CN105979965A - 治疗伤口的方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了用于治疗受试者中的伤口愈合的方法，所述方法包括向受试者施用抑制VEGF‑B信号传导的化合物。

Description

治疗伤口的方法

相关申请资料

本申请要求于2013年12月18日提交的名称为“治疗伤口的方法”的澳大利亚专利申请号2013904942和于2013年12月19日提交的名称为“治疗伤口的方法”的澳大利亚专利申请号2013904966的优先权。这两个申请的全部内容在此通过引用并入。

序列表

本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容在此通过引用并入。

发明领域

本申请涉及用于治疗或预防伤口的方法。

背景介绍

伤口愈合是复杂的过程，牵涉凝固阶段、发炎阶段、肉芽组织形成阶段和组织重塑阶段。这些事件由在损伤部位释放的细胞因子和生长因子触发。许多因素可以复杂化或干扰正常的充分伤口愈合。例如，这样的因素包括年龄、感染、营养不良、免疫抑制、药物、辐射、糖尿病、周围血管疾病、全身性疾病、吸烟、压力等。

慢性伤口是不通过有序和及时的修复过程进行以产生解剖和功能完整性的那些。慢性伤口估计影响570万患者并且仅在美国就耗费约US$200亿/年。

对于糖尿病(这是一种慢性的、使人衰弱的疾病，其在2008年影响美国的约3.47亿人)患者，糖尿病足部溃疡的发展(也称为伤口，或在一些情况下，慢性伤口)是一种常见的并发症。因为皮肤用作针对环境的主要屏障，开放的难愈伤口可能是灾难性的；可能会导致主要的失能(包括肢体缺失)，甚至死亡。足部溃疡是糖尿病人中约85％下肢截肢的先兆。

在糖尿病中，伤口愈合的任何阶段可被中断。然而，糖尿病伤口的关键特征是胞外基质蛋白合成和降解的不平衡。此外，慢性炎症导致成熟肉芽组织形成的延迟和伤口拉伸强度的降低。

当前伤口护理策略包括手术和医疗方法。用药旨在控制或预防感染，防止缺血和水肿，减轻疼痛和改善代谢状态。局部治疗包括例如生长因子和富含血小板的血浆的局部应用和例如水胶体和水凝胶的伤口敷料。手术治疗包括血管成形术、植皮和机械支持以减少压力。每种疗法具有其自身的缺点，例如极为需要在正确的愈合阶段介入、令人失望的功效以及成本高。因此，本领域存在对于改善的伤口治疗的需要。

发明概述

在创造本发明的过程中，本发明人研究了在创伤例如糖尿病伤口的公认小鼠模型中，抑制血管内皮生长因子B(VEGF-B)的信号传导的作用。本发明人通过向其中已诱发伤口的糖尿病小鼠施用VEGF-B的拮抗剂(例如，拮抗性抗体)来研究此生长因子的作用。本发明人发现VEGF-B的抑制导致显著更快的伤口闭合和愈合。本发明人还发现，这种改善的伤口愈合在伤口闭合的早期阶段(例如当伤口最大和开口时)是特别显著的。在一些情况下(例如，在本文中所描述的实验中)，尽管对糖尿病受试者的血糖水平具有稍许影响，伤口愈合中的变化也会发生，表明抑制VEGF-B通过附加于或不同于血糖控制的途径提供伤口愈合益处。

本发明人的发现提供了通过抑制VEGF-B信号传导来诱导或增强伤口愈合或治疗伤口或减缓或预防受试者中的伤口并发症的方法的基础。例如，本公开内容提供了用于治疗受试者中的伤口的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

在另一实例中，本公开内容提供了用于诱导或增强受试者中的伤口愈合的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

伤口愈合的评估可以例如通过伤口面积的百分比减少或完全伤口闭合来测定。伤口面积可以通过定量分析(例如，伤口的面积测量，伤口的平面追踪等)来测定。完全伤口闭合可以通过例如皮肤闭合而无引流或敷料需要来确定。伤口的照片、伤口的物理检查等也可以用于评估伤口愈合。伤口愈合的加速可以以百分比加速来表示或以时间对愈合的风险比来表示。

在另一实例中，本公开内容提供了用于预防或减缓伤口或伤口的并发症的进展的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

在一个实例中，伤口是急性或常规的，例如，热损伤(例如，烧伤)，外伤，手术，大面积皮肤癌的切除，深部真菌和细菌感染，血管炎或硬皮病。

在另一实例中，伤口是慢性的。例如，伤口是动脉性溃疡，糖尿病伤口，糖尿病溃疡，压迫性溃疡或静脉性溃疡。

在一个实例中，伤口是皮肤伤口。

在一个实例中，受试者患有肥胖和/或糖尿病。

例如，受试者患有糖尿病，例如1型或2型糖尿病。在这样的情况下，伤口可以称为糖尿病伤口(即，在糖尿病受试者中的伤口)或糖尿病溃疡(即，在糖尿病受试者中的溃疡)。例如，伤口是糖尿病足部溃疡或糖尿病腿部溃疡。

在一个实例中，伤口是褥疮性溃疡。

在一个实例中，受试者患有神经病(例如，糖尿病性神经病)、周围血管疾病、血糖控制不良、以往的足部溃疡或截肢、肾病(或糖尿病性肾病)、小和大血管的缺血或视敏度不良中的一种或多种。

在一个实例中，受试者具有伤口。

在另一实例中，受试者处于发展伤口(例如，慢性伤口)的风险中，并且在例如手术(当会诱发伤口时)之前施用所述化合物。例如，本公开内容提供了用于减少伤口(例如，诱发的伤口，例如，通过手术诱发的)的严重程度的方法。

如本文所例举的，VEGF-B信号传导的抑制在糖尿病伤口的治疗中是有效的。因此，在一个实例中，本公开内容提供了用于治疗糖尿病受试者中的伤口的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

本公开内容还提供了用于增强或诱导具有伤口的糖尿病受试者中的伤口愈合的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

在一个实例中，受试者处于伤口进展的风险中。例如，受试者患有糖尿病。例如，受试者患有糖尿病和糖尿病性神经病、周围血管疾病、血糖控制不良、以往的足部溃疡或截肢、肾病(或糖尿病性肾病)、小和大血管的缺血或视敏度不良中的一种或多种。

在一个实例中，本公开内容提供了用于减少或预防糖尿病受试者中的伤口的进展的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

在另一实例中，本公开内容提供了用于减少具有伤口的受试者(例如，糖尿病受试者)将需要截肢的风险的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

在一个实例中，化合物以有效量施用以具有一种或多种下列效应：

·与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)中的速率相比，增强伤口闭合的速率；和/或

·与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)中的速率相比，增大特定时间点(例如，在治疗开始后)的伤口闭合的量；和/或

·与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)相比，增强受试者中的血管成熟。

本公开内容还提供了用于在受试者中产生一种或多种下列效应的方法，该方法包括向已具有伤口(和任选患有糖尿病)的受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物：

·与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)中的速率相比，增强伤口闭合的速率；和/或

·与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)中的速率相比，增大特定时间点(例如，在治疗开始后)的伤口闭合的量；和/或

·与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)相比，增强受试者中的血管成熟。

在一个实例中，抑制VEGF-B信号传导的化合物特异性抑制VEGF-B信号传导。这不意味着本公开内容的方法不包括抑制多种VEGF蛋白的信号传导，仅意指抑制VEGF-B信号传导的化合物(或其部分)是特异于VEGF-B的，例如，不是VEGF蛋白质的一般抑制剂。该术语也并不排除例如双特异性抗体或包含其结合结构域的蛋白，其可以利用一个(或多个)结合结构域特异性抑制VEGF-B信号传导，并且可以利用另一个结合结构域特异性抑制另一种蛋白质的信号传导。

在一个实例中，抑制VEGF-B信号传导的化合物结合VEGF-B。例如，该化合物是包含结合或特异性结合至VEGF-B并中和VEGF-B信号传导的抗体可变区的蛋白质。

在一个例子中，化合物是抗体模拟物。例如，化合物是包含免疫球蛋白例如IgNAR、骆驼科动物抗体或T细胞受体的抗原结合结构域的蛋白质。

在一个实例中，化合物是结构域抗体(例如，仅包含结合VEGF-B的重链可变区或仅轻链可变区)或仅重链抗体(例如，骆驼科动物抗体或IgNAR)或其可变区。

在一个实例中，化合物是包含Fv的蛋白质。例如，蛋白质选自：

(i)单链Fv片段(scFv)；

(ii)二聚scFv(di-scFv)；或

(iv)双抗体；

(v)三链抗体；

(vi)四链抗体；

(vii)Fab；

(viii)F(ab’)₂；

(ix)Fv；或

(x)连接至抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(C_H)2和/或C_H3的(i)至(ix)之一。

在另一个实例中，化合物是抗体。示例性的抗体是全长和/或裸抗体。

在一个实例中，化合物是重组的、嵌合的、CDR移植的、人源化的、类人源化的(synhumanized)、灵长类动物化的、去免疫化的或人的蛋白质。

在一个实例中，化合物是包含竞争性抑制抗体2H10与VEGF-B的结合的抗体可变区的蛋白质。在一个实例中，所述蛋白质包含重链可变区(V_H)，其包含SEQ ID NO：3所示的序列，和轻链可变区(V_L)，其包含SEQ ID NO：4所示的序列。

在一个实例中，化合物是包含抗体2H10的人源化可变区的蛋白质。例如，蛋白质包含可变区，所述可变区包含抗体2H10的V_H和/或V_L的互补决定区(CDR)。例如，蛋白质包含：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸25-34所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸49-65所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸98-108所示的序列的CDR 3；和

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸23-33所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：4的氨基酸49-55所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：4的氨基酸88-96所示的序列的CDR3。

在一个实例中，化合物是包含V_H和V_L的蛋白质，V_H和V_L是抗体2H10的人源化可变区。例如，蛋白质包含：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸25-34所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸49-65所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸98-108所示的序列的CDR 3；和

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸23-33所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：4的氨基酸49-55所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：4的氨基酸88-96所示的序列的CDR3。

在一个实例中，任何前述段落中的可变区或V_H包含SEQ ID NO：5所示的序列。

在一个实例中，任何前述段落中的可变区或V_L包含SEQ ID NO：6所示的序列。

在一个例子中，化合物是抗体。

在一个实例中，化合物是包含含有SEQ ID NO：5所示的序列的V_H和含有SEQ IDNO：6所示的序列的V_L的抗体。

在一个实例中，蛋白质或抗体是由编码任何前述蛋白质或抗体的核酸或表达所述蛋白质或抗体的细胞所编码的任何形式的蛋白质或抗体(例如，包括翻译后修饰的蛋白质或抗体)。

在一个实例中，蛋白质或抗体包括：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：11的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：12的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：13的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR 3；和/或

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：14的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：15的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：16的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR3。

在一个实例中，蛋白质或抗体包括：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：23的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：24的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：25的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR 3；和/或

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：26的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：27的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR2；和/或

(c)包含SEQ ID NO：28的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR3。

在一个实例中，蛋白质或抗体包括：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：35的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：36的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：37的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR 3；和/或

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：38的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：39的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：40的核酸编码的序列或包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR3。

