TW202023629A - 用於調節單核球及巨噬細胞發炎表型之組合物及方法以及其免疫療法用途 - Google Patents

用於調節單核球及巨噬細胞發炎表型之組合物及方法以及其免疫療法用途 Download PDF

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Abstract

本發明部分地係基於鑑別用於調節單核球及巨噬細胞發炎表型之組合物及方法以及其免疫療法用途。

Description

用於調節單核球及巨噬細胞發炎表型之組合物及方法以及其免疫療法用途
單核球及巨噬細胞係吞噬細胞類型，該等係藉由攝取有害外來顆粒、細菌及死亡細胞或瀕死細胞來保護身體之細胞。除單核球及巨噬細胞外，吞噬細胞亦包含嗜中性球、樹突狀細胞及肥大細胞。
巨噬細胞通稱為大白血細胞，其巡查身體且經由稱為吞噬作用之過程來吞食並消解細胞碎屑及外來物質(例如病原體、微生物及癌細胞)。另外，巨噬細胞(包含組織巨噬細胞及循環單核球源巨噬細胞)係先天性免疫系統及適應性免疫系統之重要媒介。
巨噬細胞表型依賴於經由經典或替代路徑之活化(例如參見Classen等人(2009)Methods Mol. Biol. 531:29-43)。經典活化之巨噬細胞係由干擾素γ (IFNγ)或脂多醣(LPS)活化且顯示M1表型。此促發炎表型與增加之發炎及免疫系統刺激有關。替代活化之巨噬細胞係由細胞介素(如IL-4、IL-10及IL-13)活化，且顯示M2表型。此抗發炎表型與降低之免疫反應、增加之傷口癒合、增加之組織修復及胚胎發育有關。
在非病理學條件下，在免疫系統中存在免疫刺激性巨噬細胞及免疫調控性巨噬細胞之平衡群體。平衡之擾動可引起各種疾病病狀。在一些癌症中，舉例而言，腫瘤分泌使巨噬細胞群體極化朝向抗發炎、促腫瘤生成M2表型之免疫因子(例如細胞介素及介白素)，此會激活傷口癒合路徑，促進新血管生長(亦即血管生成)，且向腫瘤提供營養物及生長信號。該等M2巨噬細胞稱為腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)或腫瘤浸潤性巨噬細胞。腫瘤微環境中之TAM係癌症進展及轉移之重要調控因子(Pollard (2004)Nat. Rev. Cancer 4:71-78)。已探究經設計以抑制巨噬細胞基因靶(例如CSF1R 及CCR2 )之小分子及單株抗體，其係作為可抑制腫瘤形成之巨噬細胞表型調節劑(例如藉由調節促腫瘤生成巨噬細胞(例如TAM)及促發炎巨噬細胞之平衡)。調節單核球及巨噬細胞之募集、極化、活化及/或功能以調節巨噬細胞群體之平衡之療法稱為巨噬細胞免疫療法。儘管巨噬細胞生物學之領域已取得進展，然而，仍需要用於調節巨噬細胞發炎表型之新靶(例如基因及/或基因產物)及用於巨噬細胞免疫療法中之藥劑。
本發明至少部分地係基於發現可藉由調節本文所闡述之一或多種生物標記物(例如表1、表2、實例等中所列示之靶)之拷貝數、量及/或活性來調控單核球及/或巨噬細胞之發炎表型，且使用該等生物標記物及/或調節劑來用於治療、診斷、預後及篩選目的。
舉例而言，在一態樣中，提供生成在與至少一種藥劑接觸之後具有增加之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括使單核球及/或巨噬細胞與有效量之至少一種藥劑接觸，其中至少一種藥劑係a)下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑及/或b)上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，具有增加之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與一或多種藥劑接觸之後展現下列性質中之一或多者：a)分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之增加之表現及/或分泌；b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1、TGFb及/或IL-10之降低之表現及/或分泌；c)至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18、GM-CSF、CCL3、CCL4及IL-23組成之群之細胞介素或趨化介素之增加之分泌；d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之增加之比率；e)增加之CD8+細胞毒性T細胞活化；f)增加之CD8+細胞毒性T細胞活化之募集；g)增加之CD4+輔助性T細胞活性；h)增加之CD4+輔助性T細胞活性之募集；i)增加之NK細胞活性；j)增加之NK細胞募集；k)增加之嗜中性球活性；l)增加之巨噬細胞活性；及/或m)增加之紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量，如藉由顯微術所評價。在另一實施例中，與一或多種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑增加了細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量，及/或降低了2型及/或M2巨噬細胞之數量。在再一實施例中，與一或多種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且一或多種藥劑增加了i)對ii)之比率，其中i)係細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。
在另一態樣中，提供生成在與至少一種藥劑接觸之後具有降低之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括使單核球及/或巨噬細胞與有效量之至少一種藥劑接觸，其中該藥劑係a)上調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑及/或b)下調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，具有降低之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與一或多種藥劑接觸之後展現下列性質中之一或多者：a)分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之降低之表現及/或分泌；b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之增加之表現及/或分泌；c)至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之降低之分泌；d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之降低之比率；e)降低之CD8+細胞毒性T細胞活化；f)降低之CD4+輔助性T細胞活性；g)降低之NK細胞活性；h)降低之促發炎嗜中性球活性；i)降低之巨噬細胞活性；及/或j)降低之紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量，如藉由顯微術所評價。在另一實施例中，與一或多種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑降低了細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量，及/或增加了2型及/或M2巨噬細胞之數量。在再一實施例中，與一或多種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且一或多種藥劑降低了i)對ii)之比率，其中i)係細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。在又一實施例中，一或多種下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係小分子抑制劑、CRISPR嚮導RNA (gRNA)、RNA干擾劑、反義寡核苷酸、單鏈核酸、雙鏈核酸、適配體、核酶、DNA酶、肽、肽模擬物、抗體、細胞內抗體或細胞。RNA干擾劑可包括或係(例如)小干擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)或piwi-相互作用RNA (piRNA)。在另一實施例中，一或多種下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑包括特異性結合至表1及/或表2中所列示至少一種靶之抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段。在再一實施例中，抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段係駱駝科、鼠類、嵌合、人類化、人類、可檢測地標記的，包括效應結構域，包括Fc結構域，及/或係選自由以下組成之群：Fv、Fav、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及二價抗體片段。在又一實施例中，抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞毒性劑。在另一實施例中，細胞毒性劑係選自由以下組成之群：化學治療劑、生物藥劑、毒素及放射性同位素。在再一實施例中，一或多種上調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係編碼表1及/或表2中所列示一或多種靶之核酸分子或其片段、表1及/或表2中所列示一或多種靶之多肽或其片段、結合至表1及/或表2中所列示一或多種靶之活化抗體及/或細胞內抗體或結合至表1及/或表2中所列示一或多種靶之小分子。在又一實施例中，巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中細胞及/或巨噬細胞表現靶。在另一實施例中，在活體外或離體接觸單核球及/或巨噬細胞。在再一實施例中，單核球及/或巨噬細胞係原代單核球及/或原代巨噬細胞。在又一實施例中，在與一或多種藥劑接觸之前純化及/或培養單核球及/或巨噬細胞。在另一實施例中，在活體內接觸單核球及/或巨噬細胞。在再一實施例中，藉由全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與藥劑來在活體內接觸單核球及/或巨噬細胞。在又一實施例中，在組織微環境中接觸單核球及/或巨噬細胞。
在另一實施例中，該方法進一步包括使單核球及/或巨噬細胞與至少一種調節發炎表型之免疫治療劑接觸，視情況其中免疫治療劑包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。
在再一態樣中，提供一種組合物，其包括i)根據本文所闡述方法生成之單核球及/或巨噬細胞；及/或ii)用於下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之量及/或活性之siRNA。
在又一態樣中，提供增加在與至少一種藥劑接觸之後個體中單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之方法，其包括向個體投與有效量之至少一種藥劑，其中至少一種藥劑係a)下調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑；及/或b)上調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，具有增加之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與一或多種藥劑接觸之後展現下列性質中之一或多者：a)分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之增加之表現及/或分泌；b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之降低之表現及/或分泌；c)至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之增加之分泌；d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之增加之比率；e)增加之CD8+細胞毒性T細胞活化；f)增加之CD4+輔助性T細胞活性；g)增加之NK細胞活性；h)增加之嗜中性球活性；i)增加之巨噬細胞活性；及/或j)增加之紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量，如藉由顯微術所評價。在另一實施例中，一或多種藥劑增加了1型及/或M1巨噬細胞之數量，降低了2型及/或M2巨噬細胞之數量，及/或增加了i)對ii)之比率，其中i)係個體中之1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。在再一實施例中，在投與一或多種藥劑之後，個體中之細胞毒性CD8+ T細胞之數量及/或活性有所增加。在又一實施例中，降低在與至少一種藥劑接觸之後個體中單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之方法包括向個體投與有效量之至少一種藥劑，其中至少一種藥劑係a)上調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑；及/或b)下調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。在另一實施例中，具有降低之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與一或多種藥劑接觸之後展現下列性質中之一或多者：a)分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之降低之表現及/或分泌；b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之增加之表現及/或分泌；c)至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之降低之分泌；d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之降低之比率；e)降低之CD8+細胞毒性T細胞活化；f)降低之CD4+輔助性T細胞活性；g)降低之NK細胞活性；h)降低之嗜中性球活性；i)降低之巨噬細胞活性；及/或j)降低之紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量，如藉由顯微術所評價。在再一實施例中，一或多種藥劑降低了1型及/或M1巨噬細胞之數量，增加了2型及/或M2巨噬細胞之數量，及/或降低了i)對ii)之比率，其中i)係個體中之1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。在又一實施例中，在投與藥劑之後，個體中之細胞毒性CD8+ T細胞之數量及/或活性有所降低。在另一實施例中，下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係小分子抑制劑、CRISPR嚮導RNA (gRNA)、RNA干擾劑、反義寡核苷酸、肽或肽模擬物抑制劑、適配體、抗體、細胞內抗體或細胞。RNA干擾劑可包括或係(例如)小干擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)或piwi-相互作用RNA (piRNA)。在再一實施例中，下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑包括特異性結合至表1及/或表2中所列示至少一種靶之抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段。在又一實施例中，抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段係駱駝科、鼠類、嵌合、人類化、人類、可檢測地標記的，包括效應結構域，包括Fc結構域，及/或係選自由以下組成之群：Fv、Fav、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及二價抗體片段。在另一實施例中，抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞毒性劑。在再一實施例中，細胞毒性劑係選自由以下組成之群：化學治療劑、生物藥劑、毒素及放射性同位素。在又一實施例中，上調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係編碼表1及/或表2中所列示一或多種靶之核酸分子或其片段、表1及/或表2中所列示一或多種靶之多肽或其片段、結合至表1及/或表2中所列示一或多種靶之活化抗體及/或細胞內抗體或結合至表1及/或表2中所列示一或多種靶之小分子。在另一實施例中，巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中細胞及/或巨噬細胞表現靶。在再一實施例中，藉由全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與藥劑來在活體內投與一或多種藥劑。在又一實施例中，一或多種藥劑在組織微環境中接觸單核球及/或巨噬細胞。在另一實施例中，該方法進一步包括使單核球及/或巨噬細胞與至少一種調節發炎表型之免疫治療劑接觸，視情況其中免疫治療劑包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。
在另一態樣中，提供增加個體之發炎之方法，其包括向個體投與有效量之a)與至少一種下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸的單核球及/或巨噬細胞；及/或b)與至少一種上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸的單核球及/或巨噬細胞。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中細胞及/或巨噬細胞表現靶。在另一實施例中，相對於個體之單核球及/或巨噬細胞，單核球及/或巨噬細胞係基因改造、自體、同基因或同種異體的。在再一實施例中，與a)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞不同於與b)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞。在又一實施例中，與a)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞與同b)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞相同。在另一實施例中，全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與一或多種藥劑。
在再一態樣中，提供降低個體之發炎之方法，其包括向個體投與有效量之a)與至少一種上調表1中所列示至少一種靶接觸之拷貝數、量及/或活性之藥劑的單核球及/或巨噬細胞；及/或b)與至少一種下調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸的單核球及/或巨噬細胞。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中細胞及/或巨噬細胞表現靶。在另一實施例中，相對於個體之單核球及/或巨噬細胞，單核球及/或巨噬細胞係基因改造、自體、同基因或同種異體的。在再一實施例中，與a)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞不同於與b)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞。在又一實施例中，與a)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞與同b)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞相同。在另一實施例中，全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與一或多種藥劑。
在又一態樣中，提供使個體中之癌細胞對細胞毒性CD8+ T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之方法，其包括向個體投與治療有效量之a)至少一種下調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑；及/或b)至少一種上調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，該方法進一步包括投與至少一種下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。在另一實施例中，該藥劑係小分子抑制劑、CRISPR嚮導RNA (gRNA)、RNA干擾劑、反義寡核苷酸、肽或肽模擬物抑制劑、適配體、抗體、細胞內抗體或細胞。RNA干擾劑可包括或係(例如)小干擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)或piwi-相互作用RNA (piRNA)。在再一實施例中，藥劑包括特異性結合至表1中所列示至少一種靶之抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段。在又一實施例中，抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段係駱駝科、鼠類、嵌合、人類化、人類、可檢測地標記的，包括效應結構域，包括Fc結構域，及/或係選自由以下組成之群：Fv、Fav、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及二價抗體片段。
在另一實施例中，抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞毒性劑。在再一實施例中，細胞毒性劑係選自由以下組成之群：化學治療劑、生物藥劑、毒素及放射性同位素。在又一實施例中，該方法進一步包括投與至少一種上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。在另一實施例中，該藥劑係編碼表2中所列示一或多種靶之核酸分子或其片段、表2中所列示一或多種靶之多肽或其片段、結合至表2中所列示一或多種靶之活化抗體及/或細胞內抗體或結合至表2中所列示一或多種靶之小分子。
在另一態樣中，提供使患有癌症之個體中之癌細胞對細胞毒性CD8+ T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之方法，其包括向個體投與治療有效量之a)與至少一種下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸之單核球細胞及/或巨噬細胞；及/或b)與至少一種上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸之單核球細胞及/或巨噬細胞。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中細胞及/或巨噬細胞表現靶。在另一實施例中，相對於個體之單核球及/或巨噬細胞，單核球及/或巨噬細胞係基因改造、自體、同基因或同種異體的。在再一實施例中，與a)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞不同於與b)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞。在又一實施例中，與a)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞與同b)之至少一種藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞相同。在另一實施例中，全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與一或多種藥劑。在再一實施例中，該方法進一步包括藉由向個體投與至少一種免疫療法來治療個體之癌症，視情況其中免疫療法包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。在又一實施例中，免疫檢查點係選自由以下組成之群：PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4。在另一實施例中，免疫檢查點係PD-1。在再一實施例中，一或多種藥劑減小了癌症中之增殖性細胞之數量及/或減小了包括癌細胞之腫瘤之體積或大小。在又一實施例中，一或多種藥劑增加了浸潤包括癌細胞之腫瘤之CD8+ T細胞之量及/或活性。在再一實施例中，一或多種藥劑a)增加了浸潤包括癌細胞之腫瘤之M1巨噬細胞之量及/或活性，及/或b)降低了浸潤包括癌細胞之腫瘤之M2巨噬細胞之量及/或活性。在又一實施例中，該方法進一步包括向個體投與至少一種用於治療癌症之其他療法或方案。在另一實施例中，在藥劑之前、同時或之後投與該療法。
在再一態樣中，提供鑑別可藉由調節至少一種靶來增加其發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括：a)測定來自單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；b)測定對照中之至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；及c)比較步驟a)及b)中所檢測之至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；其中相對於至少一種靶之對照拷貝數、量及/或活性，單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低指示，單核球及/或巨噬細胞可藉由調節至少一種靶來增加其發炎表型。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，該方法進一步包括使細胞與調節表1及/或表2中所列示至少一種靶之藥劑接觸、推薦、開出或投與該藥劑。在另一實施例中，若測得個體未受益於藉由調節一或多種靶來增加發炎表型，則該方法進一步包括使細胞與除調節表1及/或表2中所列示一或多種靶之藥劑外之癌症療法接觸、推薦、開出或投與該癌症療法。在再一實施例中，該方法進一步包括使細胞與至少一種增加免疫反應之其他藥劑接觸及/或投與該其他藥劑。在又一實施例中，其他藥劑係選自由以下組成之群：靶向療法、化學療法、輻射療法及/或激素療法。在另一實施例中，對照係來自個體所屬相同物種之成員。在再一實施例中，對照係包括細胞之試樣。在又一實施例中，個體患有癌症。在另一實施例中，對照係來自個體之癌症試樣。在再一實施例中，對照係來自個體之非癌試樣。
在又一態樣中，提供鑑別可藉由調節至少一種靶來降低其發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括：a)測定來自單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；b)測定對照中之至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；及c)比較步驟a)及b)中所檢測之至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；其中相對於至少一種靶之對照拷貝數、量及/或活性，單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加指示，單核球及/或巨噬細胞可藉由調節至少一種靶來降低其發炎表型。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，該方法進一步包括使單核球及/或巨噬細胞與一或多種調節表1及/或表2中所列示一或多種靶之藥劑接觸、推薦、開出或投與該(等)藥劑。在另一實施例中，若測得個體未受益於藉由調節至少一種靶來降低發炎表型，則該方法進一步包括使單核球及/或巨噬細胞與除一或多種調節表1及/或表2中所列示一或多種靶之藥劑外之癌症療法接觸、推薦、開出或投與該癌症療法。在再一實施例中，該方法進一步包括使單核球及/或巨噬細胞與至少一種降低免疫反應之其他藥劑接觸及/或投與該其他藥劑。在又一實施例中，對照係來自個體所屬相同物種之成員。在另一實施例中，對照係包括細胞之試樣。在再一實施例中，個體患有癌症。在另一實施例中，對照係來自個體之癌症試樣。在再一實施例中，對照係來自個體之非癌試樣。
在另一態樣中，提供預測患有癌症之個體之臨床結果之方法，該方法包括：a)測定來自個體單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；b)測定來自具有較差臨床結果之對照之至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；及c)比較個體試樣及對照個體試樣中之至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；其中與對照中之拷貝數、量及/或活性相比，個體單核球及/或巨噬細胞中之表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低指示，個體不具有較差臨床結果。
在再一態樣中，提供監測個體中之單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之方法，該方法包括：a)檢測第一個體試樣中在第一時間點來自個體單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；b)使用包括在後續時間點獲得之單核球及/或巨噬細胞之後續試樣重複步驟a)；及c)比較步驟a)及b)中所檢測之表1及/或表2中所列示至少一種靶之量或活性，其中與來自第一試樣之單核球及/或巨噬細胞之拷貝數、量及/或活性相比，來自後續試樣之單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加指示，個體之單核球及/或巨噬細胞具有上調之發炎表型；或其中與來自第一試樣之單核球及/或巨噬細胞之拷貝數、量及/或活性相比，來自後續試樣之單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低指示，個體之單核球及/或巨噬細胞具有下調之發炎表型。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，第一試樣及/或至少一種後續試樣包括在活體外培養之單核球及/或巨噬細胞。在另一實施例中，第一試樣及/或至少一種後續試樣包括未在活體外培養之單核球及/或巨噬細胞。在再一實施例中，第一試樣及/或至少一種後續試樣係自個體獲得之單一試樣或合併試樣之一部分。在又一實施例中，試樣包括自個體獲得之血液、血清、腫瘤周圍組織及/或腫瘤內組織。
在又一態樣中，提供評價藥劑增加個體中之單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之效能的方法，其包括：a)在第一時間點檢測包括單核球及/或巨噬細胞之個體試樣中之i)單核球及/或巨噬細胞中或其上表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)單核球及/或巨噬細胞的發炎表型；b)在單核球及/或巨噬細胞與藥劑接觸之後之至少一個後續時間點期間重複步驟a)；及c)比較步驟a)及b)中所檢測之i)及/或ii)之值，其中與在第一時間點試樣中之拷貝數、量及/或活性相比，後續試樣中表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或ii)的增加指示，該藥劑增加了個體中之單核球及/或巨噬細胞之發炎表型。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，與藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且藥劑增加了細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量。在另一實施例中，與藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且藥劑降低了細胞群體中之2型及/或M2巨噬細胞之數量。
在另一態樣中，提供評價藥劑降低單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之效能之方法，其包括：a)在第一時間點檢測包括單核球及/或巨噬細胞之個體試樣中之i)單核球及/或巨噬細胞中或其上表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)單核球及/或巨噬細胞的發炎表型；b)在單核球及/或巨噬細胞與藥劑接觸之後之至少一個後續時間點期間重複步驟a)；及c)比較步驟a)及b)中所檢測之i)及/或ii)之值，其中與在第一時間點試樣中之拷貝數、量及/或活性相比，後續試樣中表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或ii)的降低指示，該藥劑降低了個體中之單核球及/或巨噬細胞之發炎表型。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，與藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且藥劑選擇性降低細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量。在另一實施例中，與藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且藥劑選擇性增加細胞群體中之2型及/或M2巨噬細胞之數量。在再一實施例中，在活體外或離體接觸單核球及/或巨噬細胞。在又一實施例中，單核球及/或巨噬細胞係原代單核球及/或原代巨噬細胞。在另一實施例中，在與藥劑接觸之前純化及/或培養單核球及/或巨噬細胞。在再一實施例中，在活體內接觸單核球及/或巨噬細胞。在又一實施例中，藉由全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與藥劑來在活體內接觸單核球及/或巨噬細胞。在另一實施例中，在組織微環境中接觸單核球及/或巨噬細胞。在再一實施例中，本文所闡述之方法進一步包括使單核球及/或巨噬細胞與至少一種調節發炎表型之免疫治療劑接觸，視情況其中免疫治療劑包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。在又一實施例中，個體係哺乳動物。在另一實施例中，哺乳動物係非人類動物模型或人類。
在再一態樣中，提供評價藥劑治療個體之癌症之效能之方法，其包括：a)在第一時間點檢測包括單核球及/或巨噬細胞之個體試樣中之i)單核球及/或巨噬細胞中或其上表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)單核球及/或巨噬細胞的發炎表型；b)在投與藥劑之後之至少一個後續時間點期間重複步驟a)；及c)比較步驟a)及b)中所檢測之i)及/或ii)之值，其中與在第一時間點個體試樣之單核球及/或巨噬細胞中或其上之拷貝數、量及/或活性相比，在後續時間點個體試樣之單核球及/或巨噬細胞中或其上表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或ii)的增加指示，該藥劑治療個體之癌症。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，在第一時間點與後續時間點之間，個體已經受癌症治療、完成治療及/或有所緩解。在另一實施例中，第一試樣及/或至少一種後續試樣係選自由離體及活體內試樣組成之群。在再一實施例中，第一試樣及/或至少一種後續試樣係自非人類動物癌症模型所獲得。
在又一實施例中，第一試樣及/或至少一種後續試樣係自個體獲得之單一試樣或合併試樣之一部分。在另一實施例中，試樣包括自個體獲得之細胞、血清、腫瘤周圍組織及/或腫瘤內組織。
在又一態樣中，提供篩選使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑之方法，其包括a)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在單核球及/或巨噬細胞存在下接觸，該等單核球及/或巨噬細胞與i)至少一種降低表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑及/或ii)至少一種增加表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸；b)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在對照單核球及/或巨噬細胞存在下接觸，該等對照單核球及/或巨噬細胞不與至少一種藥劑或多種藥劑接觸；及c)藉由鑑別與b)相比增加a)中之細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法效能之藥劑來鑑別使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感的藥劑。
在另一態樣中，提供篩選使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑之方法，其包括a)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在單核球及/或巨噬細胞存在下接觸，該等單核球及/或巨噬細胞經改造以降低表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)經改造以增加表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；b)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在對照單核球及/或巨噬細胞存在下接觸；及c)藉由鑑別與b)相比增加a)中之細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法效能之藥劑來鑑別使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑。
如上文所闡述，另外提供諸多可應用於本發明之任一態樣及/或與本文所闡述之任一其他實施例組合之實施例。舉例而言，在一實施例中，在活體內、離體或在活體外發生接觸步驟。 在另一實施例中，該方法進一步包括測定i)癌症中之增殖性細胞數量之減小及/或ii)包括癌細胞之腫瘤之體積或大小的減小。在再一實施例中，該方法進一步包括測定i)增加之CD8+ T細胞數量及/或ii)增加之浸潤包括癌細胞之腫瘤之1型及/或M1巨噬細胞之數量。在又一實施例中，該方法進一步包括測定對調節表1及/或表2中所列示至少一種靶之藥劑之反應性，該反應性係藉由至少一種選自由以下組成之群之準則所量測：臨床受益率、至死存活直至死亡、病理完全反應、病理反應之半定量量測、臨床完全緩解、臨床部分緩解、臨床穩定疾病、無復發存活、無轉移存活、無疾病存活、循環腫瘤細胞降低、循環標記物反應及RECIST準則。在另一實施例中，該方法進一步包括使癌細胞與至少一種其他癌症治療劑或方案接觸。在再一實施例中，一或多種藥劑進一步包括脂質或類脂質。在又一實施例中，類脂質具有式(VI)：
Figure 02_image001
其中：p係介於1與3之間之整數(包含端值)；m係介於1與3之間之整數(包含端值)；RA 係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image003
或
Figure 02_image005
RF 係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image007
或
Figure 02_image009
；
R5 在每次出現時獨立地係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；或經取代或未經取代之雜芳基； 其中RA 、RF 、RY 及RZ 中之至少一者係
Figure 02_image011
或
Figure 02_image013
；
x在每次出現時係介於1與10之間之整數(包含端值)；y在每次出現時係介於1與10之間之整數(包含端值)；RY 在每次出現時係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image015
或
Figure 02_image017
；RZ 在每次出現時係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image019
或
Figure 02_image021
；或其醫藥上可接受之鹽。在另一實施例中，p為1。在再一實施例中，m為1。在又一實施例中，p及m中之每一者為1。在又一實施例中，RF 係
Figure 02_image023
。在另一實施例中，RA 係
Figure 02_image025
。在再一實施例中，式(VI)化合物具有下式：
Figure 02_image027
(C12-200)；或其鹽。在又一實施例中，組合物係呈脂質奈米顆粒形式。在另一實施例中，脂質奈米顆粒包括約1.0莫耳%至約60.0莫耳%之C12-200。在再一實施例中，脂質奈米顆粒進一步包括一或多種共脂質。在又一實施例中，每一共脂質係選自二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、膽固醇及DMG-PEG。在另一實施例中，DSPC之濃度為約1.0莫耳%至約20.0莫耳%。在再一實施例中，膽固醇之濃度為約10.0莫耳%至約50.0莫耳%。在又一實施例中，DMG-PEG之濃度為約0.1莫耳%至約5.0莫耳%。在另一實施例中，DSPC係以約1.0莫耳%至約20.0莫耳%之濃度存在；膽固醇係以約10.0莫耳%至約50.0莫耳%之濃度存在；且DMG-PEG係以約0.1莫耳%至約5.0莫耳%之濃度存在。在再一實施例中，藥劑係呈醫藥上可接受之調配物之形式。在又一實施例中，具有經調節發炎表型之單核球及/或巨噬細胞展現下列性質中之一或多者：a)分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之經調節表現；b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之經調節表現；c)至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之經調節分泌；d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之經調節比率；e)經調節CD8+細胞毒性T細胞活化；f)經調節CD4+輔助性T細胞活性；g)經調節NK細胞活性；h)經調節嗜中性球活性；i)經調節巨噬細胞活性；及/或j)經調節紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量，如藉由顯微術所評價。在另一實施例中，細胞及/或巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中細胞及/或巨噬細胞表現或經測定表現至少一種選自由表1及/或表2中所列示靶組成之群之靶。在再一實施例中，表1中所列示之至少一種靶係選自由以下組成之群：人類SIGLEC9、VSIG4、CD74、CD207、LRRC25、SELPLG、AIF1、CD84、IGSF6、CD48、CD33、LST1、TNFAIP8L2 (TIPE2)、SPI1 (PU.1)、LILRB2、CCR5、EVI2B、CLEC7A、TBXAS1、SIGLEC7及DOCK2或其片段。在又一實施例中，表2中所列示之至少一種靶係選自由以下組成之群：人類CD53、FERMT3、CD37、CXorf21、CD48及CD84或其片段。在另一實施例中，癌症係經巨噬細胞浸潤之實體腫瘤，其中浸潤性巨噬細胞佔腫瘤或腫瘤微環境中之細胞之質量、體積及/或數量之至少約5%，且/或其中癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、腎透明細胞癌、神經膠母細胞瘤、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、胰臟腺癌、乳房侵襲性癌、急性骨髓樣白血病、腎上腺皮質癌、膀胱尿路上皮癌、腦低惡性神經膠質瘤、乳房侵襲性癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌、膽管癌、結腸腺癌、食管癌、多形性神經膠母細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、腎難染細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肝細胞癌、淋巴樣贅瘤瀰漫性大B細胞淋巴瘤、間皮瘤、卵巢漿液性囊腺癌、嗜鉻細胞瘤、副神經節瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、肉瘤、皮膚黑色素瘤、胃腺癌、睪丸生殖細胞腫瘤、胸腺瘤、甲狀腺癌、子宮癌肉瘤、子宮體內膜癌及葡萄膜黑色素瘤。在再一實施例中，巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中巨噬細胞係TAM及/或M2巨噬細胞。在又一實施例中，巨噬細胞表現或經測定表現一或多種選自由表1及/或表2中所列示靶組成之群之靶。在另一實施例中，表1中所列示之至少一種靶係選自由以下組成之群：人類SIGLEC9、VSIG4、CD74、CD207、LRRC25、SELPLG、AIF1、CD84、IGSF6、CD48、CD33、LST1、TNFAIP8L2 (TIPE2)、SPI1 (PU.1)、LILRB2、CCR5、EVI2B、CLEC7A、TBXAS1、SIGLEC7及DOCK2或其片段。在再一實施例中，表2中所列示之至少一種靶係選自由以下組成之群：人類CD53、FERMT3、CD37、CXorf21、CD48及CD84或其片段。在又一實施例中，單核球及/或巨噬細胞係原代單核球及/或原代巨噬細胞。在另一實施例中，單核球及/或巨噬細胞包括於組織微環境內。在再一實施例中，單核球及/或巨噬細胞包括於人類腫瘤模型或動物癌症模型內。在又一實施例中，個體係哺乳動物。在另一實施例中，哺乳動物係人類。在再一實施例中，人類患有癌症。
在本文中測得，某些靶調控單核球及/或巨噬細胞之發炎表型、極化、活化及/或功能。因此，本發明部分地係關於調節本文所闡述之一或多種生物標記物(例如表1、表2、實例等中所列示之靶)之拷貝數、量及/或活性之方法及該等生物標記物及/或調節劑用於治療、診斷、預後及篩選目的之用途，如下文進一步所闡述。
I. 定義 在一些實施例中，術語「約」涵蓋在所量測值之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% (包含該等值)或任一中間範圍(例如±2%-6%)內之值。在一些實施例中，術語「約」係指方法、分析或量測值之固有誤差變化，例如存在於實驗中之變化。
術語「活化受體」包含結合抗原、複合抗原(例如在主要組織相容性複合物(MHC)多肽之背景中)或結合至抗體之免疫細胞受體。該等活化受體包含T細胞受體(TCR)、B細胞受體(BCR)、細胞介素受體、LPS受體、補體受體、Fc受體及其他含ITAM受體。舉例而言，T細胞受體存在於T細胞上且與CD3多肽締合。T細胞受體係由MHC多肽背景中之抗原(以及由多株T細胞活化試劑)刺激。經由TCR活化T細胞會產生諸多變化，例如蛋白質磷酸化、膜脂質變化、離子通量、環狀核苷酸改變、RNA轉錄變化、蛋白質合成變化及細胞體積變化。類似於T細胞，經由活化受體(例如細胞介素受體或模式相關分子模式(PAMP)受體)活化巨噬細胞會產生諸如以下等變化：蛋白質磷酸化、表面受體表型改變、蛋白質合成及釋放以及形態變化。
術語「投與」係關於將藥劑實際性物理引入所關注生物靶(例如宿主及/或個體)中或其上(在適當時)。可在活體外或在活體內將組合物投與細胞中(例如「接觸」)。可在活體內經由適當投與途徑將組合物投與個體。本發明涵蓋將組合物引入宿主中之任一及所有方法。該方法並不依賴於任一特定引入方式且不應如此解釋。引入方式已為熟習此項技術者所熟知，且亦例示於本文中。該術語包含容許藥劑實施其預期功能之投與途徑。可用於治療身體之投與途徑之實例包含注射(皮下、靜脈內、非經腸、經腹膜腔內、鞘內等)、口服、吸入及經皮途徑。注射可為濃注或可為連續輸注。端視投與途徑，藥劑可經所選材料塗覆或佈置於其中以保護其免受可有害地影響其實施其預期功能之能力之天然條件影響。可單獨或聯合醫藥上可接受之載劑來投與藥劑。藥劑亦可作為前藥來投與，前藥在活體內轉化成其活性形式。
術語「藥劑」係指之化合物、超分子複合物、材料及/或其組合或混合物。化合物(例如分子)可由化學式、化學結構或序列代表。藥劑之代表性非限制性實例包含(例如)小分子、多肽、蛋白質、多核苷酸(例如RNAi藥劑、siRNA、miRNA、piRNA、mRNA、反義多核苷酸、適配體及諸如此類)、脂質及多醣。一般而言，可使用業內已知之任一適宜方法來獲得藥劑。在一些實施例中，藥劑可為用於治療個體(例如人類)之疾病或病症(例如癌症)之「治療劑」。
術語「激動劑」係指結合至靶(例如受體)且活化或增加靶之生物活性之藥劑。舉例而言，「激動劑」抗體係活化或增加其所結合抗原之生物活性之抗體。
術語「改變量」或「改變程度」涵蓋與對照試樣中之拷貝數或表現程度相比生物標記物核酸之增加或降低之拷貝數(例如種系及/或體細胞)或所關注試樣中之增加或降低之表現程度。術語生物標記物之「改變量」亦包含與正常對照試樣中之相應蛋白質含量相比試樣(例如癌症試樣)中生物標記物蛋白之增加或降低之蛋白質含量。另外，可藉由檢測可影響生物標記物蛋白之表現或活性之轉譯後修飾(例如標記物之甲基化狀態)來測定生物標記物蛋白之改變量。在一些實施例中，「改變量」係指生物標記物之存在或不存在，此乃因參考基線可分別為生物標記物之不存在或存在。可根據用於量測生物標記物之給定分析之敏感性之臨限值來測定生物標記物的不存在或存在。
若生物標記物之量分別大於或小於正常含量大於用於評價量之分析之標準誤差的量及較佳地大於或小於該量至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、350%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%，則個體中之生物標記物之量「顯著」高於或低於生物標記物之正常量。或者，若個體中之生物標記物之量分別高於或低於生物標記物之正常量至少約兩倍及較佳地至少約三倍、四倍或五倍，則該量可視為「顯著」高於或低於正常量。該「顯著性」亦可適用於本文所闡述之任一其他量測參數，例如表現、抑制、細胞毒性、細胞生長及諸如此類。
術語生物標記物之「改變之表現程度」係指測試試樣(例如衍生自患有癌症之患者之試樣)中生物標記物之表現程度或拷貝數大於或小於用於評價表現或拷貝數之分析的標準誤差且較佳地至少兩倍及更佳地三倍、四倍、五倍或十倍或更大倍數於對照試樣(例如來自未患有相關疾病之健康個體之試樣)中之生物標記物之表現程度或拷貝數及較佳地若干對照試樣中之生物標記物的平均表現程度或拷貝數。在一些實施例中，生物標記物之含量係指生物標記物本身之含量、經修飾生物標記物(例如磷酸化生物標記物)之含量或生物標記物相對於另一量測變量(例如對照)之含量(例如相對於未磷酸化生物標記物之磷酸化生物標記物)。術語「表現」涵蓋核酸(例如DNA)經轉錄以產生RNA之過程，且亦可係指處理RNA轉錄物且轉譯成多肽之過程。核酸及其多肽對應體(若存在)之表現總和有助於生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之量。
術語生物標記物之「改變之活性」係指與正常對照試樣中生物標記物之活性相比，疾病狀態(例如在癌症試樣中)或經處理狀態中之生物標記物之活性有所增加或降低。生物標記物之改變之活性可源自(例如)改變之生物標記物表現、改變之生物標記物蛋白含量、改變之生物標記物結構或(例如)改變之與其他與生物標記物涉及相同或不同路徑之蛋白質之相互作用或改變之與轉錄活化劑或抑制劑之相互作用。
術語生物標記物之「改變之結構」係指與正常或野生型基因或蛋白質相比在生物標記物核酸或蛋白質內存在突變或等位基因變體，例如影響生物標記物核酸或蛋白質之表現或活性之突變。舉例而言，突變包含(但不限於)取代突變、缺失突變或添加突變。突變可存在於生物標記物核酸之編碼區或非編碼區中。
術語生物標記物之「改變之亞細胞局部化」係指相對於細胞內(例如健康及/或野生型細胞內)之正常局部化生物標記物錯位局部化於細胞內。可經由分析由生物標記物多肽所含有之業內已知之亞細胞局部化基序來測定標記物正常局部化之指示。
術語「拮抗劑」或「阻斷劑」係指結合至靶(例如受體)且抑制或減小靶之生物活性之藥劑。舉例而言，「拮抗劑」抗體係顯著抑制或減小其所結合抗原之生物活性之抗體。
除非在本文內另外指定，否則術語「抗體(antibody及antibodies)」廣泛涵蓋天然形式之抗體(例如IgG、IgA、IgM、IgE)及重組抗體(例如單鏈抗體、嵌合及人類化抗體以及多特異性抗體)以及所有前述抗體之片段、融合蛋白及衍生物，該等片段及衍生物具有至少一個抗原性結合位點。抗體衍生物可包括與抗體偶聯之蛋白質或化學部分。
另外，「細胞內抗體」係一類具有抗體特性之熟知抗原結合分子，但其能夠表現於細胞內以結合及/或抑制所關注細胞內靶(Chen等人(1994)Human Gene Ther. 5:595-601)。改變抗體以靶向(例如抑制)細胞內部分之方法在業內已眾所周知，例如使用單鏈抗體(scFv)、修飾免疫球蛋白VL結構域以達成超穩定性、修飾抗體以抵抗還原性細胞內環境、生成增加細胞內穩定性及/或調節細胞內局部化之融合蛋白及諸如此類。細胞內抗體亦可引入及表現於多細胞生物體之一或多個細胞、組織或器官中以(例如)達成預防及/或治療目的(例如作為基因療法) (至少參見PCT公開案第WO 08/020079號、第WO 94/02610號、第WO 95/22618號及第WO 03/014960號；美國專利第7,004,940號；Cattaneo及Biocca (1997)Intracellular Antibodies: Development and Applications (Landes and Springer-Verlag publs.)；Kontermann (2004)Methods 34:163-170；Cohen等人(1998)Oncogene 17:2445-2456；Auf der Maur等人(2001)FEBS Lett. 508:407-412；Shaki-Loewenstein等人(2005)J. Immunol. Meth. 303:19-39)。
術語「生物標記物」係指作為用於調節一或多種所關注表型(例如單核球及/或巨噬細胞中之所關注表型)之靶之基因或基因產物。在此上下文中，術語「生物標記物」與「靶」同義。在一些實施例中，然而，該術語進一步涵蓋經測定以指示所關注輸出(例如一或多種診斷、預後及/或治療輸出(例如用於調節發炎表型、癌症狀態及諸如此類))之可量測靶實體。生物標記物可包含(但不限於)核酸(例如基因體核酸及/或經轉錄核酸)及蛋白質、尤其表1及表2中所列示者。在一實施例中，該等靶係表1中所展示發炎表型、免疫反應及/或T細胞介導之細胞毒性之負性調控劑及/或表2中所展示發炎表型、免疫反應及/或T細胞介導之細胞毒性之正性調控劑。
術語「癌症」或「腫瘤」或「過度增殖性」係指存在擁有致癌細胞典型特性(例如不受控增殖、不死性、侵襲性或轉移性潛力、快速生長及某些特徵性形態特徵)之細胞。在一些實施例中，該等細胞展現部分地或完全由免疫檢查點蛋白(例如PD-1、PD-L1、PD-L2及/或CTLA-4)之表現及活性所致之該等特性。
癌細胞通常呈腫瘤形式，但該等細胞可單獨存在於動物內，或可為非致瘤癌細胞(例如白血病細胞)。如本文中所使用，術語「癌症」包含惡變前癌症以及惡性癌症。癌症包含(但不限於)各種癌症/癌瘤，包含膀胱癌(包含加速膀胱癌及轉移性膀胱癌)、乳癌、結腸癌(包含結腸直腸癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包含小細胞及非小細胞肺癌及肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系統癌、直腸癌、喉癌、胰臟癌(包含外分泌胰臟癌)、食管癌、胃癌、膽囊癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌(包含鱗狀細胞癌)；淋巴樣譜系之造血性腫瘤，包含白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、何傑金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、毛細胞淋巴瘤、組織細胞性淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓樣譜系之造血性腫瘤，包含急性及慢性骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群、骨髓樣白血病及前髓細胞性白血病；中心及周邊神經系統之腫瘤，包含星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；間質源腫瘤，包含纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；其他腫瘤，包含黑色素瘤、著色性乾皮症、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡性癌症及畸形癌；黑色素瘤、不可切除性階段III或IV惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、胃腸道癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、多形性神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌及頭頸癌、胃癌、生殖細胞腫瘤、骨癌、骨腫瘤、成人骨惡性纖維性組織細胞瘤；兒童期骨惡性纖維性組織細胞瘤、肉瘤、兒科肉瘤、鼻竇天然殺手腫瘤、贅瘤、漿細胞贅瘤；骨髓發育不良症候群；神經母細胞瘤；睪丸生殖細胞腫瘤、眼內黑色素瘤、骨髓發育不良症候群；骨髓發育不良/骨髓增殖性疾病、滑膜肉瘤、慢性骨髓樣白血病、急性淋巴母細胞性白血病、費城染色體(Philadelphia chromosome)陽性急性淋巴母細胞性白血病(Ph+ ALL)、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、肥大細胞增多症及與肥大細胞增多症有關之任一症狀及其任一轉移。另外，病症包含色素性蕁麻疹、肥大細胞增多症(例如瀰漫性皮膚肥大細胞增多症、人類孤立性肥大細胞瘤以及狗肥大細胞瘤及一些稀有亞型(如大皰性肥大細胞增多症、紅皮性肥大細胞增多症及毛細管擴張性肥大細胞增多症))、伴有相關血液學病症(例如骨髓增殖性或骨髓發育不良症候群或急性白血病)之肥大細胞增多症、與肥大細胞增多症有關之骨髓增殖性病症、肥大細胞白血病以及其他癌症。其他癌症亦包含於病症範圍內，包含(但不限於)下列癌症：癌瘤，包含膀胱癌、尿路上皮癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、尤其睪丸精原細胞瘤及皮膚癌(包含鱗狀細胞癌)；胃腸道基質腫瘤(「GIST」)；淋巴樣譜系之造血性腫瘤，包含白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、何傑金氏淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤；骨髓樣譜系之造血性腫瘤，包含急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞性白血病；間質源腫瘤，包含纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包含黑色素瘤、精原細胞瘤、畸形癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中心及周邊神經系統之腫瘤，包含星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；間質源腫瘤，包含纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包含黑色素瘤、著色性乾皮症、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡性癌症、畸形癌、化學療法難治性非精原性生殖細胞腫瘤及卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)及其任一轉移。適用於本發明所涵蓋方法之癌症類型之其他非限制性實例包含人類肉瘤及癌瘤，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤恩氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、骨癌、腦腫瘤、肺癌(包含肺腺癌)、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤；白血病，例如急性淋巴球性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅白血病)；慢性白血病(慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴球性白血病)；及真性多血症、淋巴瘤(何傑金氏病(Hodgkin's disease)及非何傑金氏病(non-Hodgkin's disease))、多發性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)及重鏈病。在一些實施例中，癌症係上皮性且包含(但不限於)膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦科癌、腎癌、喉癌、肺癌、口腔癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌或皮膚癌。在一些實施例中，上皮癌係非小細胞肺癌、非乳頭狀腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌(例如漿液性卵巢癌)或乳癌。可以各種其他方式來表徵上皮癌，包含(但不限於)漿液性、子宮內膜樣、黏液性、透明細胞性、布倫納氏(Brenner)或未分化性。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：(晚期)非小細胞肺癌、黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌、(晚期)尿道上皮膀胱癌、(晚期)腎癌(RCC)、高微衛星不穩定性癌症、經典何傑金氏淋巴瘤、(晚期)胃癌、(晚期)子宮頸癌、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、(晚期)肝細胞癌及(晚期)默克爾細胞(Merkel cell)癌。
術語「編碼區」係指核苷酸序列中包括轉譯成胺基酸殘基之密碼子之區域，而術語「非編碼區」係指核苷酸序列中未轉譯成胺基酸之區域(例如5'及3'未轉譯區域)。
術語「互補」係指兩個核酸股之區域之間或同一核酸股之兩個區域之間之序列互補性的廣義概念。眾所周知，若與第一區域反向平行之第二核酸區域中之殘基係胸腺嘧啶或尿嘧啶，則第一核酸區域之腺嘌呤殘基能夠與第二核酸區域中之該殘基形成特定氫鍵(「鹼基配對」)。類似地已知，若與第一股反向平行之第二核酸股中之殘基係鳥嘌呤，則第一核酸股之胞嘧啶殘基能夠與第二核酸股中之該殘基鹼基配對。若在核酸之第一區域與相同或不同核酸之第二區域以反向平行方式排列時，第一區域之至少一個核苷酸殘基能夠與第二區域之殘基鹼基配對，則該兩個區域互補。較佳地，第一區域包括第一部分且第二區域包括第二部分，其中，在第一部分及第二部分以反向平行方式配置時，第一部分中至少約50%及較佳地至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%或更多核苷酸殘基能夠與第二部分中之核苷酸殘基鹼基配對。更佳地，第一部分之所有核苷酸殘基能夠與第二部分中之核苷酸殘基鹼基配對。在一些實施例中，互補多核苷酸可為「充分互補」或可具有「充分互補性」，亦即互補性足以維持雙鏈體及/或具有期望活性。舉例而言，在RNAi藥劑之情形下，該互補性係藥劑與靶mRNA之間之互補性，其足以部分地或完全防止mRNA轉譯。舉例而言，具有「與靶mRNA序列充分互補以引導靶特異性RNA干擾(RNAi)之序列」之siRNA意指，siRNA具有足以觸發藉由RNAi機制或過程來破壞靶mRNA之序列。
術語「實質上互補」係指兩個核酸之間之鹼基配對、雙鏈區域且並非任一單鏈區域(例如兩個雙鏈區域之間之末端懸突或間隙區域)中之互補性。互補性未必係完全的；可存在任一數量之鹼基對失配。在一些實施例中，在兩個序列在本文中稱為「實質上互補」時，其意指該等序列彼此足夠互補在所選反應條件下雜交。因此，實質上互補之序列可係指在雙鏈區域中鹼基對互補性為至少100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%或更低或其間之任一數值之序列。
本文所用之術語「聯合療法」及「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑，例如表1中所列示一種以上靶之調節劑之組合、表2中所列示一種以上靶之調節劑之組合、表1中所列示至少一種靶之至少一種調節劑及表2中所列示至少一種靶之至少一種調節劑之組合、表1及/或表2中所列示至少一種靶之至少一種調節劑及另一治療劑(例如免疫檢查點療法及諸如此類)之組合及其組合。構成組合療法之不同藥劑可與投與另一者或其他者同時、在之前或在之後投與。組合療法意欲自該等治療劑之共同作用來提供有益(加和或協同)效應。該等治療劑之組合投與可在界定時間段(端視所選組合而定，通常數分鐘、數小時、數天或數週)內實施。在組合療法中，組合治療劑可以依序方式或藉由實質上同時施加來施加。
術語「對照」係指任一適於提供與測試試樣中之表現產物進行比較之參考標準物。在一實施例中，對照包括獲得檢測表現產物含量之「對照試樣」且與來自測試試樣之表現產物含量進行比較。此一對照試樣可包括任一適宜試樣，包含(但不限於)來自個體(例如具有單核球及/或巨噬細胞之個體及/或具有已知結果之對照癌症患者(可為儲存試樣或先前試樣量測))之試樣；自個體(例如正常患者或癌症患者)分離之正常組織或細胞、自個體(例如正常個體或癌症患者)分離之經培養原代細胞/組織、自癌症患者之相同器官或身體位置獲得之毗鄰正常細胞/組織、自正常個體分離之組織或細胞試樣或自儲藏室獲得之原代細胞/組織。在另一較佳實施例中，對照可包括來自任一適宜來源(包含(但不限於)管家基因)之參考標準表現產物含量，來自正常組織(或其他先前所分析對照試樣)之表現產物含量範圍、先前在來自具有某一結果(例如存活一、二、三、四年等)或接受某一治療(例如標準護理癌症療法)之患者群或患者組之測試試樣內所測定之表現產物含量範圍。熟習此項技術者應理解，該等對照試樣及參考標準表現產物含量可組合用作本發明所涵蓋方法中之對照。在一實施例中，對照可包括正常或非癌性細胞/組織試樣。在另一較佳實施例中，對照可包括患者組(例如癌症患者組或接受某一治療之癌症患者組或具有一種結果與另一結果之患者組)之表現程度。在前一情形下，可將每一患者之具體表現產物含量指派為表現程度百分位，或表示為高於或低於參考標準表現程度之平均值(mean或average)。在另一較佳實施例中，對照可包括正常細胞、來自經組合化學療法治療之患者之細胞及來自患有良性癌症之患者之細胞。在另一實施例中，對照亦可包括量測值，例如與某一群體中之管家基因之表現程度相比相同群體中之特定基因的平均表現程度。此一群體可包括正常個體、未經受任一治療(亦即未治療)之癌症患者、經受標準護理療法之癌症患者或患有良性癌症之患者。在另一較佳實施例中，對照包括表現產物含量之轉變比率，包含(但不限於)測定測試試樣中兩種基因之表現產物含量之比率且將其與參考標準物中之相同兩種基因的任一適宜比率進行比較；測定測試試樣中之兩種或更多種基因之表現產物含量且測定任一適宜對照中之表現產物含量的差；及測定測試試樣中之兩種或更多種基因之表現產物含量，將其表現正規化至測試試樣中之管家基因之表現，及與任任一適宜對照進行比較。在尤佳實施例中，對照包括與測試試樣係相同譜系及/或類型之對照試樣。在另一實施例中，對照可包括根據患者試樣(例如所有癌症患者)內或基於其之百分位分組之表現產物含量。在一實施例中，確立對照表現產物含量，其中使用相對於(例如)特定百分位之較高或較低表現產物含量作為預測結果之基礎。在另一較佳實施例中，使用來自具有已知結果之癌症對照患者之表現產物含量來確立對照表現產物含量，且將來自測試試樣之表現產物含量與作為預測結果之基礎之對照表現產物含量進行比較。本發明所涵蓋方法並不限於使用特定截止點來比較測試試樣與對照中之表現產物含量。
生物標記物核酸之「拷貝數」係指細胞(例如種系及/或體細胞)中編碼特定基因產物之DNA序列之數量。通常，對於給定基因而言，哺乳動物具有每一基因之兩個拷貝。然而，拷貝數可藉由基因擴增或複製來增加，或藉由缺失來減小。舉例而言，種系拷貝數變化包含一或多個基因座處之變化，其中該一或多個基因座並不計及對照中之種系拷貝之正常補體中之拷貝數(例如測定特定種系DNA及相應拷貝數之物種之相同物種之種系DNA中的正常拷貝數)。體細胞拷貝數變化包含一或多個基因座處之變化，其中該一或多個基因座並不計及對照之種系DNA中之拷貝數(例如測定體細胞DNA及相應拷貝數之個體之相同個體之種系DNA中的拷貝數)。
術語「細胞介素」係指由免疫系統之某些細胞分泌之物質且對其他細胞具有生物效應。細胞介素可為諸多不同物質，例如干擾素、介白素及生長因子。
術語「確定用於個體之適宜治療方案」意指，確定用於個體之基於或基本上基於或至少部分地基於本發明所涵蓋生物標記物調介之分析之結果來開始、修改及/或結束的治療方案(亦即用於預防及/或治療個體癌症之單一療法或不同療法之組合)。一實例係確定是否提供針對癌症之靶向療法，以提供使用本發明所涵蓋調節一或多種生物標記物之藥劑之療法。另一實例係在手術之後開始輔助療法，其目的在於降低復發風險。再一實例係修改特定化學療法之劑量。除本發明分析之結果外，該確定可基於擬治療個體之個人特性。在大部分情形下，由主治醫師或醫師來實際確定用於個體之適宜治療方案。
術語「無內毒素」或「實質上無內毒素」係指含有至多痕量(例如對個體無臨床不良生理學效應之量)內毒素及較佳地不可檢測量之內毒素之組合物、溶劑及/或器皿。內毒素係與某些細菌、通常性革蘭氏陰性(gram-negative)細菌有關之毒素，但內毒素可發現於性革蘭氏陽性(gram-positive bacteria)細菌(例如單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogene))中。最盛行內毒素係發現於各種性革蘭氏陰性細菌之外膜中之脂多醣(LPS)或脂寡醣(LOS)，其代表該等細菌引起疾病之能力中之主要病原性特徵。人類中之少量內毒素即可產生發熱、降低血壓以及激活發炎及凝血以及其他不良生理學效應。因此，在醫藥生產中，通常期望自藥品及/或藥物容器去除大部分或所有痕量內毒素，此乃因極小量即可在人類中引起不良效應。去熱原烘箱可用於此目的，此乃因通常需要超過300℃之溫度來分解大部分內毒素。舉例而言，基於主要包裝材料(例如注射器或小瓶)，250℃玻璃溫度及30分鐘保持時間之組合通常足以達成內毒素含量之3 log減小。涵蓋去除內毒素之其他方法，包含(例如)如本文所闡述及業內已知之層析及過濾方法。可使用業內已知之常規技術來檢測內毒素。舉例而言，鱟變形細胞溶解物分析(其利用來自鱟之血液)係用於檢測內毒素之存在之極敏感分析。在此測試中，極低含量之LPS即可引起鱟溶解物之可檢測凝血，此乃因存在擴大此反應之強力酶促級聯。亦可藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)來量化內毒素。為達成實質上無內毒素，內毒素含量可小於約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10 EU/ml或其間之任一範圍(包含端值，例如0.05 EU/ml至10 EU/ml)。通常，1 ng脂多醣(LPS)對應於約1-10 EU。
術語「表現印記」或「印記」係指一或多種指示所關注狀態之經表現生物標記物之群組。舉例而言，構成此印記之基因、蛋白質及諸如此類可表現於特定細胞譜系、分化階段或特定生物反應期間。生物標記物可反映表現其之腫瘤之生物態樣，例如細胞之發炎狀態、癌症之源細胞、生檢中之非惡性細胞性質及負責癌症之致癌機制。表現資料及基因表現程度可儲存於電腦可讀媒體(例如與微陣列或晶片讀取裝置聯合使用之電腦可讀媒體)上。可操縱該表現資料以生成表現印記。
術語「基因」涵蓋編碼具有一定功能之分子(例如RNA、蛋白質等)之核苷酸(例如DNA)序列。基因通常包括兩條互補核苷酸鏈(亦即dsDNA)，亦即編碼鏈及非編碼鏈。在提及DNA轉錄時，編碼鏈係鹼基序列對應於所產生RNA轉錄物之鹼基序列(但胸腺嘧啶由尿嘧啶代替)之DNA鏈。編碼鏈含有密碼子，而非編碼鏈含有反密碼子。在轉錄期間，RNA Pol II結合非編碼鏈，讀取反密碼子，且轉錄其序列以合成具有互補鹼基之RNA轉錄物。在一些實施例中，所列示基因序列(亦即DNA序列)係編碼鏈之序列。
術語「基因產物」 (亦在本文中稱為「基因表現產物」或「表現產物」)涵蓋基因表現之產物，例如自基因轉錄之核酸(例如mRNA)及源自該mRNA之轉譯之多肽或蛋白質。應瞭解，某些基因產物可(例如)在細胞中經受處理或修飾。舉例而言，可在轉譯之前剪接mRNA轉錄物，實施多聚腺苷酸化等，且/或多肽可經受共轉譯或轉譯後處理(例如去除分泌信號序列、去除細胞器靶向序列或諸如磷酸化、醣基化、甲基化、脂肪醯基化等修飾，等等)。術語「基因產物」涵蓋該等經處理或修飾形式。來自各種物種(包含人類)之基因體mRNA及多肽序列在業內已習知且可在可公開訪問之資料庫中獲得(例如可在國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) (ncbi.nih.gov)或通用蛋白質資源(Universal Protein Resource) (uniprot.org)處獲得者)。其他資料庫包含(例如) GenBank、RefSeq、Gene、UniProtKB/SwissProt、UniProtKB/Trembl及諸如此類。一般而言，可使用NCBI參考序列資料庫中之序列作為所關注基因之基因產物序列。應瞭解，某一基因之多個等位基因可存在於相同物種之個體中。某些蛋白質可(例如)因選擇式RNA剪接或編輯而存在多個同種型。一般而言，在本發明之態樣係關於基因或基因產物之情形下，除非另外指示，否則在適當時涵蓋涉及等位基因變體或同種型之實施例。某些實施例可係關於特定序列(例如特定等位基因或同種型)。
術語「生成」涵蓋達成期望結果之任一方式，例如藉由直接或間接作用。舉例而言，可藉由直接作用(例如藉由與至少一種調節本文所闡述一或多種生物標記物之藥劑接觸)及/或藉由間接作用(例如藉由繁殖具有期望物理、基因及/或表型屬性之細胞)來生成具有本文所闡述經調節表型之細胞。
關於細胞生物標記物表現之術語「高」、「低」、「中等」及「陰性」係指所表現生物標記物相對於生物標記物在一或多種參考細胞中之細胞表現之量。可根據本文所闡述之任一方法來測定生物標記物表現，包含(但不限於)細胞含量、活性、結構及諸如此類、一或多種生物標記物基因體核酸、核糖核酸及/或多肽之分析。在一實施例中，該術語係指分別以最高、中等或最低程度表現生物標記物之細胞群體之經定義百分比。該等百分比可定義為最高0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10%、11%、12%、13%、14%、15%或更多或其間之任一範圍(包含端值)之高度表現或較弱表現生物標記物之細胞群體。術語「低」不包含不可檢測地表現生物標記物之細胞，此乃因該等細胞對於生物標記物表現而言為「陰性」。術語「中等」包含表現生物標記物但表現程度低於「高」度表現其之群體之細胞。在另一實施例中，該術語亦可係指或替代地係指藉由定性或統計學圖區鑑別之生物標記物表現之細胞群體。舉例而言，可基於生物標記物表現程度藉由基於可檢測部分分析(例如基於平均螢光強度及諸如此類)根據業內熟知方法鑑別不同繪圖來區分使用流式細胞術分選之細胞群體。可根據數量、形狀、重疊及諸如此類基於業內用於所關注生物標記物之熟知方法來細化該等圖區。在再一實施例中，亦可根據其他生物標記物之表現之存在或不存在來測定該術語。
術語「實質上一致」係指核酸或胺基酸序列在(例如)使用下述方法最佳地比對時與第二核酸或胺基酸序列共有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。「實質性一致性」可用於係指各種類型及長度之序列，例如全長序列、功能結構域、編碼及/或調控序列、外顯子、內含子、啟動子及基因體序列。以業內所熟知之各種方式來測定兩個多肽或核酸序列之間之序列一致性百分比，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST程式(Basic Local Alignment Search Tool；(Altschul等人(1995)J. Mol. Biol. 215:403-410)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign (DNASTAR)軟體。另外，熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包含在所比較序列之長度範圍內達成最大比對所需之任何算法。應理解，出於測定序列一致性之目的，在比較DNA序列與RNA序列時，胸腺嘧啶核苷酸等效於尿嘧啶核苷酸。保守取代通常包含下列基團內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天門冬胺酸、麩胺酸；天門冬醯胺、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。
術語「免疫細胞」係指能夠直接或間接參與免疫反應之細胞。免疫細胞包含(但不限於) T細胞、B細胞、抗原呈遞細胞、樹突狀細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NK)細胞、淋巴因子活化之殺手(LAK)細胞、單核球、巨噬細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、顆粒球、肥大細胞、血小板、朗格漢斯細胞(Langerhan's cell)、幹細胞、末梢血單核細胞、細胞毒性T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)及諸如此類。「抗原呈遞細胞」 (APC)係能夠活化T細胞之細胞，且包含(但不限於)單核球/巨噬細胞、B細胞及樹突狀細胞(DC)。術語「樹突狀細胞」或「DC」係指發現於淋巴樣或非淋巴樣組織中之形態類似性細胞類型之不同群體之任一成員。該等細胞之特徵在於其特徵性形態及高表面II類MHC表現程度。DC可分離自諸多組織來源。DC能夠高度敏化MHC限制性T細胞且極有效地將抗原原位呈遞至T細胞。抗原可為表現於T細胞發育及耐受期間之自體抗原及存在於正常免疫過程期間之外來抗原。術語「嗜中性球」通常係指構成先天性免疫系統之一部分之白血球。嗜中性球通常具有含有約2-5個葉片之分段細胞核。嗜中性球通常在創傷後幾分鐘內遷移至損傷部位。嗜中性球藉由在損傷或感染部位處釋放細胞毒性化合物(包含氧化劑、蛋白酶及細胞介素)來發揮作用。術語「活化DC」係經抗原脈衝化且能夠活化免疫細胞之DC。術語「NK細胞」具有其業內一般含義且係指天然殺手(NK)細胞。熟習此項技術者可容易地藉由測定(例如)特定表型標記物(例如CD56)之表現來鑑別NK細胞且基於(例如)表現不同種類細胞介素之能力或誘導細胞毒性之能力來鑑別其功能。術語「B細胞」係指衍生自骨髓及/或脾之免疫細胞。B細胞可發育成產生抗體之漿細胞。術語「T細胞」係指參與各種細胞調介之免疫反應之胸腺源免疫細胞，包含CD8+ T細胞及CD4+ T細胞。習用T細胞(亦稱為Tconv或Teff)具有效應功能(例如細胞介素分泌、細胞毒性活性、抗自我識別及諸如此類)以藉助表現一或多種T細胞受體來增加免疫反應。Tconv或Teff通常定義為任一非Treg T細胞群體且包含(例如)幼稚T細胞、活化T細胞、記憶性T細胞、靜止性Tconv或分化成(例如) Th1或Th2譜系之Tconv。在一些實施例中，Teff係非調控性T細胞(Treg)之子組。在一些實施例中，Teff係CD4+ Teff或CD8+ Teff，例如CD4+輔助性T淋巴球(例如Th0、Th1、Tfh或Th17)及CD8+細胞毒性T細胞(淋巴球)。如本文進一步所闡述，細胞毒性T細胞係CD8+ T淋巴球。「幼稚Tconv」係已在骨髓中分化且成功地在胸腺中經受正向及負向主要選擇過程但尚未藉由暴露於抗原而活化之CD4+ T細胞。幼稚Tconv之特徵通常在於L-選擇素(CD62L)之表面表現、活化標記物(例如CD25、CD44或CD69)之不存在及記憶性標記物(例如CD45RO)之不存在。幼稚Tconv由此視為係靜止及非分裂性的，從而需要介白素-7 (IL-7)及介白素-15 (IL-15)來達成穩態存活(參見至少WO 2010/101870)。在抑制免疫反應之背景中，該等細胞之存在及活性係不期望的。不同於Treg，Tconv係無變應性且可因應於基於抗原之T細胞受體活化而增殖(Lechler等人(2001)Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356:625-637)。在腫瘤中，耗竭細胞可存在無變應性之標誌。
術語「免疫調控劑」係指調控免疫反應之物質、藥劑、信號傳導路徑或其組分。關於免疫反應之術語「調控」、「修飾」或「調節」係指免疫系統細胞或該細胞之活性之任一改變。該調控包含免疫系統(或其不同部分)之刺激或抑制，其可表現為各種細胞類型之數量之增加或減少、該等細胞之活性之增加或減少或可在免疫系統內發生之任何其他變化。已鑑別抑制性及刺激性免疫調控劑，其中之一些在癌症微環境中可具有增強之功能。
術語「免疫反應」意指身體針對「外來物」 (例如細菌、病毒及病原體)以及針對可能未必源自身體外部之靶所產生之防禦反應，包含(但不限於)針對天然存在於身體中之物質(例如針對自體抗原之自體免疫性)或針對經轉變(例如癌症)細胞之防禦反應。免疫反應尤其係免疫系統之細胞(例如T淋巴球、B淋巴球、天然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞及嗜中性球)及由該等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性大分子(包含抗體(體液反應)、細胞介素及補體)之活化及/或作用，其導致選擇性靶向、結合至、損害、破壞及/或自脊椎動物身體消除侵襲性病原體、感染病原體之細胞或組織、癌性或其他異常細胞或(在自體免疫性或病理性發炎之情形下)正常人類細胞或組織。抗癌免疫反應係指一種免疫監督機制，身體藉由該機制來識別異常腫瘤細胞且引發免疫系統之先天性免疫性及適應性免疫性以消除危險癌細胞。
先天性免疫系統係非特異性免疫系統，其包括保護宿主免於由其他生物體感染之細胞(例如天然殺手細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球；及吞噬細胞，包含巨噬細胞、嗜中性球及樹突狀細胞)及機制。先天性免疫反應可引發細胞介素產生以及活性補體級聯及適應性免疫反應。適應性免疫系統係高度特殊性全身性細胞活化及過程(例如藉由抗原呈遞細胞之抗原呈遞、抗原特異性T細胞活化及細胞毒性效應)所需要及涉及之特異性免疫系統。
術語「免疫治療劑」可包含可刺激個體中之宿主免疫系統以針對腫瘤或癌症生成免疫反應之任一分子、肽、抗體或其他藥劑。各種免疫治療劑可用於本文所闡述之組合物及方法中。
術語「抑制」或「下調」包含降低、限制或阻斷(例如)特定作用、功能或相互作用。在一些實施例中，若至少一種癌症症狀得以緩解、終止、減緩或預防，則癌症「經抑制」。如本文中所使用，若癌症之復發或轉移有所減小、減緩、延遲或預防，則癌症亦「經抑制」。類似地，若與參考狀態(例如對照，如野生型狀態)相比有所降低，則生物功能(例如蛋白質功能)經抑制。該抑制或缺陷可(例如)藉由在特定時間及/或地點施加藥劑來誘導，或可為組成型(例如藉由可遺傳突變)。該抑制或缺陷亦可為部分的或完全的(例如與參考狀態(例如對照，如野生型狀態)相比基本上無可量測活性)。基本上完全之抑制或缺陷稱為阻斷。術語「促進」或「上調」具有相反含義。
在提及兩個分子之間之相互作用時，術語「相互作用」係指分子彼此之物理接觸(例如結合)。通常，此一相互作用產生該等分子中之一或兩者之活性(其產生生物效應)。活性可為一或兩個分子之直接活性(例如信號轉導)。或者，可防止相互作用中之一或兩個分子結合其配體，且由此關於配體結合活性(例如結合其配體且觸發或抑制共刺激)保持惰性。抑制此一相互作用可破壞涉及該相互作用之一或多個分子之活性。增強此一相互作用係延長該物理接觸或增加其可能性，及延長該活性或增加其可能性。
「經分離蛋白質」係指實質上不含其他蛋白質、細胞材料、分離介質及培養基(在自細胞分離或藉由重組DNA技術產生時)或化學前體或其他化學物質(在以化學方式合成時)之蛋白質。「經分離」或「經純化」蛋白質或其生物活性部分實質上不含來自細胞或組織來源(自其衍生抗體、多肽、肽或融合蛋白)之細胞材料或其他污染蛋白或實質上不含化學前體或其他化學物質(在以化學方式合成時)。語言「實質上不含細胞材料」包含生物標記物多肽或其片段之製劑，其中蛋白質與自其分離或以重組方式產生之細胞之細胞組分分離。在一實施例中，語言「實質上不含細胞材料」包含生物標記物蛋白或其片段之製劑，其具有小於約30% (以乾重計)非生物標記物蛋白(亦在本文中稱為「污染蛋白質」)、更佳地小於約20%非生物標記物蛋白、仍更佳地小於約10% 非生物標記物蛋白及最佳地小於約5%非生物標記物蛋白。在抗體、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如其生物活性片段)係以重組方式產生時，其亦較佳地實質上不含培養基，亦即，培養基佔蛋白質製劑之體積之小於約20%、更佳地小於約10%及最佳地小於約5%。
術語「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體種類(例如IgM、IgG1、IgG2C及諸如此類)。
術語「KD 」意欲係指特定抗體-抗原相互作用之解離平衡常數。可藉由標準抗體-抗原分析(例如競爭性分析、飽和分析或標準免疫分析(例如ELISA或RIA))來量測或測定所揭示發明之抗體之結合親和力。
術語「微環境」通常係指所關注組織區域中之局部區域且可(例如)係指「腫瘤微環境」。術語「腫瘤微環境」或「TME」係指始終與腫瘤細胞相互作用之周圍微環境，其有助於容許腫瘤細胞與其環境之間之串擾。腫瘤微環境可包含腫瘤、周圍血管、免疫細胞、纖維母細胞、骨髓源發炎細胞、淋巴球、信號傳導分子及細胞外基質之細胞環境。腫瘤環境可包含由腫瘤微環境輔助及影響以確保生長及存活之腫瘤細胞或惡性細胞。腫瘤微環境亦可包含腫瘤浸潤性免疫細胞(例如淋巴樣細胞及骨髓樣細胞，其可刺激或抑制抗腫瘤免疫反應)及基質細胞(例如腫瘤相關性纖維母細胞及內皮細胞，其有助於腫瘤之結構完整性)。基質細胞可包含構成腫瘤相關性血管之細胞(例如內皮細胞及外周細胞，其係有助於結構完整性之細胞(纖維母細胞))以及腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)及浸潤性免疫細胞(包含單核球、嗜中性球(PMN)、樹突狀細胞(DC)、T細胞及B細胞、肥大細胞及天然殺手(NK)細胞)。基質細胞構成腫瘤細胞之主體，而實體腫瘤中之主要細胞類型係巨噬細胞。
術語「調節」及其語法等效詞係指增加或降低(例如沉默)，換言之係指上調或下調。
生物標記物之「正常」表現程度係生物標記物在未患有癌症之個體(例如人類患者)之細胞中之表現程度。
生物標記物之「過度表現」或「顯著較高表現程度」係指測試試樣中之表現程度大於用於評價表現之分析的標準誤差，且較佳地高於對照試樣(例如來自未患有生物標記物相關疾病之健康個體之試樣)中生物標記物之表現活性或程度及較佳地若干對照試樣中之平均生物標記物表現程度至少10%及更佳地1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多。生物標記物之「顯著較低表現程度」係指測試試樣中之表現程度低於對照試樣(例如來自未患有生物標記物相關疾病之健康個體之試樣)中生物標記物之表現程度及較佳地若干對照試樣中之平均生物標記物表現程度至少10%、及更佳地1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多。
該「顯著性」程度亦可適用於本文所闡述之任一其他量測參數，例如表現、抑制、細胞毒性、細胞生長及諸如此類。
術語「末梢血細胞亞型」係指通常發現於末梢血中之細胞類型，包含(但不限於)嗜酸性球、嗜中性球、T細胞、單核球、巨噬細胞、NK細胞、顆粒球及B細胞。
術語「預定」生物標記物量及/或活性量測可為用於(僅舉例而言)以下用途之生物標記物量及/或活性量測：評估可選擇用於特定治療之個體，評估對治療(例如本文所闡述一或多種生物標記物之一或多種調節劑)之反應，及/或評估疾病狀態。預定生物標記物量及/或活性量測可實施於患者群體(例如患有或未患癌症者)中。預定生物標記物量及/或活性量測可為同等適用於每一患者之單一數值，或預定生物標記物量及/或活性量測可根據患者之特定亞群體而有所變化。個體之年齡、體重、身高及其他因素可影響個體之預定生物標記物量及/或活性量測。另外，可個別地測定每一個體之預定生物標記物量及/或活性。在一實施例中，在本文所闡述方法中所測定及/或比較之量係基於絕對量測。在另一實施例中，本文所闡述方法中所測定及/或比較之量係基於相對量測，例如比率(例如細胞比率或正規化至管家生物標記物或另外通常恆定之生物標記物之表現之血清生物標記物)。預定生物標記物量及/或活性量測可為任一適宜標準。舉例而言，可自評價患者選擇之相同或不同人類獲得預定生物標記物量及/或活性量測。在一實施例中，可自同一患者之先前評價獲得預定生物標記物量及/或活性量測。以此一方式，可隨時間監測患者選擇之進展。另外，若個體係人類，則可自另一人或多人(例如所選人類群組)之評價獲得對照。以此一方式，可將評價選擇之人類選擇程度與適宜其他人(例如與所關注人類處於類似情況下之其他人，例如患有類似或相同病狀及/或屬相同種族者)進行比較。
術語「預測」包含使用生物標記物核酸及/或蛋白質狀態(例如腫瘤在療法之前、期間或之後之過度活性或活性不足、出現、表現、生長、緩解、復發或抗性)來測定期望情形之可能性。生物標記物之該預測用途可藉由(例如)以下各項來證實：(1)增加或降低之拷貝數(例如藉由FISH、FISH + SKY、單分子測序(例如如業內至少在J. Biotechnol., 86:289-301中所闡述)或qPCR)、生物標記物核酸之過度表現或表現不足(例如藉由ISH、北方印漬(Northern Blot)或qPCR)、增加或降低之生物標記物蛋白(例如藉由IHC)或(例如)在大於約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%或更多之所分析人類癌症類型或癌症試樣中之增加或降低之活性；(2)生物試樣(例如來自患有癌症之個體(例如人類)之含有組織、全血、血清、血漿、頰部刮片、唾液、腦脊髓液、尿、糞便或骨髓之試樣)中之其絕對或相對經調節存在或不存在；(3)癌症患者(例如對T細胞介導之細胞毒性之特定調節劑(單獨或與免疫療法組合)具有反應者或對其產生抗性者)之臨床子組中之其絕對或相對經調節存在或不存在。
術語「預防(prevent、preventing、prevention)」、「預防性治療」及諸如此類係指降低未患但具有罹患疾病、病症或病狀之風險或易患疾病、病症或病狀之個體罹患疾病、病症或病狀之可能性。
術語「探針」係指任一能夠選擇性結合至特定預期靶分子(例如由生物標記物核酸編碼或對應於其之核苷酸轉錄物或蛋白質)之分子。探針可由熟習此項技術者合成，或衍生自適當生物製劑。出於檢測靶分子之目的，探針可經特定設計以經標記，如本文所闡述。可用作探針之分子之實例包含(但不限於) RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
術語「比率」係指兩個數值(例如評分、總和及諸如此類)之間之關係。儘管比率可以特定順序來表示(例如a對b或a:b)，但熟習此項技術者將認識到，數值之間之潛在關係可以任一順序來表示而不損失潛在關係之顯著性，且可逆轉基於該比率之觀察及趨勢關聯。
術語「受體」係指通常存在於靶器官、組織或細胞類型之細胞表面上天然分子或分子複合物。
術語「癌症反應」、「對免疫療法之反應」或「對T細胞介導之細胞毒性之調節劑/免疫療法組合療法之反應」係關於過度增殖性病症(例如癌症)對癌症藥劑(例如T細胞介導之細胞毒性之調節劑及免疫療法)之任一反應，較佳地係關於在開始新輔助或輔助療法之後腫瘤質量及/或體積之變化。可(例如)針對效能或在新輔助或輔助情況下來評價過度增殖性病症反應，其中可將全身性干預後之腫瘤大小與初始大小及尺寸進行比較，如藉由CT、PET、乳房X光攝影片、超音波或觸診所量測。亦可藉由在生檢或手術切除術之後腫瘤之測徑器量測或病理學檢驗來評價反應。反應可以定量方式(如腫瘤體積之變化百分比)或以定性方式(如「病理完全反應」 (pCR)、「臨床完全緩解」 (cCR)、「臨床部分緩解」 (cPR)、「臨床穩定疾病」 (cSD)、「臨床進展性疾病」 (cPD)或其他定性準則)來記錄。可在開始新輔助或輔助療法之後早期(例如在數小時、數天、數週之後或較佳地在數月之後)評價過度增殖性病症反應。反應評價之典型終點係在終止新輔助化學療法時或在手術去除殘餘腫瘤細胞及/或腫瘤床時。此通常係在開始新輔助療法之後三個月。在一些實施例中，可藉由量測臨床受益率(CBR)來測定本文所闡述治療性治療之臨床效能。藉由測定在自結束療法至少6個月之時間點完全緩解(CR)之患者百分比、部分緩解(PR)之患者數及患有穩定疾病(SD)之患者數之總和來量測臨床受益率。此式簡寫為CBR=超過6個月之CR+PR+SD。在一些實施例中，特定癌症治療方案之CBR為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或更高。用於評估對癌症療法之反應之其他準則與「存活」相關，其包含所有下列各項：存活直至死亡，亦稱為整體存活(其中該死亡可不論何原因或與腫瘤相關)；「無復發存活」 (其中術語復發應包含局部復發及遠端復發)；無轉移存活；無疾病存活(其中術語疾病應包含癌症及與其有關之疾病)。可藉由參照所定義起點(例如診斷或開始治療之時間)及端點(例如死亡、復發或轉移)來計算該存活之持續時間。另外，治療效能之準則可擴展至包含對化學療法之反應、存活機率、給定時間段內之轉移機率及腫瘤復發機率。舉例而言，為測定適當臨限值，可向個體群體投與特定癌症治療方案且結果可與在投與任一癌症療法之前測得之生物標記物量測相關。結果量測可為對在新輔助設置中給予之療法之病理學反應。或者，可在已知生物標記物量測值之癌症療法後一定時間段內監測個體之結果量測(例如整體存活及無疾病存活)。在某些實施例中，所投與劑量係業內已知用於癌症治療劑之標準劑量。監測個體之時間段可有所變化。舉例而言，可監測個體至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60個月。可使用業內熟知方法(例如實例部分中所闡述者)來測定與癌症療法結果相關之生物標記物量測臨限值。
術語「抗性」係指癌症試樣或哺乳動物對癌症療法之獲得性或天然抗性(亦即對治療性治療無反應或具有減小或有限之反應)，例如對治療性治療之反應減小5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更高(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更高)或其間之任一範圍(包含端值)。可藉由以下方式來量測反應減小：與在獲得抗性之前之相同癌症試樣或哺乳動物進行比較，或與已知對治療性治療無抗性之不同癌症試樣或哺乳動物進行比較。關於化學療法之典型獲得性抗性稱為「多藥物抗性」。多藥物抗性可由P-醣蛋白介導或可由其他機制介導，或其可出現於在哺乳動物感染多藥物抗性微生物或微生物組合時。治療性治療抗性之測定在業內已眾所周知且為一般熟練臨床醫師所熟知，例如可藉由細胞增殖性分析及細胞死亡分析(如在本文中闡述為「敏化」)來量測。在一些實施例中，術語「逆轉抗性」意指，與僅一級癌症療法(例如化學治療或輻射療法)不能統計學顯著性減小腫瘤體積(與未治療腫瘤之腫瘤體積相比)之情況中未治療腫瘤之腫瘤體積相比，使用第二藥劑與一級癌症療法(例如化學治療或輻射療法)之組合能夠以統計學顯著程度(例如p＜0.05)顯著減小腫瘤體積。此通常適用於在未治療腫瘤以對數節奏生長時進行之腫瘤體積量測。
術語「反應」或「反應性」係指(例如)在減小腫瘤大小或抑制腫瘤生長之意義上之癌症反應。該術語亦可指改良之預後，例如如藉由增加之復發時間(其係至第一次復發之時段，其針對作為第一事件之第二原發性癌或無復發跡象之死亡設限)或增加之總體存活(其係自治療至因任何原因死亡之時段)所反映。作出反應或具有反應意指，在暴露於刺激物時達成有益終點。或者，在暴露於刺激物時，最小化、減輕或減弱陰性或有害症狀。應瞭解，評估腫瘤或個體展現有益反應之可能性等效於評估腫瘤或個體不展現有益反應(亦即展現反應缺乏或係無反應性)之可能性。
「RNA干擾(RNAi)」係一種進化保守之過程，其中表現或引入序列一致或高度類似於靶生物標記物核酸之RNA使得自該靶向基因轉錄之信使RNA (mRNA)發生序列特異性降解或特異性轉錄後基因沉默(PTGS) (參見Coburn及Cullen (2002)J. Virol. 76:9225)，由此抑制靶生物標記物核酸之表現。在一實施例中，RNA係雙鏈RNA (dsRNA)。此過程已闡述於植物、無脊椎動物及哺乳動物之細胞中。在自然界中，RNAi係由dsRNA特異性內核酸酶Dicer引發，其促進長dsRNA進行性裂解成稱為siRNA之雙鏈片段。siRNA納入識別且裂解靶mRNA之蛋白質複合物中。亦可藉由引入核酸分子(例如合成siRNA或RNA干擾劑)來引發RNAi以抑制靶生物標記物核酸之表現或使其沉默。如本文中所使用，「抑制靶生物標記物核酸表現」或「抑制標記物基因表現」包含靶生物標記物核酸或由靶生物標記物核酸編碼之蛋白質之表現或蛋白質活性或含量之任何降低。降低可為與未由RNA干擾劑靶向之靶生物標記物核酸之表現或由該靶生物標記物核酸編碼之蛋白質的活性或含量相比降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或更多。
除RNAi外，可使用基因體編輯來調節所關注生物標記物之拷貝數或基因序列，例如所關注生物標記物之組成型或誘導型敲除或突變。舉例而言，可使用CRISPR-Cas系統來精確編輯基因體核酸(例如用於產生非功能或無效突變)。在該等實施例中，可表現CRISPR嚮導RNA及/或Cas酶。舉例而言，可將僅含嚮導RNA之載體投與Cas9酶轉基因動物或細胞中。可使用類似策略(例如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或歸巢大範圍核酸酶(HE)，例如MegaTAL、MegaTev、Tev-mTALEN、CPF1及諸如此類)。該等系統在業內已眾所周知(例如參見美國專利第8,697,359號；Sander及Joung (2014)Nat. Biotech. 32:347-355；Hale等人(2009)Cell 139:945-956；Karginov及Hannon (2010)Mol.Cell 37:7；美國專利公開案第2014/0087426號及第2012/0178169號；Boch等人(2011)Nat. Biotech. 29:135-136；Boch等人(2009)Science 326:1509-1512；Moscou及Bogdanove (2009)Science 326:1501；Weber等人(2011)PLoS One 6:e19722；Li等人(2011)Nucl. Acids Res. 39:6315-6325；Zhang等人(2011)Nat. Biotech. 29:149-153；Miller等人(2011)Nat. Biotech. 29:143-148；Lin等人(2014)Nucl. Acids Res. 42:e47)。該等基因策略可根據業內熟知方法使用組成型表現系統或可誘導表現系統。
本文所用之「RNA干擾劑」定義為任一藉由RNA干擾(RNAi)來干擾或抑制靶生物標記物基因之表現之藥劑。該等RNA干擾劑包含(但不限於)核酸分子(包含與本發明所涵蓋之靶生物標記物基因或其片段同源之RNA分子)、短干擾RNA (siRNA)及藉由RNA干擾(RNAi)來干擾或抑制靶生物標記物核酸之表現之小分子。
術語用於檢測或測定至少一種生物標記物之存在或含量之「試樣」通常係腦組織、腦脊髓液、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便(例如大便)、眼淚及任一其他體液(例如如上文在「體液」之定義下所闡述)或組織試樣(例如生檢，例如小腸、結腸試樣或手術切除術組織)。在某些情況下，本發明所涵蓋方法進一步包括自個體獲得試樣，然後檢測或測定試樣中之至少一種標記物之存在或含量。
術語「敏化」意指改變癌細胞或腫瘤細胞以容許更有效地使用癌症療法(例如抗免疫檢查點療法、化學治療療法及/或輻射療法)治療相關癌症。在一些實施例中，正常細胞並不受影響至導致正常細胞由療法過度損傷之程度。根據業內已知用於特定治療的方法及下文所闡述方法來量測關於治療性治療之增加之敏感性或減小之敏感性，該等方法包含(但不限於)細胞增殖性分析(Tanigawa等人(1982)Cancer Res. 42:2159-2164)及細胞死亡分析(Weisenthal等人(1984)Cancer Res. 94:161-173；Weisenthal等人(1985)Cancer Treat Rep. 69:615-632；Weisenthal等人，Kaspers G J L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P編輯，Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993:415-432；Weisenthal (1994)Contrib. Gynecol. Obstet. 19:82-90)。亦可在動物中藉由量測一定時間段(例如對於人類係6個月且對於小鼠係4-6週)內之腫瘤大小減小來量測敏感性或抗性。若與在不存在該組合物或方法下之治療敏感性或抗性相比治療敏感性增加或抗性減小5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更高(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更高)或其間之任一範圍(包含端值)，則組合物或方法使治療性治療反應敏化。關於治療性治療之敏感性或抗性之測定在業內已眾所周知且為一般熟練臨床醫師所熟知。應理解，本文所闡述增強癌症療法之效能之任一方法可同樣適用於使過度增殖性或另外癌性細胞(例如抗性細胞)對癌症療法敏感之方法。
「短干擾RNA」 (siRNA)亦在本文中稱為「小干擾RNA」，其定義為用於(例如)藉由RNAi來抑制靶生物標記物核酸之表現之藥劑。siRNA可以化學方式合成，可藉由活體外轉錄產生，或可產生於宿主細胞內。在一實施例中，siRNA係長約15至約40個核苷酸、較佳地長約15至約28個核苷酸、更佳地長約19至約25個核苷酸及更佳地長約19、20、21或22個核苷酸之雙鏈RNA (dsRNA)分子，且可在每一鏈上含有長約0、1、2、3、4或5個核苷酸之3’及/或5’懸突。兩條鏈上之懸突之長度係獨立的，亦即，一條鏈上之懸突長度並不依賴於第二鏈上之懸突長度。較佳地，siRNA能夠經由靶信使RNA (mRNA)之降解或特異性轉錄後基因沉默(PTGS)來促進RNA干擾。
在另一實施例中，siRNA係小髮夾(亦稱為莖環) RNA (shRNA)。在一實施例中，該等shRNA係由短(例如17-29個核苷酸、19-25個核苷酸等區域)反義鏈、隨後之4-10核苷酸環(例如4、5、6、7、8、9或10鹼基連接體區域)及類似有義鏈構成。或者，有義鏈可位於核苷酸環結構前面且反義鏈可位於核苷酸環結構後面。該等shRNA可含於質體、逆轉錄病毒及慢病毒中且自(例如) pol III U6啟動子或另一啟動子表現(例如參見Stewart等人(2003)RNA Apr;9(4):493-501，其以引用方式併入本文中)。
可將RNA干擾劑(例如siRNA分子)投與患有癌症或處於患有癌症之風險下之患者以抑制過度表現於癌症中之生物標記物基因的表現，且由此治療、預防或抑制個體之癌症。
應用於生物活性劑之術語「選擇性調節劑」或「選擇性調節」係指與脫靶細胞群體、信號傳導活性等相比，藥劑能夠經由與靶直接或間接相互作用來調節靶(例如細胞群體、信號傳導活性等)。舉例而言，較蛋白質與另一結合配偶體間之另一相互作用及/或所關注細胞群體上之該(等)相互作用選擇性抑制蛋白質與一種天然結合配偶體間之相互作用的藥劑將該相互作用抑制至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、2× (倍)、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、35×、40×、45×、50×、55×、60×、65×、70×、75×、80×、85×、90×、95×、100×、105×、110×、120×、125×、150×、200×、250×、300×、350×、400×、450×、500×、600×、700×、800×、900×、1000×、1500×、2000×、2500×、3000×、3500×、4000×、4500×、5000×、5500×、6000×、6500×、7000×、7500×、8000×、8500×、9000×、9500×、10000×或更大或其間之任一範圍(包含端值) (較至少一種其他結合配偶體)。該等量度通常係以將相互作用/活性減半所需藥劑之相對量之形式來表示。該等量度適用於任一其他選擇性處理，例如核酸分子與一或多個靶序列之結合。
更通常而言，術語「選擇性」係指優先作用或功能。術語「選擇性」可針對相對於其他靶在所關注特定靶中之優先效應來量化。舉例而言，所量測變量(例如調節期望細胞中相對於其他細胞之生物標記物表現、期望細胞相對於其他細胞之富集及/或缺失等)可在所關注靶與非預期或不期望靶中相差10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更大或其間之任一範圍(包含端值) (例如50%至16倍)。可使用相同倍數分析來證實給定組織、細胞群體中之效應、所量測變量及/或所量測效應及諸如此類(例如細胞比率、過度增殖性細胞生長速率或體積、細胞增殖速率等、細胞數量及諸如此類)之等級。
與之相比，術語「特異性」係指排他性作用或功能。舉例而言，特異性調節蛋白質與一種結合配偶體之間之相互作用係指排他性調節該相互作用，且並不以任何顯著性調節蛋白質與另一結合配偶體之間之相互作用。在另一實例中，抗體特異性結合預定抗原係指抗體能夠結合至所關注抗原而不結合至其他抗原。通常，抗體以大約小於1 × 10-7 M (例如大約小於10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或甚至更低)之親和力(KD )結合至預定抗原，該親和力係藉由表面電漿共振(SPR)技術在BIACORE®分析儀器中使用所關注抗原作為分析物且使用抗體作為配體所測定；且以較其針對結合至除預定抗原或密切相關抗原外之非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)之親和力至少1.1、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.5-、3.0-、3.5-、4.0-、4.5-、5.0-、6.0-、7.0-、8.0-、9.0-或10.0倍或更大之親和力結合至預定抗原。另外，KD 係KA 之倒數。片語「識別抗原之抗體」及「特異性針對抗原之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
術語「小分子」係業內術語且包含小於約1000分子量或小於約500分子量之分子。在一實施例中，小分子不排他性地包括肽鍵。在另一實施例中，小分子並非寡聚的。可針對活性篩選之實例性小分子化合物包含(但不限於)肽、肽模擬物、核酸、碳水化合物、小有機分子(例如多聚乙醯) (Cane等人(1998)Science 282:63)及天然產物提取物庫。在另一實施例中，化合物係小有機非肽化合物。除非另外指示，否則該術語意欲涵蓋所關注化學結構之所有立體異構體、幾何異構體、互變異構體及同位素。
術語「個體」係指動物、脊椎動物、哺乳動物或人類，尤其係投與藥劑以(例如)用於實驗、診斷及/或治療目的或獲得試樣或實施程序者。在一些實施例中，個體係哺乳動物，例如人類、非人類靈長類動物、齧齒類動物(例如小鼠或大鼠)、家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)或其他動物(例如駱馬及駱駝)。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體係患有癌症之人類個體。術語「個體」與「患者」可互換使用。
術語「存活」包含所有下列各項：存活直至死亡，亦稱為總體存活(其中該死亡可不論何原因或與腫瘤相關)；「無復發存活」 (其中術語復發應包含局部復發及遠端復發)；無轉移存活；無疾病存活(其中術語疾病應包含癌症及與其有關之疾病)。可藉由參照所定義起點(例如診斷或開始治療之時間)及端點(例如死亡、復發或轉移)來計算該存活之持續時間。另外，治療效能之準則可擴展至包含對化學療法之反應、存活機率、給定時間段內之轉移機率及腫瘤復發機率。
術語「協同效應」係指兩種或更多種藥劑(例如表1及/或表2中所列示生物標記物之調節劑及免疫療法組合療法)之組合效應，該效應大於僅癌症藥劑/療法之單獨效應之總和。
術語「靶」係指藉由本文所闡述之藥劑、組合物及/或調配物調節、抑制或沉默之基因或基因產物。靶基因或基因產物包含野生型形式及突變形式。本發明所涵蓋靶之非限制性、代表性清單提供於表1及表2中。類似地，用作動詞之術語「靶向(target、targets)」或「靶向(targeting)」係指調節靶基因或基因產物之活性。靶向可係指上調或下調靶基因或基因產物之活性。
術語「治療效應」涵蓋動物、尤其哺乳動物及更尤其人類中由藥理學活性物質引起之局部或全身性效應。該術語由此意指意指用於診斷、治癒、減輕、治療或預防動物或人類之疾病或增強期望身體或精神發育及狀況之任一物質。由該術語涵蓋之預防性效應涵蓋延遲或消除疾病或病狀之出現，延遲或消除疾病或病狀之症狀之發作，減緩、終止或逆轉疾病或病狀之進展，或其任一組合。
術語藥劑(包含組合物及/或包括此一藥劑之調配物)之「有效量」或「有效劑量」係指(例如)在根據所選投與形式、途徑及/或時間表遞送至細胞或生物體時足以達成期望生物及/或藥理學效應之量。如熟習此項技術者所瞭解，特定藥劑或組合物之絕對有效量可端視諸如以下等因素而有所變化：期望生物或藥理學終點、擬遞送藥劑、靶組織等。熟習此項技術者進一步應理解，在各個實施例中，可「有效量」與細胞接觸或以單一劑量或經由使用多個劑量投與個體。術語「有效量」可為「治療有效量」。
術語「治療有效量」係指在適用於任一醫學治療之合理益處/風險比下於動物中之至少細胞亞群體中有效產生一定期望治療效應之藥劑量。可藉由標準醫藥程序在(例如)用於測定LD50 及ED50 之細胞培養物或實驗動物中來測定標的化合物之毒性及治療效能。展現大治療指數之組合物較佳。在一些實施例中，可量測LD50 (致死劑量)且可為(例如)相對於不投與藥劑使藥劑減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更高。類似地，可量測ED50 (亦即達成半最大症狀抑制之濃度)且可為(例如)相對於不投與藥劑使藥劑增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更高。同樣，類似地，可量測IC50 (亦即對癌細胞達成半最大細胞毒性或細胞生長抑制效應之濃度)且可為(例如)相對於不投與藥劑使藥劑增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更高。在一些實施例中，可將分析中之癌細胞生長抑制至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%。在另一實施例中，可達成實體惡性腫瘤降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%。
術語「耐受性」或「不反應性」包含細胞(例如免疫細胞)對刺激(例如經由活化受體或細胞介素之刺激)之抵抗性。不反應性可(例如)因暴露於免疫抑制劑或暴露於高劑量抗原而出現。若干獨立方法可誘導耐受性。一種機制稱為「無反應性」，其定義為細胞作為不反應性細胞保留於活體內而非分化成具有效應功能之細胞之狀態。該抵抗性通常係抗原特異性且在停止暴露於耐受性抗原之後得以保留。舉例而言，T細胞中之無反應性之特徵在於缺乏細胞介素產生(例如IL-2)。T細胞無反應性出現於使T細胞暴露於抗原且在不存在第二信號(共刺激信號)下接收第一信號(T細胞受體或CD-3調介之信號)時。在該等條件下，將細胞再暴露於相同抗原(即使再暴露發生於在共刺激多肽存在下)不能產生細胞介素且由此不能增殖。然而，若與細胞介素(例如IL-2)一起培養，則無反應性T細胞可發生增殖。舉例而言，亦可藉由缺乏藉由T淋巴球之IL-2產生來觀察T細胞無反應性，如藉由ELISA或藉由增殖分析使用指示細胞系所量測。或者，可使用報告基因構築體。舉例而言，無變應性T細胞不能引發藉由異源性啟動子在5’ IL-2基因增強子之控制下或藉由可發現於增強子內之AP1序列多聚體誘導之IL-2基因轉錄(Kang等人(1992)Science 257:1134)。另一機制稱為「耗竭」。T細胞耗竭係在許多慢性感染及癌症期間產生之T細胞功能障礙狀態。其係根據較差效應功能、抑制受體之持續表現及不同於功能性效應或記憶T細胞之轉錄狀態來進行定義。
「經轉錄多核苷酸」或「核苷酸轉錄物」係與全部或一部分成熟mRNA互補或同源之多核苷酸(例如mRNA、hnRNA、cDNA或該RNA或cDNA之類似物)，其係藉由轉錄生物標記物核酸及正常轉錄後處理(例如剪接，若存在) RNA轉錄物及逆轉錄RNA轉錄物所製得。
術語「治療」係指所關注病狀(例如疾病或病症)之治療性管控或改良。治療可包含(但不限於)向個體投與藥劑或組合物(例如醫藥組合物)。通常實施治療以試圖以有益於個體之方式改變疾病(該術語用於指示需要或可能需要療法之任一疾病、病症、症候群或不期望病狀)之過程。治療效應可包含逆轉、緩解疾病或該疾病之一或多種症狀或表現、減小其嚴重程度、延遲其發作、治癒其、抑制其進展及/或減小其發生或復發之可能性。期望治療效應包含(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。可將治療劑投與患有疾病或相對於一般群體成員處於增加之發生疾病之風險下之個體。在一些實施例中，可將治療劑投與已患有疾病但不再展示疾病跡象之個體。可投與藥劑以(例如)減小明顯疾病之復發可能性。可預防性投與治療劑，亦即在發生疾病之任一症狀或表現之前投與。「預防性治療」係指向未發生疾病或未展示疾病跡象之個體提供醫學及/或手術管控以(例如)減小發生疾病之可能性或減小所發生疾病之嚴重程度。個體可能已鑑別為處於發生疾病之風險下(例如相對於一般群體處於增加之風險下)或具有增加疾病發生可能性之風險因子。
術語「不反應性」包含癌細胞對療法之抵抗性或治療性細胞(例如免疫細胞)對刺激(例如經由活化受體或細胞介素之刺激)之抵抗性。不反應性可(例如)因暴露於免疫抑制劑或暴露於高劑量抗原而出現。如本文中所使用，術語「無反應性」或「耐受性」包含對活化受體調介之刺激之抵抗性。該抵抗性通常係抗原特異性且在停止暴露於耐受性抗原之後得以保留。舉例而言，T細胞中之無反應性(與不反應性不同)之特徵在於缺乏細胞介素產生(例如IL-2)。T細胞無反應性出現於使T細胞暴露於抗原且在不存在第二信號(共刺激信號)下接收第一信號(T細胞受體或CD-3調介之信號)時。在該等條件下，將細胞再暴露於相同抗原(即使再暴露發生於在共刺激多肽存在下)不能產生細胞介素且由此不能增殖。然而，若與細胞介素(例如IL-2)一起培養，則無反應性T細胞可發生增殖。舉例而言，亦可藉由缺乏藉由T淋巴球之IL-2產生來觀察T細胞無反應性，如藉由ELISA或藉由增殖分析使用指示細胞系所量測。或者，可使用報告基因構築體。舉例而言，無變應性T細胞不能引發藉由異源性啟動子在5’ IL-2基因增強子之控制下或藉由可發現於增強子內之AP1序列多聚體誘導之IL-2基因轉錄(Kang等人(1992)Science 257:1134)。
術語「疫苗」係指用以生成用於預防及/或治療疾病之免疫性之組合物。
另外，在特定蛋白質之胺基酸序列與可編碼該蛋白質之核苷酸序列(如由基因代碼(展示於下文中)所定義)之間存在已知且確定之對應性。同樣，在特定核酸之核苷酸序列與由該核酸編碼之胺基酸序列(如由基因代碼所定義)之間存在已知且確定之對應性。
基因代碼 丙胺酸(Ala, A)            GCA, GCC, GCG, GCT 精胺酸(Arg, R)            AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT 天門冬醯胺(Asn, N)          AAC, AAT 天門冬胺酸(Asp, D)          GAC, GAT 半胱胺酸(Cys, C)         TGC, TGT 麩胺酸(Glu, E)            GAA, GAG 麩醯胺酸(Gln, Q)        CAA, CAG 甘胺酸(Gly, G)            GGA, GGC, GGG, GGT 組胺酸(His, H)            CAC, CAT 異白胺酸(Ile, I)           ATA, ATC, ATT 白胺酸(Leu, L)            CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG 離胺酸(Lys, K)            AAA, AAG 甲硫胺酸(Met, M)        ATG 苯丙胺酸(Phe, F) TTC, TTT 脯胺酸(Pro, P)            CCA, CCC, CCG, CCT 絲胺酸(Ser, S)             AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT 蘇胺酸(Thr, T)            ACA, ACC, ACG, ACT 色胺酸(Trp, W)           TGG 酪胺酸(Tyr, Y)            TAC, TAT 纈胺酸(Val, V)            GTA, GTC, GTG, GTT 終止信號(末端)            TAA, TAG, TGA
