MX2011004317A - Inhibidores del receptor-3 del factor de crecimiento del fibroblasto (rtf-3) y metodos de tratamiento. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, el cual se une a FGFR-3(IIIb) y FGFR-3(IIIc) o formas mutantes de los mismos. Modalidades adicionales incluyen composiciones farmacéuticas comprendiendo el anticuerpo y métodos para usar el anticuerpo para tratar cáncer.

Description

INHIBIDORES DEL RECEPTOR-3 DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL FIBROBLASTO (RTF-3) Y MÉTODOS DE TRATAMIENTO Esta invención está en el tratamiento de cáncer e inmunología. Más específicamente, la presente invención se dirige a un anticuerpo humano que enlaza al receptor-3 del factor de crecimiento del fibroblasto humano (FGFR-3) (SEC ID NO. 11) . El FGFR es también conocido como CD333, ACH, CEK2, HSFGFR-3EX y JTK4.

El FGFR-3 ha sido mostrado por estar involucrado en el desarrollo de cáncer, que incluye mieloma múltiple, carcinoma de células uroteliales y vejiga. El enlace al ligando-receptor de FGF induce la dimerización del receptor y autofosforilación, conduciendo a activación corriente abajo de las moléculas efectoras. La señalización de FGFR-3 es capaz de regular un amplio intervalo de actividades celulares tales como proliferación, diferenciación, migración, supervivencia/apoptosis, citoesqueleto y regulación de citocina y endocitocis/exocitosis . La hiper-activación de la señalización FGFR-3 ha sido reconocida como un evento importante que proporciona células tumorales con un crecimiento o ventaja de supervivencia y de este modo, contribuye a la malignidad del tumor.

El FGFR-3 de longitud completa, tiene dos formas de empalme llamadas FGFR-3 (Illb) y FGFR-3 (IIIc) , que resultan de exones alternativos que codifican el tercer dominio similar a IgG de FGFR-3. El FGFR-3 también ha documentado formas mutantes debido a errores en la replicación o traducción del DNA. Dado el papel activo de la trayectoria de señalización de FGFR-3 en un amplio intervalo de enfermedades que incluyen cáncer, existe una necesidad de un mecanismo el cual regule esta trayectoria.

Los anticuerpos anti-EGFR-3 que bloquean el enlace del ligando, han sido descritos. (Rauchenberger, R. et al., J. Biol. Chem. 2003 Oct 3; 278 (40) : 38194-205.) . Los anticuerpos anti-FGFR-3 que se enlazan a formas tanto de tipo nativas como mutantes de FGFR-3, han sido descritos. (Martinez-Torrecuadrada, J., et al., Clin. Cáncer Res. 2005 Sep 1; 11 (17) : 6280-90; Trudel S., et al., Blood 2006 Mayo 15; 107 (10) : 4039-46.) . Los anticuerpos anti-FGFR-3 que inhiben la activación mediada del ligando de la señalización de FGFR-3, e inhiben el crecimiento del tumor mediado por FGFR-3, han sido descritos. (Trudel S., et al., Blood 2006 Mayo 15; 107 (10) : 039-46.) . Los anticuerpos anti-FGFR-3 que mejoran los efectos anti-tumorales de cisplatina cuando se dan como terapia de combinación, han sido descritos. (Deevi, D. et al., AACR 2007 Oct. 21-24; Wang, W., et al., EORTC 2008 Oct. 22-26. ) Sin embargo, existe una necesidad en la técnica para un antagonista de anticuerpo que sea capaz de uno o más de lo siguiente: ser altamente especifico a ambas formas de empalme de FGFR-3, ( FG R-3 ( I I Ib) y FGFR-3 ( IIIc) ) , que internalice el FGFR-3 y que preferiblemente también induzca degradación de FGFR-3 (Illb) y FGFR-3 (IIIc) o formas mutantes de los mismos, y que mejore la eficacia terapéutica e invierta la quicio-resistencia cuando se usa en combinación con un agente citotóxico. Adicionalmente, el anticuerpo es preferiblemente también activo a formas mutantes de FGFR-3, bloquea ligandos FGF del enlace a FGFR-3, inhibe las trayectorias de señalización de FGFR-3 inducidas por el ligando, inhibe las actividades celulares mediadas por FGFR-3, e inhibe el crecimiento del tumor in vitro e in vivo.

Los anticuerpos de la invención han resuelto estas necesidades. El anticuerpo es altamente especifico para ambas formas de empalme de FGFR-3, ( FGFR-3 ( Illb) y FGFR-3 ( IIIc) ) , internaliza el FGFR-3 y preferiblemente también induce la degradación del receptor después del enlace a receptores FGFR-3 o mutantes del receptor en células del mismo, mejora la eficacia terapéutica e invierte la quimio-resistencia cuando se usa en combinación con un agente quimio-citotóxico, asi como también es activo a formas mutantes de FGFR-3, bloquea ligandos FGF del enlace a FGFR-3, inhibe las trayectorias de señalización de FGFR-3 inducidas por ligando, inhibe las actividades celulares mediadas por FGFR-3, e inhibe el crecimiento del tumor in vitro e in vivo.

La invención también se refiere a un anticuerpo aislado, que se enlaza específicamente a (FGFR-3) (Illb) y FGFR-3(IIIc) humano.

Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano que tiene un KD de aproximadamente 1 x 10~8 M o menos a temperatura ambiente (20-25°C) .

Preferiblemente, el anticuerpo específicamente se une al dominio 2 de FGFR-3 humano (SEC ID NO. 12) .

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención que se enlaza específicamente a FGFR-3 (Illb) y FGFR-3 (lile) humano, comprende una CDRH1 que tiene la secuencia GYMFTSYGIS (SEC ID NO 1), una CDRH2 que tiene la secuencia VSTYNGDTNYAQKFQG (SEC ID NO 2), una CDRH3 que tiene la secuencia VLGYYDSI DGYYYGMDV (SEC ID NO 3), una CDRL1 que tiene la secuencia GGNNIGDKSVH (SEC ID NO 4), una CDRL2 que tiene la secuencia LDTERPS (SEC ID NO 5), y una CDRL3 que tiene la secuencia QV DSGSDHVV (SEC ID NO 6).

Preferiblemente, el anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácido pesada variable de EVQLVQSGAEVK PGASVKVSC ASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYA Q FQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDV GQGTTV TVSS (SEC ID NO 7) y una secuencia de aminoácido ligera variable de QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVH YRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERM SGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG (SEC ID NO 8) .

Preferiblemente, el anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácido pesada variable de EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYA QKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTV TVSS (SEC ID NO 7) o una secuencia de aminoácido ligera variable de QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERM SGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG (SEC ID NO 8) .

La región constante pesada de anticuerpo puede ser de IgGl humano, o un fragmento enlazante a FGFR-3 del anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEC ID NO: 9 y una cadena ligera de la SEC ID NO: 10. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEC ID NO: 9, y una cadena ligera de la SEC ID NO: 10, o un fragmento enlazante a FGFR-3 del anticuerpo .

El anticuerpo también puede comprender dos cadenas pesadas de la SEC ID NO: 9 y dos cadenas ligeras de la SEC ID NO: 10. El anticuerpo también puede comprender dos cadenas pesadas de la SEC ID NO: 9 y dos cadenas ligeras de la SEC ID NO: 10. Preferiblemente, el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas de la SEC ID NO: 9 y dos cadenas ligeras de la SEC ID NO: 10, o un fragmento enlazante a FGFR-3 del anticuerpo.

El anticuerpo puede comprender un fragmento enlazante a FGFR-3 humano neutralizante.

En un aspecto preferido, la invención se dirige a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo compite para enlace al dominio extracelular de FGFR-3 en un ensayo de competencia ELISA con un anticuerpo de competencia, en donde el anticuerpo de competencia se enlaza a FGFR-3 con un KD de aproximadamente 1 x 10"8 M o menos a temperatura ambiente (20-25°C) .

La invención además se refiere a un anticuerpo que se enlaza a formas mutantes de FGFR-3.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también se refiere a un producto que contiene un anticuerpo o fragmento y un agente anti-cancerigeno adicional para el tratamiento en combinación para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia.

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo o fragmento es para uso como un medicamento. En otro aspecto de esta invención, el anticuerpo o fragmento es para uso en el tratamiento de cáncer. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo o fragmento se usa como un medicamento en donde el cáncer es de vejiga o mieloma múltiple.

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo o fragmento se usa en el tratamiento de cáncer junto con otro agente. El anticuerpo o fragmento de la invención puede ser administrado simultáneamente, separadamente, o secuencialmente con una cantidad efectiva de otro agente al paciente. La invención puede comprender una composición farmacéutica que comprende un compuesto junto con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos .

La invención también se refiere a un método para tratar cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva del anticuerpo de la invención. El cáncer puede ser de vejiga o mieloma múltiple. En otro aspecto, la invención incluye un método para tratar cáncer en un paciente que comprende administrar simultáneamente, separadamente, o secuencialmente una cantidad efectiva del anticuerpo de la presente invención y otro agente al paciente. El otro agente puede ser cisplatina.

Por consiguiente, el anticuerpo de la invención se enlaza a formas mutantes y que se originan naturalmente de FGFR-3 e inducen degradación de FGFR-3, son capaces de inhibir tumores actuando sobre las células tumorales asi como también en componentes estromales, tienen amplio valor terapéutico en el tratamiento del cáncer.

El término "anticuerpo", incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras idénticas (L) , interconectadas por un enlace disulfuro. Las cadenas individuales pueden plegarse en dominios que tienen tamaños similares (110-125 aminoácidos), y estructuras, pero diferentes funciones.

Un "anticuerpo aislado", es un anticuerpo que (1) ha sido parcialmente, sustancialmente o completamente purificado de una mezcla de componentes; (2) ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural; (3) es monoclonal; (4) está libre de otras proteínas de las mismas especies; (5) es expresado por una célula a partir de diferentes especies; o (6) no ocurre en la naturaleza. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales podrían interferir con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos . Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen, un anticuerpo que ha sido purificado de afinidad, un anticuerpo que ha sido hecho por un hibridoma u otra línea de células in vitro, o un anticuerpo humano, derivado de un ratón transgénico .

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población, son sustancialmente idénticos, excepto para mutaciones posibles que se originan naturalmente o variaciones post-traduccionales menores que pueden estar presentes. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico único (también conocido como determinante o epitope) . Además, contrario a preparaciones de anticuerpo convencional (policlonal) el cual típicamente incluye diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una determinante única en el antígeno. El modificador "monoclonal", indica el carácter del anticuerpo como se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, y no está construido para requerir la producción del anticuerpo por cualquier método particular.