在一个实例中，化合物在组合物内。例如，组合物包括包含如本文中所述的抗体可变区或V_H或V_L或抗体的蛋白质。在一个实例中，组合物还包括蛋白质或抗体的一种或多种变体(例如，翻译后修饰的变体)。例如，其包括缺少编码的C-末端赖氨酸残基的变体、脱酰胺变体和/或糖基化变体和/或例如在蛋白质的N-末端包含焦谷氨酸的变体和/或缺乏N-末端残基(例如抗体或V区中的N-末端谷氨酰胺)的变体和/或包含分泌信号的全部或部分的变体。编码的天冬酰胺残基的脱酰胺变体可能会导致产生异天冬氨酸和天冬氨酸亚型，或甚至产生牵涉相邻氨基酸残基的琥珀酰胺。编码的谷氨酰胺残基的脱酰胺变体可能会导致谷氨酸。当提及特定氨基酸序列时，旨在包括包含这样的序列和变体的异质混合物的组合物。

在一个实例中，抑制VEGF-B信号传导的化合物抑制或阻止VEGF-B的表达。例如，所述化合物选自反义物、siRNA、RNAi、核酶和DNAzyme。

在一个实例中，VEGF-B是哺乳动物VEGF-B，例如，人VEGF-B。

在一个实例中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。

本文描述的治疗方法可另外包括施用用于伤口的其它治疗。

本文所述的治疗糖尿病伤口或溃疡的方法可以另外包括施用其它化合物以治疗或预防糖尿病(或延缓其进展)。本文描述了示例性的化合物。

在另一实例中，本公开内容提供了抑制VEGF-B信号传导用于诱导或增强受试者中的伤口愈合和/或预防或减缓受试者中的伤口或伤口的并发症的进展的化合物。

在另一实例中，本公开内容提供了抑制VEGF-B信号传导的化合物在制造用于诱导或增强受试者中的伤口愈合和/或预防或减缓受试者中的伤口或伤口的并发症的进展的药物中的用途。

本公开内容还提供了试剂盒，其包含抑制VEGF-B信号传导的化合物，包装有在治疗或预防伤口中使用和/或使用本公开内容的方法的说明书。

示例性伤口和化合物描述于本文中并且将被认为对前三段示出的本公开内容的实例应用必要修改。

本公开内容的实例应被认为对改善伤口愈合或减少复发或伤口(例如，糖尿病性溃疡)复发的可能性或加速伤口愈合应用必要修改。

附图简述

图1是显示使用2H10的抗VEGF-B治疗在严重糖尿病动物模型中不显著影响创伤后的血糖水平或体重减轻的一系列图示。图A显示在对照或抗VEGF-B治疗的糖尿病db/db或非糖尿病db/+小鼠中在动物的创伤之前和之后的饲养血糖水平且图B显示在对照或抗VEGF-B治疗的糖尿病db/db或非糖尿病db/+小鼠中在动物的创伤之前和之后的饲养体重(N＝4-7/组)。数值是平均值±s.e.m。

图2是显示使用2H10的VEGF-B的药理学抑制增强严重糖尿病小鼠模型中的伤口闭合的图示。改善的伤口闭合在糖尿病db/db BKS动物中的VEGF-B药理学抑制后检测到。在非糖尿病db/+BKS小鼠中在VEGF-B抑制后未发现伤口闭合的差异(N＝8-14/组)。数值是平均值±s.e.m。相较于对照治疗的db/db小鼠，*Ρ<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图3包括显示尽管血糖水平没有差异，使用2H10的抗VEGF-B治疗仍然在短时间段内加速伤口愈合的一系列图示。分析用2H10或对照抗体治疗的db/db动物以及db/+动物。图A显示在前四天的血糖水平(N＝5-6/组)，B组显示在前四天的伤口闭合(N＝10-12/组)。数值是平均值±s.e.m。相较于对照治疗的db/db，***P<0.001。

图4是显示使用2H10的抗VEGF-B治疗减少在糖尿病创伤期间被上调的几个基因的表达的图示。在2Η10或对照抗体治疗的db/db小鼠和对照治疗的db/+小鼠(n＝8-14/组)中测量终点IGF-1,TGF-b,TNF-α,α-SMA,COL1α,Fgf-7和IFN-γ表达水平。数值是平均值±s.e.m。相较于对照治疗的db/db动物，*P<0.05，相较于对照治疗的db/+小鼠动物，#P<0.05，##P<0.01。IGF-1；胰岛素样生长因子1，TGF-b：转化生长因子β，TNF-α；肿瘤坏死因子，α–SMA；α-平滑肌肌动蛋白，COL1a；α-1I型胶原，Fgf-7；成纤维细胞生长因子7。

图5包括显示db/db小鼠中的VEGF-B抑制影响血管形态学但不促进细胞增殖的一系列图示。顶部图显示Brdu/DAPI染色的定量并且下部图显示来自具有对照或2H10抗体的db/db小鼠的CD45、CIV和CD31染色的定量。N＝4-6/组。数值是平均值±s.e.m。相较于对照治疗的db/db，*P<0.05，**P<0.01。

图6是显示VEGF-B信号传导通路在糖尿病伤口中被上调的图示。在来自糖尿病db/db小鼠和非糖尿病db/+小鼠的伤口的组织中测量终点Vegfb,Vegfr1,Fatp4,Vegfa和Vegfr2表达水平。将表达水平标准化至TUBB5。数值是平均值±s.e.m。对照治疗的db/db相较于对照治疗的db/+，#P<0.05，##P<0.01，n＝3-5。Vegfb；血管内皮生长因子B；Vegfr1；血管内皮生长因子受体1，Fatp4；脂肪酸转运蛋白4，Vegfa；血管内皮生长因子A；Vegfr2；血管内皮生长因子受体2。

图7是显示使用2H10的抗VEGF-B治疗降低db/db小鼠的皮肤中的脂质累积的图示。所描述的图显示用对照或2H10抗体治疗的db/db和db/+中的油红O染色的定量。数值是平均值±s.e.m。对照治疗的db/db相较于2H10治疗的db/db小鼠，***P<0.001。Db/+动物相较于对照治疗的db/db小鼠，###P<0.001。

序列表的信息

SEQ ID NO：1是含有21个氨基酸的N末端信号序列的人VEGF-B₁₈₆同种型的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是含有21个氨基酸的N末端信号序列的人VEGF-B₁₆₇同种型的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是来自抗体2H10的V_H的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是来自抗体2H10的V_L的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是来自抗体2H10的人源化形式的V_H的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是抗体2H10的人源化形式的V_L的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是来自抗体4E12的V_H的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是抗体4E12的V_L的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是来自抗体2F5的V_H的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是抗体2F5的V_L的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是来自抗体2H10的V_L CDR1的核苷酸序列

SEQ ID NO：12是来自抗体2H10的V_L CDR2的核苷酸序列

SEQ ID NO：13是来自抗体2H10的V_L CDR3的核苷酸序列

SEQ ID NO：14是来自抗体2H10的V_H CDR1的核苷酸序列

SEQ ID NO：15是来自抗体2H10的V_H CDR2的核苷酸序列

SEQ ID NO：16是来自抗体2H10的V_H CDR3的核苷酸序列

SEQ ID NO：17是来自抗体2H10的V_L CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO：18是来自抗体2H10的V_L CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO：19是来自抗体2H10的V_L CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO：20是来自抗体2H10的V_H CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO：21是来自抗体2H10的V_H CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO：22是来自抗体2H10的V_H CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO：23是来自抗体2F5的V_L CDR1的核苷酸序列

SEQ ID NO：24是来自抗体2F5的V_L CDR2的核苷酸序列

SEQ ID NO：25是来自抗体2F5的V_L CDR3的核苷酸序列

SEQ ID NO：26是来自抗体2F5的V_H CDR1的核苷酸序列

SEQ ID NO：27是来自抗体2F5的V_H CDR2的核苷酸序列

SEQ ID NO：28是来自抗体2F5的V_H CDR3的核苷酸序列

SEQ ID NO：29是来自抗体2F5的V_L CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO：30是来自抗体2F5的V_L CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO：31是来自抗体2F5的V_L CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO：32是来自抗体2F5的V_H CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO：33是来自抗体2F5的V_H CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO：34是来自抗体2F5的V_H CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO：35是来自抗体4E12的V_L CDR1的核苷酸序列

SEQ ID NO：36是来自抗体4E12的V_L CDR2的核苷酸序列

SEQ ID NO：37是来自抗体4E12的V_L CDR3的核苷酸序列

SEQ ID NO：38是来自抗体4E12的V_H CDR1的核苷酸序列

SEQ ID NO：39是来自抗体4E12的V_H CDR2的核苷酸序列

SEQ ID NO：40是来自抗体4E12的V_H CDR3的核苷酸序列

SEQ ID NO：41是来自抗体4E12的V_L CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO：42是来自抗体4E12的V_L CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO：43是来自抗体4E12的V_L CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO：44是来自抗体4E12的V_H CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO：45是来自抗体4E12的V_H CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO：46是来自抗体4E12的V_H CDR3的氨基酸序列

发明详述

一般的

在整个本说明书中，除非另外特别说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组的提及应认为包含一个和多个(即一个或多个)那些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组。

本领域技术人员将理解，本公开内容易于作出各种变化和修改，除了具体描述的那些以外。应当理解，本公开内容包括所有这样的变化和修改。本公开内容还单独或共同地包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任意两种或多种。

本公开内容的范围不受本文所描述的具体实例限制，其仅用于示例的目的。功能性等同的产品、组合物和方法显然在本公开内容的范围之内。

本公开内容的任何实例在本文应被认为对本公开内容的任何其它实例应用必要修改，除非另有特别说明。

除非另有具体定义，本文使用的所有技术和科学术语应当认为具有与通常由本领域普通技术人员所理解的(例如，在细胞培养，分子遗传学，免疫学，免疫组织化学，蛋白质化学，和生物化学中)相同的含义。

除非另有说明，本公开内容中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这样的技术在各种来源的文献中得到描述和解释，所述来源为例如：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989),T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:APractical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and1996),和F.M.Ausubel等人(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括直到目前为止所有的更新),Ed Harlow and David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,(1988),和J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons(包括直到目前为止所有的更新)。

可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段在本文的描述和定义可通过在下列参考资料中的讨论进一步阐明：Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991,Bork等人,JMol.Biol.242,309-320,1994,Chothia and Lesk J.Mol Biol.196:901-917,1987,Chothia等人Nature 342,877-883,1989和/或Al-Lazikani等人,J Mol Biol 273,927-948,1997。

蛋白质或抗体在本文中的任何讨论将被理解为包括制造和/或储存过程中产生的蛋白质或抗体的任何变体。例如，在制造或储存过程中，抗体可被脱酰胺化(例如，在天冬酰胺或谷氨酰胺残基)和/或具有改变的糖基化和/或具有转换为焦谷氨酰胺的谷氨酰胺残基和/或具有移除或“修剪”的N-末端或C-末端残基和/或具有不完全加工的信号序列的一部分或全部并且作为结果保留在该抗体的末端。应理解的是包含特定氨基酸序列的组合物可以是所述的或编码的序列和/或该所述的或编码的序列的变体的异质混合物。

术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并应认为是对两种含义或任一含义提供明确的支持。

贯穿本说明书中，词语“包括”或变型例如“包含”或“含有”将被理解为暗指包括所述的元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其它元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组。

