JP2016104757A - 血管増殖性疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
Lrg1のブロック
本発明のアンタゴニストはLrg1の機能をブロックする。Lrg1をブロックすることは、その活性または機能を低下させることを含んでおり、その結果として内皮細胞増殖、周皮細胞脱落、内皮細胞死、血管リモデリング、血管形成、毛細管拡張症、血管漏出などの血管増殖作用が低下するものである。
任意の適当なアンタゴニスト、たとえばペプチドおよびペプチドミメティック、抗体、小分子阻害剤、二本鎖RNA、アプタマーおよびリボザイムを、本発明にしたがって使用することができる。好ましいアンタゴニストとしては、Lrg1のペプチド断片、二本鎖RNA、アプタマーおよび抗体がある。
ペプチドアンタゴニストは、典型的には、TGFβRIIおよび/またはALK1との結合に関して全長Lrg1と競合し、したがってLrg1と拮抗する、Lrg1の断片である。こうしたペプチドは直鎖状でも環状でもよい。ペプチドアンタゴニストは典型的には、5から50、好ましくは10-40、10-30もしくは15-25アミノ酸長であって、概してLrg1内部由来の連続配列と同一であるが、ペプチドアンタゴニストがLrg1をブロックする性質を保持している限り、その同一性は100%未満でもよく、たとえば95%以上、90%以上、または80%以上であってもよい。ブロッキングペプチドは、任意の適当な方法で、たとえばLrg1配列の一部もしくはすべてに及ぶ、連続したペプチドもしくはオーバーラップしたペプチドの、系統的スクリーニングによって同定することができる。こうしたブロッキングペプチドを模倣するように、ペプチドミメティックを設計することもできる。
既知の技術を使用し、Lrg1の配列に関する知見を基にして、配列相同性に基づいてLrg1 RNAを標的化することにより、二本鎖RNA(dsRNA)分子を、Lrg1と拮抗するようにデザインすることができる。こうしたdsRNAは典型的には、通常ステムループ(「ヘアピン」)構造をとる低分子干渉RNA(siRNA)、またはマイクロRNAである。こうしたdsRNAの配列は、Lrg1をコードするmRNAの一部に相当する部分を含んでいる。この部分は、通常、Lrg1 mRNAの標的部分に100%相補的であるが、相補性はもっと低レベル(たとえば90%以上、または95%以上)であってもよい。
アプタマーは総じて、特異的な標的分子と結合する核酸分子である。アプタマーは完全にin vitroで操作することが可能であり、化学合成によって容易に作製され、望ましい保存特性を有しており、加えて治療的応用において免疫原性をほとんど、もしくはまったく生じない。これらの特徴から、アプタマーは、薬剤および治療の実用性において特に有用である。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合フラグメント(すなわち、「抗原結合部分」)またはそれらの一本鎖を含んでいる。抗体は、ジスルフィド結合で相互に連結された、少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含んでなる糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)および重鎖定常領域で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)および軽鎖定常領域で構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。VHおよびVL領域は、さらに、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性領域に細分化することができ、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる保存性の高い領域が散在している。
Lrg1を介して血管増殖が生じるような、いかなる疾患も、原則的に本発明にしたがって治療、予防もしくは改善することができる。本明細書で使用される「血管増殖」「血管増殖性の」「血管増殖性疾患」および同様の用語は、血管、または血管組織もしくは細胞の、異常な、または望ましくない発達に関わる、ありとあらゆる病変を含んでいる。新血管形成および血管内皮細胞増殖を予防もしくは軽減することができるので、たとえば、(新血管の形成、たとえば既存の血管からの新たな毛細管の成長による)病気を引き起こす可能性のある血管形成も、ならびに血管奇形(たとえば、毛細血管拡張症、拡張し、蛇行した、機能不全の血管の形成、毛細血管瘤)も、予防もしくは軽減することができる。また、当技術分野で知られているように、腫瘍性成長は、増大する腫瘍に血液を供給するために新血管の形成を必要とする。したがって、Lrg1を介した血管増殖が起こる腫瘍も、本発明にしたがって治療、予防もしくは軽減することができる疾患である。
