ES2851386T3

ES2851386T3 - Método de tratamiento de las heridas

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Publication number: ES2851386T3
Application number: ES14871427T
Authority: ES
Inventors: Ulf Eriksson; Annelie Falkevall; Annika Mehlem
Original assignee: CSL Ltd; B Creative Sweden AB
Current assignee: CSL Ltd; B Creative Sweden AB
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2021-09-06
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: CN105979965A; EP3082860B1; US10543270B2; JP2017501182A; JP6553618B2; EP3082860A4; KR20220115815A; CA2932465A1; AU2014366837A1; AU2014366837B2; CA2932465C; KR20160096194A; EP3082860A1; BR112016014099A2; RU2016127196A; KR102466794B1; DK3082860T3; RU2672377C1; CN105979965B; WO2015089585A1

Abstract

Un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B para uso para tratar una herida o mejorar la cicatrización de heridas o para prevenir o ralentizar la progresión de la herida en un sujeto que padece una herida, donde la herida es una herida dérmica, el sujeto padece diabetes, y el compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B es: (i) una proteína que comprende una región de variable de anticuerpo que se une o se une específicamente a VEGF-B y neutraliza la señalización de VEGF-B; o (ii) un ácido nucleico que inhibe o previene la expresión de VEGF-B, en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en un antisentido, ARNip, ARNi, ribozima y ADNzima.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de tratamiento de las heridas

CAMPO

[0001] La presente invención se refiere a tratar o prevenir heridas dérmicas.

INTRODUCCIÓN

[0002] La cicatrización de heridas es un proceso complejo, que implica una fase de coagulación, una fase de inflamación, una fase de formación del tejido de granulación, y una fase de remodelación de tejido. Estos eventos son provocados por citocinas y factores de crecimiento que se liberan en el sitio de la lesión. Muchos factores pueden complicar o interferir con la cicatrización adecuada normal de las heridas. Por ejemplo, tales factores incluyen edad, infección, mala nutrición, inmunosupresión, medicamentos, radiación, diabetes, enfermedad vascular periférica, enfermedad sistémica, tabaquismo, estrés, etc.

[0003] Las heridas crónicas son aquellas que no proceden de un proceso de reparación ordenado y oportuno para producir integridad anatómica y funcional. Se estima que las heridas crónicas afectan a 5,7 millones de pacientes y cuestan alrededor de 20 mil millones de dólares anuales solo en los Estados Unidos.

[0004] Para los pacientes con diabetes, que es una enfermedad crónica, debilitante que afecta a aproximadamente 347 millones de personas en los Estados Unidos en 2008, el desarrollo de una úlcera del pie diabético (también referido como una herida o, en algunos casos, una herida crónica) es una complicación común. Debido a que la piel sirve como barrera principal contra el medio ambiente, una herida refractaria abierta puede ser catastrófica; una discapacidad importante (incluida la pérdida de una extremidad) e incluso la muerte. La ulceración del pie es el precursor de aproximadamente el 85% de las amputaciones de extremidades inferiores en personas con diabetes.

[0005] En la diabetes cualquiera de las fases de la cicatrización de la herida puede ser interrumpida. Sin embargo, una característica clave de las heridas diabéticas es un desequilibrio en la síntesis y degradación de las proteínas de la matriz extracelular. Además, la inflamación crónica provoca un retraso en la formación de tejido de granulación maduro y una reducción de la resistencia a la tracción de la herida.

[0006] Las terapias actuales de cuidado de heridas incluyen enfoques quirúrgicos y médicos. El documento WO 2009/126698 se refiere a materiales y métodos para modular la expresión y/o la actividad del transportador de ácidos grasos in vivo, incluidas composiciones que comprenden un inhibidor de VEGF-B. El documento WO 03/063904 se refiere a usos de inhibidores contra genes inducidos por hipoxia para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o suprimir la formación de adherencias postoperatorias/post-herida. Hagberg et al (2012) Nature, 490:426-32 se ocupa de apuntar al VEGF-B como un tratamiento novedoso para la resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2. Sands et al (2011) Respiratory Research, 12:17 se ocupa de cómo VEGF-B y PIGF pueden inhibir o potenciar las acciones de VEGFA. Berdal et al (2013) Endocrinology, 2013: 307925 no describe ninguna asociación entre la glucemia y la cicatrización de heridas en un modelo experimental de ratón db/db. Li et al (2008) Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 28:1614-1620 describen que el VEGF-B parece tener una actividad angiogénica relativamente restringida en el corazón isquémico.

[0007] La medicación tiene como objetivo controlar o prevenir infecciones, prevenir la isquemia y el edema, reducir el dolor y mejorar el estado metabólico. Los tratamientos locales incluyen la aplicación tópica de, p. ej., factores de crecimiento y plasma rico en plaquetas y apósitos para heridas de, p. ej., hidrocoloides e hidrogeles. Las intervenciones quirúrgicas incluyen angioplastia, injertos de piel y soporte mecánico para disminuir la presión. Cada terapia adolece de sus propias desventajas, como la necesidad crucial de intervenir en la fase de curación adecuada, una eficacia decepcionante y un coste elevado. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de tratamientos mejorados para heridas.

RESUMEN

[0008] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0009] En la producción de la presente invención, los inventores estudiaron los efectos de la inhibición de la señalización del factor de crecimiento vascular endotelial B (VEGF-B) en un modelo de ratón aceptado de herida, p. ej., heridas diabéticas. Los inventores estudiaron el efecto de este factor de crecimiento administrando un antagonista de VEGF-B (p. ej., un anticuerpo antagonista) a ratones diabéticos en los que se había inducido una herida. Los inventores encontraron que la inhibición de VEGF-B daba como resultado un cierre y curación de heridas significativamente más rápidos. Los inventores también encontraron que esta curación mejorada de la herida era particularmente notable en las primeras fases del cierre de la herida, p. ej., cuando la herida es más grande y abierta). En algunos casos (p. ej., en un experimento descrito en este documento), los cambios en la cicatrización de heridas se produjeron a pesar de un efecto moderado sobre los niveles de glucosa en sangre en sujetos diabéticos, lo que indica que la inhibición de VEGF-B proporciona un beneficio de cicatrización de heridas a través de una vía adicional o distinta a la glucémica. controlar.

[0010] Los resultados de los inventores proporcionan la base para métodos para inducir o mejorar la cicatrización de la herida o en el tratamiento de heridas o en el retraso o la prevención de las complicaciones de las heridas en un sujeto mediante la inhibición de la señalización de VEGF-B. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un método para tratar heridas en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B.

[0011] En otro ejemplo, la divulgación proporciona un método para inducir o mejorar la cicatrización de heridas en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización VEGF-B.

[0012] La evaluación de la cicatrización de la herida se puede determinar, p. ej., mediante el porcentaje de reducción en el área de la herida o el cierre completo de la herida. El área de la herida se puede determinar mediante análisis cuantitativo, p. ej., mediciones del área de la herida, trazados planimétricos de la herida, etc. El cierre completo de la herida se puede determinar, p. ej., mediante el cierre de la piel sin necesidad de drenaje o vendaje. También se pueden utilizar fotografías de la herida, exámenes físicos de la herida, etc. para evaluar la cicatrización de la herida. La aceleración de la cicatrización de heridas se puede expresar en términos de porcentaje de aceleración o expresado en términos de un índice de riesgo como tiempo de curación.

[0013] En otro ejemplo, la divulgación proporciona un método para prevenir o ralentizar la progresión de una herida o una complicación de una herida, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización VEGF-B.

[0014] En un ejemplo, la herida es aguda o normal, p. ej., lesión térmica (p. ej., una quemadura), trauma, cirugía, la escisión de cáncer de piel extenso, infecciones fúngicas profundas y bacterianas, la vasculitis o la esclerodermia.

[0015] En otro ejemplo, la herida es crónica. Por ejemplo, la herida es una úlcera arterial, una herida diabética, una úlcera diabética, una úlcera por presión o una úlcera venosa.

[0016] La herida es una herida dérmica.

[0017] Los sujetos padecen diabetes. En algunas realizaciones, el sujeto también padece obesidad.

[0018] Por ejemplo, los sujetos padecen diabetes, p. ej., diabetes de tipo 1 o tipo 2. En tal caso, la herida puede denominarse herida diabética (es decir, herida en un sujeto diabético) o úlcera diabética (es decir, úlcera en un sujeto diabético). Por ejemplo, la herida es una úlcera de pie diabético o una úlcera de pierna diabética.

[0019] En un ejemplo, la herida es una úlcera de decúbito.

[0020] En un ejemplo, los sujetos padecen uno o más de la neuropatía (p. ej., neuropatía diabética), enfermedad periférica vascular, mal control glucémico, anteriores ulceraciones del pie o amputaciones, nefropatía (o nefropatía diabética), isquemia de vasos sanguíneos pequeños y grandes o mala agudeza visual.

[0021] En un ejemplo, el sujeto tiene una herida.

[0022] En otro ejemplo, el sujeto está en riesgo de desarrollar una herida (p. ej., una herida crónica) y se administra el compuesto antes de, p. ej., cirugía (cuando se inducirá una herida). Por ejemplo, la divulgación proporciona un método para reducir la gravedad de una herida, p. ej., una herida inducida, p. ej., inducida por cirugía.

[0023] Como se ejemplifica en el presente documento, la inhibición de la señalización de VEGF-B es eficaz en el tratamiento de heridas diabéticas. Por tanto, en un ejemplo, la divulgación proporciona un método para tratar una herida en un sujeto diabético, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B.

[0024] La presente descripción también proporciona un método para mejorar o inducir la cicatrización de heridas en un sujeto diabético que sufre de una herida, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B.

[0025] En un ejemplo, el sujeto está en riesgo de evolución de una herida. Por ejemplo, el sujeto padece diabetes. Por ejemplo, el sujeto padece diabetes y uno o más de neuropatía diabética, enfermedad vascular periférica, control glucémico deficiente, ulceraciones o amputaciones previas del pie, nefropatía (o nefropatía diabética), isquemia de vasos sanguíneos pequeños y grandes o agudeza visual deficiente.

[0026] En un ejemplo, la presente descripción proporciona un método para reducir o prevenir la progresión de una herida en un sujeto diabético, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización VEGF-B.

[0027] En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un método para reducir el riesgo de que un sujeto (p. ej., un sujeto diabético) que padece una herida requerirá una amputación, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización VEGF-B.

[0028] En un ejemplo, el compuesto se administra en una cantidad eficaz para tener uno o más de los siguientes efectos:

• Mejorar la velocidad de cierre de la herida en comparación con la tasa en un sujeto (p. ej., en un sujeto que sufre de la diabetes y una herida) a quienes no se les ha administrado el compuesto; y/o

• Mejorar la cantidad de cierre de la herida en un momento específico (p. ej., después del comienzo del tratamiento) en comparación con la tasa en un sujeto (p. ej., en un sujeto que padece diabetes y una herida) a quien el compuesto no le ha sido administrado; y/o

• Mejorar la maduración de los vasos sanguíneos en un sujeto en comparación con un sujeto (p. ej., en un sujeto que padece diabetes y una herida) al que no se le ha administrado el compuesto.

[0029] La presente descripción también proporciona un método para tener uno o más de los siguientes efectos en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto que padece una herida (y, sufre opcionalmente de diabetes) un compuesto que inhibe señalización VEGF B:

• Mejorar la tasa de cierre de la herida en comparación con la tasa en un sujeto al que no se le ha administrado el compuesto; y/o

• Mejorar la cantidad de cierre de la herida en un momento específico en el tiempo en comparación con la tasa en un sujeto al que no se le ha administrado el compuesto; y/o

• Mejorar la maduración de los vasos sanguíneos en un sujeto en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado el compuesto.

[0030] En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B inhibe específicamente la señalización de VEGF-B. Esto no significa que un método de la presente divulgación no incluya la inhibición de la señalización de múltiples proteínas de VEGF, solo que el compuesto (o parte del mismo) que inhibe la señalización de VEGF-B es específico de VEGF-B, p. ej., no es un inhibidor general de proteínas VEGF. Este término tampoco excluye, p. ej., un anticuerpo o proteína biespecífica que comprende dominios de unión del mismo, que pueden inhibir específicamente la señalización de VEGF-B con uno (o más) dominios de unión y pueden inhibir específicamente la señalización de otra proteína con otro dominio de unión.

[0031] En un ejemplo, un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B es una proteína que comprende una región variable de anticuerpo que se une a o se une específicamente a VEGF-B y neutraliza la señalización de VEGF-B.

[0032] En un ejemplo, el compuesto es un mimético de anticuerpo. Por ejemplo, el compuesto es una proteína que comprende un dominio de unión a antígeno de una inmunoglobulina, p. ej., un IgNAR, un anticuerpo de camélido o un receptor de células T.

[0033] En un ejemplo, un compuesto es un anticuerpo de dominio (p. ej., que comprende solamente una región variable de cadena pesada, o sólo una región variable de cadena ligera que se une a VEGF-B) o un anticuerpo de solo cadena pesada (p. ej., un anticuerpo de camélido o un IgNAR) o una región variable del mismo.

[0034] En un ejemplo, un compuesto es una proteína que comprende una Fv. Por ejemplo, la proteína se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv);

(ii) un scFv dimérico (di-scFv); o

(iv) un diacuerpo;

(v) un triacuerpo;

(vi) un tetracuerpo;

(vii) un Fab;

(viii) a F(ab')2;

(ix) un Fv; o

(x) uno de (i) a (ix) unido a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (Ch)2 y/o Ch3.

[0035] En otro ejemplo, un compuesto es un anticuerpo. Los anticuerpos ejemplares son anticuerpos de longitud completa y/o desnudos.

[0036] En un ejemplo, el compuesto es una proteína que es recombinante, quimérica, injertada por CDR, humanizada, sinhumanizada, primatizada, desinmunizada o humana.