如本文所用，术语“来源于”应被认为表示指定的整数可以从特定来源获得，尽管非必需地直接从该来源获得。

选择的定义

VEGF-B已知以两个主要的同种型存在，称为VEGF-B₁₈₆和VEGF-B₁₆₇。仅用于命名而非限制的目的，人VEGF-B₁₈₆的示例性序列示于NCBI参考序列：NP_003368.1，NCBI蛋白登录号NP_003368、P49765和AAL79001以及SEQ ID NO：1中。在本公开内容的上下文中，VEGF-B₁₈₆的序列可以缺少21个氨基酸的N-末端信号序列(例如，如在SEQ ID NO：1的氨基酸1至21所示的)。仅用于命名而非限制的目的，人VEGF-B₁₆₇的示例性序列示于NCBI参考序列：NP_001230662.1，NCBI蛋白登录号AAL79000和AAB06274以及SEQ ID NO：2中。在本公开内容的上下文中，VEGF-B₁₆₇的序列可以缺少21个氨基酸的N-末端信号序列(例如，如在SEQ ID NO：2的氨基酸1至21所示的)。VEGF-B的其它序列可使用本文提供的和/或公共可得的数据库中的序列测定和/或使用标准技术(例如，Ausubel等人,(editors),Current Protocols inMolecular Biology,Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988,包括直到目前为止所有的更新)或Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中描述的)测定。对人VEGF-B的提及可以被缩写为hVEGF-B。在一个实例中，本文对VEGF-B的提及是对VEGF-B₁₆₇同种型的提及。

本文对VEGF-B的提及还包括在WO2006/012688中所述的VEGF-B_10-108肽。

术语“伤口”将被认为意指其中受试者的组织被破坏(例如，撕裂，刺破，切割，或以其它方式损坏)的任何损伤。

如本文所用，术语“皮肤伤口”应被认为意指受试者皮肤的一个或多个层的病变，例如，其中所述病变包括一个或多个细胞凋亡的真皮细胞和/或一个或多个坏死的真皮细胞。术语“皮肤伤口”应被认为包括影响受试者的表皮层和/或受试者的真皮层和/或受试者的皮下的伤口。

术语“慢性伤口”是指不在有序集合的阶段和可预测的时间量中愈合的伤口。一般来说，在三个月内不愈合的伤口被认为是慢性的。慢性伤口包括但不限于，例如，动脉性溃疡，糖尿病性溃疡，压迫性溃疡，静脉性溃疡等。急性伤口可以发展成慢性伤口。

术语“急性伤口”或“常规伤口“是指经历常规伤口愈合修复的伤口。

术语“伤口的进展”将被理解为意指伤口的恶化，例如，在大小和/或深度和/或进展上增加至更高级阶段和/或感染的发展。

本公开内容的上下文中的术语“愈合”是从施用化合物直到显著或完全的伤口闭合(完全伤口收缩)的时间的提升或加速。

术语“组织”是指人体中的细胞团，其一起形成特定的功能。组织包括但不限于皮肤、软骨和结缔组织。

术语“重组体”应被理解为意指人工遗传重组的产物。因此，在包含抗体可变区的重组蛋白的背景下，该术语不包括受试者体内天然存在的不是在B细胞成熟过程中出现的天然重组的产物的抗体。然而，如果这样的抗体是分离的，它应被认为是包含抗体可变区的分离的蛋白质。同样地，如果编码蛋白质的核酸是分离的并且使用重组手段表达，则所得的蛋白质是包含抗体可变区的重组蛋白。重组蛋白还包括当它在细胞、组织或受试者(例如，在其中表达它)中时通过人工重组手段表达的蛋白质。

术语“蛋白质”应被认为包括单个多肽链，即，一系列通过肽键连接的连续氨基酸或一系列共价或非共价连接到彼此的多肽链(即，多肽复合物)。例如，该多肽链系列可以使用适当的化学或二硫键共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力以及疏水相互作用。

术语“多肽”或“多肽链”将从前述段落理解为意指一系列通过肽键连接的连续氨基酸。

本领域技术人员将意识到“抗体”通常被认为是包含由多个多肽链(例如包含轻链可变区(V_L)的多肽和包含重链可变区(V_H)的多肽)构成的可变区的蛋白质。抗体还通常包括恒定结构域，其中的一些可以被排列成恒定区，其在重链的情况下包括恒定片段或可结晶的片段(Fc)。V_H和V_L相互作用以形成包含抗原结合区的Fv，其能够特异性地结合一种或几种密切相关的抗原。一般情况下，来自哺乳动物的轻链是κ轻链或λ轻链并且来自哺乳动物的重链是α,δ,ε,γ或μ。抗体可以是任何类型(例如，IgG,IgE,IgM,IgD,IgA和IgY)、种类(例如，IgG₁,IgG₂,IgG₃,IgG₄,IgA₁和IgA₂)或亚类。术语“抗体”还包括人源化抗体，灵长类动物化抗体，人抗体，类人源化的抗体和嵌合抗体。

术语“全长抗体”，“完整抗体”或“完全抗体”可互换使用来指处于其基本上完整形式的抗体，而不是抗体的抗原结合片段。具体地，完全抗体包括具有包含Fc区的重链和轻链的那些抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如，人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。

如本文中所使用的，“可变区”是指如本文所定义的能够特异性结合抗原的抗体的轻链和/或重链的部分，并且包括互补决定区(CDR)(即，CDR1，CDR2和CDR3)和构架区(FR)的氨基酸序列。示例性可变区包括三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3和任选地FR4)以及三个CDR。在来源于IgNAR的蛋白质的情况下，该蛋白质可能缺少CDR2。V_H是指重链的可变区。V_L是指轻链的可变区。

如本文所用，术语“互补决定区”(同义词：CDR；即，CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，它的存在是抗原结合所必需的。每个可变结构域通常具有鉴定为CDR1、CDR2和CDR3的3个CDR区域。分配给CDR和FR的氨基酸位置的定义可以根据KabatSequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1987和1991或本公开内容的执行中的其它编号系统，例如，Chothiaand Lesk J.Mol Biol.196:901-917,1987；Chothia等人Nature 342,877-883,1989；和/或Al-Lazikani等人,J Mol Biol 273:927-948,1997的典型编号系统；Lefranc等人,Devel.And Compar.Immunol.,27:55-77,2003的IMGT编号系统；或Honnegher and Plükthun J.Mol.Biol.,309:657-670,2001的AHO编号系统。

“框架区”(FR)是非CDR残基的那些可变结构域残基。

如本文所用，术语“Fv”应被认为意指任何蛋白质，可包含多个多肽或单个多肽，其中V_L和V_H缔合并形成具有抗原结合位点的复合体，即，能够特异性地结合抗原。形成抗原结合位点的V_H和V_L可以是在单个多肽链中或在不同的多肽链中。此外，本公开内容的Fv(以及本公开内容的任何蛋白质)可以具有结合或不结合相同抗原的多个抗原结合位点。该术语应理解为包括直接来源于抗体的片段，以及对应于使用重组手段产生的这样的片段的蛋白质。在一些实例中，V_H未连接至重链恒定结构域(C_H)1和/或V_L未连接至轻链恒定结构域(C_L)。含有多肽或蛋白质的示例性Fv包括Fab片段，Fab’片段，F(ab’)片段，scFv，双抗体，三链抗体，四链抗体或更高阶的复合物，或者连接于恒定区或其结构域例如C_H2或C_H3结构域的任何前述抗体，例如，微型抗体。“Fab片段”由抗体的一价抗原结合片段组成，并可以通过用木瓜蛋白酶消化完全抗体来产生以得到由完整的轻链和重链的一部分组成的片段，或可使用重组方法来产生。抗体的“Fab'片段”可以通过用胃蛋白酶处理完全抗体，随后还原，以得到由完整的轻链和包含V_H和单个恒定结构域的重链的一部分的分子来获得。两个Fab'片段通过以这种方式处理的抗体来获得。Fab'片段还可以通过重组方法产生。抗体的“F(ab')2片段”由通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体组成，并且通过用胃蛋白酶处理完全抗体分子得到，且没有随后的还原。“Fab₂”片段是包括使用例如亮氨酸拉链或C_H3结构域连接的两个Fab片段的重组片段。“单链Fv”或“scFv”是包含抗体的可变区片段(Fv)的重组分子，其中轻链的可变区和重链的可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。

如本文所用，在提及蛋白质或其抗原结合位点与抗原的相互作用时，术语“结合”意指相互作用取决于特定结构(例如，抗原决定簇或表位)在抗原上的存在。例如，抗体识别并结合特定蛋白质结构，而不一般性地结合蛋白。如果抗体结合表位“A”，含有表位“A”(或游离的，未标记的“A”)的分子的存在会在含有标记的“A”和蛋白质的反应中降低与抗体结合的标记的“A”的量。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异结合”应被认为意指本公开内容的蛋白质比它与可选择的抗原或细胞更频繁、更迅速、以更大的持续时间和/或以与特定抗原或表达其的细胞的更大的亲和力反应或缔合。例如，相比于蛋白质结合其它生长因子(例如，VEGF-A)或通过多反应性天然抗体(即，通过已知结合天然发现于人中的多种抗原的天然存在的抗体)共同识别的抗原，该蛋白质以实质上更大的亲和力(例如，20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍)结合VEGF-B。通常，但不一定地，提及结合意指特异性结合，每个术语应被理解为提供对其它术语的明确支持。

如本文中所使用的，术语“中和”应被认为意指蛋白质能够通过VEGF-R1阻断、减少或阻止细胞中的VEGF-B信号传导。用于测定中和的方法是本领域已知的和/或描述于本文中。

如本文中所使用的，术语“预防”、“防止”或“阻止”包括施用本公开内容的化合物，从而阻止或阻碍病况的至少一种症状的发展。

如本文中所使用的，术语“治疗”、“处理”或“疗法”包括施用本文描述的蛋白质，从而减少或消除指定疾病或病况的至少一种症状，或减缓疾病或病况的进展。

如本文所使用的，术语“受试者”应被认为意指任何动物，包括人，例如哺乳动物。示例性的受试者包括但不限于人和非人灵长类动物。例如，受试者是人。

伤口的治疗

本公开内容提供了用于通过施用抑制VEGF-B信号传导的化合物加速和/或改善和/或增强伤口愈合的方法。例如，方法包括将化合物施用至受试者的伤口或全身性施用至受试者。

在一个实例中，受试者具有伤口。伤口可以是慢性、急性或常规的伤口。在一个实例中，伤口是慢性的。在一个实例中，被治疗的伤口是如表1中所示的0A阶段伤口或1A阶段伤口或2A阶段伤口或3A阶段伤口。在一个实例中，被治疗的伤口是如表1中所示的0B阶段伤口或1B阶段伤口或2B阶段伤口或3B阶段伤口。在一个实例中，被治疗的伤口是如表1中所示的0C阶段伤口或1C阶段伤口或2C阶段伤口或3C阶段伤口。在一个实例中，被治疗的伤口是如表1中所示的0D阶段伤口或1D阶段伤口或2D阶段伤口或3D阶段伤口。

表1：伤口阶段(通过Texas伤口分类系统定义)