基因代碼之重要熟知特徵在於其冗餘性，藉此，對於用於製備蛋白質之大部分胺基酸而言，可採用一種以上之編碼核苷酸三聯體(闡釋於上文中)。因此，諸多不同核苷酸序列可編碼給定胺基酸序列。該等核苷酸序列視為在功能上等效，此乃因其在所有生物體中產生相同胺基酸序列(但某些生物體可較其他序列更有效地轉譯一些序列)。此外，不時地，嘌呤或嘧啶之甲基化變體可發現於給定核苷酸序列中。該等甲基化不影響三核苷酸密碼子與相應胺基酸之間之編碼關係。
鑒於前述內容，可使用編碼生物標記物核酸(或其任一部分)之DNA或RNA之核苷酸序列藉由使用基因代碼將DNA或RNA轉譯成胺基酸序列以導出多肽胺基酸序列。同樣，對於多肽胺基酸序列而言，可編碼多肽之相應核苷酸序列可自基因代碼推斷出(因基因代碼之冗餘性，此將產生用於任一給定胺基酸序列之多個核酸序列)。因此，在本文中闡述及/或揭示編碼多肽之核苷酸序列應視為亦包含闡述及/或揭示由核苷酸序列編碼之胺基酸序列。類似地，在本文中闡述及/或揭示多肽胺基酸序列應視為亦包含闡述及/或揭示可編碼胺基酸序列之所有可能核苷酸序列。
II. 單核球及巨噬細胞 單核球係骨髓源免疫效應細胞，其循環於血液、骨髓及脾中且在穩態條件中具有有限之增殖。術語「骨髓樣細胞」可係指骨髓或脊髓中之顆粒球或單核球前體細胞或類似於發現於骨髓或脊髓中之細胞者。該等骨髓樣細胞譜系包含末梢血中之循環單核球及其在成熟、分化及/或活化後所變成之細胞群體。該等群體包含非最終分化性骨髓樣細胞、骨髓源抑制細胞及經分化巨噬細胞。經分化巨噬細胞包含非極化及極化巨噬細胞、靜止性及活化巨噬細胞。並不加以限制，骨髓樣譜系亦可包含顆粒球性前體、多形核源抑制細胞、經分化多形核白血球、嗜中性球、顆粒球、嗜鹼性球、嗜酸性球、單核球、巨噬細胞、小神經膠質細胞、骨髓源抑制細胞、樹突狀細胞及紅血球。單核球發現於末梢血單核細胞(PBMC)中，該等末梢血單核細胞亦包括其他造血細胞及免疫細胞(例如B細胞、T細胞、NK細胞及諸如此類)。藉由來自稱為單核母細胞之造血幹細胞前體之骨髓來產生單核球。單核球在免疫系統中具有兩種主要功能：(1)其可離開血流以在正常狀態下補充駐留型巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)，且(2)其可迅速遷移至組織中之感染部位並分裂/分化成巨噬細胞及發炎樹突狀細胞以因應於發炎信號誘發免疫反應。通常在經染色塗片中藉由大雙葉核來鑑別單核球。單核球亦表現在感染期間調介自血液至組織之遷移之趨化介素受體及病原體識別受體 。其產生發炎細胞介素且吞噬細胞。在一些實施例中，根據CD11b+表現及/或CD14+表現來鑑別所關注單核球及/或巨噬細胞。
如下文所詳細闡述，單核球可分化成巨噬細胞。單核球亦可(例如)經由細胞介素顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及介白素4 (IL-4)之作用分化成樹突狀細胞。一般而言，術語「單核球」涵蓋未分化單核球以及自其分化之細胞類型(包含巨噬細胞及樹突狀細胞)。在一些實施例中，術語「單核球」可係指未分化單核球。
巨噬細胞係發炎及先天性免疫反應之關鍵免疫效應物及調控因子。巨噬細胞係異質、組織駐留型、最終分化之先天性骨髓樣細胞，其具有顯著可塑性且可因應於來自微環境之局部因子而改變其生理學，並可承擔自宿主防禦至組織穩態之諸多功能需求(Ginhoux等人(2016)Nat. Immunol . 17:34-40)。巨噬細胞存在於身體中之實際上所有組織中。其係組織駐留型巨噬細胞(例如駐留於肝中之庫弗氏細胞(Kupffer cell))，或衍生自循環單核球前體(亦即單核球)，該等前體主要源自骨髓及脾儲存器且在穩態下或因應於發炎或其他刺激因子而遷移至組織中。舉例而言，可將單核球自血液募集至組織以補充骨、肺泡(肺)、中樞神經系統、結締組織、胃腸道、肝、脾及腹膜之組織特異性巨噬細胞。
術語「組織駐留型巨噬細胞」係指實施組織特異性及/或顯微解剖生態區位特異性功能(例如組織免疫監督、感染反應及發炎消退)及專用穩態功能之免疫細胞之異質群體。組織駐留型巨噬細胞源於胚胎之卵黃囊中且成熟於發育中胎兒中之一個特定組織中，在此其獲得組織特異性作用且改變其基因表現特徵。維持群落形成能力之組織駐留型巨噬細胞之局部增殖可直接在組織中產生成熟巨噬細胞之群體。亦可根據其佔據組織來鑑別組織駐留型巨噬細胞且加以命名。舉例而言，脂肪組織巨噬細胞佔據脂肪組織，庫弗氏細胞佔據肝組織，竇組織細胞佔據淋巴結，肺泡巨噬細胞(塵細胞)佔據肺泡，朗格漢斯細胞(Langerhans cell)佔據皮膚及黏膜組織，產生巨細胞之組織細胞佔據結締組織，小神經膠質細胞佔據中樞神經系統(CNS)組織，霍夫鮑爾細胞(Hofbauer cell)佔據胎盤組織，腎小球內系膜細胞佔據腎組織，破骨細胞佔據骨組織，上皮樣細胞佔據肉芽腫，紅髓巨噬細胞(竇內皮細胞)佔據脾組織之紅髓，腹膜腔巨噬細胞佔據腹膜腔組織，lysomac細胞佔據派伊爾斑(Peyer’s patch)組織，且胰臟巨噬細胞佔據胰臟組織。
除在宿主中防禦傳染原及其他發炎反應外，巨噬細胞亦可實施不同穩態功能，包含(但不限於)發育、傷口癒合及組織修復及免疫反應調控。巨噬細胞首次識別為身體中經由吞噬作用來防禦感染之吞噬細胞，其係先天性免疫性之基本組分。因應於病原體及其他發炎刺激物，經活化巨噬細胞可吞食所感染細菌及其他微生物；刺激發炎且將促發炎分子之混合劑釋放至該等細胞內微生物。在吞食病原體之後，巨噬細胞將病原性抗原呈遞至T細胞以進一步活化用於防禦之適應性免疫反應。實例性促發炎分子包含細胞介素IL-1β、IL-6及TNF-α、趨化介素MCP-1、CXC-5及CXC-6以及CD40L。
除有助於針對感染之宿主防禦外，巨噬細胞亦獨立於其免疫反應關聯性而發揮重要穩態作用。巨噬細胞係清除紅血球之巨大吞噬細胞且所釋放物質(例如鐵及血紅蛋白)可再循環以供宿主再利用。此清除過程係重要代謝貢獻，宿主離開其將不能生存。
巨噬細胞亦涉及去除生成於組織重塑期間之細胞碎屑，且快速並有效地清除發生細胞凋亡之細胞。據信，巨噬細胞涉及經由清除細胞凋亡細胞來達成組織穩態(steady-state tissue homeostasis)。該等穩態清除過程通常係由巨噬細胞上之表面受體(包含清除劑受體、磷脂醯絲胺酸受體、凝血酶敏感蛋白受體、整聯蛋白及補體受體)來介導。介導吞噬作用之該等受體不能轉導誘導細胞介素-基因轉錄之信號或有效產生抑制信號及/或細胞介素。巨噬細胞之穩態功能獨立於其他免疫細胞。
巨噬細胞亦可清除源自細胞創傷或其他細胞損害之細胞碎屑/壞死細胞。巨噬細胞經由類鐸受體(TLR)、細胞內模式識別受體及介白素-1受體(IL-1R)來檢測存在於壞死細胞碎屑中之內源性危險信號，大部分該等信號係經由轉接分子骨髓樣分化一級反應基因 88 (MyD88)來傳導。清除細胞碎屑可顯著改變巨噬細胞之生理學。清除壞死之巨噬細胞可發生顯著生理學變化，包含改變表面蛋白之表現及產生細胞介素及促發炎媒介。巨噬細胞表面蛋白表現因應於該等刺激物之改變可潛在地用於鑑別該等經改變細胞之獨特生物化學標記物。
巨噬細胞在維持許多組織(例如白色脂肪組織、褐色脂肪組織、肝及胰臟)中之穩態方面具有重要功能。藉由釋放觸發使組織細胞適應之變化級聯之細胞信號傳導分子，組織巨噬細胞可對組織中之條件變化迅速作出反應。舉例而言，脂肪組織中之巨噬細胞因應於飲食變化(例如白色脂肪組織中之巨噬細胞)或暴露於冷溫度(例如褐色脂肪組織中之巨噬細胞)來調控新脂肪細胞之產生。肝中之巨噬細胞(稱為庫弗氏細胞)因應於飲食變化來調控葡萄糖及脂質之分解。胰臟中之巨噬細胞可因應於高脂肪飲食來調控胰島素產生。
巨噬細胞亦可有助於傷口癒合及組織修復。舉例而言，巨噬細胞可因應於源自經損傷組織及細胞之信號而活化且誘導組織修復反應以修復經損害組織(Minutti等人(2017)Science 356:1076-1080)。
在胚胎發育期間，巨噬細胞亦在組織重塑及器官發育中發揮關鍵作用。舉例而言，駐留型巨噬細胞使新生小鼠心臟中之血管發育有效進行(Leid等人(2016) Circ. Res. 118:1498-1511)。腦中之小神經膠質細胞可產生在胚胎發育期間引導發育中腦中之神經元及血管之生長因子。類似地，CD95L (一種由巨噬細胞產生之蛋白質)結合至小鼠胚胎之腦中神經元及發育中血管之表面上之CD95受體且增加神經元及血管發育(Chen等人(2017)Cell Rep . 19:1378-1393)。在無配體下，神經元以較小頻率分支，且所得成人腦展現較小電活性。稱為破骨細胞之單核球源細胞涉及骨發育，且缺乏該等細胞之小鼠產生稠密硬化骨，此係稱為骨硬化症之罕見病狀。巨噬細胞亦主導乳腺之發育且有助於早期產後期中之視網膜發育(Wynn等人(2013) Nature 496:445-455)。
如上所述，巨噬細胞調控免疫系統。除將抗原呈遞至T細胞外，巨噬細胞亦可在一些條件中向免疫細胞提供免疫抑制/抑制信號。舉例而言，在睪丸中，巨噬細胞幫助產生保護性精子環境以免受免疫系統攻擊。睪丸中之組織駐留型巨噬細胞產生防止針對精子之免疫細胞反應之免疫抑制分子(Mossadegh-Keller等人(2017)J. Exp. Med. 214:10.1084/jem.20170829)。
因應於不同環境信號且與功能需求一致之巨噬細胞可塑性已產生諸多巨噬細胞活化狀態，包含連續功能狀態之兩個極端，亦即「經典活化」 M1及「替代活化」 M2巨噬細胞。
術語「活化」係指單核球及/或巨噬細胞已經充分刺激以誘導可檢測細胞增殖及/或已經刺激以施加其效應功能之狀態，該效應功能係(例如)經誘導細胞介素表現及分泌、吞噬作用、細胞信號傳導、抗原處理及呈遞、靶細胞殺死及促發炎功能。
術語「M1巨噬細胞」或「經典活化之巨噬細胞」係指具有促發炎表型之巨噬細胞。術語「巨噬細胞活化」 (亦稱為「經典活化」)由Mackaness在1960年代引入感染背景中以闡述在二次暴露於病原體後巨噬細胞針對BCG (卡介苗(bacillus Calmette-Guerin))及李斯特菌之抗原依賴性但非特異性增強之殺微生物活性(Mackaness (1962)J. Exp. Med. 116:381-406)。後來，使該增強與藉由抗原活化性免疫細胞之Th1反應及IFN-γ產生建立聯繫(Nathan等人(1983)J. Exp. Med. 158:670-689)且擴展至細胞毒性及抗腫瘤性質(Pace等人(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:3782-3786；Celada等人(1984)J. Exp. Med. 160:55-74)。因此，藉由細胞介素分泌、抗原呈遞、吞噬作用、細胞-細胞相互作用、遷移等增強發炎之任一巨噬細胞功能性可視為促發炎性。活體外及活體內分析可量測不同終點：一般活體外量測包含促發炎細胞刺激，如藉由增殖、遷移、促發炎Th1細胞介素/趨化介素分泌及/或遷移所量測；而一般活體內量測進一步包含分析病原體防治、組織損傷立即反應者、其他細胞活化劑、遷移誘導劑等。對於活體外及活體內二者，可評價促發炎抗原呈遞。細菌部分(例如脂多醣(LPS)、某些類鐸受體(TLR)激動劑、Th1細胞介素干擾素-γ (IFNγ) (例如由因應於應激及感染之NK細胞及具有持續產生之T輔助細胞產生之IFNγ)及TNF沿M1路徑極化巨噬細胞。經活化M1巨噬細胞吞噬且破壞微生物，消除經損害細胞(例如腫瘤細胞及細胞凋亡細胞)，將抗原呈遞至T細胞以用於增加適應性免疫反應，且產生較高含量之促發炎細胞介素(例如IL-1、IL-6及IL-23)、反應性氧物質(ROS)及一氧化氮(NO)，並活化其他免疫及非免疫細胞。以表現可誘導一氧化氮合酶(iNOS)、反應性氧物質(ROS)且產生Th1相關細胞介素IL-12為特徵，M1巨噬細胞極適於促進強免疫反應。M1巨噬細胞代謝之特徵在於增強之好氧性醣解、使葡萄糖轉化成乳酸鹽、增加之穿過磷酸戊糖路徑(PPP)之通量、脂肪酸合成及截短之三羧酸(TCA)循環，從而累積琥珀酸鹽及檸檬酸鹽。
「1型」或「M1樣」單核球及/或巨噬細胞係能夠有助於促發炎反應之單核球及/或巨噬細胞，其特徵在於下列各項中之至少一者：藉由分泌至少一種促發炎細胞介素來產生發炎刺激物，在其表面上表現至少一種細胞表面活化分子/活化分子配體，募集/引導至少一種其他細胞(包含其他巨噬細胞及/或T細胞)/與其相互作用以刺激促發炎反應，呈遞促發炎背景中之抗原，遷移至容許促發炎反應開始之部位，或開始表現至少一種預計產生促發炎功能性之基因。在一些實施例中，該術語包含活化細胞毒性CD8+ T細胞，調介癌細胞對免疫療法(例如免疫檢查點療法)之增加之敏感性，及/或調介癌細胞之抗性逆轉。在某些實施例中，可以諸多熟知方式來量測朝向促發炎狀態之該調節，包含(但不限於)以下各項中之一或多者：a)增加之分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)；b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1、TGFb及/或IL-10之降低之表現及/或分泌；c)至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18、GM-CSF、CCL3、CCL4及IL-23組成之群之細胞介素或趨化介素之增加之分泌；d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之增加之比率；e)增加之CD8+細胞毒性T細胞活化；f)增加之CD8+細胞毒性T細胞活化之募集；g)增加之CD4+輔助性T細胞活性；h)增加之CD4+輔助性T細胞活性之募集；i)增加之NK細胞活性；j)增加之NK細胞募集；k)增加之嗜中性球活性；l)增加之巨噬細胞活性；及/或m)增加之紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量，如藉由顯微術所評價。
在已係促發炎之細胞中，增加之發炎表型係指更強之促發炎狀態。
與之相比，術語「M2巨噬細胞」係指具有抗發炎表型之巨噬細胞。Th2-及腫瘤源細胞介素(例如IL-4、IL-10、IL-13、轉變生長因子β (TGF-β)或前列腺素E2 (PGE2))可促進M2極化。M2巨噬細胞之代謝特徵係由OXPHOS、FAO、降低之醣解及PPP來定義。甘露糖受體由鼠類巨噬細胞中之Th2 IL-4及IL-13選擇性增強之發現以及誘導之甘露糖基化配體之胞吞清除、增加之主要組織相容性複合物(MHC)種類II抗原表現及減小之促發炎細胞介素分泌促使Stein、Doyle及同事提出，IL-4及IL-13誘導替代活化表型，該替代活化表型係完全不同於IFN-γ活化但遠未去活化之狀態(Martinez及Gordon (2014)F1000 Prime Reports 6:13)。活體外及活體內定義/分析可量測不同終點：一般活體外終點包含抗發炎細胞刺激(藉由增殖、遷移、抗發炎Th2細胞介素/趨化介素分泌及/或遷移量測)；而一般活體內M2終點進一步包含分析病原體防治、組織損傷延遲/促纖維化反應、其他細胞Th2極化、遷移誘導劑等。對於活體外及活體內二者，可評價促致耐受性抗原呈遞。
「2型」或「M2樣」單核球及/或巨噬細胞係能夠有助於抗發炎反應之單核球及/或巨噬細胞，其特徵在於下列各項中之至少一者：藉由分泌至少一種抗發炎細胞介素來產生抗發炎刺激物，在其表面上表現至少一種細胞表面抑制分子/抑制分子配體，募集/引導至少一種其他細胞/與其相互作用以刺激抗發炎反應，呈遞促致耐受性背景中之抗原，遷移至容許致耐受性反應開始之部位，或開始表現至少一種預計產生促致耐受性/抗發炎功能性之基因。在某些實施例中，可以諸多熟知方式(包含(但不限於)與上述1型促發炎狀態量測相反者)來量測朝向促發炎狀態之該調節。
具有「增加之發炎表型」之細胞係在調節本發明之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之後具有與以下相關的較大促發炎反應能力者：a)所列示1型準則中之一或多者之增加；及/或b)所列示2型準則中之一或多者之降低，該調節係(例如)接觸調節本發明之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之藥劑。
具有「降低之發炎表型」之細胞係在調節本發明之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之後具有與以下相關的較大抗發炎反應能力者：a)所列示1型準則中之一或多者之降低；及/或b)所列示2型準則中之一或多者之增加，該調節係(例如)接觸調節本發明之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之藥劑。
因此，巨噬細胞可採用具有介於1型狀態與2型狀態之間之中間表型之替代活化狀態的連續功能狀態(例如參見Biswas等人(2010)Nat. Immunol . 11: 889-896；Mosser及Edwards (2008)Nat. Rev. Immunol . 8:958-969；Mantovani等人(2009)Hum. Immunol. 70:325-330)，且可如上文所闡述來測定該等增加或降低之發炎表型。
如本文中所使用，術語「替代活化之巨噬細胞」或「替代活化狀態」係指除經典活化之M1促發炎巨噬細胞外之基本上所有類型之巨噬細胞群體。最初，替代活化狀態僅指定為M2型抗發炎巨噬細胞。該術語擴展至包含所有其他替代活化狀態之巨噬細胞，其生物化學、生理學及功能性具有顯著差異。
舉例而言，一類替代活化之巨噬細胞係涉及傷口癒合者。因應於在組織損傷(例如手術傷口)期間釋放之先天性及適應性信號(例如由嗜鹼性球及肥大細胞產生之IL-4)，可活化組織駐留型巨噬細胞以促進傷口癒合。傷口癒合巨噬細胞並不產生高含量之促發炎細胞介素，而分泌大量細胞外基質組分(例如幾丁質酶及幾丁質酶樣蛋白YM1/CHI3L3、YM2、AMCase及斯塔比林(Stabilin))，所有組分皆展現碳水化合物及基質結合活性且涉及組織修復。
替代活化之巨噬細胞之另一實例涉及調控性巨噬細胞，其可藉由先天性免疫反應及適應性免疫反應誘導。調控性巨噬細胞可有助於免疫調控功能。舉例而言，巨噬細胞可對來自下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸之激素(例如糖皮質激素)作出反應以採用具有經抑制宿主防禦及發炎功能(例如抑制促發炎細胞介素之轉錄)之狀態。調控性巨噬細胞可產生調控性細胞介素TGF-β以減弱某些條件中(例如在適應性免疫反應晚期)之免疫反應。許多調控性巨噬細胞可表現高含量之共刺激分子(例如CD80及CD86)且由此增強至T細胞之抗原呈遞。
許多刺激物/因子可誘導調控性巨噬細胞之極化。該等因子可包含(但不限於) TLR激動劑及免疫複合物之組合、細胞凋亡細胞、IL-10、前列腺素、GPcR配體、腺苷、多巴胺(dopamine)、組胺、神經鞘胺醇1-磷酸鹽、黑皮質素、血管作用腸肽及Siglec-9。一些病原體(例如寄生蟲、病毒及細菌)可特異性誘導調控性巨噬細胞之分化，從而產生缺陷性病原體殺死以及經感染微生物之增強之存活及擴傳播。
調控性巨噬細胞具有一些公有特徵。舉例而言，調控性巨噬細胞需要兩種刺激物來誘導其抗發炎活性。亦觀察到由不同因子/刺激物誘導之調控性巨噬細胞亞群體具有差異，從而反映了其異質性。
調控性巨噬細胞亦係巨噬細胞之異質群體，包含發現於代謝中、發育期間、穩態維持中之各種亞群體。在一實例中，替代活化之巨噬細胞之亞群體係具有獨特免疫調控性質之免疫調控性巨噬細胞，其可在M-CSF/GM-CSF、CD16配體(例如免疫球蛋白)及IFN-γ存在下誘導(PCT申請案公開案第WO2017/153607號)。
組織中之巨噬細胞可在活體內隨時間改變其活化狀態。此動態性反映了遷移中巨噬細胞至組織之恆定流入、活化巨噬細胞之動態變化及切換回靜止狀態之巨噬細胞。在一些條件中，環境中之不同信號可誘導巨噬細胞變成不同活化狀態之混合物。舉例而言，在具有慢性傷口之條件中，巨噬細胞可隨時間包含促發炎活化亞群體、促傷口癒合性巨噬細胞及展現一定促消退活性之巨噬細胞。在非病理學條件下，免疫刺激性巨噬細胞及免疫調控性巨噬細胞之平衡群體存在於免疫系統中。在一些疾病條件中，平衡被中斷且不平衡引起許多臨床病狀。
巨噬細胞之表觀可塑性亦使得其易於對其接收於疾病條件中之環境因子具有反應。巨噬細胞可因應於各種疾病條件發生再極化，從而顯示不同特性。一實例係被吸引且自末梢血單核球濾液浸入腫瘤組織中之巨噬細胞，其通常稱為「腫瘤相關性巨噬細胞」 (「TAM」)或「腫瘤浸潤性巨噬細胞」 (「TIM」)。腫瘤相關性巨噬細胞係腫瘤中之最豐富發炎細胞且對於大部分癌症而言在高TAM密度與較差預後之間發現顯著關聯(Zhang等人(2012)PloS One 7:e50946.10.1371/journal.pone.0050946)。
TAM係M1樣促發炎亞群體及M2樣抗發炎亞群體之混合群體。在贅瘤形成之最早期，具有促發炎表型之經典活化之巨噬細胞存在於常氧腫瘤區域中，且視為有助於經轉變腫瘤細胞之早期清除。然而，隨著腫瘤有所生長及進展，晚期腫瘤中之大部分TAM係駐留於腫瘤之低氧區域中之M2樣調控性巨噬細胞。巨噬細胞之此表型變化受腫瘤微環境刺激物(例如腫瘤細胞外基質、缺氧環境及由腫瘤細胞分泌之細胞介素)顯著影響。M2樣TAM顯示傷口癒合性巨噬細胞及調控性巨噬細胞之混合活化狀態，從而證實具有各種獨特特性，包含產生高含量IL-10但產生極少IL-12、產生缺陷性TNF、抑制抗原呈遞細胞及有助於腫瘤血管生成。
通常，TAM之特徵在於M2表型且經由IL-10及IL-1β產生來抑制M1巨噬細胞介導之發炎。因此，TAM經由活化傷口癒合(亦即抗發炎)路徑(其提供用於增殖及侵襲之營養物及生長信號)來促進腫瘤生長及轉移且促進產生新血管(亦即血管生成)。另外，TAM藉由分泌抗發炎信號來有助於免疫抑制性腫瘤微環境，該等抗發炎信號可防止免疫系統之其他組分識別並攻擊腫瘤。已報導，在許多類型之癌症(例如乳癌、星形細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌症、II型乳頭狀腎細胞癌、肺癌、胰臟癌、膽囊癌、直腸癌、神經膠質瘤、經典何傑金氏淋巴瘤、卵巢癌及結腸直腸癌)中，TAM在促進癌症生長、增殖及轉移方面發揮關鍵作用。一般而言，特徵在於大群體TAM之癌症與較差疾病預後有關。
若不適當調控，則各種功能及活化狀態可具有危險結果。舉例而言，若過度活化，則經典活化之巨噬細胞可對宿主組織引起損害，易於損害環繞組織且影響葡萄糖代謝。
在許多疾病條件中，巨噬細胞活化狀態之平衡動力學被打破且不平衡會引起疾病。舉例而言，腫瘤大量聚集巨噬細胞。巨噬細胞可發現於75%之癌症中。攻擊型癌症通常與巨噬細胞及其他免疫細胞之較高浸潤有關。在大部分惡性腫瘤中，TAM施加若干腫瘤促進功能，包含促進癌細胞存活、增殖、侵襲、外滲及轉移，刺激血管生成，重塑細胞外基質，及抑制抗腫瘤免疫性(Qian及Pollard, 2010,Cell , 141(1): 39-51)。其亦可產生生長促進分子，例如鳥胺酸、VEGF、EGF及TGF-β。
TAM因應於腫瘤微環境中所遇到之CSF1及IL4/IL13而刺激腫瘤生長及存活。TAM亦可經由表現蛋白酶(例如MMP、細胞自溶酶及uPA)及基質重塑酶(例如離胺醯基氧化酶及SPARC)來重塑腫瘤微環境。
TAM在調控腫瘤組織中之顯著血管增加之腫瘤血管生成中發揮重要作用，腫瘤血管生成係轉變腫瘤之惡性狀態所需。該等血管生成性TAM表現血管生成素受體TIE2且分泌許多血管生成分子(包含VEGF家族成員、TNFα、IL1β、IL8、PDGF及FGF)。
各種巨噬細胞亞群體實施該等個別促腫瘤功能。該等TAM在不同腫瘤類型中具有不同之巨噬細胞浸潤程度以及表型。舉例而言，人類肝細胞癌之詳細剖析展示根據解剖位置以及促腫瘤及抗腫瘤性質來定義之各種巨噬細胞亞型。已展示，M2樣巨噬細胞係TAM之促腫瘤功能之主要來源。M2樣TAM已展示可影響抗癌治療效能，有助於療法抗性，且在習用癌症療法後介導腫瘤復發。
III. 可用於調節單核球及 / 或巨噬細胞發炎表型之靶及生物標記物 本發明涵蓋可用於調節單核球及/或巨噬細胞之發炎表型以及相應免疫反應(例如用以增加抗癌巨噬細胞免疫療法)之生物標記物(例如表1及表2中所列示之靶)。
表1提供靶之基因資訊，其中其下調(例如藉由下調靶之藥劑，如本文所闡述之抗體、siRNA及諸如此類)涉及且產生增加之發炎表型(例如1型表型)。
表2提供靶之基因資訊，其中其下調(例如藉由下調靶之藥劑，如本文所闡述之抗體、siRNA及諸如此類)涉及且產生降低之發炎表型(例如2型表型)。
本發明所涵蓋基因座及生物標記物(例如表1及2中所列示之生物標記物)之核酸及胺基酸序列資訊為業內所熟知且易於在可公開獲得之資料庫(例如國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))中獲得。舉例而言，下文提供源自可公開獲得之序列資料庫之實例性核酸及胺基酸序列。
如下文進一步所論述，調節單核球及/或巨噬細胞中之本發明所涵蓋生物標記物之表現、轉譯、降解、量、亞細胞局部化及其他活性之藥劑可用於調節該等細胞之發炎表型以及調節由該等細胞調介之免疫反應。
儘管下文提供人類序列之諸多代表性異種同源物，但在一些實施例中，人類生物標記物(包含其調節及調節劑)係較佳的。對於一些生物標記物而言，據信，人類中由該等生物標記物調介之免疫反應尤其可用於考量人類免疫系統與其他脊椎動物之免疫系統之間的差異。
術語「SIGLEC9」係指結合唾液酸之Ig樣凝集素9，其係調介唾液酸依賴性細胞結合之假定黏附分子。SIGLEC9優先結合至α-2,3-或α-2,6-連接之唾液酸。唾液酸識別位點可由與相同細胞表面上之唾液酸之順式相互作用遮蔽。相關路徑係先天性免疫系統及種類I MHC調介之抗原處理及呈遞。在一些實施例中，位於人類中之染色體19q上之SIGLEC9基因由12個外顯子組成。已知來自黑猩猩、恒河猴及小鼠之異種同源物。生成稱為Siglectm1Croc 之經敲除小鼠系(McMillan等人(2013)Blood 121(11):2084-2094)。在一些實施例中，人類SIGLEC9蛋白具有463個胺基酸及/或具有50082 Da之分子質量。在一些實施例中，SIGLEC9蛋白含有一個拷貝之稱為免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)之細胞質基序。此基序參與調節細胞反應。經磷酸化ITIM基序可結合若干含SH2磷酸酶之SH2結構域。
術語「SIGLEC9」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類SIGLEC9 cDNA及人類SIGLEC9蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/27180)。舉例而言，已知至少兩種不同人類SIGLEC9同種型。人類SIGLEC9同種型1 (NP_001185487.1)可由轉錄物變體1 (NM_001198558.1，其係較長轉錄物)編碼。人類SIGLEC9同種型2 (NP_055256.1)可由轉錄物變體2 (NM_014441.2)編碼，其3' UTR及3'編碼區不同於同種型1。經編碼同種型2較短且具有不同於同種型1之C-末端。除人類外之生物體中之SIGLEC9異種同源物之核酸及多肽序列眾所周知且包含(例如)黑猩猩SIGLEC9 (XM_024351618.1及XP_024207386.1及XM_003316566.5及XP_003316614.2)、恒河猴SIGLEC9 (XM_015124691.1及XP_014980177.1、XM_001114560.3及XP_001114560.2、XM_015124692.1及XP_014980178.1)及小鼠SIGLEC9 (NM_031181.2及NP_112458.2)。SIGLEC9異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測SIGLEC9蛋白之抗SIGLEC9抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體MAB1139及AF1139 (R&D systems, Minneapolis, MN)、抗體MAB1139、NBP1-47969、AF1139、NBP2-27070及NBP1-85755 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab89484、ab96545及ab197981 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體編號：CF500382及TA500382 (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗SIGLEC9抗體及包含(例如)闡述於美國專利公開案US20170306014、US20190085077、US20190023786及US20180244770中者。另外，用於檢測SIGLEC9表現之試劑已眾所周知。多個SIGLEC9臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000547533.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小SIGLEC9表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR309022、shRNA產品編號TG309443、TL309443及CRISPR產品編號KN206674、來自Santa Cruz之CRISPR gRNA產品(sc-406675及sc-406675-KO-2)及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-106550及sc-153462)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對SIGLEC9分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之SIGLEC9分子。
術語「VSIG4」係指含V-Set及免疫球蛋白結構域蛋白4，其係與免疫調控蛋白之B7家族結構相關之含v-set及免疫球蛋白結構域蛋白。VSIG4蛋白係T細胞反應之負性調控劑。其亦係補體組分3片段C3b及iC3b之受體。VSIG4蛋白係吞噬受體以及T細胞增殖及IL2產生之強負性調控劑。其亦係替代補體路徑轉化酶之強力抑制劑。與VSIG4有關之疾病包含富集T細胞/組織細胞之大B細胞淋巴瘤及朗格漢斯細胞肉瘤。其相關路徑係補體及凝血級聯。在一些實施例中，位於人類染色體Xq上之VSIG4基因由8個外顯子組成。已知來自黑猩猩、恒河猴、狗、小鼠及大鼠之異種同源物。存在經敲除小鼠系，包含Vsig4tm1Gne (Helmy等人(2006)Cell 124:915-927)及Vsig4tm1b(EUCOMM)Hmgu (Skarnes等人(2011)Nature 474:337-342)。在一些實施例中，人類VSIG4蛋白具有399個胺基酸及/或43987 Da之分子質量。
術語「VSIG4」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類VSIG4 cDNA及人類VSIG4蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/11326)。舉例而言，已知至少5種不同人類VSIG4同種型。人類VSIG4同種型1 (NP_009199.1)可由轉錄物變體1 (NM_007268.2，其係最長轉錄物)編碼。人類VSIG4同種型2 (NP_001093901.1)可由轉錄物變體2 (NM_001100431.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏交替框內區段。人類VSIG4同種型3 (NP_001171760.1)可由轉錄物變體3 (NM_001184831.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比具有多個差異。人類VSIG4同種型4 (NP_001171759.1)可由轉錄物變體4 (NM_001184830.1)編碼，該轉錄物變體與變體1之差異在於3' UTR及3'編碼區。人類VSIG4同種型5 (NP_001244332.1)可由轉錄物變體5 (NM_001257403.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏3'編碼區中之兩個交替框內外顯子。除人類外之生物體中之VSIG4異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩VSIG4 (NM_001279873.1及NP_001266802.1)、恒河猴VSIG4 (XM_015127596.1及XP_014983082.1、XM_015127593.1及XP_014983079.1、XM_015127595.1及XP_014983081.1、XM_001099264.2及XP_001099264.2及XM_015127594.1及XP_014983080.1)、狗VSIG4 (XM_005641424.3及XP_005641481.1；XM_005641423.3及XP_005641480.1；XM_022416007.1及XP_022271715.1；XM_005641421.3及XP_005641478.1；及XM_005641422.3及XP_005641479.1)、小鼠VSIG4 (NM_177789.4及NP_808457.1)及大鼠VSIG4 (NM_001025004.1及NP_001020175.1)。VSIG4異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測VSIG4蛋白之抗VSIG4抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體AF4646及AF4674 (R&D systems, Minneapolis, MN)、抗體NBP1-86843、AF4646、AF4674及NBP1-69631 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab56037、ab197161及ab138594 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA346124 (Origene, Rockville, MD)、抗體05及202 (Sino Biological, Beijing, China)等。亦已知其他抗VSIG4抗體且包含(例如)闡述於美國專利公開案US20090162356A1及US20180371095A1中者。另外，用於檢測VSIG4表現之試劑已眾所周知。多個VSIG4臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000544515.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小VSIG4表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR323415、shRNA產品編號TG308440、TL308440、TF308440及CRISPR產品編號KN203751、來自Applied Biological Materials (K7367508)及來自Santa Cruz (sc-404067)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-72190及sc-72196)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對VSIG4分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之VSIG4分子。
術語「CD74」係指CD74。由此基因編碼之蛋白質與種類II主要組織相容性複合物(MHC)締合且係調控用於免疫反應之抗原呈遞之重要伴護蛋白。其亦用作細胞介素巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)之細胞表面受體，該因子在結合至所編碼蛋白質時會引發存活路徑及細胞增殖。CD74蛋白亦與類澱粉前體蛋白(APP)相互作用且抑制類澱粉β (Abeta)之產生。另外，藉由穩定呈複合物形式之無肽種類II α/β異二聚體(在其合成之後不久)且引導該複合物自內質網傳輸至胞內體/溶酶體系統(在此發生抗原處理且抗原性肽結合至MHC種類II)，CD74蛋白在MHC種類II抗原處理中發揮關鍵作用。CD74蛋白用作細胞介素MIF之細胞表面受體。與CD74有關之疾病包含未分化多形性肉瘤及外套細胞淋巴瘤。其相關路徑係對升高之血小板胞質Ca2+ 及先天性免疫系統之反應。在一些實施例中，位於人類中之染色體5q上之CD74基因由9個外顯子組成。已知來自黑猩猩、恒河猴、狗、小鼠、大鼠、雞及青蛙之異種同源物。存在經敲除小鼠系，包含CD74tm1Doi (Viville等人(1993)Cell 72:635-648)、CD74tm1Liz (Bikoff等人(1993)J Exp Med 177:1699-1712)、CD74tm1Eae (Elliott等人(1994)J Exp Med 179:681-694)及CD74tm1Anjm (Barlow等人(2010)Nat Med 16:59-66)及CD74tm2Liz (Takaesu等人(1995)Immunity 3:385-396)。在一些實施例中，人類CD74蛋白具有296個胺基酸及/或33516 Da之分子質量。在一些實施例中，CD74蛋白含有MHC2-相互作用結構域、種類II MHC相關性不變鏈三聚結構域及甲狀腺球蛋白類型I重複。
術語「CD74」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CD74 cDNA及人類CD74蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/972)。舉例而言，已知至少三種不同人類CD74同種型。人類CD74同種型A (NP_001020330.1)可由轉錄物變體1 (NM_001025159.2，其係最長轉錄物)編碼。人類CD74同種型B (NP_004346.1)可由轉錄物變體2 (NM_004355.3)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏3'編碼區中之框內外顯子。人類CD74同種型C (NP_001020329.1)可由轉錄物變體3 (NM_001025158.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏3'編碼區中之三個連續外顯子，從而產生框移。除人類外之生物體中之CD74異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CD74 (NM_001144836.1及NP_001138308.1)、恒河猴CD74 (XM_015141237.1及XP_014996723.1及XM_015141236.1及XP_014996722.1)、狗CD74 (XM_536468.7及XP_536468.5；及XM_005619298.3及XP_005619355.1)、小鼠CD74 (NM_001042605.1及NP_001036070.1；及NM_010545.3及NP_034675.1)、大鼠CD74 (NM_013069.2及NP_037201.1)、雞CD74 (XM_015293754.2及XP_015149240.1)及青蛙CD74 (NM_001197110.1及NP_001184039.1)。CD74異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測CD74蛋白之抗CD74抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體AF3590及MAB35901 (R&D systems, Minneapolis, MN)、抗體NBP2-29465、NBP2-66762、NBP1-33109及NBP1-85225 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab9514、ab22603及ab108393 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：CF507339及TA507339 (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗CD74抗體且包含(例如)闡述於美國專利公開案US20140030273、US20170173151、US7312318及US20170253656中者。另外，用於檢測CD74表現之試劑已眾所周知。多個CD74臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000532717.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CD74表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR300649、shRNA產品編號TR314068、TL314068、TG314068及CRISPR產品編號KN205824、來自Applied Biological Materials (K6656308)及來自Santa Cruz (sc-400279)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目標編號sc-35023及sc-42802)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CD74分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CD74分子。
術語「CD207」係指CD207。CD207蛋白僅表現於朗格漢斯細胞中，該等細胞係表皮及黏膜之不成熟樹突狀細胞。其局部化於伯貝克顆粒(Birbeck granule)中，伯貝克顆粒係存在於朗格漢斯細胞之細胞質中且由疊加及拉鍊膜組成之細胞器。其係具有甘露糖結合特異性之C型凝集素，且已提出，甘露糖結合CD207蛋白可使抗原內化至伯貝克顆粒中且進入非經典抗原處理路徑。CD207突變導致伯貝克顆粒缺陷或糖結合活性損失。另外，CD207蛋白係顯示甘露糖結合特異性之鈣依賴性凝集素。CD207蛋白誘導形成伯貝克顆粒(BG)且係膜疊加及拉鍊之強力調控劑。CD207蛋白結合至硫酸化以及甘露糖基化聚醣、硫酸角質素(KS)及β-聚醣，促進抗原攝取，且涉及呈遞至T細胞之抗原之路由及/或處理。CD207係念珠菌(Candida)屬、酵母菌屬(Saccharomyces)屬及糠秕馬拉色菌(Malassezia furfur)之原代朗格漢斯細胞上之主要受體。CD207抵抗人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)感染。其結合至存在於套膜醣蛋白上之高甘露糖結構，隨後使病毒靶向伯貝克顆粒，從而使病毒快速降解。與CD207有關之疾病包含伯貝克顆粒缺陷及朗格漢斯細胞組織細胞增生症。其相關路徑係先天性免疫系統及種類I MHC調介之抗原處理及呈遞。在一些實施例中，位於人類中之染色體2p上之CD207基因由10個外顯子組成。已知來自黑猩猩、恒河猴、牛、小鼠、大鼠及青蛙之異種同源物。存在經敲除小鼠系，包含CD207tm1Mal (Kissenpfennig等人(2005)Mol Cell boil 25:88-99)及CD207tm1.1Cfg (Orr等人(2013)Glycobiology 23:363-380)。在一些實施例中，人類CD207蛋白具有328個胺基酸及/或36725 Da之分子質量。在一些實施例中，CD207蛋白含有Rad50鋅鉤基序及C型凝集素樣結構域。C型凝集素結構域調介硫酸化及甘露糖基化聚醣之雙重識別。
術語「CD207」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CD207 cDNA及人類CD207蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/50489)。舉例而言，人類CD207 (NP_056532.4)可由轉錄物(NM_015717.4)編碼。除人類外之生物體中之CD207異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CD207 (XM_016945490.2及XP_016800979.1)、恒河猴CD207 (XM_001100466.3及XP_001100466.2)、牛CD207 (XM_015473414.2及XP_015328900.2)及小鼠CD207 (NM_144943.3及NP_659192.2)、大鼠CD207 (NM_013069.2及NP_037201.1)。CD207異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測CD207之抗CD207抗體蛋白為業內所熟知且包含(例如)抗體AF2088、BAF2088、及MAB2088 (R&D systems, Minneapolis, MN)、抗體DDX0362P-100、DDX0363P-100、DDX0361P-100及NB100-56733 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab192027 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA336470及TA349377 (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測CD207表現之試劑已眾所周知。多個CD207臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000516372.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CD207表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR309386、shRNA產品編號TL305520V、TR305520、TG305520、TF305520、TL305520及CRISPR產品編號KN204669、來自Applied Biological Materials (K4909208)及來自Santa Cruz (sc-401949)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-43888及sc-43889)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CD207分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CD207分子。
術語「LRRC25」係指富含白胺酸重複蛋白25。LRRC25基因廣泛表現於組織(包含脾及骨髓)中。LRRC25蛋白可參與活化具有先天性免疫性及獲得性免疫性之細胞。其在CD40活化之單核球源樹突狀細胞中有所下調。與LRRC25有關之疾病包含暫時性完全性遺忘。在一些實施例中，位於人類中之染色體19p上之LRRC25基因由3個外顯子組成。已知來自黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠及大鼠之異種同源物。在一些實施例中，人類LRRC25蛋白具有305個胺基酸及/或33179 Da之分子質量。在一些實施例中，LRRC25蛋白含有兩個拷貝之富白胺酸重複及GRB2結合適配體。
術語「LRRC25」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類LRRC25 cDNA及人類LRRC25蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/126364)。舉例而言，人類LRRC25 (NP_660299.2)可由轉錄物(NM_145256.2)編碼。除人類外之生物體中之LRRC25異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩LRRC25 (XM_009435028.3及XP_009433303.1；及XM_001173930.6及XP_001173930.1)、恒河猴LRRC25 (XM_001114428.3及XP_001114428.1)、狗LRRC25 (XM_847238.5及XP_852331.3；及XM_014122405.2及XP_013977880.1)、牛LRRC25 (XM_005208421.4及XP_005208478.1)、小鼠LRRC25 (NM_153074.3及NP_694714.1)及大鼠LRRC25 (XM_573882.6及XP_573882.1；XM_006252977.3及XP_006253039.1；XM_008771187.2及XP_008769409.1；XM_006252978.3及XP_006253040.1；及XM_008771188.2及XP_008769410.1)。LRRC25異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測LRRC25蛋白之抗LRRC25抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX45692 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-514216 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體NBP2-03747、NBP1-83476及NBP2-45673 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab84954 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA504941及CF504941 (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測LRRC25表現之試劑已眾所周知。多個LRRC25臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000541158.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小LRRC25表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR325688、shRNA產品編號TL303467、TR303467、TG303467、TF303467、TL303467V及CRISPR產品編號KN209911、來自Applied Biological Materials (K3598208)及來自Santa Cruz (sc-414270)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-97675及sc-149064)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對LRRC25分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之LRRC25分子。
術語「SELPLG」或「PSGL1」係指選擇素P配體，其係用作表現於骨髓樣細胞及經刺激T淋巴球上之細胞黏附分子P-選擇素、E-選擇素及L-選擇素之高親和力反受體之一種醣蛋白。因此，藉由使白血球結合至活化血小板或內皮表現選擇素，SELPLG蛋白在發炎期間之白血球輸送中發揮關鍵作用。SELPLG蛋白具有用於其高親和力結合活性之兩種轉譯後修飾，亦即酪胺酸硫酸化及將唾液醯基路易斯(Lewis) x四醣(sLex)添加至其O-連接聚醣中。SELPLG之異常表現及SELPLG中之多型性與先天性免疫反應及適應性免疫反應中之缺陷有關。SELPLG係SLe(x)型蛋白多糖，其經由與E-選擇素、P-選擇素及L-選擇素之高親和力、鈣依賴性相互作用調介在初始發炎步驟期間血管表面上之白血球之快速滾動。SELPLG對於初始白血球捕獲至關重要。在一些實施例中，位於人類中之染色體12q上之SELPLG基因由3個外顯子組成。已知來自黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠及大鼠之異種同源物。存在經敲除小鼠系，包含  Selplgtm2Rpmc (Miner等人(2008)Blood 112:2035-2045)、Selplgtm1Fur (Yang等人(1999)J Exp Med 190:1769-1782)及Selplgtm1Rpmc (Xia等人(2002)J Clin Invest 109:939-950)。在一些實施例中，人類SELPLG蛋白具有412個胺基酸及/或43201 Da之分子質量。在一些實施例中，SELPLG蛋白含有核糖核酸酶E/G家族結構域及/或可在微生物感染期間用作腸病毒71之受體。SELPLG之已知結合配偶體包含(例如) P-選擇素、E-選擇素及L-選擇素、SNX20、MSN及SYK。
術語「SELPLG」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類SELPLG cDNA及人類SELPLG蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/6404)。舉例而言，已知至少兩種不同人類SELPLG同種型。人類SELPLG同種型1 (NP_001193538.1)可由轉錄物變體1 (NM_001206609.1，其係較長轉錄物)編碼。人類SELPLG同種型2 (NP_002997.2)可由轉錄物變體2 (NM_003006.4)編碼，該轉錄物變體與變體1之區別在於在5' UTR中缺乏5'編碼區之一部分，且在下游起始密碼子處引發轉譯。所編碼同種型2與同種型1相比具有較短N-末端。除人類外之生物體中之SELPLG異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩SELPLG (XM_016924121.2及XP_016779610.1)、恒河猴SELPLG (XM_015152715.1及XP_015008201.1；及XM_015152716.1及XP_015008202.1)、狗SELPLG (NM_001242719.1及NP_001229648.1)、牛SELPLG (NM_001037628.2及NP_001032717.2；及NM_001271160.1及NP_001258089.1)、小鼠SELPLG (NM_009151.3及NP_033177.3)及大鼠SELPLG (NM_001013230.1及NP_001013248.1)。SELPLG異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測SELPLG蛋白之抗SELPLG抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX19793、GTX54688及GTX34468 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-365506及sc-398402 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體MAB9961、MAB996、NBP2-53344及AF3345 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab68143、ab66882及ab110096 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA349432及TA338245 (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗SELPLG抗體且包含(例如)闡述於美國專利公開案US20130209449、US20170190782A1及US20070160601A1以及美國專利第US7833530B2號及第US9487585B2號中者。另外，用於檢測SELPLG表現之試劑已眾所周知。多個SELPLG臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000547735.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小SELPLG表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR321732、shRNA產品編號TL309563、TR309563、TG309563、TF309563、TL309563V及CRISPR產品編號KN206507、來自Applied Biological Materials (K6134408)及來自Santa Cruz (sc-401534)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-36323及sc-42833)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對SELPLG分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之SELPLG分子。
術語「AIF1」係指同種移植物發炎因子1，其係結合肌動蛋白及鈣之一種蛋白質。AIF1基因係由細胞介素及干擾素誘導且可促進巨噬細胞活化以及血管平滑肌細胞及T淋巴球之生長。AIF1中之多型性可與全身性硬化有關。AIF1係增強膜邊緣波動及RAC活化之肌動蛋白結合蛋白。其增強LCP1之肌動蛋白集束活性，結合鈣，且在RAC信號傳導及吞噬作用中發揮作用。AIF1促進血管平滑肌細胞及T淋巴球之增殖，增強淋巴球遷移，且在血管發炎中發揮作用。與AIF1有關之疾病包含慢性發炎性去髓鞘型多發性神經病變及急性腹瀉。其相關路徑係脊髓損傷。在一些實施例中，位於人類中之染色體6p上之AIF1基因由6個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，包含Aif1tm1.1(KOMP)Wtsi (Dickinson等人(2016)Nature 537:208-514)及Aif1tm1Nsib (Casimiro等人(2013)Genesis 51:734-740)。在一些實施例中，人類AIF1蛋白具有147個胺基酸及/或16703 Da之分子質量。在一些實施例中，AIF1蛋白含有五EF手(PEF)家族結構域。AIF1之已知結合配偶體包含(例如) LCP1。
術語「AIF1」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類AIF1 cDNA及人類AIF1蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/199)。舉例而言，已知至少兩種不同人類AIF1同種型。人類AIF1同種型1 (NP_001305899.1及NP_116573.1)可由轉錄物變體1 (NM_032955.2)及轉錄物變體4 (NM_001318970.1)編碼。人類AIF1同種型3 (NP_001614.3)可由轉錄物變體3 (NM_001623.4，其編碼最長同種型)編碼。轉錄物變體1與變體3之區別在於在5' UTR中缺乏5'編碼區之一部分，且在下游起始密碼子處引發轉譯。轉錄物變體4與變體3相比在5'區中使用交替剪接位點且在下游起始密碼子處引發轉譯。變體1及4編碼相同同種型1，該同種型之N-末端短於同種型3。除人類外之生物體中之AIF1異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩AIF1 (XM_009450914.2及XP_009449189.2；XM_009450910.2及XP_009449185.2；XM_001154743.5及XP_001154743.1；XM_009450908.3及XP_009449183.1；及XM_024357095.1及XP_024212863.1)、恒河猴AIF1 (NM_001047118.1及NP_001040583.1)、狗AIF1 (XM_532072.6及XP_532072.2)、牛AIF1 (NM_173985.2及NP_776410.1)、小鼠AIF1 (NM_001361501.1及NP_001348430.1；NM_001361502.1及NP_001348431.1；NM_019467.3及NP_062340.1)及大鼠AIF1 (NM_017196.3及NP_058892.1)。AIF1異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測AIF1蛋白之抗AIF1抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX100042、GTX101495及GTX632426 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-32725及sc-398406 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體NB100-1028、NBP2-19019、NBP2-16908及NB100-2833 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab5076、ab178847及ab48004 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：AP08793PU-N及AP08912PU-N (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測AIF1表現之試劑已眾所周知。多個AIF1臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000542089.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小AIF1表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR300138、shRNA產品編號TL314878、TR314878、TG314878、TF314878、TL314878V及CRISPR產品編號KN203154、來自Applied Biological Materials (K6902508)及來自Santa Cruz (sc-400513)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-36323及sc-42833)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對AIF1分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之AIF1分子。
術語「CD84」係指CD84分子，其係作為信號傳導淋巴球活化分子(SLAM)家族之成員之膜醣蛋白。此家族形成較大CD2細胞表面受體Ig超家族之子組。所編碼蛋白質係表現於諸多免疫細胞類型中之嗜同性黏附分子且參與調控彼等細胞中之受體調介之信號傳導。與CD84有關之疾病包含慢性淋巴球性白血病。其相關路徑係對升高之血小板胞質 ca2+之反應及血管壁處之細胞表面相互作用。在一些實施例中，位於人類中之染色體1q上之CD84基因由9個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，包含Cd84tm1Beni (Hofmann等人(2014)Plos One 9:e115306)、                Cd84tm1b(KOMP)Mbp (Dickinson等人(2016)Nature 537:508-514)及      Cd84tm1Pls (Cannnons等人(2010)Immunity 32:253-265)。在一些實施例中，人類CD84蛋白具有345個胺基酸及/或38782 Da之分子質量。在一些實施例中，CD84蛋白含有N-末端免疫球蛋白(Ig)樣結構域及免疫球蛋白結構域。CD84係信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM)家族之自身配體受體。由同型或異型細胞-細胞相互作用觸發之SLAM受體調節眾多種免疫細胞之活化及分化且由此參與調控及互聯先天性免疫反應及適應性免疫反應。藉由存在或不存在小細胞質適配體蛋白SH2D1A/SAP及/或SH2D1B/EAT-2來控制活性。CD84可依賴於SH2D1A及SH2D1B來介導天然殺手(NK)細胞之細胞毒性。CD84增加經活化T細胞之增殖性反應且SH2D1A/SAP似乎並非此過程所需。CD84之嗜同性相互作用增強淋巴球中之干擾素γ/IFNG分泌且經由SH2D1A依賴性路徑誘導血小板刺激。CD84可用作造血祖細胞之標記物(Martin等人(2001)J Immunol 167:3668-3676)。需要CD84來達成延長T細胞:B細胞接觸、最佳T濾泡性輔助功能及生髮中心形成。在生髮中心中，CD84參與維持B細胞耐受性及防止自體免疫性。在肥大細胞中，CD84負性調控高親和力免疫球蛋白ε受體信號傳導(Alvarez-Errico等人(2011)J Immunol 187:5577-5586)。
術語「CD84」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CD84 cDNA及人類CD84蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/8832)。舉例而言，已知至少5種不同人類CD84同種型。人類CD84同種型1 (NP_001171808.1)可由轉錄物變體1 (NM_001184879.1，其係最長轉錄物)編碼。人類CD84同種型2 (NP_003865.1)可由轉錄物變體2 (NM_003874.3)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏交替框內區段。人類CD84同種型3 (NP_001171810.1)可由轉錄物變體3 (NM_001184881.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏兩個交替區段，一個交替區段可使閱讀框移位。人類CD84同種型4 (NP_001171811.1)可由轉錄物變體4 (NM_001184882.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏兩個交替區段。人類CD84同種型5 (NP_001317671.1)可由轉錄物變體5 (NM_001330742.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比使用交替框內剪接點。除人類外之生物體中之CD84異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CD84 (XM_016930506.2及XP_016785995.1；及XM_001172059.4及XP_001172059.1)、恒河猴CD84 (XM_001117595.3及XP_001117595.1、XM_015113569.1及XP_014969055.1及XM_015113561.1及XP_014969047.1)、狗CD84 (XM_022415343.1及XP_022271051.1；及XM_005640884.3及XP_005640941)、牛CD84 (XM_024989885.1及XP_024845653.1；XM_024989884.1及XP_024845652.1；XM_010802802.3及XP_010801104.1；XM_010802805.3及XP_010801107.1；XM_024989882.1及XP_024845650.1；XM_024989883.1及XP_024845651.1；及XM_024989886.1及XP_024845654.1)、小鼠CD84 (NM_013489.3及NP_038517.1；NM_001252472.1及NP_001239401.1；及NM_001289470.1及NP_001276399.1)及大鼠CD84 (NM_001192006.1及NP_001178935.1)。CD84異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1及表2中，此乃因(如本文所證實) CD84可端視背景差異性影響單核球及/或巨噬細胞以使其更具促發炎性或更具抗發炎性。
適於檢測CD84蛋白之抗CD84抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX32506、GTX75849及GTX75851 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-39821及sc-70810 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體MAB1855、AF1855、NBP2-49635及NB100-65929 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab131256、ab202841及ab176513 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：SM1845R及SM1845PT (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗CD84抗體且包含(例如)闡述於美國專利公開案US20140147451A1、US20170260270A1及US20180327493中者。另外，用於檢測CD84表現之試劑已眾所周知。多個CD84臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000532250.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CD84表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR322568、shRNA產品編號TL314062、TR314062、TG314062、TF314062、TL314062V及CRISPR產品編號KN204477、來自Applied Biological Materials (K6196808)及來自Santa Cruz (sc-416482)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-42810及sc-42811)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CD84分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CD84分子。
術語「IGSF6」係指免疫球蛋白超家族成員6。與IGSF6有關之疾病包含減壓性骨壞死及發炎腸病。在一些實施例中，位於人類中之染色體16p上之IGSF6基因由6個外顯子組成。IGSF6完全編碼於轉錄於DNA之相對鏈之METTL9之內含子內。IGSF6局部化至與發炎腸病有關之基因座處。在一些實施例中，人類IGSF6蛋白質具有241個胺基酸及/或27013 Da之分子質量。在一些實施例中，IGSF6含有免疫球蛋白結構域。
術語「IGSF6」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類IGSF6 cDNA及人類IGSF6蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/10261)。舉例而言，人類IGSF6 (NP_005840.2)可由轉錄物變體1 (NM_005849.3)編碼。除人類外之生物體中之IGSF6異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩IGSF6 (XM_001160217.6及XP_001160217.1；及XM_016928690.2及XP_016784179.1)、恒河猴IGSF6 (XM_001093144.3及XP_001093144.1)、狗IGSF6 (XM_005621426.3及XP_005621483.1；XM_005621428.3及XP_005621485.1；及XM_022419960.1及XP_022275668.1)、牛IGSF6 (XM_002697991.6及XP_002698037.1)、小鼠IGSF6 (NM_030691.1及NP_109616.1)、大鼠IGSF6 (NM_133542.2及NP_598226.1)；及雞IGSF6 (NM_001277599.1及NP_001264528.1)。IGSF6異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測IGSF6蛋白質之抗IGSF6抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體sc-377053 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體DDX0220P-100、NBP1-84061、H00010261-M02及H00010261-M01 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab197659 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA322553 (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測IGSF6表現之試劑已眾所周知。多個IGSF6臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000542139.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小IGSF6表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR323049、shRNA產品編號TL312209、TR312209、TG312209、TF312209、TL312209V及CRISPR產品編號KN204717、來自Applied Biological Materials (K7017208)及來自Santa Cruz (sc-411445)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-93333及sc-146192)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對IGSF6分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之IGSF6分子。
術語「CD48」係指CD48分子，其係免疫球蛋白樣受體中包含SLAM (信號傳導淋巴球活化分子)蛋白之CD2亞科之成員。CD48蛋白發現於淋巴球及其他免疫細胞、樹突狀細胞及內皮細胞之表面上，且參與該等細胞中之活化及分化路徑。CD48蛋白不具有跨膜結構域，然而其藉由GPI錨經由可裂解以產生可溶性形式之受體之C-末端結構域保持於細胞表面處。其相關路徑係對升高之血小板胞質Ca2+之反應以及造血幹細胞分化路徑及譜系特異性標記物。在一些實施例中，位於人類中之染色體1q上之CD48基因由5個外顯子組成。在一些實施例中，人類CD48蛋白具有243個胺基酸及/或27683 Da之分子質量。存在稱為CD48tm1Rsr 之經敲除小鼠系(Gonazalez-Cabrero等人(1999)Proc Natl Acad Sci 96:1019-1023)。CD48以異嗜性方式與CD244相互作用。在一些實施例中，CD48蛋白含有一或多個免疫球蛋白樣結構域。
術語「CD48」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CD48 cDNA及人類CD48蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/962)。舉例而言，已知至少兩種不同人類CD48同種型。人類CD48同種型1 (NP_001769.2)可由轉錄物變體1 (NM_001778.3，其係較短轉錄物)編碼。人類CD48同種型2 (NP_001242959.1)可由轉錄物變體2 (NM_001256030.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在3' UTR及編碼區中有所不同。所編碼同種型2長於同種型1且具有不同C-末端。除人類外之生物體中之CD48異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CD48 (XM_009435717.1及XP_009433992.1；及XM_001172145.3及XP_001172145.2)、恒河猴CD48 (XM_015113628.1及XP_014969114.1；XM_015113634.1及XP_014969120.1；及XM_015113619.1及XP_014969105.1)、狗CD48 (XM_545759.6及XP_545759.2；及XM_022415374.1及XP_022271082.1)、牛CD48 (NM_001046002.1及NP_001039467.1)、小鼠CD48 (NM_007649.5及NP_031675.1；及NM_001360767.1及NP_001347696.1)、大鼠CD48 (NM_139103.1及NP_620803.1)；及雞CD48 (NM_001277599.1及NP_001264528.1)。CD48異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1及表2中，此乃因(如本文所證實) CD48可端視背景差異性影響單核球及/或巨噬細胞以使其更具促發炎性或更具抗發炎性。
適於檢測CD48蛋白之抗CD48抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體sc-70719、sc-70718 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體AF3327、AF3644、MAB36441及MAB-3644 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab9185、ab134049、ab119873及ab76904 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA351055、TA320283 (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗CD48抗體且包含(例如)闡述於美國專利第US9097717B2號及美國專利公開案US20120076790、US20130230533及US20180092984中者。另外，用於檢測CD48表現之試劑已眾所周知。多個CD48臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000532164.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CD48表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR300685、shRNA產品編號TL314079、TR314079、TG314079、TF314079、TL314079V及CRISPR產品編號KN204849、來自Applied Biological Materials (K7408008)及來自Santa Cruz (sc-416692)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-35008及sc-35009)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CD48分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CD48分子。
術語「CD33」係指CD33分子，其係調介唾液酸依賴性細胞結合之骨髓單核球性源細胞之假定黏附分子。CD33優先結合至α-2,6-連接之唾液酸。唾液酸識別位點可由與相同細胞表面上之唾液酸之順式相互作用所遮蔽。在免疫反應中，CD33可在配體誘導性酪胺酸磷酸化時藉由經由SH2結構域募集細胞質磷酸酶來用作抑制受體，該等結構域經由信號傳導分子去磷酸化來阻斷信號轉導。CD33在活體外誘導急性骨髓樣白血病中之細胞凋亡。與CD33有關之疾病包含膽囊淋巴瘤及皮膚外肥大細胞瘤。其相關路徑係造血幹細胞分化路徑以及譜系特異性標記物及先天性免疫系統。在一些實施例中，位於人類中之染色體19q上之CD33基因由14個外顯子組成。在一些實施例中，人類CD33蛋白具有364個胺基酸及/或39825 Da之分子質量。CD33在磷酸化時與PTPN6/SHP-1及PTPN11/SHP-2相互作用。在一些實施例中，人類CD33蛋白含有兩個拷貝之細胞質基序，其稱為免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)。此基序參與調節細胞反應。經磷酸化ITIM基序可結合若干含SH2磷酸酶之SH2結構域。
術語「CD33」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CD33 cDNA及人類CD33蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/945)。舉例而言，已知至少三種不同人類CD33同種型。人類CD33同種型1 (NP_001763.3)可由轉錄物變體1 (NM_001772.3，其係最長轉錄物)編碼。人類CD33同種型2 (NP_001076087.1)可由轉錄物變體2 (NM_001082618.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏5'編碼區中之交替框內外顯子，從而產生短於同種型1之蛋白質(同種型2，亦稱為CD33m)。人類CD33同種型3 (NP_001171079.1)可由轉錄物變體3 (NM_001177608.1)編碼，其與變體1相比之不同之處在於3' UTR及編碼序列。所編碼同種型3與同種型1相比具有較短及不同之C-末端。除人類外之生物體中之CD33異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CD33 (XM_512850.7及XP_512850.3；XM_009436143.3及XP_009434418.1；及XM_016936702.2及XP_016792191.1)、恒河猴CD33 (XM_015124693.1及XP_014980179.1；及XM_001114616.3及XP_001114616.2)及狗CD33 (XM_005616249.2及XP_005616306.1)。CD33異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測CD33蛋白質之抗CD33抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體sc-514119、sc-376184 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體NBP2-22377、NBP2-29619、NBP2-37388及MAB1137 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab199432、ab134115、ab30371及ab11032 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：CF806758、TA806758 (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗CD33抗體且包含(例如)闡述於美國專利公開案US20150125447A1、US20160362490A1、US20170002074A1及US20190002560A1及美國專利第US7022500B1號及第US9587019B2號中者。另外，用於檢測CD33表現之試劑已眾所周知。多個CD33臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000532386.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CD33表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR319607、shRNA產品編號TL314092、TR314092、TG314092、TF314092、TL314092V及CRISPR產品編號KN207023、來自Applied Biological Materials (K3368408)及來自Santa Cruz (sc-401011)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-42782及sc-42783)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CD33分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CD33分子。
術語「LST1」係指白血球特異性轉錄物1，其係可抑制淋巴球增殖之膜蛋白。LST1之表現係由脂多醣、干擾素-γ及細菌來增強。LST1誘導形態變化(包含在過度表現於各種細胞類型中時產生絲狀偽足及微刺)且可參與樹突狀細胞成熟。LST1之同種型1及同種型2對淋巴球增殖具有抑制效應。在一些實施例中，位於人類中之染色體6p上之LST1基因由6個外顯子組成。在一些實施例中，人類LST1蛋白具有97個胺基酸及/或10792 Da之分子質量。
術語「LST1」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類LST1 cDNA及人類LST1蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/7940)。舉例而言，已知至少6種不同人類LST1同種型。人類LST1同種型1 (NP_009092.3)可由轉錄物變體1 (NM_007161.3，其係最長轉錄物)編碼。人類LST1同種型2 (NP_995309.2)可由轉錄物變體2 (NM_205837.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在5' UTR中包含額外外顯子且在3'編碼區中缺乏引起框移之內部外顯子。人類LST1同種型3 (NP_995310.2)可由轉錄物變體3 (NM_205838.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在5' UTR中包含額外外顯子、在5'編碼區中缺乏交替框內外顯子且在3'編碼區中使用交替框內剪接位點。人類LST1同種型4 (NP_995311.2)可由轉錄物變體4 (NM_205839.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在5' UTR中包含額外外顯子且在3'編碼區中使用交替框內剪接位點。人類LST1同種型5 (NP_995312.2)可由轉錄物變體5 (NM_205840.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在中心編碼區中缺乏交替外顯子且在3'編碼區中使用引起框移之交替剪接位點。人類LST1同種型6 (NP_001160010.1)可由轉錄物變體6 (NM_001166538.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在5'編碼區中缺乏交替框內外顯子，從而產生短於同種型1之同種型6。除人類外之生物體中之LST1異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩LST1 (XM_009450906.3及XP_009449181.1；XM_009450900.3及XP_009449175.1；XM_009450905.3及XP_009449180.1；XM_003950777.4及XP_003950826.1；XM_016955125.2及XP_016810614.1；XM_016955127.2及XP_016810616.1；XM_016955126.2及XP_016810615.1；XM_016955129.2及XP_016810618.1；XM_009450901.3及XP_009449176.1；及XM_009450902.3及XP_009449177.1)。LST1異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測LST1蛋白之抗LST1抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX16300 (GeneTex)、抗體NBP1-45072、NBP1-98482及H00007940-B01P (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab14557及ab172244 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：AM20987PU-N (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測LST1表現之試劑已眾所周知。多個LST1臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000541902.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小LST1表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville、MD)之siRNA產品編號SR305318、shRNA產品編號TL311652、TR311652、TG311652、TF311652、TL311652V及CRISPR產品編號KN213273、來自Applied Biological Materials (K7098808)及來自Santa Cruz (sc-407477)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-95628及sc-149136)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對LST1分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之LST1分子。
術語「TNFAIP8L2」或「TIPE2」係指TNFα誘導蛋白8樣蛋白2。與TNFAIP8L2有關之疾病包含皮膚鱗狀細胞癌。其相關路徑係代謝及甘油磷脂生物合成。TNFAIP8L2藉由維持免疫穩態來用作先天性免疫性及適應性免疫性之負性調控劑。TNFAIP8L2用作類鐸受體及T細胞受體功能之負性調控劑。其亦防止免疫系統之高反應性且維持免疫穩態。TNFAIP8L2抑制JUN/AP1及NF-κ-B活化且促進Fas誘導之細胞凋亡。在一些實施例中，位於人類中之染色體1q上之TNFAIP8L2基因由14個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，其稱為Tnfaip8l2tm1Yhcn (Sun等人(2008)Cell 132:415-426)。在一些實施例中，人類TNFAIP8L2蛋白具有184個胺基酸及/或20556 Da之分子質量。最初認為，TNFAIP8L2蛋白之中心區域構成DED (死亡效應物)結構域。然而，3D結構數據揭示不同於DED (死亡效應物)結構域之預測摺疊之先前未描述摺疊。TNFAIP8L2由備用於輔因子結合之大疏水性中心空腔組成。
術語「TNFAIP8L2」或「TIPE2」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類TNFAIP8L2 cDNA及人類TNFAIP8L2蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/79626)。舉例而言，人類TNFAIP8L2 (NP_078851.2)係由轉錄物(NM_024575.4)編碼。除人類外之生物體中之TNFAIP8L2異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩TNFAIP8L2 (XM_009431068.3及XP_009429343.1；及XM_003308373.4及XP_003308421.1)、恒河猴TNFAIP8L2 (NM_001257419.1及NP_001244348.1)、狗TNFAIP8L2 (XM_005630793.3及XP_005630850.1；及XM_540310.6及XP_540310.2)、牛TNFAIP8L2 (NM_001034389.1及NP_001029561.1)、小鼠TNFAIP8L2 (NM_027206.2及NP_081482.1)、大鼠TNFAIP8L2 (NM_001014039.1及NP_001014061.1)；熱帶爪蛙TNFAIP8L2 (XM_012969840.1及XP_012825294.1；XM_012969842.1及XP_012825296.1；XM_012969839.1及XP_012825293.1；及XM_012969841.1及XP_012825295.1)；及斑馬魚TNFAIP8L2 (NM_200374.1及NP_956668.1)。TNFAIP8L2異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測TNFAIP8L2蛋白之抗TNFAIP8L2抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體H00079626-B01P及H00079626-D01P (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體目錄編號：TA315795, AP54305PU-N (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測TNFAIP8L2表現之試劑已眾所周知。多個TNFAIP8L2臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000544194.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小TNFAIP8L2表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR312471、shRNA產品編號TL300917、TR300917、TG300917、TF300917、TL300917V及CRISPR產品編號KN209504、來自Applied Biological Materials之CRISPR gRNA產品(K6597108)及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-76702及sc-76702-PR)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對TNFAIP8L2分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之TNFAIP8L2分子。
術語「SPI1」或「PU.1」係指Spi-1原癌基因，其係在骨髓樣及B-淋巴樣細胞發育期間激活基因表現之ETS結構域轉錄因子。核蛋白SPI1結合至發現於靶基因啟動子附近之稱為PU盒之富嘌呤序列，且協同其他轉錄因子及輔因子來調控其表現。SPI1蛋白亦可調控靶基因之交替剪接。SPI1結合至PU盒，該PU盒係可用作淋巴樣特異性增強子之富嘌呤DNA序列(5-GAGGAA-3)。SPI1蛋白係可特異性參與巨噬細胞或B細胞之分化或活化之轉錄活化劑。SPI1亦結合RNA且可調節mRNA前體剪接。與SPI1有關之疾病包含發炎性腹瀉及嗜中性球特異性顆粒缺陷。其相關路徑係破骨細胞中之RANK信號傳導及破骨細胞分化。在一些實施例中，位於人類中之染色體11p上之SPI1基因由8個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，包含Spi1tm1Ram (McKercher等人(1996)EMBO J. 15:5647-5658)、Spi1tm2b(EUCOMM)Wtsi (International Knockout Mouse Consortium)及  Spi1tm2.1DgtHuman SPI1 (Iwasaki等人(2005)Blood 106:1590-1600)。在一些實施例中，SPI1蛋白具有270個胺基酸及/或31083 Da之分子質量。SPI1屬ETS家族。SPI1之已知結合配偶體包含(例如) CEBPD、NONO、RUNX1、SPIB、GFI1及CEBPE。
術語「SPI1」或「PU.1」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類SPI1 cDNA及人類SPI1蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/6688)。舉例而言，已知至少兩種不同人類SPI1同種型。人類SPI1同種型1 (NP_001074016.1)可由轉錄物變體1 (NM_001080547.1，其係較長轉錄物)編碼。人類SPI1同種型2 (NP_003111.2)可由轉錄物變體2 (NM_003120.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在5'編碼區中使用交替框內剪接位點，從而產生較短蛋白質(同種型2)。除人類外之生物體中之SPI1異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)狗SPI1 (XM_005631240.3及XP_005631297.1；及XM_848897.5及XP_853990.1)、牛SPI1 (NM_001192133.2及NP_001179062.1)、小鼠SPI1 (NM_011355.2及NP_035485.1)、大鼠SPI1 (NM_001005892.2及NP_001005892.1)、雞SPI1 (NM_205023.1及NP_990354.1)、熱帶爪蛙SPI1 (NM_001145983.1及NP_001139455.1)及斑馬魚SPI1 (NM_001328368.1及NP_001315297.1；NM_001328369.1及NP_001315298.1.；及NM_198062.2及NP_932328.2)。SPI1異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測SPI1蛋白之抗SPI1抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX128266、GTX101581及GTX60620 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-390659 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體NBP2-27163、NBP1-00135、MAB7124及MAB5870 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab76543、ab88082及ab76542 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：CF808850及TA808850 (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測SPI1表現之試劑已眾所周知。多個SPI1臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000546129.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小SPI1表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR304549、shRNA產品編號TL316738、TR 316738、TG 316738、TF 316738、TL316738V及CRISPR產品編號KN212818、來自Applied Biological Materials (K6488408)及來自Santa Cruz (sc- 400547-KO-2)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-36330及sc36331)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對SPI1分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之SPI1分子。
術語「LILRB2」係指白血球免疫球蛋白樣受體B2，其係白血球免疫球蛋白樣受體(LIR)家族之成員且在人類中發現於染色體區域19q13.4處之基因簇中。所編碼蛋白質屬LIR受體之亞科B種類，該等LIR受體通常含有兩個或四個細胞外免疫球蛋白結構域、一個跨膜結構域及二至四個細胞質免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)。該受體表現於免疫細胞上，在此其結合至抗原呈遞細胞上之MHC種類I分子且轉導抑制免疫反應刺激之負信號。據信，其可控制發炎反應及細胞毒性以幫助聚焦免疫反應且限制自身反應性。其相關路徑係先天性免疫系統及破骨細胞分化。LILRB2係種類I MHC抗原之受體。其識別寬範圍之HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-G等位基因。LILRB2參與免疫反應下調及耐受性產生。LILRB2與CD8A競爭結合至種類I MHC抗原。LILRB2抑制細胞蛋白之FCGR1A調介之磷酸化及細胞內鈣離子之動員。在一些實施例中，位於人類中之染色體19q上之LILRB2基因由15個外顯子組成。在一些實施例中，人類LILRB2蛋白具有598個胺基酸及/或65039 Da之分子質量。在一些實施例中，LILRB2含有3個拷貝之稱為免疫受體酪胺抑制基序(ITIM)之細胞質基序。此基序參與調節細胞反應。經磷酸化ITIM基序可結合若干含SH2磷酸酶之SH2結構域。LILRB2之已知結合配偶體包含(例如) PTPN6及FCGR1A。
術語「LILRB2」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類LILRB2 cDNA及人類LILRB2蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/10288)。舉例而言，已知至少5種不同人類LILRB2同種型。人類LILRB2同種型1 (NP_005865.3)可由轉錄物變體1 (NM_005874.4，其係最長轉錄物)編碼。人類LILRB2同種型2 (NP_001074447.2及NP_001265332.2)可由轉錄物變體2 (NM_001080978.3)編碼，該轉錄物變體2與變體1相比在中心編碼區中使用交替框內剪接位點，且可由轉錄物變體3 (NM_001278403.2)編碼，該轉錄物變體3與變體1相比之不同之處在於5' UTR且在中心編碼區中使用交替框內剪接位點。所編碼同種型2短於同種型1。變體2及3皆編碼相同同種型。人類LILRB2同種型3 (NP_001265333.2)可由轉錄物變體4 (NM_001278404.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏5'編碼區之一部分，且使用下游框內起始密碼子。所編碼同種型(3)與同種型1相比具有較短N-末端。人類LILRB2同種型4 (NP_001265334.2)可由轉錄物變體5 (NM_001278405.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比具有較短5' UTR，且缺乏產生框移及早期終止密碼子之內部外顯子。所編碼同種型(4)與同種型1相比具有較短且不同之C-末端。人類LILRB2同種型5 (NP_001265335.2)可由轉錄物變體6 (NM_001278406.2)編碼，該轉錄物變體具有較短5' UTR，缺乏若干外顯子，且其3'-末端外顯子延伸至超過變體1中所使用之剪接位點。所得蛋白質(同種型5)與同種型1相比具有較短且不同之C-末端。LILRB2異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測LILRB2蛋白之抗LILRB2抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體sc-515288、及sc-390287 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體MAB2078、AF2078、H00010288-M01及NBP1-98554 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab128349、ab95819及ab95820 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA349368及TA323297 (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測LILRB2表現之試劑已眾所周知。多個LILRB2臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000541153.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小LILRB2表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR323061、shRNA產品編號TL311729、TR311729、TG311729、TF311729、TL311729V及CRISPR產品編號KN207770、來自Applied Biological Materials (K1215408)及來自Santa Cruz (sc-401944)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-45200)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對LILRB2分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之LILRB2分子。
術語「CCR5」係指C-C基序趨化介素受體5，其係β趨化介素受體家族之成員且預計係類似於G蛋白偶合受體之七次跨膜蛋白。CCR5係由T細胞及巨噬細胞表現，且已知係使巨噬細胞嗜性病毒(包含HIV)進入宿主細胞之重要共受體。CCR5基因之缺陷性等位基因與HIV感染抗性有關。CCR5受體之配體包含單核球化學吸引劑蛋白2 (MCP-2)、巨噬細胞發炎蛋白1α (MIP-1α)、巨噬細胞發炎蛋白1β (MIP-1β)及調節活化正常T細胞表現及分泌蛋白(RANTES)。亦在前骨髓母細胞細胞系中檢測到CCR5基因表現，從而指示此蛋白質可在顆粒球譜系增殖及分化中發揮作用。CCR5基因位於趨化介素受體基因簇區域處。與CCR5有關之疾病包含西尼羅病毒(west nile virus)及胰島素依賴性糖尿病。其相關路徑係免疫系統中之細胞介素信號傳導及akt信號傳導。在一些實施例中，位於人類中之染色體3p上之CCR5基因由3個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，包含Ccr5tm1Kuz (Huffnagle等人(1999)J Immunol. 163:4642-4646)、Ccr5tm1Blck (Luckow等人(2004)Eur J Immunol 34:2568-2578)及      Ccr5tm1(CCR5)PfiHuman (Amsellem等人(2014)Circulation 130:880-891)。在一些實施例中，CCR5蛋白具有352個胺基酸及/或40524 Da之分子質量。CCR5之已知結合配偶體包含(例如) PRAF2、CCL4、GRK2、ARRB1、ARRB2及CNIH4。
術語「CCR5」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CCR5 cDNA及人類CCR5蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/1234)。舉例而言，人類CCR5 (NP_000570.1及NP_001093638.1)可由轉錄物變體A (NM_000579.3，其係較長轉錄物)及轉錄物變體B (NM_001100168.1，其5' UTR與變體A不同)編碼。兩種變體皆編碼相同蛋白質。除人類外之生物體中之CCR5異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CCR5 (NM_001009046.1及NP_001009046.1)、恒河猴CCR5 (NM_001042773.3及NP_001036238.2；及NM_001309402.1及NP_001296331.1)、狗CCR5 (NM_001012342.3及NP_001012342.2)、牛CCR5 (NM_001011672.2及NP_001011672.2)、小鼠CCR5 (NM_009917.5及NP_034047.2)及大鼠CCR5 (NM_053960.3及NP_446412.2)。CCR5異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測CCR5蛋白之抗CCR5抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX101330、GTX109635及GTX21673 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-57072及sc-55484 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體MAB182、NBP2-31374、NBP1-41434及MAB181 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab65850、ab1673及ab7346 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA351039及TA348418 (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗CCR5抗體及包含(例如)闡述於美國專利公開案US20010000241、US20020099176A1、US20090110686A1及US20080107595中者。另外，用於檢測CCR5表現之試劑已眾所周知。多個CCR5臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000516140.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CCR5表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR300873、shRNA產品編號TL314126、TR314126、TG314126、TF 314126、TL314126V及CRISPR產品編號KN216008、來自Applied Biological Materials (K6988308)及來自Santa Cruz (sc-402548)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-35062及sc-35063)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CCR5分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CCR5分子。
術語「EVI2B」係指嗜親性病毒整合位點2B。EVI2B係顆粒球分化及造血祖細胞之功能性(經由控制造血祖細胞之細胞週期進展及存活)所需。在一些實施例中，位於染色體17q上之基因EVI2B由3個外顯子組成。在一些實施例中，人類EVI2B蛋白具有448個胺基酸及/或48666 Da之分子質量。
術語「EVI2B」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類EVI2B cDNA及人類EVI2B蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/2124)。舉例而言，人類EVI2B (NP_006486.3)係由轉錄物(NM_006495.3)編碼。除人類外之生物體中之EVI2B異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩EVI2B (XM_024350668.1及XP_024206436.1；及XM_001174747.4及XP_001174747.1)、恒河猴EVI2B (XM_001111968.3及XP_001111968.1；及XM_001111891.3及XP_001111891.1)、狗EVI2B (XM_022423331.1及XP_022279039.1；XM_022423330.1及XP_022279038.1；XM_005624837.3及XP_005624894.1；及XM_005624836.3及XP_005624893.1)、牛EVI2B (NM_001099166.2及NP_001092636.1)、小鼠EVI2B (NM_001077496.1及NP_001070964.1)及大鼠EVI2B (NM_001271482.1及NP_001258411.1)。EVI2B異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測EVI2B蛋白之抗EVI2B抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX79980、GTX79981及GTX46414 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體NBP1-85342、NBP2-62207、NBP1-59952及H00002124-M02 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab101146、ab101040及ab173149 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA341843及AM12138RP-N (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測EVI2B表現之試劑已眾所周知。多個EVI2B臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000535142.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小EVI2B表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR320090、shRNA產品編號TL313146、TR313146、TG313146、TF313146、TL313146V及CRISPR產品編號KN203253、來自Applied Biological Materials (K4066808)及來自Santa Cruz (sc-416696)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-93673及sc-144963)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對EVI2B分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之EVI2B分子。
術語「CLEC7A」係指含C型凝集素結構域蛋白7A，其係C型凝集素/C型凝集素樣結構域(CTL/CTLD)超家族之成員。所編碼醣蛋白係具有細胞外C型凝集素樣結構域摺疊及細胞質結構域(具有免疫受體酪胺酸活化基序)之小II型膜受體。其用作識別來自真菌及植物之各種β-1,3-連接及β-1,6-連接之葡聚糖之模式識別受體，且以此方式在先天性免疫反應中發揮作用。此基因緊密連接至人類天然殺手基因複合物區域中之染色體12p13上之其他CTL/CTLD超家族成員。與CLEC7A有關之疾病包含家族性曲黴菌病(aspergillosis)及念珠菌病(candidiasis)。其相關路徑係CLEC7A (Dectin-1)信號傳導及先天性免疫系統。在一些實施例中，位於染色體12p上之基因CLEC7A由8個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，包含Clec7atm1Gdb (Taylor等人(2007)Nat Immunol 8:31-38)及Clec7atm1Yiw (Saijo等人(2007)Nat Immunol. 8:39-46)。在一些實施例中，人類CLEC7A蛋白具有247個胺基酸及/或27627 Da之分子質量。CLEC7A蛋白與SYK相互作用，且CLEC7A之同種型5與RANBP9相互作用。