El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, incluye anticuerpos que tienen regiones constantes y variables que corresponden a las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana como se describe en Kabat et al., Chothia et al., y Martin, supra. El anticuerpo humano de la invención puede incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis específica del sitio o aleatoria in vitro, o por mutación somática in vivo) , por ejemplo, en las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) . El anticuerpo humano puede tener al menos, una posición reemplazada con un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido que mejora la actividad, el cual no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana. Sin embargo, el término "anticuerpo humano" como se usa en la presente, no está propuesto para incluir anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la linea germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, han sido injertadas sobre secuencias de estructura humana.

La frase "anticuerpo recombinante humano", incluye anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes , tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera, los anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpo humano combinatorial , recombinante, anticuerpos asilados de un animal que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquiera de otros medios que involucran empalme de secuencias del gene de inmunoglobulina humana a otras secuencias de DNA. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana .

La cadena ligera puede comprender un dominio variable (abreviado aquí como VL) y/o un dominio constante (abreviado aquí como CL) . Las cadenas ligeras de anticuerpo son ya sea cadenas ligera kappa (?) o cadenas ligera lambda (?) . La expresión en VL, como se usa en la presente, está propuesta para incluir tanto las regiones variables de las cadenas ligeras de tipo kappa (VK) y de las cadenas ligeras de tipo lambda (VA) . La cadena pesada también puede comprender un dominio variable (abreviado aquí como VH) y/o, dependiendo de la clase o isotipo del anticuerpo, tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3, y CH4). En humanos, los isotipos son IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, con IgA e IgG además subdivididos en subclases o subtipos (IgAl-2 e IgGl-4) .

La presente invención incluye anticuerpos de cualquiera de las clases o subclases mencionadas anteriormente. El IgG humano es el isotipo preferido para el anticuerpo de la presente invención. Tres regiones llamadas hipervariable o CDRs, se encuentran en cada una de VL y VH, las cuales son soportadas por regiones menos variables llamadas regiones de armazón (abreviada aquí como FR) .

Los aminoácidos son designados a una región o dominio CDR particular, de conformidad con la convención Kabar (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)) o convención Chothia (C. Chothia y A.M. Lesk, J. Mol. Biol . 196 (4) : 901-917 (1987) o por Martin, (Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Datábase by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133.) Cada VH y VL está compuesto de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas del término amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. La porción de un anticuerpo que consiste de dominios VL y VH es designada Fv (fragmento variable) , y constituye el sitio de enlace al antigeno. La cadena única Fv (scFv) es un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio VI y un dominio VH en una cadena de polipéptido, en donde el N término de un dominio y el C-término del otro dominio, están unidos por un enlazador flexible (véase por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,946,778 (Ladner et al.), WO 88/09344, (Huston et al . ) ) .

Los fragmentos que tienen características de enlace que son las mismas como, o son comparables a, aquellas del anticuerpo completo. Los fragmentos adecuados del anticuerpo incluyen cualquier fragmento que comprende una porción suficiente de la región hipervariable (es decir, que determina la complementariedad) para enlazarse específicamente, y con suficiente afinidad para inhibir el crecimiento de células. Tales fragmentos pueden por ejemplo, contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo contienen las seis regiones que determinan la complementariedad del anticuerpo completo, aunque fragmentos funcionales que contienen algunos de todas las regiones, tal como tres, cuatro o cinco CDRs, están también incluidas. Fragmentos preferidos son anticuerpos de cadena única o fragmentos Fv. Fragmentos más preferidos son bivalentes. Anticuerpos de cadena única son polipéptidos que comprende al menos, la región variable de la cadena pesada del anticuerpo y la región variable de la cadena ligera, con o sin un enlazador de interconexión. De este modo, fragmentos Fv comprenden el sitio de combinación de anticuerpo completo. Estas cadenas pueden ser producidas en bacterias o en células eucarióticas.

Fab (Fragmento de enlace al antigeno), se refiere a los fragmentos del anticuerpo que consisten de los dominios VL, CL, VH, CHl. Aquellos generados después de la digestión de papaina simplemente son referidos como Fab y no retienen la región de articulación de cadena pesada. Después de la digestión de pepsina, varios Fabs que retienen la articulación de cadena pesada, son generados. Aquellos fragmentos con los enlaces disulfuro intercadena intactos, son referidos como F(ab' )2, mientras un Fab' único, resulta-cuando los enlaces disulfuro no son retenidos. Los fragmentos F(ab' )2 tienen avidez superior para el antigeno que los fragmentos Fab monovalentes.

Fe (fragmento de cristalización) es la designación para la porción o fragmento de un anticuerpo que comprende dominios constantes de cadena pesada apareados. En un anticuerpo IgG, por ejemplo, el Fe comprende dominios CH2 y CH3. El Fe de un anticuerpo IgA o IgM, además comprende un dominio CH4. El Fe está asociado con el enlace al receptor Fe, activación de la citotoxicidad mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Para anticuerpos tales como IgA e IgM, los cuales son complejos de proteínas similares IgG múltiples, la formación del complejo requiere dominios constantes Fe.

La región de articulación separa las porciones Fab y Fe del anticuerpo, proporcionando motilidad de Fabs relativos entre sí y relativos a Fe, así como también que incluyen enlaces disulfuro múltiples para enlace covalente de las dos cadenas pesadas.

De este modo, un anticuerpo de la invención incluye, pero no se limita a, anticuerpos que se originan naturalmente, anticuerpos humanos, anticuerpos humanos recombinantes , anticuerpos monoclonales, fragmentos de digestión, fragmentos bivalentes tales como (Fab' )2, fragmentos monovalentes tales como Fab, anticuerpos de cadena única, Fv de cadena única (scFv), anticuerpos de dominio único, anticuerpos de cadena única multivalentes, diacuerpos, triacuerpos y similares, que se enlazan específicamente con antígenos .

Un anticuerpo de la presente invención es específico para FGFR-3. La especificidad de anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo por un epítope particular de un antígeno. El anticuerpo puede exhibir tanto selectividad de especies como de molécula, o puede ser selectivo con respecto a la molécula solamente y enlazarse a FGFR-3 de más de una especie. El anticuerpo de la invención, puede enlazarse a FGFR-3 de humano, murino, rata, perro y/o conejo. Preferiblemente, el anticuerpo se enlaza al FGFR-3 humano. Los formatos de anticuerpo han sido desarrollados que retienen la especificidad de enlace pero que también tienen otras características.

Un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, puede ser monoespecífico, biespecífico o multiespecífico . Los anticuerpos biespecífieos (BsAbs) , son anticuerpos que tienen dos diferentes especificidades o sitios de enlace al antígeno. Los anticuerpos multiespecífieos tienen más de dos diferentes especificidades o sitios de enlace al antígeno. En donde un anticuerpo tiene más de una especificidad, los epítopes reconocidos pueden ser asociados con un antígeno único o con más de un antígeno.

La especificidad de los anticuerpos FGFR-3 puede ser determinada basada en la afinidad y/o avidez. La afinidad representada por la constante de equilibrio para la disociación del antigeno con un anticuerpo (Ka) , mide la intensidad de enlace entre un determinante antigénico y un sitio de enlace al anticuerpo. La avidez es la medida de la intensidad o enlace entre un anticuerpo con su antigeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epitope como con su sitio de enlace al antigeno en el anticuerpo, y la valencia del anticuerpo, la cual se refiere al número de sitios de enlace al antigeno de un epitope particular. Los anticuerpos se enlazan típicamente con una constante de disociación (KD) de aproximadamente 10"5 hasta aproximadamente 10"11 litros/mol (por ejemplo, KD <100 M) . Cualquier KD de menos de aproximadamente 10~4 litros/mol, es en general, considerado por indicar el enlace no específico -a menor valor de KD, más fuerte la intensidad de enlace entre un determinante antigénico y el sitio de enlace de anticuerpo .

En ciertos aspectos, el anticuerpo de la invención se enlaza a FGFR-3 con un KD de preferiblemente aproximadamente 1 x 10~8 M-1 o menos, más preferiblemente aproximadamente 1 x 10"9 M_1 o menos, más preferiblemente aproximadamente 1 x ÍCT10 M"1 o menos, y más preferiblemente aproximadamente 1 x 10"11 M"1 o menos. Véase Tabla 1 siguiente.

Tabla 1: Afinidades de enlace de anticuerpo 1 a variantes de empalme FGFR-3 humano y murino En ciertos aspectos, el anticuerpo de la presente invención preferiblemente tiene un KD de aproximadamente 5.0 x 10-10 hasta aproximadamente 1.5 x 10-11 M, aproximadamente 1.0 x 10-10 M hasta aproximadamente 1.0 x 10-11 M o aproximadamente 1.5 x 10-11 M hasta aproximadamente 7.5 x 10-10 M.

Como se usa en la presente, los términos "enlace de bloqueo" e "inhibe el enlace" usado intercambiablemente, se refiere a bloqueo/inhibición de enlace de una citocina a su receptor, resultando en completa o inhibición parcial o reducción de una función biológica de la trayectoria de la señal del receptor/citocina . El bloqueo/inhibición de enlace de FGF a FGFR-3 es valorado midiendo la inhibición completa o parcial o reducción de uno o más indicadores in vitro o in vivo de la actividad de FGF tal como, enlace al receptor, un efecto inhibidor en el crecimiento celular, quimiotaxis, apoptosis, fosforilación de proteina intracelular, o transducción de señal. La capacidad para bloquear el enlace de FGF a FGFR-3 puede ser medido por ELISA como se describe en la presente. El anticuerpo de la invención es un antagonista que bloquea el receptor FGFR-3 en la activación inducida por ligando en células vivas. Los ensayos de enlace se pueden llevar a cabo usando una variedad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, ELISA. Como se usa en la presente, "compite para enlace" se refiere a la situación en la cual un anticuerpo reduce el enlace o señalización por al menos aproximadamente 20%, 30%, 50%, 70% o 90% como se mide por una técnica disponible en el arte, por ejemplo, competencia ELISA o medición KD con BIAcore, pero no se pretende eliminar completamente el enlace .

La secuencia de aminoácido de cadena pesada se describe en la SEC ID NO. 9. La secuencia de aminoácido de cadena ligera se describe en la SEC ID NO. 10. En otro aspecto, el anticuerpo de la invención tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o las seis regiones que determinan la complementariedad de cualquiera de las CDRs del anticuerpo 1.

El anticuerpo de la presente invención también incluye aquellos para los cuales las características de enlace han sido mejoradas por mutación directa, métodos de maduración de afinidad, exhibición de fago o intercambio de cadena. La afinidad y especificidad pueden ser modificadas o mejoradas por mutación de CDR y/o residuos de estructura y selección para sitios de enlace al antígeno que tienen las características deseadas (Véase por ejemplo, Yang et al., J.

