MX2012012735A - Deteccion y modulacion de formacion de vasos linfaticos mediados por la proteina slit y roundabount (robo), y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno mediado por una proteína Slit, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente para modular o prevenir interacciones entre la proteína Slit y una proteína Robo, en donde el trastorno comprende la formación de vasos linfáticos. La invención además divulga una composición para prevenir o tratar un trastorno mediado por la proteína Slit y un método de prognosis o diagnóstico de una enfermedad o trastorno mediado por la proteína Slit.

Description

DETECCIÓN Y MODULACIÓN DE FORMACIÓN DE VASOS LINFÁTICOS MEDIADOS POR LA PROTEÍNA SLIT Y ROUNDABOUNT (ROBO) , Y USOS DE LO MISMO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La invención se refiere en general a reactivos y métodos para evitar, tratar o diagnosticar una enfermedad o un desorden asociado con las rutas de señalización Slit-Robo; particularmente la invención se refiere a métodos y reactivos para tratar progreso de cáncer y metástasis de cáncer.

Técnica Previa La metástasis de cáncer en cánceres avanzados es una causa principal de mortalidad en pacientes de cáncer. Una gran cantidad de esfuerzos se han dirigido a investigación y terapia de cáncer, particularmente los mecanismos subyacentes a crecimiento de cáncer y metástasis. Sin embargo, el mecanismo molecular responsable por metástasis de cáncer todavía no se comprende bien. En general, las células de cáncer hacen metástasis por invasión de tejidos locales. Una vez que las células de cáncer se desprenden de sus sitios primarios, pueden entrar al sistema circulatorio y sistema linfático, por lo cual las células de cáncer viajan entonces a diferentes sitios, en donde pueden establecer nuevo crecimiento. El hecho de que las células de cáncer a menudo se someten a metástasis en los nodos linfáticos sugiere que el sistema linfático juega un papel importante en la metástasis de los cánceres .

El sistema linfático es importante para mantener balance de fluidos en el cuerpo, respuesta inmune, y absorción de ácidos grasos. Además de estas funciones fisiológicas normales, el sistema linfático también está involucrado en reacciones de inflamación e hinchado de fluidos linfáticos. En pacientes con tumores metastásicos , se observan frecuentemente aumentos significantes en formación de vasos linfáticos. Estas observaciones sugieren la importancia del sistema linfático para facilitar metástasis de cáncer. Sin embargo, no es totalmente claro como el sistema linfático juega un papel en metástasis de cáncer.

Debido a que los sistemas linfoides están involucrados en metástasis de cáncer, hacer blanco en metástasis linfática de tumor, por lo tanto representa un enfoque racional a tratamiento de cáncer.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se refiere a métodos para evitar o tratar un desorden mediado por una proteína Slit. Un método de acuerdo con una modalidad de la invención para evitar o tratar un desorden mediado por una proteína Slit, incluye administrar a un sujeto una cantidad terapéutica efectiva de un agente que modula o evita interacciones entre la proteína Slit y una proteína Robo, en donde el desorden involucra formación de vasos linf ticos. El agente puede ser un anticuerpo contra la proteína Slit, un anticuerpo contra la proteína Robo, un fragmento del dominio extracelular de la proteína Robo, o una proteína de fusión de un fragmento del dominio extracelular de la proteína Robo. La proteína Slit puede ser Slit2. La proteína Robo puede ser Robol o Robo4.

Otro aspecto de la invención sé refiere a composiciones para evitar o tratar un desorden mediado por una proteína Slit. Una composición para evitar o tratar un desorden mediado por una proteína Slit incluye un agente que puede modular o interferir con interacciones entre la proteína Slit y una proteína Robo, y un excipiente, portador o solvente farmacéutico aceptable, en donde el desorden involucra formación de vasos linfáticos. El agente puede ser un anticuerpo contra la proteína Slit, un anticuerpo contra la proteína Robo, un fragmento del dominio extracelular de la proteína Robo, o una proteína de fusión de un fragmento del dominio extracelular de la proteína Robo. La proteína Slit puede ser Slit2. La proteína Robo puede ser Robol o Robo .

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para pronóstico o diagnóstico de una enfermedad o desorden mediada por una proteína Slit . Un método para pronóstico o diagnóstico de úna enfermedad o desorden mediado por una proteína Slit incluye: (a) obtener una muestra de prueba de un sujeto de prueba y estimar o evaluar los niveles de expresión de una proteína Slit, una proteína Robo, o tanto la proteína Slit como la proteína Robo en la muestra de prueba; (b) obtener una muestra de control de un sujeto que no tiene la enfermedad o desorden y evaluar los niveles de expresión de la proteína Slit, la proteína Robo, o tanto la proteína Slit como la proteína Robo en la muestra de control; y (c) comparar los niveles de expresión evaluados en (a) y (b) para obtener un resultado respecto a la enfermedad o desorden mediado por la proteína Slit. La proteína Slit puede ser Slit2. La proteína Robo puede ser Robol o Robo . Los niveles de expresión pueden ser ADN, ARN y/o niveles de expresión de proteína.

Otros aspectos y ventajas de la invención serán aparentes de la siguiente descripción y reivindicaciones anexas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la expresión de Slit2 en cánceres, (a) Inmunotransferencia de lisados celulares de diversas líneas celulares de cáncer con anti-Slit2 Ab. Las células Slit2/293 se emplean como el control positivo mientras que las células V/293 se emplean como el control negativo, (b) Tinción inmunohistoquímica de cánceres humanos con anti-Slit2 Ab. Flechas indican la expresión de Slit2 en células de tumor. La escala de barras, 100 µ?? para el panel superior y 10 µ?? para el panel inferior, respectivamente, (c) Los gradientes Slit2 en carcinoma invasivo de mama humana visualizados por la tinción con anti-Slit2 Ab. Flechas indican los micro-vasos dentro de tumores. Escalas de barras, 100 µp? para el panel superior y 40 pm para el panel inferior, respectivamente.

La Figura 2 muestra la construcción de ratones transgénicos Slit2, (a) Un diagrama del vector de expresión Slit2 humano (hSlit2) empleado para la construcción de ratones transgénicos, (b) Hibridización punto de los ratones transgénicos hSlit2 recientemente generados, indicando hSlit2-positivo en el ratón #9, (c) Análisis de transferencia Southern de los ratones transgénicos hSlit2 recientemente generados, indicando hSlit2-positivo en ratón #9, (d) Análisis de inmunotransferencia para la expresión hSli2 en tejidos de páncreas de los ratones transgénicos hSlit2 utilizando el anticuerpo monoclonal 5A5. La IgG isotípica se emplea como un control negativo. Células hSlit2/293 se emplean como un control positivo. (e) Análisis de inmunotransferencia de expresión de hSlit2 utilizando anticuerpo monoclonal M2 específico para la proteína FLAG, (f) Análisis PCR para, la expresión FLAG en los ratones transgénicos Slit2-positivos . Ratones C57 se emplean como un control negativo, (g) Sin expresión hSlit2 en el tejido de páncreas de un ratón normal (panel izquierdo superior) , el resto de los paneles muestra la expresión positiva de hSlit2, insulina, robol, y vWF en tejidos de páncreas de ratones transgénicos Ripl-Tag2 utilizando análisis inmunohistoquímico, (h) La expresión de la proteína hSlit2 determinada por análisis inmunohistoquímico es superior en los tejidos de páncreas de ratones transgénicos hSlit2/Ripl-Tag2 que los ratones Ripl-Tag2. * p < 0.05; barra de escalas: 10 'µt?.

La Figura 3 muestra que Slit2 promueve el crecimiento de tumor pancreático. Comparación entre ratones transgénicos Ripl-Tag2 y Slit2/Ripl-Tag2 en términos de (a) número de isletas pancreáticas angiogénicas, (b) volumen de tumor, (c) número de tumor, (d) conteo de leucocitos en páncreas y sangre, (e) -Tinción de florescencia de los tumores pancreáticos en los ratones transgénicos. (f) Tinción de Hematoxilina y Eosina (HE) de los tumores pancreáticos en los ratones transgénicos. Tanto tinción de florescencia como tinción de HE muestran el mayor tamaño de tumor y más vasos sanguíneos en ratones transgénicos Sli2/Ripl-Tag2 que los ratones transgénicos Ripl-Tag2. Comparación entre los ratones transgénicos Sli2/Ripl-Tag2 y los ratones transgénicos Ripl-Tag2 en (g) la densidad de vasos sanguíneos, (h) índice de proliferación, y (i) índice de apoptosis como se determina por el análisis inmunohistoquímico, indicando que los ratones transgénicos Sli2/Ripl-Tag2 tienen más angiogénesis , superior proliferación, y reducida apoptosis que los ratones transgénicos Ripl-Tag2. Barra de escala: 50 pm; *: p < 0.05; ** : p < 0.01.

La Figura 4 muestra la formación de vasos linfáticos y metástasis linfática de tumor en los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2. La Slit2-sobreexpresión de ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 muestra (a) neovascularización linfática intestinal de tumor (indicada por flechas) , (b) tumores dentro de los vasos linfáticos por tinción HE (indicada por flechas) , y (c) Tinción LYVE-1 de los nodos linfoides intestinales. Tinción LYVE-1 es para detectar las células endoteliales de los vasos linfáticos. Hay más células endoteliales linfáticas en los tejidos periféricos del páncreas en los ratones transgénicos Slit2/Rip-1-Tag2 (d, e, f) que en los ratones transgénicos Ripl-Tag2 como se determina por análisis inmunohistoquímico (g, h, i) . La proliferación de células endoteliales linfáticas en el páncreas, es superior en los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 (1) que en los ratones C57 tipo silvestre (j) y los ratones transgénicos Ripl-Tag2 (k) como se determina por tinción de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo anti-LYVE-1. La expresión de Robol y LYVE-1 en las células endoteliales linfáticas en el páncreas se determina por análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpo anti-Robol (m) y anticuerpo anti-LYVE-1 (n) . La superposición de expresión de Robol y LYVE-1 se muestra (o) . LN: Nodo linfoide; C: tejido de tumor; *: p < 0.05; Barras de escala: 1 mm (j-1) y 100 pm (el resto de paneles) .

