CN106604931B - 靶向表面活性蛋白a受体的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于预防、治疗和诊断涉及表面活性蛋白受体(SPR)(包括表面活性蛋白A(SPA)的SPR)的病症的组合物和方法。包括含有SP‑R210L和SP‑R210S亚型的单克隆抗体的特异性结合配偶体和使用此类结合配偶体的方法。还包括单克隆抗体的片段和含有它们的融合蛋白。还提供了通过向个体施用有效量的单克隆抗体或其抗原结合片段为有需要的个体提供预防和/或治疗的方法。单克隆抗体与SP‑R210L和SP‑R210S亚型之一或两者中的表位特异性结合。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年7月14日提交的申请No.62/024,314的美国专利申请以及于2015年2月27日提交的申请no.62/121,830的美国专利申请的优先权，将其各自公开的内容并入本文。
技术领域
本公开大体上涉及用于预防、治疗和诊断包括巨噬细胞介导的免疫应答病症的组合物。
背景技术
表面活性蛋白A(SP-A)是肺泡空间中肺部天然免疫系统的关键组分。SP-A是肺部表面活性物质的主要蛋白成分；其参与组织大的聚集表面活性磷脂类排列于肺泡表面，并作为病原体的调理素发挥作用。SP-A掺入包括远端气道上皮细胞的肺泡内液的肺部表面活性成分的管状髓磷脂成分中。病原体衍生的分子的存在可触发表面活性脂质的重新组织并可激发在表面活性界面上的进入点处暴露SP-A以结合病原体。随后水性下相(hypophase)中的肺泡巨噬细胞可以巡逻结合SP-A调理的细菌的表面活性层的干扰区域，且SP-A在调节补体受体介导的吞噬作用中已经显示出重要作用。这方面，SP-A调节巨噬细胞的吞噬作用和宿主的促炎和抗炎反应，帮助首先根除感染并随后解决体内炎症。几种巨噬细胞受体与SP-A协调病原体和凋亡细胞的清除和肺部炎症的时间控制的能力密切相关。SP-A受体SP-R210被认为是非常规Myo18A的细胞表面亚型(Yang C.H.等人(2005)J.Biol.Chem.280,34447-34457)。Myo18A基因编码两种可变剪接SP-R210亚型，SP-R210L和SP-R210S。较长的230-240-kDa SP-R210L亚型含有氨基末端的PDZ蛋白相互作用组件，其在较短的210-kDaSP-R210S中是不存在的。SP-R210S在成熟巨噬细胞和未成熟单核细胞中高度表达。然而，SP-R210L仅在成熟巨噬细胞中表达。因此，出于各种原因，需要开发选择性靶向/结合不同SP-R210亚型的新型组合物和方法。本公开满足了这些和其它需要。
发明内容
本公开提供了用于预防、治疗和诊断涉及表面活性蛋白受体(SPR)(包括表面活性蛋白A(SPA)的SPR)的病症的组合物和方法。特别地，被称为SP-R210的SP-A受体通过巨噬细胞表达为至少两种亚型，即SP-R210L和SP-R210S亚型，SP-R210L亚型在例如肺泡巨噬细胞中占有优势。本公开包括SP-R210L和SP-R210S亚型的新型特异性结合配偶体和使用此类结合配偶体的方法。
一方面，本公开包括单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体由图14中描述的杂交瘤制备。在实施方案中，该单克隆抗体或其抗原结合片段具有与图14的杂交瘤制备的单克隆抗体相同的特异性，但是该单克隆抗体或其抗原结合片段是以重组方式制备的。在某些实施方案中，将该单克隆抗体或其抗原结合片段提供为药物制剂。
在某些实施方案中，该单克隆抗体和/或其片段由图14所示的被称为P2H10的杂交瘤或如被称为P4G4的杂交瘤制备或以重组方式制备，并具有与如图14所示的被称为P2H10的杂交瘤或被称为P4G4的杂交瘤制备的mAb的相同的氨基酸序列或相同的CDR序列。在实施方案中，mAb或其片段包括如图30A、图30C、图30E和图30G中所示的氨基酸序列或其片段和它们的组合，或由如图30A、图30C、图30E和图30G中所示的氨基酸序列或其片段和它们的组合组成。编码此mAb和片段的DNA序列的非限制性示例分别示于图30B、30D、30F和30H。
在某些方面，本公开中描述的单克隆抗体的抗原结合片段包括但不必限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段和它们的组合。在某些实施方案中，可以将单克隆抗体或其抗原结合片段提供为融合蛋白的组分。
另一方面，本公开包括向有需要的个体提供预防和/或治疗的方法，如本文进一步描述，其包括向个体给药有效量的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，将包括此类抗体或其抗原结合片段的组合物给药至的个体需要选自细菌感染、病毒感染或存在不期望炎症的任何其它病症的病症。在实施方案中，个体患有病毒性肺炎。在实施方案中，个体需要治疗病毒性流感。
一方面，本公开包括抑制个体中病原微生物与巨噬细胞结合的方法，其包括将本文所述的药物组合物引入至个体中。在实施方案中，给药防止或抑制了至少部分地由病原微生物与巨噬细胞的所述结合引起的信号级联反应。
另一方面，本公开包括制备单克隆抗体的方法，其包括从包括了本文进一步描述的杂交瘤的培养基中分离出该单克隆抗体。
另一方面，本公开包括制备单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将编码该单克隆抗体或其抗原结合片段的表达载体引入细胞培养物中，以使该单克隆抗体或其抗原结合片段表达，并从细胞培养物中分离出单克隆抗体或其抗原结合片段。
编码单克隆抗体或其抗原结合片段的表达载体以及包括此类表达载体的细胞培养物也包括在本公开的范围内。
本公开包括编码mAb和其Ag结合片段的所有多核苷酸以及制备此类抗体的方法。
另一方面，本公开包括抑制个体中病原微生物与巨噬细胞群结合的方法，其包括向个体中引入本公开的药物组合物。
另一方面，本公开包括制备单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将编码该单克隆抗体或其抗原结合片段的表达载体引入细胞培养物中，以使该单克隆抗体或其抗原结合片段表达，并从细胞培养物中分离出单克隆抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本公开包括SP-R210调节，使得在至少一种类型的细胞(例如免疫细胞)中诱导一种以上天然受体表达增加。在非限制性实施方案中，在蛋白质(TLR-2、CD11c、CD36和CD14)和转录(SR-A、CD11b)水平上几种天然受体的表达的2-20倍的增加可以通过扰乱SP-R210L的表达/功能来实现。
在各个方面，本公开还包括通过调节SP-R210L来调节巨噬细胞对某些试剂(包括但不一定限于LPS)的反应性。
在各个方面，本公开还包括巨噬细胞中TLR4信号传导的激活，并且还可以进一步包括通过调节SP-R210L来调节CD14和TLR-4内化。
在实施方案中，本公开大体上包括靶向SP-R210S以促进流感肺炎的消退。本公开包括通过调节效应器T淋巴细胞来增强T细胞介导的免疫，例如细胞介导的对流感的免疫反应。在实施方案中，本公开包括针对多种甲型流感病毒株赋予交叉保护性免疫。
附图说明
图1提供了SP-A SP-R210受体和其两种亚型SP-R210L和SP-R210S的结构域组织的图示。图1中的插图表明，通过流式细胞术测定，SP-R210表达于巨噬细胞的表面。将细胞与非特异性对照IgG和结合SP-R210的羧基末端结构域的抗体(被称为抗SP-R210IgG)一起孵育。随后用荧光抗-IgG二抗探查细胞以确定与IgG一抗的结合水平。红色踪迹报道了x轴上SP-R210的荧光强度水平，其与背景对照IgG的蓝色踪迹明显分开。因此，SP-R210存在于细胞膜上，可以进入细胞的外部环境。
图2.SP-R210S和SP-R210L的小鼠(Ms)和人(Hu)SP-R210羧基末端(cooh)结构域的蛋白质序列比对表位位置。由被称为P4G4的杂交瘤制备的单克隆抗体识别的表位包括KYQKKKNK(SEQ ID NO:15)和VKSWLSKNK(SEQ ID NO:16)以粗斜体显示，产生KxxxxKNK(SEQID NO:17)的共有基序。由被称为P2H10的杂交瘤制备的单克隆抗体识别的表位在下文中进一步描述，并且包括以粗体显示的DLINSLQD(SEQ ID NO：18)。值得注意的是，如下文进一步描述，KYQKKKNK(SEQ ID NO:15)和DLINSLQD(SEQ ID NO:18)表位包括SP-R210S独特的15个氨基酸的插入。
图3提供了在转基因小鼠的MΦ中产生SP-R210的条件性破坏的克隆程序的图示。Ms SP-R210Scooh(SEQ ID NO:19)；Ms SP-R210Lcooh(SEQ ID NO:20)；Hu SP-R210Scooh(SEQ ID NO:21)；Hu SP-R210Lcooh(SEQ ID NO:22)。
图4提供了表明SP-R210L的缺乏阻断了MΦ中甲型流感病毒(IAV)感染的数据的照片和图示。
图5提供了表明SP-R210L的缺乏不影响IAV的结合和内化，但是当SP-R210L不存在时，NP到细胞核的内吞运输被阻断的数据。
图6提供了表明SP-R210L介导的MΦ的IAV感染与TNFα产生相关的数据的图示。
图7提供了表明SP-R210L缺陷的MΦ和AM对TLR7配体是高反应性的数据的图示。
图8提供了显示IAV感染导致SP-R210L表达以时间依赖性的方式的抑制的数据的图片和照片证据。
图9提供了表明SP-R210L缺陷的小鼠明显更易受到IAV感染的图片和免疫组织化学数据。
图10提供了显示巨噬细胞中SR-R210亚型介导的结合和内化的显微镜图像。
图11提供了显示肺泡巨噬细胞(AM)中SP-R210的破坏延迟了体内IAV复制的图像数据。
图12提供了显示SP-R210的抗体抑制IAV感染的流式细胞术和图形数据。
图13提供了表明去唾液酸(DS)的SP-A阻断了IAV对巨噬细胞的感染的流式细胞术数据。因此，SP-A竞争性地抑制了流感病毒与受体的结合。
