JP2012505912A - 線維芽細胞成長因子受容体3(fgfr−3)阻害剤および治療方法 - Google Patents

線維芽細胞成長因子受容体3(fgfr−3)阻害剤および治療方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトFGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)、またはその突然変異型に対して特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントに関する。更に、実施形態としては、当該抗体を含む薬学的組成物および当該抗体を用いて癌を治療する方法が挙げられる。

Description

本発明は、免疫学および癌治療におけるものである。より具体的には、本発明は、ヒト線維芽細胞成長因子受容体3(FGFR−3)(配列番号11)に結合するヒト抗体に関する。FGFRはまた、CD333、ACH、CEK2、HSFGFR−3EXおよびJTK4としても知られる。
FGFR−3は、多発性骨髄種、膀胱腺癌および尿路上皮細胞癌を含む癌の発症に関与することが示されている。FGFリガンド−受容体結合は、受容体二量化および自己リン酸化を誘導し、エフェクター分子の下流活性を導く。FGFR−3シグナル伝達は、例えば、増殖、分化、移動、生存/アポトーシス、細胞骨格およびサイトカイン調節、ならびにエンドサイトーシス/エクソサイトーシス等の広範な細胞活動を制御可能である。FGFR−3シグナル伝達の過剰活性化は、腫瘍細胞の成長または生存における便宜を図り、それ故に腫瘍の悪性度に寄与する重要な事象として認識されている。
完全長FGFR−3は、FGFR−3の第3IgG様ドメインをコードする選択的エクソンによって生じる、FGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)と呼ばれる2つのスプライシング型を有する。FGFR−3はまた、DNA複製または翻訳における誤りに起因する、文書で十分に裏づけされた突然変異型を有する。癌を含む広範な疾患におけるFGFR−3シグナル伝達経路の積極的役割を鑑みると、この経路を制御する機構が必要とされている。
リガンド結合をブロックする抗FGFR−3抗体が開示されている(非特許文献1)。野生型および突然変異型の両方のFGFR−3に対して結合する抗FGFR−3抗体が開示されている(非特許文献2、非特許文献3)。FGFR−3シグナル伝達のリガンド媒介性活性化を阻害し、かつ、FGFR−3腫瘍成長を阻害する、抗FGFR−3抗体が開示されている(非特許文献3)。併用療法として投与される場合のシスプラチンの抗腫瘍効果を促進する抗FGFR−3抗体が開示されている(非特許文献4、非特許文献5)。
Rauchenberger,R.ら、J.Biol.Chem.、278(40):38194−205(2003年10月3日) Martinez−Torrecuadrada,J.ら、Clin.Cancer Res.、11(17):6280−90(2005年9月1日) Trudel S.ら、Blood、107(10):4039−46(2006年5月15日) Deevi,D.ら、AACR(2007年10月21〜24日) Wang,W.ら、EORTC(2008年10月22〜26日)
しかしながら、当該技術分野において、FGFR−3の両方のスプライシング型(FGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc))に対して高度に特異的であり、FGFR−3を内在化し、FGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)、またはその突然変異型の分解も好ましくは誘導し、治療効果を促進し、そして、化学的細胞毒性因子と組み合わせて用いる場合の化学療法耐性を逆転することのうち、1つ以上が可能な抗体アンタゴニストが必要とされている。加えて、当該抗体はまた、好ましくは、FGFR−3の突然変異型に対して活性であり、FGFR−3への結合からFGFリガンドをブロックし、リガンド誘導FGFR−3シグナル伝達経路を阻害し、FGFR−3媒介性細胞活動を阻害し、または、インビトロおよびインビボにおける腫瘍成長を阻害することが必要とされている。
本発明の抗体は、これらの課題を解決する。本発明の抗体は、FGFR−3の両方のスプライシング型(FGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc))に対して高度に特異的であり、FGFR−3を内在化し、また好ましくは、FGFR−3受容体またはそれらの細胞の受容体突然変異体への結合における受容体分解を誘導し、治療効果を促進し、化学的細胞毒性因子と組み合わせて用いる場合における化学療法耐性を逆転させ、そして、FGFR−3の突然変異型に対して活性であり、FGFR−3への結合からFGFリガンドをブロックし、リガンド誘導FGFR−3シグナル伝達経路を阻害し、FGFR−3媒介性細胞活動を阻害し、また、インビトロおよびインビボにおける腫瘍成長を阻害する。
本発明は、ヒトFGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)に対して特異的に結合する、単離された抗体に関する。
好ましくは、本発明の抗体は、室温(20〜25℃)にて約1×10−8M以下のKを有するヒト抗体である。
好ましくは、本発明の抗体は、ヒトFGFR−3ドメイン2(配列番号12)に対して特異的に結合する。
好ましくは、本発明の抗体は、ヒトFGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)に対して特異的に結合し、当該抗体は、配列GYMFTSYGIS(配列番号1)を有するCDRH1、配列WVSTYNGDTNYAQKFQG(配列番号2)を有するCDRH2、配列VLGYYDSIDGYYYGMDV(配列番号3)を有するCDRH3、配列GGNNIGDKSVH(配列番号4)を有するCDRL1、配列LDTERPS(配列番号5)を有するCDRL2、および、配列QVWDSGSDHVV(配列番号6)を有するCDRL3を含む。
好ましくは、本発明の抗体は、重鎖可変アミノ酸配列:EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS(配列番号7)、および、軽鎖可変アミノ酸配列:QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG(配列番号8)を含み得る。
好ましくは、本発明の抗体は、重鎖可変アミノ酸配列:EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS(配列番号7)、または、軽鎖可変アミノ酸配列:QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG(配列番号8)を含み得る。
本発明の抗体の重鎖定常領域は、ヒトIgG1または当該抗体のFGFR−3結合フラグメント由来であり得る。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号9の重鎖および配列番号10の軽鎖を含む。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号9の重鎖および配列番号10の軽鎖、または、当該抗体のFGFR−3−結合フラグメントを含む。
