JP5577345B2 - 線維芽細胞成長因子受容体3(fgfr−3)阻害剤および治療方法 - Google Patents
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Description
(FGFR−3特異的抗体アンタゴニストの生成)
組み換えヒトFGFR−Fc、組み換えヒトFGF、カスタム合成プライマー、制限酵素およびDNAポリメラーゼは、業者から取得され得るか、または、公知の方法により調製され得る。
(抗体1)
抗体1を周知の方法を用いて適切な哺乳動物発現系にて生合成することができ、かつ、周知の方法により精製することができる。
(ELISA結合アッセイ)
組み換えFGFRを、96ウェルプレート上でPBS中に1μg/mlの濃度にて、2時間室温でコーティングする。プレートを0.2%のTween20/PBSで3回洗浄し、使用前に5%のミルク/PBSで2時間ブロックする。ファージ、Fabまたは抗体をプレートに加え、0.2%のTween20/PBS中で連続希釈する。2時間以上、室温にてプレートをインキュベートする。適切な市販の二次抗体を用いて捕捉した分子を検出し、供給者の指示書に従って検出する。
組み換えFGFを、室温で2時間、0.5〜2μg/mlの濃度にてImmulon(登録商標)2Bマイクロタイタープレート(ThermoLab Systems,Franklin,MA)上でコーティングする。プレートを0.2%のTween20/PBSで洗浄し、使用前に5%のミルク/PBSで2時間ブロックする。ファージ、Fab、または抗体を5μg/mlのヘパリン、5%のミルク、PBSで連続希釈する。FGFR−3(IIIb)または(IIIc)ECD(細胞外領域)FCで標識を付けた可溶性組み換えタンパク質を1μg/mlの最終濃度まで加える。FGF−1でコーティングしたプレートに移す前に、室温にて1時間、混合物をインキュベートし、さらに2時間、室温にてインキュベートする。プレートを0.2%のTween20/PBSで3回洗浄する。供給者の指示書に従って調製したセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)溶液に結合した抗ヒトFcモノクローナル抗体を用いて、結合した受容体を検出する。ブロッキング活性は低いシグナルを生じる。
製造業者によって教示された標準プロトコルに従って、室温にてBiaCore(登録商標)3000バイオセンサー(BiaCore,Inc.,Piscataway,NJ)を用いてFGFR−3(IIIb)および(IIIc)に対する抗体の結合キネティクスを測定する。表1に記載した結果の要約により、抗体がヒトFGFR−3のbおよびc−スプライシング型の両方に結合し、10−9M未満の親和性でマウスFGFR−3(IIIc)受容体と完全に交差反応することが示される。
マウスFGFR−3(IIIc)のcDNAを、ピューロマイシン選択遺伝子を含有するpBABE発現ベクターにクローニングする。L6細胞中で得られたプラスミドのレトロウイルス発現を実施する。細胞を選択し、10%のFBSおよび2μg/mlのピューロマイシンを含有するDMEM培地中で培養する。FGFR−3を発現するL6細胞を1%のBSA/PBSに懸濁する。抗体1を1〜30μg/mlの最終濃度まで加える。氷上で1時間のインキュベーションの後、1%のBSA/PBS中で細胞を洗浄し、氷上で1時間、同じバッファー中の適切な二次検出抗体またはFabフラグメントとともにインキュベートする。この二次抗体でのみコントロールサンプルを染色する。FACSvantage SEフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて全てのサンプルを解析する。抗体1は、FGFR−3ネガティブL6親細胞を使用した場合ではなく、FGFR−3でトランスフェクトした細胞(R3−L6)を使用した場合のみ、ポジティブ染色シグナルを生じることによって示されるように、FGFR−3に特異的である。
FGFR−3(III)bドメイン境界は、公知であるFGFR−3(IIIb)細胞外ドメイン3DモデルおよびFGFRの結晶構造に基づいて規定され得る。野生型FGFR−3(IIIb)D1−3(25−372)とともに5つの切断FGFR−3(IIIb)ECD構築物、すなわちD1(25−148)、D2(149−245)、D3(250−372)、D1−2(25−245)およびD2−3(149−372)を設計する。その構築物を、複数のクローニング部位の3’末端にて操作したFcタグを有するpGSベクターにサブクローニングし、配列を確認した。推定リガンド結合領域に近接する20のFGFR−3(IIIb)残基ならびにヘパリン結合に関するものおよび受容体−受容体の二量体化を、公知のFGFR−3(IIIb)ECDモデルおよびFGFR−3(IIIc)構造に基づいて選択する。FGFR−3(IIIb)ECDの単一のアラニン残基の変異を、鋳型として完全長FGFR(IIIb)ECD構築物を用いてオーバーラッピングPCRにより生成し、続いてpGS−Fcベクターにサブクローニングする。ドメイン切断およびアラニン変異を、293フェクチン(fectin)(商標)(Invitrogen)を用いるトランスフェクション後に293細胞において一時的に発現する。培養上清を、トランスフェクション後6日で収集し、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティーカラムを通すことによって精製し、PBS中で緩衝液を交換し、SDS−PAGE解析により定量し、評価して、構造的完全性を確認する。
