CN113884682A - 检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途,所述表面标志分子的组合物为选自CD48、CD53、CD44、CD305、CD52、CD62L、CD162、CD230、CD114、CD18、CD28、CD87、CD88、CD45、CD217、CD284、CD14或CD50中的一种或几种。本发明所鉴定的表面标志分子在与感染相关的巨核细胞或血小板亚群中特异性高表达,有助于巨核细胞和血小板免疫亚群的标记和分离。本发明筛选出的巨核细胞和血小板免疫亚群的特征性表面标志分子,为在生理病理条件下监测巨核细胞和血小板免疫亚群的动态变化提供了工具,并为相关疾病的临床治疗提供了新的理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域,特别涉及检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途。
背景技术
骨髓中的巨核细胞是一类大胞体、数量稀少的血细胞,其经典功能是产生并释放血小板颗粒,通过血小板在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中发挥重要作用。此外,巨核细胞自身在多种生理病理过程中也发挥重要功能,包括维持造血干细胞静息状态、促进肿瘤细胞骨髓转移以及调节免疫和炎症反应(Malara,A.et al.Megakaryocytes contribute to the bone marrow-matrix environment byexpressing fibronectin,type IV collagen,and laminin.Stem Cells 32(4),926-937(2014);Zhao,M.et al.Megakaryocytes maintain homeostatic quiescence andpromote post-injury regeneration of hematopoietic stem cells.Nat.Med.20(11),1321(2014)),并且巨核细胞表达炎症和适应性免疫反应相关表面标志分子,可能作为免疫细胞发挥多种潜在作用。最近的研究表明小鼠肺部的巨核细胞具有免疫特征,表达促炎性的免疫受体和介导分子,可能作为免疫感受器发挥作用(Cunin,P.&Nigrovic,P.A.Megakaryocytes as immune cells.J.Leukoc.Biol.105(6),1111-1121(2019))。而且成熟的巨核细胞表达MHC I类模式分子,可以进行抗原递呈并激活CD8+T细胞,并将载有外来抗原的MHC I传递给血小板(Zufferey,A.et al.Mature murine megakaryocytespresent antigen-MHC class I molecules to T cells and transfer them toplatelets.Blood.Adv.1:1773-1785(2017))。此外,巨核细胞通过分泌多种炎性因子影响其他免疫细胞的功能。这些研究表明巨核细胞具有功能上的异质性并且具有重要的免疫调控作用。然而巨核细胞的多种功能是否通过不同的功能亚群来发挥以及巨核细胞中是否具有独特的免疫偏向的细胞群体尚不明确。巨核细胞主要分析方法是基于经典的形态学观察和传统的转录组测序技术,将巨核细胞作为一个整体进行研究。随着单细胞测序技术的兴起,利用单细胞技术解析巨核细胞的异质性,将进一步加深我们对于巨核细胞功能的理解。
血小板作是成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质,在生理止血过程中发挥重要功能。最近的发现表明,血小板还积极参与止血和血栓形成以外的许多生理和病理过程,例如先天性和适应性免疫反应(Li C,Li J,Li Y,et al.Crosstalk betweenplatelets and the immune system:old systems with new discoveries.Adv Hematol2012;2012:384685.;Semple JW,Italiano Jr JE,Freedman J.Platelets and theimmune continuum.Nat Rev Immunol2011;11:264–74.),动脉粥样硬化(Siegel-Axel D,Daub K,Seizer P,et al.Platelet lipoprotein interplay:trigger of foam cellformation and driver of atherosclerosis.Cardiovasc Res 2008;78:8–17.),淋巴管发育(Hess PR,Rawnsley DR,Jakus Z,et al.Platelets mediate lymphovenoushemostasis to maintain blood-lymphatic separation throughout life.J ClinInvest 