CN110398584B

CN110398584B - 血清Slit2作为结直肠癌诊治和转移监测标志物的应用

Info

Publication number: CN110398584B
Application number: CN201910436470.5A
Authority: CN
Inventors: 章倩倩; 王丽京; 姚玉莹; 李留有; 周子钧; 段有发
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110398584A

Abstract

本发明公开了血清Slit2作为结直肠癌诊治和转移监测标志物的应用。本发明首次证实了血清Slit2在结直肠癌患者血清中表达水平显著升高，利用血清Slit2可有效的区分结直肠癌患者和健康人，特异性阻断Slit2/Robo1信号可以抑制结直肠癌的生长、增殖和转移。因此，本发明提供了一种新的结直肠癌诊断、转移监测和治疗标志物，即血清Slit2，该标志物对结直肠癌患者具有良好的早期诊断、转移监测和早期治疗作用，灵敏度高、特异性强，在临床诊断结直肠癌中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

血清Slit2作为结直肠癌诊治和转移监测标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及血清Slit2作为结直肠癌诊治和转移监测标志物的应用。

背景技术

结直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，其致死率位于癌症死亡的第二位。近年来，随着人民生活水平的提高，生活方式和饮食结构改变，导致结直肠癌发生率逐年升高，且有年轻化趋势。结直肠癌患者预后与肿瘤临床分期密切相关，早期治疗结直肠癌后五年生存率达60％，但实际上，由于大多数患者在肿瘤早期鲜有明显症状，待首诊时即为中晚期，错过了最佳治疗时期。

目前，对于结直肠癌的临床诊断主要通过肠镜检查。随着医疗水平的发展，利用肿瘤标志物进行疾病的早期检测，已成为医学研究和临床诊断的热点。例如，检测血清CA199和癌胚抗原(CEA)水平，对于结直肠癌的早期诊断具有重要的临床价值。CA199是一种低聚糖肿瘤相关糖类抗原，在消化道恶性肿瘤中特异性高，一旦检测结果呈阳性，对于结直肠癌的诊断具有重要的临床指导意义，但其敏感性不如CEA高；CEA增高的结直肠癌患者常发生转移且预后差，但对于早期结直肠癌病人不敏感。理想的标志物应具有较高敏感性，在肿瘤早期即可提示诊断、易检测的特点。因此，进一步探索结直肠癌的血清学诊断标志物，从而减少结直肠癌的漏诊，提高结直肠癌的检测准确性，对结直肠癌的早期治疗和改善患者预后具有重要临床意义。

目前，虽然临床已有结直肠癌早期诊断的标志物，但是对早期结直肠癌病人不敏感性。因此，寻找新的、敏感性更高的结直肠癌诊断标志物，对于结直肠癌患者的早期诊断、转移监测和治疗有着更加广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有结直肠癌诊断标志物对早期结直肠癌病人不敏感性的问题，提供一种新的、敏感性更高的结直肠癌诊断标志物，为结直肠癌的诊断、转移监测和治疗提供新的靶点，对早期诊断结直肠癌具有重要的指导意义。

本发明的第一个目的是提供血清Slit2作为结直肠癌诊断标志物的应用。

本发明的第二个目的是提供血清Slit2的检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂盒和/或制剂方面的应用。

本发明的第三个目的是提供血清Slit2作为结直肠癌转移监测标志物的应用。

本发明的第四个目的是提供血清Slit2的检测试剂在制备结直肠癌远处转移监测试剂盒和/或制剂方面的应用。

本发明的第五个目的是提供血清Slit2作为结直肠癌治疗靶点方面的应用。

本发明的第六个目的是提供血清Slit2在制备结直肠癌治疗试剂或药物方面的应用。

本发明的第七个目的是提供一种结直肠癌诊断试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

具体地，本发明研究了结直肠癌发展病理进程中血清Slit2含量，发现结直肠癌患者血清Slit2含量高于健康志愿者，差异十分显著(P＜0.001)；随着病理进程的发展，血清Slit2含量逐渐升高；利用血清Slit2可有效的区分结直肠癌患者和健康人。

此外，本发明利用ROC曲线分析了血清Slit2在结直肠癌中的诊断作用，发现血清Slit2可作为结直肠癌的诊断标志物，AUC为0.92，灵敏度和特异性分别为78.6％和92.9％，具有灵敏度高、特异性强的特点，表明血清Slit2对临床诊断结直肠癌具有良好的应用价值。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

血清Slit2作为结直肠癌诊断标志物的应用，以及血清Slit2的检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂盒和/或制剂方面的应用。