La Figura 5 muestra que la proteína recombinante Slit2 promueve migración y formación de vasos de células endoteliales linfáticas humanas. La expresión Robol en la membrana celular de las células endoteliales linfáticas (a, panel izquierdo (Rb7) ; panel derecho (R4) ) . (b) Si sube la densidad de vasos linfáticos en la periferia del páncreas en ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 es 1.5-veces superior que en los ratones Ripl-Tag2. La proteína Slit2.1 recombinante promueve migración de células endoteliales linfáticas (c) y formación de vasos (d, e) . La migración y formación de vasos puede inhibirse específicamente por R5 (c, d, y e). "Ninguno" indica un control negativo. VEGF-C sirve como un control de posición. Barra: 25 µp?; *: p < 0.05; **: p < 0.01.

La Figura 6 muestra (A) interacción de proteínas hRobo-Fc y hSlit2; (B) R5 (un anticuerpo monoclonal liga al primer motivo tipo Inmunoglobulina de proteína Robol) inhibe la interacción de proteínas hRobo-Fc y hSlit2.

La Figura 7 muestra la expresión de una proteína recombinante hRobo-Fc de ~ 85 kD detectada por una IgG anti-humano conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante.

La Figura 8 muestra un análisis funcional del anticuerpo monoclonal anti-Slit2 y su uso en diversos tejidos de tumor humano. Inmunotransferencia se emplea para probar la capacidad de anticuerpos SI y S3 para detectar la longitud completa o fragmentos de la proteína Slit2, (a) SI detecta la proteína Slit2 de longitud íntegra al ligar al N-terminal de la proteína. Anticuerpos 9E10 y S3 detectan Slit2 de longitud íntegra al ligar al C-terminal de la proteína. Los anticuerpos SI y S3 detectan específicamente la proteína Slit2 y el anticuerpo SI también detecta las proteínas Slitl y Slit3 humanas. 9E10 sirve como un control positivo. Anticuerpo monoclonal SI se emplea para detectar la expresión Slit2 en cáncer colorectal y cáncer de mama (b) , cáncer pulmonar primario y su cáncer pulmonar metastásico (c) , y cáncer colorectal con y sin metástasis linfática (d) . mlgG sirve como un control negativo (análisis inmunohistoquímico) . Barra de escala: 10 pm.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Modalidades de la invención se refieren a métodos, composiciones o agentes para evitar, tratar o diagnosticar una enfermedad o desorden mediado por proteínas Slit, particularmente aquellas enfermedades o desórdenes asociados con formación de vasos linfáticos . Las enfermedades o desórdenes mediados por proteína Slit involucran las interacciones entre proteínas Slit y sus receptores, proteínas Robo. Estos desórdenes o enfermedades incluyen metástasis de tumor y/o crecimiento de tumor, tales como metástasis linfática de tumor.

Los inventores de la presente invención han encontrado inesperadamente que las interacciones entre las proteínas Slit y las proteínas Robo (que son receptores de proteínas Slit) resultan en transducción de señal que lleva a formación de vasos linfáticos. Por lo tanto, reactivos que pueden modular o interferir con las interacciones entre las proteínas Slit y sus receptores (proteínas Robo) pueden emplearse para diagnosticar, tratar o controlar formación de vasos linfáticos indeseada, tales como aquellos involucrados en metástasis de cáncer.

Algunas modalidades de la invención se refieren a reactivos para modular o interferir con las interacciones entre proteínas Slit y sus receptores (proteínas Robo) . Estos reactivos pueden ser fragmentos de proteínas o análogos de proteínas Slit o Robo (incluyendo proteínas de fusión o fragmentos de estas proteínas) , o anticuerpos (policlonales , monoclonales o humanizados) contra proteínas Slit o Robo. Algunas modalidades de la invención se refieren a métodos para diagnosticar, evitar o tratar desórdenes mediados por interacciones Slit-Robo, particularmente aquellos que involucran metástasis de cáncer y progreso de cáncer.

Los siguientes ejemplos ilustran modalidades de la invención utilizando Slit2 como un ejemplo de las proteínas Slit y Robol o Robo4 como un ejemplo de las proteínas Robo. Sin embargo, modalidades de la invención también pueden incluir otras proteínas Slit o Robo que están involucradas en transducciones de señal relacionadas a formaciones de vasos linfáticos.

Los genes Slit codifican proteínas secretadas esenciales para el desarrollo neuronal. Estas proteínas funcionan como señales migratorias "neurológicas" . En mamíferos, hay tres genes Slit conocidos, es decir, Slitl, Slit2, y Slit3. Estos genes también expresan en sistemas no nerviosos (Holmes, G. P. et al. Meen. Dev. 79:57-72 (1998)). Por ejemplo, mRNAs para Slit2 y Slit3 (pero no para Slit 1) se encuentran en células endoteliales de rata ( u, J. Y. et al. Nature 410:948-952 (2001)).

De manera estructural, las proteínas Slit poseen cada una 4 secuencias de repetición rica en leucina, 9 dominios funcionales tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF = epidemial growth factor) , un elemento ALPS situado entre el sexto y séptimo dominios funcionales EGF, y un nudo de cisteína en C-terminal. Aunque las proteínas Slit son proteínas solubles, la mayoría de las proteínas Slit2 están asociadas con la superficie celular.

Las proteínas Slit ligan a sus receptores, proteínas Robo (Roundabout) . En conjunto, las proteínas Slit y Robo pueden función como repelentes en guía de axon (Kidd, T. et al. Cell 92:201-215 (1998)) y ramificación (Wang, K.-H. et al. Cell 96:771-784 (1999)), y en migración neuronal (Wu, W. et al. Nature 400:331-336 (1999)). Además, también funcionan como inhibidores endógenos para quimiotaxia de leucocitos (Wu, J. Y. et al. Nature 410:948-952 (2001)).

Siendo inhibidores endógenos para quimiotaxia de leucocitos, las proteínas Slit (por ejemplo, Slit2) juegan un papel en inflamación (Wu, J. Y. et al. Nature 410:948-952 (2001) ) . En procesos de inflamación, los leucocitos se conectan a las células endoteliales en los vasos sanguíneos, penetran la pared capilar y llegan a los tejidos de daño o infección. En general se considera que el enlace y penetración de leucocitos están bien coordinados en tiempo y ubicación por las acciones de muchas moléculas, tales como factores quimiotácticos , moléculas de adhesión celular, proteínas de citoesqueleto y metaloenzimas . Wu et al., muestran que Slit2 puede inhibir quimiotaxia de leucocitos inducida por factores quimiotácticos in vitro. Aún más, la inhibición de quimiotaxia de leucocitos por Slit2 puede ser bloqueada por un fragmento extracelular soluble de proteína Robo (RoboN) (Wu et al, Nature, 410:948, 2001), demostrando que la inhibición de quimiotaxia de leucocitos por Slit2 es mediada por las rutas de señal mediada de receptor Robo.

Proteínas Robo son proteínas transmembrana con un solo dominio transmembrana. Funcionan como receptores de proteínas Slit (por ejemplo, Slit2) . Hay cuatro genes Robo, robol, robo2, rig-1 y robo4, en mamíferos. Las proteínas Robo también expresan fuera del sistema nervioso (Piper, . et al., Meen. Dev. 94: 213-217 (2000)). Por ejemplo, Robol RNA se encuentra en leucocitos de ratón (Wu, J. Y. et al., Nature 410:948-952 (2001)). Además, células endoteliales humanas expresan Robo4 (Huminiecki, L. et al. Genomics . 79:547-552 (2002) ) .

Por enlace de los ligandos (es decir, proteínas Slit) , los receptores Robo transducen señales intracelulares que llevan eventualmente a acciones inhibitorias en diversos procesos biológicos, incluyendo guía de axones y ramificación, migración neuronal y quimiotaxia de leucocitos.

Como se notó anteriormente, proteínas de familia Robo son proteínas de transmembrana, que tienen un solo dominio de transmembrana. Estructuralmente , los dominios extracelulares de Robo 1, Robo2 , y Robo3 cada uno tiene 5 dominios tipo inmunoglobulina (tipo Ig) y 3 secuencias fibronectina tipo III. Los dominios intracelulares contienen muchos sub-dominios estructurales, incluyendo secuencias CCO, CC1, CC2 , y CC3. Robo4 es más pequeño y tiene 2 dominios tipo inmunoglobulina en su dominio extracelular, y contiene secuencias CCO y CC2 en su dominio intracelular .

Se ha mostrado que Slit2 liga al primer dominio tipo inmunoglobulina de Robol a través múltiples interacciones (Chen et al, J Neurosci. 2001 21: 1548-1556). Además, un anticuerpo monoclonal R5, que liga al primer dominio tipo inmunoglobulina de prote na Robol, se muestra que neutraliza la angiogénesis mediada por Slit2 (Wang et al, Cáncer Cell. 2003 4: 19-29), sugiriendo que el enlace específico de Slit2 a Robol es esencial para la angiogénesis mediada por Slit2.

Las proteínas Slit y Robo se han mostrado que están involucradas en diversas actividades biológicas, incluyendo angiogénesis. Sin embargo, los inventores de la presente invención han encontrado inesperadamente que las interacciones Slit-Robo también están involucradas en linfogénesis (es decir, formación de vasos linfáticos) . De manera más importante, los inventores encontraron que ésta formación de vasos linfáticos está involucrada en metástasis de cáncer. Por lo tanto, agentes que pueden interrumpir las interacciones Slit-Robo pueden ser agentes útiles en la prevención y tratamiento de canceres, particularmente en la prevención y tratamiento de metástasis de cáncer.

Slit2 se expresa a altos niveles en diversos tejidos de cáncer (ver FIGURA 1) . En contraste, Slit2 se expresa a niveles bajos o indetectables en tejidos normales o tejidos de proliferación atípica. El hecho de que la expresión de Slit2 se regula por incremento en diversos canceres sugiere que Slit2 puede jugar un papel importante en progreso y/o metástasis de cáncer. Como se describe en las siguientes secciones, Slit2 sin duda juega un papel en progreso y metástasis de cáncer. Un mecanismo posible por el cual Slit2 puede contribuir a progreso y metástasis de cáncer, es al promover formación de vasos linfáticos de tumor .

La posibilidad que Slit2 juega un papel en progreso y metástasis de tumor se ha probado en modelos de animales. Por ejemplo, ratones que expresan alto nivel de Slit2 se generaron, como se ilustra en la FIGURA 2. Cruzar los ratones transgénicos Slit2 con ratones transgénicos Ripl-Tag2, puede desarrollar espontáneamente cáncer pancreático, producir ratones progenitores (ratones Slit2/Ripl-Tag2 ) . Detalles respecto a la construcción de la cepa de ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 se describen posteriormente en la sección de EJEMPLOS. Estos ratones progenitores (Slit2/Rpil-Tag2 ) producen niveles significativamente superiores de Slit2, como se determina por análisis inmunohistoquimico (FIGURA 2h) . Además, estos ratones progenitores exhiben incremento sustancial en formación de nuevos vasos linfáticos, incrementados tamaños de tumor, metástasis de tumor a nodos linfáticos de membrana intestinal (FIGURA 3) . Estos resultados indican que expresión incrementada de Slit2 se asocia con crecimiento de cáncer incrementado e incrementada metástasis de cáncer.