本発明のアンタゴニストは、典型的には製薬上許容されるキャリアとともに製剤して、医薬組成物とする。
上記のように、本発明のLrg1アンタゴニストは、任意の他の適切な活性化合物と併用して投与することができる。詳細には、Lrg1およびVEGFの両者の拮抗作用は病気を引き起こす可能性のある血管新生を減少させるので、Lrg1アンタゴニスト、特に、抗VEGF抗体、たとえばアバスチンおよび/またはルセンティスな、および/または受容体に基づくVEGFトラップ、たとえばアフリベルセプトなど。
網膜疾患についてさまざまな動物モデルがあるが、これらは遺伝的起源および細胞起源は異なるにもかかわらず、異常な血管反応を示し、この血管反応には血管形成だけでなく、他の血管変化、たとえば毛細血管拡張症(拡張し、蛇行した、機能不全の血管)も含まれる。網膜血管リモデリングの生物学的基礎について新たな知見を得るために、本発明者らはこうした4つのモデルで研究を行うことで(図1)、病気を引き起こす可能性のある網膜微小血管における遺伝子の発現差異を正常対照の微小血管と比較して検討した。血管異常が現れる段階に相当する時点で、野生型(WT)マウス、網膜ジストロフィー(RD)1マウス、Curlytail(CT)マウス、および超低比重リポタンパク質受容体(VLDLR)ノックアウトマウスから摘出し浄化した微小血管断片を調べた。3つのマウスモデルから単離されたRNAに関するマイクロアレイ遺伝子発現解析(Affymetrix)は、罹患した網膜由来の微小血管においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた、全モデルに共通の63個の遺伝子を明らかにした(図10)。血管リモデリングに関する3つのマウスモデルの網膜血管系において、発現に差異のある63個の遺伝子のうち、ロイシンリッチα-2-糖タンパク質-1(Lrg1)は、もっとも重要であると評価された(FDR解析後に)。Lrg1は、タンパク質-タンパク質相互作用、シグナル伝達、ならびに細胞の接着および発生に関与する、タンパク質のロイシンリッチリピートファミリーの、分泌型糖タンパク質である(図2)。
マウスモデルの網膜におけるLrg1の発現増加は、まず、定量PCRによって検証した。WT、RD1、CTおよびVLDLR-/-マウスの網膜全体からmRNAを抽出し、リアルタイム定量PCR(qRTPCR)に供した。マイクロアレイ解析で示されるように、対照モデルと比較すると、網膜血管病変の3モデルにおいて、Lrg1の転写産物発現が有意に(p<0.05)増加していることが、qRTPCRによって実証された(図3A)。mRNAの増加が結果としてタンパク質発現の増加につながることを確認するために、本発明者らは次に、遺伝子発現実験と同一の時点で網膜を取り出し、その組織を、ウェスタンブロットによるタンパク質分析用に調製した(図3B)。デンシトメトリー分析によるウェスタンブロットデータ(n > 3)の半定量化は、ハウスキーピングタンパク質(GAPDH)と比較して、Lrg1タンパク質発現の有意な増加を明らかにした(p<0.05)。網膜血管系におけるLrg1の分布を決定し、網膜の他の細胞がLrg1を発現するかどうか確認するために、本発明者らは、in situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学的検査を行って、それぞれLrg1 mRNAおよびタンパク質を検出した。正常なマウスにおいて、Lrg1 mRNA(図3C)およびタンパク質(図3D)は、大部分が血管系によって発現された。