血清Slit2作为结直肠癌转移监测标志物的应用，以及血清Slit2的检测试剂在制备结直肠癌远处转移监测试剂盒和/或制剂方面的应用。

血清Slit2作为结直肠癌治疗靶点方面的应用，以及血清Slit2在制备结直肠癌治疗试剂或药物方面的应用。

所述血清Slit2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述血清Slit2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述药物是能够抑制结直肠癌细胞的生长、增殖和/或转移的药物。

优选地，所述抑制剂为Slit2/Robo1信号抑制剂。

优选地，所述血清为外周血血清。

另外，本发明还请求保护一种结直肠癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含血清Slit2的检测试剂。

所述试剂盒能检测血清Slit2表达水平，表达水平异常升高，则患有结直肠癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的结直肠癌诊断标志物，即血清Slit2，首次证实了血清Slit2在结直肠癌患者血清中表达水平显著升高，利用血清Slit2可有效的区分结直肠癌患者和健康人。另外，本发明利用ROC曲线分析，发现血清Slit2表达水平对结直肠癌患者的灵敏度和特异性分别为78.6％和92.9％。因此，血清Slit2可以作为结直肠癌诊断、远处转移监测和治疗的标志物，具有灵敏度高、特异性强的特点，对临床诊断结直肠癌具有指导意义和良好的实际应用价值。

附图说明

图1是小鼠肿瘤发展病理进程中肠道组织结构变化H&E染色的结果图。

图2是小鼠肿瘤发展病理进程中血清Slit2含量的检测结果图；其中，n＝10、14、16分别代表供试小鼠为10只、14只和16只，“***”代表P＜0.001，“*”代表P＜0.05。

图3是Apc^Min/+小鼠血清Slit2含量的ROC曲线图。

图4是结直肠癌患者和健康志愿者血清Slit2含量的检测结果图；其中，“normal”代表健康志愿者，“CRC”代表结直肠癌患者，“***”代表P＜0.001。

图5是结直肠癌患者血清Slit2和健康志愿者血清Slit2含量的ROC曲线图。

图6是抗体特异性阻断Slit2/Robo1信号治疗Apc^Min/+小鼠的肿瘤数量和肿瘤体积结果；其中，“***”代表P＜0.001，“*”代表P＜0.05。

图7是抗体靶向Slit2/Robo1信号治疗LoVo细胞肺转移小鼠模型转移灶数目结果图；其中，“*”代表P＜0.05。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用的供试小鼠：24周龄正常C57小鼠、9周龄Apc^Min/+小鼠、15周龄Apc^Min/+小鼠、24周龄Apc^Min/+小鼠。

实施例1 H&E染色观察Apc^Min/+小鼠肿瘤发展病理进程

1、实验方法

1)小鼠肠道分离

(1)将小鼠麻醉后，使用颈椎脱臼处死法处死小鼠，并呈仰卧位四肢平放在手术板上；

(2)用浸泡了75％酒精的棉球擦拭小鼠腹部，一只手用镊子提起小鼠腹部皮肤，另一只手用手术剪沿腹中线剪开皮肤，然后用镊子轻轻提起腹膜，剪开腹膜，剪时注意不要碰到肠道；

(3)从十二指肠开始往下小心地剥离肠系膜，直至肛门，剥离白色脂肪，将剪下的肠道组织放入1×PBS溶液中，用剪刀将小肠三均等分，肛门到盲肠为结直肠段；

(4)用注射器吸取1×PBS冲洗肠道内容物，置滤纸上吸干多余水分，用干净的手术剪沿肠道纵轴剖开(剪刀悬空剪，尽量不要刮到粘膜层)，用棉签小心的将剖开的肠道铺展在滤纸上，标记好是第几段肠，剖开的肠道组织可在空气中放置1min左右，使PBS略干，放入包埋盒后再放入4％多聚甲醛溶液中固定，即完成了小鼠肠道分离。

2)小鼠肠道组织石蜡切片的制备

采用苏木精-伊红染色法(H&E染色)将小鼠的肠道组织固定、包埋，得到石蜡切片，厚度为3～4μm；然后将石蜡切片脱蜡、苏木素染色4min，反蓝，伊红染色3s，37℃过夜、封片；将石蜡切片正置显微镜下，观察各个周龄Apc^Min/+小鼠肠道组织结构变化并拍照，记录小鼠肠道组织结构的变化。