術語「CLEC7A」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CLEC7A cDNA及人類CLEC7A蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI) (例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/64581)公開獲得。舉例而言，已知至少6種不同人類CLEC7A同種型。人類CLEC7A同種型a (NP_922938.1)可由轉錄物變體1 (NM_197947.2，其係最長轉錄物)編碼。人類CLEC7A同種型b (NP_072092.2)可由轉錄物變體2 (NM_022570.4)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏交替框內外顯子，從而產生短於同種型a之蛋白質(同種型b)。人類CLEC7A同種型c (NP_922939.1)可由轉錄物變體3 (NM_197948.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏產生框移及早期終止密碼子之交替外顯子。所得蛋白質(同種型c)短於同種型a且具有不同C-末端。人類CLEC7A同種型d (NP_922940.1)可由轉錄物變體4 (NM_197949.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏產生框移及早期終止密碼子之兩個交替外顯子。所得蛋白質(同種型d)短於同種型a且含有不同C-末端。人類CLEC7A同種型e (NP_922941.1)可由轉錄物變體5 (NM_197950.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏交替框內外顯子，從而產生短於同種型a之蛋白質(同種型e)。人類CLEC7A同種型f (NP_922945.1)可由轉錄物變體6 (NM_197954.2)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在編碼區中具有多個差異，其中之一個差異產生早期終止密碼子。所得蛋白質(同種型f)較同種型a具有不同C-末端且極短。除人類外之生物體中之CLEC7A異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CLEC7A (XM_016922965.2及XP_016778454.1；XM_001144689.3及XP_001144689.1；XM_001144825.3及XP_001144825.1；XM_003313487.4及XP_003313535.1；XM_528732.4及XP_528732.2；及XM_001144313.4及XP_001144313.1)、恒河猴CLEC7A (NM_001032943.1及NP_001028115.1)、狗CLEC7A (XM_022411028.1及XP_022266736.1；XM_849050.3及XP_854143.1；及XM_005637163.2及XP_005637220.1)、牛CLEC7A (NM_001031852.1及NP_001027022.1)、小鼠CLEC7A (NM_001309637.1及NP_001296566.1；及NM_020008.3及NP_064392.2)及大鼠CLEC7A (NM_001173386.1及NP_001166857.1)。CLEC7A異種同源物之代表性序列呈現於下表1中。
適於檢測CLEC7A蛋白之抗CLEC7A抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX41467、GTX41471及GTX41466 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體MAB1859、AF1859、NBP1-45514及NBP2-41170 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab140039、ab82888及ab189968 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：TA322197及TA320003 (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗CLEC7A抗體及包含(例如)闡述於美國專利公開案US20140322214A1及US20170095573A1及美國專利第US7915041B2號中者。另外，用於檢測CLEC7A表現之試劑已眾所周知。多個CLEC7A臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000516241.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CLEC7A表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR312068、shRNA產品編號TL305354、TR305354、TG305354、TF305354、TL305354V及CRISPR產品編號KN214107、來自Applied Biological Materials (K6685408)及來自Santa Cruz (sc-417053)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-63276及sc-63277)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CLEC7A分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CLEC7A分子。
術語「TBXAS1」係指血栓烷A合酶1，其係細胞色素P450超家族酶之成員。細胞色素P450蛋白係單氧合酶，其催化涉及藥物代謝及膽固醇、類固醇及其他脂質之合成之許多反應。然而，基於序列類似性而非功能類似性，此蛋白質可視為細胞色素P450超家族之成員。此內質網膜蛋白催化前列腺素H2至血栓烷A2之轉化，血栓烷A2係強力血管收縮劑及血小板聚集誘導劑。該酶若干病理生理學過程(包含止血、心血管疾病及中風)中發揮作用。與TBXAS1有關之疾病包含ghosal型血液骨幹發育不良及出血病症血小板型14。其相關路徑係血小板活化及代謝。在一些實施例中，位於染色體7q上之基因TBXAS1由23個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，包含Tbxas1tm1Swl (Yu等人(2004)Blood 104:135-142)及Tbxas1tm1OkunHuman (Matsunobu等人(2013)J Lipid Res 54:2979-2987)。在一些實施例中，TBXAS1蛋白具有533個胺基酸及/或60518 Da之分子質量。
術語「TBXAS1」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類TBXAS1 cDNA及人類TBXAS1蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/6916)。舉例而言，已知至少5種不同人類TBXAS1同種型。人類TBXAS1同種型1 (NP_001052.2及NP_001124438.1)可由轉錄物變體1 (NM_001061.4)及轉錄物變體3 (NM_001130966.2)編碼。此變體(3，亦稱為TXS-III)與變體1相比之不同之處在於5' UTR。變體1及3皆編碼相同同種型(1，亦稱為同種型TXS-I)。人類TBXAS1同種型2 (NP_112246.2)可由轉錄物變體2 (NM_030984.3)編碼，該轉錄物變體與轉錄物變體1相比在3'編碼區中缺乏編碼血紅素結合位點之交替外顯子。所編碼同種型(2，亦稱為同種型TXS-II)較同種型1缺乏血栓烷A合酶活性，具有不同C-末端，且較短。人類TBXAS1同種型3 (NP_001159725.1)可由轉錄物變體4 (NM_001166253.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在中心編碼區中包含交替框內外顯子，從而產生長於同種型1之同種型(3)。人類TBXAS1同種型4 (NP_001159726.1)可由轉錄物變體5 (NM_001166254.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比之不同之處在於5' UTR，缺乏5'編碼區之一部分，且使用下游轉譯起始密碼子。所編碼同種型(4)在N-末端處短於同種型1。人類TBXAS1同種型5 (NP_001300957.1)可由轉錄物變體6 (NM_001314028.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在內部外顯子中使用交替剪接位點。所得同種型(5)短於同種型1且具有不同N-末端。除人類外之生物體中之TBXAS1異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)狗TBXAS1 (XM_005629559.2及XP_005629616.1；XM_539887.5及XP_539887.2；XM_014119949.2及XP_013975424.1；及XM_022403739.1及XP_022259447.1)、牛TBXAS1 (NM_001046027.2及NP_001039492.1)、小鼠TBXAS1 (NM_011539.3及NP_035669.3)、大鼠TBXAS1 (NM_012687.1及NP_036819.1)、雞TBXAS1 (XM_416334.6及XP_416334.4；XM_004937846.3及XP_004937903.2；及XM_025155784.1及XP_025011552.1)、熱帶爪蛙TBXAS1 (NM_001171526.1及NP_001164997.1)及斑馬魚 TBXAS1 (NM_205609.2及NP_991172.2)。TBXAS1異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測TBXAS1蛋白之抗TBXAS1抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX83523、GTX83521及GTX83522 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體NBP2-02710、NBP2-33948、NBP2-33946及NBP2-33947 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab39362、ab187176及ab157481 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：CF501380及AP51174PU-N (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測TBXAS1表現之試劑已眾所周知。多個TBXAS1臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000518496.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小TBXAS1表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR304732、shRNA產品編號TL301186、TR301186、TG301186、TF301186、TL301186V及CRISPR產品編號KN208028、來自Applied Biological Materials (K6806708)及來自Santa Cruz (sc-418609)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-62451及sc-76779)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對TBXAS1分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之TBXAS1分子。
術語「SIGLEC7」係指唾液酸結合性Ig樣凝集素7，其係調介唾液酸依賴性細胞結合之假定黏附分子。SIGLEC7優先結合至α-2,3-連接及α-2,6-連接之唾液酸。SIGLEC7亦結合二唾液酸神經節苷酯(二唾液酸半乳糖基紅血球醣苷脂、二唾液醯基乳四醣神經醯胺及二唾液醯基GalNAc乳四醣神經醯胺)。SIGLEC7之唾液酸識別位點可由相同細胞表面上與唾液酸之順式相互作用所遮蔽。在免疫反應中，SIGLEC7可在配體誘導性酪胺酸磷酸化時藉由經由SH2結構域募集細胞質磷酸酶來用作抑制受體，該等結構域經由信號傳導分子去磷酸化來阻斷信號轉導。SIGLEC7調介天然殺手細胞細胞毒性之抑制。SIGLEC7可在造血中發揮作用。SIGLEC7在活體外抑制CD34+細胞前體朝向骨髓單核球性細胞譜系之分化及白血病骨髓樣細胞之增殖。與SIGLEC7有關之疾病包含嗜鉻細胞瘤。其相關路徑係造血幹細胞分化路徑以及譜系特異性標記物及先天性免疫系統。在一些實施例中，位於染色體19q上之基因SIGLEC7由7個外顯子組成。在一些實施例中，人類SIGLEC7蛋白具有467個胺基酸及/或51143 Da之分子質量。在一些實施例中，SIGLEC7蛋白含有1個拷貝之稱為免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)之細胞質基序。此基序參與調節細胞反應。經磷酸化ITIM基序可結合若干含SH2磷酸酶之SH2結構域。SIGLEC7蛋白在磷酸化時與PTPN6/SHP-1相互作用。
術語「SIGLEC7」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類SIGLEC7 cDNA及人類SIGLEC7蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI) (例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/27036)公開獲得。舉例而言，已知至少三種不同人類SIGLEC7同種型。人類SIGLEC7同種型1 (NP_055200.1，最長同種型)可由轉錄物變體1 (NM_014385.3)編碼。人類SIGLEC7同種型2 (NP_057627.2)可由轉錄物變體2 (NM_016543.3)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏框內編碼外顯子。所得同種型(2)與同種型1相比缺乏內部區段。人類SIGLEC7同種型3 (NP_001264130.1)可由轉錄物變體3 (NM_001277201.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比缺乏所有內部編碼外顯子。所得同種型(3)與同種型1相比係C-末端截短的。除人類外之生物體中之SIGLEC7異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩SIGLEC7 (XM_016936700.1及XP_016792189.1；及XM_016936701.1及XP_016792190.1)。SIGLEC7異種同源物之代表性序列呈現於下表1中。
適於檢測SIGLEC7蛋白之抗SIGLEC7抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX107080、GTX116337及GTX53005 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-398919及sc-398181 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體AF1138、MAB1138、MAB11381及NBP2-20360 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab38573、ab38574及ab111619 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：AM05592FC-N及AM05592PU-L (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗SIGLEC7抗體且包含(例如)闡述於美國專利公開案US20170306014、US20190085077、US20190023786及US20180244770中者。另外，用於檢測SIGLEC7表現之試劑已眾所周知。多個SIGLEC7臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000546879.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小SIGLEC7表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR308944、shRNA產品編號TL309445、TR309445、TG309445、TF309445、TL309445V及CRISPR產品編號KN206995、來自Applied Biological Materials (K2147608)及來自Santa Cruz (sc-407464)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-106757及sc-106757-SH)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對SIGLEC7分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之SIGLEC7分子。
術語「DOCK2」係指胞質分裂作用因子2。DOCK2屬CDM蛋白家族。其特異性表現於造血細胞中且主要表現於末梢血白血球中。該蛋白質參與重塑因應於趨化介素信號傳導之淋巴球遷移所需之肌動蛋白細胞骨架。其藉由用作鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)以將經結合GDP交換成游離GTP來活化GTPase之Rho家族成員(例如RAC1及RAC2)。DOCK2參與因應於趨化介素之淋巴球遷移所需之細胞骨架重排。DOCK2藉由用作將經結合GDP交換成游離GTP之鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)來活化RAC1及RAC2，但並不活化CDC42。DOCK2亦經由活化RAC2來參與IL2轉錄活化。存在經敲除小鼠系，其稱為Dock2tm1Tsas (Fukui等人(2001)Nature 412:826-831)及Dock2tm1Ysfk (Kunisaki等人(2006)J Cell Biol 174:647-652)。在一些實施例中，位於人類中之染色體5q上之基因DOCK2由59個外顯子組成。DOCK2基因在黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、雞及青蛙中係保守的。在一些實施例中，人類DOCK2蛋白具有1830個胺基酸及/或211948 Da之分子質量。DOCK2之已知結合配偶體包含(例如) RAC1、RAC2、CRKL、VAV及CD3Z。
術語「DOCK2」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類DOCK2 cDNA及人類DOCK2蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/80231)。舉例而言，人類DOCK2 (NP_004937.1)可由轉錄物(NM_004946.3)編碼。除人類外之生物體中之DOCK2異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩DOCK2 (XM_016954161.2及XP_016809650.1；XM_016954163.2及XP_016809652.1；XM_016954162.2及XP_016809651.1；及XM_016954164.2及XP_016809653.1)、狗DOCK2 (XM_546246.5及XP_546246.3)、牛DOCK2 (XM_024981420.1及XP_024837188.1及XM_024981421.1及XP_024837189.1)、小鼠DOCK2 (NM_033374.3及NP_203538.2)、大鼠DOCK2 (XM_008767630.2及XP_008765852.1)、雞DOCK2 (XM_425184.6及XP_425184.4)及熱帶爪蛙DOCK2 (XM_018092631.1及XP_017948120.1)。DOCK2異種同源物之代表性序列呈現於下文之表1中。
適於檢測DOCK2蛋白之抗DOCK2抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體TA340057及TA802698 (OriGene, Rockville, MD)、抗體NBP2-46468及NBP2-38303 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab74659、ab226797及ab203068 (AbCam, Cambridge, MA)等。另外，用於檢測DOCK2表現之試劑已眾所周知。多個DOCK2臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000536814.1，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小DOCK2表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR301250、shRNA產品編號TL313396、TR313396、TG313396、TF313396、TL313396V及CRISPR產品編號KN211198、來自Applied Biological Materials (K3865908)及來自Santa Cruz (sc-407692)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-60545及sc-60546)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對DOCK2分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之DOCK2分子。
術語「CD53」係指CD53分子，其係4跨膜蛋白超家族之成員且亦稱為四分子交聯體家族。大部分該等成員係特徵在於存在4個疏水性結構域之細胞表面蛋白。該等蛋白質調介用於調控細胞發育、活化、生長及運動之信號轉導事件。此所編碼蛋白質係已知與整聯蛋白複合之細胞表面醣蛋白。其有助於轉導T細胞及天然殺手細胞中之CD2生成信號且已表明在生長調控中發揮作用。此基因之家族性缺陷涉及與由細菌、真菌及病毒引起之復發性感染性疾病有關之免疫缺陷。與CD53有關之疾病包含腸結核病及胃腸道結核病。其相關路徑係先天性免疫系統。需要CD53以在細胞融合層面上有效形成再生肌肉中之肌纖維。CD53可參與造血細胞中之生長調控。在一些實施例中，位於染色體1p上之基因CD53由9個外顯子組成。在一些實施例中，人類CD53蛋白具有219個胺基酸及/或24341 Da之分子質量。
術語「CD53」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CD53 cDNA及人類CD53蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/963)。舉例而言，已知至少兩種不同人類CD53同種型。人類CD53同種型1 (NP_000551.1及NP_001035122.1)可由轉錄物變體1 (NM_001040033.1，其代表較長轉錄物)及轉錄物變體2 (NM_000560.3，其與變體1之不同之處在於5’ UTR相比)編碼。變體1及2編碼相同蛋白質。人類CD53同種型2 (NP_001307567.1)可由轉錄物變體3 (NM_001320638.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比之不同之處在於5' UTR且在編碼區中缺乏外顯子。所編碼同種型(2)短於同種型1。除人類外之生物體中之CD53異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CD53 (XM_003308334.3及XP_003308382.1；XM_016925800.1及XP_016781289.1；及XM_009429624.2及XP_009427899.1)、恒河猴CD53 (XM_015148031.1及XP_015003517.1、XM_001102190.3及XP_001102190.1及XM_015148036.1及XP_015003522.1)、狗CD53 (XM_003639132.3及XP_003639180.1)、牛CD53 (NM_001034232.2及NP_001029404.1)、小鼠CD53 (NM_007651.3及NP_031677.1)及大鼠CD53 (NM_012523.2及NP_036655.1)。CD53異種同源物之代表性序列呈現於下文之表2中。
適於檢測CD53蛋白之抗CD53抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX34220、GTX79940及GTX79942 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-390185及sc-73365 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體MAB4624、NB500-393、NBP2-44609及NBP2-14464 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab134094、ab68565及ab213083 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：SM1137AS及SM1137LE (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測CD53表現之試劑已眾所周知。多個CD53臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000532965.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CD53表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR300686、shRNA產品編號TL314077、TR314077、TG314077、TF314077、TL314077V及CRISPR產品編號KN208095、來自Applied Biological Materials (K6868708)及來自Santa Cruz (sc-405861)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-42796及sc-42797)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CD53分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CD53分子。
術語「FERMT3」係指Fermitin家族成員3，且屬調介涉及整聯蛋白活化之蛋白質-蛋白質相互作用且由此在細胞黏附、遷移、分化及增殖中具有作用之蛋白質之小家族。FERMT3蛋白在止血及血栓形成之調控中具有關鍵作用。其亦可幫助維持紅血球之膜骨架。FERMT3基因中之突變會引起常染色體隱性白血球黏附缺陷症候群-III (LAD-III)。FERMT3在造血細胞中之細胞黏附中發揮主要作用(Svensson等人(2009)Nat Med 15:306-312；Suratannon等人(2016)Pediatr Allergy Immunol 27:214-217)。FERMT3藉由活化整聯蛋白β-1-3 (ITGB1、ITGB2及ITGB3)而發揮作用。FERMT3係整聯蛋白調介之血小板黏附及白血球至內皮細胞之黏附所需(Malinin等人(2009)Nat Med 15:313-318)，且係活化多形核顆粒球(PMN)中之整聯蛋白β-2 (ITGB2)所需。FERMT3之人類同種型2可用作NF-κ-B及細胞凋亡之抑制子。在一些實施例中，位於染色體11q上之基因FERMT3由16個外顯子組成。存在經敲除小鼠系，包含Fermt3tm1Ref (Moser等人(2008)Nat Med . 14:325-330)、Fermt3tm2.2Ref (Cohen等人(2013)Blood 122:2609-2617)及Fermt3tm1b(KOMP)Wtsi (International Knockout Mouse Consortium)。在一些實施例中，人類FERMT3蛋白具有667個胺基酸及/或75953 Da之分子質量。FERMT3經由細胞質尾部與ITGB1、ITGB2及ITGB3相互作用。
術語「FERMT3」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類FERMT3 cDNA及人類FERMT3蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/83706)。舉例而言，已知至少兩種不同人類FERMT3同種型。人類FERMT3同種型1 (NP_848537.1)可由轉錄物變體1 (NM_178443.2，其代表較長轉錄物)編碼。人類FERMT3同種型2 (NP_113659.3)可由轉錄物變體2 (NM_031471.5)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在編碼外顯子之5'端使用交替框內剪接點。所得同種型(2)與長同種型(1)相比具有相同但較短之N-末端及C-末端。除人類外之生物體中之FERMT3異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩FERMT3 (XM_009423350.3及XP_009421625.1；及XM_508522.6及XP_508522.3)、恒河猴FERMT3 (XM_015113900.1及XP_014969386.1及XM_015113898.1及XP_014969384.1)、狗FERMT3 (XM_003639655.3及XP_003639703.1)、小鼠FERMT3 (NM_001362399.1及NP_001349328.1及NM_153795.2及NP_722490.1)、大鼠FERMT3 (NM_001127543.1及NP_001121015.1)；及斑馬魚 FERMT3 (NM_200904.2及NP_957198.2)。FERMT3異種同源物之代表性序列呈現於下文之表2中。
適於檢測FERMT3蛋白之抗FERMT3抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX116828、GTX85027及GTX88332 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體NBP2-45641、AF7004、NBP2-20821及H00083706-B01P (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab68040、ab126900及ab173416 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：CF807994及TA807994 (Origene, Rockville, MD)等。另外，用於檢測FERMT3表現之試劑已眾所周知。多個FERMT3臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000516681.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小FERMT3表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR313216、shRNA產品編號TL307798、TR307798、TG307798、TF307798、TL307798V及CRISPR產品編號KN202580、來自Applied Biological Materials (K7584608)及來自Santa Cruz (sc-408381)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-96761及sc-146483)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對FERMT3分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之FERMT3分子。
術語「CD37」係指CD37，其係4跨膜蛋白超家族之成員且亦稱為四分子交聯體家族。大部分該等成員係特徵在於存在4個疏水性結構域之細胞表面蛋白。該等蛋白質調介用於調控細胞發育、活化、生長及運動之信號轉導事件。CD37蛋白係已知與整聯蛋白及其他4跨膜超家族蛋白複合之細胞表面醣蛋白。CD37可在T細胞-B細胞相互作用中發揮作用。存在經敲除小鼠系，其稱為CD37tm1Hor (Knobeloch等人(2000)Mol Cell Biol 20:5363-5369)。在一些實施例中，位於染色體19q上之基因CD37由8個外顯子組成。在一些實施例中，人類CD37蛋白具有281個胺基酸及/或31703 Da之分子質量。在一些實施例中，CD37與SCIMP相互作用。
術語「CD37」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CD37 cDNA及人類CD37蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/951)。舉例而言，已知至少兩種不同人類CD37同種型。人類CD37同種型A (NP_001765.1)可由轉錄物變體1 (NM_001774.2，其代表較長轉錄物)編碼。人類CD37同種型B (NP_001035120.1)可由轉錄物變體2 (NM_001040031.1)編碼，該轉錄物變體與變體1相比在5'編碼區中缺乏交替框內區段且使用下游起始密碼子。所編碼同種型(B)與同種型A相比具有較短N-末端。除人類外之生物體中之CD37異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CD37 (XM_016947061.2及XP_016802550.1；XM_016947063.2及XP_016802552.1；XM_016947062.2及XP_016802551.1；及XM_016947064.2及XP_016802553.1)、恒河猴CD37 (XM_015124560.1及XP_014980046.1；XM_001114865.3及XP_001114865.2；XM_015124562.1及XP_014980048.1；及XM_015124563.1及XP_014980049.1)、狗CD37 (XM_014118925.2及XP_013974400.1；XM_541497.5及XP_541497.2；及XM_005616317.3及XP_005616374.1)、牛CD37 (NM_001046011.2及NP_001039476.1)、小鼠CD37 (NM_001290802.1及NP_001277731.1、NM_001290804.1及NP_001277733.1及NM_007645.4及NP_031671.1)、大鼠CD37 (NM_017124.1及NP_058820.1)及熱帶爪蛙CD37 (NM_001015801.2及NP_001015801.2)。CD37異種同源物之代表性序列呈現於下文之表2中。
適於檢測CD37蛋白之抗CD37抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體GTX129598、GTX19701及GTX83137 (GeneTex, Irvine, CA)、抗體sc-73364及sc-23924 (Santa Cruz Biotechnology)、抗體NBP1-28869、NBP2-33969、NBP2-33970及MAB4625 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab170238、ab213068及ab227624 (AbCam, Cambridge, MA)、抗體目錄編號：AM06314SU-N及AM32392PU-N (Origene, Rockville, MD)等。亦已知其他抗CD37抗體且包含(例如)彼闡述於美國專利公開案US20160051694A1、US20100189722、US20180186876及US20140348745及美國專利第US8333966B2號及第US8765917B2號中者。另外，用於檢測CD37表現之試劑已眾所周知。多個CD37臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000532008.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CD37表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR300873、shRNA產品編號TL314089、TR314089、TG314089、TF314089、TL314089V及CRISPR產品編號KN210768、來自Applied Biological Materials (K6910708)及來自Santa Cruz (sc-404423)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-42784及sc-44663)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CD37分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CD37分子。
術語「CXorf21」係指染色體X開放閱讀框21。在一些實施例中，位於人類中之染色體Xp上之基因CXorf21由3個外顯子組成。CXorf21基因在黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚及青蛙中係保守的。在一些實施例中，人類CXorf21蛋白具有301個胺基酸及/或33894 Da之分子質量。
術語「CXorf21」意欲包含其片段、變體(例如等位基因變體)及衍生物。代表性人類CXorf21 cDNA及人類CXorf21蛋白序列為業內所熟知且可自國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得(例如參見ncbi.nlm.nih.gov/gene/80231)。舉例而言，人類CXorf21 (NP_079435.1)可由轉錄物(NM_025159.2)編碼。除人類外之生物體中之CXorf21異種同源物之核酸及多肽序列已眾所周知且包含(例如)黑猩猩CXorf21 (XM_001134922.2及XP_001134922.1)、恒河猴CXorf21 (NM_001194018.1及NP_001180947.1)、狗CXorf21 (XM_005641222.3及XP_005641279.1；XM_005641223.3及XP_005641280.1；XM_022416085.1及XP_022271793.1；及XM_022416084.1及XP_022271792.1)、牛CXorf21 (NM_001038537.2及NP_001033626.1)、小鼠CXorf21 (NM_001163539.1及NP_001157011.1)、大鼠CXorf21 (NM_001109318.1及NP_001102788.1)及雞CXorf21 (XM_003640512.4及XP_003640560.1)。CXorf21異種同源物之代表性序列呈現於下文之表2中。
適於檢測CXorf21蛋白之抗CXorf21抗體為業內所熟知且包含(例如)抗體NBP1-82317及H00080231-B01P (Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗體ab69152 (AbCam, Cambridge, MA)等。另外，用於檢測CXorf21表現之試劑已眾所周知。多個CXorf21臨床測試可在NIH Genetic Testing Registry (GTR®)中獲得(例如GTR測試編號：GTR000537724.2，由Fulgent Clinical Diagnostics Lab (Temple City, CA)提供)。此外，用於減小CXorf21表現之多種siRNA、shRNA、CRISPR構築體可發現於上文所提及公司之商業產品清單中，例如來自Origene Technologies (Rockville, MD)之siRNA產品編號SR312858、shRNA產品編號TL314126、TR305156、TG305156、TF305156、TL305156V及CRISPR產品編號KN204618及KN300469、來自Applied Biological Materials (K0537008)及來自Santa Cruz (sc-413367)之CRISPR gRNA產品及來自Santa Cruz之RNAi產品(目錄編號sc-91192及sc-140364)。應注意，該術語可進一步用於係指本文針對CXorf21分子所闡述特徵之任一組合。舉例而言，可使用序列組成、一致性百分比、序列長度、結構域結構、功能活性等之任一組合來闡述本發明所涵蓋之CXorf21分子。
表 1 SIGLEC9 VSIG4 CD74 CD207 LRRC25 SELPLG AIF1 CD84 IGSF6 CD48 CD33 LST1 TNFAIP8L2 (TIPE2) SPI1 (PU.1) LILRB2 CCR5 EVI2B CLEC7A TBXAS1 SIGLEC7 DOCK2
SEQ ID NO: 1 人類 SIGLEC9 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001198558.1; CDS: 96-1535)
Figure 02_image029
Figure 02_image031
SEQ ID NO: 2 人類 SIGLEC9 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001185487.1)
Figure 02_image033
SEQ ID NO: 3 人類 SIGLEC9 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_014441.2; CDS: 96-1487)
Figure 02_image035
SEQ ID NO: 4 人類 SIGLEC9 同種型 2 胺基 酸 序列 (NP_055256.1)
Figure 02_image037
Figure 02_image039
SEQ ID NO: 5 小鼠 SIGLEC9 cDNA 序列 (NM_031181.2; CDS: 30-1433)
Figure 02_image041
SEQ ID NO: 6 小鼠 SIGLEC9 胺基酸序列 (NP_112458.2)
Figure 02_image043
SEQ ID NO: 7 人類 VSIG4 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_007268.2; CDS: 128-1327)
Figure 02_image045
Figure 02_image047
SEQ ID NO: 8 人類 VSIG4 同種型 1 胺基酸序列 (NP_009199.1)
Figure 02_image049
SEQ ID NO: 9 人類 VSIG4 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001100431.1; CDS: 128-1045)
Figure 02_image051
Figure 02_image053
SEQ ID NO: 10 人類 VSIG4 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001093901.1)
Figure 02_image055
SEQ ID NO: 11 人類 VSIG4 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001184831.1; CDS: 128-811)
Figure 02_image057
SEQ ID NO: 12 人類 VSIG4 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001171760.1)
Figure 02_image059
SEQ ID NO: 13 人類 VSIG4 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_001184830.1; CDS: 128-1093)
Figure 02_image061
SEQ ID NO: 14 人類 VSIG4 同種型 4 胺基酸序列 (NP_001171759.1)
Figure 02_image063
SEQ ID NO: 15 人類 VSIG4 轉錄物變體 5 cDNA 序列 (NM_001257403.1; CDS: 128-1171)
Figure 02_image065
SEQ ID NO: 16 人類 VSIG4 同種型 5 胺基酸序列 (NP_001244332.1)
Figure 02_image067
SEQ ID NO: 17 小鼠 VSIG4 cDNA 序列 (NM_177789.4; CDS: 71-913)
Figure 02_image069
Figure 02_image071
SEQ ID NO: 18 小鼠 VSIG4 胺基酸序列 (NP_808457.1)
Figure 02_image073
SEQ ID NO: 19 人類 CD74 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001025159.2; CDS: 188-1078)
Figure 02_image075
SEQ ID NO: 20 人類 CD74 同種型 A 胺基酸序列 (NP_001020330.1)
Figure 02_image077
SEQ ID NO: 21 人類 CD74 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_004355.3; CDS: 188-886)
Figure 02_image079
Figure 02_image081
SEQ ID NO: 22 人類 CD74 同種型 B 胺基酸序列 (NP_004346.1)
Figure 02_image083
SEQ ID NO: 23 人類 CD74 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001025158.2; CDS: 188-670)
Figure 02_image085
SEQ ID NO: 24 人類 CD74 同種型 C 胺基酸序列 (NP_001020329.1)
Figure 02_image087
SEQ ID NO: 25 小鼠 CD74 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001042605.1; CDS: 86-925)
Figure 02_image089
SEQ ID NO: 26 小鼠 CD74 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001036070.1)
Figure 02_image091
SEQ ID NO: 27 小鼠 CD74 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_010545.3; CDS: 86-733)
Figure 02_image093
Figure 02_image095
SEQ ID NO: 28 小鼠 CD74 同種型 2 胺基酸序列 (NP_034675.1)
Figure 02_image097
SEQ ID NO: 29 人類 CD207 cDNA 序列 (NM_015717.4; CDS: 48-1034)
Figure 02_image099
SEQ ID NO: 30 人類 CD207 胺基酸序列 (NP_056532.4)
Figure 02_image101
SEQ ID NO: 31 小鼠 CD207 cDNA 序列 (NM_144943.3; CDS: 59-1054)
Figure 02_image103
SEQ ID NO: 32 小鼠 CD207 胺基酸序列 (NP_659192.2)
Figure 02_image105
SEQ ID NO: 33 人類 LRRC25 cDNA 序列 (NM_145256.2; CDS: 643-1560)
Figure 02_image107
Figure 02_image109
SEQ ID NO: 34 人類 LRRC25 胺基酸序列 (NP_660299.2)
Figure 02_image111
SEQ ID NO: 35 小鼠 LRRC25 cDNA 序列 (NM_153074.3; CDS: 193-1086)
Figure 02_image113
SEQ ID NO: 36 小鼠 LRRC25 胺基酸序列 (NP_694714.1)
Figure 02_image115
SEQ ID NO: 37 人類 SELPLG 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001206609.1; CDS: 178-1464)
Figure 02_image117
SEQ ID NO: 38 人類 SELPLG 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001193538.1)
Figure 02_image119
SEQ ID NO: 39 人類 SELPLG 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_003006.4; CDS: 161-1399)
Figure 02_image121
SEQ ID NO: 40 人類 SELPLG 同種型 1 胺基酸序列 (NP_002997.2)
Figure 02_image123
SEQ ID NO: 41 小鼠 SELPLG cDNA 序列 (NM_009151.3; CDS: 159-1412)
Figure 02_image125
SEQ ID NO: 42 小鼠 SELPLG 胺基酸序列 (NP_033177.3)
Figure 02_image127
SEQ ID NO: 43 人類 AIF1 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_032955.2; CDS: 113-394)
Figure 02_image129
SEQ ID NO: 44 人類 AIF1 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_001318970.1; CDS: 223-504)
Figure 02_image131
SEQ ID NO: 45 人類 AIF1 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001305899.1 及 NP_116573.1)
Figure 02_image133
SEQ ID NO: 46 人類 AIF1 轉錄物變體 3 序列 (NM_001623.4; CDS: 122-565)
Figure 02_image135
SEQ ID NO: 47 人類 AIF1 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001614.3)
Figure 02_image137
SEQ ID NO: 48 小鼠 AIF1 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001361501.1; CDS: 369-812)
Figure 02_image139
SEQ ID NO: 49 小鼠 AIF1 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_019467.3; CDS: 366-809)
Figure 02_image141
SEQ ID NO: 50 小鼠 AIF1 同種型 A 胺基酸序列 (NP_001348430.1 及 NP_062340.1)
Figure 02_image143
SEQ ID NO: 51 小鼠 AIF1 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001361502.1; CDS: 194-634)
Figure 02_image145
Figure 02_image147
SEQ ID NO: 52 小鼠 AIF1 同種型 B 胺基酸序列 (NP_001348431.1)
Figure 02_image149
SEQ ID NO: 53 人類 CD84 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001184879.1; CDS: 80-1117)
Figure 02_image151
Figure 02_image153
Figure 02_image155
SEQ ID NO: 54 人類 CD84 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001171808.1)
Figure 02_image157
SEQ ID NO: 55 人類 CD84 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_003874.3; CDS: 80-1066)
Figure 02_image159
Figure 02_image161
Figure 02_image163
Figure 02_image165
SEQ ID NO: 56 人類 CD84 同種型 2 胺基酸序列 (NP_003865.1)
Figure 02_image167
SEQ ID NO: 57 人類 CD84 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001184881.1; CDS: 80-898)
Figure 02_image169
Figure 02_image171
Figure 02_image173
SEQ ID NO: 58 人類 CD84 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001171810.1)
Figure 02_image175
SEQ ID NO: 59 人類 CD84 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_001184882.1; CDS: 80-724)
Figure 02_image177
Figure 02_image179
Figure 02_image181
SEQ ID NO: 60 人類 CD84 同種型 4 胺基酸序列 (NP_001171811.1)
Figure 02_image183
SEQ ID NO: 61 人類 CD84 轉錄物變體 5 cDNA 序列 (NM_001330742.1; CDS: 80-1099)
Figure 02_image185
Figure 02_image187
Figure 02_image189
Figure 02_image191
SEQ ID NO: 62 人類 CD84 同種型 5 胺基酸序列 (NP_001317671.1)
Figure 02_image193
SEQ ID NO: 63 小鼠 CD84 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_013489.3; CDS: 180-1169)
Figure 02_image195
Figure 02_image197
SEQ ID NO: 64 小鼠 CD84 同種型 1 胺基酸序列 (NP_038517.1)
Figure 02_image199
SEQ ID NO: 65 小鼠 CD84 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001252472.1; CDS: 180-602)
Figure 02_image201
Figure 02_image203
SEQ ID NO: 66 小鼠 CD84 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001239401.1 )
Figure 02_image205
SEQ ID NO: 67 小鼠 CD84 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001289470.1; CDS: 180-1166)
Figure 02_image207
Figure 02_image209
SEQ ID NO: 68 小鼠 CD84 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001276399.1)
Figure 02_image211
SEQ ID NO: 69 人類 IGSF6 序列 (NM_005849.3; CDS: 69-794)
Figure 02_image213
Figure 02_image215
SEQ ID NO: 70 人類 IGSF6 胺基酸序列 (NP_005840.2)
Figure 02_image217
SEQ ID NO: 71 小鼠 IGSF6 cDNA 序列 (NM_030691.1)
Figure 02_image219
SEQ ID NO: 72 小鼠 IGSF6 胺基酸序列 (NP_109616.1)
Figure 02_image221
SEQ ID NO: 73 人類 CD48 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001778.3; CDS: 89-820)
Figure 02_image223
SEQ ID NO: 74 人類 CD48 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001769.2)
Figure 02_image225
SEQ ID NO: 75 人類 CD48 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001256030.1; CDS: 89-847)
Figure 02_image227
Figure 02_image229
SEQ ID NO: 76 人類 CD48 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001242959.1)
Figure 02_image231
SEQ ID NO: 77 小鼠 CD48 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_007649.5; CDS: 103-825)
Figure 02_image233
SEQ ID NO: 78 小鼠 CD48 同種型 1 胺基酸序列 (NP_031675.1)
Figure 02_image235
SEQ ID NO: 79 小鼠 CD48 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001360767.1; CDS: 103-558)
Figure 02_image237
Figure 02_image239
SEQ ID NO: 80 小鼠 CD48 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001347696.1)
Figure 02_image241
SEQ ID NO: 81 人類 CD33 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001772.3; CDS: 41-1135)
Figure 02_image243
SEQ ID NO: 82 人類 CD33 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001763.3)
Figure 02_image245
SEQ ID NO: 83 人類 CD33 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001082618.1; CDS: 41-754)
Figure 02_image247
SEQ ID NO: 84 人類 CD33 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001076087.1)
Figure 02_image249
SEQ ID NO: 85 人類 CD33 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001177608.1; CDS: 41-973)
Figure 02_image251
SEQ ID NO: 86 人類 CD33 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001171079.1)
Figure 02_image253
SEQ ID NO: 87 人類 LST1 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_007161.3; CDS: 101-415)
Figure 02_image255
SEQ ID NO: 88 人類 LST1 同種型 1 胺基酸序列 (NP_009092.3)
Figure 02_image257
SEQ ID NO: 89 人類 LST1 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_205837.2; CDS: 210-410)
Figure 02_image259
SEQ ID NO: 90 人類 LST1 同種型 2 胺基酸序列 (NP_995309.2)
Figure 02_image261
SEQ ID NO: 91 人類 LST1 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_205838.2; CDS: 238-438)
Figure 02_image263
SEQ ID NO: 92 人類 LST1 同種型 3 胺基酸序列 (NP_995310.2)
Figure 02_image265
SEQ ID NO: 93 人類 LST1 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_205839.2; CDS:238-531)
Figure 02_image267
SEQ ID NO: 94 人類 LST1 同種型 4 胺基酸序列 (NP_995311.2)
Figure 02_image269
SEQ ID NO: 95 人類 LST1 轉錄物變體 5 cDNA 序列 (NM_205840.2; CDS: 101-280)
Figure 02_image271
SEQ ID NO: 96 人類 LST1 同種型 5 胺基酸序列 (NP_995312.2)
Figure 02_image273
SEQ ID NO: 97 人類 LST1 轉錄物變體 6 cDNA 序列 (NM_001166538.1; CDS: 101-322)
Figure 02_image275
SEQ ID NO: 98 人類 LST1 同種型 6 胺基酸序列 (NP_001160010.1)
Figure 02_image277
SEQ ID NO: 99 人類 TNFAIP8L2 cDNA 序列 (NM_024575.4; CDS: 127-681)
Figure 02_image279
SEQ ID NO: 100 人類 TNFAIP8L2 胺基酸序列 (NP_078851.2)
Figure 02_image281
SEQ ID NO: 101 小鼠 TNFAIP8L2 cDNA 序列 (NM_027206.2; CDS: 93-647)
Figure 02_image283
SEQ ID NO: 102 小鼠 TNFAIP8L2 胺基酸序列 (NP_081482.1)
Figure 02_image285
SEQ ID NO: 103 人類 SPI1 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001080547.1; CDS: 224-1039)
Figure 02_image287
SEQ ID NO: 104 人類 SPI1 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001074016.1)
Figure 02_image289
SEQ ID NO: 105 人類 SPI1 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_003120.2; CDS: 224-1036)
Figure 02_image291
Figure 02_image293
SEQ ID NO: 106 人類 SPI1 同種型 2 胺基酸序列 (NP_003111.2)
Figure 02_image295
SEQ ID NO: 107 小鼠 SPI1 cDNA 序列 (NM_011355.2; CDS: 272-1090)
Figure 02_image297
SEQ ID NO: 108 小鼠 SPI1 胺基酸序列 (NP_035485.1)
Figure 02_image299
SEQ ID NO: 109 人類 LILRB2 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_005874.4; CDS: 267-2063 )
Figure 02_image301
Figure 02_image303
SEQ ID NO: 110 人類 LILRB2 同種型 1 胺基酸序列 (NP_005865.3)
Figure 02_image305
Figure 02_image307
SEQ ID NO: 111 人類 LILRB2 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001080978.3; CDS: 267-2060)
Figure 02_image309
SEQ ID NO: 112 人類 LILRB2 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001074447.2 及 NP_001265332.2)
Figure 02_image311
SEQ ID NO: 113 人類 LILRB2 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001278403.2; CDS: 129-1922)
Figure 02_image313
Figure 02_image315
SEQ ID NO: 114 人類 LILRB2 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_001278404.2; CDS: 464-1912)
Figure 02_image317
Figure 02_image319
SEQ ID NO: 115 人類 LILRB2 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001265333.2)
Figure 02_image321
SEQ ID NO: 116 人類 LILRB2 轉錄物變體 5 cDNA 序列 (NM_001278405.2; CDS: 49-1581)
Figure 02_image323
Figure 02_image325
SEQ ID NO: 117 人類 LILRB2 同種型 4 胺基酸序列 (NP_001265334.2)
Figure 02_image327
SEQ ID NO: 118 人類 LILRB2 轉錄物變體 6 cDNA 序列 (NM_001278406.2; CDS: 49-1416)
Figure 02_image329
SEQ ID NO: 119 人類 LILRB2 同種型 5 胺基酸序列 (NP_001265335.2)
Figure 02_image331
SEQ ID NO: 120 人類 CCR5 轉錄物變體 A cDNA 序列 (NM_000579.3; CDS: 358-1416)
Figure 02_image333
Figure 02_image335
SEQ ID NO: 121 人類 CCR5 轉錄物變體 B cDNA 序列 (NM_001100168.1; CDS: 123-1181)
Figure 02_image337
Figure 02_image339
SEQ ID NO: 122 人類 CCR5 胺基酸序列 (NP_000570.1 及 NP_001093638.1)
Figure 02_image341
SEQ ID NO: 123 人類 EVI2B cDNA 序列 (NM_006495.3; CDS: 156-1502)
Figure 02_image343
Figure 02_image345
SEQ ID NO: 124 人類 EVI2B 胺基酸序列 (NP_006486.3)
Figure 02_image347
SEQ ID NO: 125 小鼠 EVI2B cDNA 序列 (NM_001077496.1; CDS: 167-1501)
Figure 02_image349
Figure 02_image351
SEQ ID NO: 126 小鼠 EVI2B 胺基酸序列 (NP_001070964.1)
Figure 02_image353
SEQ ID NO: 127 人類 CLEC7A 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_197947.2; CDS: 188-931)
Figure 02_image355
Figure 02_image357
SEQ ID NO: 128 人類 CLEC7A 同種型 A 胺基酸序列 (NP_922938.1)
Figure 02_image359
SEQ ID NO: 129 人類 CLEC7A 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_022570.4; CDS: 188-793)
Figure 02_image361
Figure 02_image363
SEQ ID NO: 130 人類 CLEC7A 同種型 B 胺基酸序列 (NP_072092.2)
Figure 02_image365
SEQ ID NO: 131 人類 CLEC7A 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_197948.2; CDS: 188-757)
Figure 02_image367
Figure 02_image369
SEQ ID NO: 132 人類 CLEC7A 同種型 C 胺基酸序列 (NP_922939.1)
Figure 02_image371
SEQ ID NO: 133 人類 CLEC7A 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_197949.2)
Figure 02_image373
Figure 02_image375
SEQ ID NO: 134 人類 CLEC7A 同種型 D 胺基酸序列 (NP_922940.1)
Figure 02_image377
SEQ ID NO: 135 人類 CLEC7A 轉錄物變體 5 cDNA 序列 (NM_197950.2; CDS: 188-694)
Figure 02_image379
SEQ ID NO: 136 人類 CLEC7A 同種型 E 胺基酸序列 (NP_922941.1)
Figure 02_image381
SEQ ID NO: 137 人類 CLEC7A 轉錄物變體 6 cDNA 序列 (NM_197954.2; CDS: 188-421)
Figure 02_image383
SEQ ID NO: 138 人類 CLEC7A 同種型 F 胺基酸序列 (NP_922945.1)
Figure 02_image385
SEQ ID NO: 139 小鼠 CLEC7A 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001309637.1; CDS: 95-694)
Figure 02_image387
SEQ ID NO: 140 小鼠 CLEC7A 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001296566.1)
Figure 02_image389
SEQ ID NO: 141 小鼠 CLEC7A 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_020008.3; CDS: 95-829)
Figure 02_image391
SEQ ID NO: 142 小鼠 CLEC7A 同種型 1 胺基酸序列 (NP_064392.2)
Figure 02_image393
SEQ ID NO: 143 人類 TBXAS1 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001061.4; CDS: 236-1840)
Figure 02_image395
SEQ ID NO: 144 人類 TBXAS1 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001052.2 及 NP_001124438.1)
Figure 02_image397
SEQ ID NO: 145 人類 TBXAS1 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_030984.3; CDS: 236-1618)
Figure 02_image399
Figure 02_image401
SEQ ID NO: 146 人類 TBXAS1 同種型 2 胺基酸序列 (NP_112246.2)
Figure 02_image403
SEQ ID NO: 147 人類 TBXAS1 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001130966.2; CDS: 539-2143)
Figure 02_image405
Figure 02_image407
SEQ ID NO: 148 人類 TBXAS1 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_001166253.1; CDS: 236-1978)
Figure 02_image409
Figure 02_image411
SEQ ID NO: 149 人類 TBXAS1 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001159725.1)
Figure 02_image413
SEQ ID NO: 150 人類 TBXAS1 轉錄物變體 5 cDNA 序列 (NM_001166254.1; CDS: 490-1890)
Figure 02_image415
Figure 02_image417
SEQ ID NO: 151 人類 TBXAS1 同種型 4 胺基酸序列 (NP_001159726.1)
Figure 02_image419
SEQ ID NO: 152 人類 TBXAS1 轉錄物變體 6 cDNA 序列 (NM_001314028.1; CDS: 325-1869)
Figure 02_image421
SEQ ID NO: 153 人類 TBXAS1 同種型 5 胺基酸序列 (NP_001300957.1)
Figure 02_image423
SEQ ID NO: 154 小鼠 TBXAS1 cDNA 序列 (NM_011539.3; CDS: 168-1769)
Figure 02_image425
SEQ ID NO: 155 小鼠 TBXAS1 胺基酸序列 (NP_035669.3)
Figure 02_image427
Figure 02_image429
SEQ ID NO: 156 人類 SIGLEC7 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_014385.3; CDS: 70-1473)
Figure 02_image431
SEQ ID NO: 157 人類 SIGLEC7 同種型 1 胺基酸序列 (NP_055200.1)
Figure 02_image433
SEQ ID NO: 158 人類 SIGLEC7 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_016543.3; CDS: 70-1194)
Figure 02_image435
Figure 02_image437
SEQ ID NO: 159 人類 SIGLEC7 同種型 2 胺基酸序列 (NP_057627.2)
Figure 02_image439
SEQ ID NO: 160 人類 SIGLEC7 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001277201.1; CDS: 70-507)
Figure 02_image441
SEQ ID NO: 161 人類 SIGLEC7 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001264130.1)
Figure 02_image443
SEQ ID NO: 162 人類 DOCK2 胺基酸序列 (NP_004937.1)
Figure 02_image445
Figure 02_image447
SEQ ID NO: 163 人類 DOCK2 cDNA 序列 (NM_004946.3; CDS: 53-5545)
Figure 02_image449
Figure 02_image451
Figure 02_image453
SEQ ID NO: 164 小鼠 DOCK2 胺基酸序列 (NP_203538.2)
Figure 02_image455
SEQ ID NO: 165 小鼠 DOCK2 cDNA 序列 (NM_033374.3; CDS: 83-5569 )
Figure 02_image457
Figure 02_image459
Figure 02_image461
*表1中所列示之本發明所涵蓋生物標記物之核酸及多肽序列已以本文所提供之獨特識別符提交至GenBank，且提交至GenBank之每一該獨特識別之序列之全部內容以引用方式併入本文中。
*表1包含RNA核酸分子(例如胸苷經尿苷代替)、編碼所編碼蛋白質之異種同源物之核酸分子以及包括在全長中與表1中所列示任一可公開獲得之序列之核酸序列(例如參見下文)具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高一致性之核酸序列的DNA或RNA核酸序列或其部分。該等核酸分子可具有全長核酸之功能，如本文進一步所闡述。
*表1包含蛋白質之異種同源物以及包括在全長中與表1中所列示任一可公開獲得之序列之核酸序列(例如參見下文)具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高一致性之核酸序列的多肽分子或其部分。該等多肽可具有全長多肽之功能，如下文進一步所闡述。
*表1包含所列示生物標記物之其他已知核酸及胺基酸序列。
表 2 CD53 FERMT3 CD37 CXorf21 CD48 CD84
SEQ ID NO: 166 人類 CD53 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001040033.1; CDS: 172-831)
Figure 02_image463
Figure 02_image465
SEQ ID NO: 167 人類 CD53 同種型 1 胺基酸序列 (NP_000551.1 及 NP_001035122.1)
Figure 02_image467
SEQ ID NO: 168 人類 CD53 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_000560.3; CDS: 167-826)
Figure 02_image469
Figure 02_image471
SEQ ID NO: 169 人類 CD53 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001307567.1)
Figure 02_image473
SEQ ID NO: 170 人類 CD53 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001320638.1; CDS: 167-649)
Figure 02_image475
SEQ ID NO: 171 小鼠 CD53 cDNA 序列 (NM_007651.3; CDS: 200-859)
Figure 02_image477
Figure 02_image479
SEQ ID NO: 172 小鼠 CD53 胺基酸序列 (NP_031677.1)
Figure 02_image481
SEQ ID NO: 173 人類 FERMT3 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_178443.2; CDS: 150-2153)
Figure 02_image483
Figure 02_image485
SEQ ID NO: 174 人類 FERMT3 同種型 1 胺基酸序列 (NP_848537.1)
Figure 02_image487
SEQ ID NO: 175 人類 FERMT3 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_031471.5; CDS: 150-2141)
Figure 02_image489
Figure 02_image491
SEQ ID NO: 176 人類 FERMT3 同種型 2 胺基酸序列 (NP_113659.3)
Figure 02_image493
SEQ ID NO: 177 小鼠 FERMT3 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001362399.1; CDS: 210-2207)
Figure 02_image495
Figure 02_image497
SEQ ID NO: 178 小鼠 FERMT3 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_153795.2; CDS: 207-2204)
Figure 02_image499
Figure 02_image501
SEQ ID NO: 179 小鼠 FERMT3 胺基酸序列 (NP_001349328.1 及 NP_722490.1)
Figure 02_image503
SEQ ID NO: 180 人類 CD37 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001774.2; CDS: 122-967)
Figure 02_image505
Figure 02_image507
SEQ ID NO: 181 人類 CD37 同種型 A 胺基酸序列 (NP_001765.1)
Figure 02_image509
SEQ ID NO: 182 人類 CD37 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001040031.1; CDS: 292-933)
Figure 02_image511
SEQ ID NO: 183 人類 CD37 同種型 B 胺基酸序列 (NP_001035120.1)
Figure 02_image513
SEQ ID NO: 184 小鼠 CD37 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001290802.1; CDS: 97-1008)
Figure 02_image515
Figure 02_image517
SEQ ID NO: 185 小鼠 CD37 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001277731.1)
Figure 02_image519
SEQ ID NO: 186 小鼠 CD37 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001290804.1; CDS: 97-933)
Figure 02_image521
SEQ ID NO: 187 小鼠 CD37 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001277733.1)
Figure 02_image523
SEQ ID NO: 188 小鼠 CD37 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_007645.4; CDS: 112-957)
Figure 02_image525
SEQ ID NO: 189 小鼠 CD37 同種型 3 胺基酸序列 (NP_031671.1)
Figure 02_image527
SEQ ID NO: 190 人類 CXorf21 cDNA 序列 (NM_025159.2; CDS: 396-1301)
Figure 02_image529
Figure 02_image531
SEQ ID NO: 191 人類 CXorf21 胺基酸序列 (NP_079435.1)
Figure 02_image533
SEQ ID NO: 192 小鼠 CXorf21 cDNA 序列 (NM_001163539.1; CDS: 166-1062)
Figure 02_image535
Figure 02_image537
SEQ ID NO: 193 小鼠 CXorf21 胺基酸序列 (NP_001157011.1)
Figure 02_image539
SEQ ID NO: 194 人類 CD48 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001778.3; CDS: 89-820)
Figure 02_image541
Figure 02_image543
SEQ ID NO: 195 人類 CD48 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001769.2)
Figure 02_image545
SEQ ID NO: 196 人類 CD48 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001256030.1; CDS: 89-847)
Figure 02_image547
SEQ ID NO: 197 人類 CD48 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001242959.1)
Figure 02_image549
SEQ ID NO: 198 小鼠 CD48 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_007649.5; CDS: 103-825)
Figure 02_image551
Figure 02_image553
SEQ ID NO: 199 小鼠 CD48 同種型 1 胺基酸序列 (NP_031675.1)
Figure 02_image555
SEQ ID NO: 200 小鼠 CD48 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001360767.1; CDS: 103-558)
Figure 02_image557
SEQ ID NO: 201 小鼠 CD48 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001347696.1)
Figure 02_image559
SEQ ID NO: 202 人類 CD84 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_001184879.1; CDS: 80-1117)
Figure 02_image561
Figure 02_image563
Figure 02_image565
Figure 02_image567
SEQ ID NO: 203 人類 CD84 同種型 1 胺基酸序列 (NP_001171808.1)
Figure 02_image569
SEQ ID NO: 204 人類 CD84 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_003874.3; CDS: 80-1066)
Figure 02_image571
Figure 02_image573
Figure 02_image575
SEQ ID NO: 205 人類 CD84 同種型 2 胺基酸序列 (NP_003865.1)
Figure 02_image577
SEQ ID NO: 206 人類 CD84 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001184881.1; CDS: 80-898)
Figure 02_image579
Figure 02_image581
Figure 02_image583
SEQ ID NO: 207 人類 CD84 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001171810.1)
Figure 02_image585
SEQ ID NO: 208 人類 CD84 轉錄物變體 4 cDNA 序列 (NM_001184882.1; CDS: 80-724)
Figure 02_image587
Figure 02_image589
Figure 02_image591
Figure 02_image593
SEQ ID NO: 209 人類 CD84 同種型 4 胺基酸序列 (NP_001171811.1)
Figure 02_image595
SEQ ID NO: 210 人類 CD84 轉錄物變體 5 cDNA 序列 (NM_001330742.1; CDS: 80-1099)
Figure 02_image597
Figure 02_image599
Figure 02_image601
SEQ ID NO: 211 人類 CD84 同種型 5 胺基酸序列 (NP_001317671.1)
Figure 02_image603
SEQ ID NO: 212 小鼠 CD84 轉錄物變體 1 cDNA 序列 (NM_013489.3; CDS: 180-1169)
Figure 02_image605
Figure 02_image607
SEQ ID NO: 213 小鼠 CD84 同種型 1 胺基酸序列 (NP_038517.1)
Figure 02_image609
SEQ ID NO: 214 小鼠 CD84 轉錄物變體 2 cDNA 序列 (NM_001252472.1; CDS: 180-602)
Figure 02_image611
Figure 02_image613
SEQ ID NO: 215 小鼠 CD84 同種型 2 胺基酸序列 (NP_001239401.1)
Figure 02_image615
SEQ ID NO: 216 小鼠 CD84 轉錄物變體 3 cDNA 序列 (NM_001289470.1; CDS: 180-1166)
Figure 02_image617
Figure 02_image619
SEQ ID NO: 217 小鼠 CD84 同種型 3 胺基酸序列 (NP_001276399.1)
Figure 02_image621
*表2中所列示之本發明所涵蓋生物標記物之核酸及多肽序列已以本文所提供之獨特識別符提交至GenBank，且提交至GenBank之每一該獨特識別之序列之全部內容以引用方式併入本文中。
*表2包含RNA核酸分子(例如胸苷經尿苷代替)、編碼所編碼蛋白質之異種同源物之核酸分子以及包括在全長中與表2中所列示任一可公開獲得之序列之核酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高一致性之核酸序列的DNA或RNA核酸序列或其部分。該等核酸分子可具有全長核酸之功能，如本文進一步所闡述。
*表2包含蛋白質之異種同源物以及包括在全長中與表2中所列示任一可公開獲得之序列之核酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高一致性之核酸序列的多肽分子或其部分。該等多肽可具有全長多肽之功能，如下文進一步所闡述。
*表2包含所列示生物標記物之其他已知核酸及胺基酸序列。
IV. 可用於調節靶及生物標記物之藥劑 本文證實，可藉由單獨或組合調節某些生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之拷貝數、量及/或活性來控制單核球及/或巨噬細胞之發炎表型，且調節發炎表型可調節免疫反應。因此，本發明提供調節至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之拷貝數、量及/或活性之組合物，該等組合物可上調或下調發炎表型且由此分別上調或下調免疫反應。本文亦闡述可檢測至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之拷貝數、量及/或活性之藥劑，其中該等藥劑可用於診斷、預後及篩選由至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)調介之效應。
下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑(例如下調本文所闡述之至少一種靶之藥劑，如抗體、siRNA及諸如此類)可增加單核球及/或巨噬細胞之發炎表型。
下調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑(例如下調本文所闡述之至少一種靶之藥劑，如抗體、siRNA及諸如此類)可降低單核球及/或巨噬細胞之發炎表型。
本發明涵蓋調節本文所闡述之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之任一藥劑。該藥劑可調節基因序列、拷貝數、基因表現、轉譯、轉譯後修飾、亞細胞局部化、降解、構形、穩定性、分泌、酶促活性、轉錄因子、受體活化、信號轉導及由至少一種生物標記物調介之其他生物化學功能。
該藥劑可結合任一細胞部分，例如受體、細胞膜、抗原決定子或存在於靶分子或靶細胞上之其他結合位點。在一些實施例中，該藥劑可擴散或傳輸至細胞中，其中藥劑可作用於細胞內。在一些實施例中，藥劑係基於細胞。
如下文進一步所闡述，代表性藥劑包含(但不限於)核酸(DNA及RNA)、寡核苷酸、多肽、肽、抗體、融合蛋白、抗生素、小分子、脂質/脂肪、糖、載體、偶聯物、疫苗、基因療法藥劑、細胞療法藥劑及諸如此類，例如小分子、編碼多肽之mRNA、CRISPR嚮導RNA (gRNA)、RNA干擾劑、小干擾RNA (siRNA)、CRISPR RNA (crRNA及tracrRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)、piwi-相互作用RNA (piRNA)、反義寡核苷酸、肽或肽模擬物抑制劑、適配體、結合且活化或抑制蛋白質生物標記物之天然配體及其衍生物、抗體、細胞內抗體或細胞，該等藥劑單獨存活或與其他藥劑進行組合。
在一些實施例中，調節至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)與天然結合配偶體之間之相互作用之藥劑可用於本發明。舉例而言，在一實施例中，直接阻斷生物標記物與其天然結合配偶體中之一或多者之間之相互作用的藥劑(例如阻斷抗體)可調節生物標記物活性且由此調節發炎表型。或者，可使用間接阻斷相互作用之藥劑。舉例而言，藉由結合至生物標記物天然結合配偶體或替代地藉由模擬生物標記物天然結合配偶體，可溶性蛋白質間接減小可用於結合至細胞上之各別蛋白質之生物標記物及/或生物標記物天然結合配偶體之有效濃度。實例性藥劑包含針對生物標記物或生物標記物天然結合配偶體之抗體，其阻斷生物標記物與天然結合配偶體之間之相互作用；非活化形式之生物標記物及/或生物標記物天然結合配偶體(例如顯性陰性多肽)；阻斷生物標記物與其天然結合配偶體之間之相互作用之小分子或肽；抑制生物標記物與其天然結合配偶體之間之相互作用之融合蛋白(例如融合至抗體或免疫球蛋白之Fc部分之生物標記物及/或其天然結合配偶體之細胞外部分)；阻斷生物標記物及/或其天然結合配偶體之轉錄或轉譯之核酸分子及/或基因修飾；非活化形式之生物標記物及/或其天然結合配偶體。
在其他實例性實施例中，本發明涵蓋促進生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)結合至一或多種天然結合配偶體之藥劑。調節此一相互作用之藥劑可直接或間接進行。因此，在一實施例中，直接增強生物標記物與生物標記物之天然結合配偶體之間之相互作用的藥劑係有用調節劑。或者，阻斷生物標記物及/或生物標記物之天然結合配偶體與其他結合配偶體之結合之藥劑增加了可用於彼此結合之兩種組分的有效濃度。實例性藥劑包含針對生物標記物及/或其天然結合配偶體之抗體、小分子及活化或促進生物標記物與其天然結合配偶體之間之相互作用之肽。
本發明所涵蓋之藥劑可包括任一數量、類型及模態。舉例而言，藥劑可包括1、2、3、4、5種或更多或其間之任一範圍(包含端值)數量之調節一種生物標記物或一種以上生物標記物之藥劑(例如2種調節表1或表2中所列示之相同靶之藥劑、一種調節表1中所列示靶之藥劑及調節表2中所列示靶之第二藥劑、siRNA及調節表2中所列示靶之抗體藥劑之組合、兩種調節表1中所列示單一靶之siRNA以及調節表2中所列示單一靶之單一siRNA之組合及調節表2中所列示不同靶之抗體藥劑等)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之調節劑進一步包括一或多種靶向吞噬細胞(例如單核球及/或巨噬細胞)之其他藥劑。該等單核球/巨噬細胞靶向劑包含(但不限於)靶向CD11b之羅維珠單抗(rovelizumab)、小分子(包含MNRP1685A，其靶向神經菌毛素(Neurophilin)-1)、靶向ANG2之奈斯庫單抗(nesvcumab)、對IL-4具有特異性之帕考珠單抗(pascolizumab)、對IL4Rα具有特異性之杜匹魯單抗(dupilumab)、對IL-6R具有特異性之托珠單抗(tocilizumab)及撒裡路單抗(sarilumab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、他奈西普(tanercept)、戈利木單抗(golimumab)及對TNF-α具有特異性之英夫利昔單抗(infliximab)及靶向CD40之CP-870及CP-893。
除下文及本文所闡述之藥劑外，業內已闡述調節本發明所涵蓋之所關注生物標記物之實例性藥劑(例如參見(i)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics, Inc.)在2019年6月4日提出申請之共同待決申請案U.S.S.N. 62/857,169，其標題為「Anti-PSGL-1 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof」；(ii)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics, Inc.)在2019年6月27日提出申請之共同待決申請案，其標題為「Anti-PSGL-1 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof」；(iii)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics, Inc.)在2019年6月4日提出申請之共同待決申請案U.S.S.N. 62/857,194，其標題為「Anti-SIGLEC-9 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof」；(iv)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics, Inc.)在2019年6月27日提出申請之共同待決申請案，其標題為「Anti-SIGLEC-9 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof」；(v)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics, Inc.)在2019年6月27日提出申請之共同待決申請案，其標題為「Anti-LRRC25 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof」；及(vi)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics, Inc.)在2019年6月27日提出申請之共同待決申請案，其標題為「Anti-CD53 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof」， 該等申請案中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中)。
1. 核酸藥劑 本發明所涵蓋之一態樣涉及使用核酸分子。核酸分子可為去氧核糖核酸(DNA)分子(例如cDNA、基因體DNA及諸如此類)、核糖核酸(RNA)分子(例如mRNA、長非編碼RNA、小RNA物質及諸如此類)、DNA/RNA雜合體及使用核苷酸類似物生成之DNA或RNA之類似物。RNA藥劑可包含RNAi (RNA干擾)藥劑(例如小干擾RNA (siRNA))、單鏈RNA (ssRNA)分子(例如反義寡核苷酸)或雙鏈RNA (dsRNA)分子。dsRNA分子包括第一鏈及第二鏈，其中第二鏈與第一鏈實質上互補，且第一鏈及第二鏈形成至少一個雙鏈體區域。dsRNA分子可具有鈍端或具有至少一個末端懸突。在用作結合靶核酸序列之藥劑時，本發明所涵蓋之核酸藥劑可雜交至靶序列(例如基因體序列及/或mRNA序列)之任一區域，包含(但不限於)增強子區域、啟動子區域、轉錄起始及/或終止區域、剪接位點、編碼區、3’-未轉譯區域(3’-UTR)、5’-未轉譯區域(5’-UTR)、5’帽、3’聚腺苷醯基尾部或其任一組合。
「經分離」核酸分子係與存在於核酸分子天然來源中之其他核酸分子所分離者。較佳地，「經分離」核酸分子不含天然側接於衍生核酸之生物體之基因體DNA中之核酸的序列(較佳地蛋白質編碼序列，亦即位於核酸之5'端及3'端之序列)。舉例而言，在各個實施例中，分離核酸分子可含有小於約5 kB、4 kB、3 kB、2 kB、1 kB、0.5 kB或0.1 kB天然側接於衍生核酸之細胞之基因體DNA中之核酸分子的核苷酸序列。此外，「經分離」核酸分子(例如cDNA分子)可在藉由重組技術產生時實質上不含其他細胞材料或培養基，或在以化學方式合成時實質上不含化學前體或其他化學物質。
可使用標準分子生物學技術及本文所闡述資料庫記錄中之序列資訊來分離本發明所涵蓋之核酸分子。使用該等核酸序列之全部或一部分，可使用標準雜交及選殖技術來分離本發明所涵蓋之核酸分子(例如如Sambrook等人編輯，Molecular Cloning:  A Laboratory Manual ， 第4 版 ， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2012中所闡述)。
可使用cDNA、mRNA或基因體DNA (作為模板)及適當寡核苷酸引子根據標準PCR擴增技術來擴增本發明所涵蓋之核酸分子。可將如此擴增之核酸分子選殖至適當載體中並藉由DNA序列分析進行表徵。另外，可藉由標準合成技術(例如)使用自動化核酸合成器來製備對應於本發明所涵蓋核酸分子之全部或一部分之核酸分子。或者，可以生物方式使用亞選殖核酸之表現載體來產生核酸分子。舉例而言，可以反義定向選殖反義核酸分子(亦即，自插入核酸轉錄之RNA與所關注靶核酸具有反義定向，如下文進一步所闡述)。
此外，本發明所涵蓋之核酸分子可僅包括核酸序列之一部分，其中全長核酸序列包括本發明所涵蓋之標記物或編碼對應於本發明所涵蓋之標記物之多肽。可使用該等核酸分子作為(例如)探針或引子。探針/引子通常係以一或多種實質上純化之寡核苷酸形式來使用。寡核苷酸通常包括在嚴格條件下雜交至生物標記物核酸序列之至少約7、較佳地約15、更佳地約25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400或更多個連續核苷酸之核苷酸序列區域。可使用基於生物標記物核酸分子之序列之探針來檢測對應於本發明所涵蓋一或多個標記物之轉錄物或基因體序列。探針包括附接至其之標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。
亦涵蓋因基因代碼簡並性而與編碼對應於生物標記物之蛋白質之核酸分子之核苷酸序列不同且由此編碼相同蛋白質的生物標記物核酸分子。
另外，熟習此項技術者將瞭解，在群體(例如人類群體)內可存在引起胺基酸序列變化之DNA序列多型性。在群體內之個體之間可由於天然等位基因變異而存在該等基因多型性。等位基因係在給定遺傳基因座替代性存在之一組基因中之一者。另外，應瞭解，亦可存在影響RNA表現程度之DNA多型性，其可影響該基因之總體表現程度(例如藉由影響調節或降解)。
術語「等位基因」可在本文中與「等位基因變體」互換使用，其係指替代形式之基因或其部分。等位基因佔據同源染色體上之相同基因座或位置。在個體具有基因之兩個相同等位基因時，該個體可視為對於該基因或等位基因為純合性。在個體具有基因之兩個不同等位基因時，該個體可視為對於該基因或等位基因為雜合性。舉例而言，生物標記物等位基因可在單一核苷酸或若干核苷酸中彼此不同，且可包含核苷酸之取代、缺失及插入。基因之等位基因亦可呈含有一或多種突變之基因形式。
術語「基因之多型區域之等位基因變體」或「等位基因變體」可在本文中互換使用且係指替代形式之具有發現於群體中之該基因區域中之若干可能核苷酸序列之一的基因。如本文中所使用，等位基因變體意欲涵蓋功能性等位基因變體、非功能性等位基因變體、SNP、突變及多型性。
術語「單一核苷酸多型性」 (SNP)係指由單一核苷酸佔據之多型位點，其係等位基因序列之間之變化位點。該位點之前後通常具有高度保守之等位基因序列(例如在群體之小於1/100或1/1000成員中有所變化之序列)。SNP通常源自使用一種核苷酸取代多型位點處之另一者。SNP亦可源自相對於參考等位基因缺失核苷酸或插入核苷酸。通常，多型位點由除參考鹼基外之鹼基佔據。舉例而言，在參考等位基因在多型位點處含有鹼基「T」 (胸苷)之情形下，改變之等位基因可在該多型位點處含有「C」 (胞苷)、「G」 (鳥嘌呤)或「A」 (腺嘌呤)。SNP可出現於編碼蛋白質之核酸序列中，在該情形下其可產生缺陷性蛋白質或另外變體蛋白或基因疾病。此一SNP可改變基因之編碼序列且由此指定另一胺基酸(「誤義」 SNP)或SNP可引入終止密碼子(「無義」 SNP)。在SNP不改變蛋白質之胺基酸序列時，SNP稱為「沉默的」。SNP亦可出現於核苷酸序列之非編碼區域中。此可(例如)因交替剪接而產生缺陷性蛋白質表現，或其可對蛋白質功能無效應。
如本文中所使用，術語「基因」及「重組基因」係指包括編碼對應於本發明所涵蓋標記物之多肽之開放閱讀框之核酸分子。該等天然等位基因變化通常可引起給定基因之核苷酸序列中的1-5%變化。可藉由對諸多不同個體中之所關注基因測序來鑑別替代等位基因。此可藉由使用雜交探針鑑別多個個體中之相同遺傳基因座容易地實施。任一及所有該等核苷酸變化及因天然等位基因變化產生且不改變功能活性之所得胺基酸多型性或變化意欲在本發明所涵蓋之範圍內。
在另一實施例中，生物標記物核酸分子可長至少7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500或更多個核苷酸且在嚴格條件下雜交至對應於本發明所涵蓋標記物之核酸分子或雜交至編碼對應於本發明所涵蓋標記物之蛋白質之核酸分子。術語「在嚴格條件下雜交」意欲闡述彼此至少60% (65%、70%、75%、80%、較佳地85%)一致之核苷酸序列通常保持彼此雜交之雜交及洗滌條件。該等嚴格條件為熟習此項技術者所習知且可參見Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, N.Y. (1989)之部分6.3.1-6.3.6。嚴格雜交條件之較佳非限制性實例係在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45℃下雜交，隨後在0.2× SSC、0.1% SDS中在50-65℃下洗滌一或多次。
除可存在於群體中之本發明所涵蓋之核酸分子之天然等位基因變體外，熟習此項技術者進一步應瞭解，可藉由突變引入序列變化，由此改變所編碼蛋白質之胺基酸序列且並不改變由此編碼之蛋白質之生物活性。舉例而言，可進行核苷酸取代以在「非必需」胺基酸殘基處產生胺基酸取代。「非必需」胺基酸殘基係可自野生型序列改變而不改變生物活性之殘基，而「必需」胺基酸殘基係生物活性所需。舉例而言，在各種物質之同系物中並不保守或僅半保守之胺基酸殘基可對於活性而言係非必需的且由此係用於改變之適當靶。或者，在各種物種(例如鼠類及人類)之同系物中保守之胺基酸殘基可對於活性而言係必需的且由此並非用於改變之適當靶。
因此，本發明所涵蓋之另一態樣涵蓋編碼本發明所涵蓋多肽之核酸分子，該等核酸分子含有對於活性而言非必需之胺基酸殘基之變化。該等多肽之胺基酸序列不同於對應於本發明所涵蓋標記物之天然蛋白質，但保留生物活性。在一實施例中，生物標記物蛋白具有與本文所闡述生物標記物蛋白之胺基酸序列至少約40%一致、50%、60%、70%、75%、80%、83%、85%、87.5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列。
可藉由以下方式來產生編碼變體蛋白之經分離核酸分子：將一或多個核苷酸取代、添加或缺失引入本發明所涵蓋核酸之核苷酸序列中，從而將一或多個胺基酸殘基取代、添加或缺失引入所編碼蛋白質中。可藉由標準技術(例如定點誘變及PCR調介之誘變)引入突變。較佳地，在一或多個所預測非必需胺基酸殘基處達成保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基代替之取代。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。該等家族包含具有以下側鏈之胺基酸：鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(例如甘胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-具支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。或者，可沿編碼序列之全部或一部分(例如)藉由飽和誘變來隨機引入突變，且可針對生物活性來篩選所得突變體以鑑別保留活性之突變體。在誘變後，可以重組方式表現所編碼蛋白質且可測定蛋白質之活性。
如下文進一步所闡述，用於本發明之一些形式之核酸可用作抑制劑，其係指抑制生物靶之功能之藥劑。在一些實施例中，抑制劑係防止表現基因或基因產物之基因沉默劑。「基因沉默」通常稱為「基因敲低」。基因沉默可發生於轉錄層面上(亦即防止DNA轉錄成RNA)或轉譯層面上(亦即轉錄後沉默，亦即防止mRNA轉譯成蛋白質)。轉錄基因沉默之類型包含(例如)基因體印記、副突變、轉座子沉默、組織蛋白修飾、轉基因沉默、位置效應及RNA定向DNA甲基化。轉錄後基因沉默之實例包含RNA干擾(RNAi)、RNA沉默及無義調介之降解。基因沉默劑可經設計以沉默(例如抑制表現)特定基因或同時沉默多個基因。基因沉默劑可將基因及/或基因產物之表現減小至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約100%。在一些實施例中，基因沉默劑將基因及/或基因產物之表現減小至少約70%。
在一些實施例中，基因體中之核酸係有用的且可用作靶及/或藥劑。舉例而言，可使用業內熟知方法來操縱基因體中之靶DNA。可藉由缺失、插入及/或突變(逆轉錄病毒插入、人工染色體技術、基因插入、使用組織特異性啟動子之隨機插入、基因靶向、可轉座元件及/或用於引入外來DNA或產生經修飾DNA/經修飾核DNA之任一其他方法)來操縱基因體中之靶DNA。其他修飾技術包含自基因體缺失DNA序列及/或改變核DNA序列。舉例而言，可藉由定點誘變來改變核DNA序列。
a.信使 RNA (mRNA) 及 cDNA 在一些實施例中，可使用編碼靶蛋白及其變體之mRNA及/或cDNA作為調節所關注靶蛋白之量及/或活性之藥劑。可修飾mRNA及cDNA以增加穩定性及/或免疫原性，例如密碼子最佳化。
b.小干擾 RNA (siRNA) 在一些實施例中，核酸藥劑可為RNAi (RNA干擾)藥劑。RNAi藥劑可為單鏈RNA分子或雙鏈RNA分子，例如小(或短)干擾RNA (siRNA)分子。siRNA分子係具有有義鏈及反義鏈之雙鏈寡核苷酸或RNA分子，其中反義鏈與靶mRNA分子中之序列實質上互補。siRNA分子在細胞遞送時將誘導RNA干擾(RNAi)。RNAi係經由染色質重塑、抑制蛋白質轉譯或直接mRNA降解來達成基因沉默之轉錄後機制。在RNAi過程期間，小RNA分子(例如siRNA)被募集至RNA誘導之沉默複合物(RISC)處。此複合物能夠經由siRNA分子結合至實質性互補序列(亦即轉錄基因之mRNA)且藉由內核酸酶活性將其降解。此最終可抑制編碼與siRNA分子互補之mRNA之相應基因之表現(例如McManus及Sharp (2002)Nat. Rev. Genet . 3: 737-747)。
術語「雙鏈RNA」、「雙鏈體RNA」或「RNA雙鏈體」係指具有兩種條及至少一個雙鏈區域之RNA，且包含在雙鏈區域內或在兩個相鄰雙鏈區域之間具有至少一個間隙、切口、膨出部、環及/或泡狀體之RNA分子。若一條鏈在兩個雙鏈區域之間具有間隙或不匹配核苷酸之單鏈區域，則該鏈可視為具有多個片段。本文所用之雙鏈RNA可在任一端或兩端具有末端懸突。在一些實施例中，雙鏈體RNA之兩條鏈可經由某些化學連接體連接。
術語「反義鏈」係指與靶信使RNA具有實質性序列互補性之RNA鏈。反義鏈可為siRNA分子之一部分、miRNA/miRNA雙鏈體之一部分或單鏈成熟miRNA。
siRNA分子之有義鏈及反義鏈各自可包括約10至50個核苷酸或核苷酸類似物。較佳地，siRNA分子之有義鏈及反義鏈各自具有約15-45個核苷酸之長度。進一步較佳地，siRNA分子之反義鏈及有義鏈各自之長度為18至30個核苷酸或21至23個核苷酸，例如約18個核苷酸、約19個核苷酸、約20個核苷酸、約21個核苷酸、約22個核苷酸、約23個核苷酸、約24個核苷酸、約25個核苷酸、約26個核苷酸、約27個核苷酸、約28個核苷酸、約29個核苷酸或約30核苷酸。
siRNA分子之有義鏈及反義鏈形成雙鏈體區域。反義鏈包括與靶mRNA實質上互補(或替代地基本上由其組成或由其組成)之核苷酸序列以調介RNAi。
術語「實質上互補」係指siRNA分子之鹼基配對及雙鏈區域中之互補性。互補性未必係完全的；可存在任一數量之鹼基對失配，其並不影響雜交，即使在最不嚴格之雜交條件下。舉例而言，本發明所涵蓋siRNA分子之反義區可與靶mRNA分子之核酸序列至少約70%或更大程度互補、至少約75%或更大程度互補、至少約80%或更大程度互補或至少約85%或更大程度互補或至少約90%或更大程度互補或至少約91%或更大程度互補或至少約92%或更大程度互補或至少約93%或更大程度互補或至少約94%或更大程度互補或至少約95%或更大程度互補或至少約96%或更大程度互補或至少約97%或更大程度互補或至少約98%或更大程度互補或至少約99%或更大程度互補。
siRNA分子可進一步包含至少一個懸突區域，其中每一懸突區域具有6個或更少核苷酸。舉例而言，在siRNA分子之反義鏈及有義鏈對準時，在不對準鏈之末端存在至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個核苷酸(亦即在相對鏈中無互補鹼基)。在一些實例中，在將有義鏈及反義鏈退火時，懸突可出現於雙鏈體之一端或兩端。
在一些實例中，siRNA分子之反義區及有義區之長度、序列及其化學修飾之性質可有所變化。
c.微 RNA (miRNA) 及 Piwi- 相互作用 RNA (piRNA) 在一些實施例中，核酸分子可為miRNA、miRNA模擬物或miRNA抑制劑。miRNA係一類長21-25個核苷酸之天然、小非編碼RNA分子，其在轉錄後調控基因表現且係細胞RNAi機制之一部分。miRNA與信使RNA (mRNA)分子部分地互補，且其主要功能係經由轉譯抑制、mRNA裂解及去腺苷化來下調基因表現。
微RNA抑制劑係可用於使內源性miRNA沉默之安塔夠妙(antagomir)。miRNA模擬物(mimetic或mimic)係miRNA激動劑，且可用於代替內源性miRNA作為功能等效物且由此上調由該等內源性miRNA影響之路徑。
