ES2865303T3

ES2865303T3 - Ligante de adrenomedulina para su uso en la terapia del cáncer

Info

Publication number: ES2865303T3
Application number: ES14830958T
Authority: ES
Inventors: Andreas Bergmann
Original assignee: Angiobiomed GmbH
Current assignee: Angiobiomed GmbH
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: US20160319007A1; JP2017508781A; EP3082858A1; JP6673847B2; EP3082858B1; WO2015092021A1; PL3082858T3; US10793626B2

Abstract

Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina que se une a la porción C-terminal de la adrenomedulina, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY, para su uso en una terapia del cáncer, en el que dicho anticuerpo IgG antiadrenomedulina es un anticuerpo de longitud completa.

Description

DESCRIPCIÓN

Ligante de adrenomedulina para su uso en la terapia del cáncer

El objeto de la presente invención es un anticuerpo IgG anti-ADM que se une a la porción C-terminal de la ADM, que es s Eq ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2, para su uso en una terapia del cáncer.

El objeto de la presente invención, en una realización, es un anticuerpo IgG anti-ADM para su uso en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo IgG anti-ADM requiere la presencia de un resto tirosina amidado C-terminal dentro de la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2, para la unión.

El péptido adrenomedulina (ADM) se describió por primera vez en 1993 (Kitamura, K., et al., "Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma", Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 192 (2), pp. 553-560 (1993)) como un nuevo péptido hipotensor que comprende 52 aminoácidos, que ha sido aislado a partir de un feocromocitoma humano (SEQ ID NO:2). En ese mismo año, también se describió un ADNc que codifica un péptido precursor que comprende 185 aminoácidos y la secuencia de aminoácidos completa de este péptido precursor. El péptido precursor, que comprende, entre otras, una secuencia señal de 21 aminoácidos en la región N-terminal, se denomina "preproadrenomedulina" (pre-proADM). En la presente descripción, todas las posiciones de aminoácidos especificadas habitualmente se refieren a la pre-proADM que comprende los 185 aminoácidos. El péptido adrenomedulina (ADM) es un péptido que comprende 52 aminoácidos (SEQ ID NO:2) y que comprende los aminoácidos 95 a 146 de la pre-proADM, a partir de la cual se forma por escisión proteolítica. Hasta la fecha, sustancialmente solo unos pocos fragmentos del péptido formado por la escisión de la pre-proADM se ha caracterizado con más exactitud, en particular los péptidos fisiológicamente activos adrenomedulina (ADM) y "PAMP", un péptido que comprende 20 aminoácidos (22-41) que siguen a los 21 aminoácidos del péptido señal en la pre-proADM. El descubrimiento y la caracterización de la ADM en 1993 disparó una intensa actividad de investigación, cuyos resultados han sido resumidos en diversos artículos de revistas y, en el contexto de la presente descripción, se remite, en particular, a los artículos que se encuentran en un número de "Peptides" dedicado a ADM en particular (editorial, Takahashi, K., "Adrenomedullin: from a pheochromocytoma to the eyes", Peptides, vol. 22, p. 1691 (2001); y Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, pp. 1693-1711 (2001). Otro artículo es Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, vol. 21(2), pp. 138-167 (2000). En las investigaciones científicas hasta la fecha, se ha descubierto, entre otras cuestiones, que la ADM puede considerarse como un péptido regulador polifuncional. Se libera hacia la circulación en una forma inactiva extendida por glicina (Kitamura, K., et al., "The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma", Biochem. Biophys. Res., Commun., vol. 244(2), pp. 551-555 (1998), solo el resumen). También existe una proteína de unión (Pio, R., et al., "Complement Factor H is a Serum-binding Protein for adrenomedullin, and the Resulting Complex Modulates the Bioactivities of Both Partners", The Journal of Biological Chemistry, vol. 276(15), pp. 12292-12300 (2001)) que es específica para la ADM y que, probablemente, modula de modo similar el efecto de la ADM. Los efectos fisiológicos de la ADM, así como del PAMP, que son de principal importancia en las investigaciones hasta la fecha, son los efectos de influir en la presión sanguínea.

Por tanto, la ADM es un vasodilatador eficaz y, por tanto, es posible asociar el efecto hipotensor con los segmentos del péptido concretos en la parte C-terminal de la ADM. También se ha descubierto que el péptido fisiológicamente activo PAMP mencionado anteriormente formado a partir de la pre-proADM muestra, de modo similar, un efecto hipotensor, aunque parece que tiene un mecanismo de acción diferente del de la ADM (cp. además de los artículos de revista mencionados anteriormente, Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, pp. 1693-1711 (2001); y Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, vol. 21(2), pp. 138-167 (2000); también Kuwasako, K., et al., "Purification and characterization of PAMP-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla as a major endogenous biologically active peptide", FEBS Lett., vol.

414(1), pp. 105-110 (1997), solo el resumen); Kuwasaki, K., et al., "Increased plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with essential hypertension", Ann. Clin. Biochem., vol. 36 (pt. 5), pp. 622-628 (1999), solo el resumen); o Tsuruda, T., et al., "Secretion of proadrenomedullin N-terminal20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells", Life Sci., vol. 69(2), pp. 239-245 (2001), solo el resumen); y el documento EP-A20622458). También se ha descubierto que las concentraciones de ADM que pueden medirse en la circulación y otros líquidos biológicos, en una serie de estados patológicos, son significativamente más altas que las concentraciones que se encuentran en personas control sanas. Por tanto, el nivel de ADM en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades renales, trastornos hipertensivos, diabetes mellitus, en la fase aguda del choque y en la sepsis y el choque séptico, es significativamente más alto, aunque en diferentes grados. Las concentraciones de PAMP también son más altas en algunos de dichos estados patológicos, pero los niveles en plasma son menores con relación a la ADM (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, pp.

1693-1711 (2001), p. 1702). También se sabe que se han observado unas concentraciones inusualmente elevadas de ADM en la sepsis, y las concentraciones más altas en el choque séptico (cp., Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, pp. 1693-1711 (2001); y Hirata, et al., "Increased Circulating Adrenomedullin, a Novel Vasodilatory Peptide, in Sepsis", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 81(4), pp. 1449-1453 (1996); Ehlenz, K., et al., "High levels of circulating adrenomedullin in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence against the adrenal medulla as site of origin", Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, vol. 105, pp. 156-162 (1997); Tomoda, Y., et al., "Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells", Peptides, vol. 22, pp. 1783-1794 (2001); Ueda, S., et al., "Increased Plasma Levels of Adrenomedullin in Patients with Systemic Inflammatory Response Syndrome", Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 160, pp. 132-136 (1999); y Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, vol. 22, pp. 1835-1840 (2001)).

