mediante citometría de flujo (analizador LSRFortessa™, BD Biosciences, San José, CA), y el análisis de los datos se realizó con el software FCAP Array™ versión 3.0 (BD Biosciences, San José, CA). Los kits de matriz de microesferas hu- IFN-y, hu-TNF-a y hu-IL-2 se adquirieron de BD Biosciences (San José, CA), y se confirmó que no tenían reacción cruzada con las citocinas de ratón.
Todos los análisis incluyeron una comparación de medias utilizando la prueba t de muestras independientes o ANOVA de 2 vías utilizando Graphpad Prism (Graphpad Software, San Diego, CA). Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los datos de injerto se representan en las figuras como concentraciones medias, incluyendo el error estándar de la media (sem).
El tratamiento de ratones inmunocomprometidos NSG con el anticuerpo mAb7 anti-PD-1 aceleró la pérdida de peso corporal (Tabla 17) e indujo otros signos de la enfermedad que se observan comúnmente en este modelo, tales como postura encorvada, pelaje erizado, disminución de la movilidad y, en algunos casos, diarrea. En este modelo, se espera que la pérdida de peso corporal se acelere entre el Día 20 y el Día 30 después de la transferencia (véase, por ejemplo, Schroeder y DiPersio, 2011). Debido a que el tratamiento con mAb7 y los controles positivos 1 y 2 aceleraron los síntomas de la xenoinmunodeficiencia, a los ratones se les tuvo que aplicar la eutanasia en puntos de tiempo más tempranos y no se pudo obtener una curva de supervivencia; por lo tanto, la pérdida de peso corporal fue la medida de resultado principal. En el primer experimento, los ratones fueron tratados con 0,1, 1 y 10 mg/kg de mAb7 o con el anticuerpo de control negativo a 10 mg/kg. En la Tabla 17, la pérdida de peso corporal se calculó normalizando las diferencias de peso corporal entre los grupos tratados en el Día 23 en relación con el Día 0. Los valores indican un promedio de 5 ratones por grupo ± sem.
Tabla 17
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Los ratones fueron tratados con los anticuerpos indicados en el Día 2 y el Día 8 después de la transferencia de hu-PBMC. Mientras que la pérdida de peso corporal se hizo evidente en el grupo de control en el día 23, la pérdida de peso corporal y la progresión de la enfermedad se detectaron en ratones individuales de todos los grupos tratados con el anticuerpo mAb7 anti-PD-1 a partir del Día 10-11 después de la transferencia de hu-PBMCs. Tanto en el grupo tratado con 1 mg/kg como en el tratado con 10 mg/kg, la pérdida de peso corporal alcanzó significación entre los Días 14 y 23, en comparación con el grupo tratado con el control negativo (p<0,0001). En el Día 23, se detectó una pérdida de peso del 15 % en los grupos tratados con 1 mg/kg y 10 mg/kg y una pérdida de peso del 7,9 % en el grupo tratado con 0,1 mg/kg (Tabla 17).
Los análisis FACS de la sangre periférica, el hígado y el bazo demostraron un aumento del porcentaje de células positivas para hu-CD45 y células T positivas para hu-CD3 en el grupo tratado con mAb7 frente al grupo de control. Los datos representativos de los bazos también mostraron un aumento en los recuentos de células T positivas para hu-CD8, y en los recuentos de células T positivas para hu-CD4 (pero en menor medida) en mAb7 frente al grupo de tratamiento con anticuerpos de control negativo. También se observó un aumento similar en el recuento de células T hu en el hígado y la sangre. Para evaluar si el aumento de células T se debía al bloqueo de PD-1 a través de la unión de mAb7 a las células T humanas, se tiñeron las células T con un anticuerpo comercial para PD-1 (clon EH12.1) que compite con la unión de mAb7. Los linfocitos tratados con mAb7 de todos los órganos (analizados por FACS) no mostraron ninguna unión a EH12.1. Para confirmar que las células T tratadas con mAb7 siguen expresando PD-1, se tiñeron las células T con un clon diferente de anti-hu-PD-1 (clon MIH4) que compite parcialmente con mAb7 en la unión a las células T. Los resultados mostraron que las células T tratadas con mAb7 se unían parcialmente a MIH4; indicando así que PD-1 se expresaba en las células T tratadas y que el bloqueo de PD-1 por mAb7 era evidente (datos no mostrados, mantenidos en los registros internos de Pfizer). No se observaron cambios detectables en la expresión de hu-PD-L1 en el bazo, en las células T ( positivas para hu-CD3) o en las células no hu-T (negativas para hu-CD3 ). El Ki67, un marcador de la proliferación de linfocitos se elevó en las células hu-CD3 positivas del grupo tratado con PF-0681591 frente al grupo tratado con control negativo en el bazo (panel central). Se observaron resultados similares en la sangre y el hígado.
Para examinar los efectos de mAb7 en la liberación de citoquinas durante la xeno-aGvHD, se aislaron adicionalmente células positivas para hu-CD45 (de hígado y bazo) de células positivas para CD45 de ratón. A continuación, estos linfocitos se trataron con una mezcla de PMA y ionomicina (en 2 concentraciones: baja y alta) o se dejaron sin tratar durante 8 horas a 37 °C. La secreción de citoquinas se midió en los sobrenadantes mediante CBA (Tabla 18). No se obtuvieron citocinas detectables sin estimulación (Tabla 18). Tras el tratamiento con mAb7, hu-IFN-Y, hu-IL-2 y hu-TNF-a se elevaron en los linfocitos humanos aislados de los compartimentos del bazo y del hígado de los ratones en comparación con los grupos de control. Bajo condiciones de estimulación débil ex vivo, las células T tratadas con mAb7 aumentaron la secreción de hu-IFN-Y hasta niveles significativamente superiores a los de las células T aisladas del grupo de control negativo (p<0,05). Bajo condiciones de estimulación fuerte ex vivo, todas las citocinas se indujeron en todos los grupos, pero aumentaron más en las células T tratadas con mAb7 en comparación con las células T aisladas de los controles negativos. La Tabla 18 muestra los datos recogidos de 5 ratones diferentes en cada grupo. En la Tabla 18, *p<0,05, **p<0,01 en la prueba t no emparejada que compara mAb7 con el grupo de control negativo; aGvHD = Enfermedad aguda del injerto contra el huésped; Hu = Humano; IFN-y = Interferón gamma; IL-2 = Interleucina-2; Ino = lonomicina; N = Número; ns = No significativo; P = Valor P; PMA = Acetato de miristato de forbol; TNFa = Factor de necrosis tumoral alfa; Xeno = Xenogénico.
Tabla 18
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continuación
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Estos resultados demuestran que el tratamiento de la xenoinjerencia con el anticuerpo mAb7 anti-PD-1 aceleró el desarrollo de xeno-aGvHD en los ratones NSG, según lo medido por la pérdida de peso corporal, la proliferación de células T y el aumento de la secreción de citoquinas, incluyendo el interferón-gamma (IFN-y) y la interleucina-2 (IL-2).
Ejemplo 11: Caracterización de los anticuerpos anti-PD-1
Este ejemplo ilustra la afinidad de unión, la especificidad y la actividad de bloqueo del ligando del anticuerpo mAb7 anti-PD-1 en células que expresan el receptor de superficie PD-1.
mAb7, el anticuerpo de control negativo y los anticuerpos de control positivo se generaron como se describió anteriormente en el Ejemplo 9. El clon EH12.1 de anticuerpo anti-hu-PD-1, marcado primariamente con ficoeritrina (PE) o violeta brillante (BV)-786 y los anticuerpos de control del isotipo marcados con los mismos colorantes se adquirieron de BD Biosciences (San José, CA). El anticuerpo de clon J43 de anti-ratón PD-1 marcado con PE y de control de isotipo anti-hámster IgG fueron adquiridos de Affymetrix/eBiosciense (San Diego, CA). La hu-PD-L1 biotinilada y la hu-PD-L2 biotinilada (CD273), se obtuvieron de ACRO Biosystems (Newark, DE). Las proteínas PD-L1 y PD-L2 del mono Cinomolgo se compraron a Creative BioMart® Recombinant Proteins (Shirley, NY), y ambas se marcaron internamente con colorante Alexa Fluor® 647 utilizando un kit de marcaje de proteínas Alexa Fluor® 647 (LifeTechnologies, San Diego,CA) según las instrucciones del protocolo del fabricante. Se probó la unión de PD-L1 y PD-L2 de mono cinomolgo a la línea celular que expresa PD-1 de mono cinomolgo. Las etiquetas Fc de la PD-L1 de rata y de ratón (región Fc de la IgG1 humana en el extremo C) se compraron a Creative BioMart® Recombinant Proteins (Shirley, NY). La detección de PD-L1 y PD-L2 biotinilados se logró utilizando estreptavidina PE o aloficocianina (APC) (Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA). La detección de la PD-L1 de rata o de ratón se logró utilizando el fragmento Fc gamma (Fcy) marcado con APC, asno-anti-humano affiniPure F(ab')2 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA).