Slit2 promueve el crecimiento y metástasis de cáncer pancreático. Comparación entre ratones transgénicos Ripl-Tag2 y Slit2/Ripl-Tag2 revela que Slit2 aumenta el número de isletas pancreáticas angiogénicas (FIGURA 3a) , volumen de tumor (FIGURA 3b) , y número de tumores (FIGURA 3c) , pero no el conteo de leucocitos en páncreas y en sangre (FIGURA 6d) . La FIGURA 3e muestra tinción de florescencia de los cánceres pancreáticos en ratones transgénicos, mientras que FIGURA 3f muestra tinción de hematoxilina y eosina (HE) de los cánceres pancreáticos en ratones transgénicos . Tanto tinción de florescencia como tinción de HE muestran el más grande tamaño de tumor y más vasos sanguíneos en los ratones transgénicos Sli2/Ripl-Tag2 , en comparación con los ratones transgénicos Ripl-Tag2.

La comparación entre ratones transgénicos Sli2/Ripl-Tag2 y ratones transgénicos Ripl-Tag2 revela que la expresión Slit2 aumenta la densidad de vasos sanguíneos (FIGURA 3g) , mejora el índice de proliferación (FIGURA 3h) , y reduces el índice de apoptosis (FIGURA 3i) , como se determina por análisis inmunohistoquímico . Estos resultados indican que los ratones transgénicos Sli2/Ripl-Tag2 tienen más angiogénesis , superior proliferación, y reduce el potencial de apoptosis, en comparación con los ratones transgénicos Ripl-Tag2.

La observación de que la expresión Slit2 aumenta el número de tumores sugiere una posibilidad de que también puede estar involucrada en la metástasis de tumor. Esta posibilidad se prueba respecto a los efectos de Slit2 en formación de vasos linfáticos debido a que los sistemas linfáticos se consideran involucrados en la mayoría de las metástasis de tumores.

La FIGURA 4 muestra que la sobre expresión de Slit2 en los ratones Sli2/Ripl-Tag2 sin duda resulta en incrementada formación de vasos linfáticos y metástasis linfática de tumor. Los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 exhiben incrementada formación de vasos linfáticos intestinales de tumor (FIGURA 4a) ; indicado por las flechas) , asi como un número incrementado de células de tumor dentro de los vasos linfáticos, como se revela por tinción HE (FIGURA 4b; indicado por flechas) . La FIGURA 4c muestra los nodos linfoides intestinales, como se revela por inmuno tinción LYVE-1 positiva, en las células endoteliales de los vasos linfáticos.

Además, los ratones transgénicos Slit2/Rip-1-Tag2 tienen más células endoteliales linfáticas en los tejidos periféricos del páncreas, en comparación con ratones transgénicos Ripl-Tag2 (Figuras 4g, 4h, y 4i) . La proliferación de células endoteliales linfáticas en el páncreas, como se determina por tinción de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo anti-LYVE-1, también es superior en los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 (FIGURA 41) , en comparación con ratones C57 tipo silvestre (FIGURA 4j) y ratones transgénicos Ripl-Tag2 (FIGURA 4k) . Estos resultados indican que la sobre expresión de Slit2 puede inducir formación de vasos linfáticos y promover metástasis linfática de cáncer.

Los papeles de Slit2 para inducir formación de vasos linfáticos de tumor se soportan adicionalmente por la observación de que la migración inducida por Slit2 y formación de vasos de células endoteliales linfáticas pueden inhibirse específicamente por R5, un anticuerpo monoclonal contra Robol (ver, Figuras 5c-e) , o por RoboN, un fragmento de dominio extracelular de Robol capaz de ligar a Slit2 (no se muestran datos) . La FIGURA 6 muestra que R5 puede disociar específicamente las interacciones entre el Robol recombinante (hRobo-Fc) (FIGURA 7) y Slit2 (Figuras 6A y 6B) .

Las observaciones anteriores claramente muestran la participación de interacciones Slit-Robo en la formación de vasos linfáticos inducidos por tumor y metástasis linfática de tumor. Por lo tanto, reactivos que pueden interferir con o modular las interacciones entre proteínas Slit y proteínas Robo, pueden emplearse como agentes terapéuticos para evitar o tratar canceres metastáticos o como agentes de diagnóstico para identificar pacientes de cáncer adecuados para ciertos tratamientos de cáncer. De acuerdo con modalidades de la invención, estos reactivos pueden incluir anticuerpos contra las proteínas Slit, anticuerpos contra las proteínas Robo, fragmentos de proteínas que contienen los dominios extracelulares de las proteínas Robo y semejantes. Anticuerpos para uso con modalidades de la invención pueden ser anticuerpo policlonales o monoclonales . Además, estos anticuerpos pueden ser humanizados para reducir complicaciones o rechazos inmunes.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, anticuerpos específicos Robo o fragmento de sitio activo extracelular de proteínas Robo, pueden emplearse para inhibir en forma competitiva las interacciones Slit-Robo, resultando en la inhibición de funciones biológicas mediadas por transducción de señal Slit-Robo. De manera similar, anticuerpos contra las proteínas Slit también pueden emplearse para diagnóstico, prevención o tratamiento de desórdenes mediados por la transducción de señal Slit-Robo. ' De acuerdo con algunas modalidades de la invención, anticuerpos para utilizar en tratar desordenes mediados por Slit pueden ser anticuerpos humanizados que pueden ser empleados en lá clínica con mínima respuesta inmune. Los métodos para humanización de anticuerpos son bien conocidos en la especialidad. Algunas modalidades de la invención se refieren a métodos para producción masiva de estas proteínas recombinantes como agentes terapéuticos . Estos métodos y reactivos se ilustran en los ejemplos descritos a continuación.

Además de evitar o tratar desordenes mediados por proteínas Slit, algunas modalidades de la invención se refieren a métodos para diagnóstico de estos desordenes. Como se anotó anteriormente, niveles de expresión de proteínas Slit se mejoran en diversos canceres. Por lo tanto, la detección de expresión incrementada de proteínas Slit puede indicar la presencia de desórdenes mediados por Slit.

La FIGURA 8 muestra análisis funcional de los anticuerpos mohoclonales anti-Slit2 y su uso en la detección de diversos tumores humanos. Tres anticuerpos, SI, S3, y 9E10 se emplean en estos experimentos. La inmuno transferencia se emplea para estimar la capacidad de anticuerpos SI y S3 para detectar la longitud completa o fragmentos de proteína Slit2. Como se muestra en la FIGURA 8a, SI detecta la proteína Slit2 de longitud completa al ligar al N- terminal de la proteína. Los anticuerpos 9E10 y S3 detectan Slit2 de longitud integra al ligar al C- terminal de la proteína. Los anticuerpos SI y S3 detectan específicamente proteína Slit2 humana y anticuerpo SI también detecta las proteínas Slitl y Slit3 humanas. El anticuerpo 9E10 (obtenido de ATCC) sirve como un control positivo.

Como se muestra en las FIGURAS 8b, 8c, y 8d, el anticuerpo monoclonal SI puede emplearse para detectar la expresión Slit2 en cáncer colorectal y cáncer de mama, (FIGURA 8b) , cáncer pulmonar primario y su cáncer pulmonar metastático (FIGURA 8c) , y cáncer colorectal con y sin metástasis linfática (FIGURA 8d) . Los ejemplos anteriores claramente muestran que anticuerpos contra proteínas Slit pueden emplearse como herramientas de diagnóstico para detectar o pronosticar la presencia o resultado de diversos tumores .

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente modalidades de la invención.

MÉTODOS PARA EVITAR O TRATA UNA ENFERMEDAD O DESORDEN ASOCIADO CON FORMACIÓN DE VASOS LINFÁTICOS MEDIADA CON SLIT2 Como se anotó anteriormente, algunas modalidades de la presente invención se refieren a métodos para evitar o tratar una enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada con Slit2 en un sujeto. Un método de acuerdo con una modalidad de la invención, por ejemplo puede comprender reducir o evitar interacciones Slit2-Robo en un sujeto a un nivel suficiente para evitar o tratar una enfermedad o desorden asociado con formación de vasos linfáticos mediada por Slit2 en el sujeto. Estas enfermedades o desordenes pueden relacionarse a progreso , de cáncer o metástasis de cáncer.

Las interacciones Slit2-Robo (por ejemplo, las interacciones Slit2-Robol o Slit2-Robo4) pueden reducirse por cualesquiera métodos convenientes. Por ejemplo, las interacciones Slit2-Robo pueden reducirse al administrar al sujeto una cantidad efectiva de una sustancia que reduce replicación del gen Slit2, replicación del gen receptor Slit2, trascripción del gen Slit2, trascripción del gen receptor Slit2, combinación o traducción de mRNA receptores Slit2, maduración o tráfico celular de precursor Slit2 o maduración o tráfico celular de precursor de receptor Slit2.

De acuerdo con otras modalidades de la invención, las interacciones Slit2-Robo pueden reducirse o evitarse al administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una sustancia que reduce o bloquea interacciones proteína-proteína Slit2-Robo. Cualquier sustancia conveniente puede emplearse para reducir o bloquear las interacciones proteína-proteína Slit2-Robo. Estas sustancias, por ejemplo, pueden incluir anticuerpos anti-Slit2, anticuerpos anti-Robo o un fragmento de proteína Robo derivado de su dominio extracelular que es capaz de ligar a Slit2. Cualquier anticuerpo anti-Slit2 o anticuerpo anti-Robo puede emplearse para reducir o evitar las interacciones de proteína-proteína Slit2-Robo, incluyendo anticuerpos policlonales, anticuerpo monoclonales, fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 y estos anticuerpos pueden ser humanizados. Además, antagonistas de receptor Robo, que pueden ligar al receptor Robo en forma directa o indirecta, también pueden emplearse. Ejemplos de antagonistas de receptor pueden incluir moléculas pequeñas o análogos de Slit2 que pueden ligar a los receptores Robo sin producir la transduccion de señal normal.

