ES2869909T3 - Composiciones y métodos para la modificación del receptor de la proteína tensioactiva A - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal (mAb) o su fragmento que se une con especificidad al receptor SP-R210 de la proteína tensioactiva A, que comprende: (I) una secuencia de cadena pesada variable que comprende: a) una región 1 determinante de complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR1) que comprende la secuencia GYIFSDYYMR (SEQ ID NO:3); y b) una región 2 determinante de complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR2) que comprende la secuencia DINPKNGDTFYNQKFKGK (SEQ ID NO:4); y c) una región 3 determinante de complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR3) que comprende la secuencia REGD (SEQ ID NO: 5); y una secuencia de cadena ligera variable que comprende: d) una región 1 determinante de complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR1) que comprende la secuencia RSSQTILHSNGNTYLE (SEQ ID NO:6); y e) una región 2 determinante de complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR2) que comprende la secuencia KVSKRFS (SEQ ID NO: 7): y f) una región 3 determinante de complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR3) que comprende la secuencia LQGSHVPLT (SEQ ID NO:8); y en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de (I) se une con especificidad solo a la isoforma SP-R210S del receptor SP-R210.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la modificación del receptor de la proteína tensioactiva A
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad a la solicitud de patente de EE. UU. núm. 62/024,314, presentada el 14 de julio de 2014, y a la Solicitud de patente de EE. UU. núm. 62/121,830, presentada el 27 de febrero de 2015.
Campo
La presente descripción se refiere en general a composiciones para profilaxis, terapia y diagnóstico de afecciones que incluyen respuestas inmunitarias mediadas por macrófagos.
Antecedentes
La proteína tensioactiva A (SP-A) es un componente crucial del sistema inmunitario innato pulmonar en los espacios alveolares. SP-A es el componente proteico principal del surfactante pulmonar; participa en la organización de grandes agregados de fosfolípidos surfactantes que recubren la superficie alveolar y actúa como una opsonina para los patógenos. SP-A se incorpora en la fracción de mielina tubular del surfactante pulmonar que cubre el fluido de revestimiento alveolar del epitelio distal de las vías respiratorias. La presencia de moléculas derivadas de patógenos puede desencadenar la reorganización de los lípidos del surfactante y la exposición de SP-A para unirse a los patógenos en los puntos de entrada en la interfaz del surfactante. Los macrófagos alveolares en la hipofase acuosa pueden entonces patrullar las áreas de alteración en la capa de surfactante que se une a las bacterias opsonizadas con SP-A, y se ha demostrado que la SP-A juega un papel importante en la modulación de la fagocitosis mediada por el receptor del complemento. En este sentido, SP-A modula la fagocitosis de los macrófagos y una serie de respuestas proinflamatorias y antiinflamatorias que ayudan a erradicar la infección primero y después, a la resolución de la inflamación in vivo. Se han implicado varios receptores de macrófagos en la capacidad de SP-A para coordinar la eliminación de patógenos y células apoptóticas y el control temporal de la inflamación en los pulmones. El receptor SP-A SP-R210 se identificó como isoformas de superficie celular de Myo18A no convencional (Yang C. H. y otros (2005) J. Biol. Chem. 280, 34447-34457). El gen Myo18A codifica dos isoformas SP-R210 empalmadas alternativamente, SP-R210l y SP-R210s . La isoforma SP-R210l más larga de 230-240 kDa contiene un módulo de interacción de la proteína PDZ amino-terminal que está ausente del SP-R210s más corto de 210 kDa. SP-R210s se expresa altamente tanto en macrófagos maduros como en células monocíticas inmaduras. Sin embargo, SP-R210l solo se expresa en macrófagos maduros. Mori y otros (Journal of Biochemistry, 133 (4), págs.
405 - 413) describe la estructura del genoma y la expresión diferencial de dos isoformas de una miosina que contiene PDZ (MysPDZ) (Myo18A). Por tanto, por diversas razones, existe la necesidad de desarrollar composiciones y métodos novedosos para modificar/unirse selectivamente a las distintas isoformas de SP-R210. La presente descripción satisface estas y otras necesidades.
Resumen
La presente descripción proporciona composiciones y composiciones para el uso en métodos para la profilaxis, terapia y diagnóstico de afecciones que implican receptores de proteínas surfactantes (SPR) que incluyen la SPR para proteínas surfactantes A (SPA). En particular, el receptor SP-A conocido como SP-R210 se expresa por macrófagos en al menos dos isoformas, a saber, las isoformas SP-R210l y SP-R210s, siendo la isoforma SP-R210l predominante en, por ejemplo, macrófagos alveolares. La descripción incluye parejas de unión específicas novedosas para las isoformas SP-R210l y SP-R210s, y métodos para usar dichas parejas de unión.
De acuerdo con la invención, se proporciona un fragmento o anticuerpo monoclonal que se une con especificidad solo a la isoforma SP-R210S del receptor SP-R210.
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Las modalidades y/o ejemplos de la siguiente descripción, que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas, no se consideran parte de la presente invención.
En un aspecto, la descripción comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno, en donde el anticuerpo monoclonal se produce por un hibridoma descrito en la Figura 14. En modalidades, el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma de la Figura 14, pero el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno se produce de manera recombinante. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de unión a antígeno se proporcionan en preparaciones farmacéuticas.
En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales y/o sus fragmentos se producen por el hibridoma denominado P2H10 como se muestra en la Figura 14, o se producen de forma recombinante y tienen las mismas secuencias de aminoácidos, o las mismas secuencias CDR, de los mAb producidos por el hibridoma denominado P2H10 como se
muestra en la Figura 14. En ciertas descripciones, los anticuerpos monoclonales y/o sus fragmentos se producen por el hibridoma denominado P4G4 como se muestra en la Figura 14, o se producen de forma recombinante y tienen las mismas secuencias de aminoácidos, o las mismas secuencias CDR, de los mAb producidos por el hibridoma denominado P4G4 como se muestra en la Figura 14. En las modalidades, los mAb o sus fragmentos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos o su fragmento que se muestra en la Figura 30A, Figura 30C, Figura 30E, Figura 30G y combinaciones de estas. Los ejemplos no limitantes de secuencias de ADN que codifican tales mAb y fragmentos se ilustran en las Figuras 30B, 30D, 30F y 30H, respectivamente.
En ciertos aspectos, los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales descritos en esta descripción incluyen, pero no necesariamente se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, fragmentos scFv y sus combinaciones. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de unión a antígeno pueden proporcionarse como componentes de una proteína de fusión.
En otro aspecto, la descripción incluye una composición para el uso en métodos de profilaxis y/o terapia para un individuo que la necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición que comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno, como se describe adicionalmente en la presente. En ciertas modalidades, el individuo al que se administra una composición que comprende tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno necesita tratamiento de una afección seleccionada de una infección bacteriana, una infección viral o cualquier otra afección en donde esté presente una inflamación indeseable. En modalidades, el individuo tiene una neumonía viral. En modalidades, el individuo necesita tratamiento contra la influenza viral.
En un aspecto, la descripción incluye un método para inhibir la unión de un microorganismo patógeno a macrófagos en un individuo que comprende introducir en el individuo una composición farmacéutica descrita en la presente. En modalidades, la administración evita o inhibe una cascada de señalización que iniciaría al menos en parte dicha unión del microorganismo patógeno a los macrófagos.
En otro aspecto, la descripción incluye un método para preparar un anticuerpo monoclonal que comprende aislar el anticuerpo monoclonal de un medio de cultivo que comprende un hibridoma descrito adicionalmente en la presente. En otro aspecto, la descripción incluye un método para preparar un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno que comprende introducir un vector de expresión que codifica el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno en un cultivo celular, lo que permite la expresión del anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno, y aislar el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno a partir del cultivo celular. Los vectores de expresión que codifican un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno, así como también los cultivos celulares que comprenden dichos vectores de expresión, se incluyen además dentro del alcance de esta descripción.
Todos los polinucleótidos que codifican los mAb y sus fragmentos de unión a Ag se incluyen en esta descripción, al igual que los métodos para preparar dichos anticuerpos.
En otro aspecto, la presente descripción incluye un método para inhibir la unión de un microorganismo patógeno a una población de macrófagos en un individuo que comprende introducir en el individuo una composición farmacéutica de esta descripción.
En otro aspecto, la presente descripción incluye un método para preparar un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno que comprende introducir un vector de expresión que codifica el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno en un cultivo celular, lo que permite la expresión del anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno, y aislar el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno a partir del cultivo celular.
En otro aspecto, la presente descripción incluye la modulación de SP-R210 de manera que se induce una expresión aumentada de uno o más receptores innatos en al menos un tipo de célula, tal como en las células inmunitarias. En modalidades no limitantes, puede lograrse una expresión aumentada de 2 a 20 veces de varios receptores innatos en los niveles de proteínas (TLR-2, CD11c, CD36 y CD14) y transcripcionales (SR-A, CD11b) tras interrumpir la expresión/función de SP-R210l.
En varios aspectos, la descripción también incluye modular la capacidad de respuesta de los macrófagos a ciertos agentes, que incluyen pero no necesariamente se limitan a LPS, mediante la modulación de SP-R210L.
En varios aspectos, la descripción también incluye la activación de la señalización de TLR4 en macrófagos, y puede comprender además modular la internalización de CD14 y TLR-4, tras modular a SP-R210l.
En las modalidades, la descripción generalmente comprende modificar los SP-R210 para facilitar la resolución de la neumonía por influenza. La descripción incluye mejorar la inmunidad mediada por células T, tales como reacciones inmunitarias mediadas por células a la influenza mediante la modulación de los linfocitos T efectores. En modalidades, la descripción comprende impartir inmunidad protectora cruzada contra una pluralidad de cepas del virus de la influenza A.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona una representación gráfica de la organización del dominio del receptor SP-A SP-R210 y sus dos isoformas SP-R210l y SP-R210s . El recuadro de la Figura 1 demuestra que SP-R210 se expresa en la superficie de los macrófagos según lo determinado por citometría de flujo. Las células se incubaron con IgG de control no específico y un anticuerpo que se une al dominio carboxi-terminal de SP-R210, denominado IgG anti-SP-R210. Las células se interrogaron posteriormente con anticuerpos anti-IgG fluorescentes secundarios para determinar el nivel de unión de las IgG primarias. La señal roja informa el nivel como intensidad fluorescente de SP-R210 en el eje x, que está claramente separado de la señal azul para la IgG de control de fondo. Por lo tanto, SP-R210 está presente en la membrana celular con acceso al entorno externo de la célula.
Figura 2. Ubicación del epítopo de alineación de secuencias de proteínas de dominios SP-R210 carboxi-terminales (cooh) de ratón (Ms) y humanos (Hu) de SP-R210S y SP-R210L. Los epítopos reconocidos por un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma denominado P4G4 comprenden KYQKKKNK (SEQ ID NO: 15) y VKSWLSKNK (SEQ ID NO: 16) se muestran en negrita y cursiva, lo que produce un motivo de consenso de KxxxxKNK (SEQ ID NO: 17). Un epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma denominado P2H10 que también se describe a continuación y comprende DLINSLQD (SEQ ID NO: 18) se muestra en negrita. En particular, los epítopos KYQKKKNK (SEQ ID NO: 15) y DLINSLQD (SEQ ID NO: 18) abarcan una inserción de 15 aminoácidos única para SP-R210s como se describe a continuación.
La Figura 3 proporciona una representación gráfica de un procedimiento de clonación para generar una alteración condicional de SP-R210 en m O en ratones transgénicos. Ms SP-R210scooh (SEQ ID NO:19); Ms SP-R210Lcooh (SEQ ID NO:20); Hu SP-R210scooh (SEQ ID NO:21); Hu SP-R210Lcooh (SEQ ID NO:22).
La Figura 4 proporciona una representación fotográfica y gráfica de los datos que demuestran que la falta de SP-R210l bloquea la infección del virus de la influenza A (IAV) en MO.
La Figura 5 proporciona datos que demuestran que la falta de SP-R210l no afecta la unión e internalización de IAV, pero el tráfico endocítico de NP al núcleo se bloquea cuando SP-R210l está ausente.
La Figura 6 proporciona una representación gráfica de los datos que demuestran que la infección de MO por IAV mediada por SP-R210L se acopla a la producción de TNFa.
La Figura 7 proporciona representaciones gráficas de datos que demuestran que los MO y los AM deficientes en SP-R210l son hipersensibles a los ligandos de TLR7.
La Figura 8 proporciona una representación gráfica y fotográfica de los datos que muestran que la infección por IAV da como resultado la inhibición de la expresión de SP-R210L de una manera dependiente del tiempo.
La Figura 9 proporciona datos gráficos e inmunohistoquímicos que demuestran que los ratones deficientes en SP-R210L son significativamente más susceptibles a la infección por IAV.