2014;124:273–84.;Navarro-Nunez L,Langan SA,Nash GB,Watson SP.Thephysiological and pathophysiological roles of platelet CLEC-2.Thromb Haemost2013;109:991–8.),血管生成(Italiano Jr.JE,,Richardson JL,Patel-Hett S,etal.Angiogenesis is regulated by a novel mechanism:pro-and antiangiogenicproteins are organized into separate platelet alpha granules anddifferentially released.Blood 2008;111:1227–33.)和肿瘤转移(Labelle M,HynesRO.The initial hours of metastasis:the importance of cooperative host-tumorcell interactions during hematogenous dissemination.Cancer Discov 2012;2:1091–9)。血小板具有重要的免疫功能,并且血小板作为巨核细胞的产物可能延续巨核细胞的特征,然而是否存在具有免疫偏向性的血小板亚群尚不明确。
感染是细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。目前对于感染的诊断和监测一般通过了解患者的病史及症状、实验室检查以及一些非损伤性措施的检查,例如,超声监测、CT、MRI等。实验室检查包括血及其他可采集到的体液的细菌,真菌,病毒和分枝杆菌的分离培养,全部血球计数和抗体滴定(如伤寒,布氏菌病和某些病毒病)。对某些疾病(如感染性心内膜炎)的诊断,可能需要多次采血,如一天2~3次,进行分离培养;对原虫病(如疟疾)的确诊需进行血液的直接检查,抗体滴度的升高可诊断很多传染病,但血清标本采集的间隔应有规律。此外,厌氧菌感染已日益受到关注,由于其要求厌氧或低氧的培养环境方可发现,特别是专性厌氧菌(如破伤风杆菌)和微需氧菌(如幽门螺杆菌)引起的感染,已越来越被提高重视程度。
尽管现有技术中有很多检测感染的方法,但其样本需求量较高(3-5mL),花费时间较长(如血/体液培养或微生物培养需要24h或48h),检测成本高(精密仪器的使用增加成本),有的检测需要反复取样才能鉴定(感染初期抗体水平低或取样不达标)。因此,需要寻找一种新的方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的一个方面,是针对现有技术中检测感染的方法样本需求量大、检测时间长、检测成本高、检测过程复杂的缺陷,提供了一种检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途。
本发明提供的技术方案为:
检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途,所述表面标志分子的组合物为选自CD48、CD53、CD44、CD305、CD52、CD62L、CD162、CD230、CD114、CD18、CD87、CD28、CD88、CD45、CD217、CD284、CD14或CD50中的一种或几种。
例如,所选表面标志分子的组合物为CD48、CD53、CD162、CD44和CD114的组合;CD87、CD88、CD45、CD217、CD284、CD14和CD50的组合;CD48和CD53的组合;CD48、CD53、CD284、CD28、CD88和CD44的组合,等等。上述组合均能实现本发明的目的。
作为优选,在本发明的实施方式中,所述表面标志分子为选自CD48、CD53、CD284、CD28、CD88或CD44中的一种或几种。
例如,所选表面标志分子的组合物为CD48和CD53的组合;CD48、CD53和CD284的组合;CD48、CD53、CD284和CD88的组合;CD48、CD53、CD284、CD28和CD88的组合;CD53、CD284、CD88和CD44的组合,等等。上述组合均能实现本发明的目的。
在本发明中,所述表面标志分子的来源可以为体内或者体外。作为优选,在本发明的实施方式中,所述巨核细胞为骨髓、脾脏或肺脏中分离的巨核细胞,或在体外经造血干祖细胞诱导分化产生的巨核细胞,所述血小板为外周血中的血小板,或在体外经造血干祖细胞诱导分化产生的血小板。
更优选地,所述巨核细胞为骨髓中分离的巨核细胞或在体外经脐带血CD34+细胞诱导分化产生的巨核细胞,所述血小板为外周血中的血小板。
在本发明的一个实施方式中,上述造血干祖细胞可以为任意合适来源的造血干祖细胞,例如,商业化的人胚胎干细胞、iPS细胞、脐带血或骨髓。
上述巨核细胞或血小板可以为人或其他动物来源的巨核细胞或血小板,例如,小鼠、兔。
上述巨核细胞或血小板可通过常规细胞分离方法获得,或通过常规方法进行检测。
作为优选,在本发明的一个实施方式中,还提供了一种上述巨核细胞或血小板的检测方法。例如,一种巨核细胞免疫亚群的检测方法:
步骤1)抽取骨髓细胞;