「Piwi-相互作用RNA (piRNA)」係最大種類之小非編碼RNA分子。piRNA經由與piwi蛋白之相互作用形成RNA-蛋白質複合物。該等piRNA複合物與生殖系細胞中之反轉錄轉座子及其他基因元件(尤其精子生成中者)之表觀遺傳及轉錄後基因沉默相關。其與微RNA (miRNA)具有不同大小(26-31 nt而非21-24 nt)，缺乏序列保守性，且具有增加之複雜性。然而，如同其他小RNA，piRNA可視為參與基因沉默、具體而言轉座子沉默。大部分piRNA對於轉座子序列而言係反義的，從而表明轉座子係piRNA靶。在哺乳動物中，轉座子沉默中之piRNA活性在胚胎發育期間似乎最為重要，且在C線蟲(C. elegan )及人類中，piRNA係精子生成所需。piRNA經由形成RNA誘導之沉默複合物(RISC)來用於RNA沉默。
d.反義核酸及寡核苷酸 在一些實施例中，核酸分子可包括反義核酸分子，例如與具有與靶mRNA互補及/或與雙鏈cDNA之編碼鏈互補之序列者。本發明所涵蓋之反義核酸分子可氫鍵結至整個編碼鏈或僅其一部分(例如蛋白質編碼區(或開放閱讀框)之全部或一部分) (亦即經其退火)，可與其互補。反義核酸分子亦可對於編碼所關注多肽之核苷酸序列中編碼鏈之非編碼區之全部或一部分係反義的。非編碼區(「5'及3'未轉譯區域」)係側接於編碼區且未轉譯成胺基酸之5'及3'序列。
在一些實施例中，核酸分子可包括寡核苷酸，包含反義寡核苷酸及有義寡核苷酸。寡核苷酸係在細胞攝取時可選擇性抑制靶蛋白之表現及功能之短單鏈核酸分子。反義寡核苷酸與靶mRNA互補及/或與雙鏈cDNA之編碼鏈互補且通常長10-50個核苷酸、較佳地長15-30個核苷酸更佳地長18-20個核苷酸。舉例而言，反義寡核苷酸可包括18個核苷酸或19個核苷酸或20個核苷酸或21個核苷酸或22個核苷酸或23個核苷酸或24個核苷酸或25個核苷酸或26個核苷酸或27個核苷酸或28個核苷酸或29個核苷酸或30個核苷酸。反義寡核苷酸可與靶mRNA形成雙鏈體且抑制其轉譯或處理，從而抑制蛋白質生物合成。反義寡核苷酸較佳地經設計以靶向起始劑密碼子、靶向基因之轉錄起始位點或內含子-外顯子接點。出於治療目的，可使用寡核苷酸選擇性阻斷與涉及疾病之巨噬細胞有關之靶蛋白表現。
反義寡核苷酸可經由以下各種機制來抑制基因表現：(1)藉由RNase H降解靶RNA/DNA寡核苷酸之間之複合物。該RNase H係DNA合成所需之普遍性核酶，其用作識別及裂解雙鏈體中之RNA之內核酸酶。大部分類型寡核苷酸(但非全部)與mRNA形成引導藉由RNase H之裂解之複合物；(2)抑制藉由核糖體複合物之轉譯；(3)在寡核苷酸經設計以針對內含子-外顯子接點時競爭mRNA剪接。
e.核酶及 DNA 酶 在一些實施例中，核酸分子可為核酶及DNA酶。核酶係保留催化活性之單鏈RNA分子，其能夠序列特異性地裂解RNA分子(例如參見Haselhoff及Gerlach (1988)Nature 334:585-591)。其藉由經由反義序列特異性雜交結合至靶且藉由裂解特定位點處之磷酸二酯主鏈來發揮作用。其結構係基於天然位點特異性、自裂解RNA分子。已基於獨特特徵闡述5類核酶，亦即四膜蟲I群組內含子、RNase P、錘頭狀核酶、髮夾核酶及δ肝炎病毒核酶。錘頭狀核酶藉由水解(若係3’-5’磷酸二酯鍵)裂解核苷酸序列U-H (H=A、C或U)處之RNA。髮夾核酶利用核苷酸序列C-U-G作為其裂解位點。在一些實施例中，核酶可藉由靶向所關注細胞中之過度表現基因來用於敲除療法。可基於對應於標記物之cDNA之核苷酸序列來設計對編碼對應於本發明所涵蓋標記物之多肽之核酸分子具有特異性的核酶。舉例而言，可構築四膜蟲L-19 IVS RNA之衍生物，其中活性位點之核苷酸序列與擬裂解核苷酸序列互補(例如參見美國專利第4,987,071號及第5,116,742號)。或者，可使用編碼所關注多肽之mRNA自一組RNA分子來選擇具有特異性核糖核酸酶活性之催化RNA (例如參見Bartel及Szostak (1993)Science 261:1411-1418)。
DNA酶係具有較大生物穩定性之核酶類似物，其中RNA主鏈由賦予改良之生物穩定性之DNA基序代替。
f.適配體 在一些實施例中，核酸分子可為適配體。DNA或RNA適配體係可與靶蛋白直接相互作用且干擾其活性之雙鏈(亦即DNA適配體)或單鏈(亦即RNA適配體)核酸區段。通常，「適配體」係結合至特異性靶分子之寡核苷酸或肽分子。「核酸適配體」係已經由多輪活體外選擇或等效地SELEX (指數富集之配體系統進化技術)進行改造以結合至各種分子靶(例如小分子、蛋白質、核酸及甚至細胞、組織及生物體)之核酸物質。「肽適配體」係經選擇或改造以結合特異性靶分子之人工蛋白質。該等蛋白質由顯示為蛋白質支架之可變序列之一或多個肽環組成。其通常自組合庫分離且通常隨後來藉由定向突變或數輪可變區誘變及選擇進行改良。「黏合素蛋白」 (肽適配體之進化物)係經改造以顯示肽環之較小高度穩定性蛋白質，其提供用於特異性靶蛋白之高親和力結合表面。其係低分子量蛋白質(12-14 kDa)，且衍生自胱蛋白之半胱胺酸蛋白酶抑制劑家族。適配體可用於生物技術及治療應用，此乃因其提供與常用生物分子、抗體匹敵之分子識別性質。除獨特識別外，適配體亦較抗體提供優點，此乃因其可在測試管中完全改造，易於藉由化學合成產生，擁有期望儲存性質，且在治療應用中誘發極少免疫原性。在一些實施例中，可使用適配體來調節涉及疾病之巨噬細胞之靶蛋白之分子功能。在一些情況下，因對靶蛋白之特異性及親和力、非免疫原性及醫藥調配物之穩定性，故適配體在蛋白質抑制方面優於抗體。
g.核酸誘餌 在一些實施例中，核酸分子可為誘餌DNA或誘餌RNA。核酸誘餌尤其可用於靶向轉錄因子。RNA誘餌係經特定設計之小RNA分子，其提供用作轉譯活化劑或mRNA穩定元件之蛋白質之替代競爭性結合位點。可使用RNA誘餌來防止mRNA分子之轉譯或誘導不穩定性且最終將其破壞。在一些實例中，可使用對應於關鍵順式作用性調控元件之過度表現之短RNA分子作為反式活化蛋白之誘餌，由此防止該等反式活化劑結合至其相應順式作用元件。
在其他實例中，誘餌可為對靶向蛋白具有高結合親和力之雙鏈核酸分子(例如DNA)，該靶向蛋白尤其係作為調節(增加或降低)巨噬細胞中一或多種特定基因之轉錄速率之序列特異性雙鏈DNA結合蛋白之轉錄因子。
h.核酸嵌合體 在一些實施例中，核酸分子可為核酸嵌合體。核酸嵌合體係不同類型之經設計以調節巨噬細胞相關靶蛋白之核酸分子之偶聯物。舉例而言，可使用結合至細胞表面受體(作為載體)之細胞內化性DNA或RNA適配體及對靶蛋白具有特異性之siRNA分子(或miRNA)之偶聯物作為一種巨噬細胞調控方式。適配體-siRNA嵌合體可改良遞送及治療效應。
i.三重螺旋結構 在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可形成三重螺旋結構。舉例而言，可藉由靶向與編碼多肽之基因之調控區(例如啟動子及/或增強子)互補之核苷酸序列以形成三重螺旋結構來抑制所關注蛋白質的表現，該三重螺旋結構可防止靶細胞中之基因轉錄(例如參見Helene (1991)Anticancer Drug Des. 6:569-584；Helene (1992)Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36；Maher (1992)Bioassays 14:807-815)。該等核酸可經由雙重螺旋之大溝中之特異性相互作用結合至DNA雙鏈體。
j.核酸修飾及變體 在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可含有一或多種化學修飾。該等修飾並不損害核酸分子之活性。業內熟知之化學修飾能夠增加核酸分子之穩定性、可用性及/或細胞攝取。在一實施例中，可使用修飾來改良降解(藉由核酸酶)抗性或改良細胞對核酸分子之攝取。在一些實施例中，與相應未修飾核酸分子相比，本發明所涵蓋之經修飾核酸分子可具有增強之靶效率。
在一些實施例中，可最佳化本發明所涵蓋之核酸分子以(例如)增加表現，改良用於使靶基因沉默之基因沉默之有效性，及諸如此類。在另一實施例中，可使用修飾來增加或降低對靶mRNA及/或互補siRNA鏈中之互補核苷酸之親和力。在一些實施例中，可修飾本發明所涵蓋之siRNA以增加避免或調節細胞、組織或生物體中之免疫反應之能力。
在一些實施例中，可進一步修飾本發明所涵蓋之核酸分子以增加膜滲透性及/或至靶器官、組織及細胞之遞送。在一實例中，可修飾核酸分子以增加其至骨髓樣細胞、單核球及巨噬細胞之遞送。舉例而言，可修飾核酸分子，從而其特異性結合至表現於所選細胞表面上之受體或抗原，例如藉由使反義核酸分子連接至結合至細胞表面受體或抗原之肽或抗體來達成。核酸分子亦可修飾為靶向所關注細胞及/或選擇性表現於所關注細胞內之載體之一部分。
本發明所涵蓋之雙鏈體分子(例如siRNA分子)可包括經修飾有義鏈、經修飾反義鏈或經修飾有義鏈及反義鏈。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可為α-變旋異構核酸分子。α-變旋異構核酸分子與互補RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中與常見α單元不同，鏈彼此平行(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。反義核酸分子亦可包括2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett. 215:327-330)。
本發明所涵蓋之核酸分子可在5′端、3′端、5′及3′端及/或內部殘基或其任一組合處進行修飾。如本文所闡述，具有重複核苷酸殘基之天然核酸具有由糖及磷酸二酯組成之主鏈以及含氮鹼基(通常稱為核鹼基或簡稱為鹼基)。因此，經化學修飾之核苷酸可包含經修飾核鹼基、經修飾糖及/或非磷酸二酯鍵聯(亦即主鏈修飾)。在一些實施例中，修飾係不同種類之本文所闡述修飾之混合物，例如解鎖核單體劑(UNA)、經修飾帽結構、經修飾核苷間鍵聯及或核鹼基修飾之組合。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可進一步包括至少一種末端修飾或「帽」。
舉例而言，帽可為5′及/或3′-帽結構。術語「帽」及「端帽」包含核酸分子之每一鏈之任一末端處之化學修飾(關於末端核糖核苷酸)；及/或5′端最後兩個核苷酸及/或3′端最後兩個核苷酸之間之鍵聯處之修飾。帽結構可增加核酸分子對外核酸酶之抗性且並不損害與靶mRNA或細胞機構之分子相互作用。可基於其增加之活體外或活體內功效來選擇該等修飾。
帽可存在於5′-末端(5′-帽)或3′-末端(3′-帽)或可存在於此兩端。在某些實施例中，5′-及/或3′-帽獨立地選自硫代磷酸酯單磷酸酯、無鹼基殘基(部分)、硫代磷酸酯鍵聯、4′-硫基核苷酸、碳環核苷酸、二硫代磷酸酯鍵聯、倒轉核苷酸或倒轉無鹼基部分(2′-3′或3′-3′) (例如Invabasic X、Abasic II、無鹼基rSpacer/RNA及dSpacer)、二硫代磷酸酯單磷酸酯及甲基膦酸酯部分。在作為帽結構之一部分時，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鍵聯通常位於5′端之兩個末端核苷酸與3′端之兩個末端核苷酸之間。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子具有至少一個末端硫代磷酸酯單磷酸酯。硫代磷酸酯單磷酸酯可位於核酸分子之每一鏈之5′端及/或3′端處。在其他實施例中，核酸分子在有義鏈及/或反義鏈之5’末端及3’末端具有末端硫代磷酸酯單磷酸酯。硫代磷酸酯單磷酸酯可藉由抑制外核酸酶之作用來支持較高功效。
在一些實施例中，5′端處之修飾在有義鏈中較佳，且包括(例如) 5′-丙基胺基團。3′ OH末端修飾位於有義鏈、反義鏈或有義鏈及反義鏈中。3′端修飾包括(例如) 3′-嘌呤黴素(puromycin)、3′-生物素及諸如此類。
末端修飾亦可用於監測分佈，且在該等情形下，擬添加較佳基團包含螢光團(例如螢光黃或Alexa染料，例如Alexa 488)。末端修飾亦可用於增強攝取，用於此用途之有用修飾包含靶向配體。末端修飾亦可用於使寡核苷酸交叉連接至另一部分；可用於此用途之修飾包含絲裂黴素(mitomycin) C、補骨脂素(psoralen)及其衍生物。實例性5′-修飾包含(但不限於) 5′-單磷酸酯((HO)2 (O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2 (O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2 (O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-單硫基磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5′)；5′-單二硫基磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5′)；5′-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5′)；5′-α-硫基三磷酸酯；5′-β-硫基三磷酸酯；5′-γ-硫基三磷酸酯；5′-胺基磷酸酯((HO)2 (O)P-NH-5′, (HO)(NH2 )(O)P-O-5′)。其他5′-修飾包含5′-烷基膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5′, R=烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丙基等)、5′-烷基醚膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5′, R=烷基醚，例如甲氧基甲基(CH2 OMe)、乙氧基甲基等)。
在一些實施例中，核酸分子末端處之帽可為偶聯物，例如5’偶聯物。5’端偶聯物可抑制5’至3’外切性核酸裂解(例如萘普生(naproxen)；布洛芬(ibuprofen)；小烷基鏈；芳基；雜環偶聯物；經修飾糖(D-核糖、去氧核糖、葡萄糖等))。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可包含天然核鹼基之鹼基修飾及/或取代。
術語「未修飾」或「天然」核鹼基包含嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。在一些實施例中，核酸分子可包括一或多個核鹼基修飾之核苷酸。其可包括約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或更多個核鹼基修飾之核苷酸。在一些實例中，核酸分子可包括約1%至10%經修飾核苷酸或約10%至50%經修飾核苷酸。經修飾鹼基係指藉由代替或添加一或多個原子或基團進行修飾之核苷酸鹼基，例如腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、黃嘌呤、肌苷及辮苷。可包括針對鹼基部分修飾核苷酸之修飾類型之一些實例個別地或組合地包含(但不限於)烷基化、鹵化、硫醇化、胺化、醯胺化或乙醯化鹼基。更具體實例包含(例如) 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫基尿嘧啶、β-D-甘露糖基化辮苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷、2-硫基胞嘧啶、5-甲基-2-硫基尿嘧啶、2-硫基尿嘧啶、4-硫基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫基尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w及2,6-二胺基嘌呤、5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-胺基腺嘌呤、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷及在5位具有修飾之其他核苷酸、5-(2-胺基)丙基尿苷、5-鹵基胞苷、5-鹵基尿苷、4-乙醯基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、5-甲基胺基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、去氮雜核苷酸(例如7-去氮雜-腺苷)、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫基尿苷、其他硫基鹼基(例如2-硫基尿苷及4-硫基尿苷以及2-硫基胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、辮苷、古嘌苷、萘基及經取代萘基、任何O-及N-烷基化嘌呤及嘧啶(例如N6-甲基腺苷)、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基及經修飾苯基(例如胺基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、用作G形夾核苷酸之經修飾胞嘧啶、8-取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5-取代尿嘧啶及胸腺嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基胺基烷基核苷酸及烷基羰基烷基化核苷酸。經修飾核苷酸亦包含彼等針對糖部分進行修飾之核苷酸以及具有非核糖基糖或其類似物之核苷酸。舉例而言，糖部分可為或基於甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4′-硫基核糖及其他糖、雜環或碳環。
實例性經修飾核鹼基包含(但不限於)其他合成及天然經修飾核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫基尿嘧啶、2-硫基胸腺嘧啶及2-硫基胞嘧啶、5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫基尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫基烷基、8-羥基及其他8-取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基、尤其5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤及3-去氮雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。在一些特定實施例中，核鹼基修飾之核苷酸可用於本發明包含(但不限於)：5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖-胸苷、2-胺基嘌呤、5-氟-胞苷及5-氟-尿苷、2,6-二胺基嘌呤、4-硫基-尿苷；及5-胺基-烯丙基-尿苷及諸如此類。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子亦可含有具有鹼基類似物之核苷酸。
核鹼基可為天然非標準鹼基，例如CpG島、可與C、U或A鹼基配對之肌苷、硫基尿苷、二氫尿苷、辮苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、異鳥嘌呤核苷(isoguanisine)、殺結核菌素(tubercidine)及懷俄苷(wyosine)。其他類似物可包含螢光團(例如玫瑰紅、螢光黃)及其他螢光鹼基類似物，例如2-AP (2-胺基嘌呤)、3-MI、6-MI、6-MAP、吡咯并-dC、吡咯并-dC之經修飾及改良衍生物、呋喃修飾之鹼基及三環胞嘧啶家族(例如1,3-二氮雜-2-側氧基酚噻嗪(tC)；tC之側氧基-同源物(tCO )；1,3-二氮雜-2-側氧基酚噁嗪)。經核鹼基修飾之核苷酸亦可包含通用鹼基。舉例而言，通用鹼基包含(但不限於) 3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水松蕈素(nebularine)。術語「核苷酸」亦意欲包含N3′至P5′胺基磷酸酯，其係藉由使用胺基團取代核糖基3′氧所產生。如本文中所使用，通用核鹼基係任一可與所有4種天然核鹼基進行鹼基配對之經修飾核鹼基，該鹼基配對並不實質上影響熔化行為、藉由細胞內酶之識別或寡核苷酸雙鏈體之活性。一些實例性通用核鹼基包含(但不限於) 2,4-二氟甲苯、硝基吡咯基、硝基吲哚基、8-氮雜-7-去氮雜腺嘌呤、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基異卡波苯乙烯基(3-methyl isocarbostyrilyl)、5-甲基異卡波苯乙烯基、3-甲基-7-丙炔基異卡波苯乙烯基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、異卡波苯乙烯基、7-丙炔基異卡波苯乙烯基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、茋基、並四苯基、並五苯基及其結構衍生物。在一些實施例中，核酸分子之核苷酸可納入美國專利第6,008,334號、第6,107,039號、第6,664,058號、第7,678,894號、第7,786,292號及第7,956,171號、美國專利公開案第2013/122,506號及第2013/0296402號中所闡述之鹼基類似物及經修飾鹼基；如PCT專利公開案第WO 2012/061810號中所闡述之甲醯胺基修飾之鹼基。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之經修飾核酸分子可包括人工核酸類似物。
術語「人工核酸類似物」或簡稱「核酸類似物」係指在結構上類似於天然DNA或RNA之化合物。類似物之磷酸鹽主鏈、糖或核鹼基(亦即G、C、T、U及A)中之任一者可有所改變。在一些實施例中，經修飾核苷酸可為解鎖核單體劑(UNA)。UNA包含任一適於納入寡聚或聚合組合物(例如寡核苷酸或多核苷酸)中且參照核苷或核苷酸具有解鎖或非環狀糖部分之單體單元。在該等UNA包含於較大寡聚物或聚合物中之情形下，該較大寡聚物或聚合物(例如寡核苷酸)亦可稱為UNA寡聚物或UNA聚合物或UNA寡核苷酸。在UNA包含於標準核苷酸中之情形下，該變體核苷酸稱為UNA核苷酸。在UNA包含於標準核苷中之情形下，該變體核苷稱為UNA核苷。可使用UNA代替寡核苷酸中之核苷或核苷酸。在此情形下，UNA (不論係單體抑或含有單體之寡聚物)在業內通稱為「解鎖核酸」。在本文中稱為解鎖核酸時，熟習此項技術者應理解，發明者係提及UNA。根據本發明，UNA並非天然核單體劑。在一實施例中，核酸分子中之一或多個核苷酸可經一或多個解鎖核酸/核單體劑(UNA)部分(包含闡述於例如PCT公開案WO 2015/148580中者)代替。UNA寡聚物可為由UNA單體構成之鏈以及各種可基於天然核苷之核苷酸或經修飾核苷酸。已報導，UNA寡聚物之脫靶效應小於缺乏修飾之對應體寡核苷酸。可用於本發明之其他UNA修飾及應用包含任一揭示於以下案件中者：美國公開案US20150232851、美國專利US9051570、美國公開案US20150232849、歐洲公開案EP2162538、美國公開案US20150239926、美國公開案US20150239834、美國公開案US20150141678、國際公開案WO2015074085及/或歐洲公開案EP2370577。
在一些實施例中，具有主鏈類似物之人工核酸類似物包含(但不限於)雙環核苷酸類似物，例如鎖核酸(LNA)、橋核酸(BNA)、乙二醇核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)及嗎啉基。包括該等主鏈類似物之經修飾寡核苷酸儘管具有不同主鏈糖或在PNA之情形下使用胺基酸殘基代替磷酸核糖，但根據沃森及克裡克配對(Watson and Crick pairing)仍結合至RNA或DNA，且對核酸酶活性具有免疫性。LNA闡述於(例如)美國專利第6,268,490號、第6,316,198號、第6,403,566號、第6,770,748號、第6,998,484號、第6,670,461號及第7,034,133號、PCT公開案第99/14226號中。可納入本發明所涵蓋之核酸分子中之其他適宜鎖核苷酸包含闡述於美國專利第6,403,566號、第6,833,361號及第7,060,809號中者。其他鎖核酸衍生物(例如D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-胺基-LNA、α-L-胺基-LNA、硫基-LNA、α-L-硫基-LNA、硒基-LNA、亞甲基-LNA及β-D-ENA)可納入本發明所涵蓋之核酸分子中。彼等闡述於美國專利第7,569,575號、第8,084,458號及第8,429,390號中之LNA衍生物亦可納入核酸分子中。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可包括一或多個糖修飾之核苷酸。
其可包括約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10個或更多個糖修飾之核苷酸。可用於本發明中之糖修飾之核苷酸包含(但不限於)：2′-氟修飾之核糖核苷酸、2′-OMe修飾之核糖核苷酸、2′-去氧核糖核苷酸、2′-胺基修飾之核糖核苷酸及2′-硫基修飾之核糖核苷酸。經糖修飾之核苷酸可為(例如) 2′-氟-胞苷、2′-氟-尿苷、2′-氟-腺苷、2′-氟-鳥苷、2′-胺基-胞苷、2′-胺基-尿苷、2′-胺基-腺苷、2′-胺基-鳥苷或2′-胺基-丁醯基-芘-尿苷。除主鏈糖之2’修飾外，糖基團可在其他位置經修飾。糖基團可在糖之同一碳處包括兩種不同修飾。糖基團亦可含有一或多個與核糖中之相應碳擁有相反立體化學構形之碳。因此，核酸分子可包含含有(例如)阿拉伯糖作為糖之核苷酸。核苷酸可在糖上之1′位置具有α鍵聯，例如α-核苷。核苷酸亦可在4′-位具有相反構形，舉例而言，C5′及H4′或代替其之取代基彼此互換。在C5′及H4′或代替其之取代基彼此互換，則該糖可視為在4′位經修飾。
本發明所涵蓋之核酸分子亦可包含無鹼基糖，該等無鹼基糖在C-1′處缺乏核鹼基或在C1′處具有其他化學基團代替核鹼基(例如參見美國專利第5,998,203號)。該等無鹼基糖亦可進一步在一或多個組分糖原子處含有修飾。在其他實施例中，核酸分子亦可含有一或多種係L異構體之糖。在一態樣中，糖基團修飾亦可包含使用硫、視情況經取代氮或CH2 基團代替4′-O。在另一態樣中，糖基團修飾亦可包含非環狀核苷酸，其中核糖碳之間之C-C鍵不存在及/或至少一個核糖碳或氧獨立地或組合地不存在於核苷酸中。該等非環狀核苷酸已揭示於美國專利第5,047,533號及第7,737,273號及美國專利公開案第20130130378號中，。應理解，在特定核苷酸經由其2′-位連接至下一核苷酸時，本文所闡述之糖修飾可位於特定核苷酸之糖之3′-位，例如經由2′-位連接之核苷酸。3′位之修飾可以木糖構形存在。本文所用之術語「木糖構形」係指核糖之C3′上之取代基佈置與木糖中的3′-OH具有相同構形。附接至糖基團之C4′及/或C1′之氫可由如針對2’修飾所闡述之取代基代替。在一實例中，本發明所涵蓋之核酸分子可包括2′-氟修飾之核糖核苷酸。較佳地，2′-氟核糖核苷酸位於有義鏈及反義鏈中。更佳地，2′-氟核糖核苷酸係每一尿苷及胞苷。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子之核苷間鍵聯基團經修飾。
核苷間鍵聯修飾可位於有義鏈內、反義鏈內或有義鏈及反義鏈內。術語「核苷間鍵聯基團」欲指能夠使兩個核鹼基(例如DNA殘基之間、RNA殘基之間、DNA及RNA殘基以及核苷酸類似物之間、兩個非LNA殘基之間、非LNA殘基與LNA殘基之間及兩個LNA殘基之間，等等)以共價方式偶合至一起之基團。天然標準鍵聯係由-O-P(O)2 -O- (自5’端至3’端)組成之磷酸二酯鍵聯(PO鍵聯)，其中去氧核糖/核糖在3'-羥基及5'-羥基處接合至酯連接(亦稱為「磷酸二酯」鍵/連接體)中之磷酸酯基團。可藉由使用氮(橋接磷醯胺酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)代替一或兩個連接性氧(亦即連接磷酸酯與核苷之氧)來修飾連接體。在一些實施例中，磷酸酯連接體部分可由非含磷連接體(例如去磷連接體)代替。儘管不期望受限於理論，但據信，因帶電磷酸二酯基團係溶核降解中之反應中心，故使用中性結構模擬物代替其應賦予增強之核酸酶穩定性。可代替磷酸酯連接體之部分之實例包含(但不限於)醯胺(例如醯胺-3 (3′-CH2 -C(═O)-N(H)-5′)及醯胺-4 (3′-CH2 -N(H)-C(═O)-5′))、羥基胺基、矽氧烷(二烷基矽氧烷)、羧醯胺、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、羧酸酯、硫醚、環氧乙烷連接體、硫化物、磺酸酯、磺醯胺、磺酸酯、硫基甲縮醛(3′-S-CH2 -O-5′)、甲縮醛(3′-O-CH2 -O-5′)、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基羰基胺基、亞甲基甲基亞胺基(MMI，3′-CH2 -N(CH3 )-O-5′)、亞甲基亞肼基、亞甲基二甲基亞肼基、亞甲基氧基甲基亞胺基、醚(C3′-O-C5′)、硫醚(C3′-S-C5′)、硫基乙醯胺基(C3′-N(H)-C(═O)-CH2 -S-C5′、C3′-O-P(O)-O-SS-C5′、C3′-CH2 -NH-NH-C5′、3′-NHP(O)(OCH3 )-O-5′及3′-NHP(O)(OCH3 )-O-5′及含有混合N、O、S及CH2 組分部分之非離子型鍵聯。
在一些實施例中，鍵聯之修飾進一步包括代替或修飾一個磷酸酯中之至少一個氧原子。在一些態樣中，可修飾或代替磷酸酯連接體中之一或兩個非連接性磷酸酯氧。經修飾磷酸酯可包含(但不限於)膦醯基甲酸酯(其中一個非連接性氧原子已經羧酸代替/修飾) (例如磷酸乙酸酯、膦醯基甲酸、胺基磷酸酯)；硫代磷酸酯(-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2 -O-)；甲基膦酸酯(-O-P(OCH3)-O-)及膦酸烷基酯或膦酸芳基酯。如本文所論述，對本發明所涵蓋siRNA分子之兩個連續單體之間之鍵聯的一或多個原子進行修飾。該等鍵聯之闡釋性實例係-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CO-CH2 -、-CH2 -CHOH-CH2 -、-O-CH2 -O-、-O-CH2 -CH2 -、-O-CH2 -CH═、-CH2 -CH2 -O-、-NRH -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -NRH -、-CH2 -NRH -CH2 -、-O-CH2 -CH2 -NRH -、-NRH -CO-O-、-NRH -CO-NRH -、-NRH -CS-NRH -、-NRH C(═NRH )-NRH -、-NRH -CO-CH2 -NRH -、-O-CO-O-、-O-CO-CH2 -O-、-O-CH2 -CO-O-、-CH2 -CO-NRH -、-O-CO-NRH -、-NRH -CO-CH2 -、-O-CH2 -CO-NRH -、-O-CH2 -CH2 -NRH -、-CH═N-O-、-CH2 -NRH O-、-CH2 -O-N═、-S-P(O)2 -O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2 -O-、-O-P(O)2 -S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2 -S-、-O-PO(RH )-O-、-O-PO(NRH )-O-、-O-PO(OCH2 CH2 S-R)-O-、-O-PO(BH3 )-O-、-O-PO(NHRH )-O-、-O-P(O)2 -NRH -、-NRH -P(O)2 -O-、-NR″-CO-O-、-NRH -CO-NRH -、-O-CO-O-、-O-CO-NRH -、-NRH -CO-CH2 -、-O-CH2 -CO-NRH -、-O-CH2 -CH2 -NRH -、-CO-NRH -CH2 -、-CH2 -NRH -CO-、-O-CH2 -CH2 -S-、-S-CH2 -CH2 -O-、-S-CH2 -CH2 -S-、-CH2 -SO2 -CH2 -、-CH2 -CO-NRH -、-O-CH2 -CH2 -NRH -CO-、-CH2 -NCH3 -O-CH2 -、-S-CH2 -CH═、-O-PO(OCH2 CH3 )-O-、-O-PO(OCH2 CH2 S-R)-O-、-O-PO(BH3 )-O-、-CH2 -S-CH2 -、-CH2 -SO-CH2 -、-CH2 -SO2 -CH2 -、-O-SO-O-、-O-S(O)2 -O-、-O-S(O)2 -CH2 -、-O-S(O)2 -NRH -、-NRH -S(O)2 -CH2 -、-O-S(O)2 -CH2 -、-O-P(O)2 -O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2 -O-、-O-P(O,NRH )-O-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(CH3 )-O-及-O-PO(NHRN )-O-，其中RH 係選自氫及C1-4 -烷基。
在本發明所涵蓋之背景中，較佳實例包含磷酸酯鍵聯、磷酸二酯(PO)鍵聯及硫代磷酸酯(PS)鍵聯。二硫代磷酸酯之兩個非橋接氧由硫代替。二硫代磷酸酯中之磷中心係非對掌性，此可防止形成寡核苷酸非對映異構體。因此，儘管不期望受限於理論，但對兩個非連接性氧之修飾(其消除了對掌性中心，例如二硫代磷酸酯形成)可係期望的，其中其不能產生非對映異構體混合物。因此，非連接性氧可獨立地係O、S、Se、B、C、H、N或OR (R係烷基或芳基)中之任一者。在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可含有一或多個硫代磷酸酯鍵聯。舉例而言，多核苷酸可部分地係硫代磷酸酯連接的，舉例而言，硫代磷酸酯鍵聯可與磷酸二酯鍵聯交替。在某些實施例中，寡核苷酸完全係硫代磷酸酯連接的。在其他實施例中，寡核苷酸具有一至七、一至五或一至三個磷酸二酯鍵聯。已使用硫代磷酸酯鍵聯來促使寡核苷酸更加抵抗核酸酶裂解。除正常5’-3’鍵聯外，經修飾寡核苷酸可具有5’-2’鍵聯及具有反極性者(其中核苷單元之毗鄰對之連接由3′-5′變為5′-3′或由2′-5′變為5′-2′)。教示核苷間鍵聯基團之修飾之代表性美國專利包含美國專利第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,306號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第5,625,050號、第5,378,825號、第5,697,248號及第7,368,439號。教示核苷間鍵聯修飾之其他參考文獻包含Mesmaeker等人(1995)Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355；Freier及Altmann (1997)Nucl. Acids Res. 25:4429-4443；及Micklefield (2001)Curr. Med. Chem. 8:1157-1179。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可包括一或多個主鏈修飾之核苷酸。
主鏈修飾之核苷酸位於有義鏈內、反義鏈內或有義鏈及反義鏈內。本文所用之正常「主鏈」係指DNA或RNA分子中之重複交替糖-磷酸酯序列。在天然DNA及RNA分子中，核酸分子之主鏈包含在3'-羥基及5'-羥基處接合至酯連接(亦即PO鍵聯)中之磷酸酯基團之去氧核糖/核糖。天然磷酸二酯鍵可由醯胺鍵代替，但兩個糖單元之間之4個原子得以保留。該等醯胺修飾可增加與miRNA補體形成之雙鏈體之熱動力學穩定性(例如參見Mesmaeker等人(1997)Pure Appl. Chem. 3:437-440)。在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可在序列中含有針對非鎖核苷酸之化學修飾，例如針對2’羥基之2’修飾。舉例而言，在siRNA分子中納入2′-位修飾之核苷酸可增加寡核苷酸對核酸酶之抗性及其與互補靶之熱穩定性。2′位之各種修飾可獨立地選自提供增加之核酸酶抗性且並不損害與靶或細胞機構之分子相互作用。可基於其增加之活體外或活體內功效來選擇該等修飾。在一些實施例中，2′修飾可獨立地選自諸多不同「氧基」或「去氧」取代基。「氧基」-2′羥基修飾之實例包含烷氧基或芳基氧基(例如O甲基、R═H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖；聚乙二醇(PEG)、O(CH2 CH2 O)n CH2 CH2 OR (n=1-50)；O-胺或O-(CH2 )n 胺(n=1-10)、胺=NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基；及O-CH2 CH2 (NCH2 CH2 NMe2 )2 )。「去氧」修飾包含氫(亦即去氧核糖，其與單鏈懸突尤其相關)；鹵基(例如氟)；胺基(例如NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸；NH(CH2 CH2 NH)n CH2 CH2 -胺(胺=NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基；-NHC(O)R(R=烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫基烷氧基；硫基烷基；烷基；環烷基；芳基；烯基及炔基。
在某些實施例中，非鎖核苷酸之實質上所有或所有核苷酸2′位可經修飾。舉例而言，2′修飾可各自獨立地選自O-甲基及氟。在實例性實施例中，嘌呤核苷酸各自具有2′ O-甲基且吡咯啶核苷酸各自具有2′-F。根據本發明，2′位修飾亦可包含小烴取代基。烴取代基包含烷基、烯基、炔基及烷氧基烷基，其中烷基(包含烷氧基之烷基部分)、烯基及炔基可經取代或未經取代。烷基、烯基及炔基可為C1至C10烷基、烯基或炔基，例如C1、C2或C3。烴取代基可包含一個或兩個或三個可獨立地選自N、O及/或S之非碳原子。2′修飾可進一步包含呈O-烷基、O-烯基及O-炔基形式之烷基、烯基及炔基。本發明之實例性2′修飾包含2’-H、2′-O-烷基(C1-3烷基，例如2′O-甲基或2′OEt)、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)、2′-O-胺基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基胺基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基胺基丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基胺基乙基氧基乙基(2′-O-DMAEOE)、2′-O-N-甲基乙醯胺基(2′-O-NMA)或孿位2′-OMe/2′F取代。在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子在非鎖核苷酸中含有至少一個修飾為2’O-甲氧基(2’-OMe)之2’位。寡核苷酸可含有1至約5個2′-O-甲氧基(2’-OMe)修飾之核苷酸或1至約3個2′-O-甲氧基(2’-OMe)修飾之核苷酸。在一些實施例中，miR-124模擬物中之所有核苷酸皆含有2′-O-甲氧基(2’-OMe)修飾。不同類型之2’位修飾之其他實例性組合可含有至少一個2′-鹵基修飾(例如代替2′羥基)，例如2′-氟、2′-氯、2′-溴及2′-碘。
在一些實施例中，可構築核酸分子之主鏈鏈或鏈，其中磷酸酯連接體及核糖糖由抗核酸酶性核苷或核苷酸代用品代替。儘管不期望受限於理論，據信，不存在重複性帶電主鏈可減弱與識別聚陰離子之蛋白質(例如核酸酶)之結合。作為非限制性實例，該等核苷酸代用品包含嗎啉基、環丁基、吡咯啶、肽核酸(PNA)、胺基乙基甘胺醯基PNA (Aegina)及主鏈延長之嘧啶PNA (bepPNA)核苷代用品(例如美國專利第5,359,044號、第5,519,134號、第5,142,047號及第5,235,033號；Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996), 4:5-23)。用於代替糖-磷酸酯主鏈之代用品涉及PNA代用品(肽核酸)。術語「肽核酸(PNA)」係類似於DNA及RNA之化學合成之聚合物，其中主鏈係由藉由肽鍵連接之重複N-(2-胺基乙基)-甘胺酸(AEG)單元構成(Nielsen等人(1991)Science 254:1497-1500)。具有PNA之合成寡核苷酸在結合至互補DNA或RNA時具有較高結合強度及較大特異性，其中PNA/DNA鹼基失配較類似DNA/RNA雙鏈體更為合意。PNA不易由核酸酶或蛋白酶識別，從而使得其可抵抗酶降解。PNA亦在寬pH範圍內較為穩定。在諸多研究中已表明，PNA可用於反義及抗基因療法。PNA可抵抗DNase及蛋白酶且可進一步修飾以增加細胞滲透，等等。
可使用PNA作為藉由(例如)誘導轉錄或轉譯停滯或抑制複製來序列特異性調節基因表現之反義或抗基因藥劑。PNA亦可用於(例如)藉由(例如) PNA定向PCR箝位來分析基因中之單一鹼基對突變；在與其他酶(例如S1核酸酶)組合使用時用作人工限制酶(Hyrup等人(1996)Bioorg. Med. Chem. 4:5-23；或用作DNA序列及雜交之探針或引子(Perry-O'Keefe等人(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670-14675)。
在另一實施例中，可藉由以下方式來修飾PNA以(例如)增強其穩定性或細胞攝取：使親脂性或其他輔助基團附接至PNA，形成PNA-DNA嵌合體，或使用脂質體或業內已知之其他藥物遞送技術。舉例而言，可生成可組合PNA及DNA之有利性質之PNA-DNA嵌合體。該等嵌合體容許DNA識別酶(例如RNASE H及DNA聚合酶)與DNA部分相互作用，而PNA部分將提供高結合親和力及特異性。可使用針對鹼基堆疊、核鹼基之間之鍵數量及定向進行選擇之適當長度之連接體來連接PNA-DNA嵌合體(Hyrup等人(1996)Bioorg. Med. Chem. 4:5-23)。可如以下文獻中所闡述來合成PNA-DNA嵌合體：Hyrup等人(1996)Bioorg. Med. Chem. 4:5-23及Finn等人(1996)Nucleic Acids Res. 24:3357-3363。舉例而言，可在固體載體上使用標準亞磷醯胺偶合化學及經修飾核苷類似物來合成DNA鏈。可使用諸如5'-(4-甲氧基三苯甲基)胺基-5'-去氧-胸苷亞磷醯胺等化合物作為PNA與DNA之5'端之間之連接(Mag等人(1989)Nucleic Acids Res. 17:5973-5988)。然後以逐步方式偶合PNA單體以產生具有5' PNA區段及3' DNA區段之嵌合分子(Finn等人(1996)Nucleic Acids Res. 24:3357-3363)。或者，可合成具有5' DNA區段及3' PNA區段之嵌合分子(Peterser等人(1975)Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124)。
本發明所涵蓋之核酸分子亦可含有其他修飾，例如失配、膨出部或交聯。類似地，其亦可包含其他偶聯物，例如連接體、異源功能交聯劑、樹枝狀聚合物、奈米顆粒、肽、有機化合物(例如螢光染料)及/或光可裂解化合物。在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可包括如本文所闡述之兩種或更多種修飾之任一組合。核酸序列可獨立地包括關於一或多個糖部分、一或多個核苷間鍵聯及/或一或多個核鹼基之一或多個修飾。如本文所揭示，可使用化學修飾之任何組合來修飾該等序列。
在一些實施例中，核酸分子係siRNA，其包括其中有義鏈及反義鏈包括一或多個失配(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個失配)之核酸序列。術語「失配」係指由非互補鹼基組成之鹼基對，例如非正常互補G:C、A:T或A:U鹼基對。在一些實施例中，本發明所涵蓋siRNA分子之反義鏈及靶mRNA序列可包括一或多個失配，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個失配。在一些情況下，失配可參照反義鏈位於裂解位點下游。更佳地，失配可存在於距反義鏈之3′端1-6個核苷酸內。在另一實施例中，本發明所涵蓋之siRNA分子在雙鏈體siRNA中包括膨出部，例如一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)未配對鹼基。較佳地，膨出部可位於有義鏈中。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之siRNA分子包括一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)交聯，例如其中有義鏈交聯至siRNA雙鏈體之反義鏈之交聯。可用於本發明之交聯劑係業內通常已知者，包含(但不限於)補骨脂素、絲裂黴素C、順鉑(cisplatin)、氯乙基亞硝基脲及諸如此類。較佳地，交聯參照反義鏈存在於裂解位點下游，且更佳地，交聯存在於有義鏈之5′端處。根據本發明，亦包含siRNA衍生物，例如具有單一交聯(例如補骨脂素交聯)之siRNA衍生物、具有光可裂解生物素(例如光可裂解生物素)之siRNA、肽(例如Tat肽)、奈米顆粒、肽模擬物、有機化合物(例如染料，例如螢光染料)或樹枝狀聚合物。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸分子可包含其他附加基團，例如肽(例如用於靶向活體內宿主細胞受體)或促進傳輸穿過細胞膜(例如參 Letsinger等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556；Lemaitre等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652；PCT專利公開案第WO 88/09810號)或血-腦障壁(例如參見PCT公開案第WO 89/10134號)之藥劑。另外，可雜交觸發性裂解劑(例如參見Krol等人(1988)BioTechniques 6:958-976)或嵌入劑(例如參見Zon (1988)Pharm. Res. 5:539-549)修飾核酸分子。
k.載體及其他核酸媒劑 根據本發明，可藉由業內已知之任何方法(例如直接合成及基因重組技術)來產生核酸分子及其變體。核酸分子可以任何形式存在，例如純核酸分子、質體、DNA載體、RNA載體、病毒載體及顆粒。術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。本發明所涵蓋之載體亦可用於將經包裝多核苷酸遞送至細胞、局部組織位點或個體。
一類載體為「質體」，其係指其他核酸區段可連接至其中之環形雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連接至病毒基因體中。病毒核酸遞送載體可為任一種類，包含逆轉錄病毒 、腺病毒 、腺相關病毒 、單純皰疹病毒 及其變體。病毒載體技術已眾所周知且闡述於Sambrook等人(2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (第4版), New York)中。
某些載體能夠在已引入其之宿主細胞中進行自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因體中，並藉此隨宿主基因體一同複製。此外，某些載體、亦即表現載體能夠引導與其可操作連接之基因的表現。一般而言，在重組DNA技術中可用之表現載體通常呈質體(載體)形式。然而，本發明意欲包含該等提供等效功能之其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
本發明所涵蓋之重組表現載體包括本發明所涵蓋之核酸，該核酸呈適於在宿主細胞中表現核酸之形式。此意味著，重組表現載體包含一或多個基於擬用於表現之宿主細胞所選擇之調控序列，該調控序列可操作地連接至擬表現之核酸序列。在重組表現載體內，「可操作地連接」欲指，所關注核苷酸序列以容許表現核苷酸序列(例如在活體外轉錄/轉譯系統中或在宿主細胞中(在將載體引入宿主細胞中時))之方式連接至調控序列。術語「調控序列」意欲包含啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。該等調控序列闡述於(例如) Goeddel,Methods in Enzymology: Gene Expression Technology ，第185卷，Academic Press, San Diego, CA (1991)中。調控序列包含在許多類型之宿主細胞中引導核苷酸序列之組成型表現者及僅在某些宿主細胞中引導核苷酸序列之表現者(例如組織特異性調控序列)。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可取決於諸如以下等因素：擬轉變宿主細胞之選擇、期望蛋白質表現程度及諸如此類。可將本發明所涵蓋之表現載體引入宿主細胞中以由此產生由如本文所闡述之核酸編碼之蛋白質或肽(包含融合蛋白或肽)。舉例而言，一般而言，載體含有在至少一種生物體中發揮作用之複製起點、啟動子序列及便利限制性內核酸酶位點及一或多種可選標記物(例如抗藥物性基因)。載體可包括可操作地連接至本發明所涵蓋之多核苷酸之天然或非天然啟動子。所選啟動子可為較強、較弱、組成型、可誘導型、組織特異性、發育階段特異性及/或生物體特異性的。在一些實施例中，載體可包括對引入載體之宿主細胞類型具有特異性之調控序列，例如增強子、轉錄及轉譯起始及終止密碼子。
用於本發明之重組表現載體可經設計用於在原核細胞(例如大腸桿菌(E. coli ))或真核細胞(例如昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒表現載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞)中表現對應於本發明所涵蓋生物標記物之多肽。適宜宿主細胞進一步由Goeddel論述(見上文)。或者，可在活體外(例如)使用T7啟動子調控序列及T7聚合酶來轉錄及轉譯重組表現載體。
原核生物中之蛋白質表現最通常係在大腸桿菌中使用含有引導表現融合蛋白或非融合蛋白之組成型或可誘導型啟動子之載體來實施。融合載體向其中所編碼之蛋白質、通常向重組蛋白之胺基末端添加了諸多胺基酸。該等融合載體通常用於以下三個目的：1)增加重組蛋白之表現；2)增加重組蛋白之溶解性；及3)藉由用作親和力純化中之配體來幫助純化重組蛋白。通常，在融合表現載體中，將蛋白水解裂解位點引入融合部分與重組蛋白之接點處以使得能夠在純化融合蛋白後分離重組蛋白與融合部分。該等酶及其同族識別序列包含因子Xa、凝血酶及腸激酶。典型融合表現載體包含pGEX (Pharmacia Biotech Inc；Smith及Johnson (1988)Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)及pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)，其分別使麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白質A融合至靶重組蛋白。
適宜可誘導型非融合大腸桿菌表現載體之代表性、非限制性實例包含pTrc (Amann等人(1988)Gene 69:301-315)及pET 11d (Studier等人(1991)Meth. Enzymol. 185:60-89)。來自pTrc載體之靶生物標記物核酸表現依賴於來自雜合trp-lac融合啟動子之宿主RNA聚合酶轉錄。來自pET 11d載體之靶生物標記物核酸表現依賴於由共表現病毒RNA聚合酶(T7 gn1)調介之來自T7 gn10-lac融合啟動子之轉錄。此病毒聚合酶係由來自駐留型原噬菌體之宿主菌株BL21 (DE3)或HMS174(DE3)所供應，該駐留型原噬菌體含有在lacUV 5啟動子之轉錄控制下之T7 gn1基因。
最大化大腸桿菌中之重組蛋白表現之一種策略係在以蛋白水解方式裂解重組蛋白之能力受損的宿主細菌中表現蛋白質(Gottesman (1990)Meth. Enzymol. 185:119-128)。另一策略係改變擬插入表現載體中之核酸之核酸序列，從而每一胺基酸之個別密碼子係優先用於大腸桿菌中者(Wada等人(1992)Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。本發明所涵蓋核酸序列之該改變可藉由標準DNA合成技術來實施。
在一些實施例中，表現載體係酵母表現載體。用於釀酒酵母(S. cerevisiae )表現之載體之實例包含pYepSec1 (Baldari等人(1987)EMBO J. 6:229-234)、pMFa (Kurjan及Herskowitz (1982)Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz等人(1987)Gene 54:113-123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)及pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)。
或者，表現載體係桿狀病毒表現載體。可用於在經培養昆蟲細胞(例如Sf 9細胞)中表現蛋白質之桿狀病毒載體包含pAc系列(Smith等人(1983)Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)及pVL系列(Lucklow及Summers (1989)Virology 170:31-39)。
在一些實施例中，使用哺乳動物表現載體在哺乳動物細胞中表現本發明所涵蓋之核酸。哺乳動物表現載體之實例包含pCDM8 (Seed (1987)Nature 329:840)及pMT2PC (Kaufman等人(1987)EMBO J. 6:187-195)。在用於哺乳動物細胞中時，表現載體之控制功能通常係由病毒調控元件來提供。舉例而言，常用啟動子係衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒及猿病毒40。關於用於原核細胞及真核細胞之其他適宜表現系統，參見Sambrook等人之前述文獻第16及17章。
在一些實施例中，重組哺乳動物表現載體能夠引導核酸優先表現於特定細胞類型中(舉例而言，使用組織特異性調控元件來表現核酸)。業內已知組織特異性調控元件。適宜組織特異性啟動子之非限制性實例包含白蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert等人(1987)Genes Dev. 1:268-277)、淋巴樣特異性啟動子(Calame及Eaton (1988)Adv. Immunol. 43:235-275)、尤其T細胞受體啟動子(Winoto及Baltimore (1989)EMBO J. 8:729-733)及免疫球蛋白啟動子(Banerji等人(1983)Cell 33:729-740；Queen及Baltimore (1983)Cell 33:741-748)、神經元特異性啟動子(例如神經絲啟動子；Byrne及Ruddle (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5473-5477)、胰臟特異性啟動子(Edlund等人(1985)Science 230:912-916)及乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子；美國專利第4,873,316號及歐洲申請案公開案第264,166號)。亦涵蓋發育調控性啟動子，例如鼠類hox啟動子(Kessel及Gruss (1990)Science 249:374-379)及(-胎蛋白啟動子(Camper及Tilghman (1989)Genes Dev. 3:537-546)。
本發明亦提供用於表現反義核酸之重組表現載體，如下文進一步所闡述。舉例而言，可以容許表現(藉由轉錄DNA分子) RNA分子之方式使DNA分子可操作地連接至調控序列，該RNA分子針對編碼本發明所涵蓋之多肽之mRNA係反義的。可選擇可操作地連接至以反義定向選殖之核酸之調控序列來引導各種細胞類型中反義RNA分子之連續表現，舉例而言，可選擇引導反義RNA之組成型、組織特異性或細胞類型特異性表現之病毒啟動子及/或增強子或調控序列。反義表現載體可呈重組質體、噬菌粒或減毒病毒之形式，其中反義核酸係在高效調控區之控制下所產生，該高效調控區之活性可由引入載體之細胞類型來決定。關於使用反義基因之基因表現之調控之論述，參見Weintraub等人(1986)Trends Genet. 1(1)。
在一些實施例中，逆轉錄病毒載體可用於本發明中。逆轉錄病毒之命名係因為在整合至宿主細胞基因體中之前需要將病毒RNA基因體逆轉錄成DNA。因此，逆轉錄病毒載體之最重要特徵係將其基因物質永久性整合至靶/宿主細胞之基因體中。用於核酸遞送之最常用逆轉錄病毒載體係慢病毒媒劑/顆粒。慢病毒之一些實例包含人類免疫缺陷病毒：HIV-1及HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、珍布拉那病病毒(Jembrana Disease Virus，JDV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、馬感染性貧血病毒、維斯那-梅迪病毒(visna-maedi)及山羊關節炎－腦炎病毒(CAEV)。
通常，構成基因遞送媒劑之慢病毒顆粒自身係複製缺陷性，從而其不能複製於宿主細胞中且可感染僅一種細胞(亦稱為「自我不活化」)。慢病毒能夠藉助經由完整宿主核膜之進入機制感染分裂細胞及非分裂細胞(Naldini等人(1998)Curr. Opin. Biotechnol. 9:457-463)。藉由多次減毒HIV致病性基因來生成重組慢病毒媒劑/顆粒，舉例而言，缺失基因Env、Vif、Vpr、Vpu、Nef及Tat，從而使得載體在生物上安全。相應地，衍生自(例如) HIV-1/HIV-2之慢病毒媒劑可調介轉基因至非分裂細胞之有效遞送、整合及長期表現。術語「重組」係指含有慢病毒序列及非慢病毒逆轉錄病毒序列之載體或其他核酸。可藉由在產生細胞(例如HEK293T細胞、293G細胞、STAR細胞及其他病毒表現細胞系)中共表現病毒包裝元件及載體基因體本身來生成慢病毒顆粒。該等元件通常提供於三個(在第二代慢病毒系統中)或4個單獨質體(在第三代慢病毒系統中)中。使用編碼慢病毒組分(包含病毒之核心(亦即結構蛋白)及酶促組分以及套膜蛋白(稱為包裝系統))之質體及編碼擬轉移至靶細胞、載體(vehicle)本身(亦稱為轉移載體(vector))中之基因體(包含外來轉基因)之質體來共轉染生產細胞。
重組慢病毒載體之套膜蛋白可為來自其他病毒之異源性套膜蛋白，例如水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)之G蛋白(VSV G)或桿狀病毒gp64套膜蛋白。VSV-G醣蛋白可尤其選自歸類於水皰病毒屬中之物種：卡拉加斯病毒(Carajas virus ) (CJSV)、金迪普拉病毒(Chandipura virus ) (CHPV)、科卡爾病毒(Cocal virus ) (COCV)、伊斯法罕病毒(Isfahan virus ) (ISFV)、馬拉巴病毒(Maraba virus ) (MARAV)、帛黎病毒(Piry virus ) (PIRYV)、阿拉戈斯水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Alagoas virus ) (VSAV)、印第安納水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus ) (VSIV)及新澤西水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis New Jersey virus ) (VSNJV)；及/或臨時性分類於水皰病毒屬中之菌株，如草魚彈狀病毒(Grass carp rhabdovirus )、比安157575彈狀病毒(BeAn 157575 virus ) (BeAn 157575)、博特克病毒(Boteke virus ) (BTKV)、卡爾查基病毒(Calchaqui virus ) (CQIV)、美洲鰻病毒(Eel virus American ) (EVA)、格雷洛奇病毒(Gray Lodge virus ) (GLOV)、朱羅訥病毒(Jurona virus ) (JURY)、克拉馬斯病毒(Klamath virus ) (KLAV) 、 克瓦塔病毒(Kwatta virus ) (KWAV)、拉霍亞病毒(La Joya virus ) (LJV)、馬爾佩斯泉病毒(Malpais Spring virus ) (MSPV)、埃爾崗蝙蝠病毒(Mount Elgon bat virus ) (MEBV)、佩裡內特病毒(Perinet virus ) (PERV)、梭子魚魚苗彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus ) (PFRV)、波登病毒(Porton virus ) (PORV)、拉迪病毒(Radi virus ) (RADIV)、鯉春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus ) (SVCV)、圖帕伊阿病毒(Tupaia virus ) (TUPV)、潰瘍病彈狀病毒(Ulcerative disease rhabdovirus ) (UDRV)及尤格波格丹諾夫奇病毒(Yug Bogdanovac virus ) (YBV)。gp64或其他桿狀病毒套膜蛋白可衍生自苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica )核型多角體病毒(AcMNPV)、芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera )核型多角體病毒、家蠶(Bombyx mori )核型多角體病毒、雲杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana )核型多角體病毒、黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata )單核衣殼核型多角體病毒、蘋淺褐卷蛾(Epiphyas postvittana )核型多角體病毒、美國白蛾(Hyphantria cunea )核型多角體病毒、大蠟螟(Galleria mellonella )核型多角體病毒、佐立病毒(Dhori virus)、索戈托病毒(Thogoto virus)、柞蠶(Antheraea pemyi )核型多角體病毒或貝特肯病毒(Batken virus)。
生成重組慢病毒顆粒之方法在業內已論述於(例如)美國專利第8,846,385號、第7,745,179號、第7,629,153號、第7,575,924號、第7,179,903號及第6,808,905號中。
所用慢病毒載體可選自(但不限於) pLVX、pLenti、pLenti6、pLJM1、FUGW、pWPXL、pWPI、pLenti CMV puro DEST、pLJM1-EGFP、pULTRA、pInducer20、pHIV-EGFP、pCW57.1、pTRPE、pELPS、pRRL及pLionII。亦可使用業內已知之慢病毒媒劑(參見美國專利第9,260,725號、第9,068,199號、第9,023,646號、第8,900,858號、第8,748,169號、第8,709,799號、第8,420,104號、第8,329,462號、第8,076,106號、第6,013,516號及第5,994,136號；PCT公開案第WO 2012079000號)。
其他元件可包含於重組慢病毒顆粒中，包含在5’或3’末端之逆轉錄病毒LTR (長末端重複)、逆轉錄病毒輸出元件、視情況慢病毒逆向反應元件(RRE)、啟動子或其活性部分及基因座控制區(LCR)或其活性部分。其他元件包含中央多聚嘌呤區(cPPT)序列(用以改良非分裂細胞中之轉導效率)、旱獺肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHP)轉錄後調控元件(WPRE) (其增強轉基因表現且增加效價)。效應模組連接至載體。除基於複雜HIV-1/2之慢病毒載體外，基於簡單γ-逆轉錄病毒之逆轉錄病毒載體已廣泛用於遞送治療性核酸且在臨床上證實為能夠轉導寬範圍細胞類型之最有效且強力之核酸遞送系統之一。γ逆轉錄病毒之實例性物種包含鼠類白血病病毒(MLV)及貓白血病病毒(FeLV)。衍生自哺乳動物γ-逆轉錄病毒(例如鼠類白血病病毒(MLV))之γ-逆轉錄病毒載體可為重組的。γ逆轉錄病毒之MLV家族包含嗜親性、雙嗜性、嗜異性及多嗜性子家族。嗜親性病毒僅能夠使用mCAT-1受體感染鼠類細胞。嗜親性病毒之實例係莫洛尼(Moloney) MLV及AKV。雙嗜性病毒經由Pit-2受體感染鼠類、人類及其他物種。雙嗜性病毒之一實例係4070A病毒。嗜異性及多嗜性病毒利用相同(Xpr1)受體，但其物種嗜性有所不同。嗜異性病毒(例如NZB-9-1)感染人類及其他物種，但不感染鼠類物種，而多嗜性病毒(例如病灶形成病毒(MCF))感染鼠類、人類及其他物種。
可在包裝細胞中藉由使用若干質體共轉染細胞來產生γ-逆轉錄病毒載體，該等質體包含編碼逆轉錄病毒結構及酶促(gag-pol)聚蛋白者、編碼套膜(env)蛋白者及編碼包括多核苷酸(其編碼本發明所涵蓋之組合物且擬包裝至新形成病毒顆粒中)之載體mRNA者。可使用來自其他病毒之套膜蛋白使重組γ-逆轉錄病毒載體變為假型。將套膜醣蛋白納入病毒顆粒之外脂質層中，此可增加/改變細胞嗜性。實例性套膜蛋白包含長臂猿白血病病毒套膜蛋白(GALV)或水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)或猿內源性逆轉錄病毒套膜蛋白或麻疹病毒H及F蛋白質或人類免疫缺陷病毒gp120套膜蛋白或科卡爾水泡病毒套膜蛋白(例如參見美國公開案第2012/164118號)。在其他實施例中，套膜醣蛋白可經基因修飾以將靶向/結合配體納入γ-逆轉錄病毒載體中，結合配體包含(但不限於)肽配體、單鏈抗體及生長因子(Waehler等人(2007)Nat. Rev. Genet. 8:573–587)。該等經改造醣蛋白可使載體再靶向表現其相應靶部分之細胞。在其他態樣中，可引入「分子橋」以將載體引入特異性細胞中。分子橋具有雙重特異性：一端可識別病毒醣蛋白，且另一端可結合至靶細胞上之分子決定子。該等分子橋(例如配體-受體、抗生物素蛋白-生物素、化學偶聯物、單株抗體及經改造融合蛋白)可引導病毒載體附接至用於轉導之靶細胞(Yang等人(2008)Biotechnol. Bioeng . 101:357-368；Maetzig等人(2011)Viruses 3:677-713)。重組γ-逆轉錄病毒載體可為自我不活化(SIN) γ逆轉錄病毒載體。該等載體係複製缺陷性。SIN載體可在最初包括增強子/啟動子活性之3’ U3區域內含有缺失。另外，5’ U3區域可經衍生自巨細胞病毒或RSV之強啟動子(在包裝細胞系時需要)或所選內部啟動子及/或增強子元件代替。可根據本發明所涵蓋之特定目的所需之基因表現之具體需求來選擇內部啟動子。
類似地，可使用重組腺相關病毒(rAAV)載體來包裝及遞送本發明所涵蓋之核酸分子。該等載體或病毒顆粒可經設計以利用任一已知血清型衣殼或血清型衣殼之組合。血清型衣殼可包含來自任何所鑑別AAV血清型及其變體之衣殼，例如AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及AAVrh10 (例如參見美國專利公開案20030138772)或其變體。AAV載體不僅包含單鏈載體，且亦包含自我互補性AAV載體(scAAV)。scAAV載體含有一起退火以形成雙鏈載體基因體之DNA。藉由跳過第二鏈合成，scAAV容許快速表現於細胞中。可藉由業內標準方法(例如藉由三重轉染)在sf9昆蟲細胞中或在人類細胞(例如HEK293細胞)之細胞培養懸浮液中來製造rAAV載體。本發明所涵蓋之核酸分子可編碼於一或多個擬包裝於AAV衣殼中之病毒基因體中。除至少一或兩個ITR (倒轉末端重複)外，該等載體或病毒基因體亦可包含自載體或病毒基因體表現所需之某些調控元件。該等調控元件為業內所熟知且包含(例如)啟動子、內含子、間隔體、填充序列及諸如此類。
另外，核酸分子之非病毒遞送系統為業內所熟知。術語「非病毒載體」共同地係指在不使用病毒顆粒下將本發明所涵蓋之核酸分子轉移至所關注細胞中之任何媒劑。該等非病毒遞送載體之代表性實例係塗覆核酸之載體，該塗覆基於載體上之陽離子位點與帶負電核酸構成基因上之陰離子位點之間的電相互作用。用於遞送之一些實例性非病毒載體可包含裸核酸遞送系統、聚合遞送系統及脂質體遞送系統。陽離子聚合物及陽離子脂質可用於核酸遞送，此乃因其可容易地與陰離子核苷酸複合。常用聚合物可包含(但不限於)聚乙烯亞胺、聚-L-離胺酸、幾丁聚醣及樹枝狀聚合物。陽離子脂質可包含(但不限於)單價陽離子脂質、多價陽離子脂質、含胍脂質、膽固醇衍生物化合物、陽離子聚合物:聚(乙烯亞胺) (PEI)、聚-l-離胺酸) (PLL)、魚精蛋白(protamine)、其他陽離子聚合物及脂質-聚合物雜合體。
可經由習用轉變或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。如本文中所使用，術語「轉變」及「轉染」意欲係指用於將外來核酸引入宿主細胞中之各種業內公認技術，包含磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-右旋糖酐調介之轉染、脂轉染或電穿孔。用於轉變或轉染宿主細胞之適宜方法可參見Sambrook等人之前述文獻及其他實驗室手冊。
對於哺乳動物細胞之穩定轉染而言，眾所周知，端視所用之表現載體及轉染技術，僅小部分之細胞可將外來DNA整合至其基因體中。為鑑別及選擇該等整合體，通常將編碼可選標記物(例如對於抗生素抗性而言，如neo、DHFR、Gln合成酶、ADA及諸如此類)之基因與所關注基因一起引入宿主細胞中。較佳可選標記物包含賦予藥物(例如G418、潮黴素(hygromycin)及胺甲喋呤(methotrexate))抗性者。可藉由藥物選擇來鑑別經所引入核酸穩定轉染之細胞(舉例而言，納入可選標記物基因之細胞將存活，而其他細胞會死亡)。
因此，本發明涵蓋已引入本發明所涵蓋之重組表現載體之宿主細胞。術語「宿主細胞」及「重組宿主細胞」可在本文中互換使用。應理解，該等術語不僅係指特定個體細胞，且亦係指此一細胞之後代或潛在後代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與母細胞不同但卻仍包含於本文所用術語之範圍內。宿主細胞可為任一原核細胞(例如大腸桿菌細胞)或真核細胞(例如昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞)。
2. 蛋白質藥劑 本發明所涵蓋之另一態樣涉及基於胺基酸之藥劑之用途。該等藥劑可包含(但不限於)抗體、融合蛋白、合成多肽及肽以及其片段(例如生物活性片段)。亦提供編碼該等基於胺基酸之化合物之多核苷酸。
本發明之基於胺基酸之藥劑(例如抗體及重組蛋白)可以以下形式存在：全多肽、複數個多肽或多肽片段(其可獨立地由一或多個核酸編碼)、複數個核酸、核酸片段或上文所提及物質中之任一者之變體。
術語「多肽」係指最通常由肽鍵連接至一起之胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。如本文中所使用，該術語係指具有任一大小、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。因此，術語多肽相互性包含術語「肽」及「蛋白質」。術語「融合蛋白」係指包括至少兩個來自不同來源之胺基酸序列之融合多肽分子，其中組分胺基酸序列藉由肽鍵直接或經由一或多個肽連接體彼此連接。在一些情況下，所編碼多肽小於約個50胺基酸且多肽則稱為「肽」。若多肽係肽，則其長至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基。因此，多肽包含基因產物、天然多肽、合成多肽、同系物、異種同源物、同種同源物、片段及前述物質之其他等效物、變體及類似物。多肽可為單一分子或可為多分子複合物(例如二聚體、三聚體或四聚體)。其亦可包括單鏈或多鏈多肽且可進行締合或連接。術語多肽亦可適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基係相應天然胺基酸之人工化學類似物。
「經分離」或「經純化」蛋白質或其生物活性部分實質上不含來自衍生蛋白質之細胞或組織來源之細胞材料或其他污染蛋白，或實質上不含化學前體或其他化學物(在以化學方式合成時)。語言「實質上不含細胞材料」包含其中蛋白質與自其分離或重組產生之細胞之細胞組分分離之蛋白質製劑。因此，實質上不含細胞材料之蛋白質包含具有小於約30%、20%、10%或5% (以乾重計)異源性蛋白質(亦在本文中稱為「污染蛋白」)之蛋白質製劑。在蛋白質或其生物活性部分係以重組方式產生時，其亦較佳地實質上不含培養基，亦即，培養基佔蛋白質製劑之體積之小於約20%、10%或5%。在蛋白質係藉由化學合成產生時，其較佳地實質上不含化學前體或其他化學物質，亦即，其與涉及蛋白質合成之化學前體或其他化學物質分離。因此，除所關注多肽外，該等蛋白質製劑具有小於約30%、20%、10%、5% (以乾重計)之化學前體或化合物。
在一些實施例中，可藉由適當純化方案使用標準蛋白質純化技術自細胞或組織來源分離對應於標記物之天然多肽。在另一實施例中，藉由重組DNA技術產生對應於本發明所涵蓋標記物之多肽。作為重組表現之替代方式，可以化學方式使用標準肽合成技術來合成對應於本發明所涵蓋標記物之多肽。
多肽片段包含含有與所關注胺基酸序列足夠一致或衍生自所關注胺基酸序列之胺基酸序列之多肽，但該等多肽包含少於全長蛋白質之胺基酸。其亦可展現相應全長蛋白質之至少一種活性。通常，生物活性部分包括具有相應蛋白質之至少一種活性之結構域或基序。本發明所涵蓋蛋白質之生物活性部分可為長10、25、50、100或更多個胺基酸之多肽。此外，可藉由重組技術製備缺失其他蛋白質區域之其他生物活性部分，且評估本發明所涵蓋多肽之天然形式之一或多種功能活性。
較佳多肽具有所關注多肽(例如由本文所闡述之核酸分子編碼之多肽)之胺基酸序列。其他有用蛋白質與該等序列中之一者實質上一致(例如至少約40%、較佳地50%、60%、70%、75%、80%、83%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)且保留相應天然蛋白質之蛋白質功能活性，但胺基酸序列因天然等位基因變化或誘變而有所不同。
應用於胺基酸序列之術語「一致性」定義為在比對序列且視需要引入空位以達成最大百分比一致性之後，候選序列中與第二序列之胺基酸序列中之殘基一致之殘基的百分比。用於比對之方法及電腦程式為業內所熟知。應理解，同源性取決於所計算一致性百分比，但其值可因引入計算中之空位及罰分而有所不同。
為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸之一致性百分比，出於最佳對比目的來比對序列(舉例而言，可將空位引入第一胺基酸或核酸之序列中以用於與第二胺基酸或核酸序列進行最佳對比)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。在第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據，則該等分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性%係該等序列所共有之一致位置數之函數(亦即，一致性% =一致位置數/總位置(例如重疊位置)數×100)。在一實施例中，兩個序列具有相同長度。
可使用數學算法來測定兩個序列之間之一致性百分比。用於對比兩個序列之數學算法之較佳非限制性實例係Karlin及Altschul之算法(1990,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268)，其根據Karlin及Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877加以修改。此一算法已納入Altschul等人之NBLAST及XBLAST程式中(1990,J. Mol. Biol. 215:403-410)。可使用NBLAST程式(分數=100，字長=12)來實施BLAST核苷酸搜索以獲得與本發明所涵蓋之核酸分子同源之核苷酸序列。可使用XBLAST程式(評分= 50，字長= 3)來實施BLAST蛋白質搜索以獲得與本發明所涵蓋之蛋白質分子同源之胺基酸序列。出於對比目的，為獲得加空位比對，可如Altschul等人(1997)Nucl. Acids Res . 25:3389-3402中所闡述來利用加空位BLAST。或者，可使用PSI-Blast來實施迭代搜索以檢測分子之間之遠距離聯繫。在利用BLAST、加空位BLAST及PSI-Blast程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數(例如參見ncbi.nlm.nih.gov)。用於比較序列之數學算法之另一較佳非限制性實例係Myers及Miller之算法(1988，Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)。此一算法已納入ALIGN程式(2.0版)中，後者係GCG序列比對軟體包之一部分。在利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘差表、等於12之空位長度罰分及等於4之空位罰分。用於鑑別具有局部序列類似性及對準之區域之又一有用算法係FASTA算法，如Pearson及Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448中所闡述。在使用FASTA算法來比較核苷酸或胺基酸序列時，可(例如)使用PAM120加權殘差表以及k -元組值2。可使用類似於上述技術之技術使用或不使用容許空位來測定兩個序列之間之一致性百分比。在計算一致性百分比時，僅計數確切匹配。
術語「多肽變體」或「胺基酸序列變體」係指胺基酸序列與天然或參考序列不同之分子。與天然或參考序列相比，胺基酸序列變體可在胺基酸序列內之某些位置擁有取代、缺失及/或插入。在提及序列時，術語「天然」或「參考」係提及可進行比較之原始分子之相對術語。天然或參考序列不應與野生型序列混淆。天然序列或分子可代表野生型(該序列發現於自然界中)，但不與野生型序列一致。變體可與天然或參考序列擁有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或至少約99.9%之胺基酸序列一致性(同源性)。
多肽變體具有改變之胺基酸序列且在一些實施例中可用作激動劑或拮抗劑。可藉由誘變(例如離散點突變)或截短來生成變體。激動劑可保留天然形式之蛋白質之實質上相同之生物活性或生物活性子組。蛋白質拮抗劑可藉由(例如)競爭性結合至細胞信號傳導級聯之下游或上游成員(物包含所關注蛋白質)來抑制天然形式之蛋白質之一或多種活性。因此，可藉由使用具有限制功能之變體進行處理來誘發特定生物效應。相對於使用天然形式之蛋白質之治療，使用具有天然形式之蛋白質之生物活性子組之變體治療個體可在個體中具有較少副效應。
可藉由篩選本發明所涵蓋蛋白質之突變體(例如截短突變體)之組合庫之激動劑或拮抗劑活性來鑑別用作激動劑或拮抗劑的生物標記物蛋白變體。在一實施例中，藉由組合誘變在核酸層面上來生成變體多樣化庫且藉由多樣化基因庫進行編碼。可藉由(例如)以下方式來產生多樣化變體庫：以酶促方式使合成寡核苷酸之混合物接合至基因序列，從而簡並組之潛在蛋白質序列可表示為個別多肽或替代地一組較大融合蛋白(例如用於噬菌體顯示)。存在可用於自簡並寡核苷酸序列產生本發明所涵蓋多肽之潛在變體庫之多種方法。業內已知合成簡並寡核苷酸之方法(例如參見 Narang (1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等人(1984)Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakura等人(1984)Science 198:1056；及Ike等人(1983)Nucleic Acid Res . 11:477)。
另外，可使用對應於本發明所涵蓋標記物之多肽之編碼序列之片段庫來生成用於篩選及隨後選擇變體的多肽多樣化群體。舉例而言，可藉由以下方式來生成編碼序列片段之庫：使用核酸酶在切口形成僅每分子發生約一次之條件下處理所關注編碼序列之雙鏈PCR片段，使雙鏈DNA變性，使DNA複性以形成可包含來自不同切口形成產物之有義/反義對之雙鏈DNA，藉由使用S1核酸酶進行處理自再形成雙鏈體去除單鏈部分，且使所得片段庫接合至表現載體。藉由此方法，可衍生編碼所關注蛋白質之各種大小之胺基末端及內部片段之表現庫。
業內已知若干用於藉由點突變或截短來篩選組合庫之基因產物及用於篩選cDNA庫中具有所選性質之基因產物之技術。用於篩選大型基因庫之最廣泛使用之技術(其適於高通量分析)通常包含將基因庫選殖至可複製表現載體中，使用所得載體庫轉變適當細胞，及在其中檢測期望活性促進分離編碼其產物經檢測之基因之載體之條件下表現組合基因。遞歸總體誘變(REM)係增強庫中之功能突變體頻率之技術，其可與篩選分析組合用於鑑別本發明所涵蓋蛋白質之變體(Arkin及Yourvan (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8 9:7811-7815及Delgrave等人(1993)Prot. Engin. 6:327- 331)。
在一些實施例中，提供「變體模擬物」。如本文中所使用，術語「變體模擬物」係指含有一或多個模擬活化序列之胺基酸之變體。舉例而言，麩胺酸鹽可用作磷酸-蘇胺酸及/或磷酸-絲胺酸之模擬物。或者，變體模擬可產生含有模擬物之去活化或不活化產物，舉例而言，苯丙胺酸可用作酪胺酸之不活化替代物；或丙胺酸可用作絲胺酸之不活化替代物。胺基酸序列可包括天然胺基酸且由此可視為蛋白質、肽、多肽或其片段。或者，本發明所涵蓋之藥劑可包括天然胺基酸及非天然胺基酸。非天然胺基酸可包含(但不限於)包括羰基或胺基氧基或醯肼基團或胺基脲基團或疊氮化物基團之胺基酸。
應用於胺基酸序列之術語「同系物」意指與第二物種之第二序列實質上一致之另一物種的相應序列。
術語「類似物」意欲包含因一或多個胺基酸改變(例如胺基酸殘基之取代、添加或缺失)而有所不同且仍維持親代多肽之性質之多肽變體。
術語「衍生物」與術語「變體」同義使用且係指相對於參考分子或起始分子以任一方式進行修飾或改變之分子。本發明涵蓋若干類型之基於胺基酸之化合物及/或組合物(包含變體及衍生物)。該等物質包含取代、插入、缺失及共價變體及衍生物。因此，包括取代、插入、添加、缺失及/或共價修飾之藥劑包含於本發明範圍內。可視情況缺失位於肽或蛋白質之胺基酸序列之羧基-及胺基末端區域之胺基酸殘基，從而提供截短序列。端視序列之用途(使序列表現為可溶性或連接至固體載體之較大序列之一部分)，某些胺基酸(例如C-末端或N-末端殘基)可替代地缺失。
在提及蛋白質時，「取代變體」係去除天然或參考序列中之至少一個胺基酸殘基且在相同位置插入不同胺基酸者。取代可為單一取代，其中僅取代分子中之一個胺基酸，或其可為多取代，其中取代相同分子中之兩個或更多個胺基酸。在一實例中，本發明所涵蓋多肽中之胺基酸經另一具有類似結構及/或化學性質之胺基酸取代，例如保守胺基酸取代。如本文中所使用，術語「保守胺基酸取代」係指通常存在於序列中之胺基酸經具有所涉及殘基之類似大小、電荷、極性、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性性質之不同胺基酸取代。保守取代之實例包含使用非極性(疏水性)殘基(例如丙胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、異白胺酸、纈胺酸、白胺酸及甲硫胺酸)取代另一非極性殘基。同樣，保守取代之實例包含使用一種極性(親水性)殘基取代另一殘基，例如精胺酸與離胺酸之間、麩醯胺酸與天門冬醯胺之間及甘胺酸與絲胺酸之間。另外，使用鹼性殘基(例如離胺酸、精胺酸或組胺酸)取代另一鹼性殘基或使用一種酸性殘基(例如天門冬胺酸或麩胺酸)取代另一酸性殘基係保守取代之其他實例。「非保守取代」必須將該等種類中之一者之成員交換為另一種類。非保守取代之實例包含使用非極性(疏水性)胺基酸殘基(例如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸)取代極性(親水性)殘基(例如半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸或離胺酸)及/或使用極性殘基取代非極性殘基。可使用業內熟知之基因或化學方法生成胺基酸突變。基因方法可包含定點誘變、PCR、基因合成及諸如此類。預計亦可使用藉由除基因改造外之方法來改變胺基酸之側鏈基團的方法，例如化學修飾。
在提及蛋白質時，術語「插入變體」係緊鄰天然或起始序列中之特定位置之胺基酸插入一或多個胺基酸者。如本文中所使用，術語「緊鄰」係指連結至起始或參考胺基酸之α-羧基或α-胺基官能基之毗鄰胺基酸。與之相比，在提及蛋白質時，術語「缺失變體」係去除天然或起始胺基酸序列中之一或多個胺基酸者。通常，缺失變體在特定分子區域中缺失一或多個胺基酸。
術語「衍生物」包含含有一或多個使用有機蛋白質性或非蛋白質性衍生劑之修飾及轉譯後修飾之天然或參考蛋白質之變體。通常藉由以下方式來引入共價修飾：使蛋白質之靶向胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或末端殘基反應之有機衍生劑進行反應，或利用在所選重組宿主細胞中發揮作用之轉譯後修飾機制。所得共價衍生物可用於旨在鑑別對於生物活性、免疫分析或製備免疫親和力純化重組醣蛋白之抗蛋白質抗體較為重要之殘基之程式。該等修飾為業內所熟知且無需過多實驗即可實施。
某些轉譯後修飾係重組宿主細胞對所表現多肽之作用之結果。通常使麩醯胺醯基及天門冬醯胺醯基殘基轉譯後去醯胺成相應麩胺醯基及天門冬胺醯基殘基。或者，在弱酸條件下使該等殘基去醯胺。任一形式之該等殘基可存在於本發明所用之蛋白質中。其他轉譯後修飾包含脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))。
在一些實施例中，提供經共價修飾之多肽(例如融合蛋白)，例如經異源性多肽及/或非多肽修飾進行修飾之多肽。舉例而言，共價衍生物具體而言包含融合分子，其中本發明所涵蓋之蛋白質共價鍵結至非蛋白質性聚合物。非蛋白質性聚合物通常係親水性合成聚合物(亦即未另外發現於自然界中之聚合物)。然而，存在於自然界中且藉由重組或活體外方法產生之聚合物係有用的，如自自然界分離之聚合物。親水性聚乙烯基聚合物在本發明範圍內，例如聚乙烯醇及聚乙烯基吡咯啶酮。尤其有用者係聚乙烯基伸烷基醚，例如聚乙二醇、聚丙二醇(PEG)。蛋白質可以陳述於美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中之方式連接至各種非蛋白質性聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)。融合分子可進一步包括共價鍵結至其他生物活性分子或連接體之本發明所涵蓋之蛋白質。
術語「嵌合蛋白」或「融合蛋白」係指包括全部或一部分(較佳地生物活性部分)對應於可操作地連接至異源性多肽(例如除生物標記物多肽外之多肽)之本發明所涵蓋多肽之多肽的多肽。就融合蛋白而言，術語「可操作地連接」意欲指示，本發明所涵蓋之多肽及異源性多肽在框內彼此融合。異源性多肽可融合至本發明所涵蓋多肽之胺基-末端或羧基-末端。
一種有用融合蛋白係GST融合蛋白，其中對應於本發明所涵蓋標記物之多肽融合至GST序列之羧基末端。該等融合蛋白可促進本發明所涵蓋之重組多肽之純化。在另一實施例中，融合蛋白含有異源性信號序列、免疫球蛋白融合蛋白、毒素或其他有用蛋白質序列。可藉由標準重組DNA技術來產生本發明所涵蓋之嵌合蛋白及融合蛋白。在另一實施例中，融合基因可藉由習用技術(包含自動化DNA合成器)來合成。或者，基因片段之PCR擴增可使用錨定引子來實施，該等錨定引子在兩個鄰接基因片段之間產生互補懸突，其隨後可退火且再擴增以生成嵌合基因序列(例如參見Ausubel等人之前述文獻)。此外，許多已編碼融合部分(例如GST多肽)之表現載體市面有售。可將編碼本發明所涵蓋多肽之核酸選殖至此一表現載體中，從而融合部分框內連接至本發明所涵蓋之多肽。
可使用信號序列來促進經分泌蛋白質或其他所關注蛋白質之分泌及分離。信號序列之特徵通常在於疏水性胺基酸之核心，該等疏水性胺基酸通常係在分泌期間於一或多個裂解事件中自成熟蛋白質所裂解。該等信號肽含有處理位點，該等處理位點容許在成熟蛋白質通過分泌路徑時自成熟蛋白質裂解信號序列。因此，本發明涵蓋具有信號序列之所闡述多肽以及信號序列已以蛋白水解方式發生裂解之多肽(亦即裂解產物)。在一實施例中，編碼信號序列之核酸序列可在表現載體中可操作地連接至所關注蛋白質(例如通常未分泌或另外難以分離之蛋白質)。信號序列引導(例如)自轉變表現載體之真核宿主分泌蛋白質，且信號序列隨後或同時發生裂解。可然後易於藉由業內公認方法自細胞外介質純化蛋白質。或者，可使用促進純化之序列(例如使用GST結構域)使信號序列連接至所關注蛋白質。
在提及蛋白質時，術語「特徵」定義為分子之基於胺基酸序列之不同組分。本發明所涵蓋蛋白質之特徵包含表面表現、局部構形形狀、摺疊、環、半環、結構域、半結構域、位點、末端或其任一組合。舉例而言，在提及蛋白質時，術語「表面表現」係指出現於最外表面上之蛋白質之基於多肽之組分。在提及蛋白質時，術語「局部構形形狀」係指位於界定蛋白質空間內之蛋白質之基於多肽之結構表現。在提及蛋白質時，術語「摺疊」係指在能量最小化時胺基酸序列之所得構形。摺疊可出現於摺疊過程之二級或三級層面上。二級層面摺疊之實例包含β褶板及α螺旋。三級摺疊之實例包含因能量力之聚集或分離而形成之結構域及區域。以此方式形成之區域包含疏水性及親水性袋及諸如此類。關於蛋白質構形之術語「轉角」係指改變肽或多肽之主鏈方向之彎部且可涉及一個、兩個、三個或更多個胺基酸殘基。關於蛋白質之術語「環」係指肽或多肽中逆轉肽或多肽之主鏈方向之結構特徵且包括4個或更多個胺基酸殘基(Oliva等人(1997)J. Mol. Biol . 266:814-830)。在提及蛋白質時，術語「半環」係指所鑑別環中與衍生其之環相比具有至少一半數量之胺基酸殘基之部分。應理解，環並不總是含有偶數個胺基酸殘基。因此，在環含有或經鑑別包括奇數個胺基酸之彼等情形下，奇數環之半環將包括環之整數部分或下一整數部分(環之胺基酸數/2+/-0.5個胺基酸)。舉例而言，鑑別為7胺基酸環之環可產生具有3個胺基酸或4個胺基酸之半環(7/2=3.5+/-0.5為3或4)。在提及蛋白質時，術語「結構域」係指多肽中具有一或多種可鑑別結構或功能特性或性質(例如結合能力及/或用作蛋白質-蛋白質相互作用之位點)之基序。在提及蛋白質時，術語「半結構域」係指所鑑別結構域中與衍生其之結構域相比具有至少一半數量之胺基酸殘基之部分。應理解，結構域並不總是含有偶數個胺基酸殘基。因此，在結構域含有或經鑑別包括奇數個胺基酸之彼等情形下，奇數結構域之半結構域將包括結構域之整數部分或下一整數部分(結構域之胺基酸數/2+/-0.5個胺基酸)。舉例而言，鑑別為7胺基酸結構域之結構域可產生具有3個胺基酸或4個胺基酸之半結構域(7/2=3.5+/-0.5為3或4)。亦應理解，可在結構域或半結構域內鑑別子結構域，該等子結構域擁有衍生其之結構域或半結構域中所鑑別之非全部之結構或功能性質。亦應理解，包括本文之任一結構域類型之胺基酸未必沿多肽主鏈係鄰接的(亦即，非毗鄰胺基酸可在結構上發生摺疊以產生結構域、半結構域或子結構域)。關於基於胺基酸之實施例之術語「位點」與「胺基酸殘基」及「胺基酸側鏈」同義使用。位點代表肽或多肽內可在本發明所涵蓋基於胺基酸之分子內加以修飾、操縱、改變、衍生、或變化之位置。在提及蛋白質時，術語「末端(termini或terminus)」係指肽或多肽之端部。該等端部並不僅限於肽或多肽之第一或最終位點，且亦可包含末端區域中之其他胺基酸。本發明所涵蓋基於多肽之分子可描述為具有N-末端(亦即終止於具有游離胺基(NH2)之胺基酸)及C-末端(亦即終止於具有游離羧基(COOH)之胺基酸)。在一些情形下，本發明所涵蓋之蛋白質係由藉由二硫鍵或藉由非共價力結合至一起之多個多肽鏈(例如多聚體或寡聚物)構成。該等蛋白質具有多個N-末端及C-末端。或者，可修飾多肽之末端，從而其視情況始於或止於基於非多肽之部分(例如有機偶聯物)。
在任一特徵已鑑別或定義為本發明所涵蓋分子之組分後，可藉由移動、交換、倒轉、缺失、隨機化或複製實施該等特徵之若干操縱及/或修飾中之任一者。另外，應理解，操縱特徵可與修飾本發明所涵蓋之分子產生相同結果。舉例而言，涉及缺失結構域之操縱將改變分子之長度，此正如修飾核酸以編碼小於全長之分子所達成一般。可藉由業內已知方法(例如定點誘變)來達成修飾及操縱。
在一些實施例中，本文所闡述之藥劑可包括一或多個同位素原子。如本文中所使用，術語「同位素」係指具有一或多個額外中子之化學元素，例如氘同位素。
3. 抗體藥劑 在另一態樣中，本發明涵蓋抗體藥劑及其變體及/或抗原結合片段。
a.抗體組合物 術語「抗體」或「Ab」係以最廣泛意義使用且具體而言包含(但不限於)全抗體、單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如自至少兩種完整抗體形成之雙特異性抗體、三特異性抗體或具有較大多特異性之抗體)、抗體片段、二價抗體、抗體變體及抗體源結合結構域(其係其他肽之一部分或與其締合)。抗體主要係基於胺基酸之分子，但亦可包括一或多種修飾(包含(但不限於)添加糖部分、螢光部分、化學標籤等)。在一些情形下，抗體可包含基於非胺基酸之分子。本發明所涵蓋之抗體可為天然抗體或藉由生物改造產生。
在一些實施例中，抗體可包括重鏈及輕鏈可變結構域以及Fc區。術語「天然抗體」通常係指約150,000道爾頓(dalton)之異源四聚體醣蛋白，其係由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成。每一輕鏈係藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈，而在不同免疫球蛋白同型之重鏈中二硫鍵之數量各不相同(例如IgG、IgA、IgE及IgM)。每一重鏈及輕鏈亦具有規則地間隔開之鏈內二硫鍵。每一重鏈在一端具有可變結構域(VH)，且後接多個恆定結構域。每一輕鏈在一端均具有可變結構域(VL)且在其另一端具有恆定結構域；輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域對準，且輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域對準。抗體之兩條重鏈之其餘重鏈恆定結構域構成抗體之可結晶片段(Fc)區。抗體之尾部區域中之Fc區與細胞表面受體(稱為Fc受體)及補體系統之一些蛋白質相互作用。
術語「輕鏈」係指來自任一脊椎動物物種之抗體之組分，其基於恆定結構域之胺基酸序列可指派為兩種完全不同類型(稱為κ及λ)中之一者。端視抗體重鏈中恆定結構域之胺基酸序列，可將抗體歸類為不同種類。存在5個主要種類之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將該等種類中若干種類進一步劃分成亞類(同型物)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。
術語「可變結構域」係指抗體重鏈及輕鏈上之特定抗體結構域，其序列在抗體中廣泛不同且用於每一特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。舉例而言，術語「VH」係指「重鏈可變結構域」且術語「VL」係指「輕鏈可變鏈」。可變結構域包括超變區。術語「超變區」係指可變結構域內包括負責抗原結合之胺基酸殘基之區域。該等區域具有超變序列及/或形成結構界定之環。存在於超變區內之胺基酸決定了成為抗體中抗原結合位點之一部分之互補決定區(CDR)的結構。通常，抗體包括6個HVR；3個位於VH中(H1、H2、H3)，且3個位於VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3及L3顯示6個HVR之大部分多樣性，且特定而言據信H3在賦予抗體良好特異性方面發揮獨特作用(例如參見Xu等人(2000)Immunity 13, 37-45；Johnson及Wu (2003)Meth. Mol. Biol. 248:1-25)。術語「CDR」係指抗體中包括與其靶抗原或表位互補之結構之區域。可變結構域中不與抗原相互作用之其他部分稱為框架(FW)區。抗原結合位點(亦稱為抗原組合位點或互補位)包括與特定抗原相互作用所需之胺基酸殘基。通常藉由共晶體學使用結合抗原來闡明構成抗原結合位點之確切殘基，然而，亦可使用基於與其他抗體之對比之計算評價(Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54)。構成CDR之殘基之測定可包含使用編號方案，包含(但不限於)由以下各項教示者：Kabat (Wu等人(1970)JEM 132:211-250；Kabat等人(1992)，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，U.S. Department of Health and Human Services；Johnson等人(2000)Nucl. Acids Res . 28:214-218)、Chothia (Chothia及Lesk (1987)J. Mol. Biol. 196:901；Chothia等人(1989)Nature 342:877；Al-Lazikani等人(1997)J. Mol. Biol . 273:927-948)、Lefranc (Lefranc等人(1995)Immunome Res . 1:3)、Honegger (Honegger及Pluckthun (2001)J. Mol. Biol . 309: 657-670)及MacCallum (MacCallum等人(1996)J. Mol. Biol. 262:732)。
VH及VL結構域各自具有三個CDR。VL CDR在本文中稱為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其出現順序係沿可變結構域多肽自N-末端移動至C-末端。VH CDR在本文中稱為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其出現順序係沿可變結構域多肽自N-末端移動至C-末端。每一CDR具有有益之規範結構，CDR-H3除外，其包括在抗體之間序列及長度可高度可變之胺基酸序列，從而在抗原結合結構域中產生各種三維結構(Nikoloudis等人(2014)Peer J . 2:e456)。在一些情形下，可在一組相關抗體中分析CDR-H3以評價抗體多樣性。業內已知測定CDR序列之各種方法且可應用於已知抗體序列(Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54)。
在一些實施例中，抗體片段及變體可包括完整抗體之任一部分。術語「抗體片段」及「抗體變體」亦包含如同抗體一般藉由結合至特異性抗原以形成複合物來發揮作用之任何合成或基因改造之蛋白質/多肽。在一些實施例中，抗體片段及變體包括來自完整抗體之抗原結合區域。抗體片段之實例可包含(但不限於) Fab、Fab'、F(ab’)2 及Fv片段；Fd、二價抗體；細胞內抗體、線性抗體；單鏈抗體分子，例如單鏈可變片段(scFv)；自抗體片段形成之多特異性抗體；及諸如此類。不論結構如何，抗體片段或變體結合由親代全長抗體識別之相同抗原。
藉由野生型抗體之限制性蛋白水解產生之抗體片段稱為蛋白水解性抗體片段。該等片段包含(但不限於) Fab片段、Fab’片段及F(ab′)2 片段。抗體之木瓜酶消解產生兩個相同抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自具有單一抗原結合位點。亦產生殘餘「Fc」片段，其名稱反映了其易於結晶之能力。胃蛋白酶或無花果蛋白酶處理可產生F(ab′)2 片段，該片段具有兩個抗原結合位點且仍然能夠交聯抗原。一般而言，F(ab′)2片段包括兩個「臂」，每一臂包括指向且特異性結合公用抗原之可變區。兩個Fab′分子由重鏈之鉸鏈區中之鏈間二硫鍵接合；Fab′分子可指向相同(雙價)或不同(雙特異性)表位。如本文中所使用，「Fab’片段」含有單一抗原結合結構域(包含Fab)及重鏈中穿過鉸鏈區之另一部分。本發明所涵蓋之化合物及/或組合物可包括該等片段中之一或多者。
術語「Fv」係指包括完整抗原識別及抗原結合位點之抗體片段。該等區域由一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域呈緊密非共價締合形式之二聚體組成。Fv片段可藉由蛋白水解裂解生成，但極其不穩定。業內已知生成穩定Fv片段之重組方法，其通常經由在輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域之間插入撓性連接體(以形成單鏈Fv (scFv)或經由在重鏈可變結構域與輕鏈可變結構域之間引入二硫橋來達成(Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p46-47)。
術語「單鏈Fv」或「scFv」係指VH抗體結構域及VL抗體結構域之融合蛋白，其中該等結構域由撓性肽連接體一起連接成單一多肽鏈。在一些實施例中，Fv多肽連接體使得scFv能夠形成用於抗原結合之期望結構。在一些實施例中，可藉由10至30個胺基酸殘基之肽連接VH結構域及VL結構域。在一些實施例中，使scFv與噬菌體顯示、酵母顯示或其他顯示方法聯合利用，其中其可與表面成員(例如噬菌體外殼蛋白)相關聯地表現且用於鑑別給定抗原之高親和力肽。在一些實施例中，術語「單鏈抗體」可進一步包含(但不限於)二硫化物連接之Fv (dsFv)，其中兩種單鏈抗體(各自可指向不同表位)藉由二硫鍵連接至一起。使用分子基因學，可將兩個scFv串聯改造成由連接體結構域間隔開之單一多肽，稱為「串聯scFv」 (tascFv)。使用具有兩個不同scFv之基因構築tascFv會產生「雙特異性單鏈可變片段」 (雙scFv) (Nelson (2010)Mabs 2:77-83)。亦可包含巨抗體(融合至IgG之Fc (CH2-CH3結構域)之胺基末端之雙價scFv)。
在一些實施例中，抗體可包括經修飾Fc區。作為一非限制性實例，可藉由一定方法來製備經修飾Fc區或可為美國專利公開案第US 2015-0065690號中所闡述之任一區域。
術語「多株抗體」包含在針對具有許多表位之蛋白質之免疫原性反應中生成之抗體。多株抗體之組合物(例如血清)由此包含多種指向蛋白質內之相同及不同表位之不同抗體。業內已知產生多株抗體之方法(例如參見Cooper等人，Short Protocols in Molecular Biology ，第2版，第11章第III部分；Ausubel等人編輯，John Wiley and Sons, New York, 1992,第11-37頁至第11-41頁)。
與之相比，術語「單株抗體」係指自實質上均質細胞(或純系)之群體獲得之抗體，亦即，構成群體之個別抗體相同及/或結合抗原之相同特異性表位，可在產生單株抗體期間出現之可能變體除外，該等變體通常係以極少量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑不同，每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上均質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。單株抗體包含「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬特定抗體種類或亞類之抗體的對應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬另一抗體種類或亞類之抗體的對應序列相同或同源；以及該等抗體之片段。
術語「抗體變體」係指經修飾抗體(相對於天然或起始抗體)或在結構及/或功能上類似於天然或起始抗體之生物分子，該生物分子與天然或起始抗體(例如抗體模擬物)相比在胺基酸序列、組成或結構方面包含一定差異。與天然抗體相比，抗體變體之胺基酸序列、組成或結構可有所改變。抗體變體可包含(但不限於)具有改變之同型之抗體(例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM)、人類化變體、最佳化變體、多特異性抗體變體(例如雙特異性變體)及抗體片段。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可包括抗體融合蛋白。如本文中所使用，術語「抗體融合蛋白」係重組產生之抗原結合分子，其中兩種或更多種具有相同或不同特異性之相同或不同天然抗體、單鏈抗體或抗體片段區段連接至一起。融合蛋白之化合價指示融合蛋白針對抗原或表位所具有之結合臂或位點之總數；亦即單價、二價、三價或多價。抗體融合蛋白之多價性意指，其可利用多種相互作用結合至抗原，由此增加與抗原之結合親合力。特異性指示抗體融合蛋白能夠結合多少不同抗原或表位，亦即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性等。使用該等定義，天然抗體(例如IgG)係二價，此乃因其具有兩個結合臂，但係單特異性，此乃因其結合至一種抗原。單特異性多價融合蛋白針對一個表位具有一個以上之結合位點，但僅結合相同抗原上之相同表位，例如具有兩個與相同抗原具有反應性之結合位點之二價抗體。融合蛋白可包含不同抗體組分或多個拷貝之相同抗體組分之多價或多特異性組合。融合蛋白可進一步包含治療劑。適用於該等融合蛋白之治療劑之實例包含免疫調節劑(「抗體-免疫調節劑融合蛋白」)及毒素(「抗體-毒素融合蛋白」)。一種較佳毒素包括核糖核酸酶(RNase)，較佳係重組RNase。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可包含多特異性抗體。如本文中所使用，術語「多特異性抗體」係指結合一個以上表位之抗體。如本文中所使用，術語「多體」或「多特異性抗體」係指其中兩個或更多個可變區結合至不同表位之抗體。表位可位於相同或不同靶上。在一實施例中，可藉由PCT公開案第WO 2011/109726號及美國專利公開案第2015-0252119號中所闡述之方法來生成多特異性抗體且最佳化。該等抗體能夠以高特異性及高親和力結合至多個抗原。在一些實施例中，多特異性抗體係「雙特異性抗體」。如本文中所使用，術語「雙特異性抗體」係指能夠結合相同或不同抗原上之兩個不同表位之抗體。在一態樣中，雙特異性抗體能夠結合兩種不同抗原。該等抗體通常包括來自至少兩種不同抗體之抗原結合區域。舉例而言，雙特異性單株抗體(BsMAb、BsAb)係由兩種不同單株抗體之片段構成之人工蛋白質，由此容許BsAb結合至兩種不同類型之抗原。雙特異性抗體可包含Riethmuller (2012)Cancer Immun. 12:12-18；Marvin等人(2005)Acta Pharmacol. Sinica 26:649-658及Schaefer等人(2011)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:11187-11192中所闡述之任一者。已研發新一代BsMAb，稱為「三功能雙特異性」抗體。該等抗體由兩條重鏈及兩條輕鏈組成，每一者來自兩種不同抗體，其中兩個Fab區(臂)指向兩種抗原，且Fc區(足)包括兩條重鏈且形成第三結合位點。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之組合物可包含抗肽抗體。如本文中所使用，術語「抗肽抗體」係指在針對短(通常5至20個胺基酸)免疫原性多肽之體液反應中生成之「單特異性抗體」，該免疫原性多肽對應於衍生其之蛋白質(例如本發明所涵蓋之靶蛋白)之較少(較佳地一個)經分離表位。複數個抗肽抗體包含各種針對蛋白質之特定部分(亦即針對含有至少一個、較佳地僅一個表位之胺基酸序列)之不同抗體。業內已知產生抗肽抗體之方法(例如參見Cooper等人，Short Protocols in Molecular Biology ，第2版，第11章第III部分；Ausubel等人編輯，John Wiley and Sons, New York, 1992,第11-42頁至第11-46頁)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可包含二價抗體。如本文中所使用，術語「二價抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段。二價抗體在同一多肽鏈中包括連結至輕鏈可變結構域VL之重鏈可變結構域VH。藉由使用過短而不容許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接體，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。二價抗體更全面地闡述於(例如)以下文獻中：EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可包含細胞內抗體。如本文中所使用，術語「細胞內抗體」係指並非自產生其之細胞分泌而係靶向一或多種細胞內蛋白質之抗體形式。可使用細胞內抗體來影響諸多細胞過程，包含(但不限於)細胞內輸送、轉錄、轉譯、代謝過程、增殖性信號傳導及細胞分裂。在一些實施例中，本發明所涵蓋之方法可包含基於細胞內抗體之療法。在一些該等實施例中，可將本文所揭示之可變結構域序列及/或CDR序列納入一或多種用於基於細胞內抗體之療法之構築體中。舉例而言，細胞內抗體可靶向一或多種醣化細胞內蛋白質或可調節一或多種醣化細胞內蛋白質與替代蛋白質之間之相互作用。細胞內抗體在哺乳動物細胞之不同腔室中之細胞內表現容許阻斷或調節內源性分子之功能(Biocca等人(1990)EMBO J . 9:101-108；Colby等人(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 101: 17616-17621)。細胞內抗體可改變蛋白質摺疊、蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質-DNA相互作用、蛋白質-RNA相互作用及蛋白質修飾。其可誘導表型敲除且藉由直接結合至靶抗原、藉由使其細胞內輸送轉向或藉由抑制其與結合配偶體之締合而用作中和劑。鑒於對基於靶抗原高特異性及親和力，細胞內抗體可有利地阻斷特定靶分子之某些結合相互作用，同時保留其他相互作用。可使用來自供體抗體之序列來產生細胞內抗體。細胞內抗體通常在細胞內重組表現為單一結構域片段(例如經分離VH及VL結構域)或單鏈可變片段(scFv)抗體。舉例而言，細胞內抗體通常表現為單一多肽以形成包括由撓性連接體多肽接合之重鏈及輕鏈之可變結構域之單鏈抗體。細胞內抗體通常缺乏二硫鍵且能夠經由其特異性結合活性來調節靶基因之表現或活性。單鏈細胞內抗體通常表現自重組核酸分子且經改造以保留於細胞內(例如保留於細胞質、內質網或周質中)。可使用業內已知方法來產生細胞內抗體，例如揭示且綜述於(例如)以下文獻中之方法：Marasco等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7889-7893；Chen等人(1994)Hum. Gene Ther . 5:595-601；Chen等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5932-5936；Maciejewski等人(1995)Nat. Med . 1:667-673；Marasco (1995)Immunotech. 1: 1-19；Mhashilkar等人(1995)EMBO J. 14: 542-1451；Chen等人(1996)Hum. Gene Therap . 7:1515-1525；Marasco (1997)Gene Ther . 4:11-15；Rondon及Marasco (1997)Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283；Cohen等人(1998)Oncogene 17:2445-2456；Proba等人(1998)J. Mol. Biol. 275:245-253；Cohen等人(1998)Oncogene 17:2445-2456；Hassanzadeh等人(1998)FEBS Lett. 437:81-86；Richardson等人(1998)Gene Ther. 5:635-644；Ohage及Steipe (1999)J. Mol. Biol. 291:1119-1128；Ohage等人(1999)J. Mol. Biol. 291:1129-1134；Wirtz及Steipe (1999)Protein Sci. 8:2245-2250；Zhu等人(1999)J. Immunol. Methods 231:207-222；Arafat等人(2000)Cancer Gene Ther . 7:1250-1256；der Maur等人(2002)J. Biol. Chem. 277:45075-45085；Mhashilkar等人(2002)Gene Ther. 9:307-319；及Wheeler等人(2003)FASEB J. 17:1733-1735)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可包含嵌合抗體。如本文中所使用，術語「嵌合抗體」係指重組抗體，其中重鏈及輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬特定抗體種類或亞類之抗體的相應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬另一抗體種類或亞類之抗體的相應序列相同或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現期望之生物活性即可(例如參見美國專利第4,816,567號；Morrison等人(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855)。舉例而言，本文之所關注嵌合抗體可包含包括衍生自非人類靈長類動物(例如舊大陸猴(Old World Monkey)，例如狒狒、恒河猴或食蟹猴)之可變結構域抗原結合序列及人類恆定區序列之「靈長類化」抗體。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可為人類化抗體。如本文中所使用，術語「人類化抗體」係指包括來自一或多種非人類(例如鼠類)抗體來源之最小部分且剩餘部分衍生自一或多種人類免疫球蛋白來源之嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體係如下人類免疫球蛋白(受體抗體)：其中來自受體抗體之超變區之殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之抗體(供體抗體)之超變區中具有期望特異性、親和力及/或能力之殘基代替。在一實施例中，抗體可為人類化全長抗體。可使用蛋白質改造技術來生成人類化抗體(例如Gussow及Seemann (1991)Meth. Enzymol . 203:99-121)。作為一非限制性實例，可使用美國專利公開案第2013/0303399號中所教示之方法使抗體人類化。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可包含經半胱胺酸修飾之抗體。在「經半胱胺酸修飾之抗體」中，藉由基因操縱將半胱胺酸胺基酸插入或取代於抗體表面上且用於經由(例如二硫橋)使抗體偶聯至另一分子。已闡述抗體之半胱胺酸取代或插入(例如參見美國專利第5,219,996號)。將半胱胺酸殘基引入用於位點特異性偶聯抗體之IgG抗體之恆定區中之方法闡述於Stimmel等人(2000)J. Biol. Chem . 275:330445-30450)中。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體變體可為抗體模擬物。如本文中所使用，術語「抗體模擬物」係指模擬抗體之功能或效應且以高親和力特異性結合至其分子靶之任一分子。在一些實施例中，抗體模擬物可為單抗體，其經設計以納入纖連蛋白類型III結構域(Fn3)作為蛋白質支架(參見美國專利第6,673,901號及第6,348,584號)。在一些實施例中，抗體模擬物可包含業內已知者中之任一者，包含(但不限於)親和體分子、親和素、阿非廷(affitin)、抗運載蛋白、高親和性多聚物、森特因(Centyrin)、DARPINSTM 、非諾爾(Fynomer)及庫尼茲(Kunitz)以及結構域肽。在其他實施例中，抗體模擬物可包含一或多個非肽區域。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可包括單一抗原結合結構域。該等分子極小，其中分子量大約為針對全尺寸mAb所觀察者之十分之一。其他抗體可包含「奈米抗體」衍生自駱駝及駱馬中所發現缺乏輕鏈之重鏈抗體之抗原結合可變重鏈區域(VHH) (例如參見Nelson (2010)Mabs 2:77-83)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可為「小型化」的。mAb小型化之一實例係小模組免疫醫藥(SMIP)。該等分子可為單價或二價，其係含有一個VL、一個VH抗原結合結構域及一或兩個恆定「效應」結構域之重組單鏈分子，該等結構域皆由連接體結構域連結。(例如參見Nelson (2010)Mabs 2:77-83)。據信，此一分子可提供以下優點：增加了由片段所需要之組織或腫瘤滲透，同時保留由恆定結構域賦予之免疫效應功能。小型化抗體之另一實例稱為「單抗體」，其中已自IgG4分子去除鉸鏈區。儘管IgG4分子不穩定且可彼此交換輕-重鏈異二聚體，但缺失鉸鏈區可完全防止重鏈-重鏈配對，從而留下高度特異性之單價輕/重異二聚體，同時保留Fc區以確保穩定性及活體內半衰期。此構形可最小化免疫活化或致癌生長之風險，此乃因IgG4很少與FcR相互作用且單價單抗體不能促進細胞內信號傳導複合物形成(例如參見Nelson (2010)Mabs 2:77-83)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體變體可為單一結構域抗體(sdAb或奈米抗體)。如本文中所使用，術語「sdAb」或「奈米抗體」係指由單一單體可變抗體結構域組成之抗體片段。如同完整抗體，其能夠選擇性結合至特異性抗原。在一態樣中，sdAb可為「駱駝Ig」或「駱駝科VHH」。如本文中所使用，術語「駱駝Ig」係指重鏈抗體之最小已知抗原結合單元(Koch-Nolte等人(2007)FASEB J . 21:3490-3498)。「重鏈抗體」或「駱駝科抗體」係指含有兩個VH結構域且不含輕鏈之抗體(Hamers-Casterman等人(1993)Nature 363:446-448 (1993)；Sheriff等人(1996)Nat. Struct. Biol. 3:733-736；Riechmann等人(1999)J. Immunol .Meth. 231:25-38；PCT公開案第WO1994/04678號及第WO 1994/025591號；及美國專利第6,005,079號)。在另一態樣中，sdAb可為「免疫球蛋白新抗原受體」 (IgNAR)。術語「免疫球蛋白新抗原受體」係指來自鯊魚免疫譜之抗體種類，其由一個可變新抗原受體(VNAR)結構域及五個恆定新抗原受體(CNAR)結構域之同源二聚體組成。IgNAR代表一些最小已知免疫球蛋白基蛋白質支架，且高度穩定並擁有有效結合特性。固有穩定性可歸因於以下因素：(i)基礎Ig支架，其與發現於鼠類抗體中之習用抗體VH及VL結構域相比呈現大量帶電及親水性表面暴露殘基；及(ii)互補決定區(CDR)環中之穩定結構特徵，包含環間二硫化物橋及環內氫鍵模式。其他小型化抗體片段可包含「互補決定區肽」或「CDR肽」。CDR肽(亦稱為「最小識別單元」)係對應於單一互補決定區(CDR)之肽，且可藉由構築編碼所關注抗體之CDR之基因來製備。舉例而言，藉由使用聚合酶鏈反應自抗體產生細胞之RNA合成可變區來製備該等基因(例如參見Larrick等人(1991)Methods Enzymol. 2:106)。