本発明の抗体はまた、配列番号9の2本の重鎖および配列番号10の2本の軽鎖を含み得る。本発明の抗体はまた、配列番号9の2本の重鎖および配列番号10の2本の軽鎖を含み得る。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号9の2本の重鎖および配列番号10の2本の軽鎖、または、当該抗体のFGFR−3−結合フラグメントを含む。
本発明の抗体は、中和ヒトFGFR−3結合フラグメントを含み得る。
好ましい態様において、本発明は、単離された抗体またはそのフラグメントに関する。ここで、本発明の抗体は、競合抗体を用いる競合ELISAアッセイにおいてFGFR−3の細胞外ドメインに対する結合と競合し、当該競合抗体は、室温(20〜25℃)にて約1×10−8M以下のKでFGFR−3と結合する。
本発明は更に、変異FGFR−3に対して結合する抗体に関する。
本発明は、本発明の抗体またはフラグメントと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、薬学的組成物に関する。
本発明はまた、本発明の抗体またはフラグメントと、治療のための追加の抗癌剤とを含有し、同時投与、別個投与または連続投与を組み合わせて治療に用いられる、製剤に関する。
本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、医薬として用いられる。本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、癌の治療に用いられる。本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、癌が膀胱癌または多発性骨髄腫である医薬として用いられる。
本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、別の薬剤とともに癌の治療に用いられる。本発明の抗体またはフラグメントは、患者に対して有効量の別の薬剤とともに、同時投与、別個投与、または、連続投与され得る。本発明は、化合物と、薬学的に受容可能な担体および必要に応じて他の治療成分を共に含む、薬学的組成物を含み得る。
本発明はまた、患者に対して有効量の本発明の抗体を投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法に関する。癌は、膀胱癌または多発性骨髄腫であり得る。別の態様において、本発明は、患者に対して有効量にて本発明の抗体および別の薬剤を、同時投与、別個投与、または、連続投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法を含む。他の薬剤は、薬剤はシスプラチンであり得る。
したがって、本発明の抗体は、天然および突然変異型のFGFR−3に対して結合し、FGFR−3の分解を誘導し、腫瘍細胞ならびに間質成分に作用することで腫瘍を阻害することができ、癌治療において広範な治療価値を有する。
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子を含み、当該分子は、4本のポリペプチド鎖(2本の同一重鎖(H)および2本の同一軽鎖(L))を含み、ジスルフィド結合により相互に結合されている。個々の鎖は、同様の大きさ(110〜125アミノ酸)および構造であるが異なる機能を有するドメインに折り畳まれ得る。
「単離された抗体」とは、(1)構成要素の混合物から部分的、実質的、または、完全に精製されているか、(2)天然の構成要素から同定、分離、および/または回収されているか、(3)モノクローナルであるか、(4)同種由来の他のタンパク質が存在しないか、(5)異種由来の細胞により発現されているか、あるいは(6)天然に存在しない、抗体である。天然の環境における汚染物質の構成要素は、本発明の抗体についての診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質を含み得る。単離された抗体の例としては、アフィニティー精製された抗体、ハイブリドーマまたはインビトロにおける他の細胞株、あるいは、トランスジェニックマウス由来のヒト抗体から作成された抗体が挙げられる。
本願明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同質の抗体の集団から得られた抗体を意味し、例えば、当該集団を含む個々の抗体であり、起こり得る自然発生変異または存在し得るマイナーな翻訳後変異体を除いて実質的に同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位(決定基またはエピトープとしても知られる)に対して高度に特異的である。更に、一般的に異なる決定基に対する異なる抗体を含む、従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の性質が、抗体の実質的に同質な集団から得られたものであることを示し、任意の特定の方法により必要な抗体の生産物と解釈されるべきはない。
本願明細書において用いられる、用語「ヒト抗体」とは、上述したKabatら、Chothiaら、およびMartinの文献に記載されたような、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えば、相補性決定領域(CDR)において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列(例えば、インビトロにおけるランダム突然変異または部位特異的突然変異により、あるいは、インビボにおける体細胞変異により誘導された変異)によりコードされていないアミノ酸残基を含み得る。ヒト抗体は、アミノ酸残基(例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていない活性促進アミノ酸残基)により置換された少なくとも1つの位置を有し得る。しかしながら、本願明細書において用いられる、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種(例えば、マウス)の生殖系列由来のCDR配列における抗体を含むこと、および、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことは、意図していない。
語句「組み換えヒト抗体」とは、組み換え方法により調製され、発現され、作製され、または、単離されたヒト抗体を含み、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組み換え組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子でトランスジェニックされる動物から単離された抗体、あるいは、他のDNA配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する任意の他の方法により調製され、発現され、作成され、または、単離された抗体である。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。