图14提供的表格总结了通过用r350蛋白免疫小鼠并筛选r350和r300蛋白(r＝重组；350和300蛋白如图1所示)而制备的杂交瘤。该表提供了1ELISA数据：假定的阳性的融合(杂交瘤)的筛选。2R350＝U18AC2；R300＝U18AC2。3采用完整和变性的抗原对抗体进行测试以筛选出与线性表位抗体相对的构象；4抑制甲型流感病毒与巨噬细胞结合的抗体；5通过免疫沉淀识别天然蛋白的抗体被表示为ip；6使用标准程序制备小鼠单克隆抗体。在RIBI佐剂中采用纯化的重组鼠SP-R210CL(R350)蛋白免疫BALB/c小鼠。在每次免疫中以每只小鼠每个位点(site)0.05ml的体积在皮下和腹膜内递送免疫。每两周施加3次免疫，最终的加强免疫以蛋白质的盐水溶液施加。最终加强免疫后三天，采用氯胺酮/塞啦嗪麻醉小鼠，并在放血后移除脾和淋巴结。制备免疫细胞的单细胞悬浮液，并与P3X63-Ag8.653骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤。通过ELISA筛选杂交瘤培养物的上清液对SP-R210CL和SP-R210CS(R300)的反应性并分离出用于扩增和克隆的阳性培养物。使用Sigma EX-CELL610HSF无血清培养基在ELISA中使产生反应性抗体的阳性克隆适应于无血清条件来大规模制备单克隆抗体。
图15.SP-R210L的显性负性破坏。采用空pTriexNeo2对照或含有SP-R210羧基末端亚型(6)的300(SP-R210L(DN1))和350(SP-R210L(DN2))bp cDNA的载体稳定转染Raw 264.7细胞。A)通过使用亲和纯化多克隆抗体识别SP-R210L和SP-R210S的蛋白质印迹法分析洗涤提取物(Detergent extracts)。泳道上样5微克蛋白质。B)使用TaqMan测定法和包含SP-R210L特异性外显子1和2(红色柱)的引物和包含SP-R210亚型(黑色柱)和作为内参(internal control)的18S rRNA共有的外显子17和18的内部引物的qPCR反转录和定量指定细胞系的总RNA。(n＝4，***p<0.001)。
图16.SP-R210L的消耗差异性地增强了巨噬细胞中天然受体的表达。使用指定的APC(A)或PE-偶联的抗体(B，C)(n＝4-8)通过流式细胞术分析对照和SP-R210L(DN)细胞。(D)通过qRT-PCR(一式两份的n＝4次独立实验，**p<0.02，***p<0.005)确定SP-R210L(DN)细胞中相对于对照细胞的指定受体的mRNA水平。
图17.SP-R210L(DN)细胞对LPS反应性的增加。将对照和SPR210L(DN)细胞以150,000个细胞/孔的密度接种在12孔组织培养皿中，并在RPMI/10％FBS中培养24小时。然后用100ng/mL的LPS将细胞处理2、4、8、16和24小时。A)在用LPS处理后2小时后，在布雷菲德菌素A(brefeldin A)阻断的细胞中进行TNFα的细胞内染色。虚线直方图表示未处理的细胞。黑色、红色和蓝色直方图显示了对照、SP-R210L(DN)1和SP-R210L(DN)2细胞的细胞内TNFα染色。B)在用LPS处理后的指定时间点，通过ELISA在培养基中测量分泌的TNFα的水平。(n＝6；***p<0.005)。
图18.SP-A诱导了SP-R210的表达。通过蛋白质印迹法分析在对照(A)和通过方法1纯化的浓度增加的SP-A处理的SP-R210L(DN)(B)细胞中测定SP-R210的表达。细胞还用100ng/mL LPS处理。用肌动蛋白作为上样对照再探测印迹。将对照(A)和SP-R210L(DN)(B)细胞在12孔培养皿中培养24小时，然后用浓度增加的SP-A或100ng/mL LPS处理。通过光密度法测定SP-R210L、SP-R210S和肌动蛋白的条带强度。将光密度数据归一化至肌动蛋白并表达为相对于未处理(NT)对照细胞(A)中的SP-R210L和SP-R210L(DN)(B)细胞中的SP-R210S。
图19.SP-A增强了体内SP-R210L在肺泡巨噬细胞中的表达。通过肺灌洗分离出肺泡巨噬细胞，并使用多克隆抗SP-R210抗体进行蛋白质印迹法(A)和光密度分析(B)。***p<0.001，来自两次独立实验的n＝8只WT小鼠和n＝6只SR-＝A-/-小鼠。
图20.SP-A和SP-R210L调节巨噬细胞对LPS的反应性。采用如本文所述的方法1(SP-Am1)或方法2(SP-Am2)纯化的APF-1的SP-A(图27)预处理对照和SP-R210L(DN)细胞。用指定量的SP-Am1(A)或SP-Am2(B)将细胞预处理24小时，然后用100ng/mL LPS孵育。在加入LPS 4小时后，通过ELISA在培养基中测量分泌的TNFα水平。所示数据为平均值±SD，n＝3表示3-6次独立实验。线表示指定组之间的明显差异，*p<0.0001；#p<0.04；$p<0.005。
图21.SP-R210与天然受体的相互作用。采用10mg/mL(A和B)或2.5mg/mL(C)的对照和具有多克隆抗SP-R210(A)、单克隆CD11b(B)的SP-R210L(DN)巨噬细胞的细胞提取物进行免疫沉淀实验。为了评估LPS处理的效果，在用100ng/mL LPS(C)处理后的10、30、60和120分钟进行免疫沉淀反应。共沉淀的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上分离并用指定的抗体印迹。采用多克隆SP-R210抗体对单克隆抗SP-R210免疫沉淀的提取物进行再探测。抗不相关病毒抗原的单克隆IgG1作为对照(C)。所示结果代表2-4次独立实验。
图22.中和抗体在对LPS的炎症反应的效果。采用20μg/mL指定的单个或抗体组合或各自的亚型对照对对照和SP-R210L(DN)巨噬细胞预处理30min，随后用100ng/mL LPS刺激4小时。然后收获细胞并用TNFα抗体对细胞内细胞因子染色来处理细胞。通过流式细胞术分析染色的细胞。将阳性染色的细胞的平均荧光表示为亚型对照处理的细胞的百分比。所示数据表示为平均值±SD，且数据来自一式三份的2-4次独立实验。*p<0.04。
图23.在对照和SP-R210L(DN)细胞中TLR4信号传导的激活。在指定的时间点用100ng/mL LPS刺激巨噬细胞。收获非刺激(NS)和刺激的细胞，并进行蛋白质印迹分析。用IRAK-1抗体(A)或NFκB p65(B)探测印迹、洗脱并分别用IkB或磷酸化的p65进行再探测。用微管蛋白作为上样对照再探测印迹。光密度法分析比较了相对于微管蛋白的磷酸化p65水平(C)，所示数据是平均值±SD，n＝4次独立实验。*p<0.05
图24.对照和SP-R210L(DN)细胞中NFκB的核易位。巨噬细胞在玻璃盖玻片上生长24小时，然后用100ng/mL LPS刺激。然后在LPS处理后的指定时间点用抗p65NFκB处理受刺激的细胞以用于免疫荧光染色。通过共聚焦显微镜观察NFκB的核定位(A)。在100×放大倍数下，在10个随机显微镜视野中定量包含核p65的细胞的百分比(B)。所示数据为平均值±SD，n＝4次独立实验。**p<0.01。
图25.SP-R210L破坏对CD14和TLR-4内化和信号传导的影响。采用100ng/mL LPS在指定的时间点刺激12孔培养皿中培养24小时的巨噬细胞。然后在指定的时间点采用非酶促细胞置换培养基来收获细胞，并采用CD14(A和B)或TLR-4(C)的抗体染色。在加入LPS之前30min通过加入抑制剂来评估dynasore对CD14(B)的内化效果和dynasore、EIPA和NSC23766对TNFα合成(D)的效果。通过流式细胞术分析收获的细胞，并将平均荧光表示为与未刺激的对照或SP-R210L(DN)细胞(t＝0)(A-C)相比的对照的％或表示为与对照细胞(D)相比在SP-R210L(DN)细胞中的对照TNFα的百分比。所示数据是平均值±SD，进行一式三份的n＝2-4次独立实验。***p<0.01，*p<0.04。
图26.提议的巨噬细胞激活中SP-R210亚型与CD14和SR-A的相互作用。SP-R210L通过与rac1的相互作用介导LPS-CD14的巨胞饮，导致内体LPS递送至TLR-4和NFκB的下游激活。随后的LPS降解导致了NFκB信号传导。SP-R210L介导的巨胞饮和信号传导对EIPA和NSC23766都敏感。来自细胞表面的TLR-4信号对dynasore敏感。SP-R210L表达的抑制导致了SP-R210S-CD14-SR-A复合物的形成。LPS的结合导致了SP-R210S-CD14-SR-A复合物巨胞饮样的内化和依赖于通过SR-A对rac1的激活的前馈炎症通路的激活。SP-R210S-CD14-SR-A通路对NSC23766敏感，但对EIPA不敏感。
图27.SP-B与SP-A共分离。(A)使用如材料和方法中所述的方法1和2，通过在从不同肺泡蛋白沉积患者的治疗性肺灌洗得到肺泡蛋白沉积液(APF)来纯化SP-A。通过银染色来评估SP-A的纯度。共分离的低分子量条带经胰蛋白酶消化并通过质谱法确定为SP-B(未显示)。(B)通过蛋白质印迹分析证实SP-B的存在。在还原(图27A)或非还原(图27B)的4-17％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质。通过两种方法纯化的SP-A不含SP-D(未显示)。采用从APF-1纯化的SP-A进行本研究中的所有实验。箭头表示SP-B和SP-A的位置。
图28A.单克隆SP-R210抗体增强了流感肺炎的康复。在用3LD50的流感病毒H1N1PR8感染前24小时，采用100μg抗体或100μl PBS溶剂对小鼠进行腹膜内注射。每天监测小鼠发病率和体重。IgG1：亚型对照抗体；P2H10：抗SP-R210S抗体；P4G4：抗SP-R210L+S抗体。每组N＝5只小鼠。图28B.单克隆SP-R210抗体增强了流感感染致死的存活。采用1000ffc的流感病毒H1N1 PR8感染前24小时，采用＝100μg抗体或100μl PBS溶剂对小鼠进行腹膜内注射。每天监测小鼠发病率和体重。IgG1：亚型对照抗体；P2H10：抗SP-R210S抗体；P4G4：抗SP-R210L+S抗体。每组N＝5只小鼠。*p<0.04
图29.CD103+树突状细胞中SP-R210的缺失增强了IAV感染的康复和效应器T淋巴细胞的募集。携带具有loxP序列的(floxed)SP-R210敲入等位基因的小鼠与Clec9A-Cre小鼠杂交以破坏CD103+DC中的SP-R210。用亚致死剂量的0.75LD50的IAV PR8对WT同窝幼畜对照和DC SP-R210缺陷小鼠进行鼻内感染。(A)随时间监测14天体重。每个时间点每组N＝4-12只小鼠。在感染后3、7和14天，使用每组中的4只小鼠得到肺灌洗液。通过流式细胞术测定效应器T淋巴细胞数(B)和淋巴细胞总数(C)。A-C中所示的数据是平均值±SEM。