[0037] En un ejemplo, el compuesto es una proteína que comprende una región variable de anticuerpo que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo 2H10 a VEGF-B. En un ejemplo, la proteína comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 4.

[0038] En un ejemplo, el compuesto es una proteína que comprende una región variable humanizada del anticuerpo 2H10. Por ejemplo, la proteína comprende una región variable que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Vh y/o Vl del anticuerpo 2H10. Por ejemplo, la proteína comprende:

(i) un Vh que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 25-34 de SEQ ID NO: 3;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoácidos 49-65 de SEQ ID NO: 3; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 98-108 de SEQ ID NO: 3; y/o

(ii) una Vl que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 23-33 de SEQ ID NO: 4;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoácidos 49-55 de SEQ ID NO: 4; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 88-96 de la SEQ ID NO: 4.

[0039] En un ejemplo, el compuesto es una proteína que comprende una Vh y una Vl, Vh y Vl siendo regiones variables humanizadas del anticuerpo 2H10. Por ejemplo, la proteína comprende:

(i) un Vh que comprende:

(b) una CDR2 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 49-65 de SEQ ID NO: 3; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 98-108 de SEQ ID NO: 3; y

(ii) una VL que comprende:

[0040] En un ejemplo, la región variable o Vh en cualquiera de los párrafos precedentes comprende un conjunto de secuencias sucesivamente en SEQ ID NO: 5.

[0041] En un ejemplo, la región variable o Vl en cualquiera de los párrafos precedentes comprende un conjunto de secuencias sucesivamente en la SEQ ID NO: 6.

[0042] En un ejemplo, el compuesto es un anticuerpo.

[0043] En un ejemplo, el compuesto es un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5 y una Vl que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6.

[0044] En un ejemplo, la proteína o anticuerpo es cualquier forma de la proteína o anticuerpo codificado por un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas o anticuerpos anteriores o una célula que expresa la proteína o anticuerpo (p. ej., que incluye una proteína o anticuerpo modificado postraduccionalmente).

[0045] En un ejemplo, la proteína o el anticuerpo comprende:

(i) una Vh que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 11 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 12 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 13 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y/o

(ii) una Vl que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 14 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 15 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 16 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[0046] En un ejemplo, la proteína o el anticuerpo comprende:

(i) una VH que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 23 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 24 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 25 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; y/o

(ii) una VL que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 26 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 27 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 28 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[0047] En un ejemplo, la proteína o el anticuerpo comprende:

(i) una VH que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 35 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 36 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 37 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y/o

(ii) una VL que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 38 o que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 39 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 40 o que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

[0048] En un ejemplo, el compuesto es dentro de una composición. Por ejemplo, la composición comprende una proteína que comprende una región variable de anticuerpo o un Vh o un Vl o un anticuerpo como se describe en el presente documento. En un ejemplo, la composición comprende adicionalmente una o más variantes (p. ej., variantes modificadas postraduccionalmente) de la proteína o el anticuerpo. Por ejemplo, que comprende una variante que carece de un residuo de lisina C-terminal codificado, una variante desamidada y/o una variante glicosilada y/o una variante que comprende un piroglutamato, p. ej., en el extremo N-terminal de una proteína y/o una variante que carece un residuo N-terminal, p. ej., una glutamina N-terminal en un anticuerpo o región V y/o una variante que comprende toda o parte de una señal de secreción. Las variantes desamidadas de residuos de asparagina codificados pueden dar como resultado la generación de isoformas de ácido aspártico e isoaspártico o incluso una succinamida que implica un residuo de aminoácido adyacente. Las variantes desamidadas de residuos de glutamina codificados pueden dar como resultado ácido glutámico. Se pretende que las composiciones que comprenden una mezcla heterogénea de tales secuencias y variantes se incluyan cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos particular.

[0049] En un ejemplo, el compuesto que inhibe VEGF-B inhibe o evita la expresión de VEGF-B de señalización. Por ejemplo, el compuesto se selecciona del grupo antisentido, un ARNip, un ARNi, una ribozima y una ADNzima.

[0050] En un ejemplo, el VEGF-B es VEGF-B de mamífero, p. ej., VEGF-B humano.

[0051] En un ejemplo, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un primate, tal como un humano.

[0052] Los métodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden comprender adicionalmente administrar un tratamiento adicional para una herida.

[0053] Los métodos de tratamiento de heridas o úlceras diabéticas descritos en el presente documento pueden comprender adicionalmente la administración de un compuesto adicional para tratar o prevenir (o retrasar la progresión de) la diabetes. Aquí se describen compuestos ejemplares.

[0054] En otro ejemplo, la divulgación proporciona un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B para inducir o mejorar la cicatrización de heridas en un sujeto y/o prevenir o ralentizar la progresión de una herida o una complicación de una herida en un sujeto.

[0055] En otro ejemplo, la divulgación proporciona el uso de un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B en la fabricación de un medicamento para inducir o aumentar la cicatrización de heridas en un sujeto y/o prevenir o ralentizar la progresión de una herida o una complicación de una herida en un sujeto.

[0056] La presente descripción también proporciona un kit que comprende un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B envasada con instrucciones de uso en el tratamiento o la prevención de una herida y/o un método de la descripción.

[0057] En el presente documento se describen heridas y compuestos ejemplares y se debe considerar que se aplican mutatis mutandis a los ejemplos de la divulgación que se exponen en los tres párrafos anteriores.

[0058] Se tomarán ejemplos de la presente descripción para aplicar mutatis mutandis a la mejora de la cicatrización de heridas o la reducción de la recurrencia o la probabilidad de reaparición de una herida (p. ej., una úlcera diabética) o acelerar la cicatrización de heridas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0059]

La Figura 1 es una serie de representación gráfica que muestra el tratamiento anti-VEGF-B, el uso de 2H10 no afecta significativamente los niveles de glucosa en sangre o la pérdida de peso tras la herida en un modelo animal severamente diabético. El panel A muestra los niveles de glucosa en sangre alimentados y el panel B muestra el peso corporal alimentado en ratones diabéticos db/db o no diabéticos db/+ o tratados con anti-VEGF-B antes y después de herir a los animales (n=4-7/grupo) Valores son medias ± s.e.m.

La Figura 2 es una representación gráfica que muestra la inhibición farmacológica de VEGF-B usando 2H10 que mejora el cierre de heridas en un modelo de ratón severamente diabético. El cierre mejorado de la herida se detecta tras la inhibición farmacológica de VEGF-B en animales BKS diabéticos db/db. No se encuentran diferencias en el cierre de heridas en ratones db/+ BKS no diabéticos tras la inhibición de VEGF-B (n=8-14/grupo). Los valores son medias ± s.e.m. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 en comparación con los ratones tratados con control db/db.

La Figura 3 incluye una serie de representaciones gráficas que muestran el tratamiento anti-VEGF-B, usando 2H10 acelera la cicatrización de heridas, a pesar de que no hay diferencias en los niveles de glucosa en sangre, en períodos de tiempo cortos. Análisis de animales db/db tratados con 2H10 o anticuerpo de control y animales db/+. El panel A muestra los niveles de glucosa en sangre alimentados (n=5-6/grupo) y el panel B muestra el cierre de la herida durante los primeros cuatro días (n=10-12/grupo). Los valores son medias ± s.e.m. ***p<0,001 en comparación con el control db/db tratado.

La Figura 4 es una representación gráfica que muestra que el tratamiento anti-VEGF-B, usando 2H10, reduce la expresión de varios genes que se regulan positivamente durante la herida diabética. Los niveles de expresión de punto final de IGF-1, TGF-b, TNF-a, a-SMA, COL1a, Fgf-7 e IFN-y se midieron en ratones db/db tratados con 2H10 o anticuerpo de control, y en ratones db/+ tratados con control (n=8-14/grupo). Los valores son medias ± s.e.m. *p<0,05, en comparación con los animales de control tratados con db/db, # P <0,05, ## P <0,01, en comparación con los animales ratones tratados con control db/+. IGF-1; Factor de crecimiento similar a la insulina 1, TGF-b; factor de crecimiento transformante beta, TNF-a; Factor de necrosis tumoral, a-SMA; actina de músculo liso alfa, COL1a; colágeno alfa-1 tipo I, Fgf-7; factor de crecimiento de fibroblastos 7.

La Figura 5 incluye una serie de representaciones gráficas que muestran que la inhibición de VEGF-B en ratones db/db afecta la morfología de los vasos sanguíneos pero no promueve la proliferación celular. El gráfico superior muestra la cuantificación de la tinción Brdu/DAPI y el gráfico inferior muestra la cuantificación de la tinción CD45, CIV y CD31 de ratones db/db con control o anticuerpo 2H10. n = 4-6/grupo. Los valores son un promedio de ± s.e.m. *p<0,05, **p<0,01 en comparación con el control db/db tratado.

La Figura 6 es una representación gráfica que muestra que la vía de señalización de VEGF-B está regulada al alza en heridas diabéticas. Niveles de expresión de punto final VEGF-B, Vegfrl, Fatp4, Vegfa y Vegfr2 se midieron en el tejido de las heridas de ratones diabéticos db/db y ratones no diabéticos db/+. Los niveles de expresión se normalizan a TUBB5. Los valores son medias ± s.e.m. #P <0,05, ## P <0,01, tratado con control db/db comparado con tratado con control db/+, n = 3-5. VEGF-B; factor de crecimiento endotelial vascular B; Vegfrl; receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular, Fatp4; transportador de ácidos grasos 4, Vegfa; factor A de crecimiento endotelial vascular; Vegfr2; receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular. La Figura 7 es una representación gráfica que muestra que el tratamiento anti-VEGF-B usando 2H10 reduce la acumulación de lípidos en la piel en ratones db/db. El gráfico representado muestra la cuantificación de la tinción con rojo aceite O en db/db y db/+ tratados con control o anticuerpo 2H10. Los valores son medias ± s.e.m. ***p<0,001 tratado con control db/db en comparación con ratones tratados con db/db 2H10. ### P <0,001 animales Db/+ en comparación con ratones tratados con control db/db.

CLAVE PARA LISTADO DE SECUENCIAS

[0060]

SEQ ID NO:1 es una secuencia de aminoácidos de una isoforma humana VEGF-B186 que contiene una secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos

SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos de una isoforma humana VEGF-B167 que contiene una secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos.

SEQ ID NO 3 es una secuencia de aminoácidos de una Vh del anticuerpo 2H10.

SEQ ID NO 4 es una secuencia de aminoácidos de una Vl del anticuerpo 2H10.

SEQ ID NO 5 es una secuencia de aminoácidos de una Vh de una forma humanizada del anticuerpo 2H10. SEQ ID NO 6 es una secuencia de aminoácidos de una Vl de una forma humanizada del anticuerpo 2H10. SEQ ID NO 7 es una secuencia de aminoácidos de una Vh del anticuerpo 4E12.

SEQ ID NO 8 es una secuencia de aminoácidos de una Vl del anticuerpo 4E12.

SEQ ID NO 9 es una secuencia de aminoácidos de una Vh del anticuerpo 2F5.

SEQ ID NO 10 es una secuencia de aminoácidos de una Vl del anticuerpo 2F5.

SEQ ID NO 11 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR1 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 12 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR2 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 13 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR3 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 14 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR1 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 15 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR2 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 16 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR3 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 17 es una secuencia de aminoácidos de una Vl CDR1 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 18 es una secuencia de aminoácidos de una Vl CDR2 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 19 es una secuencia de aminoácidos de una Vl CDR3 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 20 es una secuencia de aminoácidos de una Vh CDR1 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 21 es una secuencia de aminoácidos de una Vh CDR2 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 22 es una secuencia de aminoácidos de una Vh CDR3 del anticuerpo 2H10

SEQ ID NO 23 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR1 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 24 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR2 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 25 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR3 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 26 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR1 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 27 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR2 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 28 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR3 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 29 es una secuencia de aminoácidos de una Vl CDR1 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 30 es una secuencia de aminoácidos de una Vl CDR2 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 31 es una secuencia de aminoácidos de una Vl CDR3 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 32 es una secuencia de aminoácidos de una Vh CDR1 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 33 es una secuencia de aminoácido de una Vh CDR2 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 34 es una secuencia de aminoácidos de una Vh CDR3 del anticuerpo 2F5

SEQ ID NO 35 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR1 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO 36 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR2 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO 37 es una secuencia de nucleótidos de una Vl CDR3 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO 38 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR1 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO 39 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR2 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO 40 es una secuencia de nucleótidos de una Vh CDR3 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO: 41 es una secuencia de aminoácidos de una Vl CDR1 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO: 42 es una secuencia de aminoácidos de una VL CDR2 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO: 43 es una secuencia de aminoácidos de una VL CDR3 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO: 44 es una secuencia de aminoácidos de una Vh CDR1 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO: 45 es una secuencia de aminoácidos de una VH CDR2 del anticuerpo 4E12

SEQ ID NO: 46 es una secuencia de aminoácidos de una VH CDR3 del anticuerpo 4E12

DESCRIPCIÓN DETALLADA

General

[0061] A lo largo de esta especificación, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a un solo paso, composición de materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de materia debe considerarse para abarcar uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupos de composiciones de la materia.

[0062] Los expertos en la técnica apreciarán que la presente descripción es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la divulgación incluye todas esas variaciones y modificaciones. La divulgación también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o indicados en esta especificación, individual o colectivamente, y todas y cada una de las combinaciones o dos o más de dichas etapas o características.

[0063] La presente divulgación no está limitada en su alcance por los ejemplos específicos descritos en este documento, que se pretende con el propósito de ejemplificación solamente. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la presente descripción.

[0064] Cualquier ejemplo de la presente descripción en el presente documento debe tomarse para aplicar mutatis mutandis a cualquier otro ejemplo de la descripción a menos que se indique específicamente lo contrario.

[0065] A menos que se defina específicamente de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento se considerará que tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia (p. ej., en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas y bioquímica).

[0066] A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo de células, y técnicas inmunológicas utilizados en la presente descripción son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican a lo largo de la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), DM Glover y BD Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996) y FM Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) y JE Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluidas todas las actualizaciones hasta el presente).