También se conoce en la técnica un método para identificar la inmunorreactividad de la adrenomedulina en líquidos biológicos para fines de diagnóstico y, en particular, dentro del alcance del diagnóstico de la sepsis, el diagnóstico cardíaco y el diagnóstico del cáncer. Según el documento WO2004/090546, se mide el péptido parcial mediorregional de la proadrenomedulina, que contiene aminoácidos (45-92) de la preproadrenomedulina completa, en particular con un inmunoensayo que funciona con al menos un anticuerpo marcado que reconoce específicamente una secuencia de la med-proADM (documento WO2004/090546).

El documento WO-A1 2004/097423 describe el uso de un anticuerpo contra la adrenomedulina para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de trastornos cardiovasculares. En la técnica también se describe el tratamiento de enfermedades mediante el bloqueo del receptor de ADM (por ejemplo, documentos WO-A1 2006/027147, PCT/EP2005/012844) y dichas enfermedades pueden ser sepsis, choque séptico, enfermedades cardiovasculares, infecciones, enfermedades dermatológicas, enfermedades endocrinológicas, enfermedades metabólicas, enfermedades gastroenterológicas, cáncer, inflamación, enfermedades hematológicas, enfermedades respiratorias, enfermedades del músculo esquelético, enfermedades neurológicas, enfermedades urológicas.

El documento WO2013/072513 describe un anticuerpo monoclonal CT-H generado contra la ADM 42-52 amidada. Se han descrito varias posibilidades para modular el sistema de señalización de ADM para reprimir el crecimiento de células tumorales, que incluyen el uso de un péptido (ADM 22-52) [1] y antagonistas del receptor de ADM de molécula pequeña [2], así como anticuerpos dirigidos contra el receptor de ADM [3] o la ADM [4]. Con más detalle, el uso de anticuerpos anti-ADM se ha descrito como sigue: Se ha descrito que la neutralización de la adrenomedulina con anticuerpos anti-ADM 1-52 policlonales inhibe el crecimiento de líneas celulares de glioblastoma humano in vitro y reprime el crecimiento de tumores de xenoinjerto in vivo [5]. Los anticuerpos usados muestran reactividad total solo contra la ADM 1-52 de longitud completa, mientras que fue marcadamente reducida contra los variantes del péptido ADM truncados en el N-terminal.

Se demostró que un anticuerpo anti-ADM monoclonal (MoAb-G6) reprimía el crecimiento de varias líneas celulares tumorales (NCI-H157, NCI-H720, MCF-7, NIH: OVCAR-3) en 30-50 %, cuando se aplica a 100 pg/mL [6]. MoAb-G6 es un anticuerpo de tipo IgA desarrollado mediante inmunización con un péptido de pre-proADM 116-146 (T-V-Q-K-L-A-H-Q-I-Y-Q-F-T-D-K-D-K-D-N-V-A-P-R-S-K-I-S-P-Q-G-Y-NH2 (SEQ ID No: 3)) (también denominado PO72) [7]. El epítopo preciso del anticuerpo monoclonal MoAb-G6 no se conoce.

Se indicó que el anticuerpo monoclonal MoAb-G6 neutralizaba la bioactividad de la ADM (patente de EE. UU.

7939639) y se demostró que inhibía completamente la unión de ADM a su receptor. El documento WO2006/027147 describe estrategias para tratar el cáncer con ligantes (que incluyen anticuerpos) del receptor de ADM.

El anticuerpo IgG anti-ADM que se une a la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2, muestra propiedades favorables en comparación con anticuerpos conocidos para tratar el cáncer. El anticuerpo IgG anti-ADM que se une a la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2, tiene una mayor capacidad para reducir significativamente el crecimiento de tumores, en comparación con anticuerpos de ADM conocidos.

Este anticuerpo puede seleccionarse del grupo que comprende: CT-H, CT-H-1, CT-H-2, CT-H-3, CT-H-Gly, CT-H-OH (tabla 3), que se describen a continuación:

• Los anticuerpos del grupo CT-H, CT-H-1, CT-H-2, CT-H-3 se definen como un anticuerpo anti-ADM que se une a la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1, y se unen a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4) y se unen en condiciones comparables a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGYG-OH (SEQ ID NO:5) en menos del 20 %, preferiblemente en menos del 10 %, más preferiblemente en menos del 5 %, y lo más preferiblemente en menos del 1 %, en comparación con la unión a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4).

• El anticuerpo CT-H-Gly se define como un anticuerpo anti-ADM que se une a la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1, y se une a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4), y se une en condiciones comparables a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGYG-OH (SEQ ^{i D} NO:5) en más del 100 %, preferiblemente en más del 200 %, más preferiblemente en más del 300 %, y lo más preferiblemente en más del 400 %, en comparación con la unión a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4).

• El anticuerpo CT-H-OH se define como un anticuerpo anti-ADM que se une a la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1, y se une a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4), y se une en condiciones comparables a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-OH (SEQ ID ^{N o : 4 )} en más del 500 %, preferiblemente en más del 1000 %, más preferiblemente en más del 1500 %, y lo más preferiblemente en más del 2500 %, en comparación con la unión a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4).

ADM, a lo largo de la memoria descriptiva, significa adrenomedulina. A lo largo de la memoria descriptiva, los "anticuerpos" según la invención son capaces de unirse a ADM y, por tanto, se dirigen contra ADM y, por tanto, pueden denominarse "anticuerpos anti-ADM".

En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-ADM proporcionados por la invención son capaces de unirse a ADM circulante y, por tanto, se dirigen contra ADM circulante.

El anticuerpo IgG antiadrenomedulina (ADM) es un anticuerpo que se une específicamente a la ADM. La unión específica a la ADM permite también la unión a otros antígenos. Esto significa que esta especificidad no excluye que el anticuerpo pueda presentar reacción cruzada con otros polipéptidos distintos al polipéptido contra el cual ha sido generado.

El objeto de la presente invención, en una realización, es un anticuerpo IgG anti-ADM para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que dicho anticuerpo anti-ADM requiere la presencia de un resto tirosina amidado C-terminal dentro de la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2, para la unión.

Un anticuerpo que requiere la presencia de un resto tirosina amidado C-terminal dentro de la porción C-terminal de la ADM, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2, para la unión, se define como sigue: Es un anticuerpo que se une a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4), y que se une en condiciones comparables a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGYG-OH (SEQ ID NO:5) en menos del 20 %, preferiblemente en menos del 10 %, más preferiblemente en menos del 5 %, y lo más preferiblemente en menos del 1 %, en comparación con la unión a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4).

En otras palabras, el objeto de la presente invención, en una realización, es un anticuerpo IgG anti-ADM para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que dicho anticuerpo anti-ADM se une a un resto tirosina amidado C-terminal dentro de la porción C-terminal de la ADM, que es ^{s E q} ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2, y se une en condiciones comparables a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGYG-OH (SEQ ID NO:5) en menos del 20 %, preferiblemente en menos del 10 %, más preferiblemente en menos del 5 %, y lo más preferiblemente en menos del 1 %, en comparación con la unión a biotina-FTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:4). Unas condiciones comparables significan el uso del mismo ensayo de unión, y dicho ensayo se describe en el ejemplo 1.