在一个实例中，受试者患有受感染的和/或缺血的伤口。

在一个实例中，伤口是全层伤口。

在一个实例中，伤口是糖尿病性溃疡，例如，糖尿病足部溃疡。糖尿病性溃疡可以使用表1所示的系统分类。在另一个实例中，溃疡根据如表2所示的Wagner溃疡分类系统分类。

表2:Wagner溃疡分类系统

糖尿病足部溃疡的一些风险因素的实例包括周围神经病，其影响足部的运动和感觉功能，受限的关节活动，足畸形，足压力分布异常，反复的轻微创伤，和受损的视敏度。周围感觉神经病是主要因素。约45％-60％的所有糖尿病性溃疡是神经性的，而高达45％既有神经性又有缺血性成分。伴随着无感觉的足，患者不能够感知在每日生活的步行和活动期间由例如匹配不良的鞋引起的对足部的反复损伤。神经病与行走的生物力学改变组合导致反复的钝挫伤和异常高应力载荷分布到足的易受伤害部分，从而导致胼胝形成和皮肤侵蚀。溃疡形成后，它往往是缓慢愈合的，可以继续扩大，提供了局部或全身感染的机会，并且需要全面的医疗和手术护理以促进愈合。

在一个实例中，伤口在施用本文描述的化合物前存在于或已经存在于受试者上至少约2周。在一个实例中，伤口在施用本文描述的化合物前存在于或已经存在于受试者上至少约4周。在一个实例中，伤口在施用本文描述的化合物前存在于或已经存在于受试者上至少约6周。

本公开内容的方法还适用于正在经历或已经经历了治疗的受试者，其中所述治疗延迟或提供无效伤口愈合。治疗可以包括，但不限于，用药、辐射、导致免疫系统抑制的治疗等。在一个实例中，受试者具有第二病况，其中所述第二病况延迟或提供无效伤口愈合。第二病况包括但不限于，例如，糖尿病，周围血管疾病，感染，自身免疫疾病或胶原血管疾病，导致免疫系统抑制的疾病状态等。

定量分析可用于评估伤口愈合，例如，测定伤口面积的％减少，或伤口完全闭合(例如，通过例如皮肤闭合而无引流或敷料需要来测量)。伤口面积在治疗之前、期间和之后通过本领域技术人员已知的方法评估。例如，评估可以通过例如定量面积法、照片、物理检查等来测定。伤口面积可以在治疗之前、期间和之后测定。在一个实例中，伤口面积可以通过测量伤口长度L(以例如cm计的最长的边到边长度)和宽度W(以例如cm计的垂直于L的最长的边到边宽度)，并且将L乘W以获得估计的表面积(cm)来评估。用于治疗的伤口的大小可以变化。在本发明的一个实例中，治疗前的伤口面积为约0.4cm²或更多，或者约1.0cm²或更多，或在约0.4cm²和约10cm²之间，或在约1cm²和约10cm²之间，或在约1cm²和约7cm²之间，或在约1cm²和约5cm²之间，或大于4.0cm²。所述面积可以在清创之前或之后进行测量。

伤口愈合的加速可通过伤口愈合的％加速和/或风险比进行描述。例如，当与对照相比较时，化合物的施用加速伤口愈合大于50％，或等于或大于60％，等于或大于70％，等于或大于74％，等于或大于75％，等于或大于80％，等于或大于85％，等于或大于90％，等于或大于95％，等于或大于100％，等于或大于110％或更多。

本公开内容的方法包括加速和/或改善和/或增强受试者群体中的伤口愈合。例如，方法包括将化合物施用给群体的受试者，其中所述化合物的施用导致群体中与对照相比大于10％(或大于12％，或14％，或15％，或17％，或20％，或25％，或30％，或33％，或35％，或40％，或45％，或50％或更多)的伤口愈合改善。

本公开内容还提供了用于减少伤口(或溃疡)的复发的方法。例如，方法包括向受试者施用化合物，以使得溃疡复发的发病率降低。

还提供了用于降低例如处于发展伤口(例如，慢性伤口)的风险中的将要经历手术(当将诱发伤口时)的受试者中的伤口的严重性的方法。

在替代实例中，本公开内容提供了用于减少由受试者中的伤口引起的结疤的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

在其它替代实例中，本公开内容提供用于预防伤口的形成(即，新的伤口)的方法，该方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

VEGF-B信号传导抑制剂

包含抗体可变区的蛋白质

示例性的VEGF-B信号传导抑制剂包括抗体可变区，例如是结合VEGF-B和中和VEGF-B信号传导的抗体或抗体片段。

在一个实例中，抗体可变区特异性结合VEGF-B。

合适的抗体和包含其可变区的蛋白质在本领域中是已知的。

例如，抗VEGF-B抗体及其片段描述于WO2006/012688中。

在一个实例中，抗VEGF-B抗体或其片段是竞争性抑制2H10与VEGF-B的结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实例中，抗VEGF-B抗体或其片段是抗体2H10或其嵌合的、CDR移植的或人源化形式或其抗原结合片段。在这方面，抗体2H10包含含有SEQ ID NO：3所示的序列的V_H和含有SEQ ID NO：4所示的序列的V_L。这种抗体的示例性的嵌合和人源化形式描述于WO2006/012688中。

在一个实例中，抗VEGF-B抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：5所示的序列的V_H和含有SEQ ID NO：6所示的序列的V_L的抗体。

在一个实例中，抗VEGF-B抗体或其片段是竞争性抑制4E12与VEGF-B的结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实例中，抗VEGF-B抗体或其片段是抗体4E12或其嵌合的、CDR移植的或人源化形式或其抗原结合片段。在这方面，抗体4E12包含含有SEQ ID NO：7所示的序列的V_H和含有SEQ ID NO：8所示的序列的V_L。

在一个实例中，所述化合物是包含抗体4E12的人源化可变区的蛋白质。例如，该蛋白质包括可变区，其包含抗体4E12的V_H和/或V_L的互补性决定区(CDR)。例如，该蛋白质包含：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸25-34所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：7的氨基酸49-65所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：7的氨基酸98-105所示的序列的CDR 3；和

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸24-34所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸50-56所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：8的氨基酸89-97所示的序列的CDR3。

在一个实例中，抗VEGF-B抗体或其片段是竞争性抑制2F5与VEGF-B的结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实例中，抗VEGF-B抗体或其片段是抗体2F5或其嵌合的、CDR移植的或人源化形式或其抗原结合片段。在这方面，抗体2F5包含含有SEQ ID NO：9所示的序列的V_H和含有SEQ ID NO：10所示的序列的V_L。

在一个实例中，所述化合物是包含抗体2F5的人源化可变区的蛋白质。例如，该蛋白质包括可变区，其包含抗体2F5的V_H和/或V_L的互补性决定区(CDR)。例如，该蛋白质包含：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：9的氨基酸25-34所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸49-65所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：9的氨基酸98-107所示的序列的CDR 3；和

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸24-34所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸50-56所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸89-96所示的序列的CDR3。

在另一实例中，抗体和包含其可变区的蛋白利用标准方法产生，例如，如在本领域中已知的或本文中简单地描述的方法。

基于免疫的方法

为了产生抗体，将任选地与任何合适的或期望的佐剂和/或药学上可接受的载体配制的VEGF-B或其表位携带片段或部分或其修饰形式或编码其的核酸(“免疫原”)以可注射组合物的形式施用至受试者(例如，非人动物受试者，例如，小鼠，大鼠，鸡等)。示例性非人动物是哺乳动物，例如鼠动物(例如，大鼠或小鼠)。注射可以是鼻内，肌肉内，皮下，静脉内，皮内，腹膜内，或通过其它已知的途径。任选地，多次施用免疫原。用于制备和表征抗体的手段是本领域已知的(见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,1988)。用于在小鼠中产生抗VEGF-B抗体的方法描述于WO2006/012688中。

多克隆抗体的产生可以通过在免疫后在不同点采集免疫动物的血液来监测。如果需要实现所需的抗体滴度，可以给予第二增强注射。重复增强和滴定的过程直到实现合适的滴度。当获得期望水平的免疫原性时，对经免疫的动物放血，分离和储存血清，和/或将所述动物用于产生单克隆抗体(mAb)。

单克隆抗体是由本公开内容考虑的示例性的抗体。通常，单克隆抗体的产生包括用免疫原在足以刺激抗体产生细胞的条件下免疫受试者(例如，啮齿类动物，例如，小鼠或大鼠)。在一些实例中，将经遗传工程化以表达人抗体而不表达鼠抗体的小鼠免疫以产生抗体(例如，如PCT/US2007/008231和/或Lonberg等人,Nature 368(1994):856-859中描述的)。免疫后，将抗体产生性体细胞(例如，B淋巴细胞)与永生细胞例如永生骨髓瘤细胞融合。用于产生这样的融合细胞(杂交瘤)的各种方法在本领域中是已知的并且描述于例如Kohler and Milstein,Nature 256,495-497,1975中。然后可在足以用于抗体产生的条件下培养杂交瘤细胞。

本公开内容考虑了用于产生抗体的其它方法，例如，ABL-MYC技术(如例如描述于Largaespada等人,Curr.Top.Microbiol.Immunol,166,91-96.1990中的)。

基于文库的方法

本公开内容还包括筛选抗体或包含其抗原结合结构域(例如，包含其可变区)的蛋白质的文库来鉴定VEGF-B结合抗体或包含其可变区的蛋白质。

本公开内容考虑的文库的实例包括原态文库(library)(来自未攻击的受试者)，经免疫的文库(来自用抗原免疫的受试者)或合成文库。编码抗体或其区域(例如，可变区)的核酸通过常规技术(例如公开于Sambrook and Russell,eds,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed,vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001中的)克隆，并用于使用本领域已知的方法编码和展示蛋白质。用于产生蛋白质文库的其它技术在例如US6300064(例如，Morphosys AG的HuCAL文库)；US5885793；US6204023；US6291158；或US6248516中描述。

根据本公开内容的蛋白质可以是可溶的分泌蛋白质或可作为细胞或颗粒(例如，噬菌体或其它病毒，核糖体或孢子)的表面上的融合蛋白呈现。各种展示文库形式是本领域已知的。例如，文库是体外展示文库(例如，核糖体展示文库，共价展示文库或mRNA展示文库，例如，如在US7270969中描述的)。在又一个实例中，展示文库是噬菌体展示文库，其中包含抗体的抗原结合结构域的蛋白质被表达在噬菌体上，例如，如在US6300064；US5885793；US6204023；US6291158；或US6248516中描述的。其它噬菌体展示方法是本领域已知的并且由本公开内容考虑。类似地，细胞展示的方法由本公开内容考虑，例如，细菌展示文库，例如，如在US5516637中描述的；酵母展示文库，例如，如在US6423538中描述的或哺乳动物展示文库。

用于筛选展示文库的方法是本领域已知的。在一个实例中，本公开内容的展示文库使用亲和纯化筛选，例如，如在Scopes(In:Protein purification:principles andpractice,Third Edition,Springer Verlag,1994)中描述的。亲和纯化的方法通常牵涉使由文库展示的包含抗原结合结构域的蛋白质与靶抗原(例如，VEGF-B)接触和随后洗涤、洗脱保持结合至抗原的那些结构域。

