ES2940360T3 - Polipéptidos capaces de inhibir la unión entre leptina y neuropilina-1 - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con agentes capaces de inhibir la unión entre Leptina y Neuropilina-1 (NRP1) y usos de los mismos en el campo terapéutico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos capaces de inhibir la unión entre leptina y neuropilina-1

Campo de la invención

La presente invención se refiere a agentes capaces de inhibir la unión entre leptina y neuropilina-1 (NRPl) y a usos de las mismas en el campo terapéutico.

Antecedentes de la invención

Las citocinas, las hormonas y las interacciones con sus receptores afines desempeñan funciones críticas en la regulación y la homeostasis de diversos sistemas fisiológicos. Su desregulación puede conducir a enfermedades relacionadas con el metabolismo, el desarrollo de cáncer y los trastornos inmunitarios o hematopoyesis.

Las interacciones entre las hormonas, las citocinas y sus receptores afines son complejas y pueden requerir la implicación de diversos co-receptores que modulan en un tipo de célula específica su afinidad y la transducción de señales. Por tanto, dependiendo de los co-receptores implicados, las hormonas/citocinas pueden competir entre sí y pueden transducir señales positivas o negativas para el crecimiento celular, la supervivencia y las funciones específicas.

La leptina (Lep/OB) es una hormona similar a citocina producida principalmente por adipocitos y desempeña un papel crucial en el mantenimiento del equilibrio de energía a través de su efecto en la reducción de la ingesta de alimentos y el aumento del gasto de energía. Activa los receptores (OBR) altamente expresados en el núcleo de arco hipotálico cerebral (ARC), un sitio bien conocido para controlar el peso corporal (Heike Münzberg y Christoper D Morrison, Metabolism 2014). Por tanto, el defecto en la señalización del receptor de leptina conduce a una obesidad grave. Actualmente, se estudian principalmente dos isoformas de los receptores de leptina (OBR), la isoforma OBRa corta y la isoforma OBRb larga.

La leptina media la mayoría de su efecto activando la isoforma de receptor largo (OBRb), que es la especie de señalización dominante altamente expresada en el núcleo de arco hipotálico cerebral (ARC) (Heike Münzberg y Christoper D Morrison, Metabolism 2014).

Sin embargo, las evidencias recientes mostraron que la OBR también se expresa en tejidos periféricos y que la leptina es una hormona más pleiotrópica que desempeña un papel en otros procesos fisiopatológicos, incluyendo la regulación inmunitaria, la hematopoyesis, el desarrollo del cáncer y los trastornos asociados al metabolismo, incluyendo la diabetes tipo 2, el fallo de la activación de riñón y las enfermedades oculares asociadas al metabolismo y relacionadas con la edad.

En los estudios de nuestro grupo, descifrar el papel de los adipocitos en la regulación de la hematopoyesis mostraron que la neuropilina-1 (NRP-1) se sobreexpresa en la médula ósea de la grasa femoral (Zakia Beleid y col. Heamatologica 2005). La NRP-1 es una glicoproteína transmembrana implicada en la guía axonal y la angiogénesis a través de ligandos específicos y co-receptores SEMA/Plexin y VEGFNEGFR, respectivamente (Fujisawa H y col, J Neurobiol 2004 y Soker S y col, Cell 1998). El grupo ha demostrado que NRP-1 está implicada en 1) la respuesta inmunitaria participando en la formación de la sinapsis inmunitaria entre células dendríticas y linfocitos T (R. Tordjman, Yves Lepelletier y col., Nature Immunology 2002), 2) la entrada de HTLVI en linfocitos (David Ghez, Yves Lepelletier y col., Journal of Virology 2005) y 3) la regulación de la hematopoyesis mediante el bloqueo de la granulopoyesis a través de la inhibición de la producción del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) por los macrófagos bajo la influencia de los adipocitos (Zakia Belaid-Choucair y col. Stem Cell 2008). La última función fue independiente de ligandos de NRP-1 conocidos pero implicaron la leptina producida por adipocitos (datos no publicados).

La NRP-1 necesita formar un complejo con receptores que pertenecen a la familia de plexina, que sirven como el elemento de transducción de señales para la repulsión axonal y el colapso de los conos de crecimiento neuronal después de la unión de SEMA al complejo NRP-1/plexina (He y Tessier-Lavigne, Cell 1997). La NRP-1 también puede interactuar con los receptores de VEGF (VEGF-R) formando un complejo, que puede activarse por VEGF165 para la angiogénesis de desarrollo normal (Soker S y col. Cell 1998). Basándose en la bibliografía y los resultados en la regulación de la granulopoyesis, se postuló que el receptor de leptina OBR puede formar un complejo con NRP-1. Curiosamente, los macrófagos implicados en la inhibición de la granulopoyesis expresaron tanto NRP-1 como OBR en sus superficies celulares.

La interacción de NR-1 y OBR en macrófagos se detectó mediante inmunotransferencia de tipo Western después de la coinmunoprecipitación de NR-1.

Mediante el uso de las líneas celulares de cáncer de mama bien descritas MDA-MB231 (positivas para NRP-1 y OBR) y T47D (OBR bajas y NRP-1 negativas) transducidas o bien bien por shNRP-1 o ADNc que codifica para NRP-1, se ha demostrado que 1) NRP-1 forma un complejo con OBR 2) la formación del complejo NRP-1/OBR es dependiente de la leptina 3) el complejo NRP-1/OBR se transloca al núcleo 4) tanto la formación compleja como la translocación nuclear dependen de la fosforilación de NRP-1 y JAK2 por la serina/treonina caseína cinasa 2 (CK2). Este hallazgo se confirmó mediante la inhibición de CK2 por 3 compuestos químicos diferentes (TBB, DRB y CX4945) y mediante silenciamiento de ARN que no solo evitó la fosforilación de NRP-1 y JAK2 pero también la formación del complejo NRP-1/OBR.

Se ha informado que la leptina regula más de 64 genes, incluyendo aquellos para el crecimiento, reguladores del ciclo celular, proteínas de la matriz extracelular y gen asociados con la metástasis (Perera C.N y col. J de Endocrinol 2008 y EBM 2008).

Además, un papel importante en la homeostasis energética, la “ leptina” similar a la hormona adipocina se emerge como una citocina pleiotrópica con actividad proangiogénica mediante la inducción de la expresión de VEGF y VEGFR2. Múltiples moléculas de señalización modulan la interacción compleja entre el sistema vascular y los adipocitos (Yihai Cao, Cell Metabolism 2013).

En el cáncer de mama, la leptina se considera un marcador proangiogénico (Ruben Rene Gonzalez-Pérez y col., Cancers 2013). El tratamiento con anticuerpo anti-VEGF (bevacizumab) de pacientes con cáncer rectal se asoció significativamente con metástasis distante a los tres años, lo que se correlacionó con la regulación por aumento de NRP-1 y la activación de rutas inflamatorias (Xu Lei y col, cancer Research 2009).