Un anticuerpo que requiere la presencia de un resto tirosina amidado C-terminal dentro de la porción C-terminal de la ADM puede desarrollarse mediante la inmunización con un antígeno que contiene una porción C-terminal de la ADM que incluye el resto tirosina amidado C-terminal libre de la ADM (posición 52 de la ADM). Después de dicha inmunización, un anticuerpo que requiere la presencia de un resto tirosina amidado C-terminal dentro de la porción C-terminal de la ADM puede seleccionarse de este proceso de inmunización ensayando su unión a la porción C-terminal de la ADM que incluye el resto tirosina amidado C-terminal libre de la ADM (posición 52 de la ADM) y a péptidos relacionados (en el caso del desarrollo de anticuerpos monoclonales, se ensayarían los anticuerpos segregados desde las respectivas líneas celulares de hibridoma): Este anticuerpo debe unirse a la porción C-terminal de la ADM que incluye el resto tirosina amidado C-terminal libre, pero no la porción C-terminal de la ADM que contiene el resto tirosina C-terminal (posición 52 de la ADM), que, en el C-terminal, tiene un grupo COOH en lugar de un grupo amida. Tampoco debe unirse a la porción C-terminal de la ADM desprovista de al menos el resto tirosina C-terminal (posición 52 de la ADM).

Se ha indicado que las concentraciones en plasma de la adrenomedulina biológicamente activa amidada en el C-terminal son aproximadamente 5 veces más bajas que el variante de adrenomedulina biológicamente inactivo extendido con glicina en el N-terminal (Kitamura K., Kato J., Kawamoto M., Tanaka M., Chino N., Kangawa K., Eto T., The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma, Biochemical and biophysical research communications, 1998, 244:551-5). En consecuencia, puede aplicarse un anticuerpo que se une específicamente a la adrenomedulina biológicamente activa amidada en el C-terminal, pero fundamentalmente no al variante de adrenomedulina biológicamente inactivo extendido con glicina en el N-terminal en una dosis al menos aproximadamente 5 veces menor, en comparación con un anticuerpo sin esta especificidad de unión diferencial, para lograr la misma unión a la adrenomedulina biológicamente activa amidada en el C-terminal in vivo. Además, un anticuerpo sin especificidad de unión por la región C-terminal amidada también podría unirse a la pro- o preproadrenomedulina y ser consumido por esta unión a una tasa elevada impredecible. Por tanto, se prevé que un anticuerpo con especificidad de unión por la región C-terminal amidada sea aplicable a una dosis aún menor de 5 veces, en comparación con un anticuerpo sin esta especificidad de unión diferencial, para lograr la misma unión a la adrenomedulina biológicamente activa amidada en el C-terminal in vivo. La aplicación de un compuesto terapéutico a una dosis menor se asocia con menos efectos secundarios y también es más barata.

La ADM se expresa en una diversidad de tumores, en donde agrava varias de las características moleculares y fisiológicas de las células malignas. Se ha demostrado que la ADM es un factor mitogénico que estimula el crecimiento en varios tipos de cánceres y promueve un fenotipo de tumor más agresivo. Además, la ADM es un factor de supervivencia a la apoptosis para las células de cáncer y un supresor indirecto de la respuesta inmunitaria. La ADM desempeña un papel importante en los entornos sometidos a bajas tensiones de oxígeno, lo cual es una característica típica en la proximidad de tumores sólidos. En estas condiciones, la ADM se sobrerregula a través de una vía dependiente del factor inducible por hipoxia 1 ("hypoxia-inducible factor 1", HIF-1) y actúa como un potente factor angiogénico que estimula la neovascularización [8, 9].

En una realización específica de la presente invención, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que comprende: cáncer de próstata, mama, colon, pulmón, vejiga, piel, útero, cérvix, cavidad oral y faringe, estómago, ovarios, riñón, páncreas, linfoma no hodgkiniano, leucemia, hígado, esófago, testículo, tiroides, sistema nervioso central, laringe, vesícula biliar, plasmocitoma, y enfermedad de Hodgkin.

En otra realización específica de la presente invención, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que comprende: cáncer de próstata, mama, colon, pulmón, vejiga, piel, útero, cérvix, riñón, páncreas, cavidad oral y faringe, estómago, y ovarios.

En una realización específica, dicho cáncer que se va a tratar es un cáncer positivo a K-RAS. Las proteínas RAS son pequeñas enzimas GTPasas que transmiten señales dentro de las células. Son fundamentales para las células por el papel crucial que desempeñan en el crecimiento y la supervivencia de las células. Uno de estos genes, K-RAS, que se descubrió hace casi 30 años, está mutado en 30 % de los tumores humanos, incluyendo 90 % de cánceres pancreáticos, 40 % de cánceres de colon, y 20 % de cánceres de pulmón no microcíticos. Las mutaciones de K-RAS activadoras son las mutaciones oncogénicas más frecuentes en el cáncer humano. Los cánceres con mutaciones de K-RAS son agresivos y responden mal a las terapias convencionales. La activación constitutiva de K-RAS y la estimulación persistente de vías de señalización corriente abajo son responsables de muchos de los rasgos distintivos del cáncer, la proliferación sostenida, la reprogramación metabólica, la antiapoptosis, la remodelación del microentorno del tumor, la evasión de la respuesta inmunitaria, la migración de células y la metástasis (Pylayeva-Gupta et al., 2011, RAS oncogenes: weaving a tumorigenic web, Nat. Rev. Cancer, 11:761-774). En la práctica clínica, la mutación de K-RAS define un subconjunto de pacientes para los cuales el pronóstico es, en general, malo, y las opciones de tratamiento son limitadas. No existen fármacos que se dirijan a las proteínas de RAS directa o indirectamente y tampoco hay terapias eficaces para los cánceres dirigidos por RAS. Por tanto, los cánceres de RAS y K-RAS están excluidos del tratamiento con terapias dirigidas.

Una única sustitución de aminoácido y, en particular, una única sustitución de un nucleótido en el gen K-RAS, es responsable de una mutación activadora. La mayoría de las mutaciones de K-RAS aparecen en el codón 12 o 13 del gen. Se han desarrollado una diversidad de métodos de laboratorio para evaluar el estado de mutación del gen K-RAS. Muchos de estos métodos, que incluyen PCR específica de alelo, métodos de PCR a tiempo real con análisis de curva de fusión, y técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos, proporcionan el rendimiento analítico apropiado para incluir la heterogeneidad de tejidos en las muestras de tumores, según se describe en Anderson S.M., Laboratory methods for K-RAS mutation analysis, Expert Rev. Mol. Diagn., julio de 2011, 11(6):635-42. El criterio de referencia actual para el ensayo de K-RAS sigue siendo la secuenciación directa de productos de amplificación de PCR (Nollau P., Wagener C., Methods for detection of point mutations: performance and quality assessment, IFCC Scientific Division, Committee on Molecular Biology Techniques, Clin. Chem., 1997, 43:1114-1128).