Mol. Biol. 254:392-403 (1995)). Una forma es aleatorizar residuos individuales o combinaciones de residuos de manera que en una población de otros sitios de enlace al antigeno son idénticos, las subseries desde dos hasta veinte aminoácidos, se encuentran en posiciones particulares. Alternativamente, las mutaciones pueden ser inducidas sobre un intervalo de residuos por error usando métodos de PCR (véase por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., (1992) 226:889-96). En otro ejemplo, los vectores de exhibición de fago que contienen genes de región variable de cadena ligera y pesada, pueden ser propagados en cepas mutadoras de E. coli (véase por ejemplo, Low et al., J. Mol. Biol. 250:359-68 (1996) .

Un proceso de selección in vitro puede entonces ser adecuadamente usado para seleccionar aquellas secuencias de aminoácido de región variable adicionales para fragmentos Fab que tienen la reactividad cruzada reivindicada e in vitro. En esta forma fragmentos Fab adicionales son identificados, que son adecuados para preparar un anticuerpo humanizado de conformidad con la presente invención. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de las armazones está restringida a una, dos o tres posiciones dentro de una o cada una de las secuencias de armazón descritas en la presente. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de las CDRs está restringida de una a tres posiciones dentro de una o cada CDR, más preferiblemente, se realiza la sustitución en una o dos posiciones de aminoácido dentro de una o cada CDR. Preferida además, la sustitución de aminoácido se realiza en una o dos posiciones de aminoácido en las CDRs de la región variable de cadena pesada. Una metodología adecuada para combinar CDR y sustituciones de armazón para preparar anticuerpos alternativos de conformidad con la invención, usando un anticuerpo descrito en la presente como un anticuerpo precursor, se proporciona en Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151-162.

El anticuerpo de la presente invención puede ser producido por métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen métodos inmunológicos descritos por Kohler and Milstein en Nature 256:495-497 (1975) y Campbell en "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" en Burdon et al., Eds . , Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 13, Elsevier Science Publishers, Holanda (1985); así como también por método de DNA recombinante descrito por Huse et al. En Science 246:1275-1281 (1989) .

Los anticuerpos humanos también se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de exhibición de fagos (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). Las técnicas de Colé et al. y Boemer et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boemer et al., J. Immunol. 147 (1) :;86-95 (1991)). El anticuerpo de la invención secretado por subclones, pueden ser aislado o purificado de medio de cultivo o fluido de ascitos por procesos de purificación de inmunoglobulina convencional tal como, por ejemplo, Sefarosa de proteína A, cromatografía hidroliapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ácido polinucleico que codifica para el anticuerpo de la invención se obtiene por técnicas de biología molecular estándares.

La invención también incluye células hospederas para transformación de vectores y expresión de anticuerpos. Las células hospederas preferidas incluyen células de mamífero, tales como NSO (células de mieloma de ratón no secretante (o) ) , células 293 y CHO, y otras líneas de células de origen linfoide tal como células de linfoma, mieloma, o hibridoma. Otros hospederos eucarióticos, tales como levadura, pueden ser usados.

Son conocidos los vectores para expresar proteínas en bacterias, especialmente E. coli. Tales vectores incluyen los vectores de PATH descritos por Dieckmann and Tzagoloff en J. Biol. Chem. 260:1513-1520 (1985). Estos vectores contienen secuencias de DNA que codifican antranilato sintetasa (TrpE) seguido por un polienlazante en el término carboxi. Otros sistemas de vector de expresión se basan en beta-galatosidasa (pEX) ; lambda PL; proteina de enlace de maltosa (pMAL) ; y glutationa S-transferasa (pGST) . Véase Gene 67:31 (1988) y Peptide Research 3:167 (1990).

Los vectores útiles en levadura están disponibles. Un ejemplo adecuado es el plásmido lambda ZAP. Los vectores adecuados para la expresión en células de mamífero también son conocidos. Tales vectores incluyen derivados bien conocidos de SV-40, adenovirus, secuencias de DNA derivadas de retrovirus y vectores de lanzadera derivados de la combinación de vectores de mamífero funcionales, tales como aquellos descritos anteriormente, y plásmidos funcionales y DNA de fago.

Los vectores útiles en la presente invención contienen al menos, un elemento de control que está ligado a la secuencia de DNA o fragmento a ser expresado. El elemento de control es insertado en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de DNA clonada.

Después de la expresión en una célula hospedera mantenida en un medio adecuado, el polipéptido a ser expresado, se puede recuperar del medio, y purificar por métodos conocidos en la técnica. Si el polipéptido o péptido no es secretado en el medio de cultivo, las células hospederas son lisadas previo al aislamiento y purificación.

Esta invención adicionalmente proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, ácido nucleico, vector o célula hospedera de esta invención junto con un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un agente terapéutico adicional. El agente adicional puede ser un agente quimioterapéutico, por ejemplo, cisplatina.

El portador como se usa en la presente incluye portadores, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables los cuales son no tóxicos a la célula o mamífero que se expone a estos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Frecuentemente el portador farmacéuticamente aceptable es una solución de pH amortiguado acuosa. En otro aspecto de la invención, anticuerpos anti-FGFR-3 o fragmentos de anticuerpo, pueden ser químicamente o biosintéticamente ligados a agentes anti-tumorales o agentes que producen señal detectable, particularmente cuando el anticuerpo es internalizado. Un anticuerpo a FGFR-3 puede inhibir la activación del receptor (FGFR-3 fosforilado) , así como también activación de las moléculas de señalización corriente abajo, que incluyen fosfor- APK y fosfor-AKT en varias células de cáncer, tales como células de cáncer de vejiga, los cuales resultan en inhibición de su capacidad proliferativa .

El anticuerpo de la presente invención, puede enlazarse a FGFR-3 que se origina naturalmente o sus formas de empalme o mutantes del mismo. "Formas de empalme" de FGFR-3, significan las formas de los exones que codifican el tercer dominio similar a IgG de FGFR-3 llamado FGFR-3 (Illb) y FGFR-3 (lile) . El mutante FGFR-3 incluye aquellas formas del receptor alteradas por replicación de DNA o errores en la traducción. Las mutaciones pueden ser mutaciones de ganancia de función que intensifican la actividad de los receptores mutantes a través de los mecanismos tales como activación constitutiva, vida media prolongada y sensibilidad incrementada del ligando.

El anticuerpo de la presente invención se puede enlazar al dominio 2 de FGFR-3 de tipo nativo (SEC ID NO. 12) . Un residuo de arginina en la posición 173 de las secuencias FGFR-3 de ratón y humanas no es compartido por los otros miembros de la familia, sugiriendo que este residuo es probablemente responsable de la especificidad de FGFR-3 exhibida por el Anticuerpo 1.

El anticuerpo de la presente invención induce degradación de FGFR-3. Degradar significa desintegrar el receptor de manera que no puede realizar ampliamente su función de señalización.

El anticuerpo de la presente invención puede neutralizar la activación de PGFR-3. En esta especificación, la neutralización de un receptor significa la inactivación de la actividad de cinasa intrínseca del receptor para transducir una señal. Neutralización, por ejemplo, puede ocurrir por un anticuerpo que bloquea el acceso de ciertos epítopes a un ligando, o cambiando la conformación de FGFR-3 en cierta manera de manera que el ligando, particularmente FGF, no puede activar el receptor todavía aunque pueda enlazar el receptor. La sub-regulación puede ocurrir cuando las células que expresan FGFR-3 disminuyen el número de tirosina cinasas de receptor FGFR-3 en su superficie, por ejemplo, induciendo la internalización o degradación del receptor, o inhibiendo la expresión de FGFR-3. Por lo tanto, la neutralización tiene varios efectos, incluyendo inhibición, disminución, inactivación y/o interrupción del crecimiento (proliferación y diferenciación) , angiogénesis (reclutamiento de vasos sanguíneos, invasión, y metástasis), y motilidad celular y metástasis (invasividad y adhesión celular) .

Una medida de la neutralización de FGFR-3 es la inhibición de la actividad de tirosina cinasa del receptor. La inhibición de tirosina cinasa se puede determinar usando métodos ya conocidos; por ejemplo, midiendo el nivel de autofosforilación del receptor de cinasa recombinante, y/o fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. Por consiguiente, los ensayos de fosforilación son útiles en la determinación de anticuerpos de neutralización en el contexto de la presente invención. La fosforilación se puede detectar, por ejemplo, usando un anticuerpo especifico para fosfotirosina en un ensayo de ELISA o un análisis de manchado western. Algunos ensayos para la actividad de tirosina cinasa se describen en Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 283:1433-44 (1997) y Batley et al., Life Sci. 62:143-50 (1998) .

Además, el anticuerpo de la invención puede inhibir la señalización por las células tumorales mismas, puesto que muchas células tumorales tienen FGFR-3 en su superficie celular. El anticuerpo de la invención puede ser usado para tratar un mamífero en necesidad del mismo. "Tratar" una enfermedad incluye inhibir la enfermedad, detener o retardar su desarrollo; aliviar la enfermedad, o causar regresión de los síntomas de la enfermedad.

El anticuerpo y composiciones de la invención se pueden usar para tratar cáncer. El cáncer puede ser refractario o de primera línea. Los cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de cerebro, pulmón, célula escamosa, vejiga, gástrico, pancreático, mama, cabeza, cuello, renal, riñon, ovarios, próstata, colon, colorrectal, esofágico, ginecológico (ovárico, endometrial ) , próstata, estómago, o tiroides, leucemia, y linfoma. Adicionalmente, los cánceres que se pueden tratar por los anticuerpos y composiciones de la invención incluyen mieloma múltiple, carcinoma colorrectal, sarcoma de Ewing, coriocarcinoma .

La administración se logra por cualquier fuente de administración adecuada, incluyendo inyección, infusión, oralmente, parenteralmente, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente.

El método de tratamiento descrito en la presente se puede realizar con el anticuerpo que se administra con otro tratamiento, particularmente agentes anti-neoplásticos . El tratamiento anti-neoplástico puede incluir moléculas orgánicas pequeñas- Los ejemplos de tales moléculas orgánicas pequeñas incluyen agentes citotóxicos y/o quimioterapéuticos tales como taxol, doxorrubicina, actinomicina-D, cisplatina, metotrexato, irinotecan (CPT-11), gemcitabina, oxiplatina, fluorouracilo (5-FU), leucourina (LU) , cisplatina, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, epotilona, cisplatina/carboplatina y adriamicina Pegilada. Un tratamiento preferido de la invención es la administración del anticuerpo con cisplatina.

El agente anti-neoplástico puede también ser radiación, la fuente de la radiación puede ser ya sea externa (terapia de radiación de haz externa - EBRT) o interna (braquiterapia - BT) al paciente a ser tratado. La dosis de agente anti-neoplástico administrado depende de numerosos factores, incluyendo, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y severidad de tumor a ser tratado y la ruta de administración del agente. La presente invención no se limita a cualquier dosis particular.

La administración de los anticuerpos FGFR-3 con otros anticuerpos y/o tratamientos puede ocurrir simultáneamente, o separadamente, vía la misma o diferente ruta, al mismo o diferente tiempo. Además, el anticuerpo se puede conjugar con uno o más de los otros agentes para administración .