2、实验结果

小鼠肿瘤发展病理进程中肠道组织结构变化H&E染色的结果如图1所示，可以看出，24周龄正常C57小鼠小肠绒毛排列整齐，肠道结构分层清晰；9周龄Apc^Min/+小鼠小肠腺管增生明显，腺管细胞层数增多变厚；15周龄Apc^Min/+小鼠肠道中出现散发的管状绒毛状小肠腺瘤，细胞排列紊乱，腺体和腺体之间的界限消失，出现“背靠背”和共壁现象，但基底膜尚保持完整；24周龄Apc^Min/+小鼠肠道中瘤细胞明显复层化，核异型性明显，染色质深染，部分核上浮至腔缘，核极向消失，部分细胞发生核溶解，肿瘤细胞突破基底膜。

实施例2不同病理进程Apc^Min/+小鼠血清Slit2表达检测

1、实验方法

1)小鼠眼眶取血

(1)在干燥器内倒入适量乙醚，随后将24周龄正常C57小鼠，9周龄、15周龄、24周龄Apc^Min/+小鼠放入干燥器内，由于小鼠死后无法取血，因此，待小鼠昏迷后立即取出，切记麻醉时间不可过长，否则会导致麻痹过久而死；

(2)用长度为1cm左右的毛细管插入小鼠内眼眶下方，食指与中指轻轻旋转毛细管，此时可见血液流出，将流出的血液装入事先编好号码的离心管中(在取血时，轻轻按压心脏可以使小鼠血液充分流出)；

(3)取血后，室温静置，待血液明显分层后，于室温5000rpm离心30min(切忌放入4℃离心，否则会溶血)，离心完成后，吸取上层血清至编码的新离心管中，吸取完毕后，血清保存于-80℃，以用于后续的酶联免疫吸附(ELISA)实验。

2)小鼠血清Slit2含量检测

小鼠血清Slit2的ELISA检测按照试剂盒(CSB-E11039m,Cusabio Biothech Co.,Wuhan,China)说明书进行操作，检测小鼠血清Slit2含量；利用分光光度计检测ELISA结果，根据标准曲线分析小鼠血清Slit2含量。

3)ROC曲线绘制及灵敏度和特异性分析

利用GraphPad软件，以灵敏度％为纵坐标、100％-特异性％为横坐标，分析Apc^Min/+小鼠血清Slit2含量的ROC(receiver operating characteristic)曲线，利用最佳约登指数(敏感度Sensitivity+特异性Specificity-1)确定灵敏度和特异性。

2、实验结果

小鼠肿瘤发展病理进程中血清Slit2含量的检测结果如图2所示，可以看出，9周龄、15周龄、24周龄Apc^Min/+小鼠血清Slit2含量均高于24周龄正常C57小鼠，差异十分显著(P＜0.001)，且24周龄发生腺癌的Apc^Min/+小鼠，比9周龄增生期Apc^Min/+小鼠血清Slit2含量显著升高(P＜0.05)。以上结果表明：随着Apc^Min/+小鼠肠道肿瘤病理进程的发展，小鼠血清Slit2含量逐渐升高。

Apc^Min/+小鼠血清Slit2含量的ROC曲线如图3所示，可以看出，所有周龄Apc^Min/+小鼠组合AUC(曲线下面积)为0.96，灵敏度为97.5％，特异性为87.5％；9周龄Apc^Min/+小鼠AUC为0.91，灵敏度为90％，特异性为87.5％；15周龄Apc^Min/+小鼠AUC为0.95，灵敏度为100％，特异性为87.5％；24周龄Apc^Min/+小鼠AUC为1.0，灵敏度为100％，特异性为100％。

以上结果表明：利用小鼠血清Slit2可有效的区分肠道肿瘤小鼠和健康小鼠，而且可以早期检测结直肠癌，灵敏度高、特异性强。

实施例3临床结直肠癌患者血清Slit2表达检测

1、实验方法

1)外周血标本的收集与处理

外周血标本收取于广东药科大学第一附属医院，分别收取14例结直肠癌患者血清、14例健康志愿者血清，每个标本收集0.5mL于冻存管中，放于-80℃冰箱保存，以用于后续的ELISA实验。所有研究对象均知情同意参加本项实验，并通过医院伦理委员会同意。

2)血清Slit2含量检测

患者血清Slit2和健康志愿者血清Slit2的ELISA检测按照试剂盒(CSB-E11039m,Cusabio Biothech Co.,Wuhan,China)说明书进行操作，检测患者血清Slit2和健康志愿者血清Slit2含量；利用分光光度计检测ELISA结果，根据标准曲线分析患者血清Slit2和健康志愿者血清Slit2含量。

3)ROC曲线绘制及灵敏度和特异性分析

利用GraphPad软件，以灵敏度％为纵坐标、100％-特异性％为横坐标，分析患者血清Slit2和和健康志愿者血清Slit2的ROC曲线，利用最佳约登指数(敏感度Sensitivity+特异性Specificity-1)确定灵敏度和特异性。