步骤2)PBE(PBS+2%FBS+0.4%0.5M EDTA)重悬细胞,加入红细胞裂解液裂解红细胞3-5min;
步骤3)将细胞用PBE洗涤后重悬为1×107/100ul,加入流式抗体(以检测CD48表达为例:anti-hCD41a,anti-hCD42b,anti-hCD148,anti-hCD48或anti-mCD41,anti-mCD42d,anti-mCD148,anti-mCD48),4℃标记抗体30min。
步骤4)1ml PBS洗去未结合的抗体后200ulPBE重悬细胞,进行流式检测。
再例如,一种血小板免疫亚群的检测方法:
步骤1)将全血吸至15ml离心管,加入等体积生理盐水,轻轻混匀,在室温离心1100rpm,10min(5-6ml/管)获取上层富含血小板血浆(PRP);
步骤2)将步骤1)中得到的PRP在室温离心2min,离心速度为(人血小板:3200rpm:小鼠血小板:3500rpm),得到血小板沉淀;
步骤3)用CGS buffer洗涤步骤2)中得到的血小板沉淀,室温离心,2min,离心速度(人血小板:2300rpm,小鼠血小板:2500rpm),人血小板用CGS buffer洗涤1遍,小鼠血小板用CGS buffer洗涤2遍;
步骤4)台式液重悬步骤3)中得到的血小板,室温静置(人血小板:静置40min,小鼠血小板:静置2h);
步骤5)取2×106血小板于100ul台式液中,人血小板悬液中加入1ul anti-CD41a、1μL anti-CD42b(BD)和1ul anti-CD48(Biolegend)流式抗体;小鼠血小板悬液中加入1ulanti-CD41(Biolegend)、1ul anti-CD42d(Biolegend)和1ul anti-CD48(BD)。室温避光孵育30min后,流式细胞仪(FACS Canto II;BD Biosciences)检测CD41a+CD42b+CD48+血小板的比例。
上述抗体可通过现有技术制备或购买。
在本发明中,上述CD48等表面分子可以为不同的命名方式,本领域技术人员可以通过例如GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)等工具来查找其相关信息。例如,在本发明中:
所述CD48可以命名为CD48、B-lymphocyte activation marker BLAST-1、BCM1surface antigen、Leukocyte antigen MEM-102、SLAM family member 2(Short name:SLAMF2)、Signaling lymphocytic activation molecule 2或TCT.。CD48是CD2的配体,表达于淋巴细胞和其他免疫细胞,树突状细胞和内皮细胞的表面,并参与这些细胞的活化和分化途径。
所述CD53可以命名为CD53或Tetraspanin-25(Short name:Tspan-25)。CD53是跨膜4超家族的成员,其特征在于存在四个疏水域。介导信号转导事件,在细胞发育,激活,生长和运动的调节中发挥作用。是已知与整联蛋白复合的细胞表面糖蛋白。它有助于在T细胞和自然杀伤细胞中CD2产生的信号的转导,在生长调节中发挥作用。CD53编码基因的家族缺陷与细菌、真菌和病毒引起的反复传染病相关的免疫缺陷有关。
所述CD44可以命名为CD44、CDw44、Epican、Extracellular matrix receptor III(Short name:ECMR-III)、GP90 lymphocyte homing/adhesion receptor、HUTCH-I、Heparan sulfate proteoglycan、Hermes antigen、Hyaluronate receptor、Phagocyticglycoprotein 1(Short name:PGP-1)或Phagocytic glycoprotein I(Short name:PGP-I)。CD44是一种参与细胞-细胞相互作用,细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。它是透明质酸(HA)的受体,还可以与其他配体相互作用,例如骨桥蛋白,胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMP)。该蛋白参与多种细胞功能,包括淋巴细胞活化,再循环和归巢,造血作用和肿瘤转移。
所述CD305可以命名为Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor1(Short name:LAIR-1;Short name:hLAIR1)或CD305。LAIR1充当抑制性受体,对自然杀伤(NK)细胞,B细胞和T细胞的溶细胞功能起组成性负调控作用。
所述CD52可以命名为CAMPATH-1antigen、CDw52、Cambridge pathology1antigen、Epididymal secretory protein E5或Human epididymis-specific protein 5(Shortname:He5)。可能在携带和定向碳水化合物方面发挥作用。