La Figura 10 proporciona imágenes de microscopía que demuestran la unión mediada por isoformas de SR-R210 y la internalización en macrófagos.
La Figura 11 proporciona datos gráficos que muestran que la alteración de SP-R210 en macrófagos alveolares (AM) retrasa la replicación de IAV in vivo.
La Figura 12 proporciona datos gráficos y de citometría de flujo que muestran que los anticuerpos contra SP-R210 inhiben la infección por IAV.
La Figura 13 proporciona datos de citometría de flujo que demuestran que el SPA desialilado (DS) bloquea la infección de macrófagos con IAV. Por tanto, SP-A inhibe competitivamente la unión del virus de la influenza al receptor.
La Figura 14 proporciona una Tabla que resume los hibridomas que se generaron tras inmunizar ratones con la proteína r350 y seleccionar contra las proteínas r350 y r300 (r = recombinante; las proteínas 350 y 300 son como se representan en la Figura 1). La tabla proporciona 1datos de ELISA para: Selección de fusión (hibridomas) para posibles positivos. 2R350 = U18AC2; R300 = U18AC2. 3Los anticuerpos se evaluaron frente a antígeno intacto y desnaturalizado para seleccionar la conformación frente a anticuerpos de epítopo lineal; 4Anticuerpos que inhiben la
unión del virus de la influenza A a los macrófagos; 5Anticuerpos que reconocen la proteína nativa por inmunoprecipitación se indican como ip; 6Se prepararon anticuerpos monoclonales de ratón mediante el uso de procedimientos estándar. Se inmunizaron ratones BALB/c mediante el uso de la proteína SP-R210cl (R350) murina recombinante purificada en adyuvante RIBI. Las inmunizaciones se suministraron tanto por vía subcutánea como intraperitoneal en volúmenes de 0,05 ml por sitio por ratón por inmunización. Las inmunizaciones se administraron 3 veces bisemanalmente, la inmunización de refuerzo final se administró como proteína en solución salina. Tres días después de la inmunización de refuerzo final, los ratones se anestesiaron mediante el uso de ketamina/xilazina y se extrajeron el bazo y los ganglios linfáticos después del desangrado. Se prepararon suspensiones de células individuales de células inmunitarias y se fusionaron con células de mieloma P3X63-Ag8.653 para la producción de hibridomas. Los sobrenadantes de cultivos de hibridomas se seleccionaron mediante ELISA para determinar la reactividad a SP-R210cl y SP-R210cs (R300) y se aislaron cultivos positivos para expansión y clonación. Los clones positivos que producen anticuerpos reactivos en ELISA se adaptaron a condiciones sin suero mediante el uso del medio de cultivo sin suero Sigma EX-CELL 610HSF para la producción a gran escala de anticuerpos monoclonales. Figura 15. Alteración dominante-negativa de SP-R210L. Las células Raw264.7 se transfectaron de forma estable con un control pTriexNeo2 vacío o un vector que contenía el ADNc de 300 (SP-R210l(DN1)) y 350 (SP-R210l(DN2)) pb de las isoformas carboxi-terminales de SP-R210 (6). A) Los extractos de detergente se analizaron mediante transferencia Western mediante el uso de anticuerpos policlonales purificados por afinidad que reconocen tanto a SP-R210l como a SP-R210s. Los carriles se cargaron con 5 pg de proteína. B) El ARN total de las líneas celulares indicadas se transcribió de forma inversa y se cuantificó mediante qPCR mediante el uso de ensayos TaqMan y cebadores que abarcan los exones 1 y 2 específicos de SP-R210L (barras rojas) y cebadores internos que abarcan los exones 17 y 18 comunes a ambas isoformas de SP-R210 (barras negras) y ARNr 18S como control interno. (n=4 ***p<0,001).
Figura 16. La disminución de SP-R210l mejora de manera diferencial la expresión de receptores innatos en macrófagos. Las células controles y SP-R210l(DN) se analizaron mediante citometría de flujo mediante el uso de APC (A) o los anticuerpos conjugados con PE indicados (B, C) (n = 4-8). (D) Los niveles de ARNm de los receptores indicados en las células SP-R210l(DN) en relación con las células controles se determinaron mediante qRT-PCR (n=4 experimentos independientes realizados por duplicado, **p<0,02, ***p<0,005).
Figura 17. Mayor capacidad de respuesta de las células SP-R210l(DN) a LPS. Las células controles y SPR210L(DN) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos a una densidad de 150000 células/pocillo y se cultivaron durante 24 horas en RPMI/FBS 10 %. A continuación, las células se trataron con 100 ng/ml de LPS durante 2, 4, 8, 16 y 24 horas. A) La tinción intracelular de TNFa se realizó en células bloqueadas con brefeldina A 2 horas después del tratamiento con LPS. Los histogramas de puntos muestran células no tratadas. Los histogramas negros, rojos y azules muestran tinción con TNFa intracelular de las células controles, SP-R210l(DN)1 y SP-R210l(DN)2. B) Los niveles de TNFa secretado se midieron mediante ELISA en el medio en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento con LPS. (n=6; ***p<0,005).
Figura 18. SP-A induce la expresión de SP-R210. La expresión de SP-R210 se determinó mediante análisis de transferencia Western en células controles (A) y SP-R210l(DN) (B) tratadas con una concentración creciente de SP-A purificada mediante el método 1. Las células también se trataron con LPS 100 ng/ml. Las transferencias se volvieron a sondar con actina como control de carga. Las células controles (A) y SP-R210l(DN) (B) se cultivaron en placas de 12 pocillos durante 24 horas y después se trataron con una concentración creciente de SP-A o 100 ng/ml de LPS. La intensidad de la banda de SP-r210l, SP-R210s y actina se determinó por densitometría. Los datos de densitometría se normalizaron a actina y se expresaron en relación a SP-R210L en células controles no tratadas (NT) (A) y a SP-R210S en células SP-R210l(DN) (B).
Figura 19. SP-A mejora la expresión de SP-R210l en macrófagos alveolares in vivo. Los macrófagos alveolares se aislaron mediante lavado pulmonar y se procesaron para transferencia Western (A) y análisis de densitometría (B) mediante el uso de anticuerpos policlonales anti-SP-R210. ***p<0,001, n=8 ratones WT y n=6 ratones SR-=A-/- de dos experimentos independientes.
Figura 20. SP-A y SP-R210L modulan la capacidad de respuesta de los macrófagos a LPS. Las células controles y SP-R210l(DN) se trataron previamente con SP-A de APF-1 (Figura 27) purificadas mediante el método 1 (SP-Am1) o el método 2 (SP-Am2) como se describe en la presente. Las células se trataron previamente con las cantidades indicadas de SP-Am1 (A) o SP-Am2 (B) durante 24 horas y después se incubaron con 100 ng/ml de LPS. Los niveles de TNFa secretado se midieron en el medio mediante ELISA 4 horas después de la adición de LPS. Los datos mostrados son medias ± SD, n = 3 representativos de 3-6 experimentos independientes. Las líneas indican diferencias significativas entre los grupos indicados a *p<0,0001; #p<0,04; $p<0,005.
Figura 21. Interacción de SP-R210 con receptores innatos. Los experimentos de inmunoprecipitación se llevaron a cabo mediante el uso de extractos de células de 10 mg/ml (A y B) o 2,5 mg/ml (C) de macrófagos de controles y SP-R210l(DN) con anti-SP-R210 (A) policlonal, CD11b monoclonal (B), para evaluar el efecto del tratamiento con LPS, se llevaron a cabo reacciones de inmunoprecipitación 10, 30, 60 y 120 min después del tratamiento con 100 ng/ml de LPS (C). Las proteínas precipitadas conjuntamente se separaron en geles de SDS-PAGE y se transfirieron con los anticuerpos indicados. Los extractos inmunoprecipitados con anti-SP-R210 monoclonal se volvieron a sondar con
anticuerpos SP-R210 policlonales. Una IgG1 monoclonal contra un antígeno viral no relacionado sirvió como control (C) . Los resultados mostrados son representativos de 2-4 experimentos independientes.
Figura 22. Efecto de los anticuerpos neutralizantes sobre la respuesta inflamatoria a LPS. Los macrófagos de controles y SP-R210l(DN) se trataron previamente durante 30 min con 20 pg/ml de combinaciones de anticuerpos o indicados individualmente o controles de isotipo respectivos seguidos de estimulación con 100 ng/ml de LPS durante 4 h. A continuación, se recogieron las células y se procesaron mediante tinción de citocinas intracelulares con anticuerpos TNFa. Las células teñidas se analizaron mediante citometría de flujo. La fluorescencia media de las células teñidas positivamente se expresó como por ciento de las células tratadas con el control de isotipo. Los datos mostrados se expresan como medias ± SD y se combinan a partir de 2-4 experimentos independientes realizados por triplicado. *p<0,04.
Figura 23. Activación de la señalización TLR4 en células controles y SP-R210l(DN). Los macrófagos se estimularon con 100 ng/ml de LPS durante los puntos de tiempo indicados. Las células no estimuladas (NS) y estimuladas se recogieron y procesaron para análisis de transferencia Western. Las transferencias se sondaron con anticuerpos IRAK-1 (A) o NFkB p65 (B), se separaron y se volvieron a sondar con IkB o p65 fosforilado, respectivamente. Las transferencias se volvieron a sondar con tubulina como control de carga. El análisis de densitometría comparó los niveles de p65 fosforilado en relación con la tubulina (C). Los datos mostrados son medias ± SD, n = 4 de experimentos independientes. *p<0,05.
Figura 24. Translocación nuclear de NFkB en células controles y SP-R210l (DN). Los macrófagos se cultivaron en cubreobjetos de vidrio durante 24 horas y después se estimularon con 100 ng/ml de LPS. A continuación, las células estimuladas se procesaron para la tinción inmunofluorescente con anti-p65 NFkB en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento con LPS. La localización nuclear de NFkB se visualizó mediante microscopía confocal (A). El porcentaje de células que contienen p65 nuclear se cuantificó en 10 campos microscópicos aleatorios con un aumento de 100 x (B). Los datos mostrados son medias ± SD, n = 4 experimentos independientes. **p<0,01.
Figura 25. Efecto de la alteración de SP-R210L en la internalización y señalización de CD14 y TLR-4. Los macrófagos cultivados durante 24 horas en placas de 12 pocillos se simularon con 100 ng/ml de LPS para los puntos de tiempo indicados. A continuación, las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados mediante el uso de medio de desplazamiento celular no enzimático y se tiñeron con anticuerpos contra CD14 (A y B) o TLR-4 (C). El efecto de dynasore sobre la internalización de CD14 (B) y de dynasore, EIPA y NSC23766 sobre la síntesis de TNFa (D) se evaluó mediante la adición de inhibidores 30 min antes de la adición de LPS. Las células recogidas se analizaron mediante citometría de flujo y la fluorescencia media se expresó como % de control en comparación con el control no estimulado o células SP-R210l(DN) (t = 0) (A-C) o como por ciento de TNFa de control en SP-R210l(DN) en comparación con las células controles (D). Los datos mostrados son medias ± SD, n = 2-4 experimentos independientes realizados por triplicado. ***p<0,01, *p<0,04.
Figura 26. Propuesta de interacción de las isoformas de SP-R210 con CD14 y SR-A en la activación de macrófagos. SP-R210L media la macropinocitosis de LPS-CD14 a través de la interacción con rac1, lo que da como resultado el suministro de LPS endosomal a TLR-4 y la activación aguas abajo de NFKB. La degradación subsiguiente de LPS da como resultado la señalización de NFkB. La macropinocitosis y la señalización mediadas por SP-R210L son sensibles tanto a EIPA como a NSC23766. La señalización de TLR-4 desde la superficie celular es sensible a dynasore. La inhibición de la expresión de SP-R210l da como resultado la formación del complejo SP-R210s-CD14-SR-A. La unión de LPS da como resultado una internalización similar a la macropinocitosis del complejo SP-R210s-CD14-SR-A y la activación de una vía inflamatoria de retroalimentación que depende de la activación de rac1 por SR-A. La vía SP-R210s-CD14-SR-A es sensible a NSC23766 pero no a EIPA.
Figura 27. Aislamientos conjuntos de SP-B con SP-A. (A). Se purificó SP-A a partir de fluido de proteinosis alveolar (APF) obtenido mediante lavado pulmonar terapéutico de diferentes pacientes con proteinosis alveolar mediante el uso de los métodos 1 y 2 como se describe en Materiales y métodos. La pureza de SP-A se evaluó mediante tinción con plata. Las bandas aisladas conjuntamente de bajo peso molecular se digirieron con tripsina y se identificaron como SP-B por espectrometría de masas (no mostrado). (B). La presencia de SP-B se verificó mediante análisis de transferencia Western. Las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE reductores (Figura 27A) o no reductores (Figura 27B) 4-17 %. El SP-A purificado por ambos métodos estaba libre de SP-D (no mostrado). Todos los experimentos del presente estudio se realizaron mediante el uso de SP-A purificado a partir de APF-1. Las flechas indican las posiciones de SP-B y SP-A.