Vectores para la transfección transitoria
El plásmido de expresión de Hu-PD-1 (en el vector pCMV6-Entry) se adquirió de OriGene Technologies, Inc (Rockville, m D), catálogo No RC210364/Número de acceso NM_005018.
El plásmido de expresión del ratón-PD-1 (en el vector pCMV6-Entry) se adquirió de OriGene Technologies, Inc (Rockville, MD), catálogo No MR227347/Número de acceso NM_008798. La PD-1 de mono Cinomolgo fue optimizada en cuanto a codones y sintetizada por Life Technologies (San Diego, CA), lote No 1482149/Número de acceso EF443145. Se clonó en un plásmido de expresión patentado por Pfizer (San Francisco, CA) con base en el citomegalovirus (CMV), en el marco de una secuencia de señal secretoria kappa de ratón que añadía una etiqueta FLAG terminal C al extremo C.
El ácido desoxirribonucleico (ADN) de la PD-1 de rata se sintetizó a medida de acuerdo con la secuencia del número de acceso NM_001106927 y se clonó en los sitios BamHI-Notl del vector de expresión pEF1V5-His de LifeTechnologies (San Diego, Ca ), lote No 1598305.
Vectores de expresión de PD-1 para la transfección estable
El ADN de Hu-PD-1 se sintetizó a medida de acuerdo con la secuencia del número de acceso NM_005018 y se clonó en los sitios BamHI-Notl del vector de expresión InVitroGen pEF1V5-His B; lote No 513478.
El ADN del PD-1 de mono cinomolgo se sintetizó a medida de acuerdo con el número de acceso EF443145 y se clonó en los sitios BamHI-Notl del vector de expresión InVitroGen pEF1V5-His B, lote No 1482149.
El ADN del ratón-PD-1 se sintetizó a medida de acuerdo con el número de acceso NM_008798 y se clonó en los sitios BamHI-Notl del vector de expresión InVitroGen pEF1V5-His B, lote No 1513476.
Todos los vectores fueron sintetizados y clonados en el vector de expresión InVitroGen pEF1V5-His B por Life Technologies (San Diego, CA). Todos los vectores contienen la secuencia completa de PD-1, incluyendo el dominio extracelular, el dominio de membrana y el dominio citosólico. Todos los vectores codificaban una etiqueta epitópica V5-6His en el extremo C de PD-1. El gen de resistencia a la neomicina se incluyó en cada vector para la selección mediante el uso de antibióticos de sulfato G418.
Transfección transitoria utilizando la línea celular HEK-293T
Las células HEK-293T se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC®, Manassas, VA), y las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Corning CellGro, Manassas, VA) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS) y 1 * Penicilina/Estreptomicina (Pen/Strep) y se cultivaron en 6 % de dióxido de carbono (CO2) a 37 °C. Un día antes de la transfección, las células fueron tripsinizadas y sembradas a 4 *106 células por matraz T75 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). El día de la transfección, los medios de crecimiento precalentados y sin antibióticos sustituyeron a los medios antiguos y las células se incubaron durante 2 horas a 37° C en CO26 %. Se añadió el vector de expresión o el vector vacío (10 |jg) a medio OptiMEM 1,5 ml (Life Technologies, San Diego, CA). A continuación, se añadió el reactivo Lipofectamine 2000 (20 j l) (Life Technologies, San Diego, CA) a otro OptiMEM 1,5 ml. A continuación, se mezclaron los tubos de OptiMEM con Lipofectamine OptiMEM y se incubaron a temperatura ambiente durante 25 minutos. A continuación, se añadió la mezcla de OptiMEM gota a gota al frasco de cultivo apropiado, y se dejó el frasco toda la noche a 37 °C en CO26 %. Al día siguiente, se retiró el medio del matraz y se sustituyó por un medio de crecimiento completo. Cuarenta y ocho (48) horas después de la transfección, las células se cosecharon utilizando el StemPro-Accutase (Life Technologies, San Diego, CA), permitiendo así que las células se retiraran suavemente de la superficie de cultivo sin afectar a la expresión de la superficie de PD-1. A continuación, las células se sometieron a análisis de unión de anticuerpos y de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Transfección estable con la línea celular Jurkat
La línea celular Jurkat, (clon E6-1 -TIB-152™, ATCC®, Manassas, VA), se utilizó para expresar de forma estable la PD-1 de hu y mono cinomolgo. Las líneas celulares se generaron mediante electroporación con el sistema de necluotransfección Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Las transfecciones se realizaron en Pfizer (San Francisco, CA) utilizando un Kit V según las instrucciones del protocolo del fabricante (Lonza, Walkersville, MD). Las células se mantuvieron en un medio de crecimiento Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 complementado con FBS 10 % y 1 * L-glutamina (LifeTechnologies, San Diego, CA) a 37°C en CO2 5 % a una densidad entre 0,3 y 1,0 * 106 células/ml. Para cada uno de los vectores, se utilizaron 2 jg/m l para transfectar 2 * 106 células. Tras la transfección, las células se cultivaron en presencia de sulfato G418 (600 jg/mL) durante 2 semanas para la selección y el mantenimiento de las células transfectadas de forma estable. Para evitar la contaminación a largo plazo, se añadió al medio 1 * Pen/Strep. Los clones unicelulares se seleccionaron cultivando las células en una dilución de 1:200 (1 célula en 200 j l de medio completo suplementado con antibióticos de sulfato G418). Para seleccionar los clones que expresan un alto nivel de PD-1 de hu o de mono cinomolgo, se utilizó el clon EH12.1 de anti-hu-PD-1 marcado con PE en los ensayos de citometría de flujo. Las muestras se recogieron con el analizador celular BD LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA). Los análisis de datos y la intensidad media de fluorescencia (MFI) se calcularon con el software Flowjo (FLOWJO LLC, Ashland, OR). Para el desarrollo del ensayo se eligieron las líneas celulares con una MFI elevada.
Las células HEK-293T transfectadas con vectores de PD-1 de hu, mono cinomologo, ratón o rata, o con un vector vacío, se cosecharon a las 48 horas después de la transfección. Antes de la unión con mAb7, las células de cada transfección específica se probaron con anticuerpos o ligandos comerciales para asegurar que el receptor PD-1 apropiado estuviera altamente expresado en la superficie celular. Para los humanos y el mono cinomolgo, se utilizó un anticuerpo comercial anti-PD-1 de reacción cruzada (clon EH12.1). Para el ratón, se utilizó un anticuerpo comercial PD-1 de anti-ratón (clon J43). En el caso de la rata, se utilizó un ligando PD-L1 de rata (ya que no se disponía de un anticuerpo comercial anti-PD-1 de reacción cruzada con la rata). Una vez confirmada la expresión adecuada de PD-1, se contaron las células y se incubaron 2 *105 células con la mezcla de Grado Funcional del Inhibidor de la Unión al Receptor hu-Fc (bloqueo del receptor Fc-y a 1 jg/1 *106 células, Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA) durante 20 minutos y se añadió a la mezcla el colorante reactivo fluorescente azul, utilizado para la tinción de vivo/muerto (Life Technologies, San Diego, CA). Se añadieron a las mezclas de células diluciones seriadas del anticuerpo mAb7 o del control negativo (1-0,00001 jg/m l) y se dejaron incubar en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células y se añadió a la mezcla un Fragmento IgG F(ab')2 antifiniPure de asno antihumano marcado con APC, específico para Fcy (dilución 1:100) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA) y, a continuación, se incubaron las células en hielo durante otros 30 minutos. Los datos se adquirieron en el analizador celular BD LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA), y se analizaron utilizando el software Flowjo (FLOWJO LLC, Ashland, OR).