Curiosamente, la caracterización funcional del complejo NRP-1/OBR usando el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama condujo a demostrar que la NRP-1 modula la función de la leptina disminuyendo la proliferación celular, induciendo la migración celular y la infiltración de los ganglios linfáticos. Dado que se ha informado que la leptina es proangiogénica, se postuló que fisiológicamente, VEGF (una diana de bevacizumab) podría desempeñar una retroalimentación negativa sobre la acción de la leptina durante la angiogénesis. Durante el tratamiento con bevacizumab, el VEGF podría ser incapaz de reducir la acción de la leptina y, por tanto, la sobreexpresión de NRP-1 estará en favor de las interacciones NRP-1/OBR y de la leptina. Este complejo conduciría a una señalización no canónica implicada en la metástasis y, por tanto, disminuiría la supervivencia global.

Tal como se hipotetizó, prevenir la unión de VEGF a VEGFR mediante el tratamiento de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB231 con Avastin solo induce migración celular in vitro, como la leptina sola. Este efecto aumentó adicionalmente cuando las células se trataron conjuntamente tanto con Avastin como con leptina. El aumento del efecto de la leptina en la migración celular por el tratamiento con Avastin planteó la pregunta de si VEGF puede tener una retroalimentación negativa en la señalización NRP-1/OBR. Curiosamente, se pudo demostrar que VEGF se une a OBR. Por tanto, se puede concluir que el bloqueo del VEGF con Avastin aumenta la acción de la leptina e induce la metástasis y otro efecto conocido de la leptina, tal como la inflamación, que también se informa durante la terapia de Avastin a través de un aumento de la formación del complejo NRP-1/OBR. Curiosamente, la hipótesis se demuestra claramente por el aumento de la detección del complejo NRP-1/OBR por la tecnología PLA-HRP en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB231 tratada con Avastin en comparación con la célula control. El experimento se realizó en presencia de suero humano normal para imitar la condición de fisiología durante la terapia con Avastin.

Usando una tecnología de interferometría de biocapas (BLI, http://www.fortebio.com), se pudo demostrar una interacción directa entre las proteínas recombinantes leptina y NRP-1. A diferencia de otros ligandos de NRP-1, tales como VEGF, y Sema3A, conocidos como competidores, la leptina se une directamente a NRP-1 pero no compiten con la unión a VEGF. De manera similar, VEGF no evita la unión de leptina a NRP-1. Estas observaciones sugieren que leptina y VEGF tienen dominios de unión distintos.

Este hallazgo sugiere que la terapia anti-VEGF debe combinarse con una terapia anti-leptina en el cáncer.

Esto también podría implicar la enfermedad asociada a la disfunción del sistema inmunitario donde la leptina se ha asociado claramente en el agravamiento de la enfermedad.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a agentes capaces de inhibir la unión entre leptina y NRP-1 y a sus usos en el campo terapéutico. En particular, la presente invención se define por las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Un objeto de la presente invención se refiere a un agente capaz de inhibir la unión entre leptina y NRP-1.

Este agente es un polipéptido sintético o recombinante aislado capaz de inhibir la unión entre leptina y NRP-1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 (ENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETL) o SEQ ID ⁿ O:4 (EGNKPVLFQGNTNPTDVVVAVFPK).

Tal como se usa en el presente documento, el término “ leptina” tiene su significado general en la técnica y se refiere a una proteína secretada por adipocitos blancos, y que desempeña un papel importante en la regulación del peso corporal. En particular, la leptina funciona como parte de una ruta de señalización que puede inhibir la ingesta de alimentos y/o regular el gasto de energía para mantener la constancia de la masa adiposa. Esta proteína también tiene varias funciones endocrinas, y está implicada en la regulación de respuestas inmunitarias e inflamatorias, hematopoyesis, angiogénesis y cicatrización de heridas. Una secuencia de aminoácidos humana a modo de ejemplo de leptina es SEQ ID NO:1.

MHWGTLCGFL WLWPYLFYAQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSS KQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDL LHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDML WQLDLSPGC

Tal como se usa en el presente documento, el término “ NRP-1” tiene su significado general en la técnica y se refiere al receptor de neuropilina-1. Una secuencia de aminoácidos humana a modo de ejemplo de NRP-1 es SEQ ID NO:2.

MERGLPLLCAVLALVLAPAGAFRNDKCGDTIKIESPGYLTSPGYPHSYHPSEK CEWLIQAPDPYQRIMINFNPHFDLEDRDCKYDYVEVFDGENENGHFRGKFCG KIAPPPVVSSGPFLFIKFVSDYETHGAGFSIRYEIFKRGPECSQNYTTPSGVIKSP GFPEKYPNSLECTYIVFAPKMSEIILEFESFDLEPDSNPPGGMFCRYDRLEIWDG FPDVGPHIGRYCGQKTPGRIRSSSGILSMVFYTDSAIAKEGFSANYSVLQSSVSE DFKCMEALGMESGEIHSDQITASSQYSTNWSAERSRLNYPENGWTPGEDSYR

EWIOVDLGLLRFVTAVGTOCGAISKETKKKYYVKTYKIDVSSNGEDWITIKEGN KPVLFQGNTNPTDVVVAVFPKPLITRFVRIKPATWETGISMRFEVYGCKITDY PCSGMLGMVSGLISDSQITSSNQGDRNWMPENIRLVTSRSGWALPPAPHSYIN EWLQIDLGEEKIVRGIIIQGGKHRENKVFMRKFKIGYSNNGSDWKMIMDDSKR KAKSFEGNNNYDTPELRTFPALSTRFIRIYPERATHGGLGLRMELLGCEVEAPT AGPTTPNGNL VDECDDDQANCHSGTGDDFQLTGGTTVLATEKPTVIDSTIQSE FPTYGFNCEFGWGSHKTFCHWEHDNHVQLKWSVLTSKTGPIQDHTGDGNFIY SQADENQKGKVARLVSPVVYSQNSAHCMTFWYHMSGSHVGTLRVKLRYQK PEEYDQLVWMAIGHQGDHWKEGRVLLHKSLKLYQVIFEGEIGKGNLGGIAVD DISINNHISQEDCAKPADLDKKNPEIKIDETGSTPGYEGEGEGDKNISRKPGNVL KTLDPILITIIAMSALGVLLGAVCGVVLYCACWHNGMSERNLSALENYNFELV DGVKLKKDKLNTQSTYSEA

Según la divulgación, una primera secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con una segunda secuencia de aminoácidos significa que la primera secuencia tiene 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; el 99 o el 100 % de identidad con la segunda secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia se mide frecuentemente en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor sea el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Se describen diversos programas y algoritmos de alineamiento en: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet y col. Nue. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang y col., Comp. Appls Biosci, 8:155-165, 1992; and Pearson y col., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul y col., Nat. Genet, 6:119-129, 1994, presenta una consideración detallada de los métodos de alineamiento de secuencias y los cálculos de homología. A modo de ejemplo, las herramientas de alineación ALIGN (Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) o LFASTA (Pearson and Lipman, 1988) pueden usarse para realizar comparaciones de secuencias (Internet Program® 1996, W. R. Pearson and the University of Virginia, fasta20u63 version 2.0u63, fecha de liberación, diciembre de 1996). ALIGN compara las secuencias enteras entre sí, mientras que LFASTA compara regiones de similitud local. Estas herramientas de alineación y sus respectivas guías están disponibles en Internet en la página web NCSA, por ejemplo. Alternativamente, para las comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, puede emplearse la función de secuencias Blast 2 usando la matriz BLOSUM62 por defecto establecida en los parámetros por defecto (coste de existencia de hueco de 11 y un coste de hueco por residuo de 1). Al alinear péptidos cortos (menos de alrededor de 30 aminoácidos), la alineación debe realizarse usando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 establecida en los parámetros por defecto (hueco abierto de 9, penalizaciones de hueco de extensión de 1). El sistema de comparación de secuencias BLAST está disponible, por ejemplo, del sitio web de NCBI: véase también Altschul y col., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden y col. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul y col., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997; y Zhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997.