Lrg1の生物学に関しては、ほとんど何もわかっていない。多くの疾患においてTGFβ1、TGFβRIIおよびLrg1の発現レベルが同時に増加することが、いくつかの報告に記載されている(Sun et al., 1995; Li et al., 2007)。内皮細胞におけるTGFβシグナル伝達の機能不全が、遺伝性出血性毛細血管拡張症(HHT)という病気をもたらすので、上記は特に密接な関係がある。毛細血管拡張症などの血管異常を特徴とする、こうした疾病群において、TGFβ内皮補助受容体エンドグリンおよびTGFβI型受容体ALK1における変異は、HHT1(McAllister et al. 1994)およびHHT2(Johnson et al. 1995)をそれぞれ引き起こす。さらに、VLDLR-/-マウスにおいて、網膜組織ではTGFβmRNAが有意に増加しているが、RPEまたは微小血管ではそうではないという趣旨の、試験的なデータがある。さらによく当てはまることに、TGFβは、血管リモデリングがよく見られる糖尿病性網膜症患者の網膜において増加していることが明らかになった。
Lrg1がTGFβを介した血管内皮細胞反応に影響を及ぼすかどうかを確認するために、本発明者らは次に、sirRNAを用いてGPNT細胞のLrg1をノックダウンし、それがTGFβを介した細胞増殖に及ぼす影響を測定した。対照細胞において、TGFβは、2時間にわたって内皮細胞増殖の有意な増加(p<0.05)を引き起こす(70%コンフルエント細胞)。siRNAによるGPNT内皮細胞のLrg1のノックダウンは、このTGFβを介した細胞増殖の増加をブロックする(図6AおよびB)。これは、Smad5リン酸化の減少と相関する(図4D)。反対に、Lrg1遺伝子でトランスフェクトされたGPNT細胞では、Lrg1過剰発現が、TGFβに対応した内皮細胞増殖の増強をもたらすことを示す(図6AおよびB)。この増強された反応は、Smad2発現のダウンレギュレーション、およびSmad5リン酸化の増加と相関している(図4E)。これらのデータは、TGFβRII/ALK5受容体複合経路を介したシグナル伝達の減少と符合し、したがって血管病変を引き起こしうるTGFβRII/ALK1シグナル伝達経路の活性化へのシフトと矛盾しない。
Lrg1が内皮細胞においてTGFβシグナル伝達を微調整し、TGFβを介した細胞増殖に影響を及ぼすことが確認されたので、本発明者らは次に、Lrg1が血管形成に影響を与えるかどうかを、標準的なin vitro血管形成アッセイによって判定した。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をMatrigel中で増殖させ、馴化されていない増殖培地、(構成的にLrg1を分泌する)GPNT細胞で馴化された培地、ならびにLrg1を過剰発現するGPNT細胞で馴化された培地に供する。対照培地がLrg1を含有しないのに対して、GPNT培地およびLrg1過剰発現GPNT培地は、それぞれ中程度、および高レベルのLrg1を含有していた(図7B)。血管形成の程度は、Lrg1過剰発現細胞から得られた馴化培地を加えたとき、最大であった(図7AおよびC)。血管新生の増加は、培地におけるLrg1タンパク質発現と相関していた。
本発明者らは次に、TGFβにより誘導される内皮細胞のSmad5リン酸化を、抗Lrg1抗体を用いて、またはLrg1由来ペプチド配列によって、ブロックすることができるかを確認した。Lrg1配列のロイシンリッチリピート領域に由来するペプチド(付表2のL1-24およびL169-192、もしくは付表3のL94-117およびL262-285)(タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると考えられている)、ならびに高度に保存されたロイシンリッチC末端ドメインに由来するペプチド(付表2のL227-252もしくは付表3のL320-345)を作製した(付表2)。GPNT細胞におけるLrg1過剰発現は、結果としてSmad5リン酸化をもたらさなかった。対照細胞の5 ng/ml TGFβによる処理は、Smad5リン酸化の有意な増加をもたらす。Lrg1過剰発現細胞において、Smad5リン酸化に及ぼすTGFβの影響は有意に強められる。Lrg1過剰発現内皮細胞を抗Lrg1ポリクローナル抗体で同時に処理すると、Smad5リン酸化のレベルが減少するので、この抗体がLrg1の相互作用を妨げる能力を有することが示唆される。ペプチドとの同時処理の影響はさまざまで、付表2のペプチドL1-24(付表3のL94-117)はSmad5リン酸化に何の影響も与えず、付表2のペプチドL169-192(付表3のL262-285)は部分的な影響を与えたが、付表2のペプチドL227-252(付表3のL320-345)(図5)は劇的な阻害効果を示した。3つのペプチドをすべて組み合わせると、TGFβを介したSmad5リン酸化はほぼ完全に消失した。これらのデータは、Lrg1がTGFβを介したシグナル伝達を微調整する、ならびに、Lrg1アンタゴニストを治療薬として使用することができる、という仮説を支持する。