Figura 28A. Los anticuerpos monoclonales SP-R210 mejoran la recuperación de la neumonía por influenza. Se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal 100 pg de anticuerpos o 100 pl de vehículo de PBS 24 horas antes de la infección con el virus de la influenza H1N1 PR8 LD50 3. La morbilidad y el peso de los ratones se controlaron diariamente. IgG1: anticuerpo de control de isotipo; P2H10: anticuerpo anti-SP-R210s; P4G4: anticuerpo anti-SP-R210l + s . N = 5 ratones por grupo. Figura 28B. Los anticuerpos monoclonales SP-R210 mejoran la supervivencia a la letalidad para la infección por influenza. Se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal 100 pg de anticuerpos o 100 pl de vehículo de PBS 24 horas antes de la infección con 1000 ffc del virus de la influenza H1N1 PR8. La
morbilidad y el peso de los ratones se controlaron diariamente. IgG1: anticuerpo de control de isotipo; P2H10: anticuerpo anti-SP-R210s; P4G4: anticuerpo anti-SP-R210L s. N = 5 ratones por grupo. *p<0,04.
Figura 29. La deleción de SP-R210 en células dendríticas CD103+ mejora la recuperación de la infección por IAV y el reclutamiento de linfocitos T efectores. Los ratones que portaban un alelo insertado de SP-R210 flanqueado por LoxP se cruzaron con ratones Clec9A-Cre para alterar SP-R210 en CD103 DC. Los controles compañeros de camada WT y los ratones deficientes en DC SP-R210 se infectaron con una dosis subletal de IAV PR8 LD500,75 por vía intranasal. (A) Se controló el peso corporal a lo largo del tiempo durante 14 días. N = 4-12 ratones por grupo por punto de tiempo. A los 3, 7 y 14 días después de la infección, se usaron 4 ratones de cada grupo para obtener el lavado pulmonar. El número de linfocitos T efectores (B) y el número total de linfocitos (C) se determinó mediante citometría de flujo. Los datos mostrados en A-C son medias ± SEM.
Figura 30A. Mapeo de CDR de la cadena pesada variable anti-SPR210s producida por el hibridoma P2H10. Figura 30B. Secuencias codificantes de la cadena pesada variable anti-SP-R210s producida por el hibridoma P2H10. Las ubicaciones de las secuencias codificantes de CDR se muestran en negrita. Figura 30C. Mapeo de CDR de la cadena ligera variable anti-SPR210s producida por el hibridoma P2H10. Figura 30D. Secuencias codificantes de la cadena ligera variable anti-SP-R210s producida por el hibridoma P2H10. Las ubicaciones de las secuencias codificantes de CDR se muestran en negrita. Figura 30E. Mapeo de CDR de la cadena pesada variable anti-SPR210s+l producida por el hibridoma P4G4. Figura 30F. Secuencias codificantes de la cadena pesada variable anti-SP-R210s+L producida por el hibridoma P4G4. Las ubicaciones de las secuencias codificantes de CDR se muestran en negrita. Figura 30G. Mapeo de CDR de la cadena ligera variable anti-SPR210s+L producida por el hibridoma P4G4. Figura 30H. Secuencia codificante de cadena ligera variable anti-SP-R210s+L producida por el hibridoma P4G4. Las ubicaciones de las secuencias codificantes de CDR se muestran en negrita.
Descripción detallada
La presente descripción proporciona composiciones y composiciones para el uso en métodos de profilaxis, terapia y diagnóstico de afecciones que involucran patógenos microbiológicos y las células inmunitarias que participan en la respuesta inmunitaria innata dirigida hacia ellos. La descripción incluye métodos para modular la respuesta inmunitaria innata y, en particular, las vías inflamatorias, que se conoce que son facilitadas al menos en parte por los macrófagos. En modalidades, la descripción incluye métodos para modular respuestas mediadas por células. En modalidades, modular una respuesta inmunitaria comprende estimular una respuesta inmunitaria o inhibir una respuesta inmunitaria. En una modalidad, inhibir una respuesta inmunitaria comprende inhibir la inflamación y/o una vía inflamatoria.
Los macrófagos también se denominan algunas veces en esta descripción como "MO". Los macrófagos expresan receptores de proteínas surfactantes como los receptores de proteínas surfactantes A (SPA) y D (SPD). Estos receptores son una línea de defensa primaria contra, por ejemplo, infecciones bacterianas y virales, que incluyen, pero no se limitan de ninguna manera a infecciones por patógenos tales como Staphylococcus aureus y virus de la influenza. En particular, el receptor SP-A conocido como SP-R210 media la eliminación de patógenos opsonizados por SP-A. Como se discutió brevemente anteriormente, MO expresa al menos dos variantes de SP-R210, SP-R210l y SP-R210s. SP-R210l predomina, por ejemplo, en macrófagos alveolares (AM). La presente descripción demuestra, entre otros hallazgos, el papel de SP-R210l en la infección por el virus de la influenza A (IAV), y que los anticuerpos dirigidos a SP-R210 inhiben la internalización de macrófagos por IAV. Además, y como se demuestra a continuación, la presente descripción demuestra que los anticuerpos que reconocen SP-R210 con especificidad para la isoforma SP-R210s mejoran la recuperación de la neumonía por influenza e incluso pueden proteger contra el reto letal a la influenza. Por ejemplo, para obtener los datos presentados en la Figura 28, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con 100 pg de anticuerpos o 100 pl de vehículo de PBS 24 horas antes de la infección con el virus de la influenza H1N1 PR8 LD500,75. Como se muestra en la Figura 28A, los anticuerpos monoclonales anti-SP-R210 mejoran la recuperación de la neumonía por influenza. Además, como se muestra en la Figura 28B, los anticuerpos monoclonales anti-SP-R210 mejoran la supervivencia después del reto con una infección por influenza de otra manera letal. Esto es coherente con los datos mostrados en la Figura 29, que demuestran que la deleción de SP-R210 en células dendríticas CD103+ mejora la recuperación de la infección por IAV y el reclutamiento de linfocitos T efectores. Por lo tanto, la presente descripción demuestra numerosos efectos beneficiosos que se logran tras modificar la isoforma SP-R210s, que incluyen pero no necesariamente se limitan a la resolución de la neumonía por influenza, y que la modificación de la isoforma SP-R210s en células dendríticas mejora la inmunidad mediada por células T como lo indica la inducción y contracción rápida de los linfocitos T efectores. Además, estos datos sugieren que la inmunidad mediada por células T mejorada mediante la modificación de SP-R210s da como resultado una amplia inmunidad protectora cruzada contra todas las cepas del virus de la influenza A.
Con respecto a las dos isoformas de SP-R210, en la Figura 1 se proporciona una representación gráfica de la organización del dominio. La Figura 1 incluye la anotación de U18AC1 (SP-R210l) y U18AC2 (SP-R210s) en donde la región U18AC2 tiene un inserto único de 15 aminoácidos que se cree que define la forma S en los macrófagos.
El contexto de aminoácidos U18AC1 murino, que no contiene el inserto de 15 aminoácidos, es: EDEMESDENEDLINSEGDSDVDSELEDRVDGVKSWLSKNKGPSKAPSDDGSLKSSSPTSHWKPLAPDPSD
DEHDPVDSIFRPRFSHSYLSDSDTEAKLTETSA (SEQ ID NO:1). Esta secuencia de aminoácidos también se denomina en la presente descripción "R300". Esta secuencia está disponible con el número de acceso de GenBank AAV80767.1 para la variante de empalme CS de la subunidad alfa de SP-R210. El "CS" y "CL" denotan dos variantes del dominio SP-R210 carboxi-terminal a saber, "Carboxi-terminal grande" y "Carboxi-terminal pequeño", respectivamente, el E N-terminal es el residuo 1580 en SP-R210s y 1938 en SP-R210l.
El inserto único de U18AC2 murino es la secuencia de 15 aminoácidos que está subrayada y en cursiva como se muestra en el siguiente contexto de secuencia de aminoácidos: EDEMESDENEDLINSLQDMVTKYQKKKNKLEGDSDVDSELEDRVDRVKSWLSKNKGPSKAPSDDGSLKSS SPTSHWKPLAPDPSDDEHDPVDSISRPRFSHSYLSDSDTEAKLTETSA (SEQ ID NO:2). Esta secuencia de aminoácidos también se denomina en la presente descripción "R350". Esta secuencia está disponible con el número de acceso de GenBank AAV80766.1 para la variante de empalme CL de la subunidad alfa de SP-R210.
La Figura 2 proporciona un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos CS y CL del carboxi-terminal de SP-R210 murino (MSP) y humano (HSP). Los aminoácidos coloreados indican diferencias entre la secuencia murina y humana como se indica en la leyenda. Para ciertas modalidades de esta descripción, como se demuestra en los ejemplos y la Tabla presentados en la presente descripción, usamos la secuencia de R350 murino (SP-R210CL) para inmunizar ratones. Esta proteína comprende una etiqueta de seis histidinas en el extremo carboxilo para el uso en la purificación de proteínas. El péptido distintivo de CL está ausente en CS y es idéntico a una única sustitución conservada de K a R entre CL de ratón y humano y hemos demostrado que los anticuerpos murinos tienen reactividad cruzada con el homólogo humano.
Un aspecto de la presente descripción comprende parejas de unión novedosas que se unen con especificidad al receptor de la proteína tensioactiva humana A (SP-A). En modalidades, las parejas de unión comprenden anticuerpos y/o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen con especificidad a una isoforma de SP-A. La isoforma a la que se unen las parejas de unión específicas puede ser la isoforma SP-R210l. En modalidades, la isoforma a la que se unen las parejas de unión específicas es la isoforma SP-R210s .
Hemos generado una serie de hibridomas que se caracterizan en la Tabla que se presenta en la Figura 14. Cada uno de estos hibridomas, así como los cultivos celulares que los comprenden y su progenie, están incluidos en la invención. Además, cada uno de los polinucleótidos que codifican los anticuerpos producidos por los hibridomas se incluyen en la invención en sus formas nativas y aisladas, al igual que los ARNm que producen en sus formas nativa y aislada, al igual que los ADNc generados a partir de esos ARNm. Se incluyen vectores de expresión que comprenden polinucleótidos que codifican los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión a antígeno, así como cultivos celulares que contienen dichos vectores de expresión. En modalidades, la presente descripción comprende la preparación de anticuerpos monoclonales (mAb) producidos por los hibridomas establecidos en la Tabla de la Figura 14 tras aislar los mAb del medio de hibridoma, así como métodos recombinantes para producir los mAb y sus fragmentos de unión a antígeno tras introducir un vector de expresión que codifica tal mAb o su fragmento de unión a antígeno en un cultivo celular, lo que permite la expresión del mAb o su fragmento de unión a antígeno, y aislar el mAb producido de forma recombinante o su fragmento de unión a antígeno del cultivo celular. En modalidades, los polinucleótidos proporcionados por la invención codifican una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los mAb. En modalidades, los polinucleótidos codifican las CDR1, CDR2, CDR3 o una combinación de estas.
Por tanto, en un aspecto, la presente descripción comprende una o más parejas de unión aisladas y/o sintetizadas de forma recombinante o de cualquier otro modo que reconocen específicamente la isoforma SP-R210l o la isoforma SP-R210s . Dichas parejas de unión pueden incluir anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno que pueden unirse específicamente y distinguir las isoformas de SP-A entre sí. En modalidades, los fragmentos de unión a antígeno pueden comprender fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, fragmentos scFv, aptámeros y diacuerpos. Los anticuerpos dirigidos a la isoforma SP-R210s pueden unirse con especificidad a uno o más epítopos en la secuencia única de 15 aminoácidos descrita anteriormente como componente de la secuencia de aminoácidos U18AC2 (SP-R210s) que se cree que define la forma S en macrófagos. En otra modalidad, la secuencia única de 15 aminoácidos está compuesta por o participa en la formación de un epítopo conformacional que es específicamente reconocido por un mAb o su fragmento de unión a antígeno. Asimismo, en ciertas descripciones, los mAb o sus fragmentos de unión a antígeno pueden unirse específicamente a la isoforma R210l debido a la ausencia de la secuencia única de 15 aminoácidos en la isoforma SP-R210s , lo que puede dar como resultado epítopos lineales o conformacionales que proporcionan un sitio de unión para dichas parejas de unión. Los mAb que están dirigidos a los 458 aminoácidos N-terminales que están en R210l pero no en R210s, también están incluidos en la presente descripción.