軽鎖は、1つの可変ドメイン(本願明細書においてVLとして略称される)、および/または、1つの定常ドメイン(本願明細書においてCLとして略称される)を含み得る。抗体の軽鎖は、カッパ(κ)軽鎖またはラムダ(λ)軽鎖のいずれかである。本願明細書において用いられる、VLにおける発現は、カッパ型軽鎖(Vκ)由来の可変領域およびラムダ型軽鎖(Vλ)由来の可変領域の両方を含むことを意図する。重鎖はまた、1つの可変ドメイン(本願明細書においてVHとして略称される)を含み得、および/または、抗体のクラスもしくはアイソタイプ、3つもしくは4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3、およびCH4)に依存し得る。ヒトにおいて、アイソタイプは、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMであり、更にサブクラスまたはサブタイプ(IgA1−2およびIgG1−4)に細分されたIgAおよびIgGを有する。
本発明は、上述したクラスまたはサブクラスのうちのいずれかの抗体を含む。ヒトIgGは、本発明の抗体に対する好ましいアイソタイプである。超可変領域またはCDRと呼ばれる3つの領域が、各VLおよびVHにおいて見出され、これらは、フレームワーク領域(本願明細書においてFRとして略称される)と呼ばれる、より変化が少ない可変領域により支持される。
アミノ酸は、Kabatの定義(Kabatら,Ann.NY Acad.Sci.190:382−93(1971);Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242(1991))、または、Chothiaの定義(C.ChothiaおよびA.M.Lesk,J.Mol.Biol.196(4):901−917(1987))、または、Martin(Martin,A.C.R.Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS:Structure,Function and Genetics,25(1996),130−133.)に従って、特定のCDR領域またはドメインに割り当てられる。
各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRにより構成されており、以下の順序(FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4)でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される。VLドメインおよびVHドメインからなる抗体の部分は、Fv(フラグメント可変部)に指定され、抗原結合部位を構成する。一本鎖Fv(scFv)は、1本のポリペプチド鎖上のVLドメインおよびVHドメインを含有する抗体フラグメントであり、ここで、1つのドメインのN末端および他のドメインのC末端は、柔軟なリンカーにより結合される(例えば、米国特許第4,946,778号(Ladnerら)、国際公開第88/09344号パンフレット(Hustonら)参照)。
フラグメントは、全抗体のフラグメントと同じかまたは同程度の結合特性を有する。抗体の適切なフラグメントは、特異的に結合し、かつ、細胞成長を阻害する十分な親和性を有する超可変(すなわち、相補性決定)領域の十分な部分を含む任意のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、例えば、1つまたは両方のFabフラグメントまたはF(ab’)2フラグメントを含み得る。好ましくは、抗体フラグメントは、全抗体における全ての6つの相補性決定領域を含むが、このような領域の全てよりも少ない、例えば、3つ、4つまたは5つのCDRを含む機能的フラグメントもまた含む。好ましいフラグメントは、一本鎖抗体またはFvフラグメントである。より好ましいフラグメントは、二価のフラグメントである。一本鎖抗体は、ポリペプチドであり、当該ポリペプチドは、相互結合リンカーを含むかまたは含まない、少なくとも抗体の重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含む。したがって、Fvフラグメントは、全抗体の結合部位を含む。これらの鎖は、細菌または真核細胞において生成され得る。
Fab(フラグメント、抗原結合)は、VL CL VH CH1ドメインからなる抗体のフラグメントを意味する。パパイン消化の後に生成されたものは、単に、Fabとして称され、重鎖ヒンジ領域を保持しない。ペプシン消化の後に、重鎖ヒンジを保持する種々のFabが生成される。鎖間ジスルフィド結合を有するこれらのインタクトなフラグメントは、F(ab’)2として称され、一方で、ジスルフィド結合が保持されない場合、単一のFab’が生じる。F(ab’)2フラグメントは、一価Fabフラグメントである抗原に対してより高い親和性を有する。
Fc(フラグメント結晶化)は、対の重鎖定常ドメインを含む抗体の部分またはフラグメントに対する記号表示である。IgG抗体において、例えば、Fcは、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。IgA抗体またはIgM抗体のFcは、更に、CH4ドメインを含む。Fcは、Fc受容体結合、補体媒介性細胞毒性の活性、および、抗体依存性細胞毒性(ADCC)に関連する。多数のIgG様タンパク質の複合体である抗体(例えばIgAおよびIgM)について、複合体形成には、Fc定常ドメインが必要である。
ヒンジ領域は、抗体においてFab部分とFc部分に分かれ、相互におよびFcに関連したFabの移動性を提供し、2本の重鎖の共有結合について多数のジスルフィド結合を含む。
したがって、本発明の抗体は、限定されないが、抗原に対して特異的に結合する、天然抗体、ヒト抗体、組み換えヒト抗体、モノクローナル抗体、消化フラグメント、二価フラグメント(例えば、(Fab’)2)、一価フラグメント(例えば、Fab)、一本鎖抗体、一本鎖Fv(scFv)、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、二重特異性抗体(diabody)、三重特異性抗体(triabody)などが挙げられる。
本発明の抗体は、FGFR−3に対して特異的である。抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対して抗体が選択的に認識することを意味する。抗体は、種および分子両方または分子のみに対して選択性を示し得、1つより多い種のFGFR−3に結合する。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ラット、イヌおよび/またはウサギのFGFR−3に結合し得る。好ましくは、抗体は、ヒトFGFR−3に結合する。抗体の型は、結合特異性を保持するが、他の特性もまた有するように開発されている。
本発明の抗体は、例えば、単一特異的、二重特異的または多特異的であり得る。二重特異的抗体(BsAbs)は、2つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である。多特異的抗体は、2つより多い異なる抗原結合特異性または部位を有する。抗体が1つより多い特異性を有する場合、認識されたエピトープは、単一の抗原または1つより多い抗原と関連し得る。
FGFR−3抗体の特異性は、親和性および/または結合力に基づいて決定され得る。親和性は、抗原と抗体との解離についての平衡定数(K)により表され、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合の強さを測定する。結合力は、抗体とその抗原と間の結合の強さを測定する。結合力は、抗体上のエピトープとその抗原結合部位との間の親和性、および、特定のエピトープの抗原結合部位数を示す、抗体の価数の両方に関連する。抗体は、一般的に、約10−5から約10−11モル/リットル(例えば、K<100M)の解離定数(K)にて結合する。約10−4モル/リットル以下の任意のKは、一般的に、非特異的結合を示すものと考えられる。ここで、Kの値が低いほど、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合の強さが強くなる。