Se generaron clones estables de células Jurkat que fueron transfectadas con el receptor PD-1 de hu, mono cinomolgo o ratón. Los clones de células PD-1 elegidos para estos ensayos de cada especie expresaban cantidades similares de receptores PD-1 (~400.000 receptores/célula; los receptores se cuantificaron previamente durante la generación de estas líneas celulares). Una vez confirmada la expresión adecuada de PD-1, se contaron las células y se incubaron 2 x 105 células con el Grado Funcional del Inhibidor de la Unión al Receptor hu-Fc (Bloqueo del receptor Fc-y a 1 pg/1 x106 células, Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA) durante 20 minutos y se añadió a la mezcla el colorante reactivo fluorescente azul, utilizado para la tinción de vivo/muerto (Life Technologies, San Diego, CA). Se añadieron a la mezcla de células diluciones seriadas (1:3) de mAb7, control positivo 1, control positivo 2 o anticuerpos de control negativo (utilizando un marco IgG4) y se dejaron incubar en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células y se añadió a la mezcla una Fragmento IgG F(ab')2 antifiniPure de asno antihumano marcado con APC, específico para Fcy (dilución 1:100) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA) y se dejaron incubar las células en hielo durante otros 30 minutos. Los datos se adquirieron en el analizador celular BD LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA). Los análisis se realizaron con el software Flowjo (FLOWJO LLC, Ashland, OR) y se calcularon las medias geométricas. Los valores de EC50 se calcularon con Graph Pad Prism (Log agonístico frente a la respuesta de [unión]).
Se generaron células T activadas que expresaban altos niveles de receptores PD-1. Se confirmó la expresión adecuada de PD-1 para las células T, obtenidas de cada especie, utilizando reactivos comerciales (clon EH12.1 de anti-hu-PD-1 para humanos y monos cinomolgo, clon J43 de anti-ratón-PD-1 para PD-1 de ratón, y PD-L1 de rata para PD-1 de rata). Se contaron las células y se incubaron 1 x 106 células con Grado Funcional del Inhibidor de la Unión al Receptor hu-Fc (Bloqueo del receptor Fc-y a 1 pg/1 x 106 células, Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA) durante 20 minutos y se añadió a la mezcla el colorante reactivo azul fluorescente, utilizado para la tinción de vivo/muerto (Life Technologies, San Diego, CA). Se añadieron diluciones seriadas de mAb7 (dilución 1:3) a la mezcla de células y se dejaron incubar en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células antes de añadir el anticuerpo secundario del Fragmento IgG F(ab')2 antifiniPure de asno antihumano marcado con APC, específico para Fcy (dilución 1:100) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA), y se dejaron incubar las células en hielo durante 30 minutos. Los datos se adquirieron en el analizador celular BD LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA). Los análisis de datos se realizaron con el software Flowjo (FLOWJO LLC, Ashland, OR). Se contaron las medias geométricas y se calcularon los valores de EC50 utilizando el Pad Graph Prism (Log agonístico frente a la respuesta de [unión]).
Para el ensayo se eligieron clones estables de células Jurkat que expresaban altos niveles de hu-PD-1. Veinte (20) pg/ml de hu-PD-L1 biotinilado o de hu-PD-L2 biotinilado saturaron todos los receptores de PD-1 en esta línea celular (después de los ensayos de titulación de unión previa). Por lo tanto, se eligió esta concentración como la óptima en estos estudios. Las células Jurkat que expresan Hu-PD-1 (2 x105) se incubaron con el Grado Funcional del Inhibidor de la Unión al Receptor hu-Fc l (bloqueo del receptor Fc-y a 1 pg/1 x 106 células, Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA) durante 20 minutos, y también se añadió a la mezcla el colorante reactivo fluorescente azul, utilizado para la tinción de vivo/muerto (Life Technologies, San Diego, CA). Se añadió hu-PD-L1 biotinilado o hu-PD-L2 biotinilado a las células a 20 pg/ml, seguidos inmediatamente por la adición de diluciones seriadas de mAb7, control positivo 1, control positivo 2 o control negativo (todos ellos en la espina dorsal de IgG4 y en diluciones seriadas de 1:3).Las células se dejaron incubar en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células y se añadió estreptavidina PE (dilución 1:100) (Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA) y se dejaron incubar las células en hielo durante 30 minutos. A continuación, se adquirieron los datos en el analizador celular BD LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA) y se analizaron con el software Flowjo (FLOWJO LLC, Ashland, OR) y se calcularon las medias geométricas. Los valores de IC50 se calcularon utilizando el Graph Pad Prism (Log inhibidor frente a la respuesta de [unión]).
Las células Jurkat fueron transfectadas de forma estable con altos niveles de receptores PD-1 de hu- o mono cinomolgo. Para este ensayo se eligieron células que expresan receptores PD-1 de mono cinomolgo (~400.000 receptores/célula). Se probó la unión de PD-L1 y PD-L2 de mono cinomolgo utilizando estas células y los resultados mostraron que 20 pg/mL de PD-L1 o PD-L2 de mono cinomolgo fueron suficientes para saturar todos los receptores de PD-1 con base en la media geométrica probada para diferentes concentraciones (50 ng/ml-50 pg/ml) de estos ligandos cuando se unen a esta línea celular. Se incubaron células Jurkat que expresaban el PD-1 de mono cinomolgo-(2 x105) con el Grado Funcional del Inhibidor de la Unión al Receptor hu-Fc l (bloqueo del receptor Fc-y a 1 pg/1 x 106 células, Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA) durante 20 minutos y se añadió a la mezcla el colorante reactivo azul fluorescente, utilizado para la tinción de vivo/muerto (Life Technologies, San Diego, CA). Se añadieron a las células, PD-L1 de mono cinomolgo de Alexa-Fluor®-647 o PD-L2 de mono cinomolgo de Alexa--Fluor®-647- a t 20 pg/ml inmediatamente seguidos de diferentes concentraciones de mAb7, control positivo 1, control positivo 2, o anticuerpos de control negativo (utilizando la espina dorsal de IgG4, en dilución serial 1:3). A continuación, se dejaron incubar las células en hielo durante 1 hora. Tras el lavado, las células se adquirieron en el analizador celular BD LSRFortessa™ (BD Biosciences, San José, CA). Los análisis de los datos se realizaron con el software Flowjo (FLOWJO LLC, Ashland, OR), y se calcularon las medias geométricas. Los valores de IC50 se calcularon con Graph Pad Prism (Log inhibidor versus respuesta de [unión]).
La capa leucocitaria humana, adquirida en el Stanford Blood Center (Stanford, CA), se diluyó con PBS y se colocó en capas sobre Ficoll para el aislamiento de PBMC. Las PBMC se lavaron 4 veces con PBS. Se les aplicó lisis a los glóbulos rojos utilizando el tampón con lisis ACK como se indica en el protocolo del fabricante (Life Technologies, San Diego, CA). Tras la lisis de los RBC, las células se lavaron una vez más y se diluyeron en PBS a 5 * 107 células por ml. La mitad de las PBMC se contaron y se congelaron en medios de congelación (90 % de FBS con dimetilsulfóxido [DMSO] 10 % de ) y las células restantes se sometieron a la purificación de células T.
A partir de las PBMC restantes, se aislaron linfocitos T utilizando un kit de aislamiento de células T Pan específico para hu con selección negativa, tal como se describe en el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, San Diego, CA).