抗体−1の精製した溶液をPBS中に2mg/mlの濃度まで希釈する。MSD Sulfo−TAG NHS−Ester(MesoScale Discovery,#R91AN2)、ルテニウム−トリス−ビピリジンN−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、冷蒸留水を用いて10nmol/ulの濃度に再構成する。12:1モル比のMSD Sulfo−TAG NHS−エステル:抗体1を反応に使用する。インキュベーションを、室温にて2時間、光を遮断して実施する。未反応のMSD Sulfo−TAG NHS−Esterを、脱塩樹脂を用いて結合した抗体1から除去する。ルテニウムが結合した抗体1を−80℃にて保存する。結合した抗体1の濃度を、検量線のためにウシ血清アルブミンを用いて測定する。
96ウェルELISAマイクロタイタープレートのウェルを、4℃にて穏やかに攪拌しながら100μLのPBS、pH7.2中の200ngの抗FGFR−3モノクローナル抗体、B9(Santa Cruz sc−13121)で一晩コーティングする。コーティング後、抗体溶液をデカントし、ウェルを、室温にて2時間、穏やかに攪拌しながら0.1%のTween(PBST)、5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含む100μLのリン酸緩衝生理食塩水でブロックする。ブロック後、ウェルを、200μLのPBSTで5回洗浄する。次いで、3倍希釈系列(100〜0.006nM)の変異または野生型FGFR−3(IIIb)−FCを、試験される各タンパク質について3連で100μLのPBST、1%のBSAに加え、室温にて1時間穏やかに攪拌しながらインキュベートする。ウェルを再び200μLのPBSTで5回洗浄する。100μLのPBST、5%のBSA中の1:5000希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)が結合した抗マウスIgGを、室温にて1時間穏やかに攪拌しながら各ウェル中でインキュベートする。ウェルを最後に200μLのPBSTで5回洗浄し、次いで100μLの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ(TMB)発色基質で5分間、発達させる。反応を1ウェルあたり100μLの1N H2SO4で停止する。吸光度を450nmにて分光光度法で測定する。吸光度の読み取り値を、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアバージョン5.0でプロットする。KD値を、ソフトウェアのOne Site−Specific Binding機能の非線形回帰曲線フィット解析により算出する。野生型FGFR−3(IIIb)−Fcに対するB9の結合を、切断または変異FGFRの相対的結合親和性解析に関する基準として使用し、野生型の割合としてプロットする。
突然変異生成研究を導くことを支援するために、FGFR−3(IIIb)ECDのドメイン2および3の3次元モデルを、SWISS−MODEL(登録商標)を用いて生成する。ヒトFGFR−3(IIIb)、およびヒトFGFR−3(IIIc)の配列を、CLUSTALW(登録商標)法を用いて整列させ、そのモデルを、鋳型としてFGFR−3(IIIc)のX線結晶構造(タンパク質データバンクコードIRY7)を用いて構築する。
FGFR受容体ファミリーのリガンド結合部位は、細胞外ドメインを規定する3つのN末端Igドメイン内に含まれる(Chellaiahら,J.Biol.Chem.1999年12月3日;274(49):34785−34794)。3つのIgドメインが抗体1のエピトープを含むことを決定するために、ドメイン切断のパネルを利用する。ヒトIgドメインをコードするDNA配列を、種々の形で切断し、ヒトFcタグを有するホモ二量体融合タンパク質として発現する。コードされたタンパク質を、一時的にトランスフェクトした細胞の馴化した上清から精製し、各々の精製したドメイン切断のホモ二量体構造をSDS−PAGEにより確認する。次いで、切断体を、メソスケール結合アッセイにおいて抗体1に対する結合に関して試験する(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)。抗体1は、D1およびD3切断体に対して検出可能な結合を示さないが、それは、メソスケール結合アッセイ(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)において、およびBIAcore(商標)(Pharmacia,Piscataway,NJ)によって測定した場合、D1−2およびD2切断体に対して有意な結合を示した。