次にin vivo血管形成におけるLrg1の役割を検討した。頸椎脱臼により屠殺したP14 Lrg1ノックアウトマウス、または野生型同腹仔対照から胸部大動脈を摘出し、直ちに氷冷した無血清OPTI-MEM(Invitrogen)を入れた培養皿に移した。大動脈周囲の繊維脂肪組織を細い顕微解剖用のはさみで注意深く取り除いた。長さ1 mmの大動脈輪を切開し、DMEM, pH 7.4中で調製されたラット尾部コラーゲンIゲル(1.5 mg/ml)に包埋した。大動脈輪を含有するコラーゲンゲルを96ウェルプレート中で7日間37℃に保った。各ウェルには、2.5% FCS、100 U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを添加した内皮細胞基本培地が入っていた。画像はOlympus顕微鏡で撮影した。
ブルッフ膜を、Lrg1ノックアウトマウスまたは野生型同腹仔対照のそれぞれの眼の視神経を取り囲む3カ所で、レーザーにより破断した。ブルッフ膜裂傷部位のCNV病変をレーザー処置の1週間後にin vivo蛍光眼底血管造影(FA)により測定した。蛍光は腹腔内注入により投与した。7分の間隔をおいて初期および後期の眼底血管造影図が得られた。初期の血管造影図は、注入の90秒後に得られ、脈絡膜新血管形成の大きさを示している。後期血管造影図は、脈絡膜新生血管膜からの漏出を示す。
生後7日(P7)のLrg1ノックアウトマウスおよび野生型同腹仔対照は、哺育する親マウスとともに、酸素過剰(75%酸素)に5日間暴露したが、これは、その新生マウスにおいて、網膜血管発達の有意な阻害をもたらす。生後12日(P12)にマウスは酸素正常状態に戻され、その時、低酸素で血管のない網膜は、正常な血管再増殖および病的な新血管形成をともに引き起こすが、これは生後17日(P17)にピークとなる。網膜を摘出し、固定して、イソレクチン-B4によるホールマウント免疫染色に供した(図13A)。血管の再増殖は無血管面積を全網膜面積と比較することによって数値化した。新血管形成は、新生血管網の面積を手作業で測定することによって数値化した。
in vitro管形成アッセイは、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を用いてMatrigel中で行った。96ウェルプレートを、ウェル当たり60μlのMatrigelでコーティングした。各ウェルを、100 nMの(Lrg1糖タンパク質全体に対する)抗ヒトポリクローナルLrg1抗体、100 nM IgGアイソタイプ、または同量の抗体溶出バッファーの存在下で、37℃、5% CO2にて16時間、15,000 HUVECを含有する100μl EGM2培地で処理した。細胞を洗浄し、固定した。管形成は、中和抗体である抗ヒトLrg1ポリクローナル抗体の添加によって、抗体溶出バッファー添加(p<0.01)または無関係なIgG抗体の添加(p<0.05)と比べて、有意に減少した。管形成は、分岐点の数(図14A)、管の数(図14A)および管の全長(図14B)で評価した。
ヒト網膜の免疫組織化学分析を行って、網膜血管系においてLrg1の染色を検出した(図15A)。硝子体液のサンプルは非糖尿病患者およびPDR患者から得られた。硝子体液サンプル中に存在するLrg1を、ウェスタンブロッティングによって測定し、デンシトメトリー分析で数値化した(図15B)。PDR患者の硝子体液では非糖尿病患者と比べて、Lrg1は有意に増加していた(p<0.01)。硝子体液サンプル中に存在するTGFβもウェスタンブロッティングによって測定し、Lrg1と同様に数値化した(図15C)。TGFβもPDR患者において有意に増加していた(p<0.01)。
ロイシンリッチα2糖タンパク質1(Lrg1)は、リモデリングされた網膜血管において最大の変化倍率を示した。ヒトおよびマウスLrg1のアラインされたアミノ酸配列。ロイシンリッチリピート領域は赤色、ブロッキングペプチドとして使用されたヒトC末端ドメイン領域は緑色で示す。
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US 2007/0184503。
ヒトLrg1の配列
配列番号1 −ヒトLrg1のDNA配列
[配列番号2のタンパク質をコードする配列は太字で下線を付してあり、下記配列番号1内にある]
配列番号2 −ヒトLrg1のアミノ酸配列
[配列番号3-5の配列は太字で下線を付してあり、下記配列番号2 内にある]
配列番号3-5 −Lrg1内のペプチドのアミノ酸配列