Las propiedades funcionales del polipéptido de la presente invención, es decir, la inhibición de la unión entre leptina y NRP-1, podrían evaluarse normalmente en cualquier ensayo funcional tal como se describe en el ejemplo.

En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se fusiona con al menos un polipéptido heterólogo para formar una proteína de fusión.

En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se fusiona o bien directamente o bien mediante un espaciador en su extremo C-terminal al extremo N-terminal del polipéptido heterólogo, o en su extremo N-terminal al extremo C-terminal del polipéptido heterólogo. Tal como se usa en el presente documento, el término “directamente” significa que el (primer o último) aminoácido en el extremo terminal (extremo N o C-terminal) del polipéptido de la presente invención se fusiona al (primer o último) aminoácido en el extremo terminal (extremo N o C-terminal) del polipéptido heterólogo. En otras palabras, en esta realización, el último aminoácido del extremo C-terminal de dicho polipéptido está unido directamente por un enlace covalente al primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho polipéptido heterólogo, o el primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho polipéptido está unido directamente por un enlace covalente al último aminoácido del extremo C-terminal de dicho polipéptido heterólogo. Tal como se usa en el presente documento, el término “espaciador” se refiere a una secuencia de al menos un aminoácido que une el polipéptido de la invención al polipéptido heterólogo. Un espaciador de este tipo puede ser útil para evitar impedimentos estéricas. Normalmente, un espaciador comprende 2, 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; o 20 aminoácidos.

Los polipéptidos de la presente invención se producen mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, o bien sola o bien en combinación. Por ejemplo, conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos polipéptidos, mediante técnicas estándar para la producción de secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse usando un método de fase sólida bien conocido, preferiblemente usando un aparato de síntesis de péptidos disponible comercialmente (tal como el elaborado por Applied Biosystems, Poster City, california) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención pueden sintetizarse mediante técnicas de ADN recombinante, tal como es ahora bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estos fragmentos pueden obtenerse como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican para el (poli)péptido deseado en vectores de expresión e introducción de tales vectores en huéspedes eucariotas o procariotas adecuados que expresarán el polipéptido deseado, de los cuales pueden aislarse posteriormente usando técnicas bien conocidas.

Los polipéptidos o proteínas de fusión de la invención pueden usarse en una forma aislada (por ejemplo, purificada) o contenida en un vector, tal como una membrana o vesícula lipídica (por ejemplo, un liposoma).

En algunas realizaciones, se contempla que los polipéptidos de la presente invención puedan modificarse para mejorar su eficacia terapéutica. Tal modificación de compuestos terapéuticos puede usarse para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo circulatorio o modificar la biodistribución. Por ejemplo, la toxicidad de compuestos terapéuticos potencialmente importantes puede disminuirse significativamente mediante la combinación con una variedad de vehículos portadores de fármacos que modifican la biodistribución. Una estrategia para mejorar la viabilidad del fármaco es la utilización de polímeros solubles en agua. Se ha demostrado que diversos polímeros solubles en agua modifican la biodistribución, mejoran el modo de captación celular, cambian la permeabilidad a través de barreras fisiológicas; y modificar la tasa de aclaramiento del cuerpo. Para lograr o bien un efecto de direccionamiento o bien de liberación sostenida, se han sintetizado polímeros solubles en agua que contienen restos de fármaco como grupos terminales, como parte de la estructura principal, o como grupos colgantes en la cadena de polímero. Por ejemplo, la pegilación es un enfoque bien establecido y validado para la modificación de un intervalo de polipéptidos (Chapman, 2002). Los beneficios incluyen entre otros: (a) semividas circulantes notablemente mejoradas in vivo debido o bien a la evasión del aclaramiento renal como resultado del polímero que aumenta el tamaño aparente de la molécula con respecto al límite de filtración glomerular, y/o bien a través de la evasión de los mecanismos de aclaramiento celular; (b) antigenicidad e inmunogenicidad reducidas de la molécula a la que está unido PEG; (c) farmacocinética mejorada; (d) resistencia proteolítica potenciada de la proteína conjugada (Cunningham-Rundles y col., 1992); y (e) estabilidad térmica y mecánica mejoradas del polipéptido pegilado. Por tanto, ventajosamente, los polipéptidos de la invención pueden unirse covalentemente con uno o más grupos de polietilenglicol (PEG). Un experto en la técnica puede seleccionar una masa molecular adecuada para PEG, basándose en cómo se usará terapéuticamente el polipéptido pegilado considerando diferentes factores, incluyendo la dosificación, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, la inmunogenicidad, etc. En algunas realizaciones, pueden introducirse sitios adicionales para la pegilación por mutagénesis dirigida al sitio introduciendo uno o más residuos de lisina. Por ejemplo, uno o más residuos de arginina pueden mutarse a un residuo de lisina. En algunas realizaciones, se introducen químicamente sitios de pegilación adicionales modificando aminoácidos en polipéptidos de la invención. En algunas realizaciones, los PEG se conjugan con los polipéptidos o proteínas de fusión a través de un ligador.

Los ligadores adecuados son bien conocidos por el experto.

Un objeto adicional de la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ ácido nucleico” tiene su significado general en la técnica y se refiere a una molécula de ADN o ARN. Sin embargo, el término captura de secuencias que incluye cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4- tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

En alguna realización, el ácido nucleico se incluye en un vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o vector viral. Por tanto, un objeto adicional de la presente invención se refiere a un vector y a un casete de expresión en el que un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la presente invención está asociado con elementos adecuados para controlar la transcripción (en particular promotor, potenciador y, opcionalmente, terminador) y, opcionalmente, traducción, y también los vectores recombinantes en los que se inserta un ácido nucleico según la invención. Estos vectores recombinantes pueden, por ejemplo, ser vectores de clonación o vectores de expresión. Tal como se usa en el presente documento, los términos “vector” , “vector de clonación” y “vector de expresión” significan el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) en una célula huésped, para transformar el huésped y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Puede usarse cualquier vector de expresión para la célula animal.