特定の態様において、本発明の抗体は、好ましくは約1×10−8M以下、より好ましくは約1×10−9M以下、より好ましくは約1×10−10M以下、最も好ましく約1×10−11M以下のKにて、FGFR−3と結合する。以下の表1を参照のこと。
表1:ヒトおよびマウスのFGFR−3スプライス変異体に対する抗体1の結合親和力
Figure 2012505912
特定の態様において、本発明の抗体は、好ましくは約5.0×10−10Mから約1.5×10−11M、約1.0×10−10Mから約1.0×10−11M、または、約1.5×10−11Mから約7.5×10−10MのKを有する。
本願明細書において用いられる用語「結合をブロックする」および「結合を阻害する」は、交換可能に用いられ、サイトカイン/受容体シグナル伝達経路の生物学的機能の完全または部分的な阻害または減少をもたらす、サイトカインのその受容体に対する結合のブロック/阻害を意味する。FGFのFGFR−3に対する結合のブロック/阻害は、FGF活動(例えば、受容体結合、細胞成長の阻害効果、走化性、アポトーシス、細胞内タンパク質リン酸化反応、または、シグナル変換)における1つ以上のインビトロまたはインビボの指標の完全または部分的な阻害または減少を測定することにより評価される。FGFのFGFR−3に対する結合をブロックする能力は、本願明細書において記載されるELISAにより測定され得る。本発明の抗体は、生細胞のリガンド誘導活性におけるFGFR−3受容体をブロックするアンタゴニストである。結合アッセイは、当該技術分野において公知の種々の方法(例えば、限定されないが、ELISA)を利用して実施され得る。本願明細書において用いられる「結合について競合する」とは、抗体が結合またはシグナル伝達を、当該技術分野において利用可能な技術(例えば、BIAcoreを用いる競合ELISAまたはK測定)により測定されるように、少なくとも約20%、30%、50%、70%または90%まで減少させる状況を意味するが、結合を完全に除外することを意図しない。
重鎖アミノ酸配列は、配列番号9に記載される。軽鎖アミノ酸配列は、配列番号10に記載される。別の態様において、本発明の抗体は、抗体1のCDRのうちいずれか1つの相補性決定領域の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ全てを有する。
本発明の抗体はまた、直接変異法、親和性成熟法、ファージ提示法、または、鎖シャッフリング法により改善された結合特性を有する。親和性および特異性は、CDRおよび/またはフレームワーク残基を変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることにより、修飾または改良され得る(例えば、Yangら,J.Mol.Biol.254:392−403(1995)を参照)。1つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせを無作為に選択するものであり、これにより、他の同一抗原結合部位の集団において、2個〜20個のアミノ酸のサブセットが特定の位置にて見出される。あるいは、変異は、PCR法を用いて広範囲の残基にわたってエラーにより誘発され得る(例えば、Hawkinsら,J.Mol.Biol.,(1992)226:889 96を参照)。別の例において、重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージ提示ベクターは、大腸菌の突然変異誘発株において増殖され得る(例えば、Lowら,J.Mol.Biol.250:359 68(1996)を参照)。
次いで、インビトロでの選択プロセスは、要求される(claimed)交差反応性を有するFabフラグメントについてこれらの追加の可変領域アミノ酸配列をインビトロでスクリーニングするために適切に使用され得る。この方法において、更に、本発明に従ってヒト化抗体を調製するために適切なFabフラグメントが同定される。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本願明細書に開示された1つまたはそれぞれのフレームワーク配列内における1、2または3箇所の位置に制限される。好ましくは、CDR内のアミノ酸置換は、1つまたはそれぞれのCDR内における1から3箇所の位置に制限され、より好ましくは、1つまたはそれぞれのCDR内における1または2箇所のアミノ酸位置にて置換が行われる。更に好ましくは、アミノ酸置換は、重鎖可変領域のCDRにおける1または2箇所のアミノ酸位置にて行われる。本願明細書に記載された抗体を親抗体として用いて、本発明に従って代替抗体を調製するために、CDRおよびフレームワーク置換を組み合わせる適切な方法は、Wuら,J.Mol.Biol.,294:151−162により提供される。
本発明の抗体は、当該技術分野に公知の方法により生成され得る。これらの方法は、KohleerおよびMilsteinのNature 256:495−497(1975)、および、Burdonら,Eds.,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,第13巻,Elsevier Science Publishers,Amsterdam(1985)におけるCampbellの「Monoclonal Antibody Technology,The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas」により記載された免疫学的方法、ならびに、HuseらのScience 246:1275−1281(1989)により記載された組み換えDNA法によるものを含む。
ヒト抗体はまた、当該技術分野において公知の種々の技術(例えば、ファージ提示ライブラリー)を用いて生成され得る(HoogenboomおよびWinter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marksら,J.Mol.Biol.222:581(1991))。ColeらおよびBoemerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製において利用可能である(Coleら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)ならびにBoemerら,J.Immunol.147(1):86−95(1991))。サブクローンにより分泌された本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順(例えば、プロテインA−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または、親和性クロマトグラフィー)により、培養培地または腹水から単離または精製され得る。
本発明の抗体をコードするポリ核酸は、標準的な分子生物学的技術により得られる。