Para el ensayo ADCC, se contaron las células T recién aisladas (células objetivo) y se cultivaron 1 * 106 células T por ml en medios X-vivo 15 sin suero (Lonza, Walkersville, MD) y se estimularon utilizando perlas recubiertas con anti-CD3 y anti-CD28 (Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 for T-Cell Expansion and Activation (Life Technologies, San Diego, CA) y 100 U/ml de recombinante-humano (rh)-IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los cultivos se incubaron a 37 °C en CO25 durante 72 horas. Cuando la activación de las células T alcanzó el punto de tiempo de 48 horas, se descongelaron las PBMC (células efectoras derivadas del mismo donante), se contaron y se estimularon con rh-IL-2 (50 U/ml a 5 *106 células/ml de cultivo) durante un total de 18 a 24 horas en medio completo RPMI-1640 con FBS 10 %. El día del ensayo, se contaron ambos tipos de células y se analizaron mediante citometría de flujo para garantizar una activación adecuada. Para las células T, se examinó la expresión de PD-1 alta y para las PBMC se examinó el nivel de expresión de los receptores CD16, CD32 y CD64 (receptor Fc-gamma-[FcyR] III [a y b], FcyRlla, FcyRI, respectivamente) que median ADCC. Las células se sembraron en una relación de 5:1 entre efectores y objetivo (ya que esta era una relación óptima) en placas de fondo plano de 96 pocillos tratadas para cultivo de tejidos (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) tras la adición de anticuerpos: mAb7 (marcos de IgG4 e IgG1), y anticuerpos de control positivo. Todos los anticuerpos se probaron en concentraciones de 0,01 a 100 pg/ml (en diluciones seriadas de 1:10). Se añadieron controles de ensayo, incluyendo las células objetivo solas, para evaluar la lisis máxima, las células efectoras solas, y el efector al objetivo en una relación de 5:1 sin adición de anticuerpos. Las placas de ensayo se incubaron a 37 °C en CO25 % durante 4 horas. Los datos se analizaron utilizando el Ensayo de Citotoxicidad CytoTox 96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega US, Madison, WI) según las instrucciones del protocolo del fabricante. El ensayo midió cuantitativamente la lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima citosólica estable que se libera tras la lisis celular. El porcentaje (%) de citotoxicidad se midió como = 100 * (Liberación experimental de LDH [OD490]/Liberación máxima de LDH [OD490]). La liberación máxima de LDH se calculó cuando se aplicó lisis químicamente sólo a las células objetivo (células T) para obtener la máxima mortandad.
La capacidad de mAb7 de unirse a la PD-1 de hu, mono cinomolgo, ratón y rata se evaluó mediante ensayos de unión celular por citometría de flujo (FACS) que incluían la línea celular HEK-293T transfectada transitoriamente, células T activadas primarias y células Jurkat transfectadas de forma estable con PD-1 de hu o PD-1 de mono cinomolgo y ratón. Se unió mAb7 tanto a la hu-PD-1 como a la PD-1 de mono cinomolgo con alta afinidad y mostró valores de EC50 similares para las 2 especies (la secuencia de aminoácidos de estas isoformas es la más similar de las especies analizadas). Los datos se resumen en las Tablas 19, 20 y 21. La unión a la PD-1 de ratón sólo se logró a una concentración elevada de mAb7 que es biológicamente irrelevante y podría deberse al procedimiento de maduración de la afinidad. No se detectó ninguna unión de mAb7 para la PD-1 de rata- cuando se utilizaron células transfectadas o células T primarias activadas (Tabla 19).
T l 1 ni n mA n l l T rim ri ír n i r FA
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Tabla 20: Unión de mAb7 a células T primarias activadas obtenidas que expresan PD-1 de un individuo humano y de un mono Cinomol o EC50
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En la Tabla 20, cada número representa los valores EC50 para la unión de mAb7 a un donante diferente. La fila inferior representa el promedio ± sem. sem = error estándar de la media.
Tabla 21: Unión de mAb7 a líneas celulares Jurkat transfectadas de forma estable con PD-1 humana o PD-1 de
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En la Tabla 21, cada número representa los valores EC50 para la unión de mAb7 en un solo experimento. *indica el promedio ± sem. mAb (IgG4) = Anticuerpo monoclonal con marco IgG4; PD-1= Muerte programada-1; sem= Error medio estándar.
Se examinó la unión de mAb7 a la PD-1 de hu y monos cinomolgo utilizando diferentes sistemas de ensayo con base en células. En todos los sistemas la unión se encontró con alta afinidad y especificidad en ambas especies. Utilizando líneas celulares HEK-293T transfectadas transitoriamente que expresaban la PD-1 de hu o de mono cinomolgo, el mAb7 mostró patrones de unión similares, tal y como indica MFI. Se observó una unión mínima o nula en la línea celular parental transfectada con un vector vacío (vehículo).
Los valores EC50 de la unión de mAb7 a las células T primarias activadas de hu y mono cinomolgo se determinaron a las 72 horas después de la activación, cuando la expresión de PD-1 en la superficie celular y la viabilidad celular eran óptimas (Tabla 19). Se calcularon los valores EC50 para 2 donantes diferentes de cada especie (Tabla 20). Tanto en las células T activadas de hu como en las del mono cinomolgo, se obtuvieron valores EC50 bajos y se encontró que los valores EC50 eran cercanos entre las 2 especies, 51,04 ± 5,07 pM y 85,34 ± 11,73 pM, respectivamente (media ± error estándar medio [sem]). No se observó ninguna unión con el anticuerpo de control negativo por encima de los valores de línea de base.
La línea de células T Jurkat, que expresa mínimamente los receptores hu-PD-1, se utilizó para generar líneas celulares hu-PD-1, PD-1 de mono cinomolgo y PD-1 de ratón- transfectadas de forma estable. Se subclonaron líneas celulares y se seleccionaron clones que expresaban altos niveles de receptores hu-PD-1 y PD-1 de mono cinomolgo (~400.000 receptores PD-1 por célula fue la máxima expresión obtenida). En este sistema, mAb7 mostró una alta afinidad por los receptores hu-PD-1 y PD-1 de mono cinomolgo. Los valores de EC50 para las dos especies fueron similares a los datos de las células T activadas primarias (Tabla 21); EC50= 64,725 ± 1,89 para hu-PD-1 y 222,55 ± 41,3 para PD-1 de mono cinomolgo-. Los valores de EC50 para las células que expresan PD-1 de mono cinomolgo fueron más variables que los valores de EC50 de humanos entre las 2 series experimentales. Los datos de las dos especies fueron similares a los obtenidos con los anticuerpos de control positivo utilizados en cualquier repetición (Tabla 21). El anticuerpo de control negativo no mostró una unión por encima de los valores de línea de base en ninguna de las repeticiones experimentales. La capacidad de mAb7 para bloquear la interacción de los ligandos PD-L1 y PD-L2 con el receptor PD-1 se examinó en una línea celular Jurkat transfectada con PD-1 (que expresaba hu-PD-1 o PD-1 de mono cinomolgo). En este ensayo, las células se incubaron con ligandos marcados a concentraciones saturadas tras la incubación con mAb7 no marcados a diferentes concentraciones. Como se muestra en la Tabla 22, mAb7 inhibió la unión de los ligandos PD-L1 y PD-L2 al receptor PD-1 de forma dependiente de la dosis. Los anticuerpos de control positivo para PD-1 mostraron una inhibición comparable. El IC50 de mAb7 fue comparable entre PD-1 de hu- y mono cinomolgo (880,15 ± 289,85 y 1058 ± 355,4 para hu-PD-L1 y hu- PD-L2, respectivamente; y 942,9± 110,1 y 839 ± 89,5 para PD-L1 de mono cinomolgo y PD-L2 de mono cinomolgo, respectivamente). En la Tabla 22 se presenta un sumario de los valores de IC50. En la Tabla 22, cada número representa los valores de IC50 para mAb7 en un único experimento; *indica el promedio ± sem; $ indica el número de repeticiones entre paréntesis; mAb IgG4=anticuerpo monoclonal con marco IgG4; PD-1=Muerte programada-1; PD-L1=Ligando de muerte programada 1; PD-L2=Ligando de muerte programada 2; sem = Error estándar de la media.