Los ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji y col., 1990), pAGE103 (Mizukami e Itoh, 1987), pHSG274 (Brady y col., 1984), pKCR(O'Hare y col., 1981), pSG1 beta d2-4 (Miyaji y col., 1990) y similares. Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos replicantes que comprenden un origen de replicación, o plásmidos integrativos, tales como por ejemplo pUC, pcDNA, pBR y similares. Otros ejemplos de vectores virales incluyen vectores adenovirales, retrovirales, del virus del herpes y de AAV. Tales virus recombinantes pueden producirse mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como transfectando células de empaquetamiento o mediante transfección transitoria con plásmidos o virus auxiliares. Los ejemplos típicos de células de empaquetamiento de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Los protocolos detallados para producir tales virus recombinantes defectuosos en la replicación pueden encontrarse, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US-5.882.877, US-6.013.516, US-4.861.719, US 5.278.056 y WO 94/19478. Los ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresión para células animales incluyen el promotor y potenciador tempranos de SV40 (Mizukami e Itoh, 1987), promotor LTR y potenciador del virus de la leucemia de ratón Moloney (Kuwana y col., 1987), promotor (Mason y col., 1985) y potenciador (Gillise y col., 1983) de la cadena H de inmunoglobulina y similares.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la presente invención. En particular, un sujeto de la presente invención es una célula huésped procariota o eucariota transformada genéticamente con al menos un ácido nucleico de la presente invención. El término “transformación” significa la introducción de un gen “extraño” (es decir, extrínseco o extracelular), secuencia de ADN o ARN a una célula huésped, de modo que la célula huésped expresará el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, normalmente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducido. Una célula huésped que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha “transformado” . En algunas realizaciones, para expresar y producir polipéptidos o proteínas de fusión de la invención, se elegirán células procariotas, en particular, células de E. coli. En realidad, según la invención, no es obligatorio producir el polipéptido o la proteína de fusión de la invención en un contexto eucariota que favorezca modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glucosilación). Además, las células procariotas tienen las ventajas de producir proteínas en grandes cantidades. Si se necesita un contexto eucariótico, las levaduras (por ejemplo, cepas de Saccharomyces) pueden ser particularmente adecuadas ya que permiten la producción de grandes cantidades de proteínas. De otro modo, podrían usarse líneas celulares eucariotas típicas tales como CHO, BHK-21, COS-7, C127, PER.C6, YB2/0 o HEK293, para su capacidad para procesar correctamente las modificaciones postraduccionales de la proteína de fusión de la invención. La construcción de vectores de expresión según la invención, y la transformación de las células hospedadoras se puede llevar a cabo usando técnicas convencionales de biología molecular. El polipéptido o la proteína de fusión de la invención puede, por ejemplo, obtenerse cultivando células genéticamente transformadas según la invención y recuperando el polipéptido o la proteína de fusión expresada por dicha célula, del cultivo. Entonces, si es necesario, se pueden purificar mediante procedimientos convencionales, conocidos en sí mismos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante precipitación fraccionada, en particular precipitación con sulfato de amonio, electroforesis, filtración en gel, cromatografía de afinidad, etc. En particular, se pueden usar métodos convencionales para preparar y purificar proteínas recombinantes para producir las proteínas según la invención.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo o un aptámero, que se une específicamente a un polipéptido de la presente invención.

Tal como se usa en la presente descripción, el término “anticuerpo” se usa por tanto para referirse a cualquier molécula similar a un anticuerpo que tenga una región de unión a antígeno, y este término incluye fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único (DAB), dímero TandAbs, Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpos lineales, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, bicuerpo, tricuerpo (fusiones scFv-Fab, biespecíficos o triespecíficos, respectivamente); sc-diacuerpo; cuerpos kappa(lamda) (fusiones scFv-CL); BiTE (activador de células T biespecífico, tándems scFv-scFv para atraer células T); DVD-Ig (anticuerpo de dominio variable dual, formato biespecífico); SIP (pequeña inmunoproteína, un tipo de minicuerpo); SMIP (“ inmunofármaco modular pequeño” scFv-Fc <limer; DART ((diacuerpo estabilizado con ds “ redireccionamiento de afinidad dual” ); miméticos de anticuerpos pequeños que comprenden una o más CDR y similares. Las técnicas para preparar y usar diversos constructos basados en anticuerpos y fragmentos se conocen bien en la técnica (véanse Kabat y col., 1991) Diabodies, en particular, se describen adicionalmente en los documentos EP 404.097 y WO 93/1 1161; mientras que los anticuerpos lineales se describen adicionalmente en Zapata y col. (1995). Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 pueden generarse tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'. La digestión con papaína puede conducir a la formación de fragmentos Fab. Fab, Fab' and F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos y otros fragmentos también pueden sintetizarse mediante técnicas recombinantes o pueden sintetizarse químicamente. Las técnicas para producir fragmentos de anticuerpos son bien conocidas y se describen en la técnica. Por ejemplo, cada uno de Beckman y col., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall y col., 2004; Reff & Heard, 2001; Reiter y col., 1996; y Young y col., 1995 describen adicionalmente y permiten la producción de fragmentos de anticuerpos eficaces.

En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera, lambda (1) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo; IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CHI, CH2 y CH3, denominados colectivamente CH). Las regiones variables de ambas cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de unión al antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren propiedades biológicas importantes, tales como asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria, unión del complemento y unión a receptores de Fe (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación de anticuerpos y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos están formados por residuos que son principalmente de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR). Ocasionalmente, los residuos de regiones no hipervariables o de entramado (FR) influyen en la estructura global del dominio y, por tanto, el sitio de combinación. Regiones determinantes de complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos, que juntas definen la afinidad y especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, designadas L-CDRI, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDRI, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera. Las regiones de entramado (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR.

El término “ Fab” indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión al antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa, entre fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, papaína, se unen entre sí a través de un enlace disulfuro.

El término “ F(ab')2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de unión a antígeno, que es ligeramente más grande que el Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región bisagra, entre fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, pepsina.

El término “ Fab'” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab')2.

Un polipéptido Fv de cadena sencilla (“scFv” ) es un heterodímero VH:VL unido covalentemente que generalmente se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes codificantes de VH y VL unidos por un ligador que codifica para un péptido. “dsFv” es un heterodímero VH:VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes pueden formarse o bien espontáneamente mediante asociación de scFv monovalentes, o bien pueden generarse acoplando scFv monovalentes mediante un ligador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.

El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno.

Los anticuerpos monoclonales pueden generarse usando el método de Kohler y Milstein (Nature, 256:495, 1975). Para preparar anticuerpos monoclonales útiles en la invención, un ratón u otro animal huésped apropiado se inmuniza a intervalos adecuados (por ejemplo, dos veces a la semana, semanalmente, dos veces al mes o mensualmente) con las formas antigénicas apropiadas (es decir, polipéptidos de la presente invención). Al animal puede administrársele un “ refuerzo” final de antígeno dentro de una semana de sacrificio. A menudo es deseable usar un adyuvante de inmunología durante la inmunización. Los adyuvantes de inmunología adecuados incluyen adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, alumbre, adyuvante Ribi, Titermax de Hunter, adyuvantes de saponina tales como QS21 o Quil A, u oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen CpG. Otros adyuvantes adecuados son bien conocidos en el campo. Los animales pueden inmunizarse por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intranasal u otras vías. Un animal dado puede inmunizarse con múltiples formas del antígeno por múltiples vías.