所述CD62L可以命名为L-selectin、CD62 antigen-like family member L、Leukocyte adhesion molecule 1(Short name:LAM-1)、Leukocyte surface antigenLeu-8、Leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 1(Short name:LECAM1)、Lymphnode homing receptor、TQ1、gp90-MEL、CD62L或SELL。SELL通过与邻近细胞上的糖蛋白结合来介导细胞粘附的钙依赖性凝集素,介导淋巴细胞粘附于外周淋巴结中高内皮小静脉的内皮细胞,促进内皮细胞白细胞的初始束缚和滚动。
所述CD162可以命名为P-selectin glycoprotein ligand 1(Short name:PSGL-1)、Selectin P ligand、CD162或SELPLG。SELPLG是一种糖蛋白,该蛋白对髓样细胞和受激T淋巴细胞表达的细胞粘附分子P-,E-和L-选择蛋白具有高亲和力。这样,该蛋白通过将白细胞束缚在表达血小板活化素或表达选择素的内皮细胞中,在炎症过程中在白细胞运输中起关键作用。此蛋白需要两个翻译后修饰,酪氨酸硫酸化,并在其O-连接的聚糖上添加唾液酸路易斯x四糖(sLex),以实现其高亲和力结合活性。
所述CD230可以命名为Major prion protein(Short name:PrP)、ASCR、PrP27-30、PrP33-35C、CD230或PRNP。所述CD114可为Granulocyte colony-stimulating factorreceptor(Short name:G-CSF receptor;Short name:G-CSF-R)、CD114、CSF3R几种命名中的一种或几种,CSF3R是粒细胞集落刺激因子(CSF3)的受体,对粒细胞成熟至关重要。在嗜中性细胞系沿细胞的增殖,分化和存活中起关键作用。另外,它可能在细胞表面的某些粘附或识别事件中起作用。
所述CD87可以命名为Urokinase plasminogen activator surface receptor(Short name:U-PAR;Short name:uPAR)、Monocyte activation antigen Mo3、CD87或PLAUR。其充当尿激酶纤溶酶原激活剂的受体,在促进纤溶酶形成中起作用,介导不依赖蛋白水解的信号转导激活效应。
所述CD88可以命名为C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1、C5aanaphylatoxin chemotactic receptor(Short name:C5a-R;Short name:C5aR)或CD88。CD88是趋化和炎性肽过敏毒素C5a的受体,该受体激活后刺激趋化分子、颗粒酶释放、细胞内钙释放和超氧阴离子产生。
所述CD45可以命名为Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C(shortname:PTPRC)、Leukocyte common antigen(Short name:L-CA)、T200或CD45。PTPRC是蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员,是调节各种细胞过程(包括细胞生长,分化,有丝分裂和致癌转化)的信号分子。
所述CD217可以命名为Interleukin-17receptor A(Short name:IL-17receptorA;Short name:IL-17RA)、CDw217或CD217。IL17RA是IL17A的受体,IL17RA的激活导致诱导炎症趋化因子和细胞因子例如CXCL1,CXCL8/IL8和IL6的表达。
所述CD284可以命名为CD284、hToll、或Toll-like receptor 4(short name:TLR4)。TLR4与LY96和CD14协同介导对细菌脂多糖(LPS)的先天免疫应答,通过MYD88,TIRAP和TRAF6起作用,导致NF-κB活化,细胞因子分泌和炎症反应。
所述CD50可以命名为Intercellular adhesion molecule 3(Short name:ICAM-3)、CDw50、ICAM-R或CD50。ICAM蛋白是白细胞粘附蛋白LFA-1(整联蛋白α-L/β-2)的配体,ICAM3也是整联蛋白alpha-D/beta-2的配体。与整合素α-L/β-2结合,通过巨噬细胞促进凋亡性中性粒细胞吞噬。
所述CD18可以命名为Integrin beta-2(ITGB2)、Cell surface adhesionglycoproteins LFA-1/CR3/p150,95subunit beta或Complement receptor C3 subunitbeta。整联蛋白ITGAL/ITGB2是ICAM1,ICAM2,ICAM3和ICAM4的受体,是参与细胞粘附以及细胞表面介导的信号传导的完整细胞表面蛋白。在免疫应答中起重要作用,其编码基因的缺陷导致白细胞粘附不足。
