CN107207593B - 抗pd-1抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供结合程序性细胞死亡蛋白1的拮抗性抗体和其使用方法。所述抗PD‑1抗体可治疗上单独或与其他治疗剂组合使用以治疗癌症和其他疾病。

Description

抗PD-1抗体及其使用方法
领域
本发明涉及抗体，例如结合PD-1的全长抗体。本发明进一步涉及包含抗PD-1抗体的组合物和使用抗PD-1抗体作为药剂的方法。某些实施方案涉及使用抗PD-1抗体用于各种疾病的治疗、预防和/或诊断的方法，该疾病包括过度增生疾病，诸如癌症。
背景
PD-1是50-55kDa的I型跨膜受体，其起初在经历活化诱导的细胞凋亡的T细胞系中被鉴定。PD-1表达于T细胞、B细胞和巨噬细胞上。PD-1的配体是B7家族成员PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。
PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，该超家族在其胞外区中含有单个Ig V-样结构域。PD-1细胞质结构域含有两个酪氨酸，其中最接近于膜的酪氨酸(小鼠PD-1中的VAYEEL)位于ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)内。PD-1上ITIM的存在表明此分子功能为通过募集细胞质磷酸酶而削弱抗原受体的信号传导。人类和鼠PD-1蛋白共享大约60％的氨基酸同一性，具有四个潜在的N-糖基化位点和定义Ig-V结构域的残基的保守性。细胞质区中的ITIM和羧基末端酪氨酸周围的ITIM-样基序在人类和鼠直向同源物之间也是保守的。
癌症免疫疗法已传统上涉及使用细胞与经个体化且费时的制剂的复杂方法。最近，基于递送至适应免疫系统的抑制信号的中断的基于单克隆抗体的癌症免疫疗法，已显示于临床中现有全身性免疫疗法的环境内有希望。然而，本领域对于获得癌症的更安全且更有效的治疗有持续需求。
概述
提供选择性地与PD-1相互作用的抗体。已证明某些抗PD-1抗体有效地体内预防和/或治疗癌症。有利地，本文提供的抗PD-1抗体结合人类、猕猴和小鼠PD-1。还有利地，本文提供的抗PD-1抗体有效地体内刺激T细胞增殖。
本文中提供特异性结合PD-1且预防或减少PD-1的生物效应的分离的拮抗剂抗体。在一些实施方案中，所述拮抗剂抗体可以是，例如，人类、人源化或嵌合抗体。本文公开的发明涉及结合PD-1的抗体。
在一个方面，本发明提供一种分离的拮抗剂抗体，其特异性结合PD-1，其中所述抗体包含：重链可变区(VH)，其包含所述VH的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，所述VH具有选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含所述VL的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL具有选自SEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VH区包含示于SEQ ID NO: 3、4、5或6的氨基酸序列、或其在非CDR内的残基具有一个或几个保守性氨基酸取代的变体和/或所述VL包含示于SEQ IDNO: 2、7、8或9的氨基酸序列、或其在非CDR内的氨基酸具有一个或几个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含示于SEQ ID NO: 39的氨基酸序列的轻链和/或包含示于SEQ ID NO: 29或38的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，所述抗体包含具有ATCC登录号PTA-121183的表达载体所产生的VH区。在一些实施方案中，所述抗体包含具有ATCC登录号PTA-121182的表达载体所产生的VL区。
在另一个方面，本发明提供一种分离的抗体，其特异性结合PD-1，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO: 13、14或15的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO: 16、17、24、25、27、28、35或36的氨基酸序列的VH CDR2、包含示于SEQ ID NO: 18、23、26或37的氨基酸序列的VH CDR3、包含示于SEQ ID NO: 10、22、30或32的氨基酸序列的VL CDR1、包含示于SEQ IDNO: 11、20或33的氨基酸序列的VL CDR2和包含示于SEQ ID NO: 12、21、31或34的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体可以是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包含恒定区。在一些实施方案中，所述抗体具有人类IgG1、IgG2、IgG2Δa、IgG3、IgG4、IgG4Δb、IgG4Δc、IgG4 S228P、IgG4Δb S228P和IgG4Δc S228P亚类。在一些实施方案中，所述抗体具有IgG4同种型且包含经稳定绞链，例如S228P。
在另一个方面，本发明提供一种分离的抗体，其特异性结合PD-1且与如本文所述的所述抗体竞争和/或结合相同PD-1表位。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体促进从T细胞分泌IFNγ和/或TNF。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体促进T细胞增殖。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体结合人类PD-1与小鼠PD-1。
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的如本文所述的PD-1抗体和药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码如本文所述的PD-1抗体的核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供一种载体，其包含所述多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种分离的宿主细胞，其重组产生如本文所述的PD-1抗体。
在另一个方面，本发明提供一种产生抗PD-1拮抗剂抗体的方法，所述方法包括：在其中产生所述抗体的条件下培养重组产生如本文所述的抗体的细胞系；和回收所述抗体。
在另一个方面，本发明提供一种产生抗PD-1拮抗剂抗体的方法，所述方法包括：在其中产生所述抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的细胞系，所述抗体包含：包含示于SEQ ID NO: 29或38的氨基酸序列的重链和包含示于SEQ ID NO: 39的氨基酸序列的轻链；和回收所述抗体。
在一些实施方案中，所述重链和轻链被编码在个别载体上。在其他实施方案中，重链和轻链被编码在相同载体上。
在另一个方面，本发明提供一种用于治疗个体的症状的方法，其包括对有需要的个体施用有效量的如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，该症状是癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤。在一些实施方案中，所述个体是具有局部晚期或转移黑色素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤、或复发或难治的经典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)的先前经治疗的成人患者。在一些实施方案中，所述癌症可以是铂抗性和/或铂难治癌症，诸如，例如铂抗性和/或难治卵巢癌、铂抗性和/或难治乳腺癌、或铂抗性和/或难治肺癌。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以约0.5 mg/kg、约1.0 mg/kg、约3.0 mg/kg或约10 mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体每7、14、21或28天施用一次。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体被静脉内或皮下施用。
在另一个方面，本发明提供一种抑制具有肿瘤的个体的肿瘤生长或进展的方法，其包括对所述个体施用有效量的如本文所述的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供一种抑制或预防个体的癌细胞转移的方法，其包括对有需要的个体施用有效量的如本文所述的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供一种诱导具有PD-1表达肿瘤的个体的肿瘤消退的方法，其包括对所述个体施用有效量的如本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，本文中的所述抗体可肠胃外地施用至个体。在一些实施方案中，所述个体是人类。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括施用有效量的第二治疗剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是，例如，克里唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(palbociclib)、抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、或第二PD-1抗体。
也提供如本文所提供的所述抗PD-1拮抗剂抗体的任一者在制备在有需要的个体内用于治疗癌症或用于抑制癌症生长或进展的药剂的用途。在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体减少所述个体的重量增加。
还提供在有需要的个体内用于治疗癌症或用于抑制癌症生长或进展的抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施方案中，所述癌症是，例如但不限于，胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌(包括，例如非小细胞肺癌)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤。
在另一个方面，本公开提供一种用于增强疫苗用于在哺乳动物、特别是人类中治疗癌症的免疫原性或治疗效应的方法，所述方法包括对接受该疫苗的哺乳动物施用有效量的本公开所提供的抗PD-1拮抗剂抗体。
在另一个方面，本公开提供一种用于治疗哺乳动物、特别是人类的癌症的方法，所述方法包括对哺乳动物施用(1)有效量的能够引发针对癌细胞的免疫反应的疫苗和(2)有效量的本公开所提供的抗PD-1拮抗剂抗体。
附图简述
图1A描绘概述用抗PD-1拮抗剂抗体处理的小鼠体重的图。
图1B描绘概述用抗PD-1拮抗剂抗体处理的小鼠体重的图。
图1C描绘概述用抗PD-1拮抗剂抗体处理的小鼠体重的图。
图1D描绘概述用抗PD-1拮抗剂抗体处理的小鼠体重的图。
图1E描绘概述用抗PD-1拮抗剂抗体处理的小鼠体重的图。
图2A描绘概述抗PD-1抗体结合原代人类经活化T细胞的EC50的图。
图2B描绘概述抗PD-1抗体结合原代猕猴经活化T细胞的EC50的图。
图3描绘概述培养的活化CD4 T细胞的增殖的柱状图，该T细胞经如下处理：(a)无抗体；(b)同种型对照；(c)EH12.1；(d)C1；(e)C2；(f)C3；(g)mAb1；(h)mAbX；(i)mAb4；(j)mAb5；(k)mAb6；(l)mAb7；(m)mAb9；(n)mAb10；(o)mAb11；(p)mAb14；(q)mAb15；(r)mAb16。
图4描绘概述培养的活化CD8 T细胞的增殖的柱状图，该T细胞经如下处理：(a)无抗体；(b)同种型对照；(c)EH12.1；(d)C1；(e)C2；(f)C3；(g)mAb1；(h)mAbX；(i)mAb4；(j)mAb5；(k)mAb6；(l)mAb7；(m)mAb9；(n)mAb10；(o)mAb11；(p)mAb14；(q)mAb15；(r)mAb16。
详述
本文公开的是特异性结合PD-1的抗体。提供制备抗PD-1抗体的方法、包含这些抗体的组合物和使用这些抗体作为药剂的方法。抗PD-1抗体可用于抑制肿瘤进展，且可用于癌症和/或其他疾病的预防和/或治疗中。
一般技术
除非另有表明，否则实施本发明将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术内。此类技术充分解释于文献，诸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 (Sambrook等人, 1989)Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait,编, 1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A LaboratoryNotebook (J.E. Cellis,编, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I.Freshney,编, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather和P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: LaboratoryProcedures (A. Doyle, J.B. Griffiths,和D.G. Newell, 编, 1993-1998) J. Wileyand Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook ofExperimental Immunology (D.M. Weir和C.C. Blackwell, 编); Gene TransferVectors for Mammalian Cells (J.M. Miller和M.P. Calos, 编, 1987); CurrentProtocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人, 编, 1987); PCR: ThePolymerase Chain Reaction, (Mullis等人, 编, 1994); Current Protocols inImmunology (J.E. Coligan等人, 编, 1991); Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway和P. Travers, 1997);Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty.,编,IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P.Shepherd和C. Dean, 编, Oxford University Press, 2000); Using antibodies: alaboratory manual (E. Harlow和D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999); The Antibodies (M. Zanetti和J.D. Capra, 编, Harwood AcademicPublishers, 1995)。
定义
除非另有表明，下述术语应理解成具有下述意义：术语“分离的分子”是指凭借其衍生起源或来源是如下的分子(其中该分子为，例如多肽、多核苷酸或抗体)：(1)不与在其天然状态下伴随其的天然相关成分结合；(2)实质上不含来自相同来源，例如物种、其由其表达的细胞、文库等的其他分子；(3)被来自不同物种的细胞表达；或(4)不在天然中存在。因此，化学合成的分子、或在不同于其由其天然起源的系统的细胞系统中表达的分子，将与其天然相关成分“分离”。也可通过使用本领域众所周知的纯化技术的分离，使分子实质上不含天然相关成分。分子纯度或同质性(homogeneity)可通过本领域众所周知的多种手段测定。例如，多肽样品的纯度可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳与使用本领域众所周知的技术染色该凝胶以显现该多肽而测定。为了某些目的，可通过使用HPLC或本领域众所周知的其他纯化手段提供更高解析。
“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于该免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合目标，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。除非另有具体指明，本文所使用的该术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，也涵盖与该完整抗体竞争特异性结合的任何其抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗原结合部分包括，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、结构域抗体(dAb，例如鲨鱼和骆驼抗体)、包括互补决定区(CDR)的片段、单链可变片段抗体(scFv)、大型抗体(maxibodies)、迷你抗体(minibodies)、细胞内抗体(intrabodies)、双价抗体(diabodies)、三价抗体、四价抗体、v-NAR和双-scFv，和含有足以赋予该多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。抗体包括任何类型的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其亚型)，且所述抗体不需要是任何特定类型。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分配至不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的数种可进一步分成亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同类型免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本领域已知，重链和轻链的可变区各由下列所组成：通过三个也称为高变区的互补决定区(CDR)连接的四个框架区(FR)，并有助于形成所述抗体的抗原结合位点。如果期望个体可变区的变体，特别是在CDR区外(即，在框架区中)的氨基酸残基具有取代，适当的氨基酸取代，优选地保守性氨基酸取代，可通过比较所述个体可变区与含有和所述个体可变区相同的经典类型中的CDR1和CDR2序列的其他抗体的可变区而鉴定出(Chothia和Lesk, J Mol Biol196(4): 901-917, 1987)。
在某些实施方案中，明确划定CDR和鉴定包含抗体结合位点的残基通过解析所述抗体的结构和/或解析所述抗体-配体复合物的结构完成。在某些实施方案中，其可通过本领域技术人员所知的各种技术中的任一者完成，诸如X光结晶学。在某些实施方案中，各种分析方法可用于鉴定或估计所述CDR区。在某些实施方案中，各种分析方法可用于鉴定或估计所述CDR区。此类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、接触定义和构型定义。
Kabat定义是用于编号抗体中残基的标准，且典型用于鉴定CDR区。参见例如Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8。Chothia定义与Kabat定义相似，但Chothia定义考虑某些结构环区的位置。参见例如Chothia等人, 1986, J. Mol. Biol.,196: 901-17; Chothia等人, 1989, Nature, 342: 877-83。AbM定义使用OxfordMolecular Group产生的计算机程序的整合套装，其模型化抗体结构。参见例如Martin等人, 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; “AbM™, A Computer Programfor Modeling Variable Regions of Antibodies,” Oxford, UK; Oxford Molecular,Ltd。AbM定义使用知识数据库与从头计算方法的组合，诸如由Samudrala等人, 1999, “AbInitio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach,”PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198描述的那些，而自一级序列模型化抗体的三级结构。接触定义基于可得复合物结晶结构的分析。参见例如MacCallum等人, 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45。在另一种在本文中称为CDR的“构型定义”的方法中，CDR的位置可被鉴定为对抗原结合作出焓贡献的残基。参见例如Makabe等人,2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166。还有其他CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但还是将与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管它们可能根据特定残基或残基组群不显著影响抗原结合的预测或实验结果而被缩短或延长。本文所使用的CDR可指，通过本领域已知的任何方法，包括方法的组合所定义的CDR。本文所使用的方法可利用根据这些方法中任一者所定义的CDR。对于含有超过一种CDR的任何给定实施方案而言，所述CDR可根据Kabat、Chothia、延长、AbM、接触和/或构型定义中任一者进行定义。
如本领域已知，抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。
如本文所使用的“单克隆抗体”是指自实质上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量出现的可能天然存在的突变以外，组成该群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原位点。此外，与典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体自实质上同质的抗体群体获得的特征，不应被视为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler和Milstein, 1975,Nature 256:495所描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法诸如美国专利号4,816,567所述的方法制备。该单克隆抗体也可分离自使用，例如，McCafferty等人, 1990,Nature 348:552-554描述的技术所产生的噬菌体文库。如本文所使用的“人源化”抗体是指这样的非人类(例如鼠)抗体的形式：其为含有衍生自非人类免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)。优选地，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。该人源化抗体可包含既不在受体抗体也不在导入的CDR或构架序列中找到，但却被包括以进一步改进和优化抗体性能的残基。
“人类抗体”是具有对应由人类产生的抗体的氨基酸序列和/或已使用如本文公开的用于制备人类抗体的技术的任一者所制备的抗体。该人类抗体的定义具体排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列衍生自一个物种且恒定区序列衍生自另一个物种的抗体，诸如其中可变区序列衍生自小鼠抗体且恒定区序列衍生自人类抗体的抗体。
术语“表位”是指分子的能够被抗体在所述抗体的一个或多个抗原结合区所识别且结合的部分。表位经常由分子诸如氨基酸或糖侧链的表面集合所组成，且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。在一些实施方案中，表位可以是蛋白表位。蛋白表位可以是线性或构型的。在线性表位中，在蛋白与相互作用分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点沿着该蛋白的一级氨基酸序列线性存在。“非线性表位”或“构型表位”包含对该表位特异性的抗体所结合的抗原性蛋白内的不连续多肽(或氨基酸)。如本文所使用的术语“抗原性表位”被定义为抗体可特异性结合的抗原的部分，如通过本领域众所周知的任何方法，例如通过常规的免疫测定法所确定。一旦确定在抗原上的所需表位，可产生针对该表位的抗体，例如使用本说明书中所述的技术。或者，在发现过程期间，抗体的产生和表征可阐释关于所需表位的信息。由此信息则可能竞争性地筛选结合相同表位的抗体。一种实现此的方法是进行竞争和交叉竞争研究，以找到彼此竞争或交叉竞争结合PD-1的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。
如本文所使用的术语“PD-1”是指任何形式的PD-1和其变体，该变体保留至少部分PD-1活性。除非不同地表明，诸如通过具体提及人类PD-1，否则PD-1包括所有哺乳动物物种的天然序列PD-1，例如人类、犬、猫、马和牛。一种示例性人类PD-1被发现为Uniprot登录号Q15116(SEQ ID NO: 1)。
术语“激动剂”是指促进(即，诱导、造成、增强或增加)另一种分子的生物活性或效应的物质。该术语激动剂涵盖结合受体的物质诸如抗体，和促进受体功能但不结合受体(例如通过活化相关蛋白)的物质。
术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指预防、阻断、抑制、中和或减少另一种分子，诸如受体的生物活性或效应的物质。
术语“拮抗剂抗体”是指结合目标且预防或减少该目标的生物效应的抗体。在一些实施方案中，该术语可表示防止其所结合的目标例如PD-1行使生物功能的抗体。
如本文所使用的“抗PD-1拮抗剂抗体”是指能够抑制PD-1生物活性和/或PD-1介导的一个或多个下游事件的抗体。抗PD-1拮抗剂抗体涵盖阻断、拮抗、抑制或减少(至任何水平，包括显著地)PD-1生物活性的抗体，该生物活性包括PD-1介导的下游事件、此PD-L1结合和下游信号传导、PD-L2结合和下游信号传导、T细胞增殖的抑制、T细胞活化的抑制、IFN分泌的抑制、IL-2分泌的抑制、TNF分泌的抑制、IL-10的诱导和抗肿瘤免疫反应的抑制。就本发明的目的而言，将明确理解术语“抗PD-1拮抗剂抗体”(可互换地被称为“拮抗剂PD-1抗体”、“拮抗剂抗PD-1抗体”、或“PD-1拮抗剂抗体”)涵盖由此以任何有意义程度实质上废止、降低或中和PD-1本身、PD-1生物活性或该生物活性的后果的所有先前鉴定的术语、名称以及功能状态和特征。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体结合PD-1且上调抗肿瘤免疫反应。抗PD-1拮抗剂抗体的实例被提供于本文中。
在本文中可互换使用的术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”，是指任何长度的氨基酸链。该链可以是线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸和/或可能被非氨基酸中断。所述术语还涵盖经天然或通过干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标签成分缀合。也包括在该定义内的是，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)和本领域已知的其他修饰的多肽。应理解的是该多肽可以作为单个链或相关链存在。
如本领域已知，本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”，是指任何长度的核苷酸链，且包括DNA和RNA。该核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或任何可通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的物质。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可在该链组装之前或之后赋予。核苷酸的序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸在聚合之后可进一步被修饰，诸如通过与标记成分缀合而被修饰。其他种类的修饰包括，例如“加帽(cap)”、以类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如，例如具有不带电连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)和带电连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有侧基团(moieties)的那些，诸如例如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷化剂的那些、具有经修饰的连接的那些(例如α异位性核酸等)以及多核苷酸的未经修饰形式。另外，最初存在于糖类中的羟基的任一者可能被，例如膦酸酯基、磷酸酯基置换；被标准保护基保护或被活化以制备与其他核苷酸的额外连接；或可缀合至固体支持物。5’和3’端OH可被磷酸化或被胺类或1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其他羟基也可被衍生成为标准保护基。多核苷酸也可包含本领域一般已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括例如2’-O-甲基-核糖、2’-O-烯丙基核糖、2’-氟-核糖或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α或β异位性糖类、差向异构体糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天酮庚糖类、非环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯连接可被替代性连接基置换。这些替代性连接基包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中各R或R’独立地为H或取代或未取代的烷基(1至20个碳)，其任选地含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。不是多核苷酸中的所有连接都需要相同。前面的描述适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文中所使用，当通过本文中的实施例7所公开的方法测量的平衡解离常数等于或小于20 nM、优选地小于约6 nM、更优选地小于约1 nM、最优选地小于约0.2 nM时，抗体与PD-1“相互作用”。
“优先结合”或“特异性结合”(在本文中可互换使用)至表位的抗体，是本领域充分理解的术语，且确定此种特异性或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定细胞或物质反应或结合与其与替代性细胞或物质反应或结合相比更频繁、更快速、有更长持续时间和/或有更高亲和力，则该分子被称为展现“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体与目标的结合与其结合其他物质相比有更高亲和力、亲合力(avidity)、更快速和/或有更长持续时间，则所述抗体“特异性结合”或“优先结合”至目标。例如，特异性或优先地结合PD-1表位的抗体，是以与其结合其他PD-1表位或非PD-1表位相比更高的亲和力、亲合力、更快速和/或有更长持续时间结合此表位的抗体。通过阅读此定义也可理解，例如，特异性或优先结合第一目标的抗体(或基团或表位)可能会或可能不会特异性或优先结合第二目标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合。一般来说，但不必然，提及结合意指优先结合。
如本文所使用的“实质上纯的”是指为至少50%纯的(即不含污染物)，更优选地至少90%纯的，更优选地至少95%纯的，甚至更优选地至少98%纯的，且最优选地至少99%纯的物质。
“宿主细胞”包括可以是或已经是一种或多种用以并入多核苷酸插入物的载体的受体的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，且该后代可能由于天然、意外或蓄意突变而不一定与原始亲本细胞(在形态学或基因学DNA互补物上)相同。宿主细胞包括以一个或多个本发明的多核苷酸在体内转染的细胞。
如本领域已知，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区。该“Fc区”可能为天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可有变化，人类IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230位置的氨基酸残基延伸至其羧基端。Fc区中的残基编号是如Kabat中所述的EU指数的编号。Kabat等人, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md., 1991。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域，CH2和CH3。如本领域已知，Fc区可以二聚体或单体形式存在。
本领域所使用的“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。另外，优选的FcR是这样的FcR，其结合IgG抗体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚型的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，其主要差异在其细胞质结构域。FcR综述于Ravetch和Kinet, 1991,Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel等人, 1994, Immunomethods, 4:25-34;和de Haas等人, 1995, J. Lab.Clin. Med., 126:330-41。“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责转运母体IgG至胎儿(Guyer等人, 1976, J. Immunol., 117:587;和Kim等人, 1994, J. Immunol., 24:249)。
如本文关于抗体所使用的术语“竞争”，意指第一抗体或其抗原结合部分以充分相似于第二抗体或其抗原结合部分的结合的方式结合表位，使得第一抗体与其同源表位在第二抗体存在的情况下的结合结果与该第一抗体在第二抗体不存在的情况下的结合相比可检测地降低。替代情况可以是但不一定是，其中该第二抗体与其表位的结合也在第一抗体存在的情况下而可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制该第一抗体与其相应表位的结合。然而，当各抗体不论在相同、较高或较低程度上可检测地抑制另一个抗体与其同源表位或配体结合时，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合它们分别的一个或多个表位。本发明涵盖竞争抗体和交叉竞争抗体两者。不论此种竞争或交叉竞争发生的机制(例如空间位阻、构型改变或结合共同表位或其部分)，本领域技术人员将理解，基于本文提供的教导，涵盖此类竞争和/或交叉竞争抗体且其可用于本文所公开的方法。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种效应子功能。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。此类效应子功能一般需要所述Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，且可使用本领域已知的各种用于评价此类抗体效应子功能的测定法评估。
“天然序列Fc区”包含与在天然中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含凭借至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同，但仍保留该天然序列Fc区的至少一种效应子功能的氨基酸序列。优选地，该变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约1至约10个氨基酸取代，且优选地约1至约5个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80%的序列同一性，最优选地与其具有至少约90%的序列同一性，更优选地与其具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列同一性。
如本文所使用的“治疗”是用于获得有益或所需临床结果的方法。就本发明的目的而言，有益或所需的临床结果包括但不限于下列中的一种或多种：减少肿瘤细胞或癌细胞增殖(或破坏肿瘤细胞或癌细胞)、抑制肿瘤细胞转移、缩小或降低肿瘤体积、缓解癌症、降低癌症所导致的症状、增加患有癌症的那些的生活质量、降低治疗癌症所需的其他药剂的剂量、推迟癌症的进展、治愈癌症和/或延长具有癌症的患者的存活。
“改善”意指与未施用抗PD-1拮抗剂抗体相比一种或多种症状的减轻或改善。“改善”也包括症状的持续时间的缩短或减少。
如本文所使用的药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任何一种或多种有益或所需结果的量。在更特定的方面中，有效量预防、缓和或改善疾病的症状，和/或延长所治疗个体的存活。就预防性用途而言，有益或所需结果包括消除或减少风险、减轻严重性或延迟疾病的开始，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为学的症状、其并发症和在疾病发展期间所出现的中间病理学表型。就治疗性用途而言，有益或所需结果包括临床结果诸如减少疾病的一种或多种症状，该疾病诸如例如癌症，所述癌症包括例如但不限于胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、头颈癌、鳞状细胞头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤；降低治疗该疾病所需的其他药剂的剂量；增强另一种药剂的效应；和/或推迟患者的所述癌症的进展。有效剂量可以一次或多次施用进行施用。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可与或不可与另一药物、化合物或药物组合物组合实现。因此，“有效剂量”可在施用一种或多种治疗剂的背景中被考虑，且可考虑给予有效量的单一剂，如果与一种或多种其他试剂组合时可能或会实现所需的结果。
“个体(individual)”或“个体(subject)”是哺乳动物，更优选人类。哺乳动物也包括但不限于农场动物(例如，牛、猪、马、鸡等)、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。
如本文所使用的“载体”是指构建体，其能够在宿主细胞中递送和优选地表达一种或多种感兴趣的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒载体、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞诸如生产细胞。
如本文所使用的“表达控制序列”意指引导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，诸如组成性或诱导性启动子或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作连接。
如本文所使用的“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性组分组合时允许该组分保留生物活性且不与个体的免疫系统反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准药物载体诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液和各种种类的润湿剂。优选的用于气雾剂或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9%)盐水。包含此类载体的组合物由众所周知的常规方法配制(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences, 第18版, A. Gennaro,编, Mack Publishing Co., Easton,PA, 1990;和Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版. MackPublishing, 2000)。
如本文所使用的术语“kon”是指抗体与抗原结合的速率常数。具体地，所述速率常数(kon和koff)和平衡解离常数使用全长抗体和/或Fab抗体片段(即单价)与PD-1测量。
如本文所使用的术语“koff”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的速率常数。
如本文所使用的术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
在本文中提及“约”一定数值或参数，包括(且描述)针对该数值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。数值范围包含定义该范围的数字。
术语“免疫效应子细胞增强剂”或“IEC增强剂”，是指能够增加或增强哺乳动物的一个或多个种类的免疫效应子细胞的数目、质量或功能的物质。免疫效应子细胞的实例包括细胞裂解性CD8 T细胞、CD4 T细胞、NK细胞和B细胞。
术语“免疫调节剂”是指能够改变(例如，抑制、降低、增加、增强或刺激)宿主哺乳动物的固有、体液或细胞性免疫系统的任何成分的免疫反应(如本文中所定义)或工作的物质。因此，术语“免疫调节剂”涵盖如本文中所定义的“免疫效应子细胞增强剂”和如本文中所定义的“免疫抑制细胞抑制剂”，以及影响哺乳动物免疫系统的其他成分的物质。
术语“免疫反应”是指宿主哺乳动物的免疫系统对特定物质(诸如抗原或免疫原)的任何可检测反应，诸如固有免疫反应(例如，Toll受体信号传导级联的活化)、细胞介导的免疫反应(例如T细胞介导的反应，诸如免疫系统的抗原特异性T细胞和非特异性细胞)和体液免疫反应(例如，B细胞介导的反应，诸如产生和分泌抗体至细胞质、淋巴和/或组织液中)。
术语“免疫原性”，是指在佐剂存在或不存在的情况下，不论是单独还是当连接至载体，物质对特定抗原造成、引发、刺激或诱导免疫反应；或改进、增强、增加或延长预先存在的免疫反应的能力。
术语“免疫抑制细胞抑制剂”或“ISC抑制剂”，是指能够减少或抑制哺乳动物免疫抑制细胞的数目或功能的物质。免疫抑制细胞的实例包括调节性T细胞(“T reg”)、骨髓衍生抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞。
在施用物质至包括人类的哺乳动物的上下文中，术语“皮内施用”或“皮内地施用”，是指递送该物质至该哺乳动物皮肤的真皮层中。哺乳动物皮肤由表皮层、真皮层和皮下层所组成。表皮层是皮肤的外层。真皮，其为皮肤的中间层，含有神经末梢、汗腺与油脂(皮脂)腺、毛囊和血管。皮下层由脂肪和容置较大血管和神经的结缔组织所构成。与皮内施用相比，“皮下施用”是指施用物质至皮下层中，而“外用施用”是指施用物质至皮肤表面上。
术语“肿瘤病症”，是指其中细胞以异常地高且不受控的速率增殖的状况，该速率超出且不同步于周围正常组织的速率。其通常导致实体病变或称为“肿瘤”的块。此术语涵盖良性和恶性肿瘤病症。术语“恶性肿瘤病症”，在本公开中与术语“癌症”可互换使用，是指特征在于肿瘤细胞扩散至身体中其他位置的能力(称为“转移”)的肿瘤病症。术语“良性肿瘤病症”，是指其中肿瘤细胞缺乏发生转移的能力的肿瘤病症。
术语“预防(preventing)”或“预防(prevent)”，是指(a)使病症免于发生或(b)推迟病症开始或推迟病症的症状开始。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”，是指被肿瘤细胞特异性表达或被肿瘤细胞以与相同组织种类的非肿瘤细胞相比较高频率或密度表达的抗原。肿瘤相关抗原可以是正常不被宿主表达的抗原；它们可经突变、截短、错误折叠、或正常被宿主表达的分子的其他方式异常显现；它们可与正常表达的分子相同但以异常高水平表达；或它们可以在异常的情况或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是，例如，蛋白或蛋白片段、复杂碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、或这些或其他生物分子的组合。
术语“疫苗”是指用于施用至哺乳动物的免疫原性组合物，其用于在哺乳动物中引发针对特定抗原的免疫反应。疫苗典型地含有相似于或衍生自该免疫反应的目标的试剂(已知为“抗原”或“免疫原”)，该目标诸如造成疾病的微生物或肿瘤细胞。意图用于肿瘤诸如癌症的治疗的疫苗，典型地含有衍生自目标肿瘤上所发现的TAA且能够引发对目标肿瘤上的TAA的免疫原性的抗原。
术语“基于疫苗的免疫疗法方案”是指其中疫苗与一种或多种免疫调节剂组合施用的治疗方案。疫苗与免疫调节剂可在单一制剂中一起施用或个别施用。