配列番号3 −付表2からのヒトLrg1のアミノ酸1-24 (付表3からのL94-117)
L1-24/L94-117: LQELHLSSNGLESLSPEFLRPVPQ
配列番号4 −付表2からのヒトLrg1のアミノ酸169-192(付表3からのL262-285)
L169-192/L262-285: LDMLDLSNNSLASVPEGLWASLGQ
配列番号5 −付表2からのヒトLrg1のアミノ酸227-252(付表3からのL320-345)
L227-252/L320-345: KMFSQNDTRCAGPEAVKGQTLLAVAK
Claims (16)
- ロイシンリッチα2糖タンパク質1(Lrg1)のアンタゴニストを含む、血管増殖性疾患の治療または予防のための医薬組成物であって、該アンタゴニストが、Lrg1に結合する抗体である、上記医薬組成物。
- 前記アンタゴニストが、TGFβシグナル伝達複合体において、
(a) アクチビン受容体様キナーゼ1(ALK1)とLrg1との相互作用;
(b) Lrg1とTGFβ受容体II(TGFβRII)との相互作用;および/または
(c) Lrg1とTGFβとの相互作用
をブロックする、請求項1に記載の医薬組成物。 - 前記アンタゴニストによる前記ブロックがALK1とLrg1との相互作用を減少させ、それによってALK1とTGFβ受容体II(TGFβRII)との相互作用が低下しかつTGFβRIIとアクチビン受容体様キナーゼ5(ALK5)との相互作用が促進され、それによりALK1活性化シグナル伝達カスケードにおけるTGFβの効果が、ALK5活性化シグナル伝達カスケードにおけるTGFβの効果と比べて低下する、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 疾患の治療に使用するための、請求項1〜4のいずれか1つに記載の医薬組成物であって、その疾患において前記血管増殖性疾患が、新血管形成、血管内皮細胞増殖、血管新生、毛細血管拡張症、または毛細血管瘤を含む、前記医薬組成物。
- 眼の血管増殖性疾患の治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 眼の疾患の治療に使用するための、請求項6に記載の医薬組成物であって、その疾患が糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、黄斑部毛細血管拡張症、加齢黄斑変性、または脈絡膜血管新生から選択される、前記医薬組成物。
- 血管増殖を示す腫瘍の治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 腫瘍の治療に使用するための、請求項8に記載の医薬組成物であって、その腫瘍が脳腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、大腸腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頸部腫瘤、骨腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍、および肝臓腫瘍から選択される、前記医薬組成物。
- 抗血管形成化合物と併用して使用するための、請求項1〜9のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 前記抗血管形成化合物が血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアンタゴニストである、請求項10に記載の医薬組成物。
- 前記VEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記VEGFアンタゴニストが受容体に基づくVEGFトラップである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記受容体に基づくVEGFトラップがアフリベルセプトである、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記抗VEGF抗体がアバスチンまたはルセンティスである、請求項12に記載の医薬組成物。
- 血管増殖性疾患の治療もしくは予防のための薬剤の製造におけるLrg1アンタゴニストの使用であって、該アンタゴニストが、Lrg1に結合する抗体である、上記使用。
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