La adrenomedulina (ADM) fue identificada por Wang et al. (2014) [ Wang L., Gala M., Yamamoto M., Pino M.S., Kikuchi H., Shue D.S., Shirasawa S., Austin T.R., Lynch M.P., Rueda B.R., Zukerberg L.R., Chung D.C., Adrenomedullin is a therapeutic target in colorectal cancer, Int. J. Cancer, 134, 2041-2050 (2014)] como uno de los genes más significativamente sobrerregulados en las líneas de cáncer de colon humano que expresan el oncogén K-RAS, en particular en condiciones hipóxicas, tal como aparecen en los tumores sólidos. La inactivación in vivo de ADM mediante ARN de horquilla corto (ARNhc) dirigido a diversas regiones codificadoras de la ADM en xenoinjertos de tumor de colon bloqueó la angiogénesis y estimuló la apoptosis, dando como resultado la represión del tumor. Entre 56 pacientes con CRC, se observó unos niveles de expresión significativamente mayores de ADM en las muestras que contenían una mutación de K-RAS. Se sugiere que un KRAS mutante puede desempeñar un papel específico en la supervivencia del tumor en entornos hipóxicos y que actúa de modo sinérgico para sobrerregular la a Dm . En conjunto, la activación potenciada de la ADM por un K-RAS mutante puede desempeñar un papel crucial en la adaptación de los tumores de colon a condiciones de estrés hipóxico.

El anticuerpo IgG anti-ADM según la presente invención muestra una afinidad hacia la ADM humana de modo que la constante de afinidad es menor que 10'7 M, preferiblemente 10'8 M, preferiblemente una constante de afinidad menor que 10'9 M, y lo más preferiblemente menor que 10'10 M. Los expertos en la técnica saben que puede considerarse compensar una afinidad baja mediante la aplicación de una dosis más alta de compuestos, y esta medida no estaría fuera del alcance de la invención. Las constantes de afinidad pueden determinarse según el método descrito en el ejemplo 1.

Un anticuerpo según la presente invención es una proteína que incluye uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina, que se une específicamente a un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa (IgA), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta (IgD), épsilon (IgE) y mu (IgM), así como la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de longitud completa en general tienen una longitud de aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud completa en general tienen una longitud de aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos. Las cadenas ligeras son codificadas por un gen de la región variable en la región NH2-terminal (con una longitud de aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en la región COOH-terminal. De modo similar, las cadenas pesadas son codificadas por un gen de la región variable (con una longitud de aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante.

La unidad estructural básica de un anticuerpo, en general, es un tetrámero que consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, y cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada se unen a un antígeno, y las regiones constantes median en funciones efectoras. Las inmunoglobulinas también existen en una diversidad de otras formas que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab')2, así como anticuerpos híbridos bifuncionales y monocatenarios (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol., 17:105,1987; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988; Bird et al., Science, 242:423-426, 1988; Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2a ed., 1984; Hunkapiller y Hood, Nature, 323:15-16,1986). Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina incluye una región de marco interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) (véase, Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Tal como se indicó anteriormente, las CDR son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Un complejo inmunitario es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano, o un fragmento de anticuerpo funcional, específicamente unido al antígeno.

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada han sido construidos, generalmente mediante ingeniería genética, a partir de genes de la región variable y constante de inmunoglobulinas que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes procedentes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos, tales como kappa y gamma 1 o gamma 3. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico terapéutico es, por tanto, una proteína híbrida compuesta por el dominio variable o de unión al antígeno procedente de un anticuerpo de ratón y el dominio constante o efector procedente de un anticuerpo humano, aunque pueden usarse otras especies de mamífero, o la región variable puede producirse mediante técnicas moleculares. Los métodos para fabricar anticuerpos quiméricos son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, véase, la patente de ^{E e .} UU. n.° 5.807.715. Una inmunoglobulina "humanizada" es una inmunoglobulina que incluye una región de marco humana y una o más CDR procedentes de una inmunoglobulina no humana (tal como de ratón, rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptor". En una realización, todas las CDR proceden de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que estén presentes regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humanas, es decir, al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente 95 % o más idénticas. Por tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto probablemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las correspondientes partes de las secuencias de inmunoglobulina humanas naturales. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco del aceptor de un anticuerpo o inmunoglobulina humana puede tener un número limitado de sustituciones por aminoácidos extraídos del marco del donante. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas adicionales, que sustancialmente no produzcan efectos sobre la unión al antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina. Los ejemplos de sustituciones conservativas son gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden construirse mediante ingeniería genética (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.585.089). Un anticuerpo humano es un anticuerpo en el que los genes de cadena ligera y pesada tienen un origen humano. Los anticuerpos humanos pueden generarse usando métodos conocidos en la técnica. Pueden producirse anticuerpos humanos inmortalizando una célula B humana que segrega el anticuerpo de interés. La inmortalización puede lograrse, por ejemplo, mediante una infección con EBV o condensando una célula B humana con una célula de mieloma o hibridoma para producir una célula de trioma. Los anticuerpos humanos también pueden producirse mediante métodos de presentación sobre fagos (véase, por ejemplo, Dower et al., publicación PCT n.° WO91/17271; McCafferty et al., publicación PCT n.° WO92/001047; y Winter, publicación PCT n.° WO92/20791), o pueden seleccionarse de un banco de anticuerpos monoclonales combinatorio humano (véase el sitio web de Morphosys). Los anticuerpos humanos también pueden prepararse usando animales transgénicos que portan un gen de inmunoglobulina humana (por ejemplo, véase Lonberg et al., publicación PCT n.° WO93/12227; y Kucherlapati, publicación PCT n.° WO91/10741).