如果需要，将通过筛选鉴定的任何可变区或scFv容易地修饰成完整的抗体。用于修饰或重新设计可变区或scFv成完整抗体的示例性方法例如描述于Jones等人,J ImmunolMethods.354:85-90,2010；或Jostock等人,J Immunol Methods,289:65-80,2004中。可替代地，或另外地，使用标准的克隆方法，例如，如描述于Ausubel等人(In:CurrentProtocols in Molecular Biology.Wiley Interscience,ISBN 047150338,1987),和/或(Sambrook等人(In:Molecular Cloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratories,New York,Third Edition 2001)中的。

去免疫化的、嵌合的、人源化的、类人源化的、灵长类动物化的和人蛋白质

本公开内容的蛋白质可以是人源化蛋白质。

术语“人源化蛋白质”应被理解为是指包含人样可变区的蛋白质，所述人样可变区包括移植到或插入来自人抗体的FR的来自非人类物种(例如，小鼠或大鼠或非人灵长类动物)的抗体的CDR(这种类型的抗体也称为“CDR-移植的抗体”)。人源化蛋白质还包括其中人蛋白质的一个或多个残基被一个或多个氨基酸置换修饰和/或人蛋白质的一个或多个FR残基被相应的非人残基取代的蛋白质。人源化蛋白质还可以包括在人抗体和在非人抗体中均未发现的残基。蛋白质的任何额外的区域(例如，Fc区)通常是人的。人源化可以使用本领域已知的方法(例如，US5225539，US6054297，US7566771或US5585089)执行。术语“人源化蛋白质”还包括超人源化蛋白，例如，如在US7732578中描述的。

本公开内容的蛋白质可以是人蛋白质。如本文所用的术语“人蛋白质”是指具有在人中(例如在人种系或体细胞中)发现的可变抗体区域和任选地恒定抗体区域或来自使用这样的区域产生的文库的蛋白质。“人”抗体可包括不是由人序列编码的氨基酸残基，例如通过随机或定点突变在体外引入的突变(特别是牵涉蛋白质的少量残基例如蛋白质的1、2、3、4或5个残基中的保守置换或突变的突变)。这些“人抗体”并不一定需要作为人的免疫应答的结果产生，相反，它们可以使用重组手段(例如，筛选噬菌体展示文库)和/或通过包含编码人抗体恒定区和/或可变区的核酸的转基因动物(例如，小鼠)和/或使用定向选择(例如，如在US5565332中描述的)产生。该术语还包括这样的抗体的亲和成熟的形式。对于本公开内容的目的，人蛋白质还将被认为是包括含有来自人抗体的FR或包含来自人FR的共有序列的序列的FR并且其中一个或多个CDR是随机或半随机的的蛋白质，例如，如在US6300064和/或US6248516所述的。

本公开内容的蛋白质可以是类人源化的蛋白质。术语“类人源化的蛋白质”是指通过在WO2007/019620中描述的方法制备的蛋白质。类人源化的蛋白质包括抗体的可变区，其中所述可变区包含来自新世界灵长类动物抗体可变区的FR和来自非新世界灵长类动物抗体可变区的CDR。例如，类人源化的蛋白质包括抗体的可变区，其中所述可变区包含来自新世界灵长类动物抗体可变区的FR和来自小鼠或大鼠抗体的CDR。

本公开内容的蛋白质可以是灵长类动物化蛋白质。“灵长类动物化蛋白质”包括来自在非人灵长类动物(例如，食蟹猴)的免疫后产生的抗体的可变区。任选地，将非人灵长类动物抗体的可变区连接到人恒定区以产生灵长类动物化抗体。用于产生灵长类动物化抗体的示例性的方法在US6113898中描述。

在一个实例中，本公开内容的蛋白质是嵌合蛋白。术语“嵌合蛋白”是指其中抗原结合结构域来自特定物种(例如，鼠，例如小鼠或大鼠)或属于特定抗体种类或亚类的蛋白质，而该蛋白质的其余部分来自来源于另一物种(例如，人或非人灵长类动物)或属于另一抗体种类或亚类的蛋白质。在一个实例中，嵌合蛋白质是包含来自非人类抗体(例如，鼠抗体)的VH和/或VL的嵌合抗体，抗体的剩余区域是来自人抗体。这种嵌合蛋白质的产生在本领域中是已知的，并且可以通过标准手段来实现(例如，在US6331415；US5807715；US4816567和US4816397中描述的)。

本公开内容还包括去免疫化的蛋白质，例如，如在WO2000/34317和WO2004/108158中描述的。去免疫化的抗体和蛋白质具有移除的一个或多个表位例如B细胞表位或T细胞表位(即，突变的)以由此降低受试者将产生针对抗体或蛋白质的免疫应答的可能性。

包含抗体可变区的其它蛋白质

本公开内容还考虑了包含抗体的可变区或抗原结合结构域的其它蛋白质，例如：

(i)单结构域抗体，其是包含抗体的V_H或V_L的全部或部分的单个多肽链(参见，例如，US6248516)；

(ii)双抗体、三链抗体和四链抗体，例如如US5844094和/或US2008152586中描述的；

(iii)scFv，例如，如在US5260203中描述的；

(iv)微型抗体，例如，如在US5837821中描述的；

(v)如在US5731168中描述的“钥和孔”双特异性蛋白质；

(vi)异源缀合蛋白质，例如，如在US4676980中描述的；

(vii)使用化学交联剂产生的异源缀合蛋白质，例如，如在US4676980中描述的；

(viii)Fab'-SH片段，例如，如在Shalaby等人,J.Exp.Med.,175:217-225,1992中描述的；或

(ix)Fab₃(例如，如在EP19930302894中描述的)。

恒定结构域融合体

本公开内容包括包含抗体的可变区和恒定区或Fc或其结构域例如C_H2和/或C_H3结构域的蛋白质。合适的恒定区和/或结构域将对于本领域技术人员是明显的和/或这样的多肽的序列可容易地从公共可得的数据库获得。Kabat等人还提供了一些合适的恒定区/结构域的描述。

恒定区和/或其结构域可用于提供生物活性，例如，二聚化，延长的血清半衰期例如通过与FcRn(新生儿Fc受体)结合，抗原依赖性细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)，抗原依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

本公开内容还考虑了包含突变的恒定区或结构域的蛋白质，例如，如在US7217797；US7217798；或US20090041770(具有增加的半衰期)或US2005037000(增加的ADCC)中描述的。

稳定化的蛋白质

本公开内容的中和蛋白质可包含IgG4恒定区或稳定化的IgG4恒定区。术语“稳定化的IgG4恒定区”将被理解为意指已被修饰以减少Fab臂交换或经历Fab臂交换的倾向或半抗体形成或形成半抗体的倾向的IgG4恒定区。“Fab臂交换”指的是针对人IgG4的蛋白质修饰类型，其中IgG4重链和连接的轻链(半分子)被交换为另一个IgG4分子的重链-轻链对。因此，IgG4分子可以获取识别两个不同抗原的两个不同的Fab臂(导致双特异性分子)。Fab臂交换在体内天然地发生，并且可以通过纯化的血细胞或还原剂例如还原的谷胱甘肽来体外诱导。“半抗体”在IgG4抗体解离以形成各含有单个重链和单个轻链的两个分子时形成。

在一个实例中，稳定化的IgG4恒定区包含根据Kabat系统(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Departmentof Health and Human Services,1987和/或1991)的铰链区的241位脯氨酸。这个位置对应于根据EU编号系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological InterestWashington DC United States Department of Health and Human Services,2001和Edelman等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85,1969)的铰链区的位置228。在人IgG4中，该残基通常是丝氨酸。在丝氨酸被脯氨酸取代后，IgG4铰链区包含序列CPPC。在这方面，本领域技术人员将知道，“铰链区”是赋予抗体的两个Fab臂移动性的连接Fc和Fab区的抗体重链恒定区的富含脯氨酸的部分。铰链区包括牵涉重链间二硫键的半胱氨酸残基。它通常被定义为根据Kabat编号系统的从人IgG1的Glu226延伸到Pro243。其它IgG同种型的铰链区可以通过将形成重链间二硫(S-S)键的第一和最后一个半胱氨酸残基置于相同的位置来与IgG1序列对齐(参见例如WO2010/080538)。

其它基于蛋白质的VEGF-B信号传导抑制剂

可能干扰VEGF-B与其受体的生产性相互作用的其它蛋白质包括突变的VEGF-B蛋白质。

在一个实例中，所述抑制剂是包含结合VEGF-B(以及，例如，不显著结合VEGF-A)的VEGF-R1的一个或多个结构域的可溶性蛋白。在一个实例中，可溶性蛋白还包含抗体例如IgG1抗体的恒定区。例如，可溶性蛋白还包含抗体例如IgG1抗体的Fc区和任选地铰链区。

在一个实例中，蛋白抑制剂是抗体模拟物，例如，包含以类似于抗体的方式结合靶蛋白的可变区的蛋白质支架。示例性抗体模拟物的描述如下。

免疫球蛋白和免疫球蛋白片段

本公开内容的化合物的实例是包含免疫球蛋白例如T细胞受体或重链免疫球蛋白(例如，IgNAR，骆驼科动物抗体)的可变区的蛋白质。

重链免疫球蛋白

重链免疫球蛋白与许多其它形式的免疫球蛋白(例如，抗体)在结构上的不同之处在于它们包含重链，但不包含轻链。因此，这些免疫球蛋白也称作“仅重链抗体”。重链免疫球蛋白发现于例如骆驼科动物和软骨鱼中(也称为IgNAR)。

存在于天然存在的重链免疫球蛋白中的可变区通常称为骆驼科动物Ig中的“V_HH结构域”和IgNAR中的V-NAR，以从存在于常规的4-链抗体中的重链可变区(其被称为“V_H结构域”)和从存在于常规4-链抗体中的轻链可变区(其被称为“V_L结构域”)来区分它们。

重链免疫球蛋白不需要轻链的存在来以高亲和力和高特异性结合相关抗原。这意味着，单结构域结合片段可以来源于重链免疫球蛋白，其容易表达并且通常是稳定和可溶的。

来自骆驼科动物的重链免疫球蛋白及其可变区的一般描述和用于其生产和/或分离和/或使用的方法特别记载于下列参考文献WO94/04678，WO97/49805和WO 97/49805中。

来自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区的一般描述和用于其生产和/或分离和/或使用的方法除其它以外发现于WO2005/118629中。

V-样蛋白

本公开内容的化合物的实例是T细胞受体。T细胞受体具有组合成相似于抗体的Fv模块的结构的两个V-结构域。Novotny等人,Proc Natl Acad Sci USA 88:8646-8650,1991描述了T细胞受体的两个V-结构域(称为α和β)可以如何融合并表达为单链多肽，并且进一步地，如何改变表面残基以降低类似于抗体scFv的疏水性。描述单链T细胞受体或包含两个V-α和V-β结构域的多聚T细胞受体的产生的其它出版物包括WO1999/045110或WO2011/107595。

包含抗原结合结构域的其它非抗体蛋白质包括具有V-样结构域的蛋白质，其通常是单体的。包含这样的V-样结构域的蛋白质的实例包括CTLA-4、CD28和ICOS。包含这样的V-样结构域的蛋白质的进一步的公开内容包括在WO1999/045110中。