本発明はまた、ベクターの形質転換および抗体の発現のための宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞を含み、例えば、NSO(非分泌性(o))マウス骨髄腫細胞、293およびCHO細胞、ならびに、リンパ系起源の他の細胞株(例えば、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞)が挙げられる。他の真核宿主(例えば、酵母)が用いられてもよい。
細菌(特に、大腸菌)においてタンパク質を発現するためのベクターが知られている。このようなベクターとしては、DieckmannおよびTzagoloffのJ.Biol.Chem.260:1513−1520(1985)により記載されたPATHベクターが挙げられる。これらのベクターは、アントラニル酸塩合成酵素(TrpE)の後に、カルボキシル末端にてポリリンカーをコードするDNA配列を含む。他の発現ベクター系は、βガラクトシダーゼ(pEX)、ラムダ PL、マルトース結合タンパク質(pMAL)、および、グルタチオンSトラスフェラーゼ(pGST)に基づくものである。Gene 67:31(1988)およびPeptide Research 3:167(1990)を参照のこと。
酵母において有用なベクターが利用可能である。適切な例としては、ラムダZAPプラスミドである。哺乳動物細胞における発現の適切なベクターもまた知られている。このようなベクターとしては、SV−40、アデノウイルス、レトロウイルス由来DNA配列、および、機能的哺乳動物ベクター(例えば、上述のベクター、機能的プラスミドおよびファージDNA)の組み合わせに由来するシャトルベクターにおける周知の誘導体が挙げられる。
本発明において有用なベクターは、発現されるDNA配列またはフラグメントに結合する少なくとも1つの制御エレメントを含む。制御エレメントは、クローンされたDNA配列の発現を制御および規制するためにベクター内に挿入される。
適切な培地内で維持される宿主細胞内の発現の後に、発現されるポリペプチドは、培地から回収され得、当該技術分野において公知の方法により精製され得る。ポリペプチドまたはペプチドが培養培地内へと分泌されない場合、宿主細胞は、単離および精製の前に溶解される。
本発明は更に、本発明における抗体、ポリ核酸、ベクターまたは宿主細胞を、薬学的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤と共に含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物はまた、追加の治療薬剤を含み得る。追加の薬剤は、化学療法薬(例えば、シスプラチン)であり得る。
本願明細書において用いられる担体としては、薬学的に受容可能な担体、賦形剤、または、安定剤が挙げられ、これらは、適用された用量および濃度にて曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である。多くの場合、生理学的に受容可能な担体は、pH緩衝水溶液である。本発明の別の態様において、抗FGFR−3抗体または抗体フラグメントは、特に抗体が内在化する場合、化学的または生合成的に、抗腫瘍剤または検出可能なシグナル生成因子と結合され得る。FGFR−3に対する抗体は、それらの増殖能を阻害することになる、いくつかの癌細胞(例えば、膀胱癌細胞)中のリンMAPKおよびリンAKTを含む、受容体(リン酸化FGFR−3)の活性化および下流シグナル伝達分子の活性を阻害し得る。
本発明の抗体は、天然FGFR−3またはそのスプライシング型もしくはその変異体と結合し得る。FGFR−3の「スプライシング型」とは、FGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)と呼ばれるFGFR−3の第3IgG様ドメインをコードするエクソンの形態を意味する。FGFR−3変異体は、DNA複製または翻訳時のエラーにより変更された受容体の形態を含む。変異は、例えば、構成的活性化、半減期の延長、および、増強されたリガンド感受性の機構を介して、突然変異体受容体の活性を高めた機能獲得型変異であり得る。
本発明の抗体は、野生型FGFR−3ドメイン2(配列番号12)に対して結合し得る。ヒトおよびマウスのFGFR−3配列の位置173におけるアルギニン残基は、他のファミリーメンバーと共通ではない。これは、この残基が抗体1により示されたFGFR−3特異性に関与する可能性があることを示唆している。
本発明の抗体は、FGFR−3の分解を誘導する。分解は、受容体を分解して、そのシグナル伝達機能がもはや行われ得ないことを意味する。
本発明の抗体は、FGFR−3の活性を中和し得る。受容体を中和するとは、受容体の内因性キナーゼ活性を不活性化して、シグナルを変換することを意味する。中和は、例えば、リガンドへの特定エピトープの接近を抗体がブロックするか、または、特定の様式においてFGFR−3の構造を変更することにより生じ得る。これにより、リガンド(特に、FGF)は、受容体に結合できたとしても、受容体を活性化できない。例えば、受容体の内在化または分解を誘導するか、または、FGFR−3の発現を阻害することにより、FGFR−3を発現する細胞がそれらの表面上におけるFGFR−3受容体の数を減少させる場合に、ダウンレギュレーションが生じ得る。ゆえに、中和は、阻害、減少、不活性化、および/または、成長(増殖および分化)の途絶、血管形成(血管の回復、侵襲、および、転移)、ならびに、細胞の運動性および転移(細胞粘着および侵襲性)を含む種々の効果を有する。
FGFR−3中和の測定の一つは、受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、例えば、組み換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および/または、天然もしくは合成基質のリン酸化反応を測定することによる、周知の方法を用いて決定され得る。したがって、リン酸化アッセイは、本発明において中和抗体を決定するのに有用である。リン酸化は、ELISAアッセイまたはウェスタンブロットにおいて例えばホスホチロシンに特異的な抗体を用いて決定され得る。チロシンキナーゼ活性のいくつかのアッセイは、Panekら,J.Pharmacol.Exp.Ther.283:1433−44(1997)、および、Batleyら,Life Sci.62:143−50(1998)において記載される。
加えて、本発明の抗体は、多くの腫瘍細胞がそれらの細胞表面上にFGFR−3を有するので、腫瘍細胞自体によるシグナル伝達を阻害し得る。本発明の抗体は、それを必要とする哺乳動物を治療するために使用され得る。疾患を「治療する」とは、疾患を阻害すること、その進行を阻止または遅延させること、疾患を軽減すること、あるいは、疾患の症状を退行させることを含む。
本発明の抗体および組成物は、癌を治療するために使用され得る。癌は、難治性または最前線であり得る。癌は、限定されないが、脳、肺、扁平上皮細胞、膀胱、胃、脾臓、胸、頭、首、腎臓(renal)、腎臓(kidney)、卵巣、前立腺、大腸、結腸直腸、食道、婦人科(卵巣、子宮内膜)、前立腺、胃、または甲状腺における癌、白血病、および、リンパ腫が挙げられる。加えて、本発明の抗体および組成物により治療され得る癌としては、多発性骨髄種、結腸直腸癌、ユーイング肉腫、絨毛腫が挙げられる。
投与は、注射投与、注入投与、経口投与、非経口投与、皮下投与、筋肉注射投与または静脈内投与を含む任意の適切な投与経路により達成される。