2、实验结果

结直肠癌患者血清Slit2和健康志愿者血清Slit2含量的检测结果如图4所示，可以看出，结直肠癌患者血清Slit2含量高于健康志愿者，差异十分显著(P＜0.001)。以上结果表明：结直肠癌患者血清Slit2含量升高。

结直肠癌患者血清Slit2和健康志愿者血清Slit2含量的ROC曲线如图5所示，可以看出，结直肠癌患者AUC为0.92，灵敏度为78.6％，特异性为92.9％。以上结果表明：利用血清Slit2可有效的区分结直肠癌患者和健康人。

实施例4抗体特异性阻断Slit2/Robo1信号治疗Apc^Min/+小鼠

1、实验方法

1)小鼠肠道肿瘤数量和肿瘤体积测定

(1)9周龄Apc^Min/+小鼠隔天腹腔注射IgG或Slit2/Robo1信号特异性阻断抗体R5(1mg/只)，持续4周，治疗后处死小鼠；

(2)将步骤(1)得到的13周龄Apc^Min/+小鼠(每组至少6只)按照实施例1中步骤1)的方法分离和固定肠道，随后用0.4％亚甲蓝瞬时染色小鼠肠道组织；

(2)染色时间根据染色深浅而定，染色过深则可用70％乙醇脱色，将染好的小鼠肠道置于不透光面板上；

(3)用体式显微镜200倍镜观察，利用显微镜自带软件测量工具，来测量每个腺瘤的最长径和最短径，总体长短径数目的二分之一为单位长度内肿瘤的数量，肿瘤体积的计算公式如下：

体积＝4/3πab2(a为长径的一半，b为短径的一半)

(4)肠道肿瘤的分级：可分为微腺瘤(MA)和腺瘤(AD)两类，微腺瘤定义为：体积不超过2mm x 2mm的肿瘤，腺瘤定义为：体积大于2mm的肿瘤；完成肠道肿瘤计数后，肠道组织可用70％乙醇保存备用，或直接进行脱水处理。

2、实验结果

抗体特异性阻断Slit2/Robo1信号治疗Apc^Min/+小鼠的肿瘤数量和肿瘤体积结果如图6所示，从图6中的A可以看出，注射IgG的小鼠肠道微腺瘤的数量显著高于注射R5的小鼠肠道微腺瘤的数量(P＜0.05)，而注射IgG的小鼠肠道腺瘤的数量与注射R5的小鼠肠道腺瘤的数量无显著差异，注射IgG的小鼠肠道肿瘤的数量显著高于注射R5的小鼠肠道肿瘤的数量(P＜0.05)；

从图6中的B可以看出，注射IgG的小鼠肠道微腺瘤的体积高于注射R5的小鼠肠道微腺瘤的体积，差异十分显著(P＜0.001)，而注射IgG的小鼠肠道腺瘤的体积与注射R5的小鼠肠道腺瘤的体积无显著差异，注射IgG的小鼠肠道肿瘤的体积显著高于注射R5的小鼠肠道肿瘤的体积(P＜0.05)。以上结果表明：靶向Slit2/Robo1信号治疗可以显著抑制小鼠肠道肿瘤的早期生长和增殖。相反，Slit2/Robo1信号激活，可以促进肿瘤的生长和增殖。

实施例5抗体特异性阻断Slit2/Robo1信号治疗LoVo细胞小鼠肺转移模型

1、实验方法

(1)将10⁶个LoVo细胞经尾静脉注射到12只24周龄正常C57小鼠中；

(2)隔天腹腔注射IgG或Slit2/Robo1信号特异性阻断抗体R5(1mg/只)，持续3周；

(3)3周后处死小鼠，剥离肺组织，用包因氏固定液固定，统计小鼠肺表面的结节数目。

2、实验结果

抗体靶向Slit2/Robo1信号治疗LoVo细胞肺转移小鼠模型转移灶数目结果如图7所示，可以看出，注射IgG的小鼠转移灶数目显著高于注射R5的小鼠转移灶数目(P＜0.05)。以上结果表明：靶向Slit2/Robo1信号治疗可以显著抑制小鼠肠道肿瘤的转移。相反，Slit2/Robo1信号激活，可以促进肿瘤的转移。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 广东药科大学