[0067] La descripción y las definiciones de las regiones variables y partes de las mismas, inmunoglobulinas, anticuerpos y fragmentos de los mismos en el presente documento pueden ser clarificados aún más por la discusión en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, 1987 y 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia y Lesk J. Mol Biol. 196: 901 - 917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 y/o Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997.

[0068] Se entenderá que cualquier discusión de una proteína o anticuerpo en este documento incluye cualquier variante de la proteína o anticuerpo producido durante la fabricación y/o almacenamiento. Por ejemplo, durante la fabricación o el almacenamiento, un anticuerpo se puede desamidar (p. ej., en un residuo de asparagina o glutamina) y/o tener una glicosilación alterada y/o convertir un residuo de glutamina en piroglutina y/o tener un extremo N-terminal o residuo C-terminal eliminado o "recortado" y/o tiene parte o la totalidad de una secuencia señal procesada de forma incompleta y, como consecuencia, permanece en el término del anticuerpo. Se entiende que una composición que comprende una secuencia de aminoácidos particular puede ser una mezcla heterogénea de la secuencia indicada o codificada y/o variantes de esa secuencia indicada o codificada.

[0069] El término "y/o", p. ej., "X y/o Y" se entiende que significa ya sea "X e Y" o "X o Y" y deberá ser tomado para proporcionar apoyo explícito a ambos significados o para cualquier significado.

[0070] A lo largo de esta especificación la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

[0071] Tal como se utiliza aquí, el término "derivado de" se empleará para indicar que un entero especificado puede obtenerse de una fuente en particular aunque no necesariamente directamente de esa fuente.

Definiciones seleccionadas

[0072] VEGF-B se sabe que existe en dos isotermas principales, denominadas VEGF-B186 y VEGF-B167. A efectos de nomenclatura únicamente y no de limitación, las secuencias ejemplares de VEGF-B186 humano se establecen en la secuencia de referencia n Cb I: NP_003368,1, en los números de acceso de la proteína NCBI NP_003368, P49765 y AAL79001 y en la SEQ ID NO:1. En el contexto de la presente divulgación, la secuencia de VEGF-B186 puede carecer de la secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos (p. ej., como se establece en los aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:1. A efectos de nomenclatura únicamente y no de limitación, las secuencias ejemplares de VEGF-Bw humano se establecen en la secuencia de referencia NCBI: NP_001230662,1, en los números de acceso de la proteína NCBI AAL79000 y AAB06274 y en la SEQ ID NO: 2. En el contexto de la presente divulgación, la secuencia de VEGF-Bw puede carecer de la secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos (p. ej., como se establece en los aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2. Se puede determinar una secuencia adicional de VEGF-B usando secuencias proporcionadas en este documento y/o en bases de datos disponibles públicamente y/o determinado utilizando técnicas estándar (p. ej., como se describe en Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente) o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La referencia a VEGF-B humano puede abreviarse como hVEGF-B. En un ejemplo, la referencia en el presente documento a VEGF-B es a la isoforma de VEGF-Bw.

[0073] La referencia en el presente documento a VEGF-B también abarca el péptido VEGF-B10-108como se describe en el documento WO2006/012688.

[0074] El término "herida" tendrá el significado de cualquier lesión en donde se ve comprometido un tejido de un sujeto (p. ej., desgarrado, perforado, cortado, o roto de otro modo).

[0075] Tal como se utiliza aquí, el término "herida dérmica" tendrá el significado de una lesión a una o más capas de piel de un sujeto, p. ej., en donde la lesión comprende una o más células apoptóticas dérmicas y/o una o más células necróticas dérmicas. El término "herida dérmica" debe entenderse para incluir una herida que afecta una capa epidérmica de un sujeto y/o una capa dérmica de un sujeto y/o una capa hipodérmica de un sujeto.

[0076] El término "herida crónica" se refiere a una herida que no se cura en un conjunto ordenado de etapas y en una cantidad de tiempo predecible. Generalmente, las heridas que no se curan en tres meses se consideran crónicas. Las heridas crónicas incluyen, pero no se limitan a por ejemplo, úlceras arteriales, úlceras diabéticas, úlceras por presión, úlceras venosas, etc. Una herida aguda puede convertirse en una herida crónica.

[0077] El término "herida aguda" o "herida normal" se refiere una herida que sufre herida normal de reparación de curación.

[0078] El término "progresión de una herida" se entiende que significa un empeoramiento de una herida, p. ej., el aumento de tamaño y/o profundidad y/o la progresión a una etapa y/o desarrollo más avanzado de una infección.

[0079] El término "curación" en el contexto de la presente descripción es una promoción o aceleración del tiempo desde que se administra el compuesto hasta el cierre de la herida significativa o completa (contracción completa de la herida).

[0080] El término "tejido" se refiere a una masa de células en el cuerpo humano que se agrupan para formar una función específica. El tejido incluye, pero no se limita a piel, cartílago y tejido conectivo.

[0081] El término "recombinante" se entiende que significa el producto de recombinación genética artificial. Por consiguiente, en el contexto de una proteína recombinante que comprende una región variable de anticuerpo, este término no abarca un anticuerpo que se produce naturalmente dentro del cuerpo de un sujeto que es el producto de la recombinación natural que se produce durante la maduración de las células B. Sin embargo, si se aísla tal anticuerpo, se considerará una proteína aislada que comprende una región variable de anticuerpo. De manera similar, si el ácido nucleico que codifica la proteína se aísla y expresa usando medios recombinantes, la proteína resultante es una proteína recombinante que comprende una región variable de anticuerpo. Una proteína recombinante también incluye una proteína expresada por medios recombinantes artificiales cuando está dentro de una célula, tejido o sujeto, p. ej., en donde se expresa.

[0082] El término "proteína" tendrá el significado de incluir una única cadena polipeptídica, es decir, una serie de aminoácidos contiguos unidos por enlaces peptídicos o una serie de cadenas de polipéptido covalentemente o no covalentemente unidas entre sí (es decir, un polipéptido complejo). Por ejemplo, la serie de cadenas polipeptídicas puede unirse covalentemente usando un enlace químico o disulfuro adecuado. Los ejemplos de enlaces no covalentes incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas.

[0083] El término "polipéptido" o "cadena de polipéptido" se entenderá a partir del párrafo anterior en el sentido de una serie de aminoácidos contiguos unidos por enlaces peptídicos.

[0084] El experto en la materia será consciente de que un "anticuerpo" se considera generalmente que es una proteína que comprende una región variable compuesta por una pluralidad de cadenas de polipéptidos, p. ej., un polipéptido que comprende una región de cadena ligera variable (Vl) y un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada (Vh). Un anticuerpo también comprende generalmente dominios constantes, algunos de los cuales pueden disponerse en una región constante, que incluye un fragmento constante o un fragmento cristalizable (Fc), en el caso de una cadena pesada. Un Vh y un Vl interactúan para formar un Fv que comprende una región de unión a antígeno que es capaz de unirse específicamente a uno o unos pocos antígenos estrechamente relacionados. Generalmente, una cadena ligera de mamíferos es una cadena ligera k o una cadena ligera A y una cadena pesada de mamíferos es a, 8, £, y o m. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. El término "anticuerpo" también incluye anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos humanos, anticuerpos sinhumanizados y anticuerpos quiméricos.

[0085] Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" o "conjunto de anticuerpos" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, en contraposición a un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Específicamente, los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadenas ligeras y pesadas que incluyen una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia de tipo silvestre (p. ej., dominios constantes de secuencia de tipo silvestre humano) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos.

[0086] Como se usa en este documento, "región variable" se refiere a las porciones de las cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo como se define el presente documento que es capaz de unirse específicamente a un antígeno e incluye secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad (CDRs); es decir, CDR1, CDR2 y CDR3, y regiones marco (FR). Las regiones variables ejemplares comprenden tres o cuatro FR (p. ej., FR1, FR2, FR3 y opcionalmente FR4) junto con tres CDR. En el caso de una proteína derivada de un IgNAR, la proteína puede carecer de CDR2. Vh se refiere a la región variable de la cadena pesada. Vl se refiere a la región variable de la cadena ligera.

[0087] Como se usa en este documento, el término "regiones determinantes de complementariedad" (syn. CDRs; es decir, CDR1, CDR2, y CDR3) se refiere a los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión al antígeno. Cada dominio variable tiene típicamente tres regiones c Dr identificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Las posiciones de aminoácidos asignadas a las CDR y FR se pueden definir de acuerdo con Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991 u otros sistemas de numeración en la realización de esta descripción, p. ej., el sistema canónico de numeración de Chothia y Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877 - 883, 1989; y/o Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997; el sistema de numeración IMGT de Lefranc et al., Devel. y Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003; o el sistema de numeración AHO de Honnegher y Plükthun J. Mol. Biol,. 309: 657-670, 2001.

[0088] "Regiones marco" (FR) son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de CDR.

[0089] Como se usa en este documento, por el término "Fv" se entiende cualquier proteína, si se compone de múltiples polipéptidos o un único polipéptido, en donde un Vl y un Vh se asocian y forman un complejo que tiene un sitio de unión a antígeno, es decir, capaz de unirse específicamente a un antígeno. Vh y el Vl que forman el sitio de unión al antígeno pueden estar en una única cadena polipeptídica o en diferentes cadenas polipeptídicas. Además, un Fv de la divulgación (así como cualquier proteína de la divulgación) puede tener múltiples sitios de unión al antígeno que pueden o no unirse al mismo antígeno. Se entenderá que este término engloba los fragmentos derivados directamente de un anticuerpo así como las proteínas correspondientes a dicho fragmento producido usando medios recombinantes. En algunos ejemplos, el Vh no está unido a un dominio constante de cadena pesada (Ch) 1 y/o el Vl no está unido a un dominio constante de cadena ligera (Cl). Los polipéptidos o proteínas que contienen Fv ejemplares incluyen un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab'), un scFv, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o complejo de orden superior, o cualquiera de los anteriores unidos a una región constante o dominio del mismo, p. ej., dominio Ch2 o Ch3, p. ej., un minicuerpo. Un "fragmento Fab" consiste en un fragmento monovalente de unión al antígeno de un anticuerpo, y se puede producir mediante la digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína, para producir un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada o se puede producir usando medios recombinantes. Puede obtenerse un "fragmento Fab'" de un anticuerpo tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido de reducción, para producir una molécula que consta de una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada que comprende un Vh y un único dominio constante. Se obtienen dos fragmentos Fab' por anticuerpo tratado de esta manera. También se puede producir un fragmento Fab' por medios recombinantes. Un "fragmento F(ab')2" de un anticuerpo consiste en un dímero de dos fragmentos Fab' unidos por dos enlaces disulfuro, y se obtiene tratando una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento "Fab2" es un fragmento recombinante que comprende dos fragmentos Fab enlazados usando, p. ej., una cremallera de leucina o un dominio Ch3. Un "Fv monocatenario" o "scFv" es una molécula recombinante que contiene el fragmento de región variable (Fv) de un anticuerpo en donde la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están unidas covalentemente por un engarce polipeptídico flexible adecuado.

[0090] Como se usa en este documento, el término "une" en referencia a la interacción de una proteína o un sitio de unión a antígeno del mismo con un antígeno significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (p. ej., un antigénico determinante o epítopo) sobre el antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo se une al epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo "A" (o libre, sin marcar "A"), en una reacción que contiene "A" marcado y la proteína, reducirá la cantidad de "A" marcado "unido al anticuerpo.

[0091] Como se usa en este documento, el término "se une específicamente" o "específicamente se une" significa que una proteína de la divulgación reacciona o se asociad más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con un antígeno o célula particular que expresa lo mismo que con antígenos o células alternativos. Por ejemplo, una proteína se une a VEGF-B con una afinidad materialmente mayor (p. ej., 20 veces o 40 veces o 60 veces o 80 veces a 100 veces o 150 veces o 200 veces) que con otro factor de crecimiento (p. ej., VEGF-A) o con antígenos comúnmente reconocidos por anticuerpos naturales polirreactivos (es decir, por anticuerpos naturales que se sabe que se unen a una variedad de antígenos que se encuentran naturalmente en los seres humanos). Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la vinculación significa la vinculación específica, y se entenderá que cada término proporciona un apoyo explícito para el otro término.

[0092] Tal como se utiliza aquí, el término "neutralizar" tendrá el significado de que una proteína es capaz de bloquear, reducir o prevenir señalización de VEGF-B en una célula a través de la VEGF-R1. Los métodos para determinar la neutralización se conocen en la técnica y/o se describen en el presente documento.

[0093] Como se usa en este documento, los términos "prevenir", "prevenido" o "prevención" incluyen la administración de un compuesto de la divulgación para detener de ese modo o dificultar el desarrollo de al menos un síntoma de una condición.

[0094] Como se usa en este documento, los términos "tratar", "tratado" o "tratamiento" incluyen la administración de una proteína descrita en este documento para de este modo reducir o eliminar al menos un síntoma de una enfermedad especificada o condición o hasta la progresión lenta de la enfermedad o condición.

[0095] Tal como se utiliza aquí, el término "sujeto" tendrá el significado de significar cualquier animal, incluyendo seres humanos, por ejemplo un mamífero. Los sujetos ejemplares incluyen, pero no se limitan a humanos y primates no humanos. Por ejemplo, el sujeto es un ser humano.

Tratamiento de heridas

[0096] La presente descripción proporciona métodos para acelerar y/o mejorar y/o potenciar la curación de heridas, mediante la administración de un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B. Por ejemplo, un método comprende administrar el compuesto a una herida de un sujeto o sistémicamente a un sujeto.