图30A.由杂交瘤P2H10制备的抗SPR210S可变重链的CDR图谱。图30B.由杂交瘤P2H10制备的抗SP-R210S可变重链的编码序列。CDR编码序列的位置以粗体显示。图30C.由杂交瘤P2H10制备的抗SPR210S可变轻链的CDR图谱。图30D.由杂交瘤P2H10制备的抗SP-R210S可变轻链的编码序列。CDR编码序列的位置以粗体显示。图30E.由杂交瘤P4G4制备的抗SPR210S+L可变重链的CDR图谱。图30F.由杂交瘤P4G4制备的抗SP-R210S+L可变重链的编码序列。CDR编码序列的位置以粗体显示。图30G.由杂交瘤P4G4制备的抗SPR210S+L可变轻链的CDR图谱。图30H.由杂交瘤P4G4制备的抗SP-R210S+L可变轻链的编码序列。CDR编码序列的位置以粗体显示。
具体实施方式
本公开提供了用于预防、治疗和诊断涉及微生物病原体和参与针对它们的天然免疫应答的免疫细胞的病症的组合物和方法。本公开包括调节天然免疫应答、特别是已知的至少部分地由巨噬细胞促进的炎症通路的方法。在实施方案中，本公开包括调节细胞介导应答的方法。在实施方案中，调节免疫应答包括刺激免疫应答或抑制免疫应答。在一个实施方案中，抑制免疫应答包括抑制炎症和/或炎症通路。
巨噬细胞在本公开中有时也被称为“MΦ”。巨噬细胞表达表面活性蛋白受体，例如表面活性蛋白A(SPA)和D(SPD)的受体。这些受体是抵抗例如细菌和病毒感染的主要防御线，其包括但不以任何方式限于诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和流感病毒等病原体的感染。特别地，被称为SP-R210的SP-A受体介导SP-A调理的病原体的清除。如上简要讨论，MΦ表达至少两种SP-R210变体，SP-R210L和SP-R210S。SP-R210L主要在例如肺泡巨噬细胞(AM)上。除其它发现外，本公开证明了SP-R210L在甲型流感病毒(IAV)感染中的作用，以及针对SP-R210的抗体抑制了巨噬细胞的IAV内化。此外，如下文进一步所示，本公开证明，识别对SP-R210S亚型具有特异性的SP-R210的抗体增强了流感性肺炎的康复并且甚至可以防止致死性流感的攻击。例如，为了获得图28中所示的数据，在采用0.75LD50的流感病毒H1N1 PR8感染前24小时，向小鼠腹膜内注射100μg抗体或100μlPBS溶剂。如图28A所示，单克隆抗SP-R210抗体增强了流感性肺炎的康复。此外，如图28B所示，单克隆抗SP-R210抗体增强了其它致死性流感感染攻击后的存活。这与图29中所示的数据一致，其证明了CD103+树突状细胞中SP-R210的缺失增强了IAV感染的康复和效应器T淋巴细胞的募集。因此，本公开证实了通过靶向SP-R210S亚型实现的许多有益效果(包括但不一定限于流感性肺炎的消退)，并且靶向树突细胞中的SP-R210S亚型增强了效应器T淋巴细胞的诱导和快速收缩所示的T细胞介导的免疫。此外，这些数据表明通过靶向SP-R210S增强的T细胞介导的免疫导致了对所有甲型流感病毒株的广泛的交叉保护性免疫。
关于两种SP-R210亚型，在图1中提供了其结构域组织的图形描述。图1包括U18AC1(SP-R210L)和U18AC2(SP-R210S)的注释，其中U18AC2区域具有被认为限定了巨噬细胞的S构形的独特的15个氨基酸插入片段。
不含有15个氨基酸插入片段的小鼠U18AC1氨基酸上下文(context)是：
EDEMESDENEDLINSEGDSDVDSELEDRVDGVKSWLSKNKGPSKAPSDDGSLKSSSPTSHWKPLAPDPSDDEHDPVDSIFRPRFSHSYLSDSDTEAKLTETSA(SEQ ID NO:1)。该氨基酸序列在本文中也被称为“R300”。该序列可在基因库登录号AAV80767.1下获得，用于SP-R210α亚基剪接变体CS。“CS”和“CL”分别表示SP-R210羧基末端结构域的两种变体，即分别为“羧基末端大”和“羧基末端小”。N末端E是SP-R210S的残基1580和SP-R210L中的残基1938。
小鼠U18AC2独特的插入片段是下划线和斜体所示的15个氨基酸序列，如下氨基酸序列上下文(context)中所示：
EDEMESDENEDLI
EGDSDVDSELEDRVDRVKSWLSKNKGPSKAPSDDGSLKSSSPTSHWKPLAPDPSDDEHDPVDSISRPRFSHSYLSDSDTEAKLTETSA(SEQ ID NO:2)。该氨基酸序列在本文中也被称为“R350”。该序列可在基因库登录号AAV80767.1下获得，用于SP-R210α亚基剪接变体CL。
图2提供了小鼠(MSP)和人(HSP)SP-R210羧基末端CS和CL氨基酸序列的氨基酸序列比对。如图例中所示，着色的氨基酸表明了鼠和人序列之间的差异。对于本文公开的某些实施方案，如本文中的示例和表中所表明，我们采用小鼠R350(SP-R210CL)序列免疫小鼠。该蛋白质包括用于蛋白质纯化的羧基末端的六个组氨酸的标签。CL的区别肽在CS中不存在，并且与小鼠和人CL之间单一保守性取代K至R相同，并且我们已经证明小鼠抗体与人同源物是交叉反应的。
本公开的一个方面包括与人表面活性蛋白A(SP-A)受体特异性结合的新型结合配偶体。在实施方案中，该结合配偶体包括特异性结合SP-A亚型的抗体和/或其抗原结合片段。在实施方案中，与该特异性结合配偶体结合的亚型是SP-R210L亚型或SP-R210S亚型。
我们已经制备了图14所示表中表征的一系列杂交瘤。这些杂交瘤中的每一种以及包括它们的细胞培养物及它们的后代都包括在本发明中。此外，本发明包括编码由杂交瘤产生的抗体的天然和分离的形式的各个多核苷酸，如它们以其天然和分离形式产生的mRNA，如从那些mRNA产生的cDNA。包括了编码单克隆抗体及其抗原结合片段的多核苷酸的表达载体也包括在本公开中，如包含这种表达载体的细胞培养物。在实施方案中，本公开包括通过从杂交瘤培养基中分离单克隆抗体(mAb)由如图14表中所阐释的杂交瘤制备单克隆抗体(mAb)，以及通过将编码该mAb或其抗原结合片段的表达载体引入细胞培养物制备mAb和其抗原结合片段而实现该mAb或其抗原结合片段的表达和从细胞培养物分离以重组方式产生的mAb或其抗原结合片段的重组方法。在实施方案中，本发明提供的多核苷酸编码mAb的一个以上互补决定区(CDR)。在实施方案中，多核苷酸编码CDR1、CDR2、CDR3或它们的组合。
因此，一方面，本公开包括特异性识别SP-R210L亚型或SP-R210S亚型的一种以上分离的和/或以重组方式或其它方式合成的结合配偶体。此类结合配偶体可以包括能够特异性结合并将SP-A亚型彼此区分的抗体及其抗原结合片段。在实施方案中，抗原结合片段可以包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、适配体和双价抗体。针对SP-R210S亚型的抗体可以特异性结合一个以上被认为限定了巨噬细胞中S构形的作为U18AC2(SP-R210S)氨基酸序列组分的上述独特的15个氨基酸序列中的表位。在另一个实施方案中，独特的15个氨基酸序列被包括在或参与了由mAb或其抗原结合片段特异性识别的构象表位的形成。同样地，在某些实施方案中，由于SP-R210S亚型中不存在独特的15个氨基酸序列，mAb或其抗原结合片段能够特异性结合R210L亚型，这可能导致了提供该结合配偶体的结合位点的线性或构象表位。针对在R210L中而不在R210S中的N末端第458位氨基酸的mAb也包括在本公开内容中。
在实施方案中，抗体及其抗原结合片段会特异性识别存在于SP-RR210L或SP-R210S蛋白中至少7个连续氨基酸中的至少一个表位，在实施方案中，本公开提供的结合配偶体可以包括识别至少一个前述7个氨基酸片段中的至少一个对位，或识别至少一个前述片段中的至少两个对位。
由于我们保留杂交瘤并可以容易地表征，可以对编码它们分泌的免疫球蛋白(Ig)的DNA进行测序，因而可以确定Ig的氨基酸序列，并且可以确定Ig重链和轻链的互补决定区(CDR)并将Ig重链和轻链的互补决定区(CDR)用于通过杂交瘤制备抗体的合成版本，或用于制备本文进一步描述的抗原结合部分。可替代地，可以克隆产生抗体的细胞以产生相同的子克隆，其将提供持续的单克隆抗体来源。在这方面，在某些和非限制性实施方案中，单克隆抗体和/或其片段由如图14所示的被称为P2H10的杂交瘤或被称为P4G4的杂交瘤制备或以重组的方式制备，但具有与通过如图14所示的被称为P2H10的杂交瘤或被称为P4G4的杂交瘤制备的mAb相同的氨基酸序列或相同的CDR序列。在实施方案中，mAb和/或其片段包括图30A(P2H10重链蛋白和CDR)、图30C(P2H10轻链蛋白和CDR)、图30E(P4G4重链VH蛋白和CDR)、图30G(P4G4轻链蛋白)和它们的组合提供的氨基酸序列的序列或片段。分别在图30B、30D、30F和30H中描述了编码该mAb和片段的DNA序列的非限制性示例。为了方便起见，有时本说明书中是常规的，并对本领域技术人员是明显的，由杂交瘤制备的mAb也指采用相同名称的杂交瘤本身。
我们已经确定了由P2H10和P4G4杂交瘤制备的两种代表性mAb识别的表位。mAbP4G4有两个表位：KYQKKKNK(SEQ ID NO:15)和VKSWLSKNK(SEQ ID NO:16)。它们提供了共有基序：KxxxxKNK(SEQ ID NO:17)，其中x是任何氨基酸。mAb P2H10的表位是DLINSLQD(SEQ ID NO:18)。这些表位可以在图2中的两种亚型的上下文中观察到，并且明显的是，P2H10mAb可检测地仅与S亚型结合，而P4G4可检测地与S和L亚型结合。然而，在实施方案中认为P4G4与S形特异性结合，因为没有观察到其与任何其它蛋白质的交叉反应。在实施方案中，本公开包括特异性结合这些表位中的任一个或任何组合的任何其它抗体及其片段，并且包括制备和使用如本文所述的此类抗体和片段的组合物和方法。
如从图30中所示的氨基酸序列中所认识到，在实施方案中，本公开包括与表面活性蛋白ASP-R210受体特异性结合的mAb或其片段，该mAb或其片段包括(I)可变重链序列，其包括：a)包括序列GYIFSDYYMR(SEQ ID NO:3)的重链互补决定区1(P2H10-HCDR1)；和b)包括序列DINPKNGDTFYNQKFKGK(SEQ ID NO:4)的重链互补决定区2(P2H10-HCDR2)；和c)包括序列REGD(SEQ ID NO:5)的重链互补决定区3(P2H10-HCDR3)；和/或可变轻链序列，其包括：d)包括序列RSSQTILHSNGNTYLE(SEQ ID NO:6)的轻链互补决定区1(P2H10-LCDR1)；和e)包括序列KVSKRFS(SEQ ID NO:7)的轻链互补决定区2(P2H10-LCDR2)；和f)包括序列LQGSHVPLT(SEQ ID NO:8)的轻链互补决定区3(P2H10-LCDR3)。因此，本公开包括任何mAb或其抗原结合片段，其包括有助于在由P2H10杂交瘤制备的mAb中的表位识别的一种CDR或CDR的组合。