<120> 血清Slit2作为结直肠癌诊治和转移监测标志物的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgcggcg ttggctggca gatgctgtcc ctgtcgctgg ggttagtgct ggcgatcctg 60

aacaaggtgg caccgcaggc gtgcccggcg cagtgctctt gctcgggcag cacagtggac 120

tgtcacgggc tggcgctgcg cagcgtgccc aggaatatcc cccgcaacac cgagagactg 180

gatttaaatg gaaataacat cacaagaatt acgaagacag attttgctgg tcttagacat 240

ctaagagttc ttcagcttat ggagaataag attagcacca ttgaaagagg agcattccag 300

gatcttaaag aactagagag actgcgttta aacagaaatc accttcagct gtttcctgag 360

ttgctgtttc ttgggactgc gaagctatac aggcttgatc tcagtgaaaa ccaaattcag 420

gcaatcccaa ggaaagcttt ccgtggggca gttgacataa aaaatttgca actggattac 480

aaccagatca gctgtattga agatggggca ttcagggctc tccgggacct ggaagtgctc 540

actctcaaca ataacaacat tactagactt tctgtggcaa gtttcaacca tatgcctaaa 600

cttaggactt ttcgactgca ttcaaacaac ctgtattgtg actgccacct ggcctggctc 660

tccgactggc ttcgcaaaag gcctcgggtt ggtctgtaca ctcagtgtat gggcccctcc 720

cacctgagag gccataatgt agccgaggtt caaaaacgag aatttgtctg cagtgatgag 780

gaagaaggtc accagtcatt tatggctcct tcttgtagtg ttttgcactg ccctgccgcc 840

tgtacctgta gcaacaatat cgtagactgt cgtgggaaag gtctcactga gatccccaca 900

aatcttccag agaccatcac agaaatacgt ttggaacaga acacaatcaa agtcatccct 960

cctggagctt tctcaccata taaaaagctt agacgaattg acctgagcaa taatcagatc 1020

tctgaacttg caccagatgc tttccaagga ctacgctctc tgaattcact tgtcctctat 1080

ggaaataaaa tcacagaact ccccaaaagt ttatttgaag gactgttttc cttacagctc 1140

ctattattga atgccaacaa gataaactgc cttcgggtag atgcttttca ggatctccac 1200

aacttgaacc ttctctccct atatgacaac aagcttcaga ccatcgccaa ggggaccttt 1260

tcacctcttc gggccattca aactatgcat ttggcccaga acccctttat ttgtgactgc 1320

catctcaagt ggctagcgga ttatctccat accaacccga ttgagaccag tggtgcccgt 1380

tgcaccagcc cccgccgcct ggcaaacaaa agaattggac agatcaaaag caagaaattc 1440

cgttgttcag gtacagaaga ttatcgatca aaattaagtg gagactgctt tgcggatctg 1500

gcttgccctg aaaagtgtcg ctgtgaagga accacagtag attgctctaa tcaaaagctc 1560

aacaaaatcc cggagcacat tccccagtac actgcagagt tgcgtctcaa taataatgaa 1620

tttaccgtgt tggaagccac aggaatcttt aagaaacttc ctcaattacg taaaataaac 1680

tttagcaaca ataagatcac agatattgag gagggagcat ttgaaggagc atctggtgta 1740

aatgaaatac ttcttacgag taatcgtttg gaaaatgtgc agcataagat gttcaaggga 1800

ttggaaagcc tcaaaacttt gatgttgaga agcaatcgaa taacctgtgt ggggaatgac 1860

agtttcatag gactcagttc tgtgcgtttg ctttctttgt atgataatca aattactaca 1920

gttgcaccag gggcatttga tactctccat tctttatcta ctctaaacct cttggccaat 1980

ccttttaact gtaactgcta cctggcttgg ttgggagagt ggctgagaaa gaagagaatt 2040

gtcacgggaa atcctagatg tcaaaaacca tacttcctga aagaaatacc catccaggat 2100

gtggccattc aggacttcac ttgtgatgac ggaaatgatg acaatagttg ctccccactt 2160

tctcgctgtc ctactgaatg tacttgcttg gatacagtcg tccgatgtag caacaagggt 2220

ttgaaggtct tgccgaaagg tattccaaga gatgtcacag agttgtatct ggatggaaac 2280

caatttacac tggttcccaa ggaactctcc aactacaaac atttaacact tatagactta 2340

agtaacaaca gaataagcac gctttctaat cagagcttca gcaacatgac ccagctcctc 2400

accttaattc ttagttacaa ccgtctgaga tgtattcctc ctcgcacctt tgatggatta 2460

aagtctcttc gattactttc tctacatgga aatgacattt ctgttgtgcc tgaaggtgct 2520

ttcaatgatc tttctgcatt atcacatcta gcaattggag ccaaccctct ttactgtgat 2580

tgtaacatgc agtggttatc cgactgggtg aagtcggaat ataaggagcc tggaattgct 2640

cgttgtgctg gtcctggaga aatggcagat aaacttttac tcacaactcc ctccaaaaaa 2700