Por tanto, el anticuerpo IgG anti-ADM puede tener los formatos conocidos en la técnica. Los ejemplos son anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR. En una realización preferida, los anticuerpos según la presente invención son anticuerpos producidos de modo recombinante, por ejemplo, como una IgG, una inmunoglobulina de longitud completa típica. Además de los anticuerpos anti-ADM, en la técnica son conocidos otros andamiajes de biopolímeros para complejar una molécula diana, y estos se han usado para la generación de biopolímeros muy específicos de diana. Los ejemplos son aptámeros, spiegelmeros, anticalinas y conotoxinas. Los aptámeros son ácidos de oligonucleótidos o moléculas de péptidos que se unen a una molécula diana específica. Un spiegelmero es una molécula similar a ARN construida a partir de unidades de L-ribosa que se une a una molécula diana específica. Las anticalinas son proteínas artificiales que se unen a una molécula diana específica. Se derivan de lipocalinas humanas, que son una familia de proteínas de unión naturales. Se están utilizando anticalinas en lugar de anticuerpos monoclonales, pero son aproximadamente ocho veces más pequeñas, con un tamaño de aproximadamente 180 aminoácidos y una masa de aproximadamente 20 kDa (Gebauer M., Skerra A., Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics, Current opinion in chemical biology, 2009, 13(3):245-255; Wurch T., Pierre A., Depil S., Novel protein scaffolds as emerging therapeutic proteins: from discovery to clinical proof-of-concept, Trends in biotechnology, 2012, 30(11):575-582; Skerra A. (junio de 2008), "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities", FEBS J., 275 (11): 2677 83).

Los andamiajes que no son Ig pueden ser andamiajes de proteínas o andamiajes de péptidos, y pueden usarse como imitaciones de anticuerpos que son capaces de unirse a ligandos o antígenos. Los andamiajes que no son Ig pueden seleccionarse del grupo que comprende andamiajes que no son Ig basados en tetranectina (por ejemplo, descritos en el documento US 2010/0028995), andamiajes de fibronectina (por ejemplo, descritos en el documento EP 1266 025); andamiajes basados en lipocalina (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/154420); andamiajes de ubiquitina (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/073214), andamiajes de transferrina (por ejemplo, descritos en el documento US 2004/0023334), andamiajes de proteína A (por ejemplo, descritos en el documento EP 2231860), andamiajes basados en repeticiones de anquirina (por ejemplo, descritos en el documento WO 2010/060748), andamiajes de microproteínas, preferiblemente microproteínas que forman un nudo de cistina (por ejemplo, descritos en el documento EP 2314308), andamiajes basados en el dominio SH3 de Fyn (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/023685), andamiajes basados en el dominio EGFR-A (por ejemplo, descritos en el documento WO 2005/040229) y andamiajes basados en el dominio Kunitz (por ejemplo, descritos en el documento EP 1941867).

Además, en una realización de la invención, un anticuerpo IgG antiadrenomedulina (ADM) es monoespecífico. Un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico significa que dicho anticuerpo se a una región específica que incluye preferiblemente al menos 4 o al menos 5 aminoácidos dentro de la ADM diana. Los anticuerpos antiadrenomedulina (ADM) monoespecíficos son anticuerpos antiadrenomedulina (ADM) que tienen todos afinidad por el mismo antígeno. En otra realización especial, el anticuerpo anti-ADM que se une a la ADM es un anticuerpo monoespecífico. Monoespecífico significa que dicho anticuerpo se une a una región específica que incluye preferiblemente al menos 4 o al menos 5 aminoácidos dentro de la ADM diana. Los anticuerpos monoespecíficos tienen todos afinidad por el mismo antígeno. Los anticuerpos monoclonales son monoespecíficos, pero también pueden producirse anticuerpos monoespecíficos por otros medios que su producción a partir de una célula germinal común.

En una realización específica de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una realización de la invención, el anticuerpo anti-ADM es un anticuerpo humano o humanizado o derivado de estos. En una realización específica, una o más CDR (murinas) se injertan en un anticuerpo humano.

En una realización preferida de la invención, los anticuerpos según la presente invención pueden producirse como sigue:

Se inmunizaron ratones Balb/c con 100 pg de conjugado de péptido-BSA (véase la tabla 1) en el día 0 y 14 (emulsionados en 100 pl de adyuvante de Freund completo) y con 50 pg en el día 21 y 28 (en 100 pl de adyuvante de Freund incompleto). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 pg del conjugado disuelto en 100 pl de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.

Se fusionaron esplenocitos procedentes de los ratones inmunizados y células de la línea celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50 % durante 30 s a 37 °C. Después de un lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se seleccionaron los clones híbridos mediante su cultivo en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 20 % y suplemento HAT]. Después de dos semanas, el medio HAT se reemplazó por medio HT durante tres transferencias, seguido de la vuelta al medio de cultivo celular normal.

Los sobrenadantes del cultivo celular se seleccionaron principalmente para anticuerpos IgG específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. El criterio para seleccionar la línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo CT-H fue una unión positiva frente al péptido APRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:1), pero una unión negativa frente al péptido APRSKISPQGY-COOH (SEQ ID NO:1).

Los microcultivos con resultado positivo se trasladaron a placas de 24 pocillos para la propagación. Después de volver a ensayar, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron usando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos (Lane, R.D., "A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth., 81:223-228; (1985); Ziegler, B. et al., "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res., 28:11-15 (1996)).

Pueden producirse anticuerpos mediante la presentación sobre fagos según el siguiente procedimiento: Se usaron los bancos de genes de anticuerpos no expuestos humanos HAL7/8 para el aislamiento de dominios de F variable monocatenario recombinantes (scFv) contra el péptido adrenomedulina. Los bancos de genes de anticuerpos se seleccionaron con una estrategia de inmunoadsorción ("panning") que comprende el uso de péptidos que contienen un marcador de biotina a través de dos espaciadores diferentes para la secuencia del péptido adrenomedulina. Se usó una mezcla de rondas de inmunoadsorción empleando antígeno no unido específicamente y antígeno unido a estreptavidina para minimizar el fondo de los ligantes no específicos. Los fagos eluidos de la tercera ronda de inmunoadsorción se usaron para la generación de cepas de E. coli que expresan scFv monocatenarios. El sobrenadante del cultivo de estas cepas clonales se usó directamente para un ensayo de ELISA de antígeno (véase también Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011, A human scFv antibody generation pipeline for proteome research, Journal of Biotechnology, 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.,Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009, Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus, PloS One 4, e6625).

La humanización de anticuerpos murinos puede realizarse según el siguiente procedimiento: Para la humanización de un anticuerpo de origen murino, la secuencia del anticuerpo se modela para la interacción estructural de regiones de marco ("framework regions", FR) con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y el antígeno. Basándose en el modelaje estructural, se selecciona una FR de origen humano apropiada, y las secuencias de CDR murinas se trasplantan en la FR humana. Pueden introducirse variaciones en la secuencia de aminoácidos de las CDR o FR para recuperar interacciones estructurales que fueron abolidas por el cambio de especie para las secuencias de the FR. Esta recuperación de las interacciones estructurales puede lograrse mediante una estrategia aleatoria que emplea bancos de presentación sobre fagos, o a través de una estrategia directa guiada por el modelaje molecular (Almagro J.C., Fransson J., 2008, Humanization of antibodies, Front Biosci., 1 de enero de 2008, 13:1619-33).

Uno de los formatos más preferidos es un anticuerpo humanizado.

En otra realización preferida, el anticuerpo IgG anti-ADM es un anticuerpo de longitud completa.