应理解本文中只要以语句“包含(comprising)”描述实施方案，还提供在“由…组成”和/或“基本上由…组成”的方面所描述的其他方式类似实施方案。
在本发明的方面或实施方案以马库什组群或其他替代物组群描述的情况下，本发明不仅涵盖作为整体所列的整个组群，还包含个别的该组群的各成员和该主要组群中的所有可能亚群，且还涵盖没有该组群成员中的一个或多个的该主要组群。本发明还设想明确排除所请求保护发明中任何该组群成员中的一个或多个。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所述的本领域普通技术人员通常理解的相同意义。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义，为准。遍及本说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”或变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意指包括所指整数或整数的群，但不排除任何其他整数或整数的群。除非上下文以其他方式要求，单数术语应包括复数术语且复数术语应包括单数术语。任何在术语“例如”或“例如”之后的实例并不意在穷举或限制。
尽管与本文所述的那些方法和材料相似或相等的方法和材料也可用于实施或测试本发明，但本文中描述了示例性方法和材料。所述材料、方法和实例仅为例示而非意图限制。
抗PD-1拮抗剂抗体
本文提供抗PD-1拮抗剂抗体，其阻断、抑制或减少(包括显著地减少)PD-1生物活性，包括PD-1介导的下游事件。抗PD-1拮抗剂抗体应展现下述特征的任何一种或多种：(a)结合PD-1且阻断下游信号传导事件；(b)阻断PD-L1结合PD-1；(c)上调T细胞介导的免疫反应；(d)刺激IFNγ分泌；(e)刺激TNF分泌；(f)增加T细胞增殖；和(g)减少通过PD-1的抑制性信号转导。
为了本发明的目的，抗体优选地以抑制PD-1信号传导功能的方式与PD-1反应。在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体特异性结合灵长类动物PD-1。
可用于本发明的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合物抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如结构域抗体)、人源化抗体和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。所述抗体可以是小鼠、大鼠、人类或任何其他起源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人类或人源化抗体。
抗PD-1拮抗剂抗体可通过领域已知的任何方法制备。用于产生人类和小鼠抗体的一般技术是本领域已知的和/或描述于本文中。
抗PD-1拮抗剂抗体可使用本领域已知的方法鉴定或表征，由此检测和/或测量PD-1生物活性的减少、改善、或中和。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体通过培养候选剂与PD-1并监测结合和/或随之而来的PD-1生物活性的减少或中和而鉴定。该结合测定法可使用，例如经纯化的PD-1多肽进行，或使用天然表达PD-1多肽(例如，各种株)或经转染以表达PD-1多肽的细胞进行。在一个实施方案中，该结合测定法是竞争性结合测定法，其中评价候选抗体与已知的抗PD-1拮抗剂抗体竞争与PD-1结合的能力。该测定法可以各种格式进行，包括ELISA格式。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体通过培养候选抗体与PD-1并监测结合而鉴定。
在初步鉴定之后，候选抗PD-1拮抗剂抗体的活性可通过已知用于测试经靶向生物活性的生物测定法进一步确认和精细化。在一些实施方案中，体外细胞测定法用于进一步表征候选抗PD-1拮抗剂抗体。例如，候选抗体与原代人类T细胞培养，且添加PD-L1，并监测IFNγ分泌。或者，生物测定法可用来直接筛选候选物。
本发明的抗PD-1拮抗剂抗体展现下述特征的一种或多种：结合PD-1且阻断下游信号传导事件；(b)阻断PD-L1结合PD-1；(c)上调T细胞介导的免疫反应；(d)刺激IFNγ分泌；(e)刺激TNF分泌；(f)增加T细胞增殖；(g)减少通过PD-1的抑制性信号转导；和(h)阻断PD-L2结合PD-1。优选地，抗PD-1抗体具有这些特征的两者或更多种。更优选地，所述抗体具有所述特征的三种或更多种。更优选地，所述抗体具有所述特征的四种或更多种。更优选地，所述抗体具有所述特征的五种或更多种。更优选地，所述抗体具有所述特征的六种或更多种。更优选地，所述抗体具有所述特征的七种或更多种。最优选地，所述抗体具有所有八种特征。
抗PD-1拮抗剂抗体可使用本领域众所周知的方法表征。例如，一种方法是鉴定其所结合的表位，或“表位定位”。本领域有许多已知的用于定位和表征蛋白上表位位置的方法，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定法、基因片段表达测定法和基于合成肽的测定法，如描述于，例如Harlow和Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999的第11章。在一种额外实例中，表位定位可用于确定抗PD-1拮抗剂抗体所结合的序列。表位定位可自各种商业来源获得，例如Pepscan系统(Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, TheNetherlands)。该表位可以是线性表位(即在单一伸展氨基酸中含有)，或通过不一定于单一伸展中含有的氨基酸的三维相互作用所形成的构型表位。具有不同长度(例如至少4至6个氨基酸长)的肽可经分离或合成(例如重组地)，并用于用抗PD-1拮抗剂抗体的结合测定法。在另一种实例中，抗PD-1拮抗剂抗体所结合的表位可在系统化筛选中确定，该筛选通过使用衍生自PD-1序列的重叠肽并确定抗PD-1拮抗剂抗体的结合。根据基因片段表达测定法，编码PD-1的开放阅读框被随机或通过特定基因构建而片段化，且测定PD-1的表达片段与待测试抗体的反应性。该基因片段可能，例如通过PCR产生，且接着在体外在放射性氨基酸存在的情况下被转录和翻译成蛋白。所述抗体与放射性标记的PD-1片段的结合接着通过免疫沉淀和凝胶电泳来确定。某些表位也可通过使用噬菌体粒子或酵母表面上所展示的随机肽序列的大型文库(噬菌体文库或酵母展示)进行鉴定。或者，可在简单结合测定法中测试定义的重叠肽片段文库对测试抗体的结合。在一个额外实例中，可进行抗原的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合所需、足够和/或必要的残基。例如，丙氨酸扫描诱变实验可使用突变体PD-1进行，其中PD-1多肽的各种残基已被丙氨酸置换。通过评估所述抗体对突变体PD-1的结合，可评估特定PD-1残基对抗体结合的重要性。
可用于表征抗PD-1拮抗剂抗体的又另一种方法，是使用与已知结合相同抗原(即PD-1的各种片段)的其他抗体的竞争测定法，以确定所述抗PD-1拮抗剂抗体是否结合与其他抗体相同的表位。竞争测定法为本领域技术人员众所周知，包括ELISA 格式。
抗PD-1拮抗剂抗体对PD-1的结合亲和力(KD)可以是约0.001至约200 nM。在一些实施方案中，所述结合亲和力为下列中的任一者：约200 nM、约100 nM、约50 nM、约10 nM、约1 nM、约500 pM、约100 pM、约60 pM、约50 pM、约20 pM、约15 pM、约10 pM、约5 pM、约2pM或约1 pM。在一些实施方案中，所述结合亲和力为小于下列的任一者：约250 nM、约200nM、约100 nM、约50 nM、约10 nM、约1 nM、约500 pM、约100 pM、约50 pM、约20 pM、约10 pM、约5 pM或约2 pM。
因此，本发明提供下列的任一者、或包含抗体或其变体的组合物(包括药物组合物)，所述抗体具有如表1中所找到的一部分轻链序列和一部分重链序列。在表1中，加下划线序列是CDR序列。除非另有表明，在表1中，KD表明对人类PD-1的亲和力，如使用表面等离子共振于25℃下所测量。
表1：抗PD-1拮抗剂抗体的可变区序列
Figure 47863DEST_PATH_IMAGE002
Figure 761741DEST_PATH_IMAGE003
Figure 541478DEST_PATH_IMAGE004
Figure 936688DEST_PATH_IMAGE005
本发明也提供抗PD-1抗体的CDR部分。CDR区的确定完全在本领域的技术内。应理解，在一些实施方案中，CDR可以是Kabat和Chothia CDR的组合(也称为“组合CDR”或“延伸CDR”)。在本文中称为CDR的“构型定义”的另一种方法中，CDR的位置可被鉴定为对抗原结合作出焓贡献的残基。参见例如Makabe等人, 2008, Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166。通常，“构型CDR”包括Kabat CDR中的残基位置和Vernier区，所述Vernier区经受限以维持所述抗体的适当环结构以与特定抗原结合。构型CDR的确定完全在本领域的技术内。在一些实施方案中，所述CDR是Kabat CDR。在其他实施方案中，所述CDR是Chothia CDR。在其他实施方案中，所述CDR是延伸CDR、AbM CDR、构型CDR、或接触CDR。换句话说，在具有超过一个CDR的实施方案中，所述CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR、延伸CDR、AbM CDR、构型CDR、接触CDR或其组合中任一者。
在一些实施方案中，所述抗体包含表1中所示的重链可变区的任一者的三个CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含表1中所示的轻链可变区的任一者的三个CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含表1中所示的重链可变区的任一者的三个CDR，和表1中所示的轻链可变区的任一者的三个CDR。
表2提供本文提供的抗PD-1拮抗剂抗体的CDR序列的实例。
表2. 抗PD-1拮抗剂抗体(mAb)及其根据Kabat (加下划线)和Chothia (粗体)的抗原结合CDR序列
Figure 564109DEST_PATH_IMAGE006
Figure 714468DEST_PATH_IMAGE007
Figure 981501DEST_PATH_IMAGE008
Figure 180401DEST_PATH_IMAGE009
在一些实施方案中，所述抗体包含来自表2的三个轻链CDR和三个重链CDR。
在表3中提供来自抗PD-1抗体的轻链CDR的比对。可变残基以粗体显示。在表3的最后一列提供一致的轻链CDR序列。
表3. 抗PD-1轻链CDR的比对
Figure 895285DEST_PATH_IMAGE010
Figure 888649DEST_PATH_IMAGE011
在表4中提供来自抗PD-1抗体的重链CDR的比对。可变残基以粗体显示。在表4的最后一列提供一致的重链CDR序列。
表4. 抗PD-1重链CDR的比对
Figure 642978DEST_PATH_IMAGE012
在一些实施方案中，所述抗体包含来自表3的三个轻链CDR和来自表4的三个重链CDR。
在一些实施方案中，所述抗体包含全长重链，其具有或不具有C-端赖氨酸，和/或抗PD-1拮抗剂抗体mAb7或mAb15的全长轻链。mAb7全长重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)显示如下：
Figure 707886DEST_PATH_IMAGE013
不具有C-端赖氨酸的mAb7全长重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 38)显示如下：
Figure 231272DEST_PATH_IMAGE014
mAb7全长轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 39)显示如下：
Figure 661116DEST_PATH_IMAGE015
本发明也提供产生、选择和制备抗PD-1拮抗剂抗体的方法。本发明的抗体可通过本领域已知的程序制备。在一些实施方案中，抗体可重组制备并使用任何本领域已知的方法表达。
在一些实施方案中，抗体可通过噬菌体展示技术制备和选择。参见例如，美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；和6,265,150；和Winter等人, Annu. Rev. Immunol.12:433-455, 1994。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等人, Nature 348:552-553,1990)可用于自来自未经免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱系(repertoire)体外产生人类抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因同框克隆至丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，且作为功能性抗体片段展示于噬菌体粒子的表面上。由于丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体的功能性质的选择也导致编码展现那些性质的抗体的基因的选择。因此，该噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以各种格式进行；对于综述，参见例如Johnson, Kevin S.和Chiswell,David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993。几个V基因区段来源可用于噬菌体展示。Clackson等人, Nature 352:624-628, 1991，从衍生自经免疫小鼠的脾脏的V基因的小随机组合文库分离各种各样的抗噁唑酮抗体。基本上遵循Mark等人,J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991或Griffith等人, EMBO J. 12:725-734, 1993所述的技术，可构建来自人类供体的V基因谱系，且可分离多样抗原(包括自体抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率累积突变(体细胞超突变)。一些所导入改变将赋予更高的亲和力，且展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在后续抗原攻击期间优先复制和分化。此天然过程可通过采用被称为“链改组(chain shuffling)”的技术模拟(Marks等人, Bio/Technol. 10:779-783, 1992)。在此方法中，通过噬菌体展示获得的“初级”人类抗体的亲和力，可通过以自未经免疫的供体获得的V结构域基因的天然存在的变体的谱系(谱系)顺序置换重链和轻链V区基因而改进。此技术允许产生具有范围为pM至nM的亲和力的抗体和抗体片段。用于制备非常大的噬菌体抗体谱系(也称为“万众之母文库(the mother-of-alllibraries)”)的策略已由Waterhouse等人, Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993描述。基因改组也可用于自啮齿动物抗体衍生人类抗体，其中该人类抗体具有与该起始啮齿动物抗体相似的亲和力和特异性。根据此方法(其又称为“表位印记”)，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V区基因被人类V结构域基因的谱系置换，产生啮齿动物-人类嵌合体。对于抗原的选择导致分离能够恢复功能性抗原结合位点的人类可变区，即表位主宰(印记)配偶体的选择。当重复该过程以置换剩余的啮齿动物V结构域时，获得人类抗体(参见PCT公开号WO 93/06213)。与传统的通过CDR接枝将啮齿动物抗体人源化不同，此技术提供完全人类抗体，其不具啮齿动物起源的构架或CDR残基。
在一些实施方案中，抗体可使用杂交瘤技术制备。可考虑任何哺乳动物个体(包括人类或来自其的产生抗体的细胞)可被操纵以充当产生哺乳动物(包括人类)杂交瘤细胞系的基础。免疫宿主动物的途径和时程一般与已建立和常规的抗体刺激与产生技术一致，如本文进一步描述。典型地，宿主动物用一定量免疫原(包括如本文所述)腹膜内、肌肉内、经口、皮下、足底和/或皮内接种。
杂交瘤可自淋巴细胞和永生化的骨髓瘤细胞制备，其使用Kohler, B.和Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497的一般体细胞杂交技术或由Buck, D. W.,等人, In Vitro, 18:377-381, 1982所修饰。可得的骨髓瘤细胞系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA的那些可用于杂交中。通常，该技术涉及使用促融剂诸如聚乙二醇或通过本领域技术人员众所周知的电学手段将骨髓瘤细胞与淋巴样细胞融合。在融合后，使细胞与融合培养基分离并生长在选择性生长培养基诸如次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷(HAT)培养基中以消除未杂交的亲本细胞。任何本文中所描述的补充有或未补充血清的培养基都可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种替代方案，EBV永生化B细胞可用于产生本发明的PD-1单克隆抗体。如果需要，将所述杂交瘤或其他永生化B细胞进行扩增和亚克隆，且通过常规免疫测定程序(例如放射性免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测定法)来测定上清液的抗免疫原活性。
可被用作抗体来源的杂交瘤涵盖产生对PD-1或其部分特异性的单克隆抗体的亲本杂交瘤的所有衍生物、后代细胞。
产生此种抗体的杂交瘤可使用已知程序在体外或体内生长。如果需要，可通过常规免疫球蛋白纯化程序诸如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱和超滤自培养基或体液分离单克隆抗体。可移除非所需活性(如果存在的话)，例如通过使该制剂运行通过由附接至固相的免疫原制备的吸附物，和自免疫原洗脱或释放所需抗体。以PD-1多肽、或缀合至蛋白的含有目标氨基酸序列的片段来免疫宿主动物可产生抗体群体(例如单克隆抗体)，所述蛋白在待免疫的物种中是免疫原性的，例如钥孔䗩血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，所述缀合使用双功能剂或衍生剂，例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺基酯(经由半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N=C=NR，其中R和R1是不同的烷基。
如果需要，可对感兴趣的抗PD-1拮抗剂抗体(单克隆或多克隆)测序，接着可将核苷酸序列克隆至载体用于表达或增殖。在宿主细胞中，编码感兴趣的抗体的序列可维持于载体中，接着可将宿主细胞扩增和冷冻用于将来使用。在细胞培养中产生重组单克隆抗体可通过借助本领域已知的手段自B细胞克隆抗体基因来进行。参见例如Tiller等人, 2008,J. Immunol. Methods 329, 112；和美国专利号7,314,622。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列可用于基因操纵以“人源化”所述抗体或改进所述抗体的亲和力或其他特征。也可将抗体定制用于，例如狗、猫、灵长类动物、马和牛中。
在一些实施方案中，全人类抗体可通过使用市售小鼠获得，该市售小鼠已工程化以表达特定人免疫球蛋白蛋白。经设计以产生更所需(例如全人类抗体)或更稳健的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化抗体或人类抗体。此种技术的实例是来自Abgenix,Inc. (Fremont, CA)的Xenomouse™和来自Medarex, Inc. (Princeton, NJ)的HuMAb-Mouse®和TC Mouse™。
可通过如下重组制备抗体：首先自宿主动物分离抗体和产生抗体的细胞、获得基因序列，和使用基因序列在宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达所述抗体。另一种可采用的方法是在植物(例如烟草)或转基因乳中表达所述抗体序列。已公开了在植物或乳中重组表达抗体的方法。参见例如，Peeters,等人 Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N.和D.Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995;和Pollock,等人, J Immunol Methods 231:147, 1999。用于制备抗体的衍生物，例如结构域、单链等的方法是本领域已知的。
免疫测定法和流式细胞分选技术诸如荧光激活细胞分选(FACS)也可用于分离对PD-1特异性的抗体。
编码单克隆抗体的DNA使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码所述单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置入表达载体中(诸如PCT公开号WO 87/04462中所公开的表达载体)，其接着被转染至不另外产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在所述重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见例如PCT公开号WO 87/04462。也可将所述DNA修饰，例如通过以人类重链和轻链恒定结构域的编码序列置换同源小鼠序列(Morrison等人, Proc. Nat. Acad. Sci.81:6851, 1984)，或通过将所有或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。以该方式，制备具有本文的PD-1单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
可通过抗体的蛋白水解或其他降解、通过如上所述的重组方法(即单一或融合多肽)或通过化学合成而产生抗体片段。所述抗体的多肽，尤其是最高约50个氨基酸的较短多肽，方便地通过化学合成制备。化学合成的方法是本领域已知的且市售的。例如，抗体可通过采用固相方法的自动多肽合成仪产生。还参见美国专利号5,807,715、4,816,567和6,331,415。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码下列抗体的重链和/或轻链可变区的序列：mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13、mAb14、mAb15或mAb16。在宿主细胞中，编码感兴趣抗体的序列可维持于载体中，接着可将宿主细胞扩增和冷冻用于将来使用。在本文中进一步描述载体(包括表达载体)和宿主细胞。
本发明包括亲和力成熟的实施方案。例如，亲和力成熟抗体可通过本领域已知的程序产生(Marks等人, 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas等人, 1994, ProcNat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier等人, 1995, Gene, 169:147-155; Yelton等人, 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson等人, 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins等人, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896；和PCT公开号WO2004/058184)。
下列方法可用于调整抗体的亲和力和用于表征CDR。一种表征抗体的CDR和/或改变(诸如改进)多肽诸如抗体的结合亲和力的方式被称为“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变如下工作。使用本领域公认的方法将CDR中的一个或多个氨基酸位置以两个或更多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸置换。这产生小克隆文库(在一些实施方案中，对于每个经分析的氨基酸位置，一个克隆)，各自具有两个或更多个成员的复杂性(如果在每个位置取代两种或更多种氨基酸)。通常，该文库还包括包含天然(未经取代的)氨基酸的克隆。筛选来自各文库的少量克隆，例如约20至80个克隆(取决于该文库的复杂性)的对目标多肽(或其他结合目标)的结合亲和力，且鉴定具有增加的结合、相同的结合、降低的结合或不结合的候选物。用于确定结合亲和力的方法是本领域众所周知的。结合亲和力可使用，例如Biacore™表面等离子共振分析(其检测约2倍或更高的结合亲和力差异)、Kinexa®生物传感器、邻近闪烁测定法、ELISA、ORIGEN®免疫测定法、荧光猝灭、荧光转移和/或酵母展示来确定。结合亲和力也可利用适当的生物测定法筛选。当起始抗体已以相对高的亲和力(例如约10 nM或更低的KD)结合时，Biacore™是特别有用的。
在一些实施方案中，使用本领域公认的诱变方法(所述诱变方法的一些描述于本文中)，将CDR中的每个氨基酸位置(在一些实施方案中，一个位置一次)以所有20种天然氨基酸置换。这产生小克隆文库(在一些实施方案中，对于每个经分析的氨基酸位置，一个克隆)，各自具有20个成员的复杂性(如果在每个位置取代所有20种氨基酸)。
在一些实施方案中，待筛选的文库包含在两个或更多个位置的取代，所述两个或更多个位置可以在相同CDR中或在两个或更多个CDR中。因此，该文库可包含在一个CDR中的两个或更多个位置的取代。该文库可包含在两个或更多个CDR中的两个或更多个位置的取代。该文库可包含在3、4、5或更多个位置的取代，所述位置见于二、三、四、五或六个CDR中。该取代可使用低冗余密码子制备。参见例如Balint等人, 1993, Gene 137(1):109-18的表2。
所述CDR可以是重链可变区(VH) CDRH3和/或轻链可变区(VL) CDRL3。所述CDR可以是VH CDRL1、VH CDRL2、VH CDRL3、VL CDRH1、VL CDRH2和/或VL CDRH3的一个或多个。所述CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR、延伸CDR、AbM CDR、接触CDR或构型CDR。
可测序具有改进的结合的候选物，从而鉴定导致改进的亲和力的CDR取代突变体(也称为“改进的”取代)。还可测序结合的候选物，从而鉴定保留结合的CDR取代。
可进行多轮筛选。例如，具有改进的结合的候选物(各自包含在一个或多个CDR的一个或多个位置的氨基酸取代)也可用于设计第二文库，所述第二文库在各改进的CDR位置(即在该位置取代突变体显示改进的结合的所述CDR中的氨基酸位置)含有至少该原始和取代的氨基酸。此文库的制备、筛选和选择在下面进一步讨论。
文库扫描诱变还提供用于表征CDR的手段，就具有改进的结合、相同的结合、降低的结合或不结合的克隆的频率还提供有关各氨基酸位置对抗体-抗原复合物稳定性的重要性的信息来说。例如，如果CDR的位置当被改变成所有20种氨基酸时仍保留结合，该位置被鉴定为不可能是抗原结合所需的位置。相反地，如果CDR的位置只有在小百分比的取代中保留结合，则该位置被鉴定为对CDR功能重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生有关下列位置的信息：CDR中可被改变成许多不同氨基酸(包括所有20种氨基酸)的位置和CDR中不可被改变或仅能够被改变成少数氨基酸的位置。
具有改进的亲和力的候选物可组合于第二文库中，所述第二文库在该位置包括改进的氨基酸和原始氨基酸，且可进一步包括在该位置的额外取代，此取决于所需的该文库复杂性，或使用所需筛选或选择方法所允许的文库复杂性。此外，如果需要，相邻氨基酸位置可被随机化成至少两种或更多种氨基酸。相邻氨基酸的随机化可允许突变体CDR中的额外构型柔性，其可进而允许或促进导入更大数量的改善突变。该文库也可包含在第一轮筛选中不显示改善的亲和力的位置的取代。
第二文库使用本领域已知的任何方法筛选或选择具有改进和/或改变的结合亲和力的文库成员，所述方法包括使用Kinexa™生物传感器分析筛选，和使用本领域已知的任何用于选择的方法选择，包括噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示。
为了表达本发明的抗PD-1抗体，编码VH和VL区的DNA片段可首先使用上述的任何方法获得。各种修饰例如突变、缺失和/或添加也可使用本领域技术人员已知的标准方法导入DNA序列中。例如，可使用标准方法进行诱变，诸如PCR介导的诱变，其中突变核苷酸被并入PCR引物中，使得PCR产物含有所需突变或位点定向诱变。
本发明涵盖对表1中所示的可变区和表2、3或4中所示的CDR的修饰。例如，本发明包括包含功能相等可变区和不会显著影响它们的性质的CDR的抗体以及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。例如，氨基酸序列可被突变以获得对PD-1具有所需结合亲和力的抗体。多肽的修饰是本领域常规操作，不必在本文中详细描述。修饰的多肽的实例包括具有下列的多肽：氨基酸残基的保守取代、不显著有害地改变功能活性或使多肽对其配体的亲和力成熟(增强)的氨基酸的一个或多个缺失或添加或使用化学类似物。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及在序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体或融合至表位标签的抗体。抗体分子的其他插入变体包括增加所述抗体于血液循环中的半衰期的酶或多肽与抗体的N端或C端的融合体。
取代变体移除所述抗体分子中的至少一个氨基酸残基并在其位置插入不同的残基。对于取代性诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也可考虑构架改变。保守取代显示于表5中标题“保守取代”下。如果此类取代导致生物活性改变，则可导入表5中称为“示例性取代”或如下参照氨基酸分类进一步描述的更实质改变，并且筛选产物。
表5：氨基酸取代
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抗体生物性质的实质修饰通过选择其在维持下列的效果上显著不同的取代来完成：(a)取代区的多肽骨架的结构，例如，作为β-片或螺旋构型、(b)分子在目标位点的带电或疏水性、或(c)侧链的主体。基于常见侧链性质将天然存在的氨基酸残基分成下列组群：
(1) 非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2) 极性不带电：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3) 酸性(带负电)：Asp、Glu；
(4) 碱性(带正电)：Lys、Arg；
(5) 影响链方向的残基：Gly、Pro；和
(6) 芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
非保守取代通过将这些分类中的一个分类的成员交换成另一分类来制备。
例如，一种可作出的取代是将抗体中的一个或多个半胱氨酸(其可以是化学反应性的)改变成另一个残基诸如但不限于丙氨酸或丝氨酸。例如，可存在非典型半胱氨酸的取代。该取代可在抗体的可变结构域的CDR或框架区中或在抗体的恒定区中作出。在一些实施方案中，半胱氨酸是典型的。任何不涉及维持适当抗体构型的半胱氨酸也可被取代，一般取代为丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反地，半胱氨酸键可被添加到抗体，以提高其稳定性，特别是在抗体是抗体片段诸如Fv片段时。
也可在，例如重链和/或轻链的可变结构域中修饰抗体，例如以改变所述抗体的结合性质。在可变区的改变可改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR结构域内作出不超过一至五个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，在CDR结构域内作出不超过一至三个保守氨基酸取代。例如，可在一个或多个CDR区中作出突变，以增加或降低所述抗体对PD-1的KD、增加或降低koff、或改变所述抗体的结合特异性。位点定向诱变的技术是本领域众所周知的。参见例如Sambrook等人和Ausubel等人(同上)。
修饰或突变也可在框架区或恒定区中作出以增加抗PD-1抗体的半衰期。参见例如PCT公开号WO 00/09560。也可在框架区或恒定区中做出突变，以改变所述抗体的免疫原性、提供用于共价或非共价结合另一分子的位点、或改变性质诸如补体固定、FcR结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，在框架区或恒定区内作出不超过一至五个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，在框架区或恒定区内作出不超过一至三个保守氨基酸取代。根据本发明，单一抗体可在可变区的CDR或框架区的任一个或多个中或在恒定区中具有突变。
修饰还包括糖基化和非糖基化多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，诸如例如以不同糖糖基化、乙酰化和磷酸化。抗体在它们的恒定区中的保守位置糖基化(Jefferis和Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright和Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响该蛋白的功能(Boyd等人, 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180)和糖蛋白的各部分之间的分子内相互作用，其可影响糖蛋白的构型和呈现的三维表面(Jefferis和Lund, 同上;Wyss和Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416)。基于特定识别结构，寡糖也可用来将给定糖蛋白靶向至某些分子。也已报告抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。具体而言，报告具有β(1,4)-N-乙酰葡萄胺基转移酶III(GnTIII，一种催化平分型GlcNAc形成的糖基转移酶)的四环素调节的表达的CHO细胞产生的抗体具有改进的ADCC活性(Umana等人, 1999, Nature Biotech. 17:176-180)。
抗体的糖基化通常为N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分酶附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的任一者的存在产生潜在糖基化位点。O-连接糖基化是指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向抗体加入糖基化位点通过改变氨基酸序列、使得其包含上述三肽序列的一者或多者(用于N-连接的糖基化位点)而方便地完成。该改变也可通过向原始抗体的序列加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来作出(用于O-连接的糖基化位点)。
抗体的糖基化模式也可在不改变基础核苷酸序列的情况下改变。糖基化大多取决于用来表达所述抗体的宿主细胞。由于用来表达重组糖蛋白、例如抗体作为潜在治疗剂的细胞类型很少是天然细胞，因此可预期抗体的糖基化模式的变化(参见例如Hse等人,1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070)。
除了宿主细胞的选择以外，在重组产生抗体期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基制剂、培养密度、氧化、pH、纯化方案等。已提出各种方法，以改变在特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括导入或过表达某些涉及寡糖产生的酶(美国专利号5,047,335；5,510,261和5,278,299)。糖基化、或某些类型的糖基化可自糖蛋白酶移除，例如利用内切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。此外，所述重组宿主细胞可基因工程化成在加工某些类型的多糖中有缺陷。这些和类似技术是本领域众所周知的。
其他修饰方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶手段、氧化取代和螯合。修饰可用于，例如用于附接用于免疫测定法的标记。修饰的多肽使用本领域已建立的程序来制备，且可使用本领域已知的标准测定法来筛选，其中一些在下面和实施例中描述。
在一些实施方案中，所述Fc可以是人类IgG2或人类IgG4。在一些实施方案中，所述抗体包含IgG4的恒定区，其包含下列突变(Armour等人, 2003, Molecular Immunology 40585-593)：E233F234L235至P233V234A235 (IgG4Δc)，其中编号参照野生型IgG4。在又另一个实施方案中，所述Fc是具有缺失G236的人类IgG4 E233F234L235至P233V234A235 (IgG4Δb)。在一些实施方案中，所述Fc是含有稳定绞链的突变S228至P228的任何人类IgG4 Fc(IgG4、IgG4Δb或IgG4Δc)(Aalberse等人, 2002, Immunology 105, 9-19)。在其他实施方案中，所述Fc可以是含有突变A330P331至S330S331的人类IgG2(IgG2Δa)，其中氨基酸残基参照野生型IgG2序列编号(Aalberse等人, 2002, Immunology 105, 9-19)。
在一些实施方案中，所述抗体包含修饰的恒定区，该修饰的恒定区对人类Fcγ受体具有增加的或降低的亲和力；是免疫惰性或部分惰性的，例如不引发补体介导的裂解、不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、或不活化小神经胶质细胞；或在下列任一者或多者中具有减少的活性(与未修饰的抗体相比)：引发补体介导的裂解、刺激ADCC、或活化小神经胶质细胞。可使用恒定区的不同修饰达到效应子功能的最佳水平和/或组合。参见例如，Morgan等人, Immunology 86:319-324, 1995; Lund等人, J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996; Idusogie等人, J. Immunology 164:4178-4184, 2000; Tao等人, J. Immunology 143: 2595-2601, 1989;和Jefferis等人, Immunological Reviews163:59-76, 1998。在一些实施方案中，恒定区如Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624；PCT公开WO99/058572中所述修饰。
在一些实施方案中，可修饰抗体恒定区以避免与Fcγ受体与补体和免疫系统相互作用。用于制备此类抗体的技术描述于WO 99/58572。例如，如果抗体用于人类中的临床试验和治疗，则该恒定区可工程化以更类似于人类恒定区，以避免免疫反应。参见例如美国专利号5,997,867和5,866,692。
在又其他实施方案中，该恒定区无N-连接的糖基化。在一些实施方案中，该恒定区通过使恒定区中为N-糖基化识别序列的部分的附接残基和/或侧接残基的寡糖突变而无N-连接的糖基化。例如，N-糖基化位点N297可被突变成，例如A、Q、K或H。参见Tao等人, J.Immunology 143: 2595-2601, 1989;和Jefferis等人, Immunological Reviews 163:59-76, 1998。在一些实施方案中，该恒定区无N-连接的糖基化。该恒定区可经酶(诸如通过酶PNGase移除碳水化合物)或通过在糖基化缺陷宿主细胞中表达而无N-连接的糖基化。
其他抗体修饰包括如PCT公开号WO 99/58572中所述修饰的抗体。除了包含针对目标分子的结合结构域，这些抗体还包含具有实质上与人类免疫球蛋白重链的所有或部分恒定区同源的氨基酸序列的效应子结构域。这些抗体能够结合目标分子，而不引发显著的目标的补体依赖性裂解或细胞介导的破坏。在一些实施方案中，该效应子结构域能够特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些典型地基于衍生自两种或更多种人类免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以此方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体疗法中，以避免对常规抗体疗法的炎性和其他不良反应。
在一些实施方案中，所述抗体包含修饰的恒定区，该修饰的恒定区具有与未修饰的抗体相比对FcRn增加的结合亲和力和/或增加的血清半衰期。
在称为“种系化(germlining)”的过程中，可突变VH和VL序列中的某些氨基酸以匹配在种系VH和VL序列中天然发现的氨基酸。具体而言，可突变VH和VL序列中的框架区的氨基酸序列以匹配种系序列，以降低所述抗体在施用时的免疫原性风险。人类VH和VL基因的种系DNA序列是本领域已知的(参见例如“Vbase”人类种系序列数据库；还参见Kabat, E.A.,等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;Tomlinson等人, 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798;和Cox等人, 1994, Eur. J.Immunol. 24:827-836)。
另一种可作出的氨基酸取代是移除抗体中潜在的蛋白水解位点。此类位点可存在于抗体的可变结构域的CDR或框架区中或抗体的恒定区中。取代半胱氨酸残基和移除蛋白水解位点可降低抗体产物的异质性的风险，因此增加其同质性。另一类氨基酸取代是消除天冬酰胺-甘氨酸对，其通过改变所述残基的一者或两者以形成潜在的脱酰胺位点。在另一种实例中，可切割本发明的抗PD-1抗体的重链的C端赖氨酸。在本发明的各个实施方案中，抗PD-1抗体的重链和轻链任选地包括信号序列。
一旦获得编码本发明的VH和VL区段的DNA片段，可进一步通过标准重组DNA技术操纵这些DNA片段，例如，将可变区基因转换为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作连接至编码另一种蛋白(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一种DNA片段。在此上下文中所使用的术语“可操作连接”意指连接两个DNA片段，使得由两个DNA片段所编码的氨基酸序列维持同框。
编码VH区的分离的DNA可通过将编码VH的DNA可操作连接至另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子而转换成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A.,等人, 1991, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。所述重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选的是IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可以是已知存在于不同个体间的各种等位基因或同种异型的任一者，诸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。这些同种异型代表在IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。就Fab片段重链基因而言，编码VH的DNA可以可操作连接至另一种仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。CH1重链恒定区可衍生自所述重链基因的任一者。
编码VL区的分离的DNA可通过将编码VL的DNA可操作连接至另一种编码轻链恒定区(CL)的DNA分子而转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A.,等人, 1991, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。所述轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。κ恒定区可以是已知存在于不同个体间的各种等位基因的任一者，诸如Inv(1)、Inv(2)和Inv(3)。λ恒定区可衍生自三个λ基因中的任一者。
为了产生scFv基因，编码VH的DNA片段和编码VL的DNA片段可操作连接至另一种编码柔性接头的片段，使得所述VH和VL序列可被表达为连续单链蛋白，其中所述VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人, 1988, Science 242:423-426; Huston等人, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty等人, 1990, Nature 348:552-554)。连接肽的一个实例是(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 19)，其在一个可变区的羧基端与另一个可变区的氨基端之间桥接约3.5 nm。已设计并使用其他序列的接头(Bird等人,1988，同上)。进而针对额外功能诸如药物附接或附接至固体支持物而修饰接头。如果仅使用单一VH和VL，单链抗体可以是单价的；如果使用两个VH和VL，单链抗体可以是双价的；或者如果使用超过两个VH和VL，单链抗体可以是多价的。可产生双特异性或多价抗体，其与PD-1和另一个分子特异性结合。可重组或合成产生单链变体。就scFv的合成产生而言，可使用自动化合成仪。就scFv的重组产生而言，含有编码scFv的多核苷酸的适当质粒可被导入适当的宿主细胞中，所述宿主细胞为，真核细胞诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核细胞诸如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可通过常规操纵(诸如多核苷酸的连接)作出。所得scFv可使用本领域已知的标准蛋白纯化技术分离。