[0097] En un ejemplo, el sujeto padece una herida. La herida puede ser crónica, aguda o normal. En un ejemplo, la herida es crónica. En un ejemplo, la herida que se trata es una herida en etapa 0A o una herida en etapa 1A o una herida en etapa 2A o una herida en etapa 3A como se establece en la Tabla 1. En un ejemplo, la herida que se trata es una herida en etapa 0B o una herida en etapa 1B o una herida en etapa 2B o una herida en etapa 3B como se establece en la Tabla 1. En un ejemplo, la herida que se está tratando es una herida en etapa 0C o una herida en etapa 1C o una herida en etapa 2c o una herida en etapa 3C según lo establecido en la Tabla 1. En un ejemplo, la herida que se está tratando es una herida de etapa 0D o una herida de etapa ID o una herida de etapa 2D o una herida de etapa 3D tal como se establece en la Tabla 1.

Tabla 1: Etapas de la herida (según la definición del Sistema de clasificación de heridas de Texas)

(Continuación)

[0098] En un ejemplo, un sujeto padece una herida que está infectada y/o isquémica.

[0099] En un ejemplo, la herida es una herida de espesor total.

[0100] En un ejemplo, la herida es una úlcera diabética, p. ej., una úlcera de pie diabético. Las úlceras diabéticas se pueden clasificar utilizando el sistema expuesto en la Tabla 1. En otro ejemplo, la úlcera se clasifica de acuerdo con el Sistema de Clasificación de Úlceras de Wagner como se establece en la Tabla 2.

Tabla 2: Sistema de clasificación de úlceras de Wagner

[0101] Los ejemplos de algunos de los factores de riesgo de úlceras de pie diabético incluyen neuropatía periférica, que afecta las funciones motoras y sensoriales del pie, movilidad articular limitada, deformidades del pie, distribución anormal de la presión del pie, traumatismos menores repetidos y agudeza visual deteriorada. La neuropatía sensorial periférica es un factor primario. Aproximadamente el 45% - 60% de todas las ulceraciones diabéticas son neuropáticas, mientras que hasta el 45% tienen componentes tanto neuropáticos como isquémicos. Con un pie insensible, el paciente es incapaz de percibir una lesión repetitiva en el pie causada, p. ej., por un calzado mal ajustado durante la deambulación y las actividades de la vida diaria. La neuropatía, combinada con la biomecánica alterada de la marcha, conduce a un traumatismo contundente repetitivo y a la distribución de cargas de estrés anormalmente elevadas en las partes vulnerables del pie, lo que da como resultado la formación de callos y erosión cutánea. Una vez que se forma una úlcera, a menudo tarda en curarse, puede continuar agrandándose, brinda una oportunidad para una infección local o sistémica y requiere atención médica y quirúrgica integral para promover la curación.

[0102] En un ejemplo, la herida es o ha estado presente en el sujeto durante al menos aproximadamente 2 semanas antes de administrar un compuesto descrito en este documento. En un ejemplo, la herida está o ha estado presente en el sujeto durante al menos aproximadamente 4 semanas antes de administrar un compuesto descrito en este documento. En un ejemplo, la herida está o ha estado presente en el sujeto durante al menos aproximadamente 6 semanas antes de administrar un compuesto descrito en este documento.

[0103] Los métodos de la divulgación también son aplicables a sujetos que se están sometiendo o se han sometido a un tratamiento, en donde el tratamiento retrasa o proporciona una cicatrización de heridas ineficaz. Los tratamientos pueden incluir, pero no se limitan a medicamentos, radiación, tratamientos que dan como resultado sistemas inmunes suprimidos, etc. En un ejemplo, un sujeto tiene una afección secundaria, en donde las afecciones secundarias retrasan o proporcionan una cicatrización de heridas ineficaz. Condiciones secundarias, incluyen, pero no se limitan a por ejemplo, diabetes, enfermedad vascular periférica, infección, trastornos vasculares autoinmunes o de colágeno, estados de enfermedad que dan como resultado sistemas inmunes suprimidos, etc.

[0104] El análisis cuantitativo se puede utilizar para evaluar la cicatrización de heridas, p. ej., determinar el % de reducción en el área de la herida, o el cierre completo de la herida (p. ej., medido por el cierre de la piel sin necesidad de drenaje o vendaje). El área de la herida se evalúa antes, durante y después del tratamiento mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la evaluación se puede determinar, p. ej., mediante planimetría cuantitativa, fotografías, exámenes físicos, etc. El área de la herida se puede determinar antes, durante y después del tratamiento. En un ejemplo, el área de la herida se puede estimar midiendo la longitud, L, de la herida, la longitud más larga de borde a borde en, p. ej., cm, y el ancho, W, el ancho más largo de borde a borde perpendicular a L en, p. ej., cm, y multiplicar LxW para obtener el área de superficie estimada (cm). El tamaño de la herida para el tratamiento puede variar. En un ejemplo de la invención, el área de la herida antes del tratamiento es de aproximadamente 0,4 cm2 o más, o aproximadamente 1,0 cm2 o más, o entre aproximadamente 0,4 cm2 y aproximadamente 10 cm2, o entre aproximadamente 1 cm2 y aproximadamente 10 cm2, o entre aproximadamente 1 cm2 y aproximadamente 7 cm2, o entre aproximadamente 1 cm2 y aproximadamente 5 cm2, o más de 4,0 cm2 El área se puede medir antes o después del desbridamiento.

[0105] La aceleración de la cicatrización de heridas se puede describir mediante el % de aceleración de la cicatrización de heridas y/o una relación de riesgo. Por ejemplo, la administración de un compuesto acelera la cicatrización de heridas mayor al 50%, o igual o superior al 60%, igual o superior al 70%, igual o superior al 74%, igual o superior al 75%, igual o superior al 80%, igual o superior al 85%, igual o superior al 90%, igual o superior al 95%, igual o superior al 100%, igual o superior al 110% o más, cuando en comparación con un control.

[0106] Los métodos de la divulgación abarcan acelerar y/o mejorar y/o potenciar la cicatrización de heridas en una población de sujetos. Por ejemplo, un método comprende administrar un compuesto a un sujeto de la población, en donde la administración del compuesto da como resultado más del 10% (o más del 12%, o 14%, 15%, 17% o 20%, o 25%, o 30%, o 33%, o 35%, o 40%, o 45%, o 50% o más) de mejora en la cicatrización de heridas en la población en comparación con un control.

[0107] La presente descripción también proporciona métodos para reducir la recurrencia de heridas (o úlceras). Por ejemplo, un método comprende administrar un compuesto a un sujeto de manera que se reduzca la incidencia de recurrencia de la úlcera.

[0108] También se proporcionan métodos para reducir la gravedad de una herida, p. ej., en un sujeto en riesgo de desarrollar una herida (p. ej., una herida crónica) que ha de someterse a cirugía (cuando se inducirá una herida).

[0109] En un ejemplo alternativo, la descripción proporciona un método para reducir la cicatrización resultante de una herida en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B.

[0110] En un ejemplo alternativo adicional, la descripción proporciona un método para prevenir la formación de una herida (es decir, una nueva herida), comprendiendo el método administrar al sujeto un compuesto que inhibe la señalización VEGF-B.

Inhibidores de la señalización VEGF-B

Proteínas que comprenden regiones variables de anticuerpos

[0111] Un inhibidor de la señalización ejemplar VEGF-B comprende una región variable de anticuerpo, p. ej., es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a VEGF-B y neutraliza la señalización de VEGF-B.

[0112] En un ejemplo, la región variable de anticuerpo se une específicamente a VEGF-B.

[0113] Se conocen en la técnica anticuerpos y proteínas adecuados que comprenden regiones variables de los mismos.

[0114] Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF-B y fragmentos de los mismos se describen en el documento WO2006/012688.

[0115] En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es un anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de 2S10 a VEGF-B o un antígeno fragmento de unión del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o un fragmento del mismo es el anticuerpo 2H10 o una versión quimérica, injertada con CDR o humanizada del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. A este respecto, el anticuerpo 2H10 comprende un Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3 y un Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 4. Versiones quiméricas y humanizadas ejemplares de este anticuerpo se describen en WO2006/012688.

[0116] En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo comprende un Vh que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5 y un Vl que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6.

[0117] En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es un anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de 4E12 a VEGF-B o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es el anticuerpo 4E12 o una versión quimérica, injertada con CDR o humanizada del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. A este respecto, el anticuerpo 4E12 comprende un Vh que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7 y un Vl que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 8.

[0118] En un ejemplo, el compuesto es una proteína que comprende una región variable humanizada del anticuerpo 4E12. Por ejemplo, la proteína comprende una región variable que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Vh y/o Vl del anticuerpo 4E12. Por ejemplo, la proteína comprende:

(i) un Vh que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 25-34 de SEQ ID NO: 7;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 49-65 de SEQ ID NO: 7; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoácidos 98-105 de SEQ ID NO: 7; y/o

(ii) una Vl que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 24-34 de SEQ ID NO: 8;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 50-56 de SEQ ID NO: 8; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 8.

[0119] En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es un anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de 2F5 a VEGF-B o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o un fragmento del mismo es el anticuerpo 2F5 o una versión quimérica, injertada con CDR o humanizada del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. A este respecto, el anticuerpo 2E5 comprende una Vh que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 9 y una Vl que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 10.

[0120] En un ejemplo, el compuesto es una proteína que comprende una región variable humanizada del anticuerpo 2F5. Por ejemplo, la proteína comprende una región variable que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Vh y/o Vl del anticuerpo 2F5. Por ejemplo, la proteína comprende:

(i) un VH que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 25-34 de SEQ ID NO: 9;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 49-65 de SEQ ID NO: 9; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 98-107 de SEQ ID NO: 9; y/o

(ii) un VL que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 24-34 de SEQ ID NO: 10;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 50-56 de SEQ ID NO: 10; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 89-96 de la SEQ ID NO: 10.

[0121] En otro ejemplo, un anticuerpo o proteína que comprende una región variable de la misma se produce utilizando un estándar de método, p. ej., como se conoce en la técnica o se describe brevemente en el presente documento.

Métodos basados en inmunización

[0122] Para generar anticuerpos, VEGF-B o un fragmento que lleva un epítopo o parte del mismo o una forma modificada del mismo o del ácido nucleico que codifica el mismo (un "inmunógeno"), opcionalmente formulado con cualquier adyuvante adecuado o deseado y/o vehículo farmacéuticamente aceptable se administra un a un sujeto (p. ej., un sujeto animal no humano, tal como un ratón, una rata, un pollo, etc.) en forma de una composición inyectable. Los animales no humanos ejemplares son mamíferos, tales como animales murinos (p. ej., ratas o ratones). La inyección puede ser intranasal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal o por otra vía conocida. Opcionalmente, el inmunógeno se administra numerosas veces. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los métodos para producir anticuerpos anti-VEGF-B en ratones se describen en WO2006/012688.

[0123] La producción de anticuerpos policlonales se puede monitorizar mediante el muestreo de sangre del animal inmunizado en varios puntos después de la inmunización. Se puede administrar una segunda inyección de refuerzo, si se requiere para lograr el título de anticuerpos deseado. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta que se alcanza un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado se sangra y el suero se aísla y se almacena, y/o el animal se usa para generar anticuerpos monoclonales (mAb).

[0124] Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos ejemplares contemplados por la presente divulgación. Generalmente, la producción de anticuerpos monoclonales implica inmunizar a un sujeto (p. ej., un roedor, p. ej., un ratón o una rata) con el inmunógeno en condiciones suficientes para estimular las células productoras de anticuerpos. En algunos ejemplos, un ratón modificado genéticamente para expresar anticuerpos humanos y no expresar proteínas de anticuerpos murinos, se inmuniza para producir un anticuerpo (p. ej., como se describe en PCT/US2007/008231 y/o Lonberg et al., Nature 368 (1994): 856-859). Después de la inmunización, las células somáticas productoras de anticuerpos (p. ej., linfocitos B) se fusionan con células inmortales, p. ej., células de mieloma inmortales. Se conocen en la técnica varios métodos para producir tales células fusionadas (hibridomas) y se describen, p. ej., en Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497, 1975. Las células de hibridoma pueden cultivarse luego en condiciones suficientes para la producción de anticuerpos.

[0125] La presente descripción contempla otros métodos para la producción de anticuerpos, p. ej., tecnología ABL-MYC (como se describe, por ejemplo en Largaespada et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol, 166, 91-96. 1990).

Métodos basados en bibliotecas

[0126] La presente divulgación también abarca la selección de bibliotecas de anticuerpos o proteínas que comprenden dominios de unión de antígeno de los mismos (p. ej., que comprende regiones variables de los mismos) para identificar un anticuerpo o proteína de unión a VEGF-B que comprende una región variable del mismo.

[0127] Los ejemplos de bibliotecas contempladas por esta divulgación incluyen bibliotecas ingenuas (de sujetos no desafiados), bibliotecas inmunizadas (de sujetos inmunizados con un antígeno) o bibliotecas sintéticas. El ácido nucleico que codifica anticuerpos o regiones de los mismos (p. ej., regiones variables) se clonan mediante técnicas convencionales (p. ej., como se describe en Sambrook y Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Press, 2001) y se utiliza para codificar y presentar proteínas utilizando un método conocido en la técnica. Otras técnicas para producir bibliotecas de proteínas se describen, p. ej., en el documento US6300064 (p. ej., una biblioteca HuCAL de Morphosys AG); US5885793; US6204023; US6291158; o US6248516.

[0128] Las proteínas de acuerdo con la invención pueden ser proteínas secretadas solubles o se pueden presentar como una fusión de proteína en la superficie de una célula, o una partícula (p. ej., un fago u otro virus, un ribosoma o una espora). Se conocen en la técnica varios formatos de biblioteca de visualización. Por ejemplo, la biblioteca es una biblioteca de presentación in vitro (p. ej., una biblioteca de presentación de ribosomas, una biblioteca de presentación covalente o una biblioteca de presentación de ARNm, p. ej., como se describe en el documento US7270969). En otro ejemplo más, la biblioteca de presentación es una biblioteca de presentación de fagos en donde las proteínas que comprenden dominios de unión a antígenos de anticuerpos se expresan en fagos, p. ej., como se describe en el documento US6300064; US5885793; US6204023; US6291158; o US6248516. Se conocen en la técnica otros métodos de presentación de fagos y se contemplan en la presente divulgación. De manera similar, los métodos de exhibición celular son contemplados por la divulgación, p. ej., bibliotecas de exhibición bacteriana, p. ej., como se describe en US5516637; bibliotecas de presentación de levadura, p. ej., como se describe en el documento US6423538 o una biblioteca de presentación de mamíferos.