tttacctgtc aaggtcctgt ggatgtcaat attctagcta agtgtaaccc ctgcctatca 2760

aatccgtgta aaaatgatgg cacatgtaat agtgatccag ttgactttta ccgatgcacc 2820

tgtccatatg gtttcaaggg gcaggactgt gatgtcccaa ttcatgcctg catcagtaac 2880

ccatgtaaac atggaggaac ttgccactta aaggaaggag aagaagatgg attctggtgt 2940

atttgtgctg atggatttga aggagaaaat tgtgaagtca acgttgatga ttgtgaagat 3000

aatgactgtg aaaataattc tacatgtgtc gatggcatta ataactacac atgcctttgc 3060

ccacctgagt atacaggtga gttgtgtgag gagaagctgg acttctgtgc ccaggacctg 3120

aacccctgcc agcacgattc aaagtgcatc ctaactccaa agggattcaa atgtgactgc 3180

acaccagggt acgtaggtga acactgcgac atcgattttg acgactgcca agacaacaag 3240

tgtaaaaacg gagcccactg cacagatgca gtgaacggct atacgtgcat atgccccgaa 3300

ggttacagtg gcttgttctg tgagttttct ccacccatgg tcctccctcg taccagcccc 3360

tgtgataatt ttgattgtca gaatggagct cagtgtatcg tcagaataaa tgagccaata 3420

tgtcagtgtt tgcctggcta tcagggagaa aagtgtgaaa aattggttag tgtgaatttt 3480

ataaacaaag agtcttatct tcagattcct tcagccaagg ttcggcctca gacgaacata 3540

acacttcaga ttgccacaga tgaagacagc ggaatcctcc tgtataaggg tgacaaagac 3600

catatcgcgg tagaactcta tcgggggcgt gttcgtgcca gctatgacac cggctctcat 3660

ccagcttctg ccatttacag tgtggagaca atcaatgatg gaaacttcca cattgtggaa 3720

ctacttgcct tggatcagag tctctctttg tccgtggatg gtgggaaccc caaaatcatc 3780

actaacttgt caaagcagtc cactctgaat tttgactctc cactctatgt aggaggcatg 3840

ccagggaaga gtaacgtggc atctctgcgc caggcccctg ggcagaacgg aaccagcttc 3900

cacggctgca tccggaacct ttacatcaac agtgagctgc aggacttcca gaaggtgccg 3960

atgcaaacag gcattttgcc tggctgtgag ccatgccaca agaaggtgtg tgcccatggc 4020

acatgccagc ccagcagcca ggcaggcttc acctgcgagt gccaggaagg atggatgggg 4080

cccctctgtg accaacggac caatgaccct tgccttggaa ataaatgcgt acatggcacc 4140

tgcttgccca tcaatgcgtt ctcctacagc tgtaagtgct tggagggcca tggaggtgtc 4200

ctctgtgatg aagaggagga tctgtttaac ccatgccagg cgatcaagtg caagcatggg 4260

aagtgcaggc tttcaggtct ggggcagccc tactgtgaat gcagcagtgg atacacgggg 4320

gacagctgtg atcgagaaat ctcttgtcga ggggaaagga taagagatta ttaccaaaag 4380

cagcagggct atgctgcttg ccaaacaacc aagaaggtgt cccgattaga gtgcagaggt 4440

gggtgtgcag gagggcagtg ctgtggaccg ctgaggagca agcggcggaa atactctttc 4500

gaatgcactg acggctcctc ctttgtggac gaggttgaga aagtggtgaa gtgcggctgt 4560

acgaggtgtg tgtcctaa 4578

<210> 2

<211> 1521

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Gly Val Gly Trp Gln Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ala Ile Leu Asn Lys Val Ala Pro Gln Ala Cys Pro Ala Gln Cys

20 25 30

Ser Cys Ser Gly Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu Arg Ser

35 40 45

Val Pro Arg Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly

50 55 60

Asn Asn Ile Thr Arg Ile Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His

65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Gln Leu Met Glu Asn Lys Ile Ser Thr Ile Glu Arg

85 90 95

Gly Ala Phe Gln Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg

100 105 110

Asn His Leu Gln Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr Ala Lys

115 120 125

Leu Tyr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gln Ile Gln Ala Ile Pro Arg

130 135 140

Lys Ala Phe Arg Gly Ala Val Asp Ile Lys Asn Leu Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Asn Gln Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp

165 170 175

Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Ile Thr Arg Leu Ser Val

180 185 190

Ala Ser Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser

195 200 205

Asn Asn Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu

210 215 220

Arg Gln Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gln Cys Met Gly Pro Ser

225 230 235 240

His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gln Lys Arg Glu Phe Val

245 250 255

Cys Ser Gly His Gln Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val Leu His

260 265 270

Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly

275 280 285

Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu

290 295 300

Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe

305 310 315 320

Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln Ile

325 330 335

Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser

340 345 350

Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe

355 360 365

Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile

370 375 380

Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Leu

385 390 395 400

Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe

405 410 415

Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn Pro Phe

420 425 430

Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn

435 440 445

Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala

450 455 460

Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser Gly

465 470 475 480

Thr Glu Asp Tyr Arg Ser Lys Leu Ser Gly Asp Cys Phe Ala Asp Leu

485 490 495

Ala Cys Pro Glu Lys Cys Arg Cys Glu Gly Thr Thr Val Asp Cys Ser

500 505 510

Asn Gln Lys Leu Asn Lys Ile Pro Glu His Ile Pro Gln Tyr Thr Ala

515 520 525

Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu Phe Thr Val Leu Glu Ala Thr Gly

530 535 540

Ile Phe Lys Lys Leu Pro Gln Leu Arg Lys Ile Asn Phe Ser Asn Asn

545 550 555 560

Lys Ile Thr Asp Ile Glu Glu Gly Ala Phe Glu Gly Ala Ser Gly Val

565 570 575

Asn Glu Ile Leu Leu Thr Ser Asn Arg Leu Glu Asn Val Gln His Lys

580 585 590

Met Phe Lys Gly Leu Glu Ser Leu Lys Thr Leu Met Leu Arg Ser Asn

595 600 605

Arg Ile Thr Cys Val Gly Asn Asp Ser Phe Ile Gly Leu Ser Ser Val

610 615 620

Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Gln Ile Thr Thr Val Ala Pro Gly

625 630 635 640

Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu Ser Thr Leu Asn Leu Leu Ala Asn

645 650 655

Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu Ala Trp Leu Gly Glu Trp Leu Arg

660 665 670

Lys Lys Arg Ile Val Thr Gly Asn Pro Arg Cys Gln Lys Pro Tyr Phe

675 680 685

Leu Lys Glu Ile Pro Ile Gln Asp Val Ala Ile Gln Asp Phe Thr Cys

690 695 700

Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser Cys Ser Pro Leu Ser Arg Cys Pro

705 710 715 720

Thr Glu Cys Thr Cys Leu Asp Thr Val Val Arg Cys Ser Asn Lys Gly

725 730 735

Leu Lys Val Leu Pro Lys Gly Ile Pro Arg Asp Val Thr Glu Leu Tyr

740 745 750

Leu Asp Gly Asn Gln Phe Thr Leu Val Pro Lys Glu Leu Ser Asn Tyr

755 760 765

Lys His Leu Thr Leu Ile Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile Ser Thr Leu

770 775 780

Ser Asn Gln Ser Phe Ser Asn Met Thr Gln Leu Leu Thr Leu Ile Leu

785 790 795 800

Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys Ile Pro Pro Arg Thr Phe Asp Gly Leu

805 810 815

Lys Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu His Gly Asn Asp Ile Ser Val Val

820 825 830

Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Leu Ser Ala Leu Ser His Leu Ala Ile

835 840 845

Gly Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp Cys Asn Met Gln Trp Leu Ser Asp

850 855 860

Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lys Glu Pro Gly Ile Ala Arg Cys Ala Gly

865 870 875 880

Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser Lys Lys

885 890 895

Phe Thr Cys Gln Gly Pro Val Asp Val Asn Ile Leu Ala Lys Cys Asn

900 905 910

Pro Cys Leu Ser Asn Pro Cys Lys Asn Asp Gly Thr Cys Asn Ser Asp

915 920 925

Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Tyr Gly Phe Lys Gly Gln

930 935 940

Asp Cys Asp Val Pro Ile His Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys Lys His

945 950 955 960

Gly Gly Thr Cys His Leu Lys Glu Gly Glu Glu Asp Gly Phe Trp Cys

965 970 975

Ile Cys Ala Asp Gly Phe Glu Gly Glu Asn Cys Glu Val Asn Val Asp

980 985 990

Asp Cys Glu Asp Asn Asp Cys Glu Asn Asn Ser Thr Cys Val Asp Gly

995 1000 1005

Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Leu Cys Pro Pro Glu Tyr Thr Gly Glu Leu