Los métodos de tratamiento descritos en la presente se pueden usar para tratar cualquier mamífero adecuado, incluyendo primates, tales como monos y humanos, caballos, vacas, gatos, perros, conejos, y roedores tales como ratas y ratones. Preferiblemente, el mamífero a ser tratado es humano .

Ejemplos Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se proponen limitar el alcance de la presente invención en cualquier forma. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales, tales como aquellos empleados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de genes que codifican polipéptidos en tales vectores y plásmidos, o la introducción de plásmidos en células huésped. Tales métodos son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica y se describen en numerosas aplicaciones incluyendo Sambrook, J., Fritsch, E. F. y aniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Ejemplo 1 Generación de antagonista de anticuerpo específico de FGFR-3 FGFR-Fc humano recombinante , FGFs humanos recombinantes , cebadores habitualmente sintetizados, enzimas de restricción y polimerasas de DNA, se pueden obtener a partir de vendedores o preparados por métodos conocidos.

Se paneó una biblioteca de bacteriófago Fab humano naive contra el dominio extracelular FGFR-3 humano con tubos revestidos con 10 de proteínas recombinantes (ECD)-Fc del dominio extracelular FGFR-3 ( lile) , de conformidad con protocolos de paneo publicados. Se eluyen los fagos retenidos del proceso de paneo e infectan las células hospederas bacterianas con los fagos retenidos. Se recolectan los fagos producidos por las células hospederas. Se repiten los procedimientos anteriores una vez más. Se transfieren colonias individuales de células hospederas infectadas en placas de 96 cavidades que contienen 100 µ?/cavidad de 2xYTAG, y se hace crecer el fago en la presencia de 10 µ? de fago auxiliador M13K07 ( 5xl010pfu/ml) . Las placas se incubaron a 37°C por 30 minutos sin sacudimiento después por 30 minutos con sacudimiento (100 rpm) . Se prepararon pellas celulares por centrifugación a 2,500 rpm por 10 minutos, se resuspendieron en 200 µ? de 2xYTAK, y se incubó a 30°C con sacudimiento (100 rpm) durante la noche. Las placas se centrifugaron a 2, 500 rpm por 10 min. Se transfirieron los sobrenadantes en placas frescas y mezclaron con amortiguador de bloqueo 6x (18% leche/PBS) por 1 hr. Se seleccionaron clones de fago usando el enlace ELISA y bloquearon ensayos como se describe abajo. Se seleccionaron clones de fago que se enlazan a FGFR-3(IIIb) o FGFR-3 (IIIc) , después de esta combinación, se seleccionaron aquellos que bloquean los receptores del enlace al ligando FGF-1. Se determinaron las secuencias de DNA de los clones que tanto se enlazan como bloquean el receptor de conformidad con las técnicas de secuencia estándar. Cada secuencia DNA única se mantiene y el clon de fago correspondiente es designado como candidatos de fago bloqueadores de FGFR-3. Se prepararon Fabs solubles a partir de estos candidatos de fago. Se repitió el enlace ELISA y ensayos de bloqueo usando Fabs purificados para confirmar la actividad de bloqueo. Se diseñó por ingeniería los bloqueadores Fab confirmados en anticuerpos de tamaño completo por clonación de las CDRs (SEC ID NO. 1-6) en una estructura IgGl humana de conformidad con las técnicas publicadas. Se usó el ensayo ELISA para determinar el enlace de Anticuerpo 1 a proteínas solubles recombinantes FGFR-1 (IHb), FGFR-1 (IIIc), FGFR-2 (Illb), FGFR-2 (IIIc), y FGFR-4 ECD. Se seleccionaron anticuerpos que muestran alta afinidad de enlace a formas de empalme tanto b como c de FGFR-3, pero baja afinidad de enlace a otros receptores FGFR.

Ejemplo 2 Anticuerpo 1 El anticuerpo 1 puede ser biosintetizado en un sistema de expresión de mamífero adecuado usando métodos ya conocidos y pueden ser purificados por métodos ya conocidos.

Las secuencias de aminoácido para el Anticuerpo 1 se dan abajo.

Cadena Pesada Cadena Ligera GYMFTSYGIS GGNNIGDKSVH CDRl (SEC ID NO 1) (SEC ID NO 4) WVSTYNGDTNYAQKFQG LDTERPS CDR2 (SEC ID NO 2) (SEC ID NO 5) VLGYYDSIDGYYYGMDV QVWDSGSDHVV CDR3 (SEC ID NO 3) (SEC ID NO 6) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWM QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNN GWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTT IGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTE V DTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYC RPSGI PERMSGSNFGNTATLTITRVE ARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGT AGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTK TVTVSS LTVLG (SEC ID NO 8) (SEC ID NO 7) Cadena SEC ID NO: 9 SEC ID NO: 10 completa ENSAYOS Ensayo de enlace ELISA Se revistieron FGFRs recombinantes a una concentración de lpg/ml en PBS en placas de 96 cavidades a temperatura ambiente por 2 horas. Se lavaron las placas 3 veces con 0.2% de Tween20/PBS, y se bloqueó con 5% leche/PBS por 2 hrs antes del uso. Se agregaron fagos, Fabs o anticuerpos a la placa a temperatura ambiente por 2 horas más. Se detectaron las moléculas capturadas usando un anticuerpo secundario comercial apropiado y se detectaron de conformidad con las instrucciones de los proveedores.

Ensayo de bloqueo ELISA Se revistieron FGFs recombinantes en placas microtituladoras Immulon® 2B (ThermoLab Systems, Franklin, MA) a concentraciones de 0.5-2 ug/ml por 2 hrs a temperatura ambiente. Se lavaron las placas con 0.2% de Tween20/PBS, y se bloqueó con 5% de leche/PBS por 2 hrs antes del uso. Se diluyeron serialmente fagos, Fabs o anticuerpos con 5 pg/ml de heparina, 5% leche, PBS . Se agregaron proteínas recombinantes solubles etiquetadas Fe, FGFR-3(IIIb) o (lile) ECD (dominio extracelular) , a una concentración final de 1 pg/ml . Se incubó la mezcla a temperatura ambiente por 1 hr antes de transferir las placas revestidas con FGF-1, y se incubó a temperatura ambiente por 2 horas adicionales. Se lavaron las placas 3 veces con 0.2% de Tween20/PBS. Se detectaron los receptores unidos usando un anticuerpo monoclonal Fe anti-humano, acoplado con solución de peroxidasa de rábano picante (HRP) preparada de conformidad con las instrucciones del proveedor. El bloqueo de actividades conduce a señales reducidas.

Afinidad de enlace del Anticuerpo 1 a FGFR-3(IIIb) y FGFR-3(IIIc) humano y de ratón Se determinaron las cinéticas de enlace al anticuerpo FGFR-3(IIIb) y (lile) usando un biosensor BiaCore® 3000 (BiaCore, Inc., Piscataway, NJ) a temperatura ambiente después de los protocolos estándares sugeridos por el fabricante. El sumario de los resultados expuestos en la Tabla l, indican que el anticuerpo se enlaza a formas de empalme tanto b como c de FGFR-3 humano, asi como también reacciona cruzado completamente con el receptor FGFR-3 (IIIc) de ratón con afinidades de menos de 10"9 M.

Especificidad al Anticuerpo 1 a FGFR-3 unido a la membrana Se clonó el cDNA de FGFR-3 (IIIc) de murino en un vector de expresión pBABE que contiene el gene de selección de puromicina. Se realizaron expresiones retrovirales de plásmidos resultantes en células L6. Las células se seleccionaron y cultivaron en medio DMEM que contiene 10% de FBS y 2 g/ml de puromicina. Se suspendió el FGFR-3 que expresa células L6 en 1% BSA/PBS. Se agregó el anticuerpo 1 a las concentraciones finales de 1-30 g/ml. Después de una incubación de 1 hora en hielo, las células se lavaron en 1% de BSA/PBS y se incubó con un anticuerpo de detección secundario apropiado o fragmentos Fab en el mismo amortiguador por 1 hora en hielo. Se tiñeron las muestras de control solamente con este anticuerpo secundario. Se analizaron todas las muestras usando citómetro de flujo FACSvantage SE (BD Biosciences) . El anticuerpo 1 es especifico a FGFR-3, como se muestra produciendo señales de teñido positivas solamente cuando son usadas células transfectadas FGFR-3 (R3-L6) , pero no cuando se usan las células parentales L6 negativas FGFR-3.

Células de riñon embriónicas humanas (HEK) 293, 293fectina, Medio FreeStyle 293 y Medio OptiMEM pueden ser adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA) . El medio de purificación de afinidad de proteina-A puede ser adquirido de GE Healthcare. Generando un constructo de DNA para FGFR(IIIb) -Fe.

Producción de FGFR-3 (Illb) -Fe, dominios truncados de Ig de FGFR-3 (Illb) -Fe, y mutantes de residuo alanina simple de FGFR-3 (Illb) -Fe.

Limites de dominio de FGFR-3 (III)b pueden ser definidos con base en el modelo de dominio 3D extracelular de FGFR-3 (Illb) asi como también las estructuras cristalinas de los FGFRs, las cuales se conocen. Se diseñaron cinco constructos ECD truncados de FGFR-3 ( Illb) , es decir DI (25-148), D2 (149-245), D3 (250-372), Dl-2 (25-245) y D2-3 (149-372) junto con el Dl-3 (25-372) de FGFR-3 (Illb) de tipo nativo. Los constructos son subclonados en un vector de pGS con una etiqueta Fe diseñada en el extremo 3' del sitio de clonación múltiple y las secuencias confirmadas. Veinte residuos FGFR-3 (Illb) en proximidad a la región de enlace del ligando putativo, asi como también aquellos implicados en el enlace a heparina y dimerización del receptor-receptor, se seleccionaron con base en el modelo ECD de FGFR-3(IIIb) y la estructura de FGFR-3(IIIc) como se conoce. Se generaron mutantes de residuo de alanina único ECD de FGFR-3(IIIb) vía PCR traslapante usando el constructo ECD de FGFR(IIIb) de longitud completa como la plantilla, y subsecuentemente subclonado en el vector pGS-Fc. Los dominios truncados y mutantes de alanina son expresados temporalmente en células 293 después de la transfección usando 293fectin™ (Invitrogen) . Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron 6 días posteriores a la transfección y los Fe que contienen las proteínas se purifican pasando sobre una columna de afinidad de proteína-A, el amortiguador se intercambió en PBS, cuantificó y evaluó por análisis de SDS— PAGE para confirmar la integridad estructural.