本願明細書において記載された治療方法は、別の治療薬(例えば、抗腫瘍薬)を用いて投与する際に本発明の抗体とともに行われ得る。抗腫瘍薬は、小有機分子を含み得る。このような小有機分子の例としては、細胞毒性および/または化学療法薬(例えば、タキソール、ドキソルビシン、アクチノマイシン−D、シスプラチン、メトトレキサート、イリノテカン(CPT−11)、ゲムシタビン、オキサプラチン(oxyplatin)、フルオロウラシル(5−FU)、ロイコウリン(leucourin)、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、エポチロン、シスプラチン/カルボプラチンおよびペグ化アドリアマイシン)が挙げられる。本発明の好ましい治療は、シスプラチンとともに抗体を投与することである。
抗腫瘍薬はまた放射線であり得、放射線の供給源は、治療される患者に対する、外的療法(外照射療法(EBRT))または内的療法(小線源療法(BT))のいずれかであり得る。投与される抗腫瘍薬の用量は、多くの因子(例えば、薬剤の型、治療される腫瘍の型および重傷度、ならびに、薬剤の投与経路)に依存する。本発明は、任意の特定の用量に限定されない。
FGFR−3抗体を他の抗体および/または治療薬とともに投与することは、同時または異なる時間において、同じかまたは異なる経路を介して、同時にまたは別々に行われ得る。更に、抗体は、投与する他の1つ以上の薬剤と抱合され得る。
本願明細書において記載された治療方法は、霊長類(例えば、サルおよびヒト)、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギならびに齧歯類(ラットおよびマウス)を含む、任意の適切な哺乳動物を治療するために使用され得る。好ましくは、治療される哺乳動物は、ヒトである。
以下の実施例は、例示目的のためのみに提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例は、従来方法の詳細の説明を含まない。例えば、ベクターおよびプラスミドの構築、このようなベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、あるいは、宿主細胞へのプラスミドの導入において適用される方法などである。このような方法は当業者に周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Pressを含む種々の文献に記載される。
(実施例1)
(FGFR−3特異的抗体アンタゴニストの生成)
組み換えヒトFGFR−Fc、組み換えヒトFGF、カスタム合成プライマー、制限酵素およびDNAポリメラーゼは、業者から取得され得るか、または、公知の方法により調製され得る。
公開された抽出プロトコルにしたがって、10μgのFGFR−3(IIIc)細胞外ドメイン(ECD)−Fc組み換えタンパク質でコーティングされたチューブを用いて、ヒトFGFR−3細胞外ドメインに対する未使用ヒトFabバクテリオファージライブラリーを抽出する。抽出工程から保持されたファージを溶出し、保持されたファージを用いて細菌宿主細胞に感染させる。宿主細胞により生成されたファージを収集する。上記手順を再度繰り返す。感染させた宿主細胞の単一コロニーを100μl/ウェルの2×YTAGを含有する96ウェルプレートへ移し、10μlのM13KO7ヘルパーファージ(5×1010pfu/ml)の存在下で、ファージを成長させる。振とうさせずに30分間37℃にてプレートをインキュベートし、その後、振とうさせて(100rpm)30分間インキュベートする。2500rpmで10分間遠心分離することで細胞のペレットを調製し、200μlの2×YTAKに再懸濁し、振とうさせて(100rpm)一晩30℃にてインキュベートする。プレートを2500rpmで10分間遠心分離する。上澄みを新しいプレートに移し、6×ブロッキングバッファー(18%ミルク/PBS)と1時間混合する。下記に示すELISA結合・ブロッキングアッセイを用いてファージクローンをスクリーニングする。FGFR−3(IIIb)またはFGFR−3(IIIc)に結合するファージクローンを選択し、その後、このプールから、FGF−1リガンドに対する結合から受容体をブロックするファージクローンを選択する。標準的な配列決定技術にしたがって、受容体に結合しかつブロックするクローンのDNA配列を決定する。各特有のDNA配列を保持し、対応するファージクローンをFGFR−3ブロッカーファージ候補として指定する。これらのファージ候補から可溶Fabを調製する。精製されたFabを用いてELISA結合・ブロッキングアッセイを繰り返して、ブロック活性を確認する。公開された技術にしたがってCDR(配列番号1〜6)をヒトIgG1フレームワークへクローニングすることで、確認されたFabブロッカーを完全なサイズの抗体内に設計する。ELISA結合アッセイを用いて、FGFR−1(IIIb)、FGFR−1(IIIc)、FGFR−2(IIIb)、FGFR−2(IIIc)、およびFGFR−4細胞外ドメイン組み換え可溶タンパク質に対する抗体1の結合を決定する。bとcの両方のスプライシング型FGFR−3の結合について高い親和性を示すが、他のFGFR受容体の結合について低い親和性を示す抗体を選択する。
(実施例2)
(抗体1)
抗体1を周知の方法を用いて適切な哺乳動物発現系にて生合成することができ、かつ、周知の方法により精製することができる。
抗体1のアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2012505912
(アッセイ)
(ELISA結合アッセイ)
組み換えFGFRを、96ウェルプレート上でPBS中に1μg/mlの濃度にて、2時間室温でコーティングする。プレートを0.2%のTween20/PBSで3回洗浄し、使用前に5%のミルク/PBSで2時間ブロックする。ファージ、Fabまたは抗体をプレートに加え、0.2%のTween20/PBS中で連続希釈する。2時間以上、室温にてプレートをインキュベートする。適切な市販の二次抗体を用いて捕捉した分子を検出し、供給者の指示書に従って検出する。
(ELISAブロッキングアッセイ)
組み換えFGFを、室温で2時間、0.5〜2μg/mlの濃度にてImmulon(登録商標)2Bマイクロタイタープレート(ThermoLab Systems,Franklin,MA)上でコーティングする。プレートを0.2%のTween20/PBSで洗浄し、使用前に5%のミルク/PBSで2時間ブロックする。ファージ、Fab、または抗体を5μg/mlのヘパリン、5%のミルク、PBSで連続希釈する。FGFR−3(IIIb)または(IIIc)ECD(細胞外領域)FCで標識を付けた可溶性組み換えタンパク質を1μg/mlの最終濃度まで加える。FGF−1でコーティングしたプレートに移す前に、室温にて1時間、混合物をインキュベートし、さらに2時間、室温にてインキュベートする。プレートを0.2%のTween20/PBSで3回洗浄する。供給者の指示書に従って調製したセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)溶液に結合した抗ヒトFcモノクローナル抗体を用いて、結合した受容体を検出する。ブロッキング活性は低いシグナルを生じる。
(ヒトおよびマウスのFGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)に対する抗体1の結合親和性)