En modalidades, los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno reconocerán específicamente al menos un epítopo presente en al menos 7 aminoácidos contiguos de la proteína SP-R210s. En las descripciones, los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno reconocerán específicamente al menos un epítopo presente en al menos 7 aminoácidos contiguos de la proteína SP-RR210l. En modalidades, las parejas de unión proporcionadas por esta descripción pueden comprender al menos un parátopo que reconoce al menos uno de los 7 segmentos de aminoácidos anteriores, o al menos dos parátopos que reconocen al menos uno de los segmentos anteriores.
Dado que los hibridomas permanecen en nuestro poder y pueden caracterizarse fácilmente, el ADN que codifica la inmunoglobulina (Ig) que secretan puede secuenciarse y, por tanto, puede determinarse la secuencia de aminoácidos de la Ig, y pueden determinarse las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas ligeras y pesadas de Ig y usarse para producir versiones sintéticas de los anticuerpos producidos por los hibridomas, o para producir porciones de unión a antígeno como se describe adicionalmente en la presente. Alternativamente, la célula que produce el anticuerpo puede clonarse para producir clones hijos idénticos que proporcionarán una fuente continua de anticuerpos monoclonales. A este respecto, en ciertas y no limitantes modalidades, los anticuerpos monoclonales y/o sus fragmentos son producidos por el hibridoma denominado P2H10, o el hibridoma denominado P4G4 como se muestra en la Figura 14, o se producen de forma recombinante pero tienen las mismas secuencias de aminoácidos, o las mismas secuencias de CDR, de los mAb producidos por el hibridoma denominado P2H10, o el hibridoma denominado P4G4 como se muestra en la Figura 14. En modalidades, los mAb y/o sus fragmentos comprenden secuencias o segmentos de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Figura 30A (proteína de cadena pesada P2H10 y las CDR, Figura 30C (proteína de cadena ligera P2H10 y las CDR), Figura 30E (proteína VH de cadena pesada P4G4) y las CDR), Figura 30G (proteína de cadena ligera P4G4) y sus combinaciones. Los ejemplos no limitantes de secuencias de ADN que codifican tales mAb y fragmentos se ilustran en las Figuras 30B, 30D, 30F y 30H, respectivamente. Por conveniencia, algunas veces en esta descripción, como es habitual y será evidente para los expertos en la técnica, los mAb producidos por los hibridomas también se denominan mediante el uso de los mismos nombres de los propios hibridomas.
Hemos determinado los epítopos que son reconocidos por los dos mAb representativos producidos por los hibridomas P2H10 y P4G4. Para el mAb P4G4 hay dos epítopos: KYQKKKNK (SEQ ID NO:15) y VKSWLSKNK (SEQ ID NO: 16). Estos proporcionan un motivo de consenso de: KxxxxKNK (SEQ ID NO: 17), en donde x es cualquier aminoácido. Para el mAb P2H10, el epítopo es DLINSLQD (SEQ ID NO:18). Estos epítopos pueden verse en el contexto de las dos isoformas en la Figura 2, y será evidente que el mAb P2H10 se une de forma detectable sólo a la isoforma S, mientras que P4G4 se une de forma detectable a las isoformas S y L. Sin embargo, se considera que P4G4 se une con especificidad a la forma S porque no se ha observado que reaccione de forma cruzada con ninguna otra proteína. En modalidades, la descripción abarca cualquier otro anticuerpo y sus fragmentos que se unen con especificidad a uno cualquiera o cualquier combinación de estos epítopos, e incluye composiciones y métodos para fabricar y usar dichos anticuerpos y fragmentos que se describen en la presente.
Como se reconocerá a partir de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Figura 30, en las modalidades, la presente descripción comprende un mAb o su fragmento que se une con especificidad al receptor SP-R210 de la proteína tensioactiva A, el mAb o su fragmento comprende (I) una secuencia de cadena pesada variable que comprende: a) una región 1 determinante de complementariedad de cadena pesada (P2H10-HCDR1) que comprende la secuencia GYIFSDYYMR (SEQ ID NO:3); y b) una región 2 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR2) que comprende la secuencia DINPKNGDTFYNQKFKGK (SEQ ID NO:4); y c) una región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR3) que comprende la secuencia REGD (SEQ ID NO:5); y/o una secuencia de cadena ligera variable que comprende: d) una región 1 determinante de complementariedad de cadena ligera (P2H10-LCDR1) que comprende la secuencia RSSQTILHSNGNTYLE (SEQ ID NO:6); y e) una región 2 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR2) que comprende la secuencia KVSKRFS (SEQ ID NO:7): y f) una región 3 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR3) que comprende la secuencia LQGSHVPLT (SEQ ID NO:8). Por tanto, la descripción incluye cualquier mAb o su fragmento de unión a antígeno que comprende una o una combinación de las CDR que contribuyen al reconocimiento de epítopos en el mAb producido por el hibridoma P2H10.
La descripción también incluye un mAb o su fragmento que comprende (II) una secuencia de cadena pesada variable que comprende: i) una región 1 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (P4G4-HCDR1) que comprende la secuencia GYTFTDYAMH (SEQ ID No :9): y ii) una región 2 determinante de la complementariedad de la cadena pesada P4G4-HCDR2) que comprende la secuencia VISTYNGNTKYNQKFKD (SEQ ID NO:10): y iii) una región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada P4G4-HCDR3) que comprende la secuencia ARTDYDNGDYVMDY (SEQ ID NO:11): y una secuencia de la cadena ligera variable que comprende: iv) una región 1 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (P4G4-LCDR1) que comprende la secuencia KASQDINNYLS (SEQ ID NO:12): y v) una región 2 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (P4G4-LCDR2) que comprende la secuencia RANRLVD (SEQ ID NO:13): y vi) una región 3 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (P4G4-LCDR3) que comprende la secuencia LQYDEFPLT (SEQ ID NO:14). Por tanto, la descripción incluye cualquier mAb o su fragmento de unión a antígeno que comprende una o una combinación de las CDR que contribuyen al reconocimiento de epítopos en el mAb elaborado por el hibridoma P4G4.
En las modalidades, la descripción se une con especificidad solo a la isoforma SP-R210s del receptor SP-R210, o la descripción incluye un anticuerpo monoclonal o su fragmento que se une con especificidad a las isoformas SP-R210s y SP-R210l del receptor SP-R210.
La descripción también incluye regiones variables mixtas pesadas y ligeras y, por tanto, incluye todas las combinaciones de las cadenas pesadas de P2H10 con las cadenas ligeras de PFG4, y viceversa. Por consiguiente, la descripción incluye parejas de unión al receptor SP-R210 monovalentes y multivalentes.
En modalidades, la descripción comprende una composición para el uso en un método para tratar a un individuo que lo necesita, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición que comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento como se describe en la presente. En ciertos aspectos, el individuo necesita tratamiento contra una infección viral o bacteriana. En ciertas modalidades, el individuo necesita tratamiento contra una infección por influenza viral, que puede estar asociada o no a neumonía.
En ciertas modalidades, la descripción comprende una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento como se describe en la presente.
En ciertas modalidades, los mAb o sus fragmentos de unión a antígeno son componentes de proteínas de fusión, o se modifican químicamente de modo que se unen covalentemente a otra porción, o se fijan a un sustrato, o están presentes en un complejo con la proteína SPR210.
Cualquier anticuerpo producido por un hibridoma derivado de mamífero no humano del tipo descrito en la presente puede modificarse para proporcionar una forma quimérica o parcial o totalmente humanizada, y la presente descripción incluye tales modificaciones. En general, las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratones) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Los anticuerpos humanizados son esencialmente inmunoglobulinas humanas (también llamadas anticuerpo "receptor") en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (también llamada anticuerpo "donante") como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener más detalles, véase Jones y otros, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)).
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la técnica. La humanización de un anticuerpo producido de acuerdo con la presente descripción puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores tras sustituir las secuencias de CDR de ratón por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (Jones y otros, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239: 1534-1536 (1988)).
En modalidades, los anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno de la invención se proporcionan en una formulación farmacéutica, que puede contener componentes tales como vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables.
En modalidades, los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden administrarse por cualquier medio adecuado, que incluye parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intralinfática o subcutánea. Además, los anticuerpos monoclonales y/o sus fragmentos de unión a antígeno pueden administrarse mediante infusión de pulsos, por ejemplo, con dosis decrecientes.
En diversas modalidades, se proporcionan los mAb y sus fragmentos de unión a antígeno para el uso en los métodos. En un aspecto, la descripción incluye administrar una composición que comprende una cantidad eficaz de un mAb y/o su fragmento de unión a antígeno a un individuo que lo necesite. En modalidades, el individuo que lo necesita es un sujeto que está infectado con, o tiene riesgo de infectarse con un microorganismo (que incluye un virus), en donde el microorganismo expresa o comprende un ligando para la isoforma SP-R210l, o la isoforma SP-R210s, o ambas. En una modalidad, el individuo necesita profilaxis y/o terapia para una infección bacteriana. En una modalidad, el individuo necesita profilaxis y/o terapia para una infección viral. En una modalidad, el individuo necesita profilaxis y/o terapia para una infección por una cepa patógena de Staphylococcus, virus sincitial respiratorio o por un virus de la influenza. En modalidades, la cantidad del anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno es adecuada para, por ejemplo, bloquear o inhibir la unión de SP-A, o para inhibir el tráfico endocítico de un complejo que comprende SP-A, en donde SP-A se expresa mediante un microorganismo patógeno tal que no se establece una infección sintomática en el individuo, o una infección sintomática en el individuo se alivia más rápidamente que para un individuo que no recibe el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno. En las modalidades, el individuo necesita disminuir la inflamación, tal inflamación causada o correlacionada por una
infección, un traumatismo u otra agresión al individuo, o una enfermedad que se correlaciona con un aumento de la inflamación, como una enfermedad cardiovascular, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica y cáncer.
En otro aspecto, la descripción incluye formar un complejo entre un mAb o su fragmento de unión a antígeno y una isoforma del receptor SP-A. En modalidades, el complejo puede detectarse para el uso en la detección inmunitaria de células que expresan una isoforma particular, o puede usarse en diversas técnicas para clasificar células, como por citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En modalidades, puede obtenerse una muestra biológica de un individuo y evaluarla para determinar la presencia, ausencia o cantidad de células, como macrófagos, que expresan la isoforma SP-R210l, o la isoforma SP-R210s, o ambas. En modalidades, puede obtenerse una muestra biológica de un individuo y manipularse, por ejemplo, para disminuir las células que expresan la isoforma SP-R210l o la isoforma SP-R210s, o para purificar dichas células de la muestra para su análisis y/o para cultivar in vivo, o para proporcionar poblaciones enriquecidas de tales células. Dichos enfoques pueden realizarse mediante el uso de cualquier técnica de inmunoseparación adecuada basada en el reconocimiento específico de la isoforma SP-R210l, o la isoforma SP-R210s, según sea el caso, mediante el uso de los mAb o sus fragmentos de unión a antígeno. En modalidades, los mAb o sus fragmentos de unión a antígeno pueden unirse a un sustrato y usarse, por ejemplo, como agentes de captura.
En otra modalidad, los mAb o sus fragmentos de unión a antígeno pueden conjugarse con otra porción, como en el caso de una proteína de fusión entre el mAb o su fragmento de unión a antígeno y otra secuencia polipeptídica, lo que hace que penetren péptidos o moléculas para obtener acceso al receptor de forma intracelular, o pueden acoplarse a un agente terapéutico, o un agente que puede funcionar como un marcador detectable, que incluye, pero no necesariamente se limita a, un marcador fluorescente.
En modalidades, la descripción incluye métodos para usar los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno en aplicaciones ex vivo, que incluyen pero no necesariamente se limitan a enfoques de inmunoterapia adoptiva. En una modalidad, los macrófagos se aíslan de un individuo, se ponen en contacto con anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno y, después de un período de tiempo, los macrófagos se introducen en el individuo del que se obtuvieron u otro individuo.
En una modalidad, las composiciones y métodos descritos en la presente son adecuados para fines veterinarios, es decir, para el uso en animales no humanos.
Los siguientes ejemplos ilustrarán pero no limitarán la invención.
Ejemplo 1
Como se demuestra en la Figura 3, la descripción proporciona una representación gráfica de un procedimiento de clonación para generar una alteración condicional de SP-R210 en MO en ratones transgénicos. Como se ilustra en estas figuras, esto se realizó mediante la inversión mediada por CRE del exón 1 de SP-R210. Se cruzaron ratones SP-R210flox/+ con ratones CD11cCRE para generar SP-R210-/+ heterocigotos con el alelo inactivado invertido y progenie SP-R210flox/+. Las líneas celulares deficientes (DN) de SP-R210l (300 y 350) también se construyeron mediante la alteración negativa dominante de SP-R210 en MO Raw264.7.