1010 1015 1020

Cys Glu Glu Lys Leu Asp Phe Cys Ala Gln Asp Leu Asn Pro Cys Gln

1025 1030 1035 1040

His Asp Ser Lys Cys Ile Leu Thr Pro Lys Gly Phe Lys Cys Asp Cys

1045 1050 1055

Thr Pro Gly Tyr Val Gly Glu His Cys Asp Ile Asp Phe Asp Asp Cys

1060 1065 1070

Gln Asp Asn Lys Cys Lys Asn Gly Ala His Cys Thr Asp Ala Val Asn

1075 1080 1085

Gly Tyr Thr Cys Ile Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Glu

1090 1095 1100

Phe Ser Pro Pro Met Val Leu Pro Arg Thr Ser Pro Cys Asp Asn Phe

1105 1110 1115 1120

Asp Cys Gln Asn Gly Ala Gln Cys Ile Val Arg Ile Asn Glu Pro Ile

1125 1130 1135

Cys Gln Cys Leu Pro Gly Tyr Gln Gly Glu Lys Cys Glu Lys Leu Val

1140 1145 1150

Ser Val Asn Phe Ile Asn Lys Glu Ser Tyr Leu Gln Ile Pro Ser Ala

1155 1160 1165

Lys Val Arg Pro Gln Thr Asn Ile Thr Leu Gln Ile Ala Thr Asp Glu

1170 1175 1180

Asp Ser Gly Ile Leu Leu Tyr Lys Gly Asp Lys Asp His Ile Ala Val

1185 1190 1195 1200

Glu Leu Tyr Arg Gly Arg Val Arg Ala Ser Tyr Asp Thr Gly Ser His

1205 1210 1215

Pro Ala Ser Ala Ile Tyr Ser Val Glu Thr Ile Asn Asp Gly Asn Phe

1220 1225 1230

His Ile Val Glu Leu Leu Ala Leu Asp Gln Ser Leu Ser Leu Ser Val

1235 1240 1245

Asp Gly Gly Asn Pro Lys Ile Ile Thr Asn Leu Ser Lys Gln Ser Thr

1250 1255 1260

Leu Asn Phe Asp Ser Pro Leu Tyr Val Gly Gly Met Pro Gly Lys Ser

1265 1270 1275 1280

Asn Val Ala Ser Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Asn Gly Thr Ser Phe

1285 1290 1295

His Gly Cys Ile Arg Asn Leu Tyr Ile Asn Ser Glu Leu Gln Asp Phe

1300 1305 1310

Gln Lys Val Pro Met Gln Thr Gly Ile Leu Pro Gly Cys Glu Pro Cys

1315 1320 1325

His Lys Lys Val Cys Ala His Gly Thr Cys Gln Pro Ser Ser Gln Ala

1330 1335 1340

Gly Phe Thr Cys Glu Cys Gln Glu Gly Trp Met Gly Pro Leu Cys Asp

1345 1350 1355 1360

Gln Arg Thr Asn Asp Pro Cys Leu Gly Asn Lys Cys Val His Gly Thr

1365 1370 1375

Cys Leu Pro Ile Asn Ala Phe Ser Tyr Ser Cys Lys Cys Leu Glu Gly

1380 1385 1390

His Gly Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Glu Asp Leu Phe Asn Pro Cys

1395 1400 1405

Gln Ala Ile Lys Cys Lys His Gly Lys Cys Arg Leu Ser Gly Leu Gly

1410 1415 1420

Gln Pro Tyr Cys Glu Cys Ser Ser Gly Tyr Thr Gly Asp Ser Cys Asp

1425 1430 1435 1440

Arg Glu Ile Ser Cys Arg Gly Glu Arg Ile Arg Asp Tyr Tyr Gln Lys

1445 1450 1455

Gln Gln Gly Tyr Ala Ala Cys Gln Thr Thr Lys Lys Val Ser Arg Leu

1460 1465 1470

Glu Cys Arg Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gln Cys Cys Gly Pro Leu Arg

1475 1480 1485

Ser Lys Arg Arg Lys Tyr Ser Phe Glu Cys Thr Asp Gly Ser Ser Phe

1490 1495 1500

Val Asp Glu Val Glu Lys Val Val Lys Cys Gly Cys Thr Arg Cys Val

1505 1510 1515 1520

Ser

Claims

1.血清Slit2的检测试剂在制备结直肠癌诊断制剂方面的应用。

2.血清Slit2的检测试剂在制备结直肠癌远处转移监测制剂方面的应用。

3.血清Slit2的抑制剂在制备结直肠癌治疗试剂方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗试剂是能够抑制结直肠癌细胞的生长、增殖和/或转移的治疗试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为Slit2/Robo1信号抑制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述血清为外周血血清。