Adnectin

在一个实例中，本公开内容的化合物是adnectin。Adnectin基于人纤连蛋白的第十纤连蛋白III型(¹⁰Fn3)结构域，其中环区被改变以赋予抗原结合。例如，在¹⁰Fn3结构域的β-夹心的一个末端的三个环可以被工程改造以使Adnectin特异性识别抗原。进一步的细节参见US20080139791或WO2005/056764。

Anticalin

在进一步的实例中，本公开内容的化合物是anticalin。Anticalin来源于脂质运载蛋白，其是运输小的疏水性分子例如类固醇、胆素、类视黄醇和脂质的胞外蛋白家族。脂质运载蛋白具有刚性β折叠二级结构，其中在锥形结构的开口端具有多个环，其可被工程化以结合抗原。这样的工程改造的脂质运载蛋白被称为anticalin。anticalin的进一步描述参见US7250297B1或US20070224633。

亲和体

在进一步的实例中，本公开内容的化合物是亲和体。亲和体是来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的Z结构域(抗原结合结构域)的支架，其可被工程改造以结合抗原。Z结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已通过表面残基的随机化产生了文库。更多细节见EP1641818。

Avimer

在进一步的实例中，本公开内容的化合物是Avimer。Avimer是来源于A-结构域支架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键合结构。通过由A-结构域家族展现的天然变异的重排产生多样性。更多细节见WO2002088171。

DARPin

在进一步的实例中，本公开内容的化合物是设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。DARPin来源于锚蛋白，其是介导膜内在蛋白附着到细胞骨架的蛋白家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33残基基序。它们可以通过在每个重复的第一α-螺旋和β-转角中随机化残基来工程改造以结合不同的靶抗原。它们的结合界面可通过增加模块数量来增加(亲和力成熟的方法)。更多细节见US20040132028。

用于产生蛋白质的方法

重组表达

在重组蛋白质的情况下，可以将编码其的核酸克隆到表达载体中，然后将其转染到否则不产生抗体的宿主细胞例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞或骨髓瘤细胞中。用于表达本公开内容的蛋白质的示例性细胞是CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。实现这些目的的分子克隆技术来本领域中是已知的，并且描述于例如Ausubel等人,(编辑),CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括到目前为止的所有更新)或Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中。各种各样的克隆和体外扩增方法适合于重组核酸的构建。产生重组抗体的方法在本领域中也是已知的。见US4816567或US5530101，

在分离后，将核酸插入用于进一步克隆(DNA扩增)或用于在无细胞系统或细胞中表达的表达构建体或表达载体中与启动子可操作地连接。

如本文所用，术语“启动子”将在其最广泛的背景下考虑，并且包括基因组基因的转录调节序列，包括TATA盒或起始元件，其对于精确的转录起始是所需的，具有或不具有例如响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变核酸的表达的附加调节元件(例如，上游激活序列，转录因子结合位点，增强子和沉默子)。在本上下文中，术语“启动子”还用于描述赋予、激活或增强其可操作地连接的核酸的表达的重组、合成或融合核酸或衍生物。示例性启动子可以含有一个或多个特异性调节元件的额外拷贝以进一步增强表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时序表达。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”意指相对于核酸定位启动子以使得核酸的表达由该启动子控制。

用于在细胞中表达的许多载体是可用的。载体组件通常包括但不限于下述的一种或多种：信号序列，编码抗体的序列(例如，来源于本文所提供的信息)，增强子元件，启动子，和转录终止序列。本领域技术人员将意识到用于抗体表达的合适序列。示例性信号序列包括原核分泌信号(例如，pelB，碱性磷酸酶，青霉素酶，Ipp或热稳定的肠毒素II)，酵母分泌信号(例如，转化酶前导序列，α因子前导序列，或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如，单纯疱疹gD信号)。

在哺乳动物细胞中具有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)，人延伸因子1-α启动子(EF1)，小核RNA启动子(U1a和U1b)，α-肌球蛋白重链启动子，猿猴病毒40启动子(SV40)，Rous肉瘤病毒启动子(RSV)，腺病毒主要晚期启动子，β-肌动蛋白启动子；包括CMV增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段的混合调节元件。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。

适合于在酵母细胞例如选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)的酵母细胞中表达的典型启动子包括但不限于，ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子，RPR1启动子，或TEF1启动子。

用于将分离的核酸或包含其的表达构建体引入细胞用于表达的手段是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的技术依赖于已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞的手段包括显微注射、通过DEAE-葡聚糖介导的转染、通过脂质体介导的转染(例如，通过使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击例如通过使用DNA包被的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA)等。

用于产生抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养，取决于使用的细胞类型。诸如Ham's Fl0(Sigma)，最小必需培养基((MEM)，(Sigma)，RPMl-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)的商购可得培养基适于培养哺乳动物细胞。用于培养本文所讨论的其它细胞类型的培养基在本领域中是公知的。

蛋白质纯化

在产生/表达后，将本公开内容的蛋白质使用本领域中已知的方法纯化。这样的纯化提供了基本上不含非特异性蛋白质、酸、脂质、碳水化合物等的本公开内容的蛋白质。在一个实例中，蛋白质处于这样的制剂中：其中超过约90％(例如95％，98％或99％)的制剂中的蛋白质是本公开内容的蛋白质。

肽纯化的标准方法被用来获得本公开内容的分离的蛋白质，包括但不限于各种高压(或高效)液相色谱(HPLC)和非HPLC多肽分离方案，例如大小排阻色谱，离子交换色谱，疏水相互作用色谱，混合模式色谱，相分离方法，电泳分离，沉淀法，盐溶/析法，免疫色谱，和/或其它方法。

在一个实例中，亲和纯化可用于分离含有标记的融合蛋白。使用亲和色谱分离蛋白质的方法在本领域中是公知的，并且描述于例如Scopes(In:Protein purification:principles and practice,Third Edition,Springer Verlag,1994)中。例如，将结合至标记(在多组氨酸标签的情况下，这可以是例如镍-NTA)的抗体或化合物固定在固体支持物上。包含蛋白质的样品随后与固定的抗体或化合物在足够用于发生结合的条件下接触一定时间。在洗涤以去除任何未结合或非特异性结合的蛋白质后，洗脱蛋白质。

在包含抗体的Fc区的蛋白质的情况下，蛋白A或蛋白G或其修饰形式可以用于亲和纯化。蛋白A可用于分离含有人γ1、γ2或γ4重链Fc区的纯化蛋白。蛋白G推荐用于所有小鼠Fc同种型和人γ3。

基于核酸的VEGF-B信号传导抑制剂

在本公开内容的一个实例中，根据本公开内容的任何实例的如本文中所述的治疗和/或预防方法包括减少VEGF-B的表达。例如，这样的方法涉及施用减少核酸的转录和/或翻译的化合物。在一个实例中，化合物为核酸，例如反义多核苷酸，核酶，PNA，干扰RNA，siRNA或microRNA，

反义核酸

术语“反义核酸”应当被认为意指DNA或RNA或其衍生物(例如，LNA或PNA)或它们的组合，其互补于编码本公开内容的任何实例中的如本文所述的多肽的特定mRNA分子的至少一部分，并且能够干扰转录后事件例如mRNA翻译。反义方法的使用在本领域中是已知的(参见例如，Hartmann and Endres(editors),Manual of Antisense Methodology,Kluwer(1999))。

本公开内容的反义核酸将在生理条件下与靶核酸杂交。反义核酸包括对应于结构基因或编码区的序列或对应于实现对基因表达和剪接的控制的序列的序列。例如，反义核酸可对应于编码VEGF-B的核酸的靶向编码区，或5'-非翻译区(UTR)或3'-UTR或这些的组合。它可以与内含子序列部分互补，所述内含子序列可在转录期间或之后剪接掉，例如，仅与靶基因的外显子序列互补。反义序列的长度应为至少19个连续核苷酸，例如，编码VEGF-B的核酸的至少50个核苷酸，例如至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用互补于整个基因转录物的全长序列。长度可以是100-2000个核苷酸。反义序列与靶向转录物的同一性程度应为至少90％，例如95-100％。

针对VEGF-B的示例性反义核酸描述于例如WO2003/105754中。

催化核酸

术语“催化核酸”指的是DNA分子或含DNA的分子(本领域中也称为“脱氧核酶”或“DNAzyme”)或RNA或含RNA的分子(也称为“核酶”或“RNAzyme”)，其特异性识别独特的底物并且催化这种底物的化学修饰。催化核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T(和对于RNA的U)。

通常地，催化核酸包含用于靶核酸的特异性识别的反义序列，和核酸切割酶促活性(在此也称为为“催化结构域”)。可用于本公开内容的核酶的类型是锤头核酶和发夹核酶。

RNA干扰

RNA干扰(RNAi)可用于特异性抑制特定蛋白质的产生。不受理论的限制，该技术依赖于包含与目标基因的mRNA(在此情况下是编码VEGF-B的mRNA)或其部分基本上相同的序列的dsRNA分子的存在。便利地，该dsRNA可以从重组载体宿主细胞中的单个启动子产生，其中有义和反义序列被不相关的序列侧接，所述不相关序列使得有义和反义序列能够杂交以形成dsRNA分子，其中不相关序列形成环结构。用于本公开内容的合适的dsRNA分子的设计和产生是在本领域技术人员能力范围之内的，特别是考虑到WO99/32619，WO99/53050的，WO99/49029和WO01/34815。

杂交的有义和反义序列的长度应各自为至少19个连续的核苷酸，诸如至少30或50个核苷酸，例如至少100，200，500或1000个核苷酸。可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。长度可以是100-2000个核苷酸。有义和反义序列与靶向的转录物的同一性程度应是至少85％，例如，至少90％，例如，95-100％，

示例性小干扰RNA(“siRNA”)分子包含与靶mRNA的约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。例如，siRNA序列开始于双核苷酸AA，包括约30-70％的GC-含量(例如，30-60％，例如40-60％，例如约45％-55％)，并且与不是待将其引入的哺乳动物的基因组中的靶的任何核苷酸序列不具有高的百分比同一性，例如如通过标准BLAST搜索测定的。减少VEGF-B的表达的示例性siRNA可从Santa Cruz Biotechnology或Novus Biologicals商购。

减少VEGF-B的表达的短发夹RNA(shRNA)在本领域中也是已知的并且可商购自Santa Cruz Biotechnology。

筛选测定

抑制VEGF-B信号传导的化合物可以使用本领域中已知的技术(例如下文描述的)鉴定。类似地，适合用于本文中描述的方法的VEGF-B信号传导抑制剂的量可使用本领域中已知的技术(例如下文描述的)确定或估计。

中和测定

对于结合VEGF-B和抑制信号传导的化合物，可以使用中和测定。

在一个实例中，中和测定涉及将VEGF-B与化合物在可检测地标记的可溶性VEGF-R1的存在或不存在下接触或将可检测地标记的VEGF-B与化合物在表达VEGF-R1或可溶性VEGF-R1的细胞的存在或不存在下接触。然后评估结合VEGF-R1的VEGF-B的水平。结合的VEGF-B在存在化合物时相较于不存在化合物时的水平降低表明所述化合物抑制VEGF-B与VEGF-R1的结合和因此抑制VEGF-B信号传导。