包括抗體之抗原結合片段之其他變體可包含(但不限於)二硫化物連接之Fv (sdFv)、VL 、VH 、駱駝Ig、V-NAR、VHH、三特異性變體(Fab3 )、雙特異性變體(Fab2 )、三價抗體(三價)、四價抗體(四價)、微小抗體((scFv -CH3)2 )、雙特異性單鏈Fv (雙scFv)、IgGdeltaCH2、scFv-Fc、(scFv)2 -Fc、親和體、肽適配體、高親和性多聚物或奈米抗體或完整免疫球蛋白之其他抗原結合子序列。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可為如美國專利第5,091,513號中所闡述之抗體。此一抗體可包含一或多個構成表現為生物合成抗體結合位點(BABS)之區域之胺基酸序列。該等位點包括1)非共價相關或二硫化物鍵結之合成VH及VL二聚體；2) VH-VL或VL-VH單鏈，其中VH及VL由多肽連接體附接；或3)個別VH或VL結構域。結合結構域包括可衍生自單獨免疫球蛋白之連接之CDR及FR區域。生物合成抗體亦可包含用作(例如)酶、毒素、結合位點或至固定介質或放射性原子之附接位點之其他多肽序列。揭示用於以下之方法：產生生物合成抗體，設計具有任一可藉由活體內生成抗體來誘發之特異性之BABS，及產生其類似物。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可為具有美國專利第8,399,625號中所教示之抗體受體框架之抗體。該抗體受體框架可尤其極適於接受來自所關注抗體之CDR。
在一實施例中，抗體可為條件性活性生物蛋白。可使用抗體來生成在野生型正常生理學條件下可逆地或不可逆地不活化之條件性活性生物蛋白，且提供該等條件性活性生物蛋白及該等條件性活性生物蛋白之用途。該等方法及條件性活性蛋白教示於(例如) PCT公開案第WO 2015/175375號及第WO 2016/036916號及美國專利公開案第2014/0378660號中。
可使用重組多核苷酸來產生如本文所闡述之抗體以及其變體及/或片段。在一實施例中，多核苷酸具有模組設計以編碼抗體、其片段或變體中之至少一者。作為一非限制性實例，多核苷酸構築體可編碼下列設計中之任一者：(1)抗體之重鏈，(2)抗體之輕鏈，(3)抗體之重鏈及輕鏈，(4)藉由連接體間隔開之重鏈及輕鏈，(5) VH1、CH1、CH2、CH3結構域、連接體及輕鏈，或(6) VH1、CH1、CH2、CH3結構域、VL區及輕鏈。該等設計中之任一者亦可包括任一結構域及/或區域之間之可選連接體。可使用本文所闡述之抗體或任一其組分部分作為起始分子來改造本發明所涵蓋之多核苷酸以產生任一標準種類之免疫球蛋白。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體係治療性抗體。如本文中所使用，術語「治療性抗體」意指有效治療患有或易患疾病或病症之哺乳動物之疾病或病症之抗體。抗體可為細胞滲透抗體、中和抗體、激動劑抗體、部分激動劑、反激動劑、部分拮抗劑或拮抗劑抗體。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體可為裸抗體。如本文中所使用，術語「裸抗體」係不含其他修飾之完整抗體分子，該等其他修飾係(例如)與毒素或用於結合至放射性核素之螯合物偶聯。裸抗體之Fc部分可提供效應功能(例如補體固定及ADCC (抗體依賴性細胞毒性))，該等效應功能開啟了可產生細胞裂解之機制(例如參見Markrides (1998)Pharmacol. Rev . 50:59-87)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體不具有針對表現所關注生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物)之細胞之ADCC活性。在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體不具有針對表現所關注生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物)之細胞之CDC活性。在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體並不偶聯至另一治療部分(例如細胞毒性劑)。在一些實施例中，本發明所涵蓋之抗體在結合細胞及/或由細胞內化時不殺死表現所關注生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物)之細胞。
b.抗體生成 本發明所涵蓋之抗體可為天然抗體或經由業內已知之任何方法人工製得者，例如藉由習用雜交瘤技術、重組技術、突變或最佳化已知抗體、自抗體庫或抗體片段庫進行選擇及免疫化產生之單株抗體(mAb)。業內熟知抗體(不論單株抑或多株)之生成。業內熟知產生抗體之技術且闡述於(例如)以下文獻中：Harlow及Lane 「Antibodies, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988；Harlow及Lane 「Using Antibodies: A Laboratory Manual」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999；及「Therapeutic Antibody Engineering: Current and Future Advances Driving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry」 Woodhead Publishing, 2012。
抗體產生方法通常依賴於用於選擇、免疫化及/或證實抗體親和力及/或特異性之所用靶分子。用於本發明之靶分子包含靶抗原。靶抗原可為基於胺基酸之分子、非基於胺基酸之分子或由基於胺基酸之分子及非基於胺基酸之分子構成之化合物。術語「胺基酸(amino acid及amino acids)」係指所有天然L-α-胺基酸以及非天然胺基酸。胺基酸係藉由如下單字母或三字母名稱來鑑別：天門冬胺酸(Asp: D)、異白胺酸(Ile: I)、蘇胺酸(Thr: T)、白胺酸(Leu: L)、絲胺酸(Ser: S)、酪胺酸(Tyr: Y)、麩胺酸(Glu: E)、苯丙胺酸(Phe: F)、脯胺酸(Pro: P)、組胺酸(His: H)、甘胺酸(Gly: G)、離胺酸(Lys: K)、丙胺酸(Ala: A)、精胺酸(Arg: R)、半胱胺酸(Cys: C)、色胺酸(Trp: W)、纈胺酸(Val: V)、麩醯胺酸(Gln: Q)、甲硫胺酸(Met: M)及天門冬醯胺(Asn: N)，其中首先列示胺基酸，隨後在括號內分別藉由三個字母代碼及一個字母代碼列示。基於胺基酸之靶抗原可為蛋白質或肽。如本文中所使用，術語「肽」係指具有2至50個或更多個胺基酸之基於胺基酸之分子。特殊標示符適用於較小肽，其中「二肽」係指兩胺基酸分子且「三肽」係指三胺基酸分子。具有50個以上鄰接胺基酸之基於胺基酸之分子可視為多肽或蛋白質。
在一些實施例中，可經由使用一或多種靶抗原使宿主免疫化來製備抗體，該等靶抗原用作免疫原來誘發免疫學反應。在一些情形下，可僅使用給定抗原之部分或區域。在基於胺基酸之抗原之情形下，可使用一或多種抗原源多肽或肽(在本文中稱為「抗原肽」)。適於生成抗體之抗原肽較佳地含有長至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、約5至約50個胺基酸、約10至約30個胺基酸、約10至約20個胺基酸、約40至約200個胺基酸或至少200個胺基酸之序列。在使用較大多肽或蛋白質來生成抗體之本發明所涵蓋之某些實施例中，該等多肽或蛋白質之長度較佳為至少50、至少55、至少60、至少70、至少80、至少90或更多個胺基酸。
藉由免疫化生成抗體通常涉及使用非人類動物宿主作為免疫化個體(在本文中稱為「免疫原性宿主」)。在一些實施例中，免疫原性宿主係選自任何脊椎動物。在其他實施例中，免疫原性宿主係選自所有哺乳動物。在其他實施例中，免疫原性宿主係小鼠，包含轉基因或經敲除小鼠。其他免疫原性宿主可包含(但不限於)大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、倉鼠、天竺鼠、牛、馬、豬、駱馬、駱駝及雞。
使用本文所闡述之靶抗原使免疫原性宿主免疫化可包括使用一或多種佐劑。可使用佐劑在該等免疫原性宿主中誘發較高免疫反應。因此，可基於影響抗體效價之能力來選擇本發明所用之佐劑。佐劑可包含(但不限於)弗羅因德氏佐劑(Freund’s) (完全及不完全)、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂)、普羅尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、鑰孔帽貝血藍蛋白、二硝基苯酚及其他有用人類佐劑(例如BCG (卡介苗)及短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum ))。業內亦熟知該等佐劑。在一些實施例中，油包水型乳液可用作佐劑。油包水型乳液可藉由形成移動抗原儲積物來發揮作用，從而促進緩慢抗原釋放且增強至免疫組分之抗原呈遞。弗羅因德氏可以以下形式使用：完全弗羅因德氏佐劑(CFA)佐劑，其包括已乾燥且不活化之分支桿菌顆粒；或不完全弗羅因德氏佐劑(IFA)，其缺乏該等顆粒。其他基於油包水型之佐劑包含EMULSIGEN® (MVP Technologies, Omaha, NE)。EMULSIGEN®包括不含動物基組分之微米級油滴。其可單獨使用或與其他佐劑(包含(但不限於)氫氧化鋁及CARBIGENTM (MVP Technologies, Omaha, NE))組合使用。在一些實施例中，可使用TITERMAX®佐劑。TITERMAX®係另一油包水型乳液，其包括角鯊烯以及山梨醇酐單油酸酯80 (作為乳化劑)及其他組分。在一些情形下，TITERMAX®可提供較高免疫反應，但針對免疫原性宿主之毒性較低。亦可使用免疫刺激性寡核苷酸作為佐劑。該等佐劑可包含(例如) CpG寡去氧核苷酸(ODN) (Chu等人(2000) Infect. Immunity 68:1450-1456；ODN可包含市面有售者中之任一者，例如ODN-1585、ODN-1668、ODN-1826、ODN-2006、ODN-2007、ODN-2216、ODN-2336、ODN-2395及/或ODN-M362，其中之每一者可購自(例如) InvivoGen, San Diego, CA)；或免疫刺激複合物(ISCOM)，其係在特定化學計量下一起混合膽固醇、磷脂及皂樹屬(Quillaia )皂素時自發形成之球形開口籠樣結構(通常直徑為40 nm) (例如參見AbISCO-100, Isconova, Uppsala, Sweden)。根據本發明所涵蓋之實施例，免疫化溶液之佐劑組分可有所變化以達成期望結果。該等結果可包含調節免疫原性宿主中之免疫反應整體程度及/或毒性程度。
可使用熟習此項技術者已知之充分確立之方法來製備本發明所涵蓋之單株抗體。在一實施例中，使用雜交瘤技術來製備單株抗體(Kohler等人(1975)Nature 256: 495-497)。在雜交瘤方法中，通常使用免疫劑(例如靶抗原)對小鼠、倉鼠或其他適當免疫原性宿主動物實施免疫以誘發產生或能夠產生特異性結合至免疫劑之抗體之淋巴球。或者，可在活體外對淋巴球實施免疫。然後使用適宜融合劑(例如聚乙二醇)使淋巴球與永生化細胞系融合以形成雜交瘤細胞(Goding, J.W.,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice . Academic Press. 1986；59-1031)。永生化細胞系通常係經轉變哺乳動物細胞，尤其係齧齒類動物、兔、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。可在適宜培養基中培養雜交瘤細胞，該培養基較佳地含有一或多種抑制未融合、永生化細胞之生長或存活之物質。舉例而言，若親代細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤之培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(「HAT培養基」)，該等物質會防止HGPRT缺陷型細胞之生長。
在一些實施例中，永生化細胞系係彼等可有效融合、支持所選抗體產生細胞穩定大量表現抗體且對諸如HAT培養基等培養基敏感之細胞。該等細胞系可為鼠類骨髓瘤細胞系，其可(例如)自沙克研究院細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，San Diego, Calif.及美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection), Manassas, Va獲得。亦已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系(Kozbor等人(1984) J. Immunol. 133:3001-3005；Brodeur, B.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc., New York. 1987；33:51-63)。然後可分析培養雜交瘤細胞之培養基以用於確定單株抗體之存在。較佳地，藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(例如放射性免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來測定由雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性(亦即特異性免疫反應性)。熟習此項技術者已知該等技術及分析。可(例如)藉由斯卡查德分析(Scatchard analysis) (Munson (1980) Anal. Biochem. 107:220-239)來測定單株抗體之結合特異性。在鑑別期望雜交瘤細胞之後，可藉由限制性稀釋程序亞選殖該等純系且藉由標準方法使其生長。用於此目的之適宜培養基包含(例如)達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)或RPMI-1640培養基。或者，可使雜交瘤細胞作為哺乳動物體內之腹水在活體內生長。可藉由習用免疫球蛋白純化程序(例如蛋白質A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和力層析)將由亞純系分泌之單株抗體自培養基或腹水液分離或純化。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之單株抗體亦可藉由重組DNA方法(例如美國專利第4,816,567號中所闡述者)製得。可易於使用習用程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)分離編碼本發明所涵蓋之單株抗體之DNA且測序。本發明所涵蓋之雜交瘤細胞用作DNA之較佳來源。在分離後，可將DNA置於表現載體中，然後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以在重組宿主細胞中實現單株抗體之合成。亦可藉由(例如)使用人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列代替同源鼠類序列(例如參見美國專利第4,816,567號)或藉由共價接合免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列來對DNA進行修飾。此一非免疫球蛋白多肽可代替本發明所涵蓋抗體之恆定結構域，或可代替本發明所涵蓋抗體之可變結構域以產生嵌合二價抗體。
亦可藉由業內所熟知用於產生多株抗體之各種程序來產生本發明所涵蓋之抗體。多株抗體產生通常涉及(例如)藉由腹膜腔內及/或真皮內注射使用游離或與載劑偶合之免疫原(例如靶抗原)將免疫原性宿主動物(例如兔、大鼠、小鼠、綿羊或山羊)免疫化。注射材料通常係含有約100 μg免疫原或載體蛋白之乳液。可能需要(例如)以約兩週之間隔實施若干加強注射以提供有用抗體效價，抗體效價可(例如)藉由ELISA分析使用吸附至固體表面之游離肽來檢測。可藉由根據業內熟知方法選擇抗體(例如藉由使肽吸附於固體載體上)且洗脫所選抗體來增加來自實施免疫動物之血清中之抗體效價。
c.抗體選擇 期望抗體可選自基於針對靶抗原及/或其表位之親和力及/或特異性之兩種或更多種候選抗體之較大集合。在一些實施例中，可使用抗體結合分析來實施抗體選擇。該等分析可包含(但不限於)基於表面電漿共振(SPR)之分析、ELISA及基於流式細胞術之分析。分析可利用靶抗原結合期望抗體且然後使用一或多種檢測方法來檢測結合。
在一些實施例中，可使用高通量發現方法來選擇及產生本發明所涵蓋之抗體。在一實施例中，經由使用顯示庫來產生本發明所涵蓋之抗體。術語「顯示」係指在給定顯示宿主之表面上表現或「顯示」蛋白質或肽。術語「庫」係指獨特cDNA序列之集合體。庫可含有自少至兩個獨特cDNA至數千億個獨特cDNA。在一些實施例中，使用抗體顯示庫或抗體片段顯示庫來產生包括合成抗體之檢測劑。術語「抗體片段顯示庫」係指其中每一成員編碼含有抗體之至少一個可變區之抗體片段之顯示庫。該等抗體片段較佳係Fab片段，但亦涵蓋其他抗體片段(例如單鏈可變片段(scFv))。在Fab抗體片段庫中，所編碼每一Fab可相同，含於Fab片段之互補決定區(CDR)之可變環內之胺基酸序列除外。在一替代或其他實施例中，個別VH及/或VL區內之胺基酸序列亦可有所不同。
顯示庫可表現於諸多可能宿主(在本文中稱為「顯示宿主」)，該等宿主包含(但不限於)酵母、細菌噬菌體(亦在本文中稱為「噬菌體」或「噬菌體顆粒」)、細菌及逆轉錄病毒。可使用之其他顯示技術包含核糖體顯示、微珠顯示及蛋白質-DNA鍵聯技術。在表現時，Fab會修飾宿主(例如噬菌體或酵母)之表面，在此其可與給定靶抗原相互作用。可使用任何靶抗原來選擇表現對該靶具有最高親和力之抗體片段之顯示宿主。然後可經由測序使用結合顆粒或細胞來測定編碼結合抗體片段之可變結構域之DNA序列。在一些實施例中，使用正向選擇來研發抗體。術語「正向選擇」係指基於針對含有期望靶位點之靶抗原之親和力自顯示庫選擇抗體及/或其片段之過程。在一些實施例中，利用負向選擇來研發抗體。術語「負向選擇」係指在抗體研發期間使用非靶藥劑自給定顯示庫排除抗體及/或其片段之過程。在一些實施例中，在使用顯示庫研發抗體時於多輪選擇期間利用正向選擇過程及負向選擇過程。
在酵母顯示中，將編碼不同抗體片段之cDNA引入酵母細胞中，在此表現cDNA且使抗體片段「顯示」於細胞表面上，如由Chao等人(2006)Nat. Protoc. 1:755-768所闡述。在酵母表面顯示中，所表現抗體片段含有包括酵母凝集素蛋白Aga2p之其他結構域。此結構域容許抗體片段融合蛋白經由與表面表現之Aga1p形成二硫鍵而附接至酵母細胞之外表面。最終，酵母細胞塗覆於特定抗體片段中。最初利用編碼該等抗體片段之cDNA之顯示庫，其中抗體片段各自具有獨特序列。該等融合蛋白表現於數百萬個酵母細胞之細胞表面上，其中其可與期望靶(與細胞一起培育)相互作用。可使用化學或磁基團以共價方式或以其他方式修飾靶肽以容許在成功結合適宜抗體片段之後達成有效細胞分選。可藉由以下方式進行回收：磁活化細胞分選(MACS)、螢光活化細胞分選(FACS)或業內已知之其他細胞分選方法。在選擇酵母細胞之亞群體後，可分析相應質體以測定所顯示抗體片段之序列。
細菌噬菌體顯示方法通常利用絲狀噬菌體，包含fd、F1及M13病毒體。該等菌株係非裂解性，從而繼續傳播宿主且增加病毒效價。可用於製備本發明所涵蓋抗體之噬菌體顯示方法之實例包含揭示於以下文獻中者：Miersch等人(2012)Methods. 57:486-498；Bradbury等人(2011)Nat. Biotechnol. 29:245-254；Brinkman等人(1995)J. Immunol. Meth. 182:41-50；Ames等人(1995)J. Immunol. Meth . 184:177-186；Kettleborough等人(1994)Eur. J. Immunol . 24:952-958)；Persic等人(1997)Gene 187:9-18)；PCT公開案第PCT/GB91/01134號、第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/11236號、第WO 95/15982號及第WO 95/20401號；及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號。
可藉由將編碼片段之cDNA插入表現病毒外殼蛋白之基因中來實施細菌噬菌體上之抗體片段表現。絲狀細菌噬菌體之病毒外殼係由5種由單鏈基因體編碼之外殼蛋白構成。外殼蛋白pIII係用於抗體片段表現之較佳蛋白質，其通常位於N-末端處。若抗體片段表現危害pIII功能，則可經由共表現野生型pIII來恢復病毒功能，但該表現將減小表現於病毒外殼上之抗體片段之數量，但可增強靶至抗體片段之可及性。病毒以及抗體片段蛋白質之表現可替代地編碼於多個質體上。此方法可用於減小感染性質體之整體大小且增強轉變效率。噬菌體顯示庫可包括數百萬至數十億個噬菌體顆粒，每一噬菌體顆粒在其病毒外殼上表現獨特抗體片段。該等庫可提供可用於選擇可能數百個針對一或多種靶具有不同親和力程度之抗體片段之豐富資源(McCafferty等人(1990)Nature 348:552-554；Edwards等人(2003)JMB 334:103-118；Schofield等人(2007)Genome Biol. 8:R254及Pershad等人(2010)Prot. Engin. Design Select . 23:279-288)。通常，存在於該等庫中之抗體片段包括scFv抗體片段，該等抗體片段包括藉由撓性連接體(例如富Ser/Gly連接體)接合之VH及VL抗體結構域之融合蛋白。該等片段通常主要包括VH結構域，但VL-連接體-VH片段亦涵蓋於本文中。在一些情形下，除編碼互補決定區(CDR)之可變環之獨特序列外，scFv可含有相同序列。在一些情形下，scFv表現為連接至病毒外殼蛋白(例如病毒pIII外殼蛋白之N-末端)之融合蛋白。在複合納入病毒外殼中之前，VL鏈可單獨表現以與VH鏈組裝於周質中。
在一些實施例中，噬菌體富集包括溶液相噬菌體富集，其中靶抗原存在於與噬菌體溶液組合之溶液中。根據該等方法，靶抗原可包括可檢測標記(例如生物素標記)以促進自溶液之提取及結合噬菌體之回收。在其他實施例中，溶液相噬菌體富集可包括使用結合至珠粒(例如鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)珠粒)之靶。在一些情形下，該等珠粒可為磁珠粒以促進沈澱。在其他實施例中，噬菌體富集可包括固相富集，其中靶抗原固定於固體表面上。根據該等方法，可使用噬菌體溶液接觸固體表面以富集經固定靶。固體表面可包含任何能夠保留靶之表面且可包含(但不限於)盤、板、燒瓶、膜及管。在一些情形下，可使用免疫管，其中該等管之內表面經靶抗原塗覆(例如藉由使生物素化靶通過經鏈黴抗生物素蛋白或中和抗生物素蛋白(neutravidin)塗覆之管)。可藉由使噬菌體溶液通過管以富集經結合靶來使用免疫管進行噬菌體富集。
在選擇之後，可使用結合噬菌體感染使用輔助噬菌體共感染之大腸桿菌培養物以產生用於下一輪富集之擴增輸出庫。可重複此過程以產生愈來愈窄之純系組。在一些實施例中，限制富集輪數以改良所選噬菌體之多樣性。可自結合噬菌體對經沈澱庫成員測序以獲得編碼期望scFv之cDNA。可將該等序列直接納入抗體序列中以用於重組抗體產生，或實施突變且用於經由活體外親和力成熟進行進一步最佳化。可合成包括一或多個來自所選scFv之可變結構域之IgG抗體以用於進行測試及/或產物研發。可藉由將一或多個scFv cDNA區段插入適於IgG產生之表現載體中來產生該等抗體。
d.抗體改造 如上所述，可用於產生抗體及抗體片段(例如Fab及scFv)之技術為業內所熟知且包含闡述於以下文獻中者：美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Miersch等人(2012)Methods 57:486-498；Chao等人(2006)Nat. Protoc. 1:755-768)；Huston等人(1991)Methods Enzymol. 203:46-88；Shu等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7995-7999；及Skerra等人(1988)Science 240:1038-1041)。
中分離或選擇靶抗原特異性抗體之後，可使用抗體序列來重組產生及/或最佳化該等抗體。在自顯示庫分離抗體片段之情形下，可使用來自所分離片段之編碼區來生成全抗體(包含人類抗體)或任一其他期望靶結合片段，且表現於任一期望宿主(包含哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌)中，如下文詳細所述。若期望，則可自根據本文所闡述方法產生或選擇之可變結構域片段來合成IgG抗體(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)以用於進一步測試及/或產物研發。可藉由將一或多個編碼期望胺基酸序列之cDNA區段插入適於IgG產生之表現載體中來產生該等抗體。表現載體可包括適用於哺乳動物細胞中之IgG表現之哺乳動物表現載體。可實施哺乳動物IgG表現以確保所產生抗體包括哺乳動物蛋白之修飾(例如醣基化)特性，及/或確保抗體製劑並無可存在於來自細菌表現系統之蛋白質製劑中之內毒素及/或其他污染物。
在一些實施例中，實施親和力成熟。術語「親和力成熟」係指經由連續數輪突變及選擇編碼抗體或抗體片段之cDNA序列來產生對給定靶具有增加之親和力之抗體的方法。在一些情形下，在活體外實施此製程。為達成此製程，可使用易錯PCR擴增可變結構域序列(在一些情形下限於CDR編碼序列)以產生數百萬個含有突變(包含(但不限於)點突變、區域突變、插入突變及缺失突變)之拷貝。如本文中所使用，術語「點突變」係指其中核苷酸序列內之一個核苷酸變為不同核苷酸之核酸突變。如本文中所使用，術語「區域突變」係指其中兩個或更多個連續核苷酸變為不同核苷酸之核酸突變。如本文中所使用，術語「插入突變」係指其中將一或多個核苷酸插入核苷酸序列中之核酸突變。如本文中所使用，術語「缺失突變」係指其中自核苷酸序列去除一或多個核苷酸之核酸突變。插入或缺失突變可包含完全代替整個密碼子或藉由改變起始密碼子之一或兩個核苷酸來將一個密碼子變為另一密碼子。
可在編碼CDR之cDNA序列上實施誘變以產生數百萬個在重鏈及輕鏈CDR區中具有奇異突變之突變體。在另一方式中，僅在最可能改良親和力之CDR殘基處引入隨機突變。可使用該等新生誘變庫重複該過程以篩選編碼對靶肽具有極高親和力之抗體片段之純系。連續數輪突變及選擇可促進具有愈來愈大親和力之純系之合成(例如參見Chao等人(2006)Nat. Protoc. 1:755-768)。
可基於如藉由結合分析(例如FACS、ELISA、表面電漿共振等)所測定之親和力來選擇親和力成熟之純系。然後可將所選純系轉化成IgG且進一步測試親和力及功能活性。在一些情形下，親和力最佳化之目標係與原始抗體之親和力相比將親和力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1,000倍或更高倍數。在最佳化親和力小於期望之情形下，可重複該製程。
在一些實施例中，生成嵌合及/或人類化抗體係有用的。舉例而言，對於一些應用(包含抗體在人類中之活體內應用及活體外檢測分析)而言，可較佳使用嵌合、人類化或人類抗體。嵌合抗體係其中不同抗體部分衍生自不同動物物種之分子，例如具有衍生自鼠類單株免疫球蛋白之可變區及人類免疫球蛋白恆定區之抗體。業內熟知產生嵌合抗體之方法(例如參見Morrison (1985)Science 229:1202-1207；Gillies等人(1989)J. Immunol. Meth. 125:191-202；及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第4,816,397號)。
人類化抗體係來自非人類物種之抗體分子，其結合至期望靶且具有一或多個來自非人類物種之互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之框架區。通常，人類框架區中之框架殘基經來自供體抗體之CDR及框架區之相應殘基取代以改變、較佳地改良靶結合。該等框架取代係藉由業內熟知之方法來鑑別，例如藉由對CDR與框架殘基之相互作用建模以鑑別對靶結合至關重要之框架殘基，及藉由比較序列以鑑別特定位置之不尋常框架殘基(例如參見美國專利第5,693,762號及第5,585,089號；Riechmann等人(1988)Nature 332:323-327)。
可使用業內已知之各種技術使抗體人類化，該等技術包含(例如) CDR移植(例如參見歐洲專利公開案第239,400號；PCT公開案第WO 91/09967號；美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)；覆蓋或表面重修(例如參見歐洲專利公開案第592,106號；歐洲專利公開案第519,596號；Padlan (1991)Mol. Immunol. 28:489-498；Studnicka等人(1994) Protein Eng. 7:805-814；Roguska等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:969-973)；及鏈改組(例如參見美國專利第5,565,332號)。
完全人類抗體尤其期望用於治療性治療人類患者以避免或緩解對外來蛋白質之免疫反應。人類抗體可藉由業內已知之各種方法製得，包含使用衍生自人類免疫球蛋白序列之抗體庫之上述抗體顯示方法(例如參見美國專利第4,444,887號及第4,716,111號；及PCT公開案第WO 98/46645號、第WO 98/50433號、第WO 98/24893號、第WO 98/16654號、第WO 96/34096號、第WO 96/33735號及第WO 91/10741號)。亦可使用不能表現功能內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白多核苷酸之轉基因小鼠來產生人類抗體。舉例而言，可隨機或藉由同源重組將人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白多核苷酸複合物引入小鼠胚胎幹細胞中。或者，除人類重鏈及輕鏈多核苷酸外，亦可將人類可變區、恆定區及多樣化區引入小鼠胚胎幹細胞中。可單獨或與藉由同源重組引入人類免疫球蛋白基因座同時使小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白多核苷酸變為非功能性。特定而言，JH區之純合缺失可防止內源性抗體產生。擴增經修飾胚胎幹細胞且微注射至胚泡中以產生嵌合小鼠。然後將嵌合小鼠育種以產生表現人類抗體之純合後代。以常用方式使用所選免疫原(例如靶抗原)對轉基因小鼠實施免疫。使用此一技術，可產生有用人類IgG、IgA、IgM、IgD及IgE抗體。如上文所闡釋，產生人類抗體及人類單株抗體之方法及產生該等抗體之方案為業內所熟知(亦例如參見PCT公開案第WO 98/24893號、第WO 92/01047號、第WO 96/34096號及第WO 96/33735號；及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號、第5,885,793號、第5,916,771號、第5,939,598號、第6,075,181號及第6,114,598號)。
在已藉由動物、細胞系產生本發明所涵蓋之抗體分子、以化學方式合成或以重組方式表現後，可藉由業內已知之任一方法純化(亦即分離)以純化免疫球蛋白或多肽分子，該方法係(例如)藉由層析(例如離子交換層析、親和力層析、尤其用於特定靶之親和力層析、蛋白質A層析及粒度分級管柱層析)、離心、差別溶解性或藉由用於純化蛋白質之任一其他標準技術。另外，本發明所涵蓋之抗體或其片段可與本文所闡述或以其他方式為業內已知之異源多肽序列融合以促進純化。
根據本發明，特異性結合至抗原之抗體可存在於溶液中或結合至受質。在一些實施例中，抗體結合至纖維素奈米珠粒且限制於檢測裝置之基板之一或多個檢測區域中。
e.抗體表徵 可藉由一或多種選自由以下組成之群之特性來表徵本發明所涵蓋之抗體：結構、同型、結合(例如親和力及特異性)、偶聯、醣基化及其他區分特徵。
本發明所涵蓋之抗體可來自任一動物來源，包含鳥類及哺乳動物。較佳地，該等抗體係人類、鼠類(例如小鼠及大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬或雞來源之抗體。本發明所涵蓋之抗體可為單特異性或多特異性。多特異性抗體可對本發明所涵蓋肽之不同表位具有特異性，或可對本發明所涵蓋之肽及異源性表位(例如異源性肽或固體載體材料)具有特異性(例如參見PCT公開案第WO 93/17715號、第WO 92/08802號、第WO 91/00360號及第WO 92/05793號；Tutt等人(1991)J. Immunol . 147:60-69；美國專利第4,474,893號、第4,714,681號、第4,925,648號、第5,573,920號及第5,601,819號；及Kostelny等人(1992)J. Immunol. 148:1547-1553)。舉例而言，可針對含有本發明所涵蓋肽序列之重複單元之肽產生抗體，或其可針對含有兩個或更多個本發明所涵蓋之肽序列之肽產生，或其組合。作為一非限制性實例，已設計異源雙價配體(HBL)系統，其競爭性抑制抗原結合至肥大細胞結合之IgE抗體，由此抑制肥大細胞去顆粒(Handlogten等人(2011)Chem. Biol. 18:1179-1188)。
可相對於標準物在正常生理學條件下在活體外或在活體內來測定抗體特性。亦可相對於抗體之存在或不存在來進行量測。該等量測方法包含組織或流體(例如血清或血液)中之標準量測，例如西方印漬(Western blot)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、活性分析、報告基因分析、螢光素酶分析、聚合酶鏈反應(PCR)陣列、基因陣列、實時逆轉錄酶(RT) PCR及諸如此類。
抗體可結合靶蛋白上或沿靶蛋白之任一數量之位置或與其相互作用。所涵蓋抗體靶位點包含靶蛋白上之任何及所有可能之位點。可針對結合(可逆地或不可逆地)至特定靶上之一或多個表位之能力來選擇抗體。靶上表位可包含(但不限於)一或多個特徵、區域、結構域、化學基團、官能基或部分。該等表位可由以下各項構成：一或多個原子、原子基團、原子結構、分子結構、環狀結構、疏水性結構、親水性結構、糖、脂質、胺基酸、肽、醣肽、核酸分子或任一其他抗原結構。
f. 抗體偶聯物 在一些實施例中，可根據業內熟知方法使本發明所涵蓋之抗體與一或多種用於檢測目的之可檢測標記偶聯。標記可為放射性同位素、螢光化合物、化學發光化合物、酶或酶輔因子或業內已知之任何其他標記。在一些實施例中，結合至期望靶之抗體(亦在本文中稱為「一級抗體」)未經標記，但可來藉由結合特異性結合至一級抗體之第二抗體(在本文中稱為「二級抗體」)來進行檢測。根據該等方法，二級抗體可包含可檢測標記。
在一些實施例中，可附接至抗體之酶可包含(但不限於)辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶及葡萄糖氧化酶(GOx)。螢光化合物可包含(但不限於)溴乙錠(ethidium bromide)；螢光黃及其衍生物(例如FITC)；花青及其衍生物(例如吲哚羰花青、氧雜羰花青、硫雜羰花青及部花青)；玫瑰紅；俄勒岡綠(oregon green)；伊紅(eosin)；德克薩斯紅(texas red)；尼羅紅(nile red)；尼羅藍(nile blue)；甲酚紫；噁嗪170；原黃素(proflavin)；吖啶橙；吖啶黃；金胺；結晶紫；孔雀綠；卟吩；酞菁；膽紅素；別藻藍蛋白(APC)；綠色螢光蛋白(GFP)及其變體(例如黃色螢光蛋白YFP、藍色螢光蛋白BFP及青色螢光蛋白CFP)；ALEXIFLOUR®化合物(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)；及量子點。可用於標記抗體之其他偶聯物可包含生物素、抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白。
在一些實施例中，本發明涵蓋抗體-藥物偶聯物(ADC)藥劑。ADC係抗體與另一部分之偶聯物，從而該藥劑具有由抗體賦予之靶向能力及由該部分賦予之另一效應。舉例而言，可使細胞毒性藥物結合至單株抗體，該單株抗體使該藥物靶向有助於疾病進展(例如腫瘤進展)之所關注細胞且在內化後向細胞釋放其毒性酬載。不同效應係基於如上文所闡述之偶聯部分所達成。
4. 小分子藥劑 在另一態樣中，本發明涵蓋小分子藥劑。小分子可為本文所闡述之生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之抑制劑、活化劑或調節劑。術語「小分子」係指可幫助調控生物過程之約10-9 m大小之低分子量(亦即小於約900道爾頓)有機化合物。在一些實施例中，小分子可為酶(例如激酶及轉錄因子)之抑制劑。
該等分子亦可包含該等化合物之結晶及非晶形形式，包含(例如)該等化合物之多型、假多型、溶劑合物、水合物、未溶劑化多型(包含無水物)、構形多型及非晶形形式以及其混合物。除非預指特定結晶或非晶形形式，否則術語「結晶形式」及「多型」意欲包含化合物之所有結晶及非晶形形式，包含(例如)多型、假多型、溶劑合物、水合物、未溶劑化多型(包含無水物)、構形多型及非晶形形式以及其混合物。
結合至且調節靶基因及/或基因產物之已知小分子以及關於所影響生物活性及路徑之資訊可易於自可公開獲得之資料庫(例如Drugbank、PharmGKB、MedChemExpress及Selleckchem)獲得。
5. 基於細胞之藥劑 在另一態樣中，涵蓋基於細胞之藥劑。在一些實施例中，操縱單核球及/或巨噬細胞(例如與一或多種藥劑接觸)以調節本發明所涵蓋之一或多種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)。舉例而言，可使經培養細胞及/或原代細胞與藥劑接觸，處理，且引入分析、個體及諸如此類中。該等細胞之子代由本文所闡述之基於細胞之藥劑涵蓋。
在一些實施例中，以重組方式改造單核球及/或巨噬細胞以調節本發明所涵蓋之一或多種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)。舉例而言，如上所述，可使用基因體編輯來調節所關注生物標記物之拷貝數或基因序列，例如所關注生物標記物之組成型或誘導型敲除或突變。舉例而言，可使用CRISPR-Cas系統來精確編輯基因體核酸(例如用於產生非功能或無效突變)。在該等實施例中，可表現CRISPR嚮導RNA及/或Cas酶。舉例而言，可將僅含嚮導RNA之載體投與Cas9酶轉基因動物或細胞。可使用類似策略(例如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或歸巢大範圍核酸酶(HE)，例如MegaTAL、MegaTev、Tev-mTALEN、CPF1及諸如此類)。該等系統在業內已眾所周知(例如參見美國專利第8,697,359號；Sander及Joung (2014)Nat. Biotech. 32:347-355；Hale等人(2009)Cell 139:945-956；Karginov及Hannon (2010)Mol. Cell 37:7；美國專利公開案第2014/0087426號及第2012/0178169號；Boch等人(2011)Nat. Biotech. 29:135-136；Boch等人(2009)Science 326:1509-1512；Moscou及Bogdanove (2009)Science 326:1501；Weber等人(2011)PLoS One 6:e19722；Li等人(2011)Nucl. Acids Res. 39:6315-6325；Zhang等人(2011)Nat. Biotech. 29:149-153；Miller等人(2011)Nat. Biotech. 29:143-148；Lin等人(2014)Nucl. Acids Res. 42:e47)。該等基因策略可根據業內熟知方法使用組成型表現系統或可誘導表現系統。
基於細胞之藥劑與個體宿主具有免疫相容性關係且任一該關係涵蓋用於本發明中。舉例而言，細胞(例如接受性單核球及/或巨噬細胞、T細胞及諸如此類)可為同基因的。術語「同基因」可係指衍生自、源於或係相同物種之成員之狀態，該等成員在基因上相同，尤其係在抗原或免疫學反應方面。該等情形包含具有匹配MHC類型之同卵雙胞胎。因此，「同基因移植」係指將供體細胞轉移至在與供體在基因上相同或足夠免疫學相容以容許移植而無不期望不良免疫原性反應(例如不利於詮釋本文所闡述之免疫學篩選結果)之接受者。
若所轉移細胞係獲得自且移植至同一個體，則同基因移植可為「自體」的。「自體移植」係指收穫且再輸注或移植個體之自身細胞或器官。排他性或補充性使用自體細胞可消除或減小將細胞投與回宿主之許多不良效應，尤其係移植物抗宿主反應。
若所轉移細胞係獲得自且移植至相同物種之不同成員，但具有足夠匹配之主要組織相容性複合物(MHC)抗原以避免不良免疫原性反應，則同基因移植可為「匹配同種異體」的。可根據業內已知及使用之標準測試來測定MHC失配程度。舉例而言，在人類中存在至少6大類鑑別為在移植生物學中較為重要之MHC基因。HLA-A、HLA-B、HLA-C編碼HLA種類I蛋白質，而HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP編碼HLA種類II蛋白質。該等群組中之每一者內之基因高度多型，如在發現於人類群體中之諸多HLA等位基因或變體中所反映，且該等群組之個體間差異與針對移植細胞之免疫反應之強度有關。測定MHC匹配程度之標準方法可檢驗HLA-B及HLA-DR或HLA-A、HLA-B及HLA-DR群組內之等位基因。因此，可分別測試兩個或三個HLA群組內之至少4種及甚至5或6種MHC抗原。在血清學MHC測試中，使針對每一HLA抗原類型之抗體與來自一個個體(例如供體)之細胞進行反應以測定與抗體反應之某些MHC抗原的存在或不存在。將此結果與另一個體(例如接受者)之反應性特徵進行比較。通常藉由以下方式來測定抗體與MHC抗原之反應：使抗體與細胞一起培育，且然後添加補體以誘導細胞裂解(亦即淋巴細胞毒性測試)。檢驗反應且根據反應中所裂解之細胞量來分級(例如參見Mickelson及Petersdorf (1999)Hematopoietic Cell Transplantation , Thomas, E. D.等人編輯，pg 28-37, Blackwell Scientific, Malden, Mass.)。其他基於細胞之分析包含使用經標記抗體之流式細胞術或酶連接免疫分析(ELISA)。測定MHC類型之分子方法已眾所周知且通常採用合成探針及/或引子來檢測編碼HLA蛋白之特異性基因序列。可使用合成寡核苷酸作為雜交探針來檢測與特定HLA類型有關之限制片段長度多型性(Vaughn (2002)Method. Mol. Biol. MHC Protocol. 210:45-60)。或者，可使用引子來擴增HLA序列(例如藉由聚合酶鏈反應或連接鏈反應)，其產物可進一步藉由直接DNA測序、限制片段多型性分析(RFLP)或與一系列序列特異性寡核苷酸引子(SSOP)雜交進行檢驗(Petersdorf等人(1998)Blood 92:3515-3520；Morishima等人(2002)Blood 99:4200-4206；以及Middleton及Williams (2002)Method. Mol. Biol. MHC Protocol. 210:67-112)。
若所轉移細胞及個體細胞通常因近親交配而在界定基因座(例如單一基因座)中有所不同，則同基因移植可為「同基因型」。術語「同基因型」係指衍生自、源於或係相同物種之成員，其中該等成員除小基因區域(通常係單一遺傳基因座，亦即單一基因)外在基因上相同。「同基因型移植」係指將細胞或器官自供體轉移至接受者且其中接受者與供體除單一遺傳基因座外在基因上相同。舉例而言，CD45係以若干等位基因形式存在，且存在同基因型小鼠系，其中該等小鼠系關於表現CD45.1抑或CD45.2等位基因形式有所不同。
與之相比，「失配同種異體」係指衍生自、源於或係相同物種中具有足以誘發不良免疫原性反應之不同主要組織相容性複合物(MHC)抗原(亦即蛋白質)之成員，如通常藉由業內所用之標準分析(例如界定數量之MHC抗原之血清學或分子分析)所測定。「部分失配」係指在成員之間、通常在供體與接受者之間測得之MHC抗原之部分匹配。舉例而言，「半失配」係指50%之MHC抗原測試為在兩個成員之間展示不同MHC抗原類型。「全」或「完全」失配係指所有MHC抗原皆測試為在兩個成員之間不同。
類似地，與之相比，「異基因」係指衍生自、源於或係不同物種(例如人類及齧齒類動物、人類及豬、人類及黑猩猩等)之成員。「異基因移植」係指將細胞或器官自供體轉移至接受者且其中接受者係不同於供體之物種。
另外，可自單一來源或複數個來源(例如單一個體或複數個個體)獲得細胞。複數個係指至少兩個(例如一個以上)。在再一實施例中，非人類哺乳動物係小鼠。獲得所關注細胞類型之動物可為成人、新生(例如小於48小時)、不成熟或子宮內動物。所關注細胞類型可為原代癌細胞、癌症幹細胞、確立癌細胞系、永生化原代癌細胞及諸如此類。在某些實施例中，宿主個體之免疫系統可經改造或另外選擇以與所移植癌細胞免疫學相容。舉例而言，在一實施例中，可使個體「人類化」以與人類癌細胞相容。術語「免疫系統人類化」係指包括人類HSC譜系細胞及人類獲得性及先天性免疫細胞之動物(例如小鼠)，該等細胞可存活而不自宿主動物排斥，由此容許人類造血作用及獲得性及先天性免疫性重構於宿主動物中。獲得性免疫細胞包含T細胞及B細胞。先天性免疫細胞包含巨噬細胞、顆粒球(嗜鹼性球、嗜酸性球、嗜中性球)、DC、NK細胞及肥大細胞。代表性、非限制性實例包含SCID-hu、Hu-PBL-SCID、Hu-SRC-SCID、NSG (NOD-SCID IL2r-γ(無效)缺乏先天性免疫系統、B細胞、T細胞及細胞介素信號傳導)、NOG (NOD-SCID IL2r-γ(截短))、BRG (BALB/c-Rag2(無效)IL2r-γ(無效))及H2dRG (Stock-H2d-Rag2(無效)IL2r-γ(無效))小鼠(例如參見Shultz等人(2007)Nat. Rev. Immunol. 7:118；Pearson等人(2008)Curr. Protocol. Immunol. 15:21；Brehm等人(2010)Clin. Immunol. 135:84-98；McCune等人(1988)Science 241:1632-1639；美國專利7,960,175及美國專利公開案第2006/0161996)號以及免疫相關基因之相關無效突變體(如Rag1 (缺乏B及T細胞)、Rag2 (缺乏B及T細胞)、TCRα (缺乏T細胞)、穿孔素(cD8+ T細胞缺乏細胞毒性功能)、FoxP3 (缺乏功能CD4+ T調控細胞)、IL2rg或Prfl)以及PD-1、PD-L1、Tim3及/或2B4之突變體或敲除物，其容許有效植入人類免疫細胞及/或提供免疫受損動物(如小鼠)之腔室特異性模型(例如參見PCT公開案第WO 2013/062134號)。另外，NSG-CD34+ (NOD-SCID IL2r-γ(無效) CD34+)人類化小鼠可用於研究動物模型(如小鼠)中之人類基因及腫瘤活性。
如本文中所使用，自生物材料來源「獲得」意指自供體收穫或分配生物材料來源之任一習用方法。舉例而言，生物材料可自實體腫瘤、血樣(例如末梢血或臍帶血試樣)獲得，或自另一體液(例如骨髓液或羊水)收穫。獲得該等試樣之方法為熟習此項技術者所熟知。在本發明中，試樣可為新鮮試樣(亦即自供體獲得且未冷凍)。此外，可在擴增之前進一步操縱試樣以去除外源性或不期望組分。亦可自保藏儲備液獲得試樣。舉例而言，在細胞系或流體(例如末梢血或臍帶血)之情形下，可自該細胞系或流體之低溫或其他保藏庫汲取試樣。可自任一適宜供體獲得該等試樣。
所獲得群體細胞可直接使用或經冷凍以待以後使用。業內已知用於冷凍保藏之各種介質及方案。通常，冷凍介質包括約5-10% DMSO、10-90%血清白蛋白及50-90%培養基。可用於保藏細胞之其他添加劑包含(舉例而言且並不限於)二醣(例如海藻糖) (Scheinkonig等人(2004)Bone Marrow Transplant. 34:531-536)或血漿增容劑(例如羥乙基澱粉(hetastarch)) (亦即羥乙基澱粉)。在一些實施例中，可使用等滲緩衝溶液，例如磷酸鹽緩衝鹽水。實例性冷凍保藏組合物具有含有4% HSA、7.5%二甲基亞碸(DMSO)及2%羥乙基澱粉之細胞培養基。用於冷凍保藏之其他組合物及方法已眾所周知且闡述於業內(例如參見Broxmeyer等人(2003)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:645-650)。在小於約-135℃之最終溫度下保藏細胞。
在一些實施例中，免疫療法可CAR (嵌合抗原受體)-T療法，其中T細胞經改造以表現包括對所關注腫瘤細胞上之抗原具有特異性之抗原結合結構域之CAR。術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指具有期望抗原特異性及信號傳導結構域以在抗原結合時傳播細胞內信號之受體。舉例而言，T淋巴球經由T細胞受體(TCR)與由主要組織相容性複合物(MHC)種類I或II分子呈現之短肽之相互作用來識別特異性抗原。對於初始活化及純系擴增而言，幼稚T細胞依賴於提供其他共刺激信號之專職性抗原呈遞細胞(APC)。在不存在共刺激下之TCR活化可產生不反應性及純系無反應性。為繞過免疫化，已研發用於衍生具有移植識別特異性之細胞毒性效應細胞之不同方式。已構築由衍生自對TCR相關CD3複合物之細胞表面組分具有特異性之天然配體或抗體之結合結構域組成的CAR。在抗原結合時，該等嵌合抗原受體連接至效應細胞中之內源性信號傳導路徑且生成類似於由TCR複合物所引發信號之活化信號。自關於嵌合抗原受體之首次報告開始，此概念已逐步完善並已最佳化嵌合受體之分子設計，且通常使用任一數量之熟知結合結構域(例如scFV、Fav及本文所闡述之另一蛋白質結合片段)。
在一些實施例中，可改造單核球及巨噬細胞以(例如)表現嵌合抗原受體(CAR)。經修飾細胞可募集至腫瘤微環境，在此其藉由浸潤腫瘤且殺死靶癌細胞而用作強力免疫效應物。CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。抗原結合結構域結合至靶細胞上之抗原。可用作結合至CAR之抗原結合結構域之抗原之細胞表面標記物的實例包含與病毒、細菌、寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞有關者(例如腫瘤抗原)。
在一實施例中，抗原結合結構域結合至腫瘤抗原(例如對所關注腫瘤或癌症具有特異性之抗原)。腫瘤相關抗原之非限制性實例包含BCMA、CD19、CD24、CD33、CD38；CD44v6、CD123、CD22、CD30、CD117、CD171、CEA、CS-1、CLL-1、EGFR、ERBB2、EGFRvIII、FLT3、GD2、NY-BR-1、NY- ESO-1、p53、PRSS21、PSMA、ROR1、TAG72、Tn Ag、VEGFR2。
在一實施例中，跨膜結構域與CAR中之一或多個結構域天然締合。跨膜結構域可衍生自天然或合成來源。特定用於本發明中之跨膜區可衍生自(亦即包括至少其跨膜區) T細胞受體、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、類鐸受體1 (TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9之α、β或ζ鏈。在一些情況下，亦可採用各種人類鉸鏈，包含人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈。
在一實施例中，CAR之細胞內結構域包含負責信號活化及/或轉導之結構域。細胞內結構域之實例包含來自一或多種包含(但不限於)以下之分子或受體之片段或結構域：TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、公用FcRγ、FcRβ (Fcε Rib)、CD79a、CD79b、Fcγ RIIa、DAP10、DAP 12、T細胞受體(TCR)、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配體、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD l id、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAMl、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGLl、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、類鐸受體1 (TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所闡述之其他共刺激分子、其任一衍生物、變體、或片段、具有相同功能能力之共刺激分子之任一合成序列及其任一組合。
在一些實施例中，可使用本發明所涵蓋之藥劑、組合物及方法來再改造單核球及巨噬細胞以增加其將抗原呈遞至其他免疫效應細胞(例如T細胞)之能力。作為抗原呈遞細胞(APC)之經改造單核球及巨噬細胞將處理腫瘤抗原且將抗原性表位呈遞至T細胞以刺激攻擊腫瘤細胞之適應性免疫反應。
V. 用途及方法 本文所闡述之組合物及藥劑可用於關於本文所闡述之生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之各種調節、治療、篩選、診斷、預後及治療應用中。在本文所闡述之任一方法(例如調節方法、治療方法、篩選方法、診斷方法、預後方法或其組合)中，該方法之所有步驟可由單一行動者或替代地由一個以上行動者來實施。舉例而言，可由提供治療性治療之行動者直接實施診斷。或者，提供治療劑者可要求實施診斷分析。診斷醫師或治療干預者可詮釋診斷分析結果以確定治療策略。類似地，該等替代過程可應用於其他分析(例如預後分析)。
另外，本發明本文所闡述之任一態樣可單獨實施，或與本發明之任一其他態樣(包含其一個、一個以上或所有實施例)組合實施。舉例而言，可單獨或與治療步驟組合實施診斷及/或篩選方法，從而(例如)在測得適當診斷及/或篩選結果後提供適當療法。
1. 調節及治療方法 本發明所涵蓋之一態樣係關於調節本文所闡述至少一種生物標記物(例如表1、表2、實例等中所列示之一或多種靶)之拷貝數、量(例如表現)及/或活性(例如調節亞細胞局部化)以(例如)用於治療目的之方法。該等藥劑可用於操縱單核球及/或巨噬細胞之特定亞群體且調控生理學條件中之其數量及/或活性，且用於治療巨噬細胞相關疾病及其他臨床病狀。舉例而言，本發明所涵蓋之藥劑(包含組合物及醫藥調配物)可調節生物標記物(例如表1、表2、實例等中所列示之至少一種靶)之拷貝數、量及/或活性以由此調節單核球及/或巨噬細胞之發炎表型且進一步調節免疫反應。在一些實施例中，調節細胞活性(例如細胞介素分泌、細胞群體比率等)，而非調節免疫反應本身。提供使用本文所揭示之藥劑、組合物及調配物來調節單核球及巨噬細胞發炎表型之方法。因此，可使用該等藥劑、組合物及方法藉由以下方式來調節免疫反應：調節生物標記物(例如表1、表2、實例等中所列示之至少一種靶)之拷貝數、量及/或活性，消耗或富集某些類型之細胞，及/或調節細胞類型之比率。舉例而言，表1及/或表2中所列示之某些靶係細胞存活所需，從而抑制該等靶可引起細胞死亡。該調節可用於調節免疫反應，此乃因介導免疫反應之細胞類型之比率(例如促發炎細胞對抗發炎細胞)有所調節。在一些實施例中，使用該等藥劑來治療患有癌症之個體之癌症。
本發明證實，下調巨噬細胞中之該等基因之表現可再極化(例如改變表型)巨噬細胞。在一些實施例中，改變M2巨噬細胞之表型以產生具有1型(M2樣)或M1表型之巨噬細胞，或關於M1巨噬細胞及2型(M2樣)或M2表型反之亦然。在一些實施例中，使用本發明所涵蓋之藥劑來調節(例如抑制)具有M2表型之單核球及巨噬細胞之輸送、極化及/或活化，或關於1型及M1巨噬細胞反之亦然。本發明另外提供減少所關注單核球及/或巨噬細胞(例如M1巨噬細胞、M2巨噬細胞(例如腫瘤中之TAM)及諸如此類)之群體之方法。
在一些實施例中，本發明提供改變單核球及/或巨噬細胞(包含其亞型，例如促腫瘤巨噬細胞及抗腫瘤巨噬細胞)之分佈之方法。在一實例中，本發明提供將巨噬細胞自抗發炎免疫反應驅向促發炎免疫反應且反之亦然之方法。細胞類型可消耗及/或富集5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高或其間之任一範圍(包含端值，例如45-55%)。
在一些實施例中，調節發生於細胞(例如單核球、巨噬細胞或其他吞噬細胞(如樹突狀細胞))中。在一些實施例中，細胞係巨噬細胞亞型，例如本文所闡述之巨噬細胞亞型。舉例而言，巨噬細胞可為組織駐留型巨噬細胞(TAM)或衍生自血流中之循環單核球之巨噬細胞。
在一些實施例中，調節單核球及/或巨噬細胞發炎表型可產生期望經調節免疫反應，例如異常單核球遷移及增殖之調節、組織駐留型巨噬細胞之未調控增殖、未調控促發炎巨噬細胞、未調控抗發炎巨噬細胞、組織中之促發炎及抗發炎巨噬細胞亞群體之不平衡分佈、疾病病狀中異常採用之單核球及巨噬細胞之活化狀態、經調節細胞毒性T細胞活化及功能、克服癌細胞對療法之抗性及癌細胞對免疫療法(例如免疫檢查點療法)之敏感性。在一些實施例中，逆轉該等表型。
治療及/或預防與單核球及巨噬細胞有關之疾病之方法包括使細胞與本發明所涵蓋之藥劑及組合物活體外、離體或活體內(例如投與個體)接觸，其中該等藥劑及組合物操縱單核球及巨噬細胞之遷移、募集、分化及極化、活化、功能及/或存活。在一些實施例中，調節本發明所涵蓋之一或多種生物標記物可用於調節(例如抑制或消耗)組織微環境(例如腫瘤組織)中之單核球及巨噬細胞之增殖、募集、極化及/或活化。
在本發明所涵蓋之一態樣中，提供減小單核球及/或巨噬細胞之抗發炎活性之方法。
在本發明所涵蓋之另一態樣中，提供增加單核球及/或巨噬細胞之促發炎活性之方法。
在本發明所涵蓋之另一態樣中，提供平衡組織中之促發炎單核球及巨噬細胞及抗發炎單核球及巨噬細胞之方法。
本發明所涵蓋之調節方法涉及使細胞與一或多種本發明所涵蓋之生物標記物(包含本發明所涵蓋之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)，包含表1、表2及實例中所列示之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶))或其片段之調節劑或調節與細胞有關之生物標記物活性中之一或多種活性的藥劑接觸。調節生物標記物活性之藥劑可為如本文所闡述之藥劑，例如核酸或多肽、生物標記物之天然結合配偶體、針對生物標記物之抗體、針對生物標記物之抗體及針對其他免疫相關靶之抗體之組合、至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)激動劑或拮抗劑、至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)激動劑或拮抗劑之肽模擬物、至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)肽模擬物、其他小分子或針對至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)核酸基因表現產物之小RNA或其模擬物。
調節本發明所涵蓋之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶) (包含本發明所涵蓋之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)，包含表1、表2及實例中所列示之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶))或其片段之表現之藥劑係(例如)反義核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、miRNA前體、初級miRNA、miRNA*、抗miRNA或miRNA結合位點或其變體或其他小RNA分子、三元寡核苷酸、核酶或用於表現至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)多肽之重組載體。舉例而言，可合成與至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)多肽轉譯起始位點之周圍區域互補之寡核苷酸。可通常以200 μg/ml將一或多個反義寡核苷酸添加至細胞培養基中或投與患者以防止至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)多肽之合成。反義寡核苷酸由細胞吸收且雜交至至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶) mRNA以防止轉譯。或者，可使用結合雙鏈DNA以形成三元構築體來防止DNA解開及轉錄之寡核苷酸。出於任一情形，生物標記物多肽之合成得以阻斷。在調節生物標記物表現時，該調節可藉由除敲除生物標記物基因外之方式進行。
鑒於調節表現之藥劑實際上控制細胞中之生物標記物之量，故其亦調節細胞中之生物標記物活性之總量。
在一實施例中，該等藥劑刺激本發明所涵蓋之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶) (包含表1及實例中所列示之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶))或其片段之一或多種活性。該等刺激劑之實例包含活性生物標記物多肽或其片段及引入細胞中之編碼生物標記物或其片段之核酸分子(例如cDNA、mRNA、shRNA、siRNA、小RNA、成熟miRNA、miRNA前體、初級miRNA、miRNA*、抗miRNA或miRNA結合位點或其變體或熟習此項技術者已知之其他功能等效分子)。在另一實施例中，該藥劑抑制一或多種生物標記物活性。在一實施例中，該藥劑抑制或增強生物標記物與其天然結合配偶體之相互作用。該等抑制劑之實例包含反義核酸分子、抗生物標記物抗體、生物標記物抑制劑及本文所闡述篩選分析中所鑑別之化合物。
在一些實施例中，一或多種生物標記物係本文所闡述之一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種等(最多且包含所有)生物標記物及其間之任一範圍(例如表1及/或表2中所列示之2-4種靶)。
該等調節方法可在活體外實施(例如藉由使細胞與藥劑接觸)，或替代地藉由使藥劑與細胞在活體內接觸來實施(例如藉由向個體投與藥劑)。在一些實施例中，可在接種疫苗期間使用本發明所涵蓋之藥劑、組合物及方法來調節單核球及/或巨噬細胞。疫苗保護通常需要誘導促發炎細胞介素。一種潛在治療干預可為在接種疫苗期間操縱單核球及/或巨噬細胞群體以(例如)最小化調控性巨噬細胞之誘導。
a.個體 本發明提供治療患有病狀或病症之個體之方法，該病狀或病症將受益於上調或下調表1及/或表2及實例中列示之本發明所涵蓋之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)或其片段，例如特徵在於生物標記物或其片段之不期望、不充分或異常表現或活性之病症。在一實施例中，該方法涉及投與調節(例如上調或下調)生物標記物表現或活性之藥劑(例如藉由本文所闡述之篩選分析鑑別之藥劑)或藥劑組合。在另一實施例中，該方法涉及以療法形式投與至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)多肽或核酸分子以補償減小、異常或不期望之生物標記物表現或活性。可根據本文所闡述之方法及其他方法(例如亦闡述於本文中者)來治療需要療法之個體，可與該等治療方法(例如用以診斷、預後、監測及諸如此類之方法)進行組合(例如調節經證實以表現所關注生物標記物之單核球及/或巨噬細胞之群體，及包括該等單核球及/或巨噬細胞之個體)。
在生物標記物異常下調及/或增加之生物標記物活性很可能具有有益效應之情形下，期望刺激生物標記物活性。同樣，在生物標記物異常上調及/或降低之生物標記物活性很可能具有有益效應之情形下，期望抑制生物標記物活性。
在一些實施例中，個體係動物。動物可為任一性別且可處於任一發育階段。在一些實施例中，動物係脊椎動物，例如哺乳動物。在一些實施例中，個體係非人類哺乳動物。在一些實施例中，個體係家養動物，例如狗、貓、牛、豬、馬、綿羊或山羊。在一些實施例中，個體係伴侶動物，例如狗或貓。在一些實施例中，個體係家畜動物，例如牛、豬、馬、綿羊或山羊。在一些實施例中，個體係動物園動物。在一些實施例中，個體係研究動物，例如齧齒類動物(例如小鼠或大鼠)、狗、豬或非人類靈長類動物。在一些實施例中，動物係經基因改造之動物。在一些實施例中，動物係轉基因動物(例如轉基因小鼠及轉基因豬)。在一些實施例中，個體係魚或爬行動物。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體係癌症動物模型。舉例而言，動物模型可為人類源癌症之正位異種移植物動物模型。
在本發明所涵蓋方法之一些實施例中，個體尚未經受治療(例如化學療法、輻射療法、靶向療法及/或免疫療法)。在一些實施例中，個體已經受治療(例如化學療法、輻射療法、靶向療法及/或免疫療法)。
在一些實施例中，個體已進行手術以去除癌性或癌症前期組織。在一些實施例中，癌性組織尚未去除，舉例而言，癌性組織可位於不宜手術身體區域(例如生命必需組織)或手術程序將向患者引起重大危害風險之區域中。
在一些實施例中，個體或其細胞抵抗相關療法，例如抵抗免疫檢查點抑制劑療法。舉例而言，調節本發明所涵蓋之一或多種生物標記物可克服免疫檢查點抑制劑療法抗性。
在一些實施例中，個體需要本文所闡述之組合物及方法之調節，例如已鑑別為具有本文所闡述之一或多種生物標記物之不期望不存在、存在或異常表現及/或活性者。
在一些實施例中，個體具有經巨噬細胞浸潤之實體腫瘤，該等巨噬細胞佔腫瘤或腫瘤微環境中之細胞之質量、體積及/或數量之至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%或更多或其間之任一範圍(包含端值) (例如至少約5%至至少約20%)。該等細胞可為任何闡述為可用於本文中之其他實施例者，例如表現CD11b或CD14或CD11及CD14二者及諸如此類之1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、TAM、單核球及/或巨噬細胞。
可使用本發明所涵蓋之方法來測定個體之許多不同癌症(例如本文所闡述者)之癌症療法(例如表1及/或表2中所列示生物標記物之至少一種調節劑)之反應性。
另外，該等調節劑亦可以組合療法投與以進一步調節期望活性。舉例而言，可使用靶向IL-4、IL-4Rα、IL-13及CD40之藥劑及組合物來調節單核球及/或巨噬細胞分化及/或極化。可使用靶向CD11b、CSF-1R、CCL2、奈羅利姆(neurophilim)-1及ANG-2之藥劑及組合物來調節巨噬細胞至組織之募集。可使用靶向IL-6、IL-6R及TNF-α之藥劑及組合物來調節巨噬細胞功能。其他藥劑包含(但不限於)化學治療劑、激素、抗血管生成劑、經放射性標記之化合物或使用手術、冷凍療法及/或放射療法。前述治療方法可與其他形式之習用療法(例如熟習此項技術者熟知之癌症標準護理治療)聯合投與，其係與習用療法連續、在之前或在之前投與。舉例而言，該等調節劑可與治療有效劑量之化學治療劑一起投與。在另一實施例中，聯合投與該等調節劑與化學療法以增強化學治療劑之活性及效能。醫師案頭參考(Physicians’ Desk Reference，PDR)揭示已用於治療各種癌症之化學治療劑之劑量。該等上文所提及之治療有效性化學治療藥物之投藥方案及劑量將取決於所治療特定黑色素瘤、疾病程度及其他為業內熟練醫師所熟知且可由醫師測定之因素。
b.癌症療法 在一些實施例中，使用本發明所涵蓋之藥劑來治療癌症。舉例而言，本發明提供減小單核球及/或巨噬細胞之促腫瘤功能(亦即致瘤性)及/或增加單核球及/或巨噬細胞之抗腫瘤功能之方法。在一些特定實施例中，本發明所涵蓋之方法可減小巨噬細胞之至少一種促腫瘤功能，包含1)腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)之募集及極化、2)腫瘤血管生成、3)腫瘤生長、4)腫瘤細胞分化、5)腫瘤細胞存活、6)腫瘤侵襲及轉移、7)免疫抑制及8)免疫抑制性腫瘤微環境。
可使用癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶之至少一種調節劑)或療法組合(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶之至少一種調節劑與至少一種免疫療法之組合)來接觸癌細胞及/或投與期望個體(例如指示為癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶之至少一種調節劑)之可能反應者之個體)。在另一實施例中，在個體指示為並非癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶之至少一種調節劑)之可能反應者後，可避免使用該癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶之至少一種調節劑)且可投與替代治療方案(例如靶向及/或非靶向癌症療法)。亦涵蓋組合療法且可包括(例如)一或多種化學治療劑及輻射、一或多種化學治療劑及免疫療法或一或多種化學治療劑、輻射及化學療法，每一組合可使用或不使用癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶之至少一種調節劑)。
可用於調節本發明所涵蓋之生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之代表性實例性藥劑闡述於上文中。如下文進一步所闡述，抗癌劑涵蓋生物治療性抗癌劑(例如干擾素、細胞介素(例如腫瘤壞死因子、干擾素α、干擾素γ等)、疫苗、造血生長因子、單株血清療法、免疫刺激劑及/或免疫調節劑(例如IL-1、2、4、6及/或12)、免疫細胞生長因子(例如GM-CSF)及抗體(例如曲妥珠單抗(trastuzumab)、T-DM1、貝伐珠單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托西莫單抗(tositumomab)及諸如此類)以及化學治療劑。
術語「靶向療法」係指投與選擇性與所選生物分子相互作用以由此治療癌症之藥劑。舉例而言，關於免疫檢查點抑制劑之抑制之靶向療法可與發明所涵蓋之方法組合使用。
術語「免疫療法(immunotherapy或immunotherapies)」通常係指以有益方式調節免疫反應之任一策略，且涵蓋藉由包括誘導、增強、抑制或以其他方式改良免疫反應之方法來治療患有疾病或處於染上或經受疾病復發之風險下之個體以及使用某些部分之個體免疫系統來抵抗疾病(例如癌症)的任一治療。在投與或不投與一或多種用於該目的之藥劑下，刺激(或抑制)個體自身免疫系統。經設計以誘發或擴增免疫反應之免疫療法稱為「活化免疫療法」。經設計以減小或抑制免疫反應之免疫療法稱為「抑制免疫療法」。在一些實施例中，免疫療法對所關注細胞(例如癌細胞)具有特異性。在一些實施例中，免疫療法可為「非靶向」，其係指投與不選擇性與免疫系統細胞相互作用但調節免疫系統功能之藥劑。非靶向療法之代表性實例包含(但不限於)化學療法、基因療法及輻射療法。
一些形式之免疫療法係可包括(例如)使用癌症疫苗及/或敏化抗原呈遞細胞之靶向療法。舉例而言，溶瘤病毒係能夠感染且裂解癌細胞之病毒，但其使正常細胞不受損害，從而使得其可用於癌症療法中。溶瘤病毒之複製促進了腫瘤細胞破壞且亦在腫瘤位點處產生劑量擴增。其亦可用作抗癌基因之載體，容許該等抗癌基因特異性遞送至腫瘤位點。免疫療法可涉及用於宿主短期保護之被動免疫性，該被動免疫性係藉由投與針對癌症抗原或疾病抗原之預形成抗體(例如投與針對腫瘤抗原之視情況連接至化學治療劑或毒素之單株抗體)所達成。舉例而言，抗VEGF及mTOR抑制劑已知可有效治療腎細胞癌。免疫療法亦可著眼於使用癌細胞系之細胞毒性淋巴球識別表位。或者，可使用反義多核苷酸、核酶、RNA干擾分子、三重螺旋多核苷酸及諸如此類來選擇性調節與腫瘤或癌症之開始、進展及/或病理學有關之生物分子。類似地，免疫療法可採用基於細胞之療法之形式。舉例而言，接受性細胞免疫療法係一類使用對患者癌症具有天然或基因改造之反應性之免疫細胞(例如T細胞)之免疫療法，其中生成該等免疫細胞且然後轉移回癌症患者中。注射大量經活化腫瘤特異性T細胞可誘導癌症之完全及持久性消退。
免疫療法可涉及用於宿主短期保護之被動免疫性，該被動免疫性係藉由投與針對癌症抗原或疾病抗原之預形成抗體(例如投與針對腫瘤抗原之視情況連接至化學治療劑或毒素之單株抗體)所達成。免疫療法亦可著眼於使用癌細胞系之細胞毒性淋巴球識別表位。或者，可使用反義多核苷酸、核酶、RNA干擾分子、三重螺旋多核苷酸及諸如此類來選擇性調節與腫瘤或癌症之開始、進展及/或病理學有關之生物分子。
在一些實施例中，免疫治療劑係免疫刺激分子之激動劑；免疫抑制分子之拮抗劑；趨化介素之拮抗劑；刺激T細胞活化之細胞介素之激動劑；拮抗或抑制抑制T細胞活化之細胞介素之藥劑；及/或結合至B7家族之膜結合蛋白之藥劑。在一些實施例中，免疫治療劑係免疫抑制分子之拮抗劑。在一些實施例中，免疫治療劑可為針對細胞介素、趨化介素及生長因子之藥劑，例如中和腫瘤相關細胞介素、趨化介素、生長因子及其他可溶性因子(包含IL-10、TGF-β及VEGF)之抑制效應之中和抗體。
在一些實施例中，免疫療法包括一或多種免疫檢查點之抑制劑。術語「免疫檢查點」係指CD4+及/或CD8+ T細胞之細胞表面上藉由調節抗癌免疫反應(例如下調或抑制抗腫瘤免疫反應)來微調免疫反應之分子之群組。免疫檢查點蛋白為業內所熟知且包含(但不限於) CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD200R、CD160、gp49B、PIR-B、KRLG-1、KIR家族受體、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3 (CD223)、IDO、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα (CD47)、CD48、2B4 (CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白(butyrophilin)及A2aR (例如參見WO 2012/177624)。
一些免疫檢查點係「免疫抑制性免疫檢查點」，其涵蓋抑制、下調或抑制免疫系統之功能(例如免疫反應)之分子(例如蛋白質)。舉例而言，PD-L1 (程式化死亡配體1)亦稱為CD274或B7-H1，其係傳輸減小T細胞增殖以抑制免疫系統之抑制信號之蛋白質。CTLA-4 (細胞毒性T-淋巴球相關蛋白4)亦稱為CD152，其係抗原呈遞細胞表面上用作下調免疫反應之免疫檢查點(「關斷」開關)之蛋白質受體。TIM-3 (含有T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域之蛋白質3)亦稱為HAVCR2，其係用作調控巨噬細胞活化之免疫檢查點之細胞表面蛋白。VISTA (T細胞活化之V-結構域Ig抑制因子)係一類用作抑制T細胞效應功能且維持周邊耐受性之免疫檢查點之I跨膜蛋白。LAG-3 (淋巴球活化基因3)係負性調控性T細胞之增殖、活化及穩態之免疫檢查點受體。BTLA (B-及T-淋巴球衰減蛋白)係經由與腫瘤壞死家族受體(TNF-R)之相互作用來顯示T細胞抑制之蛋白質。KIR (殺手細胞免疫球蛋白樣受體)係表現於NK細胞及少數T細胞上之抑制NK細胞之細胞毒性活性之蛋白質的家族。在一些實施例中，免疫治療劑可為對免疫抑制酶具有特異性之藥劑，例如可阻斷精胺酸酶(ARG)及吲哚胺2,3-二氧合酶(IDO) (一種抑制T細胞及NK細胞之免疫檢查點蛋白)之活性之抑制劑，該等抑制劑改變胺基酸精胺酸及色胺酸在免疫抑制性腫瘤微環境中之分解代謝。該等抑制劑可包含(但不限於)N -羥基-L-Arg (NOHA)，其靶向表現ARG之M2巨噬細胞；硝基阿司匹林(nitroaspirin)或西地那非(sildenafil) (Viagra®)，其同時阻斷ARG及一氧化氮合酶(NOS)；及IDO抑制劑，例如1-甲基-色胺酸。該術語進一步涵蓋生物活性蛋白片段以及編碼全長免疫檢查點蛋白之核酸及其生物活性蛋白片段。在一些實施例中，該術語進一步涵蓋根據本文所提供之同源性闡述之任一片段。
與之相比，其他免疫檢查點係涵蓋「免疫刺激性」之分子(例如蛋白質)，其活化、刺激或促進免疫系統之功能(例如免疫反應)。在一些實施例中，免疫刺激分子係CD28、CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2)、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、CD27、CD70、CD40、CD40L、CD122、CD226、CD30、CD30L、OX40、OX40L、HVEM、BTLA、GITR及其配體GITRL、LIGHT、LTβR、LTαβ、ICOS (CD278)、ICOSL (B7-H2)及NKG2D。CD40 (分化簇40)係發現於抗原呈遞細胞上之係該等細胞之活化所需之共刺激蛋白。OX40亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員4 (TNFRSF4)或CD134，其在活化之後藉由防止T細胞死亡且隨後增加細胞介素產生來參與維持免疫反應。CD137係腫瘤壞死因子受體(TNF-R)家族中共刺激活化T細胞以增強增殖及T細胞存活之成員。CD122係介白素-2受體(IL-2)蛋白之亞單元，其促進不成熟T細胞分化成調控性T細胞、效應T細胞或記憶性T細胞。CD27係腫瘤壞死因子受體超家族之成員且用作共刺激免疫檢查點分子。CD28 (分化簇28)係表現於T細胞上之提供T細胞活化及存活所需之共刺激信號之蛋白質。GITR (糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白)亦稱為TNFRSF18及AITR，其係在藉由調控性T細胞維持之顯性免疫學自我耐受性來發揮關鍵作用之蛋白質。ICOS (可誘導T細胞共刺激因子)亦稱為CD278，其係表現於活化T細胞上且在T細胞信號傳導及免疫反應中發揮作用之CD28超家族共刺激分子。
免疫檢查點及其序列為業內所熟知且代表性實施例進一步闡述於下文中。免疫檢查點通常係關於抑制受體及天然結合配偶體(例如配體)之對。舉例而言，PD-1多肽係能夠將抑制信號傳輸至免疫細胞以由此抑制免疫細胞效應功能之抑制受體，或能夠(例如)在以可溶性單體形式存在時促進免疫細胞之共刺激(例如藉由競爭性抑制)。較佳PD-1家族成員與PD-1共有序列一致性且結合至一或多種B7家族成員(例如B7-1、B7-2)、PD-1配體及/或抗原呈遞細胞上之其他多肽。術語「PD-1活性」包含PD-1多肽(例如)藉由咬合抗原呈遞細胞上之天然PD-1配體來調節活化免疫細胞中之抑制信號之能力。調節免疫細胞中之抑制信號使得可調節免疫細胞之增殖及/或藉由細免疫細胞之胞介素分泌。因此，術語「PD-1活性」包含PD-1多肽結合其天然配體之能力、調節免疫細胞抑制信號之能力及調節免疫反應之能力。術語「PD-1配體」係指PD-1受體之結合配偶體且包含PD-L1 (Freeman等人(2000) J. Exp. Med. 192:1027-1034)及PD-L2 (Latchman等人(2001)Nat. Immunol. 2:261)。術語「PD-1配體活性」包含PD-1配體多肽結合其天然受體(例如PD-1或B7-1)之能力、調節免疫細胞抑制信號之能力及調節免疫反應之能力。
如本文中所使用，術語「免疫檢查點療法」係指抑制免疫抑制性免疫檢查點(例如抑制其核酸及/或蛋白質)之藥劑之應用。抑制一或多種該等免疫檢查點可阻斷或另外中和抑制性信號傳導以由此上調免疫反應，從而更有效地治療癌症。可用於抑制免疫檢查點之實例性藥劑包含可結合及/或不活化或抑制免疫檢查點蛋白或其片段之抗體、小分子、肽、肽模擬物、天然配體及天然配體衍生物；以及可下調免疫檢查點核酸或其片段之表現及/或活性之RNA干擾劑、反義物、核酸適配體等。上調免疫反應之實例性藥劑包含針對一或多種免疫檢查點蛋白之阻斷該等蛋白質與其天然受體之間之相互作用之抗體；非活化形式之一或多種免疫檢查點蛋白(例如顯性陰性多肽)；阻斷一或多種免疫檢查點蛋白與其天然受體之間之相互作用之小分子或肽；結合至其天然受體之融合蛋白(例如融合至抗體或免疫球蛋白之Fc部分之免疫檢查點抑制蛋白之細胞外部分)；阻斷免疫檢查點核酸轉錄或轉譯之核酸分子；及諸如此類。該等藥劑可直接阻斷一或多種免疫檢查點與其天然受體(例如抗體)之間之相互作用以防止抑制性信號傳導且上調免疫反應。或者，藥劑可間接阻斷一或多種免疫檢查點蛋白與其天然受體之間之相互作用以防止抑制性信號傳導且上調免疫反應。舉例而言，可溶性形式之免疫檢查點蛋白配體(例如穩定化細胞外結構域)可結合至其受體以間接減小結合至適當配體之受體之有效濃度。在一實施例中，單獨或組合使用抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及/或抗PD-L2抗體來抑制免疫檢查點。用於阻斷PD-1路徑之治療劑包含拮抗性抗體及可溶性PD-L1配體。針對PD-1及PD-L1/2抑制路徑之拮抗劑可包含(但不限於)針對PD-1或PD-L1/2之拮抗性抗體(例如17D8、2D3、4H1、5C4 (亦稱為尼沃魯單抗(nivolumab)或BMS-936558)、4A11、7D3及5F4，其揭示於美國專利第8,008,449號中；AMP-224、匹利珠單抗(pidilizumab) (CT-011)、派姆單抗(pembrolizumab)及美國專利第8,779,105號、第8,552,154號、第8,217,149號、第8,168,757號、第8,008,449號、第7,488,802號、第7,943,743號、第7,635,757號及第6,808,710號中所揭示之抗體。類似地，其他代表性檢查點抑制劑可為(但不限於)針對抑制性調控因子CTLA-4 (抗細胞毒性T-淋巴球抗原4抗細胞毒性T-淋巴球抗原4)之抗體，例如伊匹單抗(ipilimumab)、曲美目單抗(tremelimumab) (完全人類化)、抗CD28抗體、抗CTLA-4阿德奈汀(adnectin)、抗CTLA-4結構域抗體、單鏈抗CTLA-4抗體片段、重鏈抗CTLA-4片段、輕鏈抗CTLA-4片段及其他抗體(例如揭示於以下文獻中者：美國專利第8,748, 815號、第8,529,902號、第8,318,916號、第8,017,114號、第7,744,875號、第7,605,238號、第7,465,446號、第7,109,003號、第7,132,281號、第6,984,720號、第6,682,736號、第6,207,156號及第5,977,318號以及歐洲專利第1212422號、美國專利公開案第2002/0039581號及第2002/086014號及Hurwitz等人(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:10067-10071)。
針對PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4例示之免疫檢查點之活性、配體、阻斷及諸如此類之代表性定義通常適用於其他免疫檢查點。
術語「非靶向療法」係指投與不與所選生物分子選擇性相互作用但仍治療癌症之藥劑。非靶向療法之代表性實例包含(但不限於)化學療法、基因療法及輻射療法。
在一實施例中，使用化學療法。化學療法包含投與化學治療劑。此一化學治療劑可為(但不限於)選自下列化合物群者：鉑化合物、細胞毒性抗生素、抗代謝物、抗有絲分裂劑、烷基化劑、砷化合物、DNA拓撲異構酶抑制劑、紫杉烷(taxane)、核苷類似物、植物鹼及毒素；及其合成衍生物。實例性藥劑包含(但不限於)烷基化劑：氮芥(nitrogen mustard) (例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、曲磷胺(trofosfamide)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、雌氮芥(estramustine)及美法侖(melphalan))、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine) (BCNU)及洛莫司汀(lomustine) (CCNU))、烷基磺酸鹽(例如白消安(busulfan)及曲奧舒凡(treosulfan))、三氮烯(例如達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)) 、 順鉑、曲奧舒凡及曲磷胺；植物鹼：長春鹼(vinblastine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxol)；DNA拓撲異構酶抑制劑：替尼泊苷(teniposide)、克立那托(crisnatol)及絲裂黴素；抗葉酸劑：胺甲喋呤、黴酚酸(mycophenolic acid)及羥基脲；嘧啶類似物：5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷(doxifluridine)及胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)；嘌呤類似物：巰基嘌呤及硫基鳥嘌呤；DNA抗代謝物：2'-去氧-5-氟尿苷、甘胺酸阿非迪黴素(aphidicolin glycinate)及吡唑并咪唑；及抗有絲分裂劑：軟海綿素(halichondrin)、秋水仙鹼(colchicine)及利索新(rhizoxin)。類似地，其他實例性藥劑包含含鉑化合物(例如順鉑、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin))、長春花生物鹼(vinca alkaloid) (例如長春新鹼(vincristine)、長春鹼、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine))、類紫杉醇(taxoid) (例如太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇等效物，例如奈米顆粒白蛋白結合太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、二十二碳六烯酸結合-太平洋紫杉醇(DHA-太平洋紫杉醇，Taxoprexin)、聚麩胺酸鹽結合-太平洋紫杉醇(PG-太平洋紫杉醇、聚麩胺酸太平洋紫杉醇(paclitaxel poliglumex)、CT-2103、XYOTAX)、腫瘤活化前藥(TAP) ANG1005 (結合三個太平洋紫杉醇分子之Angiopep-2)、太平洋紫杉醇-EC-1 (結合至erbB2識別肽EC-1之太平洋紫杉醇)及葡萄糖偶聯太平洋紫杉醇(例如2'-太平洋紫杉醇琥珀酸甲酯2-吡喃葡萄糖基酯)；多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(taxol))、表鬼白毒素(epipodophyllin) (例如依託泊苷(etoposide)、磷酸依託泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷、托泊替康(topotecan)、9-胺基喜樹鹼(9-aminocamptothecin)、伊立替康注射液(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、克立那托、絲裂黴素C (mytomycin C))、抗代謝物、DHFR抑制劑(例如胺甲蝶呤、二氯胺甲喋呤(dichloromethotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate)、依達曲沙(edatrexate))、IMP去氫酶抑制劑(例如黴酚酸、噻唑羧胺核苷(tiazofurin)、利巴韋林(ribavirin)及EICAR)、核糖核苷酸還原酶抑制劑(例如羥基脲及去鐵胺(deferoxamine))、尿嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、卡培他濱(capecitabine))、胞嘧啶類似物(例如阿糖胞苷(cytarabine) (ara C)、胞嘧啶阿糖胞苷及氟達拉濱(fludarabine))、嘌呤類似物(例如巰基嘌呤及硫鳥嘌呤)、維他命D3類似物(例如EB 1089、CB 1093及KH 1060)、異戊烯化抑制劑(例如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神經毒素(例如1-甲基-4-苯基吡啶鎓離子)、細胞週期抑制劑(例如星狀孢子素(staurosporine))、放線菌素(actinomycin) (例如放線菌素D、更生黴素(dactinomycin))、博來黴素(bleomycin) (例如博來黴素A2、博來黴素B2、培洛黴素(peplomycin))、蒽環類抗生素(例如柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇化脂質多柔比星、艾達黴素(idarubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone))、MDR抑制劑(例如維拉帕米(verapamil))、Ca2+ ATPase抑制劑(例如毒胡蘿蔔內酯(thapsigargin))、伊馬替尼(imatinib)、沙立度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、酪胺酸激酶抑制劑(例如阿昔替尼(axitinib) (AG013736)、博舒替尼(bosutinib) (SKI-606)、西地尼布(cediranib) (RECENTINTM , AZD2171)、達沙替尼(dasatinib) (SPRYCEL®, BMS-354825)、埃羅替尼(erlotinib) (TARCEVA®)、吉非替尼(gefitinib) (IRESSA®)、伊馬替尼(Gleevec®, CGP57148B, STI-571)、拉帕替尼(TYKERB®, TYVERB®)、來他替尼(lestaurtinib) (CEP-701)、來那替尼(neratinib) (HKI-272)、尼羅替尼(nilotinib) (TASIGNA®)、司馬沙尼(semaxanib) (司馬西尼(semaxinib)，SU5416)、舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT®, SU11248)、托西尼布(toceranib) (PALLADIA®)、凡德他尼(vandetanib) (ZACTIMA®, ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787, PTK/ZK)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN®)、貝伐珠單抗(AVASTIN®)、利妥昔單抗(RITUXAN®)、西妥昔單抗(ERBITUX®)、帕尼單抗(VECTIBIX®)、蘭尼單抗(ranibizumab) (Lucentis®)、尼羅替尼(TASIGNA®)、索拉非尼(sorafenib) (NEXAVAR®)、依維莫司(everolimus) (AFINITOR®)、阿來組單抗(CAMPATH®)、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin) (MYLOTARG®)、西羅莫司(temsirolimus) (TORISEL®)、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、乳酸多韋替尼(dovitinib lactate) (TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992 (TOVOKTM )、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120 (VARGATEF®)、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃紮尼(tivozanib) (AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647及/或XL228)、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib) (VELCADE))、mTOR抑制劑(例如雷帕黴素(rapamycin)、特姆莫司(temsirolimus) (CCI-779)、依維莫司(everolimus) (RAD-001)、地磷莫司(ridaforolimus)、AP23573 (Ariad)、AZD8055 (AstraZeneca)、BEZ235 (Novartis)、BGT226 (Norvartis)、XL765 (Sanofi Aventis)、PF-4691502 (Pfizer)、GDC0980 (Genetech)、SF1126 (Semafoe)及OSI-027 (OSI))、奧利默森(oblimersen)、吉西他濱(gemcitabine)、洋紅黴素(carminomycin)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、環磷醯胺、達卡巴嗪、丙卡巴肼(procarbizine)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜樹鹼(campathecin)、普利黴素(plicamycin)、天門冬醯胺酶、胺基蝶呤(aminopterin)、甲胺喋呤(methopterin)、泊非黴素(porfiromycin)、美法侖、異長春鹼(leurosidine)、長春羅新(leurosine)、氮芥苯丁酸、曲貝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、圓皮海綿內酯(discodermolide)、洋紅黴素、胺基蝶呤及六甲基密胺(hexamethyl melamine)。亦可使用包括一或多種化學治療劑之組合(例如FLAG、CHOP)。FLAG包括氟達拉濱、胞嘧啶阿糖核苷(Ara-C)及G-CSF。CHOP包括環磷醯胺、長春新鹼、多柔比星及普賴松(prednisone)。在另一實施例中，使用PARP (例如PARP-1及/或PARP-2)抑制劑且該等抑制劑為業內所熟知(例如奧拉帕尼(olaparib)、ABT-888、BSI-201、BGP-15 (N-Gene Research Laboratories, Inc.)；INO-1001 (Inotek Pharmaceuticals Inc.)；PJ34 (Soriano等人，2001；Pacher等人，2002b)；3-胺基苯甲醯胺(Trevigen)；4-胺基-1,8-萘二甲醯亞胺；(Trevigen)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen)；苯甲醯胺(美國專利Re. 36,397)；及NU1025 (Bowman等人)。作用機制通常與PARP抑制劑結合PARP且降低其活性之能力相關。PARP催化β-菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)至菸鹼醯胺及聚-ADP-核糖(PAR)之轉化。聚(ADP-核糖)及PARP與轉錄、細胞增殖、基因體穩定性及癌發生之調控相關(Bouchard等人(2003)Exp. Hematol. 31:446-454)；Herceg (2001)Mut. Res. 477:97-110)。聚(ADP-核糖)聚合酶1 (PARP1)係修復DNA單鏈斷裂(SSB)之關鍵分子(de Murcia J.等人(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:7303-7307；Schreiber等人(2006)Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:517-528；Wang等人(1997)Genes Dev. 11:2347-2358)。藉由抑制PARP1功能來敲除SSB修復可誘導DNA雙鏈斷裂(DSB)，該DNA雙鏈斷裂可觸發具有缺陷同源性定向DSB修復之癌細胞中之協同致死性(Bryant等人(2005)Nature 434:913-917；Farmer等人(2005)Nature 434:917-921)。化學治療劑之前述實例係闡釋性且並不意欲加以限制。
在另一實施例中，使用輻射療法。輻射療法中所使用之輻射可為離子化輻射。輻射療法亦可為γ射線、X射線或質子光束。輻射療法之實例包含(但不限於)外部光束輻射療法、間質植入放射性同位素(I-125、鈀、銥)、放射性同位素(例如鍶-89)、胸腔輻射療法、腹膜腔內P-32輻射療法及/或總腹盆輻射療法(total abdominal and pelvic radiation therapy)。關於輻射療法之一般概述，參見Hellman，第16章：Principles of Cancer Management: Radiation Therapy，第6版，2001, DeVita等人編輯，J. B. Lippencott Company, Philadelphia。輻射療法可作為外部光束輻射或遠程放射療法來投與，其中輻射係自遠程來源引入。輻射治療亦可作為內部療法或短距離放射療法來投與，其中將放射源置於身體內部靠近癌細胞或腫瘤團塊處。亦涵蓋使用光動力學療法，其包括投與光敏劑(例如血紫質及其衍生物、維替泊芬(Vertoporfin) (BPD-MA)、酞青素、光敏劑Pc4、去甲氧基-竹紅菌甲素A；及2BA-2-DMHA)。
在另一實施例中，使用激素療法。激素治療性治療劑可包括(例如)激素激動劑、激素拮抗劑(例如氟他胺(flutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、乙酸柳培林(leuprolide acetate) (LUPRON)、LH-RH拮抗劑)、激素生物合成及處理之抑制劑及類固醇(例如地塞米松、類視色素、類維生素D (deltoid)、倍他米松(betamethasone)、皮質醇、可的松(cortisone)、普賴松、去氫睪固酮(dehydrotestosterone)、糖皮質激素、鹽皮質激素、雌激素、睪固酮、助孕素)、維他命A衍生物(例如全反視黃酸(ATRA))；維他命D3類似物；抗孕激素(例如米非司酮(mifepristone)、奧那司酮(onapristone))或抗雄激素(例如乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate))。
在另一實施例中，使用熱療，其係其中使身體組織暴露於高溫(高達106℉)之程序。熱量可藉由損害細胞或剝奪其存活所需物質來幫助縮小腫瘤。熱療療法可為局部熱療、區域熱療及全身熱療且使用外部及內部加熱裝置。熱療幾乎總是與其他形式之療法(例如輻射療法、化學療法及生物療法)一起使用以試圖增加其有效性。局部熱療係指將熱量施加至極小區域(例如腫瘤)。可使用來自身體外部裝置之針對腫瘤之高頻波外部加熱該區域。為達成內部加熱，可使用若干類型之無菌探針中之一者，包含細加熱絲或填充有溫水之空心管；植入微波天線；及射頻電極。在區域熱療中，加熱器官或肢體。將產生高能量之磁體及裝置置於擬加熱區域上方。在稱為灌注之另一方式中，取出一些患者之血液，加熱，且然後抽吸(灌注)至擬內部加熱之區域中。使用全身加熱來治療已擴散至全身之轉移性癌症。其可使用溫水毯、熱蠟、感應線圈(如電毯中者)或熱室(類似於大培育器)來達成。熱療不引起輻射副效應或併發症之任何顯著增加。然而，直接施加至皮膚之熱量可在約一半所治療患者中引起不適或甚至顯著局部疼痛。其亦可引起通常快速癒合之水泡。
在再一實施例中，使用光動力學療法(亦稱為PDT、光輻射療法、光療法或光化學療法)來治療一些類型之癌症。其係基於如下發現：在將單細胞生物體曝光於特定類型之光時，某些稱為光敏劑之化學物質可殺死該等生物體。PDT經由使用固定頻率雷射光與光敏劑之組合來破壞癌細胞。在PDT中，將光敏劑注射至血流中且由全身之細胞吸收。該藥劑在癌細胞中之保留時間長於正常細胞。在將所治療癌細胞曝光於雷射光時，光敏劑吸收光且產生破壞所治療癌細胞之活性氧形式。曝光必須嚴格定時，從而其發生於大部分光敏劑已離開健康細胞但仍存在於癌細胞中時。可引導PDT中所用之雷射光穿過光纖(極細玻璃原絲)。將光纖置於靠近癌症處以遞送適當量之光。可引導光纖穿過支氣管視鏡進入肺中以用於治療肺癌或穿過內視鏡進入食管中以用於治療食管癌。PDT之優點在於其對健康組織引起最小損害。然而，因當前使用之雷射光不能通過組織之大於約3公分(略大於1.25英吋)，PDT主要用於治療皮膚上或皮膚正下方或內部器官襯層上之腫瘤。光動力學療法使皮膚及眼睛在治療之後對光敏感6週或更長。建議患者避免直射日光及明亮室內光至少6週。若患者必須去戶外，則其需要穿戴防護服(包含太陽鏡)。PDT之其他暫時性副效應與特定區域之治療相關且可包含咳嗽、吞嚥困難、腹痛及呼吸疼痛或呼吸短促。在1995年12月，美國食品藥物監督管理局(U.S. Food and Drug Administration，FDA)批准稱為卟吩姆鈉(porfimer sodium)或Photofrin®之光敏劑來減輕引起堵塞之食管癌及不能單獨使用雷射滿意治療之食管癌的症狀。在1998年1月，FDA批准卟吩姆鈉用於治療常用肺癌治療不適用之患者之早期非小細胞肺癌。國家癌症研究院(National Cancer Institute)及其他機構正支持臨床試驗(研究性學習)來評估光動力學療法用於若干類型癌症(包含膀胱癌、腦癌、喉癌及口腔癌)之應用。
在又一實施例中，使用雷射療法來提供高強度光以破壞癌細胞。此技術通常用於減輕癌症症狀(例如出血或堵塞)，尤其在癌症不能藉由其他治療治癒時。其亦可用於藉由縮小或破壞腫瘤來治療癌症。術語「雷射」代表藉由刺激輻射發射來放大光。尋常光(例如來自電燈泡者)具有許多波長且以所有方向上進行擴散。另一方面，雷射光具有特定波長且聚焦於窄光束中。此類高強度光含有許多能量。雷射極為強大且可用於切割鋼或使金剛石成型。雷射亦可用於極精確手術工作，例如修復眼睛中之經損害視網膜或切割組織(代替解剖刀)。儘管存在若干不同種類之雷射，但僅以下三類廣泛用於醫學中：二氧化碳(CO2 )雷射--此類雷射可自皮膚表面去除薄層且不滲透較深層。此技術尤其可用於治療尚未擴散至皮膚深處之腫瘤及某些癌症前期病狀。作為傳統解剖刀手術之替代者，CO2 雷射亦能夠切割皮膚。以此方式使用雷射以去除皮膚癌。釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)雷射--來自此雷射之光可較來自其他類型雷射之光滲透至組織較深處，且其可使得血液迅速凝結。其可經由光學纖維攜載至身體之較小可及部分。有時使用此類雷射來治療喉癌。氬雷射--此雷射可僅通過組織淺層且由此可用於皮膚病學及眼睛手術中。在稱為光動力學療法(PDT)之程序中，其亦與光敏性染料一起使用以治療腫瘤。雷射較標準手術工具具有若干優點，包含：雷射較解剖刀更為精確。靠近切口之組織得以保護，此乃因與周圍皮膚或其他組織之接觸較少。由雷射產生之熱量使手術部位滅菌，由此減小感染風險。可能需要較少操作時間，此乃因雷射精確度容許較小切口。癒合時間通常縮短；此乃因雷射熱量會密封血管，從而存在較少出血、腫脹或結瘢。雷射手術可較不複雜。舉例而言，可使用光纖在不形成大切口下將雷射光引導至身體部分中。可針對門診病人進行更多程序。雷射可以以下兩種方式來使用以治療癌症：藉由使用熱量縮小或破壞腫瘤，或藉由活化破壞癌細胞之稱為光敏劑之化學物質。在PDT中，光敏劑保留於癌細胞中且可由光刺激以引起殺死癌細胞之反應。使用CO2 及Nd:YAG雷射來縮小或破壞腫瘤。其可與內視鏡一起使用，內視鏡係容許醫師看到身體之某些區域(例如膀胱)之管子。來自一些雷射之光可傳輸穿過配備有光纖之撓性內視鏡。此容許醫師看到及處理除手術外不能以其他方式到達之身體部分且由此容許極精確地瞄準雷射光束。雷射亦可與低倍顯微鏡一起使用，從而賦予醫生所治療部位之清晰視圖。與其他儀器一起使用，雷射系統可產生直徑小至200微米之切割區域，該尺寸小於極細線之寬度。使用雷射來治療許多類型之癌症。雷射手術係某些階段之聲門(聲帶)癌、子宮頸癌、皮膚癌、肺癌、陰道癌、外陰癌及陰莖癌之標準治療。除用於破壞癌症外，雷射手術亦可用於幫助減輕由癌症引起之症狀(姑息性護理)。舉例而言，可使用雷射來縮小或破壞阻塞患者氣管(嗓門)之腫瘤，從而使得其較易於呼吸。其亦有時用於緩解結腸直腸癌及肛門癌。雷射誘導性間質熱療(LITT)係雷射療法中之最新進展之一。LITT與稱為熱療之癌症治療使用相同理念；亦即，熱量可藉由損害細胞或剝奪其存活所需物質來幫助縮小腫瘤。在此治療中，雷射係針對身體中之間質區域(器官之間之區域)。雷射光然後身高腫瘤溫度，此會損害或破壞癌細胞。
使用癌症療法(例如表1及/或表2中所列示生物標記物之至少一種調節劑)之治療之持續時間及/或劑量可根據表1及/或表2中所列示生物標記物之特定調節劑或其組合而有所變化。熟習此項技術者應瞭解用於特定癌症治療劑之適當治療時間。本發明涵蓋繼續評價每一癌症治療劑之最佳治療時間表，其中如由本發明所涵蓋方法測定之個體之癌症表型係決定最佳治療劑量及時間表之因素。
2. 篩選方法 本發明所涵蓋之另一態樣涵蓋篩選分析。
在一些實施例中，提供選擇調節單核球及/或巨噬細胞中本發明所涵蓋之一或多種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之拷貝數、量及/或活性之藥劑(例如抗體、融合蛋白、肽或小分子)的方法。在一些實施例中，所選藥劑亦調節由該等單核球及/或巨噬細胞調介之免疫反應(例如調節CD8+ 細胞毒性T細胞殺死；調節癌細胞對免疫檢查點療法之敏感性；調節抗癌療法(如免疫檢查點療法)之抗性；調節癌症療法；調節(例如) NK、嗜中性球及巨噬細胞之免疫細胞遷移、募集、分化及/或存活；及諸如此類)。因此，本文所闡述之任一診斷、預後或篩選方法可使用本文所闡述之生物標記物作為期望表型(例如經調節免疫表型)之讀出，且使用調節本文所闡述一或多種生物標記物之拷貝數、量及/或活性之藥劑來證實一或多種生物標記物之調節及/或證實該等藥劑對期望表型之讀出的效應(例如經調節免疫反應、對免疫檢查點阻斷之敏感性及諸如此類)。該等方法可利用篩選分析，包含基於細胞之分析及非基於細胞之分析。
舉例而言，提供篩選使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑之方法，其包括：a)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在單核球及/或巨噬細胞存在下接觸，該等單核球及/或巨噬細胞與i)至少一種降低表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑及/或ii)至少一種增加表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸；b)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在未與至少一種藥劑或多種藥劑接觸之對照單核球及/或巨噬細胞存在下接觸；及c)藉由鑑別在a)中與b)相比增加細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法效能(例如細胞殺死)之藥劑來鑑別使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑。
在一些實施例中，該等分析係關於藉由分析一或多種生物標記物之相反調節效應來鑑別抑制免疫細胞增殖及/或效應功能或誘導無反應性、純系缺失及/或消耗之藥劑。本發明進一步涵蓋經由此一調節來抑制免疫細胞增殖及/或效應功能或誘導無反應性、純系缺失及/或消耗之方法。
在另一實例中，提供篩選使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑之方法，其包括a)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在單核球及/或巨噬細胞存在下接觸，該等單核球及/或巨噬細胞經改造以降低表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)經改造以增加表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；b)使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在對照單核球及/或巨噬細胞存在下接觸；及c)鑑別與b)相比在a)中使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法效能(例如細胞殺死)敏感之藥劑。
通常，本發明涵蓋篩選結合至本發明所涵蓋之一或多種生物標記物(例如表1、表2、實例等中所列示之靶)或調節其活性之藥劑(例如測試化合物)之分析。在一實施例中，鑑別調節免疫反應之藥劑之方法需要測定藥劑調節(例如增強或抑制)表1及/或表2中所列示之一或多種靶的能力。該等藥劑包含(但不限於)抗體、蛋白質、融合蛋白、小分子及核酸。
在一些實施例中，鑑別增強免疫反應之藥劑之方法需要測定候選藥劑調節一或多種生物標記物及進一步調節所關注免疫反應(例如經調節發炎表型、細胞毒性T細胞活化及/或活性、癌細胞對免疫檢查點療法之敏感性及諸如此類)的能力。
在一些實施例中，分析係無細胞或基於細胞之分析，其包括使一或多種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)與測試藥劑接觸，及(例如)藉由量測如下文所闡述之直接或間接參數來測定測試藥劑調節(例如上調或下調)生物標記物之拷貝數、量及/或活性之能力。
在一些實施例中，分析係基於細胞之分析，例如包括以下步驟者：使(a)所關注細胞(例如單核球及/或巨噬細胞)與測試藥劑接觸，及測定測試藥劑調節(例如上調或下調)一或多種生物標記物之拷貝數、量及/或活性(例如一或多種生物標記物與一或多種天然結合配偶體之間之結合)之能力。可(例如)藉由量測直接結合或藉由量測免疫細胞活化之參數來測定多肽彼此結合或相互作用之能力。
在另一實施例中，分析係基於細胞之分析，其包括使癌細胞與細胞毒性T細胞、單核球及/或巨噬細胞及測試藥劑接觸，及(例如)藉由量測如下文所闡述之直接或間接參數來測定測試藥劑調節表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或調節免疫反應之能力。
上文及本文所闡述之方法亦可適於測試一或多種已知調節本文所闡述之一或多種生物標記物之拷貝數、量及/或活性的藥劑，從而證實一或多種生物標記物之調節及/或證實該等藥劑對期望表型之讀出之效應(例如經調節免疫反應、對免疫檢查點阻斷之敏感性及諸如此類)。
在直接結合分析中，可使生物標記物蛋白(或其各別靶多肽或分子)與放射性同位素或酶促標記偶合，從而可藉由檢測複合物中之經標記蛋白質或分子來測定結合。舉例而言，可使用125 I、35 S、14 C或3 H來直接或間接標記靶，且藉由放射性發射之直接計數或藉由閃爍計數來檢測放射性同位素。或者，可以酶促方式使用(例如)辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶來標記靶，且藉由測定適當受質至產物之轉化來檢測酶促標記。亦可使用標準結合或酶促分析來測定生物標記物與受質之間之相互作用。在上述分析方法之一或多個實施例中，可期望固定多肽或分子以促進一或兩種蛋白質或分子之複合形式與未複合形式之分離且適應分析自動化。
可在任一適於含有反應物之器皿中使測試藥劑結合至靶。該等器皿之非限制性實例包含微量滴定板、測試管及微型離心管。固定形式之本發明所涵蓋之抗體亦可包含結合至固相之抗體，該固相係(如)多孔、微孔(平均孔隙直徑小於約一微米)或大孔(平均孔隙直徑大於約10微米)材料，例如膜、纖維素、硝基纖維素或玻璃纖維；珠粒，例如由瓊脂糖或聚丙烯醯胺或乳膠製得者；或盤、板或孔之表面，例如由聚苯乙烯製得者。
舉例而言，在直接結合分析中，可使多肽與放射性同位素或酶促標記偶合，從而可藉由檢測複合物中之經標記蛋白質來測定多肽相互作用及/或活性(例如結合事件)。舉例而言，可使用125 I、35 S、14 C或3 H來直接或間接標記多肽，且藉由放射性發射之直接計數或藉由閃爍計數來檢測放射性同位素。或者，可以酶促方式使用(例如)辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶來標記多肽，且藉由測定適當受質至產物之轉化來檢測酶促標記。
亦在本發明範圍內，在不標記任一相互作用物下測定藥劑調節所關注參數之能力。舉例而言，可在不標記擬監測多肽下使用微生理記錄儀來檢測多肽之間之相互作用(McConnell等人(1992)Science 257:1906-1912)。如本文中所使用，「微生理記錄儀」 (例如Cytosensor)係使用光定址電位感測器(LAPS)來量測細胞酸化其環境之速率之分析儀器。此酸化速率之變化可用於指示化合物與受體之間之相互作用。
在一些實施例中，可藉由測定給定組多肽中一或多種成員之活性來測定阻斷劑(例如抗體、融合蛋白、肽或小分子)拮抗該組多肽之間之相互作用的能力。舉例而言，可藉由以下方式來測定蛋白質及/或一或多種天然結合配偶體之活性：檢測細胞第二信使之誘導(例如細胞內信號傳導)，檢測適當受質之催化/酶促活性，檢測報告基因(包括操作性連接至編碼可檢測標記物(例如氯黴素(chloramphenicol)乙醯基轉移酶)之核酸之靶反應性調控元件)之誘導，或檢測由蛋白質及/或一或多種天然結合配偶體調控之細胞反應。可(例如)藉由以下方式來測定阻斷劑結合至該多肽或與其相互作用之能力：在增殖分析中量測化合物調節免疫細胞共刺激或抑制之能力，或干擾該多肽結合至識別其部分之抗體之能力。
可藉由在添加至活體外分析中時抑制免疫細胞增殖及/或效應功能或誘導無反應性、純系缺失及/或消耗之能力來鑑別調節生物標記物量及/或活性(例如與一或多種天然結合配偶體之相互作用)之藥劑。舉例而言，可在刺激經由活化受體之信號轉導之藥劑存在下培養細胞。可採用細胞活化之諸多識別讀出在活化劑存在下來量測細胞增殖或效應功能(例如抗體產生、細胞介素產生、吞噬作用)。可易於藉由使用業內已知技術量測藥劑降低所量測增殖或效應功能之能力來測定測試藥劑阻斷此活化之能力。
舉例而言，可在T細胞分析中測試本發明所涵蓋之藥劑抑制或增強共刺激之能力，如Freeman等人(2000)J. Exp. Med. 192:1027及Latchman等人(2001)Nat. Immunol. 2:261中所闡述。可自人類PBMC分離CD4+ T細胞且使用活化抗CD3抗體加以刺激。可藉由3 H胸苷納入來量測T細胞增殖。可在分析中使用或不使用CD28共刺激下來實施分析。可使用來自PBMC之Jurkat T細胞及PHA-母細胞來實施類似分析。
或者，可測試本發明所涵蓋之藥劑調節細胞介素之細胞產生之能力，該等細胞介素係藉由調節一或多種生物標記物所產生或該產生可在免疫細胞中因應於調節一或多種生物標記物來予以增強或抑制。由所關注免疫細胞釋放之指示性細胞介素可藉由ELISA來鑑別，或藉由抗體阻斷細胞介素以抑制免疫細胞增殖或由該細胞介素誘導之其他細胞類型之增殖之能力來鑑別。舉例而言，可自Genzyme (Cambridge MA)獲得IL-4 ELISA套組以及IL-7阻斷抗體。可自Genetics Institute (Cambridge, MA)獲得針對IL-9及IL-12之阻斷抗體。活體外免疫細胞共刺激分析亦可用於鑑別可藉由調節一或多種生物標記物來調節之細胞介素之方法中。舉例而言，若在共刺激時誘導之特定活性(例如免疫細胞增殖)不能藉由添加已知細胞介素之阻斷抗體來抑制，則該活性可源自未知細胞介素之作用。在共刺激後，可藉由習用方法自培養基純化此細胞介素且藉由其誘導免疫細胞增殖之能力來量測其活性。為鑑別可用於誘導耐受性之細胞介素，可使用如上文所闡述之活體外T細胞共刺激分析。在此情形下，給予T細胞一級活化信號且使其與所選細胞介素接觸，但並不給予共刺激信號。在洗滌且靜置免疫細胞之後，使用一級活化信號及共刺激信號再攻擊細胞。若免疫細胞不具有反應(例如增殖或產生細胞介素)，則其已變得耐受且細胞介素尚未防止耐受性誘導。然而，若免疫細胞具有反應，則耐受性誘導已由細胞介素防止。能夠防止耐受性誘導之彼等細胞介素可聯合阻斷B淋巴球抗原之試劑靶向活體內阻斷，此可作為誘導患有自體免疫疾病之移植接受者或個體中之耐受性之較有效方式。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之分析係用於篩選調節生物標記物及/或一或多種天然結合配偶體間之相互作用之藥劑的無細胞分析，其包括使多肽及一或多種天然結合配偶體或其生物活性部分與測試藥劑接觸，及測定測試化合物調節多肽與一或多種天然結合配偶體或其生物活性部分之間之相互作用之能力。可如上文所闡述來直接或間接測定測試化合物之結合。在一實施例中，該分析包含使多肽或其生物活性部分與其結合配偶體接觸以形成分析混合物，使分析混合物與測試化合物接觸，及測定測試化合物與分析混合物中之多肽相互作用之能力，其中測定測試化合物與多肽相互作用之能力包括測定與結合配偶體相比測試化合物優先結合至多肽或其生物活性部分之能力。
在一些實施例中，不論係基於細胞之分析抑或無細胞分析，可利用其他結合配偶體進一步分析測試藥劑以測定其是否影響多肽與一或多種天然結合配偶體之間之結合及/或相互作用活性。其他有用結合分析方法包含使用即時生物分子相互作用分析(BIA) (Sjolander及Urbaniczky (1991)Anal. Chem. 63:2338-2345及Szabo等人(1995)Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705)。如本文中所使用，「BIA」係用於在不標記任一相互作用物之情況下即時研究生物特異性相互作用之技術(例如BIAcore)。可使用表面電漿共振(SPR)之光學現象變化來指示生物多肽之間之即時反應。可將所關注多肽固定於BIAcore晶片上且可測試多種藥劑(阻斷抗體、融合蛋白、肽或小分子)與所關注多肽之結合。使用BIA技術之一實例闡述於Fitz等人(1997)Oncogene 15:613中。