Ejemplo 2
Como se demuestra en la Figura 4, esta descripción demuestra que la falta de SP-R210l bloquea la infección del virus de la influenza A (IAV) en MO. Panel A) Análisis de transferencia Western de las isoformas de SP-R210 en células RAW 264.7 WT y s P-R210l(DN). Panel B) Las células controles WT y SP-R210L(DN) se infectaron con IAV PR8 (cepa H1N1, fila superior del panel B) y Phil82 (cepa H3N2, fila inferior del panel B), después se dejó que la infección progresara, se recogieron a las 6, 12 o 24 horas y se procesaron para evaluar la infección por citometría de flujo. Para ello, las células se tiñeron con anticuerpos frente a la proteína nuclear NP de la influenza. La citometría de flujo de las células teñidas detecta dos picos en las células controles. El pico de la izquierda indica el virus entrante y disminuye con el tiempo a medida que avanza la infección, y el pico de la derecha indica la síntesis de NP nueva que se acumula con el tiempo en el núcleo a medida que prolifera el virus; el pico de síntesis de NP está atenuado o ausente en las células SP-R210l(DN), lo que indica que la influenza coopta a SP-R210l para infectar la célula objetivo.
Ejemplo 3
Como se demuestra en la Figura 5, esta descripción demuestra que la falta de SP-R210l no afecta la unión e internalización de IAV, pero el tráfico endocítico de NP al núcleo se bloquea cuando SP-R210l está ausente. MO control y SP-R210l(DN) se infectaron con 1:1 MOI de IAV PR8. A) El virus unido se visualizó por citometría de flujo mediante el uso de anticuerpos anti NP, B) Las células se cambiaron a 37 °C durante 4 horas y se visualizó NP mediante microscopía de fluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI.
Ejemplo 4
Como se demuestra en la Figura 6, esta descripción demuestra que la infección de MO por IAV mediada por SP -R210l se acopla a la producción de TNFa. Las células controles (superior) y SP-R210l(DN) (inferior) se infectaron con PR8. NP y el TNFa intracelulares se analizaron mediante citometría de flujo.
Ejemplo 5
Como se demuestra en la Figura 7, esta descripción demuestra que los MO y AM deficientes en SP-R210l son hipersensibles a los ligandos de TLR7. (7A). Células no tratadas (histogramas delgados) o incubadas (histogramas gruesos) con 2 pg/ml de imiquimod o ssRNA40 durante 8 horas. El TNFa intracelular se analizó mediante citometría de flujo. Los AM recogidos mediante lavado de pulmón se trataron con 2 pg/ml de imiquimod (7B) o ssRNA40 (7C). El TNFa se midió en medios de cultivo mediante ELISA 24 horas después del tratamiento.
Ejemplo 6
Como se demuestra en la Figura 8, esta descripción muestra que la infección por IAV da como resultado la inhibición de la expresión de SP-R210l de una manera dependiente del tiempo. (8A) Se infectaron células controles WT con PR8, se recogieron y se procesaron para transferencia Western con anti-SP-R210 o b-actina. (8B) Los datos densitométricos se obtuvieron mediante el uso del programa Bio-Rad Quantity One y se graficaron.
Ejemplo 7
Como se demuestra en la Figura 9, esta descripción demuestra que los ratones deficientes en SP-R210l son significativamente más susceptibles a la infección por IAV. Los ratones se infectaron con PR8 LD500,75 por ratón. El peso corporal (A) y la supervivencia (B) se controlaron diariamente. (C) El tejido de los pulmones se aisló y procesó para tinción con HE para histopatología (18 días después de la inoculación). EM: metaplasia de células epiteliales; N: neutrófilos; .BOOP: bronquiolitis obliterante y neumonía incipiente.
Ejemplo 8
Como se demuestra en la Figura 10, esta descripción demuestra la unión mediada por isoformas de SR-R210 e internalización en macrófagos. A) Se localizaron SP-R210 e IAV mediante microscopía confocal (A) y electrónica (B) 6 horas después de la infección.
Ejemplo 9
Como se demuestra en la Figura 11, esta descripción demuestra que la alteración de SP-R210 en AM retrasa la replicación de IAV in vivo. Los ratones se infectaron por vía intranasal con PR8 LD500,75. Se extrajo el ARN total de tejido pulmonar completo 3 y 7 días después de la inoculación. El ARNm para el gen del virus M1 se cuantificó mediante PCR en tiempo real frente a una curva estándar de ARN de virus purificado.
Ejemplo 10
Como se demuestra en la Figura 12, esta descripción proporciona citometría de flujo y datos gráficos que muestran que los anticuerpos contra SP-R210 inhiben la infección por IAV. Los datos presentados en esta Figura se obtuvieron mediante el uso de mAb producidos por los hibridomas P3D7, P2H10 y P2F8. También evaluamos a P2F5, P6B9 y P8F6. Aquellos con actividad detectable se indican como o /- en la Figura 14). Para obtener estos datos, se preincubaron macrófagos durante 1 hora en ausencia o presencia de medios de hibridoma que contenían anticuerpos (a) contra la hemaglutinina (HA) de IAV, una proteína de superficie del virus del papiloma humano (HPV) o anticuerpos contra SP-R210l (A y B), o una combinación de anticuerpos aSP-R210L y aSP-R210S. A continuación, las células se infectaron con PR8 y se determinó la infección por citometría de flujo después de 24 horas.
Ejemplo 11
Como se demuestra en la Figura 13, esta descripción demuestra que la SP-A desialilada (DS) bloquea la infección de macrófagos con IAV. Por tanto, SP-A inhibe competitivamente la unión del virus de la influenza al receptor. Esta Figura demuestra que tanto la SP-A nativa como la desialilada compiten por la unión de la influenza al mismo receptor, es decir, SP-R210, en lugar de que la influenza se una al ácido siálico en la SP-A. Sin pretender estar limitado por ninguna teoría en particular, el significado biológico de esto es que los polimorfismos o mutaciones en SP-A pueden alterar su afinidad por el receptor lo que permite una infección irruptiva con influenza. Por tanto, se espera que el uso de los anticuerpos de acuerdo con la presente descripción sea una alternativa de tratamiento considerablemente mejorada.
A partir de lo anterior, resultará evidente que se requiere SP-R210l para el tráfico endocítico de IAV al núcleo en MO, que las células deficientes en SP-R210l son hipersensibles a la inflamación y que el modelo de ratón muestra que el deterioro de SP-R210l en AM reduce la función beneficiosa de SP-R210l en la infección por IAV, promueve una mayor proliferación de virus en las células distintas de AM y conduce a una inflamación pulmonar excesiva. Por
lo tanto, y sin pretender ceñirse a ninguna teoría en particular, se considera que al cooptar SP-R210l, IAV provoca un 'derribo' funcional, lo que reduce la función beneficiosa de SP-R210l y conduce a una mayor inflamación en el pulmón. Por consiguiente, es razonable esperar que el bloqueo de la interacción de IAV con SP-R210l mediante el uso de las composiciones y métodos de esta descripción, se pueda reducir la infección de IAV y/o su inflamación concomitante. Además, no hay ninguna razón particular para limitar la descripción a IAV, ya que los datos, resultados y Figuras proporcionados en la presente descripción apoyan fuertemente una amplia variedad de usos para los mAb o sus fragmentos de unión a antígeno para el uso en profilaxis y/o terapia para infección por muchos distintos patógenos, y demuestran además la viabilidad de usar estos reactivos en el sentido aún más amplio de modular la inflamación y la manipulación ex vivo de poblaciones celulares, así como también enfoques de diagnóstico.
Ejemplo 12
En este y en los siguientes ejemplos, los términos SP-R210 y Myo18A se usan para células inmunitarias y no inmunitarias, respectivamente. La razón de este nombre se basa en evidencia experimental y computacional que indica que el gen Myo18A está sujeto a un empalme alternativo dependiente del tipo de célula. Por ejemplo, además del empalme que genera las isoformas SP-R210l y SP-R210s, el empalme de exones pequeños genera formas alternativas del dominio carboxi-terminal único de Myo18A en macrófagos. Como se conoce en la técnica y se analiza brevemente anteriormente, SP-A utiliza diversos mecanismos reguladores y contrarreguladores para modular las funciones inmunitarias innatas de los macrófagos. En ciertos ejemplos de esta descripción, analizamos macrófagos que carecen de expresión de la isoforma SP-R210l. Los hallazgos indican que SP-R210l y SP-R210s coordinan la función y expresión de los receptores inmunitarios innatos en los macrófagos. Por tanto, en diversas modalidades, la presente descripción se refiere a modular la función de los macrófagos para afectar las respuestas inmunitarias y, en particular, la función y actividad de los macrófagos. Este ejemplo proporciona una descripción de los materiales y el método usado para obtener los datos presentados en los ejemplos que lo siguen y, en algunos casos, los que serán evidentes para los expertos en la técnica también son pertinentes para los ejemplos anteriores.
Reactivos y anticuerpos
Los productos químicos se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los marcadores de peso molecular previamente teñidos eran de Bio-Rad (Hercules, CA) y suero fetal bovino (FBS) de Atlanta Biologicals (Atlanta, GA). El kit de ELISA de TNFa era de eBioscience (San Diego, CA). El lipopolisacárido liso (LPS) de los serotipos O111: B6 u O26: B6 de Escherichia coli fue de Sigma-Aldrich. El kit RNAeasy midi fue de Qiagen (Valencia, CA). El kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad y los ensayos de expresión génica TaqMan qRT-PCR fueron de Life Technologies/Invitrogen (Carlsbad, CA). Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD11c (N418); CD11b (M1/70); CD14 (Sa2-8); CD282 (TLR-2; mT2.7); CD284 (TLR-4; UT41); SIRPa (P84); F4/80 (BM8); Ly-6C (HK1.4); TNFa (MPX-XT22) y Fc block CD16/32 (93) fueron de eBiosciences (San Diego, CA). Los anticuerpos c D36 (72-1) y CD284 (TLR-4; Sa15-21) fueron de Biolegend (San Diego, CA). Los anticuerpos SR-AI/MSR1 (clon: 268318) y CD87 (upAr ; clon 109801) fueron de R&D (Minneapolis, MN). Los controles emparejados por isotipos procedían de eBiosciences o R&D. Se adquirieron de R&D el policlonal de cabra no conjugado contra CD14, TLR-2, CD36, SR-AI/MSR1 de ratón y CD11b anti-ratón monoclonal de rata (M1/70). Se usaron anticuerpos policlonales de conejo contra SP-A humano como enfoques estándar. Los anticuerpos contra SP-B fueron de Seven Hills Bioreagents (Cincinnati, OH). La brefeldina A y la solución de fijación/permealización para la tinción de citocinas intracelulares fueron de eBioscience. Los anticuerpos contra la subunidad RelA(p65) de NF-kB, Re1A (p65)S536, IRAK-1 e IKB se adquirieron de Cell Signaling. Los anticuerpos anti-cabra de burro conjugados con HRP secundarios fueron de R&D. Las perlas de proteína G-Sepharose IP anti-conejo conjugadas con HRP de transferencia verdadera fueron de eBioscience o GE Lifesciences. El kit de quimioluminiscencia ECL era de Perkin Elmer (Waltham, MA). La generación y purificación de anticuerpos monoclonales anti-SP-R210 se informará en otro lugar. Dynasore se obtuvo de SIGMA, y 5-(N-etil-N-isopropil) amiloride (EIPA) y NSC23766 fueron de SelleckChem a través de Fisher Scientific.
Ratones
Se adquirieron ratones WT C57BL/6 de JAX Labs (Bar Harbor, MN). Los ratones SPA-/- se criaron y mantuvieron localmente en University Of Cincinnati College Of Medicine o en Penn State College of Medicine. Los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas con microaislador y se les suministró agua esterilizada en autoclave y alimento ad libitum. Los ratones transgénicos SP-A-/- en las dos instituciones se obtuvieron de forma independiente mediante el uso de un enfoque conocido y retrocruzado con el trasfondo genético C57BL/6. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales.
Aislamiento de macrófagos alveolares
Los macrófagos alveolares se aislaron por lavado alveolar mediante el uso de cinco lavados consecutivos de contenido alveolar con 0,5 ml de PBS suplementado con EDTA 1 mM. Los macrófagos alveolares se recogieron por centrifugación y se procesaron para análisis de transferencia Western mediante el uso de técnicas estándar.