另一中和测定在WO2006/012688中描述并且涉及将包含固定在固体支持物上的第二Ig-样结构域的VEGF-R1的片段与用化合物预温育的亚饱和浓度的重组VEGF-B接触。在洗涤以去除未结合的蛋白后，将固定的蛋白质与抗VEGF-B抗体接触并测定结合的抗体的量(指示固定的VEGF-B)。相较于化合物不存在时的水平，减少结合的抗体的水平的化合物被认为是VEGF-B信号传导的抑制剂。

在另一实例中，抑制VEGF-B信号传导的化合物使用依赖VEGF-B信号传导进行增殖的细胞来鉴定，例如，在WO2006/012688中所述的经修饰以表达掺入人促红细胞生成素受体的胞内结构域和VEGF-R1的胞外结构域的嵌合受体的BaF3细胞。细胞在VEGF-B的存在下和在化合物的存在或不存在下进行培养。然后使用标准方法评估细胞增殖，例如，集落形成测定法、胸苷掺入或细胞增殖的另一种合适标记的摄取(例如，MTS染料还原测定)。在VEGF-B的存在下降低增殖水平的化合物被认为是VEGF-B信号传导的抑制剂。

化合物还可以使用标准方法来评估它们结合VEGF-B的能力。用于评估结合蛋白质的方法是本领域中已知的，例如如在Scopes(In:Protein purification:principles andpractice,Third Edition,Springer Verlag,1994)中描述的。这样的方法通常涉及标记化合物，并将其与固定的VEGF-B接触。在洗涤以去除非特异性结合的化合物后，检测标记和因而结合的化合物的量。当然，可以固定化合物和标记VEGF-B。还可以使用平移型测定法。可替代地，或另外地，可以使用表面等离子体共振测定法。

表达测定

减少或阻止VEGF-B的表达的化合物通过将细胞与化合物接触和测定VEGF-B的表达水平来鉴定。用于在核酸水平测定基因表达的合适的方法是本领域中已知并且包括，例如，定量聚合酶链反应(qPCR)或微阵列测定法。用于在蛋白质水平测定表达的合适的方法也是本领域中已知的并且包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)，荧光连接的免疫吸附测定(FLISA)，免疫荧光或Western印迹。

体外测定

许多体外测定已被描述用于评估伤口愈合，包括划痕或刮伤测定，其中内皮细胞或成纤维细胞的培养物被刮掉以产生无细胞区域并且在存在或不存在化合物的情况下评估该无细胞区域的闭合速率。

其它测定法包括鸡尿囊绒膜(CAM)模型。

体内测定

存在用于评估伤口愈合的许多体内测定法。例如，本发明人利用了其中使糖尿病动物受伤(例如，产生全层伤口)并在存在或不存在测试化合物的情况下随时间评估伤口闭合的量和/或速率的模型。

慢性伤口的其它模型包括，例如，兔耳“溃疡”模型，皮瓣模型，压力性溃疡模型(例如，通过使用铸件施加压力至灰狗的腿)或皮下阿霉素施用。

急性伤口的模型包括，例如，切口模型，切除模型和烧伤模型。

伤口可在患有其它缺陷例如代谢缺陷的动物中产生(例如，如本文所描述的或通过施用链脲霉素)。

伤口的各种模型描述于例如Demling等人,WOUNDS.13(1Suppl A):5–14,2001中和慢性皮肤溃疡和烧伤伤口的FDA指导手册中。

药物组合物和治疗方法

抑制VEGF-B信号传导的化合物(同义词：活性成分)可用于胃肠外、表面(topical)、口服或局部(local)施用，气雾剂施用，或透皮施用，以用于预防或治疗性处理。在一个实例中，化合物胃肠外施用，例如皮下或静脉内注射。

待施用的化合物的制剂将根据施用途径和选择的剂型(例如溶液，乳剂，胶囊)而变化。包含待施用的化合物的适当的药物组合物可在生理上可接受的载体中制备。对于溶液或乳剂，合适的载体包括，例如，水溶液或醇/水溶液，乳剂或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定的油。各种合适的水性载体是本领域技术人员公知的，包括水、缓冲的水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油，丙二醇，液体聚乙二醇)、葡萄糖溶液和甘氨酸。静脉内媒介物可以包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养物或电解质补充剂(一般参见，Remington's PharmaceuticalScience,16th Edition,Mack,Ed.1980)。组合物可任选地含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂以及毒性调节剂，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。可以根据本领域已知的冻干和重构技术将化合物冻干用于存储并在使用前在合适的载体中重构。

在一个实例中，本公开内容提供了包含本公开内容的化合物的表面制剂。在一个实例中，将化合物用适合用于表面制剂的载体配制。合适的载体包括适合于应用至一个或多个皮肤层而不必需地应用至皮肤的外层，并且适合于在其它情况下使用的化合物或其混合物。可用于本公开内容的表面组合物的载体和赋形剂通常不会以任何显著的程度抑制活性化合物的相关生物活性，例如，载体或赋形剂不会显著抑制活性化合物关于VEGF-B信号传导的抑制活性。例如，载体或赋形剂提供缓冲活性以维持化合物在适当的pH，以从而发挥其生物活性，例如，载体或赋形剂是磷酸缓冲盐水。可替代地，或另外地，载体或赋形剂包含增强抑制剂的摄取和/或增强抑制剂的透皮递送的化合物。例如，载体或赋形剂包含皮肤渗透促进剂，例如，二丙二醇和/或油醇。可替代地，或另外地，载体或赋形剂包含脂质体促进细胞摄取。

可替代地，或另外地，载体或赋形剂包含增强化合物的活性和/或减少化合物的抑制的化合物，例如蛋白酶抑制剂和/或DNase抑制剂和/或RNase抑制剂，从而增强抑制剂的稳定性。

活性成分在所选择的介质中的最佳浓度可以凭经验、根据本领域技术人员已知的程序确定，并且将取决于所需的最终药物制剂。

用于本公开内容的化合物的施用的剂量范围足够大以产生所需的效应。例如，组合物包含治疗或预防有效量的化合物。

如本文所用，术语“有效量”应被认为意指抑制/减少/阻止受试者中的VEGF-B信号传导的化合物的足够量。本领域技术人员将意识到，这样的量将取决于例如化合物和/或特定受试者和/或进行治疗的伤口的类型和/或严重程度而变化。因此，该术语不应被解释为将本公开内容限制到特定的量，例如，化合物的重量或数量。

如本文所使用的，术语“治疗有效量”应被认为意指增强或诱导伤口愈合的化合物的足够量。

如本文所用，术语“预防有效量”应该认为意指预防或抑制或延缓伤口的进展的化合物的足够量。

剂量不应大到引起不良副作用，例如高粘度综合征、肺水肿、充血性心脏衰竭等。通常，剂量将随年龄、状况、性别和疾病在患者中的程度而变化，并且可以由本领域的技术人员来确定。剂量可在任何并发症的情况下由个体医师调整。

剂量可以为约0.1mg/kg至约300mg/kg，例如从约0.2mg/kg至约200mg/kg，例如从约0.5mg/kg至约20mg/kg，每日施用一个或多个剂量，持续一天或数天。

在一些实例中，化合物以比后续(维持剂量)更高的初始(或装载)剂量施用。例如，化合物以约1mg/kg至约30mg/kg的初始剂量施用。然后化合物以约0.0001mg/kg至约1mg/kg的维持剂量施用。维持剂量可以每7-35天施用，例如，每14天或21天或28天。

在一些实例中，使用剂量递增方案，其中化合物以比后续剂量所使用的较低的剂量初始施用。该剂量方案可用于受试者最初遭受不良反应的情况下。

在受试者不充分地响应治疗的情况下，可一周施用多个剂量。可替代地，或另外地，可以施用增加的剂量。

受试者可以用化合物通过给予多于一次暴露或一组剂量来再次治疗，例如进行化合物的至少约两次暴露，例如，约2至60次暴露，并且更特别地约2至40次暴露，最特别地约2至20次暴露。

在另一实例中，任何再次治疗可以以确定的间隔给予。例如，随后的暴露可以以不同的间隔施用，例如约24-28周或48-56周或更久。例如，这样的暴露以各自约24-26周或约38-42周或约50-54周的间隔施用。

本公开内容的方法还可以包括根据本公开内容的至少一种化合物与用于预防或治疗伤口和/或糖尿病的另一种治疗有效药剂的施用一起联合施用。

在一个实例中，本公开内容的化合物与当前正在使用的或正在开发用于预防或治疗糖尿病的至少一中另外的已知化合物组合使用。这样的已知化合物的实例包括但不限于常见的抗糖尿病药物，例如磺酰脲(例如格列齐特，格列吡嗪)，二甲双胍，格列酮(例如罗格列酮，吡格列酮)，餐后血糖释放剂(例如瑞格列奈，那格列奈)，阿卡波糖和胰岛素(包括所有天然存在的、合成的和修饰形式的胰岛素，例如人、牛或猪来源的胰岛素；悬浮在例如低精蛋白锌或锌中的胰岛素和衍生物例如赖谷胰岛素，赖脯胰岛素，赖脯胰岛素鱼精蛋白，甘精胰岛素，地特胰岛素或门冬胰岛素)。

在一个实例中，本公开内容的化合物与已知可用于治疗伤口的化合物一起施用。例如，化合物与抗-感染剂(例如，抗生素或抗真菌剂)、VEGF-A、IGF-1、IGF-2、PDGF、TGF-β、EGF或干细胞(例如，间充质干细胞或祖细胞或内皮干细胞)组合施用。

在一个实例中，本公开内容的化合物与另一种用于伤口的治疗例如敷料和/或移植物和/或负压力一起施用。

可与根据本公开内容的化合物共施用的药剂的其它实例是皮质类固醇和免疫抑制药物。

如根据前文将明显的，本公开内容提供了受试者的伴随治疗性处理的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的第一化合物和第二化合物，其中所述试剂是本公开内容的化合物(即，VEGF-B信号传导的抑制剂)，并且第二试剂用于伤口或糖尿病的预防或治疗。

如本文所用，如在短语“伴随治疗性处理”中的术语“伴随”包括在第二试剂的存在下施用第一试剂。伴随治疗性处理方法包括其中第一、第二、第三或另外的试剂共同施用的方法。伴随治疗性处理方法还包括其中第一或另外的试剂在第二或另外的试剂的存在下施用的方法，其中所述第二或另外的试剂例如可已在先前施用。伴随治疗性处理方法可以由不同的行为者逐步执行。例如，一个行为者可以给受试者施用第一试剂并且第二行为者可以给受试者施用第二试剂，并且施用步骤可以在相同的时间或几乎相同的时间或间隔远的时间执行，只要第一试剂(和/或另外的试剂)是在第二试剂(和/或另外的试剂)的存在下的施用之后。行为者和受试者可以是相同的实体(例如人)。

在一个实例中，本公开内容还提供了用于治疗或预防受试者中的伤口的方法，所述方法包括向受试者施用包含本公开内容的至少一种化合物的第一药物组合物和包含一种或多种另外的化合物的第二药物组合物。

在一个实例中，本公开内容的方法包括给具有伤口(例如，糖尿病性溃疡)和接受另一治疗(例如，用于糖尿病)的受试者施用VEGF-B信号传导的抑制剂。

试剂盒和物质的其它组合物

本公开内容的另一实例提供含有如上所述的可用于伤口的治疗的化合物的试剂盒。

在一个实例中，试剂盒包括(a)包含任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中的如本文所述的抑制VEGF-B信号传导的化合物的容器；和(b)具有用于治疗受试者中的伤口的说明的包装说明书。