[0129] Los métodos para bibliotecas de presentación de detección son conocidos en la técnica. En un ejemplo, se analiza una biblioteca de presentación de la presente divulgación usando purificación por afinidad, p. ej., como se describe en Scopes (en: Protein purification: principles and practice, tercera edición, Springer Verlag, 1994). Los métodos de purificación por afinidad típicamente implican poner en contacto proteínas que comprenden dominios de unión a antígeno presentados por la biblioteca con un antígeno diana (p. ej., VEGF-B) y, después del lavado, eluir aquellos dominios que permanecen unidos al antígeno.

[0130] Cualesquiera regiones variables o scFv identificadas mediante cribado se modifican fácilmente en un anticuerpo completo, si se desea. Se describen métodos ejemplares para modificar o reformatear regiones variables o scFv en un anticuerpo completo, p. ej., en Jones et al., J Immunol Methods. 354: 85-90, 2010; o Jostock et al., J Immunol Methods, 289: 65-80, 2004. Alternativamente, o adicionalmente, se utilizan métodos de clonación estándar, p. ej., como se describe en Ausubel et al (en: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) y/o (Sambrook et al (en: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, tercera edición 2001).

Proteínas desinmunizadas, quiméricas, humanizadas, sinhumanizadas, primatizadas y humanas

[0131] Las proteínas de la presente divulgación pueden ser una proteína humanizada.

[0132] El término "proteína humanizada" se entenderá para referirse a una proteína que comprende una región variable de tipo humano, que incluye CDR de un anticuerpo de una especie no humana (p. ej., ratón o rata o primate no humano) injertada o insertada en FR de un anticuerpo humano (este tipo de anticuerpo también se denomina "anticuerpo injertado con CDR"). Las proteínas humanizadas también incluyen proteínas en las que se modifican uno o más residuos de la proteína humana por una o más sustituciones de aminoácidos y/o uno o más restos FR de la proteína humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Las proteínas humanizadas también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo humano ni en el anticuerpo no humano. Cualquier región adicional de la proteína (p. ej., región Fc) es generalmente humana. La humanización se puede realizar usando un método conocido en la técnica, p. ej., US5225539, US6054297, US7566771 o US5585089. El término "proteína humanizada" también abarca una proteína superhumanizada, p. ej., como se describe en el documento US7732578.

[0133] Las proteínas de la presente divulgación pueden ser proteínas humanas. El término "proteína humana" como se usa en este documento se refiere a proteínas que tienen regiones de anticuerpos variables y, opcionalmente, constantes que se encuentran en humanos, p. ej., en la línea germinal humana o células somáticas o de bibliotecas producidas usando tales regiones. Los anticuerpos "humanos" pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas, p. ej., mutaciones introducidas por mutaciones aleatorias o dirigidas al sitio in vitro (en particular mutaciones que implican sustituciones conservadoras o mutaciones en un pequeño número de residuos de la proteína, p. ej., en 1,2, 3, 4 o 5 de los residuos de la proteína). Estos "anticuerpos humanos" no necesitan necesariamente generarse como resultado de una respuesta inmune de un ser humano, sino que pueden generarse usando medios recombinantes (p. ej., cribado de una biblioteca de presentación de fagos) y/o por un animal transgénico (p. ej., un ratón) que comprende ácido nucleico que codifica regiones constantes y/o variables de anticuerpos humanos y/o que usa selección guiada (p. ej., como se describe en US5565332). Este término también incluye formas maduradas por afinidad de tales anticuerpos. Para los propósitos de la presente divulgación, también se considerará que una proteína humana incluye una proteína que comprende FR de un anticuerpo humano o FR que comprenden secuencias de una secuencia consenso de FR humanas y en las que una o más de las CDR son aleatorias o semi aleatorias, p. ej., como se describe en US6300064 y/o US6248516.

[0134] Las proteínas de la presente divulgación pueden ser proteínas sinhumanizadas. El término "proteína sinhumanizada" se refiere a una proteína preparada mediante un método descrito en el documento WO2007/019620. Una proteína sinhumanizada incluye una región variable de un anticuerpo, en donde la región variable comprende FR de una región variable de anticuerpo de primates del Nuevo Mundo y CDR de una región variable de anticuerpo de primates que no es del Nuevo Mundo. Por ejemplo, una proteína sinhumanizada incluye una región variable de un anticuerpo, en donde la región variable comprende FR de una región variable de anticuerpo de primate del Nuevo Mundo y CDR de un anticuerpo de ratón o rata.

[0135] Las proteínas de la presente divulgación pueden ser proteínas primatizadas. Una "proteína primatizada" comprende región(es) variable(s) de un anticuerpo generado después de la inmunización de un primate no humano (p. ej., un macaco cynomolgus). Opcionalmente, las regiones variables del anticuerpo de primates no humanos se unen a regiones constantes humanas para producir un anticuerpo primatizado. En el documento US6113898 se describen métodos ejemplares para producir anticuerpos primatizados.

[0136] En un ejemplo, una proteína de la divulgación es una proteína quimérica. El término "proteínas quiméricas" se refiere a proteínas en las que un dominio de unión a antígeno es de una especie particular (p. ej., murino, como ratón o rata) o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la proteína es de una proteína derivada de otra especie (como, p. ej., primate humano o no humano) o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos. En un ejemplo, una proteína quimérica es un anticuerpo quimérico que comprende un Vh y/o un Vl de un anticuerpo no humano (p. ej., un anticuerpo murino) y las regiones restantes del anticuerpo son de un anticuerpo humano. La producción de tales proteínas quiméricas es conocida en la técnica y se puede lograr por medios estándar (como se describe, p. ej., en los documentos US6331415; US5807715; US4816567 y US4816397).

[0137] La presente descripción también contempla una proteína desinmunizada, p. ej., como se describe en WO2000/34317 y WO2004/108158. Los anticuerpos y proteínas desinmunizados tienen uno o más epítopos, p. ej., epítopos de células B o epítopos de células T eliminados (es decir, mutados) para reducir así la probabilidad de que un sujeto genere una respuesta inmune contra el anticuerpo o proteína.

Otras regiones variables de proteínas que comprenden anticuerpos

[0138] La presente descripción también contempla otras proteínas que comprenden una región variable o dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, tales como:

(i) un anticuerpo de un solo dominio, que es una única cadena de polipéptido que comprende la totalidad o una porción de Vh o Vl de un anticuerpo (ver, p. ej., US6248516);

(ii) diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, p. ej., como se describe en los documentos US5844094 y/o US2008152586;

(iii) scFv, p. ej., como se describe en el documento US5260203;

(iv) minicuerpos, p. ej., como se describe en el documento US5837821;

(v) proteínas biespecíficas de "llave y agujero" como se describe en el documento US5731168;

(vi) proteínas heteroconjugadas, p. ej., como se describe en el documento US4676980;

(vii) proteínas heteroconjugadas producidas usando un reticulante químico, p. ej., como se describe en el documento US4676980;

(viii) fragmentos Fab'-SH, p. ej., como se describe en Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225, 1992; o (ix) Fab3 (p. ej., como se describe en EP19930302894).

Fusiones de dominio constantes

[0139] La presente divulgación abarca una proteína que comprende una región variable de un anticuerpo y una región constante o Fc o un dominio del mismo, p. ej., dominio Ch2 y/o Ch3. Las regiones y/o dominios constantes adecuados serán evidentes para el experto en la materia y/o las secuencias de dichos polipéptidos están fácilmente disponibles en bases de datos disponibles públicamente. Kabat et al también proporcionan una descripción de algunas regiones/dominios constantes adecuados.

[0140] Las regiones constantes y/o dominios de las mismas son útiles para proporcionar actividades biológicas tales como dimerización, semivida sérica prolongada, p. ej., mediante unión a FcRn (receptor Fc neonatal), citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, fagocitosis celular dependiente de antígeno (ADCP).

[0141] La presente descripción también contempla proteínas que comprenden regiones constantes mutantes o dominios, p. ej., como se describe en US7217797; US7217798; o US20090041770 (que tiene una mayor vida media) o US2005037000 (aumento de la ADCC).

Proteínas estabilizadas

[0142] Proteínas neutralizantes de la presente descripción pueden comprender una región constante de IgG4 o una región constante estabilizada por IgG4. el término "región constante estabilizada por IgG4" se entiende que significa una región constante de IgG4 que ha sido modificado para reducir intercambio de brazo Fab o la propensión a someterse a un intercambio de brazo Fab o formación de un medio anticuerpo o una propensión a formar un medio anticuerpo. "Intercambio de brazo Fab" se refiere a un tipo de modificación de proteína para IgG4 humana, en donde una cadena pesada de IgG4 y una cadena ligera unida (media molécula) se intercambian por un par de cadenas ligeras y pesadas de otra molécula de IgG4. Por tanto, las moléculas de IgG4 pueden adquirir dos brazos Fab distintos que reconocen dos antígenos distintos (lo que da como resultado moléculas biespecíficas). El intercambio de brazos Fab se produce de forma natural in vivo y puede inducirse in vitro mediante células sanguíneas purificadas o agentes reductores como el glutatión reducido. Un "medio anticuerpo" se forma cuando un anticuerpo IgG4 se disocia para formar dos moléculas, cada una de las cuales contiene una única cadena pesada y una única cadena ligera.

[0143] En un ejemplo, una región constante de IgG4 estabilizada comprende una prolina en la posición 241 de la región de bisagra de acuerdo con el sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 y/o 1991). Esta posición corresponde a la posición 228 de la región de bisagra según el sistema de numeración de la u E (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 y Edelman et al., Proc. Natl. Acad. EE. UU., 63, 78 - 85, 1969). En la IgG4 humana, este residuo es generalmente una serina. Tras la sustitución de prolina por serina, la región de bisagra de IgG4 comprende una secuencia CPPC. A este respecto, el experto en la materia sabrá que la "región bisagra" es una porción rica en prolina de una región constante de la cadena pesada de anticuerpo que une las regiones Fc y Fab que confiere movilidad a los dos brazos Fab de un anticuerpo. La región de bisagra incluye residuos de cisteína que están implicados en enlaces disulfuro de cadenas pesadas. Generalmente se define como el estiramiento de Glu226 a Pro243 de IgG1 humana según el sistema de numeración de Kabat. Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y el último residuo de cisteína que forman enlaces disulfuro (S-S) entre cadenas pesadas en las mismas posiciones (véase, p. ej., el documento WO2010/080538).

Inhibidores de señalización VEGF-B en base a proteína adicionales

[0144] Otras proteínas que pueden interferir con la interacción productiva de VEGF-B con su receptor incluyen proteínas VEGF-B mutante.

[0145] En un ejemplo, el inhibidor es una proteína soluble que comprende uno o más dominios de un polipéptido VEGF-R1 que se unen a VEGF-B (y, p. ej., no se unen sustancialmente a VEGF-A). En un ejemplo, la proteína soluble comprende además una región constante de un anticuerpo, tal como un anticuerpo IgG1. Por ejemplo, la proteína soluble comprende adicionalmente una región Fc y, opcionalmente, una región bisagra de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo IgG1.

[0146] En un ejemplo, el inhibidor de proteínas es un mimético de anticuerpos, p. ej., un andamio de proteínas que comprende regiones variables que se unen a una proteína diana de una manera análoga a un anticuerpo. A continuación se ofrece una descripción de miméticos de anticuerpos ejemplares.

Fragmentos de inmunoglobulinas e inmunoglobulina

[0147] Un ejemplo de un compuesto de la presente divulgación es una proteína que comprende una región variable de una inmunoglobulina, tal como un receptor de células T o una cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., un IgNAR, un anticuerpo de camélido).

Inmunoglobulinas de cadena pesada

[0148] Inmunoglobulinas de cadena pesada difieren estructuralmente de muchas otras formas de inmunoglobulina (p. ej., anticuerpos) en la medida en que comprenden una cadena pesada, pero no comprenden una cadena ligera. Por consiguiente, estas inmunoglobulinas también se denominan "anticuerpos de cadena pesada solamente". Las inmunoglobulinas de cadena pesada se encuentran, p. ej., en camélidos y peces cartilaginosos (también llamados IgNAR).

[0149] Las regiones variables presentes en inmunoglobulinas de cadena pesada naturales se denominan generalmente como "dominios Vhh" en camélidos Ig y V-NAR en IgNAR, con el fin de distinguirlos de las regiones variables de cadena pesada que están presentes en anticuerpos cadena 4 convencionales (que se denominan "dominios Vh") y de las regiones variables de cadena ligera que están presentes en los anticuerpos de cadena 4 convencionales (que se denominan "dominios Vl").

[0150] Inmunoglobulinas de cadena pesada no requieren la presencia de cadenas ligeras de unirse con alta afinidad y con alta especificidad a un antígeno relevante. Esto significa que los fragmentos de unión de un solo dominio pueden derivarse de inmunoglobulinas de cadena pesada, que son fáciles de expresar y generalmente son estables y solubles.

[0151] Una descripción general de inmunoglobulinas de cadena pesada de camélidos y las regiones variables de los mismos y métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso se encuentra entre otras cosas en las siguientes referencias WO94/04678, WO97/49805 y WO 97/49805.

[0152] Una descripción general de inmunoglobulinas de cadena pesada de peces cartilaginosos y las regiones variables de los mismos y métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso se encuentra entre otras cosas en el documento WO2005/118629.