Purificación y caracterización de SP-A humano
Se aisló SP-A a partir de lavado pulmonar terapéutico descartado de pacientes con proteinosis alveolar mediante modificaciones del método tradicional de extracción de butanol/octilglucósido de Hawgood y colaboradores (Método 1) o de acuerdo con protocolos detallados conocidos en la técnica (Método 2). Las preparaciones de SP-A se dializaron en Hepes 5 mM, pH 7,5, y se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su uso. Todos los procedimientos usaron agua sin LPS de un sistema de purificación de agua Millipore (Millipore RiOs 16 y Milli-Q Biocel con resistencia > 18,2 MQ). La concentración de LPS en SP-A purificado se midió mediante el uso del ensayo Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 (Lonza, Walkersville, MA). El LPS fue indetectable en SP-A purificado por el Método 1. La concentración de LPS en SP-A preparado mediante el uso del Método 2 fue de 20 pg/pg de proteína. La pureza de la proteína se determinó mediante tinción con plata. Para la espectrometría de masas, los geles de SDS-PAGE se tiñeron con el kit de tinción Invitrogen SilverQuest. Las proteínas que se aislaron conjuntamente con SP-A se escindieron, se digirieron en gel con tripsina y las proteínas se identificaron por espectrometría de masas MALDI (Figura 27) en Penn State College of Medicine Mass Spectrometry Facility.
Cultivo de células
La generación de células controles y SP-R210l(DN) Raw264.7 fue descrita recientemente por nosotros [8]. En resumen, las células se transfectaron de forma estable con el vector pTriex-2 que expresa el dominio carboxiterminal de SP-R210 (células SP-R210L(DN)) [6]. Las células controles se transfectaron con vector vacío. Las células se cultivaron durante 20-48 horas en RPMl suplementado con suero bovino fetal (FBS) 10 %. Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 50000 células/pocillo o placas de 12 pocillos a una densidad de 150000-250000 células/pocillo.
Citometría de flujo
Las células controles y SP-R210l(DN) Raw264.7 se separaron mediante el uso de medio de disociación celular no enzimática (SIGMA) y se lavaron en PBS. Las células se bloquearon en PBS, pH 7,4, suplementado con suero de cabra 1 %, BSA 0,5 %, y Fc block 5 pg/ml a una concentración de 1 x 107 células/ml durante 1 hora en hielo. Las células se tiñeron con las concentraciones recomendadas de anticuerpos monoclonales durante 30 min en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS sin proteína ni azida. Células teñidas con colorante de viabilidad fijable eBioscience e506 durante 20 min a 4 °C. Las células se lavaron una vez con tampón FACS (solución salina tamponada de Hanks (HBSS) que contenía Ca y Mg , FBS 2 %, azida sódica al 0,02 %) y después las células se fijaron con 100 pl de tampón de fijación intracelular (IC) de eBioscience durante 30 min a temperatura ambiente, después se permeabilizó con tampón de permeabilización eBioscience. Para la tinción de citocinas intracelulares, las células se incubaron con aditivos en presencia de Brefeldin A durante puntos de tiempo establecidos y después se tiñeron con TNFa anti-ratón conjugado con ficoeritrina (PE). Los eventos se adquirieron mediante el uso de un citómetro de flujo BD FACS Calibur o LSR II (BD Pharmingen) y se analizaron mediante el uso del programa de análisis de citometría de flujo FlowJo (Treestar, Mountain View, CA).
Ensayos de endocitosis
Se colocaron células controles y SP-R210l(DN) en placas de 12 pocillos a una densidad de 250000 células/pocillo y se cultivaron en RPMI/FBS 10 % durante 20 horas. A continuación, las células se estimularon con 100 ng/ml o 2 pg/ml de LPS para ensayos de endocitosis de CD14 y TLR-4, respectivamente, y se recogieron a las 0, 1, 2, 3 y 4 horas después de la estimulación mediante el uso de tampón de disociación celular. Las células se bloquearon en PBS que contenía suero de cabra 1 % y Fc block 5 pg/ml durante 30 min a temperatura ambiente, después se procesaron para tinción de flujo con anticuerpo PE-TLR4 (BioLegend) durante 30 min a temperatura ambiente. Para evaluar el efecto de los inhibidores, las células fueron Dynasore 80 pM para inhibir dinamina, EIPA 40 pM para inhibir la macropinocitosis o NSC23766 100 pM para inhibir RAC1 en medio normal 30 min antes de la adición de LPS. Se evaluaron CD14 y TLR-4 de la superficie celular mediante citometría de flujo con anticuerpos CD14 conjugados con Cy7 (clon Sa2-8) o TLR-4 conjugados con PE (clon Sa15-21).
Generación de extractos celulares y análisis de transferencia Western
Las células cultivadas se lavaron en PBS y se separaron mediante el uso de medio de disociación celular no enzimática. Las suspensiones celulares se centrifugaron a 210 x g a 4 °C y se lisaron en tampón de lisis helado mediante ciclos de congelación y descongelación. Los extractos se usaron inmediatamente o se almacenaron congelados a -80 °C. Las proteínas se separaron en geles en gradiente de SDS-PAGE 4-17 % y se transfirieron a nitrocelulosa mediante transferencia semiseca. A continuación, las transferencias se bloquearon en solución salina tamponada con Tris, pH 7,5, suplementada con Tween 200,1 % y leche en polvo desnatada 5 %. Las transferencias se sondaron con anticuerpos anti-Myo18A, CD14, SR-A, TLR-2 o CD36 y después se incubaron con anticuerpos secundarios anti-conejo o anti-cabra conjugados con HRP. Los anticuerpos unidos se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada. La intensidad relativa de la banda se determinó por densitometría mediante el uso de un densitómetro calibrado GS-800 (Bio-Rad) y el programa Quantity One (Bio-Rad).
Microscopía con focal
Los macrófagos cultivados en cubreobjetos de vidrio se estimularon con 100 ng/ml de LPS para los puntos de tiempo establecidos, se lavaron con PBS, se fijaron después de 15 min con paraformaldehído 4 %, se permeabilizaron durante 10 min en Triton X-100/PBS 0,3 % y después se bloquearon en suero de cabra/PBS 10 % durante 60 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se tiñeron con anticuerpos de conejo p65(RelA) (dilución 1:400) y después con anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con Cy3 (dilución 1:500). Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos mediante el uso de medio de montaje Prolong con DAPI (Life Technologies). Se adquirieron imágenes confocales de células marcadas con fluorescencia con un microscopio confocal de barrido láser Leica AOBS SP8 (Leica, Heidelberg, Alemania) mediante el uso de un objetivo de inmersión en aceite Leica 40 X/1,3 Plan-Apochromat de alta resolución en Penn State College of Medicine Imaging Core. Las líneas láser usadas para la excitación fueron onda continua 405 (para DAPI), y 80 MHz pulsadas 591 (para Cy3). Estas líneas láser se produjeron por diodo UV, láser de luz blanca de 80 MHz (módulo Leica AOBS SP8) respectivamente y las respectivas señales de emisión se recogieron secuencialmente mediante el uso de filtros sintonizables AOBs . Todas las imágenes y los datos de medición de datos espectrales se generaron mediante el uso de los detectores HyD de alta sensibilidad (con opción de tiempo controlado). Las señales de emisión retrodispersadas de la muestra se suministraron a través del filtro sintonizable AOBS (para eliminar el láser irradiado), el orificio de detección ajustado a 1 unidad Airy (para obtener resoluciones laterales y axiales óptimas), prisma de dispersión espectral y finalmente a los detectores HyD. El ancho de las rendijas delante de cada HyD podría ajustarse mediante el programa para que cada HyD pudiera detectar regiones espectrales que abarcan desde un ancho de banda de 10 nm hasta la capacidad espectral general del sistema (400-800 nm). Mediante el uso de esta opción única, se realizó un barrido espectral en todos los tintes para confirmar la especificidad de la señal. Las imágenes confocales se analizaron mediante el uso del programa Imaris.
Inmunoprecipitación
Se cultivaron células controles y SP-R210l(DN) en DMEM/FBS 10 % durante 24 horas en placas de 100 mm y después se estimularon con 100 ng/ml de LPS durante 10, 30, 60 y 120 minutos. Después de períodos de tiempo establecidos, se aspiró el medio y las placas se lavaron dos veces con PBS frío. A continuación, las células se lisaron directamente en la placa mediante el uso de una solución tampón de lisis completa (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP-401 % suplementado con MnCl21 mM, glicerol 10 %, cóctel de inhibidor de proteasa/fosfatasa de señalización celular 1x) en hielo durante 30 minutos y después se recogieron los lisados en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Los lisados se centrifugaron durante 15 minutos a 10000 x g y los sobrenadantes se recogieron sin perturbar el sedimento. La concentración de proteína de los sobrenadantes se midió con el ensayo BCA y se preincubaron 1,5 2,0 mg de proteína por muestra con perlas de agarosa proteína G preequilibradas (Roche) en un rotador durante 3 h a 4 °C. Las perlas se eliminaron mediante centrifugación a 12 000 x g durante 1 minuto y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. A continuación, los lisados preadsorbidos se incubaron con los anticuerpos indicados o los controles de isotipo en un rotador durante 1 h a 4 °C y después se añadieron a los lisados 40-50 pl de perlas de agarosa proteína G preequilibradas (1:1, perlas al volumen del lecho). Las muestras se incubaron en un rotador durante una noche a 4 °C. Los productos de inmunoprecipitación se centrifugaron durante 1 minuto a 12000 x g y se descartó el sobrenadante. Las perlas se lavaron tres veces en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP-40 1 %) y el tampón de lisis se descartó después de cada centrifugación. Después del último lavado, se añadió directamente a las perlas tampón de muestra de urea 2x (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, SDS 1,6 %, glicerol 7 %, urea 8 M, DTT 200 mM, azul de bromofenol 0,01 %). Las muestras preparadas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos y se calentaron a 95 °C durante 2 minutos. Las muestras se centrifugaron a 12000 x g durante 1 minuto, las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE 4-17 % y se analizaron mediante transferencia Western. Las reacciones de inmunoprecipitación se llevaron a cabo mediante el uso de 1,5 mg/ml de extracto de proteína.
RT-PCR cuantitativa en tiempo real
El ARNm tratado con ADNasa se aisló de los macrófagos controles y SP-R210l(DN) mediante el uso del kit Qiagen RNAeasy. El ADNc se sintetizó con el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se incubó 1 pg de ARN purificado con 2 pl de tampón 10X, 0,8 pl de dNTP 25X, 2 pl de cebadores aleatorios 10X, 1 pl de inhibidor de ARNasa y 50 U de transcriptasa inversa en un volumen final de 20 pl. La reacción se incubó durante 10 min a 25 °C, 2 h a 37 °C y se inactivó durante 5 min a 85 °C. El ADNc se diluyó cinco veces antes de la amplificación por PCR con ensayos de expresión génica TaqMan SR-A, CD11b, CD36 y CD14 y el ARN ribosómico® 18S se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) mediante el uso de ensayos TaqMan. El ARNm de SP-R210l se midió mediante el uso de cebadores que abarcan el dominio PDZ que contiene la unión del ARNm del exón 1 y exón 2 del gen Myo18A. Se usaron cebadores internos comunes entre los exones 18 y 19 para cuantificar el ARNm de SP-R210l y SP-R210s. Cada reacción de qPCR de 20 pl incluyó 10 pl de TaqMan Gene Expression Master Mix 2X, 1 pl de TaqMan Gene Expression Assay 20X y un total de 10 a 40 ng de ADNc. Las reacciones se incubaron en placas ópticas de 384 pocillos a 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min y 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 1 min. Cada muestra se analizó por triplicado junto con controles sin molde. Los resultados se monitorearon y almacenaron por el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems) en Functional Genomics Core Facility en Penn State College of Medicine. La expresión de ARNm para cada gen se normalizó a ARNr 18S. Los datos se expresan como expresión relativa de
ARNm en SP-R210(DN) en comparación con las células controles y se calcularon mediante el uso del método 2'AACt mediante el uso del ACt medio en las células controles como calibrador [57].
Estadísticas
La comparación estadística de datos se realizó mediante el uso del programa GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA). Se usaron comparaciones por pares mediante el uso de la prueba t de pares apareados de Wilcoxon para evaluar las diferencias estadísticas. P<0,05 se consideró significativo.
Ejemplo 13
Este ejemplo demuestra la inhibición negativa dominante de SP-R210l ARNm en células SP-R210l(DN). La expresión estable del dominio carboxi-terminal (ct) único de SP-R210, SP-R210ct [5,6], en macrófagos Raw264.7 dio como resultado una inhibición selectiva negativa dominante (DN) de SP-R210l. Las isoformas de SP-R210ct difieren por una inserción de 15 aminoácidos designada como s P-r210l(DN1) y SP-R210l(DN2) en la Figura 15A. La transferencia Western (Figura 15A) y el análisis de qPCR (Figura 15B) demuestran que la expresión estable del mutante de deleción de SP-R210ct bloqueaba tanto la expresión de ARNm como de proteína de SP-R210l en más del 85 %. Por el contrario, la expresión de la variante SP-R210s no disminuyó significativamente.