本公开还包括mAb或其片段，其包括(II)可变重链序列，其包括：i)包括序列GYTFTDYAMH(SEQ ID NO:9)的重链互补决定区1(P4G4-HCDR1)；和ii)包括序列VISTYNGNTKYNQKFKD(SEQ ID NO:10)的重链互补决定区2(P4G4-HCDR2)；和iii)包括序列ARTDYDNGDYVMDY(SEQ ID NO:11)的重链互补决定区3(P4G4-HCDR3)；和可变轻链序列，其包括：iv)包括序列KASQDINNYLS(SEQ ID NO:12)的轻链互补决定区1(P4G4-LCDR1)；和v)包括序列RANRLVD(SEQ ID NO:13)的轻链互补决定区2(P4G4-LCDR2)：和vi)包含序列LQYDEFPLT(SEQ ID NO:14)的轻链互补决定区3(P4G4-LCDR3)。因此，本公开包括包括了有助于由P4G4杂交瘤制备的mAb中的表位识别的一种CDR或CDR的组合的任何mAb或其抗原结合片段。
在本公开的实施方案中，单克隆抗体或其片段仅与SP-R210受体的SP-R210S亚型特异性结合，或与SP-R210受体的SP-R210S和SP-R210L亚型特异性结合。
本公开还包括混合的重链和轻链可变区，因此包括P2H10重链与PFG4轻链的所有组合，反之亦然。因此，本公开包括单价和多价SP-R210受体结合配偶体。
在实施方案中，本公开包括对有需要的个体治疗的方法，其包括向个体给药有效量的包括如本文所述的单克隆抗体或其片段的组合物。在某些方面，个体需要对病毒或细菌感染的治疗。在某些实施方案中，个体需要对可能与肺炎相关或可能不相关的病毒性流感感染的治疗。
在某些实施方案中，本公开包括了包括如本文所述的单克隆抗体或其片段的药物组合物。
在某些实施方案中，mAb或其抗原结合片段是融合蛋白的组分，其或被化学修饰使得它们与另一部分共价连接，或被固定至底物，或存在于与SPR210蛋白的复合物中。
由非人哺乳动物来源的本文所述类型的杂交瘤制备的任何抗体可以被修饰来提供嵌合的或部分或完全人源化的形式，且本公开包括此类修饰物。一般来说，非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体基本是人免疫球蛋白(也称为“受体(recipient)”抗体)，其中来自受体(recipient)的高可变区的残基被来自例如具有所需的抗体特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(也称为“供体”抗体)的高可变区的残基所替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基所替换。此外，人源化抗体可以包括在受体(recipient)抗体或供体抗体中未发现的残基。进行此类修饰来进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体会包括基本上至少一个、通常两个的所有可变结构域，其中所有或基本上所有的高可变环对应于非人免疫球蛋白的高可变环，并且所有的或基本上所有的FR都是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还可以包括至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常包括人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。根据本公开制备的抗体的人源化可以基本上按照Winter和同事的方法，通过用小鼠CDR序列取代人抗体的相应序列来进行(Jones等人，Nature，321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239:1534-1536(1988))。
在实施方案中，本发明的抗体和/或抗原结合片段提供为药物制剂，其可以包含诸如药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂的组分。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以通过任何合适的方式给药，包括肠胃外、皮下、腹膜、肺内和鼻内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉、动脉、腹膜、淋巴或皮下给药。此外，单克隆抗体和/或其抗原结合片段可以通过例如采用递减剂量的脉冲输注给药。
在各个实施方案中，提供了使用mAbs及其抗原结合片段的方法。一方面，本公开包括向有需要的个体给药包括有效量的mAb和/或其抗原结合片段的组合物。在实施方案中，有需要的个体是受微生物(包括病毒)感染或有风险感染的受试者，其中所述微生物表达或包括SP-R210L亚型或SP-R210S亚型或两者的配体。在实施方案中，个体需要预防和/或治疗细菌感染。在实施方案中，个体需要预防和/或治疗病毒感染。在实施方案中，个体需要预防和/或治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)的病原菌株、呼吸道合胞病毒或流感病毒的感染。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段的量足以例如阻断或抑制SP-A的结合或抑制包括SP-A的复合物的内吞运输(其中该SP-A由病原微生物表达)，使得个体中不建立症状性感染，或个体中的症状性感染比不接受抗体或其抗原结合片段的个体更快地缓解。在实施方案中，个体需要减轻的炎症，所述炎症是由感染、或创伤或对个体的其它损伤、或与增强的炎症相关的疾病(如心血管疾病、慢性阻塞性肺病和癌症)引起或与其相关。
另一方面，本公开包括在mAb或其抗原结合片段与SP-A受体亚型之间形成复合物。在实施方案中，可以检测该复合物来用于对表达特定亚型的细胞进行基于免疫学的检测，或可用于各种分选细胞的技术，如通过流式细胞术和荧光激活细胞分选(FACS)。在实施方案中，生物样品可以从个体获得并进行测试，以确定表达SP-R210L亚型或SP-R210S亚型或两者的细胞(例如巨噬细胞)的存在、不存在或量。在实施方案中，生物样品可以从个体获得并操作以例如耗尽表达SP-R210L亚型或SP-R210S亚型的细胞，或以从样品中纯化这些细胞以用于分析和/或在体内培养，或以提供此类细胞的富集群。可以基于SP-R210L亚型或SP-R210S亚型的特异性识别(视情况而定)，通过使用mAb或其抗原结合片段采用任何合适的免疫分离技术来进行此类方法。在实施方案中，mAb或其抗原结合片段可以连接至底物并被用作例如捕获剂。
在另一个实施方案中，mAb或其抗原结合片段可以与另一部分偶联，如在mAb或其抗原结合片段与另一个多肽序列之间的融合蛋白的情况下穿透肽或分子进入受体细胞内，或它们可以与治疗剂或与可用作可检测标记的试剂进行偶联，该可检测标记包括但不必限于荧光标记。
在实施方案中，本公开包括在体外施用中采用抗体或其抗原结合片段的方法，包括但不一定限于继发性免疫治疗法。在实施方案中，巨噬细胞从个体分离，与抗体或其抗原结合片段接触，并且在一段时间后，将巨噬细胞引入获得它们的个体或另一个体。
在实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于兽医，即用于非人的动物。
下面的示例将对本发明进行描述但不限制本发明。
示例1
如图3所示，本公开提供了在转基因小鼠的MΦ中产生SP-R210的条件性破坏的克隆程序的图示。如图所示，其通过SP-R210外显子1的CRE介导的倒置来进行。将SP-R210flox/+小鼠与CD11cCRE小鼠进行杂交以产生具有倒置敲除(knockout)等位基因和SP-R210flox/+后代的杂合SP-R210-/+。还通过在Raw 264.7MΦ中的SP-R210的显性负性破坏来构建SP-R210L缺陷(DN)细胞系(300&350)。
示例2
如图4所示，本公开证明SP-R210L的缺乏阻断了在MΦ中甲型流感病毒(IAV)的感染。图A)RAW 264.7WT和SP-R210L(DN)细胞中SP-R210亚型的蛋白质印迹分析。图B)采用IAVPR8(H1N1菌株，图B上行)和Phil82(H3N2菌株，图B下行)感染对照WT和SP-R210L(DN)细胞，然后进行感染并在6、12或24小时收获，并通过流式细胞术处理以评价感染。为此，用流感核蛋白NP的抗体对细胞进行染色。染色细胞的流式细胞术识别了对照细胞中的两个峰。左边的峰表示进入的病毒，其随着感染过程的进行随时间减少，右边的峰表示随着病毒增殖在核中随时间积累的新NP的合成；NP合成峰在SP-R210L(DN)细胞中减弱或不存在，这表明流感指派(co-opt)SP-R210L感染靶细胞。
示例3
如图5所示，本公开证明了SP-R210L的缺乏不影响IAV的结合和内化，但是当SP-R210L不存在时，NP到细胞核的内吞运输被阻断。用1:1MOI的IAV PR8感染对照和SP-R210L(DN)MΦ。A)通过流式细胞术采用NP抗体显示结合的病毒，B)将细胞转移到37℃下保持4小时，并通过荧光显微镜观察NP。用DAPI对细胞核进行染色。
示例4
如图6所示，本公开证明SP-R210L介导的MΦ的IAV感染与TNFα产生相关。用PR8感染对照(上)和SP-R210L(DN)(下)细胞。通过流式细胞术分析细胞内NP和TNFα。
示例5
如图7所示，本公开证明SP-R210L缺陷型MΦ和AM对TLR7配体是高反应性的。(7A).未处理(细直方图)或用2μg/mL咪喹莫特或ssRNA40孵育8小时的细胞(厚直方图)。通过流式细胞术分析细胞内TNFα。用2μg/mL咪喹莫特(7B)或ssRNA40(7C)处理通过肺灌洗收集的AM。治疗24小时后，通过ELISA在培养基中测量TNFα。
示例6
如图8所示，本公开显示IAV感染导致SP-R210L表达以时间依赖性的抑制。(8A)对照WT细胞用PR8感染、收获并用抗SP-R210或b-肌动蛋白处理用于蛋白质印迹。(8B)使用Bio-Rad Quantity One软件获得光密度数据并作图。
示例7
如图9所示，本公开证明SP-R210L缺陷型小鼠明显更易受到IAV感染。用0.75LD50的PR8/小鼠感染小鼠。每天监测体重(A)和存活(B)。(C)分离肺组织并进行HE染色以用于组织病理学(接种后18天)。EM：上皮细胞化生；N：嗜中性粒细胞；.BOOP：闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎。