Proteínas de tipo V

[0153] Un ejemplo de un compuesto de la descripción es un receptor de células T. Los receptores de células T tienen dos dominios V que se combinan en una estructura similar al módulo Fv de un anticuerpo. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 88: 8646-8650, 1991 describe cómo los dos dominios V del receptor de células T (denominados alfa y beta) pueden fusionarse y expresarse como un polipéptido de cadena sencilla y, además, cómo alterar los residuos de la superficie para reducir la hidrofobicidad directamente análoga a un anticuerpo scFv. Otras publicaciones que describen la producción de receptores de células T de cadena sencilla o receptores de células T multiméricos que comprenden dos dominios V-alfa y V-beta incluyen WO1999/045110 o WO2011/107595.

[0154] Otras proteínas que no son anticuerpos que comprenden dominios de unión a antígenos incluyen proteínas con dominios de tipo V, que son generalmente monoméricas. Los ejemplos de proteínas que comprenden tales dominios tipo V incluyen CTLA-4, CD28 e ICOS. En el documento Wo 1999/045110 se incluye una descripción adicional de proteínas que comprenden dichos dominios tipo V.

Adnectinas

[0155] En un ejemplo, un compuesto de la divulgación es una adnectina. Las adnectinas se basan en el décimo dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) de la fibronectina humana en donde las regiones del bucle se alteran para conferir unión al antígeno. Por ejemplo, se pueden diseñar tres bucles en un extremo del sándwich p del dominio 10Fn3 para permitir que una adnectina reconozca específicamente un antígeno. Para obtener más detalles, consulte los documentos US20080139791 o WO2005/056764.

Anticalinas

[0156] En un ejemplo adicional, un compuesto de la revelación es una anticalina. Las anticalinas se derivan de las lipocalinas, que son una familia de proteínas extracelulares que transportan pequeñas moléculas hidrófobas como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Las lipocalinas tienen una estructura secundaria rígida de hoja p con una pluralidad de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que pueden modificarse para unirse a un antígeno. Estas lipocalinas modificadas se conocen como anticalinas. Para obtener una descripción más detallada de las anticalinas, consulte los documentos US7250297B1 o US20070224633.

Aficuerpos

[0157] En un ejemplo adicional, un compuesto de la revelación es un aficuerpo. Un aficuerpo es un andamio derivado del dominio Z (dominio de unión al antígeno) de la Proteína A de Staphylococcus aureus que puede modificarse para unirse al antígeno. El dominio Z consta de un paquete de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado bibliotecas por aleatorización de residuos superficiales. Para obtener más detalles, consulte EP1641818.

Avímeros

[0158] En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgación es un avímero. Los avímeros son proteínas multidominio derivadas de la familia de andamios de dominio A. Los dominios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura definida con enlaces disulfuro. La diversidad se genera mediante la mezcla de la variación natural que presenta la familia de dominios A. Para obtener más detalles, consulte el documento WO2002088171.

DARPin

[0159] En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgación es una proteína de repetición de anquirina diseñada (DARPin). Las DARPins se derivan de anquirina, que es una familia de proteínas que median la unión de proteínas integrales de membrana al citoesqueleto. Una sola repetición de anquirina es un motivo de 33 residuos que consta de dos hélices a y un giro p. Pueden diseñarse para unirse a diferentes antígenos diana aleatorizando residuos en la primera hélice a y una vuelta p de cada repetición. Su interfaz de enlace se puede aumentar incrementando el número de módulos (un método de maduración por afinidad). Para obtener más detalles, consulte US20040132028.

Métodos para producir proteínas

Expresión recombinante

[0160] En el caso de una proteína recombinante, ácido nucleico que codifica la misma se puede clonar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como E. coli, células de levadura, células de insecto, o células de mamíferos, como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK) o células de mieloma que de otro modo no producen un anticuerpo. Las células ejemplares utilizadas para expresar una proteína de la divulgación son células CHO, células de mieloma o células HEK. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos fines se conocen en la técnica y se describen, p. ej., en Ausubel et al., (Editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente) o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Una amplia variedad de métodos de clonación y amplificación in vitro son adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes. Los métodos para producir anticuerpos recombinantes también se conocen en la técnica. Consulte US4816567 o US5530101.

[0161] Después del aislamiento, el ácido nucleico se inserta operativamente unido a un promotor en una construcción de expresión o vector de expresión para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión en un sistema libre de células o en células.

[0162] Tal como se utiliza aquí, el término "promotor" se debe tomar en su contexto más amplio e incluye las secuencias transcripcionales reguladoras de un gen genómico, incluyendo la caja TATA o elemento iniciador, que se requiere para iniciación de la transcripción precisa, con o sin elementos reguladores adicionales (p. ej., secuencias de activación cadena arriba, sitios de unión de factores de transcripción, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión de un ácido nucleico, p. ej., en respuesta a un estímulo del desarrollo y/o externo, o de una manera específica de tejido. En el presente contexto, el término "promotor" también se usa para describir un ácido nucleico recombinante, sintético o de fusión, o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de un ácido nucleico al que está operativamente unido. Los promotores ejemplares pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos para mejorar más la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de dicho ácido nucleico.

[0163] Como se usa en este documento, el término "unido operativamente a" significa el posicionamiento de un promotor con relación a un ácido nucleico tal que la expresión del ácido nucleico está controlada por el promotor.

[0164] Muchos vectores para la expresión en células están disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: una secuencia señal, una secuencia que codifica un anticuerpo (p. ej., derivada de la información proporcionada en este documento), un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El experto en la materia conocerá las secuencias adecuadas para la expresión de un anticuerpo. Ejemplos de secuencias señal incluyen señales de secreción procariota (p. ej., pelB, fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable), señales de secreción de levadura (p. ej., líder de invertasa, líder de factor a o líder de fosfatasa ácida) o señales de secreción de mamíferos (p. ej., señal gD de herpes simplex).

[0165] Los ejemplos de promotores activos en células de mamíferos incluyen el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV-IE), el promotor del factor de elongación humano 1-a (EF1), los promotores de ARN nuclear pequeño (U1a y U1b), el promotor de la cadena pesada de la a-miosina, el virus de los simios Promotor 40 (SV40), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor tardío principal de adenovirus, promotor de p-actina; elemento regulador híbrido que comprende un potenciador de CMV/promotor de p-actina o un promotor de inmunoglobulina o un fragmento activo del mismo. Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en suspensión de cultivo; células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); o células de ovario de hámster chino (CHO).

[0166] Los promotores típicos adecuados para la expresión en células de levadura, tales como por ejemplo, una célula de levadura seleccionada del grupo que comprende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y S. pombe, incluyen, pero no se limitan a el promotor ADH1, el promotor GAL1, el promotor GAL4, el promotor CUP1, el promotor PHO5, el promotor nmt, el promotor RPR1, o el promotor TEF1.

[0167] Los medios para introducir el ácido nucleico aislado o construcción de expresión que comprende el mismo en una célula para la expresión son conocidos para los expertos en la técnica. La técnica utilizada para una célula dada depende de la técnicas exitosas conocidas. Los medios para introducir ADN recombinante en las células incluyen microinyección, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas tal como usando lipofectamina (Gibco, MD, EE.UU.) y/o cellfec estaño (Gibco, MD, EE. UU.), captación de ADN mediada por PEG, electroporación y bombardeo de micropartículas, como mediante el uso de partículas de oro o tungsteno recubiertas de Ad N (Agracetus Inc., WI, EE. UU.), entre otros.

[0168] Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo pueden cultivarse en una variedad de medios, dependiendo del tipo de célula utilizado. Los medios disponibles comercialmente como Ham's Fl0 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPM1-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de células de mamíferos. Medios para el cultivo de otros tipos de células analizadas en este documento son conocidos en la técnica.

Purificación de proteínas

[0169] Después de la producción/expresión, una proteína de la divulgación se purifica usando un método conocido en la técnica. Tal purificación proporciona la proteína de la divulgación sustancialmente libre de proteínas no específicas, ácidos, lípidos, carbohidratos y similares. En un ejemplo, la proteína estará en una preparación en donde más del 90% (p. ej., 95%, 98% o 99%) de la proteína en la preparación es una proteína de la divulgación.

[0170] Se emplean los métodos estándar de purificación de péptidos para obtener una proteína aislada de la divulgación, incluyendo pero no limitado a varios protocolos de aislamiento de cromatografía líquida de alta presión (o rendimiento) (HPLC) y el polipéptido no-HPLC, tales como cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de modo mixto, métodos de separación de fases, separaciones electroforéticas, métodos de precipitación, métodos de entrada/salida de sal, inmunocromatografía y/u otros métodos.

[0171] En un ejemplo, la purificación por afinidad es útil para aislar una proteína de fusión que comprende un marcador. Los métodos para aislar una proteína usando cromatografía de afinidad se conocen en la técnica y se describen, p. ej., en Scopes (en: Protein purification: principles and practice, tercera edición, Springer Verlag, 1994). Por ejemplo, un anticuerpo o compuesto que se une al marcador (en el caso de un marcador de polihistidina, esto puede ser, p. ej., níquel-NTA) se inmoviliza sobre un soporte sólido. A continuación, se pone en contacto una muestra que comprende una proteína con el anticuerpo o compuesto inmovilizado durante un tiempo y en condiciones suficientes para que se produzca la unión. Después del lavado para eliminar cualquier proteína no unida o unida no específicamente, se eluye la proteína.

[0172] En el caso de una proteína que comprende una región Fc de un anticuerpo, proteína A o proteína G o formas modificadas de los mismos se puede utilizar para purificación por afinidad. La proteína A es útil para aislar proteínas purificadas que comprenden una región Fc de cadena pesada y1, y2 o y4 humana. La proteína G se recomienda para todos los isotipos Fc de ratón y para y3 humano.

Inhibidores de señalización VEGF-B a base de ácido nucleico

[0173] En un ejemplo de la divulgación, métodos terapéuticos/profilácticos como se describe en el presente documento de acuerdo con cualquier ejemplo de la divulgación implican la reducción de la expresión de VEGF-B. Por ejemplo, tal método implica la administración de un compuesto que reduce la transcripción y/o traducción del ácido nucleico. En un ejemplo, el compuesto es un ácido nucleico, p. ej., un polinucleótido antisentido, una ribozima, un PNA, un ARN de interferencia, un ARNip o un microARN.

Ácidos nucleicos antisentido

[0174] El término "ácido nucleico antisentido" debe entenderse como un ADN o ARN o un derivado del mismo (p. ej., LNA o PNA), o una combinación de los mismos que es complementario de al menos una porción de una molécula de ARNm específica que codifica un polipéptido como se describe en el presente documento en cualquier ejemplo de la divulgación y capaz de interferir con un evento postranscripcional tal como traducción de ARNm. El uso de métodos antisentido es conocido en la técnica (véase, p. ej., Hartmann y Endres (editores), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)).

[0175] Un ácido nucleico antisentido de la divulgación se hibridará con un ácido nucleico diana en condiciones fisiológicas. Los ácidos nucleicos antisentido incluyen secuencias que corresponden a genes estructurales o regiones codificantes o secuencias que efectúan el control sobre la expresión o corte y empalme de genes. Por ejemplo, el ácido nucleico antisentido puede corresponder a la región codificante dirigida de un ácido nucleico que codifica VEGF-B, o la región no traducida 5' (UTR) o la UTR 3' o una combinación de estos. Puede ser complementario en parte a las secuencias de intrones, que pueden empalmarse durante o después de la transcripción, p. ej., solo a las secuencias de exones del gen diana. La longitud de la secuencia antisentido debe ser de al menos 19 nucleótidos contiguos, p. ej., al menos 50 nucleótidos, tal como al menos 100, 200, 500 o 1.000 nucleótidos de un ácido nucleico que codifica VEGF-B. Puede usarse la secuencia de longitud completa complementaria a la transcripción completa del gen. La longitud puede ser de 100 a 2000 nucleótidos. El grado de identidad de la secuencia antisentido con el transcrito dirigido debe ser al menos del 90%, p. ej., del 95-100%.

[0176] Se describen ácidos nucleicos antisentido ejemplares contra VEGF-B, p. ej., en WO2003/105754.

Ácido nucleico catalizador

[0177] El término "ácido nucleico catalítico" se refiere a una molécula de ADN o molécula que contiene ADN (también conocido en la técnica como un "desoxirribozima" o "ADNzima") o un ARN o molécula que contiene ARN (también conocida como una "ribozima" o "ARNzima") que reconoce específicamente un sustrato distinto y cataliza la modificación química de este sustrato. Las bases de ácido nucleico en el ácido nucleico catalítico pueden ser bases A, C, G, T (y U para ARN).

[0178] Típicamente, el ácido nucleico catalítico contiene una secuencia antisentido para el reconocimiento específico de un ácido nucleico diana, y una actividad enzimática de escisión de ácido nucleico (también denominado en este documento como el "dominio catalítico"). Los tipos de ribozimas que son útiles en esta descripción son una ribozima de cabeza de martillo y una ribozima de horquilla.

Interferencia de ARN

[0179] La interferencia de ARN (ARNi) es útil para inhibir específicamente la producción de una proteína particular. Sin estar limitado por la teoría, esta tecnología se basa en la presencia de moléculas de dsARN que contienen una secuencia que es esencialmente idéntica al mARN del gen de interés o parte del mismo, en este caso un mARN que codifica un VEGF-B. Convenientemente, el dsARN se puede producir a partir de un solo promotor en una célula huésped de vector recombinante, donde las secuencias sentido y antisentido están flanqueadas por una secuencia no relacionada que permite que las secuencias sentido y antisentido hibriden para formar la molécula de dsARN con la secuencia no relacionada que forma una estructura de bucle. El diseño y producción de moléculas de dsARN adecuadas para la presente divulgación está dentro de la capacidad de un experto en la técnica, considerando particularmente los documentos WO99/32619, WO99/53050, WO99/49029 y WO01/34815.