Ejemplo 14
Este ejemplo demuestra niveles aumentados de receptores innatos en la superficie de las células SP-R210l(DN). Analizamos si la alteración de SP-R210l altera la expresión de receptores innatos. Los datos presentados a continuación representan datos combinados de ambas líneas celulares SP-R210l(DN). La Figura 16 muestra niveles de superficie celular de 20 y 4 veces más altos de SRA y CD36 (Figura 16A), aumento de 2 a 3 veces en TLR-2 y CD14 (Figura 16B), y aumentos de 4 y 2 veces en CD11b y CD11c en células SP-R210l(DN) (Figura 16C). Curiosamente, los niveles de TLR-4 fueron 40 % más bajos que el control en las células SP-R210l(DN) (Figura 16B). Los marcadores monocíticos Ly-6C y uPAR se expresaron a niveles bajos y no fueron diferentes entre el control y las células SP-R210l(DN) (Figuras 16A y 2B). El marcador de diferenciación de macrófagos F4/80 no fue estadísticamente diferente en comparación con las células controles (Figura 16A y 16C). Además, la falta de SP-R210l no alteró la expresión de SlRPa (Figura 16C). Curiosamente, la disminución de SP-R210l dio como resultado aumentos de 4 y 20 veces en los niveles de ARNm de CD11b y SR-A (Figura 16D). Los niveles de ARNm de CD14 y CD36 fueron similares a los de las células controles (Figura 16D), aunque la expresión de superficie de los cuatro receptores aumentó significativamente en las células SP-R210l(DN). Dado que los niveles de CD14 aumentaron en las células SP-R210l(DN), medimos los niveles de TNFa después de la incubación con LPS. Las células controles y SP-R210l(DN) se trataron con LPS liso 100 ng/ml para desencadenar la activación de macrófagos a través de CD14. La tinción intracelular 4 horas después del reto con LPS demuestra un fuerte aumento en la síntesis de TNFa en células SP-R210l(DN)1 y SP-R210l(DN)2 en comparación con los controles (Figura 17A). Dado que se obtuvieron resultados similares con células SP-R210l(Dn )1 y SP-R210l(DN)2, los resultados descritos en SP-R210l(DN) son datos agrupados de ambas líneas celulares en estudios posteriores. La Figura 17B muestra que las células SP-R210l(DN) secretaron significativamente más TNFa en comparación con las células controles, coherente con niveles más altos de CD14. Existe una actividad funcional aumentada de los receptores de barrido coherente con niveles más altos de SR-A y CD36 (Figura 16A) en células SP-R210l(DN). Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que SP-R210L actúa como un represor intrínseco de la expresión y función del receptor innato a través de mecanismos tanto transcripcionales como postranscripcionales.
Ejemplo 15
Este ejemplo demuestra que SP-A mejora la expresión de SP-R210 en macrófagos.
Analizamos si SP-A influye en la expresión de su propio receptor, SP-R210. La Figura 18A demuestra que SP-A indujo la expresión de SP-R210l y SP-R210s en las células controles de una manera dependiente de la concentración de 25-100 pg/ml de SP-A, aunque el tratamiento con una concentración baja de 5 pg/ml de SP-A parece ser inhibitoria. Sin embargo, la alteración de SP-R210l atenuó la capacidad de SP-A para inducir la expresión de SP-R210s (Figura 18B).
Para determinar si SP-A modula la expresión de SP-R210 in vivo, se evaluó SP-R210 en macrófagos alveolares de ratones WT y SP-A -/-. SP-R210l es la principal isoforma de los macrófagos alveolares (Figura 19A). En particular, los macrófagos alveolares de ratones SP-A -/- parecen expresar niveles similares de SP-R210l y SP-R210s . El análisis de densitometría mostró que los macrófagos WT expresan niveles casi cinco veces más altos de SP-R210l en comparación con ratones SP-A -/-(Figura 19B). Estos resultados indican que SP-A es un regulador autocrino de la expresión de SP-R210 en macrófagos.
Ejemplo 16
Este ejemplo demuestra que la preparación de SP-A influye en la capacidad de respuesta de los macrófagos al LPS.
Evaluamos si SP-A modifica la respuesta inflamatoria a LPS. Para estos estudios, usamos SP-A de fluido de proteinosis alveolar del mismo individuo purificado por un método de butanol/octilglucósido modificado (SP-Am1) o el método de extracción de éter isopropílico/butanol (SP-Am2) mediante el uso de técnicas conocidas; se ha demostrado que SP-Am1 mejora la activación de macrófagos, mientras que SP-Am2 demostró ser un antagonista potente de múltiples receptores tipo toll en varias líneas de macrófagos, que incluyen los macrófagos Raw264.7. Los macrófagos controles y SP-R210l(DN) se expusieron a SP-Am1 bajo, de 5 pg/ml, o alto, de 50 pg/ml, durante 24 horas y posteriormente se incubaron con 100 ng/ml de LPS (Figura 20A). La Figura 20A muestra que SP-Am1 mejoró la capacidad de respuesta a LPS tanto en células controles como en células SP-R210l(DN) a la concentración más alta que también mejoró la expresión de isoformas de SP-R210 (Figura 19A). SP-Am1 solo a la concentración baja no tuvo ningún efecto. Por el contrario a SP-Am1, la Figura 20B muestra que SP-Am2 inhibió el TNFa inducido por LPS de ambas líneas celulares. El efecto de SP-Am2 se examinó a 50 pg/ml (Figura 20B). SP-Am2 contenía niveles medibles de LPS, lo que se traduce en 1 ng/ml de LPS a la dosis de 50 pg/ml de SP-A. A esta concentración, el tratamiento con SP-Am2 solo produjo 20-30 % menos de TNFa tanto en las células controles como SP-R210l(DN) en comparación con el tratamiento con una cantidad equivalente de LPS solo (Figura 20B), coherente con un efecto inhibidor de SP-Am2 sobre la actividad de LPS.
Para abordar la respuesta diferente a LPS en macrófagos tratados con SP-Am1 y SP-Am2, evaluamos la pureza de las preparaciones de SP-A de los mismos y diferentes individuos mediante tinción con plata y espectrometría de masas (Figura 27). La tinción con plata mediante el uso de un formaldehído/glutaraldehído conocido reveló aquel SP-Am2 aislado conjuntamente con niveles más altos de proteínas de bajo peso molecular de aproximadamente 8 15 kDa (Figura 27A, C) en el intervalo molecular de la proteína tensioactiva B (SP-B). Es de destacar que SP-B no es detectable mediante tinción con azul de Coomassie y, por tanto, las preparaciones de SP-A teñidas con Coomassie parecerían puras. Obtuvimos resultados similares con SP-A de tres individuos diferentes (Figura 27A, C). El análisis de transferencia Western confirmó la presencia de coaislamiento de SP-B con ambas preparaciones de SP-A, aunque claramente prominente en la preparación de SP-Am2 (Figura 27B). La tinción de plata con SilverQuest compatible con espectrometría de masas de Invitrogen reveló especies de proteínas adicionales por encima de 300 kDa y proteínas en el intervalo de 8-25 kDa (Figura 27C). Las proteínas de bajo peso molecular son prominentes en la preparación de SP-Am2 con una proteína que está presente en una preparación de SP-Am1 y ambas de SP-Am2 (Figura 27C, bandas 5 y 6). Estas bandas de proteínas en SP-Am1 y SP-Am2 del material de proteinosis APF-1 se digirieron en gel y se identificaron mediante espectrometría de masas MALDI. Las proteínas de las bandas 1 y 2 de alto peso molecular se identificaron como gp340, una proteína de unión conocida para SP-A. La banda 3 contiene un fragmento de SP-A y cadena ligera de ferritina, un contaminante descrito previamente en las preparaciones de SP-A. La banda 4 en SP-Am1 y las bandas 6, 7 y 8 en SP-Am2 contienen todas SP-B. La banda 5 contiene la aspartil proteasa napsina A. Además de la SP-B, las bandas 6 y 7 también contienen la napsina A específica de pulmón y la histona H4 nuclear, respectivamente. Un trozo de gel en blanco no produjo ninguna identificación de proteínas. Se ha demostrado que la napsina A intracelular procesa pro-SPB en cuerpos lamelares de células epiteliales alveolares de tipo II, aunque la napsina A secretada puede degradar las proteínas de la superficie celular en las células alveolares. La banda 9 de 30 kDa solo contenía SP-A como se esperaba. Todas las proteínas se identificaron con un índice de confianza de 100. Estos estudios indican que SP-A prepara a los macrófagos para mejorar la capacidad de respuesta a LPS a través de SP-R210l. Sin embargo, el tratamiento con SP-A que conduce a una capacidad de respuesta mejorada o reducida in vitro puede depender del nivel de componentes surfactantes bioactivos que se aíslan conjuntamente en diferentes preparaciones de SP-A.
Ejemplo 17
Este ejemplo demuestra que SP-R210s es un correceptor de CD14. Para determinar si SP-R210 modula la capacidad de respuesta de LPS a través de CD14, realizamos experimentos de inmunoprecipitación para evaluar si SP-R210 interactúa físicamente con CD14 y usamos anticuerpos neutralizantes para evaluar la capacidad de respuesta de los macrófagos controles y SP-R210l(DN) a LPS. También determinamos si SP-R210 interactúa con SR-A, CD11b, CD36 y TLR-2 que se incrementan en las células SP-R210l(DN) (Figura 16 arriba). De estos, también se conoce que CD11b, TLR-2 y SR-A interactúan con SP-A y/o SP-R210. Usamos un anticuerpo anti-SP-R210 policlonal purificado por afinidad que reconoce tanto a SP-R210l como a SP-R210s. La Figura 21A muestra que CD14 precipitó con anticuerpos SP-R210 tanto en las células controles como en las células SP-R210l(DN). El CD14 coprecipitado estaba claramente enriquecido en células SP-R210l(DN). Curiosamente, SR-A también se enriqueció en células SP-R210l(DN), lo que sugiere que SP-R210l también controla la asociación física entre SP-R210s y SR-A. Por el contrario, SP-R210 no precipitó conjuntamente con CD36 y TLR-2 (Figura 21A) ni en las células controles ni en las SP-R210l(DN), lo que sirve como control interno para la especificidad de la interacción de SP-R210 con CD14 y SR-A. Ensayos de inmunoprecipitación recíproca mediante el uso de anticuerpos monoclonales CD11b. La Figura 21B muestra que CD11b interactúa preferentemente con SP-R210s en las células controles. Curiosamente, CD11b y SP-R210s no precipitaron conjuntamente en células SP-R210l(DN). Como miembro de la familia de la miosina, se espera que SP-R210 forme dímeros a través del dominio de espiral en espiral carboxi-terminal. Sin embargo, la interacción preferencial, aunque parcial, de CD11b con la isoforma SP-R210s corta, pero no la isoforma SP-R210l más larga sugiere que la SP-R210l y SP-R210s no forman heterodímeros con el uno al otro en los macrófagos. Similar a SP-R210 (Figura 21A), CD11b no se asoció con TLR-2 (Figura 21B) o con CD36 (no se muestra). Los experimentos de inmunoprecipitación que usan anticuerpos monoclonales contra SP-R210 muestran que SP-R210s y CD14 forman un complejo estable antes y después del tratamiento de células con LPS durante dos
horas en células SP-R210l(DN) (Figura 21C). Curiosamente, el tratamiento con LPS aumentó el nivel de ¡soformas de SP-R210 inmunoprecipitadas con el tiempo. Por el contrario, el nivel de CD14 coprecipitado en las células controles fue inferior al c D14 precipitado que en las células SP-R210l(DN), lo que sugiere que SP-R210l controla la asociación de SP-R210s con Cd 14 (Figura 21C).
Para evaluar la importancia funcional de estas interacciones, usamos anticuerpos para evaluar la activación de macrófagos por LPS (Figura 22). Las células se pretrataron con anticuerpos y después con 100 ng/ml de LPS durante 4 horas seguido de TNFa intracelular. El pretratamiento de macrófagos con anticuerpos SP-R210 y CD11b no afectó la síntesis de TNFa en las células controles estimuladas con LPS. Sin embargo, los anticuerpos SR-A estimularon el TNFa significativamente en SP-R210l(DN) en comparación con las células controles en aproximadamente 30 % (Figura 22). Los anticuerpos CD14 bloquearon el TNFa en un 50 % en ambas líneas celulares. El tratamiento combinado con anticuerpos SP-R210 o SR-A interfirió con la capacidad de los anticuerpos CD14 para inhibir la síntesis de TNFa en células SP-R210l(DN), coherente con una estrecha proximidad física entre SP-R210s , CD14 y SR-A en células SP-R210l(DN) según lo previsto por los resultados de inmunoprecipitación anteriores. En coherencia con la falta de interacción de SP-R210 con cD11b (Figura 21B), el anticuerpo cD11b no interfirió con el efecto inhibidor de CD14 (Figura 22). Tomados en conjunto, estos resultados indican que SP-R210l regula la formación de complejos receptores innatos activadores en los que SP-R210s y SR-A actúan como correceptores de CD14.