Los métodos de la invención pueden emplearse para evitar o tratar una enfermedad o desorden asociados con cualquier formación de vasos linfáticos mediada por receptor Slit2. Por ejemplo, los métodos de la invención pueden emplearse para evitar o tratar una enfermedad o desorden asociados con cualquier formación de vasos linfáticos mediada por Slit2-Robol o Slit2-Robo4. Las interacciones Slit2-Robol o Slit2-Robo4 pueden ser reducidas por cualesquiera métodos convenientes. De preferencia, las interacciones Slit2-Robol o Slit2-Robo4 pueden reducirse o evitarse al administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una substancia que reduce o evita interacciones proteína-proteína Slit2-Robol o Slit2-Robo4. Esta substancia ejemplar pueden ser un anticuerpo anti-Slit2, un anticuerpo anti-Robol, un anticuerpo anti-Robo4 , o un fragmento Robol o Robo4 derivado de dominio extracelular de Robol o Robo4 , que es capaz de ligar a Slit2.

Cualquier anticuerpo anti-Slit2 conveniente puede emplearse, incluyendo el anticuerpo anti-Slit2 descrito en Hu, Neuron August 1999; 23(4):703-l 1. Similarmente , cualquier anticuerpo anti-Robol puede emplearse, incluyendo el anticuerpo anti-Robol descrito en Hivert et al, Mol Cell Neurosci December 2002; 21 (4 ): 534-45. De preferencia, el anticuerpo anti-Robol es un anticuerpo contra el primer dominio de inmunoglobulina de Robol. Más preferiblemente, el anticuerpo contra el primer dominio de inmunoglobulina de Robol es R5. Cualquier fragmento Robol conveniente derivado del dominio extracelular de Robol puede emplearse, por ejemplo RoboN.

Una substancia empleada en un método de la invención puede ser administradas por sí misma. De preferencia, la substancia puede ser administrada con un portador o excipiente farmacéutico aceptable.

Métodos de la invención pueden emplearse para evitar o tratar cualquier enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada por Slit2. Estos desórdenes por ejemplo, incluyen cáncer. De preferencia, el cáncer es metastásico. Cánceres, por ejemplo pueden ser melanoma maligno, carcinoma escamoso de vejiga, neuroblastoma, cáncer pulmonar de células pequeñas, adenocarcinoma de colon, carcinoma de células de transición de vejiga, cáncer de mama, carcinoma cístico adenoide de las glándulas salivares, carcinoma hepatocelular o rabdomiosarcoma .

Métodos de la invención pueden emplearse para evitar o tratar cualquier enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada por Slit2 en cualquier sujeto. De preferencia, el, sujeto es un mamífero. Más preferiblemente, el mamífero es un humano.

En algunas modalidades de la invención, el sujeto es un humano y la substancia que se va a administrar al humano puede ser un anticuerpo monoclonal humanizado.

Composiciones Farmacéuticas y Combinaciones para Evitar o Tratar una Enfermedad o Desorden Asociados con Formación de Vasos linfáticos Mediada por Slit2 En otro aspecto, modalidades de la presente invención se refieren a composiciones farmacéuticas para evitar o tratar una enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediados con Slit2 en un sujeto. Estas composiciones farmacéuticas, por ejemplo pueden comprender una cantidad efectiva de una substancia que reduce o evita interacciones Slit2-Robo. Las composiciones farmacéuticas además pueden comprender un portador excipiente farmacéutico aceptable.

Las formulaciones, dosis y rutas de administración pueden ser determinadas de acuerdo con métodos conocidos en la especialidad (ver e.g., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, April 1997; Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Banga, 1999; y Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Hovgaárd and Frkjr (Ed. ) , Taylor & Francis, Inc., 2000; Biopharmaceutical Drug Design and Development, Wu-Pong and Rojanasakul (Ed.), Humana Press, 1999) .

En el tratamiento o prevención de una enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada por Slit2, un nivel de dosis apropiado en general será de aproximadamente 0.01 a 500 mg por kg de peso corporal por día. De preferencia, el nivel de dosis será aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 mg/kg por día. En modalidades más preferidas, el nivel de dosis estará en el intervalo desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg por día. La dosis apropiada puede ser administrada en dosis sencillas o múltiples. Se entenderá que el nivel de dosis específico y la frecuencia de dosis para cualquier sujeto particular pueden variarse y dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de acción de este compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y hora de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la severidad de la condición particular y a la terapia a la que se somete el paciente.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas en forma oral, parenteral, por rocío de inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, mediante recipiente de implante, o cualquier forma de administración conveniente.

En todavía otro aspecto, algunas modalidades de la presente invención se refieren a combinaciones para evitar o tratar una enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada por Slit2 en un sujeto, estas combinaciones pueden comprender: a) una cantidad efectiva de una cantidad terapéutica de la invención que puede reducir o bloquear interacciones Slit2-Robo; y b) una cantidad efectiva de otro agente que puede reducir o bloquear formación de vasos linfáticos.

Para tratar cáncer, cualquier agente anti-neoplasma puede emplearse en una combinación de la presente invención. Ejemplos de agentes anti-neoplasma que pueden emplearse en las composiciones y métodos de la presente invención se describen en la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 2002/044,919. En una modalidad, el agente antineoplasma es un agente anti-angiogénico . El agente anti-angiogénico puede ser un inhibidor de degradación de membrana basal, un inhibidor de migración celular, un inhibidor de proliferación de células endoteliales y un inhibidor de organización tri-dimensional y establecimiento de potencia. Ejemplos de estos agentes anti-angiogénicos se ilustran en Auerbach and Auerbach, Pharmacol . Then, 63: 265-311 (1994); O'Reilly, Investigational New Drugs, 15: 5-13 (1997); J.

Nat'l Cáncer Instil, 88: 786-788 (1996); y las Patente de los E.U.A. Nos. 5,593,990; 5,629,327 y 5,712,291. En otra modalidad, el agente anti-neoplasma empleado es un agente de alquilación, un antimetabolito, un producto natural, un complejo de coordinación de platino, una antracendiona, una urea substituida, un derivado de metilhidrazina, un supresor adrenocortical, una hormona y un antagonista.

Métodos y Equipos para Pronosticar o Diagnosticar una Enfermedad o Desorden Asociados con Formación de Vasos linfáticos Mediada con Slit2 Algunas modalidades de la invención se refieren a métodos para pronosticar o diagnosticar una enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada con Slit2 en un sujeto. Un método de acuerdo con modalidades de la invención por ejemplo puede comprender: a) obtener una muestra de prueba de un sujeto de prueba y estimar el nivel receptor de Slit2 y/o Slit2 (Robo) en la muestra de prueba; b) obtener una muestra de control de un sujeto de control que no tiene una enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada con Slit2 y estimar nivel de receptor Slit2 y/o Slit2 (Robo) en la muestra de control; y c) comparar niveles de receptor Slit2 y/o Slit2 (Robo) en a) y b) , con lo que un nivel elevado de receptor Slit2 y/o Slit2 en el sujeto respecto a nivel de receptor Slit2 y/o Slit2 en el sujeto de control indica que el sujeto de prueba tiene la enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada con Slit2. De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el receptor Slit2 probada en estos métodos puede ser Robol o Robo4. Los niveles de receptor Slit2 y/o Slit2 pueden estimarse a niveles convenientes, por ejemplo a nivel de proteína o ácido nucleico.

Algunas modalidades de la presente invención se refieren a equipos para pronosticar o diagnosticar una enfermedad o desorden asociados con formación de vasos linfáticos mediada con Slit2 en un sujeto, este, equipo comprende: a) medios para obtener una muestra de prueba de un sujeto de prueba y una muestra de control de un sujeto de control; b) medios para estimar niveles de receptor Slit2 y/o Slit2 en las muestras de prueba y control; y opcionalmente, c) medios para estimar y/o comparar niveles de receptor Slit2 y/o Slit2 en las muestras de prueba y control. De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el receptor Slit2 probado puede ser Robol o Robo4.

EJEMPLOS (1) La Expresión de Slit2 en Cánceres Humanos Para explorar las implicaciones de nuestros hallazgos, examinamos si líneas de células de cáncer humano que se originan en diferentes tejidos y órganos expresan Slit2. La Figura la muestra que Slit2 se expresa en células A375 (melanoma maligno) , células SCaBER (carcinoma escamosa de vejiga), células SK-N-SH (neuroblastoma) , células NCI-H446 (cáncer pulmonar de células pequeñas) , células LoVo (adenocarcinoma de colon) , células T24 (carcinoma de células de transición de vejiga) , células ZR-75-30 (cáncer de mama) , células Acc-2 . y Acc-M (carcinoma cístico adenoide de glándulas salivares) , células S MC-7721 (carcinoma hepatocelular) y células A673 (rabdomiosarcoma) . Pero Slit2 aparentemente está ausente en células A549 (cáncer pulmonar) , células HeLa (adenocarcinoma hepitelial cervical) , células CF-7 (adenocarcinoma . de mama) y células 786-0 (adenocarcinoma de células renales primarias) .

El hallazgo de la expresión Slit2 en una variedad de líneas celular de cáncer es consistente con la observación de que Slit2 se expresa en cáncer de próstata detectado por RT-PCR. Además, la Figura Ib muestra que Slit 2 se expresa en melanoma maligno humano, adenocarcinoma mucinoso rectal, carcinoma invasivo de mama, y carcinoma hepatocelular. En forma notable, dentro de secciones de carcinoma de mama, parece que se detecta más tinción de Slit2 en sitios que tienen más células de cáncer y vasos sanguíneos (Figura le) . En contraste, menos tinción de Slit2 se detecta en sitios que tienen menos células de cáncer y vasos sanguíneos. Patrones similares pueden observarse para carcinoma hepatocelular humano, pero no en melanoma maligno o adenocarcinoma mucinoso rectal (datos no mostrados) . Estas correlaciones directas entre la expresión de Slit2 y proliferación de células de vasos sanguíneos/cáncer sugiere un papel significante de la formación de vasos linfáticos de tumor inducidos por Slit2 en la patogénesis de diversos cánceres humanos. (2) Construcción de Ratones Transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 La Figura 2a muestra un vector de expresión que alberga gen Slit2 humano (hSlit2) fusionado con una secuencia de ADN que codifica un segmento Flag dirigido por promotor CMV. Este vector de expresión se emplea para generar 3 cepas de líneas de ratón transgénico Slit2. La presencia de gen hSlit2 en estos ratones transgénicos se confirma por hibridación punto (Figura 2b) y transferencia Southern (Figura 2c) , y expresión de proteína hSlit2 en estos ratones transgénicos se verifica por análisis de inmunotransferencia (Figura 2d) . La expresión de etiqueta Flag (Figura 2e) y la presencia de la secuencia Flag DNA (Figura 2f) se detectan én extractos de tejido de páncreas por transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Flag (M2) y análisis PCR, respectivamente. Estos resultados confirman que cepas de ratón transgénico que expresan hSlit2 se han establecido exitosamente .