作为优选,在本发明的一个实施方式中,所述感染为由LPS和/或IFN-γ刺激引起的感染。
作为优选,在本发明的一个实施方式中,所述感染为由细菌或病毒引起的感染。
作为优选,在本发明的一个实施方式中,所述感染机体免疫力低下引起的感染、机械性损伤引起的感染、疾病诱发的感染或疾病治疗导致的感染。
在本发明中,所述检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品可以为所述的表面标志分子抗体或抗原结合部分。
在本发明中,上述抗原结合部分可以选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体,人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
本发明的另一个方面,是提供了一种用于检测感染的试剂盒,所述试剂盒包括上述检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品,以及缓冲体系。
所述检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品可以为所述的表面标志分子抗体或抗原结合部分。
在本发明中,上述抗原结合部分可以选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体,人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
本发明中所述试剂盒可以为通过单一的被标记的单克隆抗体来检测所述表面标志分子,也可以通过任意合适的现有技术中的方法,利用双夹心等方式检测所述表面标志分子,其均视为包含在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个方面,是提供了上述试剂盒在制备检测感染的产品中的用途。
本发明的另一个方面,是提供了一种细胞制剂在制备治疗由免疫或感染因素所致疾病的细胞药物中的用途,所述细胞制剂包含表达上述表面标志分子的巨核细胞或血小板。
上述细胞制剂可以利用任意合适的方法富集,例如,流式细胞术。
上述细胞制剂还可包含必要的药用制剂,例如,药用辅料、缓冲液、培养液、保存剂等。
本发明的有益效果为:
本发明所鉴定的表面标志分子在与感染应答相关的巨核细胞或血小板亚群中特异性高表达,有助于感染的监测和检测,以及巨核细胞和血小板免疫亚群的标记和分离。本发明利用单细胞测序分析方法,解析了体内外巨核细胞的异质性,鉴定了与感染相关的巨核细胞免疫亚群,同时筛选出巨核细胞免疫亚群的特征性表面标志分子,为在生理病理条件下监测巨核细胞和血小板免疫亚群的动态变化提供了工具,并为相关疾病的临床治疗提供了新的理论依据。
附图说明
图1为本发明中正常和E.coli感染情况下小鼠骨髓巨核细胞中免疫相关表面标志分子转录组表达水平变化的dotplot图,在E.coli感染情况下,巨核细胞中列举的免疫相关表面标志分子表达水平显著上升;列举的表面标志分子基因包括Ceacam1(CD66a)、Ptprc(CD45)、Cd52、Csf2ra(CD116)、Sell(CD62L)、Ifngr1(CD119)、Cd53、Cd177、Csf2rb(CD131)、Il1r2(CD121b)、Sirpa(CD172a)、Plaur(CD87)、Cd48、Tnfrsf1a(CD120a)、Csf3r(CD114)、Tlr2(CD282),其编码的表面标志蛋白分别为CD66a、CD45、CD52、CD116、CD62L、CD119、CD53、CD177、CD131、CD121b、CD172a、CD87、CD48、CD120a、CD114、TLR2(CD282);
图2为本发明中小鼠体内E.coli感染条件下巨核细胞和血小板中CD48、CD28、CD88、CD53、TLR4等表达水平变化结果图,其中,A为失活E.coli诱导的C57BL/6小鼠腹膜炎模型后巨核细胞和血小板检测示意图,B为模型小鼠巨核细胞中CD48表达水平随感染时间的动态变化情况结果图,C为对照和E.coli感染小鼠巨核细胞中CD28、CD88和CD53表达水平情况结果图,D为模型小鼠血小板中CD48、CD53和TLR4表达水平随感染时间的动态变化情况结果图;
图3为本发明中体外不同条件刺激下巨核细胞中CD48表达水平变化结果图,其中,A为本发明中脐带血CD34+细胞体外巨核分化培养过程中在不同浓度LPS刺激下巨核细胞中CD48表达水平变化结果图,B为本发明中脐带血CD34+细胞体外巨核分化培养过程中在不同浓度IFN-γ刺激下巨核细胞中CD48表达水平变化结果图,
图4为本发明中健康供者和感染病人外周血CD41a+CD42b+血小板中CD53+、CD44+、CD28+、CD305+、CD62L+、CD162+、CD50+、CD87+和CD14+血小板比例对比图;
图5为本发明中CD48+巨核细胞与CD48-巨核细胞中免疫相关受体以及免疫相关分泌蛋白基因表达水平差异结果图;
图6为本发明中流式细胞术检测CD48-和CD48+巨核细胞中LCN2、HCK、CAMP、HCK、GRN、CCL3、S100A8蛋白表达水平的结果图;