还涵盖其他形式的单链抗体诸如双价抗体。双价抗体是二价、双特异性的抗体，其中VH和VL表达于单一多肽链上，但使用过短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger, P.,等人, 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J.,等人, 1994, Structure 2:1121-1123)。
包含两个共价连接抗体的异源缀合物抗体也在本发明的范围内。此类抗体已用于将免疫系统细胞靶向至非所需的细胞(美国专利号4,676,980)和用于治疗HIV感染(PCT公开号WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。异源缀合物抗体可使用任何方便的交联方法制备。适当的交联剂和技术是本领域众所周知的且描述于美国专利号4,676,980。
嵌合或杂交抗体也可使用已知的合成蛋白化学方法(包括涉及交联剂的那些)在体外制备。例如，免疫毒素可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键而构建。为此目的的适合试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯。
本发明也涵盖包含来自本文所述的抗体的一个或多个片段或区域的融合蛋白。在一些实施方案中，可作出融合抗体，其包含连接至另一个多肽的本发明的抗PD-1抗体的全部或部分。在另一个实施方案中，仅抗PD-1抗体的可变结构域连接至该多肽。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体的VH结构域连接至第一多肽，同时抗PD-1抗体的VL结构域连接至第二多肽，该第二多肽与第一多肽以使得所述VH和VL结构域可彼此相互作用以形成抗原结合位点的方式结合。在另一个优选的实施方案中，所述VH结构域与VL结构域通过接头分开，使得所述VH和VL结构域可彼此相互作用。所述VH-接头-VL抗体接着连接至感兴趣的多肽。此外，可产生融合抗体，其中两个(或更多个)单链抗体彼此连接。如果本领域技术人员想在单一多肽链上产生二价或多价抗体，或如果本领域技术人员想产生双特异性抗体，则这是有用的。
在一些实施方案中，提供一种融合多肽，其包含如SEQ ID NO: 2、7、8或9所示的可变轻链区的至少10个连续氨基酸，和/或如SEQ ID NO: 3、4、5或6所示的可变重链区的至少10个氨基酸。在其他实施方案中，提供一种融合多肽，其包含可变轻链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸和/或可变重链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸。在另一个实施方案中，该融合多肽包含轻链可变区和/或重链可变区，如选自SEQ ID NO: 2和3、7和3、8和3、8 9和3、2和4、7和4、8和4、9和4、2和5、7和5、8和5、9和5、2和6、7和6、8和6以及9和6的序列对的任一者所示。在另一个实施方案中，该融合多肽包含一个或多个CDR。在又其他实施方案中，该融合多肽包含VH CDR3和/或VL CDR3。就本发明的目的而言，融合蛋白含有一种或多种抗体和其在天然分子中未附接的另一种氨基酸序列，例如异源序列或来自另一区域的同源序列。示例性异源序列包括但不限于“标签”诸如FLAG标签或6His标签。标签是本领域众所周知的。
融合多肽可通过本领域已知的方法产生，例如合成或重组产生。通常，本发明的融合蛋白通过，使用本文所述的重组方法制备和表达编码它们的多核苷酸所制备，尽管它们也可通过本领域已知的其他方法(包括例如化学合成)制备。
在其他实施方案中，其他修饰的抗体可使用编码抗PD-1抗体的核酸分子制备。例如，“κ抗体”(Ill等人, 1997, Protein Eng. 10:949-57)、“迷你抗体”(Martin等人,1994, EMBO J. 13:5303-9)、“双价抗体”(Holliger等人，同上)或“Janusins”(Traunecker等人, 1991, EMBO J. 10:3655-3659和Traunecker等人, 1992, Int. J. Cancer(Suppl.) 7:51-52)可遵循本说明书教导使用标准分子生物技术制备。
例如，双特异性抗体(对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体)可使用本文公开的抗体制备。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的(参见例如Suresh等人,1986, Methods in Enzymology 121:210)。例如，双特异性抗体或抗原结合片段可通过融合杂交瘤或连接Fab’片段产生。参见例如Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp.Immunol. 79:315-321, Kostelny等人, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553。传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对(其中两个重链具有不同的特异性)的共表达(Millstein和Cuello, 1983, Nature 305, 537-539)。此外，双特异性抗体可形成为“双价抗体”或“Janusins”。在一些实施方案中，该双特异性抗体结合PD-1的两种不同的表位。在一些实施方案中，上述修饰的抗体使用来自本文提供的抗PD-1抗体的一个或多个可变结构域或CDR区域制备。
根据一种制备双特异性抗体的方法，具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)融合至免疫球蛋白恒定区序列。优选地与免疫球蛋白重链恒定区(包含至少部分的绞链区、CH2区和CH3区)融合。优选地使第一重链恒定区(CH1)(其含有轻连结合所需的位点)存在于所述融合体的至少一个中。编码免疫球蛋白重链融合体和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA被插入分别表达载体中，并被共转染至适当的宿主生物体中。这在当构建中所使用的不等比例的三个多肽链提供最佳产量的实施方案中，这提供调整三个多肽片段的相互比例的高度灵活性。然而，当以相等比例表达至少两个多肽链导致高产量时，或当该比例不特别显著时，可能在一个表达载体中插入两个或所有三个多肽链的编码序列。
在一种方法中，双特异性抗体由一臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)所组成。在仅双特异性分子的一半中具有免疫球蛋白轻链的该不对称结构促进所需双特异性化合物与非所需的免疫球蛋白链组合分离。此方法描述于PCT公开号WO 94/04690。
本发明还提供组合物，其包含缀合(例如连接)至促进与固相支持物(诸如生物素或抗生物素蛋白)偶联的试剂的抗体。为了简单起见，一般将参考抗体，其中理解这些方法应用于本文所述的任何PD-1结合和/或拮抗剂实施方案的任一者。缀合一般是指如本文所述连接这些成分。该连接(其一般以近似缔合固定这些成分以至少用于施用)可以任何数目方式实现。例如，当试剂与抗体各自具有能够与彼此反应的取代基时，两者之间的直接反应是可能的。例如，在一者上的亲核基团，诸如氨基或巯基可能够与另一者上的含羰基基团，诸如酐或酸卤化物反应，或与含有良好离去基(例如卤化物)的烷基反应。
所述抗体可与许多不同载体结合。载体可以是活性和/或惰性的。众所周知的载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然和修饰纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。就本发明的目的而言，该载体的性质可以是可溶性或不溶性的。本领域技术人员知道其他用于结合抗体的适当载体，或将能够使用常规实验确认这一点。在一些实施方案中，该载体包含靶向肺、心脏或心脏瓣膜的部分。
本发明的抗体或多肽可连接至标记试剂，诸如荧光分子、放射性分子或任何其他本领域已知的标记物。标记物是本领域已知的，其一般提供(直接或间接)信号。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明也提供编码本文所述的任何抗体(包括抗体片段和修饰的抗体，诸如例如具有受损效应子功能的抗体)的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供一种制备本文所述的任何多核苷酸的方法。可通过本领域已知的程序制备和表达多核苷酸。因此，本发明提供多核苷酸或包括多核苷酸的组合物，包括药物组合物，所述多核苷酸编码下列的任一者：抗体mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13、mAb14、mAb15、mAb16和mAb17或其任何具有拮抗PD-1的能力的片段或部分。
本发明也涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，且可以是DNA(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其含有内含子且以一对一方式对应于DNA分子)和mRNA分子(其不包含内含子)。额外的编码或非编码序列可以、但不必存在于本发明的多核苷酸内，且多核苷酸可以、但不必连接至其他分子和/或支持物材料。
多核苷酸可包含天然序列(即编码抗体或其片段的内源性序列)或可包含此序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子不减少。对编码的多肽免疫反应性的影响可一般如本文所述评估。变体优选地展现与编码天然抗体或其片段的多核苷酸序列的至少约70%同一性，更优选地至少约80%同一性，又更优选地至少约90%同一性和最优选地至少约95%同一性。
如果在两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列当针对如下所述的最高对应性比对时是相同的，则两个序列被称为“相同”。两个序列之间的比较典型地通过在比较窗上比较序列以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域而进行。如本文所使用的“比较窗”是指至少约20个、通常30个至约75个或40个至约50个连续位置的区段，其中序列可与具有相同连续位置数目的参考序列在两个序列进行最佳比对后进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可使用Lasergene®生物信息软件包中的MegAlign®程序(DNASTAR®, Inc., Madison, WI)使用默认参数进行。此程序实施下列参考文献中描述的数种比对方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change inproteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff, M.O. (编)Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical ResearchFoundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods inEnzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G.和Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W.和Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987,Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A.和Sokal, R.R., 1973, NumericalTaxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press,San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 80:726-730。
优选地，“序列同一性的百分比”通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比对的序列而确定，其中在比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分当与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含20%或更低、通常5%至15%或10%至12%的添加或缺失(即缺口)。百分比通过如下计算：确定在该位置两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置数目，将匹配位置数目除以参考序列的位置总数(即窗的大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
变体也可或替代地与天然基因或其部分或互补物实质上同源。此类多核苷酸变体能够在中度严谨条件下与编码天然抗体的天然存在的DNA序列(或互补序列)杂交。
适当的“中度严谨条件”包括在5 X SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预先洗涤；在50℃至60℃、5 X SSC下杂交过夜；接着在65℃下以含有0.1% SDS的2 X、0.5X和0.2 X SSC各自洗涤20分钟两次。
如本文所使用的“高度严谨条件”或“高严谨性条件”是以下那些：(1)采用低离子强度和高温用于洗涤，例如在50℃下0.015 M氯化钠/0.0015 M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠；(2)在42℃下在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50%(体积/体积)甲酰胺，具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/含有750 mM氯化钠、75 mM柠檬酸钠的pH 6.5的50 mM磷酸钠缓冲液；或(3)在42℃下采用50%甲酰胺、5 X SSC(0.75 M NaCl、0.075 M柠檬酸钠)、50 mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5 X Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50µg/ml)、0.1% SDS和10%硫酸葡聚糖，并在42℃下在0.2 X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤和在55℃下以50%甲酰胺洗涤，之后由在55℃下含有EDTA的0.1 X SSC组成的高严谨度洗涤。本领域技术人员将认识到需要时如何调整温度、离子强度等以容纳因素诸如探针长度等。
本领域技术人员将理解的是，由于基因密码简并的结果，存在编码如本文所述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些带有与任何天然基因的核苷酸序列的最小同源性。然而，本发明特别考虑由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是作为一个或多个突变(诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代)的结果而改变的内源性基因。所得mRNA和蛋白可以、但不必具有改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)进行鉴定。
本发明的多核苷酸可使用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域众所周知的，而不必在本文中详细说明。本领域技术人员可使用本文提供的序列和市售DNA合成仪以产生所需的DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，包含所需序列的多核苷酸可被插入适合的载体中，该载体进而可被导入适合的宿主细胞用于复制和扩增，如在下面进一步讨论。多核苷酸可通过本领域已知的任何方法插入宿主细胞中。通过经由直接摄取、胞吞作用、转染、F交配(F-mating)或电穿孔导入外源性多核苷酸而转化细胞。一旦导入，该外源性多核苷酸可作为非整合性载体(诸如质粒)维持于细胞内或被整合至宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可使用本领域所众所周知的方法自宿主细胞分离。参见例如Sambrook等人,1989。
或者，PCR允许DNA序列的复制。PCR技术是本领域众所周知的，且描述于美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202，以及PCR：The Polymerase ChainReaction, Mullis等人编, Birkauswer Press, Boston, 1994。
可通过在适当载体中使用分离的DNA并将其插入适合的宿主细胞中而获得RNA。当细胞复制且DNA被转录成RNA时，接着RNA可使用本领域技术人员众所周知的方法分离，例如如Sambrook等人,1989 同上中所述。
适合的克隆载体可根据标准技术构建，或可选自本领域可用的大量克隆载体。尽管选择的克隆载体可根据意图使用的宿主细胞而变化，有用的克隆载体将一般具有自我复制的能力、可具有用于特定限制内切酶的单一目标和/或可带有可用于选择含有该载体的克隆的标记的基因。适合实例包括质粒和细菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)和其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体诸如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可得自商业供应商诸如BioRad、Strategene和Invitrogen。
进一步提供表达载体。表达载体一般是可复制的多核苷酸构建物，其含有根据本发明的多核苷酸。这暗示表达载体必须在宿主细胞中作为附加体或染色体DNA的必需部分而可复制。适合的表达载体包括但不限于质粒；病毒载体，包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒；粘粒和PCT公开号WO 87/04462中所公开的表达载体。载体成分一般可包括但不限于下列中的一者或多者：信号序列；复制起点；一种或多种标记基因；适合的转录控制元件(诸如启动子、增强子和终止子)。就表达(即翻译)而言，通常也需要一种或多种翻译控制元件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
含有感兴趣的多核苷酸的载体可通过大量适合手段的任一者导入宿主细胞，所述手段包括电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(例如其中该载体为感染性剂诸如牛痘病毒)。导入载体或多核苷酸的选择经常将取决于宿主细胞的特征。
本发明还提供包含本文所述的多核苷酸的任一者的宿主细胞。任何能够过表达异源性DNA的宿主细胞可用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还参见PCT公开号WO 87/04462。适合的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)和酵母(诸如酿酒酵母；裂殖酵母(S. pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K. lactis))。优选地，该宿主细胞以与宿主细胞中感兴趣的对应内源性抗体或蛋白(如果存在)相比约5倍、更优选10倍、甚至更优选20倍的水平表达cDNA。针对与PD-1或PD-1结构域特异性结合筛选宿主细胞通过免疫测定法或FACS实现。可鉴定过表达感兴趣的抗体或蛋白的细胞。
表达载体可用于直接表达抗PD-1拮抗剂抗体。本领域技术人员熟悉施用表达载体以在体内获得外源性蛋白的表达。参见例如美国专利号6,436,908；6,413,942；和6,376,471。表达载体的施用包括局部或全身性施用，包括注射、经口施用、粒子枪或经导管施用和外用施用。在另一个实施方案中，将表达载体直接施用至交感神经干或神经节，或施用至冠状动脉、心房、心室或心包膜中。
也可使用含有表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗性组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术描述于，例如Findeis等人, Trends Biotechnol., 1993, 11:202;Chiou等人, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct GeneTransfer, J.A. Wolff,编, 1994; Wu等人, J. Biol. Chem., 1988, 263:621; Wu等人,J. Biol. Chem., 1994, 269:542; Zenke等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87:3655; Wu等人, J. Biol. Chem., 1991, 266:338。在基因疗法方案中，对于局部施用，含有多核苷酸的治疗性组合物以约100 ng至约200 mg的DNA范围施用。约500 ng至约50mg、约1 μg至约2 mg、约5 μg至约500 μg和约20 μg至约100 μg的DNA浓度范围也可在基因疗法方案期间使用。治疗性多核苷酸和多肽可使用基因递送媒介物递送。该基因递送媒介物可以是病毒性或非病毒性起源(一般参见Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51;Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845; Connelly, Human Gene Therapy, 1995,1:185;和Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148)。此类编码序列的表达可使用内源性哺乳动物或异源启动子诱导。编码序列的表达可以是组成性或经调节的。
用于递送所需多核苷酸并在所需细胞中表达的基于病毒的载体是本领域众所周知的。示例性基于病毒的媒介物包括但不限于重组逆转录病毒(参见例如PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利号5,219,740和4,777,127；GB专利号2,200,651；和EP专利号0 345 242)、基于甲病毒的载体(例如辛德毕斯(Sindbis)病毒载体、塞姆利基森林病毒(Semlikiforest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见例如PCT公开号WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。也可采用连接至杀死的腺病毒的DNA的施用，如Curiel, Hum. Gene Ther.,1992, 3:147中所述。
也可采用非病毒性递送媒介物和方法，包括但不限于单独的连接至或未连接至杀死的腺病毒的聚阳离子性缩合的DNA(参见例如Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147)；配体连接的DNA(参见例如Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985)；真核细胞递送媒介物细胞(参见例如美国专利号5,814,482；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO95/30763和WO 97/42338)和核电荷中和或与细胞膜融合。也可采用裸DNA。示例性裸DNA导入方法描述于PCT公开号WO 90/11092和美国专利号5,580,859。可充当基因递送媒介物的脂质体描述于美国专利号5,422,120；PCT公开号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445和EP 0524968。其他方法描述于Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411和Woffendin,Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581。
组合物
本发明也提供药物组合物，其包含有效量的本文所述的抗PD-1抗体。本文中也描述此类组合物的实例以及如何配制。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种PD-1抗体。在其他实施方案中，抗PD-1抗体识别PD-1。在其他实施方案中，所述抗PD-1抗体是人类抗体。在其他实施方案中，所述抗PD-1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含能够触发所需的免疫反应(诸如抗体介导的裂解或ADCC)的恒定区。在其他实施方案中，所述抗PD-1抗体包含不触发不想要或非所需的免疫反应(诸如抗体介导的裂解或ADCC)的恒定区。在其他实施方案中，所述抗PD-1抗体包含所述抗体的一个或多个CDR(诸如一、二、三、四、五个或在一些实施方案中，所有六个CDR)。
应理解所述组合物可包含超过一种抗PD-1抗体(例如识别PD-1的不同表位的PD-1抗体的混合物)。其他示例性组合物包含超过一种识别相同的一个或多个表位的抗PD-1抗体，或结合不同PD-1表位的不同物种的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该组合物包含识别PD-1的不同变体的抗PD-1抗体的混合物。
本发明中所使用的组合物可进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington: The Science and practice of Pharmacy 第20版., 2000, LippincottWilliams and Wilkins,编 K. E. Hoover)，其呈冷冻干燥制剂或水性溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在剂量和浓度下对受体无毒性，且可包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子性表面活性剂诸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。本文中进一步说明药学上可接受的赋形剂。
所述抗PD-1抗体和其组合物也可与其他试剂结合使用、或分开、同时、或相继施用，所述其他试剂用于增强和/或补充所述试剂的有效性。
本发明也提供包含本发明的任何多核苷酸的组合物，包含药物组合物。在一些实施方案中，该组合物包含表达载体，该表达载体包含编码如本文所述的抗体的多核苷酸。在其他实施方案中，该组合物包含表达载体，该表达载体包含编码如本文所述的任何抗体的多核苷酸。
预防或治疗PD-1介导的病况的方法
本发明的抗体和抗体缀合物可用于各种应用，包括但不限于治疗性治疗方法和诊断性治疗方法。
在一个方面，本发明提供一种治疗癌症的方法。在一些实施方案中，该治疗个体的癌症的方法包括对有需要的个体施用有效量的包含如本文所述的任何PD-1抗体的组合物(例如，药物组合物)。如本文中所使用，癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食道癌、胃癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、脑肿瘤、头颈癌、肾癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、子宫癌、骨癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、血癌、甲状腺癌、胸腺癌、眼癌和皮肤癌。在一些实施方案中，提供了一种抑制个体的肿瘤生长或进展的方法，其包括对有需要的个体施用有效量的包含如本文所述的PD-1抗体或PD-1抗体缀合物的组合物。在一些实施方案中，所述癌症是表达PD-L1的肿瘤。在其他实施方案中，该肿瘤不表达PD-L1。在其他实施方案中，提供了一种抑制个体的癌细胞的转移的方法，其包括对有需要的个体施用有效量的包含如本文所述的任何PD-1抗体的组合物。在其他实施方案中，提供了一种诱导个体的肿瘤消退的方法，其包括对有需要的个体施用有效量的包含如本文所述的任何PD-1抗体的组合物。
在另一个方面，提供了一种检测、诊断和/或监测癌症的方法。例如，如本文所述的PD-1抗体可用可检测的部分诸如成像剂和酶-底物标记物进行标记。如本文所述的抗体也可用于体内诊断性测定法，诸如体内成像(例如PET或SPECT))或染色试剂。
在一些实施方案中，本文中描述的方法进一步包括以额外形式的疗法治疗个体的步骤。在一些实施方案中，额外形式的疗法是额外抗癌疗法，包括但不限于化学疗法、放射、外科手术、激素疗法和/或额外免疫疗法。
对于所有本文所述的方法，提及抗PD-1拮抗剂抗体，也包括包含一种或多种额外剂的组合物。这些组合物可进一步包含适合赋形剂，诸如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其是本领域众所周知的。本发明可单独或与其他治疗方法组合使用。
所述抗PD-1拮抗剂抗体可经由任何适合途径施用至个体。对本领域技术人员应当显而易见的是，本文中所述的实例不意图限制而是可用技术的说明。因此，在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体根据已知方法施用至个体，诸如静脉内施用，例如作为快速浓注或通过在一段时间连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、经皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内、经由吹入、鞘内、经口、吸入或外用途径。施用可以是全身性的，例如静脉内施用、或局部施用。用于液体制剂的市售雾化器，包括喷射雾化器和超声波雾化器可用于施用。液体制剂可直接雾化，且冷冻干燥的粉末可在重构后雾化。或者，抗PD-1拮抗剂抗体可使用氟碳制剂和定量吸入器雾化或作为冷冻干燥和磨细粉末吸入。
在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体经由位点特异性或靶向性局部递送技术施用。位点特异性或靶向性局部递送技术的实例包括各种抗PD-1拮抗剂抗体的可植入贮库来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管、或针导管、合成性移植物、外膜层包覆、分流器和支架或其他可植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接施用。参见例如PCT公开号WO 00/53211和美国专利号5,981,568。
抗PD-1拮抗剂抗体的各种制剂可用于施用。在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体可纯净地施用。在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体和药学上可接受的赋形剂可在各种制剂中。药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，且为有助于施用药理学有效物质的相对惰性物质。例如，赋形剂可给予形式或稠度，或充当稀释剂。适合的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿和乳化剂、用于改变摩尔渗透压浓度的盐类、包封剂、缓冲剂和皮肤穿透增强剂。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂阐述于Remington, TheScience and Practice of Pharmacy 第20版 Mack Publishing, 2000。
在一些实施方案中，这些试剂被配制用于通过注射施用(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内等)。因此，这些试剂可与药学上可接受的媒介物(诸如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液等)组合。特定剂量方案(即剂量、时机和重复性)将取决于特定个体和该个体的医学病史。
抗PD-1拮抗剂抗体可使用任何适合的方法施用，包括通过注射(例如腹膜内注射、静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射等)。如本文所述，抗PD-1抗体也可外用施用或经由吸入施用。通常，对于施用抗PD-1抗体，初始候选剂量可以是约2 mg/kg。就本发明的目的而言，取决于上述因素，典型的每日剂量可在约3 µg/kg至30µg/kg、至300µg/kg、至3 mg/kg、至30mg/kg、至100 mg/kg或更多的任一范围内。例如，可使用约1 mg/kg、约2.5 mg/kg、约5 mg/kg、约10 mg/kg和约25 mg/kg的剂量。对于在数天或更久的重复施用，取决于病况，治疗持续进行，直到发生所需的症状抑制或直到实现足够的治疗水平，例如以减少与癌症相关的症状。此疗法的进展容易通过常规技术与测定法监测。给药方案(包括使用的抗PD-1拮抗剂抗体)可随时间变化。
就本发明的目的而言，抗PD-1拮抗剂抗体的适合剂量将取决于所采用的抗PD-1拮抗剂抗体(或其组合物)、待治疗的症状的类型和严重性、以预防性还是治疗性目的施用试剂、先前疗法、患者的临床病史和对试剂的反应、患者清除施用的试剂的速率和主治医师的考虑。典型地临床医师将施用抗PD-1拮抗剂抗体，直到到达实现所需结果的剂量。剂量和/或频率可随治疗疗程而变化。经验性考虑诸如半衰期，一般将促成剂量的确定。例如，与人类免疫系统相容的抗体，诸如人源化抗体或全人类抗体，可用于延长所述抗体的半衰期和防止所述抗体被宿主的免疫系统攻击。施用频率可随疗法的疗程确定和调整，且一般但不必基于症状的治疗和/或抑制和/或改善和/或推迟。或者，抗PD-1拮抗剂抗体的持续性连续释放制剂可以是适当的。各种用于实现持续性释放的制剂和装置是本领域已知的。
在一个实施方案中，在已给予一次或多次拮抗剂抗体施用的个体中，可凭经验确定所述拮抗剂抗体的剂量。向个体给予渐增剂量的抗PD-1拮抗剂抗体。为了评估疗效，可追踪疾病的指标。
根据本发明的方法施用抗PD-1拮抗剂抗体可以是连续性或间歇性的，这取决于，例如受体的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性的和本领域技术人员已知的其他因素。抗PD-1拮抗剂抗体的施用可以基本上在预先选定的时间段是连续的，或可以是一系列间隔剂量。
在一些实施方案中，可存在超过一种抗PD-1拮抗剂抗体。可存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同或更多种拮抗剂抗体。通常，那些抗PD-1拮抗剂抗体可具有不会不利影响彼此的互补活性。抗PD-1拮抗剂抗体也可与其他抗体和/或其他疗法结合使用。抗PD-1拮抗剂抗体也可与其他试剂结合使用，所述其他试剂用以增强和/或互补所述试剂的有效性。
在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体可与施用一种或多种额外治疗剂组合施用。这些包括但不限于，施用化学治疗剂；疫苗；CAR-T基于细胞的疗法；放射疗法；细胞因子疗法；疫苗；抗PD-1双特异性抗体；其他免疫抑制途径的抑制剂；血管生成抑制剂；T细胞活化剂；代谢途径抑制剂；mTOR抑制剂；腺苷途径抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于阿西替尼(inlyta)、ALK抑制剂和舒尼替尼；BRAF抑制剂；表观遗传修饰剂；Treg细胞和/或骨髓衍生抑制细胞的抑制剂或耗尽剂；JAK抑制剂；STAT抑制剂；周期蛋白依赖性激酶抑制剂；生物治疗剂(包括但不限于VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其他生长因子受体、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS的抗体)；免疫原性剂(例如，减弱的癌细胞、肿瘤抗原、抗原递呈细胞诸如用肿瘤衍生抗原或核酸致敏的树突细胞、免疫刺激性细胞因子(例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF)和用编码免疫刺激细胞因子诸如但不限于GM-CSF的基因转染的细胞)。化学治疗剂的实例包括烷化剂诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和呱泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素；海绵多聚乙酰(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(尤其是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类诸如氮芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷酰胺、雌二醇氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲类诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如卡里奇霉素，尤其是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素phiI1，参见例如Agnew, Chem. Intl.编 Engl., 33:183-186 (1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白发色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素、卡拉星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括N-吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、PEG化的脂质体多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类诸如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺类诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类诸如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶(nitracrine)；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2, 2′,2″-三氯三乙胺；新月毒素类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托新(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；氮芥苯丁酸；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(Fareston)；抑制在肾上腺中调节雌激素产生的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、福美司坦、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素类诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体与一种或多种靶向免疫检查点调节剂的其他治疗剂结合使用，所述其他治疗剂诸如，例如但不限于靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、B7-H3、B7-H4、B7-DC(PD-L2)、B7-H5、B7-H6、B7-H8、B7-H2、B7-1、B7-2、ICOS、ICOS-L、TIGIT、CD2、CD47、CD80、CD86、CD48、CD58、CD226、CD155、CD112、LAIR1、2B4、BTLA、CD160、TIM1、TIM-3、TIM4、VISTA(PD-H1)、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、4-1BB、4-BBL、DR3、TL1A、CD40、CD40L、CD30、CD30L、LIGHT、HVEM、SLAM(SLAMF1、CD150)、SLAMF2(CD48)、SLAMF3(CD229)、SLAMF4(2B4、CD244)、SLAMF5 (CD84)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMCF7(CS1)、SLAMF8(BLAME)、SLAMF9(CD2F)、CD28、CEACAM1(CD66a )、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM1-3AS CEACAM3C2、CEACAM1-15、PSG1-11、CEACAM1-4C1、CEACAM1-4S、CEACAM1-4L、IDO、TDO、CCR2、CD39–CD73–腺苷途径(A2AR)、BTK、TIK、CXCR2、CCR4、CCR8、CCR5、VEGF途径、CSF-1的试剂、或固有免疫反应调节剂。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体与下列结合使用：例如，抗PD-L1拮抗剂抗体诸如例如，BMS-936559(MDX-1105)和MPDL3280A；抗PD-1拮抗剂抗体诸如例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和pidilizumab；抗CTLA-4拮抗剂抗体诸如例如，易普利单抗(ipilimumab)；抗LAG-3拮抗剂抗体诸如BMS-986016和IMP701；抗TIM-3拮抗剂抗体；抗B7-H3拮抗剂抗体诸如例如，MGA271；抗VISTA拮抗剂抗体；抗TIGIT拮抗剂抗体；抗CD28拮抗剂抗体；抗CD80抗体；抗CD86抗体；抗B7-H4拮抗剂抗体；抗ICOS激动剂抗体；抗CD28激动剂抗体；固有免疫反应调节剂(例如TLR、KIR、NKG2A)；和IDO抑制剂。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体与4-1BB(CD137)激动剂诸如例如PF-05082566或BMS-663513)结合使用。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂抗体与OX40激动剂(诸如例如抗OX-40激动剂抗体)结合使用。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体与GITR激动剂(诸如例如抗GITR激动剂抗体，诸如例如但不限于TRX518)结合使用。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体与IDO抑制剂结合使用。在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体与细胞因子疗法(诸如例如但不限于IL-15、CSF-1、MCSF-1等)结合使用。
在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体与一种或多种其他治疗抗体(诸如例如但不限于靶向CD19、CD22、CD40、CD52或CCR4的抗体)结合使用。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体疗法可早于或晚于其他试剂治疗范围为数分钟至数周的间隔。在其中分开施用其他试剂和/或蛋白或多核苷酸的实施方案中，本领域技术人员将一般确保在各递送之间不会经过一段显著时间，使得试剂与本发明的组合物将仍能够对个体发挥有利组合效果。在此类情况中，考虑本领域技术人员可在彼此约12至24小时内、更优选地在彼此的约6至12小时内，施用两种模式。然而，在一些情况中，可能期望显著地延长施用的时间段，其中在分别的施用之间经过数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在一些实施方案中，抗PD-1拮抗剂抗体组合物包含第二试剂，其选自克里唑替尼、帕博西尼、吉西他滨、环磷酰胺、氟尿嘧啶、FOLFOX、亚叶酸、奥沙利铂、阿西替尼、舒尼替尼苹果酸盐、托法替尼、贝伐单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体组合物与治疗方案组合，所述治疗方案进一步包含选自下列的传统疗法：外科手术、放射疗法、化学疗法、靶向性疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制和姑息疗法。
PD-1抗体在用于癌症的基于疫苗的免疫疗法方案中的用途