La Figura 2g (panel izquierdo superior) muestra que el páncreas de ratones normales no expresa el gen Slit2, mientras que Slit2 se expresa en ratones transgénicos Ripl-Tag2 de 12 semanas de edad (Figura 2h, panel derecho superior) . Además, la expresión de Slit2 se superpone con la expresión de insulina (Figura 2g, panel medio superior) . Estos resultados indican que la expresión de Slit2 se regula por incremento por tumorigénesis pancreática en células ß pancreáticas. Además, mientras que Robol y vWF ambos se expresan en células endoteliales, estas proteínas no se expresan en células ß pancreáticas en ratones transgénicos Ripl-Tag2 (Figura 2g, paneles inferior izquierdo e inferior derecho) .

Para estimar adicionalmente el papel de Slit2 en tumorigénesis, los ratones transgénicos Slit2 se cruzan con ratones transgénicos Ripl-Tag2 para crear ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2. Comparado con los ratones transgénicos Ripl-Tag2 a la misma edad, los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 expresan superiores niveles de proteína Slit2 a 10 y 13 semanas de edad (Figura 2h) , indicando una sobre-expresión exitosa de Slit2 en los. ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2. Los resultados muestran que las células ß del páncreas pueden ser inducidas para secretar proteína Slit2 por un mecanismo parácrino. Slit2, a su vez, puede interactuar con Robol, que se expresa en forma estable en las células endoteliales de los vasos sanguíneos pancreáticos, para activar rutas de señalización celular durante tumorigénesis pancreática. (3) Slit2 Promueve Crecimiento de Tumor Pancreático La Figura 3a muestra que el número de isletas angiogénicas en páncreas se incrementa significativamente en ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 a 10 y 12 semanas de edad. Las Figuras 3b y 3c muestran que tanto el volumen como el número de tumores pancreáticos son mayores en los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 que aquellos de los ratones transgénicos Ripl-Tag2. Sin embargo, no hay diferencia significante en conteo de leucocitos entre ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 y Ripl-Tag2 (Figura 3d) . Además, la Figura 3e muestra que los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 tienen vasos sanguíneos agrandados, mientras que los ratones transgénicos Ripl-Tag2 no exhiben cambio o vasos sanguíneos ligeramente agrandados, como se determina después de inyección de un colorante fluorescente en vasos sanguíneos. La Figura 3f muestra que los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 tienen evidente sangrado y agrandamiento de vasos sanguíneos. En contraste, los ratones transgénicos Ripl-Tag2 muestran poco sangrado. Además, los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 tienen más nuevos vasos sanguíneos (Figura 3g) , superior índice de proliferación (Figura 3h) , y menor índice de apoptosis (Figura 3i) , en comparación con los ratones transgénicos Ripl-Tag2. Estos resultados indican que la sobre-expresión de Slit2 promueve angiogénesis y crecimiento de tumores pancreáticos en los ratones transgénicos Ripl-Tag2. (4) La sobre-expresión de Slit2 promueve Metástasis Linfática de Tumores Pancreáticos 0 Los ratones transgénicos Ripl-Tag2 desarrollan tumores pancreáticos, que pasan a través de 4 etapas: etapas de isletas angiogénicas , etapa de crecimiento atipico, etapa de tumor pancreático, y etapa de tumor pancreático invasivo. La mayoría de estos ratones eventualmente mueren de hiperglicemia a 15-semanas de edad. Aunque no se observa metástasis de tumores pancreáticos en los ratones transgénicos Ripl-Tag2 durante su vida, alta incidencia (24.32%) de metástasis de membrana intestinal se observa en los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 (Figuras 4a y 4b) . También se observan nodulos de tumor dentro de los vasos linfáticos de los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 (Figura 4b) . No se observa diferencia en el peso de tumor entre Ripl-Tag2 y ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2.

Utilizando LYVE-1 como un marcador de células endoteliales linfáticas, las células endoteliales en los vasos linfáticos son estimadas por análisis inmunohistoquímico . Las FIGURAS 4c, 4d y 4e muestran que los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 tienen más vasos linfáticos nuevos, que se distribuyen primordialmente en las regiones periféricas del páncreas y dentro de los nodos linfoides (FIGURA 4f) . En contraste, los ratones transgénicos Ripl-Tag2 contienen menos vasos linfáticos recientemente desarrollados (FIGURAS 4g, 4h, y 4i) . Las FIGURAS 4j , 4k, 41 muestran que cuando se comparan con los ratones C57 tipo silvestre y los ratones transgénicos Ripl-Tag2, los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 tienen más vasos linfáticos recientemente desarrollados, como se determina por análisis de tinción con inmunofluorescencia. Las FIGURAS 4m, 4n, y 4o muestran que Robol se expresa en las células endoteliales linfáticas de los ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2. Hay aproximadamente un aumento de 1.5 veces en el número de vasos linfáticos, como se determina por un análisis inmunohistoquímico semi-cuantitativo, en el páncreas de ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 , en comparación con los ratones transgénicos Ripl-Tag2 (FIGURA 5b) . En conjunto, estos resultados indican que la sobre expresión de Slit2 puede inducir formación de vasos linfáticos y metástasis linfática de tumor. (5) Proteína Recombiriante Slit2 Promueve Migración de Células Endoteliales Linfáticas y Formación de Vasos In Vitro La FIGURA 5a muestra la expresión de Robol en las células endoteliales linfáticas humanas primarias que se estima por análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpo policlonal (Rb7) y anticuerpo monoclonal (R4) . R4 específicamente reconoce Robol, pero no Robo2-4. La FIGURA 5a muestra que Robol se expresa en la membrana celular de células endoteliales linfáticas humanas . La FIGURA 5b muestra que la densidad de vasos linfáticos en el páncreas de ratones transgénicos Slit2/Ripl-Tag2 es aproximadamente 1.5 veces superior a la de ratones transgénicos Ripl-Tag2.

Para determinar si proteína recombinante Slit2.1 puede afectar la migración de células endoteliales linfáticas humanas, se emplea el Ensayo de Cámara Boyden. VEGF-C se emplea como un control positivo en estos experimentos . La FIGURA 5c muestra que Slit2.1 promueve migración de células endoteliales linfáticas humanas a >200 pM. Una cantidad en exceso de R5 (anticuerpo anti-Robol) evita que Robol ligue a Slit2, resultando en una inhibición de migración de células endoteliales linfáticas mediada por Slit2.

Para determinar si Slit2.1 afecta la formación de vasos de células endoteliales linfáticas humanas in vitro, se realiza ensayo Matrigel. De nuevo, VEGF-C como un control positivo. Las FIGURAS 5d y 5e muestran que Slit2.1 induce formación de vasos a 10 nM. Una cantidad excesiva de R5 inhibe la formación de vasos de células endoteliales linfáticas mediada por Sli2. En conjunto, estos resultados indican que la proteína Slit2 liga a su receptor y promueve formación de vasos linfáticos y migración de células endoteliales linfáticas. (6) Sobre expresión de Slit2 es un Pronosticador de Metástasis Linfática de Tumor en Pacientes de Cáncer Los resultados descritos anteriormente sugieren que la expresión de Slit2 puede ser un marcador útil para metástasis de cáncer al sistema linfático. Esta noción es soportada por los datos de tinción de inmunoquímica de especímenes de tumor humano que utilizan anticuerpos anti-Slit2. Las propiedades de diversos anticuerpos empleados en estos experimentos se ilustran en la FIGURA 8a. SI, un anticuerpo monoclonal anti-Slit2, puede reconocer tanto la longitud íntegra como fragmentos N-terminales de la proteína Slit2. 9E10 reconoce la etiqueta c-myc fusionada a la proteína Slit2. S3, otro anticuerpo monoclonal anti-Slit2, reconoce tanto la longitud íntegra como fragmentos C-terminales de la proteína Slit2. SI también reconoce Slitl y Slit3 humanos (FIGURA 8a) . Por lo tanto, SI puede emplearse para detectar diferentes proteínas Slit. Utilizando inmunotinción SI, 742 de 955 muestras de tumor humano se encuentran positivas para expresión de Slit (Tabla 1; FIGURA 8b-d) . De manera importante, la expresión de Slit en cáncer colorectal, cáncer del estómago y cáncer pulmonar son significativamente superiores en metástasis linfáticas que en aquellas sin metástasis (Tabla 2; FIGURA 8c y 8d) .

Tabla 1: Expresión de proteína Slit en diversos tejidos de tumor humano, como se determina por análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpo monoclonal SI Tabla 2 : Expresión de proteína Slit en diverso tejidos de tumor humano, como se determina por análisi inmunohistoquimico utilizando anticuerpo monoclonal SI Los ejemplos presentados con anterioridad indican claramente que las rutas de señalización Slit-Robo juegan un papel importante en regular formación de vasos linfáticos y metástasis linfática de tumor. Por lo tanto, agentes, técnicas y métodos que pueden modular o interferir con la interacción entre proteínas Slit y sus receptores Robo, pueden utilizarse para tratar formación de vasos linfáticos y/o enfermedades relacionadas a metástasis linfática de tumor mediada por rutas de transduccion de señal Slit-Robo.

Por ejemplo, fragmentos de proteína' Robo (por ejemplo, dominios extracelulares Robo o sus proteínas de fusión tales como proteínas de fusión hRobo-Fc) o anticuerpos que hacen blanco en proteínas Slit o , pueden emplearse para modular o interferir con interacciones de proteína Slit-Robo, de esta manera proporcionando tratamientos para enfermedades y desórdenes mediados por la ruta de transducción de señal Slit-Robo. En este aspecto, fragmentos de proteínas Robo, tales como fragmentos extracelulares, pueden emplearse como señuelos para enlazar con ligandos Slit, de esta manera evitando o reduciendo el enlace de proteínas Slit a receptores Robo. Además de aplicaciones terapéuticas, las proteínas receptoras Slit o Robo o fragmentos o anticuerpos contra proteínas Slit o Robo, pueden emplearse como marcadores de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, anticuerpos contra proteínas Slit o Robo pueden emplearse para estimar metástasis linfática de tumor al comparar los niveles de expresión de las proteínas Slit y/o Robo en pacientes .