B9は、受容体のドメイン1において構造的に感受性の高いエピトープを認識するので、ドメイン1を含むそれらの切断体は、完全な構造が破壊されない場合、抗体を結合することが予想される。D1およびD1−2切断体は、コントロールMab B9に対して有意な結合を示し、メソスケール結合アッセイ(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)において、およびBIAcore(商標)(Pharmacia,Piscataway,NJ)によって測定した場合、それらの2つのタンパク質の構造的完全性を確認した。切断体の結合データは、FGFR−3の第2のIgドメインが、抗体1を結合するのに十分であるので、エピトープに必須の残基を含むことを明らかにした。
FGFR−3(IIIb)ECDのドメイン2および3の3次元モデルを、FGFR−3(IIIc)の結晶構造に基づいて生成した。リガンド結合、受容体の二量化またはヘパリン結合に近接するか、または直接関与するFGFR−3の第2のドメイン内の20のアミノ酸(D160、K161、K162、L163、L164、V166、P167、P220、R223、D244、N170、T171、R158、R173、R175、K205、R207、L246、E247、S249)を分子モデルに基づいて同定し、単一のアラニン残基の変異を生成する。
上述のELISAブロッキングアッセイからの結果は、抗体1が、1〜10nMの範囲内のIC50でFGF−1/FGFR−3結合をブロックすることを示す。生細胞中のFGFR−3シグナル伝達に対するこの抗体の活性を試験するために、上記のFGFR−3発現L6細胞を使用する。FGFR−3発現L6細胞を、非常に低い濃度の血清(0.1%)を含む培地中で一晩休眠させる。次の日に、細胞を等しいサイズの5つのサンプルに分割する。サンプル1および2を、アイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体(200nM)および抗体1(200nM)でそれぞれ1時間、処理する。サンプル3を0.6nMのFGF−9で15分間、曝露する。サンプル4および5を、まず、アイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体(200nM)および抗体1(200nM)でそれぞれ1時間、処理し、次いで、0.6nMのFGF−9に15分間、曝露する。これらの処理および曝露後、細胞を溶解させ、それらをSDS−PAGEおよびウェスタンブロットにかける。抗ホスホチロシン抗体を用いてFGFR−3の活性化を調べる。抗体1単独では、活性化されたFGFR−3およびMAPKのシグナルは増加も減少もせず、FGF−9リガンド曝露により、活性化されたFGFR−3およびMAPKのシグナルが同じ程度まで増加する。従って、これらの結果は、抗体1が、生細胞中のリガンドにより誘発された活性化においてFGFR−3受容体をブロックするアンタゴニストであることを実証する。
抗体1は、受容体シグナル伝達を下方調節する機構を構成する、FGFR−3の内在化を引き起こす。これを試験するために、抗体1/FGFR−3複合体の位置を追跡するために、市販のAlexa Fluor(登録商標)色素(Invitrogen)で抗体を標識する。抗体1およびアイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体を蛍光色素と結合させる。FGFR−3発現L6細胞を、非常に低い濃度の血清(0.1%)を含む培地中で一晩休眠させる。
OPM−2は、複数の骨髄種の癌細胞から最初に単離された細胞株である。OPM−2細胞は、K650E点突然変異の機能獲得を保有するFGFR−3受容体を発現することが知られている。低血清培地(0.1%FBS)中で一晩、OPM−2細胞を休眠させる。次の日、これらの細胞を5群に分ける。群1をすぐに溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。従って、この群を0時間のサンプルに指定する。群2〜5の各々を、等しいサイズの3つのサンプルにし、群2、3、4および5をサンプルA、BおよびCと名付ける。群2〜5のサンプルAは、いかなるさらなる処理にも供さないが、37℃でインキュベートする。群2〜5のサンプルBを、37℃にて30ng/mlのFGF−1で処理する。群2〜5のサンプルCを、37℃にて30μg/mlの抗体1で処理する。処理の1時間後、群2の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を1時間のサンプルと指定する。処理の4時間後、群3の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を4時間のサンプルと指定する。8時間の処理後、群4の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を8時間のサンプルと指定する。