示例8
如图10所示，本公开证明了SR-R210亚型介导的巨噬细胞中的结合和内化。A)在感染后6小时，通过共聚焦(A)和(B)电子显微镜定位了SP-R210和IAV。
示例9
如图11所示，本公开证明了AM中SP-R210的破坏延迟了体内IAV的复制。用0.75LD50的PR8鼻内感染小鼠。在接种后3和7天提取全肺组织的总RNA。通过针对纯化病毒RNA的标准曲线的实时PCR来定量病毒M1基因的mRNA。
示例10
如图12所示，本公开提供了显示SP-R210的抗体抑制IAV感染的流式细胞术和图片数据。使用由杂交瘤P3D7、P2H10和P2F8制备的mAb获得本图中的所示数据。我们还测试了P2F5、P6B9和P8F6。具有可检测活性的那些在图14上标记为+或+/-。为了获得这些数据，在存在或不存在包含针对IAV血凝素(HA)、人乳头状瘤病毒(HPV)表面蛋白的抗体(α)或针对SP-R210L的抗体(A和B)或αSP-R210L和SP-R210S抗体的组合的杂交瘤培养基的情况下，将巨噬细胞预孵育1小时。然后用PR8感染细胞，24小时后通过流式细胞术测定感染。
示例11
如图13所示，本公开证明去唾液酸化(DS)的SP-A阻断了IAV对巨噬细胞的感染。因此，SP-A竞争性地抑制了流感病毒与受体的结合。该图证明了天然和去唾液酸化的SP-A竞争流感与相同受体即SP-R210结合，而不是因为流感结合了SP-A上的唾液酸。不受任何特定理论限制的情况下，其生物学意义是SP-A中的多态性或突变可以改变其对受体的亲和力，实现对流感感染的突破。因此，预期的是根据本公开的抗体的用途是对治疗的显着改善的替代方案。
从上述内容明显的是，在MΦ中SP-R210L是IAV内吞运输到细胞核所需的，SP-R210L缺陷型细胞对炎症是高反应性的，小鼠模型显示在AM中损害SP-R210L降低了SP-R210L在IAV感染中的有益作用，在除AM之外的细胞中促进了更多的病毒增殖，并导致过度的肺部炎症。因此，且在没有受任何特定理论的束缚的情况下，认为通过指派(co-opt)SP-R210L，IAV引起了功能性“敲减(knock-down)”，降低了SP-R210L的有益作用并导致肺部炎症的增加。因此，合理预期的是，采用本公开的组合物和方法阻断IAV与SP-R210L的相互作用，可以减少IAV感染和/或其伴随的炎症。此外，没有特别的理由将本公开限制于IAV，因为本文提供的数据、结果和图强烈支持了mAb或其抗原结合片段的用于预防和/或治疗由许多不同的病原体引起的感染的多种用途并且进一步证明甚至在更广泛的调节炎症和离体操作细胞群的意义中使用这些试剂的可行性，以及诊断方法。
示例12
在本示例和以下示例中，将术语SP-R210和Myo18A分别用于免疫和非免疫细胞。该名称的原因是基于实验和计算证据，其表明Myo18A基因受细胞类型依赖的选择性剪接。例如，除了产生SP-R210L和SP-R210S亚型的剪接之外，小外显子的剪接在巨噬细胞中产生了Myo18A的独特羧基末端结构域的替代形式。如本领域已知的并如上简要讨论的，SP-A利用多种调节和反调节机制来调节巨噬细胞的天然免疫功能。在本公开的某些示例中，我们分析了缺乏SP-R210L亚型表达的巨噬细胞。结果表明在巨噬细胞中SP-R210L和SP-R210S协调了天然免疫受体的功能和表达。因此，在各种实施方案中，本公开涉及调节巨噬细胞的功能以影响免疫应答，特别是巨噬细胞的功能和活性。本示例提供了用于获得在其后示例中所示数据的材料和方法的描述，并且在一些情况下，这对于本领域技术人员是明显的，也与前述示例有关。
试剂和抗体
化学品购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。预染色的分子量标记物来自Bio-Rad(Hercules，CA)且胎牛血清(FBS)来自Atlanta Biologicals(Atlanta，GA)。TNFαELISA试剂盒来自eBioscience(San Diego，CA)。来自大肠杆菌(Escherichia coli)血清型O111:B6或O26:B6的平滑脂多糖(LPS)来自Sigma-Aldrich。RNAeasy midi试剂盒来自Qiagen(Valencia，CA)。高容量cDNA逆转录试剂盒和TaqMan qRT-PCR基因表达测定来自LifeTechnologies/Invitrogen(Carlsbad，CA)。与抗CD11c(N418)；CD11b(M1/70)；CD14(Sa2-8)；CD282(TLR-2；mT2.7)；CD284(TLR-4；UT41)；SIRPα(P84)；F4/80(BM8)；Ly-6C(HK1.4)；TNFα(MPX-XT22),和CD16/32Fc嵌段(93)的单克隆抗体偶联的荧光染料来自eBiosciences(San Diego,CA)。CD36(72-1)和CD284(TLR-4；Sa15-21)抗体来自Biolegend(San Diego，CA)。SR-AI/MSR1(克隆：268318)和CD87(uPAR；克隆109801)抗体来自R&D(Minneapolis，MN)。亚型匹配对照来自eBiosciences或R&D。对小鼠CD14、TLR-2、CD36、SR-AI/MSR1的未偶联的山羊多克隆和抗小鼠CD11b的大鼠单克隆(M1/70)购自R&D。抗人SP-A的兔多克隆抗体被作为标准方法。SP-B的抗体来自Seven Hills Bioreagents(Cincinnati，OH)。BrefeldinA和用于细胞内细胞因子染色的固定/渗透溶液来自eBioscience。NF-kB亚基RelA(p65)、RelA(p65)S536、IRAK-1和IκB的抗体购自Cell Signaling。HRP-偶联的驴抗山羊二抗来自R&D。真实印迹HRP偶联的抗兔和蛋白G-Sepharose IP珠来自eBioscience或GELifesciences。ECL化学发光试剂盒来自Perkin Elmer(Waltham，MA)。单克隆抗SP-R210抗体的产生和纯化将在其它地方进行报道。Dynasore来自SIGMA，5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)和NSC23766通过Fisher Scientific来自SelleckChem。
小鼠
WT C57BL/6小鼠购自JAX实验室(Bar Harbor，MN)。SP-A-/-小鼠在辛辛那提大学医学院或宾州州立医学院在当地饲养和维持。将小鼠保持在微隔离器通风笼中，并提供高压灭菌的水和随机的食物。在两个机构使用已知接近并与C57BL/6遗传背景回交独立地衍生SP-A-/-转基因小鼠。所有程序均遵照实验动物使用和保护委员会。
肺泡巨噬细胞的分离
使用0.5mL补充有1mM EDTA的PBS连续洗涤五次肺泡内容物，由肺泡分离肺泡巨噬细胞。通过离心收集肺泡巨噬细胞，并使用标准技术进行蛋白质印迹分析处理。
人SP-A的纯化和表征
通过Hawgood和同事的常规丁醇/辛基葡糖苷提取方法(方法1)或根据本领域已知的详细方案(方法2)的修饰，从肺泡蛋白沉积患者的废弃治疗肺灌洗中分离SP-A。将SP-A制剂在5mM Hepes、pH7.5中透析，并在-80℃下冷冻保存至使用。所有程序都采用来自Millipore水纯化系统(具有>18.2MΩ的电阻的Millipore RiOs 16和Milli-Q Biocel)的不含LPS的水。使用鲎变形细胞裂解物(Limulus Amebocyte Lysate)QCL-1000测定法(Lonza，Walkersville，MA)测量纯化的SP-A中LPS的浓度。在通过方法1纯化的SP-A中检测不到LPS。使用方法2制备的SP-A中的LPS浓度为20pg/μg蛋白质。通过银染色确定蛋白质纯度。对于质谱，SDS-PAGE凝胶用Invitrogen SilverQuest染色试剂盒染色。切下与SP-A共分离的蛋白质，用胰蛋白酶进行凝胶内消化，通过MALDI质谱(图27)在宾州州立大学的医学质谱仪测定蛋白质。
细胞培养物
最近我们描述了对照和SP-R210L(DN)Raw 264.7细胞的产生[8]。简言之，用表达SP-R210(SP-R210L(DN)细胞)的羧基末端结构域的pTriex-2载体稳定转染细胞[6]。用空载体转染对照细胞。将细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI中培养20-48小时。将细胞以50,000细胞/孔的密度在96孔板或以150,000-250,000细胞/孔的密度在12孔板中培养。
流式细胞术
使用非酶促细胞解离培养基(SIGMA)分离对照和SP-R210L(DN)Raw264.7细胞，并在PBS中洗涤。在冰上采用1×107个细胞/ml的浓度，在补充有1％山羊血清、0.5％BSA和5μg/ml Fc嵌段的PBS(pH 7.4)中将细胞封闭1小时。在冰上用推荐浓度的单克隆抗体将细胞染色30min。用不含蛋白质或叠氮化物的PBS洗涤细胞两次。在4℃下用eBioscience e506可固定活力染料将细胞染色20min。用FACS缓冲液(含有Ca+和Mg+、2％FBS、0.02％叠氮化钠的Hanks缓冲盐溶液(HBSS))将细胞洗涤一次，然后将细胞用100μl eBioscience细胞内(IC)固定缓冲液在室温下固定30min，然后用eBioscience透化缓冲液对细胞进行透化。对于细胞内细胞因子进行染色，在布雷菲德菌素A存在下将细胞与添加剂孵育至设定的时间点，然后用与藻红蛋白(PE)偶联的抗小鼠TNFα染色。使用BD FACS Calibur或LSR II流式细胞仪(BD Pharmingen)获得事件(Events)并使用FlowJo流式细胞术分析软件(Treestar，Mountain View，CA)进行分析。
内吞测定
将对照和SP-R210L(DN)细胞以250,000个细胞/孔的密度置于12孔板中，并在RPMI/10％FBS中培养20小时。然后用100ng/ml或2μg/ml的LPS刺激细胞分别用于CD14和TLR-4内吞测定，并使用细胞解离缓冲液在刺激后0、1、2、3和4小时收获。在室温下将细胞在含有1％山羊血清和5μg/ml的Fc嵌段的PBS中封闭30分钟，然后在室温下用PE-TLR4抗体(BioLegend)处理30分钟以进行流式染色。为了测试抑制剂的效果，在加入LPS之前30分钟，在正常培养基中，细胞用80μM Dynasore抑制发动蛋白，或40μM EIPA抑制巨胞饮，或100μMNSC23766抑制RAC1。通过流式细胞术用Cy7-偶联的CD14(克隆Sa2-8)或PE-偶联的TLR-4(克隆Sa15-21)抗体评估细胞表面CD14和TLR-4。