En resumen, el polipéptido recombinante de la presente invención puede proporcionarse por expresión con líneas celulares recombinantes. Las formas recombinantes de los polipéptidos pueden proporcionarse usando cualquier método descrito anteriormente. Después del régimen de inmunización, los linfocitos se aíslan del bazo, el ganglio linfático u otro órgano del animal y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada usando un agente tal como polietilenglicol para formar un hibridoma. Después de la fusión, las células se colocan en medios permisivos para el crecimiento de hibridomas pero no las parejas de fusión usando métodos convencionales. Después del cultivo de los hibridomas, se analizan los sobrenadantes celulares para determinar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, es decir, que se unen selectivamente al antígeno. Las técnicas analíticas adecuadas incluyen ELISA, citometría de flujo, inmunoprecipitación e inmunotransferencia de tipo Western. Otras técnicas de cribado son bien conocidas en el campo. Las técnicas preferidas son aquellas que confirman la unión de anticuerpos a antígeno plegado de forma nativa conformacionalmente intacto, tales como ELISA no desnaturalizante, citometría de flujo e inmunoprecipitación.

Significativamente, tal como es bien conocido en la técnica, solo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está involucrada en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase, en general, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7- Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones Fe' y Fe, por ejemplo, son efectoras de la cascada del complemento pero no están involucradas en la unión al antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc', o que se ha producido sin la región pFc', denominado fragmento F(ab')2, retiene ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fe, o que se ha producido sin la región Fe, denominado fragmento Fab, retiene uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Continuando más adelante, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porción de la cadena pesada de anticuerpo denominada Fd. Los fragmentos Fd son el principal determinante de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd puede estar asociado con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd retienen la capacidad de unión al epítopo en aislamiento.

Dentro de la porción de unión a antígeno de un anticuerpo, tal como es bien sabido en la técnica, hay regiones determinantes de complementariedad (CDR), que interactúan directamente con el epítopo del antígeno, y las regiones de entramado (FR), que mantienen la estructura terciaria del paratopo (véase, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de cadena pesada como en la cadena ligera de inmunoglobulinas IgG, hay cuatro regiones de entramado (FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDRS). Las CDR, y en particular las regiones CDRS, y más particularmente las CDRS de cadena pesada, son en gran parte responsables de la especificidad de los anticuerpos.

Ahora está bien establecido en la técnica que las regiones no CDR de un anticuerpo de mamífero pueden reemplazarse con regiones similares de anticuerpos conespecíficos o heteroespecíficos mientras se retiene la especificidad del epítopo del anticuerpo original. Esto se manifiesta más claramente en el desarrollo y uso de anticuerpos “ humanizados” en los que las CDR no humanas se unen covalentemente a regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Tal como se usa en el presente documento, “ humanizado” describe anticuerpos en los que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR se reemplazan con aminoácidos correspondientes derivados de moléculas de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes US-4.816.567, US-5.225.539, US-5.585.089, US-5.693.761, US-5.693.762 y US-5.859.205. Las patentes US-5.585.089 y US-5.693.761, y el documento WO 90/07861 también proponen cuatro criterios posibles que pueden usarse para diseñar los anticuerpos humanizados. La primera propuesta fue que, para un aceptor, usar una región de entramado de una inmunoglobulina humana particular que sea inusualmente homóloga a la inmunoglobulina donante que va a humanizarse, o usar una región de entramado de consenso de muchos anticuerpos humanos. La segunda propuesta fue que si un aminoácido en la región de entramado de la inmunoglobulina humana es inusual y el aminoácido donante en esa posición es típico de las secuencias humanas, entonces podría seleccionarse el aminoácido donante en lugar del aceptor. La tercera propuesta fue que en las posiciones inmediatamente adyacentes a las 3 CDR en la cadena de inmunoglobulina humanizada, podría seleccionarse el aminoácido donante en lugar del aminoácido aceptor. La cuarta propuesta fue usar el aminoácido donante que reside en las posiciones de entramado en las que se predice que el aminoácido tiene un átomo de cadena lateral dentro de 3A de las CDR en un modelo tridimensional del anticuerpo y se predice que es capaz de interactuar con las CDR. Los métodos anteriores son meramente ilustrativos de algunos de los métodos que un experto en la técnica podría emplear para hacer anticuerpos humanizados. Un experto en la técnica estará familiarizado con otros métodos para la humanización de anticuerpos.

En algunas moléculas, algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR se han reemplazado por aminoácidos de moléculas de inmunoglobulina humana pero donde algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR no cambian. Se permiten pequeñas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos siempre que no anularan la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno dado. Las moléculas de inmunoglobulina humana adecuadas incluirían las moléculas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo “ humanizado” conserva una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original. Sin embargo, usando determinados métodos de humanización, la afinidad y/o la especificidad de la unión del anticuerpo se puede aumentar usando métodos de “evolución dirigida” , tal como se describe por Wu y col., /. Mol. Biol.294:151,1999.

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos también se pueden preparar inmunizando ratones transgénicos para grandes porciones de loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Véanse, por ejemplo, las patentes US-5.591.669, US-5.598.369, US-5.545.806, US-5.545.807, US-6.150.584 y las referencias citadas en los mismos. Estos animales han sido modificados genéticamente de manera que hay una deleción funcional en la producción de anticuerpos endógenos (por ejemplo, murinos). Los animales se modifican adicionalmente para contener todo o una porción del locus del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana de manera que la inmunización de estos animales dará como resultado la producción de anticuerpos completamente humanos al antígeno de interés. Después de la inmunización de estos ratones (por ejemplo, XenoMouse (Abgenix), ratones HuMAb (Medarex/GenPharm), los anticuerpos monoclonales pueden prepararse según la tecnología de hibridoma convencional. Estos anticuerpos monoclonales tendrán secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina humana y, por tanto, no provocarán respuestas de anticuerpo anti-IgG de ratón humano (KAMA) cuando se administran a humanos. También existen métodos in vitro para producir anticuerpos humanos. Estos incluyen tecnología de presentación en fagos (patentes US-5.565.332 y US-5.573.905) y la estimulación in vitro de células B humanas (patentes US-5.229.275 y US-5.567.610).

Por tanto, tal como será evidente para un experto en la técnica, la presente invención también proporciona fragmentos F(ab')2, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quiméricos en los que las regiones CDR3 de Fe y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o de cadena ligera se han reemplazado por secuencias humanas homólogas o no humanas; anticuerpos de fragmentos F(ab')2 quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR3 de la cadena ligera se han reemplazado por secuencias humanas homólogas o no humanas; anticuerpos de fragmentos Fab quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR3 de la cadena ligera se han reemplazado por secuencias humanas homólogas o no humanas; y anticuerpos de fragmentos Fd quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han reemplazado por secuencias humanas homólogas o no humanas. La presente invención también incluye los denominados anticuerpos de cadena sencilla.