本發明所涵蓋之無細胞分析適於使用可溶性及/或膜結合形式之蛋白質。在使用膜結合形式蛋白質之無細胞分析之情形下，可期望利用增溶劑，從而使膜結合形式之蛋白質維持於溶液中。該等增溶劑之實例包含非離子型洗滌劑，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛醯基-N-甲基葡萄糖醯胺、癸醯基-N-甲基葡萄糖醯胺、Triton® X-100、Triton® X-114、Thesit®、異十三烷基聚(乙二醇醚)n 、3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基胺合(amminio)]-1-丙烷磺酸酯(CHAPS)、3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基胺合]-2-羥基-1-丙烷磺酸酯(CHAPSO)或N-十二烷基=N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸酯。
在上述分析方法之一或多個實施例中，可期望固定任一多肽以促進一或兩種蛋白質之複合形式與未複合形式之分離且適應分析自動化。可在任一適於含有反應物之器皿中使測試化合物結合至多肽。該等器皿之實例包含微量滴定板、測試管及微型離心管。在一實施例中，可提供增加容許一或兩種蛋白質結合至基質之結構域之融合蛋白。舉例而言，可使基於麩胱甘肽-S-轉移酶之多肽融合蛋白或麩胱甘肽-S-轉移酶/靶融合蛋白吸附於麩胱甘肽瓊脂糖珠粒(Sigma Chemical, St. Louis, MO)或麩胱甘肽源微量滴定板上，然後與測試化合物組合，且在有助於複合物形成之條件下(例如在關於鹽及pH之生理學條件下)培育混合物。在培育後，洗滌珠粒或微量滴定板孔以去除任何未結合組分，在珠粒之情形下固定基質，直接或間接(例如)如上文所闡述來測定複合物。或者，可使複合物與基質解離，且使用標準技術測定多肽結合或活性之程度。
在一替代實施例中，可如上文針對基於細胞之分析所闡述來測定測試化合物調節所關注生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之活性之能力，例如藉由測定測試化合物調節在多肽下游發揮作用之多肽活性之能力來達成。舉例而言，可測定第二信使之含量，可測定相互作用劑多肽在適當靶上之活性，或可如先前所闡述來測定相互作用劑與適當靶之結合。
本發明另外係關於藉由上述篩選分析鑑別之新穎藥劑。因此，在本發明範圍內將如本文所闡述鑑別之藥劑進一步用於適當動物模型中。舉例而言，如本文所闡述鑑別之藥劑可用於動物模型中以測定使用此一藥劑之治療之效能、毒性或副效應。或者，如本文所闡述鑑別之藥劑可用於動物模型中以測定此一藥劑之作用機制。另外，本發明係關於藉由上述篩選分析鑑別之新穎藥劑用於如本文所闡述之治療之用途。
3. 診斷用途及分析 本發明部分地提供用於精確分類生物試樣是否與所關注輸出相關之方法、系統及代碼，該所關注輸出係例如根據本文所闡述之一或多種生物標記物之調節能夠具有經調節表型之單核球及/或巨噬細胞、可能對癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶之至少一種調節劑)具有反應之癌症，及諸如此類。在一些實施例中，本發明可用於使用統計學算法及/或經驗數據(例如表1及/或表2中所列示至少一種靶之量或活性)來分類涉及對癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)具有反應或不具有反應或處於該風險下之試樣(例如來自個體)。在一些實施例中，本發明涵蓋基於檢測本文所闡述之生物標記物(例如表1、表2、實例等中所列示者，例如CD53、PSGL1及/或VSIG4)之存在、不存在及/或經調節表現來檢測單核球及/或巨噬細胞之免疫表型狀態(例如M1、1型、M2、2型等)的方法。
檢測生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之量或活性且由此可用於針對試樣很可能或不可能對發炎表型調節、癌症療法及諸如此類具有反應進行分類之實例性方法涉及使生物試樣與能夠檢測生物試樣中生物標記物之量或活性的藥劑(例如蛋白質結合劑，如抗體或其抗原結合片段；或核酸結合劑，如寡核苷酸)接觸。在一些實施例中，該方法進一步包括(例如)自測試個體獲得生物試樣。在一些實施例中，使用至少一種藥劑，其中可組合(例如在夾心式ELISA)或連續使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種該藥劑。在某些情況下，統計學算法係單一學習統計學分類系統。舉例而言，可使用單一學習統計學分類系統基於預測或機率值及生物標記物之存在或含量來使試樣分類。所用單一學習統計學分類系統通常以至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及/或整體準確度來使試樣分類。
其他適宜統計學算法為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，學習統計學分類系統包含能夠適用於複雜資料組(例如所關注標記物組)且基於該等資料組作出決策之機器學習算法技術。在一些實施例中，使用單一學習統計學分類系統，例如分類數(例如隨機森林)。在其他實施例中，較佳地串聯使用2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個學習統計學分類系統之組合。學習統計學分類系統之實例包含(但不限於)使用以下各項者：歸納學習(例如決策/分類樹，例如隨機森林、分類及回歸樹(C&RT)、提升樹等)、大概近似正確(PAC)學習、連接學習(例如神經網路(NN)、人工神經網路(ANN)、神經模糊網路(NFN)、網路結構、感知器(例如多層感知器)、多層前饋網路、神經網路應用、信任網路中之貝葉斯學習(Bayesian learning in belief network)等)、強化學習(例如已知環境中之被動學習(例如幼稚學習、適應性動態學習及時間差分學習)、未知環境中之被動學習、未知環境中之主動學習、學習動作值函數、強化學習應用等)及基因算法及演化規劃。其他學習統計學分類系統包含支援向量機(例如核方法(Kernel method))、多元適應性回歸樣條法(MARS)、李文柏格-馬誇特算法(Levenberg-Marquardt algorithm)、高斯-牛頓算法(Gauss-Newton algorithm)、混合高斯模型(mixtures of Gaussians)、梯度下降算法及學習矢量量化(LVQ)。在某些實施例中，本發明所涵蓋之方法進一步包括將試樣分類結果發送至臨床醫師(例如腫瘤學家)。
在一些實施例中，在診斷個體後向個體投與治療有效量之基於該診斷之所定義治療。
在一些實施例中，該等方法另外涉及獲得對照生物試樣，例如來自並不患有癌症或其癌症對癌症療法易感之個體之生物試樣、來自緩解期間個體之生物試樣或來自針對不管使用何種癌症療法發生癌症進展進行治療期間之個體之生物試樣。
4 . 預測醫學 本發明亦係關於預測醫學領域，其中使用診斷分析、預後分析及監測臨床試驗來達成預後(預測)目的以由此預防性治療個體。因此，本發明所涵蓋之一個態樣涵蓋診斷分析，其用於測定(例如檢測)在生物試樣(例如血液、血清、細胞或組織)之背景中本文所闡述生物標記物(例如表1及/或表2中所列示者)之存在、不存在、拷貝數、量及/或活性值，由此測定患有癌症個體是否可能對癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)具有反應，不論在原始癌症抑或復發性癌症中。該等分析可用於預後或預測目的以由此在特徵在於生物標記物多肽、核酸表現或活性或與其有關之病症發作之前或在復發之後預防性治療個體。熟習此項技術者應瞭解，任一方法可使用一或多種(例如組合)本文所闡述之生物標記物(例如表1及/或表2中所列示者)。對於任一預測醫學分析而言，可分析所關注生物標記物、所關注分級指示因子(例如CD11b+狀態、CD14+狀態等)或其任一組合。
本發明所涵蓋之另一態樣涵蓋監測藥劑(例如藥物、化合物及基於小核酸之分子)對表1及/或表2中所列示靶之表現或活性及/或所關注細胞之發炎表型之影響。該等及其他藥劑進一步詳細闡述於下列部分中。
熟習此項技術者亦應瞭解，在某些實施例中，本發明所涵蓋之方法實施電腦程式及電腦系統。舉例而言，可使用電腦程式來實施本文所闡述之算法。電腦系統亦可儲存及操縱由本發明所涵蓋方法生成之資料，該資料包括複數個可由電腦系統用於實施本發明方法之生物標記物信號變化/特徵。在某些實施例中，電腦系統接收生物標記物表現資料；(ii)儲存該資料；且(iii)比較本文所闡述任一數量方式中之資料(例如相對於適當對照之分析)以測定來自癌性或癌前期組織之資訊性生物標記物之狀態。在其他實施例中，電腦系統(i)比較所測定表現生物標記物含量與臨限值；及(ii)輸出該生物標記物含量是否相對於臨限值顯著調節(例如高於或低於)之指示或基於該指示之表型。
在某些實施例中，該等電腦系統亦視為本發明所涵蓋之部分。可使用諸多類型之電腦系統根據藉由熟習生物資訊及/或電腦技術者所擁有之知識來實施本發明之分析方法。在操作此一電腦系統期間，可將若干軟體組件加載至記憶體中。軟體組件可包括業內標準軟體組件及本發明之特殊組件(例如Lin等人(2004)Bioinformatics 20, 1233-1240中所闡述之dCHIP軟體；業內已知之徑向基礎機器學習算法(RBM))。
本發明所涵蓋之方法亦可程式化或建模於數學軟體包中，該等數學軟體包容許方程式之符號式輸入及處理之高級規範(包含擬使用具體算法)，由此使得使用者無需程序性程式化個別方程式及算法。該等軟體包包含(例如)來自Mathworks (Natick, Mass.)之Matlab、來自Wolfram Research (Champaign, Ill．)之Mathematica或來自MathSoft (Seattle, Wash.)之S-Plus。
在某些實施例中，電腦包括用於儲存生物標記物資料之資料庫。可存取該等儲存特徵且用於在後續時間點實施所關注對比。舉例而言，可儲存衍生自個體非癌性組織之試樣之生物標記物表現特徵及/或自相同物種之相關群體中所關注資訊性基因座之群體基分佈生成的特徵，且隨後與衍生自個體之癌性組織或個體之懷疑癌性組織之試樣進行比較。
除本文所闡述之實例性程式結構及電腦系統外，熟習此項技術者亦易於明瞭其他替代程式結構及電腦系統。該等替代系統並不在精神或範圍上背離上述電腦系統及程式結構，且由此意欲涵蓋於隨附申請專利範圍內。
另外，可使用本文所闡述之預後分析來測定是否可向個體投與藥劑(例如激動劑、拮抗劑、肽模擬物、多肽、肽、核酸、小分子或其他候選藥物)以治療與異常生物標記物表現或活性有關之疾病或病症。
5. 臨床效能 可藉由業內已知之任一方法來量測臨床效能。舉例而言，對癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)之反應係關於(例如)在開始新輔助或輔助化學療法之後癌症(例如腫瘤)對療法之任一反應，較佳地係關於癌細胞數量、腫瘤質量及/或腫瘤體積之變化。可在新輔助或輔助情況下評價腫瘤反應，其中可比較全身性干預後之腫瘤大小與初始大小及尺寸(如藉由CT、PET、乳房X光攝影片、超音波或觸診所量測)，且可以組織學方式估計腫瘤之細胞性並與在開始治療之前獲取之腫瘤生檢之細胞性進行比較。亦可藉由在生檢或手術切除術之後腫瘤之測徑器量測或病理學檢驗來評價反應。可以定量方式(如腫瘤體積或細胞性之變化百分比)來記錄反應，或使用半定量評分系統(例如殘餘癌症負荷(Symmans等人，J. Clin. Oncol. (2007) 25:4414-4422)或米勒 - 佩恩評分(Miller-Payne score) (Ogston等人(2003)Breast (Edinburgh, Scotland) 12:320-327))以定性方式(如「病理完全反應」 (pCR)、「臨床完全緩解」 (cCR)、「臨床部分緩解」 (cPR)、「臨床穩定疾病」 (cSD)、「臨床進展性疾病」 (cPD)或其他定性準則)來記錄。可在開始新輔助或輔助療法之後早期(例如在數小時、數天、數週之後或較佳地在數月之後)來評價腫瘤反應。反應評價之典型終點係在終止新輔助化學療法時或在手術去除殘餘腫瘤細胞及/或腫瘤床時。
在一些實施例中，可藉由量測臨床受益率(CBR)來測定本文所闡述治療性治療之臨床效能。藉由測定在自療法結束至少6個月之時間點完全緩解(CR)之患者百分比、部分緩解(PR)之患者數及患有穩定疾病(SD)之患者數的總和來量測臨床受益率。此式簡寫為CBR=超過6個月之CR+PR+SD。在一些實施例中，表1及/或表2中所列示之生物標記物之特定調節劑治療方案之CBR為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或更高。
用於評估對癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)之反應之其他準則與「存活」相關，其包含所有下列準則：至死存活，亦稱為整體存活(其中該死亡率可為任一病因或與腫瘤相關)；「無復發存活」 (其中術語復發應包含局部復發及遠端復發)；無轉移存活；無疾病存活(其中術語疾病應包含癌症及與其有關之疾病)。可藉由參照所定義起點(例如診斷或開始治療之時間)及端點(例如死亡、復發或轉移)來計算該存活之持續時間。另外，治療效能之準則可擴展至包含對化學療法之反應、存活機率、給定時間段內之轉移機率及腫瘤復發機率。
舉例而言，為測定適當臨限值，可將一或多種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之靶)之特定調節劑投與個體群體，且結果可與在投與任一癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)之前測得之生物標記物量測相關。結果量測可為對在新輔助設置中給予之療法之病理學反應。或者，可在已知生物標記物量測值之癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)後一定時間段內監測個體之結果量測(例如整體存活及無疾病存活)。在某些實施例中，向每一個體投與相同劑量之調節表1及/或表2中所列示之至少一種生物標記物之藥劑。在相關實施例中，所投與劑量係業內已知用於調節本發明所涵蓋之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之一或多種靶)之藥劑之標準劑量。監測個體之時間段可有所變化。舉例而言，可監測個體至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60個月。可使用(例如)實例部分中所闡述之方法來測定與癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一 種調節劑)之結果相關之生物標記物量測臨限值。
6. 分析生物 標記 物核酸及多肽 a.試樣收集及製備 在一些實施例中，將來自個體之試樣中之生物標記物量及/或活性量測與預定對照(標準)試樣進行比較。來自個體之試樣通常係來自患病組織(例如癌細胞或組織)。對照試樣可來自相同個體或來自不同個體。對照試樣通常係正常非患病試樣。然而，在一些實施例中，舉例而言，為對疾病分期或評估治療效能，對照試樣可來自患病組織。對照試樣可來自若干不同個體之試樣之組合。在一些實施例中，對來自個體之生物標記物量及/或活性量測與預定值進行比較。此預定值通常係自正常試樣獲得。如本文所闡述，「預定」生物標記物量及/或活性量測可為用於(僅舉例而言)以下各項之生物標記物量及/或活性量測：評估可經選擇用於治療之個體，評估對癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種生物標記物之至少一種調節劑)之反應，及/或評估對組合癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之一或多種生物標記物之至少一種調節劑與至少一種免疫療法之組合)之反應。可在患有或未患癌症之患者群體中測定預定生物標記物量及/或活性量測。預定生物標記物量及/或活性量測可為同等適用於每一患者之單一數值，或預定生物標記物量及/或活性量測可根據患者之特定亞群體有所變化。個體之年齡、體重、身高及其他因素可影響個體之預定生物標記物量及/或活性量測。另外，可個別地測定每一個體之預定生物標記物量及/或活性。在一實施例中，在本文所闡述之方法中所測定及/或比較之量係基於絕對量測。
在另一實施例中，在本文所闡述之方法中所測定及/或比較之量係基於相對量測，例如比率(例如治療前生物標記物拷貝數、含量及/或活性對治療後者、該等生物標記物量測相對於內參或人工製得對照、該等生物標記物量測相對於管家基因之表現及諸如此類)。舉例而言，相對分析可基於治療前生物標記物量測與治療後生物標記物量測相比之比率。治療前生物標記物量測可在開始癌症療法之前之任一時間進行。治療後生物標記物量測可在開始癌症療法之後之任一時間進行。在一些實施例中，治療後生物標記物量測係在開始癌症療法之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更久進行，且甚至朝向無限期更久以繼續監測。治療可包括癌症療法，例如包括表1及/或表2中所列示至少一種靶之一或多種調節劑之治療方案，該治療方案單獨使用或與其他癌症藥劑(例如免疫檢查點抑制劑)組合使用。
預定生物標記物量及/或活性量測可為任一適宜標準。舉例而言，可自評價患者選擇之相同或不同人類獲得預定生物標記物量及/或活性量測。在一實施例中，可自同一患者之先前評價獲得預定生物標記物量及/或活性量測。以此一方式，可隨時間監測患者選擇之進展。另外，若個體係人類，則可自另一人或多人(例如所選人類群組)之評價獲得對照。以此一方式，可將評價選擇之人類選擇程度與適宜其他人(例如與所關注人類處於類似情況下之其他人，例如患有類似或相同病狀及/或屬相同種族者)進行比較。
在本發明所涵蓋之一些實施例中，生物標記物量及/或活性量測自預定值之變化為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍或更大或其間之任一範圍(包含端值)。該等截止值同樣適用於在量測係基於相對變化(例如基於治療前生物標記物量測與治療後生物標記物量測相比之比率)時。
生物試樣可收集自來自患者之各種來源，包含體液試樣、細胞試樣或包括核酸及/或蛋白質之組織試樣。「體液」係指自身體排泄或分泌之液體以及通常並非自身體排泄或分泌之液體(例如 羊水、眼房水、膽汁、血液及血漿、腦脊髓液、耳垢及耵聹、考珀液(cowper’s fluid)或預射精液、乳糜、食糜、糞便、女性射液、間質液、細胞內液、淋巴液、經血、乳液、黏液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、淚液、尿、陰道潤滑性分泌物、玻璃體液、嘔吐物)。在一較佳實施例中，個體及/或對照試樣係選自由以下組成之群：細胞、細胞系、組織學切片、石蠟包埋組織、生檢、全血、乳頭抽吸液、血清、血漿、頰部刮片、唾液、腦脊髓液、尿、糞便及骨髓。在一實施例中，試樣係血清、血漿或尿。在另一實施例中，試樣係血清。
可經一定縱向時間段(例如在約數天、數週、數月、每年、每半年等一或多次)自個體重複收集試樣。經一定時間段自個體獲得諸多試樣可用於驗證來自先前檢測之結果及/或鑑別源於(例如)疾病進展、藥物治療等之生物模式變化。舉例而言，可獲取個體試樣且根據本發明每月、每兩月或以一個月、兩個月或三個月間隔之組合進行監測。另外，隨時間獲得之個體之生物標記物量及/或活性量測可便利地彼此比較以及與在監測時段期間之正常對照進行比較，由此提供個體之自身值作為用於長期監測之內部或個人對照。
端視所收集試樣類型及/或生物標記物量測之分析，試樣製備及分離可涉及任何程序。該等程序包含(藉由僅舉例而言)濃縮、稀釋、調節pH、去除高豐度多肽(例如白蛋白、γ球蛋白及轉鐵蛋白等)、添加防腐劑及校準劑、添加蛋白酶抑制劑、添加變性劑、使試樣去鹽、濃縮試樣蛋白、提取及純化脂質。
試樣製備亦可分離以非共價複合物形式結合至其他蛋白質(例如載體蛋白)之分子。此製程可分離彼等結合至特定載體蛋白(例如白蛋白)之分子，或使用較一般製程(例如經由蛋白質變性(例如使用酸)自所有載體蛋白釋放結合分子，隨後去除載體蛋白)。
可使用高親和力試劑、高分子量過濾、超離心及/或電透析自試樣去除不期望蛋白質(例如高豐度、非資訊性或不可檢測之蛋白質)。高親和力試劑包含選擇性結合至高豐度蛋白質之抗體或其他試劑(例如適配體)。試樣製備亦可包含離子交換層析、金屬離子親和力層析、凝膠過濾、疏水性層析、層析聚焦、吸附層析、等電聚焦及相關技術。分子量過濾包含基於大小及分子量分離分子之膜。該等過濾可進一步採用反滲透、奈米過濾、超濾及微過濾。
超離心係自試樣去除不期望多肽之方法。超離心係在約15,000-60,000 rpm下離心試樣，同時使用光學系統監測顆粒之沉降(或其缺乏)。電透析係使用電膜或半滲透膜之程序，在該製程中，使離子在潛在梯度之影響下自一種溶液傳輸穿過半滲透膜進入另一溶液中。因電透析中所使用之膜可能能夠選擇性傳輸具有正電荷或負電荷之離子、排斥具有相反電荷之離子或基於大小及電荷容許物質遷移穿過半滲透膜，故其使得電透析可用於濃縮、去除或分離電解質。
本發明中之分離及純化可包含業內已知之任一程序，例如毛細管電泳(例如在毛細管中或在晶片上)或層析(例如在毛細管、管柱中或在晶片上)。電泳係可用於在電場影響下分離離子型分子之方法。電泳可實施於凝膠、毛細管或晶片上之微通道中。用於電泳之凝膠之實例包含澱粉、丙烯醯胺、聚環氧乙烷、瓊脂糖或其組合。可藉由交聯、添加洗滌劑或變性劑、固定酶或抗體(親和力電泳)或受質(酶層析)及納入pH梯度來改質凝膠。用於電泳之毛細管之實例包含與電噴霧界接之毛細管。
毛細管電泳(CE)較佳用於分離複雜親水性分子及高度帶電溶質。CE技術亦可實施於微流體晶片上。端視所用毛細管及緩衝液之類型，CE可進一步分成諸如以下等分離技術：毛細管區帶電泳(CZE)、毛細管等電聚焦(CIEF)、毛細管等速電泳(cITP)及毛細管電層析(CEC)。使CE技術耦合至電噴霧離子化之一實施例涉及使用揮發性溶液，例如含有揮發性酸及/或鹼及有機物(例如醇或乙腈)之水性混合物。
毛細管等速電泳(cITP)係其中分析物以恆定速度移經毛細管但根據其各別遷移率分離之技術。毛細管區帶電泳(CZE)亦稱為自由溶液CE (FSCE)係基於物質之電泳遷移率差，該電泳遷移率差係根據分子上電荷及分子在遷移期間遇到之摩擦阻力(其通常與分子大小成正比)所測定。毛細管等電聚焦(CIEF)容許弱離子化兩性分子藉由電泳在pH梯度中分離。CEC係傳統高效液相層析(HPLC)與CE之間之混合技術。
本發明中所使用之分離及純化技術包含業內已知之任一層析程序。層析可基於微分吸附及某些分析物之洗脫或分析物在移動相與固相之間之分配。層析之不同實例包含(但不限於)液相層析(LC)、氣體層析(GC)、高效液相層析(HPLC)等。
b.分析生物標記物核酸及多肽 可根據本文所闡述之方法及熟習此項技術者已知之技術來分析生物標記物核酸及/或生物標記物多肽以鑑別可用於本發明之該等基因或表現改變，該等基因或表現改變包含(但不限於) 1)生物標記物轉錄物或多肽之含量之改變，2)自生物標記物基因缺失或添加一或多種核苷酸，4)取代一或多種核苷酸之生物標記物基因，5)生物標記物基因(例如表現調控區)之異常修飾，及諸如此類。
c.檢測拷貝數及 / 或基因體核酸突變之方法 熟習此項技術者熟知評估生物標記物核酸之拷貝數及/或基因體核酸狀態(例如突變)之方法。可簡單地藉由測定本文所鑑別區域或標記物之拷貝數來評估染色體增加或損失之存在或不存在。
在一實施例中，測試生物試樣之含有基因體標記物之基因座中之拷貝數變化的存在。在一些實施例中，表1中所列示至少一種靶之增加之拷貝數及/或表2中所列示至少一種靶之降低之拷貝數可預測癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)之較差結果。表1及/或表2中所列示至少一種靶之至少3、4、5、6、7、8、9或10之拷貝數可預測很可能對癌症療法(例如表1及/或表2中所列示之生物標記物之至少一種調節劑)具有反應。
評估生物標記物基因座之拷貝數之方法包含(但不限於)基於雜交之分析。基於雜交之分析包含(但不限於)傳統「直接探針」方法(例如南方印漬(Southern blot))、原位雜交(例如FISH及FISH + SKY)方法及「對比探針」方法(例如對比基因體雜交(CGH)，例如基於cDNA或基於寡核苷酸之CGH)。該等方法可以眾多種形式來使用，包含(但不限於)受質(例如膜或玻璃)結合方法或基於陣列之方式。
在一實施例中，評估試樣中之生物標記物基因拷貝數涉及南方印漬。在南方印漬中，使基因體DNA (通常片段化且分離於電泳凝膠上)雜交至靶區域之特異性探針。比較來自靶區域探針之雜交信號強度與來自正常基因體DNA (例如相同或相關細胞、組織、器官等之未擴增部分)之分析之對照探針信號可估計靶核酸的相對拷貝數。或者，可利用北方印漬來評估試樣中之編碼核酸之拷貝數。在北方印漬中，使mRNA雜交至靶區域之特異性探針。比較來自靶區域探針之雜交信號強度與來自正常RNA (例如相同或相關細胞、組織、器官等之未擴增部分)之分析之對照探針信號可估計靶核酸的相對拷貝數。或者，可使用業內所熟知用以檢測RNA之其他方法，從而相對於適當對照(例如相同或相關細胞、組織、器官等之未擴增部分)之較高或較低表現可估計靶核酸的相對拷貝數。
測定基因體拷貝數之替代方式係原位雜交(例如Angerer (1987)Meth. Enzymol 152: 649)。通常，原位雜交包括下列步驟：(1)固定擬分析之組織或生物結構；(2)在雜交前處理生物結構以增加靶DNA之可及性且減小非特異性結合；(3)使核酸混合物雜交至生物結構或組織中之核酸；(4)在雜交後洗滌以去除在雜交中未結合之核酸片段；及(5)檢測經雜交核酸片段。該等步驟中之每一者中所使用之試劑及所用條件端視特定應用而有所變化。在典型原位雜交分析中，使細胞固定至固體載體(通常係載玻片)上。若擬探測核酸，則通常使用熱量或鹼使細胞變性。然後使細胞與雜交溶液在中等溫度下接觸以允許編碼蛋白質之核酸序列之特異性經標記探針發生退火。然後通常以預定嚴格度下或在增加之嚴格度下洗滌靶(例如細胞)直至獲得適當信號雜訊比為止。通常(例如)使用放射性同位素或螢光報告基因標記探針。在一實施例中，探針足夠長以與靶核酸在嚴格條件下特異性雜交。探針長度通常介於約200個鹼基至約1000個鹼基之間。在一些應用中，需要阻斷重複序列之雜交能力。因此，在一些實施例中，使用tRNA、人類基因體DNA或Cot-I DNA來阻斷非特異性雜交。
測定基因體拷貝數之替代方式係對比基因體雜交。一般而言，自正常參考細胞以及測試細胞(例如腫瘤細胞)分離基因體DNA且視需要擴增。以不同方式標記兩種核酸且然後原位雜交至參考細胞之中期染色體。去除參考DNA及測試DNA中之重複序列或藉由一定方式(例如藉由使用適當阻斷核酸預雜交及/或包含在該雜交期間用於該等重複序列之該等阻斷核酸序列)減小其雜交能力。然後視需要以可視化形式呈現所結合經標記DNA序列。可藉由檢測兩種DNA信號之比率發生改變之區域來鑑別測試細胞中具有增加或降低之拷貝數的染色體區域。舉例而言，與基因體之其他區域相比，測試細胞中拷貝數有所降低之彼等區域所展示來自測試DNA之信號相對而言低於參考。測試細胞中拷貝數有所增加之區域將展示相對較高之來自測試DNA之信號。在存在染色體缺失或增加之情形下，檢測到來自兩種標記之信號之比率之差異且該比率將提供拷貝數之量度。在CGH之另一實施例(陣列CGH (aCGH))中，使用位於陣列上之結合固體載體之靶核酸之集合體代替經固定染色體元件，從而容許較大或全部百分比之基因體由結合固體載體之靶之集合體代表。靶核酸可包括cDNA、基因體DNA、寡核苷酸(例如用以檢測單一核苷酸多型性)及諸如此類。亦可使用單色標記實施基於陣列之CGH (與之相比，可使用兩種不同染料標記對照及可能腫瘤試樣且在雜交之前將其混合，此將產生由陣列上之探針之競爭性雜交所致之比率)。在單色CGH中，標記對照並雜交至一個陣列且讀取絕對信號，且標記可能腫瘤試樣並雜交至第二陣列(使用相同程度)並讀取絕對信號。基於來自兩個陣列之絕對信號來計算拷貝數差。製備固定染色體或陣列並實施對比基因體雜交之方法為業內所熟知(例如參見美國專利第6,335,167號、第6,197,501號、第5,830,645號及第5,665,549號及Albertson (1984)EMBO J . 3:1227-1234；Pinkel (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9138-9142；歐洲專利公開案第430,402號；Methods in Molecular Biology ，第33卷:In situ Hybridization Protocols, Choo編輯，Humana Press, Totowa, N.J. (1994)，等等)。在另一實施例中，使用Pinkel等人(1998)Nat. Genet. 20:207-211或Kallioniemi (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5321-5325 (1992)之雜交方案。
在再一實施例中，可使用基於擴增之分析來量測拷貝數。在該基於擴增之分析中，核酸序列用作擴增反應(例如聚合酶鏈反應(PCR)中之模板。在定量擴增中，擴增產物之量與原始試樣中之模板量成正比。與適當對照(例如健康組織)進行比較可提供拷貝數之量度。
熟習此項技術者已熟知「定量」擴增之方法。舉例而言，定量PCR涉及使用相同引子同時共擴增已知量之控制序列。此提供可用於校準PCR反應之內部標準。用於定量PCR之詳細方案提供於Innis等人(1990) PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications , Academic Press, Inc. N.Y.)中。使用定量PCR分析來量測微衛星基因座處之DNA拷貝數已闡述於Ginzonger等人(2000)Cancer Res. 60:5405-5409中。基因之已知核酸序列足以使得熟習此項技術者能夠以常規方式選擇引子來擴增基因之任一部分。螢光定量PCR亦可用於本發明所涵蓋之方法中。在螢光定量PCR中，量化係基於螢光信號(例如TaqMan及SYBR綠)之量。
其他適宜擴增方法包含(但不限於)連接酶鏈反應(LCR) (參見Wu及Wallace (1989)Genomics 4:560，Landegren等人(1988)Science 241:1077，及Barringer等人(1990)Gene 89:117)、轉錄擴增(Kwoh等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173)、自持續序列複製(Guatelli等人(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874)、點PCR及連接體適配體PCR等。
亦可使用雜合性損失(LOH)及主要拷貝比例(MCP)定位(Wang等人(2004)Cancer Res. 64:64-71；Seymour等人(1994)Cancer Res. 54:2761-2764；Hahn等人(1995)Cancer Res. 55:4670-4675；Kimura等人(1996)Genes Chromosomes Cancer 17:88-93；Li等人(2008)MBC Bioinform. 9:204-219)以鑑別擴增或缺失之區域。
d.檢測生物標記物核酸表現之方法 可藉由眾多種用於檢測經轉錄分子或蛋白質之表現之熟知方法中之任一者來評價生物標記物表現。該等方法之非限制性實例包含用於檢測分泌、細胞表面、細胞質或核蛋白之免疫學方法、蛋白質純化方法、蛋白質功能或活性分析、核酸雜交方法、核酸逆轉錄方法及核酸擴增方法。
在較佳實施例中，藉由所量測基因轉錄物(例如mRNA)、所量測轉譯蛋白之量或所量測基因產物活性來表徵特定基因之活性。可以各種方式來監測標記物表現，包含藉由檢測mRNA含量、蛋白質含量或蛋白質活性，其中之任一者可使用標準技術來量測。檢測可涉及量化基因表現程度(例如基因體DNA、cDNA、mRNA、蛋白質或酶活性)，或替代地，可定性評價基因表現程度(尤其與對照程度相比)。所檢測程度類型自上下文顯而易見。
在另一實施例中，檢測或測定生物標記物及其功能類似同系物(包含其片段或基因改變，例如在其調控或啟動子區域中)之表現程度包括檢測或測定所關注標記物之RNA含量。在一實施例中，獲得來自個體之一或多種擬測試細胞且自細胞分離RNA。在一較佳實施例中，自個體獲得乳房組織細胞之試樣。
在一實施例中，自單一細胞獲得RNA。舉例而言，可藉由雷射捕獲顯微切割(LCM)自組織試樣分離細胞。使用此技術，可來自組織切片(包含經染色組織切片)分離細胞，由此確保期望細胞得以分離(例如參見Bonner等人(1997)Science 278:1481；Emmert-Buck等人(1996)Science 274:998；Fend等人(1999)Am. J. Path. 154: 61；及Murakami等人(2000)Kidney Int. 58:1346)。舉例而言，Murakami等人(見上文)闡述自先前經免疫染色之組織切片分離細胞。
亦可自個體獲得細胞且在活體外培養細胞以(例如)獲得可提取RNA之較大細胞群體。業內已知確立非轉變細胞之培養物(亦即原代細胞培養物)之方法。
在自來自個體之組織試樣或細胞分離RNA時，在已自個體取出組織或細胞之後防止基因表現發生任何進一步變化可能較為重要。已知表現程度之變化在擾動(例如熱激或使用脂多醣(LPS)或其他試劑活化)後會快速變化。另外，組織及細胞中之RNA可迅速變得降解。因此，在一較佳實施例中，儘可能將自個體獲得之組織或細胞速凍。
可藉由各種方法自組織試樣提取RNA，例如實施硫氰酸胍裂解且隨後實施CsCl離心(Chirgwin等人(1979)Biochem. 18:5294-5299)。可如自單一細胞製備cDNA庫之方法中所闡述來獲得來自單一細胞之RNA，如Dulac (1998)Curr. Top. Dev. Biol. 36:245及Jena等人(1996)J. Immunol. Methods 190:199中所闡述。必須(例如)藉由納入RNA來確保避免RNA降解。
然後可使RNA試樣富集於特定物質中。在一實施例中，自RNA試樣分離聚(A)+ RNA。一般而言，該純化利用了mRNA上之聚A尾部。特定而言且如上所述，可將聚T寡核苷酸固定於固體載體內以用作mRNA之親和力配體。用於此目的之套組市面有售，例如MessageMaker套組(Life Technologies, Grand Island, NY)。
在一較佳實施例中，使RNA群體富集於標記物序列中。可(例如)藉由引子特異性cDNA合成或多輪基於cDNA合成之線性擴增及模板定向性活體外轉錄來實施富集(例如參見Wang等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 9717；Dulac等人(見上文)；及Jena等人(見上文))。
可進一步擴增富集或未富集於特定物質或序列中之RNA群體。如本文中所定義，設計「擴增過程」以增強、增加或增大RNA內之分子。舉例而言，在RNA係mRNA之情形下，可利用擴增過程(例如RT-PCR)來擴增mRNA，從而信號可檢測或增強檢測。此一擴增過程較為有益，尤其在生物、組織或腫瘤試樣具有較小大小或體積時。
Various擴增及檢測方法可使用。舉例而言，本發明範圍內涵蓋將mRNA逆轉錄成cDNA且隨後實施聚合酶鏈反應(RT-PCR)；或在兩個步驟中使用單一酶，如美國專利第5,322,770號中所闡述；或將mRNA逆轉錄成cDNA且隨後實施對稱間隙連接酶鏈反應(RT-AGLCR)，如由Marshall等人(1994)PCR Methods Appls. 4:80-84所闡述。亦可使用實時PCR。
可用於本文中之其他已知擴增方法包含(但不限於)所謂的「NASBA」或「3SR」技術，如Guatelli等人(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878中所闡述亦及Compton等人(1991)Nature 350:91-92中所闡述；Q-β擴增，如歐洲專利公開案第4544610號中所闡述；鏈置換擴增，如Walker等人(1996)Clin. Chem. 42:9-13及歐洲專利公開案第684315號中所闡述；靶調介之擴增，如由PCT公開案第WO 93/22461號所闡述；PCR；連接酶鏈反應(LCR) (例如參見Wu及Wallace (1989)Genomics 4:560；Landegren等人(1988)Science 241:1077)；自持續序列複製(SSR) (例如參見Guatelli等人(1990)Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874)；及轉錄擴增(例如參見Kwoh等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173)。
業內已知許多用於測定基因表現之絕對及相對程度之技術，適用於本發明中之常用技術包含北方分析(Northern analysis)、RNase保護分析(RPA)、微陣列及基於PCR之技術(例如定量PCR及差異顯示PCR)。舉例而言，北方印漬涉及在變性瓊脂糖凝膠上製備RNA，且將其轉移至適宜載體(例如活化纖維素、硝基纖維素或玻璃或耐綸(nylon)膜)中。然後使經放射性標記之cDNA或RNA雜交至該製劑，洗滌且藉由自動射線攝影術進行分析。
亦可採用原位雜交可視化，其中使經放射性標記之反義RNA探針與生檢試樣之薄切片雜交，洗滌，使用RNase裂解且暴露於敏感乳液以實施自動射線攝影術。可使用蘇木素(hematoxylin)將試樣染色以證實試樣之組織學組成，且使用適宜濾光器之暗視場成像展示顯影乳液。亦可使用非放射性標記，例如地高辛(digoxigenin)。
或者，可在DNA陣列、晶片或微陣列上檢測mRNA表現。可使自個體獲得之測試試樣之經標記核酸雜交至包括生物標記物DNA之固體表面。使用含有生物標記物轉錄物之試樣獲得正雜交信號。製備DNA陣列之方法及其用途為業內所熟知(例如參見美國專利第6,618,6796號、第6,379,897號、第6,664,377號、第6,451,536號及第6,548,257號；美國專利公開案第2003/0157485；號及Schena等人(1995)Science 20:467-470；Gerhold等人(1999)Trends Biochem. Sci. 24:168-173；及Lennon等人(2000)Drug Discovery Today 5:59-65)。亦可實施基因表現系列分析(SAGE) (例如參見美國專利公開案第2003/0215858號)。
為監測mRNA含量，舉例而言，自擬測試生物試樣提取mRNA，逆轉錄，且生成經螢光標記之cDNA探針。然後使用經標記cDNA探針探測能夠雜交至標記物cDNA之微陣列，掃描載玻片且量測螢光強度。此強度與雜交強度及表現程度相關。
可用於本文所闡述方法中之探針類型包含cDNA、核糖探針、合成寡核苷酸及基因體探針。所用探針類型通常取決於特定情況，例如用於原位雜交之核糖探針及用於北方印漬之cDNA。在一實施例中，探針係關於RNA之獨特核苷酸區域。探針可視需要較短以差異性識別標記物mRNA轉錄物，且可短至(例如) 15個鹼基；然而，可使用具有至少17、18、19或20個或更多個鹼基之探針。在一實施例中，引子及探針在嚴格條件下特異性雜交至具有對應於標記物之核苷酸序列之DNA片段。如本文中所使用，術語「嚴格條件」意指雜交僅發生於核苷酸序列具有至少95%一致性時。在另一實施例中，在「嚴格條件」下雜交發生於序列之間具有至少97%一致性時。
標記探針之形式可為任一適當者，例如使用放射性同位素(例如32 P及35 S)。可使用放射性同位素進行標記，是否探針係以化學方式抑或生物方式藉由使用經適宜標記之鹼基所合成。
在一實施例中，生物試樣含有來自測試個體之多肽分子。或者，生物試樣可含有來自測試個體之mRNA分子或來自測試個體之基因體DNA分子。
在另一實施例中，該等方法進一步涉及自對照個體獲得對照生物試樣，使對照試樣與能夠檢測標記物多肽、mRNA、基因體DNA或其片段之化合物或藥劑接觸，從而在生物試樣中檢測標記物多肽、mRNA、基因體DNA或其片段之存在，且比較對照試樣中之標記物多肽、mRNA、基因體DNA或其片段之存在與測試試樣中之標記物多肽、mRNA、基因體DNA或其片段之存在。
e.檢測生物標記物蛋白表現之方法 可藉由檢測或量化所表現多肽來檢測及/或量化生物標記物蛋白之活性或含量。可藉由熟習此項技術者所熟知之諸多方式中之任一者來檢測及量化多肽。由生物標記物核酸及其功能類似同系物(包含其片段或基因改變，例如在其調控或啟動子區域中)所編碼多肽之多肽表現之異常程度與癌症對T細胞介導之細胞毒性調節劑(單獨或與免疫療法治療組合)的反應可能性有關。可使用業內已知用於檢測多肽之任一方法。該等方法包含(但不限於)免疫擴散、免疫電泳、放射性免疫分析(RIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、免疫螢光分析、西方印漬、結合劑-配體分析、免疫組織化學技術、凝集、補體分析、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析及諸如此類(例如Basic and Clinical Immunology, Sites及Terr編輯，Appleton and Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991)。較佳者係結合劑-配體免疫分析方法，其包含使抗體與一或多個表位進行反應且競爭性置換其經標記多肽或衍生物。
舉例而言，可實施ELISA及RIA程序，從而標記 (使用放射性同位素(例如125 I或35 S)或可分析酶(例如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶))期望生物標記物蛋白標準物，且與未標記試樣一起與相應抗體接觸，其中使用第二抗體結合第一抗體，且分析放射性或經固定酶(競爭性分析)。或者，使試樣中之生物標記物蛋白與相應經固定抗體進行反應，使經放射性同位素或酶標記之抗生物標記物蛋白抗體與該系統進行反應，且分析放射性或酶(ELISA-夾心式分析)。亦可視需要採用其他習用方法。
上述技術可基本上實施為「單步驟」或「兩步驟」分析。「單步驟」分析涉及使抗原與經固定抗體接觸且在不洗滌下使混合物與經標記抗體接觸。「兩步驟」分析涉及在使混合物與經標記抗體接觸之前進行洗滌。亦可視需要採用其他習用方法。
在一實施例中，量測生物標記物蛋白含量之方法包括以下步驟：使生物樣品與選擇性結合生物標記物蛋白之抗體或其變體(例如片段)接觸，及檢測該抗體或其變體是否結合至該試樣且由此量測生物標記物蛋白之含量。
可藉由習用方式來酶促及放射性標記生物標記物蛋白及/或抗體。該方式通常包含(例如)藉由戊二醛使酶特異性共價連接至所論述抗原或抗體以並不不利地影響酶活性，此意指酶必須仍能夠與其受質相互作用，但無需所有酶皆具有活性，條件係足夠酶保持活性以允許實現分析。實際上，用於結合酶之一些技術係非特異性(例如使用甲醛)，且僅產生一部分活性酶。
通常期望將分析系統之一種組分固定於載體上，由此容許系統之其他組分與該組分接觸且易於無需費力及耗時之工作即可去除。可遠離第一相固定第二相，但一種相通常足矣。
可使酶本身固定至載體上，但若需要固相酶，然後此通常係藉由結合至抗體且使抗體附著至載體來最佳地達成，其模型及系統為業內所熟知。簡單聚乙烯可提供適宜載體。
可用於標記之酶並無特定限制，但可選自(例如)氧化酶群組之成員。該等酶藉由與其受質進行反應來催化產生過氧化氫，且因良好穩定性、便利可用性及廉價性以及其受質(葡萄糖)之隨時可用性而通常使用葡萄糖氧化酶。可藉由量測在使酶標記抗體與受質在業內熟知之受控條件下反應之後形成之過氧化氫的濃度來分析氧化酶活性。
可使用其他技術根據從業人員之偏好基於本發明來檢測生物標記物蛋白。一種該技術係西方印漬(Towbin等人(1979)Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A 76:4350)，其中在SDS-PAGE凝膠上運行經適宜處理之試樣，然後轉移至固體載體(例如硝基纖維素濾膜)上。然後使抗-生物標記物蛋白抗體(未標記)與載體接觸且藉由二級免疫學試劑(例如經標記蛋白質A或抗免疫球蛋白，適宜標記包含125 I、辣根過氧化物酶及鹼性磷酸酶)進行分析。亦可使用層析檢測。
可使用免疫組織化學來檢測(例如)生檢試樣中之生物標記物蛋白之表現。使適宜抗體與(例如)細胞薄層接觸，洗滌，且然後與第二經標記抗體接觸。可藉由螢光標記物、酶(例如過氧化物酶)、抗生物素蛋白或放射性標記進行標記。使用顯微術對分析進行目測評分。
抗生物標記物蛋白抗體(例如細胞內抗體)亦可用於成像目的以(例如)檢測個體細胞及組織中之生物標記物蛋白之存在。適宜標記包含放射性同位素(碘(125 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(112 In)及鍀(99 mTc))、螢光標記(例如螢光黃及玫瑰紅)及生物素。
對於活體內成像目的而言，抗體本身不可自身體外部檢測到，且由此必須進行標記或以其他方式修飾以允許檢測。用於此目的之標記物可為任一不實質上干擾抗體結合但容許外部檢測者。適宜標記物可包含可藉由X-射線攝影術、NMR或MRI檢測者。對於X-射線攝影術技術而言，舉例而言，適宜標記物包含任一發射可檢測輻射但並不明顯危害個體之放射性同位素(例如鋇或銫)。用於NMR及MRI之適宜標記物通常包含具有可檢測特徵性自旋者(例如氘)，其可(例如)藉由適宜地標記相關雜交瘤之營養物來納入抗體中。
個體大小及所用成像系統將決定產生診斷影像所需之成像部分之量。在放射性同位素部分之情形下，對於人類個體而言，所注射放射性之量通常介於約5毫居裡鍀-99至20毫居裡鍀-99之間。經標記抗體或抗體片段然後優先累積於含有生物標記物蛋白之細胞位置。可然後使用已知技術檢測經標記抗體或抗體片段。
可用於檢測生物標記物蛋白之抗體包含足夠強烈且特異性地結合至擬檢測生物標記物蛋白之任一抗體，不論係天然抑或合成、全長抑或其片段、單株抑或多株。抗體可具有至多約10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或10-12 M之Kd 。片語「特異性結合」係指(例如)抗體以如下方式結合至表位或抗原或抗原決定子：該結合可經具有相同或類似表位、抗原或抗原決定子之第二製劑代替或與其競爭。抗體可相對於其他蛋白質(例如相關蛋白質)優先結合至生物標記物蛋白。
抗體市面有售或可根據業內已知方法來製備。
在一些實施例中，使用除抗體外之特異性結合至生物標記物蛋白之藥劑，例如肽。可藉由業內已知之任一方式來鑑別特異性結合至生物標記物蛋白之肽。舉例而言，可使用肽噬菌體顯示庫來篩選生物標記物蛋白之特異性肽結合劑。
f.檢測生物標記物結構改變之方法 可使用下列闡釋性方法來鑑別生物標記物核酸及/或生物標記物多肽分子中之結構改變之存在以(例如)鑑別影響癌細胞之T細胞介導之殺死的序列或藥劑。
在某些實施例中，檢測改變涉及在聚合酶鏈反應(PCR) (例如參見美國專利第4,683,195號及第4,683,202號，例如錨PCR或RACE PCR)中或替代地在連接鏈反應(LCR) (例如參見 Landegran等人(1988)Science 241:1077-1080；及Nakazawa等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:360-364)中使用探針/引子，後者可尤其可用於檢測生物標記物核酸(例如生物標記物基因)中之點突變(參見Abravaya等人(1995)Nucl. Acids Res. 23:675-682)。此方法可包含以下步驟：自個體收集細胞試樣，自試樣之細胞分離核酸(例如基因體、mRNA或二者)，使核酸試樣與一或多個在生物標記物基因(若存在)發生雜交及擴增之條件下特異性雜交至生物標記物基因之引子接觸，及檢測擴增產物之存在或不存在，或擴增產物之檢測大小且將長度與對照試樣進行比較。預計可期望聯合使用PCR及/或LCR (作為初步擴增步驟)與用於檢測本文所闡述突變之任一技術。
替代擴增方法包含：自持續序列複製(Guatelli等人(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi等人(1988)Biotechnol. 6:1197)或任一其他核酸擴增方法，隨後使用熟習此項技術者熟知之技術檢測擴增分子。該等檢測方案尤其可用於檢測核酸分子(若該等分子以極低數量存在)。
在一替代實施例中，可藉由限制性酶裂解模式之改變來鑑別來自試樣細胞之生物標記物核酸中之突變。舉例而言，分離試樣及對照DNA，擴增(視情況)，使用一或多種限制性內核酸酶消解，且藉由凝膠電泳測定片段長度大小並加以比較。試樣與對照DNA之間之片段長度大小之差異指示試樣DNA中的突變。此外，可使用序列特異性核酶(例如參見美國專利第5,498,531號)藉由產生或損失核酶裂解位點來對特異性突變之存在進行評分。
在其他實施例中，可藉由使試樣及對照核酸(例如DNA或RNA)雜交至含有數百或數千寡核苷酸探針之高密度陣列來鑑別生物標記物核酸中之基因突變(Cronin等人(1996)Hum. Mutat. 7:244-255；Kozal等人(1996)Nat. Med. 2:753-759)。舉例而言，可在含有光生成DNA探針之二維陣列中鑑別生物標記物基因突變，如Cronin等人(1996) (見上文)中所闡述。簡言之，可使用探針之第一雜交陣列掃描穿過試樣及對照中之長DNA片段以藉由製備順序、重疊探針之線性陣列來鑑別序列間的鹼基變化。此步驟容許鑑別點突變。在此步驟之後使用第二雜交陣列，其容許藉由使用與所檢測所有變體或突變互補之較小特殊探針陣列來表徵特異性突變。每一突變陣列係由平行探針組構成，一組與野生型基因互補且另一組與突變體基因互補。可在各種背景(包含(例如)種系突變及體細胞突變)中鑑別該等生物標記物基因突變。
在又一實施例中，可使用業內已知之各種測序反應中之任一者來直接對生物標記物基因測序且藉由比較試樣生物標記物之序列與相應野生型(對照)序列來檢測突變。對反應測序之實例包含基於由Maxam及Gilbert (1977)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:560或Sanger (1977)Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 74:5463研發之技術者。亦預計，可在實施診斷分析(Naeve (1995)Biotechniques 19:448-53)時利用各種自動化測序程序中之任一者，包含藉由質譜進行測序(例如參見 PCT公開案第WO 94/16101號；Cohen等人(1996)Adv. Chromatogr. 36:127-162；及Griffin等人(1993)Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159)。
檢測生物標記物基因中之突變之其他方法包含使用裂解劑保護來檢測RNA/RNA或RNA/DNA異源雙鏈體中之失配鹼基的方法(Myers等人(1985)Science 230:1242)。一般而言，「失配裂解」之業內技術始於提供藉由使用自組織試樣獲得之潛在突變體RNA或DNA雜交(標記)含有野生型生物標記物序列之RNA或DNA所形成之異源雙鏈體。使用裂解雙鏈體之單鏈區域(例如因對照與試樣鏈之間之鹼基對失配而存在者)之試劑處理雙鏈雙鏈體。舉例而言，可使用RNase處理RNA/DNA雙鏈體且使用SI核酸酶處理DNA/DNA雜合體來以酶促方式消解失配區域。在其他實施例中，可使用羥基胺或四氧化鋨及使用六氫吡啶來處理DNA/DNA或RNA/DNA雙鏈體以消解失配區域。在消解失配區域之後，然後根據大小在變性聚丙烯醯胺凝膠上分離所得材料以測定突變位點。例如參見Cotton等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4397及Saleeba等人(1992)Methods Enzymol. 217:286-295。在一較佳實施例中，可標記對照DNA或RNA以用於檢測。
在再一實施例中，失配裂解反應在界定系統中採用一或多種識別雙鏈DNA中之失配鹼基對之蛋白質(所謂的「DNA失配修復」酶)來檢測及定位自細胞試樣獲得之生物標記物中的cDNA點突變。舉例而言，大腸桿菌之mutY酶裂解G/A失配處之A且來自HeLa細胞之胸苷DNA醣苷酶裂解G/T失配處之T (Hsu等人(1994)Carcinogenesis 15:1657-1662)。根據一實例性實施例，可使用電泳方案或諸如此類來檢測基於生物標記物序列(例如經DNA失配修復酶處理之野生型生物標記物)之探針及裂解產物(若存在) (例如美國專利第5,459,039號)。
在其他實施例中，可使用電泳遷移率之改變來鑑別生物標記物基因中之突變。舉例而言，可使用單鏈構形多型性(SSCP)來檢測突變體與野生型核酸之間之電泳遷移率差(Orita等人(1989)Proc Natl. Acad. Sci U.S.A. 86:2766；Cotton (1993)Mutat. Res. 285:125-144；Hayashi (1992)Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79)。使試樣及對照生物標記物核酸之單鏈DNA片段變性且使其複性。單鏈核酸之二級結構隨序列有所變化，電泳遷移率之所得改變使得能夠檢測甚至單一鹼基變化。可使用經標記探針來標記或檢測DNA片段。可藉由使用RNA (而非DNA)來增強分析敏感性，其中二級結構對序列變化較為敏感。在一較佳實施例中，標的方法利用異源雙鏈體分析基於電泳遷移率之變化來分離雙鏈異源雙鏈體分子(Keen等人(1991)Trends Genet. 7:5)。
在又一實施例中，使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)來分析突變體或野生型片段在含有變性劑梯度之聚丙烯醯胺凝膠中之移動(Myers等人(1985)Nature 313:495)。在使用DGGE作為分析方法時，藉由(例如)使用PCR添加大約40 bp高熔點富GC DNA之GC鉗來修飾DNA以確保其不完全變性。在另一實施例中，使用溫度梯度代替變性梯度以鑑別對照及試樣DNA之遷移率差(Rosenbaum及Reissner (1987)Biophys. Chem. 265:12753)。
用於檢測點突變之其他技術之實例包含(但不限於)選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴增或選擇性引子延伸。舉例而言，可製備在中心引入已知突變之寡核苷酸引子且然後在僅在發現完美匹配時允許雜交之條件下雜交至靶DNA (Saiki等人(1986)Nature 324:163；Saiki等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6230)。在該等等位基因特異性寡核苷酸附接至雜交膜並與經標記靶DNA雜交時，該等寡核苷酸雜交至經PCR擴增之靶DNA或諸多不同突變。
或者，依賴於選擇性PCR擴增之等位基因特異性擴增技術可與本發明聯合使用。用作特異性擴增之引子之寡核苷酸可在以下位置攜載所關注突變：分子中心(從而擴增取決於差異雜交) (Gibbs等人(1989)Nucleic Acids Res. 17:2437-2448)；或一個引子之末端3'端，其中在適當條件下可防止失配或減小聚合酶延伸(Prossner (1993)Tibtech. 11:238)。另外，可期望在突變區域中引入新穎限制位點以進行基於裂解之檢測(Gasparini等人(1992)Mol. Cell Probes 6:1)。預計在某些實施例中亦可使用用於擴增之Taq連接酶來實施擴增(Barany (1991)Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88:189)。在該等情形下，連接僅發生於在5'序列之3'端存在完美匹配時，從而使得可藉由尋找擴增之存在或不存在來檢測在特定位點處已知突變之存在。
Ⅵ . 組合物 ， 包含調配物及醫藥組合物 涵蓋(但不限於)包括本發明所涵蓋之藥劑之組合物。舉例而言，涵蓋基於核酸之組合物(例如信使RNA (mRNA)、cDNA、siRNA、反義核酸、寡核苷酸、核酶、DNA酶、適配體、核酸誘餌、核酸嵌合體、三重螺旋結構等)、基於蛋白質之組合物、基於細胞之組合物以及其變體、修飾及改造形式以用於本文所闡述之方法且涵蓋組合物本身。在一些實施例中，本發明涵蓋具有有義鏈核酸序列及反義鏈核酸序列(其各自選自本文所闡述之序列以及其序列變體及/或化學修飾形式)之siRNA分子且詳細闡述於上文中。在一些實施例中，如本文所闡述修飾之細胞(例如單核球及/或巨噬細胞)具有經調節發炎表型。
該等組合物可包括於醫藥組合物及/或調配物內。可藉由已知或將來研發於藥理學技術中之任一方法來製備該等組合物。一般而言，該等製備方法包含以下步驟：使藥劑(例如活性成分)與賦形劑及/或一或多種其他輔助成分混合，且然後視需要及/或在期望時使產物成型及/或包裝為期望單一或多劑量單元。如本文中所使用，術語「活性成分」係指在暴露時於人類或動物中具有生理學效應之任一化學及生物物質。在本發明所涵蓋之背景中，調配物中之活性成分可為任一調節本發明所涵蓋之生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)之藥劑。
1. 組合物製備 本發明之組合物可以散裝、作為單一單位劑量及/或作為複數個單一單位劑量來製備、包裝及/或出售。如本文中所使用，「單位劑量」係包括預定量之活性成分之醫藥組合物之離散量。活性成分之量通常等於將向個體投與之活性成分之劑量及/或此一劑量之便捷分率(例如此一劑量之二分之一或三分之一)。
術語「醫藥上可接受」係指彼等在合理醫學判斷範圍內適於與人類及動物之組織接觸使用而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症且與合理益處/風險比相應之藥劑、材料、組合物及/或劑型。
本發明所涵蓋之醫藥組合物可呈現為無水醫藥調配物及劑型、液體醫藥調配物、固體醫藥調配物、疫苗及諸如此類。適宜液體製劑可包含(但不限於)緩衝至所選pH之等滲水溶液、懸浮液、乳液或黏性組合物。
如下文所詳述，可以特別方式調配本發明所涵蓋之藥劑及其他組合物以供以固體或液體形式投與，該等投與形式包含適於諸如以下等各種投與途徑者：(1)經口投與，例如獸用頓服藥(水性或非水性溶液或懸浮液)、錠劑、大丸劑、粉劑、粒劑、糊劑；(2)非經腸投與，例如皮下、肌內、靜脈內或硬膜外注射(例如)無菌溶液或懸浮液；(3)局部施加，例如以乳膏、軟膏或噴霧劑形式施加至皮膚；(4)經陰道內或經直腸內投與，例如陰道栓劑、乳膏或發泡劑；或(5)含有化合物之氣溶膠(例如呈水性氣溶膠形式)、脂質體製劑或固體顆粒。涵蓋用於本文所闡述之藥劑或組合物之任一適當形狀因子，例如(但不限於)錠劑、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。
本發明所涵蓋之醫藥組合物可呈現為離散劑型，例如膠囊、藥袋或錠劑或液體或氣溶膠噴霧劑(各自含有預定量之呈粉劑或粒劑形式之活性成分)、溶液或懸浮液(於水性或非水性液體中)、水包油型乳液、油包水型液體乳液、重構用粉劑、口服粉劑、瓶(包含粉劑或液體瓶)、經口溶解膜、菱形錠劑、膏、管、膠及包裝。該等劑型可藉由任一藥學方法來製備。
可藉由壓縮或模製來製備錠劑，其視情況含有一或多種輔助成分。壓縮錠劑可使用黏合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥乙酸澱粉鈉或交聯羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑來製備。模製錠劑可藉由在適宜機器中模製經惰性液體稀釋劑濕潤之粉末狀肽或肽模擬物之混合物來製得。
可視情況使用包衣及包殼(例如腸溶包衣及醫藥調配領域中熟知之其他包衣)刻痕或製備錠劑及其他固體劑型(例如糖衣錠、膠囊、丸劑及粒劑)。以不同比例使用(例如)提供期望釋放特徵之羥丙基甲基纖維素、其他聚合物基質、脂質體及/或微球體，其亦可經調配以提供其中活性成分之緩慢或受控釋放。其可藉由(例如)經由細菌截留過濾器過濾或藉由納入滅菌劑來滅菌，該等滅菌劑呈無菌固體組合物形式，可在即將使用前將其溶於無菌水或一些其他無菌可注射介質中。該等組合物亦可視情況含有遮光劑且亦可為視情況以延遲方式僅(或優先)在胃腸道之某一部分中釋放活性成分的組合物。可使用之包埋組合物之實例包含聚合物質及蠟。若適宜，則活性成分亦可呈含有一或多種賦形劑之微囊封形式。
在用於經口投與之固體劑型(膠囊、錠劑、丸劑、糖衣錠、粉劑、粒劑及諸如此類)中，可將活性成分與一或多種醫藥上可接受之載劑(例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣)及/或以下中之任一者混合：(1)填充劑或增量劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或矽酸；(2)黏合劑，例如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯啶酮、蔗糖及/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；(5)緩溶劑，例如石蠟；(6)吸收加速劑，例如四級銨化合物；(7)潤濕劑，例如乙醯醇及甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，例如高嶺土及膨潤土；(9)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；及(10)著色劑。在膠囊、錠劑及丸劑之情形下，醫藥組合物亦可包括緩衝劑。在使用諸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇及諸如此類等賦形劑之軟質及硬質填充明膠膠囊中，亦可使用類似類型之固體組合物作為填充劑。
用於經口投與之液體劑型包含醫藥上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性成分外，該等液體劑型亦可含有業內常用之惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、增溶劑及乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特定而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇及山梨醇酐脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物亦可包含佐劑，例如潤濕劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、芳香劑及防腐劑。除活性劑外，懸浮液亦可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及山梨醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂-瓊脂及磺蓍膠及其混合物。
用於直腸或陰道投與之調配物可作為栓劑呈遞，該栓劑可藉由將一或多種藥劑與一或多種適宜非刺激性賦形劑或載劑(包括(例如)可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽)混合來製備，且該栓劑在室溫下為固體，但在體溫下為液體，且由此將在直腸或陰道腔中融化並釋放活性劑。
適於陰道投與之調配物亦包含含有業內已知適當之該等載劑之子宮托、陰道塞(tampon)、乳霜、凝膠、膏糊、泡沫或噴霧劑調配物。
用於局部或經皮投與調節(例如抑制)生物標記物表現及/或活性之藥劑之劑型包含粉劑、噴霧劑、軟膏、膏糊、乳霜、洗劑、凝膠、溶液、貼劑及吸入劑。可在無菌條件下將該活性組分與醫藥上可接受之載劑且與任何可需要之防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。
除藥劑外，軟膏劑、糊劑、乳膏及凝膠可含有賦形劑，例如動物及植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨潤土、矽酸、滑石粉及氧化鋅或其混合物。
除調節(例如抑制)生物標記物表現及/或活性之藥劑外，粉劑及噴霧劑亦可含有賦形劑，例如乳糖、滑石粉、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉劑或該等物質之混合物。噴霧劑可另外含有常規推進劑，例如氯氟烴類及未經取代之揮發性烴類，例如丁烷及丙烷。
可藉由氣溶膠投與藥劑。此可藉由製備含有該化合物之水性氣溶膠、脂質體製劑或固體顆粒來達成。可使用非水性(例如氟碳推進劑)懸浮液。音波霧化器較佳，此乃因其使藥劑在可使得化合物降解之剪切中之暴露降至最低。
通常，藉由將藥劑之水溶液或懸浮液與習用醫藥上可接受之載劑及穩定劑調配在一起來製得水性氣溶膠。載劑及穩定劑隨特定化合物之需要而變，但通常包含非離子型表面活性劑(吐溫(Tween)、普朗尼克(Pluronic)或聚乙二醇)、無害蛋白質(如血清白蛋白)、山梨醇酐酯、油酸、卵磷脂、胺基酸(例如甘胺酸)、緩衝劑、鹽、糖或糖醇。氣溶膠通常係自等滲溶液製備。
經皮貼劑之額外優點係將藥劑受控遞送至身體中。該等劑型可藉由將該藥劑溶解或分散於適當介質中來製得。亦可使用吸收促進劑來增加肽模擬物之跨皮膚通量。此通量之速率可藉由提供速率控制膜或將肽模擬物分散於聚合物基質或凝膠中來加以控制。
眼部調配物、眼用軟膏、粉劑、溶液及諸如此類亦涵蓋於本發明範圍內。
在一些實施例中，將本發明所涵蓋之醫藥組合物調配成非經腸劑型。非經腸調配物可為含有載劑或賦形劑(例如鹽、碳水化合物及緩衝劑(例如在3至9之pH下))之水溶液；或無菌非水性溶液，或乾燥形式，其可與適宜媒劑(例如無菌無熱原水)聯合使用。舉例而言，本發明所涵蓋治療劑之水溶液包括等滲鹽水、5%葡萄糖或其他醫藥上可接受之液體載劑(例如液體醇、二醇、酯及醯胺)，例如如美國專利第7,910,594號中所揭示。在另一實例中，本發明所涵蓋治療劑之水溶液包括用於靜脈內投與之磷酸鹽緩衝調配物(pH 7.4)，如PCT公開案第WO 2011/014821號中所揭示。非經腸劑型可呈包括本發明所涵蓋治療劑之劑量之可重構凍乾物之形式。可利用業內已知之任何延長釋放劑型(例如美國專利第4,713,249號、第5,266,333號及第5,417,982號中所闡述之生物可降解碳水化合物基質)，或替代地可使用慢幫浦(例如滲透幫浦)。可易於使用熟習此項技術者熟知之標準醫藥技術在無菌條件下(例如)藉由在無菌條件下凍乾來製備非經腸調配物。可藉由使用適當調配技術(例如納入溶解性增強劑)來增加用於製備非經腸調配物之本發明所涵蓋之治療劑之溶解性。用於非經腸投與之調配物可包括一或多種藥劑與以下物質之組合：一或多種醫藥上可接受之無菌等滲水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液；或無菌粉末，其可在即將使用前重構為無菌可注射溶液或分散液，該等物質可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、可使調配物與既定接受者之血液等滲之溶質或懸浮劑或增稠劑。
該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。微生物作用之防止可藉由包含各種抗細菌及抗真菌劑來確保，例如對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸及諸如此類。該等組合物中亦可期望包含等滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外，可藉由納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射醫藥形式之吸收。
在一些情形下，為延長藥物效應，期望減緩來自皮下或肌內注射之藥物的吸收。此可藉由使用具有較差水溶性之結晶或非晶型材料之液體懸浮液來達成。因此，藥物吸收速率取決於其溶解速率，而溶解速率繼而可取決於晶體大小及結晶形式。或者，藉由將非經腸投與之藥物形式溶解或懸浮於油媒劑中來達成該藥物之延遲吸收。
藉由在生物可降解聚合物(例如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成調節(例如抑制)生物標記物表現及/或活性之藥劑之微膠囊基質來製備可注射儲積形式。端視藥物對聚合物之比率及所用特定聚合物之性質，可控制藥物釋放速率。其他生物可降解聚合物之實例包含聚(原酸酯)及聚(酐)。儲積可注射調配物亦係藉由將藥物包裹於與身體組織相容之脂質體或微乳液中來製備。
在本發明所涵蓋之藥劑係作為藥物投與人類及動物時，其可以原狀或作為含有(例如) 0.1%至99.5% (更佳地0.5%至90%)活性成分與醫藥上可接受之載劑之組合之醫藥組合物給予。
本發明醫藥組合物中活性成分之實際劑量值可取決於本發明所涵蓋之方法，從而獲得可有效地達成特定個體、組合物及投與模式之期望治療反應而對個體無毒之活性成分量。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之醫藥組合物可經調配用於受控釋放及/或靶向遞送。如本文中所使用，「受控釋放」係指符合特定釋放模式以實現治療結果之醫藥組合物或化合物釋放特徵。在一實施例中，可將本發明所涵蓋之組合物囊封至本文所闡述及/或業內已知之遞送劑中以用於受控釋放及/或靶向遞送。如本文中所使用，術語「囊封」意指包封、環繞或包殼。在涉及本發明所涵蓋之調配物時，囊封可為實質性、完全或部分的。術語「實質上囊封」意指，至少大於50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.9%或大於99.999%之本發明所涵蓋之治療劑可包封、環繞或包殼於顆粒內。術語「部分地囊封」意指，小於10%、10%、20%、30%、40%、50%或更少之本發明所涵蓋之偶聯物可包封、環繞或包殼於顆粒內。舉例而言，至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或大於99.99%之本發明所涵蓋之醫藥組合物或化合物囊封於調配物中。
在一些實施例中，亦可構築該等調配物或改變組成，從而將其被動或主動地引導至不同活體內細胞類型(包含(但不限於)單核球、巨噬細胞及其他免疫細胞(例如樹突狀細胞、抗原呈遞細胞、T淋巴球、B淋巴球及天然殺手細胞)、癌細胞及諸如此類)中。亦可經由在細胞表面上表現不同配體來選擇性靶向調配物，如藉由(但不限於)葉酸鹽、轉鐵蛋白、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)及抗體靶向方式所例示。
2. 賦形劑 可使用一或多種賦形劑來調配本發明所涵蓋之醫藥組合物以達成以下用途：(1)增加穩定性；(2)允許持續或延遲釋放(例如自儲積調配物)；(3)改變生物分佈(例如使藥劑靶向特定組織或細胞類型)；(4)改變藥劑之活體內釋放特徵。賦形劑之非限制性實例包含任一及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑及防腐劑。本發明所涵蓋之賦形劑亦可包含(但不限於)類脂質、脂質體、脂質奈米顆粒、聚合物、脂質複合物(lipoplex)、核心-殼體奈米顆粒、肽、蛋白質、透明質酸酶、奈米顆粒模擬物及其組合。
術語「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」 意欲包含適用於特定期望劑型之任一及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散劑或懸浮劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、崩解劑、防腐劑、緩衝劑、固體黏合劑、潤滑劑、油、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、吸收延遲劑及諸如此類。Remington’s The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)揭示用於調配醫藥組合物之各種賦形劑以及其已知製備技術。除非任一習用賦形劑介質皆因(例如)產生任何不期望生物效應或以有害方式與醫藥組合物中之任何其他組分相互作用而與某一物質或其衍生物不相容，否則其使用涵蓋於本發明範圍內。亦可將補充活性成分納入所闡述組合物中。
在一些實施例中醫藥上可接受之賦形劑係至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%或100%純。在一些實施例中，批准賦形劑用於人類及獸醫應用中。在一些實施例中，賦形劑係由美國食品藥物監督管理局批准。在一些實施例中，賦形劑係醫藥級。在一些實施例中，賦形劑滿足美國藥典(United States Pharmacopoeia，USP)、歐洲藥典(European Pharmacopoeia，EP)、英國藥典(British Pharmacopoeia)及/或國際藥典(International Pharmacopoeia)之標準。
實例性稀釋劑包含(但不限於)碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉、乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉、糖粉等及/或其組合。
實例性造粒劑及/或分散劑包含(但不限於)馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、木薯澱粉、羥基乙酸澱粉鈉、黏土、海藻酸、瓜爾膠、柑橘果肉、瓊脂、膨潤土、纖維素及木質產品、天然海綿、陽離子交換樹脂、碳酸鈣、矽酸鹽、碳酸鈉、交聯聚(乙烯基-吡咯啶酮) (交聚維酮(crospovidone))、羧甲基澱粉鈉(羥基乙酸澱粉鈉)、羧甲基纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉(交聯羧甲基纖維素)、甲基纖維素、預膠凝澱粉(starch 1500)、微晶澱粉、水不溶性澱粉、羧甲基纖維素鈣、矽酸鎂鋁(VEEGUM®)、月桂基硫酸鈉、四級銨化合物等及/或其組合。
實例性表面活性劑及/或乳化劑包含(但不限於)天然乳化劑(例如阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、海藻酸鈉、黃蓍膠、克羅珠克(chondrux)、膽固醇、黃原膠、果膠、明膠、蛋黃、酪蛋白、羊毛脂、膽固醇、蠟及卵磷脂)、膠質黏土(例如膨潤土[矽酸鋁]及VEEGUM® [矽酸鎂鋁])、長鏈胺基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鯨蠟醇、油醇、三醋汀單硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸、單硬脂酸甘油基酯及丙二醇單硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer) (例如羧基聚亞甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物及羧基乙烯基聚合物)、角叉菜膠、纖維質衍生物(例如羧甲基纖維素鈉、粉狀纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素)、山梨醇酐脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯[TWEEN®20]、聚氧乙烯山梨醇酐[TWEENn®60]、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯[TWEEN®80]、山梨醇酐單棕櫚酸酯[SPAN®40]、山梨醇酐單硬脂酸酯[SPAN®60]、山梨醇酐三硬脂酸酯[SPAN®65]、單油酸甘油基酯、山梨醇酐單油酸酯[SPAN®80])、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯單硬脂酸酯[MYRJ®45]、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧基亞甲基硬脂酸酯及SOLUTOL®)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如CREMOPHOR®)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[BRIJ®30])、聚(乙烯基-吡咯啶酮)、二乙二醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸鹽、油酸鈉、油酸鉀、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸鈉、PLUORINC®F 68、POLOXAMER®188、西曲溴銨(cetrimonium bromide)、鯨蠟基吡啶鎓氯化物、苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、多庫酯鈉(docusate sodium)等及/或其組合。
實例性黏合劑包含(但不限於)澱粉(例如玉米澱粉及澱粉糊劑)；明膠；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然及合成膠(例如阿拉伯膠、海藻酸鈉、角叉菜提取物、潘瓦爾膠(panwar gum)、印度膠(ghatti gum)、依沙貝果(isabgol)殼膠黏劑、羧甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、乙酸纖維素、聚(乙烯基-吡咯啶酮)、矽酸鎂鋁(Veegum®)及落葉松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸鹽；聚環氧乙烷；聚乙二醇；無機鈣鹽；矽酸；聚甲基丙烯酸酯；蠟；水；醇；等等；及其組合。
實例性防腐劑可包含(但不限於)抗氧化劑、螯合劑、抗微生物防腐劑、抗真菌防腐劑、醇防腐劑、酸性防腐劑及/或其他防腐劑。實例性抗氧化劑包含(但不限於) α生育酚、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸基酯、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯、單硫基甘油、偏亞硫酸氫鉀、丙酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉及/或亞硫酸鈉。實例性螯合劑包含乙二胺四乙酸(EDTA)、單水合檸檬酸、依地酸二鈉、依地酸二鉀、依地酸、富馬酸、蘋果酸、磷酸、依地酸鈉、酒石酸及/或依地酸三鈉。實例性抗微生物防腐劑包含(但不限於)苯紮氯銨、苄索氯銨(benzethonium chloride)、苄基醇、溴硝丙二醇、十六烷基三甲基溴化銨(cetrimide)、鯨蠟基吡啶鎓氯化物、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲、酚、苯氧基乙醇、苯基乙基醇、硝酸苯汞、丙二醇及/或硫柳汞(thimerosal)。實例性抗真菌防腐劑包含(但不限於)對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉及/或山梨酸。實例性醇防腐劑包含(但不限於)乙醇、聚乙二醇、酚、酚系化合物、雙酚、氯丁醇、羥基苯甲酸酯及/或苯基乙基醇。實例性酸性防腐劑包含(但不限於)維他命A、維他命C、維他命E、β-胡蘿蔔素、檸檬酸、乙酸、去氫乙酸、抗壞血酸、山梨酸及/或植酸。其他防腐劑包含(但不限於)生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去鐵胺、十六烷基三甲基溴化銨、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸鈉(SLS)、月桂基醚硫酸鈉(SLES)、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、偏亞硫酸氫鉀、GLYDANT PLUS®、PHENONIP®、對羥基苯甲酸甲酯、GERMALL®115、GERMABEN®II、NEOLONE™、KATHON™及/或EUXYL®。
實例性緩衝劑包含(但不限於)檸檬酸鹽緩衝溶液、乙酸鹽緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡萄糖酸鈣、D-葡萄糖酸、甘油基磷酸鈣、乳酸鈣、丙酸、乙醯丙酸鈣、戊烷酸、磷酸氫鈣、磷酸、磷酸三鈣、羥基磷灰石(calcium hydroxide phosphate)、乙酸鉀、氯化鉀、葡萄糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉混合物、胺丁三醇、氫氧化鎂、氫氧化鋁、海藻酸、無熱原水、等滲鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇等及/或其組合。
實例性潤滑劑包含(但不限於)硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸、二氧化矽、滑石粉、麥芽、山萮酸甘油基酯、氫化植物油、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、白胺酸、月桂基硫酸鎂、月桂基硫酸鈉等及其組合。
實例性油包含(但不限於)杏仁油、苦杏仁油、鱷梨油、巴巴蘇(babassu)油、佛手柑油、黑加侖籽油、玻璃苣油、刺檜油、甘菊油、芥花油、香菜油、巴西棕櫚油、蓖麻油、肉桂油、可可油、椰子油、魚肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鴯鶓油、桉樹油、月見草油、魚油、亞麻籽油、香葉醇油、葫蘆油、葡萄籽油、榛子油、牛膝草油、肉豆蔻酸異丙基酯油、荷荷巴(jojoba)油、夏威夷果油、雜薰衣草油、熏衣草油、檸檬油、蓽澄茄油、火山豆油、錦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、水貂油、肉豆蔻油、橄欖油、橙油、深海魚油、棕櫚油、棕櫚仁油、桃仁油、花生油、罌粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、紅花油、檀香油、山茶花油、開胃香油、沙棘油、芝麻油、雪亞脂油、聚矽氧油、大豆油、向日葵油、茶樹油、薊油、山茶油、岩石草油、胡桃油及小麥胚油。實例性油包含(但不限於)硬脂酸丁酯、辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、環甲基聚矽氧烷、癸二酸二乙基酯、二甲基聚矽氧烷360、肉豆蔻酸異丙基酯、礦物油、辛基十二烷醇、油醇、聚矽氧油及/或其組合。
根據調配者之判斷，可在組合物中存在賦形劑，例如可可脂及栓劑蠟、著色劑、塗覆劑、甜味劑、矯味劑及/或香味劑。
醫藥調配物亦可包括醫藥上可接受之鹽。術語「醫藥上可接受之鹽」係指衍生自業內已知之各種有機及無機相對離子之鹽(例如參見Berge等人(1977)J. Pharm. Sci . 66:1-19)。該等鹽可在藥劑最後分離及純化期間原位製備，或藉由使呈游離鹼形式之經純化藥劑與適宜有機或無機酸單獨反應並分離由此形成之鹽來製備。可使用無機酸及有機酸來形成醫藥上可接受之酸加成鹽。可自其衍生鹽之無機酸包含(例如)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸及磷酸。可自其衍生鹽之有機酸包含(例如)乙酸、丙酸、羥乙酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸及水楊酸。醫藥上可接受之鹼加成鹽可使用無機鹼及有機鹼來形成。可自其衍生鹽之無機鹼包含(例如)鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳及鋁。可自其衍生鹽之有機鹼包含(例如)一級、二級及三級胺、包含天然經取代胺之經取代胺、環胺及鹼性離子交換樹脂。具體實例包含異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺及乙醇胺。在一些實施例中，醫藥上可接受之鹼加成鹽係選自銨、鉀、鈉、鈣及鎂之鹽。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之藥劑可含有一或多種酸性官能團且因此能夠與醫藥上可接受之鹼形成醫藥上可接受之鹽。在該等情形下，術語「醫藥上可接受之鹽」係指調節(例如抑制)生物標記物表現之藥劑之相對無毒性之無機及有機鹼加成鹽。同樣，該等鹽可在藥劑之最終分離或純化期間原位製備，或藉由使經純化藥劑以其游離酸形式與適宜鹼(例如醫藥上可接受之金屬陽離子之氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、與氨或與醫藥上可接受之有機一級、二級或三級胺單獨反應而製備。代表性鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包含鋰、鈉、鉀、鈣、鎂及鋁之鹽及諸如此類。可用於形成鹼加成鹽之代表性有機胺包含乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、六氫吡嗪及諸如此類(例如參見Berge等人(見上文))。
術語「共晶體」係指衍生自業內已知之諸多共晶體形成劑之分子複合物。不同於鹽，共晶體通常不涉及共晶體與藥物之間之氫轉移，且代之以涉及共晶體形成劑與晶體結構中之藥物之間之分子間相互作用(例如氫鍵結、芳香族環堆疊或分散力)。(
可用於形成本發明所涵蓋之醫藥組合物及劑型之實例性表面活性劑包含(但不限於)親水性表面活性劑、親脂性表面活性劑及其混合物。亦即，可採用親水性表面活性劑之混合物，可採用親脂性表面活性劑之混合物，或可採用至少一種親水性表面活性劑及至少一種親脂性表面活性劑之混合物。親水性表面活性劑可為離子型或非離子型。適宜離子型表面活性劑包含(但不限於)烷基銨鹽；夫西地酸(fusidic acid)鹽；胺基酸、寡肽及多肽之脂肪酸衍生物；胺基酸、寡肽及多肽之甘油酯衍生物；卵磷脂及氫化卵磷脂；溶血卵磷脂及氫化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；肉毒鹼脂肪酸酯鹽；烷基硫酸鹽；脂肪酸鹽；多庫酯鈉；醯基乳酸鹽；單-及二甘油酯之單-及二乙醯化酒石酸鹽；琥珀醯化單-及二甘油酯；單-及二甘油酯之檸檬酸鹽；及其混合物。離子型表面活性劑可包含(舉例而言)：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉毒鹼脂肪酸酯鹽；烷基硫酸鹽；脂肪酸鹽；多庫酯鈉；醯基乳酸鹽；單-及二甘油酯之單-及二乙醯化酒石酸鹽；琥珀醯化單-及二甘油酯；單-及二甘油酯之檸檬酸鹽；及其混合物。
離子型表面活性劑可為離子化形式之卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂醯絲胺酸、PEG-磷脂醯乙醇胺、PVP-磷脂醯乙醇胺、脂肪酸之乳酸酯、硬脂醯基-2-乳酸鹽、乳酸硬脂醯基酯、琥珀醯化單甘油酯、單/二甘油酯之單/二乙醯化酒石酸鹽、單/二甘油酯之檸檬酸鹽、膽醯肌胺酸、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、月桂酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、油酸鹽、蓖麻油酸鹽、蓖麻油酸鹽、亞麻酸鹽、硬脂酸鹽、月桂基硫酸鹽、十四烷基硫酸鹽(teracecyl sulfate)、多庫脂鹽、月桂醯基肉毒鹼、棕櫚醯基肉毒鹼、肉豆蔻醯基肉毒鹼及其鹽及混合物。
親水性非離子型表面活性劑可包含(但不限於)烷基葡萄糖苷；烷基麥芽糖苷；烷硫基葡萄糖苷；月桂基聚乙二醇甘油酯；聚氧基伸烷基烷基醚，例如聚乙二醇烷基醚；聚氧基伸烷基烷基酚，例如聚乙二醇烷基酚；聚氧基伸烷基烷基酚脂肪酸酯，例如聚乙二醇脂肪酸單酯及聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧基伸烷基山梨醇酐脂肪酸酯，例如聚乙二醇山梨醇酐脂肪酸酯；多元醇與至少一種由甘油酯、植物油、氫化植物油、脂肪酸及固醇組成之群之成員之親水性轉酯化產物；聚氧乙烯固醇、其衍生物及類似物；聚氧基乙基化維他命及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；聚乙二醇山梨醇酐脂肪酸酯及多元醇與至少一種由三甘油酯、植物油及氫化植物油組成之群之成員之親水性轉酯化產物。多元醇可為甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇、丙二醇、異戊四醇或醣。
其他親水性非離子型表面活性劑包含(但不限於) PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG- 15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-25甘油基三油酸酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20甘油基月桂酸酯、PEG-30甘油基月桂酸酯、PEG-20甘油基硬脂酸酯、PEG-20甘油基油酸酯、PEG-30甘油基油酸酯、PEG-30甘油基月桂酸酯、PEG-40甘油基月桂酸酯、PEG-40棕櫚仁油、PEG-50氫化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氫化蓖麻油、PEG-60氫化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸鹽/辛酸鹽甘油酯、PEG-8癸酸鹽/辛酸鹽甘油酯、聚甘油基-10月桂酸酯、PEG-30膽固醇、PEG-25植物固醇、PEG-30大豆固醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40山梨醇酐油酸酯、PEG-80山梨醇酐月桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10油基醚、POE-20油基醚、POE-20硬脂基醚、生育酚基PEG-100琥珀酸酯、PEG-24膽固醇、聚甘油基-10油酸酯、Tween 40、Tween 60、蔗糖單硬脂酸酯、蔗糖單月桂酸酯、蔗糖單棕櫚酸酯、PEG 10-100壬基酚系列、PEG 15-100辛基酚系列及泊洛沙姆(poloxamer)。
適宜親脂性表面活性劑可包含(但不限於)脂肪醇；甘油脂肪酸酯；乙醯化甘油脂肪酸酯；低碳醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；山梨醇酐脂肪酸酯；聚乙二醇山梨醇酐脂肪酸酯；固醇及固醇衍生物；聚氧基乙基化固醇及固醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；單-及二甘油酯之乳酸衍生物；多元醇與至少一種由甘油酯、植物油、氫化植物油、脂肪酸及固醇組成之群之成員之疏水性轉酯化產物；油可溶性維他命/維他命衍生物；及其混合物。在此群組內，較佳親脂性表面活性劑包含甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯及其混合物，或係多元醇與至少一種由植物油、氫化植物油及三甘油酯組成之群之成員之疏水性轉酯化產物。
可在本發明調配物中包含增溶劑以確保本發明所涵蓋藥劑(例如化學化合物)之良好增溶及/或溶解且最小化本發明所涵蓋藥物形式之沈澱。對於用於口服使用之組合物(例如注射用組合物)，此可尤其重要。亦可添加增溶劑以增加親水性藥物及/或其他組分(例如表面活性劑)之溶解性，或使組合物維持為穩定或均質溶液或分散液。適宜增溶劑之實例包含(但不限於)下列試劑：醇及多元醇，例如乙醇、異丙醇、丁醇、苄基醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其異構體、甘油、異戊四醇、山梨醇、甘露醇、二乙二醇單乙基醚(transcutol)、二甲基異山梨醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羥丙基甲基纖維素及其他纖維素衍生物、環糊精及環糊精衍生物；平均分子量為約200至約6000之聚乙二醇之醚，例如四氫糠基醇PEG醚(糖原質)或甲氧基PEG；醯胺及其他含氮化合物，例如2-吡咯啶酮、2-六氫吡啶酮、ڙ-己內醯胺、N-烷基吡咯啶酮、N-羥基烷基吡咯啶酮、N-烷基六氫吡啶酮、N-烷基己內醯胺、二甲基乙醯胺及聚乙烯基吡咯啶酮；酯，例如丙酸乙酯、檸檬酸三丁基酯、乙醯基檸檬酸三乙基酯、乙醯基檸檬酸三丁基酯、檸檬酸三乙基酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三醋汀、丙二醇單乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、ε-己內酯及其異構體、į-戊內酯及其異構體、ȕ-丁內酯及其異構體；及業內已知之其他增溶劑，例如二甲基乙醯胺、二甲基異山梨醇、N-甲基吡咯啶酮、單辛精、二乙二醇單乙基醚及水。
亦可使用增溶劑之混合物。實例包含(但不限於)三醋汀、檸檬酸三乙基酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、N-羥乙基吡咯啶酮、聚乙烯基吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基環糊精、乙醇、聚乙二醇200-100、糖原質、二乙二醇單乙基醚、丙二醇及二甲基異山梨醇。尤佳增溶劑包含山梨醇、甘油、三醋汀、乙基醇、PEG-400、糖原質及丙二醇。
醫藥上可接受之添加劑可視需要包含於調配物中。該等添加劑及賦形劑包含(但不限於)防黏劑、抗發泡劑、緩衝劑、聚合物、抗氧化劑、防腐劑、螯合劑、黏度調節劑、張力劑、矯味劑、著色劑、芳香劑、遮光劑、懸浮劑、黏合劑、填充劑、增塑劑、潤滑劑及其混合物。
另外，可將酸或鹼納入組合物中以促進處理、增強穩定性或用於其他原因。醫藥上可接受之鹼之實例包含胺基酸、胺基酸酯、氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鋁、碳酸鈣、氫氧化鎂、矽酸鎂鋁、合成矽酸鋁、合成水滑石、氫氧化鎂鋁、二異丙基乙基胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、三乙胺、三異丙醇胺、三甲胺、參(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)及諸如此類。亦適宜者係呈諸如以下等醫藥上可接受之酸之鹽形式之鹼，例如乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、烷烴磺酸、胺基酸、抗壞血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、檸檬酸、脂肪酸、甲酸、富馬酸、葡萄糖酸、氫醌磺酸、異抗壞血酸、乳酸、馬來酸、草酸、對-溴苯基磺酸、丙酸、對甲苯磺酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、硫基乙醇酸、甲苯磺酸、尿酸及諸如此類。亦可使用多元酸之鹽，例如磷酸鈉、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉。在鹼係鹽時，陽離子可為任一便利之醫藥上可接受之陽離子，例如銨、鹼金屬及鹼土金屬。實例可包含(但不限於)鈉、鉀、鋰、鎂、鈣及銨。
適宜酸係醫藥上可接受之有機酸或無機酸。適宜無機酸之實例包含鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、硼酸、磷酸及諸如此類。適宜有機酸之實例包含乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、烷烴磺酸、胺基酸、抗壞血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、檸檬酸、脂肪酸、甲酸、富馬酸、葡萄糖酸、氫醌磺酸、異抗壞血酸、乳酸、馬來酸、甲烷磺酸、草酸、對-溴苯基磺酸、丙酸、對甲苯磺酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、硫基乙醇酸、甲苯磺酸及尿酸。
3. 基於脂質之調配物 在一些實施例中，使用基於脂質之調配物。因此，本文提供包括如本文所闡述之組合物及一或多種脂質之基於脂質之調配物。在一些實施例中，脂質係脂質顆粒或兩親性化合物。脂質在生理學pH下可為中性、陰離子性或陽離子性。
適宜固體脂質包含(但不限於)高級飽和醇、高級脂肪酸、鞘脂、合成酯及高級飽和脂肪酸之單-、二-及三甘油酯。固體脂質可包含具有10-40個、較佳地12-30個碳原子之脂肪族醇，例如鯨蠟硬脂醇。固體脂質可包含10-40個、較佳地12-30個碳原子之高級脂肪酸，例如硬脂酸、棕櫚酸、癸酸及山崳酸。固體脂質可包含具有10-40個、較佳地12-30個碳原子之高級飽和脂肪酸之甘油酯(包含單甘油酯、二甘油酯及三甘油酯)，例如單硬脂酸甘油基酯、甘油山萮酸酯、甘油棕櫚酸硬脂酸酯、甘油三月桂酸酯、三癸精、三月桂精、三肉豆蔻精、三棕櫚精、三硬脂精及氫化蓖麻油。適宜固體脂質可包含棕櫚酸鯨蠟基酯、蜂蠟或環糊精。
兩親性化合物包含(但不限於)磷脂，例如1,2二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二花生醯基磷脂醯膽鹼(DAPC)、二山崳醯基磷脂醯膽鹼(DBPC)、二-二十三醯基磷脂醯膽鹼(DTPC)及二木脂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)，其係以介於0.01-60 (重量脂質/重量聚合物)之間(例如介於0.1-30 (重量脂質/重量聚合物)之間)之比率納入。可用磷脂包含(但不限於)磷脂酸、具有飽和及不飽和脂質之磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、溶血磷脂醯衍生物、心磷脂及β-醯基-y-烷基磷脂。磷脂之實例包含(但不限於)磷脂醯膽鹼，例如二油醯基磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二-十五醯基磷脂醯膽鹼、二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二花生醯基磷脂醯膽鹼(DAPC)、二山崳醯基磷脂醯膽鹼(DBPC)、二-二十三醯基磷脂醯膽鹼(DTPC)、二木脂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)；及磷脂醯乙醇胺，例如二油醯基磷脂醯基乙醇胺或1-十六烷基-2-棕櫚醯基甘油基磷酸乙醇胺。亦可使用具有不對稱醯基鏈(例如具有一條6碳醯基鏈及另一條12碳醯基鏈)之合成磷脂。
在一些實施例中，使用基於脂質之顆粒。術語「脂質顆粒」係指由一種生物相容脂質或不同生物相容脂質之混合物(例如至少一或多種陽離子脂質及/或一或多種中性脂質及/或聚乙二醇(PEG)脂質)構成之脂質體、脂質微胞、固體脂質顆粒、脂質複合物、脂質奈米顆粒(LNP)或脂質穩定之聚合顆粒。
顆粒可為脂質微胞。脂質微胞可形成為(例如)含有脂質表面活性劑之油包水型乳液。乳液係兩種不混溶相之摻合物，其中添加表面活性劑以穩定分散液滴。在一些實施例中，脂質微胞係微乳液。微乳液係至少由水、油及脂質表面活性劑構成之熱動力學穩定系統，該脂質表面活性劑可產生液滴大小小於1微米、約10 nm至約500 nm或約10 nm至約250 nm之透明熱動力學穩定系統。脂質微胞通常可用於囊封疏水性活性劑(包含疏水性治療劑、疏水性預防劑或疏水性診斷劑)。
顆粒可為固體脂質顆粒。固體脂質顆粒可替代膠質微胞及脂質體。固體脂質顆粒通常係亞微米大小，亦即約10 nm至約1微米、10 nm至約500 nm或10 nm至約250 nm。固體脂質顆粒係由在室溫下係固體之脂質形成。其藉由使用固體脂質代替液體油而衍生自水包油型乳液。
顆粒可為脂質體。脂質體係由環繞有配置成球形雙層之脂質之水性介質構成之小囊泡。脂質體可分類為小單層囊泡、大單層囊泡或多層囊泡。多層脂質體含有多個同心脂質雙層。脂質體可用於藉由將親水性藥劑捕集於水性內部或雙層之間或藉由將疏水性藥劑捕集於雙層內來囊封藥劑。
脂質微胞及脂質體通常具有水性中心。水性中心可含有水或水及醇之混合物。適宜醇包含(但不限於)甲醇、乙醇、丙醇(例如異丙醇)、丁醇(例如正丁醇、異丁醇、第二丁醇、第三丁醇、戊醇(例如戊醇、異丁基甲醇)、己醇(例如1-己醇、2-己醇、3-己醇)、庚醇(例如1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇及4-庚醇)或辛醇(例如1-辛醇)或其組合。
脂質體係可主要由脂質雙層構成之人工製得之囊泡且可用作用於投與營養物及醫藥調配物之遞送媒劑。脂質體可具有不同大小，例如(但不限於)多層囊泡(MLV)，其可具有數百奈米之直徑且可含有一系列由窄水性腔室分隔之同心雙層；小單細胞囊泡(SUV)，其直徑可小於50 nm；及大單層囊泡(LUV)，其直徑可介於50 nm與500 nm之間。脂質體設計可包含(但不限於)調理素或配體以改良脂質體與不健康組織之附接或活化事件(例如(但不限於)胞吞作用)。脂質體可含有低或高pH以改良醫藥調配物之遞送。
脂質體之形成可取決於物理化學特性，例如(但不限於)所包埋醫藥調配物及脂質體成分、分散脂質囊泡之介質之性質、所包埋物質之有效濃度及其潛在毒性、在施加及/或遞送囊泡期間所涉及之任何其他過程、用於預期應用之囊泡之最佳化大小、多分散性及儲架壽命及大規模生產安全及有效脂質體產品之批次間再現性及可能性。
在一實施例中，本文所闡述之醫藥組合物可包含(但不限於)脂質體(例如自1,2-二油基氧基-N,N -二甲基胺基丙烷(DODMA)脂質體形成者)、來自Marina Biotech (Bothell, WA)之DiLa2脂質體、1,2-二亞油基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)及MC3 (例如如美國專利公開案第2010/0324120號中所闡述)。
在一實施例中，本發明所涵蓋之組合物可調配成脂質-多聚陽離子複合物。可藉由業內已知及/或如美國專利公開案第2012/0178702號中所闡述之方法來形成脂質-多聚陽離子複合物。作為一非限制性實例，多聚陽離子可包含陽離子肽或多肽(例如(但不限於)聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸及PCT公開案第WO 2012/013326號中所闡述之陽離子肽)。在另一實施例中，本發明所涵蓋之組合物可調配成可進一步包含中性脂質(例如(但不限於)膽固醇或二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE))之脂質-多聚陽離子複合物。脂質體調配物可由(但不限於)以下因素影響：所選陽離子脂質組分、陽離子脂質飽和程度、聚乙二醇化性質、所有組分之比率及生物物理參數(例如大小)。
在一些實施例中，脂質顆粒係脂質奈米顆粒(LNP)。術語「脂質奈米顆粒(LNP)」係指亞微米範圍內之基於脂質之顆粒，其包含一或多種如本文所闡述之脂質組分。LNP可具有脂質體之結構特性及/或具有替代非雙層型結構，其可用於全身性遞送基於核酸之藥物(包含(例如)與自本文所闡述之至少一種生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之至少一種靶)轉錄之mRNA之核酸序列互補的siRNA分子)。在一些實施例中，LNP調配物包括一或多種陽離子脂質。陽離子脂質係在任一生理學pH下攜載淨正電荷之脂質。在某些特定實施例中，LNP包括如本文所闡述之類脂質。正電荷可用於與帶負電治療劑(例如siRNA分子)締合。
在某些實施例中，脂質奈米顆粒包括一或多種脂質及如本文所闡述之組合物。在某些特定實施例中，如本文所闡述之組合物囊封於脂質奈米顆粒內。
在一些實施例中，將LNP之大小及電荷比率以及其他物理性質(例如膜流動性)最佳化以增加細胞轉染及遞送。
脂質或類脂質顆粒可包括(例如)陽離子脂質、中性脂質、基於胺基酸或肽之脂質、聚乙二醇(PEG)-脂質(例如具有PEG鏈之脂質)，例如氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、膽固醇(CHE)、1,2-二硬脂醯基-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(PEG)-2000] (DSPE-PEG2000)、在鏈遠端經馬來醯亞胺基團修飾之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(PEG)-2000]、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[馬來醯亞胺(PEG)-2000]、DSPE-PEG2000-MAL、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550] (DMPE-PEG550)、1,2-二油醯基-l-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)及具有甘油主鏈者(例如DMG-PEG、DSG-PEG (DMG-PEG2000))等。如本文中所使用，脂質體係包括包封水性內部之含脂質膜之結構。舉例而言，可使用基於脂質之調配物來遞送本發明之核酸藥劑(例如siRNA、miRNA、寡核苷酸、經修飾mRNA及其他類型之核酸分子)。
適宜中性及陰離子脂質包含(但不限於)固醇及脂質，例如膽固醇、磷脂、溶血脂質、溶血磷脂質、鞘脂或聚乙二醇化脂質。中性及陰離子脂質包含(但不限於)磷脂醯膽鹼(PC) (例如雞蛋PC、大豆PC)，包含1,2-二醯基-甘油-3-磷酸膽鹼；磷脂醯絲胺酸(PS)、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇(PI)；醣脂；鞘磷脂，例如鞘髓磷脂及鞘醣脂(亦稱為1-神經醯胺基醣苷)，例如神經醯胺吡喃半乳醣苷、神經節苷脂及腦苷脂；含有羧酸基團之脂肪酸、固醇，例如膽固醇；1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，包含(但不限於) 1,2-二油基磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二-十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)、1,2-二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、1,2-二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)及1,2-二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)。脂質亦可包含脂質之各種天然(例如組織源L-α-磷脂醯基：蛋黃、心臟、腦、肝、大豆)及/或合成(例如飽和及不飽和1,2-二醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼、1-醯基-2-醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二庚醯基-SN-甘油-3-磷酸膽鹼)衍生物。
諸多陽離子脂質及其製備方法闡述於(例如)美國專利第5,830,430號、第6,056,938號、第7,893,302號、第7,404,969號、第8,034,376號、第8,283,333號及第8,642,076號以及PCT公開案第WO 2010/054406號、第WO 2010/054401號、第WO 2010/054405號、第WO 2010/054384號、第WO 2012/040184號、第WO 2011/153120號、第WO 2011/149733號、第WO 2011/090965號、第WO 2011/043913號、第WO 2011/022460號、第WO 2012/061259號、第WO 2012/054365號、第WO 2012/044638號、第WO 2010/080724號、第WO 2010/21865號及第WO 2008/103276號。
術語「陽離子脂質」意欲包含彼等具有一或兩個脂肪酸或脂肪脂肪族鏈及胺基頭基(包含烷基胺基或二烷基胺基)之脂質，其可在生理學pH下發生質子化以形成陽離子脂質且由帶正電頭基及疏水性尾部組成。帶正電頭基可用於以靜電方式結合帶負電siRNA分子，而疏水性尾部則自組裝成親脂性顆粒。陽離子脂質之實例可包含(但不限於)：DLin-K-DMA、DLinDMA、DLinDAP、DLin-K-C2-DMA、DLin-K2-DMA、DOTAP、DMRIE、DORIE、DOTMA、DDAB、Ethyl PC、多價陽離子脂質及DC-膽固醇、DODA、DODMA、DSDMA、DOTMA、DDAB、DODAP、DOTAP、DOTAP-Cl、DC-Chol、DMRIE、DOSPA、DOGS、DOPE、CLinDMA、CpLinDMA、 DMOBA、DOcarbDAP、 DLincarbDAP、DLinCDAP。諸多該等脂質及相關類似物已闡述於美國專利公開案第2006/0083780號及第2006/0240554號及美國專利第5,208,036號、第5,264,618號、第5,279,833號、第5,283,185號、第5,753,613號及第5,785,992號中。陽離子脂質亦可為lipofectin (例如參見美國專利第5,705,188號)，例如Lipofectamine® 、Lipofectamine 2000® 、Lipofectamine 3000® 、RNAiMAX® 及諸如此類。
在約生理學pH下攜載淨正電荷之其他陽離子脂質亦可用於本發明之脂質顆粒中，包含(但不限於) N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、二-十八烷基二甲基銨(DODMA)、二硬脂基二甲基銨(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、1,2-二油醯基-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、1,2-二油基氧基-3-三甲胺基丙烷氯鹽(DOTAP.Cl)、3-(N-(N′,N′-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻醯基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、二-十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE，其在生理學pH下攜載正電荷，但在酸性pH下則不攜載正電荷)、3-二甲基胺基-2-(膽甾基-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八烷二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(膽甾基-5-烯-3β-氧基)-3′-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9′,1-2′-十八烷二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄基胺(DMOBA)、1,2-N,N′-二油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N′-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinCDAP)及其混合物。諸多該等脂質及相關類似物已闡述於美國專利申請案公開案第2006/0083780號及第2006/0240554號美國專利第5,208,036號、第5,264,618號、第5,279,833號、第5,283,185號、第5,753,613號及第5,785,992號中。
適宜其他陽離子脂質亦可包含(但不限於) N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨鹽(亦稱為TAP脂質，例如甲基硫酸鹽)。適宜TAP脂質包含(但不限於)DOTAP (二油醯基-)、DMTAP (二肉豆蔻醯基-)、DPTAP (二棕櫚醯基-)及DSTAP (二硬脂醯基-)。脂質體中之適宜陽離子脂質包含(但不限於)二甲基二-十八烷基溴化銨(DDAB)、1,2-二醯基氧基-3-三甲基銨丙烷、N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-Ν,Ν-二甲基胺(DODAP)、1,2-二醯基氧基-3-二甲基銨丙烷、N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、1,2-二烷基氧基-3-二甲基銨丙烷、二-十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-[N-(N',N'-二甲基胺基-乙烷)胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)；2,3-二油醯基氧基-N-(2-(精胺甲醯胺基)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙烷銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、β-丙胺醯基膽固醇、鯨蠟基三甲基溴化銨(CTAB)、二C14 -脒、N-第三丁基(ferf-butyl)-N'-十四烷基-3-十四烷基胺基-丙脒、N-(α-三甲基銨基乙醯基)二-十二烷基-D-麩胺酸鹽氯化物(TMAG)、二-十四烷醯基-N-(三甲基銨基-乙醯基)二乙醇胺氯化物、1,3-二油醯基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙基醯胺(DOSPER)及N,N,N',N'-四甲基-、N'-雙(2-羥乙基)-2,3-二油醯基氧基-1,4-丁烷二碘化銨。在一實施例中，陽離子脂質可為1-[2-(醯基氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羥乙基)-氯化咪唑鎓衍生物，例如1-[2-(9(Z)-十八烷醯基氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烷烯基-3-(2-羥乙基)氯化咪唑鎓(DOTIM)及1-[2-(十六烷醯基氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羥乙基)氯化咪唑鎓(DPTIM)。在一實施例中，陽離子脂質可為在四級胺上含有羥基烷基部分之2,3-二烷基氧基丙基四級銨化合物衍生物，例如1,2-二油醯基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DORI)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DORIE)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羥丙基溴化銨(DORIE-HP)、1,2-二油基-氧基-丙基-3-二甲基-羥丁基溴化銨(DORIE-HB)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羥基戊基溴化銨(DORIE-Hpe)、1,2-二肉豆蔻醯基氧基丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DMRIE)、1,2-二棕櫚基氧基丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DPRIE)及1,2-二甾基氧基丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DSRIE)。
陽離子脂質亦可為可離子化陽離子脂質。用於調配本文所闡述組合物之適宜可離子化陽離子脂質包含WO2015/074805中所闡述之脂質。適於調配本發明組合物之其他適宜可離子化陽離子脂質可包含US 2015/0239834中所闡述者。
在一些實施例中，對稱或不對稱或可離子化陽離子脂質可用於奈米顆粒或脂質調配物中。該等脂質揭示於(例如)美國專利申請案公開案第2015/0239926號、第2015/0239834號及第2015/0141678號及PCT公開案第WO 2015/074805號中。
另外，可使用陽離子脂質之諸多商業製劑，例如LIPOFECTIN® (包含DOTMA及DOPE，可自GIBCO/BRL獲得)、LIPOFECTIN® (包括DOSPA及DOPE，可自GIBCO/BRL獲得)、TRANSFECTIN® (來自Bio- Rad Laboratories, Inc.)及siPORT NEOFX® (來自Applied Biosystems)。
陽離子脂質亦可為適於細胞遞送包括本文所闡述藥劑(例如siRNA分子)之組合物之經修飾陽離子脂質(例如參見美國專利公開案第2013/0323269號中所闡述者)；陽離子甘油衍生物及多陽離子分子(例如聚離胺酸) (PCT公開案第WO 97/30731號)、包含一或多個生物可降解基團之陽離子基團(美國專利公開案第2013/0195920號)。
在一些實施例中，可離子化脂質可為WO 2015/074805或US 2015/0239834中所闡述之可離子化胺基脂質。
在某些實施例中，本文所闡述之組合物進一步包括如WO 2010/053572中所闡述之胺基醇類脂質。在某些實施例中，類脂質化合物係選自式(I)-(V)：
Figure 02_image623
及
Figure 02_image625
及其醫藥上可接受之鹽，其中： A係經取代或未經取代之具支鏈或無支鏈、環狀或非環狀C2-20 伸烷基，其視情況間雜有1或多個獨立地選自O、S及N之雜原子，或A係經取代或未經取代之飽和或不飽和4-6員環； R1 係氫、經取代、未經取代之具支鏈或無支鏈C1-20 -脂肪族基團或經取代、未經取代之具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團，其中至少一個情形之R1 係氫； RB 、RC 及RD 獨立地係氫、經取代、未經取代之具支鏈或無支鏈C1-20 -脂肪族基團或經取代、未經取代之具支鏈或無支鏈C1-20 -雜脂肪族基團或-CH2 CH(OH)RE ； RB 及RD 一起可視情況形成環狀結構； RC 及RD 一起可視情況形成環狀結構；且 RE 係經取代、未經取代之具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團或經取代、未經取代之具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團。
在某些特定實施例中，類脂質具有式(VI)：
Figure 02_image627
或其醫藥上可接受之鹽，其中： p係介於1與3之間之整數(包含端值)； m係介於1與3之間之整數(包含端值)； RA 係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image629
或
Figure 02_image631
； RF 係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image633
或
Figure 02_image635
； R5 在每次出現時獨立地係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；或經取代或未經取代之雜芳基； 其中RA 、RF 、RY 及RZ 中之至少一者係
Figure 02_image637
或
Figure 02_image639
； x在每次出現時係介於1與10之間之整數(包含端值)； y在每次出現時係介於1與10之間之整數(包含端值)； RY 在每次出現時係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image641
或
Figure 02_image643