在一些特定实施方案中，本公开提供一种用于增强用于治疗哺乳动物、特别是人类的癌症的疫苗的免疫原性或治疗效应的方法，所述方法包括对接受疫苗的哺乳动物施用有效量的本公开所提供的抗PD-1拮抗剂抗体。在一些其他特定实施方案中，本公开提供一种用于治疗哺乳动物、特别是人类的癌症的方法，所述方法包括对哺乳动物施用(1)有效量的能够引发针对癌细胞的免疫反应的疫苗和(2)有效量的本公开所提供的抗PD-1拮抗剂抗体。在上面本文所述的治疗哺乳动物的肿瘤病症的方法和增强用于治疗哺乳动物的肿瘤病症的疫苗的免疫原性或治疗效应的方法被统称“用于癌症的基于疫苗的免疫疗法方案”(或“用于癌症的VBIR”)。
在用于癌症的VBIR中，疫苗可呈任何形式或制剂，诸如(i)基于细胞的疫苗、(ii)亚单位疫苗、(iii)基于蛋白的疫苗、(iv)基于肽的疫苗、或(v)基于核酸的疫苗(诸如基于DNA的疫苗、基于RNA的疫苗、基于质粒的疫苗、或基于病毒载体的疫苗)。
本公开所提供的用于癌症的VBIR可适用于任何类型的癌症。特定癌症的实例包括：小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、胃癌、胃肠道癌、肾癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌症、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌和头颈癌。
意图用于治疗癌症的疫苗典型地含有能够引发针对特定TAA的免疫反应的抗原(呈肽、蛋白、细胞成分、整个细胞或编码基于肽的抗原的核酸分子的形式)，所述TAA在目标肿瘤细胞上表达或被目标肿瘤细胞所表达。许多TAA是本领域已知的。已知TAA的实例包括：前列腺癌的PSA、PSCA和PSMA；结肠直肠癌的CEA、MUC-1、Ep-CAM、5T4、hCG-b、K-ras和TERT；卵巢癌的CEA、Muc-1、p53、间皮素、存活素和NY-ESO-1；非小细胞肺癌的Muc-1、5T4、WT-1、TERT、CEA、EGF-R和MAGE-A3；肾细胞癌的5T4；和胰腺癌的Muc-1、间皮素、K-Ras、膜联蛋白A2、TERT和CEA。在一些特定实施方案中，本公开所提供的用于癌症的VBIR中的疫苗选自下列：
(1) 能够引发针对TAA的免疫反应的疫苗，所述TAA选自PSA、PSCA、PSMA、CEA、MUC-1、TERT、间皮素、EGF-R、或MAGE-A3；
(2) 含有肽抗原的疫苗，所述肽抗原衍生自选自PSA、PSCA、PSMA、CEA、MUC-1、TERT、间皮素、EGF-R、或MAGE-A3的TAA；和
(3) 含有编码肽抗原的核酸分子的疫苗，其中所述肽抗原衍生自选自PSA、PSCA、PSMA、CEA、MUC-1、TERT、间皮素、EGF-R、或MAGE-A3的TAA。
在又其他特定实施方案中，所述疫苗含有编码一种或多种衍生自PSA的免疫原性多肽、一种或多种衍生自PSCA的免疫原性多肽、或一种或多种衍生自PSMA的免疫原性多肽的核酸分子。
在特定实施方案中，所述核酸分子选自下列：
(1) 编码衍生自SEQ ID NO: 42的人类PSMA的免疫原性多肽的核酸分子；
(2) 编码包含SEQ ID NO: 42的氨基酸15至750的免疫原性多肽的核酸分子；
(3) 包含SEQ ID NO: 43的核苷酸序列的核酸分子、或其简并变体；
(4) 包含SEQ ID NO: 44的核苷酸序列的核酸分子、或其简并变体；
(5) 包含SEQ ID NO: 45的核苷酸序列的核酸分子、或其简并变体；
(6) 包含SEQ ID NO: 46的核苷酸序列的核酸分子、或其简并变体；
(7) 编码衍生自SEQ ID NO: 47的人类PSA的免疫原性多肽的核酸分子；
(8) 编码包含SEQ ID NO: 47的氨基酸25至261的免疫原性多肽的核酸分子；
(9) 编码衍生自SEQ ID NO: 48的人类PSCA的免疫原性多肽的核酸分子；
(10) 编码下列的核酸分子：(i)衍生自SEQ ID NO: 42的人类PSMA的免疫原性多肽，(ii)衍生自SEQ ID NO: 47的人类PSA的免疫原性多肽，和(iii)衍生自SEQ ID NO: 48的人类PSCA的免疫原性多肽；和
(11) 编码下列的核酸分子：(i)包含SEQ ID NO: 42的氨基酸15至750的免疫原性多肽，(ii)包含SEQ ID NO: 47的氨基酸25至261的免疫原性多肽，和(iii)SEQ ID NO: 48的免疫原性多肽。
编码一种或多种衍生自前列腺相关抗原的免疫原性多肽的核酸分子可呈质粒或载体的形式。此种质粒的一种实例是SEQ ID NO: 46的核酸构建体(也称为质粒458)。表达衍生自人类PSMA的免疫原性多肽的载体的核苷酸序列列于SEQ ID NO: 44 (也称为载体AdC68W)。表达衍生自人类PSMA的免疫原性多肽，衍生自人类PSA的免疫原性多肽，和衍生自人类PSCA的免疫原性多肽的载体的核苷酸序列列于SEQ ID NO: 45和载体人类PSMA(载体AdC68W-734)。各种衍生自人类PSMA、PSA和PSCA的免疫原性多肽，编码此类免疫原性多肽的核酸构建体(包括质粒和载体)，和用于制备所述免疫原性多肽和所述核酸构建体(包括质粒458，和载体AdC68W和AdC68W-734)的方法，公开于国际申请公开WO2013/164754和WO2015/063647中，其各自通过引用以其整体并入本文。
在一个方面，本发明提供一种特异性结合PD-1的分离的拮抗剂抗体，其中所述抗体包含：重链可变区(VH)，其包含所述VH的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，所述VH具有选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含所述VL的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL具有选自SEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
任何本公开所公开的抗PD-1拮抗剂抗体可用在用于癌症的VBIR中。在一些实施方案中，所述抗PD-1拮抗剂抗体包含VH区和/或VL区，其中所述VH区包含示于SEQ ID NO: 3、4、5或6的氨基酸序列、或在非CDR内的残基中具有一个或几个保守氨基酸取代的变体，且其中所述VL包含示于SEQ ID NO: 2、7、8或9的氨基酸序列、或其在非CDR内的氨基酸中具有一个或几个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含示于SEQ ID NO: 39的序列的轻链和/或包含示于SEQ ID NO: 29或38的序列的重链。在一些特定实施方案中，所述抗体包含具有ATCC登录号PTA-121183的表达载体所产生的VH区。在一些实施方案中，所述抗体包含具有ATCC登录号PTA-121182的表达载体所产生的VL区。
本公开所提供的用于癌症的VBIR可进一步包含一种或多种其他免疫调节剂(除了本公开所提供的PD-1拮抗剂抗体之外)。其他免疫调节剂可以是免疫效应子-细胞增强剂(“IEC增强剂”)或免疫抑制细胞抑制剂(“ISC抑制剂”)。额外IEC增强剂或额外ISC抑制剂可单独或与用于癌症的VBIR组合使用。额外IEC增强剂和额外ISC抑制剂也可与用于癌症的VBIR一起组合使用。
ISC抑制剂类别的实例包括蛋白激酶抑制剂、环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、磷酸二酯酶5型(PDE5)抑制剂和DNA交联剂。COX-2抑制剂的实例包括塞来昔布和罗非昔布。PDE5抑制剂的实例包括阿伐那非、罗地那非、米罗那非、西地那非、他达拉非、伐地那非、乌地那非和扎普司特。DNA交联剂的实例是环磷酰胺。术语“蛋白激酶抑制剂”是指充当蛋白激酶的选择性或非选择性抑制剂的任何物质。适合用在用于癌症的VBIR中的特定蛋白激酶抑制剂的实例包括拉帕替尼、AZD 2171、ET18OCH 3、靛玉红-3'-肟、NSC-154020、PD 169316、槲皮素、罗斯维汀(Roscovitine)、曲西立滨、ZD 1839、5-碘杀结核菌素(5-Iodotubercidin)、Adaphostin、Aloisine、阿特波龙(Alsterpaullone)、氨基染料木黄酮(Aminogenistein)、API-2、芹菜甙元(Apigenin)、牛蒡甙元(Arctigenin)、ARRY-334543、阿西替尼(AG-013736)、AY-22989、AZD 2171、双吲哚基顺丁烯二酰亚胺IX、CC1-779、白屈菜红碱(Chelerythrine)、DMPQ、DRB、依地福新(Edelfosine)、ENMD-981693、制表菌素类似物(Erbstatin analog)、埃罗替尼(Erlotinib)、法舒地尔(Fasudil)、吉非替尼(ZD1839)、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil)、Kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、木樨草素、LY294002、LY-294002、粗糠紫毒素(Mallotoxin)、ML-9、MLN608、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星(Olomoucine)、羟吲哚I、PD 153035、PD 98059、根皮苷、 白皮杉醇(Piceatannol)、鬼臼苦素(Picropodophyllin)、PKI、PP1、PP2、PTK787/ZK222584、PTK787/ZK-222584、Purvalanol A、雷帕慕恩(Rapamune)、雷帕霉素(Rapamycin)、Ro 31-8220、Rottlerin、SB202190、SB203580、西罗莫司、SL327、SP600125、星形孢菌素(Staurosporine)、STI-571、SU1498、SU4312、SU5416、SU5416(Semaxanib)、SU6656、SU6668、syk抑制剂、TBB、TCN、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1024(Tyrphostin AG 1024)、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 490、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 825、酪氨酸磷酸化抑制剂AG957、U0126、W-7、渥曼青霉素(Wortmannin)、Y-27632、Zactima (ZD6474)、ZM 252868、吉非替尼(Iressa.RTM.)、舒尼替尼苹果酸盐(SUTENT；SU11248)、埃罗替尼(TARCEVA；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、卡拉替尼(CI 1033)、塞玛昔布(semaxinib) (SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、伊马替尼(Gleevec.RTM.；STI571)、达沙替尼(BMS-354825)、来氟米特(SU101)、凡德他尼(ZACTIMA；ZD6474)和尼罗替尼(nilotinib)。
在一些具体实施方案中，该酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼苹果酸盐、索拉非尼甲苯磺酸盐、或阿西替尼。由Pfizer Inc.以商品名SUTENT销售的舒尼替尼苹果酸盐在化学上被描述为(2S)-羟基-丁二酸与N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺化合物(1:1)的化合物。该化合物、其合成和特定多晶型物描述于美国专利号6,573,293。舒尼替尼苹果酸盐在美国已被批准用于治疗具有不可切除局部晚期或转移疾病的患者的胃肠道基质肿瘤、晚期肾细胞癌和进行性充分分化的胰脏神经内分泌肿瘤。用于人类胃肠道基质肿瘤(GIST)和晚期肾细胞癌(RCC)的舒尼替尼苹果酸盐的建议剂量为50 mg每日口服一次，时程为治疗4周，随后停止2周(时程4/2)。用于胰脏神经内分泌肿瘤的舒尼替尼苹果酸盐的建议剂量为37. 5 mg每日口服一次。在用于癌症的VNIR中，舒尼替尼苹果酸盐可以单一剂量或多剂量经口施用。通常，将舒尼替尼苹果酸盐递送二、三、四或更多连续每周剂量，随后为约1或2周或更多周“停止”期，其中不递送舒尼替尼苹果酸盐。在一个实施方案中，将剂量递送约4周，停止2周。经口施用于人类的舒尼替尼苹果酸盐的有效量典型地为低于每天每人40 mg，诸如每天每人37.5、31.25、25、18.75、12.5或6.25 mg。在一些实施方案中，以每天每人1至25 mg的范围经口施用舒尼替尼苹果酸盐。在一些其他实施方案中，以每天每剂量6.25、12.5或18.75 mg范围经口施用舒尼替尼苹果酸盐。其他剂量方案和变化是可预见的，并将通过医师指导来确定。
以商品名NEXAVAR销售的索拉非尼甲苯磺酸盐具有化学名称为4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺。其在美国中被批准用于治疗原发性肾癌(晚期肾细胞癌)和晚期原发性肝癌(肝细胞癌)。建议的每日剂量为400毫克，每日口服两次。在本公开所提供的用于癌症的VBIR中，经口施用的索拉非尼甲苯磺酸盐的有效量典型地为低于每天每人400 mg。在一些实施方案中，经口施用的索拉非尼甲苯磺酸盐的有效量在每天每人10至300 mg范围内。在一些其他实施方案中，经口施用的索拉非尼甲苯磺酸盐的有效量在每天每人10至200 mg之间，诸如每天每人10、20、60、80、100、120、140、160、180 或 200 mg。
以商品名INLYTA销售的阿西替尼具有化学名称为(N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫基]-苯甲酰胺。其被批准用于治疗在一次先前全身性疗法失败后的晚期肾细胞癌。起始剂量为5mg，每日口服两次。可基于个体安全性和耐受性作出剂量调整。在本公开所提供的用于癌症的VBIR中，经口施用的阿西替尼的有效量典型地为低于5 mg，每天两次。在一些其他实施方案中，经口施用的阿西替尼的有效量在1至5 mg之间，每天两次。在一些其他实施方案中，经口施用的阿西替尼的有效量在1、2、3、4或5 mg之间，每天两次。
可用于本公开所提供的用于癌症的VBIR中的IEC增强剂的实例包括TNFR激动剂、CTLA-4拮抗剂、TLR激动剂、其他PD-1拮抗剂(诸如BMS-936558和抗PD-1抗体CT-011)、程序性细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)拮抗剂(诸如BMS-936559)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)拮抗剂和含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子-3(TIM-3)拮抗剂。TNFR激动剂的实例包括OX40、4-1BB(诸如BMS-663513)、GITR(诸如TRX518)和CD40的激动剂。下文详细描述特定CD40激动剂的实例。
在某些其他实施方案中，额外免疫调节剂是抗CD40激动剂抗体。所述抗体可以是人类、人源化或部分人类嵌合抗CD40抗体。特定抗CD40单克隆抗体的实例包括 G28-5、mAb89、EA-5或S2C6单克隆抗体和CP870893。在一个特定实施方案中，所述抗CD40激动剂抗体是CP870893或达西珠单抗(dacetuzumab)(SGN-40)。
CP-870,893为全人类激动性CD40单克隆抗体，其已在临床上作为抗肿瘤疗法探究。CP-870,893的结构和制备公开于W02003041070中，其中抗体CP870,893被鉴定为抗体“21.4.1”。CP-870,893的重链和轻链的氨基酸序列分别列于WO2003040170中的SEQ ID NO:46和SEQ ID NO: 48，以及表7中。在临床试验中，CP870,893通过静脉内输注施用，剂量一般在每输注0.05至0.25 mg/kg的范围内。在本公开所提供的用于癌症的VBIR中，CP-870,893可皮内、皮下或外用施用。此方案中待施用的CP870893的有效量一般为低于0.2 mg/kg，典型地在0.01 mg至 0.15 mg/kg或0.05至0.1 mg/kg范围内。
达西珠单抗(也称为SGN-40或huS2C6；CAS编号88-486-59-9)是另一种抗CD40激动剂抗体，其已在用于顽固性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验中探究。在本公开所提供的用于癌症的VBIR中，达西珠单抗可皮内、皮下或外用施用。待施用的达西珠单抗的有效量一般为低于16 mg/kg，典型地在0.2 mg至 14 mg/kg、或0.5至8 mg/kg或1至5 mg/kg范围内。
在又其他实施方案中，该额外免疫调节剂是抗CTLA-4拮抗剂。适合的抗CTLA-4拮抗剂的实例包括抗CTLA-4抗体(诸如人类抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、抗CTLA-4结构域抗体)，和激动共刺激途径的CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是易普利单抗或曲美目单抗(Tremelimumab)。
易普利单抗(以YERVOY销售；也称为MEX-010、MDX-101，或通过其CAS注册号477202-00-9)在PCT公开号WO 01/14424(其通过引用以其整体和用于所有目的并入本文)中作为抗体10DI公开。包含易普利单抗的药物组合物的实例被提供于PCT公开号WO 2007/67959中。易普利单抗在美国被批准用于治疗不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤。在本发明所提供的方法中，易普利单抗可皮内或皮下施用。局部施用的易普利单抗的有效量典型地在每人5至200 mg/剂量的范围内。在一些实施方案中，易普利单抗的有效量在每人每剂量10至150 mg/剂量的范围内。在一些具体实施方案中，易普利单抗的有效量是每人约10、25、50、75、100、125、150、175或200 mg/剂量。
曲美目单抗(也称为CP-675,206)是全人类IgG2单克隆抗体且具有CAS号745013-59-6。曲美目单抗在美国专利号6,682,736(其通过引用以其整体和用于所有目的并入本文)中作为抗体11.2.1公开。在本发明所提供的用于癌症的VBIR中，曲美目单抗可静脉内、皮内或皮下施用。皮内或皮下施用的曲美目单抗的有效量典型地在每人5至200 mg/剂量的范围。在一些实施方案中，曲美目单抗的有效量在每人每剂量10至150 mg/剂量的范围内。在一些具体实施方案中，曲美目单抗的有效量为每人约10、25、50、75、100、125、150、175或200mg/剂量。
在又其他实施方案中，该额外免疫调节剂是Toll样受体(TLR)激动剂。术语“toll样受体激动剂”或“TLR激动剂”是指充当toll样受体(TLR)的激动剂的化合物。此包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10和TLR11的激动剂或其组合。
可用于本发明的方法中的TLR激动剂包括小有机分子和大生物分子两者。小分子TLR激动剂的实例包括4-氨基-α,α,2-三甲基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-乙醇、N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基]乙氧基-}乙基)-N-甲基吗啉-4-甲酰胺、l~(2~氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基-)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、N-[4-(4-氨基-2-乙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基)丁基]甲磺酰胺、N-[4-(4-氨基-2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基)丁基]甲磺酰胺和咪喹莫特(imiquimod)。一些尤其可用于本公开所提供的方法或方案中的TLR激动剂讨论于综述文件：Folkert Steinhagen,等人: TLR-based immune adjuvants. Vaccine 29 (2011): 3341-3355。在一些实施方案中，该TLR激动剂是TLR9激动剂，尤其是CpG寡核苷酸(或CpG.ODN)。CpG寡核苷酸是含有通过磷酸酯键连接的胞嘧啶和接着鸟嘌呤的短核酸分子，其中胞嘧啶的嘧啶环未被甲基化。可用于本公开所提供的方法中的特定CpG寡核苷酸的实例包括：
Figure 725335DEST_PATH_IMAGE018
Figure 368806DEST_PATH_IMAGE019
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。
CpG7909，一种合成的单链24聚体，已作为单一疗法和与化学治疗剂组合，以及作为针对癌症和传染病的疫苗的佐剂而广泛探究用于治疗癌症。在本公开所提供的方法中，CpG7909可通过注射至肌肉中或任何其他适合方法施用。为了与基于核酸的疫苗诸如DNA疫苗一起使用，可将CpG与该疫苗于单一制剂中共同配制并通过肌肉内注射偶联电穿孔而施用。通过肌肉内、皮内或皮下施用的CpG7909的有效量典型地在10 µg/剂量至10 mg/剂量的范围内。在一些实施方案中，CpG7909的有效量在0.05 mg至14 mg/剂量的范围内。在一些具体实施方案中，CpG7909的有效量是约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、05、1 mg/剂量。其他CpG寡核苷酸，包括CpG 24555和CpG10103，可以类似方式和剂量水平施用。
在用于癌症的VBIR中，所述抗PD-1拮抗剂、疫苗和额外免疫调节剂可同时或依次施用。在一些实施方案中，疫苗相对于所述抗PD-1拮抗剂抗体依次施用，但相对于一种或多种额外免疫调节剂同时(例如，在混合物中)施用。在其中核酸疫苗与CpG组合施用的情况中，该疫苗和CpG可在单一制剂中含有且通过任何适合方法一起施用。在一些实施方案中，共制剂(混合物)中的核酸疫苗和CpG通过肌肉内注射组合电穿孔施用。
制剂
根据本发明所使用的抗PD-1拮抗剂抗体的治疗制剂通过混合具有所需纯度程度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington, The Science andPractice of Pharmacy 第20版. Mack Publishing, 2000)制备用于以冷冻干燥制剂或水性溶液的形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒性，且可包含缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐类诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白络合物)；和/或非离子性表面活性剂诸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
含有抗PD-1拮抗剂抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang,等人, Proc. Natl Acad.Sci. USA 77:4030 (1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。特别有用的脂质体可通过反相蒸发方法用脂质组合物产生，该脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。将脂质体挤压通过具有定义的孔径大小的过滤器以产生具有所需直径的脂质体。
活性组分也可被捕获于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊中，例如分别于羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中、于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或于巨乳液中。此类技术公开于Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版. Mack Publishing(2000)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质呈成形物品的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)所组成的可注射微球)、蔗糖乙酸酯异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易地通过，例如过滤通过无菌过滤膜来完成。治疗性抗PD-1拮抗剂抗体组合物一般置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
根据本发明的组合物可呈单位剂量形式，诸如锭剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、溶液、悬浮液或栓剂，用于经口、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物诸如锭剂，主要活性组分与药物载体，例如常规的制锭组分诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶；和其他药物稀释剂，例如水混合，以形成含有本发明的化合物或其非毒性药学上可接受的盐的均质混合物的固体预制剂组合物。当提及这些预制剂组合物为均质时，意指该活性组分均匀分散于整个该组合物内，使得该组合物可被容易地细分成同样有效的单位剂量形式诸如锭剂、丸剂和胶囊。此固体预制剂组合物接着被细分成上述类型的单位剂量形式，其含有约0.1至约500 mg的本发明的活性组分。新颖组合物的锭剂或丸剂可被包衣或以其他方式复合以提供具有长效优点的剂型。例如，该锭剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量成分，后者呈前者的包膜的形式。该两种成分可通过肠溶层分开，该肠溶层用来抵抗胃中的崩解，且允许内部成分完整通过到达十二指肠或被延迟释放。各种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸和聚合酸与材料诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。
适合的表面活性剂尤其包括非离子性剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。含有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05%至5%之间的表面活性剂，且可在0.1%至2.5%之间。将理解，如果需要的话，可添加其他组分，例如甘露醇或其他药学上可接受的媒介物。
可使用市售脂肪乳液诸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM制备适合的乳液。可将活性组分溶解于预先混合的乳液组合物中，或者替代地可将其溶解于油(例如大豆油、红花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，并且一旦与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合就形成乳液。将理解，可添加其他组分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳液的张力。适合的乳液典型地将含有最高20%，例如5至20%之间的油。脂肪乳液可包含在0.1与1.0 μm之间，尤其是0.1与0.5 μm之间的脂肪液滴，且具有5.5至8.0范围内的pH。
乳液组合物可以是通过混合抗PD-1拮抗剂抗体与IntralipidTM或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)所制备的那些。
用于吸入或吹入的组合物包括药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，和粉末。液体或固体组合物可含有如前述的适合的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，为了局部或全身性效应，组合物通过经口或经鼻呼吸途径施用。在优选无菌药学上可接受的溶剂中的组合物可通过使用气体进行雾化。雾化的溶液可从雾化装置直接吸入，或雾化装置可附接至面罩、帷幕或间歇性正压呼吸器。溶液、悬浮液或粉末组合物可从装置优选地经口或经鼻施用，该装置以适当方式递送制剂。
试剂盒
本发明还提供包含任何或所有本文所述的抗体的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个包含本文所述的抗PD-1拮抗剂抗体的容器，和根据本文所述的本发明方法中的任一者的使用说明书。通常，这些说明书包含施用用于上述治疗性治疗的抗PD-1拮抗剂抗体的说明书。在一些实施方案中，提供试剂盒用于产生单一剂量施用单位。在某些实施方案中，该试剂盒可以含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器两者。在一些实施方案中，包括含有单个或多个室预先填充的注射器(例如液体注射器和冻干剂注射器)的试剂盒。
在一些实施方案中，所述抗体是人类抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。关于使用抗PD-1抗体的说明书一般包括用于意图治疗的剂量、给药时程和施用途径的信息。所述容器可以是单位剂量、大量包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。提供于本发明的试剂盒中的说明书通常是在标记或包装插页上的书面说明书(例如包括在试剂盒中的纸页)，但机器可读取的说明书(例如磁性或光学储存磁盘上携带的说明书)也是可接受的。
本发明的试剂盒在适合包装中。适合的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如密封的Mylar或塑料袋)等。还考虑用于与特定装置组合使用的包装，诸如吸入器、经鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置诸如小型泵。试剂盒可具有无菌入口(例如该容器可以是具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。该容器也可具有无菌入口(例如该容器可以是具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂是抗PD-1抗体。该容器可进一步包含第二药物活性剂。
试剂盒可任选地提供额外成分，诸如缓冲剂和解释信息。通常，该试剂盒包含容器和该容器上或与该容器结合的标记或包装插页。
生物保藏
本发明的代表性材料于2014年4月29保藏于美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA)。具有ATCC登录号PTA-121182的载体msb7-LC是编码mAb7轻链可变区的多核苷酸，且具有ATCC登录号PTA-121183的载体mab7-HC是编码mAb7重链可变区的多核苷酸。根据布达佩斯条约对于国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的规定和其细则(布达佩斯条约)作出保藏。这确保将保藏物的活培养物维持自保藏日开始30年。保藏物将根据布达佩斯条约的条款由ATCC提供，并服从Pfizer,Inc.与ATCC的协议，该合约确保当签发相关美国专利或公开于任何美国或外国专利申请时(以先到者为主)，保藏物的培养子代可永久且不受限制地由公众使用，且确保由美国专利商标局局长根据35 U.S.C.122和该局长所根据的法则(包括37 C.F.R.1.14，特别参照886OG 638)确定有权获得子代。
本申请的被许可人已同意，如果保藏的材料的培养物应当在适当条件下培养时死亡或遗失或毁损，则将在通知后应立即用另一相同材料取代该材料。不应将保藏材料的可得性视为可藉以实施本发明而侵犯由任何政府机关依据专利法所授予的权利的许可。
提供下列实施例仅用于说明目的，而不意图以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了在本文中显示和描述的那些外，本发明的各种修饰将为本领域技术人员从前述说明而显而易见且落入随附权利要求的范围内。
实施例
实施例1：抗PD-1抗体对IFN-γ与TNF分泌的效应
本实施例说明，在混合的淋巴细胞反应(MLR)测定法中，抗PD-1抗体对IFN-γ与TNF分泌的效应。
自全血(斯坦福大学血库)分离的原代人类T细胞，通过表达高水平PD-L1和PD-L2的同种异型树突细胞(DC)活化，该树突细胞先前使用IL-4和GM-CSF自CD14+骨髓细胞分化而得。在此研究中，使用下述抗体：同种型对照(稳定的IgG4κ绞链)、抗PD-1拮抗剂抗体C1、抗PD-1拮抗剂抗体C2、抗PD-1拮抗剂抗体C3、EH12.1(BD Biosciences 小鼠抗人类抗PD-1抗体，小鼠同种型IgG1κ)、mAb7-G4、mAb15-G4、mAb-AAA、mAb15-AAA(G4=稳定的IgG4绞链；AAA=突变体IgG1，其不结合FcγR)。在下列浓度测试抗体：0、0.1、1或10 μg/ml)。
对于MLR测定法，培养物系与测试或对照抗体培养于96孔板中，一式三份，以1：10的DC：T细胞比率，且培养于37℃具有5% CO2的潮湿培养器中。在第5天收获上清液，且根据制造商的方案使用人类可溶性蛋白Flex组系统试剂盒(Human Soluble Protein Flex SetSystem kit)(BD Biosciences，目录号：558265)，以下列人类分析物使用细胞计数珠阵列法(CBA)测量细胞因子：IFNγ(BD Biosciences，目录号：558269)，TNF (BD Biosciences，目录号：558273)。简言之，96孔滤板(Millipore，目录号：MSBVN1250)以洗涤缓冲液(BDBiosciences专有配方)洗涤，且通过真空歧管吸除。将试剂盒所提供的标准品和样品稀释于测定稀释剂(BD Biosciences专有配方)中且添加至具有捕获珠的板中(捕获珠是包被有抗特定可溶蛋白的抗体，该抗体包被有区别荧光剂)。使用板震荡器以500rpm将板混合5分钟，并在室温培养1小时。将检测试剂(藻红素(PE)-缀合的抗体，由试剂盒所提供)添加至板中并将板混合5分钟。在室温培养板2小时。接着以洗涤缓冲液洗涤5分钟，且样品在BDFortessa平台上获取数据。使用FCAP阵列v3(BD)分析数据。MLR测定法的结果显示于下表6A和6B中。表6A显示IFNγ水平(单位pg/ml)，而表6B显示TNF水平(单位pg/ml)。数据以生物一式三份的平均值±S.E.M表示。样品为一次MLR实验的代表。
表6A：IFNγ分泌
Figure 495211DEST_PATH_IMAGE021
表6B：TNF分泌
Figure 574025DEST_PATH_IMAGE022
Figure 652096DEST_PATH_IMAGE023
与同种型对照相比，以抗PD-1拮抗剂抗体处理活化的T细胞导致增加的IFNγ水平(表6A)。例如，以0.1 μg/ml mAb15-G4和mAb7-G4处理导致IFNγ水平分别为4728.295 ±2.035 pg/ml和8567.203 ± 2085.826 pg/ml。以1 μg/ml mAb15-G4和mAb7-G4处理导致IFNγ水平分别为8893.595 ± 365.125 pg/ml和11876.86 ± 1259.788 pg/ml。以10 μg/ml mAb15-G4和mAb7-G4处理导致IFNγ水平分别为7790.95 ± 1700.012 pg/ml和11794.82 ± 1827.243 pg/ml。相比之下，以0.1、1或10 μg/ml同种型对照处理导致IFNγ水平分别为3760 ± 367.4262 pg/ml、3693.972 ± 1033.879 pg/ml和3525.655 ±744.676 pg/ml。
与同种型对照相比，以抗PD-1拮抗剂抗体处理活化的T细胞导致增加的TNF水平(表6 B)。例如，以0.1 μg/ml mAb15-G4和mAb7-G4处理导致TNF水平分别为743.1167 ±56.75547 pg/ml和730.47 ± 33.35488 pg/ml。以1 μg/ml mAb15-G4和mAb7-G4处理导致TNF水平分别为686.32 ± 45.63348 pg/ml和793.05 ± 21.19019 pg/ml。以10 μg/mlmAb15-G4和mAb7-G4处理导致TNF水平分别为798.853 ± 9.14366 pg/ml和930.623 ±16.0494 pg/ml。相比之下，以0.1、1或10 μg/ml同种型对照处理导致TNF水平分别为407.4133 ± 49.58195 pg/ml、486.7167 ± 4.4241 pg/ml和501.17 ± 5.033334 pg/ml。
这些结果证实，抗PD-1抗体mAb7和mAb15刺激T细胞分泌IFNγ与TNF与抗PD-1抗体C1、C2和C3相比至少一样好或更好。
进行第二MLR研究以测试较低抗体浓度对T细胞活化的效应。自全血分离的原代人类T细胞，如上所述活化。在第二研究中，测试下述抗体：mAb7(G4)、mAb15(G4)、C1(G4)、EH12.1和G4同种型对照。在下列浓度测试抗体：0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10 μg/ml。如上所述进行MLR测定法。结果概述于下表中7A和7B中。
表7A：IFNγ分泌
Figure 423743DEST_PATH_IMAGE024
表7B：TNF分泌
Figure 374382DEST_PATH_IMAGE025
与同种型对照相比，以抗PD-1拮抗剂抗体处理活化的T细胞导致增加的IFNγ水平(表7A)。在没有抗体的培养物中，IFNγ水平为901.453 ± 216.472 pg/ml。在给予0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10 μg/ml同种型对照抗体的培养物中，IFNγ水平分别为558.9629 ±489.4828 pg/ml、753.3767 ± 291.6092 pg/ml、1074.37 ± 324.2031 pg/ml、1667.96± 144.7286 pg/ml、1867.96 ± 282.7461 pg/ml、2501.293 ± 220.1829 pg/ml。相比之下，在以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10 μg/ml mAb7 (G4)处理的培养物中，IFNγ水平分别为2082.07 ± 720.9931 pg/ml、3062.09 ± 370.2791 pg/ml、5067.823 ± 111.4903pg/ml、7082.667 ± 1336.082 pg/ml、11928.81 ± 1457.723 pg/ml、11862.13 ±800.586 pg/ml。在以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10 μg/ml mAb15 (G4)处理的培养物中，IFNγ水平分别为1678.27 ± 233.82 pg/ml、1410.758 ± 439.9474 pg/ml、4734.49 ±322.2087 pg/ml、5416 ± 1054.075 pg/ml、9140.337 ± 1320.499 pg/ml和10992.13 ±1008.533 pg/ml。
与同种型对照相比，以抗PD-1拮抗剂抗体处理活化的T细胞导致增加的TNF水平(表7B)。在没有抗体的培养物中，TNF水平为365.523 ± 84.6607 pg/ml。在以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10 μg/ml同种型对照抗体处理的培养物中，TNF水平分别为452.7133± 62.85 pg/ml、282.9287 ± 56.77266 pg/ml、310.9144 ± 21.7811 pg/ml、358.948± 81.09122 pg/ml、338.1107 ± 46.88385 pg/ml和331.008 ± 31.35559 pg/ml。相比之下，在以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10 μg/ml mAb7 (G4)处理的培养物中，TNF水平分别为227.6 ± 50.63436 pg/ml、394.4233 ± 30.47005 pg/ml、452.65 ± 30.64335 pg/ml、1089.377 ± 174.7824 pg/ml、1583.52 ± 267.2131 pg/ml和1419.88 ± 108.711pg/ml。在给予0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10 μg/ml mAb15 (G4)的培养物中，TNF水平分别为494.7967 ± 48.1810 pg/ml、489.2333 ± 30.63302 pg/ml、593.34 ± 65.87622pg/ml、811.16 ± 89.50238 pg/ml、1143.54 ± 136.3954 pg/ml和1109.063 ±57.70232 pg/ml。
这些结果证实抗PD-1抗体mAb7和mAb15阻断PD-1信号传导且促进原代人类T细胞分泌IFNγ与TNF。
实施例2：抗PD-1抗体对T细胞增殖的效应
本实施例说明抗PD-1抗体对T细胞增殖的效应。
在此研究中，T细胞增殖在MLR测定法中测量，其中T细胞在抗PD-1拮抗剂或同种型对照抗体存在的情况下培养。
对于MLR，自全血(自斯坦福大学血库获得)分离的原代人类T细胞，通过表达高水平PD-L1和PD-L2的同种异型树突细胞(DC)活化，该树突细胞先前使用IL-4和GM-CSF自CD14+骨髓细胞分化而得。进行两个实验。
在第一实验中，比较mAb7 (稳定的IgG4κ绞链)、mAb15 (稳定的IgG4κ绞链)、C1、EH12.1和同种型对照。在第二实验中，比较克隆mAb7、mAb15、C2、EH12.1和同种型对照。在这两个实验中，抗体都以下列浓度添加：0、0.0001；0.001；0.01；0.1；1和10 μg/ml。
对于两个实验，培养物与抗体培养于96孔板中，一式三份，以1：10 DC：T细胞的比率，且培养于37℃具有5% CO2的潮湿培养器中。在第5天，培养物以每孔1 µCi的[3H]-胸苷在收获前脉冲18 h。接着板使用Harvester96 (Tomtec Life Sciences)在DNA特异性滤纸(Perkin Elmer)上收获。以β闪烁液体(Perkin Elmer)覆盖放射性标记的滤纸且于Microbeta®计数器板(Perkin Elmer)中读取。将胸苷掺入以每秒计数(CPM)分析。结果以一式三份的平均值±SEM显示。
表8A
Figure 53625DEST_PATH_IMAGE027
表8B
Figure 219158DEST_PATH_IMAGE029
与同种型对照相比，以浓度为0.01 μg/ml或更高的抗PD-1拮抗剂抗体处理活化的T细胞，导致显著增加的T细胞增殖(表8A和8B)。
例如，以0.01、0.1、1或10 μg/ml mAb7处理，导致胸苷掺入率分别为365625.3 ±30171.07 CPM、380054.3 ± 9774.328 CPM、392256.7 ± 15341.19 CPM和372889.7 ±14826.49 CPM(表8B)。以0.01、0.1、1或10 μg/ml mAb15-G4和mAb7处理，导致胸苷掺入率分别为317377 ± 31915.29 CPM、360226.3 ± 1802.69 CPM、421229 ± 27865.13 CPM和323441.3 ± 64476.55 CPM(表8B)。相比之下，以0.01、0.1、1或10 μg/ml同种型对照处理，导致胸苷掺入率分别为278072.3 ± 32671.62 CPM、268939.7 ± 12332.06 CPM、241164± 13776.81 CPM和231897.7 ± 25865.95 CPM(表8B)。
这些结果证实抗PD-1抗体mAb7和mAb15阻断PD-1信号传导且促进自原代人类T细胞增殖。
实施例3：在GvHD小鼠模型中抗PD-1抗体的效应
本实施例说明，在移植物抗宿主疾病(GvHD)小鼠模型中，抗PD-1抗体对T细胞增殖和体重减轻的效应。
在此研究中，使用NOD-scid-IL-2受体γ链裸(NSG)小鼠，以测试抗PD-1拮抗剂抗体在体内对T细胞增殖的效应。因为NSG小鼠缺乏T细胞和B细胞，且具有受损的NK细胞，可容易实现人类细胞的高移植。当人类PBMC移植入这些小鼠中时，发生人类T细胞增殖且诱导GvHD。该GvHD涉及宿主的骨髓隔室以及人类细胞。在早期阶段，人类淋巴细胞的大量增殖可见于血液中，随后这些细胞高浸润至小鼠器官中，诸如肝、脾、肾、肠等，导致小鼠的体重减轻以及皮肤病变、驼背和死亡。该模型的严重度取决于供体PBMC，且可在供体间不同。
在此研究中，使用下列抗PD-1拮抗剂抗体：mAb7(稳定的人类IgG4绞链或AAA)、mAb15(稳定的人类IgG4绞链)、C1、C2和C3。对于阴性对照，使用同种型对照人类IgG4绞链稳定的抗体。使用Ficoll梯度，自全血(斯坦福大学血库)分离的原代人类PBMC。将107个人类PBMC注射入NSG小鼠中(雌性，8周龄，Jackson Laboratories)。在第0天，基于体重将小鼠随机化，且静脉内注射PBMC。对于实验1至4，在第2天与第8天，以10 mg/kg腹膜内施用抗体。对于实验5，在第2天与第8天，以1 mg/kg或10 mg/kg腹膜内施用抗体。表9概述各实验中所用的抗体。
表9：实验1-5中所用的抗体
Figure 161706DEST_PATH_IMAGE030
周期地测量体重。结果概述于图1A至1E中。对小鼠周期地抽血以评估T细胞增殖。以抗PD-1抗体处理加剧疾病过程，如通过体重减轻速率所测量。与对照小鼠相比，以抗PD-1拮抗剂抗体处理的小鼠具有更快速的体重减轻(图1A至1E)。
人类T细胞增殖通过流式细胞仪使用CD45作为标记(克隆HI30；BD Biosciences)测量。流式细胞仪的结果概述于下表10中。在以抗PD-1拮抗剂抗体处理的小鼠中的T细胞增殖高于以同种型对照处理的小鼠中。较高百分比的CD45表明较高水平的CD45细胞增殖且因此更严重的GvHD。