Ejemplo 18
Este ejemplo demuestra que las isoformas de SP-R210 regulan la activación de NFkB aguas abajo de TLR-4.
El LPS se une a CD14 y la transferencia de LPS al receptor TLR-4 de tipo toll da como resultado la translocación nuclear y la activación del factor de transcripción NFKB. La vía de señalización proximal de TLR-4 implica la formación de middosomas seguida de la activación y degradación de IRAK-1 y la fosforilación y degradación de IkB aguas abajo. La degradación de IkB permite la fosforilación y translocación de la subunidad p65(RelA) de NFKB al núcleo. La restauración de la expresión de IkB contribuye a la terminación de la señalización de NFKB. Por lo tanto, determinamos si la falta de SP-R210l altera la señalización de TLR-4. El análisis de Western en la Figura 23A demuestra que la cinética de degradación de IRAK1 e IkB fue similar entre las células controles y SP-R210l(DN). La expresión de IkB se restauró después de 30 minutos de estimulación con LPS en ambas líneas celulares. Sin embargo, los análisis Western y de densitometría de las Figuras 23B y 23C demostraron que la fosforilación de NFKB en la serina 536 fue transitoria en las células controles pero permaneció elevada en las células SP-R210l(DN). Además, el análisis de microscopía de fluorescencia confocal en las Figuras 24A y B muestra una retención prolongada de NFkB en el núcleo de las células SP-R210l(DN) en comparación con los controles. Estos resultados indican que SP-R210 regula la duración de la señalización de NFk B sin afectar los eventos de señalización temprana de la activación de TLR-4.
Ejemplo 19
Este ejemplo demuestra que SP-R210l y SP-R210s median distintos mecanismos de internalización de CD14.
CD14 controla la internalización de TLR-4 que puede determinar la activación de TLR-4 desde la superficie celular o las vesículas endocíticas. También se conoce que CD14 media la eliminación de LPS mediada por macrocropinocitosis. Por tanto, preguntamos si las variantes de SP-R210 influyen en el tráfico de CD14. Los macrófagos controles y SP-R210l(DN) se trataron con 100 ng/ml de LPS a lo largo del tiempo para controlar la internalización de CD14. La Figura 25A demuestra que el 25 % de CD14 se perdió de la superficie celular a las 2 horas después de la adición de LPS y después el CD14 nuevo o reciclado regresó a la superficie celular a las 4 horas. Por el contrario, CD14 se repuso más rápidamente en células SP-R210l(DN) (Figura 25B); sólo el 15 % de CD14 se perdió de la superficie celular a los 30 minutos y el CD14 de la superficie volvió rápidamente a la superficie celular por encima de los niveles de células SP-R210l(DN) no estimuladas. Para investigar más el tráfico de CD14, monitoreamos la superficie de CD14 después de la adición de Dynasore, un inhibidor de la endocitosis dependiente de clatrina y dinamina. Dynasore también puede inhibir la endocitosis en fase líquida, el reciclaje endosómico y la secreción de proteínas constitutivas en los macrófagos. La Figura 25B demuestra que dynasore no bloqueó la internalización de CD14 en las células controles, coherente con la macrocropinocitosis insensible a dynasore de CD14. Sin embargo, dynasore bloqueó la reposición de CD14 de superficie completamente en las células controles y parcialmente en las células SP-R210l(DN), lo que sugiere que dynasore inhibe la secreción de CD14 recién sintetizado. Dynasore, sin embargo, revela un proceso de tráfico distinto en las células SP-R210l(DN) que se caracteriza por la internalización durante la primera hora después de la adición de LPS seguida del retorno de CD14 a la superficie celular (Figura 25B), aunque se realizarán estudios adicionales necesario para distinguir si esto representa reciclaje o secreción de CD14 insensible a Dynasore. Sin embargo, las diferencias en el tráfico de CD14 no afectan la endocitosis de TLR-4, aunque la internalización de TLR-4 en células SP-R210l(DN) se ralentizó después de 1 hora de LPS en comparación con los controles (Figura 25C). Se ha demostrado que Dynasore bloquea la endocitosis de TLR-4 que inhibe la señalización de los compartimentos endocíticos. Sin embargo, se demostró que CD14 media la endocitosis de LPS a través de micropinocitosis. Por lo tanto, comparamos los efectos de dynasore y el inhibidor de macropinocitosis EIPA sobre la respuesta inflamatoria a LPS mediante el uso de TNFa
intracelular como una lectura de la respuesta de LPS. La Figura 25D muestra que dynasore y EIPA inhibieron TNFa en 40 y 60 %, respectivamente, lo que indica que se requiere la internalización de CD14 para mediar parte de la respuesta inflamatoria en las células controles. Por el contrario, las células SP-R210l(d N) eran insensibles a la inhibición tanto por dynasore como por EIPA (Figura 25D). Estudios anteriores han demostrado que la pequeña GTPasa rac1 media la micropinocitosis en macrófagos. Por consiguiente, NSC23766, un inhibidor de las pequeñas GTPasas racl y rac2 bloqueó la producción de TNFa tanto en las células controles como en las células SP-R210l(DN). Curiosamente, NSC23766 fue significativamente más eficaz para inhibir TNFa en SP-R210l(DN) en comparación con las células controles (Figura 25D). Tomados en conjunto, estos resultados indican que las isoformas SP-R210l y SP-R210s median el tráfico de CD14 a través de distintos mecanismos similares a la macrocropinocitosis.
Se reconocerá por lo anterior que la regulación precisa del sistema inmunitario innato es de suma importancia para la salud respiratoria. La expresión y localización subcelular de los receptores innatos determina el resultado de las respuestas de señalización que coordinan la inflamación con la eliminación de patógenos. Los presentes hallazgos demuestran que la isoforma SP-R210l del receptor SP-A es un modulador intrínseco de los receptores innatos en los macrófagos.
Descubrimos que la alteración de SP-R210l conduce a un aumento de 2-20 veces en la expresión de varios receptores innatos en los niveles de proteínas (TLR-2, CD11c, CD36 y CD14) y transcripcionales (SR-A, CD11b). Los estudios sobre las vías de señalización indican que SP-R210s y SP-R210l controlan la activación y desactivación del factor de transcripción NPkB, respectivamente. Además, determinamos que SP-A indujo la expresión de las isoformas de SP-R210 de una manera dependiente de SP-R210l, lo que respalda la idea de que SP-A media la intercomunicación entre las isoformas de SP-R210 para modular la capacidad de respuesta a los estímulos inflamatorios. Es importante destacar que los estudios en macrófagos alveolares de ratones SP-A -/ indican que SP-A funciona de forma autocrina para mantener niveles óptimos de expresión de SP-R210l, lo que modula por consiguiente el fenotipo funcional de los macrófagos alveolares in vivo.
Los presentes resultados apoyan la indicación de que SP-R210l modula el cebado de macrófagos según lo indicado por una mayor capacidad de respuesta a LPS de células deficientes en SP-R210l o después del tratamiento de macrófagos con s P-A. Mostramos que la exposición de los macrófagos a los macrófagos preparados con SP-A para una mayor respuesta inflamatoria a la posterior adición de LPS tanto en las células controles como en las células SP-R210l(DN). En este contexto, estudios recientes mostraron que los macrófagos alveolares mantienen un distintivo proinflamatorio, lo que indica que los macrófagos alveolares ya están preparados para una mayor capacidad de respuesta a agentes inflamatorios in vivo. Por el contrario, los macrófagos alveolares son resistentes a los efectos tolerogénicos de LPS y otros estímulos inflamatorios. Aquí, mostramos que SP-A aumentó la expresión de ambas isoformas de SP-R210 que pueden ayudar a equilibrar los receptores innatos para regular el umbral de activación de los macrófagos y la disposición de los macrófagos para responder a los estímulos inflamatorios de manera adecuada, aunque SP-R210l es la principal variante en los macrófagos alveolares que está siendo afectada por SP-A in vivo.
En la presente descripción mostramos que la alteración de SP-R210l da como resultado niveles reducidos de TLR-4 de superficie, aunque aumentaron varias clases de receptores innatos. Además, encontramos diferentes mecanismos de tráfico de CD14 entre las células controles y SP-R210l(DN), lo que respalda la idea de que las isoformas de SP-R210 son reguladores intrínsecos del fenotipo funcional de los macrófagos.
Los componentes surfactantes adicionales pueden modificar la respuesta micropinocítica de los macrófagos. Sobre la base en nuestra caracterización espectrométrica de masas de SP-A usada para estudios in vitro, las actividades antiinflamatorias de las preparaciones de SP-A pueden atribuirse en parte a diferentes niveles de coaislamiento de proteína tensioactiva B y napsina A. La comparación lado a lado de SP-A preparado por el método de butanol/octilglucósido comúnmente usado (SP-Am1) o un método de extracción de éter isopropílico/butanol/etanol modificado (SP-Am2) del mismo individuo reveló niveles más altos de estas proteínas en el último método. Sin embargo, SP-Am1 preparado a partir de diferentes individuos contiene niveles variables de proteínas aisladas conjuntamente que podrían afectar los ensayos aguas abajo similares a SP_Am2, aunque el coaislamiento de SP-B en SP-Am2 fue coherentemente más alto (Figura 27A-C). La presencia de gp340, una proteína de unión a SP-A extracelular conocida, puede haber limitado la concentración eficaz de SP-A biológicamente activa, aunque se encontró en niveles similares en todas las preparaciones. Confirmamos que, a diferencia de SP-Am1, SP-Am2 no ceba pero inhibe el TNFa inducido por LPS de manera coherente.
La presente descripción abordó adicionalmente la interacción de SP-R210 y CD14. La alteración de SP-R210l reveló mecanismos distintos de captación de CD14 que modulan el umbral y la duración de la activación de macrófagos en respuesta a LPS. Encontramos que SP-R210s, CD14 y SR-A forman un complejo proinflamatorio en las células SP-R210l(DN) según lo revelado por ensayos funcionales que usan anticuerpos neutralizantes individuales o una combinación y experimentos de inmunoprecipitación. Además, mostramos diferentes mecanismos de tráfico de CD14 en las células controles y SP-R210l(DN) en las que la reubicación o secreción de CD14 a la membrana celular después de la adición de LPS es sensible a dynasore en las células controles pero insensible a dynasore en células SP-R210l(DN). La internalización inicial de CD14 estimulada por LPS es insensible a dynasore coherente con la
Claims (11)
1. Un anticuerpo monoclonal (mAb) o su fragmento que se une con especificidad al receptor SP-R210 de la proteína tensioactiva A, que comprende:
(I) una secuencia de cadena pesada variable que comprende:
a) una región 1 determinante de complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR1) que comprende la secuencia GYIFSDy Ym R (SEQ ID NO:3); y
b) una región 2 determinante de complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR2) que comprende la secuencia DINPKNGDTFYNQKFKGK (SEQ ID NO:4); y
c) una región 3 determinante de complementariedad de la cadena pesada (P2H10-HCDR3) que comprende la secuencia REGD (SEQ ID NO: 5); y
una secuencia de cadena ligera variable que comprende:
d) una región 1 determinante de complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR1) que comprende la secuencia RSSQTILHSNGNTYLE (SEQ ID NO:6); y
e) una región 2 determinante de complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR2) que comprende la secuencia KVSKRFS (SEQ ID NO: 7): y
f) una región 3 determinante de complementariedad de la cadena ligera (P2H10-LCDR3) que comprende la secuencia LQGSHVPLT (SEQ ID NO:8); y en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de (I) se une con especificidad solo a la isoforma SP-R210s del receptor SP-R210.
2. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal o su fragmento está parcial o totalmente humanizado.
3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2, que comprende una región constante de IgG humana.
4. Una composición para el uso en un método para tratar a un individuo que la necesita, el uso comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición que comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de la reivindicación 1.
5. La composición para el uso de la reivindicación 4, en donde el individuo necesita tratamiento contra una infección viral o bacteriana.
6. La composición para el uso de la reivindicación 5, en donde el individuo necesita tratamiento contra una infección por influenza viral.
7. La composición para el uso de la reivindicación 6, en donde el individuo tiene neumonía asociada con la infección por influenza viral.
8. Un vector de expresión que codifica un anticuerpo monoclonal o su fragmento de la reivindicación 1.
9. Un cultivo celular in vitro, en donde las células en el cultivo celular expresan el anticuerpo monoclonal o su fragmento de acuerdo con la reivindicación 1.
10. Un hibridoma que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.
11. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de la reivindicación 1.
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