Algunas modalidades de la invención se refieren a reactivos basados en proteína Slit y/o Robo y métodos de su uso en el tratamiento, diagnóstico, pronóstico de enfermedades o desórdenes relacionados a las rutas de señalización Slit-Robo. Algunos ejemplos de estas modalidades se describen a continuación. (7) Generación de una proteína recombinante que contiene un dominio IgG extracelular de proteína Robol humana fusionado con la región Fe de inmunoglobulina humana (hRobo-Fc) (7a) Clonación de la región Fe de inmunoglobulina humana Amplificar la región de 687 pares base (bp) situada en C-terminal de la cadena pesada inmunoglobulina por PCR utilizando plásmido pAc-k-CH3 (que aloja las regiones constantes del gen de inmunoglobulina humana) (US Biological Co.) como una plantilla. Las secuencias de los cebadores directo e inverso hFc utilizadas en la amplificación PCR son como sigue: hFc directo: 5 ' -AACCGTGCGGCCGCTGTTGTGACAAAACTCACAC-3 1 [SEQ ID NO: 1] hFc inverso: 5' - CGCGGAGATCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3 ' [SEQ ID NO: 2] El producto PCR se disocia con enzimas de restricción Notl y Bglll, seguido por ligación del fragmento NOTI/Bglll con un plásmido pVL1393 (BD Pharmingen) que se ha digerido con Notl y Bglll. Esto produce el plásmido pVL1393-hFc, que transporta la región Fe de la secuencia de inmunoglobulina humana. La secuencia de la región Fe se confirma por secuenciado de ADN. No se encuentra mutación. (7b) Clonación de fragmentos de gen Robol Un clon Robol cDNA (Origene, DNA secuencia Número NM_002941.2, Producto Número SCI 09739) se emplea como una plantilla. El dominio extracelular que contiene 5 dominios tipo inmunoglobulinas (1-1621 bp) se selecciona para amplificación PCR. Las secuencias de los cebadores directo e inverso Robol empleadas en la amplificación PCR son como sigue: Robol directo: 5' -GGCGGCCTCT AGAATGAAATGGAAAC ATGTTCC-3 ' [SEQ ID NO: 3] Robol inverso : 5 ' - CTATAAGCGGCCGCCAATGTAAGCACTCCATGTT- 31 [SEQ ID NO: 4] El producto PCR después se disocia con enzimas de restricción Xbal y Notl . El fragmento Xbal/Notl se liga a pVL1393-hFc, que se ha digerido previamente con Xbal y Notl, para generar un vector de expresión, pVL1393-hRobo-Fc . El vector de expresión pVL1393-hRobo-Fc codifica una proteína que contiene el dominio extracelular de Robol (que contiene 5 dominios tipo inmunoglobulina (tipo Ig) ) fusionados con la región Fe humanas de la inmunoglobulina. La secuencia de los dominios tipo Ig Robo en este vector de expresión se confirma por secuenciado de ADN. No se encuentra mutación. Un marco de lectura abierto de los dominios tipo Ig Robol fusionados con la región hFc se establece adecuadamente con un codón de inicio y un codón de parada en las posiciones correctas. (7c) Expresión y purificación de proteína de fusión hRobo-Fc EJEMPLO I : Producción de plásmido a gran escala de pVL1393 -hRobo-Fc se realiza y purifica utilizando un equipo de aislamiento plásmido (QIAGEN plasmid Midi Kit) de acuerdo con los protocolos que se proporcionan en el equipo. pVL1393-hRobo-Fc purificado se emplea para generar baculovirus recombinante hRobo-Fc de acuerdo con el protocolo (BD Pharmingen, equipo de Transfección y Paquete de Inicio BaculoGold" ) .

Después de criba, el virus recombinante se amplifica y utiliza para infectar células de insecto Sf9 (desarrolladas en medio IPL-41 (Inyitrogen) en una incubadora a 27°C) para expresar la proteína de fusión hRobo-Fc. La proteína de fusión se detecta como un monómero de -85 kD, bajo condiciones de reducción, utilizando anticuerpo IgG anti-humano conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotech) (FIGURA 7) . La proteína de fusión hRobo-Fc puede expresarse a gran escala al infectar células SF9 con baculovirus recombinante hRobo-Fc. La proteína recombinante de esta manera producida puede ser purificada utilizando una columna de Afinidad de Proteína A (por ejemplo, GE Healthcare, nProtein A Sepharose™ 4 Fast Flow) . En general, cantidades en miligramos de proteína de fusión hRobo-Fc pueden ser obtenidas a partir de un litro de cultivo celular sf9. La proteína de fusión hRobo-Fc expresada en el sistema de baculovirus es funcional, como se evidencia por su capacidad para ligar específicamente la proteína hSlit-2 (FIGURA 6A) . Además, R5 (un anticuerpo monoclonal que reconoce el primer dominio tipo inmunoglobulina de proteína Robol) puede inhibir las interacciones entre la proteína de fusión hRobo-Fc y hSlit2 (FIGURA 6B) . Estos datos confirman la especificidad y actividad biológica de la proteína de fusión hRobo-Fc.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, proteínas de fusión Robo similares o variantes pueden ser generadas utilizando otros sistemas, tales como utilizando dominios extracelulares diferentes del fragmento de gen Robo (por ejemplo, aquellos que contienen uno a cuatro dominios tipo inmunoglobulina) , utilizando diferentes proteínas de fusión (por ejemplo, glutationa S- transíerasa (GST) ) , y/o utilizando diferentes sistemas de expresión de proteína (por ejemplo, CHO-dhfr: células de ovario de hámster Chino deficientes en dehidrofolato reductasa) . Algunas de estas modalidades se describen a continuación.

EJEMPLO II: Producción a gran escala del dominio extracelular de Robol de ratón y la región. Fe de la proteína de fusión de inmunoglobulina de ratón (mRobo-Fc) utilizando un sistema de expresión de proteína de baculovirus. 1. Selección y clonación de la región Fe de inmunoglobulina de ratón: Utilizando el gen de anticuerpo monoclonal IgG2b de ratón como una plantilla, una secuencia de 720 nucleótidos que codifica C-terminal de la cadena pesada, se elige para amplificación PCR. Los cebadores PCR se muestran como sigue: mFc directo: 51 -GC AGTCT AGACTTGAGCCC AGCGGGCCC AT-3 ' ; [SEQ ID NO: 5] mFc inverso: 51 -CTGAGGATCCTCATTTACCCGGAGACCGGG-3 ' ; [SEQ ID NO: 6] Los productos PCR se digieren con Xbal y BamHI. Los fragmentos Xbal y BamHI son subclonados en él vector pVL1392 (BD Pharmingen) , pre-digeridos por Xbal y BamHI para generar pVL1392-mFc. Secuenciado de ADN verifica la secuencia Fe correcta. 2. Selección y clonación de los fragmentos de gen Robol de ratón Utilizando el gen Robol de ratón (M 019413) como una plantilla, una secuencia de ATG a 2445 que abarca cinco regiones de tipo Ig y tres dominios estructurales tipo Fibronectina 3 (dominio FN3) , se amplifica utilizando los siguientes cebadores: mRobol directo: 5 ' -ATCGAGATCTATGATCGCGGAGCCTGCTCACT-3 ' [SEQ ID NO: 7] mRobol inverso: 5'- GCTCTCTAGACGCTGCCACCTCCACACTGTA-31 [SEQ ID NO: 8] Los productos PCR se digieren por Bglll y Xb l. Los fragmentos Bglll y Xbal son subclonados en pVL1392-mFc, pre-digeridos por Bglll y Xbal para generar pVL1392-mRobo-Fc . Secuenciado de ADN confirma que el fragménto de gen Robol de ratón y mFc forman el mismo marco de lectura abierto. Los codones de inicio y parada se confirman como ubicados en las posiciones correctas.

Aislamiento y purificación a gran escala de plásmidos pVL1392-mRobo-Fc se realizan utilizando el Equipo QIAGEN Plasmid Midi de acuerdo con el manual del usuario (Qiagen) . Los plásmidos pVL1392-mRobo-Fc purificados se emplean para generar baculovirus recombinantes que expresan proteína de fusión mRobo-Fc de acuerdo con el manual del usuario para el sistema de expresión de baculovirus (BD Pharmingen) . Los baculovirus recombinantes se emplean para infectar células de insecto s/9, para determinar eficiencia de infección e identificar agentes de alta expresión para las proteínas de fusión. Las proteínas mRobo-Fc se purifican utilizando Cromatografía de afinidad de Proteína A (GE Healthcare) de acuerdo con el manual de usuario nProtein A Sepharose™ 4 Fast Flow (GE Healthcare) .