在实验1中，在对照小鼠中的CD45阳性血液细胞的百分比为63.86%(表10)。相比之下，在以抗PD-1抗体mAb7、mAb15、C1或mAb7-AA处理的小鼠中的CD45阳性血液细胞的百分比分别为80.34%、77.62%、77.26%和76.9%(表10)。
表10：通过CD45的存在测量的T细胞增殖，动物经处理
Figure 599641DEST_PATH_IMAGE031
Figure 82575DEST_PATH_IMAGE032
总之，与以同种型对照处理的小鼠相比，以抗PD-1抗体处理的小鼠具有更快速的体重减轻和增加的T细胞增殖。这些结果证实以抗PD-1抗体处理刺激体内人类T细胞增殖。
实施例4：抗PD-1抗体的结合
本实施例说明在活化的人类T细胞和猕猴(cyno)T细胞上的抗PD-1抗体结合。
根据制造商的方案(Miltenyi Biotec；130-096-353)，使用人类PAN T细胞分离试剂盒自PBMC(斯坦福大学血库)分离原代人类T细胞。Cyno PBMC购自(BioreclamationIVT)，而PAN T细胞使用非人类灵长类动物PAN T细胞分离试剂盒根据制造商的方案(Miltenyi Biotec; 130-091-993)分离。人类T细胞以用于细胞扩增和活化的DYNABEADS™人类T-活化剂CD3/CD28(Life Technologies; 11131D)活化3天。所用的珠：细胞比分别为1：1珠:T细胞。Cyno T细胞使用T细胞活化/扩增试剂盒，非人类灵长类动物，根据制造商的方案(Miltenyi Biotec; 130-092-919)活化3天。所用的珠:细胞比分别为1：1的珠:T细胞。3天后收获培养物，并使用磁力将珠与活化的T细胞分离。细胞经洗涤且与FACS缓冲液(包括2%FBS)和人类Fc受体结合抑制剂(Affymetrix eBioscience目录号16-9161-73)培养。对于cyno细胞，使用Fc阻断试剂(BD Biosciences目录号564765)。细胞于室温培养10分钟，且接着以排除死细胞的活死色料(LIVE/DEAD®可固定蓝色死细胞染色试剂盒(Fixable Blue Dead Cell Stain Kit) ，用于UV激发；目录号：A10346))染色再5分钟。添加抗PD-1抗体(在细胞上培养一定浓度的抗PD-1克隆，系列稀释比为1:3，开始于10 μg/ml至0 μg/ml)，各反应使用1x106个细胞，总共100 μl，且细胞在冰上培养30分钟。接着细胞以FACS缓冲液洗涤，以移除一级抗体的接近和与缀合有别藻蓝素(APC)的抗人类(AffiniPureF(ab')2片段驴抗人类IgG (H+L)二级抗体；目录号709-136-149)培养。在冰上，将细胞染色30分钟。在冰上洗涤和保持细胞直到使用BD LSRFortessa细胞分析仪(BD Biosciences，目录号647465)读取。使用FlowJo™软件分析数据。结果概述于图2A和2B中。
图2A显示抗PD-1抗体结合人类活化的细胞所测量的EC50，而图2B显示抗PD-1抗体结合猕猴活化的细胞所测量的EC50。抗PD-1抗体mAb7和C1以相似EC50结合活化的T细胞(图2A和2B)。
实施例5：抗PD-1抗体抑制PD-L1结合
本实施例说明抗PD-1抗体抑制PD-1配体(PD-L1)结合。
根据制造商的方案(Miltenyi Biotec；130-096-353)，使用人类PAN T细胞分离试剂盒自PBMC(斯坦福大学血库)分离原代人类T细胞。Cyno PBMC购自(BioreclamationIVT)，而PAN T细胞使用非人类灵长类动物PAN T细胞分离试剂盒根据制造商的方案(Miltenyi Biotec; 130-091-993)分离。人类T细胞以用于细胞扩增和活化的DYNABEADS™人类T-活化剂CD3/CD28(Life Technologies; 11131D)活化3天。所用的珠：细胞比分别为1：1。Cyno T细胞使用T细胞活化/扩增试剂盒，非人类灵长类动物，根据制造商的方案(Miltenyi Biotec; 130-092-919)活化3天。所用的珠:细胞比分别为1：1。3天后收获培养物，并使用磁力将珠与活化的T细胞分离。细胞经洗涤且与FACS缓冲液(包括2%FBS)和人类Fc受体结合抑制剂(Affymetrix eBioscience目录号16-9161-73)培养。对于cyno细胞，使用Fc阻断试剂(BD Biosciences目录号564765)。细胞于室温培养10分钟，且接着以排除死细胞的活死色料(LIVE/DEAD®可固定蓝色死细胞染色试剂盒(Fixable Blue DeadCell Stain Kit) ，用于UV激发；目录号：A10346))染色再5分钟。以10 ng/ml的人类重组PD-L1 Fc (R&D Systems，目录号156-B7)或单独缓冲剂与细胞培养。将各配体个别培养且在冰上培养30分钟。接着将细胞洗涤并与抗PD-1抗体(在细胞上培养一定浓度的抗PD-1克隆，系列稀释比为1:3，开始于1 μg/ml至0 μg/ml)，各反应使用1x106个细胞，总共100 μl，且细胞在冰上培养30分钟。接着细胞以FACS缓冲液洗涤，以移除一级抗体的接近和与缀合有别藻蓝素(APC)的抗人类κ (Life Technologies；目录号MH10515)培养。在冰上，将细胞染色30分钟，接着在冰上洗涤和保持直到使用BD LSRFortessa细胞分析仪(BDBiosciences，目录号647465)读取。使用FlowJo™软件分析数据，并于FlowJo™软件中计算在活细胞上APC染色的平均荧光强度(MFI)和几何平均值(Geo.M)。在计算Geo平均值后，使用GraphPD Prism软件计算IC50。结果概述于表11和12中。
表11：抗PD-1阻断PD-L1结合人T细胞上的PD-1
Figure 555144DEST_PATH_IMAGE033
表12：抗PD-1阻断PD-L1结合猕猴T细胞上的PD-1
Figure 668594DEST_PATH_IMAGE034
这些结果证明抗PD-1抗体mAb7和C1以相似IC50抑制PD-L1结合人类和cyno T细胞。
实施例6：抗PD-1抗体对T细胞增殖的效应
本实施例说明抗PD-1抗体对T细胞增殖的效应。
CD4和CD8(AllCells, LLC)以DYNABEADS™人类T-活化剂CD3/CD28(或细胞扩增和活化(Life Technologies; 11131D)活化2天。所用的珠:细胞比分别为1：1以诱导PD-1。在第2天收获培养物，并使用磁力将珠与活化的T细胞分离。接着细胞在表达PD-L1树突细胞上活化且细胞与1 μg/ml的不同抗PD-1克隆培养于96孔板中，一式三份，以1：10 DC：T细胞的比率，且培养于37℃具有5% CO2的潮湿培养器中。在第3天，培养物以每孔1 µCi的[3H]-胸苷在收获前脉冲18 h。接着板使用Harvester96 (Tomtec Life Sciences)在DNA特异性滤纸(Perkin Elmer)上收获。以β闪烁液体(Perkin Elmer)覆盖放射性标记的滤纸且于Microbeta®计数器板(Perkin Elmer)中读取。将胸苷掺入以每秒计数(CPM)分析。在图3和4中，结果以一式三份的平均值±SEM显示。
实施例7：测定人类、猕猴和小鼠PD-1与人源化抗PD-1抗体相互作用的动力学和亲 和力
本实施例说明抗PD-1抗体与人类、猕猴或小鼠PD-1的结合。
除非另有表明，所有相互作用分析于25℃在无标记生物传感器上进行。使用表面等离子共振生物传感器(来自BioRad™的ProteOn-XPR™，和来自GE Life Sciences的Biacore 2000™与Biacore T200™)来研究人类和猕猴PD-1，且使用生物层干涉生物传感器(Octet-Red384, Fortebio/Pall Life Sciences)来研究小鼠PD-1。ProteOn实验在PBS，pH 7.4 + 0.01% Tween-20 (PBST)运行缓冲液中进行。Biacore实验在10 mM Hepes，pH7.4，150 mM NaCl，0.05% Tween-20 (HBST+)中进行，且Octet实验在HBST+和1 g/l BSA中进行。ProteOn数据在ProteOn Manager软件中处理，Biacore数据在Biaevaluation中处理，且将Octet数据简单地对准至对照软件中的零。将SPR数据双重参照(Myszka, 1999, J Mol Recognit12(5):279-284)且全局拟合至简单朗缪尔(Langmuir)模式，以从动力学速率常数的比率确定平衡解离常数KD(KD=kd/ka)。
无校正浓度分析(CFCA)
在具有固定的IgG的动力学实验中用作分析物的人类PD-1(hPD-1)单体(SinoBiologicals，目录号10377-H08H)的活性浓度使用CFCA 测定法在配备有CM5传感器芯片的Biacore T200™上经验地确定。为了制备这些实验的表面，高容量(约12,000 RU)的mAb15hIgG4(或在一些实验中，竞争剂抗体C2-hIgG1)被胺偶联至流动室2上，让流动室1空白(仅“活化且阻断”，没有任何IgG)以提供参考表面。hPD-1样品在标称浓度0.1、1和10 µg/ml以低(5 µl/分钟)和高(100 µl/分钟)流动速率注射36秒。以2：1 v/v的Pierce IgG洗脱缓冲液(pH 2.8)：4 M NaCl的混合物再生表面。在T200软件中的CFCA工具中分析数据，以推导hPD-1分析物的表观活性值，其用以修正其“标称”蛋白浓度(如通过以适当消光系数在280nm吸光度所测定)成“活性”蛋白浓度。一些批次实测为32%活性，而其他批次为100%活性。
人类PD-1(hPD-1)结合胺偶联的mAb7、mAb15、C1、C2、C3和C4 mAb的动力学分析
使用配备有GLC传感器芯片(BioRad™, Hercules, CA)的ProteOn-XPR36来测定在PBST运行缓冲液中，hPD-1单体结合一组胺偶联的抗hPD-1 mAb(mAb7、mAb15、C1、C2、C3和C4)的动力学和亲和力。在三个步骤中制备用于这些实验的表面：(1)使用于水中最终0.8mM EDC和0.2 mM 磺基-NHS的新鲜制备的活化试剂混合物最低限度地活化配体通道2分钟，(2)于pH 4.5的10 mM乙酸钠中，IgG以15 µg/ml偶联3分钟，和(3)以1 M乙醇胺HCl pH 8.5阻断过量反应性酯3分钟。偶联的IgG的最终水平范围为400 RU至1157 RU。沿着“分析物”通道以三倍系列稀释和顶部“活性”浓度为30、44或36 nM(取决于实验)，以一步法动力学(one-shot kinetic)模式(Bravman等人, 2006, Anal Biochem 358(2):281-288)注射hPD-1单体。结合与解离时间分别为3分钟与20分钟，且所有分析物以一式两份结合循环注射。以2：1 v/v的Pierce IgG洗脱缓冲液(pH 2.8)：4 M NaCl的混合物再生表面。
表13：hPD-1单体结合胺偶联的IgG的动力学分析
Figure 905409DEST_PATH_IMAGE035
hPD-1单体与mAb7和mAb15的相互作用显示，在允许解离相内的结合反应没有可见衰退，所以在它们kd和KD值上放置上限值，根据“5%规则”(Katsamba等人, 2008, Anal Biochem 352(2):208-221)在它们kd和KD值上施加放置上限值。N=2是指在不同芯片上的两个独立实验。
mAb7和mAb15与猕猴PD-1的交叉反应
使用配备有CM4传感器芯片的Biacore 2000™和HBST+运行缓冲液，测定纯化的重组Fab片段(mAb7和mAb15)与hPD-1-hFc1(R&D systems目录号1086PD)和cynoPD-1-hFc1(内部制备)的结合动力学。抗hFc多克隆抗体被胺偶联至该芯片且用于在流动室2和3上捕获约90 RU的hPD-1-hFc1和125 RU的cynoPD-1-hFc1，让流动室1空白(裸抗hFc捕获表面)以提供参考通道。纯化的重组Fab片段作为分析物，以0、10和100 nM注射2分钟，其流过新鲜捕获的PD-1-hFc1融合蛋白，允许15分钟解离时间。使用75 mM磷酸再生捕获表面且以一式两份结合循环注射mAb7 Fab样品。所有Fab/PD-1复合物都非常稳定，以致相互作用无一显示在允许解离时间内它们的结合反应的任何可见衰退，所以施加“5%规则”(Katsamba等人, 2008)以在它们kd和KD值上放置上限值。
表14：mAb7和mAb15 Fab对hPD-1-hFc1和cynoPD-1-hFc1融合蛋白的亲和力测定
Figure 129717DEST_PATH_IMAGE036
hPD-1对mAb15、mAb7和C3的结合亲和力的温度依赖性
使用配备有CM4传感器芯片的Biacore 2000™来测定hPD-1单体结合一组hIgG4分子(mAb15、mAb7和C3)的动力学和亲和力，所述hIgG4分子经由胺偶联的抗hFc多克隆抗体以低水平被捕获。hIgG4 mAb以10 µg/ml捕获在个别流动室上，让流动室1空白以用作参考表面(裸捕获表面)。以活性浓度0、10和100 nM注射hPD-1，3分钟，允许18分钟解离相。在各结合循环后，以75 mM磷酸再生捕获表面。
表15：hPD-1单体作为分析物结合抗hFc-捕获的hIgG4分子的动力学分析
Figure 191214DEST_PATH_IMAGE037
mAb7与小鼠-PD-1的交叉反应
使用配备有链霉抗生物素蛋白传感器尖端的Octet-Red384来确定是否小鼠PD-1结合mAb7。选择亲合力-倾向(avidity-prone)测定格式以增加该测定法的检测灵敏度。传感器以生物素化抗人类κ多克隆包被并用于以10 µg/ml捕获一组hIgG4抗hPD-1 mAb(mAb7、C1、C2和C3)；各mAb被捕获在八个传感器上。作为阳性对照，八个链霉抗生物素蛋白传感器以生物素化J43(eBioSciences)(一种抗小鼠PD-1抗体)包被。将各mAb包被的传感器暴露于下列分析物：缓冲剂、1 µM结合位点小鼠PD-1-hFc、1 µM结合位点hPD-1-hFc(阳性对照)、或1 µM结合位点hGHR-hFc(阴性对照)。所有重组Fc-融合蛋白都来自R&D systems。因此在一式两份传感器上测试各分析物/mAb的相互作用。
抗PD-1抗体C1、C2和C3不结合小鼠-PD-1-hFc1(数据未显示)。抗PD-1抗体mAb7微弱结合小鼠-PD-1-hFc1(数据未显示)。所有测试的抗PD-1抗体都结合hPD-1-hFc。这些结果证实，mAb7与小鼠PD-1弱交叉反应，而C1、C2和C3与小鼠PD-1不交叉反应。
实施例8：以抗PD-1抗体治疗癌症
这是一个预言实施例，其说明本发明的抗PD-1抗体用于治疗癌症的用途。
选择具有经组织学上确认且先前未经治疗的可测量转移结肠直肠癌的患者，以用于以抗PD-1抗体治疗。将患者分组到两个治疗组之一中：化学疗法加上安慰剂或化学疗法加上mAb7。利用动态随机化算法来实现整体平衡并在下列类别的各者内：研究中心、基线ECOG表现状态(0 vs. ≧1)、原发疾病位点(结肠vs.直肠)和转移位点数目(1 vs. >1)。在各8周循环的前6周，每周施用化学疗法治疗。持续化学疗法直到研究完成(96周)或疾病进展。每2周施用5 mg/kg的mAb7或安慰剂。允许在mAb7组中具有经确认完全反应或经历为化学疗法治疗结果的不可接受毒性的患者停止化学疗法且继续接受单独mAb7作为第一线治疗。仅随机化到mAb7组群中的患者可接受mAb7作为第二线治疗的成分。在完成研究后，每4个月追踪患者的任何后续治疗和存活直到死亡、失去追踪、或研究中止。
患者将在基线和在完成每8周循环时经历肿瘤状态评估，其使用适当放射图像技术，通常为螺旋CT扫描。利用实体肿瘤的响应评价标准(Response Evaluation Criteriain Solid Tumors)(Therasse等人 (2000))，通过研究员和独立放射机构(IRF)确定肿瘤响应、或进展。IRF评估的进行不需要知道治疗分组或研究员的评估。此外，在基线和在各治疗循环之前，患者将完成第4版癌症疗法功能性评估—结肠直肠(Functional Assessment ofCancer Therapy—Colorectal (FACT-C), Version 4)，一种经过验证用于评估结肠直肠癌患者的生活质量(QOL)的工具，直到疾病进展。Ward等人 (1999) Qual. Life Res. 8:181-195。
从不良事件、实验室测试结果和生命迹象测量的报告评估安全性。使用第二版国家癌症机构一般毒标准(National Cancer Institute Common Toxicity Criteria (NCI-CTC), Version 2)分类不良事件和异常实验室结果。预先指定的安全性测量包括四种特别感兴趣的不良事件(高血压、蛋白尿、血栓形成、出血)。
主要结果量度是整个存活的持续时间。次要结果量度包括：无进展存活、客观响应率(完全或部分)、响应持续时间和在FACT-C QOL得分的改变。存活持续时间被定义为从随机化到死亡的时间。对于在分析时活着的患者，存活持续时间将在最后一次接触日审查。无进展存活被定义为从随机化到疾病进展早期或于研究时死亡的时间，所述死亡被定义为在最后一剂研究药物或化学疗法的30天内因任何原因所致的死亡。对于在分析时活着且没有疾病进展的患者，无进展存活将在其最后一次肿瘤评估、或在第1天(研究治疗的第1天)(如果没有进行基线后评估)审查。在客观响应的分析中，没有肿瘤评估的患者被分类成无响应者。疾病进展和响应分析基于IRF评估。生活质量的改变被分析为在QOL的恶化时间(TDQ)，其被定义为从随机化到从结肠癌特异性FACT-C分量表得分(CCS)基线降低≧3分的最早时间、疾病进展、或在研究时死亡的时间长度。也将确定TOI-C(CCS之和，身体上和功能上良好)和从基线改变的总FACT-C的TDQ。
实施例9：以抗PD-1抗体治疗癌症
本实施例说明本发明的抗PD-1抗体用于治疗癌症的用途。
本实施例中的研究是在具有局部晚期或转移黑色素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤、或复发或难治的经典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)的先前经治疗的成人患者中，静脉内施用抗PD-1单克隆抗体mAb7的第1期、开放标记、多中心、多剂量、剂量递增、安全、PK和PD研究。研究方案下面概述于表16中。
表16
组 所指定的干预
组1：mAb7 0.5mg/kg，每21天 药物mAb7 IV，每21天
组1：mAb7 1.0mg/kg，每21天 药物mAb7 IV，每21天
组1：mAb7 3.0mg/kg，每21天 药物mAb7 IV，每21天
组1：mAb7 10mg/kg，每21天 药物mAb7 IV，每21天
纳入标准：-组织学上或细胞学上诊断有局部晚期或转移黑色素瘤、SCCHN、卵巢癌、肉瘤、或复发或难治cHL：-患者应已接受至少1次且不超过5次用于复发或转移疾病的先前疗法线，包括标准照护和研究性疗法。-至少一个第1.1版RECIST(RECIST version 1.1)所定义的可测量病变或(用于cHL)至少1个先前未被照射的恶性淋巴瘤的响应标准所定义的氟脱氧葡萄糖正电子放射断层造影术(FDG PET)亲和(Deauville 4/5)可测量病变 >1.5cm。-对于第1B部分扩增组和所有第2部分组：患者已同意经历治疗前和治疗中活检。-充足肾、肝、骨髓功能排除标准-活性脑或柔脑膜转移。-眼黑色素瘤-活性、已知或怀疑自身免疫疾病。允许编入具有下列的患者：白癜风、I型糖尿病、只需要更换激素的因自身免疫状况导致的残留甲状腺功能低下、不需要全身性治疗的牛皮癣、或在没有外部引发剂的存在的情况下预期不会复发的状况。先前免疫缺陷或需要免疫抑制疗法的器官移植物的诊断，-对于第2部分：先前经PD 1或PD L1抗体治疗。-等级≥3的免疫介导的AE的病史(包括被视为是与药物相关的AST/ALT升高和细胞因子释放综合征)，其被视为是与先前免疫调节性疗法(例如免疫检查点抑制剂、共刺激性剂等)相关且需要免疫抑制疗法。
具有ORR(客观响应率)的患者数目将在基线且每六周测量直到疾病进展或最高24个月不可接受的毒性。
实施例9：抗PD-1抗体在人类和猕猴原代T细胞中的拮抗活性
本实施例说明抗PD-1抗体在人类和猕猴原代T细胞中的拮抗活性。
在此研究中，使用混合的淋巴细胞反应(MLR)，在体外检验抗PD-1单克隆抗体mAb7的拮抗活性。自人类和猕猴-外周血液单核细胞(PBMC)分离原代T细胞。在mAb7暴露后，使用人类和猕猴的MLR和使用经葡萄球菌肠毒素B(SEB)超级抗原活化的猕猴血液的细胞因子释放测定法，在不同活化条件下体外评价细胞增殖和细胞因子分泌。
方法
人类T淋巴细胞
人类血沉棕黄层购自斯坦福大学血液中心(Stanford, CA)，以磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释并层叠在Ficoll上以用于分离PBMC。hu-PBMC以PBS洗涤4次，并使用人类特异性Pan T-细胞分离试剂盒，如制造商的方案所述(Miltenyi Biotec, San Diego, CA)以负选择分离T淋巴细胞。
猕猴T淋巴细胞
新鲜猕猴-PBMC购自Bioreclamation IVT (New York, NY)，且以PBS洗涤两次。使用非人类灵长类动物特异性的Pan T-细胞分离试剂盒，如制造商的方案所述(MiltenyiBiotec, San Diego, CA)以负选择分离T淋巴细胞。
产生表达高水平PD-L1的人类树突细胞
人类血沉棕黄层购自斯坦福大学血液中心(Stanford, CA)，以PBS稀释并层叠在Ficoll上以用于分离hu-PBMC。hu-PBMC以PBS洗涤4次，且使用人类特异性CD14细胞分离试剂盒，如制造商的方案所述(Miltenyi Biotec, San Diego, CA)以正选择分离分化簇14(CD14+)单核细胞。接着将细胞以5 x 105细胞/mL接种在补充有10%胎牛血清(FBS)的完全罗斯维尔公园纪念学院(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培养基中7天。在第0、2和5天，对培养物补充重组人类(rh-)IL-4(1000 U/mL) (R&D Systems, Minneapolis,MN)和rh-颗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (rh-GMCSF) (500 U/mL) (R&DSystems, Minneapolis, MN)。在第7天，将未成熟DC收获、洗涤并计数。使用r-藻红素(RPE)标记的抗hu-PD-L1 (eBioscience/Affymatrix, San Diego, CA)，通过使用LSRFortessaTM分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)的流式细胞术，来测试各制剂的样品的PD-L1表达。
产生表达高水平PD-L1的猕猴树突细胞
新鲜猕猴-PBMC购自Bioreclamation IVT (New York, NY)，且以PBS洗涤两次。使用非人类灵长类动物特异性的CD14细胞分离试剂盒，如制造商的方案所述(MiltenyiBiotec, San Diego, CA)以正选择分离CD14+单核细胞。接着将细胞以5 x 105细胞/mL接种在补充有10% FBS的完全RPMI 1640培养基中7天。在第0、2和5天，对培养物补充rhIL-4(1000 U/mL) (R&D Systems, Minneapolis)和rh-GMCSF (500 U/mL) (R&D Systems,Minneapolis, MN)。在第7天，将未成熟DC收获、洗涤并计数。使用RPE标记的抗hu-PD-L1(eBioscience/Affymatrix, San Diego, CA)，通过使用LSRFortessaTM分析仪(BDBiosciences, San Jose, CA)的流式细胞术，来测试各制剂的样品的PD-L1表达。
产生表达高水平人类PD-L1的JeKo-1-Luc-绿色荧光蛋白细胞克隆
JeKo-1细胞系(套细胞淋巴瘤)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC, Manassas,VA)。JeKo-1-luc-2A-GFP细胞系根据制造商的方案通过转导程序在辉瑞(South SanFrancisco, CA)产生，该转导程序使用通过具有杀稻瘟菌素标记的双顺反子系统独立表达萤火虫荧光素酶(luc2A)和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒粒子(AMSBIO, LVP323，每200 μL1 × 10E7粒子)。将JeKo-1细胞沉淀并在具有20%FBS的RPMI培养基中稀释成1 x 106细胞/mL。以每0.5 mL细胞50 μL病毒的比率添加慢病毒粒子至经稀释细胞。为了产生表达hu-PD-L1的JeKo-1细胞系，通过Life Technologies (San Diego, CA)定制合成hu-PD-L1 cDNA并克隆到基因表达载体(pcDNA3.1)中。稳定表达hu-PDL-1的JeKo-1-Luc-GFP细胞系通过使用Amaxa® Nucleofector系统(Lonza, Walkersville, MD)的电穿孔和根据制造商的方案(Lonza, Walkersville, MD)使用的试剂盒V在辉瑞(South San Francisco, CA)产生。接着细胞在250 μg/mL潮霉素存在的情况下生长2周，然后通过使用BD FACSAria™ II细胞分选仪(BD Biosciences, San Jose, CA)的细胞分选进行选择。以直接经别藻蓝素(APC)标记标记的抗hu-PD-L1抗体克隆MIH-1(Affymetrix/eBioscience, San Diego, CA)进行细胞的分选。扩增阳性克隆并使用流式细胞仪(LSRFortessaTM分析仪，BD Biosciences, SanJose, CA)测试高PD-L1表达。选择自单一分选细胞产生且含有高水平PD-L1表达的克隆。
产生抗体
使用优良实验室操作规范(GLP)材料(批次编号STL0005717)在CHO细胞(Pharmaceutical Sciences, Pfizer Inc, Saint Louis, MO)中产生mAb7并在20 mM组氨酸、85 mg/mL蔗糖、0.2 mg/mL聚山梨醇酯-80、0.05 mg/mL EDTA二钠(pH 5.5)缓冲液中提供。测量内毒素为≤0.01 EU/mg。
所有体外测定法中使用的对照抗体是克隆到IgG4-HG构架(与MAB7相同的构架)中的抗牛疱疹病毒。对照抗体在辉瑞(South San Francisco, CA)产生，批次编号4945，具有≤0.3 EU/mg内毒素。
自公开于先前专利中的序列产生两个抗hu-PD-1抗体并于类似于MAB7所用的IgG4-HG构架中表达。抗体在辉瑞(South San Francisco, CA)产生，且被称为阳性对照1和阳性对照2(批次编号分别为5053与4255)。测量的内毒素分别为≤0.13 EU/mg与≤0.056EU/mg。
使用表达高水平人类PD-L1的树突细胞的人类测定法
方案从Kruisbeek等人, 2004调整，具有一些修改。在第7天收获分化的原代hu-DC，并通过流式细胞仪验证高水平PD-L1表达和T-细胞活化所必要的共刺激性信号；标记包括CD80和CD86(抗体，购自BD Bioscience, San Jose, CA)。计数细胞并使用RS2000 x-光机器(Radsource, Brentwood, TN)以3000辐射单位(rad)辐射，以防止DC分泌细胞因子而仅作为T细胞的Ag呈现支持物发挥功能。因此，该测定法的结果仅由T细胞诱导。在第7天，从同种异型供体收获新鲜分离的hu-T细胞。在不同浓度的mAb7、阴性与阳性对照抗体或单独培养基(用以评价基线反应)存在的情况下，以10:1比率将T细胞用辐射的DC铺板(最佳测定条件被确定为2 x 105个T细胞与2 x 104个DC于200 μL培养物中培养)。所有条件都铺板在96孔平底组织培养经处理板(Fisher Scientific Pittsburg, PA)。使用无血清X-vivo15培养基(Lonza, Walkersville, MD)培养细胞，以防止实验间的人类血清变化性。培养物在37℃，5% CO2培养5天。在第5天，收集上清液且根据制造商的方案使用细胞计数珠阵列法(CBA)(BD Biosciences, San Jose, CA)测量细胞因子浓度。使用流式细胞仪(LSRFortessaTM分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)获取数据，并使用BD FCAP阵列软件第3.0版(BD Biosceinces, San Jose, CA)进行数据分析。通过添加1 μCi的3H甲基-经氚化胸苷(Perkin Elmer, Waltham, MA)至各孔中且进一步培养16至18小时，在平行培养物中测量增殖。接着收获培养物在脱氧核糖核酸(DNA)掺入滤纸(Perkin Elmer, Waltham,MA)上，且氚化胸苷掺入提供使用MicroBeta2机器(Perkin Elmer, Waltham, MA)以每分钟计数 (cpm)测量的细胞增殖的指标。
使用JeKo1-PD-L1表达细胞系的人类测定法
使用5:1比率的T细胞:JeKo-1-PD-L1细胞系进行此测定法，因为此比率提供在第5天捕获细胞因子分泌的更理想方法。因此，各孔用2 x 105个T细胞与4 x 104个JeKo-1-PD-L1培养。在第5天，收集上清液且根据制造商的方案使用CBA(BD Biosciences, San Jose,CA)测量细胞因子浓度。此细胞系表达非常温和量的共刺激性分子(CD80和CD86)，且因此，在抗体处理后，增强的增殖非常和缓。相比之下，细胞因子分泌，包括IL-2，是稳健的，从而允许在mAb7处理后测量细胞因子分泌而不是T-细胞增殖。
使用表达高水平PD-L1的树突细胞的猕猴测定法
在第7天收获分化的DC，并通过流式细胞仪(使用LSRFortessaTM分析仪，BDBiosceinces, San Jose, CA)验证高PD-L1表达和T-细胞活化所必要的共刺激性信号；标记包括 CD80和CD86(抗体，购自BD Bioscience, San Jose, CA)。计数细胞并使用RS2000X-光机器(Radsource, Brentwood, TN)以3000 rad辐射。从同种异型供体收获新鲜分离的猕猴T细胞。在不同浓度的mAb7、阴性和阳性对照抗体或单独培养基(用以评价基线反应)存在的情况下，使用10:1 T细胞:DC的比率将T细胞用辐射的DC铺板(最佳测定法，当2 x 105个T细胞与2 x 104个DC于200 μL培养物中培养)。将所有条件铺板在96孔平底组织培养经处理板(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)。使用无血清X-vivo15培养基(Lonza,Walkersville, MD)培养细胞，以防止实验间的血清变化性。培养物在37℃，5% CO2培养5天。在第5天，收集上清液且根据制造商的方案使用CBA(BD Biosciences, San Jose, CA)测量细胞因子浓度。使用流式细胞仪(LSRFortessa™分析仪，BD Biosceinces San Jose,CA)获取数据，并使用BD FCAP阵列软件第3.0版(BD Biosciences, San Jose, CA)进行数据分析。同时在相似培养物中，添加1 μCi的3H甲基-氚化胸苷(Perkin Elmer, Waltham,MA)至各孔中；进一步培养细胞16至18小时以测量增殖。将培养物收获在DNA掺入滤纸玻璃印制滤网A(Glass Printed filtermate A，Perkin Elmer, Waltham, MA)上，并且使用MicroBeta2机器(Perkin Elmer, Waltham, MA)作为cpm测量提供细胞增殖指标的氚化胸苷掺入。
通过超级抗原(葡萄球菌内毒素B)刺激所诱导的猕猴血液的细胞因子释放
从猕猴收集全血；将225 μL血液等分到组织培养物处理的96孔板(FisherScientific, Pittsburg, PA)中。在37℃，5% CO2，在浓度从0.1至100 μg/mL范围的mAb7或同种型匹配阴性对照抗体存在的情况下，培养样品，一式两份。添加抗体1小时后，以0.1 μg/mL SEB (Toxic Technologies, Sarasota, FL)刺激样品并将培养物培养3天。在第3天，收获血浆、汇集并冷冻在-80℃。根据制造商的方案，使用MSD免疫测定板(Meso ScaleDiagnostics, Rockville, MD)和具有MSD Discovery Workbench软件(第4.0.12版)的MSD读取器(Model 1200)，测量经解冻血清样品中的IFN-γ、IL-2和TNF-α的浓度，一式两份。报告一式两份的平均值。
结果
mAb7对人类原代T细胞的拮抗活性
当原代人类T细胞于MLR中以表达PD L1的同种异型hu-DC活化时，mAb7以剂量依赖性方式增加T细胞增殖(通过经氚化胸苷掺入测量)和T-细胞活化(通过促炎性细胞因子分泌测量)。与以阴性对照抗体(10 µg/mL)处理相比，以mAb7(10 µg/mL)处理T细胞导致T细胞增殖增加最高2.5倍。当与阴性对照抗体相比时，IFN-γ与TNF-α水平分别增加最高8与5倍。IFN-γ增加优于TNF-α增加。在这些培养物中没有检测到IL-2表达。当原代人类T细胞于MLR中使用肿瘤细胞系JeKo 1 PD-L1作为同种异型抗原呈递细胞活化时，与阴性对照抗体相比，mAb7诱导IFN-γ(最高2.5倍)、TNF-α(最高2倍)和IL-2(最高5倍)分泌的剂量依赖性增加。此测定法中mAb7的效应类似于用两种阳性对照抗体获得的数据。在这些条件下未观察到增加的T细胞增殖。与原代DC介导的MLR相比，细胞增殖最小，其中CD80与CD86提供弱信号。在上述所有测定法中，IL-10、IL-4、IL-17A和IL-6最小至没有检测到。
mAb7对猕猴原代T细胞的拮抗活性
在动力学排除测定法(KinExA)中，mAb7(当在溶液中时)对hu-PD-1和猕猴PD-1的结合亲和力非常相似(对于人类和猕猴PD-1，KD分别=23和28 pM)。mAb7在表达人类PD-1和猕猴PD-1的细胞上的EC50也非常相似。在使用自不同猕猴分离的T细胞和DC的MLR功能测定法中，mAb7以剂量依赖性方式诱导T细胞增殖和活化(通过经氚化胸苷掺入测量)。此效应也用阳性对照(抗体1和抗体2)观察到，但未用阴性对照抗体观察到。mAb7也增强细胞因子分泌(即，IFN-γ和TNF-α，与用阴性对照抗体处理相比，最高5倍和3倍。在这些培养物中没有检测到IL-2表达。在使用以0.1 µg/mL的SEB超级抗原刺激3天的猕猴全血的不同细胞因子释放测定法中，当与阴性对照抗体相比时，mAb7(0.1至100 µg/mL)诱导较大的IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌。
MLR研究用于产生类似于肿瘤微环境的体外环境，其中在表达PD-L1的同种异型DC或肿瘤细胞的存在的情况下，T细胞被活化并表达高水平PD-1。PD-1/PD-L1相互作用抑制进一步的T细胞增殖和细胞因子释放。在这些MLR中添加抗PD-1抗体，恢复T细胞活化且增加增殖和细胞因子分泌，特别是IFN-γ，这是由于PD-1/PD-L1轴的阻断。
当与表达高水平PD-L1的同种异型细胞(DC或JeKo 1 PD-L1细胞系)培养时，mAb7加速人类T细胞的增殖和IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌。相比之下，阴性对照抗体，其证实与单独培养基相似，不会增强这些效应。相似地，在猕猴-MLR系统中，mAb7增强T细胞增殖，IFN-γ和TNF-α分泌，以及增强使用超级抗原SEB的从猕猴全血释放细胞因子。
这些结果证实，抗PD-1抗体mAb7增强T细胞增殖和促炎性细胞因子分泌，包括干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素(IL)-2。在原代人类和猕猴T细胞中都观察到这些活性。
实施例10：抗PD-1抗体于移植物抗宿主疾病中的效应
本实施例说明在体内抗PD-1抗体对T细胞活化与扩增的效应，其使用用hu-PBMC转移的的NSG小鼠中的异种-aGvHD模型。
在此研究中，在异种急性移植物抗宿主疾病(aGvHD)模型中，在使用hu-外周血液单核细胞(PBMC)的非肥胖糖尿病型(NOD)、重症联合免疫缺陷(SCID)、白介素2受体γ裸(IL2rγ裸)(NSG)小鼠中研究在体内抗PD-1抗体mAb7对T细胞活化与扩增的效应。
免疫功能低下NSG雌性小鼠(每组5只)8至10周龄(正式名称NOD, Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)购自Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)。所有动物根据实验动物照护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee；IACUC)圈养在辉瑞(South San Francisco, CA)的无病原设施中。
人类血沉棕黄层购自斯坦福大学血液中心(Stanford, CA)，以磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释并层叠在Ficoll上以用于分离PBMC。PBMC以PBS洗涤2次。红细胞(RBC)使用氯化铵钾(ACK)裂解缓冲液裂解，如制造商的方案(Life Technologies；San Diego, CA)所表明。在RBC裂解后，将细胞再洗涤一次并在PBS中以5 x 107个细胞/mL稀释。
为了诱导异种-aGvHD，经由尾静脉以hu-PBMC静脉内注射NSG小鼠。各小鼠接受于200 μL的PBS中的1 x 107个细胞。在所有实验中，将小鼠每周称重3次并监测异种-aGvHD-样综合征(包括重量减轻、驼背姿势、皱皮、减少移动性和在一些情况下腹泻)的出现。在减轻20%体重后或在2天中减轻1 g/天后将小鼠安乐死；将该时间点纪录为存活时间。mAb7、阴性对照抗体和阳性对照抗体如上面实施例9中所述产生。
NSG小鼠用阴性对照抗体、阳性对照抗体或mAb7处理，剂量范围在0.1至10毫克/千克(mg/kg)之间。使用适当媒介物，在hu-PBMC转移后的第2和8天向小鼠施用抗体。抗体施用途径为腹膜内(ip)。
从移植有hu-PBMC的小鼠收获外周血液、脾和肝。如下制备来自各器官的单细胞悬浮液：收集外周血液，且使用ACK-裂解缓冲液裂解RBC并以PBS洗涤。使用注射器柱塞的背面将细胞浸软通过70 μM过滤器而机械地均质化脾和肝，并用PBS洗涤一次。裂解RBC且将细胞再洗涤2次和再次将细胞浸软通过70 μM过滤器。在此阶段，脾细胞即用。为了从肝分离白细胞，使用30%至80%的Percoll梯度(Percoll® Plus, GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh, PA)将单细胞悬浮液分层，并经历高速离心。从中间层收获白细胞并以PBS洗涤二次。将所有单细胞悬浮液计数并将1 x 106个来自各样品的细胞用于荧光激活细胞分选(FACS)。对于人类细胞因子分泌测定法，如制造商的方案(Miltenyi Biotec, SanDiego, CA)中所述，使用小鼠特异性CD45细胞分离试剂盒通过正选择耗尽小鼠CD45+细胞，以确保细胞因子分泌单独来自人类免疫细胞。将细胞计数并将1 x 106个来自各样品的细胞用于该测定法。
自异种-aGvHD小鼠获得来自外周血液、脾和肝的单细胞悬浮液。在4℃，避光下，将每个样品总共1 x 106个细胞于FACS缓冲液中与适当荧光标记的单克隆抗体的混合物培养30分钟，该FACS缓冲液包括含有2%胎牛血清 (FBS)的1 x PBS，接着以FACS缓冲液洗涤细胞。对于Kiel 67蛋白(Ki67，用于测量增殖细胞)的细胞内染色，在表面染色后根据制造商的方案使用细胞内固定和透化缓冲液集合(Intracellular Fixation &Permeabilization Buffer Set)(Affymetrix/eBioscience, San Diego, CA)固定细胞。在4℃黑暗中进行细胞内染色30分钟。染色结束时，洗涤样品并使其经历使用BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)的多色流式细胞术。使用FlowJo软件(FLOWJO LLC, Ashland, OR)进行数据分析。识别细胞表面分子的不同组合中所用的抗体是：抗hu-CD45太平洋蓝(Pacific Blue；PB)或Amcyan、抗小鼠CD45-亮紫(BrilliantViolet；BV)-711、抗 hu-CD3-PerCPCy5.5、抗hu-CD8藻红素-Cy7(PE-Cy7)或BV-786、抗hu-CD4-荧光素异硫氰酸酯(FITC)或BV-650、抗hu-PD-1(克隆EH12.1)BV-786或PE、抗hu-PD-1(克隆MIH-4)PE或FITC、抗hu-Ki67别藻蓝素(APC) (所有抗体都来自BD Biosciences, SanJose, CA)、抗hu-PD-L1(PE-Affymatrix-eBioscience, San Diego, CA)和用于活/死染色的蓝色荧光反应性染料(Life Technologies, Grand Island, NY)。
自异种-aGvHD小鼠(在小鼠CD45耗尽后)收获脾和肝的富含人类CD45群体的单细胞悬浮液。在平底组织培养经处理96孔板(Fisher Scientific; Pittsburg, PA)中将每个样品总共1 x 106个细胞培养于200 μL X-vivo 15培养基中。接着使细胞未刺激或以作为低刺激条件的10 ng/mL乙酸佛波醇肉荳蔻酯(PMA)和125 ng/mL离子霉素(ionomycin；iono)或作为高刺激条件的50 ng/mL PMA和1 μg/mL离子霉素(都购自Sigma-Aldrich,Saint Louis, MO)刺激。培养物在37℃于5% CO2中培养8小时以确保最大细胞因子分泌。收集上清液并根据制造商的方案使用人类细胞因子特异性细胞计数珠阵列法(CBA)(BDBiosciences, San Jose, CA)测量人类细胞因子浓度。使用流式细胞术(LSRFortessaTM分析仪，BD Biosciences, San Jose, CA)获取数据，并使用FCAP阵列TM软件第3.0版(BDBiosceinces, San Jose, CA)进行数据分析。Hu-IFN-γ、hu-TNF-α和hu-IL-2珠阵列试剂盒购自BD Biosciences (San Jose, CA)，且已证实它们不与小鼠细胞因子交叉反应。
所有分析都涉及使用独立样品t-检验或使用Graphpad Prism的2-因子ANOVA(Graphpad Software, San Diego, CA)的平均值的比较。将p ≤0.05的值被视为统计学显著的。植入数据在图中被描绘为平均浓度，包括平均值的标准偏差(sem)。
以抗PD-1抗体mAb7处理NSG免疫低下小鼠加速体重减轻(表17)并诱导常见于此模型中的其他疾病体征，诸如驼背姿势、皱皮、降低移动性和在一些情况下腹泻。在此模型中，预期体重减轻在转移后的第20天与第30天之间加速(参见例如Schroeder and DiPersio,2011)。因为以mAb7和阳性对照1与2处理加速异种-aGvHD综合征，小鼠必须在较早时间点安乐死，而无法获得存活曲线；因此体重减轻为主要结果测量。在第一实验中，小鼠以0.1、1和10 mg/kg的mAb7或10 mg/kg阴性对照抗体处理。在表17中，通过将在第23天经处理组相对于第0天的体重差异均一化而计算体重减轻。值表明每组5只小鼠的平均值±sem。
表17
Figure 475565DEST_PATH_IMAGE038
在hu-PBMC转移后的第2天和第8天，小鼠以所表明抗体处理。尽管在第23天在对照组中体重减轻变得明显，但在hu-PBMC转移后第10至11天开始，在来自所有抗PD-1抗体mAb7处理组中的个别小鼠中检测到体重减轻和疾病进展。当与阴性对照处理组相比时，在1 mg/kg和10 mg/kg处理组中，在第14至23天之间，体重减轻达到显著(p≤0.0001)。在23天，在1mg/kg和10 mg/kg处理组中检测到15%体重减轻且在0.1 mg/kg处理组中检测到7.9%体重减轻(表17)。
外周血液、肝和脾的FACS分析证实，与对照组相比，在mAb7处理组中hu-CD45阳性细胞和hu-CD3阳性细胞T细胞的百分比增加。来自脾的代表性数据也显示，与阴性对照抗体处理组相比，在mAb7处理组中hu-CD8阳性T细胞计数和hu-CD4阳性T细胞计数增加(但程度较低)。也在肝与血液中的hu-T细胞计数中注意到相似增加。为了评估T细胞的增加是否是由于通过mAb7结合人类T细胞而阻断PD-1，将T细胞以与mAb7的结合竞争的市售PD-1抗体(克隆EH12.1)染色。来自所有器官的mAb7处理淋巴细胞(通过FACS分析)显示没有与EH12.1结合。为了确认经mAb7处理的T细胞仍表达PD-1，将T细胞用不同的抗hu-PD-1克隆(克隆MIH4)染色，所述克隆MIH4与mAb7部分竞争结合T细胞。结果显示经mAb7处理的T细胞部分结合MIH4；因此指示PD-1表达在经处理T细胞上且PD-1被mAb7阻断是显然的(数据未显示，保留在辉瑞内部纪录中)。对于在脾中、在T细胞(hu-CD3阳性)上或在非hu-T细胞(hu-CD3阴性)上的hu-PD-L1表达，没有观察到可检测改变。在脾中间组中，与阴性对照处理组相比，Ki67(淋巴细胞增殖的标记)在来自PF-0681591处理组的hu-CD3阳性细胞中升高)。相似结果还见于血液与肝中。
为了检查于异种-aGvHD期间mAb7对细胞因子释放的效应，从小鼠CD45阳性细胞进一步分离hu-CD45阳性细胞(来自肝与脾)。这些淋巴细胞接着在37℃经PMA和离子霉素的混合物(在2个浓度：低相比于高)处理或未经处理8小时。通过CBA测量上清液中细胞因子分泌(表18)。没有刺激的情况下，未获得可检测细胞因子(表18)。在mAb7处理后，与对照组相比，自小鼠脾和肝部件分离的人类淋巴细胞中的hu-IFN-γ、hu-IL-2和hu-TNF-α升高。在弱离体刺激条件下，mAb7处理的T细胞增加hu-IFN-γ分泌至显著高于自阴性对照组分离的T细胞的水平的水平(p≤0.05)。在强离体刺激条件下，所有细胞因子在所有组中被诱导，但与自阴性对照分离的T细胞相比，在mAb7处理T细胞中进一步增加。表18显示自各组中5只不同小鼠收集的数据。表18中，在比较mAb7相对于阴性对照组的未配对t-检验中，*p<0.05，**p<0.01；aGvHD=急性移植物抗宿主疾病；Hu=人类；IFN-γ=干扰素-γ；IL-2=白介素-2；Ino=离子霉素；N=数目；ns=不显著；P=P值；PMA=乙酸佛波醇肉荳蔻酯；TNFα=肿瘤坏死因子α；异种=异种的。