製造業者によって教示された標準プロトコルに従って、室温にてBiaCore(登録商標)3000バイオセンサー(BiaCore,Inc.,Piscataway,NJ)を用いてFGFR−3(IIIb)および(IIIc)に対する抗体の結合キネティクスを測定する。表1に記載した結果の要約により、抗体がヒトFGFR−3のbおよびc−スプライシング型の両方に結合し、10−9M未満の親和性でマウスFGFR−3(IIIc)受容体と完全に交差反応することが示される。
(膜結合FGFR−3に対する抗体1の特異性)
マウスFGFR−3(IIIc)のcDNAを、ピューロマイシン選択遺伝子を含有するpBABE発現ベクターにクローニングする。L6細胞中で得られたプラスミドのレトロウイルス発現を実施する。細胞を選択し、10%のFBSおよび2μg/mlのピューロマイシンを含有するDMEM培地中で培養する。FGFR−3を発現するL6細胞を1%のBSA/PBSに懸濁する。抗体1を1〜30μg/mlの最終濃度まで加える。氷上で1時間のインキュベーションの後、1%のBSA/PBS中で細胞を洗浄し、氷上で1時間、同じバッファー中の適切な二次検出抗体またはFabフラグメントとともにインキュベートする。この二次抗体でのみコントロールサンプルを染色する。FACSvantage SEフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて全てのサンプルを解析する。抗体1は、FGFR−3ネガティブL6親細胞を使用した場合ではなく、FGFR−3でトランスフェクトした細胞(R3−L6)を使用した場合のみ、ポジティブ染色シグナルを生じることによって示されるように、FGFR−3に特異的である。
ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞、293フェクチン(fectin)、FreeStyle293培地およびOptiMEM培地は、Invitrogen(Carlsbad,CA)から購入できる。プロテイン−A親和性精製培地は、GE Healthcareから購入できる。FGFR(IIIb)−FcについてのDNA構築物を生成する。
(FGFR−3(IIIb)−Fc、FGFR−3(IIIb)−Fc Igドメイン切断、およびFGFR−3(IIIb)−Fcの単一のアラニン残基の変異の生成)
FGFR−3(III)bドメイン境界は、公知であるFGFR−3(IIIb)細胞外ドメイン3DモデルおよびFGFRの結晶構造に基づいて規定され得る。野生型FGFR−3(IIIb)D1−3(25−372)とともに5つの切断FGFR−3(IIIb)ECD構築物、すなわちD1(25−148)、D2(149−245)、D3(250−372)、D1−2(25−245)およびD2−3(149−372)を設計する。その構築物を、複数のクローニング部位の3’末端にて操作したFcタグを有するpGSベクターにサブクローニングし、配列を確認した。推定リガンド結合領域に近接する20のFGFR−3(IIIb)残基ならびにヘパリン結合に関するものおよび受容体−受容体の二量体化を、公知のFGFR−3(IIIb)ECDモデルおよびFGFR−3(IIIc)構造に基づいて選択する。FGFR−3(IIIb)ECDの単一のアラニン残基の変異を、鋳型として完全長FGFR(IIIb)ECD構築物を用いてオーバーラッピングPCRにより生成し、続いてpGS−Fcベクターにサブクローニングする。ドメイン切断およびアラニン変異を、293フェクチン(fectin)(商標)(Invitrogen)を用いるトランスフェクション後に293細胞において一時的に発現する。培養上清を、トランスフェクション後6日で収集し、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティーカラムを通すことによって精製し、PBS中で緩衝液を交換し、SDS−PAGE解析により定量し、評価して、構造的完全性を確認する。
(FGFR−3(IIIb)−Fcメソスケール結合アッセイ)
抗体−1の精製した溶液をPBS中に2mg/mlの濃度まで希釈する。MSD Sulfo−TAG NHS−Ester(MesoScale Discovery,#R91AN2)、ルテニウム−トリス−ビピリジンN−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、冷蒸留水を用いて10nmol/ulの濃度に再構成する。12:1モル比のMSD Sulfo−TAG NHS−エステル:抗体1を反応に使用する。インキュベーションを、室温にて2時間、光を遮断して実施する。未反応のMSD Sulfo−TAG NHS−Esterを、脱塩樹脂を用いて結合した抗体1から除去する。ルテニウムが結合した抗体1を−80℃にて保存する。結合した抗体1の濃度を、検量線のためにウシ血清アルブミンを用いて測定する。
切断した、変異または野生型FGFR−3(IIIb)−FCを、リン酸緩衝生理食塩水PBSに5μg/mLまで希釈する。標準96ウェルプレートを、25ng/ウェルの受容体でコーティングし、室温にて1時間インキュベートする。ウェル中の非特異的結合をブロックするために、150μLの5%のMSD Blocker A(MesoScale Discovert,#R93Ba−1)を各ウェルに加える。プレートを室温にて1時間インキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、プレートを、200μLのPBS、pH7.4、0.02%のTween(登録商標)−20で5回洗浄する。3倍希釈系列(250〜0.001nM)のルテニウム標識した抗体1を、試験される各タンパク質に関して3連で25μLの体積で加える。室温にて、穏やかに攪拌し、光を遮断する1時間のインキュベーション後、遊離のルテニウム標識された抗体を、1ウェルあたり200μLのPBS、pH7.4、0.02%のTween−20でさらに5回洗浄することによって除去する。この洗浄後、150μLの1×リードバッファー(MesoScale Discovery,#R92TC−2)を各ウェルに加える。電気化学的刺激の際に、結合抗体上のルテニウム標識が620nmにて発光した。電気化学発光ECLシグナルを、SECTOR Imager2400プレートリーダー(MesoScale Discovery,#1250)中で電荷結合素子カメラにより検出し、ECLUとして表す。ECLシグナルを、GraphPad Prismソフトウェアバージョン5.0でプロットする。KD値を、ソフトウェアのOne Site−Specific Binding機能の非線形回帰曲線フィット解析により算出する。野生型FGFR−3(IIIb)−Fcに対するルテニウム標識した抗体1の結合を、切断または変異FGFRの相対的結合親和性解析に関する基準として使用し、野生型の割合をプロットする。
(Mab B9 ELISA結合アッセイ)