Tabla 22: Concentraciones inhibitorias (IC50; pM) para el bloqueo de la unión de PD-1 humana o PD-1 de mono
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Humano-PD-1/Jurkat PD-1 de mono cinomolgo/Jurkat
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mAb (IgG4) Bloqueo de PD- Bloqueo de PD- Bloqueo de PD- Bloqueo de PD-
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El mAb7 mostró una débil unión para el componente del complemento 1, subcomponente q (C1q) y CD64. El C1q y el CD64 (para el marco de IgG4) se consideran sustitutos potenciales de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y de ADCC, respectivamente. Para investigar más a fondo la falta de capacidad de mAb7 para inducir la muerte de células T in vitro, se realizó un ensayo ADCC con células T activadas (células objetivo) que expresaban altos niveles de receptores PD-1 y PBMC (células efectoras) que expresaban altos niveles de receptores Fcy. Se seleccionaron células de 2 donantes sanos. mAb7 (en su marco original IgG4) mostró una actividad ADCC mínima en ambos donantes. La falta de actividad ADCC estaba en concordancia con la actividad exhibida por el anticuerpo de control positivo anti PD-1 en el marco de la y ambos eran similares al anticuerpo IgG4 de control negativo. Cuando el anti-PD-1 (mAb7 o anticuerpos anti-PD-1 de control positivo) se evaluó en el marco de IgG1 humana, que se sabe que induce una ADCC más fuerte, el anti-PD-1 indujo una ADCC hasta 4 veces mayor que cuando el anticuerpo está en el marco de la IgG4. La liberación máxima de LDH se calculó cuando se les aplicó lisis a las células objetivo solas (células T) de forma química para obtener la máxima mortandad (la mortandad se estimó como el 100% de lisis para cada donante de acuerdo con el cálculo del ensayo). La lisis de células T utilizando el marco IgG1 se corresponde con el nivel de PD-1 en las células T activadas (la expresión de PD-1 del donante 1, así como la lisis, es mayor que la del donante 2 ), lo que confirma la precisión del ensayo.
Estos resultados demuestran que el anticuerpo mAb7 anti-PD-1 se une con alta afinidad a los receptores PD-1 de hu y mono cinomolgo expresados en las células con valores de EC50 que oscilan entre 46 y 270 pM, dependiendo del sistema de prueba. mAb7 no se unió a las células que expresan PD-1 de ratón o a PD-1 de rata en concentraciones fisiológicas. mAb7 bloqueó la interacción de los ligandos PD-L1 y PD-L2 con los receptores PD-1 de la superficie celular; los valores IC50 oscilaron entre 500 y 1000 pM, lo que indica su elevada función antagonista en el bloqueo de la función de PD-1 inducida a través de la unión del ligando. mAb7, en su marco IgG4, desencadenó una citotoxicidad mínima o nula inducida por el anticuerpo, lo que es coherente con las propiedades del anticuerpo IgG4.
Ejemplo 12: Caracterización de la unión del anticuerpo mAb7 anti-PD-1 a PD-1, FcRn, FcyRs y C1Q mediante biosensores sin etiqueta y ELISA.
Este ejemplo ilustra las afinidades de unión in vitro de mAb7 hacia la PD-1 purificada recombinante de diversas especies relevantes para los estudios de toxicología utilizando biosensores SPR. La capacidad de la región Fc del mAb7 para enganchar a los FCGR y al FcRn también se probó mediante SPR para confirmar que presentaba propiedades consistentes con las de un control de isotipo coincidente. Mediante ELISA, se analizó la unión de mAb7 y un control de isotipo coincidente a C1q humano. La capacidad de mAb7 para bloquear la interacción de unión de PD-1 con sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, también se probó mediante biosensores sin etiquetas para apoyar su mecanismo de acción.
Todos los experimentos cinéticos y de afinidad se realizaron a 25 °C en solución salina tamponada con fosfato (PBS) tampón de funcionamiento Tween 20 al 0,01 %, a menos que se indique lo contrario. Los estudios cinéticos se realizaron en un biosensor SPR ProteOn XPR36 equipado con chips n Lc (recubiertos de neutravidina) (BioRad, Hercules, CA). El ProteOn también se utilizó para determinar las concentraciones activas de los analitos hu-PD-1 y PD-1 de mono cinomologo - a través de la titulación contra mAb7 como estándar de referencia. Las concentraciones de los analitos proteicos utilizados en el presente documento se refieren a valores "activos" o "nominales". La concentración activa del receptor Fc gamma humano (hu-FCGR) I, del receptor Fc neonatal humano (hu-FcRn) (lote No R3091) y del receptor Fc neonatal de mono cinomolgo (FcRn de mono cinomolgo) (lote No JCR) se determinó mediante experimentos de análisis de concentración sin calibración (CFCA) en un Biacore T200 equipado con chips sensores c M5 (GE Life Sciences, Marlborough, MA). Todos los demás analitos se utilizaron a sus concentraciones nominales, determinadas por la absorbencia de la luz a A280 nm con un coeficiente de extinción adecuado. Las afinidades en solución se determinaron a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) utilizando un instrumento KinExA 3000 o 3200 equipado con automuestreador (Sapidyne). Los anticuerpos secundarios de detección se marcaron con DyLight 650 (Pierce Biotechnology, Grand Island, NY.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las biotinilaciones de inmunoglobulina G (IgG) se realizaron en una relación equimolar de enlazador: IgG utilizando EZ-Enlace™ Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce Biotechnology Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A menos que se indique lo contrario, las IgG inmovilizadas se regeneraron con un cóctel "Pierce/sal" que comprendía una mezcla 2:1 v/v de tampón de elución Pierce IgG (pH 2,8)/cloruro sódico (NaCI) 4 M.
Las interacciones de unión de hu-PD-1 y PD-1 de mono cinomolgo (ambos monómeros marcados con His) hacia mAb7 se determinaron en solución utilizando el procedimiento KinExA en un tampón de funcionamiento de PBS Tween 20 al 0,01 % y un tampón de muestra de PBS Tween 20 al 0,01 % 1 g/l de albúmina de suero bovino (BSA). Se emplearon dos formatos de ensayo diferentes. En el primer formato de ensayo, el mAb7 se tituló en una concentración constante de hu-PD-1 (nominal 200, 400 o 4000 pM) y se dejó que las muestras alcanzaran el equilibrio. La hu-PD-1 libre se capturó en perlas de polimetilmetacrilato (PMMA) que habían sido recubiertas (por adsorción) con el anticuerpo monoclonal mAb7 anti-hu-PD-1 (preparado internamente bajo condiciones que no son de Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) [lote No. R5432]). La hu-PD-1 capturada en las cuentas se detectó con un mAb anti-His marcado con Dylight de 0,5 pg/mL (R&D Systems, Minneapolis, MN). En el segundo formato de ensayo, se tituló hu-PD-1 o PD-1 de mono cinomolgo en una concentración constante de mAb7 (20, 50, 100 o 500 pM) y se dejó que estas mezclas se equilibraran. El mAb7 libre se capturó en perlas de PMMA que habían sido adsorbidas con un bloqueador anti-idiotípico anti-mAb7 de ratón mAb 1699.1 H6 que se une específicamente al mAb7 libre pero no al mAb7 saturado con PD-1. A continuación, se detectó mAb7 capturado con perlas con anti-hu-IgG de cabra marcado con Dylight (H L) (Jackson ImmunoResearch Inc, West Grove, PA). Todas las valoraciones se prepararon como una serie de dilución doble de 12 miembros, variando la concentración nominal superior del sitio de unión para que estuviera dentro del intervalo de 1 nM a 10 nM, dependiendo del experimento. Se dejó que las muestras se equilibraran durante un máximo de 48 horas y los volúmenes de inyección se ajustaron por experimento para obtener una señal total que cayera dentro del intervalo de 0,7 V a 1,9 V. Todas las muestras se inyectaron en ciclos duplicados. Los datos de hasta 4 experimentos independientes por interacción se analizaron globalmente utilizando la herramienta de curva N del software de análisis y se ajustaron a un modelo bimolecular simple en el que se utilizó la concentración de mAb7 como concentración de referencia. El análisis global informa de los valores de mejor ajuste (y del intervalo de confianza del 95 %) para Kd y la concentración aparente del sitio de unión activo de la PD-1.