Las diversas moléculas y fragmentos de anticuerpos pueden derivar de cualquiera de las clases de inmunoglobulina comúnmente conocidas, incluyendo pero sin limitarse a IgA, IgA secretora, IgE, IgG e IgM. Las subclases de IgG también son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.

Los aptámeros son una clase de molécula que representa una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos con la capacidad de reconocer virtualmente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Tales ligandos pueden aislarse a través de la evolución sistemática de los ligandos por enriquecimiento de exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatoria. La biblioteca de secuencias aleatoria se puede obtener mediante síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, eventualmente modificado químicamente, de una secuencia única. Los aptámeros peptídicos consisten en una región variable de anticuerpo restringida conformacionalmente mostrada por una proteína de plataforma, tal como tiorredoxina A de E. coli que se selecciona de bibliotecas combinatorias mediante dos métodos híbridos (Colas y col., 1996).

Un objeto adicional de la presente invención se refiere a un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” o “tratar” se refiere tanto al tratamiento profiláctico o preventivo como al tratamiento de modificación de la enfermedad o curativa, incluyendo el tratamiento del paciente en riesgo de contraer la enfermedad o sospechoso de haber contraído la enfermedad, así como a los pacientes que están enfermos o han sido diagnosticados con una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que tiene un trastorno médico o que finalmente puede adquirir el trastorno, para prevenir, curar, retrasar la aparición, reducir la gravedad, o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. Por “ régimen terapéutico” se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La expresión “ régimen de inducción” o “periodo de inducción” se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un paciente durante el periodo inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un “ régimen de carga” , que puede incluir administrar una dosis mayor del fármaco que un médico emplearía durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco con mayor frecuencia que un médico administraría el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambos. La expresión “ régimen de mantenimiento” o “ periodo de mantenimiento” se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un paciente durante el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, para mantener el paciente en remisión durante largos periodos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear una terapia continua (por ejemplo, administrar un fármaco a intervalos regulares, por ejemplo, semanalmente, mensuales, anuales, etc.) o terapia intermitente (por ejemplo, tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en recidiva, o tratamiento tras el logro de un criterio predeterminado particular [por ejemplo, manifestación de la enfermedad, etc.]).

Tal como se usa en el presente documento, el término “cáncer” tiene su significado general en la técnica e incluye, pero no se limita a, tumores sólidos y tumores de sangre. El término cáncer incluye enfermedades de la piel, tejidos, órganos, hueso, cartílago, sangre y vasos sanguíneos. El término “cáncer” abarca además tanto cánceres primarios como metastásicos. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse por métodos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas de la vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, gastrointestinal, encía, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovario, próstata, piel, estómago, testículo, lengua o útero. Además, el cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico, aunque no se limita a estos: neoplasia, tumor maligno; carcinoma; carcinoma, no diferenciado; carcinoma de células gigantes y fusiformes; carcinoma de células pequeñas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células basales; carcinoma de pilomatriz; carcinoma de células de transición; carcinoma papilar de células de transición; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcinoma quístico adenoide; adenocarcinoma en pólipos adenomatosos; adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquiolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical suprarrenal; carcinoma endometrioide; carcinoma de apéndices cutáneos; adenocarcinoma apocne; adenocarcinoma sebáceo; ceruminoso; adenocarcinoma; carcinoma mucoepidermoide; cistoadenocarcinoma; cistoadenocarcinoma papilar; cistoadenocarcinoma seroso papilar; cistoadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de sello; carcinoma de conducto infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, mamaria; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma ovárico, maligno; tecoma, maligno; tumor de células de granulosa, maligno; y roblastoma, maligno; carcinoma de células Sertoli; tumor maligno de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extra-mamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de extensión superficial; melanoma maligno en nevus pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto mülleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filoides, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; estruma ovárico, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor de células gigantes del hueso; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogemico olfatorio; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; llinfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocítico pequeño; linfoma maligno, células grandes, difuso; linfoma maligno folicular; micosis fungoide; otros linfomas no Hodgkin especificados; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; y leucemia de células pilosas.

Por “cantidad terapéuticamente eficaz” se entiende una cantidad suficiente de polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero de la presente invención para alcanzar un efecto terapéutico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención será decidido por el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; Fármacos usados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está dentro de la habilidad de la técnica iniciar dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logra el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de desde 0,01 hasta 1.000 mg por adulto por día. Normalmente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del principio activo para el ajuste sintomático de la dosis al sujeto que va a tratarse. Un medicamento normalmente contiene de desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 500 mg del principio activo, normalmente de desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg del principio activo. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra normalmente a un nivel de dosificación de desde 0,0002 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, especialmente de desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 7 mg/kg de peso corporal al día.

En algunas realizaciones, el polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero de la presente invención se usa en combinación con un agente quimioterapéutico para el tratamiento del cáncer. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBl-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos endiinarios (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamamicina y calicheamicina omegall; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y cromoproteínas relacionadas enediina cromóforos antiobióticos, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxi doxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como dentopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tiguanina; análogos de pirimidina, tales como ancicitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxiflidina, enoctabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromoestanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetiimida, mitotano, trilostano; un agente de reposición de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinán; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacáridos PSK); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (“Ara-C” ); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y doxetaxel; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP- 16); ifosfamida mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (por ejemplo, CPT-1 1); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, el polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero de la presente invención se usa en combinación con agentes antiangiogénicos. Tal como se usa en el presente documento, un “agente antiangiogénico” se refiere a una molécula que inhibe la angiogénesis mediada por VEGF o VEGFR, vasculogénesis o permeabilidad vascular indeseable. Por ejemplo, un agente terapéutico anti-VEGF puede ser un anticuerpo dirigido contra VEGF o VEGFR. Un anticuerpo anti-VEGF generalmente no se unirá a otros homólogos de VEGF tales como VEGF- Bor VEGF-C, u otros factores de crecimiento tales como PlGF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo anti-VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC® HB 10709 y es un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad. Un “anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad” tiene una afinidad al menos 10 veces mejor para VEGF que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1. Preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF es un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado según el documento WO 98/45331, incluyendo un anticuerpo que comprende las CDR o las regiones variables de Y0317. Más preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF es el fragmento de anticuerpo conocido como ranibizumab (LUCENTIS ®). El anticuerpo anti-VEGF ranibizumab es un fragmento Fab anti-VEGF humano madurado por afinidad humanizado. El ranibizumab se produce mediante métodos de tecnología recombinante convencional en el vector de expresión de E. coli y fermentación bacteriana. El ranibizumab no está glicosilado y tiene una masa molecular de -48.000 dalton. Véanse los documentos WO98/45331 y U.S. 2003/0190317.