图7为本发明中对照和E.coli感染小鼠的骨髓中CD48+或CD48-巨核细胞与血管距离以及中细粒细胞关系的统计图,其中,图A为CD48+或CD48-巨核细胞与血管的距离统计,图B为CD48+或CD48-巨核细胞黏附中性粒细胞情况统计;
图8为本发明中小鼠骨髓CD48-和CD48+巨核细胞中C5AR1(CD88)或TLR4(CD284)表达水平对比峰图;
图9为本发明中对照小鼠和E.coli感染后小鼠骨髓CD48+巨核细胞中CD48+CD28+巨核细胞或CD48+CD88+巨核细胞比例变化情况。
具体实施方式
本发明公开了检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明,并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。以下就本发明中出现的主要术语加以解释。
术语“巨核细胞”是骨髓中的一种从造血干细胞分化而来的细胞,是正常骨髓中的一种能生成血小板的成熟细胞,前身为颗粒巨核细胞。该细胞体积巨大,成熟的巨核细胞边缘部分破裂脱落后形成血小板。每个巨核细胞平均能生成2000个左右的血小板。巨核细胞也可来源于脾脏、肝脏、肺等其他部位。
术语“血小板”是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质。当因血管创伤而失血时,血小板在生理止血过程中的功能活动大致可以分为两个阶段:第一阶段主要是创伤发生后,血小板迅速黏附于创伤处,并聚集成团,形成较松软的止血栓子;第二段主要是促进血凝并形成坚实的止血栓子。
术语“表面标志分子”一般是指CD分子—分化簇或分化群,也叫白细胞分化抗原,指的是不同谱系的白细胞在正常分化成熟的不同阶段及活化过程中,出现或消失的细胞表面标记。它们是细胞膜上的一类蛋白质或糖蛋白。在生理学上,CD分子有许多用途,通常用作细胞的重要受体或配体。不仅可作为表面标志用于细胞的鉴定和分离,还广泛参与细胞的生长、成熟、分化、发育、迁移、激活。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1:体内感染条件下巨核细胞中免疫亚群比例检测
a.接种E.coli ATCC19138菌株于琼脂糖培养板上,37℃培养18-24h;
b.挑取单个菌落于琼脂糖液体培养基,37℃,200rpm摇菌10h;
c.生理盐水洗涤细菌后检测OD值(600nm)计算细菌浓度;
d.80℃加热30min,生理盐水调整菌浓度为1×107CFU/300μL;
e.腹腔注射300μL/只小鼠。
f.在对照小鼠和感染不同时间点的小鼠中取骨髓细胞1×107/100ul,加入3ulanti-CD41-FITC(Biolegend)、3ul anti-CD42d-APC(Biolegend)、和3ul anti-CD48-pacific blue(Biolegend);取骨髓细胞1×107/100ul,加入3ul anti-CD41-PE(Biolegend)、3ul anti-CD53-FITC(Biolegend);取骨髓细胞1×107/100ul,加入3ulanti-CD41-pacific blue(Biolegend)、3ul anti-CD42d-APC(Biolegend)、3ul anti-CD28-PECY7(Biolegend);取骨髓细胞1×107/100ul,加入3ul anti-CD41-pacific blue(Biolegend)、3ul anti-CD42d-percp-cy5.5(Biolegend)、3ul anti-CD88-APC(Biolegend)。4℃避光孵育30min后,流式细胞仪(FACS Canto II;BD Biosciences)检测CD41+CD42d+巨核细胞中CD28+/CD88+/CD48+巨核细胞的比例和CD41+巨核细胞中CD53+巨核细胞比例。
结果分别如图2的B和图2的C所示,图2的B显示CD48+巨核细胞比例随E.coli感染时间先逐渐增高,36h达高峰,后逐渐恢复,72h基本恢复正常水平。证明CD48+巨核细胞比例与感染有关。如图2的C显示,CD28+、CD88+以及CD53+巨核细胞在E.coli感染后24h的比例增高。这些结果证明这些免疫亚群巨核细胞与感染有关并且随感染时间有一定的变化规律。
实施例2:对照小鼠及E.coli感染小鼠巨核细胞单细胞测序及巨核细胞中免疫标志分子表达水平分析
按实施例1中的方法构建E.coli感染小鼠模型,取注射等量生理盐水和E.coli感染后36h骨髓巨核细胞进行Smart-seq单细胞测序,分析对照组和E.coli感染组巨核细胞中免疫标志分子表达情况。
结果如图1所示,E.coli感染组巨核细胞中Ceacam1(CD66a)、Ptprc(CD45)、Cd52、Csf2ra(CD116)、Sell(CD62L)、Ifngr1(CD119)、Cd53、Cd177、Csf2rb(CD131)、Il1r2(CD121b)、Sirpa(CD172a)、Plaur(CD87)、Cd48、Tnfrsf1a(CD120a)、Csf3r(CD114)、Tlr2(CD282)等基因表达水平高于对照组,从而证明上述细胞表面分子也与感染相关。