表18
Figure 215988DEST_PATH_IMAGE039
Figure 243986DEST_PATH_IMAGE040
这些结果证实，在NSG小鼠中，以抗PD-1抗体mAb7处理异种-aGvHD加速异种-aGvHD发展，如通过体重减轻、T细胞增殖和增加的细胞因子分泌(包括干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-2(IL-2))所测量。
实施例11：抗PD-1抗体的表征
本实施例说明抗PD-1抗体mAb7对表达表面受体PD-1的细胞的结合亲和力、特异性和配体阻断活性。
mAb7、阴性对照抗体和阳性对照抗体如实施例9中所述产生。经藻红素(PE)或亮紫(BV)-786标记的一抗抗hu-PD-1抗体克隆EH12.1和经相同染料标记的同种型对照抗体购自BD Biosciences (San Jose, CA)。PE标记的抗小鼠PD-1克隆J43和抗仓鼠IgG同种型对照抗体购自Affymetrix/eBiosciense (San Diego, CA)。生物素化hu-PD-L1和生物素化hu-PD-L2 (CD273)获得自ACRO Biosystems (Newark, DE)。猕猴PD-L1和PD-L2购自CreativeBioMart®重组蛋白(Shirley, NY)，且两者都如制造商的方案所指导使用Alexa Fluor®647蛋白标记试剂盒(LifeTechnologies, San Diego, CA)以Alexa Fluor® 647染料内部标记。测试猕猴 PD-L1和PD-L2对表达猕猴PD-1的细胞系的结合。大鼠-PD-L1-Fc-标签和小鼠-PD-L1-Fc-标签(人类IgG1在C-端的Fc区)购自Creative BioMart®重组蛋白(Shirley,NY)。生物素化PD-L1和PD-L2的检测使用链霉抗生物素蛋白PE或别藻蓝素(APC)(Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA)实现。大鼠-PD-L1或小鼠-PD-L1的检测使用APC标记的Fc伽马(Fcγ)片段特异性驴-抗人类affiniPure F(ab')2 IgG (JacksonImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA)实现。
用于瞬时转染的载体
Hu-PD-1表达质粒(在pCMV6-Entry载体中)购自OriGene Technologies, Inc(Rockville, MD)，目录号RC210364/登录号 NM_005018。
小鼠-PD-1表达载体(在pCMV6-Entry载体中)购自OriGene Technologies, Inc(Rockville, MD)，目录号MR227347/登录号NM_008798。猕猴-PD-1通过Life Technologies(San Diego, CA)、批号1482149/登录号 EF443145密码子优化和合成。将其克隆至基于专有辉瑞(San Francisco, CA)的基于巨细胞病毒(CMV)的表达质粒中，其与添加C-端FLAG标签至C-端的小鼠κ分泌性信号序列同框。
大鼠-PD-1脱氧核糖核酸(DNA)根据来自登录号NM_001106927的序列定制合成并克隆至来自LifeTechnologies (San Diego, CA)、批号1598305的表达载体pEF1V5-His的BamHI-NotI位点中。
用于稳定转染的PD-1表达载体
Hu-PD-1 DNA根据来自登录号NM_005018的序列定制合成并克隆至InVitroGen表达载体pEF1V5-His B；批号513478的BamHI-NotI位点中。
猕猴-PD-1 DNA根据登录号EF443145定制合成并克隆至InVitroGen表达载体pEF1V5-His B；批号1482149的BamHI-NotI位点中。
小鼠-PD-1 DNA根据登录号NM_008798定制合成并克隆至InVitroGen表达载体pEF1V5-His B；批号1513476的BamHI-NotI位点中。
所有载体经Life Technologies (San Diego, CA)合成并克隆至InVitroGen表线载体pEF1V5-His B中。所有载体都含有完整PD-1序列，包括胞外结构域、膜结构域和细胞内结构域。所有载体都编码于PD-1的C-端的V5-6His表位标签。在各载体内包括新霉素抗性基因，用于使用G418硫酸盐抗生素选择。
使用HEK-293T细胞系的瞬时转染
HEK-293T细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC®, Manassas, VA)，且将细胞保持于补充有10%胎牛血清(FBS)与1 x青霉素/链霉素(Pen/Strep)的Dulbecco氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)(Corning CellGro, Manassas, VA)中，并在37℃，6%二氧化碳(CO2)中生长。转染前一天，将细胞胰蛋白酶消化并以每T75烧瓶(Fisher Scientific,Pittsburg, PA)4 x 106个细胞铺板。转染当天，以预先温热的无抗生素生长培养基置换旧培养基，且细胞在37℃，6% CO2中进一步培养2小时。添加表达载体或空载体(10 µg)至1.5mL OptiMEM培养基(Life Technologies, San Diego, CA)中。接着添加Lipofectamine2000试剂(20 µl) (Life Technologies, San Diego, CA)至另一个1.5 ml OptiMEM中。接着将质粒OptiMEM和Lipofectamine OptiMEM管混合在一起并在室温培养25分钟。接着将OptiMEM混合物逐滴添加至适当培养烧瓶中，且让烧瓶在37℃，6% CO2中放置过夜。第二天，从烧瓶移除培养基并置换成完全生长培养基。转染后四十八(48)小时，使用StemPro-Accutase (Life Technologies, San Diego, CA)收获细胞，从而允许轻轻地从培养表面移除细胞，而不影响PD-1表面表达。接着使细胞经历抗体结合和荧光激活细胞分选(FACS)分析。
使用Jurkat细胞系的稳定转染
使用Jurkat细胞系(克隆E6-1-TIB-152™, ATCC®, Manassas, VA)稳定表达hu-和猕猴-PD-1。使用电穿孔经由Amaxa necluotransfector系统(Lonza, Walkersville,MD)产生细胞系。如制造商的方案(Lonza, Walkersville, MD)所指导使用试剂盒V在辉瑞(San Francisco, CA)进行转染。在37℃，5% CO2，以 0.3至1.0 × 106个细胞/ml之间的密度将细胞维持在补充有10% FBS与1 x L-谷氨酰胺(LifeTechnologies, San Diego, CA)的罗斯维尔公园纪念学院(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640生长培养基中。对于各载体，使用2 μg/mL转染2 × 106个细胞。转染后，在G418硫酸盐(600 μg/mL)存在的情况下生长细胞2周，用于选择和维持稳定转染的细胞。为了防止长期污染，添加1 x Pen/Strep至培养基中。通过以稀释度1:200(1个细胞于200 μL补充有硫酸盐抗生素的完全培养基中)培养细胞来选择单细胞克隆。为了选择表达高水平hu-PD-1或猕猴-PD-1的克隆，在流式细胞测定法中使用PE标记的抗hu-PD-1克隆EH12.1。使用BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)收集样品。使用Flowjo软件(FLOWJO LLC, Ashland,OR)数据分析和计算平均荧光强度(MFI)。选择具有高MFI的细胞系用于测定法开发。
在转染后48小时收获用hu-PD-1载体、猕猴-PD-1载体、小鼠-PD-1载体或大鼠-PD-1载体或空载体转染的HEK-293T细胞。在与mAb7结合之前，以市售抗体或配体测试来自各特定转染的细胞，以确保适当PD-1受体高度表达在细胞表面上。对于人类和猕猴，使用交叉反应性市售抗PD-1抗体(克隆EH12.1)。对于小鼠，使用市售抗小鼠-PD-1抗体(克隆J43)。对于大鼠，使用大鼠-PD-L1配体(因为没有市售大鼠交叉反应性抗PD-1抗体可得)。在确认适当PD-1表达后，将细胞计数并将2 x 105个细胞与hu-Fc受体结合抑制剂功能级混合物(以1 μg/1 x 106个细胞阻断Fc-γ受体，Affymetrix/ eBiosciense, San Diego, CA)培养20分钟，且添加用于活/死染色的蓝色荧光反应性染料(Life Technologies, San Diego, CA)至该混合物中。添加mAb7或阴性对照(1至0.00001 μg/mL)抗体的系列稀释液至细胞混合物中且接着允许在冰上培养1小时。接着洗涤细胞和添加APC标记的-驴-抗人类-affiniPureF(ab')2片段IgG, Fcγ特异性(1：100稀释度) (Jackson ImmunoResearch LaboratoriesInc, West Grove, PA)至该混合物中，接着细胞于冰上再培养30分钟。在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上获取数据并使用Flowjo软件(FLOWJOLLC, Ashland, OR)分析数据。
产生用hu-PD-1受体、猕猴-PD-1受体或小鼠-PD-1受体转染的稳定Jurka细胞克隆。来自各物种的为这些测定法所选的PD-1细胞克隆表达相似量的PD-1受体(~400,000个受体/细胞；受体先前在产生这些细胞系期间定量)。在确认适当PD-1表达后，将细胞计数并将2 x 105个细胞与hu-Fc受体结合抑制剂功能级混合物(以1 μg/1 x 106个细胞阻断Fc-γ受体，Affymetrix/ eBiosciense, San Diego, CA)培养20分钟，且添加用于活/死染色的蓝色荧光反应性染料(Life Technologies, San Diego, CA)至该混合物中。添加的mAb7、阳性对照1、阳性对照2或阴性对照抗体(使用IgG4构架)的系列稀释液(1:3)至细胞混合物中且接着允许在冰上培养1小时。接着洗涤细胞和添加APC标记的驴-抗人类-affiniPure F(ab')2片段IgG, Fcγ特异性(1：100稀释度) (Jackson ImmunoResearch LaboratoriesInc, West Grove, PA)至该混合物中，接着使细胞于冰上再培养30分钟。在BDLSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上获取数据。使用Flowjo软件(FLOWJO LLC, Ashland, OR)进行分析且计算几何平均值。使用Graph Pad Prism(对数激动性相对于响应[结合])计算EC50值。
产生活化的表达高水平PD-1受体的T细胞。使用市售试剂(对于人类和猕猴，使用抗hu-PD-1克隆EH12.1，对于小鼠-PD-1，使用抗小鼠-PD-1克隆J43，而对于大鼠-PD-1，使用大鼠-PD-L1)确认获得自各物种的T细胞的适当PD-1表达。将细胞计数并将1 x 106个细胞与hu-Fc受体结合抑制剂功能级混合物(以1 μg/1 x 106个细胞阻断Fc-γ受体，Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA)培养20分钟，且添加用于活/死染色的蓝色荧光反应性染料(Life Technologies, San Diego, CA)至该混合物中。添加mAb7的系列稀释液(1:3稀释)至细胞混合物中且接着允许在冰上培养1小时。接着，在添加APC标记的驴-抗人类-affiniPure F(ab')2片段IgG, Fcγ特异性二级抗体(1：100稀释度) (JacksonImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA)之前洗涤细胞，且允许细胞于冰上再培养30分钟。在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上获取数据。使用Flowjo软件(FLOWJO LLC, Ashland, OR)进行分析。计数几何平均值并使用Graph Pad Prism(对数激动性相对于响应[结合])计算EC50值。
为测定法选择稳定的表达高水平hu-PD-1的Jurkat细胞克隆。二十(20) μg/mL的生物素化-hu-PD-L1或生物素化-hu-PD-L2饱和在此细胞系上的所有PD-1受体(在预知结合滴定测定法后)。因此，此浓度在我们的测定法中被选择作为最佳浓度。表达Hu-PD-1的Jurkat细胞(2 x 105个)与hu-Fc受体结合抑制剂功能级(以1 μg/1 x 106个细胞阻断Fc-γ受体，Affymetrix/ eBiosciense, San Diego, CA)培养20分钟，且也添加用于活/死染色的蓝色荧光反应性染料(Life Technologies, San Diego, CA)至该混合物中。以20 μg/mL添加生物素化-hu-PD-L1或生物素化-hu- PD-L2至细胞，随后立刻添加mAb7、阳性对照1、阳性对照2或阴性对照抗体(都于IgG4骨架中且以1:3系列稀释度)的系列稀释液。允许在冰上培养细胞1小时。接着洗涤细胞和添加PE链霉抗生物素蛋白(1:100稀释度) (Affymetrix/eBiosciense, San Diego, CA)，且允许细胞于冰上培养30分钟。在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上获取数据，并使用Flowjo软件(FLOWJO LLC,Ashland, OR)进行分析且计算几何平均值。使用Graph Pad Prism(对数抑制剂相对于响应[结合])计算EC50值。
Jurkat细胞系用高水平hu-PD-1受体或猕猴-PD-1受体稳定转染。为此测定法选择表达猕猴-PD-1受体(~400,000个受体/细胞)的细胞。使用这些细胞测试猕猴-PD-L1和PD-L2结合且结果显示20 μg/mL的猕猴-PD-L1或PD-L2足以饱和所有PD-1受体，其基于不同浓度(50 ng/mL至50 μg/mL)的这些配体当结合此细胞系时所测试的几何平均值。表达猕猴-PD-1的Jurkat细胞(2 x 105个)与hu-Fc受体结合抑制剂功能级(以1 μg/1 x 106个细胞阻断Fc-γ受体，Affymetrix/ eBiosciense, San Diego, CA)培养20分钟，且添加用于活/死染色的蓝色荧光反应性染料(Life Technologies, San Diego, CA)至该混合物中。添加20μg/mL的Alexa-Fluor®- 647-猕猴PD-L1或Alexa--Fluor®-647-猕猴PD-L2至细胞，随后立即添加不同浓度的mAb7、阳性对照1、阳性对照2或阴性对照抗体(使用IgG4骨架，于1:3系列稀释液中)。接着允许在冰上培养细胞1小时。洗涤后，细胞在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上获取数据。使用Flowjo软件(FLOWJO LLC,Ashland, OR)进行分析且计算几何平均值。使用Graph Pad Prism(对数抑制剂相对于响应[结合])计算EC50值。
购自斯坦福大学血液中心(Stanford, CA)的人类血沉棕黄层以PBS稀释并层叠在Ficoll上以用于分离PBMC。PBMC以PBS洗涤4次。RBC使用ACK裂解缓冲液裂解，如制造商的方案(Life Technologies；San Diego, CA)中所表明。在RBC裂解后，再洗涤细胞一次并以5 x107个细胞/mL在PBS中稀释。将一半的PBMC计数并冷冻于冷冻介质(90%FBS与10%二甲基亚砜[DMSO])中而剩余细胞经历T-细胞纯化。
使用hu-特异性Pan T细胞分离试剂盒，如制造商的方案中所述(MiltenyiBiotec；130-096-353)以负选择自剩余PBMC分离T淋巴细胞。
对于ADCC测定法，将新鲜分离的T细胞(目标细胞)计数，且将1 x 106个T细胞/mL培养于无血清X-vivo 15培养基(Lonza, Walkersville, MD)中并使用经抗CD3和抗CD28(用于T细胞扩增和活化的Dynabeads®人类T-活化剂CD3/CD28(Life Technologies, SanDiego, CA)包被的珠和100 U/mL的重组人类(rh)-IL-2 (R&D Systems, Minneapolis,MN)刺激。将培养物在37℃，5% CO2培养72小时。当T细胞活化到达48小时时间点时，将PBMC(衍生自相同供体的效应子细胞)解冻、计数且接着于具有10% FBS的完全RPMI-1640培养基中以rh-IL-2 (50 U/mL，至5 x 106细胞/mL培养物)刺激总共18至24小时。在测定当天，将二种细胞类型计数且通过流式细胞仪测试以确保适当活化。对于T细胞，检查PD-1的高表达，而对于PBMC，检查介导ADCC的受体CD16、CD32和CD64(分别为Fc-伽马受体-[FcγR] III[a和b]、FcγRIIa、FcγRI)的表达水平。以5：1效应子:目标比(因为此为最佳比)将细胞铺板在平底96孔组织培养经处理板(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)中，随后添加抗体：mAb7(IgG4和IgG1构架)和阳性对照抗体。所有抗体以浓度0.01至100 μg/mL(以1:10系列稀释度)测试。添加测定对照，包括评价最大裂解的单独目标细胞、单独效应子细胞和以5:1比率的效应子:目标但没有添加抗体。测定板在37℃，5% CO2中培养4小时。使用CytoTox96®非放射性细胞毒性测定法(Promega US, Madison, WI)分析数据，如制造商的方案所指导。该测定法定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)，一种细胞裂解时释放的稳定胞质溶胶酶。细胞毒性百分比(%)被测量为=100 x (实验LDH释放[OD490]/最大LDH释放[OD490])。当单独目标细胞(T细胞)细胞被化学溶解以获得最大杀伤时，计算最大LDH释放。
使用流式细胞术(FACS)基于细胞的结合测定法来评价mAb7结合hu-PD-1、猕猴-PD-1、小鼠-PD-1和大鼠-PD-1的能力，该测定法包括瞬时转染的HEK-293T细胞系、原代活化的T细胞和稳定转染hu-PD-1或猕猴-PD-1和小鼠-PD-1的Jurkat细胞。mAb7以高亲和力结合hu-PD-1和猕猴-PD-1并对2个物种显示相似EC50值(这些同种型的氨基酸序列是分析的物种中最相似者)。数据概述于表19、20和21中。与小鼠-PD-1的结合仅在生物学上不相关的高浓度mAb7实现且可能是由于亲和力成熟程序。对于大鼠-PD-1，当使用转染的细胞或活化的原代T细胞时，没有检测到mAb7的结合(表19)。
表19：通过FACS的原代未活化和活化的T细胞上的mAb7结合
Figure 425569DEST_PATH_IMAGE041
表20：mAb7结合从个体人和猕猴获得的表达PD-1的活化的原代T细胞
Figure 162712DEST_PATH_IMAGE042
在表20中，每个数字表示mAb7结合不同供体的EC50值。最下面一行表示平均值 ±sem。sem = 标准误差平均值。
表21：mAb7结合用人PD-1或猕猴PD-1稳定转染的Jurkat细胞系(EC50)
Figure 62535DEST_PATH_IMAGE043
在表21中，各数目表示于单个实验中mAb7结合的EC50值。*表明平均值±sem。mAb(IgG4)= 具有IgG4构架的单克隆抗体；PD-1=程序性死亡-1；sem=平均值的标准偏差。
使用不同基于细胞的测定系统来检查mAb7结合hu- PD-1和猕猴-PD-1。在所有系统中，发现在两个物种中结合都具有高亲和力与特异性。使用表达hu-PD-1或猕猴-PD-1的瞬时转染的HEK-293T细胞系，mAb7显示相似的结合模式，如MFI所表明。在用空载体(媒介物)转染的亲本细胞系中观察到最小至没有结合。
在活化后72小时，当细胞表面上的PD-1表达和细胞活力为最佳时，确定mAb7结合经活化hu-原代T细胞和猕猴-原代T细胞的EC50值(表19)。计算各物种的2个不同供体的EC50值(表20)。在hu-活化的T细胞和猕猴-活化的T细胞中，都获得低EC50值且发现在这2个物种之间EC50值接近，分别为51.04 ± 5.07 pM和85.34 ± 11.73 pM(平均值±平均值的标准偏差[sem])。阴性对照抗体高于基线值时，则没有观察到结合。
最小地表达hu-PD-1受体的Jurkat T细胞系用于产生稳定转染的hu-PD-1、猕猴-PD-1和小鼠-PD-1细胞系。将细胞系亚克隆且选择表达高水平hu-PD-1和猕猴-PD-1受体的克隆(每个细胞~400,000个PD-1受体为所获得的最高表达)。在此系统中，mAb7显示对hu-PD-1和猕猴-PD-1受体的高亲和力。这两个物种的EC50值相似于原代活化的T细胞数据(表21)；对于hu-PD-1，EC50= 64.725 ± 1.89，而对于猕猴-PD-1，EC50=222.55 ± 41.3。在2个实验运行之间，表达猕猴-PD-1的细胞的EC50值比人类EC50值更有变化。这两个物种的数据相似于用任何给定重复中使用的阳性对照抗体所获得的数据(表21)。在实验重复的任一者中，阴性对照抗体不展现高于基线值的结合。在PD-1转染的Jurkat细胞系(表达hu-PD-1或猕猴-PD-1)中，检验mAb7阻断PD-L1和PD-L2配体与PD-1受体相互作用的能力。在此测定法中，在与不同浓度的未标记的mAb7培养后，细胞与饱和浓度的标记的配体培养。如表22所显示，mAb7以剂量依赖方式抑制PD-L1和PD-L2配体与PD-1受体相互作用。PD-1的阳性对照抗体显示相当的抑制。mAb7的IC50在hu-PD-1和猕猴-PD-1之间相当(对于hu-PD-L1和hu-PD-L2分别为880.15 ± 289.85和1058 ± 355.4；和对于猕猴-PD-L1和猕猴-PD-L2分别为942.9± 110.1和839 ± 89.5)。IC50值的概述提供于表22中。在表22中，各数目表示于单一实验中mAb7的IC50值；*表明平均值±sem；‡表明括号中重复数目；mAb IgG4=具有IgG4构架的单克隆抗体；PD-1=程序性死亡-1；PD-L1=程序性死亡-配体1；PD-L2=程序性死亡-配体2；sem=平均值的标准偏差。
表22：使用稳定转染的Jurkat细胞系系统的阻断人PD-1或猕猴-PD-1结合PD-L1和PD-L2的抑制浓度(IC50；pM)
Figure 628645DEST_PATH_IMAGE044
mAb7显示对于补体成分1，q亚成分(C1q)和CD64的弱结合。C1q和CD64(用于IgG4构架)分别被视为补体依赖细胞毒性(CDC)和ADCC的潜在代用品。为了进一步在体外调查mAb7诱导T细胞杀伤的能力的缺乏，以表达高水平PD-1受体的活化的T细胞(目标细胞)和表达高水平Fcγ受体的PBMC(效应子细胞)进行ADCC测定法。细胞选自2个健康供体。在两个供体中，mAb7(于其原始IgG4构架中)都显示最小ADCC活性。缺乏ADCC活性与于IgG4构架中的抗PD-1阳性对照抗体所展现的活性一致，且两者都相似于阴性对照 IgG4抗体。当在人类IgG1构架(已知该构架诱导较强的ADCC)中评估抗PD-1(mAb7或阳性对照抗PD-1抗体)时，则抗PD-1诱导的ADCC最高4-倍高于当抗体于IgG4构架中时。当单独目标细胞(T细胞)被化学裂解以获得最大杀伤(根据测定浓度将计算为各供体的的100%裂解)时，计算最大LDH释放。使用IgG1构架的T细胞裂解对应于活化的T细胞上的PD-1水平(供体1 PD-1表达以及裂解高于供体2的PD-1表达以及裂解)，确认了该测定法的准确性。
这些结果证实抗PD-1抗体mAb7以高亲和力结合细胞上所表达的hu-PD-1受体和猕猴-PD-1受体，其中EC50值在范围46至270 pM之间，此取决于测试系统。mAb7不以生理浓度结合表达小鼠-PD-1的细胞或表达大鼠-PD-1的细胞。mAb7阻断PD-L1和PD-L2配体与细胞表面PD-1受体相互作用；IC50值范围为500至1000 pM，表明其在阻断经由配体结合所诱导的PD-1功能中的高拮抗功能。mAb7，在其IgG4构架中，触发最小抗体诱导的细胞毒性至没有抗体诱导的细胞毒性，其与IgG4抗体性质一致。
实施例12：使用无标记的生物传感器和ELISA表征抗PD-1抗体mAb7与PD-1、FcRn、 FcγRs和C1Q的结合。
本实施例说明使用SPR生物传感器，mAb7对于来自关于毒理学研究的各种物种的重组纯化的PD-1的体外结合亲和力。也通过SPR测试mAb7的Fc区接合FCGR和FcRn的能力，以确认其展现与同种型匹配的对照的性质一致的性质。通过ELISA，测定mAb7与同种型匹配的对照与人类C1q的结合。也通过无标记的生物传感器来测试mAb7阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合相互作用的能力，以支持其作用机制。
除非另有指明，所有动力学和亲和力实验在25℃的磷酸盐缓冲盐水(PBS) +0.01% Tween 20运行缓冲液中进行。在配备有NLC(经中性抗生物素蛋白包被)芯片的SPRProteOn XPR36生物传感器(BioRad, Hercules, CA)上进行动力学研究。ProteOn也用于经由针对mAb7作为参考标准品的滴定而确定hu-PD-1和猕猴-PD-1分析物的活性浓度。本文中所用的蛋白分析物的浓度是指“活性”或“标称”值。人类Fc伽马受体(hu-FCGR) I、人类新生儿Fc受体(hu-FcRn)(批号R3091)和猕猴-新生儿Fc受体(猕猴-FcRn)(批号JCR)的活性浓度使用免校正的浓度分析(CFCA)实验在配备有CM5传感器芯片的Biacore T200(GE LifeSciences, Marlborough, MA)上确定。所有其他分析物以它们的标称浓度使用，如通过以适当消光系数在A280 nm吸光度所确定。使用配备有自动取样机的KinExA设备3000或3200(Sapidyne)，在室温(约23℃)确定溶液亲和力。根据制造商的说明以DyLight 650 (PierceBiotechnology, Grand Island, NY.)标记二级检测抗体。在等摩尔比的接头：IgG下，根据制造商的说明使用EZ-LinkTM磺基-NHS-LC-LC-生物素(Pierce Biotechnology GrandIsland, NY)进行免疫球蛋白G(IgG)生物素化。除非另有指明，用包含Pierce IgG洗脱缓冲液(pH 2.8)/4 M氯化钠(NaCl)的2:1 v/v混合物的“Pierce/盐”混合物再生固定的IgG。
使用KinExA方法于PBS + 0.01% Tween 20的运行缓冲液和PBS + 0.01% Tween20 + 1 g/l牛血清白蛋白(BSA)样品缓冲液中，在溶液中确定hu-PD-1和猕猴-PD-1(两者都是His标记的单体)与mAb7的结合相互作用。采用两种不同的测定格式。在第一测定格式中，将mAb7滴定至恒定浓度的hu-PD-1(标称200、400或4000 pM)且允许样品达到平衡。将游离hu-PD-1捕获至经抗hu-PD-1单克隆抗体mAb7(于非优良实验室操作规范(GLP)条件下内部制备[批号R5432])包被(通过吸附)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠上。接着以0.5 µg/mLDylight标记的抗His mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN)检测珠捕获的hu-PD-1。在第二测定格式中，将hu-PD-1或猕猴-PD-1滴定到恒定浓度的mAb7(20、50、100或500 pM)，且允许这些混合物达到平衡。将游离mAb7捕获到已吸附有特异性结合游离mAb7但不结合PD-1-饱和的mAb7的阻断剂抗独特型小鼠抗mAb7 mAb 1699.1 H6的PMMA珠上。接着以Dylight标记的山羊抗hu-IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch Inc, West Grove, PA)检测珠捕获的mAb7。所有滴定被制备为12-成员2-倍稀释系列，其变化顶部标称结合位点浓度为落在1 nM至10 nM的范围内，这取决于实验。允许样品平衡最高48小时且根据实验调整注射体积，以给出落在0.7 V至1.9 V范围内的总信号。所有样品以一式两份循环注射。使用分析软件中的N-曲线工具全局地分析来自每个相互作用最高4个独立实验的数据且拟合至简单生物分子模型，其中mAb7的浓度用作参考浓度。全局分析报告KD和PD-1的表观活性结合位点浓度的最佳拟合值(和95%信赖区间)。
当使用KinExA测定法研究时，溶液中hu-PD-和猕猴-PD-1针对mAb7的结合亲和力彼此不可区分；在23℃的表观平衡常数(KD)值对于hu-PD-1被测定为17 pM或23 pM(当在相反检测方向中研究时)和对于猕猴-PD-1被测定为28 pM；这三个值在统计学上彼此不可区分。这些值通过表面等离子共振(SPR)生物传感器测量扼要重述，其得到下列KD值：在25℃对于hu-PD-1为42 pM和对于猕猴-PD-1为69 pM，和在37℃对于hu-PD-1为109 pM和对于猕猴-PD-1为115 pM。当于以0.5 µM用SPR动力学分析测试时，mAb7以KD值0.9 µM结合小鼠-PD-1且没有检测到对大鼠-PD-1的结合。无标记的生物传感器用于证明mAb7阻断hu-PD-1结合其天然配体，人类程序性死亡-配体1(hu-PD-L1)和人类程序性死亡-配体2(hu-PD-L2)。SPR进一步用于确认mAb7以与同种型匹配的对照相同的动力学和特异性结合一定范围的来自人类和猕猴物种两者的可结晶片段(Fc)伽马受体(FCGR)和新生儿Fc受体(FcRn)。通过ELISA，mAb7显示与补体成分1，q亚成分(C1q)的可忽略结合，与同种型匹配的对照的行为一致。整体来说，mAb7以高结合亲和力和特异性结合hu-PD-1和猕猴-PD-1两者，但具有对小鼠-PD-1的低亲和力和对大鼠-PD-1的可忽略结合。
表23概述mAb7与来自各种物种的PD-1的相互作用分析所获得的动力学和亲和力数据。当使用KinExA方法在23℃下在溶液中测量这些相互作用时，mAb7以统计上不可区分的表观亲和力结合hu-PD-1和猕猴-PD-1；表观KD值对于hu-PD-1为17 pM和23 pM(当在两个相反测定方向中研究时)和对于猕猴-PD-1为28 pM。KinExA值通过以SPR进行的动力学测量而证实，SPR给出在25℃的表观KD值对于hu-PD-1为42 ± 11 pM (n=10)和对于猕猴-PD-1为69 ± 24 pM (n=10)。在37℃的SPR测量显示2倍较弱于在25℃的亲和力的亲和力；在37℃的KD值对于hu-PD-1被确定为109 ± 8 pM (n=15)和对于猕猴-PD-1被确定为115 ± 15pM (n=8)。当以SPR在25℃测量时，mAb7以0.9 ± 0.1 µM (n=5)的表观KD结合小鼠PD-1，其对应于20,000-倍较弱于hu-PD-1的亲和力的亲和力。尽管大鼠-PD-1蛋白经由它们与阳性对照、小鼠-PD-L1和小鼠-PD-L2的明确结合而确认为活性，当以0.5 µM通过SPR在25℃测量时，没有检测到对于大鼠PD-1的结合。KinExA测量的KD值表示N个独立实验的全局分析的最佳拟合和95%信赖区间，而SPR测量的KD值表示在ProteOn NLC传感器芯片上n个独立实验的平均值±标准偏差。在表23中，h或hu=人类；ka=结合速率常数；kd=解离速率常数；KD=平衡解离常数； KinExA=动力学排除测定法；mAb=单克隆抗体；Ms=每秒摩尔浓度；n=数目；ND=未测定；PD-1=程序性死亡-1；s=秒；SPR=表面等离子共振；Temp=温度；*mAb与hu-PD-17的相互作用在如Bee等人, 2012中所述的两个相反检测方向中进行。
表23：对于PF 06801591与人PD-1、猕猴PD-1和小鼠PD-1的相互作用获得的动力学和亲和力常数的概述
Figure 992631DEST_PATH_IMAGE045
表24显示mAb7在一定范围的Fc受体(包括来自人类和猕猴的FCGR和FcRn)的结合动力学和特异性扼要重述对于同种型匹配的同种型对照hu-IgG4预期的那些值。例如，与同种型对照的177 ± 71 pM (n=4)相比，mAb7以在25℃的146 ± 42 pM (n=14)的表观KD值(平均值±标准偏差)结合hu-FCGRI。所有其他相互作用的特征在于弱亲和力(KD值~ 1 µM或更高)。对于FCGR以pH 7.4和对于FcRn以pH 5.9在ProteOn NLC芯片上进行动力学分析。在表24中，CD=分化簇；cy=猕猴；FCGR=Fc伽马受体； FcRn=新生儿Fc受体；hu=人类；ka=结合速率常数；kd=解离速率常数；KD=平衡解离常数；=每秒摩尔浓度；n=数目；s=秒。
表24
Figure 353205DEST_PATH_IMAGE046
此外，通过ELISA，mAb7几乎不结合C1q，这与同种型匹配的对照hu-IgG4的行为一致(数据未显示)。其结合甚至低于人类免疫球蛋白G2(hu-IgG2)的低结合。相比之下，阳性对照hu-IgG1和人类免疫球蛋白G3(hu-IgG3)给出高结合信号。使用SPR和Octet生物传感器两者和不同测定格式(预混合和经典夹心测定格式)，证实mAb7阻断hu-PD-1结合其天然配体hu-PD-L1与hu-PD-L2。
这些数据证实mAb7以高亲和力与高特异性结合hu-PD-1。当使用KinExA方法在23℃于溶液中测量时，mAb7以统计上不可区分的表观KD值结合hu-PD-1和猕猴-PD-1，对于hu-PD-1，表观KD值为17 pM和23 pM(当于交替测定方向研究时)，而对于猕猴-PD-1，表观KD值为28 pM。当以0.5 µM测试时，mAb7显示对小鼠-PD-1的20,000-倍较弱的亲和力(以SPR在25℃的表观KD为0.9 µM)，而对于大鼠PD-1没有可检测的结合。当以SPR在25℃测量时，当针对一组hu-Fc受体和猕猴-Fc受体测试时，mAb7和同种型匹配的对照hu-IgG4以相似动力学和特异性结合。当以ELISA测试时，mAb7以可忽略信号结合hu-C1q，这与hu-IgG4同种型对照一致，且其结合甚至低于hu-IgG2的结合。已证明mAb7阻断hu-PD-1结合其天然配体hu-PD-L1与hu-PD-L2。
实施例13：以抗PD-1抗体与抗OX40抗体的组合治疗
本实施例说明在结肠癌的小鼠模型中以抗PD-1抗体和抗OX40抗体的组合治疗的效应。
对于此研究，以5x105个细胞/小鼠的MC-38小鼠结肠肿瘤(等级III腺瘤)皮下接种C57B6/J雌性小鼠(6至8周龄)。在第10天，将小鼠随机化并开始以10 mg/kg抗小鼠-PD-1和1mg/kg抗小鼠-OX-40处理。对于抗OX40抗体(1 mg/kg)，在第10、12和14天i.p.施用处理；和对于抗PD-1抗体(10 mg/kg)，在第10、12、14、17、23和25天i.p.施用处理。肿瘤体积每周测量2次。在第34天结束此研究。使用2因子Anova进行统计分析以在单一时间点比较各两组群之间的平均值。结果概述于表25中。在表25中，值表明每组8只小鼠的所示日的肿瘤体积平均值± (平均值的标准偏差)sem；N=每组数目，mm2=立方毫米。同种型对照包括各抗体的适当同种型，对于抗OX40为1 mg/kg而对于抗PD-1为10 mg/kg。
表25. 在用抗PD-1抗体和抗OX40抗体处理后携带MC38的小鼠中的肿瘤体积
Figure 740324DEST_PATH_IMAGE048
在第24天开始，当与对照组相比，所有抗PD-1抗体和/或抗OX-40抗体处理的组显示显著较小肿瘤体积(表25)。在第24天，当与同种型对照组相比时，组合(抗PD-1抗体加上抗OX40抗体)处理的组显示显著性为p≤0.0001，而当与对照组相比时，各单一抗体处理显示显著性为p≤0.01。第34天，当与对照组相比时，所有处理组显示显著性为p≤0.0001。第34天，当与单独抗PD-1抗体处理的组或单独OX-40抗体处理的组相比时，组合处理的组显示差异。这些结果证实，当与以单独任一抗体治疗相比时，以抗PD-1抗体和抗OX40抗体两者治疗减缓肿瘤生长。
实施例14：疫苗对活化的T细胞上PD-1表达的效应
本实施例说明，在抗CTLA4单克隆抗体曲美目单抗(检查点抑制剂)存在的情况下，表达人类前列腺特异性膜抗原(PSMA)的基于DNA的疫苗对CD3+CD4细胞上PD-1表达的效应(表26)和对CD3+CD8T细胞上PD-1表达的效应(表27)。
体内研究程序。此研究中使用三个中国食蟹猕猴(Chinese cynomolgusmacaques)组(n=8/组)。组1与组2中的动物肌肉内注射含有编码人类PSMA的氨基酸15至750的AdC68腺病毒载体(SEQ ID NO: 44)的疫苗(总剂量为2e11 VP)，而组3中的动物没有接受疫苗接种。AdC68腺病毒载体的完整序列提供在SEQ ID NO: 44。此外，疫苗接种后立即通过皮下注射以50 mg抗CTLA4单克隆抗体曲美目单抗处理组2中的动物。在第9、15和29天收集来自疫苗接种之前(Pre)与之后各动物的全血样品并通过流式细胞仪分析表达PD-1的CD3+CD4和CD3+CD8 T细胞的频率。
CD3+ CD4和CD8 T细胞表型分析。在新鲜收集的全血上，通过进行多色流式细胞术分析对白细胞群体表型分析。简言之，在室温以含有CD3-V500(克隆SP34-2)、CD4-BV605(克隆L200)、CD8-APC.H7(克隆SK1)、PD1-AF488(克隆EH12.2H7, Biolegend)、PDL1-BV421(克隆MIH1)、Lag3-PE.Cy7(克隆11E3, Novus)、CD69-PE.德克萨斯红(克隆TP1.553, BeckmanCoulter)、TIM3-APC(克隆344823, R&D Systems)、CD20-PE.Cy5.5(克隆2H7,eBioscience)、CD14-AF700(克隆M5E2)、CD16-PE.Cy5(克隆3G8)、CD56-PerCP.Cy5.5(克隆B159)和CD11c-PE(克隆SHCL3)的抗体混合物将全血染色20分钟。除非另有表明，所有抗体购自BD。样品以RBC裂解缓冲液(BD)处理、洗涤并与50ml液体计数珠(BD)混合并在LSRFortessa (BD)上获取。使用FlowJo (Tree Star Inc, USA)分析数据。
在表26中呈现CD3+CD4 T细胞上PD-1表达的结果且在表27中呈现CD3+CD8 T细胞上PD-1表达的结果。在疫苗接种后9天观察到PD-1的诱导且其在疫苗接种后第29天回复至未经活化动物中所见的水平(组群3)。这些结果表明，在非人类灵长类动物中，与抗CTLA4抗体一起给予的疫苗载体可引发CD3+ CD4和CD8 T细胞上的PD-1表达。
表26. 食蟹猕猴中的CD3+CD4 T细胞上的PD-1表达动力学
Figure 424639DEST_PATH_IMAGE049
表27. 食蟹猕猴中的CD3+CD8 T细胞上的PD-1表达动力学
Figure DEST_PATH_IMAGE050
实施例15.抗PD-1抗体对表达人类PSMA的疫苗所诱导的抗原特异性T细胞响应的 效应
本实施例说明，食蟹猕猴中抗PD1抗体对含有表达人类PSMA的AdC68腺病毒载体的疫苗所诱导的IFNγ CD4和CD8 T细胞响应的效应。
细胞内细胞因子染色(ICS)测定法。简言之，来自个别动物的PBMC与来自跨越分别的抗原的整个序列重叠11个氨基酸的15聚体(15mer)肽文库的肽合并物共培养，各肽为2 µg/ml。在37℃，5% CO2培养所述板~16小时。接着将细胞染色以检测CD8+T细胞的细胞内IFNγ表达，并固定。在流式细胞仪上取得细胞。将响应频率针对每百万个CD8+T细胞的IFNγ CD8+T细胞数目均一化，其中减掉不含有肽的二甲基亚砜对照孔中的响应。表中的抗原特异性响应表示对于对应抗原特异性肽合并物的响应之和。
体内研究程序。简言之，五个中国食蟹猕猴组群(n=8/组群)以总剂量2e11 VP肌肉内注射含有编码人类PSMA(hPSMA)的氨基酸15至750的AdC68腺病毒(SEQ ID NO: 44)的疫苗。在组群2、4和5中，疫苗接种后立即通过皮下注射50 mg抗CTLA4单克隆抗体曲美目单抗和/或皮下(组群3和4)或静脉内(组群5)给予10 mg/kg抗PD-1单克隆抗体mAb7。自各动物分离PBMC并使其经历ICCS测定法以测量人类PSMA特异性IFNγ CD4 T细胞响应(第9天或第29天)或CD8 T细胞响应(第29天)。全长人类PSAM的氨基酸序列提供在SEQ ID NO: 42。表达人类PSMA的氨基酸15至750的AdC68腺病毒载体的序列提供在SEQ ID NO: 44。
结果。在表29、30和31中呈现结果。数据证实抗CTLA4和抗PD-1两者个别地都可增加该疫苗所诱导的IFNγ CD4和CD8 T细胞响应的频率。
表28. 在ELISpot和ICCS测定法中用以诱导抗原特异性IFNγ T细胞响应的肽合 并物的肽序列信息。
抗原 肽文库合并物
人类PSMA 185个顺序15聚体肽，重叠11个氨基酸，涵盖整个全长hPSMA蛋白序列(氨基酸序列：1至750)，作为三个分开合并物测定。
表29. 在第9天由疫苗诱导的IFNγ CD8 T-细胞应答
Figure DEST_PATH_IMAGE052
表30. 在第9天由疫苗诱导的IFNγ CD4 T-细胞应答
Figure DEST_PATH_IMAGE054
表31. 在第29天由疫苗诱导的IFNγ CD4 T-细胞应答
Figure DEST_PATH_IMAGE056
实施例16. 抗PD-1抗体对共表达人类前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞 抗原(PSCA)和前列腺特异性抗原(PSA)的疫苗所诱导的IFNγ T细胞响应的效应
体内研究程序。简言之，此研究中使用三个中国食蟹猕猴组群(n=4/组群)。组群1中的动物肌肉内注射媒介物。组群2中的动物皮下施用20 mg/kg抗PD-1单克隆抗体mAb7。组群3中动物以总剂量为6e11 VP的含有共表达三种人类前列腺相关抗原(PSMA、PSCA和PSA)的AdC68腺病毒载体(载体AdC68W-734)的疫苗处理，随后立即皮下注射150 mg抗CTLA4抗体曲美目单抗和20 mg/kg抗PD-1单克隆抗体mAb7。注射后28天，以媒介物(组群1)、抗PD-1单克隆抗体mAb7皮下20 mg/kg(组群2)或通过电穿孔递送的表达三种人类前列腺癌抗原(PSMA、PSCA和PSA)的DNA质粒(质粒458)，随后立即皮下注射150 mg抗CTLA4和20 mg/kg抗PD-1单克隆抗体(组群3)加强动物。引发首次注射后四十三天，自各动物分离PBMC并使其经历ELISPOT测定法，以测量PSMA、PSCA和PSA特异性的IFNγ T细胞响应。
用于此研究中的载体AdC68W-734的完整序列提供于本公开的SEQ ID NO: 45和国际申请公开WO2015/063647的SEQ ID NO: 63。载体AdC68W-734的构建也描述于WO2015/063647，其公开内容通过引用并入本文。AdC68W-734载体和质粒458各包含(1)编码具有SEQID NO: 42的序列的人类PSMA的氨基酸15至750的核苷酸序列，(2)编码具有SEQ ID NO: 47的序列的人类PSA的氨基酸25至261的核苷酸序列，和(3)编码SEQ ID NO: 48的全长人类PSCA的核苷酸序列。
IFNγ ELISPOT测定法。简言之，来自个别动物的外周血液单核细胞(PBMC)与来自跨越分别的抗原的整个序列的重叠11个氨基酸的15聚体肽文库的肽合并物一式两份共培养，各肽为2 µg/ml。根据制造商的说明，在37℃，5% CO2培养所述板~16小时，接着洗涤并显色。以CTL读取器计数形成IFNγ斑点的细胞(SFC)的数目。计算一式两份的平均值并减掉不含有肽的阴性对照孔的响应。接着将SFC计数均一化以描述每1e6个PBMC的响应。表中的抗原特异性响应表示对对应抗原特异性肽合并物的响应之和。
结果。在表33中呈现的ELISpot结果证实，接受该疫苗与皮下抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体的动物展现对于至少一种前列腺癌抗原的IFNγ T细胞响应的强烈增加，而在媒介物组群(组群1)或单独施用抗PD-1抗体的组群(组群2)中，对这些抗原没有IFNγ T细胞响应。
表32. ELISpot和ICCS测定法中用以诱导抗原特异性IFNγ T细胞响应的肽合并 物的肽序列信息。
抗原 肽文库合并物
PSMA 185个顺序15聚体肽，重叠11个氨基酸，涵盖整个全长PSMA蛋白序列(氨基酸序列：1至750)，作为三个分开合并物测定。
PSCA 28个顺序15聚体肽，重叠11个氨基酸，涵盖整个全长PSCA蛋白序列(氨基酸序列：1至123)，作为单一分开合并物测定。
PSA 62个顺序15聚体肽，重叠11个氨基酸，涵盖整个全长PSA蛋白序列(氨基酸序列：1至246)，作为单一分开合并物测定。
表33. 在食蟹猕猴中抗PD-1抗体对疫苗诱导的抗原特异性IFNγ ELISpot T-细胞应答的效应。
Figure DEST_PATH_IMAGE058
尽管所公开的教导已通过参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述，应理解可进行各种改变和修饰而不背离本文的教导和以下请求保护的发明。提供前述实施例以更好地说明本公开的教导，并非意图限制本文呈现的教导的范围。尽管本教导已就这些示例性实施方案描述，本领域技术人员将容易理解可能对这些示例性实施方案进行许多变化和修饰而无须过度实验。所有此类变化和修饰都在目前教导的范围内。
所有本文中引用的参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，和本文中引用的参考文献，在其尚未引用的程度上，通过引用以其整体并入本文。在并入的文献和相似材料的一者或多者与本申请有不同或冲突(包括但不限于定义的术语、术语使用、所描述的技术等)的情况下，以本申请为主。
前面的描述和实施例详细描述本发明的某些特定实施方案，并描述发明人所考虑的最佳模式。然而应理解的是，不论前述内容在文本中可看起来多详细，本发明可以以许多方式实施，且应当根据随附的权利要求和其任何等效物进行解读。
序列表
<110> RINAT NEUROSCIENCE CORP.