En una realización preferida, el anticuerpo IgG antiadrenomedulina se dirige contra un epítopo, y puede unirse a él, que tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos contenidos en la ADM.

En una realización específica, el anticuerpo IgG antiadrenomedulina se dirige contra un epítopo, y puede unirse a él, que tiene una longitud de al menos 4 aminoácidos contenidos en la ADM.

En una realización específica, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en el que dicho anticuerpo no es la proteína 1 de unión a la ADM (factor del complemento H).

En una realización específica, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en el que dicho anticuerpo se une a una región de al menos 4 o al menos 5 aminoácidos dentro de la secuencia, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY-NH2.

En una realización específica, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleado en combinación con otros medicamentos para el cáncer. En una realización específica, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleado en combinación con agentes citostáticos, inhibidores de CD, inhibidores de EGFR, inhibidores de VEGFR, inhibidores de TNFR o inhibidores de tirosina quinasas. En otra realización, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para ser usado de modo monoterapéutico.

Los agentes citostáticos son agentes quimioterapéuticos y son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden seleccionarse del grupo que comprende los siguientes: abiraterona, afatinib, alitretinoína, anastrozol, bazedoxifeno, bevacizumab, bicalutamid, bleomicina, capecitabina, carboplatino, cetuximab, cisplatino, clomifeno, crizotinib, ciclofosfamida, ciproterona, dabrafenib, dacarbazina, dasatinib, docetaxel, doxorubicina, enzalutamid, epirubicina, eribulina, erlotinib, etopósido, exemestano, filgrastimo, fludarabina, fluorouracilo, fulvestrant, gefitinib, gemcitabina, hidroxicarbamida, ifosfamida, imatinib, ipilimumab, irinotecano, lapatinib, lenalidomida, letrozol, metotrexato, mitomicina, nilotinib, obinutuzumab, ofatumumab, oxaliplatino, paclitaxel, panitumumab, permetrexed, pertuzumab, pomalidomida, ponatinib, raloxifeno, regorafenib, tamoxifeno, temozolomida, trastuzumab, vemurafenib, vinblastina, vinflunina, vinorelbina, vismodegib.

En una realización, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleado en combinación con inhibidores de CD, en el que dichos inhibidores de CD se seleccionan del grupo que comprende afutuzumab, alemtuzumab, aivatuzumab mertansina, blinatumomab, brentuximab vedotina, dacetuzumab, epratuzumab, galiximab, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetano, inotuzumab ozogamicina, intetumumab, iratumumab, lintuzumab, lorvotuzumab mertansina, lucatumumab, lumiliximab, milatuzumab, moxetumomab pasudotox, ocaratuzumab, ofatumumab, ituximab, samalizumab, taplitumomab paptox, teprotumumab, tositumomab (Bexxar), veltuzumab y vorsetuzumab mafodotina.

En una realización, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleado en combinación con inhibidores de EGFR, en el que dichos inhibidores de EGFR se seleccionan del grupo que comprende cetuximab, ertumaxomab, imgatuzumab, matuzumab, necitumumab, nimotuzumab, panitumumab, patritumab, pertuzumab, trastuzumab, zalutumumab y zatuximab.

En una realización, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleado en combinación con inhibidores de VEGFR, en el que dichos inhibidores de VEGFR se seleccionan del grupo que comprende alacizumab pegol, icrucumab y ramucirumab.

En una realización, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en el que dichos inhibidores de TNFR se seleccionan del grupo que comprende conatumumab, lexatumumab, mapatumumab y tigatuzumab.

En una realización específica, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleado en combinación con un agente seleccionado del grupo que comprende brentuximab vedotina, cetuximab, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetano, ofatumumab, panitumumab, pertuzumab, rituximab, tositumomab (Bexxar) y trastuzumab.

En otra realización preferida, dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleado en combinación con un agente seleccionado del grupo que comprende alemtuzumab, bevacizumab, brentuximab, catumaxomab, cetuximab, ibritumomab-tiuxetano, ofatumumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab. El objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo IgG anti-ADM según la invención, es decir, según las realizaciones mencionadas en la presente. El objeto de la presente invención es dicha composición farmacéutica para ser usada como monoterapia.

El objeto de la presente invención, en una realización, es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleada en combinación con agentes citostáticos, inhibidores de CD, inhibidores de EGFR, inhibidores de VEGFR, inhibidores de TNFR o inhibidores de tirosina quinasas.

Los agentes citostáticos, inhibidores de CD, inhibidores de EGFR, inhibidores de VEGFR, inhibidores de TNFR o inhibidores de tirosina quinasas pueden seleccionarse de los descritos anteriormente.

En una realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un cáncer, para ser empleada en combinación con alemtuzumab, bevacizumab, brentuximab, catumaxomab, cetuximab, ibritumomab-tiuxetano, ofatumumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab.

El objeto de la presente invención, en una realización, es una composición farmacéutica como se describió anteriormente, para su uso en el tratamiento de un cáncer, en la que dicha composición farmacéutica puede administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa.

Dicho anticuerpo IgG anti-ADM es para la administración a una dosis que produzca un exceso molar frente a la concentración de ADM circulante. Esta puede estar en el intervalo de 0,1-10 mg/kg. Para mantener el intervalo de concentración deseado a lo largo del tiempo, la aplicación puede repetirse a intervalos que dependen de su semivida in vivo. Estos intervalos pueden ser de entre 2 y 7 días. Dicho anticuerpo IgG anti-ADM se formula preferiblemente como una disolución con una base de disolución salina y preferiblemente es para su aplicación como una infusión o inyección en embolada por vía intravenosa.

Conceptualmente, se prevé que los pacientes con cáncer que sobreexpresan ADM y/o el receptor de ADM en sus tumores sean los más beneficiados por el tratamiento con dicho anticuerpo IgG anti-ADM. Por tanto, los pacientes pueden estratificarse determinando el nivel de expresión de ADM y/o del receptor de ADM a partir de biopsias tumorales.

Figura 1

Aumento del volumen tumoral a lo largo del tiempo dependiente del tratamiento con compuestos. Los compuestos investigados fueron NT-H (anticuerpo monoclonal generado contra el resto N-terminal de la adrenomedulina humana), MR-H (anticuerpo monoclonal generado contra el resto mediorregional de la adrenomedulina humana), CT-H (anticuerpo monoclonal generado contra el resto C-terminal de la adrenomedulina humana) y Con (anticuerpo control no específico). La reducción del crecimiento tumoral fue significativa para CT-H (p = 0,038); para NT-H y MR-H se produjo una tendencia hacia la eficacia, pero el efecto no fue estadísticamente significativo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación y caracterización de anticuerpos

Se produjeron varios anticuerpos monoclonales contra diferentes restos de adrenomedulina y se determinaron sus constantes de afinidad.