EJEMPLO III: Producción a gran escala del dominio extracelular (con diferentes longitudes) de región Robol humana y Fe de proteínas de fusión de inmunoglobulina humana utilizando un sistema de expresión de proteína de baculovirus . 1. Selección y clonación de la región Fe de inmunoglobulina humana : Utilizando la región constante del gen de inmunoglobulina humana (pAc-k-CH3) (US Biological) como una plantilla, la secuencia de 687-nucleótidos que codifica C-terminal de la cadena pesada, se elige para la amplificación PCR. Los cebadores PCR se muestran como sigue: hFc directo: 51 -AACCGTGCGGCCGCTGTTGTGACAAAACTCACAC-3 1 [SEQ ID NO: 9] hFc inverso : 51 -CGCGGAGATCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3 ' [SEQ ID NO : 10] Los productos PCR se digieren por Notl y Bagll. Los fragmentos Notl y Bagll son subclonados en el vector pVL1392 (BD Pharmingen) , pre-digeridos por Notl y Bagll para generar pVL1392-hFc. Secuenciado de ADN verifica la secuencia Fe correcta. 2. Selección y clonación de los fragmentos de gen Robol. humano : Utilizando el gen Robol humano (M_002941.2, Producto Origene No. SC109739) como una plantilla, una secuencia de ATG a 1342 que abarca cuatro regiones tipo Ig, se amplifica utilizando los siguientes cebadores: Robol directo: 5 ' -GGCGGCCTCT AGAATGAAATGGAAAC ATGTTCC-31 [SEQ ID NO: 11] Robo inverso2 : 5 ' -CATTATGCGGCCGCCATCTGTAACTTCCAAATAT-3 ' [SEQ ID NO: 12] Utilizando el gen Robol humano (NM_002941.2 , Producto Origene No. SC109739) como una plantilla, una secuencia de ATG a 1051 que abarca tres regiones tipo Ig, se amplifica utilizando los siguientes cebadores: Robol directo: 51 -GGCGGCCTCT AGAATGAAATGGAAAC ATGTTCC-31 [SEQ ID NO: 13] Robol inverso3 : 5 ' -ATAATAGCGGCCGCGAGGTTCTTGAACAGTCAGAGTA-3 ' [SEQ ID NO: 14] Utilizando el gen Robol humano (NM_002941.2 , Producto Origene No. SC109739) como una plantilla, una secuencia de ATG a 829 que abarca dos regiones tipo Ig, se amplifica utilizando los siguientes cebadores: Robol directo: 5¦ -GGCGGCCTCT AGAATGAAATGGAAAC ATGTTCC-3¦ [SEQ ID NO: 15] Robol inverso4 : 51 -ATAATTGCGGCCGCCATCCACAGTTACTGCCAAGTTACT-3 ' [SEQ ID NO: 16] Utilizando el gen Robol humano (NM_002941.2 , Producto Origene No. SC109739) como una plantilla, una secuencia de ATG a 529 que abarca una región tipo Ig, se amplifica utilizando los siguientes cebadores: Robol directo: 5¦ -GGCGGCCTCT AGAATGAAATGGAAAC ATGTTCC-3' [SEQ ID NO: 17] Robol inverso 5: 5¦ -TTCTATGCGGCCGCAAGGGTTTTGTCTGAAGTCAT-3 ' [SEQ ID NO: 18] Productos PCR que se obtienen de las etapas anteriormente descritas, se digieren por Xbal y Notl. Los fragmentos Xbal y Notl son subclonados en pVL1393-hFc, pre-digeridos por Xbal y Notl para generar los vectores que expresan proteínas que tienen diferentes longitudes de dominio extracelular de Robol humano fusionado con la región Fe de inmunoglobulina humana. Secuenciado de ADN confirma que los fragmentos de gen Robol humano y hFc forman el mismo marco de lectura abierto. Los codones de inicio y parada se confirman ubicados en las posiciones correctas.

Aislamiento y purificación a gran escala de plásmidos pVL1393-hRobo-Fc se realizan utilizando el Equipo QIAGEN Plasmid Midi de acuerdo con el manual del usuario (Qiagen) . Los plásmidos pVL1392-hRobo-Fc purificados se emplean para generar baculovirus recombinantes que expresan proteína de fusión hRobo-Fc de acuerdo con el manual del usuario del sistema de expresión .de baculovirus (BD Pharmingen) . Los baculovirus recombinantes se emplean para infectar células de insecto s/9 para determinar la eficiencia de infección e identificar agentes de alta expresión. Las proteínas de fusión hRobo-Fc se purifican utilizando cromatografía de afinidad de Proteína A (GE Healthcare) de acuerdo con el manual de usuario nProtein A Sepharose™ 4 Fast Flow (GE Healthcare) .

EJEMPLO IV: Producción a gran escala del dominio extracelular (con diferentes longitudes) de región Robol humana y Fe de proteínas de fusión de inmunoglobulina humana utilizando un sistema de células de ovario de hámster chino deficiente en dehidrofolato reductasa (CHO-dhfr) . 1. Selección y clonación de los fragmentos de gen Robol humanos : Utilizando el gen Robol humano ( M_002941.2 , Producto Origene No. SC109739) como una plantilla, una secuencia de ATG a 1760 que abarca cinco regiones tipo Ig se amplifica utilizando los siguientes cebadores: Robol rl760: 5 ' -GGCC AAGCTT ATGAAATGGAAAC ATGTTCC-31 ; [SEQ ID NO: 19] Robol rl760: 5'- TCCACGGAATTCAAATTTGGTTGCC-31 [SEQ ID NO: 20] Los productos PCR se digieren por Hindlll y EcoRI . Los fragmentos Hindlll y EcoRI que abarcan cinco regiones tipo Ig del dominio extracelular de Robol humano son subclonados en el vector pEGFP-Nl (BD Pharmingen) , pre-digeridos por Hindlll y EcoRI para generar pEGFP-Nl-hRobo . Secuenciado de ADN confirma que la secuencia Robo humana es correcta . 2. Selección y clonación de la región Fe de inmunoglobulina humana : Utilizando la región constante del gen de inmunoglobulina humana (pAc-k-CH3) (US Biological) como una plantilla, la secuencia de 714 -nucleótidos que codifica C-terminal de la cadena pesada se elige para amplificación PCR. Los cebadores PCR se muestran como sigue: hFc directo 2: 5'-AACCGTGAATTCCGTGGACAAGAGAGTTGAGCC-3 ' ; [SEQ ID NO: 21] hFc inverso 2: 5'-T ACGGGTCGACTC ATTT ACCCGGAGAC AGGG-31 [SEQ ID NO: 22] Productos PCR se digieren por EcoRI y Salí. Los fragmentos EcoRI y Salí son subclonados en pEGFP-Nl pre-digeridos por EcoRI y Salí para generar el vector (pEGFP-Nl-hRobo-Fc) que expresa proteínas que contienen cinco regiones tipo Ig del dominio extracelular de Robol humano fusionado con la región Fe de inmunoglobulina humana. 'Secuenciado de ADN confirma que los fragmentos de gen Robol humano y hFc forman el mismo marco de lectura abierto. Los codones de inicio y parada se confirman como ubicados en las posiciones correctas .

Los vectores pEGFP-Nl-hRobo-Fc se digieren por Hindlll y Salí. Los fragmentos Hindlll y Salí son subclonados en p3CI-dhfr pre-digerido por Hindlll y Salí para generar p3CI-dhfr-hRobo-Fc que expresa proteínas que contienen cinco regiones tipo Ig del dominio extracelular de Robol humano fusionado con la región Fe de inmunoglobulina humana. Secuenciado de ADN confirma que los fragmentos de gen Robol humanos y hFc forman el mismo marco de lectura abierto. Los codones de inicio y parada se confirman como ubicados en las posiciones correctas.

Aislamiento y purificación a gran escala de plásmidos p3CI-dhfr-hRobo-Fc se realizan utilizando el Equipo QIAGEN Plasmid Midi de acuerdo con el manual de usuario (Qiagen) . Los plásmidos pVL1392-hRobo-Fc purificados se emplean para transfectar células CHO-dhfr para criba de clones de alta expresión de acuerdo con el manual de usuario de Lipofectina (Invitrogen) . Los medios que se obtienen de los clones de alta expresión se emplean para purificar las proteínas hRobo-Fc que tienen diferentes longitudes utilizando cromatografía de afinidad de Proteína A (GE Healthcare) de acuerdo con el manual de usuario de nProtein A Sepharose™ 4 Fast Flow (GE Healthcare) .

EJEMPLO V: Producción a gran escala de una proteína de fusión entre la región tipo IgG extracelular de Robol humano y la región Fe de inmunoglobulina humana utilizando un sistema de expresión de proteína de baculovirus. 1. Construction de pVL 1393 -hRobol-Fc: Utilizando los plásmidos p3CI-dhfr-hRobo-Fc obtenidos del EJEMPLO IV como una plantilla, PCR se realiza para amplificar la región Fe del gen de inmunoglobulina humano utilizando los siguientes cebadores: Robol directo' : 51 -AGGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-31 ; [SEQ ID NO: 23] hFc inverso 3: 5 ' -T ACGGGCGGCCGCTC ATTT ACCCGGAGAC AG -3· [SEQ ID NO: 24] Los productos PCR se digieren por Xbal y Notl. Los fragmentos Xbal y Notl son subclonados en vector pVL1393 (BD Pharmaingen) pre-digerido por Xbal y Notl para generar pVL1393-hRobo-Fc que expresa proteínas que contienen cinco regiones tipo Ig del dominio extracelular de Robol humano fusionado con la región Fe de inmunoglobulina humana. Secuenciado de ADN confirma que los fragmentos de gen Robol humanos y hFc forman el mismo marco de lectura abierto. Los codones de inicio y parada se confirman ubicados en las posiciones correctas. 2. Expresión y purificación de la proteína de fusión hRobo- Fc : Aislamiento y purificación a gran escala de plásmidos pVL 1393-hRobo-Fc se realizan utilizando el Equipo QIAGEN Plasmid Midi de acuerdo con el manual de usuario (Qiagen) . Los plásmidos pVL 1393-hRobo-Fc purificados se emplean para generar baculovirus recombinantes que expresan proteína de fusión hRobo-Fe de acuerdo con el manual de usuario para el sistema de expresión de baculovirus (BD Pharmingen) . Los baculovirus recombinantes se emplean para infectar células de insecto s/9 para determinar eficiencia de infección e identificar altos agentes de expresión. Las proteínas de fusión hRobo-Fe se purifican utilizando cromatografía de afinidad de Proteína A (GE Healthcare) , de acuerdo con el manual de usuario nProtein A Sepharose™ 4 Fast Flow (GE Healthcare) .

MÉTODOS Métodos de RT-PCR y Transferencia Northern HUVECs primarias se cultivan como se describió previamente (Geng, J.-G. et al., Nature 343:757-760 (1990)). RT-PCR semi-cuantitativa se realiza como con anterioridad (Ma, Y.-Q. and Geng, J.-G. J. Immunol . 165:558-565 (2000)). Cebadores empleados fueron sentido Robol humano (+4440) 5'-CCT ACA CAG ATG ATC TTC C-3* (SEQ ID NO: 25) y antisentido (-4956) 5" -CAG AGG AGC CTG CAG CTC AGC TTT CAG TTT CCT C-31 (SEQ ID NO: 26); sentido Slit2 humano (+3611) 51 -GGT GAC GGA TCC CAT ATC GCG GTA GAA CTC-3 ' (SEQ ID NO: 27) y antisentido (-4574) 5 '-GGA CAC CTC GAG CGT ACA GCC GCA CTT CAC-3 ' (SEQ ID NO: 28); sentido ß-actina humano (+1) 5¦ -ATG GAT GAT GAT ATC GCC GC-3* (SEQ ID NO: 29) y antisentido (-1127) 5'-CTA GAA GCA TTT GCG GTG G-3 ' (SEQ ID NO: 30) . Total de RNAs a partir de células A375 y el cultivo primario de HUVECs también se probó con Slit2 etiquetado con 32P o fragmentos cDNA Robol. Métodos de Generación de Anticuerpos, Inmunotransferencia e Inmunotinción Slit2-GST (que codifica los aminoácidos 57-207 de Slit2 humano) y proteínas de fusión Robol-GST (que codifican ya sea aminoácidos 1-168 o aminoácidos 961-1217 de Robol de rata) , se construyeron utilizando un vector pGEX-4T-l (Amersham Pharmacia Biotech) . Las proteínas de fusión se emplearon como antígenos para inmunizar conejos o ratones para generación de anticuerpos monoclonales o policlonales anti-Slit2 y anti-Robol. Exámenes inmunohistoquímicos se realizaron como se describe anteriormente (Liu, L.-P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286:281-291 (2001)).