Ensayo de enlace de Mesoscala de FGFR-3 (Illb) -Fe : Una solución purificada de Anticuerpo -1 se diluye a una concentración de 2mg/ml en PBS. Éster-NHS Sulfo-TAG MSD (MesoScale Discovery, #R91AN2), un éster de N-hidroxisuccinimida de rutenio-tris-bipiridina, se reconstituyó con agua destilada fría a una concentración de 10nmol/ul. Se usó una relación molar 12:1 de Éster-NHS Sulfo-TAG MSD al Anticuerpo 1 para la reacción. Las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente, protegieron de la luz, por 2 horas. El éster-NHS Sulfo-TAG MSD sin reaccionar se removió del Anticuerpo 1 conjugado usando una resina desalante. El Anticuerpo 1 conjugado con rutenio se almacenó a -80°C. La concentración del Anticuerpo 1 conjugado se determina usando albúmina de suero bovino para la curva estándar.

El FGFR-3 ( I I Ib) -Fe truncado, mutante o de tipo nativo se diluye en PBS de salina amortiguada con fosfato a 5pg/mL. Placas estándares de 96 cavidades se revistieron con 25ng/cavidad de receptor e incubaron por lhr a temperatura ambiente. Para bloquear el enlace no especifico en las cavidades, 150 \i de Bloqueador A SD al 5% (MesoScale Discovery, #R93Ba-l) se agregaron a cada cavidad. Las placas se incubaron por 1 hr a temperatura ambiente. La solución de bloqueo se removió y las placas se lavaron cinco veces con 200 pL de PBS, pH 7.4, 0.02% Tween®-20. Una serie de tres veces la dilución (250 - 0.001 nM) del Anticuerpo 1 etiquetado con rutenio se agregó en un volumen de 25 pL por triplicado para cada proteina siendo probada. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente con agitación suave y protegida de la luz, el anticuerpo etiquetado libre de rutenio se removió realizando otros cinco lavados con PBS, pH 7.4, 0.02% Tween-20, 200 \iL por cavidad. Después de este lavado, 150 pL de amortiguador de lectura IX (MesoScale Discovery, #R92TC-2) se agregó a cada cavidad. Después de la estimulación electroquímica, la etiqueta de rutenio en el anticuerpo unido emitió luz luminiscente a 620 nm. Las señales electroqumioluminiscentes ECL se detectaron por una cámara de dispositivo acoplado a carga en un lector de placa SECTOR Imager 2400 (MesoScale Discovery, #1250) y se expresaron como ECLU. Las señales ECL se trazaron en software GraphPad Prism versión 5.0. Los valores KD son calculados por análisis de ajuste de curva de regresión no lineal de la función de Enlace Especifico en Un Sitio del software. El enlace del Anticuerpo 1 etiquetado con rutenio al FGFR-3(IIIb)-Fc de tipo nativo se usó como un estándar para el análisis de afinidad de enlace relativo de los FGFRs mutantes o truncados, trazados como un porcentaje del tipo nativo.

Ensayo de enlace ELISA de Mab B9: Las cavidades de una placa microtituladora ELISA de 96 cavidades se revistieron durante la noche con 200n g de un anticuerpo monoclonal anti-FGFR-3, B9 (Santa Cruz sc-13121), en 100 \iL de PBS, pH 7.2 con agitación leve a 4°C. Después del revestimiento, la solución de anticuerpo se decantó y las cavidades se bloquearon con 100 pL de salina amortiguada de fosfato con 0.1% de Tween (PBST) , 5% de albúmina de suero Bovino (BSA) por 2 horas a temperatura ambiente con agitación leve. Después del bloqueo, las cavidades se lavaron 5 veces con 200 pL de PBST. Una serie de tres veces la dilución (100 - 0.006 nM) del FGFR-3(IIIb)-Fc de tipo nativo o mutante entonces se agrega en 100 pL de PBST, 1% de BSA por triplicado para cada proteina a ser probada e incubada con agitación leve por 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades son lavadas nuevamente 5 veces con 200 yL de PBST. Una dilución 1:5000 de IgG antiratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en 100 u de PBST, 5% de BSA se incuba en cada cavidad por 1 hora a temperatura ambiente con agitación leve. Las cavidades son lavadas unas 5 veces finales con 200 uL de PBST después desarrolladas con 100 pL de sustrato cromogénico de peroxidasa de 3, 3 ' , 5, 5 ' -Tetrametilbenzidina (TMB) por 5 minutos. La reacción se detiene con 100 L de H2SO4 1N por cavidad. La absorbancia se mide espectroscópicamente a 450 nm. Las lecturas de absorbancia son trazadas en el software GraphPad Prism® versión 5.0. Los valores KD son calculados por el análisis de ajuste de curva de regresión no lineal de la función de Enlace Especifico de Un Sitio del software. El enlace de B9 al FGFR-3 ( Illb) -Fe de tipo nativo se usa como un estándar para el análisis de afinidad de enlace relativo de los FGFRs truncados o mutantes, trazados como un porcentaje del tipo nativo.

Modelado molecular de FGFR-3 (Illb) humano: Para ayudar a guiar los estudios de mutagénesis, se generó un modelo tridimensional de los dominios 2 y 3 del ECD de FGFR-3 (Illb) usando SWISS-MODEL®. Las secuencias de FGFR-3 (Illb) humano, y FGFR-3 (lile) humano se alinean usando el método CLUSTALW®, y el modelo se construye usando la estructura cristalina de rayos-X de FGFR-3(IIIc) como la plantilla (Código de Banco de Datos de la Proteina 1RY7) .

El epítope del Anticuerpo 1 está contenido dentro del segundo dominio similar a inmunoglobulina (Ig) de FGFR-3: Los sitios de enlace al ligando de la familia del receptor de FGFR están contenidos dentro de los tres dominios Ig N-terminales los cuales definen el dominio extracelular (Chellaiah, et al., J. Biol. Chem. 1999 Dec. 3; 274 (49) : 34785-34794) . Para determinar cuál de los tres dominios de Ig contiene el epitope del Anticuerpo 1, se emplea un panel de dominios truncados. Las secuencias de DNA que codifican los dominios humanos de Ig son truncadas en varias formas y expresadas como proteínas de fusión homodiméricas con etiquetas Fe humanas. Las proteínas codificadas son purificadas de sobrenadante acondicionado de células temporalmente transfectadas y la estructura homodimérica de cada dominio truncado purificado es confirmada por SDS-PAGE. Los truncados son entonces probados para enlace al Anticuerpo 1 en un ensayo de enlace de mesoscala (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) . Mientras el Anticuerpo 1 no mostró enlace detectable a los truncados DI y D3, mostró enlace significante a los truncados Dl-2 y D2 como se determina en un ensayo de enlace de mesoscala (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) y por BIAcore (Pharmacia, Piscata ay, NJ) . El B9 reconoce un epitope conformacionalmente sensible en el dominio 1 del receptor por lo tanto aquellos truncados que contienen el dominio 1 podría esperarse que se unan al anticuerpo si la estructura total no se altera. Los truncados DI y Dl-2 muestran significante enlace al Mab B9 de control, confirmando la integridad estructural de aquellas dos proteínas como se determina en un ensayo de enlace de mesoscala (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) y por BIAcore™ (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Los datos de enlace truncado revelan que el segundo dominio Ig de FGFR-3 es suficiente para el enlace del Anticuerpo 1 y de este modo, contienen residuos críticos al epitope.

Identificación de aminoácidos de FGFR-3 dentro del epitope reconocido por el Anticuerpo 1. Se generó un modelo tridimensional de los dominios 2 y 3 del ECD de FGFR-3 (Illb) basado en la estructura cristalina de FGFR-3 (Ule) . Veinte aminoácidos (D160, K161, K162,L163, L164,V166, P167, P220, R223, D244, N170, T171, R158, R173, R175, K205, R207, L246, E247, S249) dentro del segundo dominio de FGFR-3 que están en proximidad a o directamente involucrados en el enlace al ligando, la dimerización del receptor o enlace a heparina se identifican con base en el modelo molecular y se generan las mutaciones de alanina de residuo único.

Se determinó la secuencia de tipo nativa del dominio 2 de FGFR-3 (SEC ID NO. 12) . Cada aminoácido indicado es mutado individualmente a alanina por mutagénesis dirigida al sitio y expresado en el contexto de la proteína de FGFR ( I Ilb) -Fe que codifica el ECD completo. Las proteínas mutantes codificadas son purificadas de sobrenadante acondicionado de células temporalmente transfectadas y la estructura homodimérica de cada mutante purificado es confirmada por SDS-PAGE.

Un residuo se considera crítico al epítope si la mutación de alanina descrita anteriormente conduce a una pérdida significante de enlace al Anticuerpo 1. Todas las proteínas mutantes que muestran pérdida significante de enlace son entonces probadas para determinar el enlace a Mab B9 para verificar cambios enormes en la estructura de la proteína total. De las 20 posiciones examinadas, la substitución de Alanina por Arginina en la posición 173 (R173A) conduce a casi completa pérdida de enlace al Anticuerpo 1 (>90% de reducción de enlace comparado con WT) ; mientras las otras sustituciones retienen el enlace (<20% de reducción de enlace comparado con WT) . Las pruebas subsecuentes mostraron que el enlace a Mab B9 no fue afectado por la sustitución de R173A, sugiriendo que la posición 173 constituye un residuo crítico para el reconocimiento específico del receptor por el Anticuerpo 1. La afinidad del Anticuerpo 1 para el mutante R173A se determina por análisis BIAcore®. El enlace del Anticuerpo 1 al mutante R173A es 7 veces más pobre que la afinidad del anticuerpo para la proteina de tipo nativo.

La comparación de secuencia revela que el residuo Arginina en la posición 173 de las secuencias FGFR-3 de ratón y humanas no es compartido por los otros miembros de la familia, sugiriendo que este residuo es probablemente responsable de la especificidad de FGFR-3 exhibida por el Anticuerpo 1.

El antagonista de anticuerpo FGFR-3 bloquea el enlace FGF mediado por FGFR-3 (Illb) y FGFR-3 (lile) , y señalización celular Los resultados a partir del ensayo de bloqueo ELISA mencionado anteriormente, muestran que el anticuerpo 1 bloquea el enlace FGF-l/FGFR-3 con una IC50 dentro del intervalo de 1-10 nM. Se usó FGFR-3 que expresa células L6 descrito anteriormente, para probar las actividades de este anticuerpo en la señalización FGFR-3 en células vivas. Se hicieron quiescentes el FGFR-3 que expresa células L5 durante la noche en medio con concentración de suero muy baja (0.1%). Al siguiente día, las células se dividieron en cinco muestras de tamaño igual. La muestras tratadas 1 y 2 por 1 h con un anticuerpo de control no especifico apareado con isotipo (200 nM) y anticuerpo 1 (200 nM) , respectivamente. Las muestras se expusieron 3 por 15 minutos con 0.6 nM de FGF-9. Se trataron las muestras 4 y 5 primero por 1 h con un anticuerpo de control no especifico apareado con el isotipo (200 nM) y anticuerpo 1 (200 nM) , respectivamente, después se expuso por 15 min con 0.6 nM de FGF-9. Después de estos tratamientos y exposiciones, las células se Usaron y se sometieron a SDS-PAGE y manchado Western. Se sometió a sonda para la activación de FGFR-3 con un anticuerpo anti-fosfo-tirosina . El anticuerpo 1 solo no incrementa ni reduce las señales de FGFR-3 y MAPK activadas y la exposición al ligando FGF-9 incrementa las señales de FGFR-3 activadas y MAPK al mismo grado. Estos resultados de este modo, demuestran que el Anticuerpo 1 es un antagonista que bloquea el receptor FGFR-3 en la activación inducida por ligando en células vivas.