Los anticuerpos se generaron según el siguiente método: Se inmunizaron ratones Balb/c con 100 pg de conjugado de péptido-BSA (véase la tabla 1) en el día 0 y 14 (emulsionados en 100 pl de adyuvante de Freund completo) y con 50 pg en el día 21 y 28 (en 100 pl de adyuvante de Freund incompleto). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 pg del conjugado disuelto en 100 pl de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.

Se fusionaron esplenocitos procedentes de los ratones inmunizados y células de la línea celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50 % durante 30 s a 37 °C. Después de un lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se seleccionaron los clones híbridos mediante su cultivo en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 20 % y suplemento HAT]. Después de dos semanas, el medio HAT se reemplaza por medio HT durante tres transferencias, seguido de la vuelta al medio de cultivo celular normal.

Los microcultivos con resultado positivo se trasladaron a placas de 24 pocillos para la propagación. Después de volver a ensayar, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron usando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos (Lane, R.D., "A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth., 81:223-228; (1985); Ziegler, B. et al., "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res., 28:11-15, (1996)).

Producción de anticuerpos monoclonales

Se produjeron anticuerpos mediante métodos de producción de anticuerpos convencionales (Marx et al., Monoclonal Antibody Production, ATLA, 25, 121, 1997) y se purificaron mediante proteína A. Las purezas de los anticuerpos fueron > 95 % basándose en un análisis de electroforesis en gel de SDS.

Constantes de afinidad

Para determinar la afinidad de los anticuerpos por la adrenomedulina, se determinó la cinética de unión de la adrenomedulina a anticuerpos inmovilizados mediante resonancia de plasmón de superficie sin marcador usando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Friburgo, Alemania). Se realizó una inmovilización reversible de los anticuerpos usando un anticuerpo anti-Fc de ratón unido covalentemente en alta densidad a una superficie detectora CM5 según las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de ratón; GE Healthcare) (Lorenz et al.," Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy", Antimicrob Agents Chemother, enero de 2011, 55(1 ):165-173).

Los anticuerpos monoclonales se generaron contra las regiones de la ADM humana mostradas a continuación. La siguiente tabla 1 representa una selección de los anticuerpos obtenidos usados en posteriores experimentos.

Tabla 1: Antígenos/inmunógenos relacionados con la adrenomedulina y anticuerpos desarrollados contra ellos. Cartografiado de epítopos del anticuerpo CT-H

Se sintetizaron varios péptidos relacionados con la región C-terminal de la ADM (tabla 2).

Tabla 2: Cartografiado de epítopos de CT-H: Se muestran los péptidos relacionados con la adrenomedulina. La unión de CT-H a cada péptido se expresa como el porcentaje de unión observado en comparación con la unión obtenida frente al péptido P 33-52 NH2.

Procedimiento de marcaje

Se mezclaron 100 ug (100 ul) del anticuerpo CT-H (1 mg/ ml en PBS, pH 7,4) con 10 ul de NHS-éster de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. El CT-H marcado se purificó mediante HPLC de filtración en gel en Bio-Sil® SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE. UU.). El anticuerpo marcado purificado se diluyó en fosfato de potasio 300 mmol/L, NaCl 100 mmol/L, Na-EDTA 10 mmol/L, albúmina de suero bovina 5 g/L, pH 7,0. La concentración final fue de aproximadamente 800.000 unidades de luz relativas (RLU) del anticuerpo marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 300 pL. Se midió la quimioluminiscencia del éster de acridinio usando un AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Fase sólida

Se revistieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con estreptavidina (1,5 pg /0,3 mL de NaCl 100 mmol/L, TRIS/HCl 50 mmol/L, pH 7,8). La disolución de revestimiento se aspiró y los tubos se bloquearon añadiendo Karion FP al 3 %, albúmina de suero bovina al 0,5 % y se incubó durante una hora. La disolución de bloqueo se rechazó. Los péptidos listados en la tabla 2 se disolvieron en fosfato de potasio 300 mmol/L, NaCl 100 mmol/L, Na-EDTA 10 mmol/L, albúmina de suero bovina al 0,5 %; 20 comprimidos/L de comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasas completo (Roche AG); pH 7,0) a una concentración de 10 ng/0,3 mL cada uno, y se pipetearon 0,3 mL por disolución de péptido por tubo de estreptavidina. Las disoluciones de péptido se incubaron en los tubos durante dos horas a 22 °C con agitación y se lavaron dos veces con tampón PBS, pH 7,4.

Ensayo de unión

El anticuerpo CT-H marcado se diluyó en fosfato de potasio 300 mmol/L, NaCl 100 mmol/L, Na-EDTA 10 mmol/L, albúmina de suero bovina 5 g/L, pH 7,0. La concentración final fue de aproximadamente 800.000 unidades de luz relativas (RLU) del anticuerpo marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 300 pL. De esta disolución, 300 pL se pipetearon en cada tubo de péptido/estreptavidina y se incubaron los tubos durante dos horas a 22 °C con agitación. El marcador no unido se retiró lavando 5 veces (cada una con 1 ml) con disolución de lavado (PBS 20 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1 %). Se midió la quimioluminiscencia unida al tubo usando el luminómetro LB 953 (Berthold). La unión de CT-H a cada péptido se expresó como el porcentaje de unión observado en comparación con la unión obtenida frente al péptido P 33-52 NH2 (tabla 2).

A partir de la tabla 2, es evidente que el anticuerpo CT-H se une muy específicamente al péptido P 33-52 NH2. Casi no se detectó unión frente al mismo péptido cuando la función amida C-terminal fue sustituida por un grupo carboxilo (P 33-52 COOH). De modo similar, casi no se observó unión cuando se ensayó un péptido más largo o péptidos más cortos. Estos resultados demuestran claramente que el anticuerpo CT-H se une específicamente a la región C-terminal de la ADM y requiere un resto tirosina amidado libre (posición 52 en la ADM) para la unión.

Además del anticuerpo CT-H, se generaron otros anticuerpos mediante el mismo procedimiento de inmunización que el empleado para CT-H y se seleccionaron por su capacidad para unirse al péptido APRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:1). Se determinó su especificidad de epítopo de la misma manera que se describió anteriormente para el anticuerpo CT-H. La unión de los anticuerpos a cada péptido se expresó como el porcentaje de unión observado en comparación con la unión obtenida frente al péptido P 33-52 NH2 (tabla 3).

La tabla 3 demuestra que pueden obtenerse anticuerpos monoclonales antiadrenomedulina con diferentes especificidades de epítopo.