Los agentes antiangiogénicos incluyen, pero no se limitan a, bevacizumab (rhuMab VEGF, Avastin®, Genentech, Sur de San Francisco Calif.), ranibizumab (rhuFAb V2, Lucentis®, Genentech), pegaptanib (Macugen®, Eyetech Pharmaceuticals, Nueva York N.Y.), maleato de sunitinib (Sutent®, Pfizer, Groton Conn.), ramucirumab (Cyramza®, Eli Lilly and Company, Indianápolis, IN 46285, EE.UU. licencia estadounidense).

Otro objeto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Normalmente, el polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero de la presente invención se pueden combinar con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas. “ Farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alergia u otra reacción adversa cuando se administran a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un material de carga, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación sólido, semisólido o líquido no tóxico de cualquier tipo. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a los sujetos. Las formas de administración unitaria adecuadas comprenden formas de vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o disoluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, inyección subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal. Normalmente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos, que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Estas pueden ser, en particular, soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que al añadirlas, dependiendo del caso, de agua esterilizada o suero fisiológico, permiten la constitución de disoluciones inyectables. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las disoluciones que comprenden compuestos de la presente invención como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. El polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero de la presente invención se puede formular en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. El portador también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y secado por congelación que produce un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución esterilizada por filtración previamente del mismo. También se contempla la preparación de disoluciones más o altamente concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, que suministra altas concentraciones de los agentes activos a un área tumoral pequeña. Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en dicha cantidad que es terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe tamponarse de manera adecuada si es necesario y hacer en primer lugar que el diluyente líquido sea isotónico con glucosa o solución salina suficiente. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los expertos en la técnica conocerán medios acuosos estériles, que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. Alguna variación en la dosificación se producirá necesariamente dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitativos del alcance de la presente invención.

Figuras:

La figura 1 muestra la interacción OB:NRP-1 con VEGF

La figura 2 muestra el acoplamiento OB:VEGF165:NRP1

La figura 3 muestra la interacción de los péptidos NRPP:OB

La figura 4 muestra el aumento de la formación del complejo NRP-1/0BR y la migración celular MDA-MD231 después del tratamiento con Avastin

Ejemplo:

Material y métodos

Interferometría de biocapas

La interferometría de biocapas (BLI) es una técnica sin etiqueta que es sensible a un aumento de masa unida al biosensor que permite la caracterización de la interacción proteína-proteína.

Preparación de ligandos: se incubaron las proteínas en tampón aPBS con una razón molar de 1:3 de biotina (biotina-PEG4-NHS de Pierce EZ, preparada siguiendo las instrucciones del fabricante). La biotina libre se retiró usando una columna de desalación (Pierce). La proteína biotinilada (denominada ligando) se inmovilizó sobre puntas de biosensor de estreptavidina y se sumergió en pocillos que contenían el tampón con el analito de interés (asociación) o sin (disociación).

Las condiciones experimentales fueron las siguientes: volumen total en cada pocillo: 200 p1; velocidad de agitación: 1.000 rpm. Para las interacciones proteína:proteína simples, se siguió una fase de asociación por una fase de disociación. Para los experimentos de competición, la fase de asociación fue seguida por otra fase de asociación con un segundo analito en lugar de una fase de disociación.

Los sensogramas se corrigieron en fondo, se suavizaron con el algoritmo Savitzky-Golay y se analizaron usando el programa informático OctetRED (ForteBio Data Analysis versión 7.1.).

Los sensogramas experimentales se ajustaron primero a un modelo 1:1. Se aceptó el modelo 1:1 si la prueba de Chi2 fue inferior a 3 y R2 estuvo por encima de 0,9. Cuando se rechazó el modelo 1:1, el modelo con el Chi2 más bajo y el R2 más alto luego se seleccionó.

Experimento de acoplamiento molecular

Preparación de las estructuras de proteínas

La estructura de VEGF (PDB ID: 4DEQ) and leptina (PDB ID: 1AX8) se extrajeron del banco de datos de proteínas (ref Berman). Dado que la estructura de la leptina estaba mutada en la PDB original (Wl 00E), se invirtió la mutación a la leptina de tipo natural con PyMol (ref Delano). Se añadieron hidrógenos y cargas parciales usando la rutina de DockPrep de Chimera (ref Pettersen).

Experimento de acoplamiento ciego.

Se usó un protocolo de acoplamiento ciego jerárquico que comprende el servidor web PatchDock (ref Schneidman-Duchovny) para la primera etapa con parámetros predeterminados. Las 1000 soluciones superiores de PatchDock se refinaron y se volvieron a poner en servicio usando el servidor Firefdock (ref Schneidman-duchovny 2). Las 10 mejores soluciones reclasificadas se optimizaron con RosettaDock tal como se implementó en ROSIE (ref Lyskov) con el parámetro sin refinar. El modo de unión consenso, ilustrado en la figura 2 se extrajo de las soluciones superiores. Detección del complejo NRP-1 y OBR en la línea celular de cáncer de mama MBA-MB231 mediante inmunocitoquímica usando una tecnología PLA

La detección del complejo NRP-1/OBR en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB231 humana se evaluó mediante un ensayo de ligadura de proximidad (PLA) o tecnología duolink (www.olink.com). La detección del complejo NRP-1/OBR se evaluó en la línea celular MDA-MB231 cultivada en suero humano normal (plasma humano AB humano, origen de EE.UU., número MDL MFCD00165829 H4522 Sigma) y se trató o no con una concentración final de Avastin 40 gg/ml durante 48 h. El objetivo mediante el uso de suero humano fue imitar una condición fisiológica durante la terapia con Avastin. Las muestras inmunoteñidas se analizaron mediante la adquisición de las pilas Z a través de microscopía confocal en Zeiss LSM 700, microscopio confocal invertido. Las imágenes adquiridas se analizaron usando el software Image J para la cuantificación del complejo NRP-1/OBR expresado por las células. Resultados

Usando una tecnología de interferometría de biocapas BLI, http://www.fortebio.com). se pudo demostrar una interacción directa entre las proteínas recombinantes leptina y NRP-1 (figura A).

Se ha usado VEGF165 como control positivo del experimento. Sorprendentemente, a diferencia de otros ligandos de NRP-1, VEGF y Sema3A conocidos como competidores, la leptina se une directamente a NRP-1 pero no compiten con la unión a VEGF y, de manera similar, VEGF no evita la unión de leptina a NRP-1. Estas observaciones sugieren que la leptina y el VEGF deben tener un dominio de unión distinto.

Dado que la tecnología BLI ha demostrado que la leptina y el VEGF podrían interconectarse con NRP-1 de manera no competitiva y, dado que se podía demostrar que la leptina y el VEGF forman un complejo en el tejido de personas obesas y por tecnología BLI usando proteína recombinante, se evaluó un acoplamiento de NRP-1 y leptina acomplejada con VEGF165. A partir del mejor modo de consenso, las secuencias de péptidos SEQ ID NO:3 para la leptina y la SEQ ID NO:4 para NRP-1 se han identificado (figura 2). El dominio de unión a leptina (OB) (SEQ ID:3) a NRP-1 (SEQ ID:2) se validó por BLI usando un péptido sintetizado (SEQ ID:3) y el dominio extracelular de la proteína recombinante NRP-1 de los sistemas RnD (figura 3).