细胞提取物的产生和蛋白质印迹分析
将培养的细胞在PBS中洗涤并采用非酶促细胞解离培养基进行分离。在4℃下，将细胞悬浮液在210x g下离心，并通过冷冻和解冻循环在冰冻的裂解缓冲液中进行裂解。提取物立即被使用或被冷冻保存于-80℃。在4-17％SDS-PAGE梯度凝胶上将蛋白质分离，并通过半干印迹转移到硝酸纤维素上。然后将印迹在补充有0.1％吐温20和5％脱脂干奶的Tris-缓冲盐水(pH7.5)中进行封闭。用抗Myo18A、CD14、SR-A、TLR-2或CD36抗体探测印迹，然后与HRP-偶联的抗兔或抗山羊的二抗进行孵育。通过增强的化学发光显示结合的抗体。使用GS-800校准密度计(Bio-Rad)和Quantity One软件(Bio-Rad)，通过光密度测定法测定相对条带强度。
共聚焦显微镜
将在玻璃盖玻片上生长的巨噬细胞用100ng/mL的LPS在设定的时间点进行刺激，用PBS洗涤，在采用4％多聚甲醛固定15min后，在0.3％Triton X-100/PBS中透化10min，然后在室温下在10％山羊血清/PBS中封闭60min。随后，用兔p65(RelA)抗体(1:400稀释)并随后用Cy3偶联的抗兔二抗(1:500稀释)对细胞进行染色。通过使用具有DAPI的Prolong封片剂(Life Technologies)将盖玻片封装在载玻片上。采用宾州州立大学的医学成像中心的莱卡AOBS SP8激光扫描共聚焦显微镜(Leica，Heidelberg，Germany)使用高分辨莱卡40X/1.3Plan-Apochromat油浸物镜得到荧光标记的细胞的共聚焦图像。用于激发的激光线是连续波405(用于DAPI)，和80MHz脉冲的591(用于Cy3)。这些激光线分别由UV二极管、80MHz白光激光器(莱卡AOBS SP8模块)产生，并且使用AOBS可调谐滤波器连续收集相应的发射信号。所有图像和光谱数据测量数据都使用高灵敏度的HyD检测器(具有时间门控选项)产生。来自样品的反向散射发射信号通过AOBS可调谐滤波器(以去除辐射的激光)、设置为1艾里单位的检测针孔(以获得最佳横向和轴向分辨率)、光谱色散棱镜，最后到达HyD检测器递送。在每个HyD前面的狭缝的宽度是可软件调整的，使得每个HyD可以检测到跨越从10-nm带宽到系统的整个光谱容量(400-800nm)的光谱区域。使用该独特选项，对所有染料进行光谱扫描以确认信号特异性。利用Imaris软件分析共聚焦图像。
免疫沉淀
在100mm培养皿中，将对照和SP-R210L(DN)细胞在DMEM/10％FBS中培养24小时，然后用100ng/mL的LPS刺激10、30、60和120分钟。设定时间后，吸出培养基，并用冷PBS将板洗涤两次。然后直接在板上利用完全裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40，补充有1mM MnCl2、10％甘油、1x细胞信号传导磷酸酶/蛋白酶抑制剂混合物(cocktail))在冰上将细胞裂解30分钟，然后将裂解物收获到1.5mL Eppendorf管中。将裂解物在10,000×g下离心15分钟，收集上清液而不影响沉淀。用BCA测定法测量上清液的蛋白质浓度，并在4℃下，将每个样品中的1.5-2.0mg蛋白质与预平衡的蛋白G琼脂糖珠(Roche)上在旋转器上预孵育3h。通过以12,000×g离心1分钟除去珠，并将上清液转移到新鲜试管中。然后在4℃下将预吸附的裂解物与指定的抗体或亚型对照在旋转器上孵育1小时，然后将40-50μL预平衡的蛋白G琼脂糖珠(1:1，珠对床体积)加入裂解物。在4℃下将样品在旋转器上孵育过夜。将免疫沉淀产物以12,000×g离心1分钟，弃去上清液。将珠在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40)中洗涤三次，每次离心后弃去裂解缓冲液。最后一次洗涤后，将2x尿素样品缓冲液(50mM Tris-HCl，pH6.8，1.6％SDS，7％甘油，8M尿素，200mM DTT，0.01％溴酚蓝)直接加到珠上。将制备的样品在室温下孵育20分钟，并在95℃下加热2分钟。将样品以12,000xg离心1分钟，在4-17％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质并通过蛋白质印迹分析。使用1.5mg/mL的蛋白质提取物进行免疫沉淀反应。
定量实时RT-PCR
使用Qiagen RNAeasy试剂盒从对照和SP-R210L(DN)巨噬细胞中分离出DNA酶处理的mRNA。按照制造商的方案，用高容量cDNA反转录试剂盒合成cDNA。简言之，将1μg纯化的RNA与2μl 10X缓冲液、0.8μl 25X dNTP、2μl 10X随机引物、1μl RNAse抑制剂和50U反转录酶在20μl的最终体积中进行孵育。将反应在25℃下孵育10min，在37℃下孵育2小时，并在85℃下灭活5min。在使用TaqMan基因表达测定的PCR扩增之前，将cDNA稀释5倍。使用TaqMan测定法通过实时RT-PCR(qRT-PCR)定量SR-A、CD11b、CD36和CD14以及18S
RNA。使用包含Myo18A基因的外显子1和外显子2mRNA连接的PDZ结构域的引物测量SP-R210L mRNA。使用外显子18和19间的常见内部引物来定量SP-R210L和SP-R210S mRNA。每20μl qPCR反应包括10μl的2X TaqMan基因表达预混合物、1μl的20X TaqMan基因表达测定和总共10至40ng的cDNA。将反应在384孔光学板中在50℃下孵育2min、95℃下10min，并在95℃下15秒和60℃下1分钟进行40次循环。将每个样品一式三份地与无模板对照一起分析。在宾州州立医学院的功能基因组学中心设施，通过ABI PRISM 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)对结果进行监测和存储。将每个基因的mRNA的表达归一化至18S rRNA。利用2‐ΔΔCt法，使用对照细胞中的平均ΔCt作为校准物，计算出相对于对照细胞，在SP-R210(DN)中相对的mRNA表达的数据。
统计
使用GraphPad Prism 5.0软件(San Diego，CA)进行数据的统计比较。利用Wilcoxon匹配对t检验的成对比较来评估统计学差异。认为P<0.05是显着的。
示例13
本示例证明SP-R210L(DN)细胞中SP-R210L mRNA的显性负性抑制。在Raw 264.7巨噬细胞中SP-R210、SP-R210ct[5,6]的独特羧基末端(ct)结构域的稳定表达导致了SP-R210L的选择性显性负性(DN)抑制。在图15A中，SP-R210ct亚型的每15个氨基酸插入是不同的，被称为SP-R210L(DN1)和SP-R210L(DN2)。蛋白质印迹(图15A)和qPCR分析(图15B)证明，SP-R210ct缺失突变体的稳定表达阻断了超过85％的SP-R210L的mRNA和蛋白质表达。相比之下，SP-R210S变体的表达没有明显降低。
示例14
本示例证明了SP-R210L(DN)细胞表面上天然受体的水平增加。我们分析了SP-R210L的破坏是否改变了天然受体的表达。下面所示的数据代表了SP-R210L(DN)细胞系的组合数据。图16证明了SR-A和CD36的20倍和4倍的细胞表面水平(图16A)，TLR-2和CD14中2至3倍的增加(图16B)，以及SP-R210L(DN)细胞中CD11b和CD11c中4倍和2倍的增加(图16C)。有趣的是，SP-R210L(DN)细胞中TLR-4的水平比对照低40％(图16B)。单核细胞标记物Ly-6C和uPAR低水平表达，且在对照和SP-R210L(DN)细胞间没有差异(图16A和2B)。巨噬细胞分化标志物F4/80与对照细胞相比并没有统计学差异(图16A和16C)。此外，缺乏SP-R210L没有改变SIRPα的表达(图16C)。有趣的是，SP-R210L的消耗导致CD11b和SR-A的mRNA水平的4和20倍的增加(图16D)。尽管在SP-R210L(DN)细胞上所有四种受体的表面表达明显增加，但CD14和CD36的mRNA水平与对照细胞相似(图16D)。鉴于SP-R210L(DN)细胞中CD14水平增加，我们测量了用LPS孵育后的TNFα水平。用100ng/mL平滑LPS处理对照和SP-R210L(DN)细胞以通过CD14触发巨噬细胞激活。与对照相比，用LPS攻击后4小时的细胞内染色显示，SP-R210L(DN)1和SP-R210L(DN)2细胞中TNFα的合成的剧烈增加(图17A)。鉴于使用SP-R210L(DN)1和SP-R210L(DN)2细胞获得了相似的结果，则在后续研究中，来自两种细胞系的SP-R210L(DN)中描述的结果是汇集数据。图17B显示与对照细胞相比，SP-R210L(DN)细胞分泌了明显更多的TNFα，与更高水平的CD14一致。与SP-R210L(DN)细胞中更高水平的SR-A和CD36(图16A)一致的清道夫受体的功能活性增加。总之，这些发现表明通过转录和转录后机制，SP-R210L担当了天然受体表达和功能的内在阻遏物。
示例15
本示例证明SP-A增强了SP-R210在巨噬细胞中的表达。
我们分析了SP-A是否影响其自身受体SP-R210的表达。尽管采用低浓度的5μg/mLSP–A处理似乎是抑制性的，图18A表明从25-100μg/mL以浓度依赖的方式的SP-A诱导了SP-R210L和SP-R210S在对照细胞中的表达。然而，SP-R210L的破坏减弱了SP-A诱导SP-R210S表达的能力(图18B)。
为了确定SP-A是否在体内调节SP-R210表达，在来自WT和SP-A-/-小鼠的肺泡巨噬细胞上评估SP-R210。SP-R210L是肺泡巨噬细胞上的主要亚型(图19A)。值得注意的是，来自SP-A-/-小鼠的肺泡巨噬细胞似乎表达相似水平的SP-R210L和SP-R210S。光密度测定分析显示，WT巨噬细胞表达了几乎高于SP-A-/-小鼠五倍水平的SP-R210L(图19B)。这些结果表明SP-A是巨噬细胞中SP-R210表达的自分泌调节剂。
示例16
本示例证明SP-A制剂影响了巨噬细胞对LPS的反应性。