La superficie celular FGFR-3 es internalizada después del enlace al Anticuerpo 1 El anticuerpo 1 activa la internalización de FGFR-3, constituyendo un mecanismo de modulación descendente al receptor de señalización. Para probar esto, se etiquetó el anticuerpo con el tinte Alexa Fluor® comercialmente disponible ( Invitrogen) , para trazar la ubicación del complejo Anticuerpo l/FGFR-3. El anticuerpo 1 es conjugado y un anticuerpo de control no especifico es apareado al isotipo con el tinte fluorescente. Se vuelve quiescente el FGFR-3 que expresa células L6 durante la noche en medio con concentración muy baja de suero (0.1%) .

Se dividieron las células en 8 muestras de tamaño igual y se sembraron en cavidades de una placa de cultivo de tejido de 6 cavidades. Estas muestras son sometidas a los tres procedimientos distintos: 1) Enlace, en el cual las células son incubadas con 1 mi de 200 nM de anticuerpos conjugados por ih a 4°C. La temperatura es prohibitoriamente baja para endocitosis pero conductiva a la interacción de anticuerpo-antigeno; 2) Internalización, en la cual las células son incubadas con 1 mi de 200 mM de anticuerpos conjugados por lh a 37°C. Esta temperatura permitirá la endocitosis; 3) Retiro, en el cual las células son tratadas con 1 mL de 0.2 M glicina-0.15 M de NaCl, pH3 por 30 min a 4°C. En esta condición, los anticuerpos que no son internalizados, puede no enlazarse más al receptor de la superficie y ser liberados en el medio. Las 8 muestras de células L6 transíectadas con FGFR-3, son tratadas de conformidad con la siguiente descripción: la Muestra 1 es incubada con el anticuerpo de control conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 4°C; la muestra 2 es incubada con el anticuerpo de control conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 4°C, seguida por la extracción; La Muestra 3 es tratada con el anticuerpo de control conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 37°C; la muestra 4 es tratada con el anticuerpo de control conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 37°C seguido por extracción; la muestra 5 es tratada con Anticuerpo 1 conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 4°C. La muestra 6 es tratada con Anticuerpo 1 conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 40°C seguida por extracción; la Muestra 7 es tratada con Anticuerpo 1 conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 37°C. La muestra 8 es tratada con Anticuerpo 1 conjugado (200 nM, 1 mL) por 1 h a 37°C seguido por extracción. Después de estos tratamientos, todas las células se lavaron tres veces con 1 mi de PBS enfriado en hielo y se sometieron al sistema de Imagen Infrarroja Odyssey, para la detección de intensidad fluorescente relativa. Las lecturas de la muestra 1-8 son como sigue: 1.5, 0.6, 1.1, 1, 3.3, 1.5, 5, y 5.8. Las condiciones bajo las cuales las Muestras 1 y 5 son tratadas, permiten a la superficie de anticuerpo-célula enlazarse, pero no internalizarse. Las condiciones bajo las cuales las muestras 2 y 6 son tratadas, no permitiendo el enlace de la superficie celular ni la internalización . Las condiciones bajo las cuales las Muestras 3 y 7 son tratadas, permiten el enlace de la superficie celular e internalización. Las condiciones bajo las cuales las Muestras 4 y 8 son tratadas, permiten la internalización pero no el enlace a la superficie celular. Las señales generadas por las Muestras 1-4, asi como también la Muestra 6, son consideradas antecedente debido a las no especificidades.

Se realiza una etapa de "lavado ácido" en algunas muestras, después de la incubación para retirar los anticuerpos unidos a la superficie sin afectar aquellos que han sido traficados dentro de las células. Esto permite la cuantificación de anticuerpos internalizados. Un anticuerpo de control similarmente etiquetado (hlgG no especifico) , no es retenido con respecto de la temperatura de incubación o la etapa de lavado. Aunque el anticuerpo 1 es retenido en ambas temperaturas antes del lavado, solamente aquellos incubados a 37°C permanecen adelante; demostrando la internalización del anticuerpo por las células.

El anticuerpo 1 induce degradación del receptor FGFR-3 en células .

El OPM-2 es una linea celular originalmente aislada a partir de células de cáncer de mieloma múltiple. Las células OPM-2 se conocen por expresar receptores FGFR-3, que albergan una mutación de punto de ganancia de función K650E. Se vuelven quiescentes las células OPM-2 en medio de cultivo bajo en suero (0.1% de FBS) durante la noche. Al siguiente día, se dividieron estas células en 5 grupos. El grupo 1 es lisado inmediatamente, y el lisado se mantiene a -20°C hasta el tiempo del análisis de manchado western. Este grupo es por lo tanto, designado como muestra de Tiempo 0 hrs. El grupo 2-5 de cada uno tiene 3 muestras de tamaño igual, nombradas como A, B y C del Grupo 2, 3, 4, y 5. Las muestras A del Grupo 2-5, no son sometidas a cualquier tratamiento adicional, pero son incubadas a 37°C. Las Muestras B del grupo 2-5 son tratadas con 30 ng/ml de FGF-1 a 37°C. Las muestras C del grupo 2-5, son tratadas con ug/ml de anticuerpo 1 a 37 °C. Todas las muestras del grupo 2 son lisadas después de 1 hr de tratamiento, y los lisados son mantenidos a -20°C hasta el tiempo de manchado western. Este grupo es designado como las muestras Tiempo 1 hr. Todas las muestras del grupo 3 son lisadas después de 4 hrs de tratamiento, y los lisados son mantenidos a -20°C hasta el tiempo del análisis de manchado western. Este grupo es designado como las muestras del tiempo 4 hrs. Todas las muestras del Grupo 4 son lisadas después de 8 hr de tratamiento, y los lisados se mantienen a -20°C hasta el tiempo del análisis de manchado western. Este grupo es designado como muestras de tiempo 8 hr . Todas las muestras del Grupo 5 son lisadas después de 24 hr de tratamiento, y los lisados se mantienen a -20°C hasta el tiempo del análisis de manchado western. Este grupo es designado como muestreas de tiempo 24 hr. Cuando todos los lisados son leídos, son sometidos a SDS-PAGE seguido por experimento de Manchado Western. Las señales FGFR-3 del Grupo 1 y todas las muestras del Grupo 2 son similares. En el Grupo 3, las señales FGFR-3 de las Muestras A y C son similares a aquellas del Grupo 1; todavía la señal de la Muestra B es significantemente inferior. En el Grupo 4, la señal FGFR-3 de la Muestra A es similar a aquella del Grupo 1; todavía las señales de las Muestras B y C son significantemente inferiores. En el grupo 5, la señal FGFR-3 de la muestra A es inferior que aquella del grupo 1; todavía señales de las Muestras B y C son casi ausentes. Por lo tanto, similar a FGF-1, el cual se conoce por inducir la degradación FGFR-3 en una manera dependiente del tiempo; una característica que se cree no ha sido mostrada a la fecha.

El Anticuerpo 1 induce supresión del receptor de FGFR-3 mutante a partir de la superficie celular La mayoría de las mutaciones de activación de FGFR-3 identificadas en cáncer de vejiga se localizaron en el dominio extracelular del receptor. Estas mutaciones (por ejemplo, R248C o S249C) dan origen a un nuevo residuo de cisteína no apareado, conduciendo a la formación de dímeros de FGFR-3 ligados al disulfuro en una manera dependiente del ligando. Las mutaciones más frecuentes son S249C, Y375C y R248C, las cuales en conjunto representan 91% de todas las mutaciones de FGFR-3 en cáncer de vejiga. Además, S249C en FGFR-3 (lile) también conduce a activación constitutiva de FGFR3(IIIc). El Anticuerpo 1 puede internalizar y agotar no solamente el EGFR-3 de tipo nativo (WT) , sino también los mutantes FGFR-3 asociados al tumor más prevalentes.

Para generar lineas de células NIH-3T3 y Ba/F3 que expresan establemente cada una de las tres variantes mutantes de FGFR3 más comunes y el FGFR-3 de WT, el clon de cDNA codifica el FGFR-3 (Illb) o (lile) humano de longitud completa en el vector retraviral pMSCVpuro (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) para generar pMSCVpuro-FGFR-3 ( Illb) o (lile) . Mutaciones especificas, es decir, S249C, Y375C y R248C, se introducen en el cDNA vía QickChange (Stratagene, La Jolla, CA) . Para generar células estables NIH3T3 y Ba/F3 que expresan WT o FGFR-3 mutante, varios constructos pMSCVneo son transfectados en células empacadas Phoenix-Eco (ATCC, Manassas, VA) con Lipofectamine (Invitrogen) . Los retrovirus son recolectados y usados para infectar células NIH-3T3 y Ba/F3. Después de la selección con 2 \??/µ1 de puromicina por dos semanas, células que expresan WT o FGFR-3 mutante son teñidas con FGFR-3 anti-humano conjugado con 488 Alexa Fluor y analizadas usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) .

Para la supresión/internalización inducida por el Anticuerpo 1 del mutante y WT FGFR-3 de la superficie celular, cavidades de placas de cultivo de tejido de 6 cavidades (Costar, #3598) se sembraron con 1.5 x 105 de NIH-3T3-FGFR-3 mutante en 2 mL de medio de cultivo (DMEM (Invitrogen) ; 10% (v/v) de FCS ( Invitrogen) ; 2 mM de L-glutamina (Invitrogen); 100 U/500mL de penicilina G, y 100 pg/500 mL de estreptomicina (Invitrogen)). Las placas son incubadas por 24 horas a 37°C bajo 95% de humedad relativa y 5% (v/v) de C02. El Anticuerpo 1 es entonces agregado a las cavidades a una concentración final de 5pg/mL. Después de 2 horas de tratamiento, el medio de cultivo es removido de las cavidades y reemplazado con 1 mL de solución de disociación celular libre de enzima (Chemicon, IS-014-B) . Las células son recolectadas en tubos centrífugos después de ser incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente, y lavadas una vez en medio de cultivo seguido por un lavado más en amortiguador de enlace (DPBS con 1% (p/v) BSA y 0.01% (p/v) de azida de sodio) . Antes de teñir las células, un anticuerpo FGFR-3 que reconoce un epítope diferente del Anticuerpo 1 es etiquetado usando un Kit de etiquetación de Anticuerpo Monoclonal Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) de conformidad con las instrucciones del proveedor. Se agregan 100 pL de amortiguador de enlace que contiene 2 pg/mL del anticuerpo etiquetado Alexa Fluor 488 a las células, las cuales son entonces incubadas por 60 minutos en hielo. Las células son entonces lavadas una vez con amortiguador de enlace y resuspendidas en DPBS que contiene 2 pg/mL de yoduro dé propidio (para teñir las células muertas). La cantidad de moléculas FGFR-3 que permanecen en la superficie celular se analiza por análisis FACS, y se adquieren 10,000 eventos para cada muestra.