； RZ 在每次出現時係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image645
或
Figure 02_image647
。
在式(VI)之某些實施例中，p為1。在某些實施例中，m為1。在某些實施例中，p及m二者皆為1。在某些實施例中，RF 係
Figure 02_image649
。在某些實施例中，RA 係
Figure 02_image651
。
在某些實施例中，該組合物包括選自C14-120、C16-120、C14-98、C14-113、C14-96、C12-200、C12-205、C16-96、C12-111及C12-210之胺基醇類脂質(參見上文所提及之美國專利第8,450,298號及PCT公開案第WO 2010/053572號)。
在某些特定實施例中，胺基醇類脂質係C12-200：
Figure 02_image653
(C12-200)
在某些特定實施例中，類脂質具有式(VII)：
Figure 02_image655
或其醫藥上可接受之鹽，其中： RA 在每次出現時獨立地係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
Figure 02_image657
；或
Figure 02_image659
； 其中至少一個RA 係
Figure 02_image661
或
Figure 02_image663
； R5 在每次出現時獨立地係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；或經取代或未經取代之雜芳基； x在每次出現時係介於1與10之間之整數(包含端值)；且 y在每次出現時係介於1與10之間之整數(包含端值)。
在某些實施例中，本文所闡述之組合物進一步包括如WO 2014/028847中所闡述之含胺類脂質。
在某些實施例中，含胺類脂質具有式(VIII)：
Figure 02_image665
或其醫藥上可接受之鹽，其中： 每一L獨立地係具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基，其中L視情況經一或多個氟基團取代； 每一RA 獨立地係具支鏈或無支鏈C1-6 烷基、C3-7 環烷基或具支鏈或無支鏈C4-12 環烷基烷基，其中RA 視情況經一或多個氟基團取代； 每一R獨立地係氫或-CH2 CH2 C(=O)ORB ； 每一RB 獨立地係C10-14 烷基，其中RB 視情況經一或多個氟基團取代；且 q為1、2或3； 條件係至少三個R基團係-CH2 CH2 C(=O)ORB ； 條件係該化合物不為
Figure 02_image667
。
在某些實施例中，本文所闡述之組合物進一步包括如WO 2016/004202中所闡述之聚胺-脂肪酸源類脂質。
在某些實施例中，含胺類脂質具有式(IX)：
Figure 02_image669
或醫藥上可接受之鹽，其中： X係經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸雜烯基、經取代或未經取代之伸雜炔基、經取代或未經取代之伸碳環基、經取代或未經取代之伸雜環基、經取代或未經取代之伸芳基、經取代或未經取代之伸雜芳基、式：
Figure 02_image671
之二價部分或其組合，其中每一情況之RX 獨立地係氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之碳環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、氮保護基團或式：
Figure 02_image673
之部分，或RB1 及一個RX 接合形成經取代或未經取代之雜環或經取代或未經取代之雜芳基環，或RB2 及一個RX 接合形成經取代或未經取代之雜環或經取代或未經取代之雜芳基環，其中： 每一情況之LX 獨立地係經取代或未經取代之伸烷基或經取代或未經取代之伸雜烷基；且 每一情況之RX1 獨立地係經取代或未經取代之C4-30 烷基、經取代或未經取代之C4-30 烯基或經取代或未經取代之C4-30 炔基； L1a 係經取代或未經取代之伸烷基或經取代或未經取代之伸雜烷基； RA1a 係經取代或未經取代之C4-30 烷基、經取代或未經取代之C4-30 烯基或經取代或未經取代之C4-30 炔基； RB1 係氫、經取代或未經取代之醯基、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之碳環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、氮保護基團或式：
Figure 02_image675
之部分，其中L1b 係經取代或未經取代之伸烷基或經取代或未經取代之伸雜烷基，且RA1b 係經取代或未經取代之C4-30 烷基、經取代或未經取代之C4-30 烯基或經取代或未經取代之C4-30 炔基； L2a 係經取代或未經取代之伸烷基或經取代或未經取代之伸雜烷基； RA2a 係經取代或未經取代之C4-30 烷基、經取代或未經取代之C4-30 烯基或經取代或未經取代之C4-30 炔基；且 RB2 係氫、經取代或未經取代之醯基、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之碳環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、氮保護基團或式：
Figure 02_image677
之部分，其中L2b 係經取代或未經取代之伸烷基或經取代或未經取代之伸雜烷基，且RA2b 係經取代或未經取代之C4-30 烷基、經取代或未經取代之C4-30 烯基或經取代或未經取代之C4-30 炔基；或 RB1 及RB2 接合形成經取代或未經取代之雜環或經取代或未經取代之雜芳基環。
在某些實施例中，本文所闡述之組合物進一步包括如WO 2013/063468中所闡述之胺基酸-、肽-或多肽脂質。在某些實施例中，含胺類脂質具有式(X)：
Figure 02_image679
或醫藥上可接受之鹽，其中： p係介於1與9之間之整數(包含端值)； 每一情況之Q獨立地係O、S或NRQ ，其中RQ 係氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基、氮保護基團或式(i)、(ii)、(iii)之基團； 每一情況之R1 獨立地係氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基、鹵素、-ORA1 、-N(RA1 )2 、-SRA1 ；其中RA1 在每次出現時獨立地係氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基、氧保護基團(在附接至氧原子時)、硫保護基團(在附接至硫原子時)、氮保護基團(在附接至氮原子時)，或兩個RA1 基團接合形成視情況經取代之雜環或視情況經取代之雜芳基環； 或至少一種情況之R1 係下式之基團：
Figure 02_image681
其中L係視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之伸雜烷基、視情況經取代之伸雜烯基、視情況經取代之伸雜炔基、視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基或視情況經取代之伸雜芳基，且 R6 及R7 各自獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基及氮保護基團； 每一情況之R2 獨立地係氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基、氮保護基團或式(i)、(ii)或(iii)之基團；且 式(i)、(ii)及(iii)係：
Figure 02_image683
其中： 每一情況之R′獨立地係氫或視情況經取代之烷基； X係O、S、NRX ，其中RX 係氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基或氮保護基團； Y係O、S、NRY ，其中RY 係氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基或氮保護基團； RP 係氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基、氧保護基團(在附接至氧原子時)、硫保護基團(在附接至硫原子時)或氮保護基團(在附接至氮原子時)；且 RL 係視情況經取代之C1-50 烷基、視情況經取代之C2-50 烯基、視情況經取代之C2-50 炔基、視情況經取代之雜C1-50 烷基、視情況經取代之雜   C2-50 烯基、視情況經取代之雜C2-50 炔基或聚合物； 條件係至少一種情況之RQ 、R2 、R6 或R7 係式(i)、(ii)或(iii)之基團。 在某些特定實施例中，胺基酸-、肽-或多肽脂質具有下式：
Figure 02_image685
在某些特定實施例中，可使用含有C12-200之脂質奈米顆粒來調配如本文所闡述之組合物。在一些實施例中，C12-200係以佔總組合物約1.0%至約60.0%、約10.0%至40.0%或約20.0%至約50.0%之莫耳百分比存在。在一些實施例中，該組合物包括以下濃度之C12-200：約5.0%、約7.5%、約10.0%、約12.5%、約15.0%、約17.5%、約20.0%、約20.5%、約21.0%、約21.5%、約22.0%、約22.5%、約23.0%、約23.5%、約24.0%、約24.5%、約25.0%、約25.5%、約26.0%、約26.5%、約27.0%、約27.5%、約28.0%、約28.5%、約29.0%、約29.5%、約30.0%、約30.5%、約31.0%、約31.5%、約32.0%、約32.5%、約33.0%、約33.5 %、約34.0%、約34.5%、約35.0%、約35.5%、約36.0%、約36.5%、約37.0%、約37.5%、約38.0%、約38.5%、約39.0%、約39.5%、約40.0%、約40.5%、約41.0%、約41.5%、約42.0%、約42.5%、約43.0%、約43.5%、約44.0%、約44.5%、約45.0%、約45.5%、約46.0%、約46.5%、約47.0%、約47.5%、約48.0%、約48.5%、約49.0%、約49.5%、約50.0%、約50.5%、約51.0%、約52.0%、約53.0%、約54.0%、約55.0%、約56.0%、約57.0%、約58.0%、約59.0%或約60.0% (基於總組合物之莫耳數)。在某些實施例中，該組合物包括約50.0莫耳%之C12-200。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒亦可包含一或多種輔助脂質(亦在本文中稱為「共脂質」)，該等輔助脂質包含(但不限於)中性脂質、兩親性脂質、含PEG脂質、陰離子脂質及固醇。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒進一步包括一或多種中性脂質。中性脂質(在存在時)可為諸多脂質物質中之任一者，其在生理學pH下以不帶電或中性兩性離子形式存在。該等脂質包含(例如)二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯基乙醇胺、神經醯胺、鞘髓磷脂、二氫鞘髓磷脂、腦磷脂及腦苷脂。在一些實施例中，中性脂質組分係具有兩個醯基之脂質(例如二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯基乙醇胺)。在一些實施例中，中性脂質包括碳鏈長度在C10 至C20 範圍內(包含端值)之飽和脂肪酸。在一些實施例中，中性脂質包含碳鏈長度在C10 至C20 範圍內(包含端值)之單-或二不飽和脂肪酸。適宜中性脂質包含(但不限於) DPPC (二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼)、POPC (棕櫚醯基-油醯基磷脂醯膽鹼)、DOPE (1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DSPC (二硬脂醯基磷脂醯膽鹼)、雞蛋L-α-磷脂醯膽鹼(EPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)及SM (鞘髓磷脂)。在一些實施例中，中性脂質係DSPC (二硬脂醯基磷脂醯膽鹼)。在一些實施例中，該組合物包括佔總組合物約1.0莫耳%至約20.0莫耳%或約5.0莫耳%至約10.0莫耳%之DSPC。在一些實施例中，該組合物包括佔總組合物約1.0莫耳%、約1.5莫耳%、約2.0莫耳%、約2.5莫耳%、約3.0莫耳%、約3.5莫耳%、約4.0莫耳%、約4.5莫耳%、約5.0莫耳%、約5.5莫耳%、約6.0莫耳%、約6.5莫耳%、約7.0莫耳%、約7.5莫耳%、約8.0莫耳%、約8.5莫耳%、約9.0莫耳%、約9.5莫耳%、約10.0莫耳%、約10.5莫耳%、約11.0莫耳%、約11.5莫耳%、約12.0莫耳%、約12.5莫耳%、約13.0莫耳%、約13.5莫耳%、約14.0莫耳%、約14.5莫耳%、約15.0莫耳%、約15.5莫耳%、約16.0莫耳%、約16.5莫耳%、約17.0莫耳%、約17.5莫耳%、約18.0莫耳%、約18.5莫耳%、約19.0莫耳%、約19.5莫耳%或約20.0莫耳%之DSPC。在一些實施例中，該組合物包括約10莫耳%之DSPC。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒進一步包括一或多種陰離子脂質。陰離子脂質係在生理學pH下攜載淨負電荷之脂質。在與陽離子脂質組合使用時，陰離子脂質可減小脂質顆粒之整體表面電荷，及/或引入脂質結構之pH依賴性破壞，促進調配於脂質顆粒中之治療劑(例如siRNA分子)之釋放。陰離子脂質可包含(但不限於)脂肪酸(例如油酸、亞油酸、亞麻酸)；半琥珀酸膽固醇基酯(CHEMS)；1,2-二-0-十四烷基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油) (二醚PG)；1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油) (鈉鹽)；1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸(鈉鹽)；1-十六烷醯基,2-(9Z,12Z)-十八烷二烯醯基-sn-甘油-3-磷酸鹽；1,2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)] (DOPG)；二油醯基磷脂酸(DOPA)；1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸(DOPS)；及其衍生物。適宜陰離子脂質之其他實例包含(但不限於)：脂肪酸，例如油酸、亞油酸及亞麻酸；及半琥珀酸膽固醇基酯。該等脂質可單獨或組合用於各種目的，例如使配體附接至脂質體表面。
脂質奈米顆粒亦可包含一或多種能夠減小聚集之脂質。在調配期間減小顆粒聚集之脂質之實例包含PEG脂質(例如DMG-PEG (1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇-PEG)、DMA-PEG (聚(乙二醇)-二甲基丙烯酸酯-PEG)及DMPE-PEG550 (1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550]), PEG)、單唾液酸神經節苷酯Gml及聚醯胺寡聚物(PAO) (例如美國專利第6,320,017號中所闡述者)。脂質奈米顆粒可包含DMPE-PEG2000或可經DMPE-PEG2000取代之DMG-PEG (在本文所教示之任一調配物中)。其他適宜PEG脂質包含(但不限於)經PEG修飾之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、PEG-神經醯胺偶聯物(例如PEG-CerC14 或PEG-CerC20 ) (例如美國專利第5,820,873號中所闡述者)、經PEG修飾之二烷基胺及經PEG修飾之1,2-二醯基氧基丙烷-3-胺、經PEG修飾之二醯基甘油及二烷基甘油、mPEG (mw2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(PEG-DSPE)。
在一些實施例中，能夠減小聚集之脂質係DMPE-PEG2000或DMG-PEG (1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇, PEG)。在一些實施例中，該組合物包括約0.1莫耳%至約5.0莫耳%之DMPE-PEG2000或DMG-PEG (亦即約0.1%至約5.0% DMPE-PEG2000或0.1%至約5.0% DMG-PEG)或約0.5莫耳%至2.0莫耳%之DMPE-PEG2000或DMG-PEG。在一些實施例中，該組合物包括佔總組合物約0.1莫耳%、約0.2莫耳%、約0.3莫耳%、約0.4莫耳%、約0.5莫耳%、約0.6莫耳%、約0.7莫耳%、約0.8莫耳%、約0.9莫耳%、約1.0莫耳%、約1.1莫耳%、約1.2莫耳%、約1.3莫耳%、約1.4莫耳%、約1.5莫耳%、約1.6莫耳%、約1.7莫耳%、約1.8莫耳%、約1.9莫耳%、約2.0莫耳%、約2.1莫耳%、約2.2莫耳%、約2.3莫耳%、約2.4莫耳%、約2.5莫耳%、約2.6莫耳%、約2.7莫耳%、約2.8莫耳%、約2.9莫耳%、約3.0莫耳%、約3.1莫耳%、約3.2莫耳%、約3.3莫耳%、約3.4莫耳%、約3.5莫耳%、約3.6莫耳%、約3.7莫耳%、約3.8莫耳%、約3.9莫耳%、約4.0莫耳%、約4.1莫耳%、約4.2莫耳%、約4.3莫耳%、約4.4莫耳%、約4.5莫耳%、約4.6莫耳%、約4.7莫耳%、約4.8莫耳%、約4.9莫耳%或約5.0莫耳%之DMPE-PEG2000或DMG-PEG。在一些實施例中，該組合物包括約1.5莫耳%之DMPE-PEG2000或DMG-PEG。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒進一步包括固醇。在一些實施例中，固醇為膽固醇。在一些實施例中，該組合物包括約10.0莫耳%至約50.0莫耳%之膽固醇或約15.0莫耳%至約40.0莫耳%之膽固醇。在一些實施例中，該組合物包括約10.0莫耳%、約11.0莫耳%、約11.5莫耳%、約12.0莫耳%、約12.5莫耳%、約13.0莫耳%、約13.5莫耳%、約14.0莫耳%、約14.5莫耳%、約15.0 莫耳%、約15.5莫耳%、約16.0莫耳%、約16.5莫耳%、約17.0莫耳%、約17.5莫耳%、約18.0莫耳%、約18.5莫耳%、約19.0莫耳%、約19.5莫耳%、約20.0莫耳%、約20.5莫耳%、約21.0莫耳%、約21.5莫耳%、約22.0莫耳%、約22.5莫耳%、約23.0莫耳%、約23.5莫耳%、約24.0莫耳%、約24.5莫耳%、約25.0莫耳%、約25.5莫耳%、約26.0莫耳%、約26.5莫耳%、約27.0莫耳%、約27.5莫耳%、約28.0莫耳%、約28.5莫耳%、約29.0莫耳%、約29.5莫耳%、約30.0莫耳%、約30.5莫耳%、約31.0莫耳%、約31.5莫耳%、約32.0莫耳%、約32.5莫耳%、約33.0莫耳%、約33.5莫耳%、約34.0莫耳%、約34.5莫耳%、約35.0莫耳%、約35.5莫耳%、約36.0莫耳%、約36.5莫耳%、約37.0莫耳%、約37.5莫耳%、約38.0莫耳%、約38.5莫耳%、約39.0莫耳%、約39.5莫耳%或約40.0%之膽固醇。在一些實施例中，該組合物包括約38.5莫耳%之膽固醇。
可增加或降低LNP調配物中之PEG之比率及/或可將PEG脂質之碳鏈長度自C14修飾至C18以改變LNP調配物之藥物動力學及/或生物分佈。
在一些實施例中，本文所闡述之脂質奈米顆粒進一步包括一或多種能夠增強脂質奈米顆粒及/或其囊封組合物(例如基因沉默劑、siRNA分子、肽等)之細胞攝取或胞質分佈之化合物。可增強細胞攝取之化合物可包含左旋多巴(levodopa)、萘甲唑啉鹽酸鹽(naphazoline hydrochloride)、乙酸已脲(acetohexamide)、氯硝柳胺(niclosamide)、二羥丙茶鹼(diprophylline)及伊索昔康(isoxicam)或其組合。可增強胞質分佈之化合物可包含氮雜鳥嘌呤-8、乙酸異氟普酮(isoflupredone acetate)、氯喹(chloroquine)、曲美苄胺鹽酸鹽(trimethobenzamide hydrochloride)、異舒普林鹽酸鹽(isoxsuprine hydrochloride)及甲硫酸二苯甲哌(diphemanil methylsulfate)或其組合。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒包括囊封本發明所涵蓋之一或多種藥劑(例如與本文所闡述之至少一種生物標記物之mRNA轉錄產物足夠互補之siRNA分子)之脂質雙層。在一些實施例中，調配脂質奈米顆粒以促進細胞中之攝取。在一些實施例中，調配脂質奈米顆粒以促進單核球、樹突狀細胞及/或巨噬細胞中之攝取。
在一些態樣中，脂質奈米顆粒可進一步包括其他試劑。在一些實施例中，脂質奈米顆粒進一步包括一或多種抗氧化劑。不期望受限於任一特定理論，抗氧化劑可幫助穩定脂質奈米顆粒且防止、降低及/或抑制囊封於脂質奈米顆粒中之陽離子脂質及/或活性劑之降解。在一些實施例中，抗氧化劑係親水性抗氧化劑、親脂性抗氧化劑、金屬螯合劑、一級抗氧化劑、二級抗氧化劑或鹽或其混合物。在一些實施例中，抗氧化劑包括EDTA或其鹽。在一些實施例中，脂質奈米顆粒進一步包括EDTA與1、2、3、4、5、6、7、8種或更多種其他抗氧化劑(例如一級抗氧化劑、二級抗氧化劑或其他金屬螯合劑)之組合。抗氧化劑之實例包含(但不限於)親水性抗氧化劑、親脂性抗氧化劑及其混合物。親水性抗氧化劑之非限制性實例包含螯合劑(例如金屬螯合劑)，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸鹽、乙二醇四乙酸(EGTA)、1,2-雙(鄰-胺基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸(BAPTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、2,3-二巰基-1-丙烷磺酸(DMPS)、二巰基琥珀酸(DMSA)、cc-硫辛酸、水楊醛異菸醯腙(SIR)、己基硫基乙基胺鹽酸鹽(HTA)、去鐵胺、其鹽及其混合物。其他親水性抗氧化劑包含抗壞血酸、半胱胺酸、麩胱甘肽、二氫硫辛酸、2-巰基乙烷磺酸、2-巰基苯并咪唑磺酸、6-羥基-2,5,7,8-四甲基𠳭烷-2-甲酸、偏亞硫酸氫鈉、其鹽及其混合物。親脂性抗氧化劑之非限制性實例包含維他命E異構體，例如α-、β-、γ-及δ生育酚及α-、β-、γ-及δ-生育三烯酸；多酚，例如2-第三丁基-4-甲基酚、2-第三丁基-5-甲基酚及2-第三丁基-6-甲基酚；丁基化羥基苯甲醚(BHA) (例如2-第三丁基-4-羥基苯甲醚及3-第三丁基-4-羥基苯甲醚)；丁基羥基苯(BHT)；第三丁基氫醌(TBHQ)；棕櫚酸抗壞血酸基酯；rc-沒食子酸丙酯；其鹽；及其混合物。
在一些實施例中，經調配用於遞送一或多種藥劑(例如基因沉默劑、siRNA分子、肽)之基於脂質之顆粒係選自脂質載體、脂質體、脂質複合物、脂質奈米顆粒及微胞。在一些實施例中，基於脂質之顆粒係pH敏感性奈米顆粒。該等pH敏感性奈米顆粒(PNSDS)係包括經由酸不穩定縮醛連接體與多臂聚(乙二醇)載體以化學方式交聯之siRNA之無正電荷奈米載體，其可有益地用於遞送siRNA分子(Tang 等人，SiRNA Crosslinked Nanoparticles for the Treatment of Inflammation-induced Liver Injury,Advanced Science, 2016, 4(2), e1600228)。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒進一步包括一或多種C12-200胺基醇脂質。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包括約40.0莫耳%至約50.0莫耳%之C12-200。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包括約5.0莫耳%至約10.0莫耳%之DSPC。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包括約1.0莫耳%至約2.0莫耳%之DMG-PEG。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包括約20.0莫耳%至約40.0莫耳%之膽固醇。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包括50莫耳% C12-200、10.0莫耳% DSPC、1.5莫耳% DMG-PEG及38.5莫耳%膽固醇。
在一些實施例中，調配物內之總siRNA分子莫耳數對總脂質莫耳數介於約1:5至約1:20之間。在一些實施例中，總siRNA分子莫耳數對總脂質莫耳數為約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、約1:9、約1:10、約1:11、約1:12、約1:13、約1:14、約1:15、約1:16、約1:17、約1:18、約1:18、約1:19或約1:20。在一些實施例中，總siRNA分子莫耳數對總脂質莫耳數為約1:9。
在一些實施例中，使用自發性囊泡形成調配程序來調配脂質奈米顆粒(LNP)以囊封藥劑(例如siRNA)，如先前在Semple等人(2010)Nat. Biotechnol. 28172–28176中所闡述。
在一些實施例中，調配物中與本文所闡述至少一種生物標記物之mRNA轉錄產物足夠互補之本發明所涵蓋之一或多種藥劑(例如siRNA分子)的總濃度為約0.001mg/ml至約100 mg/ml、約0.01 mg/ml至約10 mg/ml或約0.1 mg/ml至約20mg/ml。在一些實施例中，兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或所有六種siRNA分子之總濃度為約0.001 mg/ml至約100 mg/ml、約0.01 mg/ml至約10 mg/ml或約0.1 mg/ml至約20 mg/ml。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)之大小範圍為約40 nm至約200 nm或約50 nm至約100nm。在一些實施例中，脂質奈米顆粒之大小為約40 nm、約45 nm、約50 nm、約55 nm、約60 nm、約65 nm、約70 nm、約75 nm、約80 nm、約85 nm、約90 nm、約95 nm、約100 nm、約110 nm、約120 nm、約130 nm、約140 nm、約150 nm、約160 nm、約170 nm、約180 nm或約200  nm。在一些實施例中，脂質奈米顆粒之大小為約80 nm。
根據本發明，如本文所闡述之調配物係穩定的。本文所用之術語「穩定」意指保持適於投與患者之狀態或條件。在一些實施例中，調配物係實質上純的。如本文中所使用，「實質上純」意指，活性成分(例如與本文所闡述之至少一種生物標記物之mRNA轉錄產物足夠互補之siRNA分子)係存在於調配物中之主要物質。在一些實施例中，實質上純之組合物包括含有80%以上之大分子物質(例如活性劑、基因沉默劑、siRNA分子、其他試劑(例如抗氧化劑))之組合物。在一些實施例中，實質上純之組合物包括含有大於85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之大分子物質之組合物。在一些實施例中，將一或多種活性劑純化至基本均質性(亦即，藉由習用檢測方法在組合物中檢測不到污染物物質)，其中該組合物基本上由單一大分子物質組成。
可使用其他奈米顆粒作為本文所闡述之藥劑及組合物之遞送媒劑。在一些實施例中，奈米顆粒包括經化學及/或酶促修飾之脂蛋白(例如載脂蛋白，如美國專利公開案第2011/0256224號中所闡述)。在一些實施例中，奈米顆粒包括其他基於脂蛋白之奈米顆粒，例如HDL、HDL樣脂蛋白顆粒或合成HDL樣顆粒(例如參見美國專利公開案第2009/0110739號；及美國專利第7,824,709號)。
在一些實施例中使用，具有增加之巨噬細胞靶向遞送之奈米顆粒來囊封如本文所闡述之組合物。在一些實施例中，奈米顆粒係包括1,3-D-葡聚糖之GP奈米顆粒(Soto等人(2012)J. Drug. Deliv . e143524)或甘露糖基化幾丁聚醣(MCS)奈米顆粒(Peng等人(2015)J. Nanosci. Nanotechnol . 15:2619-2627)。
奈米顆粒調配物可為包括碳水化合物載劑之碳水化合物奈米顆粒。作為一非限制性實例，碳水化合物載劑可包含(但不限於)經酐修飾之植物醣原或醣原型材料、植物醣原琥珀酸辛烯基酯、植物醣原β-糊精、經酐修飾之植物醣原β-糊精。(例如參見PCT公開案第WO 2012/109121號)。
在一些實施例中，可改造脂質奈米顆粒以改變顆粒之表面性質，從而脂質奈米顆粒可滲透黏膜障壁。黏膜位於黏膜組織上，該等黏膜組織係(例如但不限於)口腔(例如頰膜及食管膜以及扁桃體組織)、眼部、胃腸道(例如胃、小腸、大腸、結腸、直腸)、鼻、呼吸道(例如鼻、咽、氣管及支氣管膜)、生殖器(例如陰道、子宮頸及尿道膜)。大於10-200 nm之奈米顆粒對於較高藥物囊封效率及能夠持續遞送眾多種藥物而言係較佳的，據信，其過大以致不能快速擴散穿過黏膜障壁。連續分泌黏液，流出，棄除或消解且再循環，從而可在數秒內或數小時內自黏膜組織去除大部分所捕集顆粒。經低分子量聚乙二醇(PEG)緻密塗覆之大聚合奈米顆粒(直徑為200nm -500nm)僅以低於相同顆粒在水中之擴散4至6倍之速率擴散穿過黏液(Lai等人(2007)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:1482-1487；Lai等人(2009)Adv Drug Deliv Rev . 61:158-171)。可使用滲透速率及/或螢光顯微術技術(包含(但不限於)光漂白後之螢光恢復(FRAP)及高解析度多顆粒追蹤(MPT))來測定奈米顆粒之傳輸。作為一非限制性實例，可如美國專利第8,241,670號中所闡述來製備可滲透黏膜障壁之組合物。
經改造以滲透黏液之脂質奈米顆粒可包括聚合材料(亦即聚合核心)及/或聚合物-維他命偶聯物及/或三嵌段共聚物。聚合材料可包含(但不限於)聚胺、聚醚、聚醯胺、聚酯、聚胺基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚醯亞胺、聚碸、聚胺基甲酸酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚異氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈及聚芳基酯。聚合材料可具有生物可降解及/或生物相容性。可另外輻照聚合材料。作為一非限制性實例，可對聚合材料實施γ輻照(例如參見PCT公開案第WO 2012/082165號)。具體聚合物之非限制性實例包含聚(己內酯) (PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸) (PLA)、聚(L-乳酸) (PLLA)、聚(乙醇酸) (PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸) (PLLGA)、聚(D,L-乳酸交酯) (PDLA)、聚(L-乳酸交酯) (PLLA)、聚(D,L-乳酸交酯-共-己內酯)、聚(D,L-乳酸交酯-共-己內酯-共-乙交酯)、聚(D,L-乳酸交酯-共-PEO-共-D,L-乳酸交酯)、聚(D,L-乳酸交酯-共-PPO-共-D,L-乳酸交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚胺基甲酸酯、聚-L-離胺酸(PLL)、甲基丙烯酸羥丙基酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-麩胺酸、聚(羥基酸)、聚酐、聚原酸酯、聚(酯醯胺)、聚醯胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烴(例如聚乙烯及聚丙烯)、聚伸烷基二醇(例如聚(乙二醇) (PEG))、聚環氧烷(PEO)、聚伸烷基對苯二甲酸酯(例如聚(對苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯(例如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯基鹵化物(例如聚(氯乙烯) (PVC))、聚乙烯基吡咯啶酮、聚矽氧烷、聚苯乙烯 (PS)、聚胺基甲酸酯、衍生纖維素(例如烷基纖維素、羥基烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素)、丙烯酸聚合物(例如聚((甲基)丙烯酸甲酯) (PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸異丁基酯)、聚((甲基)丙烯酸己基酯)、聚((甲基)丙烯酸異癸基酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂基酯)、聚((甲基)丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙基酯)、聚(丙烯酸異丁基酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)及其共聚物及混合物)、聚二氧雜環己酮及其共聚物、聚羥基烷酸酯、聚富馬酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(乳酸交酯-共-己內酯)及碳酸三亞甲基酯、聚乙烯基吡咯啶酮。脂質奈米顆粒可經共聚物塗覆或與其締合，該共聚物係(例如但不限於)嵌段共聚物及(聚(乙二醇))-(聚(環氧丙烷))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(例如參見美國專利公開案第2012/0121718號及第2010/0003337號；及美國專利第8,263,665號)。共聚物可為通常認為安全(GRAS)之聚合物且可以不產生新化學實體之方式來形成脂質奈米顆粒。舉例而言，脂質奈米顆粒可包括泊洛沙姆塗層PLGA奈米顆粒，其並不形成仍能夠快速滲透人類黏液之新化學實體(Yang等人(2011)Angew. Chem. Int. Ed . 50:2597-2600)。
舉例而言，本發明所涵蓋之LNP可包括PLGA-PEG嵌段共聚物(例如參見美國專利公開案第2012/0004293號及美國專利第8,236,330號)；PEG及PLA或PEG及PLGA之二嵌段共聚物(例如參見美國專利第8,246,968號)；多嵌段共聚物(例如參見美國專利第8,263,665號及第8,287,910號)；包括非聚合微胞及嵌段共聚物之多離子複合物(例如參見美國專利公開案第2012/00768號)；或含胺聚合物，例如(但不限於)聚離胺酸、聚乙烯亞胺、聚(醯胺基胺)樹枝狀聚合物、聚(β-胺基酯) (例如參見美國專利第8,287,849號)。
本發明所涵蓋之LNP可包括一或多種其他聚合物(例如丙烯酸聚合物)。丙烯酸聚合物可包含(但不限於)丙烯酸、甲基丙烯酸及甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其組合。
本發明所涵蓋之LNP可包括至少一種可含有多陽離子側鏈之可降解聚酯。可降解聚酯包含(但不限於)聚(絲胺酸酯)、聚(L-乳酸交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在另一實施例中，可降解聚酯可包含PEG偶聯以形成聚乙二醇化聚合物。LNP可進一步包含至少一種靶向配體。靶向配體可業內已知之任一配體，例如(但不限於)單株抗體(Kirpotin等人(2006)Cancer Res . 66:6732-6740)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之組合物可調配為固體脂質奈米顆粒。固體脂質奈米顆粒(SLN)可為球形且平均直徑介於10 nm至1000 nm之間。SLN擁有可溶解親脂性分子且可經表面活性劑及/或乳化劑穩定之固體脂質核心基質。在另一實施例中，脂質奈米顆粒可為自組裝脂質-聚合物奈米顆粒(例如參見Zhang等人(2008)ACS Nano 2 :1696-1702)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之藥劑可為持續釋放調配物(例如囊封至奈米顆粒或快速消除性奈米顆粒中)且該等奈米顆粒或快速消除性奈米顆粒可然後囊封至本文所闡述及/或業內已知之聚合物、水凝膠及/或手術密封劑。作為一非限制性實例，聚合物、水凝膠或手術密封劑可為PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL)、HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA)、手術密封劑(例如纖維蛋白原聚合物(Ethicon Inc. Cornelia, GA)、TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL)、基於PEG之密封劑及COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL)。在另一實施例中，可使奈米顆粒囊封至可在注射至個體中時形成凝膠之業內已知之任一聚合物中。作為一非限制性實例，可使奈米顆粒囊封至可生物可降解之聚合物基質中。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之組合物可調配為受控釋放奈米顆粒。在一實例中，用於受控釋放及/或靶向遞送之奈米顆粒調配物可進一步包含至少一個受控釋放塗層。受控釋放塗層包含(但不限於) OPADRY®、聚乙烯基吡咯啶酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯基吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、EUDRAGIT RL®、EUDRAGIT RS®及纖維素衍生物(例如乙基纖維素水性分散液(AQUACOAT®及SURELEASE®))。在另一實例中，受控釋放及/或靶向遞送調配物可包括至少一種可含有多陽離子側鏈之可降解聚酯。可降解聚酯包含(但不限於)聚(絲胺酸酯)、聚(L-乳酸交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。
在另一實施例中，可降解聚酯可包含PEG偶聯以形成聚乙二醇化聚合物。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之組合物可調配為脂質複合物，例如(但不限於) ATUPLEXTM 系統、DACC系統、DBTC系統及來自Silence Therapeutics (London, United Kingdom)之其他偶聯物-脂質複合物技術、來自STEMGENT® (Cambridge, MA)之STEMFECTTM 及基於聚乙烯亞胺(PEI)或魚精蛋白之靶向及非靶向治療劑遞送(Aleku等人(2008)Cancer Res . 68: 9788-9798；Strumberg等人(2012)Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. (2012) 50:76-78；Santel等人(2006)Gene Ther. 13:1222-1234；Santel等人(2006)Gene Ther. 13:1360-1370；Gutbier等人(2010)Pulm. Pharmacol. Ther. 23:334-344；Kaufmann等人(2010)Microvasc. Res. 80:286-293；Weide等人(2009)J. Immunother. 32:498-507；Weide等人(2008)J. Immunother . 31:180-188；Pascolo (2004)Exp. Opin. Biol. Ther . 4:1285-1294；Fotin-Mleczek等人(2011)J. Immunother . 34:1-15；Song等人(2005)Nature Biotechnol . 23:709-717；Peer等人(2007)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 6:4095-4100；及deFougerolles (2008)Hum. Gene Ther. 19:125-132)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之治療劑及組合物可囊封於合成奈米載體中，與其連接至及/或締合。合成奈米載體包含(但不限於)闡述於以下案件中者：國際公開案第WO 2010/005740號、第WO 2010/030763號、第WO 2012/13501號、第WO 2012/149252號、第WO 2012/149255號、第WO 2012/149259號、第WO 2012/149265號、第WO 2012/149268號、第WO 2012/149282號、第WO 2012/149301號、第WO 2012/149393號、第WO 2012/149405號、第WO 2012/149411號及第WO 2012/149454號及美國專利公開案第2011/0262491號、第2010/0104645號、第2010/0087337號及第2012/0244222號。在另一實施例中，可(例如)藉由PCT公開案第WO 2011/072218號及美國專利第8,211,473號中所闡述之方法來凍乾合成奈米載體調配物。
在一些實施例中，合成奈米載體可含有反應性基團以釋放本文所闡述之偶聯物(例如參見PCT公開案第WO 2012/0952552號及美國專利公開案第2012/0171229號)。在一實施例中，合成奈米載體可經調配用於靶向釋放。在一實施例中，調配合成奈米載體以在指定pH下及/或在期望時間間隔之後釋放治療劑。作為一非限制性實例，可調配合成奈米顆粒以在24小時之後及/或在pH 4.5下釋放偶聯物(例如參見PCT公開案第WO 2010/138193號及第WO 2010/138194號及美國專利公開案第2011/0020388號及第2011/0027217號)。在一些實施例中，合成奈米載體可經調配用於受控及/或持續釋放本文所闡述之偶聯物。作為一非限制性實例，可藉由業內已知、本文所闡述及/或如PCT公開案第WO 2010/138192號及美國專利公開案第2010/0303850號中所闡述之方法來調配用於持續釋放之合成奈米載體。
在一些實施例中，可最佳化奈米顆粒以用於經口投與。奈米顆粒可包括至少一種陽離子生物聚合物，例如(但不限於)幾丁聚醣或其衍生物。作為一非限制性實例，可藉由美國專利公開案第20120282343號中所闡述之方法來調配奈米顆粒。
在一些實施例中，亦可使用天然及/或合成聚合物來調配本發明所涵蓋之藥劑。可用於藥物遞送之聚合物之非限制性實例包含(但不限於)來自MIRUS® Bio (Madison, WI)及Roche Madison (Madison, WI)之DYNAMIC聚CONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, CA)調配物、PHASERXTM 聚合物調配物(例如(但不限於) SMARTT聚MER TECHNOLOGY™ (Seattle, WA))、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、來自Vical (San Diego, CA)之VAXFECTIN®佐劑、幾丁聚醣、來自Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA)之環糊精、樹枝狀聚合物及聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)聚合物、RONDELTM (RNAi/寡核苷酸奈米顆粒遞送)聚合物(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA)及pH反應性嵌段共聚物(例如(但不限於) PHASERXTM (Seattle, WA))。舉例而言，本發明所涵蓋之藥劑及組合物可調配成包含以下各項之醫藥化合物：聚(伸烷基亞胺)、生物可降解陽離子脂質聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解聚合物或生物可降解隨機共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯聚合物、生物可降解聚酯隨機共聚物、線性生物可降解共聚物、PAGA、生物可降解交聯陽離子多嵌段共聚物或其組合。
本發明所用之聚合物可經受處理以減小及/或抑制不期望物質(例如(但不限於)細菌)與聚合物表面之附接。可藉由業內已知及/或闡述及/或PCT公開案第WO 2011/50467號中所闡述之方法來處理聚合物。
奈米顆粒可含有一或多種聚合物。聚合物可含有下列聚酯中之一或多者：包含羥乙酸單元(在本文中稱為「PGA」)及乳酸單元(例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-乳酸交酯、聚-D-乳酸交酯及聚-D,L-乳酸交酯，在本文中通稱為「PLA」)及己內酯單元(例如聚((-己內酯)，在本文中通稱為「PCL」)之均聚物；及包含乳酸及羥乙酸單元(例如各種形式之聚(乳酸-共-乙醇酸)及聚(乳酸交酯-共-乙交酯)，其特徵在於乳酸:乙醇酸之比率，在本文中通稱為「PLGA」)及聚丙烯酸酯之共聚物；及其衍生物。實例性聚合物亦包含聚乙二醇(PEG)及上文所提及聚酯之共聚物，例如各種形式之PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，其在本文中通稱為「聚乙二醇化聚合物」。在某些實施例中，PEG區域可藉由可裂解連接體與聚合物共價締合以產生「聚乙二醇化聚合物」。
奈米顆粒可含有一或多種親水性聚合物。親水性聚合物包含纖維質聚合物，例如澱粉及多醣；親水性多肽；聚(胺基酸)，例如聚-L-麩胺酸(PGS)、γ-聚麩胺酸、聚-L-天門冬胺酸、聚-L-絲胺酸或聚-L-離胺酸；聚伸烷基二醇及聚環氧烷，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)及聚(環氧乙烷) (PEO)；聚(氧基乙基化多元醇)；聚(烯系醇)；聚乙烯基吡咯啶酮)；聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)；聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)；聚(醣)；聚(羥基酸)；聚(乙烯醇)；聚噁唑啉；及其共聚物。
奈米顆粒可含有一或多種疏水性聚合物。適宜疏水性聚合物之實例包含聚羥基酸，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)及聚(乳酸-共-乙醇酸)； 聚羥基烷酸酯，例如聚3-羥基丁酸酯或聚4-羥基丁酸酯；聚己內酯；聚(原酸酯)；聚酐；聚(膦氮烯)；聚(乳酸交酯-共-己內酯)；聚碳酸酯，例如酪胺酸聚碳酸酯；聚醯胺(包含合成及天然聚醯胺)、多肽及聚(胺基酸)；聚酯醯胺；聚酯；聚(二氧雜環己酮)；聚(伸烷基烷基化物)；疏水性聚醚；聚胺基甲酸酯；聚醚酯；聚縮醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚矽氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚縮酮；聚磷酸酯；聚羥基戊酸酯；聚草酸伸烷基酯；聚琥珀酸伸烷基酯；聚(馬來酸)以及其共聚物。
在某些實施例中，疏水性聚合物係脂肪族聚酯。在一些實施例中，疏水性聚合物係聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(乳酸-共-乙醇酸)。
奈米顆粒可含有一或多種兩親性聚合物。兩親性聚合物可為含有疏水性聚合物嵌段及親水性聚合物嵌段之聚合物。疏水性聚合物嵌段可含有一或多種上述疏水性聚合物或其衍生物或共聚物。親水性聚合物嵌段可含有一或多種上述親水性聚合物或其衍生物或共聚物。在一些實施例中，兩親性聚合物係含有自疏水性聚合物形成之疏水端及自親水性聚合物形成之親水端之二嵌段聚合物。在一些實施例中，可使某一部分附接至疏水端、親水端或二者。該顆粒可含有兩種或更多種兩親性聚合物。
聚合物亦可包含(但不限於)聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、聚(l-離胺酸) (PLL)、接枝至PLL之PEG、陽離子脂質聚合物、生物可降解陽離子脂質聚合物、聚乙烯亞胺(PEI)、交聯具支鏈聚(伸烷基亞胺)、聚胺衍生物、經改質泊洛沙姆、生物可降解聚合物、彈性生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解隨機共聚物、生物可降解聚酯共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯嵌段隨機共聚物、多嵌段共聚物、線性生物可降解共聚物、聚[α-(4-胺基丁基)-L-乙醇酸) (PAGA)、生物可降解交聯陽離子多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酐、聚羥基酸、聚富馬酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚膦氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-乳酸交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)、丙烯酸聚合物、含胺聚合物、右旋糖酐聚合物、右旋糖酐聚合物衍生物或其組合。
聚合物可為可交聯聚酯。可交聯聚酯包含業內已知且闡述於美國專利公開案第2012/0269761號中者。
奈米顆粒可含有一或多種生物可降解聚合物。生物可降解聚合物可包含不溶或微溶於水中且在身體中以化學方式或以酶促方式轉化成水溶性材料之聚合物。生物可降解聚合物可包含藉由可水解交聯基團交聯以致使交聯聚合物不溶或微溶於水中之可溶性聚合物。
生物可降解聚合物可包含聚醯胺、聚碳酸酯、聚伸烷基、聚伸烷基二醇、聚環氧烷、聚對苯二甲酸伸烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚乙烯基鹵化物、聚乙烯基吡咯啶酮、聚乙交酯、聚矽氧烷、聚胺基甲酸酯及其共聚物、烷基纖維素(例如甲基纖維素及乙基纖維素)、羥基烷基纖維素(例如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素及羥丁基甲基纖維素)、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧基乙基纖維素、三乙酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽、丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯之聚合物(例如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁基酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸基酯)、聚(甲基丙烯酸月桂基酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙基酯)、聚(丙烯酸異丁基酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯))、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(對苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯及聚乙烯基吡咯啶酮、其衍生物、其線性及具支鏈共聚物及嵌段共聚物及其摻合物。實例性生物可降解聚合物包含聚酯、聚(原酸酯)、聚(乙烯亞胺)、聚(己內酯)、聚(羥基烷酸酯)、聚(羥基戊酸酯)、聚酐、聚(丙烯酸)、聚乙交酯、聚(胺基甲酸酯)、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚膦氮烯、其衍生物、其線性及具支鏈共聚物及嵌段共聚物及其摻合物。在一些實施例中，該顆粒含有生物可降解聚酯或聚酐，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)及聚(乳酸-共-乙醇酸)。
可降解聚酯可含有多陽離子側鏈。可降解聚酯包含(但不限於)聚(絲胺酸酯)、聚(L-乳酸交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在另一實施例中，可降解聚酯可包含PEG偶聯以形成聚乙二醇化聚合物。
可藉由業內已知方法(例如美國專利第6,696,038號及美國專利公開案第2003/0073619號及第2004/0142474號中所闡述者)來製備生物可降解陽離子脂質聚合物。可使用業內已知方法(例如美國專利公開案第2010/0004315號中所闡述者)來製備聚(伸烷基亞胺)。可使用業內已知方法(例如美國專利第6,517,869號及第6,267,987號中所闡述者)來製備生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解隨機共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯聚合物或生物可降解聚酯隨機共聚物。可使用業內已知方法(例如美國專利第6,652,886號中所闡述者)來製備線性生物可降解共聚物。可使用業內已知方法(例如美國專利第6,217,912號中所闡述者)來製備PAGA聚合物。可使PAGA聚合物與諸如(但不限於)聚-L-離胺酸、聚精胺酸、聚鳥胺酸、組織蛋白、抗生物素蛋白、魚精蛋白、聚交酯及聚(乳酸交酯-共-乙交酯)等聚合物共聚合以形成共聚物或嵌段共聚物。可使用業內已知方法(例如美國專利第8,057,821號及美國專利公開案第2012/009145號中所闡述者)來製備生物可降解交聯陽離子多嵌段共聚物。舉例而言，可使用與具支鏈聚乙烯亞胺相比具有不同模式之線性聚乙烯亞胺(LPEI)嵌段來合成多嵌段共聚物。
本文所闡述之聚合物可偶聯至脂質封端性PEG。作為一非限制性實例，PLGA可偶聯至脂質封端性PEG以形成PLGA-DSPE-PEG。作為另一非限制性實例，用於本發明之PEG偶聯物闡述於PCT公開案第WO 2008/103276號中。可使用配體偶聯物(例如(但不限於)美國專利第8,273,363號中所闡述之偶聯物)來偶聯聚合物。
聚合物奈米顆粒亦可包括幾丁聚醣。幾丁聚醣調配物包含帶正電幾丁聚醣之核心及帶負電基質之外側部分(例如參見美國專利公開案第2012/0258176號)。幾丁聚醣包含(但不限於) N-三甲基幾丁聚醣、單-N-羧基甲基幾丁聚醣(MCC)、N-棕櫚醯基幾丁聚醣(NPCS)、EDTA-幾丁聚醣、低分子量幾丁聚醣、幾丁聚醣衍生物或其組合。
聚合物奈米顆粒亦可包括PLGA。PLGA調配物可包含(但不限於) PLGA可注射儲積物(例如ELIGARD®，其係藉由將PLGA溶於66% N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)在所形成，且其餘組分係水性溶劑及柳培林(leuprolide)。在注射後，PLGA及柳培林肽立即沈澱至皮下空間中。在其他實例中，可藉由以下方式來調配PLGA微球體：以可調釋放速率(例如數天及數週)製備PLGA微球體且將活性劑囊封於PLGA微球體中，同時在囊封製程期間維持藥劑完整性。
在一些實施例中，可使用Evac，其係廣泛用於臨床前持續釋放植入應用(例如延遲釋放產品Ocusert (用於青光眼之匹魯卡品(pilocarpine)眼部插入物)或progestasert (持續釋放助孕酮子宮內裝置)；經皮遞送系統Testoderm、Duragesic及Selegiline；及導管)之非生物可降解、生物相容聚合物。泊洛沙姆F-407 NF係一種親水性、非離子型表面活性劑，其係聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯之三嵌段共聚物，在小於5℃之溫度下具有低黏度且在大於15℃之溫度下形成固體凝膠。基於PEG之手術密封劑包括混合於遞送裝置中之兩種合成PEG組分，該等手術密封劑可在一分鐘內製得，在3分鐘內密封且在30天內再吸收。GELSITE®及天然聚合物能夠在投與部位原位膠凝。其已展示與蛋白質及肽治療候選物經由離子型相互作用發生相互作用以提供穩定效應。
用於本發明之聚合物奈米顆粒之其他代表性實例包含接枝有PLL之PEG之聚合化合物(如美國專利第6,177,274號中所闡述)以及呈含有陽離子聚合物之溶液或介質、乾燥醫藥組合物或能夠乾燥之溶液之形式之懸浮液(如美國專利公開案第2009/0042829號及第2009/0042825號中所闡述)。
可使用聚胺衍生物來遞送本發明所涵蓋之治療劑及組合物或治療及/或預防疾病或納入可植入或可注射裝置中(美國專利公開案第2010/0260817號)。作為一非限制性實例，可使用包括1,3-雙極性加成聚合物之聚醯胺聚合物來遞送本發明所涵蓋之藥劑，該1,3-雙極性加成聚合物係藉由組合碳水化合物二疊氮化物單體與包括寡胺之二炔烴單元來製備(美國專利第8,236,280號)。
其他聚合物可包含丙烯酸聚合物，例如丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸及甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸胺基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其組合；或含胺聚合物，例如(但不限於)聚離胺酸、聚乙烯亞胺、聚(醯胺基胺)樹枝狀聚合物或其組合；或PEG-電荷轉化聚合物(Pitella等人(2011)Biomat. 32:3106-3114)。
聚合物奈米顆粒可進一步包括二嵌段共聚物。在一實施例中，二嵌段共聚物可包含PEG與諸如(但不限於)以下聚合物之組合：聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羥基酸、聚富馬酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚膦氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-乳酸交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或其組合。在一些實施例中，可使用PLGA-PEG嵌段共聚物(例如參見美國專利公開案第US 2012/0004293號及美國專利第8,236,330號)或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物(例如參見美國專利第6,004,573號)來調配本發明所涵蓋之藥劑。作為一非限制性實例，可使用PEG及PLA或PEG及PLGA之二嵌段共聚物來調配本發明所涵蓋之藥劑(例如參見美國專利第8,246,968號)。
在一些實施例中，聚合物奈米顆粒可包括複數種聚合物，例如(但不限於)親水性-疏水性聚合物(例如PEG-PLGA)、疏水性聚合物(例如PEG)及/或親水性聚合物(例如參見PCT公開案第WO 2012/0225129號)。
在一些實施例中，聚合物奈米顆粒可調配為治療性奈米顆粒。可藉由本文所闡述及業內(例如(但不限於) PCT公開案第WO 2010/005740號、第WO 2010/030763號、第WO 2010/005721號、第WO 2010/005723號及第WO 2012/054923號及美國專利公開案第2011/0262491號、第2010/0104645號、第2010/0087337號、第2010/0068285號、第2011/0274759號、第2010/0068286號及第2012/0288541號及美國專利第8,206,747號、第8,293,276號、第8,318,208號及第8,318,211號)已知之方法及聚合物來調配治療性奈米顆粒。在一些實施例中，可藉由美國專利公開案第2012/0140790號中所闡述之方法來鑑別治療性聚合物奈米顆粒。
亦可經由表現不同配體(例如但不限於葉酸鹽、轉鐵蛋白及N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc))來選擇性靶向聚合物調配物(Benoit等人(2011)Biomacromol. 12:2708-2714；Rozema等人(2007)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887；Davis (2009)Mol. Pharm . 6:659-668；Davis (2010)Nature 464:1067-1070)。
在一些實施例中，可藉由使本發明所涵蓋之聚合物調配物(其可包含陽離子載劑)與可共價連接至膽固醇及聚乙二醇基團之陽離子脂質聚合物接觸來穩定該聚合物調配物。可使用美國專利公開案第2009/0042829號中所闡述之方法使聚合物調配物與陽離子脂質聚合物接觸。陽離子載劑可包含(但不限於)聚乙烯亞胺、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四亞甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基醣苷-聚胺、二去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、精脒、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙基酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子化明膠、樹枝狀聚合物、幾丁聚醣、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、1-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)氯化咪唑鎓(DOTIM)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、3B-[N-(N′,N′-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇鹽酸鹽(DC-膽固醇HCl)、二-十七烷基醯胺基甘胺醯基精脒(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻醯基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)及其組合。
本發明所涵蓋之偶聯物可調配於一或多種聚合物之多聚物中(例如參見美國專利公開案第2012/0237565號及第2012/0270927號)。在一實施例中，多聚物包括兩種或更多種陽離子聚合物。陽離子聚合物可包括聚(乙烯亞胺) (PEI)，例如線性PEI。
在一些實施例中，可使用其他形式之奈米顆粒。
舉例而言，可使用聚合物、脂質及/或其他生物可降解試劑(例如(但不限於)磷酸鈣)之組合將本發明所涵蓋之藥劑及組合物調配為奈米顆粒。可使組分組合於核心-殼體、混合體及/或逐層架構中以容許微調奈米顆粒，從而遞送本發明所涵蓋之組合物。生物可降解磷酸鈣奈米顆粒與脂質及/或聚合物之組合已展示可在活體內遞送治療劑。在一實施例中，可使用經脂質塗覆之磷酸鈣奈米顆粒(其亦可含有靶向配體，例如茴香醯胺)以遞送本發明所涵蓋之組合物(例如參見Li等人(2010)J. Contr. Rel . 142:416-421；Li等人(2012)J. Contr. Rel . 158:108-114；Yang等人(2012)Mol. Ther . 20:609-615)。此遞送系統組合靶向奈米顆粒及用以增強胞內體逃逸之組分、磷酸鈣以改良藥劑之遞送。
在一些實施例中，顆粒可為疏水性離子成對複合物或藉由一或多種上述偶聯物及相對離子形成之疏水性離子對。
在一些實施例中，核心-殼體奈米顆粒可用於醫藥調配物中。核心-殼體奈米顆粒之使用已另外著眼於高通量方式以合成陽離子交聯奈米凝膠核心及各種殼體(Siegwart等人(2011)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 108:12996-13001)。可藉由改變奈米顆粒之核心及殼體組分中之化學組成來精確控制聚合奈米顆粒之複合、遞送及內化。舉例而言，在使膽固醇共價附接至奈米顆粒之後，核心-殼體奈米顆粒可將治療劑有效遞送至小鼠肝細胞。用於本發明所涵蓋之組合物中之核心-殼體奈米顆粒闡述於美國專利第8,313,777號中且可藉由其中所闡述之方法形成。
無機奈米顆粒展現物理、化學、光學及電子性質之組合且提供高度多功能性平臺來使疾病成像並診斷、選擇性遞送治療劑且使細胞及組織對治療方案敏感。不期望受限於任一理論，無機奈米顆粒之增強之滲透及滯留(EPR)效應提供選擇性累積許多高分子量藥物之基礎。循環無機奈米顆粒優先地累積於腫瘤部位處及發炎組織中(Yuan等人(1995)Cancer Res. 55:3752-3756)且因其低擴散性而得以滯留(Pluen等人(2001)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4628-4633。無機奈米顆粒之大小可為10 nm-500 nm、10 nm-100 nm或100 nm-500 nm。無機奈米顆粒可包括金屬(金、鐵、銀、銅、鎳等)、氧化物(ZnO、TiO2 、Al2 O3 、SiO2 、氧化鐵、氧化銅、氧化鎳等)或半導體(CdS、CdSe等)。無機奈米顆粒亦可為全氟碳或FeCo。
無機奈米顆粒具有高表面積/單位體積。因此，其可以高密度載有治療藥物及成像劑。可使用各種方法將治療藥物加載至無機奈米顆粒中或其上，包含(但不限於) 共價鍵、靜電相互作用、包裹及囊封。除治療劑藥物負載外，可使用靶向部分(例如腫瘤靶向配體)在表面上對無機奈米顆粒實施功能化。使用無機奈米顆粒調配治療劑容許對治療劑進行成像、檢測及監測。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之藥劑及組合物係疏水性且可與經水溶性兩性離子配體功能化之金奈米顆粒形成動力學穩定之複合物(例如參見Kim等人(2009)JACS 131:1360-1361)。
可使用金奈米殼體調配本發明所涵蓋之藥劑及組合物。作為一非限制性實例，可使用包括聚合物及金奈米殼體之溫度敏感系統遞送組合物且可以光熱方式釋放(例如參見Sershen等人(2000)J. Biomed. Mater. 51:293-298)。藉由奈米殼體吸收1064 nm下輻照且轉化成熱，此可引起氫塌陷且釋放藥物。亦可(例如)藉由藥劑與奈米顆粒之間之共價鍵結使藥劑囊封於空心金奈米殼體內側。可經由連接體(例如游離硫醇、胺或羧酸酯官能基)來共價附接至金奈米顆粒。在一些實施例中，連接體位於金奈米顆粒之表面上。在一些實施例中，本發明所涵蓋之藥劑可經修飾以包括連接體。連接體可包括具有可變長度之PEG或寡乙二醇部分以增加生物環境中之顆粒穩定性且控制藥物負載之密度。PEG或寡乙二醇部分亦最小化不期望生物分子之非特異性吸附。PEG或寡乙二醇部分可為具支鏈或直鏈的(例如參見Tong等人(2009)Langmuir 25:12454-12549)。本發明所涵蓋之藥劑可結合至胺功能化金奈米顆粒(例如參見Lippard等人(2009) JACS 131:14652-14653)。Pt(IV)-金奈米顆粒複合物之細胞毒性效應高於游離Pt(IV)藥物及游離順鉑。
在一些實施例中，可使用磁奈米顆粒(例如自鐵、鈷、鎳及其氧化物或氫氧化鐵奈米顆粒製得者)來調配本發明所涵蓋之藥劑。可使用局部化磁場梯度來將磁奈米顆粒吸引至所選位點，使其保持於此處直至完成療法為止，且然後將其去除(例如參見Alexiou等人(2000)Cancer Res. 60:6641-6648)。在一些實施例中，可使用連接體使本發明所涵蓋之藥劑鍵結至磁奈米顆粒。連接體可為能夠發生分子內環化以釋放藥劑之連接體。可使用所揭示之任何連接體及奈米顆粒(例如參見PCT公開案第WO 2014/124329號)。可藉由加熱磁奈米顆粒或藉由向磁奈米顆粒施加交替電磁場來誘導環化。
在一些實施例中，將本發明所涵蓋之藥劑加載於氧化鐵奈米顆粒上。在一些實施例中，使用基於由氧化鐵組成之核心之超順磁性奈米顆粒(SPION)來調配本發明所涵蓋之藥劑。使用無機材料(二氧化矽、金等)或有機材料(磷脂、脂肪酸、多醣、肽或其他表面活性劑及聚合物)塗覆SPION且可進一步經藥物、蛋白質或質體功能化。
在一實施例中，可使用經水可分散性油酸(OA)-泊洛沙姆塗覆之氧化鐵磁奈米顆粒(例如參見JainMol. Pharm. (2005) 2:194-205)來遞送藥劑。藥劑可分配至環繞氧化鐵奈米顆粒之OA殼體中且泊洛沙姆共聚物(例如普朗尼克)調配物賦予水性分散性。
在一些實施例中，使用具有磷酸鹽部分之奈米顆粒來遞送本發明所涵蓋之藥劑(例如參見美國專利第8,828,975號)。奈米顆粒可包括金、氧化鐵、二氧化鈦、氧化鋅、二氧化錫、銅、鋁、硒化鎘、二氧化矽及/或金剛石。奈米顆粒可在表面上含有PEG部分。
在一些實施例中，可使用肽及/或其他偶聯物來調配本發明所涵蓋之藥劑以增加細胞(例如巨噬細胞及其他免疫細胞)之滲透。在一實施例中，可使用肽(例如(但不限於)細胞滲透肽及使得能夠細胞內遞送之蛋白質及肽)來遞送醫藥調配物。可用於本發明所涵蓋之藥劑之細胞滲透肽之非限制性實例包含附接至多聚陽離子以促進遞送至細胞內空間的細胞滲透肽序列，例如HIV源TAT肽、穿膜肽(penetratin)、轉膜肽(transportan)或hCT源細胞滲透肽(例如參見Caron等人(2001)Mol. Ther . 3:310-318；Langel, Cell-Penetrating Peptides:Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002)；El-Andaloussi等人(2003)Curr. Pharm. Des . 11:3597-35611；及Deshayes等人(2005)Cell. Mol. Life Sci . 62:1839-1849)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之藥劑可進一步包括一或多種增強活性劑(例如siRNA分子)至靶向細胞(例如單核球、巨噬細胞及諸如此類)之遞送之偶聯物。偶聯物可為可納入脂質調配物中以特異性靶向所關注細胞之配體。使用用於脂質顆粒藥物遞送之配體靶向策略之優點在於潛在地增加了靶特異性且無需陽離子脂質來觸發細胞內遞送。配體可包含使用單核吞噬細胞特性受體表現及吞噬先天性過程之肽、抗體、蛋白質、多醣、醣脂、醣蛋白及凝集素。
在一些實施例中，偶聯配體可為可改良細胞特異性靶向及細胞攝取之細胞靶向肽(CTP)或細胞滲透肽(CPP)。少數肽實例包含(但不限於)選擇性與單核球締合之胞壁醯三肽(MTP)、RGD肽、GGP-肽(Karathanasis等人(2009)Ann. Biomed. Engin. 37:1984-1992)。巨噬細胞肽靶向劑亦可包含自噬菌體顯示及測序所鑑別者(例如參見Liu等人(2015)Bioconjug. Chem . 26:1811-1817)。在一些實施例中，配體可為抗體及其片段，對單核球及巨噬細胞具有特異性之實例性抗體包含抗VCAM-1抗體、抗CC52抗體、抗CC531抗體、抗CD11c/DEC-205抗體。舉例而言，抗體可偶合至脂質體表面或在遠端經由其Fc區偶合至脂質體附接之PEG。
在一些實施例中，可藉由向脂質顆粒中納入凝集素(例如烷基甘露醣苷、Mann-C4-Chol、Mann-His-C4-Chol、Man2DOG、4-胺基苯基-a-D-吡喃甘露糖苷、胺基苯基- α-D-吡喃甘露糖苷及Man3-DPPE)來對奈米顆粒實施甘露糖基化。免疫細胞(包含肺泡巨噬細胞、腹膜腔巨噬細胞、單核球源樹突狀細胞及庫弗氏細胞)組成型表現高含量之甘露糖受體(MR)。可由此經由甘露糖基化脂質奈米顆粒靶向巨噬細胞及DC。
其他配體亦可包含馬來醯牛血清白蛋白(MBSA)、O-硬脂醯基支鏈澱粉(O-SAP)及纖連蛋白(例如參見Ahsan等人(2002)J. Cont. Rel. 79:29-40；Vyas等人(2004)Intl. J. Pharm. 269:37-49)。
VII. 投與及投藥 使用業內熟知方法使本文所闡述之藥劑(例如組合物及調配物)可接觸期望目標(例如細胞、無細胞結合配偶體及諸如此類)及/或投與生物體。舉例而言，可經由化學方法(例如陽離子脂質體及聚合物)或物理方法(例如基因槍、電穿孔、顆粒轟擊、超音波應用及磁轉染)將藥劑遞送至細胞中。
用以接觸巨噬細胞之投與方法為業內所熟知，此尤其係由於巨噬細胞通常存在於組織類型中(參見Ries等人(2014)Cancer Cell 25:846-859；Perry等人(2018)J. Exp. Med. 215:877-893；Novobrantseva等人(2012)Mol. Ther. Nucl. Acids 1:e4；Majmudar等人(2013)Circulation 127:2038-2046；Leuschner等人(2011)Nat. Biotechnol. 29:11)。另外，可調整投與方法以靶向所關注巨噬細胞群體，例如藉由局部投與藥劑以靶向巨噬細胞之空間受限群體(例如經腫瘤內投與靶TAM) (參見Shirota等人(2012)J. Immunol. 188:1592-1599；Wang等人(Oct. 2016)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113:11525-11530)。該等不同投與方法可選擇性靶向所關注巨噬細胞群體，同時減小或消除與其他巨噬細胞群體之接觸(例如經腫瘤內投與以選擇性靶向來自循環巨噬細胞之TAM)。
亦可藉由任一產生治療有效結果之途徑以有效量來投與藥劑。投與途徑可包含(但不限於)經腸(進入腸中)、經胃腸道、硬膜上(進入硬腦膜中)、口服(藉由口腔)、經皮、硬膜外、大腦內(進入大腦中)、腦心室內(進入腦心室中)、皮上(施加於皮膚上)、真皮內(進入皮膚本身中)、皮下(在皮膚下面)、經鼻投與(穿過鼻子)、靜脈內(進入靜脈中)、靜脈內濃注、靜脈內滴注、動脈內(進入動脈中)、肌內(進入肌肉中)、心臟內(進入心臟中)、骨內輸注(進入骨髓中)、鞘內(進入脊椎管中)、腹膜腔內(輸注或注射至腹膜中)、膀胱內輸注、玻璃體內(穿過眼睛)、海綿竇內注射(進入病理腔中)、腔內(進入陰莖根部中)、陰道內投與、子宮內、羊膜外投與、經皮(擴散穿過完整皮膚以達成全身性分佈)、經黏膜(擴散穿過黏膜)、經陰道、吹入(嗅吸)、舌下、唇下、灌腸劑、滴眼劑(於結膜上)、滴耳劑、經耳(在耳朵中或藉由耳)、經頰(指向面頰)、結膜、皮膚、經牙齒(施加至一或多個牙齒)、電滲透、子宮頸內、竇內、氣管內、體外、血液透析、浸潤、經間質、腹內、羊膜內、關節內、膽管內、支氣管內、黏液囊內、軟骨內(在軟骨內)、尾部內(在馬尾內)、腦池內(在小腦延髓池內)、角膜內(在角膜內)、牙冠內、冠狀動脈內(在冠狀動脈內)、陰莖海綿體內(在陰莖海綿體之可擴張空間內)、椎間盤內(在椎間盤內)、導管內(在腺導 管內)、十二指腸內(在十二指腸內)、硬膜內(在硬膜內或之下)、表皮內(施加至表皮)、食管內(施加至食管)、胃內(在胃內)、牙齦內(在牙齦內)、回腸內(在小腸之遠端部分內)、病灶內(在局部病灶內或直接引入局部病灶中)、管腔內(在管腔內)、淋巴管內(在淋巴內)、骨髓內(在骨之骨 髓腔內)、腦膜內(在腦膜內)、心肌內(在心肌內)、眼內(在眼內)、卵巢內(在卵巢內)、心包內(在心包內)、胸膜內(在胸膜內)、前列腺內(在前列腺內)、肺內(在肺或其支氣管內)、竇內(在鼻或眼窩竇內)、脊柱內(在脊柱內)、滑膜內(在關節之滑液腔內)、腱內(在肌腱內)、睪丸內(在睪丸內)、鞘內(在腦脊髓軸之任何層面上在腦脊髓液內)、胸腔內(在胸腔內)、小管內(在器官之管內)、腫瘤內(在腫瘤內)、鼓室內(在中耳內)、血管內(在一或多個血管內)、心室內(在心室內)、離子透入法(藉助電流，其中可溶性鹽之離子迀移至身體組織中)、沖洗(浸泡或沖洗開放性創傷或體腔)、喉(直接在喉上)、鼻胃(穿過鼻並進入胃中)、封閉敷裹技術(局部途徑投與，其然後由封閉該區域之敷料覆蓋)、眼部(施加至外眼)、口咽(直接施加至口腔及咽)、非經腸、經皮、關節周、硬膜外、神經周、牙周、直腸、呼吸(在呼吸道內，出於局部或全身性效應藉由口或鼻吸入)、眼球後(腦橋後或眼球後)、心肌內(進入心肌中)、軟組織、蛛網膜下、結膜下、黏膜下、局部、經胎盤(通過或穿過胎盤)、經氣管(穿過氣管壁)、經鼓膜(穿過或通過鼓室)、輸尿管(施加至輸尿 管)、尿道(施加至尿道)、陰道、骶管阻斷、診斷、神經阻斷、膽灌注、心臟灌注、體外光化學療法或脊柱。
通常以劑量單位形式調配藥劑以便於投與且達成劑量均勻性。然而，應理解，本發明所涵蓋之藥劑之總日用量可由主治醫生在合理醫學判斷範圍內確定。任一特定患者之具體治療有效、預防有效或適當成像劑量值取決於多種因素，包含所治療病症及該病症之嚴重程度；所採用具體藥劑之活性；所採用具體組合物；患者年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；所採用具體藥劑之投與時間、投與途徑及排泄速率；治療持續時間；與所採用具體化合物組合或同時使用之藥物；及醫學技術中已為人熟知之類似因素。
在一些實施例中，可以足以遞送約0.0001 mg/kg至約1000 mg/kg、約0.001 mg/kg至約0.05 mg/kg、約0.005 mg/kg至約0.05 mg/kg、約0.001 mg/kg至約0.005 mg/kg、約0.05 mg/kg至約0.5 mg/kg、約0.01 mg/kg至約50 mg/kg、約0.1 mg/kg至約40 mg/kg、約0.5 mg/kg至約30 mg/kg、約0.01 mg/kg至約10 mg/kg、約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或約1 mg/kg至約25 mg/kg或約10 mg/kg至約100 mg/kg或約100 mg/kg至約500 mg/kg個體體重/天(每天一或多次)之劑量值來投與本發明藥劑以獲得期望治療、診斷、預防或成像效應。期望劑量可以以下頻率來遞送：每天三次、每天兩次、每天一次、每隔一天、每三天、每週、每兩週、每三週或每四週或每兩月。在一些實施例中，可使用多個投與(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個或更多個投與)來遞送期望劑量。在採用多個投與時，可使用分開投藥方案(例如本文所闡述者)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之藥劑係抗體。如本文所定義，抗體之治療有效量(亦即有效劑量)在以下範圍內：約0.001 mg/kg體重至30 mg/kg體重、較佳地約0.01 mg/kg體重至25 mg/kg體重、更佳地約0.1 mg/kg體重至20 mg/kg體重及甚至更佳地約1 mg/kg體重至10 mg/kg體重、2 mg/kg體重至9 mg/kg體重、3 mg/kg體重至8 mg/kg體重、4 mg/kg體重至7 mg/kg體重或5 mg/kg體重至6 mg/kg體重。熟習此項技術者應瞭解，某些因素可影響有效治療個體所需之劑量，該等因素包含(但不限於)疾病或病症之嚴重程度、先前治療、個體之總體健康狀況及/或年齡及所存在其他疾病。此外，使用治療有效量之抗體治療個體可包含單一治療或較佳地可包含一系列治療。在一較佳實例中，使用介於約0.1 mg/kg體重至20 mg/kg體重之間之抗體來治療個體，每週一次且持續約1至10週、較佳地2至8週、更佳地約3至7週及甚至更佳地約4、5或6週。亦瞭解，可在特定治療過程中增加或降低用於治療之抗體之有效劑量。劑量變化可源自診斷分析之結果。
如本文中所使用，「分開劑量」係將單一單位劑量或總日劑量分成兩個或更多個劑量，例如單一單位劑量之兩個或更多個投與。如本文中所使用，「單一單位劑量」係在一個劑量/一次/單一途徑/單一接觸點(亦即單一投與事件)中所投與任一治療劑之劑量。如本文中所使用，「總日劑量」係在24小時時段內所給予或開具之量。其可以單一單位劑量形式來投與。
在一些實施例中，劑型可為液體劑型。用於非經腸投與之液體劑型包含(但不限於)醫藥上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及/或酏劑。除活性成分外，液體劑型可包括業內通常使用之惰性稀釋劑(包含(但不限於)水或其他溶劑)、增溶劑及乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及山梨醇酐之脂肪酸酯及其混合物。在用於非經腸投與之某些實施例中，可混合組合物與增溶劑(例如CREMOPHOR®、醇、油、經改質油、二醇、聚山梨醇酯、環糊精、聚合物及/或其組合)。
在某些實施例中，劑量形式可為可注射的。可根據已知技術來調配可注射製劑(例如無菌可注射水性或油性懸浮液)且可包含適宜分散劑、潤濕劑及/或懸浮劑。無菌可注射製劑可為於非經腸可接受之無毒稀釋劑及/或溶劑中之無菌可注射溶液、懸浮液及/或乳液，例如於1,3-丁二醇中之溶液。可採用之可接受之媒劑及溶劑尤其可包含(但不限於)水、林格氏溶液、U.S.P.及等滲氯化鈉溶液。通常採用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用包含合成甘油單酸酯或甘油二酸酯之任一溫和不揮發性油。在可注射製劑中可使用諸如油酸等脂肪酸。可注射調配物可藉由(例如)經由細菌截留過濾器過濾及/或藉由納入滅菌劑來滅菌，該等滅菌劑呈無菌固體組合物形式且可在使用前溶解或分散於無菌水或其他無菌可注射介質中。
在一些實施例中，錠劑、糖衣錠、膠囊、丸劑及顆粒之固體劑型可製備有包衣及外殼，例如腸溶包衣及醫藥調配領域熟知之其他包衣。其可視情況包括遮光劑且可為視情況以延遲方式僅或優先在腸道之某一部分中釋放活性成分之組合物。可使用之包埋組合物之實例包含聚合物質及蠟。在使用諸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等賦形劑之軟質及硬質填充明膠膠囊中，可採用相似類型之固體組合物作為填充劑。
可以0.1 × 106 、0.2 × 106 、0.3 × 106 、0.4 × 106 、0.5 × 106 、0.6 × 106 、0.7 × 106 、0.8 × 106 、0.9 × 106 、1.0 × 106 、5.0 × 106 、 1.0 × 107 、5.0 × 107 、1.0 × 108 、5.0 × 108 個或更多或其間之任一範圍或其間之任一值之細胞/公斤個體體重來投與細胞。可基於給定量時間內之期望植入程度來調節移植細胞數。通常，可視需要移植1×105 至約1×109 個細胞/kg體重、約1×106 至約1×108 個細胞/kg體重或約1×107 個細胞/kg體重或更多個細胞。在一些實施例中，相對於平均大小之小鼠移植至少約0.1×106 、0.5×106 、1.0×106 、2.0×106 、3.0×106 、4.0×106 或5.0×106 個總細胞係有效的。
可以如本文所闡述之任一適宜途徑(例如藉由輸注)來投與細胞。亦可在其他抗癌劑之前、同時或之後投與細胞。
可使用業內通常已知之方法來達成達成。可藉由直接注射或藉由業內所用之任一其他方式(包含(但不限於)血管內、大腦內、非經腸、腹膜腔內、靜脈內、硬膜外、脊柱內、胸骨內、關節內、滑膜內、鞘內、動脈內、心臟內或肌內投與)來將藥劑(包含細胞)引入期望部位。舉例而言，可藉由各種途徑向所關注個體植入移植細胞。該等途徑包含(但不限於)靜脈內投與、皮下投與、投與特定組織(例如病灶移植)、注射至股骨骨髓腔中、注射至脾中、投與胎兒肝之腎囊下方及諸如此類。在某些實施例中，將本發明之癌症疫苗經腫瘤內或經皮下注射至個體中。可以一個輸注來投與細胞，或經由連續輸注在足以生成期望效應之界定時間段內來投與。用於移植細胞之移植、植入評價及標記物表現型分型分析之實例性方法為業內所熟知(例如參見Pearson等人(2008)Curr. Protoc. Immunol. 81:15.21.1-15.21.21；Ito等人(2002)Blood 100:3175-3182；Traggiai等人(2004)Science 304:104-107；Ishikawa等人，Blood (2005) 106:1565-1573；Shultz等人(2005)J. Immunol. 174:6477-6489；及Holyoake等人(1999)Exp. Hematol. 27:1418-1427)。
可組合且投與兩種或更多種細胞類型，例如基於細胞之療法及幹細胞接受性細胞轉移、癌症疫苗及基於細胞之療法及諸如此類。舉例而言，基於細胞之接受性免疫療法可與本發明之基於細胞之療法進行組合。在一些實施例中，基於細胞之藥劑可單獨使用或與其他基於細胞之藥劑(例如免疫療法，如接受性T細胞療法(ACT))組合使用。舉例而言，使用經基因改造以識別CD19之T細胞來治療濾泡性B細胞淋巴瘤。用於ACT之免疫細胞可為樹突狀細胞、T細胞(例如CD8+ T細胞及CD4+ T細胞)、天然殺手(NK)細胞、NK T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、淋巴因子活化殺手(LAK)細胞、記憶性T細胞、調控性T細胞(Treg)、輔助性T細胞、細胞介素誘導性殺手(CIK)細胞及其任一組合。基於細胞之熟知接受性免疫治療方式包含(但不限於)經輻照自體或同種異體腫瘤細胞、腫瘤溶解物或細胞凋亡腫瘤細胞、基於抗原呈遞細胞之免疫療法、基於樹突狀細胞之免疫療法、接受性T細胞轉移、接受性CAR T細胞療法、自體免疫增強療法(AIET)、癌症疫苗及/或抗原呈遞細胞。可進一步改良該等基於細胞之免疫療法以表現一或多種基因產物，從而進一步調節免疫反應，例如表現細胞介素(如GM-CSF)及/或表現腫瘤相關抗原(TAA) (例如Mage-1、gp-100及諸如此類)。本發明所涵蓋之藥劑(例如癌細胞)對本發明所涵蓋之另一藥劑或另一組合物之比率可相對於彼此為1:1 (例如等量之2種藥劑、3種藥劑、4種藥劑等)，但可以任一期望量進行調節(例如1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或更大)。
可藉由各種方法中之任一者來評價移植細胞之植入，例如(但不限於)腫瘤體積、細胞介素含量、投與時間、在移植後一或多個時間點自個體獲得之所關注細胞之流式細胞術分析及諸如此類。舉例而言，等待1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28天之基於時間之分析可發送腫瘤收穫之時間信號。任一該量度係可根據熟知參數進行調節以測定變量對抗癌免疫療法反應之效應之變量。另外，移植細胞可與其他試劑(例如細胞介素、細胞外基質、細胞培養載體及諸如此類)共移植。
VII. 套組 本發明亦涵蓋用於檢測及/或調節本文所闡述之生物標記物之套組。「套組」係包括至少一種用於特異性檢測及/或影響本發明標記物之表現之試劑(例如探針或小分子)之任一製品(例如包裝或容器)。套組可以用於實施本發明方法之單元形式進行推銷、分配或出售。套組可包括一或多種可用於本發明方法中之藥劑之檢測、表現、篩選及諸如此類所需之一或多種試劑。舉例而言，可在套組中提供可用於檢測本發明所涵蓋之生物標記物(例如表1及/或表2中所列示之靶)之藥劑組合以檢測其生物標記物及調節，此可用於鑑別單核球及/或巨噬細胞發炎表型、免疫反應、抗癌功能、對免疫檢查點療法之敏感性及諸如此類。該等組合可包含一或多種用以檢測1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種生物標記物(包含該等值，例如最多且包含本發明所涵蓋之所有生物標記物)之藥劑。
在一些實施例中，套組可進一步包括參考標準物(例如編碼不影響或調控控制細胞生長、分裂、遷移、存活或細胞凋亡之信號傳導路徑之蛋白質之核酸)。熟習此項技術者可設想許多該等對照蛋白質，包含(但不限於)常用分子標籤(例如綠色螢光蛋白及β-半乳醣苷酶)、未藉由GeneOntology參照分類為涵蓋細胞生長、分裂、遷移、存活或細胞凋亡之任一路徑之蛋白質或普遍性管家蛋白。套組中之試劑可提供於個別容器中或作為兩種或更多種試劑之混合物提供於單一容器中。另外，可包含闡述套組內組合物之使用之說明材料。本發明所涵蓋之套組亦可包含揭示或闡述套組或本發明所揭示抗體在如本文所提供之本發明所揭示方法中之使用的說明材料。套組亦可包含其他組分以促進設計套組之特定應用。舉例而言，套組可另外含有檢測標記之構件(例如用於酶促標記之酶受質、用以檢測螢光標記之過濾器組、適當二級標記(例如綿羊抗小鼠-HRP)等)及對照所需試劑(例如對照生物試樣或標準物)。套組可另外包含緩衝液及用於本發明所揭示方法中之其他公開試劑。非限制性實例包含用以減小非特異性結合之試劑，例如載體蛋白或洗滌劑。
本發明所涵蓋之其他實施例闡述於下列實例中。藉由下列實例來進一步闡釋本發明，該等實例不應理解為進一步限制本發明。
實例 實例 1 ： 原代單核球及巨噬細胞系統重現活體內單核球及巨噬細胞之生物性質 人類巨噬細胞沿自促發炎(M1樣，亦在本文中稱為1型)至促腫瘤生成/抗發炎(M2樣，亦在本文中稱為2型)之分化譜存在(例如參見 Biswas等人(2010)Nat. Immunol . 11: 889-896；Mosser及Edwards (2008)Nat. Rev. Immunol . 8:958-969；Mantovani等人(2009)Hum. Immunol. 70:325–330)。沿此功能譜，巨噬細胞改變其表面標記物之表現及形態且改變多個其他特性。理解在原代人類巨噬細胞中該等標記物沿此譜如何變化對於理解在給定免疫學環境(例如腫瘤內(腫瘤相關性巨噬細胞)及/或發炎組織)中存在何種細胞及理解該等巨噬細胞如何影響該等組織內之免疫反應較為重要。某些細胞表面標記物(包含CD163、CD16及CD206)在傳統上用於對巨噬細胞亞型進行分類。除該等表面標記物外，巨噬細胞亞型亦顯示獨特形態。M1巨噬細胞顯示樹突狀細胞樣外觀且具有增加之樹突突出物。M2巨噬細胞顯示較圓形化或紡錘體樣形態。
對於本文所闡述之每一基於單核球/巨噬細胞之實驗而言，使用原代人類單核球/巨噬細胞而非使用細胞系，從而以使用經分離細胞類型之任一活體外實驗系統所容許之最接近可能方式重現模擬活體內現有細胞之生物性質。特定而言，該系統可研究原代細胞之天然生物性質且獲得源自具有不同基因及環境暴露之不同供體之天然多樣性。因此，重要的是，在詮釋分析結果時應考慮人類群體中之天然基因及免疫學可變性。
使單核球在活體外分化成M1樣(1型)及/或M2樣(2型)表型(Ries等人(2014)Cancer Cell 25:846-859；Vogel等人(2014)Immunobiol 219:695-703)。為使單核球分化成M1與M2表型，藉由Ficoll分離使用RosetteSep™人類單核球富集混合劑(Stemcell Technologies, Vancouver, Canada)根據製造商說明書自健康供體之全血來分離單核球。將經分離單核球排列於24孔板中之含有10%胎牛血清之IMDM培養基中過夜且在24小時之後洗滌掉非黏附細胞。藉由在IMDM 10% FBS + 50 ng/ml人類M-CSF (對於M2巨噬細胞)或50 ng/ml GM-CSF (Biolegend, San Diego, CA) (對於M1巨噬細胞)中培養6天來使單核球分化成巨噬細胞。在6天之後，使用10 ng/ml人類干擾素γ及100 ng/ml LPS (Invivogen, San Diego, CA) 活化M1巨噬細胞，且將M2樣巨噬細胞分配至兩個單獨培養物中，其中各自分別藉由添加IL-10進一步誘導成M2c巨噬細胞及藉由添加IL-4、IL-10及TGF-β誘導成M2d巨噬細胞。在第8天，收穫巨噬細胞並處理以用於進一步分析。藉由流式細胞術評價M1及M2巨噬細胞標記物及表面表現靶之表現。在流式細胞術中，收集細胞並再懸浮於50 ul FACS緩衝液(PBS + 2.5% FBS + 0.5%疊氮化鈉)中，且使用TruStain FcX™ (Biolegend目錄號422302)在冰上阻斷15分鐘。根據製造商說明書將抗體(表3)稀釋於FACS緩衝液且並添加至細胞中並在冰上保持15分鐘。
使用FACS緩衝液將經標記細胞洗滌兩次並使用PBS + 2%低聚甲醛固定以用於Attune™流式細胞儀(ThermoFisher)上之流式細胞術分析。經由FlowJo軟體分析數據。經由顯微術評價形態。 表3：流動抗體
抗原 純系 來源
CD163 215927 RnD Systems
CD16 3a8 BioLegend
CD206 15-2 BioLegend
SIGLEC9 191240 RnD Systems
LCP2 130-107-085 Miltenyi Biotec
CLEC7A 15E2 BioLegend
SIGLEC7 194211 RnD Systems
CD33 WM53 Biolegend
SELPLG 688101 RnD Systems
CCR5 J418F1 BioLegend
CD84 CD84.1.21 BioLegend
C3AR1 hC3ARZ8 BioLegend
CD37 MB371 BD Biosciences
VISG4 JAV4 eBioscience
LILRB2 287219 RnD Systems
TIM3 344823 RnD Systems
TLR8 935166 RnD Systems
CD48 394607 RnD Systems
CD53 H129 BioLegend
SRPa SE5A5 BioLegend
CD74 LN2 BioLegend
RP105 MHR73-11 BioLegend
CD45 2D1 BioLegend
CD3 OKT3 BioLegend
CD4 A161A1 BioLegend
CD19 HIB19 BioLegend
PD-1 NAT105 BioLegend
CD11b ICRF44 BioLegend
CD8a RPA-T8 BioLegend
CD14 M5E2 BioLegend
CD56 5.1H11 BioLegend
IFNg 4S.B3 BioLegend
顆粒酶B GB11 BioLegend
巨噬細胞朝向M2表型之傾斜展示為可相對於M1巨噬細胞上調CD163、CD16及CD206 (圖1A)。除該等經典標記物外，圖1B展示，本文所闡述之新生物標記物(例如CD53、PSGL1及VSIG4)亦上調於M2巨噬細胞上。圖1C顯示存在於巨噬細胞譜內之形態差異且重要的是顯示存在於原代人類細胞內之可變性。
實例 2 ： 藉由靶核酸敲低來驗證調節巨噬細胞發炎表型之靶 為驗證本文所闡述之巨噬細胞相關靶調節巨噬細胞表型之能力，藉由(例如)使用在原代人類巨噬細胞中設計、驗證及測試之靶特異性siRNA來實施靶敲低實驗。
由AXO Labs (Kulmbach, Germany)來合成siRNA。使用亞磷醯胺技術在固相上採用ABI 394合成器(Applied Biosystems)以10 µmol規模來合成寡核糖核苷酸。在由定孔玻璃(CPG, 520Ǻ，載量為75 μmol/g，自Prime Synthesis, Aston, PA, USA獲得)製得之固體載體上實施合成。自Proligo (Hamburg, Germany)購買規則RNA亞磷醯胺、2’-O-甲基亞磷醯胺及輔助試劑。具體而言，使用下列亞醯胺化物：(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲醯基)-2’-O-第三丁基二甲基矽基-腺苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙醯基)-2’-O-第三丁基二甲基矽基-胞苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)亞磷醯胺、(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(異丁醯基)-2’-O-第三丁基二甲基矽基-鳥苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)亞磷醯胺及5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-第三丁基二甲基矽基-尿苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基)亞磷醯胺。2’-O-甲基亞磷醯胺與規則RNA亞醯胺化物攜載相同保護基團。將所有亞醯胺化物溶於無水乙腈(100 mM)中且添加分子篩(3
Figure 02_image687
)。使用5-乙基硫基四唑(ETT, 500 mM於乙腈中)作為活化劑溶液。偶合時間為6分鐘。為引入硫代磷酸酯鍵聯，採用3-((N,N-二甲基胺基亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT，自Chemgenes, Wilmington, MA, USA獲得)於無水乙腈中之50 mM溶液。
在完成固相合成之後，將經乾燥固體載體轉移至15 mL管中並使用於甲醇中之甲胺(2M, Aldrich)在45℃下處理180 min。在離心之後，將上清液轉移至新15 mL管中且使用1200 µL N-甲基吡咯啶-2-酮(NMP, Fluka, Buchs, Switzerland)洗滌CPG。將洗滌液與甲醇性甲胺溶液合併且添加450 µL三乙胺三氫氟酸鹽(TEA·3HF, Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany)。使此混合物達到65℃並保持150 min。在冷卻至室溫之後，添加0.75 mL NMP及1.5 mL乙氧基三甲基矽烷(Merck, Darmstadt, Germany)。十分鐘後，藉由離心收集經沈澱寡核糖核苷酸，棄除上清液，且將固體重構於1 mL緩衝液A (闡述於下文中)中。
藉由陰離子交換HPLC使用填充有Source Q15之管柱(GE Healthcare)及AKTA Explorer系統(GE Healthcare)來純化粗製寡聚物。緩衝液A係10 mM過氯酸鈉、20 mM Tris、1 mM EDTA (pH 7.4) (Sigma Aldrich)且含有20%乙腈。緩衝液B與緩衝液A相同，只是含有500 mM過氯酸鈉。採用42管柱體積(CV)內之22% B至42% B之梯度。記錄280 nm下之UV跡線。合併適當部分並使用3M NaOAc (pH 5.2)及70%乙醇沈澱。最後，使用70%乙醇洗滌糰粒。或者，使用Sephadex® HiTrap®管柱(GE Healthcare)根據製造商推薦來實施去鹽。藉由UV光度計(Eppendorf, Hamburg, Germany)中之260 nm下之吸光度量測來測定溶液濃度。直至退火時，將個別鏈以冷凍溶液形式儲存於-20℃下。
藉由組合等莫耳RNA溶液來將互補鏈退火。凍乾混合物並使用適當體積之退火緩衝液(100 mM NaCl，20 mM磷酸鈉，pH 6.8)重構以達成期望濃度。將此溶液置於75℃水浴中且在2小時內冷卻至室溫。
在活體外使用表4之各種細胞系來生成siRNA之劑量反應曲線。 表4：用於siRNA分析之細胞系及條件
基因 細胞系 每孔之細胞接種密度 用以量測 mRNA 敲低之終點分析
SIGLEC9 Hepa1-6 +報告基因質體 15,000 Dual-Glo螢光素酶分析
CD74 THP-1 25,000 bDNA分析
SELPLG THP-1 25,000 bDNA分析
VSIG4 Hepa1-6 +報告基因質體 15,000 Dual-Glo螢光素酶分析
LRRC25 Hepa1-6 +報告基因質體 15,000 Dual-Glo螢光素酶分析
CD84 Hepa1-6 +報告基因質體 15,000 Dual-Glo螢光素酶分析
IGSF6 Hepa1-6 +報告基因質體 15,000 Dual-Glo螢光素酶分析
CD48 Hepa1-6 +報告基因質體 15,000 Dual-Glo螢光素酶分析
CD33 SK-MEL-2 15,000 bDNA分析
CD207 Hepa1-6 +報告基因質體 15,000 Dual-Glo螢光素酶分析
LILRB2 Hepa1-6 +報告基因質體 20,000 Dual-Glo螢光素酶分析
EVI2B A172 15,000 bDNA分析
CLEC7A Hepa1-6 +報告基因質體 20,000 Dual-Glo螢光素酶分析
SIGLEC7 Hepa1-6 +報告基因質體 20,000 Dual-Glo螢光素酶分析
AIF1 THP-1 25,000 bDNA分析
LST1 THP-1 25,000 bDNA分析
TNFAIP8L2 THP-1 25,000 bDNA分析
SPI1 THP-1 25,000 bDNA分析
TBXAS1 A549 15,000 bDNA分析
CD37 THP-1 25,000 bDNA分析
CD53 THP-1 25,000 bDNA分析
FERMT3 THP-1 25,000 bDNA分析
CXorf21 THP-1 25,000 bDNA分析
CCR5 Hepa1-6 +報告基因質體 20,000 Dual-Glo螢光素酶分析
DOCK2 THP-1 25,000 bDNA分析
簡言之，將細胞接種於96孔板中且使用siRNA、Lipofectamine® 2000 (0.5 uL/孔；ThermoFisher)及在一些情形下報告基因質體(50 ng/孔)逆轉染。報告基因質體(psiCHECK™-2, Promega)編碼螢火蟲螢光素酶及融合至海腎螢光素酶之所關注基因；使所關注基因沉默可相應地使海腎螢光素酶沉默，但螢火蟲螢光素酶保持不受影響(作為內部對照)。
在37℃下培育24 hr之後，使用終點分析量測mRNA敲低。對於不含報告基因質體之靶而言，根據製造商說明書(QuantiGene® Singleplex Gene Expression Assay, ThermoFisher)來實施具支鏈DNA (bDNA)分析以量測靶基因及GAPDH (管家基因) mRNA。將數據繪示為siRNA濃度(nM)對剩餘mRNA (靶基因對GAPDH之比率，正規化至模擬siRNA轉染細胞)。對於具有報告基因質體之靶而言，根據製造商說明書(Promega)實施Dual-Glo®螢光素酶分析以量測螢火蟲及海腎螢光素酶表現。將數據繪示為siRNA濃度(nM)對剩餘mRNA (海腎發光對螢火蟲發光之比率，正規化至模擬siRNA轉染細胞)。
對於所有劑量反應曲線而言，應用4參數邏輯模型以測定每一siRNA序列之IC50 (表5及圖2)。表5及圖2中所展示之數據代表一式四份之平均值+/-標準偏差。 表5：siRNA序列及IC50值
靶 siRNA ID IC50 (nM) 有義 反義
SIGLEC9 XD-09180 0.040 5'-acAAGuAAAcuGcuGAcGAdTsdT-3' 5'-UCGUcAGcAGUUuACUUGUdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09181 0.286 5'-guAAAcuGcuGAcgAuGcAdTsdT-3' 5'-UGcAUCGUcAGcAGUUuACdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09182 0.837 5'-ucGcAuGGcuGGAuuuAccdTsdT-3' 5'-GGuAAAUCcAGCcAUGCGAdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09183 0.229 5'-guuccGGGAAGGGgccAAudTsdT-3' 5'-AUUGGCCCCUUCCCGGAACdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09184 0.127 5'-ggGccAAuAcAGAccAGGAdTsdT-3' 5'-UCCUGGUCUGuAUUGGCCCdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09185 0.094 5'-ccAGAAGAAGuGAuGcGGGdTsdT-3' 5'-CCCGcAUcACUUCUUCUGGdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09186 0.488 5'-ucAccGGcucucuguGAAudTsdT-3' 5'-AUUcAcAGAGAGCCGGUGAdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09187 0.406 5'-gaccAcGAAcAAGaccGucdTsdT-3' 5'-GACGGUCUUGUUCGUGGUCdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09188 0.148 5'-gaAcAAGAccGuccAucucdTsdT-3' 5'-GAGAUGGACGGUCUUGUUCdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09189 0.694 5'-agAccGuccAucucAAcGudTsdT-3' 5'-ACGUUGAGAUGGACGGUCUdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09190 0.905 5'-ccGuccAucucAAcGuGucdTsdT-3' 5'-GAcACGUUGAGAUGGACGGdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09191 n.d. 5'-ggAGAcGGcAcAGuAuccAdTsdT-3' 5'-UGGAuACUGUGCCGUCUCCdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09192 0.236 5'-caGuAuccAcAGucuuGGGdTsdT-3' 5'-CCcAAGACUGUGGAuACUGdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09193 0.459 5'-guAuccAcAGucuuGGGAAdTsdT-3' 5'-UUCCcAAGACUGUGGAuACdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09194 5.626 5'-cucAGcAGGucuAccuGAAdTsdT-3' 5'-UUcAGGuAGACCUGCUGAGdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09195 0.125 5'-gcGuGGGAGAuAcgGGcAudTsdT-3' 5'-AUGCCCGuAUCUCCcACGCdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09196 n.d. 5'-ugGGAGAuAcGGGcAuAGAdTsdT-3' 5'-UCuAUGCCCGuAUCUCCcAdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09197 0.851 5'-ggAGAuAcGGGcAuAGAGGdTsdT-3' 5'-CCUCuAUGCCCGuAUCUCCdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09198 n.d. 5'-gauAcGGGcAuAGaGGAuGdTsdT-3' 5'-cAUCCUCuAUGCCCGuAUCdTsdT-3'
SIGLEC9 XD-09199 n.d. 5'-acGGGcAuAGAGGauGcAAdTsdT-3' 5'-UUGcAUCCUCuAUGCCCGUdTsdT-3'
CD74 XD-09223 0.340 5'-ggAGcuGucGGGAaGAucAdTsdT-3' 5'-UGAUCUUCCCGAcAGCUCCdTsdT-3'
CD74 XD-09224 1.983 5'-gcGcGAccuuAucuccAAcdTsdT-3' 5'-GUUGGAGAuAAGGUCGCGCdTsdT-3'
CD74 XD-09225 n.d. 5'-gcGAccuuAucuccAAcAAdTsdT-3' 5'-UUGUUGGAGAuAAGGUCGCdTsdT-3'
CD74 XD-09226 0.143 5'-cuGGAcAAAcuGAcAGucAdTsdT-3' 5'-UGACUGUcAGUUUGUCcAGdTsdT-3'
CD74 XD-09227 0.583 5'-ggAAcuGGAGGAcccGucudTsdT-3' 5'-AGACGGGUCCUCcAGUUCCdTsdT-3'
CD74 XD-09228 n.d. 5'-gcAGAGGcGGucuucAAcAdTsdT-3' 5'-UGUUGAAGACCGCCUCUGCdTsdT-3'
CD74 XD-09229 n.d. 5'-uguAccucAucccauGAGAdTsdT-3' 5'-UCUcAUGGGAUGAGGuAcAdTsdT-3'
CD74 XD-09230 0.196 5'-gacAAAccAAGucgGAAcAdTsdT-3' 5'-UGUUCCGACUUGGUUUGUCdTsdT-3'
CD74 XD-09231 0.255 5'-aaAccAAGucGGAacAGcAdTsdT-3' 5'-UGCUGUUCCGACUUGGUUUdTsdT-3'
CD74 XD-09232 0.747 5'-agcuAGAcAGAuccccGuudTsdT-3' 5'-AACGGGGAUCUGUCuAGCUdTsdT-3'
CD74 XD-09233 n.d. 5'-cuAGGcucAuGGAcGAGAudTsdT-3' 5'-AUCUCGUCcAUGAGCCuAGdTsdT-3'
CD74 XD-09234 n.d. 5'-gaGAAGGGAuAAcccuAcAdTsdT-3' 5'-UGuAGGGUuAUCCCUUCUCdTsdT-3'
CD74 XD-09235 0.245 5'-ccAAuGuuuuccAcccAuAdTsdT-3' 5'-uAUGGGUGGAAAAcAUUGGdTsdT-3'
CD74 XD-09236 n.d. 5'-guuuuccAcccAuaAuccudTsdT-3' 5'-AGGAUuAUGGGUGGAAAACdTsdT-3'
CD74 XD-09237 1.841 5'-ccAuAAuccuuucuGccGAdTsdT-3' 5'-UCGGcAGAAAGGAUuAUGGdTsdT-3'
CD74 XD-09238 n.d. 5'-ccAAGcuuGuuAucAGcuudTsdT-3' 5'-AAGCUGAuAAcAAGCUUGGdTsdT-3'
CD74 XD-09239 0.070 5'-ggccAuGGuucAcauuAGAdTsdT-3' 5'-UCuAAUGUGAACcAUGGCCdTsdT-3'
CD53 XD-09200 n.d. 5'-ccGGAuAucuGuGuuAccAdTsdT-3' 5'-UGGuAAcAcAGAuAUCCGGdTsdT-3'
CD53 XD-09201 0.067 5'-gcAuGAGuAGcuugAAAcudTsdT-3' 5'-AGUUUcAAGCuACUcAUGCdTsdT-3'
CD53 XD-09203 0.178 5'-gcAuGGGcucuAucAAGGAdTsdT-3' 5'-UCCUUGAuAGAGCCcAUGCdTsdT-3'
CD53 XD-09205 0.132 5'-acuAAuAucuGAGcAucuudTsdT-3' 5'-AAGAUGCUcAGAuAUuAGUdTsdT-3'
CD53 XD-09206 n.d. 5'-ggAuuuAAuGGcccAAcAudTsdT-3' 5'-AUGUUGGGCcAUuAAAUCCdTsdT-3'
CD53 XD-09207 0.038 5'-agGGcAAGAucucauuucAdTsdT-3' 5'-UGAAAUGAGAUCUUGCCCUdTsdT-3'
CD53 XD-09208 0.162 5'-uuuAuuAGAGGGccuuAuudTsdT-3' 5'-AAuAAGGCCCUCuAAuAAAdTsdT-3'
CD53 XD-09209 0.041 5'-auuGAuGuGuucuaAGucudTsdT-3' 5'-AGACUuAGAAcAcAUcAAUdTsdT-3'
SELPLG XD-09260 n.d. 5'-ggGcAGAuGAAGccGAGAAdTsdT-3' 5'-UUCUCGGCUUcAUCUGCCCdTsdT-3'
SELPLG XD-09261 0.386 5'-ccAccGAAuAuGAguAccudTsdT-3' 5'-AGGuACUcAuAUUCGGUGGdTsdT-3'
SELPLG XD-09262 1.354 5'-ccGAAuAuGAGuAccuAGAdTsdT-3' 5'-UCuAGGuACUcAuAUUCGGdTsdT-3'
SELPLG XD-09263 2.964 5'-gcAcAGAccAcucaAcccAdTsdT-3' 5'-UGGGUUGAGUGGUCUGUGCdTsdT-3'
SELPLG XD-09264 1.963 5'-accAAAAGAGGucuGuucAdTsdT-3' 5'-UGAAcAGACCUCUUUUGGUdTsdT-3'
SELPLG XD-09265 0.486 5'-aaGcAGAcGGGcAaGuGGAdTsdT-3' 5'-UCcACUUGCCCGUCUGCUUdTsdT-3'
SELPLG XD-09266 0.207 5'-aguAcuGAAGAGugAcGGAdTsdT-3' 5'-UCCGUcACUCUUcAGuACUdTsdT-3'
SELPLG XD-09267 1.067 5'-acuGAAGAGuGAcgGAcuudTsdT-3' 5'-AAGUCCGUcACUCUUcAGUdTsdT-3'
SELPLG XD-09268 0.471 5'-ccAAGGGcAGAccuuucuudTsdT-3' 5'-AAGAAAGGUCUGCCCUUGGdTsdT-3'
VSIG4 XD-09170 0.024 5'-aaGGcuAcAcccAaGucuudTsdT-3' 5'-AAGACUUGGGUGuAGCCUUdTsdT-3'
VSIG4 XD-09171 0.023 5'-cuuucuAcGuGAcucuucudTsdT-3' 5'-AGAAGAGUcACGuAGAAAGdTsdT-3'
VSIG4 XD-09172 ＜0.005 5'-gcAAccAAGucGugAGAGAdTsdT-3' 5'-UCUCUcACGACUUGGUUGCdTsdT-3'
VSIG4 XD-09173 ＜0.005 5'-cguGAGAGAuAAGauuAcudTsdT-3' 5'-AGuAAUCUuAUCUCUcACGdTsdT-3'
VSIG4 XD-09174 0.036 5'-aacAAGAGcAuGucuAcGAdTsdT-3' 5'-UCGuAGAcAUGCUCUUGUUdTsdT-3'
VSIG4 XD-09176 0.031 5'-cacuAGGAcuuGGucAucAdTsdT-3' 5'-UGAUGACcAAGUCCuAGUGdTsdT-3'
VSIG4 XD-09177 0.007 5'-acuAGGAcuuGGucAucAudTsdT-3' 5'-AUGAUGACcAAGUCCuAGUdTsdT-3'
VSIG4 XD-09178 0.060 5'-gucAucAuGccuAcAGAcAdTsdT-3' 5'-UGUCUGuAGGcAUGAUGACdTsdT-3'
VSIG4 XD-09179 0.006 5'-ggccAGAcAGcuuuuAAuudTsdT-3' 5'-AAUuAAAAGCUGUCUGGCCdTsdT-3'
LRRC25 XD-09250 14.978 5'-gccAGAGGAAcGccAGcGAdTsdT-3' 5'-UCGCUGGCGUUCCUCUGGCdTsdT-3'
LRRC25 XD-09251 2.770 5'-gccGucGcuuuuccAGcAudTsdT-3' 5'-AUGCUGGAAAAGCGACGGCdTsdT-3'
LRRC25 XD-09252 n.d. 5'-ggAAcGGccuGcGaGAGcudTsdT-3' 5'-AGCUCUCGcAGGCCGUUCCdTsdT-3'
LRRC25 XD-09256 0.601 5'-ccGAcuAuGAGAAcAuGuudTsdT-3' 5'-AAcAUGUUCUcAuAGUCGGdTsdT-3'
LRRC25 XD-09257 n.d. 5'-gccuAAGAuGuccuAAccudTsdT-3' 5'-AGGUuAGGAcAUCUuAGGCdTsdT-3'
LRRC25 XD-09258 0.033 5'-caAuAAAuGcuucgAGGcudTsdT-3' 5'-AGCCUCGAAGcAUUuAUUGdTsdT-3'
LRRC25 XD-09259 0.293 5'-cuucGAGGcuGAugAGGcudTsdT-3' 5'-AGCCUcAUcAGCCUCGAAGdTsdT-3'
AIF1 XD-09660 n.d. 5'-cuuAAuGGAAAuGgcGAuAdTsdT-3' 5'-uAUCGCcAUUUCcAUuAAGdTsdT-3'
AIF1 XD-09661 0.045 5'-uaAuGGAAAuGGcgAuAuudTsdT-3' 5'-AAuAUCGCcAUUUCcAUuAdTsdT-3'
AIF1 XD-09662 0.120 5'-uaucAuGucccuGaAAcGAdTsdT-3' 5'-UCGUUUcAGGGAcAUGAuAdTsdT-3'
AIF1 XD-09663 0.263 5'-gaAAcGAAuGcuGgAGAAAdTsdT-3' 5'-UUUCUCcAGcAUUCGUUUCdTsdT-3'
AIF1 XD-09664 0.433 5'-agAcucAccuAGAgcuAAAdTsdT-3' 5'-UUuAGCUCuAGGUGAGUCUdTsdT-3'
AIF1 XD-09665 0.349 5'-cucAccuAGAGcuaAAGAAdTsdT-3' 5'-UUCUUuAGCUCuAGGUGAGdTsdT-3'
AIF1 XD-09666 0.105 5'-ucAccuAGAGcuAaAGAAAdTsdT-3' 5'-UUUCUUuAGCUCuAGGUGAdTsdT-3'
AIF1 XD-09667 0.042 5'-accuAGAGcuAAAgAAAuudTsdT-3' 5'-AAUUUCUUuAGCUCuAGGUdTsdT-3'
AIF1 XD-09668 0.267 5'-ccuAGAGcuAAAGaAAuuAdTsdT-3' 5'-uAAUUUCUUuAGCUCuAGGdTsdT-3'
AIF1 XD-09669 1.234 5'-ccGGGGAGAcGuucAGcuAdTsdT-3' 5'-uAGCUGAACGUCUCCCCGGdTsdT-3'