Las afinidades de unión de hu-PD-1 y PD-1 de mono cinomolgo hacia mAb7 en solución fueron indistinguibles entre sí cuando se estudió utilizando un ensayo KinExA; los valores de la constante de disociación de equilibrio aparente (Kd ) a 23 °C se determinaron como 17 pM o 23 pM para hu-PD-1 (cuando se estudió en orientaciones opuestas del ensayo) y 28 pM para PD-1 de mono cinomolgo; estos tres valores fueron estadísticamente indistinguibles entre sí. Estos valores se recapitularon mediante mediciones de biosensores de resonancia de plasmón superficial (SPR), que arrojaron valores de Kd de 42 pM para 1 y 69 pM para PD-1 de mono cinomolgo a 25 °C, y 109 pM para PD-1 de hu y 115 pM para PD-1 de mono cinomolgo a 37 °C. El mAb7 se unió a la PD-1 de ratón con un valor Kd de 0,9 pM y no se detectó ninguna unión hacia la PD-1 de rata cuando se probó a 0,5 pM con el análisis cinético SPR. Se utilizaron biosensores sin etiquetas para demostrar que mAb7 bloquea la unión de hu-PD-1 a sus ligandos naturales, el ligando de muerte programada humano 1 (hu-PD-L1) y el ligando de muerte programada humano 2 (hu-PD-L2). SPR se utilizó además para confirmar que el mAb7 se unía a una serie de fragmentos cristalizables (Fc) de receptores gamma (FCGR) y al receptor Fc neonatal (FcRn) tanto de especies humanas como de monos cinomolgo con la misma cinética y especificidad que un control de isotipo similar. Mediante ELISA, mAb7 mostró una unión insignificante al componente del complemento 1, subcomponente q (C1q), lo que coincide con el comportamiento de un control de isotipo similar. En general, el mAb7 se une tanto a la hu-PD-1 como a la PD-1 de mono cinomolgo con una alta afinidad y especificidad de unión, pero tiene una baja afinidad hacia la PD-1 de ratón y una unión insignificante hacia la PD-1 de rata.
La Tabla 23 resume los datos cinéticos y de afinidad obtenidos para el análisis de la interacción de mAb7 con PD-1 de diversas especies. mAb7 se unió a hu-PD-1 y a PD-1 de mono cinomolgo con afinidades aparentes estadísticamente indistinguibles cuando estas interacciones se midieron en solución a 23 °C usando el procedimiento KinExA; los valores Kd aparentes fueron 17 pM y 23 pM para hu-PD-1 (cuando se estudió en dos orientaciones opuestas del ensayo) y 28 pM para PD-1 de mono cinomolgo. Los valores de KinExA fueron corroborados por mediciones cinéticas realizadas por SPR, que dieron valores de Kd aparente a 25 °C de 42 ± 11 pM (n = 10) para hu-PD-1 y 69 ± 24 pM (n = 10) para PD-1 de mono cinomolgo -. Las mediciones de SPR a 37 °C mostraron afinidades 2 veces más débiles que las realizadas a 25 °C; los valores de KD a 37°C se determinaron como 109 ± 8 pM (n = 15) para hu-PD-1 y 115 ± 15 pM (n = 8 ) para PD-1 de mono cinomolgo. El mAb7 se unió a PD-1 de ratón con una Kd aparente de 0,9 ± 0,1 pM (n = 5) cuando se midió a 25 °C por SPR, lo que corresponde a una afinidad 20.000 veces más débil que la de hu-PD-1. No se detectó ninguna unión para la PD-1 de rata cuando se probó a 0,5 pM a 25 °C por SPR, aunque las proteínas PD-1 de rata se confirmaron activas a través de su clara unión a los controles positivos, PD-L1 de ratón y PD-L2 de ratón. Los valores de Kd para las mediciones de KinExA representan el mejor ajuste y el intervalo de confianza del 95 % de un análisis global de N experimentos independientes, mientras que los de las mediciones de SPR representan la media ± desviación estándar de n experimentos independientes en un chip sensor ProteOn NLC. En la Tabla 23, h o hu = Humano; ka = Constante de velocidad de asociación; kd = Constante de velocidad de disociación; Kd = Constante de disociación de equilibrio; KinExA = Ensayo de exclusión cinética; mAb = Anticuerpo monoclonal; Ms = Molar por segundo; n = Número; ND = No determinado; PD-1 = Muerte programada-1; s = Segundo; SPR = Resonancia plasmónica de superficie; Temp = Temperatura; *La interacción del mAb7 con la PD-1 de hu se estudió en dos orientaciones de ensayo opuestas, como se describe en Bee et al, 2012.
Tabla 23: Sumario de las constantes cinéticas y de afinidad obtenidas para las interacciones del PF 06801591 con
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La Tabla 24 muestra que la cinética de unión y la especificidad para mAb7 sobre una gama de receptores Fc, incluyendo FCGRs y FcRn tanto de humanos como de monos cinomolgo recapituló aquellos valores esperados para un control de isotipo emparejado, hu-IgG4. Por ejemplo, mAb7 se unió a hu-FCGRI FCGRI con un valor Kd aparente (media ± desviación estándar) a 25 °C de 146 ± 42 pM (n = 14) en comparación con 177 ±71 pM (n = 4) para el control de isotipo. Todas las demás interacciones se caracterizaron por afinidades débiles (valores Kd - 1 pM o superiores). El análisis cinético se realizó en un chip ProteOn NLC a pH 7,4 para FCGR y a pH 5,9 para FcRn. En la Tabla 24, CD = Grupo de diferenciación; cy = Mono cinomologo; FCGR = Receptor Fc gamma; FcRn = Receptor Fc neonatal; hu = Humano; ka = Constante de velocidad de asociación; kd = Constante de velocidad de disociación; Kd = Constante de disociación de equilibrio; Ms = Molar por segundo; n = Número; s = Segundo.
Tabla 24
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Además, el mAb7 apenas se unió a C1q por ELISA, lo que coincide con el comportamiento del control de ¡sotipo, hu-IgG4 (datos no mostrados). Su unión fue incluso inferior a la de la inmunoglobulina humana G2 (hu-IgG2). En cambio, los controles positivos, hu-IgG1y la inmunoglobulina humana G3 (hu-IgG3), dieron señales de unión elevadas. Utilizando los biosensores SPR y Octet y diferentes formatos de ensayo (tanto el formato de premezcla como el clásico de intercalado), se demostró que mAb7 bloqueaba la unión de hu-PD-1 a sus ligandos naturales, hu-PD-L1 y hu-PD-L2.
Estos datos demuestran que el mAb7 se une con alta afinidad y alta especificidad hacia hu-PD-1. Cuando se midió en solución a 23 °C utilizando el procedimiento KinExA, el mAb7 se unió a la hu-PD-1 y a la PD-1 de mono cinomolgo con valores de Kd aparente estadísticamente indistinguibles de 17 pM y 23 pM para la hu-PD-1 (cuando se estudió en orientaciones alternativas del ensayo) y 28 pM para la PD-1 de mono cinomolgo. mAb7 mostró una afinidad 20.000 veces menor con la PD-1 de ratón (Kd aparente de 0,9 pM a 25 °C por SPR) y no se detectó la unión con la PD-1 de rata cuando se probó a 0,5 pM. El mAb7 y un control de isotipo similar a hu-IgG4 se unieron con cinética y especificidad similares cuando se probó contra un panel de receptores Fc de hu y mono cinomolgo, cuando se midió a 25°C por SPR. El mAb7 se unió a hu-C1q con una señal insignificante cuando se probó por ELISA, consistente con los controles de isotipo de hu-IgG4, y su unión fue incluso menor que la de hu-IgG2IgG2. Se demostró que mAb7 bloquea la unión de hu-PD-1 a sus ligandos naturales, hu-PD-L1 y hu-PD-L2.
Ejemplo 13: Tratamiento combinado con el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-OX40
Este ejemplo ilustra los efectos del tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 en combinación con el anticuerpo anti-OX40 en un modelo de ratón para el cáncer de colon.
Para este estudio, se inocularon ratones hembra C57B6/J (de 6 a 8 semanas de edad) por vía subcutánea con el tumor de colon murino MC-38 (un adenocarcinoma de grado III) a 5*105 células/ratón. En el Día 10, los ratones fueron aleatorizados y se inició el tratamiento con 10 mg/kg de anti-PD-1 de ratón y 1 mg/kg de anti-OX-40 de ratón. Los tratamientos se administraron i.p. en los días 10, 12 y 14 para el anticuerpo anti-OX40 (1 mg/kg); y en los días 10, 12, 14, 17, 23 y 25 para el anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg). El volumen del tumor se midió dos veces por semana. El estudio finalizó el día 34. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante un Anova de 2 vías para comparar los avances entre cada uno de los dos grupos en un único punto temporal. Los resultados se resumen en la Tabla 25. Vin tabla 25, los valores indican el volumen del tumor en el día indicado promedio de 8 ratones por grupo ± (error estándar medio) sem; N = número por grupo., mm2= milímetro cúbico. El control de isotipo incluyó el isotipo apropiado de cada anticuerpo a 1 mg/kg para el anti-OX40 y 10 mg/kg para el anti-PD-1.