根据本公开的这个实例，包装说明书在容器上或与容器相关联。合适的容器包括例如瓶子，小瓶，注射器等。容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器容纳或含有有效治疗伤口的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抑制VEGF-B信号传导的化合物。标签或包装说明书指示组合物用于治疗适宜于治疗(例如具有或易具有伤口)的受试者，其中提供关于化合物和任何其它药物的给药量和间隔的具体指导。试剂盒可进一步包括含有药学上可接受的稀释缓冲液(例如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸缓冲盐水，林格氏溶液和/或葡萄糖溶液)的附加容器。试剂盒可进一步包括从商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

试剂盒任选地进一步包括包含第二药物的容器，其中抑制VEGF-B信号传导的化合物是第一药物，以及该制品还包括在包装说明书上的用于使用有效量的第二药物或用于伤口的另一种治疗来治疗受试者的说明。第二药物可以是上文所示的任何药物。

本公开内容还提供了用于伤口的浸渍有或已在其中固定有(例如，可逆地固定在其中)如本文所公开的化合物的敷料。示例性敷料包括绷带，例如织物绷带或塑料绷带或纱布绷带或纱布敷料或创伤敷料。可替代地，或另外地，敷料包括支架，例如，可生物降解的支架。例如，支架包含胶原蛋白和/或聚(乳)酸和/或聚(乙醇)酸和/或纤维蛋白。这样的支架可以是多孔的或无孔的或其混合物。这样的支架的优点是，它们适应伤口的形状并递送治疗化合物至创伤部位。此外，随着伤口愈合，支架分解，从而减少生物废料。

本公开内容包括以下非限制性实施例。

实施例1：中和性抗VEGF-B抗体治疗糖尿病小鼠中的伤口

VEGF-B的抗体介导的抑制不怎么影响糖尿病db/db//BKS小鼠中的血糖水平

本机构内饲养的雄性C57BKS/Leprdb(db/db/BKS)小鼠购自Jackson Laboratory。在创伤前和在实验期间小鼠以一只小鼠/笼饲养。动物设施具有12小时的昼夜循环以及可随意获得的食物和水。富集包括大鼠隧道和筑巢材料以减少压力。db/db/BKS雄性小鼠(8周)在创伤前用400μg的VEGF-B抗体(2H10)或同种型匹配的对照抗体(BM4)预处理2次/周(i.p.)持续4周。在创伤后持续相同的治疗方案直到杀死动物。在实验前和期间监测体重和血糖。血糖水平使用血糖仪(Countour棒，Bayer)从尾部分析并使用实验室标尺测量体重。

如图1所示，在这个实验中抗VEGF-B治疗不改变严重的糖尿病db/db BKS小鼠或非糖尿病db/⁺BKS小鼠中的血糖水平或体重增加。

使用2H10的VEGF-B药理学抑制增强严重糖尿病小鼠模型中的伤口闭合

在达到15mM以上的非空腹血糖水平后，将2H10或BM4(对照)治疗的db/db或db/⁺在创伤前保持额外2周。这是为了在创伤时获得严重糖尿病动物。在全身麻醉下通过异氟烷吸入进行创伤。颈后的毛发用电动理发器和通过应用的脱毛霜(Veet)来去除。将皮肤用70％乙醇消毒，之后使用6mm活检穿孔器获得穿透皮肤和肉膜的两个成对圆形全层伤口。在创伤后的前两天期间，小鼠每天给予0.05-0.1mg/kg丁丙诺啡的皮下镇痛注射两次。伤口大小和愈合进展使用数码摄影在创伤后直接追踪并随后在实验期间隔日追踪。伤口面积通过使用Image J软件对每个伤口测量两次。摄像机和伤口之间的距离通过将伤口的大小相关于每个图像中包括的参考对象来校正。单个伤口(每个动物两个)作为单个实验数据点来处理。

如图2所示的，当用抗VRGF-B抗体治疗时，糖尿病小鼠模型(db/db BKS)中的伤口闭合显著增强。

抗VEGF-B治疗增加糖尿病小鼠模型中的伤口闭合和愈合的速率。在伤口闭合的早期阶段(第4和6天)检测到抗VEGF-B治疗的最显著效果。这在图3中进一步示出，其中抗VEGF-B治疗加速前四天期间的伤口愈合，尽管在血糖水平上没有差异。

本文中所呈现的数据表明，糖尿病的高血糖症本身不是受损的伤口愈合过程的主要原因。

使用2H10的抗VEGF-B治疗降低伤口愈合中上调的基因的表达

将雄性db/db和db/+小鼠(如上所述处理并在第16天处死)用于表达分析。对伤口进行解剖并在干冰上急速冷冻。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从伤口提取和纯化总RNA。第一链cDNA从0.5-1μg总RNA使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)合成。实时定量PCR用KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPABiosystems)在Rotor-Gene Q(Qiagen)实时PCR热循环仪中根据生产商的说明进行。将表达水平标准化至L19的表达。

如在图4中所示，db/db小鼠中的抗-VEGF-B治疗减少了在糖尿病创伤期间被上调的几个基因的表达。

使用2H10的抗VEGF-B治疗影响血管形态学但不促进细胞增殖

将雄性db/db小鼠(如上所述处理并在第16天处死)用于免疫分析。对伤口进行解剖并在多聚甲醛中在+4℃下固定24小时，在70％的乙醇中水化，包埋在石蜡中并切片成3μm厚的横截面。抗原修复使用抗原修复溶液pH6(DAKO)和通过加热切片至+98℃进行10分钟来进行。用适当的一级抗体(Brdu,CD45,CIV和CD31，稀释至1-5μg/mL)在+4℃孵育切片12小时。应用匹配的荧光标记的第二抗体(Invitrogen,Alexa fluor，1：1000稀释)，并在室温(RT)孵育切片1小时，之后将其制备用于显微镜观察。用AxioVision显微镜(Carl Zeiss)在20x放大倍数下对切片进行拍照。然后使用AxioVision Run向导程序(pixels2)对切片进行评价和量化。相关于DAPI的复染色强度定量BrdU染色强度并定量所有其它染色用于总像素面积。

如图5所示，抗VEGF-B治疗促进糖尿病伤口愈合过程中血管的成熟。

VEGF-B信号传导通路在糖尿病伤口中被上调

对照抗体(BM4)治疗的db/db或db/+基本上如上所述进行创伤并在创伤后16天处死。用6mm活检穿孔器对伤口进行采集用于表达和组织学分析。将组织在液氮中冷冻并保持在-80℃直至进一步加工。用TRIzol试剂(Invitrogen)和QIAGEN RNeasy(Qiagen)根据制造商的说明分离RNA。总RNA(500ng)根据制造商的说明(iScript cDNA合成试剂盒，Bio-Rad)进行反转录。使用Platinum SYBR green SuperMix(Invitrogen)和25ng cDNA/反应进行qPCR。将表达水平标准化至TUBB5(微管蛋白，β5I类)的表达。

如在图6中所示，伤口中的Vegfb和VEGF-B结合受体Vegfr1的表达随着糖尿病和肥胖增加。这些数据表明，VEGF-B信号传导途径是用于治疗糖尿病创伤的合适靶。

使用2H10的抗VEGF-B治疗减少db/db小鼠的皮肤中的脂质累积

将雄性的db/db和db/+小鼠(如上所述处理的)用于油红O(ORO)分析。对伤口进行解剖并在干冰上急速冷冻，并直接在低温恒温器的模子上将其包埋入(Sakura)。将冷冻切片(12μm)在油红O工作溶液(2.5g油红Q(Sigma-Aldrich)，溶解于400ml99％异丙醇中，进一步在H₂O中6:10稀释，通过22μm滤器(Corning)过滤)浸泡12分钟并安装其之前在流动自来水下冲洗20分钟。染色切片用亮视野显微镜(Axio Vision显微镜,CarlZeiss)在40x放大倍数下检查并捕获最少4帧/动物。从伤口的中心区域捕获图像。为了脂滴的定量，使用Axio Vision Run向导程序定量每帧中红色像素的量用于总ORO染色(像素，a.u)。

如图7中所示，使用2H10的抗VEGF-B治疗减少雄性db/db小鼠的皮肤中在创伤后的脂质累积。

Claims (19)

1.用于在具有伤口的受试者中治疗伤口或增强伤口愈合或用于阻止或减缓伤口进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

2.权利要求1的方法，其中所述伤口是急性的或常规的。

3.权利要求1的方法，其中所述伤口是慢性的。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述伤口是皮肤伤口。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述受试者患有肥胖和/或糖尿病。

6.用于治疗糖尿病受试者中的伤口或用于增强或诱导具有伤口的糖尿病受试者中的伤口愈合或用于减少或阻止糖尿病受试者中的伤口进展的方法，所述方法包括向受试者施用抑制VEGF-B信号传导的化合物。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述化合物以有效量施用以具有一种或多种下列效应：

(a)与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)中的速率相比，增强伤口闭合的速率；和/或

(b)与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)中的速率相比，增大特定时间点(例如，在治疗开始后)的伤口闭合的量；和/或

(c)与未曾施用所述化合物的受试者(例如，患有糖尿病且具有伤口的受试者)相比，增强受试者中的血管成熟。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述抑制VEGF-B信号传导的化合物结合VEGF-B。

9.权利要求8的方法，其中所述化合物是抗体模拟物。

10.权利要求8的方法，其中所述化合物是包含结合或特异性结合VEGF-B并中和VEGF-B信号传导的抗体可变区的蛋白质。

11.权利要求10的方法，其中所述化合物是包含Fv的蛋白质。

12.权利要求11的方法，其中所述蛋白质选自：

(i)单链Fv片段(scFv)；

(ii)二聚scFv(di-scFv)；或

(iv)双抗体；

(v)三链抗体；

(vi)四链抗体；

(vii)Fab；

(viii)F(ab’)₂；

(ix)Fv；或

(x)连接至抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(C_H)2和/或C_H3的(i)至(ix)之一。

13.权利要求11的方法，其中所述蛋白质是抗体。

14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述化合物竞争性抑制抗体2H10与VEGF-B的结合，所述抗体2H10包含重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，所述重链可变区(V_H)包含SEQID NO：3所示的序列，所述轻链可变区(V_L)包含SEQ ID NO：4所示的序列。

15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述化合物是包含抗体2H10的人源化可变区的蛋白质。

16.权利要求15的方法，其中所述蛋白质包含可变区，所述可变区包含抗体2H10的V_H和/或V_L的互补决定区(CDR)。

17.权利要求16的方法，其中所述蛋白质包含：

(i)V_H，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸25-34所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸49-65所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸98-108所示的序列的CDR 3；和

(ii)V_L，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸23-33所示的序列的CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：4的氨基酸49-55所示的序列的CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO：4的氨基酸88-96所示的序列的CDR3。

18.权利要求17的方法，其中所述蛋白质是抗体，所述抗体包含：含有SEQ ID NO：5所示的序列的V_H和含有SEQ ID NO：6所示的序列的V_L。

19.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述化合物抑制或阻止VEGF-B的表达。