La intensidad de fluorescencia media en la superficie celular refleja la cantidad de moléculas de FGFR-3 que permanecen en la superficie celular después del tratamiento con Anticuerpo 1. El porcentaje de supresión de FGFR-3 en la superficie celular se calcula usando la intensidad de fluorescencia media de células tratadas con Anticuerpo 1 divididas por la intensidad de fluorescencia media de células tratadas con IgGl humano. El Anticuerpo 1 reduce significantemente tanto WT como FGFR-3 mutante a partir de superficies celulares.

Para el ensayo de proliferación de células Ba/F3-FGFR3, 80,000 células/cavidad se sembraron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS . El Anticuerpo 1 se agregó a una concentración de 0.005 a 10 ug/ml con heparina (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) . Después de la incubación por 72 hrs, las células se pulsaron con 20 ul (2 uCi)/200 ul de metil-3H timidina por 6 horas a 37°C, 5% de C02. Las células se recolectaron y contaron para incorporación de 3H timidina. El Anticuerpo 1 inhibe significantemente la proliferación de Ba/F3-FGFR-3-R248C.

El antagonista de anticuerpo FGFR-3 inhibe la señalización FGF en células de tumor que expresan FGFR-3 in vitro Se identificaron lineas celulares del tumor para expresión FGFR-3 mutante o tipo nativo (Ilb y/o lile) usando citometria de flujo en la cual, el Anticuerpo 1 es el anticuerpo primario. Las tres lineas celulares de tumor de vejiga RT112, RT4 y BFTC905 mostraron expresión de FGFR3 significante. Las células OPM-2, conocidas por expresar receptores FGFR3 que alberga una mutación de punto K650E de ganancia de función, también exhiben un nivel alto de expresión en este estudio. Se encontraron dos lineas de célula adicional, GEO y FADU por expresar moderados pero aún niveles significantes del receptor. La trayectoria de señalización FGFR3 en estas células tumorales se caracteriza usando manchado western.

La OPM-2 es una linea celular derivada de tumores de mieloma múltiple humano. Se vuelven quiescentes las células en medio de cultivo de suero bajo (0.1% de FBS) durante la noche. Al siguiente dia, se dividieron estas células en cuatro muestras de tamaño igual. Se dejó de lado y se mantuvo la muestra 1 a 37 °C por 1 hora como la muestra de control. La muestra 2 se incubó con 200 nM de anticuerpo 1 a 37°C por 1 h. Se dejó de lado la muestra 3 a 37°C por 1 hr, después se expuso la misma muestra con 0.2 nM del ligando FGF-9 a 37°C por 15 min. Se incubó la muestra 4 con 200nM de anticuerpo 1 por 37 °C por lh, después se expuso la misma muestra con 0.2 nM de FGF-9 a 37 °C por 1 hora, después se expuso la misma muestra con 0.2 nM de FGF-9 a 37°C por 15 minutos. Después, se someten a lisis las cuatro muestras y después se someten a SDS-PAGE seguido por manchado Western. Se prueba la activación de FGFR-3 con un anticuerpo anti-fosfo-Tirosina . Se prueba la activación de la molécula efectora MAPK corriente abajo con un anticuerpo anti-fosfo-MAPK. Se prueba la activación de la molécula efectora Akt corriente abajo, con un anticuerpo anti-fosfo-Akt . Las señales de fosfor-FGFR-3 de las Muestras 2 y 4 son comparables con aquellas de la Muestra 1, las cuales representan el estado no estimulado del receptor. La señal de la Muestra 3 es más del triple que aquella de la Muestra 1. Se puede concluir que el Anticuerpo 1 antagoniza el efecto de FGF-9 en la activación de FGFR-3. Las señales de fosfor-MAPK de las Muestras 2 y 4 son comparables con aquellas de la Muestra 1, las cuales representan el estado no estimulado del receptor. La señal de la Muestra 3 es más del doble que aquella de la Muestra 1. Se puede concluir que el Anticuerpo 1 antagoniza el efecto de FGF-9 en la activación de MAPK. GEO es una linea de célula derivada de tumores colorrectales humanos. Se vuelven quiescentes las células en medio de suero bajo (0.1 % de FBS) durante la noche. Al siguiente día, se dividen estas células en seis muestras de igual tamaño. Se deja de lado y mantiene la muestra 1 a 37°C por 1 h como la muestra de control. La muestra 2 se incuba con 200 nM de anticuerpo de control no específico apareado con isotipo a 37°C por 1 h. La muestra.3 se incuba con 200 mM de anticuerpo 1 a 37°C por 1. Se deja de lado la muestra 4 a 37°C por 1 h, después se expone la misma muestra con 0.67 nM de ligando FGF-1 a 37°C por 15 min. Se incuba la muestra 5 con 200 nM de anticuerpo de control a 37 °C por 1 h, después se expone la misma muestra con 0.67 nM FGF-1 a 37°C por 15 min. Se incuba la muestra 6 con 200 nM de Anticuerpo 1 a 37 °C por 1 h, después se expone la misma muestra con 0.67 nM de FGF-1 a 37°C por 15 min. Se someten a lisis las seis muestras y se someten a SDS-PAGE seguido por manchado Western. Se prueba la activación de FGFR-3 con un anticuerpo anti-fosfo-Tirosina . Las muestras 1, 2 y 4 tienen niveles bajos similares de fosfor-FGFR-3, mientras la muestra 3 sola tiene señales significantemente superiores que corresponden a los tres tipos de moléculas. Por lo tanto, 1) la exposición FGF-9 indica fosforilación de FGFR-3; 2) el Anticuerpo 1 antagoniza estos incrementos, y 3) el Anticuerpo 1 solo no tiene alguna actividad agonista.

El RT-112 es una línea celular derivada de tumores de vejiga humana. La célula se vuelve quiescente en medio de cultivo de suero bajo (0.1% FBS) durante la noche. Al siguiente día, se dividen estas células en cuatro muestras de igual tamaño. Se deja de lado y mantiene la muestra 1 a 37 °C por 1 h como la muestra de control. Se incuba la muestra 2 con 200 nM de Anticuerpo 1 a 37°C por 1 h. Se deja de lado la muestra 3 a 37°C por 1 h, después se expone la misma muestra con 1.3 nM de ligando FGF-1 a 37°C por 15 min. Se incuba la muestra 4 con 200 nM de Anticuerpo 1 a 37 °C por 1 h, después se expone la misma muestra con 0.13 nM de FGF-1 a 37°C por 15 min. Después, se someten a lisis las cuatro muestras y se somete 10% de cada muestra sometida a lisis a SDS-PAGE seguido por manchado Western. Se prueba la activación de la molécula efectora corriente abajo MAPK con un anticuerpo anti-fosfo-MAPK . Se prueba la activación de la molécula efectora corriente abajo Akt con un anticuerpo anti-fosfo-Akt. Se someten el otro 90% de cada lisado a un experimento de inmunoprecipitación . Se mezcla la muestra con un anticuerpo comercial anti-FGFR-3 a 4°C por 4-16 hrs para permitir al anticuerpo recolectar los receptores FGFR-3 en los Usados, y después se recupera el FGFR-3 unido al anticuerpo anti-FGFR-3 mezclando 20 pg de mezcla de perlillas de proteina A-proteina G (50:50, V:V) a las muestras a 40°C durante la noche. Se lavan estas perlillas 3 veces con PBS, antes de someterlas a SDS-PAGE y manchado Western. Se prueba la activación de FGFR-3 con un anticuerpo anti-fosfo-Tirosina. Las muestras 1, 2 y 4 tienen niveles bajos similares de fosfor-FGFR-3 y fosfor-MAP , mientras la muestras 3 solo tiene señales significantemente superiores que corresponden a tres tipos de moléculas. Por lo tanto, 1) la exposición a FGF-1 incrementa la fosforilación de FGFR-3 y MAPK; 2) el Anticuerpo 1 antagoniza estos incrementos y 3) el Anticuerpo 1 solo no tiene alguna actividad agonista. La muestra 4 sola tiene señal fosfor-Akt inferior que el resto, indicando que el Anticuerpo 1 puede antagonizar la señalización Akt también.

Se usan células GEO para preparar seis muestras descritas anteriormente, después se someten a lisis y se someten a SDS-PAGE seguido por manchado Western como anteriormente. Sin embargo, se prueba la activación de la molécula efectora corriente abajo MAPK con un anticuerpo anti-fosfo-MAPK . Se prueba la activación de la molécula efectora corriente abajo Akt con un anticuerpo anti-fosfo-Akt. Las muestras 1, 2, 3 y 6, tienen niveles bajos similares de fosfor-MAPK, mientras las Muestras 4 y 5 tienen señales significantemente superiores que corresponden a los tres tipos de moléculas. Por lo tanto, 1) la exposición a FGF-1 incrementa la fosforilación de MAPK; 2) el Anticuerpo 1 antagoniza este incremento, y 3) el Anticuerpo 1 solo no tiene alguna actividad agonista.

El Anticuerpo 1 inhibe el crecimiento de la célula tumoral y supervivencia in vitro Se usó un ensayo de proliferación celular para mostrar los efectos inhibidores del Anticuerpo 1 en el crecimiento de células tumorales. Se vuelven quiescentes las células RT112 de monocapa en medio de cultivo de suero bajo (0.1% de suero de bovino fetal, 5 µ?/??]_· de heparina) por 24-72 hrs . Se dividen las células en 4 muestras. Se agrega FBS (Suero Bovino Fetal) a la Muestra 1 a la concentración final de 10% (V:V). Se deja la muestra 2 en el medio de inanición. Se agrega FGF-1 a la Muestra 3 a la concentración final de 1 nM. Se agrega el anticuerpo 1 a la Muestra 4 a la concentración final de 200 nM, se incuba a 37°C por 1 hr. Después, se agrega FGF-1 a la concentración final de 1 nM. Después de preparar las Muestras 1-4 como se describe anteriormente, se incuban las muestras en un incubador de cultivo de tejidos fijo a 37°C y con 5% de C02 (v:v) por 48 horas. Se detecta el crecimiento celular usando ensayos, incorporación estándar de 3H-timidina. El crecimiento de célula tumoral se dobla cuando las células RT112 in vivo son estimuladas con 1 nM de FGF-1 exógeno. El experimento también muestra que el Anticuerpo 1 efectivamente reduce este crecimiento exogenamente estimulado.