Ejemplo 2: Modelo de tumor de mama de xenoinjerto

Se cultivaron células MDA-MB-231 (CPQ-82, ProQinase), una línea de cáncer de mama bien establecida, en monocapa en DMEM FCS al 10 %. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada de 90 % de aire y 10 % de dióxido de carbono a 37 °C. El medio se cambió de forma acostumbrada cada 3 días. Los cultivos confluyentes se dividieron 1:3 cada 3-4 días usando tripsina/EDTA y se sembraron a una densidad de aproximadamente 3-4 x 106 células/15 cm2 25 mL de medio.

Ratones hembra BALB/c atímicos (CAnN.Cg- Foxn1nu/Crl) (Charles River GmbH, Sulzfeld, Alemania) de 4-5 semanas en el momento de la recepción y que pesaban aproximadamente 15-18 g se mantuvieron en condiciones higiénicas óptimas, se acondicionó el aire con 10-15 cambios de aire por hora, y se controló continuamente su entorno con intervalos de diana de temperatura de 22 ± 3 °C y de humedad relativa del 30-70 %, con 12 horas de luz fluorescente artificial/12 horas de oscuridad. Se mantuvo un máximo de 4 animales por jaula ventilada individual (JVI) y se alimentaron con una dieta que consistió en M-Zucht (ssniff Spezialdiaten GmbH) y agua del grifo sometida a autoclave.

Después de un periodo de aclimatación de 5 días (día 0), se implantaron 5 x 106 MDA-MB-231 en 100 pL de tampón PBS por vía subcutánea en el flanco izquierdo de los ratones hembra BALB/c atímicos usando una jeringa con aguja 29G. Posteriormente, se midieron los pesos de los animales (balanza: Mettler Toledo PB602-L). Se midieron los volúmenes de los tumores primarios mediante un calibrador (calibrador manual, OMC Fontana). Se calcularon los volúmenes tumorales según la fórmula W2xL/2 (L = longitud, y W = el ancho perpendicular del tumor, L>W). Después de 40 días, se alcanzó un promedio de volumen tumoral de aproximadamente 150 mm3, y los animales que portaban tumores se aleatorizaron en 4 grupos. Al día siguiente (día 41), se comenzó con la administración de anticuerpos antiadrenomedulina y una IgG de ratón no específica como control (tabla 4).

Los anticuerpos se administraron por vía intravenosa (i.v.) con un programa de dos veces diarias. Los anticuerpos se disolvieron en tampón PBS y se esterilizaron por filtración antes de la aplicación.

Tabla 4: Resumen de los anticuerpos investigados en el modelo de xenoinjerto

Se observó el comportamiento y el bienestar de los animales 5 veces cada semana (en los días laborables). Se midió el peso de los animales tres veces semanales después de una aleatorización (cada lunes, miércoles y viernes). Se registró el crecimiento de los tumores primarios dos veces semanales (lunes y viernes) después de una aleatorización mediante medición con calibrador.

Hasta el final del periodo de estudio programado (día 56), ninguno de los animales murió. En el día 56, el estudio terminó; todos los animales se sacrificaron y se realizó una necropsia.

Análisis estadístico

Todos los análisis de los datos se realizaron usando GraphPad Prism 5 de GraphPad Software, Inc., San Diego, EE. UU., e IBM SPSS Statistics Standard de IBM Corp., Nueva York, EE. UU.

Se calculó el promedio absoluto de los volúmenes tumorales por grupo. Se calculó el crecimiento tumoral como los cambios relativos en el volumen tumoral en el día x en comparación con el volumen tumoral en el primer día del tratamiento (día 41).

El crecimiento tumoral relativo para cada grupo tratado con anticuerpo antiadrenomedulina se comparó con el crecimiento tumoral en el grupo tratado con la IgG de ratón no específica.

Resultados

Los anticuerpos dirigidos contra los restos N-terminales y mediorregionales de la adrenomedulina mostraron un efecto ligero, pero no estadísticamente significativo, sobre el crecimiento tumoral (figura 1). El efecto del anticuerpo antimediorreginal fue más pronunciado que para el anticuerpo anti-N-terminal (figura 1). Por contraste, el anticuerpo contra la región C-terminal de la adrenomedulina redujo el crecimiento tumoral significativamente en comparación con el grupo control (figura 1).

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Descripción de la figura

Figura 1:

La figura 1 muestra el aumento del volumen tumoral a lo largo del tiempo dependiente del tratamiento con compuestos. Los compuestos investigados fueron NT-H (anticuerpo monoclonal generado contra el resto N-terminal de la adrenomedulina humana), MR-H (anticuerpo monoclonal generado contra el resto mediorregional de la adrenomedulina humana), CT-H (anticuerpo monoclonal generado contra el resto C-terminal de la adrenomedulina humana) y Con (anticuerpo control no específico). La reducción del crecimiento tumoral fue significativa para CT-H (p = 0,038); para NT-H y MR-H se produjo una tendencia hacia la eficacia, pero el efecto no fue estadísticamente significativo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina que se une a la porción C-terminal de la adrenomedulina, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY, para su uso en una terapia del cáncer, en el que dicho anticuerpo IgG antiadrenomedulina es un anticuerpo de longitud completa.

2. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo IgG antiadrenomedulina requiere la presencia de un resto tirosina amidado C-terminal dentro de la porción C-terminal de la antiadrenomedulina, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY, para la unión.

3. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que comprende: cáncer de próstata, mama, colon, pulmón, vejiga, piel, útero, cérvix, cavidad oral y faringe, estómago, ovarios, y menos preferidos: cáncer de riñón, páncreas, linfoma no hodgkiniano, leucemia, hígado, esófago, testículo, tiroides, sistema nervioso central, laringe, vesícula biliar, plasmocitoma, enfermedad de Hodgkin.

4. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, 2 o 3, en el que dicho anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa es monoespecífico.

5. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa es monoclonal.

6. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza porque dicho anticuerpo muestra una afinidad de unión por la adrenomedulina de al menos 10'7 M.

7. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo no es la proteína 1 de unión a la adrenomedulina que es el factor del complemento H.

8. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo se une a una región de al menos 4 o al menos 5 aminoácidos dentro de la secuencia de la adrenomedulina, que es SEQ ID NO:1: APRSKISPQGY.

9. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para ser usado en combinación con otro agente anticáncer o para ser usado como monoterapéutico.

10. - Un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para ser usado en combinación con agentes citostáticos, inhibidores de VEGF, inhibidores de CD20, inhibidores de HER-2, inhibidores de CD-52, inhibidores de EGFR, inhibidores de tirosina quinasas.

11. - Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo IgG antiadrenomedulina de longitud completa para su uso en el tratamiento del cáncer para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. - Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 11, para ser usado en combinación con agentes citostáticos, inhibidores de VEGF, inhibidores de CD20, inhibidores de HER-2, inhibidores de CD-52, inhibidores de EGFR, inhibidores de tirosina quinasas.

13. - Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 11 o 12, para ser usado en combinación con bevacizumab.

14. - Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dicha composición farmacéutica se administra por vía intravenosa.