<120> 抗PD-1抗体及其使用方法
<130> PC72121A
<150> US 62/089,658
<151> 2014-12-09
<150> US 62/242,750
<151> 2015-10-16
<150> US 62/251,973
<151> 2015-11-06
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Thr Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Trp Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Tyr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Tyr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser
20 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 11
Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 12
Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 13
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 14
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 15
Ser Tyr Trp Ile Asn
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 16
Tyr Pro Gly Ser Ser Leu
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 17
Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 18
Leu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Tyr
1 5
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 20
Trp Thr Ser Tyr Arg Glu Ser
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 21
Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro His Thr
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 22
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser Thr Asn Gln Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 23
Leu Ser Thr Gly Thr Phe Ala Tyr
1 5
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 24
Tyr Pro Gly Ser Ser Ile
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 25
Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 26
Leu Thr Thr Gly Thr Phe Ala Tyr
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 27
Trp Pro Gly Ser Ser Leu
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 28
Asn Ile Trp Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 29
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 30
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 31
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Trp或Leu
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Gly或Thr
<400> 32
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Xaa Asp Ser Xaa Asn Gln Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Thr或Tyr
<400> 33
Trp Thr Ser Xaa Arg Glu Ser
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Phe或Ser
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Leu或His
<400> 34
Gln Asn Asp Tyr Xaa Tyr Pro Xaa Thr
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 35
Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Tyr或Trp
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Leu, Ile,或Ser
<400> 36
Asn Ile Xaa Pro Gly Ser Ser Xaa Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Leu或Ser
<400> 37
Leu Xaa Thr Gly Thr Phe Ala Tyr
1 5
<210> 38
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 39
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Tyr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Phe Tyr Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
145 150 155 160
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
165 170 175
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
180 185 190
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
195 200 205
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 40
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb7重链可变区DNA序列
<400> 40
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaagaaac caggagccag cgtgaaagtg 60
agttgtaagg catccggcta tacctttacc tcttactgga tcaattgggt gaggcaggca 120
cctggccagg gcctggaatg gatgggaaat atctatcccg gctctagctt gactaactac 180
aatgaaaagt ttaagaatcg cgtgaccatg acccgggaca ctagcacctc caccgtgtac 240
atggagctgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtct actattgtgc ccgcctgagt 300
accgggacct ttgcctactg gggacagggt acactggtca ccgtctcctc a 351
<210> 41
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb7轻链可变区DNA序列
<400> 41
gacatcgtga tgactcagtc tcccgatagc ctggcagtca gcctgggaga gcgggccacc 60
ataaactgca aaagctcgca gtcgctgtgg gacagtggta atcagaagaa tttcctgacc 120
tggtaccagc agaagcctgg ccagccaccc aagctgctga tctactggac ctcatatcgg 180
gagtccgggg tgcccgacag attctctgga agtggcagcg gtacggactt cacactgacc 240
atatccagtc tgcaagctga ggacgtggct gtttattact gccagaacga ctacttttat 300
cctcacactt tcggaggcgg taccaaggtc gagatcaaa 339
<210> 42
<211> 750
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 43
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 43
atggctagcg ccagacgccc cagatggctg tgtgctggcg ctctggtgct ggctggcggc 60
ttcttcctgc tgggcttcct gttcggctgg ttcatcaagt cctccaacga ggccaccaac 120
atcaccccca agcacaacat gaaggccttt ctggacgagc tgaaggccga gaatatcaag 180
aagttcctgt acaacttcac ccagatcccc cacctggccg gcaccgagca gaacttccag 240
ctggccaagc agatccagtc ccagtggaaa gagttcggcc tggactccgt ggaactggcc 300
cactacgacg tgctgctgtc ctaccccaac aagacccacc ccaactacat ctccatcatc 360
aacgaggacg gcaacgaaat cttcaacacc tccctgttcg agcccccacc cccaggctac 420
gagaacgtgt ccgacatcgt gcccccattc tccgccttca gtccacaagg catgcccgag 480
ggcgacctgg tgtacgtgaa ctacgccagg accgaggact tcttcaagct ggaacgcgac 540
atgaagatca actgctccgg caagatcgtg atcgccagat acggcaaggt gttcaggggc 600
aacaaagtga agaacgccca gctggctggg gccaagggcg tgatcctgta ctccgacccc 660
gccgactact tcgccccagg cgtgaagtcc taccccgacg gatggaacct gccaggcggc 720
ggagtgcaga ggggcaacat cctgaacctg aacggcgctg gcgaccccct gaccccagga 780
tacccagcca acgagtacgc ctacagaaga ggaatcgccg aggccgtggg cctgccctct 840
atcccagtgc accccatcgg ctactacgac gcccagaaac tgctggaaaa gatgggcggc 900
tccgccccac ccgactcctc ttggagaggc tccctgaagg tgccctacaa cgtgggccca 960
ggcttcaccg gcaacttctc cacccagaaa gtgaagatgc acatccactc caccaacgaa 1020
gtgaccagga tctacaacgt gatcggcacc ctgagaggcg ccgtggaacc cgacagatac 1080
gtgatcctgg gcggccacag ggacagctgg gtgttcggcg gcatcgaccc acagtctggc 1140
gccgctgtgg tgcacgagat cgtgcggtcc ttcggaaccc tgaagaaaga gggatggcgc 1200
cccagaagga ccatcctgtt cgccagctgg gacgccgagg aattcggcct gctgggatcc 1260
accgagtggg ccgaggaaaa ctccaggctg ctgcaggaac gcggcgtcgc ctacatcaac 1320
gccgactcct ccatcgaggg caactacacc ctgagggtgg actgcacccc cctgatgtac 1380
tccctggtgc acaacctgac caaagagctg aagtcccccg acgagggctt cgagggcaag 1440
tccctgtacg agtcctggac caagaagtcc ccatcccccg agttctccgg catgcccagg 1500
atctccaagc tgggctccgg caacgacttc gaggtgttct tccagaggct gggaatcgcc 1560
tccggcaggg ccagatacac caagaactgg gagacaaaca agttctccgg ataccccctg 1620
taccactccg tgtacgaaac ctacgagctg gtggaaaagt tctacgaccc catgttcaag 1680
taccacctga ccgtggccca agtccgcgga ggcatggtgt tcgagctggc caactccatc 1740
gtgctgccct tcgactgcag agactacgcc gtggtgctga ggaagtacgc cgacaaaatc 1800
tactccatct ccatgaagca cccccaggaa atgaagacct actccgtgtc cttcgactcc 1860
ctgttctccg ccgtgaagaa tttcaccgag atcgcctcca agttcagcga gaggctgcag 1920
gacttcgaca agtccaaccc aatcgtgctg aggatgatga acgaccagct gatgttcctg 1980
gaaagggcct tcatcgaccc cctgggcctg ccagacagac ccttctacag gcacgtgatc 2040
tacgccccat cctcccacaa caaatacgcc ggcgagtcct tccccggcat ctacgatgcc 2100
ctgttcgaca tcgagtccaa ggtggacccc tccaaggcct ggggcgaagt gaagaggcaa 2160
atctacgtgg ccgccttcac agtgcaagcc gctgccgaaa ccctgtccga ggtggcc 2217
<210> 44
<211> 33562
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 44
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttactactg taatagtaat caattacggg 480
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 540
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 600
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 660
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 720
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 780
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 840
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 900
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 960
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 1020
tgtccctatc agtgatagag atctccctat cagtgataga gagtttagtg aaccgtcaga 1080
tccgctaggg taccgcgatc accatggcta gcgccagacg ccccagatgg ctgtgtgctg 1140
gcgctctggt gctggctggc ggcttcttcc tgctgggctt cctgttcggc tggttcatca 1200
agtcctccaa cgaggccacc aacatcaccc ccaagcacaa catgaaggcc tttctggacg 1260
agctgaaggc cgagaatatc aagaagttcc tgtacaactt cacccagatc ccccacctgg 1320
ccggcaccga gcagaacttc cagctggcca agcagatcca gtcccagtgg aaagagttcg 1380
gcctggactc cgtggaactg gcccactacg acgtgctgct gtcctacccc aacaagaccc 1440
accccaacta catctccatc atcaacgagg acggcaacga aatcttcaac acctccctgt 1500
tcgagccccc acccccaggc tacgagaacg tgtccgacat cgtgccccca ttctccgcct 1560
tcagtccaca aggcatgccc gagggcgacc tggtgtacgt gaactacgcc aggaccgagg 1620
acttcttcaa gctggaacgc gacatgaaga tcaactgctc cggcaagatc gtgatcgcca 1680
gatacggcaa ggtgttcagg ggcaacaaag tgaagaacgc ccagctggct ggggccaagg 1740
gcgtgatcct gtactccgac cccgccgact acttcgcccc aggcgtgaag tcctaccccg 1800
acggatggaa cctgccaggc ggcggagtgc agaggggcaa catcctgaac ctgaacggcg 1860
ctggcgaccc cctgacccca ggatacccag ccaacgagta cgcctacaga agaggaatcg 1920
ccgaggccgt gggcctgccc tctatcccag tgcaccccat cggctactac gacgcccaga 1980
aactgctgga aaagatgggc ggctccgccc cacccgactc ctcttggaga ggctccctga 2040
aggtgcccta caacgtgggc ccaggcttca ccggcaactt ctccacccag aaagtgaaga 2100
tgcacatcca ctccaccaac gaagtgacca ggatctacaa cgtgatcggc accctgagag 2160
gcgccgtgga acccgacaga tacgtgatcc tgggcggcca cagggacagc tgggtgttcg 2220
gcggcatcga cccacagtct ggcgccgctg tggtgcacga gatcgtgcgg tccttcggaa 2280
ccctgaagaa agagggatgg cgccccagaa ggaccatcct gttcgccagc tgggacgccg 2340
aggaattcgg cctgctggga tccaccgagt gggccgagga aaactccagg ctgctgcagg 2400
aacgcggcgt cgcctacatc aacgccgact cctccatcga gggcaactac accctgaggg 2460
tggactgcac ccccctgatg tactccctgg tgcacaacct gaccaaagag ctgaagtccc 2520
ccgacgaggg cttcgagggc aagtccctgt acgagtcctg gaccaagaag tccccatccc 2580
ccgagttctc cggcatgccc aggatctcca agctgggctc cggcaacgac ttcgaggtgt 2640
tcttccagag gctgggaatc gcctccggca gggccagata caccaagaac tgggagacaa 2700
acaagttctc cggatacccc ctgtaccact ccgtgtacga aacctacgag ctggtggaaa 2760
agttctacga ccccatgttc aagtaccacc tgaccgtggc ccaagtccgc ggaggcatgg 2820
tgttcgagct ggccaactcc atcgtgctgc ccttcgactg cagagactac gccgtggtgc 2880
tgaggaagta cgccgacaaa atctactcca tctccatgaa gcacccccag gaaatgaaga 2940
cctactccgt gtccttcgac tccctgttct ccgccgtgaa gaatttcacc gagatcgcct 3000
ccaagttcag cgagaggctg caggacttcg acaagtccaa cccaatcgtg ctgaggatga 3060
tgaacgacca gctgatgttc ctggaaaggg ccttcatcga ccccctgggc ctgccagaca 3120
gacccttcta caggcacgtg atctacgccc catcctccca caacaaatac gccggcgagt 3180
ccttccccgg catctacgat gccctgttcg acatcgagtc caaggtggac ccctccaagg 3240
cctggggcga agtgaagagg caaatctacg tggccgcctt cacagtgcaa gccgctgccg 3300
aaaccctgtc cgaggtggcc tgaatcgcac ctcgagattt aaatctgatc ataatcagcc 3360
ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc 3420
tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 3480
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 3540
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatatgct ggccaccgta catgtggctt 3600
cccatgctcg caagccctgg cccgagttcg agcacaatgt catgaccagg tgcaatatgc 3660
atctggggtc ccgccgaggc atgttcatgc cctaccagtg caacctgaat tatgtgaagg 3720
tgctgctgga gcccgatgcc atgtccagag tgagcctgac gggggtgttt gacatgaatg 3780
tggaggtgtg gaagattctg agatatgatg aatccaagac caggtgccga gcctgcgagt 3840
gcggagggaa gcatgccagg ttccagcccg tgtgtgtgga tgtgacggag gacctgcgac 3900
ccgatcattt ggtgttgccc tgcaccggga cggagttcgg ttccagcggg gaagaatctg 3960
actagagtga gtagtgttct ggggcggggg aggacctgca tgagggccag aataactgaa 4020
atctgtgctt ttctgtgtgt tgcagcagca tgagcggaag cggctccttt gagggagggg 4080
tattcagccc ttatctgacg gggcgtctcc cctcctgggc gggagtgcgt cagaatgtga 4140
tgggatccac ggtggacggc cggcccgtgc agcccgcgaa ctcttcaacc ctgacctatg 4200
caaccctgag ctcttcgtcg ttggacgcag ctgccgccgc agctgctgca tctgccgcca 4260
gcgccgtgcg cggaatggcc atgggcgccg gctactacgg cactctggtg gccaactcga 4320
gttccaccaa taatcccgcc agcctgaacg aggagaagct gttgctgctg atggcccagc 4380
tcgaggcctt gacccagcgc ctgggcgagc tgacccagca ggtggctcag ctgcaggagc 4440
agacgcgggc cgcggttgcc acggtgaaat ccaaataaaa aatgaatcaa taaataaacg 4500
gagacggttg ttgattttaa cacagagtct gaatctttat ttgatttttc gcgcgcggta 4560
ggccctggac caccggtctc gatcattgag cacccggtgg atcttttcca ggacccggta 4620
gaggtgggct tggatgttga ggtacatggg catgagcccg tcccgggggt ggaggtagct 4680
ccattgcagg gcctcgtgct cgggggtggt gttgtaaatc acccagtcat agcaggggcg 4740
cagggcatgg tgttgcacaa tatctttgag gaggagactg atggccacgg gcagcccttt 4800
ggtgtaggtg tttacaaatc tgttgagctg ggagggatgc atgcgggggg agatgaggtg 4860
catcttggcc tggatcttga gattggcgat gttaccgccc agatcccgcc tggggttcat 4920
gttgtgcagg accaccagca cggtgtatcc ggtgcacttg gggaatttat catgcaactt 4980
ggaagggaag gcgtgaaaga atttggcgac gcctttgtgc ccgcccaggt tttccatgca 5040
ctcatccatg atgatggcga tgggcccgtg ggcggcggcc tgggcaaaga cgtttcgggg 5100
gtcggacaca tcatagttgt ggtcctgggt gaggtcatca taggccattt taatgaattt 5160
ggggcggagg gtgccggact gggggacaaa ggtaccctcg atcccggggg cgtagttccc 5220
ctcacagatc tgcatctccc aggctttgag ctcggagggg gggatcatgt ccacctgcgg 5280
ggcgataaag aacacggttt ccggggcggg ggagatgagc tgggccgaaa gcaagttccg 5340
gagcagctgg gacttgccgc agccggtggg gccgtagatg accccgatga ccggctgcag 5400
gtggtagttg agggagagac agctgccgtc ctcccggagg aggggggcca cctcgttcat 5460
catctcgcgc acgtgcatgt tctcgcgcac cagttccgcc aggaggcgct ctccccccag 5520
ggataggagc tcctggagcg aggcgaagtt tttcagcggc ttgagtccgt cggccatggg 5580
cattttggag agggtttgtt gcaagagttc caggcggtcc cagagctcgg tgatgtgctc 5640
tacggcatct cgatccagca gacctcctcg tttcgcgggt tgggacggct gcgggagtag 5700
ggcaccagac gatgggcgtc cagcgcagcc agggtccggt ccttccaggg tcgcagcgtc 5760
cgcgtcaggg tggtctccgt cacggtgaag gggtgcgcgc cgggctgggc gcttgcgagg 5820
gtgcgcttca ggctcatccg gctggtcgaa aaccgctccc gatcggcgcc ctgcgcgtcg 5880
gccaggtagc aattgaccat gagttcgtag ttgagcgcct cggccgcgtg gcctttggcg 5940
cggagcttac ctttggaagt ctgcccgcag gcgggacaga ggagggactt gagggcgtag 6000
agcttggggg cgaggaagac ggactcgggg gcgtaggcgt ccgcgccgca gtgggcgcag 6060
acggtctcgc actccacgag ccaggtgagg tcgggctggt cggggtcaaa aaccagtttc 6120
ccgccgttct ttttgatgcg tttcttacct ttggtctcca tgagctcgtg tccccgctgg 6180
gtgacaaaga ggctgtccgt gtccccgtag accgacttta tgggccggtc ctcgagcggt 6240
gtgccgcggt cctcctcgta gaggaacccc gcccactccg agacgaaagc ccgggtccag 6300
gccagcacga aggaggccac gtgggacggg tagcggtcgt tgtccaccag cgggtccacc 6360
ttttccaggg tatgcaaaca catgtccccc tcgtccacat ccaggaaggt gattggcttg 6420
taagtgtagg ccacgtgacc gggggtcccg gccggggggg tataaaaggg tgcgggtccc 6480
tgctcgtcct cactgtcttc cggatcgctg tccaggagcg ccagctgttg gggtaggtat 6540
tccctctcga aggcgggcat gacctcggca ctcaggttgt cagtttctag aaacgaggag 6600
gatttgatat tgacggtgcc ggcggagatg cctttcaaga gcccctcgtc catctggtca 6660
gaaaagacga tctttttgtt gtcgagcttg gtggcgaagg agccgtagag ggcgttggag 6720
aggagcttgg cgatggagcg catggtctgg tttttttcct tgtcggcgcg ctccttggcg 6780
gcgatgttga gctgcacgta ctcgcgcgcc acgcacttcc attcggggaa gacggtggtc 6840
agctcgtcgg gcacgattct gacctgccag ccccgattat gcagggtgat gaggtccaca 6900
ctggtggcca cctcgccgcg caggggctca ttagtccagc agaggcgtcc gcccttgcgc 6960
gagcagaagg ggggcagggg gtccagcatg acctcgtcgg gggggtcggc atcgatggtg 7020
aagatgccgg gcaggaggtc ggggtcaaag tagctgatgg aagtggccag atcgtccagg 7080
gcagcttgcc attcgcgcac ggccagcgcg cgctcgtagg gactgagggg cgtgccccag 7140
ggcatgggat gggtaagcgc ggaggcgtac atgccgcaga tgtcgtagac gtagaggggc 7200
tcctcgagga tgccgatgta ggtggggtag cagcgccccc cgcggatgct ggcgcgcacg 7260
tagtcataca gctcgtgcga gggggcgagg agccccgggc ccaggttggt gcgactgggc 7320
ttttcggcgc ggtagacgat ctggcggaaa atggcatgcg agttggagga gatggtgggc 7380
ctttggaaga tgttgaagtg ggcgtggggc agtccgaccg agtcgcggat gaagtgggcg 7440
taggagtctt gcagcttggc gacgagctcg gcggtgacta ggacgtccag agcgcagtag 7500
tcgagggtct cctggatgat gtcatacttg agctgtccct tttgtttcca cagctcgcgg 7560
ttgagaagga actcttcgcg gtccttccag tactcttcga gggggaaccc gtcctgatct 7620
gcacggtaag agcctagcat gtagaactgg ttgacggcct tgtaggcgca gcagcccttc 7680
tccacgggga gggcgtaggc ctgggcggcc ttgcgcaggg aggtgtgcgt gagggcgaaa 7740
gtgtccctga ccatgacctt gaggaactgg tgcttgaagt cgatatcgtc gcagcccccc 7800
tgctcccaga gctggaagtc cgtgcgcttc ttgtaggcgg ggttgggcaa agcgaaagta 7860
acatcgttga agaggatctt gcccgcgcgg ggcataaagt tgcgagtgat gcggaaaggt 7920
tggggcacct cggcccggtt gttgatgacc tgggcggcga gcacgatctc gtcgaagccg 7980
ttgatgttgt ggcccacgat gtagagttcc acgaatcgcg gacggccctt gacgtggggc 8040
agtttcttga gctcctcgta ggtgagctcg tcggggtcgc tgagcccgtg ctgctcgagc 8100
gcccagtcgg cgagatgggg gttggcgcgg aggaaggaag tccagagatc cacggccagg 8160
gcggtttgca gacggtcccg gtactgacgg aactgctgcc cgacggccat tttttcgggg 8220
gtgacgcagt agaaggtgcg ggggtccccg tgccagcgat cccatttgag ctggagggcg 8280
agatcgaggg cgagctcgac gagccggtcg tccccggaga gtttcatgac cagcatgaag 8340
gggacgagct gcttgccgaa ggaccccatc caggtgtagg tttccacatc gtaggtgagg 8400
aagagccttt cggtgcgagg atgcgagccg atggggaaga actggatctc ctgccaccaa 8460
ttggaggaat ggctgttgat gtgatggaag tagaaatgcc gacggcgcgc cgaacactcg 8520
tgcttgtgtt tatacaagcg gccacagtgc tcgcaacgct gcacgggatg cacgtgctgc 8580
acgagctgta cctgagttcc tttgacgagg aatttcagtg ggaagtggag tcgtggcgcc 8640
tgcatctcgt gctgtactac gtcgtggtgg tcggcctggc cctcttctgc ctcgatggtg 8700
gtcatgctga cgagcccgcg cgggaggcag gtccagacct cggcgcgagc gggtcggaga 8760
gcgaggacga gggcgcgcag gccggagctg tccagggtcc tgagacgctg cggagtcagg 8820
tcagtgggca gcggcggcgc gcggttgact tgcaggagtt tttccagggc gcgcgggagg 8880
tccagatggt acttgatctc caccgcgcca ttggtggcga cgtcgatggc ttgcagggtc 8940
ccgtgcccct ggggtgtgac caccgtcccc cgtttcttct tgggcggctg gggcgacggg 9000
ggcggtgcct cttccatggt tagaagcggc ggcgaggacg cgcgccgggc ggcaggggcg 9060
gctcggggcc cggaggcagg ggcggcaggg gcacgtcggc gccgcgcgcg ggtaggttct 9120
ggtactgcgc ccggagaaga ctggcgtgag cgacgacgcg acggttgacg tcctggatct 9180
gacgcctctg ggtgaaggcc acgggacccg tgagtttgaa cctgaaagag agttcgacag 9240
aatcaatctc ggtatcgttg acggcggcct gccgcaggat ctcttgcacg tcgcccgagt 9300
tgtcctggta ggcgatctcg gtcatgaact gctcgatctc ctcctcttga aggtctccgc 9360
ggccggcgcg ctccacggtg gccgcgaggt cgttggagat gcggcccatg agctgcgaga 9420
aggcgttcat gcccgcctcg ttccagacgc ggctgtagac cacgacgccc tcgggatcgc 9480
gggcgcgcat gaccacctgg gcgaggttga gctccacgtg gcgcgtgaag accgcgtagt 9540
tgcagaggcg ctggtagagg tagttgagcg tggtggcgat gtgctcggtg acgaagaaat 9600
acatgatcca gcggcggagc ggcatctcgc tgacgtcgcc cagcgcctcc aaacgttcca 9660
tggcctcgta aaagtccacg gcgaagttga aaaactggga gttgcgcgcc gagacggtca 9720
actcctcctc cagaagacgg atgagctcgg cgatggtggc gcgcacctcg cgctcgaagg 9780
cccccgggag ttcctccact tcctcttctt cctcctccac taacatctct tctacttcct 9840
cctcaggcgg cagtggtggc gggggagggg gcctgcgtcg ccggcggcgc acgggcagac 9900
ggtcgatgaa gcgctcgatg gtctcgccgc gccggcgtcg catggtctcg gtgacggcgc 9960
gcccgtcctc gcggggccgc agcgtgaaga cgccgccgcg catctccagg tggccggggg 10020
ggtccccgtt gggcagggag agggcgctga cgatgcatct tatcaattgc cccgtaggga 10080
ctccgcgcaa ggacctgagc gtctcgagat ccacgggatc tgaaaaccgc tgaacgaagg 10140
cttcgagcca gtcgcagtcg caaggtaggc tgagcacggt ttcttctggc gggtcatgtt 10200
ggttgggagc ggggcgggcg atgctgctgg tgatgaagtt gaaataggcg gttctgagac 10260
ggcggatggt ggcgaggagc accaggtctt tgggcccggc ttgctggatg cgcagacggt 10320
cggccatgcc ccaggcgtgg tcctgacacc tggccaggtc cttgtagtag tcctgcatga 10380
gccgctccac gggcacctcc tcctcgcccg cgcggccgtg catgcgcgtg agcccgaagc 10440
cgcgctgggg ctggacgagc gccaggtcgg cgacgacgcg ctcggcgagg atggcttgct 10500
ggatctgggt gagggtggtc tggaagtcat caaagtcgac gaagcggtgg taggctccgg 10560
tgttgatggt gtaggagcag ttggccatga cggaccagtt gacggtctgg tggcccggac 10620
gcacgagctc gtggtacttg aggcgcgagt aggcgcgcgt gtcgaagatg tagtcgttgc 10680
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gccatcgctc ggtggcgggg gcgccgggcg cgaggtcctc gagcatggtg cggtggtagc 10800
cgtagatgta cctggacatc caggtgatgc cggcggcggt ggtggaggcg cgcgggaact 10860
cgcggacgcg gttccagatg ttgcgcagcg gcaggaagta gttcatggtg ggcacggtct 10920
ggcccgtgag gcgcgcgcag tcgtggatgc tctatacggg caaaaacgaa agcggtcagc 10980
ggctcgactc cgtggcctgg aggctaagcg aacgggttgg gctgcgcgtg taccccggtt 11040
cgaatctcga atcaggctgg agccgcagct aacgtggtat tggcactccc gtctcgaccc 11100
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ccggatgaga ctagtaagcg cggaaagcgg ccgaccgcga tggctcgctg ccgtagtctg 11220
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ggctaacgag ggcgtggctg ccccgtcgtt tccaagaccc catagccagc cgacttctcc 11340
agttacggag cgagcccctc ttttgttttg tttgtttttg ccagatgcat cccgtactgc 11400
ggcagatgcg cccccaccac cctccaccgc aacaacagcc ccctccacag ccggcgcttc 11460
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ccttcaacaa ccacgtgcgc accctgatcg cgcgcgagga ggtgaccctg ggcctgatgc 11940
acctgtggga cctgctggag gccatcgtgc agaaccccac cagcaagccg ctgacggcgc 12000
agctgttcct ggtggtgcag catagtcggg acaacgaagc gttcagggag gcgctgctga 12060
atatcaccga gcccgagggc cgctggctcc tggacctggt gaacattctg cagagcatcg 12120
tggtgcagga gcgcgggctg ccgctgtccg agaagctggc ggccatcaac ttctcggtgc 12180
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aggaggtgaa gatcgacggg ttttacatgc gcatgaccct gaaagtgctg accctgagcg 12300
acgatctggg ggtgtaccgc aacgacagga tgcaccgtgc ggtgagcgcc agcaggcggc 12360
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gcgagtacct ggaagactga tggcgcgacc gtatttttgc tagatgcaac aacaacagcc 12600
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cgccttcctc agcacccagc ccgccaacgt gccccggggc caggaggact acaccaactt 13080
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tttcaagaac ttgcagggcc tgtggggcgt gcaggccccg gtcggggacc gcgcgacggt 13260
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catcggccag gcgcacgtgg acgagcagac ctaccaggag atcacccacg tgagccgcgc 13440
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gcgcggccag cctgctgatg cccaactacg cgctgcatcc ttccatcatc cccacgccgg 17520
gctaccgcgg cacgcgcttc taccgcggtc ataccagcag ccgccgccgc aagaccacca 17580
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tgtaccgccg cggccgcgca cctctgaccc tgccgcgcgc gcgctaccac ccgagcatcg 17700
ccatttaaac tttcgcctgc tttgcagatc aatggccctc acatgccgcc ttcgcgttcc 17760
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ccctggacaa gcggggcgag aagcgacccc gccccgatgc ggaggagacg ctgctgacgc 18480
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tatacatatg gaaatgcacc cgtgcagggc attaacatca caaaagatgg tattcaactt 19380
ggaactgaca ccgatgatca gccaatctac gcagataaaa cctatcagcc tgaacctcaa 19440
gtgggtgatg ctgaatggca tgacatcact ggtactgatg aaaagtatgg aggcagagct 19500
cttaagcctg ataccaaaat gaagccttgt tatggttctt ttgccaagcc tactaataaa 19560
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cccatggaca acgtgaaccc cttcaaccac caccgcaatg cggggctgcg ctaccgctcc 20460
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tcggcggcca acatgctcta ccccatcccg gccaacgcca ccaacgtgcc catctccatc 20820
ccctcgcgca actgggccgc cttccgcggc tggtccttca cgcgtctcaa gaccaaggag 20880
acgccctcgc tgggctccgg gttcgacccc tacttcgtct actcgggctc catcccctac 20940
ctcgacggca ccttctacct caaccacacc ttcaagaagg tctccatcac cttcgactcc 21000
tccgtcagct ggcccggcaa cgaccggctc ctgacgccca acgagttcga aatcaagcgc 21060
accgtcgacg gcgagggcta caacgtggcc cagtgcaaca tgaccaagga ctggttcctg 21120
gtccagatgc tggcccacta caacatcggc taccagggct tctacgtgcc cgagggctac 21180
aaggaccgca tgtactcctt cttccgcaac ttccagccca tgagccgcca ggtggtggac 21240
gaggtcaact acaaggacta ccaggccgtc accctggcct accagcacaa caactcgggc 21300
ttcgtcggct acctcgcgcc caccatgcgc cagggccagc cctaccccgc caactacccc 21360
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ctcggccaga acatgctcta tgccaactcc gcccacgcgc tagacatgaa tttcgaagtc 21540
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ataagcgctt cccgggattc atggccccgc acaagctggc ctgcgccatc gtcaacacgg 21840
ccggccgcga gaccgggggc gagcactggc tggccttcgc ctggaacccg cgctcgaaca 21900
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tcgagtacga gggcctgctg cgccgcagcg ccctggccac cgaggaccgc tgcgtcaccc 22020
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gcatgttcct gcacgccttc gtgcactggc ccgaccgccc catggacaag aaccccacca 22140
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ccgtgtgtgt atgttaaatg tctttaataa acagcacttt catgttacac atgcatctga 22380
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tcatcttgca ggtctgcctt cccatggtgg gcacgcaccc gggcttgtgg ttgcaatcgc 22800
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cgggggtgcg ctcccggcgg cgctctgact gacttcctcc gcggccggcc attgtgttct 23940
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ccgccgacga gaagcagcag cagcagaatg aaagcttaac cgccccgccg cccagccccg 24060
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tgaggtatat tattgatgat gg 33562
<210> 45
<211> 34803
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 45
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ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 720
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 780
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 840
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 900
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 960
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 1020
tgtccctatc agtgatagag atctccctat cagtgataga gagtttagtg aaccgtcaga 1080
tccgctaggg taccaacatg gctagcatcg tcggagggtg ggagtgcgaa aagcactcac 1140
agccatggca ggtcctggtc gcctcgcgcg gacgcgccgt gtgtggaggt gtgctggtcc 1200
acccgcagtg ggtgttgact gcggcccatt gcatcagaaa taagtccgtg atcctcttgg 1260
ggagacattc cctgtttcac cccgaagata ctggacaggt gttccaagtg agccactcct 1320
tcccgcatcc actgtacgac atgagcctgc tgaagaaccg ctttctgcgg ccaggggacg 1380
actcatcaca cgatttgatg ctgcttcggc tctcggaacc ggccgagctc accgacgcag 1440
tgaaggtcat ggacctccct acgcaagagc ctgctctcgg taccacttgt tacgcatcgg 1500
gatggggctc catcgagccg gaagaattcc tgaccccgaa aaagctgcag tgcgtggatc 1560
tgcacgtgat ttcgaatgac gtgtgcgcgc aagtgcatcc acaaaaggtc actaagttca 1620
tgctgtgcgc cggaaggtgg accggcggaa aatcgacctg ttccggcgac agcggaggcc 1680
cactcgtgtg caacggtgtg ctgcagggca tcactagctg gggatcagaa ccgtgcgcgc 1740
ttccggagcg gccctcgctc tacacgaagg tggtgcacta ccgcaaatgg attaaagata 1800
ccatcgtcgc aaaccctgga tccgaaggta ggggttcatt attgacctgt ggagatgtcg 1860
aagaaaaccc aggacccgct agcaaagcag tgctgctggc gctcctgatg gctggactcg 1920
cgctgcagcc tggaaccgcc ctgctctgtt actcgtgcaa ggcccaagtc tcgaatgagg 1980
actgtttgca agtggaaaac tgcacccagc tcggagaaca atgctggact gcacggatcc 2040
gcgctgtcgg cctgctgacc gtgatctcca aagggtgctc attgaactgc gtggacgata 2100
gccaggacta ctacgtggga aagaagaata tcacttgttg cgacacggat ctttgcaacg 2160
cgtccggagc gcacgccctg cagccagcag ccgccattct ggccctgctt ccggccctgg 2220
ggttgctgct ctggggtccg ggccagctcg gatcccagac cctgaacttt gatctgctga 2280
aactggcagg cgatgtggaa agcaacccag gcccaatggc tagcgctcgc agaccgcggt 2340
ggctgtgtgc aggggcgctc gtcctggcgg gtggcttctt tttgctcggc tttcttttcg 2400
gatggttcat caaatcgtca aacgaagcta ccaatatcac cccgaagcac aacatgaagg 2460
cctttctgga tgagctgaag gctgagaaca ttaagaagtt cctctacaac ttcacccaga 2520
tcccacattt ggcgggcact gagcagaact ttcagttggc taagcagatc cagagccagt 2580
ggaaggaatt cggcctggac tccgtcgagc tggcgcatta cgatgtgctg ctgagctacc 2640
ctaataagac tcatccgaac tatatctcga ttatcaatga ggacggaaac gaaatcttta 2700
acacgtccct cttcgagccg ccaccgcctg gatacgagaa cgtgtcagat atcgtgcctc 2760
cgttctcggc cttctcgccc cagggaatgc ccgaagggga cctggtgtac gtgaactacg 2820
caaggaccga ggacttcttc aagttggagc gggatatgaa gatcaattgc agcggaaaga 2880
tcgtcatcgc ccgctacggc aaagtgttcc gcggcaacaa ggtgaagaat gcacagttgg 2940
caggcgccaa gggcgtcatc ctctactcgg atcctgccga ctacttcgct cctggcgtga 3000
aatcctaccc tgatggttgg aatctgccag gaggaggggt gcagagggga aatatcctga 3060
acctgaacgg tgccggtgac ccacttactc cgggttaccc ggccaacgaa tacgcgtaca 3120
ggcggggtat cgcggaagcc gtcggactgc cgtccatccc ggtccatccg attggttact 3180
acgacgccca gaagctcctc gaaaagatgg gaggcagcgc ccctccggac tcgtcatgga 3240
gaggctcgct gaaggtgcca tacaacgtgg gacccggatt cactggaaat ttcagcactc 3300
aaaaagtgaa gatgcacatt cactccacta acgaagtcac caggatctac aacgtcatcg 3360
gaaccctccg gggagcggtg gaaccggacc gctacgtgat cctcggtgga caccgggata 3420
gctgggtgtt cggaggaatc gatcctcaat cgggcgcagc cgtcgtccat gaaatcgtca 3480
ggtcctttgg tactcttaag aaggagggct ggcgccctag acgcactatt ctgttcgcct 3540
cgtgggatgc cgaagaattt ggtctgctcg gcagcaccga atgggctgag gaaaactccc 3600
gcctgctcca agaacgcgga gtggcgtaca tcaatgccga ctcatccatc gaaggaaact 3660
acacgctgcg ggtggactgc actccactga tgtactcgct cgtgcacaac ctgaccaaag 3720
aactcaaatc cccagacgaa ggattcgagg gaaaatcgct gtacgagtcg tggaccaaga 3780
agagcccatc cccggagttc agcgggatgc cgcggatctc aaagctcgga tcaggaaatg 3840
atttcgaagt gttctttcag aggctgggaa ttgcgtcggg aagggctcgg tacacgaaaa 3900
actgggaaac taacaagttc tcgggatacc cgctgtacca ctcggtgtat gaaacttacg 3960
aactggtgga gaaattctac gatcctatgt ttaagtacca cctgactgtg gcccaagtga 4020
gaggcggaat ggtgttcgag ttggccaatt caattgtgct gccattcgat tgccgcgact 4080
acgccgtggt gctgagaaag tacgcagaca aaatctactc aatcagcatg aagcacccac 4140