Tabla 25. Volumen tumoral en ratones portadores de MC38 tras el tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuer o anti-OX40
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A partir del Día 24, todos los grupos tratados con anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-OX-40 mostraron volúmenes tumorales significativamente menores en comparación con el grupo de control (Tabla 25). En el Día 24, el grupo tratado con la combinación (anticuerpo anti-PD-1 más anticuerpo anti-OX40) mostró una significación de p<0,0001 en comparación con el grupo de control de isotipo, mientras que cada tratamiento con un solo anticuerpo mostró una significación de p<0,01 en comparación con el grupo de control. En el Día 34, todos los grupos tratados mostraron una significación de p<0,0001 en comparación con el grupo de control. En el Día 34, el grupo tratado con la combinación mostró diferencias en comparación con el grupo tratado con el anticuerpo anti-PD-1 solo o con el grupo tratado con el anticuerpo anti OX-40 solo. Estos resultados demuestran que el tratamiento tanto con el anticuerpo anti-PD-1 como con el anticuerpo anti-OX40 ralentizó el crecimiento del tumor en comparación con el tratamiento con cualquiera de los dos anticuerpos por separado.
Ejemplo 14: Efecto de la vacuna sobre la expresión de PD-1 en las células T activadas
Este ejemplo ilustra el efecto de una vacuna con base en ADN que expresa un Antígeno de Membrana Específico de la Próstata (PSMA) humano sobre la expresión de PD-1 en las células T CD3+CD4 (Tabla 26) y CD3+CD8 (Tabla 27) en presencia del anticuerpo monoclonal antiCTLA4 tremelimumab (un inhibidor del punto de control).
Procedimientos del estudio in vivo. En el estudio se utilizaron tres grupos de macacos cinomolgo chinos (n=8/grupo). A los animales de los Grupos 1 y 2 se les inyectó por vía intramuscular una vacuna que contiene un vector de adenovirus AdC68 (SEQ ID NO:44) que codifica los aminoácidos 15-750 del PSMA humano (a una dosis total de 2e11 VP), mientras que los animales del Grupo 3 no recibieron ninguna vacuna. La secuencia completa del vector de adenovirus AdC68 se proporciona en la SEQ ID NO:44. Además, inmediatamente después de la vacunación, los animales del Grupo 2 fueron tratados con 50 mg del anticuerpo monoclonal antiCTLA4 tremelimumab mediante inyecciones subcutáneas. Se recogieron muestras de sangre total de cada animal antes (Pre) y después de la vacunación en los Días 9, 15 y 29 y se analizó la frecuencia de células T CD3+CD4 y CD3+CD8 que expresan PD-1 mediante citometría de flujo.
Fenotipado de células T CD3+ CD4 y CD8. Las poblaciones de leucocitos se fenotiparon realizando un análisis de citometría de flujo multicolor en sangre total recién recogida. Brevemente, la sangre entera se tiñó durante 20 minutos a temperatura ambiente con un cóctel de anticuerpos que contenía CD3-V500 (clon SP34-2), CD4-BV605 (clon L200), CD8-APC.H7 (clon SK1), PD1-AF488 (clon EH12.2H7, Biolegend), PDL1-BV421 (clon MIH1), Lag3-PE.Cy7 (clon 11E3, Novus), CD69-PE.Texas Red (clon TP1.553, Beckman Coulter), TIM3-APC (clon 344823, R&D Systems), CD20-PE.Cy5.5 (clon 2H7, eBioscience), CD14-AF700 (clon M5E2), CD16-PE.Cy5 (clon 3G8), CD56-PerCP.Cy5.5 (clon B159) y CD11c-PE (clon SHCL3). Todos los anticuerpos se adquirieron en BD, a menos que se indique lo contrario. Las muestras se trataron con tampón de lisis de RBC (BD), se lavaron, se mezclaron con 50 ml de perlas de recuento de líquidos (BD) y se adquirieron en LSR Fortessa (BD). Los datos se analizaron con FlowJo (Tree Star Inc, EE.UU). Los resultados de la expresión de PD-1 en células T CD3+CD4 se presentan en la Tabla 26 y los resultados de la expresión de PD-1 en células T CD3+CD8 se presentan en la Tabla 27. La inducción de PD-1 se observó 9 días después de la vacunación y se resolvió a los niveles observados en los animales no vacunados (Grupo 3) el día 29 después de la vacunación. Estos resultados indican que el vector vacunal administrado junto con el anticuerpo anti-CTLA4 puede provocar la expresión de PD-1 en las células T CD3+ CD4 y CD8 en primates no humanos.
Tabla 26. Cinética de ex resión de PD-1 en células T CD3+CD4 en macacos Cinomol o
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Tabla 27. Cinética de ex resión de PD-1 en células T CD3+CD8 en macacos Cinomol o
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(continuación)
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Ejemplo 15. Efecto del anticuerpo anti-PD-1 en la respuesta de células T específicas de antígeno inducida por una vacuna que expresa PSMA humano
Este ejemplo ilustra el efecto de los anticuerpos anti-PD1 sobre las respuestas de células T IFNy CD4 y CD8 inducidas por una vacuna que contiene un vector de adenovirus AdC68 que expresa PSMA humano en macacos cinomolgo.
Ensayo de tinción de citoquinas intracelulares (ICS). Brevemente, las PBMC de animales individuales fueron coincubadas con grupos de péptidos de una biblioteca de péptidos de 15mers que se superponen en 11 aminoácidos abarcando la secuencia completa del antígeno respectivo, cada péptido a 2 pg/ml. Las placas se incubaron -16 horas a 37 °C, 5 % CO2. A continuación, se tiñeron las células para detectar la expresión de IFNy intracelular de las células T CD8+ y se fijaron. Las células se adquirieron en un citómetro de flujo. La frecuencia de respuesta se normalizó al número de células T CD8+ de IFNy por millón de células T CD8+, restando las respuestas en los pocillos de control de dimetilsulfóxido, que no contenían péptido. Las respuestas específicas al antígeno en las tablas representan la suma de las respuestas a los grupos de péptidos específicos del antígeno correspondiente.
Procedimientos del estudio in vivo. Brevemente, cinco grupos de macacos cinomolgo chinos (n=8/grupo) fueron inyectados por vía intramuscular con una vacuna que contenía un adenovirus AdC68 (SEQ ID NO:44) que codifica el aminoácido 15-750 del PSMA humano (hPSMA) a una dosis total de 2e11 VP. La vacunación en los Grupos 2, 4 y 5 fue seguida inmediatamente por inyecciones subcutáneas de 50 mg del anticuerpo monoclonal antiCTLA4 tremelimumab y/o del anticuerpo monoclonal mAb7 anti-PD-1 administrados por vía subcutánea (grupos 3 y 4) o intravenosa (grupo 5) a 10 mg/kg. Se aislaron PBMC de cada animal y se sometieron a un ensayo ICCS para medir las respuestas de las células T CD4 (día 9 o día 29) o CD8 (día 29) específicas de PSMA IFND. La secuencia de aminoácidos del PSMA humano de longitud completa se proporciona en la SEQ ID NO:42. La secuencia del vector de adenovirus AdC68 que expresa los aminoácidos 15-750 del PSMA humano se proporciona en la SEQ ID NO:44.
Resultados. Los resultados se presentan en las tablas 29, 30 y 31. Los datos demostraron que tanto los antiCTLA4 como los anti-PD-1 pueden aumentar individualmente la frecuencia de las respuestas de las células T CD4 y CD8 al IFNy inducidas por la vacuna.
Tabla 28. Información sobre la secuencia de los péptidos utilizados en los ensayos ELISpot e ICCS para inducir res uestas de células T IFN es ecíficas de antí eno.