24時間の処理後、群5の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を24時間のサンプルと指定する。全ての溶解物を調製して、それらをSDS−PAGE、続いてウェスタンブロット実験に供する。群1のFGFR−3シグナルおよび群2の全てのサンプルは同様である。群3において、サンプルAおよびCのFGFR−3シグナルは群1のものと同様であり、さらにサンプルBのシグナルは著しく低い。群4において、サンプルAのFGFR−3シグナルは群1のものと同様であり、さらにサンプルBおよびCのシグナルは著しく低い。群5において、サンプルAのFGFR−3シグナルは群1のものより低く、さらにサンプルBおよびCのシグナルはほとんど存在しない。従って、FGFR分解を誘発することが知られている、FGF−1と同様に、抗体1は時間依存性様式においてFGFR−3分解を誘発でき、これは出願人がデータに示されていないと考える特徴である。
膀胱癌において特定される多くのFGFR−3活性化突然変異は受容体の細胞外ドメインに位置する。これらの変異(例えばR248CまたはS249C)は、リガンド非依存性様式においてジスルフィド結合されたFGFR−3二量体の形成を導く、新規の、対になっていないシステイン残基を生じる。最も頻度の高い変異は、S249C、Y375CおよびR248Cであり、それらは一緒に、膀胱癌においてFGFR−3変異全ての91%の割合を占める。さらに、FGFR−3(IIIc)上のS249Cはまた、FGFR3(IIIc)の構成的活性化を導く。抗体1は内在化し得、野生型(WT)FGFR−3だけでなく、最も多く見られる腫瘍関連FGFR−3変異体もまた枯渇させ得る。
抗体1が一次抗体であるフローサイトメトリーを用いて野生型または変異FGFR−3(IIIbおよび/またはIIIc)を発現する腫瘍細胞株を同定する。3つの膀胱腫瘍細胞株、RT112、RT4およびBFTC905は、有意なFGFR−3発現を示す。K650E点突然変異の機能獲得を保有するFGFR−3受容体を発現することが知られているOPM−2細胞もまた、この研究において高レベルの発現を示す。2つのさらなる細胞株、GEOおよびFADUは、中程度であるが、なお有意なレベルの受容体を発現することが見出される。これらの腫瘍細胞中のFGFR−3シグナル伝達を、ウェスタンブロットを用いて特徴付ける。
腫瘍細胞の増殖に対する抗体1の阻害効果を示すために、細胞増殖アッセイを使用する。単層RT112細胞を、24〜72時間、低血清培地(0.1%のウシ胎仔血清、5μg/mLのヘパリン)中で休眠させる。細胞を4つのサンプルに分ける。FBS(ウシ胎仔血清)を、10%(V:V)の最終濃度までサンプル1に加える。サンプル2を飢餓培地中に静置する。FGF−1を、1nMの最終濃度までサンプル3に加える。抗体1を、200nMの最終濃度までサンプル4に加え、37℃にて1時間、インキュベートする。次に、FGF−1を1nMの最終濃度まで加える。上記のようにサンプル1〜4を調製後、37℃にて5% CO2(v:v)で48時間、組織培養インキュベーターセット中でサンプルをインキュベートする。標準的な3H−チミジン導入アッセイを用いて、細胞増殖を検出する。インビトロにおいてRT112細胞を1nMの外因性FGF−1で刺激した場合、腫瘍細胞増殖は2倍になる。この実験はまた、抗体1が、この外因性に刺激した増殖を効果的に減少させることを示す。
慣例の方法によってRT112およびGEO異種移植腫瘍モデルを成長させる。この方法において、0〜100%のマトリゲルと混合した100万〜2000万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均値がほぼ400mm2になると、抗体処置を開始する。両方とも異種移植腫瘍に相当する2つの腫瘍細胞株、RT112およびGEOは、コントロール群中の同じタイプの腫瘍と比較して、週に3回の40mg/kgの抗体1の腹腔内注射処理によって効果的に阻害する。これらの効果がFGFR−3シグナル伝達経路の付与から生じることを実証するために、同所性(Orthotopic)PC−3腫瘍モデルを用いて有効性研究を行い、ここで、腫瘍細胞は、FGFR−3受容体リン酸化のウェスタンブロット解析からの陰性結果によって示唆されるようにFGFR−3シグナル伝達経路を欠く。同所性PC−3モデルを、ルシフェラーゼをトランスフェクトしたPC−3細胞(PC−3LP)を、外科手術によりNu/nuマウス(雄、7〜8週、1×106細胞/マウス)の背葉前立腺に直接注入することにより生成した。細胞注入の2週間後、動物の生物発光画像を、腹側位置(後方に寝かせている動物)において捕捉し、製造業者の指示書(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)に従ってIVISシステムを用いて定量化する。移植が成功したマウスを、所定のスケジュールで腹腔内に種々の試験薬剤を与える群にランダム化する。IVISによって捕捉したシグナルを、全身腫瘍組織量の代用物として用い、週に一度記録する。統計的解析を、反復ANOVAを用いて実施する。抗体1は、PC−3腫瘍の増殖に対して有意な効果を示さない。従って、抗体1は、機能的FGFR−3シグナル伝達経路を保有するそれらの固形腫瘍の増殖を阻害する。