我们评估SP-A是否改变了对LPS的炎症反应。对于这些研究，我们使用了来自相同个体的肺泡蛋白沉积流体的采用已知技术通过修饰的丁醇/辛基葡糖苷法(SP-Am1)或异丙醚/丁醇提取法(SP-Am2)纯化的SP-A；SP-Am1已经显示出增强了巨噬细胞激活，而SP-Am2显示出在几种巨噬细胞系(包括Raw 264.7巨噬细胞)中为多种toll样受体的有效拮抗剂。将对照和SP-R210L(DN)巨噬细胞暴露于低(5μg/mL)或高(50μg/mL)SP-Am1中24小时，随后用100ng/mL LPS孵育(图20A)。图20A显示，在较高浓度下SP-Am1增强了对照和SP-R210L(DN)细胞中对LPS的反应性，其也增强了SP-R210亚型的表达(图19A)。在低浓度下，单独的SP-Am1没有效果。与SP-Am1相反，图20B显示SP-Am2抑制了两种细胞系中LPS诱导的TNFα。在50μg/mL下检测SP-Am2的作用(图20B)。SP-Am2包含可测量水平的LPS，其在50μg/mL SP-A剂量下转化为1ng/mL LPS。在该浓度下，采用SP-Am2单独处理在对照和SP-R210L(DN)细胞中产生了比单独使用等量的LPS的处理低20-30％的TNFα，与SP-Am2对LPS活性的抑制效果一致。
为了说明SP-Am1和SP-Am2处理的巨噬细胞中对LPS的不同反应，我们通过银染色和质谱评估了来自相同和不同个体的SP-A制剂的纯度(图27)。采用已知的甲醛/戊二醛的银染色显示，在分子范围内的表面活性蛋白B(SP-B)，SP-Am2与约8-15kDa的较高水平的低分子量蛋白(图27A，C)共同分离。值得注意的是，SP-B是通过考马斯蓝染色不可检测的，因此用考马斯染色的SP-A制剂呈现出的是纯的。我们使用来自三个不同个体的SP-A得到了类似的结果(图27A，C)。尽管在SP-Am2制剂中明显突出，蛋白质印迹分析证实存在与两种SP-A制剂共分离的SP-B(图27B)。用Invitrogen的SilverQuest兼容的质谱法的银染色揭示了额外的高于300kDa的蛋白质种类和8-25kDa范围的蛋白质(图27C)。在SP-Am2制剂中低分子量蛋白质突出，其中一种蛋白质存在于一种SP-Am1和两种SP-Am2制剂中(条带5和6，图27C)。来自APF-1蛋白沉积材料的SP-Am1和SP-Am2中的这些蛋白质条带在凝胶中消化并通过MALDI质谱法确定。高分子量条带1和2的蛋白都被确定为gp340，一种已知的SP-A结合蛋白。条带3包含SP-A和铁蛋白轻链的片段，前述的SP-A制剂中的污染物。SP-Am1中的条带4和SP-Am2中的条带6、7和8都含有SP-B。条带5包含天冬氨酰蛋白酶napsin A。除了SP-B之外，条带6和7还分别包含肺特异性napsin A和核组蛋白H4。空白的凝胶片不产生任何蛋白质鉴定。尽管分泌的napsin A可以降解肺泡细胞上的细胞表面蛋白，细胞内napsin A已经显示出在肺泡II型上皮细胞的层状体中处理SPB前体(pro-SPB)。30kDa的条带9仅包含预期的SP-A。在100个置信指数下鉴定所有蛋白质。这些研究表明SP-A预致敏巨噬细胞以通过SP-R210L增强对LPS的反应性。然而，导致体外增强或降低的反应性的SP-A处理可以取决于在不同SP-A制剂中共分离的生物活性表面活性剂组分的水平。
示例17
本示例证明SP-R210S是CD14共受体。为了确定SP-R210是否通过CD14调节LPS反应性，我们进行免疫沉淀实验以评估SP-R210是否与CD14进行物理性相互作用，并使用中和抗体来评估对照和SP-R210L(DN)巨噬细胞对LPS的反应性。我们还确定了SP-R210是否与在SP-R210L(DN)细胞中增加的SR-A、CD11b、CD36和TLR-2进行相互作用(上图16)。其中，还已知CD11b、TLR-2和SR-A与SP-A和/或SP-R210进行相互作用。我们使用亲和纯化的多克隆抗SP-R210抗体识别SP-R210L和SP-R210S。图21A显示了在对照和SP-R210L(DN)细胞中用SP-R210抗体沉淀的CD14。共沉淀的CD14明显富集在SP-R210L(DN)细胞中。有趣的是，SR-A也在SP-R210L(DN)细胞中富集，表明SP-R210L也控制了SP-R210S和SR-A之间的物理关联。相比之下，SP-R210在对照和SP-R210L(DN)细胞中均不与CD36和TLR-2共沉淀(图21A)，其作为SP-R210与CD14和SR相互作用的特异性的内部对照。使用单克隆CD11b抗体的交互免疫沉淀测定。图21B显示CD11b优先与对照细胞中SP-R210S相互作用。有趣的是，CD11b和SP-R210S在SP-R210L(DN)细胞中没有共沉淀。作为肌球蛋白家族的成员，SP-R210预期通过羧基末端卷曲螺旋结构域形成二聚体。然而，CD11b与短SP-R210S而不是更长的SP-R210L亚型的优先的、尽管部分的相互作用表明，在巨噬细胞中SP-R210L和SP-R210S彼此不形成异二聚体。与SP-R210(图21A)类似，CD11b与TLR-2(图21B)或与CD36(未显示)不相关。使用SP-R210的单克隆抗体的免疫沉淀实验显示，在SP-R210L(DN)细胞中，用LPS处理细胞两小时之前和之后，SP-R210s和CD14形成了稳定的复合物(图21C)。有趣的是，LPS治疗随着时间增加了免疫沉淀的SP-R210亚型的水平。相比之下，对照细胞中共沉淀的CD14水平比SP-R210L(DN)细胞中沉淀的CD14水平低，这表明SP-R210L控制了SP-R210S与CD14的结合(图21C)。
为了评价这些相互作用的功能意义，我们使用抗体来评估LPS对巨噬细胞的激活(图22)。用抗体对细胞进行预处理，然后用100ng/mL LPS预处理4小时，接着用细胞内TNFα处理。用SP-R210和CD11b抗体预处理巨噬细胞没有影响LPS-刺激的对照细胞中的TNFα合成。然而，与对照细胞相比，SR-A抗体在SP-R210L(DN)中显著地刺激约30％的TNFα(图22)。CD14抗体在两种细胞系中阻断了50％的TNFα。使用SP-R210或SR-A抗体的联合治疗干扰了SP-R210L(DN)细胞中CD14抗体抑制TNFα合成的能力，这与SP-R210L(DN)细胞中的SP-R210S、CD14和SR-A之间的紧密物理距离一致，如上述免疫沉淀结果所预测。与SP-R210与CD11b缺乏相互作用(图21B)一致，CD11b抗体没有干扰CD14的抑制作用(图22)。总之，这些结果表明SP-R210L调节了激活的天然受体复合物的形成，其中SP-R210S和SR-A充当CD14的共受体。
示例18
本示例证明SP-R210亚型调节TLR-4下游的NFkB活化。
LPS结合CD14，且LPS向toll样受体TLR-4的转移导致了转录因子NFκB的核易位和激活。近端TLR-4信号通路涉及淋巴毒素的形成，之后是IRAK-1的活化和降解以及IκB的下游磷酸化和降解。IkB的降解引起磷酸化并使得NFκB p65(RelA)亚基易位到细胞核。IκB表达的恢复有助于NFκB信号传导的终止。因此，我们确定了SP-R210L的缺乏是否改变了TLR-4信号传导。图23A的蛋白质印迹分析证明，IRAK1和IκB降解的动力学在对照和SP-R210L(DN)细胞之间是相似的。在两种细胞系中，在LPS刺激30分钟后IkB恢复表达。然而，图23B和23C的蛋白质印迹和光密度测定分析证明，NFκB在第536位的丝氨酸的磷酸化在对照细胞中是短暂的，但在SP-R210L(DN)细胞中保持上升。此外，图24A和B的共聚焦荧光显微镜分析显示，与对照相比，SP-R210L(DN)细胞的细胞核中NFκB的保留延长了。这些结果表明SP-R210调节了NFκB信号传导的持续时间，而没有影响TLR-4激活的早期信号传导。
示例19
本示例证明了SP-R210L和SP-R210S介导不同的CD14内化机制。
CD14控制TLR-4的内化，其可以决定细胞表面或内吞膜泡的TLR-4的激活。还已知CD14介导了巨噬细胞吞噬作用介导的LPS的清除。因此，我们提出，是否SP-R210变体影响了CD14的运输的问题。采用100ng/mL LPS随着时间对对照和SP-R210L(DN)巨噬细胞进行处理以监测CD14的内化。图25A证明，加入LPS后2小时，细胞表面损失了25％的CD14，随后新的或再循环的CD14在4小时内返回到细胞表面。相反，在SP-R210L(DN)细胞中，CD14被更快地补充(图25B)；30分钟内细胞表面只有15％的CD14损失，表面CD14迅速回到细胞表面，达到未刺激的SP-R210L(DN)细胞水平以上。为了进一步探测CD14的运输，我们在加入Dynasore之后监测了表面CD14，Dynasore是网格蛋白和发动蛋白依赖性内吞的抑制剂。Dynasore还可以抑制巨噬细胞中的液相内吞、内体循环和组成型蛋白质分泌。图25B证明，dynasore没有阻断对照细胞中CD14的内化，这与CD14的dynasore-不敏感性的巨胞饮(macrocropinocytosis)一致。然而，dynasore在对照细胞完全阻断了和在SP-R210L(DN)细胞中部分阻断了表面CD14的补充，这表明dynasore抑制了新合成的CD14的分泌。然而，Dynasore揭示了SP-R210L(DN)细胞中的独特的运输过程，其以在加入LPS第一个小时的内化后，CD14返回到细胞表面为特征(图25B)，即使还需要另外的研究以区分其是否表示了CD14的dynasore-不敏感性的循环或分泌。然而，与对照相比，尽管在LPS 1小时后，SP-R210L(DN)细胞中TLR-4的内化作用减慢，但CD14的运输差异并没有损害TLR-4的内吞作用(图25C)。Dynasore已经显示出阻断了TLR-4从内吞室的抑制信号传导的内吞。然而，CD14显示出通过巨胞饮介导了LPS的内吞作用。因此，我们使用细胞内TNFα作为LPS应答的读数，比较了dynasore和巨胞饮抑制剂EIPA对LPS的炎症反应的影响。图25D显示，dynasore和EIPA分别抑制40和60％的TNFα，表明CD14的内化需要介导对照细胞中部分的炎症反应。相比之下，SP-R210L(DN)细胞对dynasore和EIPA的抑制不敏感(图25D)。之前的研究已经表明，小GTP酶rac1介导了巨噬细胞中的巨胞饮。因此，NSC23766是小GTP酶rac1和rac2的抑制剂，其阻断对照和SP-R210L(DN)细胞中TNFα的产生。有趣的是，与对照细胞相比，NSC23766在抑制SP-R210L(DN)中的TNFα方面明显更有效(图25D)。总之，这些结果表明SP-R210L和SP-R210S亚型通过不同的巨胞饮样的机制介导了CD14的运输。
从前述内容将认识到，天然免疫系统的精确调节对于呼吸健康是至关重要的。天然受体的表达和亚细胞定位决定了协调炎症和病原体清除的信号传导应答的结果。本发现证明SP-A受体SP-R210L亚型是巨噬细胞中天然受体的内在调节剂。