CD84 XD-09610 0.047 5'-accAAAAAuuAcAcAGAGudTsdT-3' 5'-ACUCUGUGuAAUUUUUGGUdTsdT-3'
CD84 XD-09611 0.082 5'-gaGGGuAAuGuccuucAAAdTsdT-3' 5'-UUUGAAGGAcAUuACCCUCdTsdT-3'
CD84 XD-09612 0.351 5'-gguAAuGuccuucaAAucudTsdT-3' 5'-AGAUUUGAAGGAcAUuACCdTsdT-3'
CD84 XD-09613 0.241 5'-ucAuAuGAucAuuuAAGGAdTsdT-3' 5'-UCCUuAAAUGAUcAuAUGAdTsdT-3'
CD84 XD-09614 ＜0.005 5'-gaAcAcAGuuuAuuccGAAdTsdT-3' 5'-UUCGGAAuAAACUGUGUUCdTsdT-3'
CD84 XD-09615 0.048 5'-ggAAcuGGGuAuAauccAAdTsdT-3' 5'-UUGGAUuAuACCcAGUUCCdTsdT-3'
CD84 XD-09616 0.067 5'-gcAccAAcuAccAuuAGcAdTsdT-3' 5'-UGCuAAUGGuAGUUGGUGCdTsdT-3'
CD84 XD-09617 0.010 5'-cacuAcAGuuAAcgcuGAAdTsdT-3' 5'-UUcAGCGUuAACUGuAGUGdTsdT-3'
CD84 XD-09618 ＜0.005 5'-gguAucAGGAAucaAAAuudTsdT-3' 5'-AAUUUUGAUUCCUGAuACCdTsdT-3'
CD84 XD-09619 ＜0.005 5'-ccuuAcAGcAuAAcuAAuudTsdT-3' 5'-AAUuAGUuAUGCUGuAAGGdTsdT-3'
IGSF6 XD-09641 n.d. 5'-gaGGccGucAccAuAAAGudTsdT-3' 5'-ACUUuAUGGUGACGGCCUCdTsdT-3'
IGSF6 XD-09642 0.035 5'-gaAGcGAGAGcuAaAcAGAdTsdT-3' 5'-UCUGUUuAGCUCUCGCUUCdTsdT-3'
IGSF6 XD-09643 0.077 5'-guGcucGGcGuAuuuuucAdTsdT-3' 5'-UGAAAAAuACGCCGAGcACdTsdT-3'
IGSF6 XD-09645 0.034 5'-agAAcuAuAccAuaAGAGAdTsdT-3' 5'-UCUCUuAUGGuAuAGUUCUdTsdT-3'
IGSF6 XD-09646 0.010 5'-ccAuAAGAGAcAuguGGAAdTsdT-3' 5'-UUCcAcAUGUCUCUuAUGGdTsdT-3'
IGSF6 XD-09647 0.069 5'-ggccAuAGAAAcGuuuuAAdTsdT-3' 5'-UuAAAACGUUUCuAUGGCCdTsdT-3'
IGSF6 XD-09648 0.503 5'-ccAuAGAAAcGuuuuAAuudTsdT-3' 5'-AAUuAAAACGUUUCuAUGGdTsdT-3'
IGSF6 XD-09649 0.503 5'-acAuAuAucAucAgGucuudTsdT-3' 5'-AAGACCUGAUGAuAuAUGUdTsdT-3'
FERMT3 XD-09700 n.d. 5'-cgAcGcAcGccucuucuuudTsdT-3' 5'-AAAGAAGAGGCGUGCGUCGdTsdT-3'
FERMT3 XD-09701 0.921 5'-ggcuGcGcuucAAguAcuAdTsdT-3' 5'-uAGuACUUGAAGCGcAGCCdTsdT-3'
FERMT3 XD-09705 6.753 5'-guucccGAuGuuAacGucudTsdT-3' 5'-AGACGUuAAcAUCGGGAACdTsdT-3'
FERMT3 XD-09707 n.d. 5'-ccAGcuGccGAAuuGuAcAdTsdT-3' 5'-UGuAcAAUUCGGcAGCUGGdTsdT-3'
FERMT3 XD-09708 0.012 5'-gcuGccGAAuuGuacAcGAdTsdT-3' 5'-UCGUGuAcAAUUCGGcAGCdTsdT-3'
FERMT3 XD-09709 0.048 5'-guAGcuAcAGGAugAuGAAdTsdT-3' 5'-UUcAUcAUCCUGuAGCuACdTsdT-3'
CD48 XD-09720 0.012 5'-cucuGGAAuuGcuacuGcudTsdT-3' 5'-AGcAGuAGcAAUUCcAGAGdTsdT-3'
CD48 XD-09721 0.009 5'-cuAAccuGGuuuuauAcuudTsdT-3' 5'-AAGuAuAAAACcAGGUuAGdTsdT-3'
CD48 XD-09722 0.014 5'-cuuucGAccAGAAgAuuGudTsdT-3' 5'-AcAAUCUUCUGGUCGAAAGdTsdT-3'
CD48 XD-09723 0.030 5'-uccAGAAAAucuAaGuAcudTsdT-3' 5'-AGuACUuAGAUUUUCUGGAdTsdT-3'
CD48 XD-09724 0.055 5'-gaAuccAAAuuuAaAGGcAdTsdT-3' 5'-UGCCUUuAAAUUUGGAUUCdTsdT-3'
CD48 XD-09725 0.022 5'-cccAAGccuGucAucAAAAdTsdT-3' 5'-UUUUGAUGAcAGGCUUGGGdTsdT-3'
CD48 XD-09726 0.017 5'-acAAcuGuuAucugAAAcudTsdT-3' 5'-AGUUUcAGAuAAcAGUUGUdTsdT-3'
CD48 XD-09727 0.046 5'-ccuGGcGAGucuGuAAAcudTsdT-3' 5'-AGUUuAcAGACUCGCcAGGdTsdT-3'
CD48 XD-09728 0.032 5'-cuGGcGAGucuGuaAAcuAdTsdT-3' 5'-uAGUUuAcAGACUCGCcAGdTsdT-3'
CD48 XD-09729 0.015 5'-uguuAuAcuuGccaAGucAdTsdT-3' 5'-UGACUUGGcAAGuAuAAcAdTsdT-3'
CD33 XD-09731 n.d. 5'-ccGGccAcuccAAaAAccudTsdT-3' 5'-AGGUUUUUGGAGUGGCCGGdTsdT-3'
CD33 XD-09732 5.400 5'-ggccccAGGAcuAcucAcudTsdT-3' 5'-AGUGAGuAGUCCUGGGGCCdTsdT-3'
CD33 XD-09734 0.740 5'-acuccucGGuGcucAuAAudTsdT-3' 5'-AUuAUGAGcACCGAGGAGUdTsdT-3'
CD33 XD-09735 0.818 5'-caAcGucAccuAuguuccAdTsdT-3' 5'-UGGAAcAuAGGUGACGUUGdTsdT-3'
CD33 XD-09736 0.176 5'-ucAccuAuGuuccacAGAAdTsdT-3' 5'-UUCUGUGGAAcAuAGGUGAdTsdT-3'
CD33 XD-09737 0.334 5'-cccAAcAAcuGGuaucuuudTsdT-3' 5'-AAAGAuACcAGUUGUUGGGdTsdT-3'
CD33 XD-09738 0.220 5'-ccAGAGcAGGAGugGuucAdTsdT-3' 5'-UGAACcACUCCUGCUCUGGdTsdT-3'
CD33 XD-09739 n.d. 5'-gguucAuGGGGccauuGGAdTsdT-3' 5'-UCcAAUGGCCCcAUGAACCdTsdT-3'
LST1 XD-09750 3.594 5'-cuGAucAuuucGccuAAAAdTsdT-3' 5'-UUUuAGGCGAAAUGAUcAGdTsdT-3'
LST1 XD-09751 1.539 5'-cauuucGccuAAAaGAGcAdTsdT-3' 5'-UGCUCUUUuAGGCGAAAUGdTsdT-3'
LST1 XD-09752 0.737 5'-gccuAAAAGAGcAaGGAcudTsdT-3' 5'-AGUCCUUGCUCUUUuAGGCdTsdT-3'
LST1 XD-09753 n.d. 5'-ggAAcuccAcuAugcAucudTsdT-3' 5'-AGAUGcAuAGUGGAGUUCCdTsdT-3'
LST1 XD-09754 0.052 5'-caAGGAGGAuccAaGAGcudTsdT-3' 5'-AGCUCUUGGAUCCUCCUUGdTsdT-3'
LST1 XD-09755 0.046 5'-ggAuccAAGAGcugAcuAudTsdT-3' 5'-AuAGUcAGCUCUUGGAUCCdTsdT-3'
LST1 XD-09756 6.598 5'-ucucGAGccuccGuucAAAdTsdT-3' 5'-UUUGAACGGAGGCUCGAGAdTsdT-3'
LST1 XD-09757 n.d. 5'-cuccGuucAAAuugAucAudTsdT-3' 5'-AUGAUcAAUUUGAACGGAGdTsdT-3'
LST1 XD-09758 8.205 5'-ugAucAucAucAAaAcuuAdTsdT-3' 5'-uAAGUUUUGAUGAUGAUcAdTsdT-3'
LST1 XD-09759 n.d. 5'-accuuuGAAuAGGgAAuuudTsdT-3' 5'-AAAUUCCCuAUUcAAAGGUdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09760 0.058 5'-ggAccAGGccGuGaucucudTsdT-3' 5'-AGAGAUcACGGCCUGGUCCdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09761 0.701 5'-ggucAGGuGGAGAucucuudTsdT-3' 5'-AAGAGAUCUCcACCUGACCdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09762 0.226 5'-uuuAAuGuAucGcuAccAAdTsdT-3' 5'-UUGGuAGCGAuAcAUuAAAdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09763 n.d. 5'-aaAucGAcAccuGaAAAAGdTsdT-3' 5'-CUUUUUcAGGUGUCGAUUUdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09764 2.979 5'-cguuGcGcuGGAAgGAAuudTsdT-3' 5'-AAUUCCUUCcAGCGcAACGdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09765 0.023 5'-cuGcGcGAGGcGcaAuAcAdTsdT-3' 5'-UGuAUUGCGCCUCGCGcAGdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09766 0.127 5'-cccucGAuGuAcAuAGcuudTsdT-3' 5'-AAGCuAUGuAcAUCGAGGGdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09767 n.d. 5'-cacAGuGcAuAAGcAGuuudTsdT-3' 5'-AAACUGCUuAUGcACUGUGdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09768 0.353 5'-aaAucAAucAuGuuAcAcudTsdT-3' 5'-AGUGuAAcAUGAUUGAUUUdTsdT-3'
TNFAIP8L2 XD-09796 11.602 5'-gcAcAuAGcAAGcuGAAcudTsdT-3' 5'-AGUUcAGCUUGCuAUGUGCdTsdT-3'
CD37 XD-09770 0.553 5'-gcuuGcGGGAcGucGuAGAdTsdT-3' 5'-UCuACGACGUCCCGcAAGCdTsdT-3'
CD37 XD-09771 0.388 5'-gacGucGuAGAGAaAAccAdTsdT-3' 5'-UGGUUUUCUCuACGACGUCdTsdT-3'
CD37 XD-09773 0.311 5'-cgAccAAcGAcuccAcAAudTsdT-3' 5'-AUUGUGGAGUCGUUGGUCGdTsdT-3'
CD37 XD-09774 0.129 5'-ccAAcGAcuccAcaAuccudTsdT-3' 5'-AGGAUUGUGGAGUCGUUGGdTsdT-3'
CD37 XD-09775 1.600 5'-ccAcAAuccuAGAuAAGGudTsdT-3' 5'-ACCUuAUCuAGGAUUGUGGdTsdT-3'
CD37 XD-09776 1.320 5'-ggcuGcAcAAcAAccuuAudTsdT-3' 5'-AuAAGGUUGUUGUGcAGCCdTsdT-3'
CD37 XD-09777 0.414 5'-guucAuGAcGcucucGAuAdTsdT-3' 5'-uAUCGAGAGCGUcAUGAACdTsdT-3'
CD37 XD-09778 11.400 5'-cgGcucGcucGAuaccGuudTsdT-3' 5'-AACGGuAUCGAGCGAGCCGdTsdT-3'
CD37 XD-09779 ＜0.005 5'-accAcccAcAAGAuuAuuudTsdT-3' 5'-AAAuAAUCUUGUGGGUGGUdTsdT-3'
SPI1 XD-09780 2.663 5'-ggAucuAuAccAAcGccAAdTsdT-3' 5'-UUGGCGUUGGuAuAGAUCCdTsdT-3'
SPI1 XD-09781 0.455 5'-cgccAAAcGcAcGaGuAuudTsdT-3' 5'-AAuACUCGUGCGUUUGGCGdTsdT-3'
SPI1 XD-09782 n.d. 5'-gcuucGccGAGAAcAAcuudTsdT-3' 5'-AAGUUGUUCUCGGCGAAGCdTsdT-3'
SPI1 XD-09783 1.108 5'-gcGAcAuGAAGGAcAGcAudTsdT-3' 5'-AUGCUGUCCUUcAUGUCGCdTsdT-3'
SPI1 XD-09784 n.d. 5'-cccGcuGGccAuAgcAuuAdTsdT-3' 5'-uAAUGCuAUGGCcAGCGGGdTsdT-3'
SPI1 XD-09785 0.479 5'-gucucAAGuccGuauGuAAdTsdT-3' 5'-UuAcAuACGGACUUGAGACdTsdT-3'
SPI1 XD-09786 0.250 5'-ucucAAGuccGuAuGuAAAdTsdT-3' 5'-UUuAcAuACGGACUUGAGAdTsdT-3'
SPI1 XD-09787 0.075 5'-ccGuAuGuAAAucaGAucudTsdT-3' 5'-AGAUCUGAUUuAcAuACGGdTsdT-3'
SPI1 XD-09788 1.316 5'-acAAGuAAAGuuAuucucAdTsdT-3' 5'-UGAGAAuAACUUuACUUGUdTsdT-3'
SPI1 XD-09789 0.442 5'-aaAGuuAuucucAauccAudTsdT-3' 5'-AUGGAUUGAGAAuAACUUUdTsdT-3'
CD207 XD-09240 0.678 5'-guGAGcAcucAGGauGAcudTsdT-3' 5'-AGUcAUCCUGAGUGCUcACdTsdT-3'
CD207 XD-09241 0.203 5'-gaAAAcAcccAcAguccGudTsdT-3' 5'-ACGGACUGUGGGUGUUUUCdTsdT-3'
CD207 XD-09242 0.009 5'-caGuccGuGcuGcauuAAudTsdT-3' 5'-AUuAAUGcAGcACGGACUGdTsdT-3'
CD207 XD-09243 0.198 5'-guccGuGcuGcAuuAAucudTsdT-3' 5'-AGAUuAAUGcAGcACGGACdTsdT-3'
CD207 XD-09244 0.005 5'-ugcuGAAAGGucGuGuGGAdTsdT-3' 5'-UCcAcACGACCUUUcAGcAdTsdT-3'
CD207 XD-09245 0.020 5'-gcGuucAGAuccAgAuGGudTsdT-3' 5'-ACcAUCUGGAUCUGAACGCdTsdT-3'
CD207 XD-09246 0.025 5'-aaAuAcAAAGAuccGGGcAdTsdT-3' 5'-UGCCCGGAUCUUUGuAUUUdTsdT-3'
CD207 XD-09247 n.d. 5'-auAuGAGcAAGuugcucAAdTsdT-3' 5'-UUGAGcAACUUGCUcAuAUdTsdT-3'
CD207 XD-09248 ＜0.005 5'-uauucuAcAGGuGguuucudTsdT-3' 5'-AGAAACcACCUGuAGAAuAdTsdT-3'
CD207 XD-09249 0.153 5'-uauAGuGccGAGcaGuucudTsdT-3' 5'-AGAACUGCUCGGcACuAuAdTsdT-3'
LILRB2 XD-10590 0.068 5'-caGcAuCuuGGAuuAcAcsa-3' 5'-dTGUGuAAUCcAAGAUGCUGusu-3'
LILRB2 XD-10591 0.073 5'-ggAuAcGAccAGAgcuugsa-3' 5'-dTCAAGCUCUGGUCGuAUCCusu-3'
LILRB2 XD-10592 0.459 5'-gcGAuAUGGcuGucAGuasa-3' 5'-dTUACUGAcAGCcAUAUCGCusu-3'
LILRB2 XD-10593 0.136 5'-cuAuGGUuAuGAcuuGAasa-3' 5'-dTUUcAAGUcAuAACcAuAGusu-3'
LILRB2 XD-10594 0.089 5'-gguuAuGAcuuGAacucusa-3' 5'-dTAGAGUUcAAGUcAuAACCusu-3'
LILRB2 XD-10595 n.d. 5'-ggcAcACccuucAucucasa-3' 5'-dTUGAGAUGAAGGGUGUGCCusu-3'
LILRB2 XD-10597 0.059 5'-cccAcuCcGucuAaGAucsa-3' 5'-dTGAUCUuAGACGGAGUGGGusu-3'
LILRB2 XD-10598 0.109 5'-ccAcucCGucuAAgAucasa-3' 5'-dTUGAUCUuAGACGGAGUGGusu-3'
LILRB2 XD-10599 0.127 5'-cacuccGucuAAGaucAasa-3' 5'-dTUUGAUCUuAGACGGAGUGusu-3'
EVI2B XD-10480 0.094 5'-gaGAcAAuuAcAAcAGAGAdTsdT-3' 5'-UCUCUGUUGuAAUUGUCUCdTsdT-3'
EVI2B XD-10481 0.169 5'-cuuuGGGucAAccaAcAcAdTsdT-3' 5'-UGUGUUGGUUGACCcAAAGdTsdT-3'
EVI2B XD-10482 0.017 5'-caAccAAcAccAAuAGccAdTsdT-3' 5'-UGGCuAUUGGUGUUGGUUGdTsdT-3'
EVI2B XD-10483 3.272 5'-ccAucuGcccGuAcuucuAdTsdT-3' 5'-uAGAAGuACGGGcAGAUGGdTsdT-3'
EVI2B XD-10484 0.014 5'-ccAccAAAGucAuuuGucudTsdT-3' 5'-AGAcAAAUGACUUUGGUGGdTsdT-3'
EVI2B XD-10485 1.380 5'-gucAAAAAuucAccuAGGAdTsdT-3' 5'-UCCuAGGUGAAUUUUUGACdTsdT-3'
EVI2B XD-10486 0.225 5'-ggAuuuAucuuAGauAcuAdTsdT-3' 5'-uAGuAUCuAAGAuAAAUCCdTsdT-3'
EVI2B XD-10487 0.156 5'-cauAcuAAuuGGuguAcuudTsdT-3' 5'-AAGuAcACcAAUuAGuAUGdTsdT-3'
EVI2B XD-10488 2.552 5'-agcuAuAAucAucauuGuAdTsdT-3' 5'-uAcAAUGAUGAUuAuAGCUdTsdT-3'
EVI2B XD-10489 0.013 5'-cucccAAcucuGAucAAGAdTsdT-3' 5'-UCUUGAUcAGAGUUGGGAGdTsdT-3'
CLEC7A XD-10560 0.005 5'-ggAuAuAcucAAuuAcAcudTsdT-3' 5'-AGUGuAAUUGAGuAuAUCCdTsdT-3'
CLEC7A XD-10561 0.009 5'-ggucAAGAuAAAugcAGAAdTsdT-3' 5'-UUCUGcAUUuAUCUUGACCdTsdT-3'
CLEC7A XD-10562 0.033 5'-agGuAGGcuAGuAuuAuuudTsdT-3' 5'-AAAuAAuACuAGCCuACCUdTsdT-3'
CLEC7A XD-10563 0.005 5'-ccccAAGcuuGAAuuuucAdTsdT-3' 5'-UGAAAAUUcAAGCUUGGGGdTsdT-3'
CLEC7A XD-10564 ＜0.004 5'-ggGuAAGccAuAAgcGAAudTsdT-3' 5'-AUUCGCUuAUGGCUuACCCdTsdT-3'
CLEC7A XD-10565 ＜0.004 5'-ccAuAAGcGAAucuuAAuudTsdT-3' 5'-AAUuAAGAUUCGCUuAUGGdTsdT-3'
CLEC7A XD-10566 0.006 5'-ugccAuAucucuAauAGAAdTsdT-3' 5'-UUCuAUuAGAGAuAUGGcAdTsdT-3'
CLEC7A XD-10567 0.023 5'-gccuAGAAucuuGuAuAAudTsdT-3' 5'-AUuAuAcAAGAUUCuAGGCdTsdT-3'
CLEC7A XD-10568 0.016 5'-ccuAGAAucuuGuauAAuAdTsdT-3' 5'-uAUuAuAcAAGAUUCuAGGdTsdT-3'
CLEC7A XD-10569 0.016 5'-gcucucAuAGGAAaGuuuudTsdT-3' 5'-AAAACUUUCCuAUGAGAGCdTsdT-3'
CXorf21 XD-10502 6.027 5'-cuGucAGAAGGGuaucucAdTsdT-3' 5'-UGAGAuACCCUUCUGAcAGdTsdT-3'
CXorf21 XD-10503 0.654 5'-cuAcGuGAGcuGcaAAucAdTsdT-3' 5'-UGAUUUGcAGCUcACGuAGdTsdT-3'
CXorf21 XD-10504 1.756 5'-gguGAuGGccAuuaAuucAdTsdT-3' 5'-UGAAUuAAUGGCcAUcACCdTsdT-3'
CXorf21 XD-10505 13.103 5'-cauuAuGGAcAccguGuuudTsdT-3' 5'-AAAcACGGUGUCcAuAAUGdTsdT-3'
CXorf21 XD-10506 0.750 5'-gucuGAAcucAucauGAcAdTsdT-3' 5'-UGUcAUGAUGAGUUcAGACdTsdT-3'
CXorf21 XD-10507 n.d. 5'-gcAAuuGAuGucAacuGAAdTsdT-3' 5'-UUcAGUUGAcAUcAAUUGCdTsdT-3'
CXorf21 XD-10508 1.653 5'-caAuGuAAAuccAuAGAGAdTsdT-3' 5'-UCUCuAUGGAUUuAcAUUGdTsdT-3'
CXorf21 XD-10509 n.d. 5'-guAAGAGGAGccAuAAGGAdTsdT-3' 5'-UCCUuAUGGCUCCUCUuACdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10490 0.573 5'-gccGAcAGcGuucuGuuuudTsdT-3' 5'-AAAAcAGAACGCUGUCGGCdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10491 0.048 5'-cuGcAAGcGuuucuucGAAdTsdT-3' 5'-UUCGAAGAAACGCUUGcAGdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10492 1.437 5'-gcccGGAuuuuGcccAAuAdTsdT-3' 5'-uAUUGGGcAAAAUCCGGGCdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10493 0.239 5'-ggAuuuuGcccAAuAAGAAdTsdT-3' 5'-UUCUuAUUGGGcAAAAUCCdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10494 0.049 5'-caAuAAGAAccGAgAcGAAdTsdT-3' 5'-UUCGUCUCGGUUCUuAUUGdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10495 0.125 5'-gaAccGAGAcGAAcuGAAudTsdT-3' 5'-AUUcAGUUCGUCUCGGUUCdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10496 0.061 5'-agAcGAAcuGAAugGcuuudTsdT-3' 5'-AAAGCcAUUcAGUUCGUCUdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10497 0.137 5'-ccAuGGGcGuGcAaGAcuudTsdT-3' 5'-AAGUCUUGcACGCCcAUGGdTsdT-3'
TBXAS1 XD-10498 0.273 5'-gcGuGcAAGAcuuuGAcAudTsdT-3' 5'-AUGUcAAAGUCUUGcACGCdTsdT-3'
SIGLEC7 XD-10600 0.155 5'-agAGuAAccGGAAgGAuusa-3' 5'-dTAAUCCUUCCGGUUACUCUusu-3'
SIGLEC7 XD-10601 0.127 5'-gaGuAACcGGAAGgAuuasa-3' 5'-dTUAAUCCUUCCGGUuACUCusu-3'
SIGLEC7 XD-10602 3.534 5'-guAAccGGAAGGAuuAcusa-3' 5'-dTAGuAAUCCUUCCGGUuACusu-3'
SIGLEC7 XD-10603 0.029 5'-cgGAAGGAuuAcucGcugsa-3' 5'-dTCAGCGAGuAAUCCUUCCGusu-3'
SIGLEC7 XD-10604 0.032 5'-ggAAGGAuuAcucgcuGasa-3' 5'-dTUcAGCGAGuAAUCCUUCCusu-3'
SIGLEC7 XD-10605 0.022 5'-ggAuuACucGcuGacGAusa-3' 5'-dTAUCGUcAGCGAGUAAUCCusu-3'
SIGLEC7 XD-10606 0.045 5'-ccGuGcAAGAGGGcAuGusa-3' 5'-dTAcAUGCCCUCUUGcACGGusu-3'
SIGLEC7 XD-10607 0.039 5'-cgGGcAGGGAAuGauAuasa-3' 5'-dTUAuAUcAUUCCCUGCCCGusu-3'
SIGLEC7 XD-10608 0.056 5'-gcAGGGAAuGAuAuAAGcsa-3' 5'-dTGCUuAuAUcAUUCCCUGCusu-3'
SIGLEC7 XD-10609 0.059 5'-ggAAuGAuAuAAGcuGGasa-3' 5'-dTUCcAGCUuAuAUCAUUCCusu-3'
CCR5 XD-10550 0.017 5'-ggAAcAAGAuGGAuuAucAdTsdT-3' 5'-UGAuAAUCcAUCUUGUUCCdTsdT-3'
CCR5 XD-10551 0.046 5'-ccAuAcAGucAGuaucAAudTsdT-3' 5'-AUUGAuACUGACUGuAUGGdTsdT-3'
CCR5 XD-10552 0.070 5'-cauuAAAGAuAGucAucuudTsdT-3' 5'-AAGAUGACuAUCUUuAAUGdTsdT-3'
CCR5 XD-10553 0.361 5'-agGuAuGGuuAAuaAGuuudTsdT-3' 5'-AAACUuAUuAACcAuACCUdTsdT-3'
CCR5 XD-10554 n.d. 5'-gauccuGGuuGGuguuGcAdTsdT-3' 5'-UGcAAcACcAACcAGGAUCdTsdT-3'
CCR5 XD-10555 n.d. 5'-guAuGAGGucuAGgAAcAudTsdT-3' 5'-AUGUUCCuAGACCUcAuACdTsdT-3'
CCR5 XD-10556 n.d. 5'-caucAAAcucuuAguuAcudTsdT-3' 5'-AGuAACuAAGAGUUUGAUGdTsdT-3'
CCR5 XD-10557 n.d. 5'-cuccGuAuuucAGacuGAAdTsdT-3' 5'-UUcAGUCUGAAAuACGGAGdTsdT-3'
CCR5 XD-10558 1.052 5'-gcAcAuAcuuGAGacuGuudTsdT-3' 5'-AAcAGUCUcAAGuAUGUGCdTsdT-3'
CCR5 XD-10559 1.018 5'-gcAAcGAAGGGAAauGucudTsdT-3' 5'-AGAcAUUUCCCUUCGUUGCdTsdT-3'
DOCK2 XD-09690 n.d. 5'-cacGGcGuGGccAuAuAcAdTsdT-3' 5'-UGuAuAUGGCcACGCCGUGdTsdT-3'
DOCK2 XD-09691 11.713 5'-ggGGAuAccucAuaAAGcAdTsdT-3' 5'-UGCUUuAUGAGGuAUCCCCdTsdT-3'
DOCK2 XD-09692 n.d. 5'-caAGcAAAcGGucauAAGudTsdT-3' 5'-ACUuAUGACCGUUUGCUUGdTsdT-3'
DOCK2 XD-09693 n.d. 5'-uuGuGuAcuAucAaGucAAdTsdT-3' 5'-UUGACUUGAuAGuAcAcAAdTsdT-3'
DOCK2 XD-09694 0.403 5'-ccAucuGcGAuucauGuuudTsdT-3' 5'-AAAcAUGAAUCGcAGAUGGdTsdT-3'
DOCK2 XD-09695 n.d. 5'-cucuAcAcGAuGGauuccAdTsdT-3' 5'-UGGAAUCcAUCGUGuAGAGdTsdT-3'
DOCK2 XD-09696 1.775 5'-cucAuuGcAGAccgGAAAudTsdT-3' 5'-AUUUCCGGUCUGcAAUGAGdTsdT-3'
DOCK2 XD-09697 0.556 5'-accGGAAAuuucAgcAuuudTsdT-3' 5'-AAAUGCUGAAAUUUCCGGUdTsdT-3'
DOCK2 XD-09698 1.356 5'-ggucGAGGAcAuuauuuucdTsdT-3' 5'-GAAAAuAAUGUCCUCGACCdTsdT-3'
FLuc (control) XD-00194 n.d. 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3'
然後將經驗證siRNA用於原代人類巨噬細胞分析中以測定靶敲低改變促腫瘤生成(M2)或促發炎(M1)表型之能力，如上文在實例1中所闡述。簡言之，藉由Ficoll分離使用RosetteSep™人類單核球富集混合劑(Stemcell Techhnologies, Vancouver Canada)根據製造商說明書自新供體之全血分離單核球。將經分離單核球排列於24孔板中之含有10%胎牛血清之伊氏改良達爾伯克氏培養基(Iscove’s Modified Dubelcos Media，IMDM) (ThermoFisher)中過夜且在24小時之後洗滌掉非黏附細胞。藉由在IMDM 10% FBS + 50 ng/ml人類M-CSF (對於M2巨噬細胞)或50 ng/ml GM-CSF (Biolegend, San Diego, CA) (對於M1巨噬細胞)中培養6天來使單核球分化成巨噬細胞。
以50 nM之最終濃度在第1天及第3天投與siRNA脂質奈米顆粒。如Novobrantseva等人(2012)Mol Ther. Nucl. Acids 1:e4中所闡述來調配C12-200脂質奈米顆粒(LNP)。簡言之，經由微流體混合在10 mM檸檬酸鹽緩衝液中一起混合含有莫耳比率為50:10:38.5:1.5之可離子化脂質C12-200 (闡述於Love等人(2010) AXO Labs GmbH, Kulmbach, Germany中；可獲得於全球資訊網(World Wide Web)之doi.org/10.1073/pnas.0910603106上)、二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC, Avanti Polar Lipids, Alabaster AL)、膽固醇(MP Biomedicals, Santa Ana CA)及DMPE-PEG2000 (1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000], Avanti)之乙醇相與siRNA水相。乙醇:水性體積比率為1:3，且總脂質:siRNA重量比率為大約9:1。針對1× PBS過夜透析所得LNP。經調配LNP具有大約60-70 nm之中值粒徑，如藉由奈米顆粒追蹤分析 (ZetaView, ParticleMetrix)所量測，且siRNA囊封效率為大約80-90%，如藉由改良Quant-iT™ RiboGreen®分析(Heyes等人，2005；doi:10.1016/j.jconrel.2005.06.014)所量測。
在培養第6天，使用20 ng/ml人類IL-10 (Biolegend, San Diego, CA)極化M2巨噬細胞。48小時後，藉由刮除自板去除巨噬細胞且如上所述藉由bDNA來評價mRNA含量。圖3A展示在M2巨噬細胞中評價之每一個別靶之相對敲低。圖3B展示相同M2巨噬細胞中經由流式細胞術分析測得之靶蛋白(若其表現於表面上)之敲低。
圖3展示來自上述經siRNA處理之M2巨噬細胞之結果，其(例如)藉由使用傳統標記物CD163、CD16及CD206之表現之評價以及經由上文實例1中所闡述之生物標記物(例如CD53、PSGL1及VSIG4)證實，26種經驗證靶經測定將M2巨噬細胞驅向M1表型及/或進一步沿M2譜。另外，該等靶顯示使該等M2巨噬細胞之形態改變至M1樣及/或更像M2之能力。重要的是，該等分析內發生分化之細胞在傾斜條件存在下保留於整個分析中。因此，對於將靶自M2樣驅向M1樣之siRNA而言，其必須在連續強傾斜混合劑存在下方達成此效應。此對於該等siRNA之功能設定了極高標桿，此乃因其不能達成完全敲低，但顯示顯著表型變化。實例1顯示傳統巨噬細胞標記物CD163、CD16及CD206以及生物標記物CD53、PSGL1及VSIG4之表現。圖1亦展示在個別供體之間該等標記物內之天然及顯著可變性。同樣，應注意，一些標記物在M1分化細胞與M2分化細胞之間之表現差異小於0.5倍變化(圖1A)，從而指示極小表現變化即可具有極顯著功能結果。因此，經由siRNA敲低，在最少4個供體中i)經典標記物、ii)新生物標記物、iii)經典或新生物標記物之組合或iv) i、ii或iii與形態變化之組合之平均變化為10%或更大時，來自表1及表2之靶可視為有效的。
實例 3 ： 藉由阻斷靶蛋白來驗證調節巨噬細胞發炎表型之靶 將巨噬細胞生物最佳化以誘導或抑制免疫反應。因此，經由siRNA、抗體或其他方式靶向巨噬細胞容許改變免疫反應之開始、抑制及/或永存。
已鑑別及生成如實例2中所闡述驗證之靶之抗體。用於本文所闡述實驗中之抗體係源自商業供應商或以重組方式生成。舉例而言，抗體可變區序列係衍生自已知結合劑(例如闡述於下列來源中者：美國專利公開案第2007/0160601號、美國專利第7,833,530號、美國專利第7,604,802號及美國專利公開案第2017/0190782號)。抗體可變區序列闡述於表6中或產生之。 表6：抗體可變區序列
Figure 02_image689
所有重組抗體皆表示為具有與κ或λ輕鏈配對之S228P重鏈突變之人類IgG4嵌合體。將可變重鏈(HC)及輕鏈(LC)序列選殖至含有表7中所展示抗體恆定區序列之載體中。 表7：抗體恆定區序列
Figure 02_image691
藉由ATUM (Newark, CA)且藉由將含有重鏈及輕鏈之專屬載體瞬時轉染至懸浮液適應性HEK293細胞中來實施蛋白質表現及純化。藉由蛋白質A親和力層析(MabSelect SuRe™ pcc, GE Life Sciences)根據製造商方案來純化細胞培養上清液。將經洗脫、中和蛋白質緩衝液交換至PBS (pH 7.4) (Corning)中並過濾滅菌。藉由OD280使用自一級胺基酸序列計算之消光係數來量化經純化抗體。藉由毛細管凝膠電泳(Perkin Elmer GXII)或SDS-PAGE (Bio-Rad Criterion™ Tris/甘胺酸/SDS, 4-20%)及HPLC-SEC表徵經純化抗體。亦表徵(Charles River Endosafe™)內毒素含量。
購買表8中所列示之商業抗體且用於分析中。另外，針對實例2中所闡述之經驗證靶來生成表9中所列示之抗體且包含於該等分析中。 表8：商業抗體
抗體名稱 供應商 純系名稱 抗原
AB 62 RND Systems 287219 LILRB2
AB 63 BioLegend WM53 CD33
AB 64 BioLegend KPL-1 PSGL1
AB 65 Ebiosciences 156-4H9 CD48
AB 66 NovusBio 394607 CD48
AB 67 RND Systems 424925 CD37
AB 68 Ebiosciences GE2 Dectin
AB 69 Merck Keytruda PD1
AB 70 BioLegend QA16a12 hIgG1同型
AB 71 BioLegend QA16A15 hIgG4同型
AB 72 BioLegend LN2 CD74
AB 73 BioLegend MOPC-21 mIgG1同型
AB 74 BioLegend CD84.1.2 CD84
表9：ATCC-寄存抗體
抗體 ATCC寄存號 抗原
AB 75 13H10 (PTA-125944) (Ike9.m.13H10.hyb.mG1) Siglec9
AB 76 13J19 (PTA-125945) (Ike9.m.13J19.hyb.mG1) Siglec9
AB 77 18F02 (PTA-125946) (Hn1.m.18F02.hyb.mG1) PSGL1
AB 78 19I01 (PTA-125943) (Hn1.m.19I01.hyb.mG1) PSGL1
AB 79 3C01 (PTA-126026) (Lf2.m.FJP5_3C01.hG4) LRC25
AB 80 1F01 (PTA-126025) (Lf2.m.FJP5_1F01.hG4) LRC25
AB 81 7A12 (PTA-126029) (Px1.m.7A12.hyb.mG2b) CD53
AB 82 7F19 (PTA-126030) (Px1.m.7F19.hyb.mG2b) CD53
AB 83 10M15 (PTA-126027) Px1.m.10M15.hyb.mG3 CD53
AB 84 4H23 (PTA-126028) (Px1.m.4H23.hyb.mG2b) CD53
如實例2中所闡述驗證之靶之所生成抗體已用於功能分析中。藉由包含以下之讀出來量測該等抗體對巨噬細胞分化狀態之效應：巨噬細胞狀態特異性生物標記物、細胞介素分泌及其他功能特性(例如使協同免疫反應永存於複雜多細胞分析中之能力)。
舉例而言，圖4展示表6、8及9中所列示20種用於巨噬細胞分化分析中之抗體之結果。
簡言之，藉由Ficoll分離使用RosetteSep™人類單核球富集混合劑(Stemcell Techhnologies, Vancouver Canada)根據製造商說明書自新供體之全血來分離單核球。將經分離單核球排列於24孔板中之含有10%胎牛血清之伊氏改良達爾伯克氏培養基(IMDM) (ThermoFisher)中過夜且在24小時之後洗滌掉非黏附細胞。藉由在IMDM 10% FBS + 50 ng/ml人類M-CSF (對於M2巨噬細胞)或50 ng/ml GM-CSF (Biolegend, San Diego, CA) (對於M1巨噬細胞)中培養6天來使單核球分化成巨噬細胞。在第6天使用IFN-γ及LPS活化M1巨噬細胞，而在第6天使用20 ng/ml IL-10極化M2巨噬細胞且在第7天使用100 ng/ml LPS進行活化。在培養第1、3及7天以10 ug/ml之最終濃度投與表6及8中所列示之單株抗體。評價細胞中之如上文所闡述M1及M2標記物之表現且收集無細胞上清液進行分析。數據代表至少3-4個健康供體。
特異性抗體能夠逆轉朝向M2表型之傾斜，如藉由本文(例如在實例1中)所闡述之經典及新穎生物標記物所測定。此並非所有抗體針對靶之泛功能效應，此乃因並非所有針對給定靶之mAb皆誘導巨噬細胞表型標記物之明顯變化。另外，抗體Ab 8及Ab 18能夠對所有該等標記物組顯示劑量可滴定效應(圖4)。如上所述，經由抗體處理，在最少4個供體之間i)經典標記物、ii)新的生物標記物、iii)經典或新的生物標記物之組合或iv) i、ii或iii與形態變化之組合之平均變化為10%或更大時，靶可視為有效的。
除表型表面標記物外，M1 (例如1型)及M2 (例如2型)巨噬細胞亦產生不同之細胞介素及趨化介素。舉例而言，M1巨噬細胞產生更具促發炎性細胞介素(包含(但不限於) GM-CSF、IL-12及TNFα)，而M2巨噬細胞產生更具促腫瘤生成及免疫抑制性細胞介素(例如VEGF、IL-10及TGFb)。此效應可見於圖4C中，其中與M2巨噬細胞相比，M1分化之巨噬細胞產生高含量之促發炎細胞介素。在該等分析中，巨噬細胞經由強力細胞介素IL-10及M-CSF之存在強烈驅向M2表型。在整個分化過程中，添加結合至經驗證靶之mAb能夠克服此強力極化且將M2巨噬細胞驅向更像M1狀態。此可藉由不僅經典表型標記物且亦新穎生物標記物之變化以及促發炎細胞介素產生之功能誘導所證實。
在整個分化及極化過程中添加siRNA或抗體時實現反應之能力已顯示於上文中。在疾病環境(例如腫瘤)中，據信，細胞已沿M2譜分化至一定程度。因此，在圖4D-4G中，單核球極化成如上文所闡述之M2，但僅在極化過程之最後兩天期間添加抗體。另外，投用1 ug/mL而非10 ug/mL之抗體77、78及81-84，所有其他mAb係以上述劑量投用。在此限制窗口期間，mAb 8、18及75-82能夠使M2巨噬細胞顯著極化至更像M1狀態，如藉由促發炎細胞介素之增加所證實。如實例2中所證實，一些靶之下調與siRNA敲低導致巨噬細胞達到更像M2免疫抑制表型。mAb 83及84顯示能夠經由使用mAb靶阻斷來重現此功能效應。
該等圖證實，經驗證靶之抗體能夠逆轉M2巨噬細胞之表型以及功能特性以使其更像M1，且能夠將巨噬細胞驅向更具免疫抑制性之M2樣表型。
實例 4 ： 使用複雜多細胞分析來驗證調節巨噬細胞發炎表型之靶 為使巨噬細胞誘導腫瘤免疫原性或逆轉自體免疫及發炎病症之過程，其通常應能夠誘導或阻斷協同免疫反應。此將包含對骨髓樣細胞及淋巴樣細胞具有直接及下游效應。需要由來自淋巴樣譜系及骨髓樣譜系之原代細胞組成之複雜多細胞分析來分析該等效應。
利用若干系統來證實本文所闡述之經驗證靶產生協同免疫反應之能力，包含葡萄球菌腸毒素B (SEB)分析及混合淋巴球反應(MLR)分析。該等分析利用原代人類細胞，該等細胞係用於研究之最天然細胞且對活體內疾病(例如人類疾病)具有最佳預測能力。該等分析在背景活性及反應之幅值方面天然具有高供體間可變性。
對於SEB分析而言，藉由Ficoll®分離自新供體之血液分離末梢血單核細胞(PBMC)並在-150℃下冷凍於90%胎牛血清(FBS)、10% DMSO中以用於長期儲存。在含有10% FBS、50 nM 2-巰基乙醇、非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉及10 mM HEPES之完全RPMI培養基中將PBMC解凍。接下來，將200,000個細胞平鋪於96孔板之每一孔中之完全RPMI中。添加5 μg/ml抗人類PD-1派姆單抗(Merck, KEYTRUDA® , MK-3475)且如所指示添加10 μg/ml表6-9中所指示之其他抗體，mAb 77、78及81-84除外，其係以1 ug/mL添加。將細胞及mAb在37℃下培育30分鐘且以0.1 μg/ml之最終濃度添加葡萄球菌腸毒素B (SEB) (EMD Millipore, Billerica, MA)。在活化4天之後，收集上清液並冷凍於-20℃下。使用多參數ProcartaPlex™分析(ThermoFisher Scientific)量測細胞介素濃度。數據代表至少4個健康供體。
對於MLR分析而言，藉由首先藉由梯度離心在Ficoll® Paque Plus (GE Healthcare, Chicago IL)上自全血分離PBMC來自MHC失配供體分離單核球及T細胞。使用無CD16消耗之EasySep™人類單核球富集套組(StemCell Technologies, Vancouver Canada)根據製造商手冊自PBMC分離單核球。在指示時，使單核球在如上文所闡述之抗體存在下分化成M2巨噬細胞。使用EasySep™人類T細胞分離套組(StemCell Technologies, Vancouver Canada)根據製造商手冊自PBMC分離T細胞。藉由以下方式來設置同種異體混合淋巴球反應：將20,000個單核球(M0)平鋪於U形底96孔板中且使其與1 ug/mL指示抗體在37℃下預培育30 min。然後，將50,000個T細胞添加至每一孔中且使細胞在37℃/5% CO2 下於加濕培育器中培育3天。培養基為IMDM + 10% FCS (胎牛血清)。在第3天，使用含有佈雷菲德菌素(brefeldin) A之T細胞活化混合劑(BioLegend, San Diego, CA)根據製造商手冊來將細胞再刺激4 h。在指示之情形下，收集上清液且藉由流式細胞術在Attune流式細胞儀(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)上分析T細胞，並使用FlowJo軟體(BD Bioscience, San Jose, CA)進行分析。使用Luminex panel (Thermo Fisher, Waltham, MA)根據製造商方案來量測來自上清液之細胞介素。使用Cytation 5成像讀數儀(Biotek, Winooski, VT)檢測發光。將數據正規化至同型對照組。
在該等分析中，經驗證靶之特異性抗體顯示能夠影響協同多細胞免疫反應。此協同多細胞反應包含不僅改變骨髓樣細胞之表型及功能(如先前所證實)，且亦改變淋巴樣細胞、具體而言T細胞之功能輸出。SEB分析之結果展示於圖5中。圖5A顯示IFNγ之T細胞特異性細胞內染色。如可看到，特定經驗證mAb能夠使IFNγ增加至高於對照含量。圖5B及5C顯示來自SEB分析之經分泌細胞介素之含量。使用經驗證mAb進行處理可產生骨髓源細胞介素及趨化介素(例如IL-1B、GM-CSF及CCL3.4)及T細胞源細胞介素(例如IL-2、IFNγ及IL-10)。此明確指示，經驗證可將巨噬細胞驅向更具促發炎性M1樣狀態之mAb可在多細胞分析中具有一致效應且增加發炎細胞介素，且經驗證可將巨噬細胞驅向更具免疫抑制性狀態之mAb在複雜多細胞分析中重現該效應。
圖6展示來自MLR實驗之結果，其中展示兩種不同反應。圖6A展示來自T細胞之IFNγ及顆粒酶B之細胞內流動染色。如上文所闡述藉由納入固定及滲透步驟來實施細胞內染色。使用BD Cytofix/Cytoperm™固定/滲透套組根據製造商方案來將細胞內表位染色。在此分析中，一些mAb能夠降低T細胞功能。鑒於MLR分析模擬發炎GVHD類型反應，故該等結果證實可在保證或期望降低發炎之環境中使用巨噬細胞相關靶。圖6B展示使用先前已證實能夠將M2巨噬細胞驅向更像M1狀態之mAb之其他不同反應。測得淋巴樣細胞介素及骨髓源細胞介素之增加，此係SEB分析中測得者所暗示。兩個該等分析皆明確證實，調節巨噬細胞相關靶可改變巨噬細胞功能以及T細胞功能，且由此誘發協同免疫反應。
實例 5 ： 藉由與免疫檢查點抑制劑治療相比調節經驗證靶來調節巨噬細胞發炎表型 檢查點抑制劑(例如PD-1阻斷抗體)係當前之黃金標準免疫腫瘤學治療劑。在傳統上，檢查點抑制劑已著眼於阻斷直接表現於T細胞上之抑制受體且由此直接增加針對腫瘤之T細胞活性。上文所驗證之展示靶已展示可首先改變巨噬細胞之表型及功能且然後引入協同免疫反應(包含T細胞活化)。因此，需要證實該等巨噬細胞相關靶之功能等於或優於檢查點抑制劑或潛在地與檢查點抑制劑組合之能力。
經驗證靶較檢查點抑制劑相等或更佳地發揮作用(包含在檢查點抑制劑不發揮作用之情況下)之能力顯示於圖5中。在此分析中，展示兩種供體。如上述SEB分析中所闡述來實施分析。舉例而言，供體5中之PD1阻斷(例如使用派姆單抗)可增加T細胞特異性反應，如藉由IFNg產生所指示，而在供體2中在PD1阻斷存在下T細胞活性並不增加。在供體2及供體5中，特異性抗體能夠誘導T細胞-及骨髓樣細胞特異性反應。另外， PD1阻斷與經驗證靶抗體之組合可產生加和反應，從而指示抗靶治療劑應用(單獨或與檢查點抑制劑組合)之效能。
實例 6: 巨噬細胞相關靶在腫瘤微環境中之表現及功能 測試經驗證巨噬細胞相關靶在腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)上之表現(圖7)。如上所述來實施流式細胞術。已證實，巨噬細胞相關靶表現於TAM (例如來自肺腫瘤、腎腫瘤者及來自婦科癌症之腹水液之細胞組分)上(圖7B)。該等經驗證巨噬細胞相關靶之一致穩健表現可見於不同腫瘤類型及系統中。
上述活體外系統明確展示，該等經驗證巨噬細胞相關靶能夠改變巨噬細胞功能以及複雜多細胞分析(包含T細胞)。使用患者腫瘤材料在離體培養系統中來進一步證實該等數據。此類系統代表人類活體內研究之接近且通常公認之代用者，由此提供治療益處之強力證據。使用若干獨立系統進一步測試巨噬細胞相關靶對組織環境中之巨噬細胞生物學之調控。
用於此目的之一個系統係解離腫瘤分析。解離腫瘤含有所有存在於腫瘤微環境中之不同細胞群體，包含(例如)腫瘤細胞、免疫細胞及支持細胞。該等可存活單一細胞懸浮液可用於許多應用且容許正規化每一重複實驗內之細胞數量及組合物。為在獲取新鮮腫瘤組織(小於24 hr)後實施解離腫瘤實驗，使用剪刀及解剖刀自腫瘤試樣去除環繞脂肪、纖維區域及壞死區域。將腫瘤切割成2-4 mm3 之小切片。根據製造商方案來製備腫瘤解離套組酶混合物(MACS Miltenyi Biotec)。將腫瘤切片及解離酶轉移至5 ml Snaplock微離心管中且使用一對直剪刀將組織切碎。將管在200-250 rpm下置於37℃振盪器中並保持45分鐘至1小時。在培育時間結束時，經由40 uM細胞過濾器將經消解腫瘤過濾至50 mL Falcon™圓錐形離心管中。使用冷2%-5% FBS/PBS混合物填充管以停止消解。所有剩餘步驟皆實施於冰上。特定而言，將管在300g下離心5分鐘，棄除上清液，且使用冷2%至5% FBS/PBS混合物將細胞洗滌兩次。在最後洗滌後，將細胞再懸浮於1 - 5 ml冷2%至5% FBS/PBS混合物中且實施細胞計數。將大約300k至400k細胞平鋪於6孔培養板中含有1 ml培養基(DMEM，含有L-麩醯胺酸、4.5 g/L葡萄糖及丙酮酸鈉(Fisher Scientific)、Gibco™ GlutaMAX™補充品(Fisher Scientific)、Gibco™ MEM非必需胺基酸溶液(Fisher Scientific)、2-巰基乙醇(55 mM) (Fisher Scientific)、來自人類男性AB血漿之熱滅活物(Sigma-Aldrich, Inc)、熱滅活胎牛血清(BioFluid Technologies)、100x pen/strep及人類M-CSF (BioLegend))及指示抗體之每一孔中。所有抗體皆係以10 ug/mL之濃度添加。將板在37℃及5% CO2 下於細胞培養培育器中培育24或48 hr。在研究結束時，使用Invitrogen™ Luminex™ Cytokine Human Magnetic 25-Plex Panel根據製造商說明書來量測培養物上清液中之細胞介素/趨化介素。
經特異性抗體以及派姆單抗(KEYTRUDA®)處理之腫瘤試樣展示於圖8中。本文所闡述之數據呈現34 (圖8A-8C)或11 (圖8D)個個別腫瘤(包括6個腫瘤類型)。數據證實，針對經驗證巨噬細胞相關靶之抗體能夠誘導TAM內之M1樣促發炎功能，如藉由TNFα、GM-CSF及IL-12之產生所展示。此分析亦證實除巨噬細胞功能外亦可在腫瘤內誘發協同免疫反應，如藉由細胞介素(例如IFNg)之產生所展示。此係重大發現，此乃因其證實，投與針對免疫抑制性環境中之表面受體之單一藥劑可調節骨髓樣細胞且繼而實現T細胞反應，由此證實可驅動腫瘤中之M2-至M1樣分化並誘導抗腫瘤反應。將此強力協同免疫反應與派姆單抗(KEYTRUDA®)反應直接比較且結果顯示，調節巨噬細胞相關靶可具有顯著更強力反應，從而證實可有效使用針對經驗證靶之單一藥劑療法。另外，巨噬細胞相關靶之效應可見於派姆單抗(KEYTRUDA®)不明顯之情形中，從而為擴展反應者群體鋪平道路。亦組合所選抗體與派姆單抗(KEYTRUDA®)且展示加和效應，從而證實組合療法可增加效能及/或克服檢查點療法抗性。亦應注意，除刺激IFNg產生外，派姆單抗(KEYTRUDA®)亦誘導免疫抑制性IL-10，此可限制其活性，而靶咬合併不刺激免疫抑制性IL-10。亦明顯存在趨化介素之顯著上調，此據信可募集新鮮免疫細胞以進一步永存抗腫瘤免疫反應。
使用第二系統來進一步證實解離腫瘤分析之結果。簡言之，解離腫瘤分析之優點在於能夠正規化每一實施條件中之細胞數量。其亦具有損失腫瘤結構及非細胞基質組分之潛在缺點。為解決此問題且證實經驗證靶誘導完整腫瘤中之協同免疫反應之能力，實施組織切片培養。在獲得新鮮腫瘤組織試樣(小於24hr)後，儘可能多地使用剪刀及解剖刀自腫瘤試樣去除環繞脂肪、纖維區域及壞死區域。使用4%瓊脂糖將組織包埋於組織模具中心。在固化之後，移除瓊脂糖區塊，且將模具膠黏至Leica VT1000 S切片機組織固持件上且使用Leica VT1000 S切片機切片成300微米至400微米切片。將組織切片轉移至細胞培養插件中且然後轉移至6孔細胞培養板中含有培養基(DMEM，含有L-麩醯胺酸、4.5g/L葡萄糖及丙酮酸鈉(Fisher Scientific)、Gibco™ GlutaMAX™ Supplement (Fisher Scientific)、Gibco™ MEM非必需胺基酸溶液(Fisher Scientific)、2-巰基乙醇(55mM) (Fisher Scientific)、來自人類男性AB血漿之熱滅活物(Sigma-Aldrich, Inc)、熱滅活胎牛血清(BioFluid Technologies)、100× pen/strep及人類M-CSF (BioLegend))及指示抗體之孔中。所有抗體皆係以10 ug/mL之濃度添加。然後將切片在37℃及5% CO2 下培育1-5天。在研究結束時，藉由分析分泌至培養上清液中之細胞介素/趨化介素之量(使用Invitrogen™ Luminex™ Cytokine Human Magnetic 25-Plex Panel根據製造商說明書所量測)來評估效能。若腫瘤組織試樣不適於使用Leica VT1000 S切片機切片，則使用解剖刀儘可能薄地將其切割且隨後如上文所闡述來處理切片。對於所有試樣而言，在處理之前獲取切片且用於免疫表現型分型。如上所述來解離此切片且染色以用於如上文所闡述之流式細胞術分析。
圖8顯示所選抗體在多個腫瘤類型及供體中之功能。在此圖中，組合每一治療中來自6個不同腫瘤(包含腎、肺及GI腫瘤)之結果。促發炎反應之誘導較為一致及顯著，由此顯示較寬之功能及應用性。該等不同腫瘤係由高度浸潤性實例及最小浸潤性腫瘤構成，如圖10A-C中所顯示。該等結果進一步證實，針對經驗證靶之抗體可誘導腫瘤微環境內之強力促發炎及很可能抗腫瘤免疫反應。此效應可等於或大於派姆單抗(KEYTRUDA®)，包含在具有極低或不存在T細胞浸潤物之腫瘤中之情形。
圖9A-9C展示源自經抗體以及上述經驗證siRNA處理之3個單獨腫瘤類型之細胞介素產生。在所有3個獨立試樣中，使用抗體或siRNA調節經驗證巨噬細胞相關靶可誘導促發炎免疫反應(包含骨髓樣及淋巴樣特異性反應)。
圖9A及9B亦顯示關於PD1阻斷之兩種不同反應。肺腫瘤分析(圖9A)展示派姆單抗(KEYTRUDA®)之反應，其中產生預期細胞介素(例如IFNg及TNFα)。此腫瘤中之靶之所選抗體誘發等於或大於派姆單抗(KEYTRUDA®)處理之反應。圖9B中所展示之GI腫瘤結果並不提供由派姆單抗(KEYTRUDA®)誘發之反應。重要的是，此腫瘤之免疫表現型分型展示顯著群體之PD1+ CD8 T細胞(圖10A)，此係PD-1反應之必要但不充分之特徵。在此腫瘤中，所展示抗體仍能夠誘發來自骨髓樣細胞(如藉由CCL3、CCL4及GM-CSF之產生所證實)及T細胞(如藉由IFNg之產生所證實)之反應。
因此，提供至少下列代表性實例：a)在T細胞浸潤性腫瘤中，經驗證巨噬細胞相關靶(VTx)單一療法或組合療法所產生之T細胞及巨噬細胞活化強於派姆單抗(KEYTRUDA®)；b)在T細胞浸潤性腫瘤中，VTx單一療法或組合可活化T細胞及巨噬細胞，而派姆單抗(KEYTRUDA®)則不能；c)在具有零/極差T細胞浸潤之腫瘤中，VTx單一療法或組合可引起腫瘤微環境中之寬發炎變化；且明確達成與免疫檢查點抑制之加和性及潛在協同性。
不受限於理論，據信，受其發炎狀態影響之巨噬細胞調節免疫反應，此乃因其存在並不像其他免疫細胞一樣限於抗原特異性相互作用。因此，在所有該等免疫浸潤程度中誘發免疫反應之能力證實了在腫瘤類型及免疫狀態中之寬適用性。所有人類癌症的約四分之一被視為免疫沙漠，而其餘者則由免疫細胞浸潤。儘管僅少數該等腫瘤藉由T細胞具有完全免疫監督，但其皆由監督(促發炎)及腫瘤支持(促腫瘤生成)巨噬細胞顯著浸潤。圖11展示人類癌症之大型公開資料組(TCGA, The Cancer Genome Atlas, 2017版，由OmicSoft/Qiagen處理及分配)之癌症類型中之巨噬細胞浸潤性腫瘤的分佈。藉由高於截止值之規範骨髓樣標記物CD11b之存在來量測腫瘤浸潤。截止值定義為資料組中所有原發性腫瘤中之CD11b mRNA表現分佈之第一四分位值。據信，該等巨噬細胞浸潤性腫瘤尤其可用於根據本文所闡述之組合物及方法來調節。
生物寄存 由Verseau Therapeutics, Inc在2019年6月4日及2019年6月20日將本發明之代表性材料寄存於美國模式培養物保藏所(ATCC)中。特定而言，將以具有下列名稱：「13H10」 (PTA-125944)、「13J19」 (PTA-125945)、「18F02」 (PTA-125946)及「19I01」 (PTA-125943)之個別寄存物寄存且具有表9及實例中所展示之鑑別特性之單株抗體在2019年6月4日由Verseau Therapeutics, Inc.在國際承認用於專利程序之微生物寄存布達佩斯條約(Budapest Treaty on International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)及其細則(布達佩斯條約)之規定下寄存於ATCC中。類似地，將以具有下列名稱：「1F01」 (PTA-126025)、「3C01」 (PTA-126026)、「10M15」 (PTA-126027)、「4H23」 (PTA-126028)、「7A12」 (PTA-126029)及「7F19」 (PTA-126030)之個別寄存物寄存且具有表9及實例中所展示之鑑別特性之單株抗體在2019年6月20日由Verseau Therapeutics, Inc.在國際承認用於專利程序之微生物寄存布達佩斯條約及其細則(布達佩斯條約)之規定下寄存於ATCC中。此確保自寄存之日開始維持有效寄存30年。該寄存物可根據布達佩斯條約之條款自ATCC獲得，且受限於Verseau Therapeutics, Inc.與ATCC之間的協議，該協議確保在相關美國專利頒佈時或在任何美國或外國專利申請案向公眾公開時(以先發生者為準)，該寄存物可永久且不受限制地供公眾使用，且確保由美國專利及商標事務專員(U.S. Commissioner of Patents and Trademarks)根據35 U.S.C.第122節及依照其之事務專員規則(包括37 C.F.R.第1.14節，特別參照886 OG 638)確定有權獲得者對寄存物之可獲得性。
本申請案之受讓人已同意，若寄存物丟失或被破壞，則應在通知後立即用另一相同材料替換材料。所寄存材料之可獲得性不應解釋為在違反任何政府當局根據其專利法所授予權利之情形下實踐本發明之許可。
以引用方式之併入 本文所提及之所有出版物、專利及專利申請案之全部內容皆以引用方式併入本文中，如同將每一個別出版物、專利及專利申請案特定且個別地指示以引用方式併入本文中一般。倘若出現衝突，則以本申請案(包含其中之任何定義)為準。
亦以引用方式引入任何多核苷酸及多肽序列之全部內容，其可參照與公共資料庫中之條目相關之登錄號，例如由全球資訊網上之基因組研究所(The Institute for Genomic Research，TIGR)及/或全球資訊網上之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)所維護者。
等效內容及範圍 本發明所涵蓋之一或多個實施例之細節陳述於上述說明中。儘管上文已闡述較佳之材料及方法，但任何類似或等效於本文所闡述者之材料及方法可用於實踐或測試本發明所涵蓋之實施例。與本發明相關之其他特徵、目標及優點自該說明顯而易見。除非另外定義，否則本文所用之全部技術及科學術語皆具有與本發明熟習此項技術者通常所理解相同之含義。在衝突之情形下，以上文所提供之本發明說明為準。
熟習此項技術者僅使用常規實驗將認識到或能確定本文所闡述本發明所涵蓋之具體實施例之許多等效形式。本發明範圍並不意欲限於本文所提供之說明且該等等效形式意欲由隨附申請專利範圍涵蓋。
除非指示相反情形或另外自上下文顯而易見，否則本文所用之冠詞「一個(a及an)」係指該冠詞之文法受詞之一個或一個以上(亦即係指至少一個)。舉例而言，「一個元件」意指一個元件或一個以上元件。除非指示相反情形或另外自上下文顯而易見，否則若一個、一個以上或所有群組成員存在、採用或另外相關於給定產物或製程中，則在一或多個群組成員之間包含「或」之主張或說明即足矣。本發明包含恰好一個群組成員存在、採用或另外相關於給定產物或製程中之實施例。本發明亦包含一個以上或全部群組成員存在、採用或另外相關於給定產物或製程中之實施例。
亦注意，術語「包括」意欲為開放性且允許但未必納入其他要素或步驟。在術語「包括」用於本文中時，由此亦涵蓋且揭示術語「由……組成」。
在給出範圍之情形下，包含端點。另外，應理解，除非另外指示或另外自上下文及熟習此項技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明所涵蓋之不同實施例中假設表示所陳述範圍內之任一具體值或子範圍，直至該範圍之下限單位之十分之一，除非上下文另外明確指示。
另外，應理解，本發明中在先前技術內之任一特定實施例可自任一或多個技術方案明確排除。因該等實施例視為為熟習此項技術者所已知，故其可排除，即使該排除未明確陳述於本文中。本發明所涵蓋組合物之任一特定實施例(例如任一抗生素、治療或活性成分；任一產生方法；任一使用方法；等等)可出於任一原因自任一或多個技術方案排除，不論是否與先前技術之存在相關。
應理解，所用詞語係闡述性而非限制性之詞語，且可在隨附申請專利範圍之範圍內作出變化，此並不在較廣泛態樣中背離本發明所涵蓋之真實範圍及精神。
儘管已針對若干所闡述實施例以一定篇幅且使用一定特定性闡述了本發明，但其不應意欲限於任何該等特定情形或實施例或任一特定實施例，但應參照隨附申請專利範圍來予以解釋以鑒於先前技術提供該等申請專利範圍之最廣泛可能詮釋且由此有效地涵蓋本發明之預期範圍。
本專利或申請案檔案含有至少一個有色圖式。在要求並支付必要費用之後專利事務局可提供本專利或專利申請公開案帶彩圖之複本。圖 1A - 圖 1C 展示驅動至不同分化狀態之巨噬細胞之表型及形態。圖1A展示在巨噬細胞分化之後經典M2生物標記物之表現。圖1B展示在巨噬細胞分化之後新M2生物標記物之表現。圖1C展示M1-及M2c-經分化巨噬細胞之形態影像。圖 2A - 圖 2Y 展示針對個別巨噬細胞相關靶之siRNA之IC50曲線。圖 3A - 圖 3E 展示在敲低原代人類巨噬細胞中之巨噬細胞相關靶之後表面表型及形態之表徵。該等圖展示siRNA調介之靶敲低對靶mRNA敲低(圖3A)、細胞表面靶表現(圖3B)、經典巨噬細胞表型標記物(圖3C)、新巨噬細胞表型標記物(圖3D)及巨噬細胞形態(圖3E)之效應。圖 4A - 圖 4G 展示在抑制原代人類巨噬細胞中之巨噬細胞相關靶之後經調節巨噬細胞表型及功能之表徵。該等圖展示抗體調介之靶抑制對於以下各項之效應：在M2-傾斜條件存在下降低經典M2標記物(圖4A)；在M2-傾斜條件存在下降低新M2標記物(圖4B)；在M2-傾斜條件存在下增加M1促發炎細胞介素(圖4C)；在添加於M2-傾斜條件之後時以劑量依賴性方式降低經典M2標記物(圖4D)；在添加於M2-傾斜條件之後時以劑量依賴性方式降低新M2標記物(圖4E)；及在添加於M2-傾斜條件之後時增加M1促發炎細胞介素產生(圖4F及4G)。圖 5A - 圖 5C 展示葡萄球菌(Staphylococcal )腸毒素B (SEB)分析實驗之結果。圖5A展示在4天之後CD3+ T細胞之細胞內細胞介素染色之結果。圖5B及5C展示在4天之後細胞介素產生之結果。圖 6A - 圖 6B 展示單因子混合淋巴球反應(MLR)分析之實驗結果。圖6A展示CD8+ T細胞之細胞內染色之結果。數據展示為相對於同型對照之倍數變化。圖6B展示細胞介素產生之結果。數據展示為相對於同型對照之倍數變化。圖 7A - 圖 7B 展示來自各種癌症類型之腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)上之巨噬細胞相關性靶表現之流式細胞術分析的結果。圖 8A - 圖 8D 展示來自解離腫瘤試樣及腫瘤切片試樣之細胞介素產生，該等試樣代表6種經個別抗體或抗體組合治療之不同腫瘤類型。圖 9A - 圖 9C 展示腫瘤切片培養物之結果。術語展示為肺腫瘤切片(圖9A)、GI腫瘤切片(圖9B)及腎腫瘤切片(圖9C)培養物相對於同型背景(作為對照)之倍數變化。圖 10A - 圖 10C 展示免疫組合物之腫瘤內分析之結果。展示GI腫瘤(圖10A)、腎腫瘤(圖10B)及經抗體處理之腫瘤切片之CD45+及CD3+組合物(圖10C)之數據。圖 11 展示含有指示TAM浸潤之巨噬細胞(CD11b)印記之腫瘤之百分比。 對於任一展示條形直方圖、曲線或與圖例有關之其他數據之圖而言，每一指示自左至右所呈現之條、曲線或其他數據直接且依序對應於圖例中自上至下之盒。
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Claims (164)

  1. 一種生成在與至少一種藥劑接觸之後具有增加之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括使單核球及/或巨噬細胞與有效量之該至少一種藥劑接觸，其中該至少一種藥劑係a)下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑及/或b)上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
  2. 如請求項1之方法，其中該等具有增加之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與該一或多種藥劑接觸後展現下列性質中之一或多者： a) 分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之表現及/或分泌增加； b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1、TGFb及/或IL-10之表現及/或分泌降低； c) 至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18、GM-CSF、CCL3、CCL4及IL-23組成之群之細胞介素或趨化介素之分泌增加； d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之比率增加； e) CD8+細胞毒性T細胞活化增加； f) CD8+細胞毒性T細胞活化之募集增加； g) CD4+輔助性T細胞活性增加； h) CD4+輔助性T細胞活性之募集增加； i) NK細胞活性增加； j) NK細胞之募集增加； k) 嗜中性球活性增加； l) 巨噬細胞活性增加；及/或 m) 紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量增加，如藉由顯微術所評價。
  3. 如請求項1或2之方法，其中與該一或多種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑使該細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量增加，及/或使2型及/或M2巨噬細胞之數量降低。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中與該一或多種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該一或多種藥劑使i)對ii)之比率增加，其中i)係該細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。
  5. 一種生成在與至少一種藥劑接觸後具有降低之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括使單核球及/或巨噬細胞與有效量之該至少一種藥劑接觸，其中該藥劑係a)上調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑及/或b)下調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
  6. 如請求項5之方法，其中該等具有降低之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與該一或多種藥劑接觸後展現下列性質中之一或多者： a) 分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之表現及/或分泌降低； b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之表現及/或分泌增加； c) 至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之分泌降低； d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之比率降低； e) CD8+細胞毒性T細胞活化降低； f) CD4+輔助性T細胞活性降低； g) NK細胞活性降低； h) 促發炎嗜中性球活性降低； i) 巨噬細胞活性降低；及/或 j) 紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量降低，如藉由顯微術所評價。
  7. 如請求項5或6之方法，其中與該一或多種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑使該細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量降低，及/或使2型及/或M2巨噬細胞之數量增加。
  8. 如請求項5至7中任一項之方法，其中與該一或多種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該一或多種藥劑使i)對ii)之比率降低，其中i)係該細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該一或多種下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係小分子抑制劑、CRISPR嚮導RNA (gRNA)、RNA干擾劑、反義寡核苷酸、單鏈核酸、雙鏈核酸、適配體、核酶、DNA酶、肽、肽模擬物、抗體、細胞內抗體或細胞。
  10. 如請求項9之方法，其中該RNA干擾劑係小干擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)或piwi-相互作用RNA (piRNA)。
  11. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該一或多種下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑包括特異性結合至表1及/或表2中所列示之該至少一種靶的抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段。
  12. 如請求項11之方法，其中該抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段係駱駝科、鼠類、嵌合、人類化、人類、經可檢測標記的，包括效應結構域，包括Fc結構域，及/或係選自由以下組成之群：Fv、Fav、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及二價抗體片段。
  13. 如請求項11或12之方法，其中該抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞毒性劑。
  14. 如請求項13之方法，其中該細胞毒性劑係選自由以下組成之群：化學治療劑、生物藥劑、毒素及放射性同位素。
  15. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該一或多種上調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係編碼表1及/或表2中所列示該一或多種靶之核酸分子或其片段、表1及/或表2中所列示該一或多種靶之多肽或其片段、結合至表1及/或表2中所列示該一或多種靶之活化抗體及/或細胞內抗體或結合至表1及/或表2中所列示該一或多種靶之小分子。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該等巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中該等細胞及/或巨噬細胞表現該靶。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中在活體外或離體接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  18. 如請求項17之方法，其中該等單核球及/或巨噬細胞係原代單核球及/或原代巨噬細胞。
  19. 如請求項17或18之方法，其中在與該一或多種藥劑接觸之前純化及/或培養該等單核球及/或巨噬細胞。
  20. 如請求項1至16中任一項之方法，其中在活體內接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  21. 如請求項20之方法，其中在活體內藉由全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與該藥劑來接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  22. 如請求項20或21之方法，其中在組織微環境中接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其進一步包括使該等單核球及/或巨噬細胞與至少一種調節該發炎表型之免疫治療劑接觸，視情況其中該免疫治療劑包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。
  24. 一種組合物，其包括i)根據如請求項1至23中任一項之方法所生成之單核球及/或巨噬細胞；及/或ii)下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之量及/或活性之siRNA。
  25. 一種使個體中單核球及/或巨噬細胞之發炎表型在與至少一種藥劑接觸後增加之方法，其包括向該個體投與有效量之該至少一種藥劑，其中該至少一種藥劑係a)下調該等單核球及/或巨噬細胞中或其上之表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑；及/或b)上調該等單核球及/或巨噬細胞中或其上之表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
  26. 如請求項25之方法，其中該等具有增加之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與該一或多種藥劑接觸後展現下列性質中之一或多者： a) 分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之表現及/或分泌增加； b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之表現及/或分泌降低； c) 至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之分泌增加； d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之比率增加； e) CD8+細胞毒性T細胞活化增加； f) CD4+輔助性T細胞活性增加； g) NK細胞活性增加； h) 嗜中性球活性增加； i) 巨噬細胞活性增加；及/或 j) 紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量增加，如藉由顯微術所評價。
  27. 如請求項25或26之方法，其中該一或多種藥劑使該個體中1型及/或M1巨噬細胞之數量增加，使2型及/或M2巨噬細胞之數量降低，及/或使i)對ii)之比率增加，其中i)係1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中在投與該一或多種藥劑之後該個體中之細胞毒性CD8+ T細胞之數量及/或活性有所增加。
  29. 一種使個體中單核球及/或巨噬細胞之發炎表型在與至少一種藥劑接觸後降低之方法，其包括向該個體投與有效量之該至少一種藥劑，其中該至少一種藥劑係a)上調該等單核球及/或巨噬細胞中或其上之表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑；及/或b)下調該等單核球及/或巨噬細胞中或其上之表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
  30. 如請求項29之方法，其中該等具有降低之發炎表型之單核球及/或巨噬細胞在與該一或多種藥劑接觸後展現下列性質中之一或多者： a) 分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之表現及/或分泌降低； b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之表現及/或分泌增加； c) 至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之分泌降低； d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之比率降低； e) CD8+細胞毒性T細胞活化降低； f) CD4+輔助性T細胞活性降低； g) NK細胞活性降低； h) 嗜中性球活性降低； i) 巨噬細胞活性降低；及/或 j) 紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量降低，如藉由顯微術所評價。
  31. 如請求項29或30之方法，其中該一或多種藥劑使該個體中1型及/或M1巨噬細胞之數量降低，使2型及/或M2巨噬細胞之數量增加，及/或使i)對ii)之比率降低，其中i)係1型及/或M1巨噬細胞且ii)係2型及/或M2巨噬細胞。
  32. 如請求項29至31中任一項之方法，其中在投與該藥劑之後該個體中之細胞毒性CD8+ T細胞之數量及/或活性有所降低。
  33. 如請求項25至32中任一項之方法，其中該下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係小分子抑制劑、CRISPR嚮導RNA (gRNA)、RNA干擾劑、反義寡核苷酸、肽或肽模擬物抑制劑、適配體、抗體、細胞內抗體或細胞。
  34. 如請求項33之方法，其中該RNA干擾劑係小干擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)或piwi-相互作用RNA (piRNA)。
  35. 如請求項25至32中任一項之方法，其中該下調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑包括特異性結合至表1及/或表2中所列示之該至少一種靶的抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段。
  36. 如請求項35之方法，其中該抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段係駱駝科、鼠類、嵌合、人類化、人類、經可檢測標記的，包括效應結構域，包括Fc結構域，及/或係選自由以下組成之群：Fv、Fav、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及二價抗體片段。
  37. 如請求項35或36之方法，其中該抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞毒性劑。
  38. 如請求項37之方法，其中該細胞毒性劑係選自由以下組成之群：化學治療劑、生物藥劑、毒素及放射性同位素。
  39. 如請求項25至32中任一項之方法，其中該上調表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑係編碼表1及/或表2中所列示該一或多種靶之核酸分子或其片段、表1及/或表2中所列示該一或多種靶之多肽或其片段、結合至表1及/或表2中所列示該一或多種靶之活化抗體及/或細胞內抗體或結合至表1及/或表2中所列示該一或多種靶之小分子。
  40. 如請求項25至39中任一項之方法，其中該等巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中該等細胞及/或巨噬細胞表現該靶。
  41. 如請求項40之方法，其中在活體內藉由全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與該藥劑來投與該一或多種藥劑。
  42. 如請求項40或41之方法，其中該一或多種藥劑在組織微環境中接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  43. 如請求項25至42中任一項之方法，其進一步包括使該等單核球及/或巨噬細胞與至少一種調節該發炎表型之免疫治療劑接觸，視情況其中該免疫治療劑包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。
  44. 一種增加個體之發炎之方法，其包括向該個體投與有效量之a)與至少一種下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸的單核球及/或巨噬細胞；及/或b)與至少一種上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸的單核球及/或巨噬細胞。
  45. 如請求項44之方法，其中該等巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中該等細胞及/或巨噬細胞表現該靶。
  46. 如請求項44或45之方法，其中該等單核球及/或巨噬細胞相對於該個體之單核球及/或巨噬細胞係經基因改造、自體、同基因或同種異體的。
  47. 如請求項44至46中任一項之方法，其中與a)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞不同於與b)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞。
  48. 如請求項44至46中任一項之方法，其中與a)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞跟與b)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞相同。
  49. 如請求項44至48中任一項之方法，其中全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與該一或多種藥劑。
  50. 一種降低個體之發炎之方法，其包括向該個體投與有效量之a)與至少一種上調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸的單核球及/或巨噬細胞；及/或b)與至少一種下調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸的單核球及/或巨噬細胞。
  51. 如請求項50之方法，其中該等巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中該等細胞及/或巨噬細胞表現該靶。
  52. 如請求項50或51之方法，其中該等單核球及/或巨噬細胞相對於該個體之單核球及/或巨噬細胞係經基因改造、自體、同基因或同種異體的。
  53. 如請求項50至52中任一項之方法，其中與a)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞不同於與b)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞。
  54. 如請求項50至52中任一項之方法，其中與a)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞跟與b)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞相同。
  55. 如請求項50至54中任一項之方法，其中全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與該一或多種藥劑。
  56. 一種使個體中之癌細胞對細胞毒性CD8+ T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之方法，其包括向該個體投與治療有效量之a)至少一種下調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑，及/或b)至少一種上調單核球及/或巨噬細胞中或其上之表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
  57. 如請求項56之方法，其包括投與至少一種下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
  58. 如請求項57之方法，其中該藥劑係小分子抑制劑、CRISPR嚮導RNA (gRNA)、RNA干擾劑、反義寡核苷酸、肽或肽模擬物抑制劑、適配體、抗體、細胞內抗體或細胞。
  59. 如請求項58之方法，其中該RNA干擾劑係小干擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA)或piwi-相互作用RNA (piRNA)。
  60. 如請求項58之方法，其中該藥劑包括特異性結合至表1中所列示之該至少一種靶之抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段。
  61. 如請求項60之方法，其中該抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段係駱駝科、鼠類、嵌合、人類化、人類、經可檢測標記的，包括效應結構域，包括Fc結構域，及/或係選自由以下組成之群：Fv、Fav、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及二價抗體片段。
  62. 如請求項60或61之方法，其中該抗體及/或細胞內抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞毒性劑。
  63. 如請求項62之方法，其中該細胞毒性劑係選自由以下組成之群：化學治療劑、生物藥劑、毒素及放射性同位素。
  64. 如請求項56之方法，其包括投與至少一種上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑。
  65. 如請求項64之方法，其中該藥劑係編碼表2中所列示該一或多種靶之核酸分子或其片段、表2中所列示該一或多種靶之多肽或其片段、結合至表2中所列示該一或多種靶之活化抗體及/或細胞內抗體或結合至表2中所列示該一或多種靶之小分子。
  66. 一種使患有癌症之個體中之癌細胞對細胞毒性CD8+ T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之方法，其包括向該個體投與治療有效量之a)與至少一種下調表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸之單核球細胞及/或巨噬細胞；及/或b)與至少一種上調表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸之單核球細胞及/或巨噬細胞。
  67. 如請求項66之方法，其中該等巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中該等細胞及/或巨噬細胞表現該靶。
  68. 如請求項66或67之方法，其中該等單核球及/或巨噬細胞相對於該個體之單核球及/或巨噬細胞係經基因改造、自體、同基因或同種異體的。
  69. 如請求項66至68中任一項之方法，其中與a)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞不同於與b)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞。
  70. 如請求項66至68中任一項之方法，其中與a)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞跟與b)之該至少一種藥劑接觸之該等單核球及/或巨噬細胞相同。
  71. 如請求項56至70中任一項之方法，其中全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與該一或多種藥劑。
  72. 如請求項56至71中任一項之方法，其進一步包括藉由向該個體投與至少一種免疫療法來治療該個體之癌症，視情況其中該免疫療法包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。
  73. 如請求項72之方法，其中該免疫檢查點係選自由以下組成之群：PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4。
  74. 如請求項73之方法，其中該免疫檢查點係PD-1。
  75. 如請求項56至74中任一項之方法，其中該一或多種藥劑使該癌症中之增殖性細胞之數量減小及/或使包括該等癌細胞之腫瘤之體積或大小減小。
  76. 如請求項56至75中任一項之方法，其中該一或多種藥劑使浸潤包括該等癌細胞之腫瘤之CD8+ T細胞之量及/或活性增加。
  77. 如請求項56至76中任一項之方法，其中該一或多種藥劑使a)浸潤包括該等癌細胞之腫瘤之M1巨噬細胞之量及/或活性增加，及/或使b)浸潤包括該等癌細胞之腫瘤之M2巨噬細胞之量及/或活性降低。
  78. 如請求項56至77中任一項之方法，其進一步包括向該個體投與至少一種用於治療該癌症之其他療法或方案。
  79. 如請求項51至63中任一項之方法，其中該療法係在該藥劑之前、同時或之後投與。
  80. 一種鑑別可藉由調節至少一種靶來增加其發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括： a) 測定來自該等單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； b) 測定對照中該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；及 c) 比較在步驟a)及b)中檢測之該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； 其中相對於該至少一種靶之對照拷貝數、量及/或活性，在該等單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低指示，該等單核球及/或巨噬細胞可藉由調節該至少一種靶來增加其發炎表型。
  81. 如請求項80之方法，其進一步包括使該等細胞與調節表1及/或表2中所列示該至少一種靶之藥劑接觸、推薦、開具或投與該藥劑。
  82. 如請求項80之方法，其進一步包括若經測定該個體未受益於藉由調節該一或多種靶來增加發炎表型，則使該等細胞與除調節表1及/或表2中所列示該一或多種靶之藥劑外之癌症療法接觸，推薦、開具或投與該癌症療法。
  83. 如請求項81或82之方法，其進一步包括使該等細胞與至少一種增加免疫反應之其他藥劑接觸及/或投與該其他藥劑。
  84. 如請求項83之方法，其中該其他藥劑係選自由以下組成之群：靶向療法、化學療法、輻射療法及/或激素療法。
  85. 如請求項80至84中任一項之方法，其中該對照係來自該個體所屬相同物種之成員。
  86. 如請求項80至85中任一項之方法，其中該對照係包括細胞之試樣。
  87. 如請求項80至86中任一項之方法，其中該個體患有癌症。
  88. 如請求項80至87中任一項之方法，其中該對照係來自該個體之癌症試樣。
  89. 如請求項80至87中任一項之方法，其中該對照係來自該個體之非癌症試樣。
  90. 一種鑑別可藉由調節至少一種靶來降低其發炎表型之單核球及/或巨噬細胞之方法，其包括： a) 測定來自該等單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； b) 測定對照中該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；及 c) 比較在步驟a)及b)中檢測之該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； 其中相對於該至少一種靶之對照拷貝數、量及/或活性，在該等單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加指示，該等單核球及/或巨噬細胞可藉由調節該至少一種靶來降低其發炎表型。
  91. 如請求項90之方法，其進一步包括使該等單核球及/或巨噬細胞與一或多種調節表1及/或表2中所列示該一或多種靶之藥劑接觸，推薦、開具或投與該藥劑。
  92. 如請求項91之方法，其進一步包括若經測定該個體未受益於藉由調節該至少一種靶來降低發炎表型，則使該等單核球及/或巨噬細胞與除該一或多種調節表1及/或表2中所列示該一或多種靶之藥劑外之癌症療法接觸，推薦、開具或投與該癌症療法。
  93. 如請求項91或92之方法，其進一步包括使該等單核球及/或巨噬細胞與至少一種降低免疫反應之其他藥劑接觸及/或投與該其他藥劑。
  94. 如請求項90至93中任一項之方法，其中該對照係來自該個體所屬相同物種之成員。
  95. 如請求項90至94中任一項之方法，其中該對照係包括細胞之試樣。
  96. 如請求項90至95中任一項之方法，其中該個體患有癌症。
  97. 如請求項90至96中任一項之方法，其中該對照係來自該個體之癌症試樣。
  98. 如請求項90至96中任一項之方法，其中該對照係來自該個體之非癌症試樣。
  99. 一種預測患有癌症之個體之臨床結果之方法，該方法包括： a) 測定來自該個體中單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； b) 測定來自具有較差臨床結果之對照之該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性；及 c) 比較該個體試樣及來自該對照個體之試樣中該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； 其中與該對照中之拷貝數、量及/或活性相比，來自該個體中該等單核球及/或巨噬細胞之表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低指示，該個體不具有較差臨床結果。
  100. 一種監測個體中之單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之方法，該方法包括： a) 檢測第一個體試樣中在第一時間點來自該個體中該等單核球及/或巨噬細胞之表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； b) 使用包括在後續時間點獲得之單核球及/或巨噬細胞之後續試樣重複步驟a)；及 c) 比較步驟a)及b)中所檢測之表1及/或表2中所列示至少一種靶之量或活性， 其中與來自該第一試樣之該等單核球及/或巨噬細胞之拷貝數、量及/或活性相比，來自該後續試樣之該等單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加指示，該個體之單核球及/或巨噬細胞具有上調之發炎表型；或 其中與來自該第一試樣之該等單核球及/或巨噬細胞之拷貝數、量及/或活性相比，來自該後續試樣之該等單核球及/或巨噬細胞中表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低指示，該個體之單核球及/或巨噬細胞具有下調之發炎表型。
  101. 如請求項100之方法，其中該第一試樣及/或至少一個後續試樣包括在活體外培養之單核球及/或巨噬細胞。
  102. 如請求項100之方法，其中該第一試樣及/或至少一個後續試樣包括未在活體外培養之單核球及/或巨噬細胞。
  103. 如請求項100至102中任一項之方法，其中該第一試樣及/或至少一個後續試樣係自該個體獲得之單一試樣或合併試樣之一部分。
  104. 如請求項100至103中任一項之方法，其中該試樣包括自該個體獲得之血液、血清、腫瘤周圍組織及/或腫瘤內組織。
  105. 一種評價藥劑用於增加個體中之單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之效能之方法，其包括： a) 在第一時間點檢測包括單核球及/或巨噬細胞之個體試樣中之i)該等單核球及/或巨噬細胞中或其上表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)該等單核球及/或巨噬細胞的發炎表型； b) 在該等單核球及/或巨噬細胞與該藥劑接觸之後之至少一個後續時間點期間重複步驟a)；及 c) 比較步驟a)及b)中所檢測之i)及/或ii)之值，其中與在該第一時間點該試樣中之拷貝數、量及/或活性相比，該後續試樣中表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或ii)的增加指示，該藥劑使該個體中之單核球及/或巨噬細胞之該發炎表型增加。
  106. 如請求項105之方法，其中該等與該藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑使該細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量增加。
  107. 如請求項105或106之方法，其中該等與該藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑使該細胞群體中之2型及/或M2巨噬細胞之數量降低。
  108. 一種評價藥劑用於降低單核球及/或巨噬細胞之發炎表型之效能之方法，其包括： a) 在第一時間點檢測包括單核球及/或巨噬細胞之個體試樣中之i)該等單核球及/或巨噬細胞中或其上表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)該等單核球及/或巨噬細胞的發炎表型； b) 在該等單核球及/或巨噬細胞與該藥劑接觸之後之至少一個後續時間點期間重複步驟a)；及 c) 比較步驟a)及b)中所檢測之i)及/或ii)之值，其中與在該第一時間點該試樣中之拷貝數、量及/或活性相比，該後續試樣中表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或ii)的降低指示，該藥劑使該個體中之單核球及/或巨噬細胞之該發炎表型降低。
  109. 如請求項108之方法，其中該等與該藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑選擇性降低該細胞群體中之1型及/或M1巨噬細胞之數量。
  110. 如請求項108或109之方法，其中該等與該藥劑接觸之單核球及/或巨噬細胞包括於細胞群體內且該藥劑選擇性增加該細胞群體中之2型及/或M2巨噬細胞之數量。
  111. 如請求項105至110中任一項之方法，其中在活體外或離體接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  112. 如請求項111之方法，其中該等單核球及/或巨噬細胞係原代單核球及/或原代巨噬細胞。
  113. 如請求項111或112之方法，其中在與該藥劑接觸之前純化及/或培養該等單核球及/或巨噬細胞。
  114. 如請求項105至110中任一項之方法，其中在活體內接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  115. 如請求項114之方法，其中在活體內藉由全身性、經腫瘤周圍或經腫瘤內投與該藥劑來接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  116. 如請求項114或115之方法，其中在組織微環境中接觸該等單核球及/或巨噬細胞。
  117. 如請求項105至116中任一項之方法，其進一步包括使該等單核球及/或巨噬細胞與至少一種調節該發炎表型之免疫治療劑接觸，視情況其中該免疫治療劑包括免疫檢查點抑制劑、免疫刺激性激動劑、發炎劑、細胞、癌症疫苗及/或病毒。
  118. 如請求項105至117中任一項之方法，其中該個體係哺乳動物。
  119. 如請求項118之方法，其中該哺乳動物係非人類動物模型或人類。
  120. 一種評價藥劑用於治療個體之癌症之效能的方法，其包括： a) 在第一時間點檢測包括單核球及/或巨噬細胞之個體試樣中之i)單核球及/或巨噬細胞中或其上表1及/或表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)該等單核球及/或巨噬細胞的發炎表型； b) 在投與該藥劑之後之至少一個後續時間點期間重複步驟a)；及 c) 比較步驟a)及b)中所檢測之i)及/或ii)之值，其中與在該第一時間點該個體試樣之該等單核球及/或巨噬細胞中或其上之拷貝數、量及/或活性相比，在該後續時間點該個體試樣之該等單核球及/或巨噬細胞中或其上表1中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之不存在或降低及/或表2中所列示該至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之存在或增加及/或ii)的增加指示，該藥劑治療該個體之癌症。
  121. 如請求項120之方法，其中在該第一時間點與該後續時間點之間，該個體已接受癌症治療，完成治療及/或癌症有所緩解。
  122. 如請求項120或121之方法，其中該第一試樣及/或至少一個後續試樣係選自由離體試樣及活體內試樣組成之群。
  123. 如請求項120至122中任一項之方法，其中該第一試樣及/或該至少一個後續試樣係自非人類動物癌症模型獲得。
  124. 如請求項120至123中任一項之方法，其中該第一試樣及/或該至少一個後續試樣係自該個體獲得之單一試樣或合併試樣之一部分。
  125. 如請求項120至124中任一項之方法，其中該試樣包括自該個體獲得之細胞、血清、腫瘤周圍組織及/或腫瘤內組織。
  126. 一種用於篩選使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑之方法，其包括 a) 使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在單核球及/或巨噬細胞存在下接觸，該等單核球及/或巨噬細胞已與i)至少一種降低表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑及/或ii)至少一種增加表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性之藥劑接觸； b) 使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在未與該至少一種藥劑或多種藥劑接觸之對照單核球及/或巨噬細胞存在下接觸；及 c) 藉由鑑別與b)相比在a)中使細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法效能增加之藥劑來鑑別使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑。
  127. 一種用於篩選使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑之方法，其包括 a) 使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在單核球及/或巨噬細胞存在下接觸，該等單核球及/或巨噬細胞已經改造以降低表1中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性及/或ii)已經改造以增加表2中所列示至少一種靶之拷貝數、量及/或活性； b) 使癌細胞與細胞毒性T細胞及/或免疫檢查點療法在對照單核球及/或巨噬細胞存在下接觸；及 c) 藉由鑑別與b)相比在a)中使細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法效能增加之藥劑來鑑別使癌細胞對細胞毒性T細胞介導之殺死及/或免疫檢查點療法敏感之藥劑。
  128. 如請求項126或127之方法，其中在活體內、離體或在活體外發生該接觸步驟。
  129. 如請求項120至128中任一項之方法，其進一步包括測定i)該癌症中之增殖性細胞數量之減小及/或ii)包括該等癌細胞之腫瘤之體積或大小的減小。
  130. 如請求項120至129中任一項之方法，其進一步包括測定i) CD8+ T細胞之數量之增加及/或ii)浸潤包括該等癌細胞之腫瘤中1型及/或M1巨噬細胞之數量之增加。
  131. 如請求項120至130中任一項之方法，其進一步包括測定對調節表1及/或表2中所列示該至少一種靶之該藥劑之反應性，該反應性係藉由至少一種選自由以下組成之群之準則量測：臨床受益率、存活直至死亡、病理完全反應、病理反應之半定量量測、臨床完全緩解、臨床部分緩解、臨床穩定疾病、無復發存活、無轉移存活、無疾病存活、循環腫瘤細胞降低、循環標記物反應及RECIST準則。
  132. 如請求項120至131中任一項之方法，其進一步包括使該等癌細胞與至少一種其他癌症治療劑或方案接觸。
  133. 如請求項1至132中任一項之方法或組合物，其中該一或多種藥劑進一步包括脂質或類脂質。
  134. 如請求項133之方法或組合物，其中該類脂質具有式(VI)：
    Figure 03_image693
    其中： p係1與3之間之整數且包含端值； m係1與3之間之整數且包含端值； RA 係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
    Figure 03_image695
    或
    Figure 03_image697
    ； RF 係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
    Figure 03_image699
    或
    Figure 03_image701
    ； R5 在每次出現時獨立地係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；或經取代或未經取代之雜芳基； 其中RA 、RF 、RY 及RZ 中之至少一者係
    Figure 03_image703
    或
    Figure 03_image705
    ； x在每次出現時係1與10之間之整數且包含端值； y在每次出現時係1與10之間之整數且包含端值； RY 在每次出現時係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
    Figure 03_image707
    或
    Figure 03_image709
    ； RZ 在每次出現時係氫；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 脂肪族基團；經取代或未經取代之環狀或非環狀、具支鏈或無支鏈C1-20 雜脂肪族基團；經取代或未經取代之芳基；經取代或未經取代之雜芳基；
    Figure 03_image711
    或
    Figure 03_image713
    ； 或其醫藥上可接受之鹽。
  135. 如請求項134之方法或組合物，其中p為1。
  136. 如請求項134或135之方法或組合物，其中m為1。
  137. 如請求項134至136中任一項之方法或組合物，其中p及m中之每一者為1。
  138. 如請求項134至137中任一項之方法或組合物，其中RF 係
    Figure 03_image715
    。
  139. 如請求項134至138中任一項之方法或組合物，其中RA 係
    Figure 03_image717
    。
  140. 如請求項134之方法或組合物，其中該式(VI)化合物具有下式：
    Figure 03_image719
    ； 或其鹽。
  141. 如請求項134至140中任一項之方法或組合物，其中該組合物係呈脂質奈米顆粒之形式。
  142. 如請求項141之方法或組合物，其中該脂質奈米顆粒包括約1.0莫耳%至約60.0莫耳%之C12-200。
  143. 如請求項141或142之方法或組合物，其中該脂質奈米顆粒進一步包括一或多種共脂質。
  144. 如請求項143之方法或組合物，其中每一共脂質係選自二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、膽固醇及DMG-PEG。
  145. 如請求項144之方法或組合物，其中DSPC之濃度為約1.0莫耳%至約20.0莫耳%。
  146. 如請求項144或145之方法或組合物，其中膽固醇之濃度為約10.0莫耳%至約50.0莫耳%。
  147. 如請求項144至146中任一項之方法或組合物，其中DMG-PEG之濃度為約0.1莫耳%至約5.0莫耳%。
  148. 如請求項136至147中任一項之方法或組合物，其中DSPC係以約1.0莫耳%至約20.0莫耳%之濃度存在；膽固醇係以約10.0莫耳%至約50.0莫耳%之濃度存在；且DMG-PEG係以約0.1莫耳%至約5.0莫耳%之濃度存在。
  149. 如請求項1至148中任一項之方法或組合物，其中該藥劑呈醫藥上可接受之調配物之形式，視情況其中該醫藥上可接受之調配物實質上無內毒素及/或具有小於約1 EU/mg蛋白質。
  150. 如請求項1至149中任一項之方法或組合物，其中該等具有經調節發炎表型之單核球及/或巨噬細胞展現下列性質中之一或多者： a) 分化簇80 (CD80)、CD86、MHCII、MHCI、介白素1-β (IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)之經調節表現； b) CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1及/或IL-10之經調節表現； c) 至少一種選自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18及IL-23組成之群之細胞介素之經調節分泌； d) IL-1β、IL-6及/或TNF-α之表現對IL-10表現之經調節比率； e) 經調節CD8+細胞毒性T細胞活化； f) 經調節CD4+輔助性T細胞活性； g) 經調節NK細胞活性； h) 經調節嗜中性球活性； i) 經調節巨噬細胞活性；及/或 j) 經調節紡錘形形態、外觀平坦性及/或樹突數量，如藉由顯微術所評價。
  151. 如請求項1至150中任一項之方法或組合物，其中該等細胞及/或巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中該等細胞及/或巨噬細胞表現或經測定表現至少一種選自由表1及/或表2中所列示靶組成之群之靶。
  152. 如請求項1至151中任一項之方法或組合物，其中表1中所列示之該至少一種靶係選自由以下組成之群：人類SIGLEC9、VSIG4、CD74、CD207、LRRC25、SELPLG、AIF1、CD84、IGSF6、CD48、CD33、LST1、TNFAIP8L2 (TIPE2)、SPI1 (PU.1)、LILRB2、CCR5、EVI2B、CLEC7A、TBXAS1、SIGLEC7及DOCK2或其片段。
  153. 如請求項1至152中任一項之方法或組合物，其中表2中所列示之該至少一種靶係選自由以下組成之群：人類CD53、FERMT3、CD37、CXorf21、CD48及CD84或其片段。
  154. 如請求項1至153中任一項之方法或組合物，其中該癌症係經巨噬細胞浸潤之實體腫瘤，其中該等浸潤性巨噬細胞佔該腫瘤或腫瘤微環境中之細胞之質量、體積及/或數量之至少約5%，及/或其中該癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、腎透明細胞癌、神經膠母細胞瘤、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、胰臟腺癌、乳房侵襲性癌、急性骨髓樣白血病、腎上腺皮質癌、膀胱尿路上皮癌、腦低惡性神經膠質瘤、乳房侵襲性癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌、膽管癌、結腸腺癌、食管癌、多形性神經膠母細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、腎難染細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肝細胞癌、淋巴樣贅瘤瀰漫性大B細胞淋巴瘤、間皮瘤、卵巢漿液性囊腺癌、嗜鉻細胞瘤、副神經節瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、肉瘤、皮膚黑色素瘤、胃腺癌、睪丸生殖細胞腫瘤、胸腺瘤、甲狀腺癌、子宮癌肉瘤、子宮體內膜癌及葡萄膜黑色素瘤。
  155. 如請求項154之方法或組合物，其中該等巨噬細胞包括1型巨噬細胞、M1巨噬細胞、2型巨噬細胞、M2巨噬細胞、M2c巨噬細胞、M2d巨噬細胞、腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)、CD11b+細胞、CD14+細胞及/或CD11b+/CD14+細胞，視情況其中該等巨噬細胞係TAM及/或M2巨噬細胞。
  156. 如請求項155之方法或組合物，其中該等巨噬細胞表現或經測定表現一或多種選自由表1及/或表2中所列示靶組成之群之靶。
  157. 如請求項156之方法或組合物，其中表1中所列示之該至少一種靶係選自由以下組成之群：人類SIGLEC9、VSIG4、CD74、CD207、LRRC25、SELPLG、AIF1、CD84、IGSF6、CD48、CD33、LST1、TNFAIP8L2 (TIPE2)、SPI1 (PU.1)、LILRB2、CCR5、EVI2B、CLEC7A、TBXAS1、SIGLEC7及DOCK2或其片段。
  158. 如請求項156或157之方法或組合物，其中表2中所列示之該至少一種靶係選自由以下組成之群：人類CD53、FERMT3、CD37、CXorf21、CD48及CD84或其片段。
  159. 如請求項1至158中任一項之方法或組合物，其中該等單核球及/或巨噬細胞係原代單核球及/或原代巨噬細胞。
  160. 如請求項1至159中任一項之方法或組合物，其中該等單核球及/或巨噬細胞包括於組織微環境內。
  161. 如請求項1至160中任一項之方法或組合物，其中該等單核球及/或巨噬細胞包括於人類腫瘤模型或動物癌症模型內。
  162. 如請求項1至161中任一項之方法或組合物，其中該個體係哺乳動物。
  163. 如請求項162之方法或組合物，其中該哺乳動物係人類。
  164. 如請求項163之方法或組合物，其中該人類患有癌症。
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