OPM−2およびKMS−11は、FGFR−3を発現する多発性骨髄腫細胞株である。さらに、両方の細胞株における受容体は、単一の点突然変異:OPM−2中のK650EおよびKMS−11中のY373Cを保有する変異体である。2つの変異体は機能獲得型変異であり、構成的活性化、延長した半減期および増加したリガンド感受性などの機構を介して変異受容体の活性を増加させる。慣例の方法によってOPM−2異種移植モデルを成長させる。この方法において、0〜100%のマトリゲルと混合した100万〜2000万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均体積がほぼ400mm2になると、注射処置を開始する。週に3回処置する。週に3回、腫瘍体積を測定する。処置の4週間後に最終測定を行う。抗体1で処置した動物の平均腫瘍サイズは、コントロール群のものより64%小さい。スチューデントt検定を実施する。P値は0.0001未満である。従って、実測値は非常に有意である。KMS−11骨生着モデルを、Xin Xら,Clin Cancer Res.2006年,8月15日;12(16):4908−15に従って確立する。腫瘍細胞注入後、1週間で抗体処置を開始する。週に3回処置する。研究の間に、腫瘍細胞によって放出されたシグナルを数回測定する。最初の注入の33日後、最終測定を行う。抗体1で処置した動物からの平均シグナルは、コントロール動物からのものの1/4である。ログランク(マンテル−コックス)検定(Long−rank(Mantel−Cox)Test)を実施する。P値は0.0002である。従って、実測値は非常に有意である。両方のモデルにおいて、週に3回の40mg/kgの抗体1の腹腔内注射処置は、コントロール群と比べて腫瘍増殖を著しく阻害する。抗体1は、最初に、インビボにおいて、K650Eを有する腫瘍細胞およびFGFR−3のY373C変異型を有するものに対する抗腫瘍活性を示すように見える。
シスプラチンは、癌治療において広範囲に使用される細胞毒性剤である。これはDNA架橋を生じ、細胞アポトーシスを誘発する。3つの膀胱異種移植モデルにおいてシスプラチンとFGFR−3抗体とを混合する治療的有用性を調べる。慣例の方法によってRT112、RT4およびBFTC905異種移植腫瘍モデルを成長させる。この方法において、0〜100%のマトリゲルと混合した100万〜2000万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均体積がほぼ400mm2になると、抗体処置を開始する。週に3回、40mg/kgの抗体1およびシスプラチンの最大耐容量(MTD)の注射を使用する。研究の終わりまで、週に3回、平均腫瘍体積を測定する。RT112腫瘍モデルのデータの概要を以下の表に記録する。
Claims (7)
- ヒトFGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)に対して特異的に結合する、抗体またはそのヒトFGFR−3結合フラグメントであって、配列GYMFTSYGIS(配列番号1)を有するCDRH1、配列WVSTYNGDTNYAQKFQG(配列番号2)を有するCDRH2、配列VLGYYDSIDGYYYGMDV(配列番号3)を有するCDRH3、配列GGNNIGDKSVH(配列番号4)を有するCDRL1、配列LDTERPS(配列番号5)を有するCDRL2、および、配列QVWDSGSDHVV(配列番号6)を有するCDRL3を含む抗体またはその機能的フラグメント。
- 抗体が室温(20〜25℃)にて1×10−8M以下のKDを有するヒト抗体である、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- ヒトFGFR−3ドメイン2(配列番号12)に対して特異的に結合する、請求項1または2に記載の抗体またはフラグメント。
- 抗体が重鎖可変アミノ酸配列:EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS(配列番号7)、および、軽鎖可変アミノ酸配列:QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLGを含む、請求項1から3のうちいずれか一項に記載の抗体またはフラグメント。
- 請求項1から4のうちいずれか一項に記載された抗体またはフラグメントと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
- 請求項1から4のうちいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントと、薬学的に受容可能な担体を共に含む、薬学的組成物。
- 他の治療成分をさらに含む、請求項6記載の薬学的組成物。
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