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T l 2 R l l T D IF in i r l n n l Dí
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T l R l l T D4 IF in i r l n n l Dí
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T l 1 R l l T D4 IF in i r l n n l Dí 2
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Ejemplo 16. Efecto de los anticuerpos anti-PD-1 en las respuestas de células T IFNv inducidas por una vacuna que coexpresa un antíaeno de membrana específico de la próstata humana (PSMA), antígeno de células madre de la próstata (PSCA) y antígeno específico de la próstata (PSA)
Procedimientos del estudio in vivo. En resumen, se utilizaron tres grupos de macacos cinomolgo chinos (n=4/grupo) en el estudio. Los animales del Grupo 1 fueron inyectados por vía intramuscular con vehículo. A los animales del Grupo 2 se les administró el anticuerpo monoclonal mAb7 anti-PD-1 por vía subcutánea a 20 mg/kg. Los animales del Grupo 3 fueron tratados con una vacuna que contenía un vector de adenovirus AdC68 que coexpresaba tres antígenos humanos asociados a la próstata (PSMA, PSCA y PSA) (Vector AdC68W-734), a una dosis total de 6e11 VP, seguida inmediatamente de inyecciones subcutáneas de 150 mg del anticuerpo antiCTLA4 tremelimumab y del anticuerpo monoclonal mAb7 anti-PD-1 a 20 mg/kg. Veintiocho días después de las inyecciones, los animales fueron reforzados con vehículo (grupo 1), con el anticuerpo monoclonal mAb7 anti-PD-1 por vía subcutánea a 20 mg/kg (grupo 2) o con un plásmido de ADN (plásmido 458) que expresaba tres antígenos del cáncer de próstata humano (PSMA, PSCA y PSA) administrado por electroporación inmediatamente seguido de inyecciones subcutáneas de 150 mg de anticuerpos monoclonales antiCTLA4 y anti-PD-1 a 20 mg/kg (grupo 3). Cuarenta y tres días después de las primeras inyecciones, se aislaron las PBMC de cada animal y se sometieron a un ensayo ELISPOT, para medir las respuestas de las células T específicas de PSMA, PSCA y PSA, IFNy.
La secuencia completa del vector AdC68W-734 utilizado en el estudio se proporciona en la SEQ ID NO:45 de la presente divulgación y en la SEQ ID NO:63 de la publicación de solicitud internacional WO2015/063647. La construcción del vector AdC68W-734 también se describe en el documento WO2015/063647. El vector AdC68W-734 y el plásmido 458 comprenden cada uno (1) una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 15-750 del PSMA humano con la secuencia de la SEQ ID NO:42, (2) una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 25-261 del PSA humano con la secuencia de la SEQ ID NO:47, y (3) una secuencia de nucleótidos que codifica la PSCA humana de longitud completa de la SEQ ID NO:48.
Ensayo IFNy ELISPOT. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de animales individuales se coincubaron por duplicado con grupos de péptidos de una biblioteca de péptidos de 15mers que se superponen en 11 aminoácidos que abarcan toda la secuencia del antígeno respectivo, cada péptido a 2 pg/ml. Las placas se incubaron durante -16 horas a 37 °C, 5% de CO2, luego se lavaron y desarrollaron, según las instrucciones del fabricante. El número de células formadoras de manchas de IFNy (SFC) se contó con un lector de CTL. Se calculó el promedio de los duplicados y se restó la respuesta de los pocillos de control negativo, que no contenían péptidos. Los recuentos de SFC se normalizaron para describir la respuesta por 1e6 PBMC. Las respuestas específicas al antígeno en las tablas representan la suma de las respuestas a los grupos de péptidos específicos del antígeno correspondiente.
Resultados. Los resultados de ELISpot, que se presentan en la Tabla 33, demuestran que los animales que recibieron la vacuna con el anticuerpo anti-PD-1 subcutáneo y el anticuerpo anti-CTLA4 mostraron un aumento robusto de la respuesta de las células T IFNy a al menos un antígeno del cáncer de próstata, mientras que no hubo respuestas de las células T IFNy a estos antígenos en el grupo del vehículo (Grupo 1) o en el grupo al que se le administró el anticuerpo anti-PD-1 solo (Grupo 2 ).
Tabla 32. Información de la secuencia de péptidos para los grupos de péptidos utilizados en los ensayos ELISpot e
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Tabla 33. Efecto del anticuerpo Anti-PD-1 en las respuestas de células T IFNy ELISpot específicas de antígeno
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Claims (26)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 y que comprende:
una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de la complementariedad VH uno (CDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14 o 15, una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17, 24, 25, 27, 28, 35 o 36, una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 18, 23, 26 o 37; y
una región variable (VL) de la cadena ligera que comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:10, 22, 30 o 32, una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, 20 o 33 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, 21, 31 o 34.
2. El anticuerpo antagonista aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, 4, 5 o 6.
3. El anticuerpo antagonista aislado de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende una VL que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 7, 8 o 9.
4. El anticuerpo antagonista aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, 4, 5, o 6, y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 7, 8 o 9.
5. El anticuerpo antagonista aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 23, una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10, una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 20, y una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21.
6. El anticuerpo antagonista aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 29 o 38 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 39.
7. El anticuerpo antagonista aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo comprende una región constante, opcionalmente en el que el anticuerpo tiene un isotipo que se selecciona del grupo que consiste en IgG2, IgG2áa, IgG4, IgG4áb, IgG4ác, IgG4 S228P, IgG4áb S228P y IgG4ác S228P.
8. El anticuerpo antagonista aislado de la reivindicación 1, en el que cada CDR del anticuerpo se define de acuerdo con la definición de Kabat, la definición de Chothia, o la combinación de la definición de Kabat y la definición de Chothia.
9. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo promueve la secreción de IFNy y/o TNF de las células T; promueve la proliferación de las células T; y/o inhibe el crecimiento del tumor.
10. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se une a la PD-1 humana y a la PD-1 de ratón, opcionalmente en el que el anticuerpo se une a la PD-1 humana con una afinidad de aproximadamente 0,73 nM a 25 °C según se mide por resonancia de plasmón superficial.
11. Una línea celular aislada que produce el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
12. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12.
14. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 13.
15. Un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
16. Un procedimiento para producir un anticuerpo antagonista anti-PD-1, comprendiendo el procedimiento : cultivar una línea celular que produce recombinantemente el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 bajo condiciones en las que se produce el anticuerpo; y recuperar el anticuerpo.
17. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.
18. Un kit para el tratamiento del cáncer que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 17.
19. Un anticuerpo anti-PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17, para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto que necesita el mismo, de manera que uno o más síntomas asociados con el cáncer mejoren en el sujeto.
20. Un anticuerpo anti-PD-1 o una composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 19, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, sarcoma, linfoma, linfoma de Hodgkin, leucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer tímico, cáncer epitelial, cáncer salival cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, glioma, leucemia, mieloma múltiple, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer oral, cáncer de piel y melanoma.
21. Un anticuerpo anti-PD-1 o una composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 19 o 20, en la que el individuo es un paciente adulto previamente tratado con melanoma localmente avanzado o metastásico, cáncer de cabeza y cuello de células escamosas (SCHNC), carcinoma de ovario, sarcoma o linfoma de Hodgkin clásico (cHL) recidivante o refractario.
22. Un anticuerpo anti-PD-1 o una composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el anticuerpo anti-PD-1:
a. se administra a una dosificación de aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, aproximadamente 3,0 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg;
b. se administra una vez cada 7, 14, 21 o 28 días; y/o
c. se administra por vía intravenosa o subcutánea.
23. Un anticuerpo anti-PD-1 o una composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el procedimiento comprende además administrar una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico; opcionalmente, en el que el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-4-1BB, un segundo antagonista de PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-GITR, un inhibidor de tirosina quinasa y un inhibidor de ALK.
24. Una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17, y una cantidad eficaz de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra las células del cáncer, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite; opcionalmente, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer colorrectal.
25. Una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17, para su uso en un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna administrada a un sujeto para el tratamiento del cáncer; opcionalmente, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer colorrectal.
26. El anticuerpo anti-PD-1 o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 24 o 25, comprendiendo además administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno o más de otros moduladores inmunitarios, opcionalmente en el que los otros moduladores inmunitarios se seleccionan del grupo que consiste en un inhibidor del receptor de la proteína quinasa, un antagonista de CTLA-4, un agonista de CD40 y un agonista de TLR9.
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