实施例3:血小板的分离
a.将人或小鼠的全血吸至15ml离心管,加入等体积生理盐水,轻轻混匀;
b.在室温离心1100rpm,10min(5-6ml/管),如果体积少,可降低离心速度或离心时间。
c.吸取上层富含血小板血浆(PRP)至1.5ml EP管,1ml/管;
d.在室温离心2min,离心速度为(人血小板:3200rpm:小鼠血小板:3500rpm)
e.弃上清,加入1ml CGS buffer,室温离心,2min,离心速度(人血小板:2300rpm,小鼠血小板:2500rpm),人血小板用CGS buffer洗涤1遍,小鼠血小板用CGS buffer洗涤2遍;
f.台式液重悬血小板,室温静置(人血小板:静置40min,小鼠血小板:静置2h)。
实施例4:体内感染条件下小鼠血小板中免疫亚群比例检测
a.按实施例1建立感染小鼠模型;
b.在对照小鼠和感染不同时间点的小鼠中取2×106血小板于100ul台式液中,加入1ul anti-CD41-APC(Biolegend)、1ul anti-CD42d-PE(Biolegend)、1ul anti-CD53-FITC(Biolegend)、1ul anti-CD48-pacific blue(Biolegend)、1ul anti-TLR4-PECY7(Biolegend),室温避光孵育30min后,流式细胞仪(FACS Canto II;BD Biosciences)检测CD41+CD42d+CD53+血小板、CD41+CD42d+TLR4+血小板、CD41+CD42d+CD48+血小板的比例随时间点的动态变化。
如图2的D所示,CD53+血小板在感染后24h上升,并维持在较高水平,CD48+血小板和TLR4+血小板呈现先降后升的变化动态,在感染后48h到60h达到高峰,72h恢复正常。证明血小板免疫亚群比例在感染后发生变化并且其变化程度与感染时间相关。
实施例5:体外感染条件下巨核细胞中免疫亚群比例检测
a.用添加人血小板生成素(hTPO,终浓度为50ng/mL)、干细胞因子(SCF,终浓度为20ng/mL)和白介素-3(IL-3,终浓度为20ng/mL)的无血清培养基StemSpan SFEM重悬脐带血CD34+细胞,以1×105/mL起始密度接种于12孔板,在37℃、5%CO2孵箱中静置培养3天;
b.第3天全量更换上述培养液和细胞因子,调整细胞培养密度为1×105/mL,继续静置培养3天;
c.第6天全量更换培养液和细胞因子(hTPO,终浓度为50ng/mL;IL-11,终浓度为20ng/mL),调整细胞培养密度为2.5×105/mL,于6孔板中培养至第9天;
d.第9天全量更换上述培养液和细胞因子,调整细胞培养密度为1×105/mL接种于24孔板,5×104/孔,分别加入0、0.1、1、10、20ug/mL的LPS或0、10、
20、100、500ng/mL IFN-γ,培养至第12天,检测CD41a+CD42b+CD148+巨核细胞中CD48+巨核细胞的比例。
结果如图3所示,从图3的A和B可以看出,CD48+巨核细胞比例随LPS和IFN-γ刺激呈剂量依赖性增高。
实施例5:感染病人血小板中免疫亚群比例检测
取正常人和细菌感染病人外周血富含血小板血浆2ul于台式液中,按实施例3或4中方法检测CD53+血小板、CD44+血小板、CD28+血小板、CD305+血小板、CD62L+血小板、CD162+血小板、CD50+血小板、CD87+血小板和CD14+血小板比例。
结果如图4所示,与正常供者相比,感染病人外周血CD41a+CD42b+血小板中CD53+、CD44+、CD28+、CD305+、CD62L+、CD162+、CD50+、CD87+、CD14+血小板比例显著增高。进一步证明血小板免疫亚群比例在感染后发生变化。
实施例6:骨髓CD48+巨核细胞和CD48-巨核细胞基因表达水平检测
a.从失活E.coli诱导的C57BL/6腹膜炎模型小鼠中分离出CD41+CD42d+CD148+CD48+和CD41+CD42d+CD148+CD48-巨核细胞;
b.分别挑取单个细胞至装有5μL RT-PCR master mix(2.5μL 2×Reaction Mix,Vazyme Single Cell Sequence Specific Amplification Kit;0.5μL primer pool;0.1μL RT/Taq Enzyme,Vazyme Single Cell Sequence Specific Amplification Kit;1.9μLnuclease-free water)的PCR管中;
c.于-80℃放置5min,3000rpm离心2min;
d.逆转录预扩增PCR反应,50℃反应60min进行逆转录,随后95℃反应3min使cDNA进行预变性,随后进行20个循环序列特异性扩增反应(95℃,15s进行变性—60℃反应15min进行退火、延伸),反应后的样本用无酶水稀释5倍后储存于-20℃;
e.无酶水将预扩增cDNA样本稀释20倍后进行Real-time SYBR Green PCR反应(Qiagen,Hilden,German)。