aagagatgaa aacctactca gtctccttcg actccctctt ctccgcggtg aagaacttca 4200
ccgagatcgc gagcaaattc tcggagcgcc ttcaagattt tgacaaatcc aatccgatcg 4260
tcctccgcat gatgaatgac cagctcatgt ttctcgaacg ggccttcatc gatccactgg 4320
gacttccgga ccggccgttt taccgccacg tgatctacgc gccctcgtcg cataacaagt 4380
atgctggaga gagcttcccg ggtatctacg acgcattgtt cgacattgag tccaaggtgg 4440
atccgtccaa agcctggggt gaagtgaagc gccaaatcta cgtggcggcc tttaccgtcc 4500
aggcggcagc agaaaccttg agcgaggtgg cttgactcga gcctaagctt ctagataaga 4560
tatccgatcc accggatcta gataactgat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt 4620
tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc 4680
aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 4740
cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 4800
catcaatgta tcttatatgc tggccaccgt acatgtggct tcccatgctc gcaagccctg 4860
gcccgagttc gagcacaatg tcatgaccag gtgcaatatg catctggggt cccgccgagg 4920
catgttcatg ccctaccagt gcaacctgaa ttatgtgaag gtgctgctgg agcccgatgc 4980
catgtccaga gtgagcctga cgggggtgtt tgacatgaat gtggaggtgt ggaagattct 5040
gagatatgat gaatccaaga ccaggtgccg agcctgcgag tgcggaggga agcatgccag 5100
gttccagccc gtgtgtgtgg atgtgacgga ggacctgcga cccgatcatt tggtgttgcc 5160
ctgcaccggg acggagttcg gttccagcgg ggaagaatct gactagagtg agtagtgttc 5220
tggggcgggg gaggacctgc atgagggcca gaataactga aatctgtgct tttctgtgtg 5280
ttgcagcagc atgagcggaa gcggctcctt tgagggaggg gtattcagcc cttatctgac 5340
ggggcgtctc ccctcctggg cgggagtgcg tcagaatgtg atgggatcca cggtggacgg 5400
ccggcccgtg cagcccgcga actcttcaac cctgacctat gcaaccctga gctcttcgtc 5460
gttggacgca gctgccgccg cagctgctgc atctgccgcc agcgccgtgc gcggaatggc 5520
catgggcgcc ggctactacg gcactctggt ggccaactcg agttccacca ataatcccgc 5580
cagcctgaac gaggagaagc tgttgctgct gatggcccag ctcgaggcct tgacccagcg 5640
cctgggcgag ctgacccagc aggtggctca gctgcaggag cagacgcggg ccgcggttgc 5700
cacggtgaaa tccaaataaa aaatgaatca ataaataaac ggagacggtt gttgatttta 5760
acacagagtc tgaatcttta tttgattttt cgcgcgcggt aggccctgga ccaccggtct 5820
cgatcattga gcacccggtg gatcttttcc aggacccggt agaggtgggc ttggatgttg 5880
aggtacatgg gcatgagccc gtcccggggg tggaggtagc tccattgcag ggcctcgtgc 5940
tcgggggtgg tgttgtaaat cacccagtca tagcaggggc gcagggcatg gtgttgcaca 6000
atatctttga ggaggagact gatggccacg ggcagccctt tggtgtaggt gtttacaaat 6060
ctgttgagct gggagggatg catgcggggg gagatgaggt gcatcttggc ctggatcttg 6120
agattggcga tgttaccgcc cagatcccgc ctggggttca tgttgtgcag gaccaccagc 6180
acggtgtatc cggtgcactt ggggaattta tcatgcaact tggaagggaa ggcgtgaaag 6240
aatttggcga cgcctttgtg cccgcccagg ttttccatgc actcatccat gatgatggcg 6300
atgggcccgt gggcggcggc ctgggcaaag acgtttcggg ggtcggacac atcatagttg 6360
tggtcctggg tgaggtcatc ataggccatt ttaatgaatt tggggcggag ggtgccggac 6420
tgggggacaa aggtaccctc gatcccgggg gcgtagttcc cctcacagat ctgcatctcc 6480
caggctttga gctcggaggg ggggatcatg tccacctgcg gggcgataaa gaacacggtt 6540
tccggggcgg gggagatgag ctgggccgaa agcaagttcc ggagcagctg ggacttgccg 6600
cagccggtgg ggccgtagat gaccccgatg accggctgca ggtggtagtt gagggagaga 6660
cagctgccgt cctcccggag gaggggggcc acctcgttca tcatctcgcg cacgtgcatg 6720
ttctcgcgca ccagttccgc caggaggcgc tctcccccca gggataggag ctcctggagc 6780
gaggcgaagt ttttcagcgg cttgagtccg tcggccatgg gcattttgga gagggtttgt 6840
tgcaagagtt ccaggcggtc ccagagctcg gtgatgtgct ctacggcatc tcgatccagc 6900
agacctcctc gtttcgcggg ttgggacggc tgcgggagta gggcaccaga cgatgggcgt 6960
ccagcgcagc cagggtccgg tccttccagg gtcgcagcgt ccgcgtcagg gtggtctccg 7020
tcacggtgaa ggggtgcgcg ccgggctggg cgcttgcgag ggtgcgcttc aggctcatcc 7080
ggctggtcga aaaccgctcc cgatcggcgc cctgcgcgtc ggccaggtag caattgacca 7140
tgagttcgta gttgagcgcc tcggccgcgt ggcctttggc gcggagctta cctttggaag 7200
tctgcccgca ggcgggacag aggagggact tgagggcgta gagcttgggg gcgaggaaga 7260
cggactcggg ggcgtaggcg tccgcgccgc agtgggcgca gacggtctcg cactccacga 7320
gccaggtgag gtcgggctgg tcggggtcaa aaaccagttt cccgccgttc tttttgatgc 7380
gtttcttacc tttggtctcc atgagctcgt gtccccgctg ggtgacaaag aggctgtccg 7440
tgtccccgta gaccgacttt atgggccggt cctcgagcgg tgtgccgcgg tcctcctcgt 7500
agaggaaccc cgcccactcc gagacgaaag cccgggtcca ggccagcacg aaggaggcca 7560
cgtgggacgg gtagcggtcg ttgtccacca gcgggtccac cttttccagg gtatgcaaac 7620
acatgtcccc ctcgtccaca tccaggaagg tgattggctt gtaagtgtag gccacgtgac 7680
cgggggtccc ggccgggggg gtataaaagg gtgcgggtcc ctgctcgtcc tcactgtctt 7740
ccggatcgct gtccaggagc gccagctgtt ggggtaggta ttccctctcg aaggcgggca 7800
tgacctcggc actcaggttg tcagtttcta gaaacgagga ggatttgata ttgacggtgc 7860
cggcggagat gcctttcaag agcccctcgt ccatctggtc agaaaagacg atctttttgt 7920
tgtcgagctt ggtggcgaag gagccgtaga gggcgttgga gaggagcttg gcgatggagc 7980
gcatggtctg gtttttttcc ttgtcggcgc gctccttggc ggcgatgttg agctgcacgt 8040
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tgacctgcca gccccgatta tgcagggtga tgaggtccac actggtggcc acctcgccgc 8160
gcaggggctc attagtccag cagaggcgtc cgcccttgcg cgagcagaag gggggcaggg 8220
ggtccagcat gacctcgtcg ggggggtcgg catcgatggt gaagatgccg ggcaggaggt 8280
cggggtcaaa gtagctgatg gaagtggcca gatcgtccag ggcagcttgc cattcgcgca 8340
cggccagcgc gcgctcgtag ggactgaggg gcgtgcccca gggcatggga tgggtaagcg 8400
cggaggcgta catgccgcag atgtcgtaga cgtagagggg ctcctcgagg atgccgatgt 8460
aggtggggta gcagcgcccc ccgcggatgc tggcgcgcac gtagtcatac agctcgtgcg 8520
agggggcgag gagccccggg cccaggttgg tgcgactggg cttttcggcg cggtagacga 8580
tctggcggaa aatggcatgc gagttggagg agatggtggg cctttggaag atgttgaagt 8640
gggcgtgggg cagtccgacc gagtcgcgga tgaagtgggc gtaggagtct tgcagcttgg 8700
cgacgagctc ggcggtgact aggacgtcca gagcgcagta gtcgagggtc tcctggatga 8760
tgtcatactt gagctgtccc ttttgtttcc acagctcgcg gttgagaagg aactcttcgc 8820
ggtccttcca gtactcttcg agggggaacc cgtcctgatc tgcacggtaa gagcctagca 8880
tgtagaactg gttgacggcc ttgtaggcgc agcagccctt ctccacgggg agggcgtagg 8940
cctgggcggc cttgcgcagg gaggtgtgcg tgagggcgaa agtgtccctg accatgacct 9000
tgaggaactg gtgcttgaag tcgatatcgt cgcagccccc ctgctcccag agctggaagt 9060
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tgcccgcgcg gggcataaag ttgcgagtga tgcggaaagg ttggggcacc tcggcccggt 9180
tgttgatgac ctgggcggcg agcacgatct cgtcgaagcc gttgatgttg tggcccacga 9240
tgtagagttc cacgaatcgc ggacggccct tgacgtgggg cagtttcttg agctcctcgt 9300
aggtgagctc gtcggggtcg ctgagcccgt gctgctcgag cgcccagtcg gcgagatggg 9360
ggttggcgcg gaggaaggaa gtccagagat ccacggccag ggcggtttgc agacggtccc 9420
ggtactgacg gaactgctgc ccgacggcca ttttttcggg ggtgacgcag tagaaggtgc 9480
gggggtcccc gtgccagcga tcccatttga gctggagggc gagatcgagg gcgagctcga 9540
cgagccggtc gtccccggag agtttcatga ccagcatgaa ggggacgagc tgcttgccga 9600
aggaccccat ccaggtgtag gtttccacat cgtaggtgag gaagagcctt tcggtgcgag 9660
gatgcgagcc gatggggaag aactggatct cctgccacca attggaggaa tggctgttga 9720
tgtgatggaa gtagaaatgc cgacggcgcg ccgaacactc gtgcttgtgt ttatacaagc 9780
ggccacagtg ctcgcaacgc tgcacgggat gcacgtgctg cacgagctgt acctgagttc 9840
ctttgacgag gaatttcagt gggaagtgga gtcgtggcgc ctgcatctcg tgctgtacta 9900
cgtcgtggtg gtcggcctgg ccctcttctg cctcgatggt ggtcatgctg acgagcccgc 9960
gcgggaggca ggtccagacc tcggcgcgag cgggtcggag agcgaggacg agggcgcgca 10020
ggccggagct gtccagggtc ctgagacgct gcggagtcag gtcagtgggc agcggcggcg 10080
cgcggttgac ttgcaggagt ttttccaggg cgcgcgggag gtccagatgg tacttgatct 10140
ccaccgcgcc attggtggcg acgtcgatgg cttgcagggt cccgtgcccc tggggtgtga 10200
ccaccgtccc ccgtttcttc ttgggcggct ggggcgacgg gggcggtgcc tcttccatgg 10260
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gggcggcagg ggcacgtcgg cgccgcgcgc gggtaggttc tggtactgcg cccggagaag 10380
actggcgtga gcgacgacgc gacggttgac gtcctggatc tgacgcctct gggtgaaggc 10440
cacgggaccc gtgagtttga acctgaaaga gagttcgaca gaatcaatct cggtatcgtt 10500
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ggtcatgaac tgctcgatct cctcctcttg aaggtctccg cggccggcgc gctccacggt 10620
ggccgcgagg tcgttggaga tgcggcccat gagctgcgag aaggcgttca tgcccgcctc 10680
gttccagacg cggctgtaga ccacgacgcc ctcgggatcg cgggcgcgca tgaccacctg 10740
ggcgaggttg agctccacgt ggcgcgtgaa gaccgcgtag ttgcagaggc gctggtagag 10800
gtagttgagc gtggtggcga tgtgctcggt gacgaagaaa tacatgatcc agcggcggag 10860
cggcatctcg ctgacgtcgc ccagcgcctc caaacgttcc atggcctcgt aaaagtccac 10920
ggcgaagttg aaaaactggg agttgcgcgc cgagacggtc aactcctcct ccagaagacg 10980
gatgagctcg gcgatggtgg cgcgcacctc gcgctcgaag gcccccggga gttcctccac 11040
ttcctcttct tcctcctcca ctaacatctc ttctacttcc tcctcaggcg gcagtggtgg 11100
cgggggaggg ggcctgcgtc gccggcggcg cacgggcaga cggtcgatga agcgctcgat 11160
ggtctcgccg cgccggcgtc gcatggtctc ggtgacggcg cgcccgtcct cgcggggccg 11220
cagcgtgaag acgccgccgc gcatctccag gtggccgggg gggtccccgt tgggcaggga 11280
gagggcgctg acgatgcatc ttatcaattg ccccgtaggg actccgcgca aggacctgag 11340
cgtctcgaga tccacgggat ctgaaaaccg ctgaacgaag gcttcgagcc agtcgcagtc 11400
gcaaggtagg ctgagcacgg tttcttctgg cgggtcatgt tggttgggag cggggcgggc 11460
gatgctgctg gtgatgaagt tgaaataggc ggttctgaga cggcggatgg tggcgaggag 11520
caccaggtct ttgggcccgg cttgctggat gcgcagacgg tcggccatgc cccaggcgtg 11580
gtcctgacac ctggccaggt ccttgtagta gtcctgcatg agccgctcca cgggcacctc 11640
ctcctcgccc gcgcggccgt gcatgcgcgt gagcccgaag ccgcgctggg gctggacgag 11700
cgccaggtcg gcgacgacgc gctcggcgag gatggcttgc tggatctggg tgagggtggt 11760
ctggaagtca tcaaagtcga cgaagcggtg gtaggctccg gtgttgatgg tgtaggagca 11820
gttggccatg acggaccagt tgacggtctg gtggcccgga cgcacgagct cgtggtactt 11880
gaggcgcgag taggcgcgcg tgtcgaagat gtagtcgttg caggtgcgca ccaggtactg 11940
gtagccgatg aggaagtgcg gcggcggctg gcggtagagc ggccatcgct cggtggcggg 12000
ggcgccgggc gcgaggtcct cgagcatggt gcggtggtag ccgtagatgt acctggacat 12060
ccaggtgatg ccggcggcgg tggtggaggc gcgcgggaac tcgcggacgc ggttccagat 12120
gttgcgcagc ggcaggaagt agttcatggt gggcacggtc tggcccgtga ggcgcgcgca 12180
gtcgtggatg ctctatacgg gcaaaaacga aagcggtcag cggctcgact ccgtggcctg 12240
gaggctaagc gaacgggttg ggctgcgcgt gtaccccggt tcgaatctcg aatcaggctg 12300
gagccgcagc taacgtggta ttggcactcc cgtctcgacc caagcctgca ccaaccctcc 12360
aggatacgga ggcgggtcgt tttgcaactt ttttttggag gccggatgag actagtaagc 12420
gcggaaagcg gccgaccgcg atggctcgct gccgtagtct ggagaagaat cgccagggtt 12480
gcgttgcggt gtgccccggt tcgaggccgg ccggattccg cggctaacga gggcgtggct 12540
gccccgtcgt ttccaagacc ccatagccag ccgacttctc cagttacgga gcgagcccct 12600
cttttgtttt gtttgttttt gccagatgca tcccgtactg cggcagatgc gcccccacca 12660
ccctccaccg caacaacagc cccctccaca gccggcgctt ctgcccccgc cccagcagca 12720
acttccagcc acgaccgccg cggccgccgt gagcggggct ggacagagtt atgatcacca 12780
gctggccttg gaagagggcg aggggctggc gcgcctgggg gcgtcgtcgc cggagcggca 12840
cccgcgcgtg cagatgaaaa gggacgctcg cgaggcctac gtgcccaagc agaacctgtt 12900
cagagacagg agcggcgagg agcccgagga gatgcgcgcg gcccggttcc acgcggggcg 12960
ggagctgcgg cgcggcctgg accgaaagag ggtgctgagg gacgaggatt tcgaggcgga 13020
cgagctgacg gggatcagcc ccgcgcgcgc gcacgtggcc gcggccaacc tggtcacggc 13080
gtacgagcag accgtgaagg aggagagcaa cttccaaaaa tccttcaaca accacgtgcg 13140
caccctgatc gcgcgcgagg aggtgaccct gggcctgatg cacctgtggg acctgctgga 13200
ggccatcgtg cagaacccca ccagcaagcc gctgacggcg cagctgttcc tggtggtgca 13260
gcatagtcgg gacaacgaag cgttcaggga ggcgctgctg aatatcaccg agcccgaggg 13320
ccgctggctc ctggacctgg tgaacattct gcagagcatc gtggtgcagg agcgcgggct 13380
gccgctgtcc gagaagctgg cggccatcaa cttctcggtg ctgagtttgg gcaagtacta 13440
cgctaggaag atctacaaga ccccgtacgt gcccatagac aaggaggtga agatcgacgg 13500
gttttacatg cgcatgaccc tgaaagtgct gaccctgagc gacgatctgg gggtgtaccg 13560
caacgacagg atgcaccgtg cggtgagcgc cagcaggcgg cgcgagctga gcgaccagga 13620
gctgatgcat agtctgcagc gggccctgac cggggccggg accgaggggg agagctactt 13680
tgacatgggc gcggacctgc actggcagcc cagccgccgg gccttggagg cggcggcagg 13740
accctacgta gaagaggtgg acgatgaggt ggacgaggag ggcgagtacc tggaagactg 13800
atggcgcgac cgtatttttg ctagatgcaa caacaacagc cacctcctga tcccgcgatg 13860
cgggcggcgc tgcagagcca gccgtccggc attaactcct cggacgattg gacccaggcc 13920
atgcaacgca tcatggcgct gacgacccgc aaccccgaag cctttagaca gcagccccag 13980
gccaaccggc tctcggccat cctggaggcc gtggtgccct cgcgctccaa ccccacgcac 14040
gagaaggtcc tggccatcgt gaacgcgctg gtggagaaca aggccatccg cggcgacgag 14100
gccggcctgg tgtacaacgc gctgctggag cgcgtggccc gctacaacag caccaacgtg 14160
cagaccaacc tggaccgcat ggtgaccgac gtgcgcgagg ccgtggccca gcgcgagcgg 14220
ttccaccgcg agtccaacct gggatccatg gtggcgctga acgccttcct cagcacccag 14280
cccgccaacg tgccccgggg ccaggaggac tacaccaact tcatcagcgc cctgcgcctg 14340
atggtgaccg aggtgcccca gagcgaggtg taccagtccg ggccggacta cttcttccag 14400
accagtcgcc agggcttgca gaccgtgaac ctgagccagg ctttcaagaa cttgcagggc 14460
ctgtggggcg tgcaggcccc ggtcggggac cgcgcgacgg tgtcgagcct gctgacgccg 14520
aactcgcgcc tgctgctgct gctggtggcc cccttcacgg acagcggcag catcaaccgc 14580
aactcgtacc tgggctacct gattaacctg taccgcgagg ccatcggcca ggcgcacgtg 14640
gacgagcaga cctaccagga gatcacccac gtgagccgcg ccctgggcca ggacgacccg 14700
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acgtcacctg tgcccttcgc cctagccgcc tccacccatc atcatgagca aagagattcc 28260
cacgccttac atgtggagct accagcccca gatgggcctg gccgccggtg ccgcccagga 28320
ctactccacc cgcatgaatt ggctcagcgc cgggcccgcg atgatctcac gggtgaatga 28380
catccgcgcc caccgaaacc agatactcct agaacagtca gcgctcaccg ccacgccccg 28440
caatcacctc aatccgcgta attggcccgc cgccctggtg taccaggaaa ttccccagcc 28500
cacgaccgta ctacttccgc gagacgccca ggccgaagtc cagctgacta actcaggtgt 28560
ccagctggcg ggcggcgcca ccctgtgtcg tcaccgcccc gctcagggta taaagcggct 28620
ggtgatccgg ggcagaggca cacagctcaa cgacgaggtg gtgagctctt cgctgggtct 28680
gcgacctgac ggagtcttcc aactcgccgg atcggggaga tcttccttca cgcctcgtca 28740
ggccgtcctg actttggaga gttcgtcctc gcagccccgc tcgggtggca tcggcactct 28800
ccagttcgtg gaggagttca ctccctcggt ctacttcaac cccttctccg gctcccccgg 28860
ccactacccg gacgagttca tcccgaactt cgacgccatc agcgagtcgg tggacggcta 28920
cgattgaatg tcccatggtg gcgcagctga cctagctcgg cttcgacacc tggaccactg 28980
ccgccgcttc cgctgcttcg ctcgggatct cgccgagttt gcctactttg agctgcccga 29040
ggagcaccct cagggcccgg cccacggagt gcggatcgtc gtcgaagggg gcctcgactc 29100
ccacctgctt cggatcttca gccagcgtcc gatcctggtc gagcgcgagc aaggacagac 29160
ccttctgact ctgtactgca tctgcaacca ccccggcctg catgaaagtc tttgttgtct 29220
gctgtgtact gagtataata aaagctgaga tcagcgacta ctccggactt ccgtgtgttc 29280
ctgaatccat caaccagtct ttgttcttca ccgggaacga gaccgagctc cagctccagt 29340
gtaagcccca caagaagtac ctcacctggc tgttccaggg ctccccgatc gccgttgtca 29400
accactgcga caacgacgga gtcctgctga gcggccctgc caaccttact ttttccaccc 29460
gcagaagcaa gctccagctc ttccaaccct tcctccccgg gacctatcag tgcgtctcgg 29520
gaccctgcca tcacaccttc cacctgatcc cgaataccac agcgtcgctc cccgctacta 29580
acaaccaaac taacctccac caacgccacc gtcgctaggc cacaatacat gcccatatta 29640
gactatgagg ccgagccaca gcgacccatg ctccccgcta ttagttactt caatctaacc 29700
ggcggagatg actgacccac tggccaacaa caacgtcaac gaccttctcc tggacatgga 29760
cggccgcgcc tcggagcagc gactcgccca acttcgcatt cgccagcagc aggagagagc 29820
cgtcaaggag ctgcaggatg cggtggccat ccaccagtgc aagagaggca tcttctgcct 29880
ggtgaaacag gccaagatct cctacgaggt cactccaaac gaccatcgcc tctcctacga 29940
gctcctgcag cagcgccaga agttcacctg cctggtcgga gtcaacccca tcgtcatcac 30000
ccagcagtct ggcgatacca aggggtgcat ccactgctcc tgcgactccc ccgactgcgt 30060
ccacactctg atcaagaccc tctgcggcct ccgcgacctc ctccccatga actaatcacc 30120
cccttatcca gtgaaataaa gatcatattg atgatgattt tacagaaata aaaaataatc 30180
atttgatttg aaataaagat acaatcatat tgatgatttg agtttaacaa aaaaataaag 30240
aatcacttac ttgaaatctg ataccaggtc tctgtccatg ttttctgcca acaccacttc 30300
actcccctct tcccagctct ggtactgcag gccccggcgg gctgcaaact tcctccacac 30360
gctgaagggg atgtcaaatt cctcctgtcc ctcaatcttc attttatctt ctatcagatg 30420
tccaaaaagc gcgtccgggt ggatgatgac ttcgaccccg tctaccccta cgatgcagac 30480
aacgcaccga ccgtgccctt catcaacccc cccttcgtct cttcagatgg attccaagag 30540
aagcccctgg gggtgttgtc cctgcgactg gccgaccccg tcaccaccaa gaacggggaa 30600
atcaccctca agctgggaga gggggtggac ctcgattcct cgggaaaact catctccaac 30660
acggccacca aggccgccgc ccctctcagt ttttccaaca acaccatttc ccttaacatg 30720
gatcacccct tttacactaa agatggaaaa ttatccttac aagtttctcc accattaaat 30780
atactgagaa caagcattct aaacacacta gctttaggtt ttggatcagg tttaggactc 30840
cgtggctctg ccttggcagt acagttagtc tctccactta catttgatac tgatggaaac 30900
ataaagctta ccttagacag aggtttgcat gttacaacag gagatgcaat tgaaagcaac 30960
ataagctggg ctaaaggttt aaaatttgaa gatggagcca tagcaaccaa cattggaaat 31020
gggttagagt ttggaagcag tagtacagaa acaggtgttg atgatgctta cccaatccaa 31080
gttaaacttg gatctggcct tagctttgac agtacaggag ccataatggc tggtaacaaa 31140
gaagacgata aactcacttt gtggacaaca cctgatccat caccaaactg tcaaatactc 31200
gcagaaaatg atgcaaaact aacactttgc ttgactaaat gtggtagtca aatactggcc 31260
actgtgtcag tcttagttgt aggaagtgga aacctaaacc ccattactgg caccgtaagc 31320
agtgctcagg tgtttctacg ttttgatgca aacggtgttc ttttaacaga acattctaca 31380
ctaaaaaaat actgggggta taggcaggga gatagcatag atggcactcc atataccaat 31440
gctgtaggat tcatgcccaa tttaaaagct tatccaaagt cacaaagttc tactactaaa 31500
aataatatag tagggcaagt atacatgaat ggagatgttt caaaacctat gcttctcact 31560
ataaccctca atggtactga tgacagcaac agtacatatt caatgtcatt ttcatacacc 31620
tggactaatg gaagctatgt tggagcaaca tttggggcta actcttatac cttctcatac 31680
atcgcccaag aatgaacact gtatcccacc ctgcatgcca acccttccca ccccactctg 31740
tggaacaaac tctgaaacac aaaataaaat aaagttcaag tgttttattg attcaacagt 31800
tttacaggat tcgagcagtt atttttcctc caccctccca ggacatggaa tacaccaccc 31860
tctccccccg cacagccttg aacatctgaa tgccattggt gatggacatg cttttggtct 31920
ccacgttcca cacagtttca gagcgagcca gtctcgggtc ggtcagggag atgaaaccct 31980
ccgggcactc ccgcatctgc acctcacagc tcaacagctg aggattgtcc tcggtggtcg 32040
ggatcacggt tatctggaag aagcagaaga gcggcggtgg gaatcatagt ccgcgaacgg 32100
gatcggccgg tggtgtcgca tcaggccccg cagcagtcgc tgccgccgcc gctccgtcaa 32160
gctgctgctc agggggtccg ggtccaggga ctccctcagc atgatgccca cggccctcag 32220
catcagtcgt ctggtgcggc gggcgcagca gcgcatgcgg atctcgctca ggtcgctgca 32280
gtacgtgcaa cacagaacca ccaggttgtt caacagtcca tagttcaaca cgctccagcc 32340
gaaactcatc gcgggaagga tgctacccac gtggccgtcg taccagatcc tcaggtaaat 32400
caagtggtgc cccctccaga acacgctgcc cacgtacatg atctccttgg gcatgtggcg 32460
gttcaccacc tcccggtacc acatcaccct ctggttgaac atgcagcccc ggatgatcct 32520
gcggaaccac agggccagca ccgccccgcc cgccatgcag cgaagagacc ccgggtcccg 32580
gcaatggcaa tggaggaccc accgctcgta cccgtggatc atctgggagc tgaacaagtc 32640
tatgttggca cagcacaggc atatgctcat gcatctcttc agcactctca actcctcggg 32700
ggtcaaaacc atatcccagg gcacggggaa ctcttgcagg acagcgaacc ccgcagaaca 32760
gggcaatcct cgcacagaac ttacattgtg catggacagg gtatcgcaat caggcagcac 32820
cgggtgatcc tccaccagag aagcgcgggt ctcggtctcc tcacagcgtg gtaagggggc 32880
cggccgatac gggtgatggc gggacgcggc tgatcgtgtt cgcgaccgtg tcatgatgca 32940
gttgctttcg gacattttcg tacttgctgt agcagaacct ggtccgggcg ctgcacaccg 33000
atcgccggcg gcggtctcgg cgcttggaac gctcggtgtt gaaattgtaa aacagccact 33060
ctctcagacc gtgcagcaga tctagggcct caggagtgat gaagatccca tcatgcctga 33120
tggctctgat cacatcgacc accgtggaat gggccagacc cagccagatg atgcaatttt 33180
gttgggtttc ggtgacggcg ggggagggaa gaacaggaag aaccatgatt aacttttaat 33240
ccaaacggtc tcggagtact tcaaaatgaa gatcgcggag atggcacctc tcgcccccgc 33300
tgtgttggtg gaaaataaca gccaggtcaa aggtgatacg gttctcgaga tgttccacgg 33360
tggcttccag caaagcctcc acgcgcacat ccagaaacaa gacaatagcg aaagcgggag 33420
ggttctctaa ttcctcaatc atcatgttac actcctgcac catccccaga taattttcat 33480
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attctgctcc tggttcacct gcagcagatt gacaagcgga atatcaaaat ctctgccgcg 33660
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tcctccccag tgagcattgc caaatgcaag actgctataa gcatgctggc tagacccggt 33840
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cgcgagtgaa aaaaagcgcc cgaggaagca ataaggcact acaatgctca gtctcaagtc 34260
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gggttcccac gctacgtcat caaaacacga ctttcaaatt ccgtcgaccg ttaaaaacgt 34680
cacccgcccc gcccctaacg gtcgcccgtc tctcagccaa tcagcgcccc gcatccccaa 34740
attcaaacac ctcatttgca tattaacgcg cacaaaaagt ttgaggtata ttattgatga 34800
tgg 34803
<210> 46
<211> 7182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 46
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
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cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320
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accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500
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atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620
ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680
gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740
actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800
ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860
tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920
tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980
gaacatggct agcattgtgg gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt 2040
gcttgtggcc tctcgtggca gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt 2100
cctcacagct gcccactgca tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagctt 2160
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ctacgatatg agcctcctga agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagccacga 2280
cctcatgctg ctccgcctgt cagagcctgc cgagctcacg gatgctgtga aggtcatgga 2340
cctgcccacc caggagccag cactggggac cacctgctac gcctcaggct ggggcagcat 2400
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tggtgtgctt caaggtatca cgtcatgggg cagtgaacca tgtgccctgc ccgaaaggcc 2640
ttccctgtac accaaggtgg tgcattaccg gaagtggatc aaggacacca tcgtggccaa 2700
ccccggatcc gaaggtaggg gttcattatt gacctgtgga gatgtcgaag aaaacccagg 2760
acccgctagc aaggctgtgc tgcttgccct gttgatggca ggcttggccc tgcagccagg 2820
cactgccctg ctgtgctact cctgcaaagc ccaggtgagc aacgaggact gcctgcaggt 2880
ggagaactgc acccagctgg gggagcagtg ctggaccgcg cgcatccgcg cagttggcct 2940
cctgaccgtc atcagcaaag gctgcagctt gaactgcgtg gatgactcac aggactacta 3000
cgtgggcaag aagaacatca cgtgctgtga caccgacttg tgcaacgcca gcggggccca 3060
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tgtggaaagc aacccaggcc caatggcaag cgcgcgccgc ccgcgctggc tgtgcgctgg 3240
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atcctccaat gaagctacta acattactcc aaagcataat atgaaagcat ttttggatga 3360
attgaaagct gagaacatca agaagttctt atataatttt acacagatac cacatttagc 3420
aggaacagaa caaaactttc agcttgcaaa gcaaattcaa tcccagtgga aagaatttgg 3480
cctggattct gttgagctgg cacattatga tgtcctgttg tcctacccaa ataagactca 3540
tcccaactac atctcaataa ttaatgaaga tggaaatgag attttcaaca catcattatt 3600
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aggagaccct ctcacaccag gttacccagc aaatgaatat gcttataggc gtggaattgc 4020
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tggtattgac cctcagagtg gagcagctgt tgttcatgaa attgtgagga gctttggaac 4380
actgaaaaag gaagggtgga gacctagaag aacaattttg tttgcaagct gggatgcaga 4440
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tgatgaaggc tttgaaggca aatctcttta tgaaagttgg actaaaaaaa gtccttcccc 4680
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cttccaacga cttggaattg cttcaggcag agcacggtat actaaaaatt gggaaacaaa 4800
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cttacaaggc ctttctaagt aaacagtaca tgaaccttta ccccgttgct cggcaacggc 5760
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atcagcgcat gcgtggaacc tttgtggctc ctctgccgat ccatactgcg gaactcctag 5880
ccgcttgttt tgctcgcagc cggtctggag caaagctcat aggaactgac aattctgtcg 5940
tcctctcgcg gaaatataca tcgtttcgat ctacgtatga tctttttccc tctgccaaaa 6000
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 6060
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg aattctgcat 6120
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 6180
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6240
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6300
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 6360
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acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6480
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6540
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tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6660
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tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 7080
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 7140
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tc 7182
<210> 47
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 48
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln
1 5 10 15
Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn
20 25 30
Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys
35 40 45
Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys
50 55 60
Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly
65 70 75 80
Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly
85 90 95
Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala
100 105 110
Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu
115 120
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 49
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 50
tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 51
tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21

Claims (40)

1.一种分离的拮抗剂抗体，其特异性结合PD-1且包含：
重链可变区(VH)，其包含所述VH的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，所述VH具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列；和
轻链可变区(VL)，其包含所述VL的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL具有SEQ IDNO: 8的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的拮抗剂抗体，其中所述抗体包含：由SEQ ID NO: 13、14或15的氨基酸序列组成的VH CDR1、由SEQ ID NO: 16或17的氨基酸序列组成的VH CDR 2、由示于SEQID NO: 23的氨基酸序列组成的VH CDR3、由示于SEQ ID NO: 10的氨基酸序列组成的VLCDR1、由示于SEQ ID NO: 20的氨基酸序列组成的VL CDR2和由示于SEQ ID NO: 21的氨基酸序列组成的VL CDR3。
3.权利要求1至2中任一项的分离的拮抗剂抗体，其中所述抗体包含：由示于SEQ IDNO: 4的氨基酸序列组成的VH和由示于SEQ ID NO: 8的氨基酸序列组成的VL。
4.权利要求1至2中任一项的分离的拮抗剂抗体，其中所述抗体包含：由示于SEQ IDNO: 29或38的氨基酸序列组成的重链和由示于SEQ ID NO: 39的氨基酸序列组成的轻链。
5.权利要求1至2中任一项的分离的拮抗剂抗体，其中所述抗体包含恒定区。
6.权利要求5的分离的拮抗剂抗体，其中所述抗体具有选自IgG2、IgG2Δa、IgG4、IgG4Δb、IgG4Δc、IgG4 S228P、IgG4Δb S228P和IgG4Δc S228P的同种型。
7.权利要求5的分离的拮抗剂抗体，其中所述恒定区是IgG4 S228P。
8.权利要求1的分离的拮抗剂抗体，其中所述抗体的各CDR根据Kabat定义、Chothia定义、或Kabat定义和Chothia定义的组合而定义。
9.一种分离的抗PD-1抗体，其中所述抗体包含：由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成的VH CDR1、由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成的VH CDR 2、由示于SEQ ID NO: 23的氨基酸序列组成的VH CDR3、由示于SEQ ID NO: 10的氨基酸序列组成的VL CDR1、由示于SEQ IDNO: 20的氨基酸序列组成的VL CDR2和由示于SEQ ID NO: 21的氨基酸序列组成的VLCDR3。
10.权利要求1、2和6-9中任一项的分离的抗体，其中所述抗体促进T细胞分泌IFNγ和/或TNF。
11.权利要求1、2和6-9中任一项的分离的抗体，其中所述抗体促进T细胞增殖。
12.权利要求1、2和6-9中任一项的分离的抗体，其中所述抗体抑制肿瘤生长。
13.权利要求1、2和6-9中任一项的分离的抗体，其中所述抗体结合人类PD-1和小鼠PD-1。
14.权利要求13的分离的抗体，其中所述抗体以如通过表面等离子共振测量的在25℃下的约0.73 nM的亲和力结合人类PD-1。
15.一种分离的细胞系，其产生前述权利要求中任一项的抗体。
16.一种分离的核酸，其编码前述权利要求中任一项的抗体。
17.一种重组表达载体，其包含权利要求16的核酸。
18.一种宿主细胞，其包含权利要求17的表达载体。
19.一种产生抗PD-1拮抗剂抗体的方法，所述方法包括：在其中产生所述抗体的条件下培养重组产生前述权利要求中任一项的抗体的细胞系；和回收所述抗体。
20.一种产生抗PD-1拮抗剂抗体的方法，所述方法包括：在其中产生所述抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的细胞系，所述抗体包含：包含示于SEQ ID NO: 29或38的氨基酸序列的重链和包含示于SEQ ID NO: 39的氨基酸序列的轻链；和回收所述抗体。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体的重链和轻链被编码在分开载体上。
22.权利要求20的方法，其中所述抗体的重链和轻链被编码在相同载体上。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1至14中任一项的抗体和药学上可接受的载体。
24.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含权利要求23的药物组合物。
25.权利要求1至14中任一项的抗体或权利要求23的药物组合物用于制备治疗有需要的个体的癌症的药物的用途，其中所述治疗包括向个体施用有效量的所述抗PD-1抗体或所述药物组合物，使得个体中改善一种或多种与所述癌症相关的症状。
26.权利要求25的用途，其中所述癌症选自肉瘤、淋巴瘤、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤。
27.权利要求25的用途，其中所述癌症选自霍奇金氏淋巴瘤和鳞状细胞头颈癌。
28.权利要求25-27中任一项的用途，其中所述个体是具有局部晚期或转移黑色素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤或复发或难治的经典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)的先前治疗的成人患者。
29.权利要求25-27中任一项的用途，其中所述抗PD-1抗体以约0.5 mg/kg、约1.0 mg/kg、约3.0 mg/kg或约10 mg/kg的剂量施用。
30.权利要求25-27中任一项的用途，其中所述抗PD-1抗体每7、14、21或28天施用一次。
31.权利要求25-27中任一项的用途，其中所述抗PD-1抗体静脉内或皮下施用。
32.权利要求25-27中任一项的用途，其中所述治疗进一步包括施用有效量的第二治疗剂。
33.权利要求32的用途，其中所述第二治疗剂选自抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、第二PD-1拮抗剂、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、酪氨酸激酶抑制剂和ALK抑制剂。
34.权利要求33的用途，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是阿西替尼或帕博西尼。
35.权利要求33的用途，其中所述ALK抑制剂是舒尼替尼或克里唑替尼。
36.权利要求1至14中任一项的抗体或权利要求23的药物组合物用于制备治疗有需要的个体的癌症的药物中的用途，所述治疗包括向个体施用(1)有效量的所述抗PD-1抗体或所述药物组合物和(2)有效量的能够引发针对癌细胞的免疫反应的疫苗。
37.权利要求1至14中任一项的抗体或权利要求23的药物组合物用于制备用于增强向个体施用而用于治疗癌症的疫苗的免疫原性或治疗效应的药物中的用途，所述治疗包括向接受所述疫苗的个体施用有效量的所述抗PD-1抗体或所述药物组合物。
38.权利要求36或37的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌。
39.权利要求36或37的用途，其中所述治疗进一步包括向所述个体施用有效量的一种或多种其他免疫调节剂。
40.权利要求39的用途，其中所述其他免疫调节剂选自蛋白激酶受体抑制剂、CTLA-4拮抗剂、CD40激动剂和TLR9激动剂。
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