JP5717021B2 - 血管新生誘導分子 - Google Patents
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Description
1.LRGからなる血管新生誘導分子。
2.前項1に記載の血管新生誘導分子を有効成分として含む血管新生誘導剤。
3.前項1に記載の血管新生誘導分子を標的とする血管新生阻害分子。
4.抗LRG抗体、LRG発現阻害物質又はLRG拮抗物質のいずれかである前項3に記載の血管新生阻害分子。
5.候補物質とLRGを相互作用させ、LRGによる血管新生誘導能を測定し、当該血管新生誘導能を低減しうる物質を選別することを特徴とする、血管新生阻害分子のスクリーニング方法。
6.血管新生誘導能が、ヒト血管内皮細胞と線維芽細胞を共培養した培養系における管腔形成能を指標とする前項5に記載のスクリーニング方法。
7.前項3若しくは4に記載の血管新生阻害分子、又は前項5若しくは6に記載のスクリーニング方法により選別された血管新生阻害分子を有効成分として含む血管新生阻害剤。
8.前項7に記載の血管新生阻害剤からなる抗炎症剤。
i)本発明のLRGタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAポリマーを宿主内で発現することができる複製可能又は組込み可能発現ベクターを調製し;
ii)該ベクターで宿主細胞を形質転換し;
iii) 該形質転換された宿主細胞を、前記DNAポリマーの発現が前記タンパク質を生産することができる条件下で培養し;そして
iv)該タンパク質を回収する。
1)LRGの調製
血管新生に対するLRGの影響を調べるため、COS-7細胞にヒトLRG遺伝子を導入し、培養上清から遺伝子組み換えヒトLRGを大量精製した。まず、ヒト肝臓癌細胞株であるHepG2よりQIAGENRN(R) easy mini kitTM(キアゲン社)を用いてtotal RNAを抽出・精製し、Quantitect reverse transcriptase kitTM(キアゲン社) を用いてcDNAに逆転写した。ヒトLRGのcDNAはHepG2のcDNAライブラリーよりPCR法にて増幅した。PCR法のプライマーは、以下の配列番号1及び2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。PCR法のDNAポリメラーゼとして、KOD plusTM (TOYOBO社)を使用した。PCRは94℃2分、(94℃15秒、53℃30秒、68℃90秒)×35サイクル行った。
Reverse primer(5'-CTGGGACTTGGCCACTG-3')(配列番号2)
5mMイミダゾール/PBS/pH8.0・・・1ml×15フラクション
10mMイミダゾール/PBS/pH8.0・・・1ml×15フラクション
200mMイミダゾール/PBS/pH8.0・・・1ml×10フラクション
各イミダゾール濃度のフラクションで吸光度(OD280)が0.1以上のフラクションをそれぞれ集め、透析チューブに入れてPBSで透析した。透析後、DCTM Protein assay (BioRad社)により濃度を測定した。
血管新生キット(クラボウ製)を用い、取扱説明書に従って上記得た精製LRGについての血管新性能を確認した。陽性コントロールとして、血管新生促進剤(VEGF-A, 10ng/ml 250μl)(製品番号KZ-1350)を用いた。血管新生キットには、血管新生確認用細胞(正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞HUVECと正常皮膚繊維芽細胞NHDFを共培養し、管腔形成初期段階である細胞)、血管新生専用培地及び必要なプレート等が含まれる。また、管腔形成の確認のために、別途管腔染色キット(CD31染色用)(製品番号KZ-1225)を用いた。本染色キットにより、HUVEC細胞のCD31(PECAM-1)が染色され、管腔観察が容易となる。
上記の結果、LRG 3μg/mlで、VEGF-A 10ng/mlと同等以上の血管新生誘導能が認められた(図1参照)。
ヒト炎症性組織アレイ(provitro社)の組織マイクロアレイを用いて関節リウマチ滑膜組織におけるLRGの発現を免疫組織化学染色にて評価した。その結果、健常者の滑膜組織に比べて、関節リウマチ患者の滑膜組織において、有意にLRGの発現が認められた(図2参照)。
ヒト炎症性組織アレイ(provitro社)の組織マイクロアレイを用いてクローン病腸粘膜組織におけるLRGの発現を免疫組織化学染色にて評価した。その結果、健常者の腸粘膜組織に比べて、クローン病患者の腸粘膜組織において、有意にLRGの発現が認められた(図3参照)。
Claims (3)
- ロイシンリッチα2グリコプロテイン(LRGタンパク質)を有効成分として含むことを特徴とする血管新生誘導剤。
- 候補物質とLRGタンパク質を相互作用させ、LRGタンパク質による血管新生誘導能を測定し、当該血管新生誘導能を低減しうる物質を選別することを特徴とする、血管新生阻害剤のスクリーニング方法。
- 血管新生誘導能が、ヒト血管内皮細胞と線維芽細胞を共培養した培養系における管腔形成能を指標とする請求項2に記載のスクリーニング方法。
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