[0180] La longitud de las secuencias sentido y antisentido que hibridan debería ser cada una al menos 19 nucleótidos contiguos, tal como al menos 30 o 50 nucleótidos, por ejemplo al menos 100, 200, 500 o 1.000 nucleótidos. Puede usarse la secuencia de longitud completa correspondiente a la transcripción completa del gen. Las longitudes pueden ser de 100 a 2000 nucleótidos. El grado de identidad de las secuencias sentido y antisentido con el transcrito dirigido debe ser al menos del 85%, p. ej., al menos el 90%, tal como el 95-100%.

[0181] Las moléculas pequeñas ejemplares de ARN de interferencia ("siARN") comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica a aproximadamente 19-21 nucleótidos contiguos de la ARNm diana. Por ejemplo, la secuencia de ARNip comienza con el dinucleótido A-A, comprende un contenido de GC de aproximadamente 30-70% (p. ej., 30-60%, tal como 40-60%, por ejemplo aproximadamente 45%-55%), y no tener un alto porcentaje de identidad con ninguna secuencia de nucleótidos distinta de la diana en el genoma del mamífero en donde se va a introducir, p. ej., según se determina mediante búsqueda BLAST estándar. Los ARNip ejemplares que reducen la expresión de VEGF-B están disponibles comercialmente en Santa Cruz Biotechnology o Novus Biologicals.

[0182] ARN de horquilla corta (shARN) que reducen la expresión de VEGF-B también son conocidos en la técnica y comercialmente disponible de Santa Cruz Biotechnology.

Ensayos de selección

[0183] Los compuestos que inhiben la señalización de VEGF-B se pueden identificar usando técnicas conocidas en la técnica, p. ej., como se describe a continuación. De manera similar, las cantidades de inhibidores de señalización de VEGF-B adecuadas para su uso en un método descrito en el presente documento pueden determinarse o estimarse usando técnicas conocidas en la técnica, p. ej., como se describe a continuación.

Ensayos de neutralización

[0184] Para compuestos que se unen a VEGF-B e inhiben la señalización, se puede usar un ensayo de neutralización.

[0185] En un ejemplo, un ensayo de neutralización implica poner en contacto VEGF-B con un compuesto en presencia o ausencia de VEGF-R1 soluble marcado detectablemente o ponerse en contacto de forma detectable VEGF-B marcado con un compuesto en presencia o ausencia de una célula que expresa VEGF-R1 o un VEGF-R1 soluble. Entonces se evalúa el nivel de VEGF-B unido al VEGF-R1. Un nivel reducido de VEGF-B unido en presencia del compuesto en comparación con la ausencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la unión de VEGF-B a VEGF-R1 y, como consecuencia, la señalización de VEGF-B.

[0186] Otro ensayo de neutralización se describe en el documento WO2006/012688 e implica poner en contacto un fragmento de VEGF-R1 que comprende el segundo dominio de tipo Ig inmovilizado sobre un soporte sólido con una concentración subsaturante de VEGF-B recombinante preincubado con un compuesto. Después del lavado para eliminar la proteína no unida, la proteína inmovilizada se pone en contacto con el anticuerpo anti-VEGF-B y se determina la cantidad de anticuerpo unido (indicativo de VEGF-B inmovilizado). Un compuesto que reduce el nivel de anticuerpo unido en comparación con el nivel en ausencia del compuesto se considera un inhibidor de la señalización de VEGF-B.

[0187] En otro ejemplo, un compuesto que inhibe la señalización VEGF-B se identifica usando una célula que depende de señalización VEGF-B para la proliferación, p. ej., una célula BaF3 modificado como se describe en el documento WO2006/012688 para expresar un receptor quimérico que incorpora el dominio intracelular del receptor de eritropoyetina humano y el dominio extracelular de VEGF-R1. Las células se cultivan en presencia de VEGF-B y en presencia o ausencia de un compuesto. A continuación, se evalúa la proliferación celular utilizando métodos estándar, p. ej., ensayos de formación de colonias, incorporación de timidina o captación de otro marcador adecuado de proliferación celular (p. ej., un ensayo de reducción de colorante MTS). Un compuesto que reduce el nivel de proliferación en presencia de VEGF-B se considera un inhibidor de la señalización de VEGF-B.

[0188] Los compuestos también pueden evaluarse para su capacidad de unirse a VEGF-B utilizando métodos estándar. Los métodos para evaluar la unión a una proteína se conocen en la técnica, p. ej., como se describe en Scopes (en: Protein purification: principles and practice, tercera edición, Springer Verlag, 1994). Tal método generalmente implica marcar el compuesto y ponerlo en contacto con VEGF-B inmovilizado. Después del lavado para eliminar el compuesto unido no específico, se detecta la cantidad de marcador y, como consecuencia, el compuesto unido. Por supuesto, el compuesto se puede inmovilizar y marcar con VEGF-B. También se pueden utilizar ensayos de tipo barrido. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden usar ensayos de resonancia de plasmón superficial.

Ensayos de expresión

[0189] Un compuesto que reduce o evita la expresión de VEGF-B se identifica poniendo en contacto una célula con el compuesto y determinar el nivel de expresión del VEGF-B. Los métodos adecuados para determinar la expresión génica a nivel de ácido nucleico son conocidos en la técnica e incluyen, p. ej., la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) o ensayos de microarrays. Los métodos adecuados para determinar la expresión a nivel de proteína también se conocen en la técnica e incluyen, p. ej., ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), ensayo de inmunoabsorción ligado a fluorescencia (FLISA), inmunofluorescencia o transferencia Western.

Ensayos in vitro

[0190] Numerosos ensayos in vitro se han descrito para la evaluación de la curación de heridas, incluyendo rascado o ensayos de cero en donde se raspa un cultivo de células endoteliales o fibroblastos para producir una zona libre de células y la tasa de cierre de esta zona libre de células se evalúa en presencia o ausencia de un compuesto.

[0191] Otros ensayos incluyen el modelo de membrana corioalantoidea (CAM).

Ensayos in vivo

[0192] Hay numerosos ensayos in vivo para evaluar la cicatrización de heridas. Por ejemplo, los presentes inventores han hecho uso de un modelo en donde se hieren animales diabéticos (p. ej., se producen heridas de espesor total) y se evalúa la velocidad y/o la cantidad de cierre de la herida a lo largo del tiempo en presencia o ausencia de un compuesto de prueba.

[0193] Otros modelos de herida crónica incluyen, p. ej., el modelo de oreja del conejo "úlcera", modelos de colgajo de piel, modelos de úlcera de presión (p. ej., mediante la aplicación de presión a la pierna de un galgo usando un yeso) o administración subcutánea adriamicina.

[0194] Los modelos de heridas agudas incluyen, p. ej., modelos de incisión, modelos de escisión y modelos de quemaduras.

[0195] Las heridas pueden ser producidas en animales que sufren de otros defectos, p. ej., defectos metabólicos (p. ej., como se describe en el presente documento o mediante la administración de estreptozotocina).

[0196] Se describen varios modelos de heridas, p. ej., en Demling et al., WOUNDS. 13(1 Suppl A): 5-14, 2001 y en las Directrices de la FDA para úlceras cutáneas crónicas y quemaduras.

Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento

[0197] Un compuesto que inhibe la señalización VEGF-B (syn. ingrediente activo) es útil para la administración parenteral, tópica, oral o administración local, administración por aerosol, o la administración transdérmica, para el tratamiento profiláctico o para el tratamiento terapéutico. En un ejemplo, el compuesto se administra por vía parenteral, tal como por vía subcutánea o intravenosa.

[0198] La formulación de un compuesto a administrar variará según la vía de administración y la formulación (p. ej., solución, emulsión, cápsula) seleccionada. Se puede preparar una composición farmacéutica apropiada que comprende el compuesto a administrar en un vehículo fisiológicamente aceptable. Para soluciones o emulsiones, los vehículos adecuados incluyen, p. ej., soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijos. El experto en la materia conoce una variedad de vehículos acuosos apropiados, que incluyen agua, agua tamponada, solución salina tamponada, polioles (p. ej., glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido), solución de dextrosa y glicina. Los vehículos intravenosos pueden incluir varios aditivos, conservantes o rellenadores de fluidos, nutrientes o electrolitos (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Science, 16a edición, Mack, Ed. 1980). Las composiciones pueden contener opcionalmente sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes reguladores y tamponadores del pH y agentes reguladores de la toxicidad, p. ej., acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico y lactato sódico. El compuesto se puede liofilizar para su almacenamiento y reconstituir en un vehículo adecuado antes de su uso según las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.

[0199] En un ejemplo, la presente divulgación proporciona una formulación tópica que comprende el compuesto de la divulgación. En un ejemplo, el compuesto se formula con un vehículo adecuado para formulación tópica. Los vehículos adecuados incluyen un compuesto o mezcla de los mismos que es adecuado para su aplicación a una o más capas dérmicas, no necesariamente a la capa externa de la piel, y que puede ser adecuado para su uso en otros contextos. Un vehículo y excipiente útil en la composición tópica de la presente divulgación generalmente no inhibirá en ningún grado significativo una actividad biológica relevante del compuesto activo, p. ej., el vehículo o excipiente no inhibirá significativamente la actividad inhibidora del compuesto activo con respecto a la señalización VEGF-B. Por ejemplo, el vehículo o excipiente proporciona una actividad tamponadora para mantener el compuesto a un pH adecuado para ejercer de ese modo su actividad biológica, p. ej., el vehículo o excipiente es solución salina tamponada con fosfato. Alternativamente, o además, el vehículo o excipiente comprende un compuesto que potencia la captación del inhibidor y/o potencia la liberación transdérmica del inhibidor. Por ejemplo, el vehículo o excipiente comprende un potenciador de la penetración en la piel, como por ejemplo dipropilenglicol y/o alcohol oleílico. Alternativamente, o además, un vehículo o excipiente comprende un liposoma para facilitar la captación celular.

[0200] Alternativamente, o además, el vehículo o excipiente comprende un compuesto que potencia la actividad de un compuesto y/o reduce la inhibición del compuesto, p. ej., un inhibidor de la proteasa y/o un inhibidor de ADNasa y/o un inhibidor de ARNsa para de ese modo mejorar la estabilidad del inhibidor.

[0201] La concentración óptima del ingrediente activo en el medio elegido puede determinarse empíricamente, de acuerdo con procedimientos conocidos por el experto en la materia, y dependerá de la formulación farmacéutica final deseada.

[0202] Los intervalos de dosificación para la administración del compuesto de la descripción son aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado. Por ejemplo, la composición comprende una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto.

[0203] Tal como se utiliza aquí, el término "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente del compuesto para inhibir/reducir/prevenir la señalización de VEGF-B en un sujeto. El experto en la materia sabrá que dicha cantidad variará dependiendo, p. ej., del compuesto y/o el sujeto particular y/o el tipo y/o la gravedad de una herida que se esté tratando. Por consiguiente, no se debe interpretar que este término limita la divulgación a una cantidad específica, p. ej., peso o número de compuestos.

[0204] Tal como se utiliza aquí, por el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente de compuesto para mejorar o inducir la cicatrización de heridas.

[0205] Tal como se utiliza aquí, por el término “cantidad profilácticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente de compuesto para prevenir o inhibir o retrasar la progresión de una herida.

[0206] La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiper viscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, el estado, el sexo y la extensión de la enfermedad en el paciente y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosis puede ser ajustada por el médico individual en caso de cualquier complicación.

[0207] La dosificación puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, p. ej., de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, tal como, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días.

[0208] En algunos ejemplos, el compuesto se administra a una dosis inicial (o carga) que es superior a subsiguientes (dosis de mantenimiento). Por ejemplo, el compuesto se administra a una dosis inicial de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg. A continuación, el compuesto se administra a una dosis de mantenimiento de entre aproximadamente 0,0001 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. Las dosis de mantenimiento se pueden administrar cada 7-35 días, p. ej., cada 14, 21 o 28 días.

[0209] En algunos ejemplos, se utiliza un régimen de aumento de la dosis, en donde un compuesto se administra inicialmente a una menor dosis que se utiliza en dosis posteriores. Este régimen de dosificación es útil en el caso de que el sujeto sufra inicialmente eventos adversos.

[0210] En el caso de un sujeto que no responde adecuadamente al tratamiento, se pueden administrar múltiples dosis en una semana. Alternativamente, o además, se pueden administrar dosis crecientes.

[0211] Se puede volver a tratar a un sujeto con el compuesto, dándole más de una exposición o conjunto de dosis, tal como al menos aproximadamente dos exposiciones del compuesto, p. ej., de aproximadamente 2 a 60 exposiciones, y más particularmente de aproximadamente 2 a 40 exposiciones, más particularmente, de aproximadamente 2 a 20 exposiciones.

[0212] En otro ejemplo, se puede administrar cualquier retratamiento a intervalos definidos. Por ejemplo, las exposiciones posteriores pueden administrarse a varios intervalos, como, p. ej., aproximadamente 24-28 semanas o 48-56 semanas o más. Por ejemplo, tales exposiciones se administran a intervalos cada uno de aproximadamente 24 26 semanas o aproximadamente 38-42 semanas, o aproximadamente 50-54 semanas.

[0213] Un método de la presente descripción puede incluir también co-administración del compuesto de al menos uno de acuerdo con la divulgación, junto con la administración de otro agente terapéuticamente eficaz para la prevención o tratamiento de una herida y/o diabetes.

[0214] En un ejemplo, el compuesto de la descripción se usa en combinación con al menos un compuesto conocido adicional que actualmente está siendo utilizado o está en desarrollo para prevenir o tratar la diabetes. Los ejemplos de tales compuestos conocidos incluyen, pero no se limitan a fármacos antidiabéticos comunes tales como sulfonilureas (p. ej., glicazida, glipizida), metformina, glitazonas (p. ej., rosiglitazona, pioglitazona), agentes liberadores de glucosa prandial (p. ej., repaglinida, nateglinida), acarbosa e insulina (incluidas todas las formas de insulina de origen natural, sintético y modificado, como la insulina de origen humano, bovino o porcino; insulina suspendida, p. ej., en isófano o zinc y derivados como insulina glulisina, insulina lispro, insulina lispro protamina, insulina glargina, insulina detemir o insulina aspart).