Un ensayo de agar suave, también conocido como ensayo de formación de colonia o ensayo colonigénico, se usa para mostrar los efectos inhibidores del Anticuerpo 1 en la supervivencia de células tumorales. Las células RT112 crecen en agar suave que contiene 200 nM de Anticuerpo 1 (en 10% de medio de cultivo FBS) formando ~50% de algunas colonias que aquellas que crecen en agar suave que contiene 10% de medio de cultivo FBS solo, o contienen 200 nM de anticuerpo de control no especifico apareado al isotipo (en 10% de medio de cultivo FBS) . Esto muestra los efectos anti-supervivencia del Anticuerpo 1 en las células tumorales.

El anticuerpo 1 muestra efectos anti-tumorales en tumores sólidos que portan FGFR-3.

Se desarrollan modelos de tumor de injerto heterólogo RT112 y GEO por métodos de rutina en los cuales, 1-20 millones de células tumorales mezclada con 0-100% de Matrigel, son inyectadas subcutáneamente en cada ratón desnudo atimico hembra. Se inicia el tratamiento de anticuerpo una vez que el volumen medio de los tumores subcutáneos es aproximadamente 400 mm2. Las dos lineas de células de tumor RT112 y GEO, que corresponden a tumores de injerto heterólogo, ambas son efectivamente inhibidas las tres veces semanalmente con tratamiento de inyección i.p. de anticuerpo 1 40 mg/kg., comparado con el mismo tipo de tumores en los grupos de control. Para demostrar que estos efectos son emanados del resto de la trayectoria de señalización de FGFR-3, se conduce un estudio de eficacia usando un modelo de tumor PC-3 ortotópico en el cual, las células tumorales son desprovistas de la señalización FGFR-3 como se sugiere por los resultados negativos a partir del análisis de manchado Western de la fosforilación de receptor FGFR-3. El modelo PC-3 ortópico se generó inyectando células PC-3 transfectadas con luciferasa (PC-3LP) directamente en las próstatas del lobo dorsal de ratones Nu/nu (macho, 7-8 semanas, 1 X 106 células/ratón) a través de cirugía. Dos semanas después del implante celular, las imágenes de bioluminiscencia de los animales son capturadas en la posición ventral (animales que permanecen de espalda) y cuantificadas usando el sistema IVIS de conformidad con las instrucciones del fabricante (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . Los ratones con implantes exitosos son aleatorizados en grupos para recibir varios agentes de prueba i.p. en un programa predeterminado. Las señales capturadas por IVIS son usadas como subrogados de carga de tumor, y son registrados semanalmente . Los análisis estadísticos se realizaron usando ANOVA repetido. El anticuerpo 1 no mostró efecto significante en el crecimiento de los tumores PC-3. Por lo tanto, el anticuerpo 1 inhibe el crecimiento de estos tumores sólidos que poseen trayectorias de señalización de FGFR-3 funcionales.

El Anticuerpo 1 muestra efecto anti-turaoral en tumores mieloide con receptores FGFR-3 mutantes OPM-3 y KMS-11 son líneas de células de mieloma múltiple que expresan FGFR-3. Además, los receptores en ambas lineas celulares son mutaciones de punto único que albergan mutantes: K650E en OPM-2 y Y373C en KMS-11. Las dos mutaciones son mutaciones de ganancia de función y resaltan la actividad de los receptores mutantes a través de mecanismos tales como activación constitutiva, vida media prolongada y sensibilidad de ligando incrementada. El desarrollo de un modelo de injerto heterólogo OPM-2 por métodos de rutina en los cuales 1-20 millones de células tumorales mezcladas con 0-100% de Matrigel, son inyectadas subcutáneamente a cada ratón desnudo atimico hembra. Se inicia el tratamiento de inyección una vez que el volumen medio del tumor subcutáneo es aproximadamente 400 rom2. Se trató 3 veces semanalmente . Se midió el volumen del tumor 3 veces semanalmente. Se hizo la medición final después de 4 semanas de tratamiento. El tamaño medio del tumor de animales tratados con Anticuerpo 1 es 64% más pequeño que aquel del grupo de control. Se realizó la prueba t de Student. El valor P es menos de 0.0001. Por lo tanto, el hallazgo es altamente significante. Se establece un modelo de injerto óseo KMS-11 de conformidad con Xin X, et al., Clin Cáncer Res. 2006 Agosto 15; 12 (16) : 908-15. Se inicia el tratamiento de anticuerpo 1 semana después de las inyecciones de células de tumor. Se trató 3 veces semanalmente. Las señales medidas se emiten por las células tumorales varias veces durante el estudio. Se hizo medición final después de 33 dias después de la primera inyección. La señal media de animales tratados con Anticuerpo 1 es 1/4 de aquella de los animales de control. Se condujo la prueba Long-rank (Mantel-Cox) . El valor P es 0.0002. Por lo tanto el hallazgo es altamente significante. En ambos modelos, el tratamiento de inyecciones i.p. de anticuerpo de 40 mg/kg tres veces semanalmente, significantemente inhibe el crecimiento de tumor comparado con los grupos de control. El anticuerpo 1 parece ser el primero para demostrar la actividad anti-tumoral in vivo contra células de tumor que poseen K650E, asi como también aquellas que poseen formas mutantes Y373C de FGFR-3.

El anticuerpo 1 mejora la eficacia terapéutica de agentes citotóxicos .

La cisplatina es un agente citotóxico ampliamente usado en terapias de cáncer. Causa reticulación de DNA e induce la apoptosis celular. El beneficio terapéutico de combinación de cisplatina con anticuerpo FGFR-3 en tres modelos de injerto heterólogo, se exploró. Se desarrollaron modelos de tumor de injerto heterólogo RT112, RT4 y BFTC905 por métodos de rutina en el cual 1-20 millones de células tumorales mezcladas con 0-100% de Matrigel, son inyectadas subcutáneamente a cada ratón desnudo atimico hembra. Se inicia el tratamiento de anticuerpo una vez que el volumen medio de los tumores subcutáneos es aproximadamente 400 mm2.

Se usan inyecciones de 40 mg/kg tres veces semanalmente de Anticuerpo 1 y la dosis tolerada máxima (MTD) de cisplatina. Se mide el tumor 3 veces semanalmente hasta el final de los estudios. Un sumario de los datos del modelo de tumor RT112 se registra en la siguiente tabla: Tabla 3: Tratamiento de Cisplatina-Volúmenes de Tumor RT-112 Individuales (mm3) Se condujo la prueba estadística R ANOVO. Se comparó la eficacia del tratamiento de cisplatina contra aquel de la combinación de cisplatina-Anticuerpo 1. El valor P es 0.018. Por lo tanto, el efecto del Anticuerpo 1 en la eficacia incrementada de la cisplatina es altamente significante .

Un sumario de los datos del modelo de tumor RT4 se registra en la siguiente tabla: Tabla 4: Tratamiento de Cisplatina-Volúmenes de Tumor Individuales (mm3) Se condujo la prueba estadística RM ANOVO. Se comparó la eficacia del tratamiento con cisplatina contra aquel de la combinación de cisplatina-Anticuerpo 1. El valor P es 0.0162. Por lo tanto el efecto del Anticuerpo 1 en la eficacia incrementada de cisplatina es altamente significante .

Un sumario de los datos del modelo de tumor BFTC905 se registra en la siguiente tabla: Tabla 5: Tratamiento de Cisplatina-Volúmenes de Tumor BFTC-905 Individuales (mm3) Se condujo la prueba estadística RM ANOVO. Se comparó la eficacia del tratamiento de cisplatina contra aquel de la combinación de cisplatina-Anticuerpo 1. El valor P es 0.0209. Por lo tanto, el efecto de Anticuerpo 1 en la eficacia incrementada de cisplatina es altamente significante.

Ninguno de los animales murió de los tratamientos durante los cursos completos de estos estudios, sugiriendo que agregar el Anticuerpo 1 a MTD de cisplatina intensifica la eficacia del último sin empeorar significantemente los efectos adversos de los dos fármacos.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se enlaza específicamente a FGFR-3 (Illb) y FGFR-3 (IIIc) humano.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo humano que tiene un KD de aproximadamente 1 x 10'8 M o menos a temperatura ambiente (20-25°C) .

3. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque se enlaza específicamente al dominio 2 de FGFR-3 humano 2 (SEC ID NO 12) .

4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se enlaza específicamente a FGFR-3 humano, caracterizado porque comprende una CDRH1 que tiene la secuencia GY FTSYGIS (SEC ID NO 1), una CDRH2 que tiene la secuencia WVSTYNGDTNYAQKFQG (SEC ID NO 2), una CDRH3 que tiene la secuencia VLGYYDSIDGYYYGMDV (SEC ID NO 3), una CDRL1 que tiene la secuencia GGNNIGDKSVH (SEC ID NO 4), una CDRL2 que tiene la secuencia LDTERPS (SEC ID NO 5) , y una CDRL3 que tiene la secuencia QVWDSGSDHVV (SEC ID NO 6) .

5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido pesada variable: EVQLVQSGAEV KPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGW VSTYNGDTNYAQ FQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSI DGYYY GMDVWGQGTTVTVSS (SEC ID NO 7) y una secuencia de aminoácido ligera variable: QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGI PERM SGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQV DSGSDHVVFGGGTKLTVLG (SEC ID NO 8) .

6. Un anticuerpo como se reivindica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende una cadena pesada de la SEC ID NO: 9 y una cadena ligera de la SEC ID NO: 10.

7. Un anticuerpo como se reivindica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende dos cadenas pesadas de la SEC ID NO: 9 y dos cadenas ligeras de la SEC ID NO: 10.

8. Un fragmento enlazante a FGFR-3 humano neutralizante del anticuerpo caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo, caracterizado porque el anticuerpo compite para enlace al dominio extracelular de FGFR-3 en un ensayo de competencia ELISA con un anticuerpo de competencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el anticuerpo de competencia se enlaza a FGFR-3 con un KD de aproximadamente 1 x 10"8 M o menos a temperatura ambiente (20-25°C) .

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque se enlaza específicamente a FGFR-3 mutante .

11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Un producto caracterizado porque contiene un anticuerpo o fragmento, de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, y un agente anti-cancerígeno adicional para tratamiento en combinación para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia.

13. Un anticuerpo o fragmento como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso como un medicamento.

14. Un anticuerpo o fragmento como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso en el tratamiento de cáncer.

15. Un anticuerpo o fragmento como se reivindica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el cáncer es de vejiga o mieloma múltiple.

16. Un anticuerpo o fragmento caracterizado porque es como se reivindica de conformidad con la reivindicación 14, junto con otro agente.

17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque además comprende administrar simultáneamente, separadamente o secuencialmente una cantidad efectiva de otro agente al paciente.

18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el agente es cisplatina.

19. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, junto con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.