Dado que se ha demostrado que VEGF desempeña un papel regulador de retroalimentación negativa para la señalización de leptina y que Avastin aumentó la migración de células MDA-MB231, esto plantea la cuestión de si el efecto de Avastin se produce o no a través del aumento de formación del complejo NRP-1/OBR. Curiosamente, en comparación con la línea celular MDA-MB231 cultivada en suero humano, las células cultivadas en la misma condición y tratadas con Avastin 40 mg/ml presentaron un alto número de complejo NRP-1/OBR que expresa el aumento de la migración de las células.

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Servidor de Firedock: E. Mashiach, D. Schneidman-Duhovny, N. Andrusier, R. Nussinov, H. J. Wolfson. FireDock: a web server for fast interaction refinement in molecular docking.Nucleic Acids Res. (2008), 36 (edición de servidor web):W229-32.

Servidor Rosetta dock: Lyskov S., Gray J.J. “The RosettaDock server for local protein-protein docking” Nucleic Acids Research 36 (Web Server Issue), W233-W238 (2008).

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un polipéptido sintético o recombinante aislado capaz de inhibir la unión entre leptina y NRP-1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 (ENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETL) o SEQ ID NO:4 (EGNKPVLFQGNTNPTDVVVAVFPK).
2. 2. El polipéptido según la reivindicación 1, que se fusiona con al menos un polipéptido heterólogo.
3. 3. Un ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la reivindicación 1.
4. 4. El ácido nucleico según la reivindicación 3, que se incluye en un vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o vector viral.
5. 5. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3.
6. 6. Un anticuerpo o un aptámero que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 1.
7. 7. El anticuerpo según la reivindicación 6, que es un anticuerpo monoclonal.
8. 8. El anticuerpo según la reivindicación 6, que es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.
9. 9. El polipéptido según la reivindicación 1, el ácido nucleico según la reivindicación 3 o el anticuerpo o aptámero según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesita.
10. 10. El polipéptido según la reivindicación 1, el ácido nucleico según la reivindicación 3 o el anticuerpo o aptámero según la reivindicación 6, para su uso según la reivindicación 9, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en células cancerosas de la vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, gastrointestinal, encía, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovario, próstata, piel, estómago, testículos, lengua, útero, carcinoma maligno, carcinoma indiferenciado, carcinoma de células fusiformes y gigantes, carcinoma de células pequeñas, carcinoma papilar, carcinoma de células escamosas, carcinoma linfoepitelial, carcinoma de células basales, carcinoma de pilomatriz, carcinoma de células de transición, carcinoma de células de transición papilar, adenocarcinoma, gastrinoma maligno, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados, adenocarcinoma trabecular, adenocarcinoma en pólipo adenomatoso, adenocarcinoma, poliposis coli familiar, carcinoma sólido, tumor carcinoide maligno, adenocarcinoma branquiolo-alveolar, adenocarcinoma papilar, carcinoma cromófobo, carcinoma acidófilo, adenocarcinoma oxifílico, carcinoma basófilo, adenocarcinoma de células claras, carcinoma de células granulares, adenocarcinoma folicular, adenocarcinoma papilar y folicular, carcinoma esclerosante no encapsulante, carcinoma de la corteza suprarrenal, carcinoma endometroide, carcinoma de apéndices cutáneos, adenocarcinoma apocrino, adenocarcinoma sebáceo, adenocarcinoma ceruminoso, carcinoma mucoepidermoide, cistadenocarcinoma, cistadenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma seroso papilar, cistadenocarcinoma mucinoso, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma de conducto infiltrante, carcinoma medular, carcinoma lobular, carcinoma inflamatorio, enfermedad de Paget mamaria, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma con metaplasia escamosa, timoma maligno, tumor maligno del estroma ovárico, tecoma maligno, tumor maligno de células de la granulosa, roblastoma maligno, carcinoma de células de Sertoli, tumor maligno de células de Leydig, tumor maligno de células lipídicas, paraganglioma maligno, paraganglioma extramamario maligno, feocromocitoma, glomangiosarcoma maligno, melanoma, melanoma amelanótico, melanoma de extensión superficial, melanoma maligno en nevo pigmentado gigante, melanoma de células epitelioides, nevo azul maligno, sarcoma, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, mixosarcoma, liposarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, rabdomiosarcoma embrionario, rabdomiosarcoma alveolar, sarcoma del estroma, tumor mixto maligno, tumor mixto mulleriano, nefroblastoma, hepatoblastoma, carcinosarcoma, mesenquimoma maligno, tumor de Brenner maligno, tumor filodes maligno, sarcoma sinovial, mesotelioma maligno, disgerminoma, carcinoma embrionario, teratoma maligno, estruma ovárico maligno, coriocarcinoma, mesonefroma maligno, hemangiosarcoma, hemangioendotelioma maligno, sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma maligno, linfangiosarcoma osteosarcoma, osteosarcoma yuxtacortical, condrosarcoma, condroblastoma maligno, condrosarcoma mesenquimatoso, tumor óseo de células gigantes, sarcoma de Ewing, tumor odontogénico maligno, odontosarcoma ameloblástico, ameloblastoma maligno, fibrosarcoma ameloblástico, pinealoma maligno, cordoma, glioma maligno de astrocitoma, epenaloma maligno, astrocitoma protoplásmico, astrocitoma fibrilar, astroblastoma, glioblastoma, oligodendroglioma, oligodendroblastoma, tumor neuroectodérmico primitivo, sarcoma cerebeloso, ganglioneuroblastoma, neuroblastoma, retinoblastoma, tumor neurogénico olfatorio, meningioma maligno, neurofibrosarcoma, neurilemoma maligno, tumor maligno de células granulares, linfoma maligno, enfermedad de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, paragranuloma maligno, linfoma maligno, linfoma linfocítico pequeño maligno, linfoma maligno difuso de células grandes, micosis fungoide foliculotrópica, otros linfomas no Hodgkin malignos especificados, histiocitosis maligna, mieloma múltiple, sarcoma de mastocitos, enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado, leucemia, leucemia linfoide, leucemia de células plasmáticas, eritroleucemia, leucemia de células de linfosarcoma, leucemia mieloide, leucemia basófila, leucemia eosinofílica, leucemia monocítica, leucemia de mastocitos, leucemia megacarioblástica, sarcoma mieloide y leucemia de células pilosas.
11. 11. El polipéptido según la reivindicación 1, el ácido nucleico según la reivindicación 3 o el anticuerpo o aptámero según la reivindicación 6, para su uso según la reivindicación 10, en donde el polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o aptámero se usa en combinación con un agente antiangiogénico tal como un anticuerpo anti-VEGF o anticuerpo anti-VEGFR.
12. 12. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido según la reivindicación 1, el ácido nucleico según la reivindicación 3 o el anticuerpo o aptámero según la reivindicación 6.