我们发现SP-R210L的破坏导致在蛋白质(TLR-2、CD11c、CD36和CD14)和转录(SR-A、CD11b)水平上几种天然受体2-20倍表达的增加。信号通路的研究表明，SP-R210S和SP-R210L分别控制转录因子NFκB的激活和失活。此外，我们确定了SP-A诱导SP-R210亚型以SP-R210L依赖性方式的表达，这支持了SP-A介导在SP-R210亚型之间的交叉相互作用以调节对炎性刺激的反应的观念。重要的是，对SP-A-/-小鼠的肺泡巨噬细胞的研究表明SP-A以自分泌的形式作用，维持了SP-R210L的最佳表达水平，从而在体内调节了肺泡巨噬细胞的功能表型。
如SP-R210L缺陷细胞对LPS应答增加或采用SP-A对巨噬细胞处理后所表明，本发明的结果支持了SP-R210L调节了对巨噬细胞的预致敏的指示。我们显示，巨噬细胞暴露于SP-A预致敏(prime)了巨噬细胞对随后在对照和SP-R210L(DN)细胞中加入LPS的更严重的炎症反应。在本文中，最近的研究表明，肺泡巨噬细胞保持了促炎性识别(signature)，这表明肺泡巨噬细胞已经在体内预致敏了对致炎剂反应性的增加。相反，肺泡巨噬细胞对LPS和其它炎性刺激的致耐受性作用具有抗性。在这里，我们展示了SP-A增强了两种SP-R210亚型的表达，这可能有助于平衡天然受体调节巨噬细胞激活阈值和巨噬细胞对炎症刺激适当反应的准备，虽然SP-R210L是肺泡巨噬细胞的主要变体，其在体内受SP-A的影响。
在本公开中，我们显示即使几种类型的天然受体增加，SP-R210L的破坏也导致表面TLR-4的水平降低。此外，我们发现了对照和SP-R210L(DN)细胞之间CD14的不同运输机制，支持了SP-R210亚型是巨噬细胞功能表型的内在调节器的概念。
其它的表面活性组分可以改变巨噬细胞的巨胞饮应答。基于我们用于体外研究的SP-A的质谱表征，SP-A制剂的抗炎活性可部分归因于不同水平的共分离的表面活性蛋白B和napsin A。并列比较通过来自相同个体的常用的丁醇/辛基葡糖苷法(SP-Am1)或改良的异丙醚/丁醇/乙醇提取法(SP-Am2)制备的SP-A揭示了后一方法中这些蛋白的更高水平。然而，从不同个体制备的SP-Am1包含不同水平的共分离蛋白，其可以类似于SP_Am2影响下游测定，尽管在SP-Am2中共分离的SP-B一致性更高(图27A-C)。已知的细胞外SP-A结合蛋白gp340的存在可能限制了生物活性SP-A的有效浓度，尽管在所有制剂中发现其具有相似的水平。我们证实，不同于SP-Am1，SP-Am2没有预致敏但是一致地抑制了LPS诱导的TNFα。
本公开进一步证实了SP-R210和CD14的相互作用。SP-R210L的破坏揭示了CD14摄取的不同机制，其调节了响应于LPS的巨噬细胞激活的阈值和持续时间。如通过单独使用中和抗体或免疫沉淀实验或中和抗体或免疫沉淀实验的组合的功能测定所揭示，我们发现SP-R210S、CD14和SR-A在SP-R210L(DN)细胞中形成促炎复合物。此外，我们展示了在对照和SP-R210L(DN)细胞中不同的CD14的运输机制，其中在加入LPS之后细胞膜上CD14的重新定位或分泌在对照细胞中是dynasore敏感的，而在SP-R210L(DN)中是dynasore不敏感的。由LPS刺激的CD14的初始内化对dynasore不敏感，与不依赖于发动蛋白的内化一致。然而，Dynasore部分抑制了LPS诱导的TNFα，仅在对照细胞中与TLR4发动蛋白依赖性内吞的抑制和由内吞TLR4的炎症应答的完全激活一致。在对照细胞中，LPS对TNFα的诱导也被标记巨胞饮抑制剂EIPA所抑制，表明CD14和/或TLR-4的巨胞饮内化是炎症应答的下游激活所需要的。然而，EIPA和dynasore对SP-R210L(DN)细胞中的LPS应答没有影响，这表明当SP-R210L表达减弱时新的炎症机制的部署。有趣的是，小GTP酶rac1的抑制减少了两种细胞中LPS激活(尽管在SP-R210L(DN)细胞中更有效)，这支持了rac1是LPS内化和信号传导的共同下游效器的概念。Rac1是介导巨胞饮的几种GTP酶之一。另一方面，rac1可能有助于SP-R210L(DN)细胞中TLR-4或SR-A下游的NFκB的激活的延长。
不受到任何具体理论的束缚，综上，本发明支持图26所示的模型。在该模型中，SP-R210L与rac1信号传导通路相互作用，以通过CD14和内吞体TLR-4的中度激活来增强巨胞饮和LPS的清除。我们提出，SP-A维持高水平的SP-R210L的能力，其增强了肺泡巨噬细胞清除LPS而没有明显炎症的能力，这提供了SP-A在体内的抗炎作用的机制性解释。反过来，SP-R210L调节天然受体的表达和定位，预致敏了在环境中在炎性剂水平增加时巨噬细胞产生适当的应答。然而，在缺乏SP-R210L介导的调节下，通过SP-R210S、CD14和SR-A之间的促炎复合物介导对LPS的应答，其中SR-A负责LPS的巨胞饮样的内化和rac-1信号传导通路的激活的延长。因此，本公开表明了SP-R210变体的差异表达决定了巨噬细胞的炎症表型。
示例20
本示例证明单克隆抗SP-R210抗体增强了流感性肺炎的康复。图28总结了数据并显示了对体重(28A)和存活(28B)的影响。为了获得数据，在用3LD50的流感病毒H1N1 PR8感染之前24小时，采用100μg抗体或100μl PBS载体对小鼠进行腹膜内注射。每天监测小鼠发病率和体重。IgG1：亚型对照抗体；P2H10：抗SP-R210S抗体；P4G4：抗SP-R210L+S抗体。每组N＝5只小鼠。如图28B所示，单克隆SP-R210抗体增强了来自流感感染的致死性攻击的存活。在用3LD50的流感病毒H1N1 PR8感染之前24小时，用100μg抗体或100μl PBS溶剂腹膜内注射小鼠。每天监测小鼠发病率和体重。IgG1：亚型对照抗体；P2H10：抗SP-R210S抗体；P4G4：抗SP-R210L+S抗体。每组N＝5只小鼠。*p<0.04
如图29所示，CD103+树突细胞中SP-R210的缺失增强了IAV感染的康复和效应器T淋巴细胞的募集。为了获得图29所示的数据，携带loxP序列的(floxed)SP-R210敲入等位基因的小鼠与Clec9A-Cre小鼠杂交以破坏CD103+DC中的SP-R210。用亚致死剂量的0.75LD50的IAV PR8对WT同窝幼畜对照和DC SP-R210缺陷小鼠进行鼻内感染。(A)随着时间监测14天体重。每个时间点每组N＝4-12只小鼠。在感染后3、7和14天，使用每组中的4只小鼠得到肺灌洗液。通过流式细胞术测定效应器T淋巴细胞数(B)和淋巴细胞总数(C)。A-C中所示的数据是平均值±SEM。
Claims (11)
1.一种单克隆抗体(mAb)或其片段，其与表面活性剂蛋白A SP-R210受体特异性结合，所述单克隆抗体(mAb)或其片段包括：
(I)可变重链序列，其包括：
a)包括序列GYIFSDYYMR(SEQ ID NO:3)的重链互补决定区1(P2H10-HCDR1)；和
b)包括序列DINPKNGDTFYNQKFKGK(SEQ ID NO:4)的重链互补决定区2(P2H10-HCDR2)；和
c)包括序列REGD(SEQ ID NO:5)的重链互补决定区3(P2H10-HCDR3)；和
可变轻链序列，其包括：
d)包括序列RSSQTILHSNGNTYLE(SEQ ID NO:6)的轻链互补决定区1(P2H10-LCDR1)；和
e)包括序列KVSKRFS(SEQ ID NO:7)的轻链互补决定区2(P2H10-LCDR2)；和
f)包括序列LQGSHVPLT(SEQ ID NO:8)的轻链互补决定区3(P2H10-LCDR3)；
或
(II)可变重链序列，其包括：
i)包括序列GYTFTDYAMH(SEQ ID NO:9)的重链互补决定区1(P4G4-HCDR1)；和
ii)包括序列VISTYNGNTKYNQKFKD(SEQ ID NO:10)的重链互补决定区2(P4G4-HCDR2)；和
iii)包括序列ARTDYDNGDYVMDY(SEQ ID NO:11)的重链互补决定区3(P4G4-HCDR3)；和
可变轻链序列，其包括：
iv)包括序列KASQDINNYLS(SEQ ID NO:12)的轻链互补决定区1(P4G4-LCDR1)；和
v)包括序列RANRLVD(SEQ ID NO:13)的轻链互补决定区2(P4G4-LCDR2)：和
vi)包含序列LQYDEFPLT(SEQ ID NO:14)的轻链互补决定区3(P4G4-LCDR3)。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其中(I)的所述单克隆抗体或其片段仅与SP-R210受体的SP-R210S亚型特异性结合，且其中(II)的所述单克隆抗体或其片段与所述SP-R210受体的SP-R210S和SP-R210L亚型特异性结合。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体或其片段是部分或完全人源化的。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其包括人IgG恒定区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体(mAb)或其片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗病毒或细菌感染，其中向有所需要的个体给药有效量的包含所述单克隆抗体或其片段的组合物。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述个体需要治疗病毒性流感感染。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述个体患有与所述病毒性流感感染相关的肺炎。
8.一种表达载体，其编码根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段。
9.一种体外细胞培养物，其中所述细胞培养物中的细胞表达根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段。
10.一种杂交瘤，其包括编码根据权利要求1所述的单克隆抗体的多核苷酸序列。
11.一种药物组合物，其包括根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段。
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