[0215] En un ejemplo, un compuesto de la divulgación se administra con un compuesto conocido por ser útil para el tratamiento de una herida. Por ejemplo, el compuesto se administra en combinación con un antiinfeccioso (p. ej., un antibiótico o un antifúngico), VEGF-A, IGF-1, IGF-2, PDGF, TGF-p, EGF o una célula madre (p. ej., una célula madre o progenitora mesenquimatosa o una célula madre endotelial).

[0216] En un ejemplo, un compuesto de la divulgación se administra con otro tratamiento para una herida, por ejemplo un apósito y/o un injerto y/o presión negativa.

[0217] Los ejemplos adicionales de agentes que pueden ser co-administrados con el compuesto según la invención son los corticosteroides y medicamentos inmunosupresores.

[0218] Como será evidente de lo anterior, la presente descripción proporciona métodos de tratamiento terapéutico concomitante de un sujeto, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un primer compuesto y un segundo compuesto, en donde dicho agente es un compuesto de la divulgación (es decir, un inhibidor de la señalización de VEGF-B), y el segundo agente es para la prevención o el tratamiento de una herida o diabetes.

[0219] Como se usa en este documento, el término “concomitante", como en la frase "tratamiento terapéutico concomitante" incluye la administración de un primer agente en presencia de un segundo agente. Un método de tratamiento terapéutico concomitante incluye métodos en los que se coadministran los agentes primero, segundo, tercero o adicionales. Un método de tratamiento terapéutico concomitante también incluye métodos en los que el primer agente o agentes adicionales se administran en presencia de un segundo agente o agentes adicionales, en los que el segundo agente o agentes adicionales, p. ej., pueden haberse administrado previamente. Un método de tratamiento terapéutico concomitante puede ser ejecutado paso a paso por diferentes actores. Por ejemplo, un actor puede administrar a un sujeto un primer agente y el segundo actor puede administrar al sujeto un segundo agente y los pasos de administración pueden ejecutarse al mismo tiempo, o casi al mismo tiempo, o en momentos distantes, por lo que siempre que el primer agente (y/o agentes adicionales) sean después de la administración en presencia del segundo agente (y/o agentes adicionales). El actor y el sujeto pueden ser la misma entidad (p. ej., un ser humano).

[0220] En un ejemplo, la divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una herida en un sujeto, comprendiendo el método la administración al sujeto de una primera composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la divulgación y una segunda composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos adicionales.

[0221] En un ejemplo, un método de la divulgación comprende administrar un inhibidor de la señalización de VEGF-B a un sujeto que sufre de una herida (p. ej., una úlcera diabética) y recibir otro tratamiento (p. ej., para diabetes).

Kits y otras composiciones de materia

[0222] Otro ejemplo de la descripción proporciona kits que contienen compuestos útiles para el tratamiento de una herida como se ha descrito anteriormente.

[0223] En un ejemplo, los kit comprenden (a) un recipiente que comprende un compuesto que inhibe VEGF-B de señalización como se describe aquí, opcionalmente en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable; y (b) un inserto del paquete con instrucciones para tratar una herida en un sujeto.

[0224] De acuerdo con este ejemplo de la divulgación, el inserto del paquete está en el recipiente o asociado con él. Los recipientes adecuados incluyen, p. ej., botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar una herida y puede tener un puerto de acceso estéril (p. ej., el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es el compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B. La etiqueta o el inserto del paquete indica que la composición se usa para tratar a un sujeto apto para el tratamiento, p. ej., uno que tiene o está predispuesto a tener una herida, con orientación específica sobre cantidades e intervalos de dosificación de compuesto y cualquier otro medicamento que se proporcione. El kit puede comprender además un recipiente adicional que comprende un tampón diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFi), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. El kit puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

[0225] El kit comprende además opcionalmente un recipiente que comprende un segundo medicamento, en donde el compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B es un primer medicamento, y cuyo artículo consta además de instrucciones en el inserto del paquete para el tratamiento del sujeto con el segundo medicamento, en una cantidad eficaz u otro tratamiento para una herida. El segundo medicamento puede ser cualquiera de los indicados anteriormente.

[0226] La presente descripción también proporciona un apósito para una herida impregnado o que tiene inmovilizado en él (p. ej., de forma reversible inmovilizada en el mismo) un compuesto como se describe aquí. Los apósitos ejemplares incluyen vendajes, p. ej., un vendaje de tela o un vendaje de plástico o un apósito de gasa o un vendaje de gasa o un vendaje para traumatismos. Alternativamente, o además, el apósito comprende un andamio, p. ej., un andamio biodegradable. Por ejemplo, el andamio comprende colágeno y/o ácido poli(láctico) y/o ácido poli(glicólico) y/o fibrina. Tal andamio puede ser poroso o no poroso o una mezcla de los mismos. Una ventaja de tales andamios es que se adaptan a la forma de una herida y administran un compuesto terapéutico al sitio de la herida. Además, a medida que cicatriza la herida, el andamio se rompe, lo que reduce los desechos biológicos.

[0227] La presente descripción incluye los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1: Un anticuerpo anti-VEGF-B neutralizante trata heridas en ratones diabéticos

Inhibición de VEGF-B mediada por anticuerpos influye moderadamente en los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos db/db//BKS

[0228] Ratones machos C57BKS/Leprdb criados internamente (db/db/BKS) se adquirieron de Jackson Laboratory.

Los ratones se alojaron en un ratón por jaula antes de herirlos y durante el experimento. La instalación para animales tiene un ciclo de oscuridad/luz de 12 horas con comida y agua disponibles adlibitum. El enriquecimiento incluyó túneles para ratas y material de anidación para reducir el estrés. Se pretrataron ratones macho db/db/BKS (8 semanas) 2 veces/semana (i.p.) durante 4 semanas antes de la herida, con 400 mg de anticuerpo VEGF-B (2H10) o un anticuerpo de control de isotipo coincidente (BM4). El mismo régimen de tratamiento continuó después de herir hasta sacrificar a los animales. El peso corporal y la glucosa en sangre se controlaron antes y durante el experimento. Los niveles de glucosa en sangre se analizaron desde la cola usando un medidor de glucosa en sangre (Countour stick, Bayer) y se midió el peso con una balanza de laboratorio.

[0229] Como se muestra en la Figura 1, en este experimento el tratamiento anti-VEGF-B no alteró los niveles de glucosa en sangre o ganancia de peso en ratones diabéticos severos db/db BKS o en ratones no diabéticos db/+ BKS.

Inhibición farmacológica de VEGF-B usando 2H10 mejora el cierre de heridas en un modelo de ratón severamente diabético.

[0230] Después de alcanzar los niveles de glucosa en sangre no en ayunas por encima de 15 mM, los db/db o db/+ tratados con 2S10 o BM4 (control) se mantuvieron durante dos semanas adicionales antes de herirse. Esto se hizo con el fin de obtener animales severamente diabéticos en el momento de la herida. La herida se realizó bajo anestesia general por inhalación de isoflurano. El vello detrás del cuello se eliminó con un cortapelos eléctrico y mediante la aplicación de una crema depilatoria (Veet). La piel se desinfectó con etanol al 70%, después de lo cual se realizaron dos heridas circulares de espesor completo emparejadas que penetran la piel y el panículo carnoso utilizando un punzón de biopsia de 6 mm. Durante los dos primeros días después de la herida, los ratones recibieron inyecciones analgésicas subcutáneas de 0,05-0,1 mg/kg de buprenorfina dos veces al día. El tamaño de la herida y la progresión de la cicatrización se rastrearon con fotografía digital directamente después de la herida y luego cada dos días durante el experimento. El área de la herida se midió dos veces por cada herida utilizando el software Image J. La distancia entre la cámara y la herida se corrigió relacionando el tamaño de la herida con un objeto de referencia incluido en cada imagen. Una sola herida (dos por animal) se trató como un único punto de datos experimentales.

[0231] Como se muestra en la Figura 2 el cierre de la herida se ha mejorado significativamente en un modelo de ratón diabético (db/db BKS) cuando se trata con un anticuerpo anti-VRGF-B.

[0232] El tratamiento anti-VEGF-B aumentó la tasa de cierre de la herida y la curación en un modelo de ratón diabético. El efecto más destacado del tratamiento anti-VEGF-B se detectó en la fase temprana del cierre de la herida (día 4 y 6). Esto se muestra además en la Figura 3, en donde el tratamiento anti-VEGF-B acelera la cicatrización de heridas durante los primeros cuatro días, a pesar de que no hay diferencias en los niveles de glucosa en sangre.

[0233] Los datos presentados en este documento sugieren que la hiperglucemia en la diabetes per se no es la principal razón del proceso de cicatrización lenta de heridas.

El tratamiento anti-VEGF-B usando 2S10 disminuye la expresión de genes regulados al alza en curación de heridas

[0234] Ratones machos db/db y db/+ (tratados como se describe anteriormente y se sacrificaron en el día 16) se utilizaron para el análisis de expresión. Las heridas se disecaron y se congelaron instantáneamente en hielo seco. Se extrajo y purificó el ARN total de las heridas usando el kit RNeasy Mini (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de la primera hebra se sintetizó a partir de 0,5-1 mg de ARN total usando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix (2x) Universal (KAPA Biosystems) en un termociclador Rotor-Gene Q (Qiagen) Real-Time PCR de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los niveles de expresión se normalizaron a la expresión de L19.

[0235] Como se muestra en la Figura 4, el tratamiento anti-VEGF-B en ratones db/db reduce la expresión de varios genes que se regulan positivamente durante la herida diabética. El tratamiento anti-VEGF-B usando 2S10 afecta a la morfología de los vasos sanguíneos, pero no promueve la proliferación celular

El tratamiento anti-VEGF-B usando 2H10 afecta la morfología de los vasos sanguíneos pero no promueve la proliferación celular

[0236] Ratones machos db/db (tratados como se describe anteriormente y sacrificados en el día 16) se utilizaron para los análisis inmunológicos. Las heridas se disecaron y fijaron en paraformaldehído a 4°C durante 24 horas, se hidrataron en etanol al 70%, se embebieron en parafina y se seccionaron en secciones transversales de 3 mm de espesor. La recuperación de antígeno se realizó utilizando una solución de recuperación de antígeno pH6 (DAKO) y calentando las secciones a 98°C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4°C durante 12 horas con anticuerpos primarios apropiados (Brdu, CD45, CIV y CD31, diluidos a 1-5 mg/ml). Se aplicaron anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia coincidentes (Invitrogen, Alexa fluor, diluido 1:1000) y las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (TA), después de lo cual se prepararon para microscopía. Las secciones se fotografiaron con un microscopio AxioVision (Carl Zeiss) con un aumento de 20x. A continuación, las secciones se evaluaron y cuantificaron utilizando el programa asistente AxioVision Run (píxeles2). La intensidad de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B para uso para tratar una herida o mejorar la cicatrización de heridas o para prevenir o ralentizar la progresión de la herida en un sujeto que padece una herida, donde la herida es una herida dérmica, el sujeto padece diabetes, y el compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B es:

(i) una proteína que comprende una región de variable de anticuerpo que se une o se une específicamente a VEGF-B y neutraliza la señalización de VEGF-B; o

(ii) un ácido nucleico que inhibe o previene la expresión de VEGF-B, en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en un antisentido, ARNip, ARNi, ribozima y ADNzima.

2. El compuesto para uso de la reivindicación 1, en donde la herida es aguda o crónica.

3. El compuesto para su uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el sujeto padece obesidad.

4. El compuesto para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto se formula para su administración en una cantidad eficaz para tener uno o más de los siguientes efectos:

(a) Mejorar la tasa de cierre de heridas en comparación con la tasa en un sujeto que padece diabetes y una herida al que no se le ha administrado el compuesto; y/o

(b) Mejorar la cantidad de cierre de la herida en un momento específico en el tiempo (p. ej., después del comienzo del tratamiento) en comparación con la tasa en un sujeto que padece diabetes y una herida a la que no se le ha administrado el compuesto; y/o

(c) Mejorar la maduración de los vasos sanguíneos en un sujeto en comparación con un sujeto que padece diabetes y una herida a la que no se le ha administrado el compuesto.

5. El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el compuesto es una proteína que comprende un Fv, p. ej., la proteína se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un fragmento Fv monocatenario (scFv);

(b) un scFv dimérico (di-scFv);

(c) un diacuerpo;

(d) un triacuerpo;

(e) un tetracuerpo;

(f) un Fab;

(g) un F(ab')2;

(h) un Fv; o

(i) uno de (a) a (h) unido a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (Ch) 2 y/o Ch3.

6. El compuesto para uso de la reivindicación 5, en donde la proteína es un anticuerpo.

7. El compuesto para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el compuesto es una proteína que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 4 a VEGF-B.

8. El compuesto para su uso de la reivindicación 7, en donde el compuesto es una proteína que comprende una región variable humanizada de la región variable de cadena pesada (Vh) como se establece en SEQ ID NO: 3 o la región variable de cadena ligera (Vl) como se expone en la s Eq ID NO: 4.

9. el compuesto para uso de la reivindicación 8, en donde la proteína comprende una región variable que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la Vh y/o la Vl del anticuerpo al VEGF-B, por ejemplo, la proteína comprende:

(i) un VH que comprende:

(ii) una VL que comprende:

(b) una CDR2 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 49-55 de SEQ ID NO: 4; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia establecida en los aminoácidos 88-96 de SEQ ID NO: 4.

10. El compuesto para uso de la reivindicación 9, en donde la proteína es un anticuerpo que comprende:

(i) un Vh que comprende:

(ii) una Vl que comprende:

11. El compuesto para uso de la reivindicación 9, en donde la proteína es un anticuerpo que comprende un Vh que comprende una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 5 y un Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 6.