Métodos de Aislamiento de Slit2 y RoboN Una línea de células 293 de riñon embriónico humano estable que secretan 'Slit2 humano de longitud íntegra con una etiqueta myc en su extremo carboxilo (Slit2/células 293) se estableció como se describió con anterioridad (Li, H. S. et al. Cell 96:807-818 (1999); ang, K.-H. et al. Cell 96:771-784 (1999)) . La proteína Slit2 altamente purificada se obtiene del medio acondicionado por cromatografía de afinidad utilizando 9E10 mAb contra la etiqueta myc (~1 mg/ml de Affi-Gel 10; Bio-Rad) . La tinción con plata e inmunotransferencia de Slit2 purificados se lleva a cabo como se describió (Ma, L. et al., J. Biol. Chem. 269:27739-27746 (1994)).

Una línea de células 293 estable que expresa un fragmento extracelular de Robol con una etiqueta de hemoaglutinina en su extremo carboxilo (RoboN) se establece como se describió con anterioridad (Li, H. S. et al. Cell 96:807-818 (1999); Whitford, K. L. et al., Neuron 33:47-61 (2002)). Perlas de afinidad acopladas con mAb contra hemoaglutinina, HA11 (B AbCO) , se emplean para purificar RoboN del medio acondicionado.

Ensayo de Cámara Boyden Ensayo de migración celular se realiza en una cámara de micro-quimiotaxia 48 pozos (o dispositivos similares) (Neuro Probé, Inc.) (Terranova, V. P. et al. J. Cell. Biol. 101:2330-2334 (1985)) . Membranas de policarbonato libres de PVP (poros de 8 µ?t?) se revistieron con gelatina al 1%. Las cámaras inferiores se cargaron con o sin Slit2 o bFGF (Sigma) , mientras que las cámaras superiores se sembraron con HUVECs, Robol/células 293 o V/células 293 resuspendidos en medio Mi 99 suplementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 1% (FCS) (todas a 5 xlO5 células/ml) . Se incubaron a 37°C por 4 h. Los filtros después se fijaron, tiñeron con violeta cristal a 0.5%, y las células que migraron a través de los filtros se contaron.

Ensayo de Migración Direccional Gradientes de proteínas microscópicos se produjeron como se describe (Hopker, V. H. et al., Nature 401:69-73 (1999)) . Brevemente, una inyección de presión repetitiva de volúmenes de pico litros de Slit2 de 0.15 µ? o bFGF 1 juM se aplican a través de una micro pipeta que tiene una abertura de punta de ~1 µ??. La placa de cultivo de 24 pozos se reviste con una capa delgada de Matrigel (Becton Dickinson Labware) y las células de prueba se deja que sedimenten y se enlacen en forma suelta con Matrigel . Los experimentos se llevaron a cabo a 37°C en la presencia de C02 5%. La punta de pipeta se colocó separada 100 µp? del centro de cualquier célula determinada [estaría esto bien??] bajo prueba. Imágenes microscópicas se registraron con una cámara CCD (JVC) enlazada con un microscopio de contraste de fase (Olympus 1X70) y almacenan en una computadora para el análisis detallado utilizando NIH Image o cualquier programa conveniente. Las distancias de migración de las células (por ejemplo, HUVECs) a un punto en tiempo apropiado (por ejemplo, 2 h) se analizaron.

Ensayo de Formación de Tubo Las placas de cultivo celular de 96 pozos se revistieron con 100 µ 1/pozo de Matrigel e incubaron a 37°C por 30 minutos para promover gelificación (Malinda, K. M. et al, Identification of laminin al y ß? chain peptides active for endothelial cell adhesión, tube formation y aortic sprouting, FASEB J. 13:53-62 (1999)). HUVECs (pasajes 2 a 3) se resuspendieron a 1.3 x 105 células por pozo en medio M199 suplementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 2%. Alícuotas de las células (0.1 mi por alícuota) se agregan a cada pozo que contiene Matrigel . Las estructuras tubulares se registraron y fotografiaron a las 12 a 18 h.

Métodos de Modelo de Crecimiento de Tumor Xenoinj ertado Células A375 se transfectaron utilizando Lipofectin™ (Gibco) y seleccionaron por 400 µ g mi"1 de higromicina B (Sigma) . RoboN/A375 Cl, células C2 y C3 , así como células V/A375 se verificaron por inmuno transferencia con los anticuerpos contra Robol, Slit2 o tubulina (como el control de carga) . Se resuspendieron en 0.2 mi de medio DME e inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos (O'Reilly, M. S. et al, Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth, Cell 88:277-285 (1997)). Para experimentos de inhibición de anticuerpo, ratones que tienen tumores de células A375 se trataron con inyecciones intraperitoneales de R5 o IgG2b de control dos veces por semana (1 mg por inyección) (Muller, A. et al., Nature 410:50-56 (2001)). Ratones se sacrificaron 30-35 días después. Sangre de ratones se recopila antes de sacrificio para conteo de leucocitos. Ensayos de mieloperoxidasa para mediciones de neutrófilos dentro de tumores sólidos, se realizaron como se describió previamente (Wang, J.-G. et al. Inflamm. Res. 51:435-43 (2002)).

Ensayos de Proliferación Celular Todos los transíectantes se desarrollaron a fases exponenciales y desprenden por tratamiento con tripsina. Células viables (células 5xl03/ml) se revisten en placas de cultivo de tejido de 96 pozos en 100 µ 1 de medio completo y cultivan a 37°C en atmósfera de C02 al 5%. En diferentes puntos en tiempo, se agrega sal tetrazolio (20 µ? por pozo) e incuba a 37°C por 4 h. El producto azul formazano insoluble se solubiliza por adición . de 100 /¿1/pozo de SDS al 10%/isobutanol al 5%. Las placas se leyeron en un lector de placas de micro titulación utilizando una longitud de onda de prueba 570 nm y una longitud de onda de referencia 6.30 nm.

Otros métodos tales como inmunoprecipitación, ensayo de perfusión de lectina, tinción de HE y tinción de inmunofluorescencia son bien conocidos en la técnica.

Modalidades de la invención puede incluir uno o más de las siguientes ventajas. Al dirigir o hacer blanco las rutas de señalización que median angiogénesis , formación de vasos linfáticos, y/o metástasis linfática de tumor, novedosos agentes terapéuticos pueden desarrollarse para tratar o diagnosticar enfermedades o desordenes tales como canceres, que se asocian con angiogénesis, génesis linfática (formación de vasos) , y/o metástasis linfática de tumor. Modalidades de la presente invención incluyen agentes que pueden emplearse para hacer blanco en estas rutas de transducción de señal, es decir, las rutas de señalización Slit-Robo. Estos agentes pueden disociar las interacciones entre los ligandos. Proteínas Slit, y sus receptores, proteínas Robo, que resultan en inhibición de angiogénesis, formación de vasos linfáticos y/o metástasis linfática de tumor. Aún más, se desarrollan otros agentes de acuerdo con modalidades de la invención para proporcionar herramientas de diagnóstico para pronosticar la presencia (y/o pronóstico) de enfermedades o desordenes asociados con angiogénesis, formación de vasos linfáticos y/o metástasis linfática de tumor .

Mientras que la invención se ha descrito con respecto a un número limitado de modalidades, aquellos con destreza en la técnica con el beneficio de esta descripción, apreciarán que otras modalidades pueden diseñarse que no se apartan del alcance de la invención como se describe aquí. De acuerdo con esto, el alcance de la invención deberá de ser limitado solo por las reivindicaciones anexas.

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para evitar o tratar un desorden mediada por una proteína Slit, que comprende: administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que modula o evita interacciones entre la proteína Slit y una proteína Robo, en donde el desorden involucra formación de vasos linfáticos.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína Slit es Slit2.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína Robo es Robol o Robo4.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es un anticuerpo contra la proteína Slit.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es un anticuerpo contra la proteína Robo.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es un fragmento de un dominio extracelular de la proteína Robo.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento se deriva del primer dominio de tipo inmunoglobulina de la proteína Robo.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es una proteína de fusión Robo.

•11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína de fusión Robo es una proteína de fusión Robo-Fc.

12. Una composición para evitar o tratar un desorden mediado por una proteína Slit, que comprende: un agente que puede modular o interferir con interacciones entre la proteína Slit y una proteína Robo; y un excipiente, portador, o solvente farmacéutico aceptable, en donde el desorden involucra formación de vasos linfáticos.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la proteína Slit es Slit2.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente es un anticuerpo contra una proteína Slit o una proteína Robo.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente es un fragmento de un dominio extracelular de la proteína Robo.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el fragmento se deriva del primer dominio tipo inmunoglobulina de la proteína Robo.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente es una proteína de fusión Robo.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la proteína de fusión Robo es una proteína de fusión Robo-Fc.

21. Un método para pronosticó o diagnóstico de una enfermedad o desorden mediados por proteína Slit, caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra de prueba de un sujeto de prueba y estimar los niveles de expresión de una proteína Slit, una proteína Robo o tanto la proteína Slit como la proteína Robo en la muestra de prueba; (b) obtener una muestra de control de un sujeto que no tiene la enfermedad o desorden y estimar los niveles de expresión de la proteína Slit, la proteína Robo, o tanto la proteína Slit como la proteína Robo en la muestra de control; y (c) comparar los niveles de expresión estimados en (a) y (b) para obtener un resultado respecto a la enfermedad o desorden mediados por la proteína Slit .

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proteína Slit es Slit2.

23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proteína Robo es Robol o Robo4.

24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque los niveles de expresión son niveles de expresión de ADN, niveles de expresión de ARN, niveles de expresión de proteína o una combinación de los mismos.

25. El método de conformidad con la reivindicación 1, 12 ó 21, caracterizado porque el desorden es cáncer.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el cáncer es metastático.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el cáncer es aquel seleccionado del grupo que consiste de cáncer colorectal, cáncer estomacal, cáncer esofágico, cáncer pulmonar, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y cáncer de vejiga.