结果如图5所示,与CD48-巨核细胞相比,CD48+巨核细胞中C5ar1、Tlr4、Fpr1、Tlr2、Ifngr1这些介导免疫应答的受体基因相对高表达,CD48+巨核细胞同时高表达Lcn2、Hck、Camp、Grn、Ccl3、S100a8这些具有免疫调控作用的蛋白基因。上述结果证明了分选出的巨核细胞CD48+免疫亚群与其他亚群相比基因水平上的差异。
实施例7:骨髓CD48+巨核细胞和CD48-巨核细胞分泌蛋白表达水平检测实验方法同实施例2或实施例4。
结果如图6所示,流式细胞术检测结果显示CD48+MK中LCN2等分泌蛋白荧光强度高于CD48-MK,表现为峰图往右迁移。上述结果证明了分选出的免疫亚群与其他亚群相比蛋白表达水平上的差异。
实施例8:骨髓巨核细胞/中性粒细胞/血管原位免疫荧光染色实验
a.将小鼠骨髓冷冻切片用4%PFA固定30分钟;
b.用PBS中的0.3%Triton X-100通透30分钟;
c.用2%BSA封闭1小时;
d.将骨髓切片与不同抗体在4℃下孵育过夜;
e.PBS洗涤3次后,将细胞核用Hoechest33342染色10分钟;
f.使用旋转盘共聚焦显微镜(UltraVIEW VOX)采集图像并通过Volocity分析。
结果如图7的A和图7的B所示,图7的A为对照或感染小鼠的骨髓中CD48+或CD48-巨核细胞与血管最短欧氏距离距离统计结果图,结果显示感染情况下CD48+巨核细胞与血管的距离明显缩短。
图7的B为正常小鼠骨髓原位CD48+或CD48-巨核细胞与S100A8hi中性粒细胞之间的相互作用关系统计图,结果显示CD48+巨核细胞周边紧邻中性粒细胞的数目增加,大部分CD48-巨核细胞周边紧邻1-2个中性粒细胞,少有CD48-巨核细胞周边紧邻超过5个中性粒细胞,而CD48+巨核细胞紧邻中性粒细胞个数为1-2个的巨核细胞比例减少,而紧邻3个以上中性粒细胞的巨核细胞比例明显增加,紧邻5个以上中性粒细胞的巨核细胞比例远高于CD48-巨核细胞。
以上两个结果进一步证明了CD48+巨核细胞与感染有关。
实施例9:小鼠巨核细胞中免疫标志分子共表达情况分析
对于CD48与CD88或CD28或TLR4共表达情况检测,按实施例2和实施例4中的方法进行相应抗体组合标记及流式检测。
结果如图8和图9所示,图8显示与CD48-巨核细胞相比,CD48+巨核细胞中C5AR1和TLR4的表达水平更高,表现为峰右移;图9显示CD48+巨核细胞中,CD48与CD28共表达的巨核细胞以及CD48与CD88共表达的巨核细胞比例在感染后增高,并且随感染时间推移比例逐渐增加。说明这些免疫标志分子在感染中具有相对同步的变化趋势,可以组合标记或互为补充标记感染相关的免疫亚群。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途,其特征在于,所述表面标志分子的组合物为选自CD48、CD53、CD44、CD305、CD52、CD62L、CD162、CD230、CD114、CD18、CD87、CD28、CD88、CD45、CD217、CD284、CD14或CD50中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述表面标志分子的组合物为选自CD48、CD53、CD28、CD284、CD88或CD44中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述巨核细胞为骨髓、脾脏或肺脏中分离的巨核细胞,或在体外经造血干祖细胞诱导分化产生的巨核细胞,所述血小板为外周血中的血小板,或在体外经造血干祖细胞诱导分化产生的血小板。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述巨核细胞为骨髓中分离的巨核细胞或在体外经脐带血CD34+细胞诱导分化产生的巨核细胞,所述血小板为外周血中的血小板。
5.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述感染为由LPS和/或IFN-γ刺激引起的感染。
6.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述感染为由细菌或病毒引起的感染。
7.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述感染为机体免疫力低下引起的感染、机械性损伤引起的感染、疾病诱发的感染或疾病治疗导致的感染。
8.一种用于检测感染的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求1~3任意一项的用途中所述的检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品,以及缓冲体系。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品为抗体或抗原结合部分。
10.一种细胞制剂在制备治疗由免疫或感染因素所致疾病的细胞药物中的用途,其特征在于,所述细胞制剂包含表达如权利要求1或2中所述的表面标志分子的巨核细胞或血小板。
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