96ウェルELISAマイクロタイタープレートのウェルを、4℃にて穏やかに攪拌しながら100μLのPBS、pH7.2中の200ngの抗FGFR−3モノクローナル抗体、B9(Santa Cruz sc−13121)で一晩コーティングする。コーティング後、抗体溶液をデカントし、ウェルを、室温にて2時間、穏やかに攪拌しながら0.1%のTween(PBST)、5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含む100μLのリン酸緩衝生理食塩水でブロックする。ブロック後、ウェルを、200μLのPBSTで5回洗浄する。次いで、3倍希釈系列(100〜0.006nM)の変異または野生型FGFR−3(IIIb)−FCを、試験される各タンパク質について3連で100μLのPBST、1%のBSAに加え、室温にて1時間穏やかに攪拌しながらインキュベートする。ウェルを再び200μLのPBSTで5回洗浄する。100μLのPBST、5%のBSA中の1:5000希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)が結合した抗マウスIgGを、室温にて1時間穏やかに攪拌しながら各ウェル中でインキュベートする。ウェルを最後に200μLのPBSTで5回洗浄し、次いで100μLの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ(TMB)発色基質で5分間、発達させる。反応を1ウェルあたり100μLの1N HSOで停止する。吸光度を450nmにて分光光度法で測定する。吸光度の読み取り値を、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアバージョン5.0でプロットする。KD値を、ソフトウェアのOne Site−Specific Binding機能の非線形回帰曲線フィット解析により算出する。野生型FGFR−3(IIIb)−Fcに対するB9の結合を、切断または変異FGFRの相対的結合親和性解析に関する基準として使用し、野生型の割合としてプロットする。
(ヒトFGFR−3(IIIb)の分子モデリング)
突然変異生成研究を導くことを支援するために、FGFR−3(IIIb)ECDのドメイン2および3の3次元モデルを、SWISS−MODEL(登録商標)を用いて生成する。ヒトFGFR−3(IIIb)、およびヒトFGFR−3(IIIc)の配列を、CLUSTALW(登録商標)法を用いて整列させ、そのモデルを、鋳型としてFGFR−3(IIIc)のX線結晶構造(タンパク質データバンクコードIRY7)を用いて構築する。
(抗体1のエピトープはFGFR−3の第2の免疫グロブリン様(Ig)ドメイン内に含まれる)
FGFR受容体ファミリーのリガンド結合部位は、細胞外ドメインを規定する3つのN末端Igドメイン内に含まれる(Chellaiahら,J.Biol.Chem.1999年12月3日;274(49):34785−34794)。3つのIgドメインが抗体1のエピトープを含むことを決定するために、ドメイン切断のパネルを利用する。ヒトIgドメインをコードするDNA配列を、種々の形で切断し、ヒトFcタグを有するホモ二量体融合タンパク質として発現する。コードされたタンパク質を、一時的にトランスフェクトした細胞の馴化した上清から精製し、各々の精製したドメイン切断のホモ二量体構造をSDS−PAGEにより確認する。次いで、切断体を、メソスケール結合アッセイにおいて抗体1に対する結合に関して試験する(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)。抗体1は、D1およびD3切断体に対して検出可能な結合を示さないが、それは、メソスケール結合アッセイ(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)において、およびBIAcore(商標)(Pharmacia,Piscataway,NJ)によって測定した場合、D1−2およびD2切断体に対して有意な結合を示した。B9は、受容体のドメイン1において構造的に感受性の高いエピトープを認識するので、ドメイン1を含むそれらの切断体は、完全な構造が破壊されない場合、抗体を結合することが予想される。D1およびD1−2切断体は、コントロールMab B9に対して有意な結合を示し、メソスケール結合アッセイ(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)において、およびBIAcore(商標)(Pharmacia,Piscataway,NJ)によって測定した場合、それらの2つのタンパク質の構造的完全性を確認した。切断体の結合データは、FGFR−3の第2のIgドメインが、抗体1を結合するのに十分であるので、エピトープに必須の残基を含むことを明らかにした。
(抗体1によって認識されるエピトープ内のFGFR−3のアミノ酸の同定)
FGFR−3(IIIb)ECDのドメイン2および3の3次元モデルを、FGFR−3(IIIc)の結晶構造に基づいて生成した。リガンド結合、受容体の二量化またはヘパリン結合に近接するか、または直接関与するFGFR−3の第2のドメイン内の20のアミノ酸(D160、K161、K162、L163、L164、V166、P167、P220、R223、D244、N170、T171、R158、R173、R175、K205、R207、L246、E247、S249)を分子モデルに基づいて同定し、単一のアラニン残基の変異を生成する。
FGFR−3ドメイン2の野生型配列を決定する(配列番号12)。示した各アミノ酸を、個々に、部位特異的突然変異誘発法によってアラニンに変異し、FGFR(IIIb)−Fcタンパク質をコードする全ECDとの関連で発現する。コードされた変異タンパク質を、一時的にトランスフェクトした細胞の馴化した上清から精製し、各々の精製した変異のホモ二量体構造をSDS−PAGEにより確認する。
上記のアラニン変異が抗体1に対する結合の著しい損失を生じる場合、残基はエピトープに必須であるとみなす。次いで、結合の著しい損失を示す全ての変異タンパク質を、全タンパク質構造の肉眼的変化を調べるためにMab B9に対する結合について試験する。試験した20部位のうち、173位におけるアルギニンに対するアラニンの置換(R173A)は、抗体1に対する結合のほとんど完全な損失を生じる(WTと比べて90%より多い結合の減少);一方で、他の置換は結合を保持する(WTと比べて20%より少ない結合の減少)。その後の試験により、Mab B9に対する結合は、R173A置換によって影響しなかったことを示し、これは、173位が、抗体1によって受容体の特異的認識に必須の残基を構築することを示唆する。R173A変異に対する抗体1の親和性を、BIAcore(登録商標)解析によって測定する。R173A変異に対する抗体1の結合は、野生型タンパク質に対する抗体の親和性より7倍低い。
配列比較により、ヒトおよびマウスFGFR−3配列の173位におけるアルギニン残基は、他のファミリーメンバーによって共有されないことが明らかにされ、この残基が、抗体1によって提示されるFGFR−3特異性に関与している可能性があることを示唆する。
(FGFR−3抗体アンタゴニストはFGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)により媒介されるFGF結合および細胞シグナル伝達をブロックする)
上述のELISAブロッキングアッセイからの結果は、抗体1が、1〜10nMの範囲内のIC50でFGF−1/FGFR−3結合をブロックすることを示す。生細胞中のFGFR−3シグナル伝達に対するこの抗体の活性を試験するために、上記のFGFR−3発現L6細胞を使用する。FGFR−3発現L6細胞を、非常に低い濃度の血清(0.1%)を含む培地中で一晩休眠させる。次の日に、細胞を等しいサイズの5つのサンプルに分割する。サンプル1および2を、アイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体(200nM)および抗体1(200nM)でそれぞれ1時間、処理する。サンプル3を0.6nMのFGF−9で15分間、曝露する。サンプル4および5を、まず、アイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体(200nM)および抗体1(200nM)でそれぞれ1時間、処理し、次いで、0.6nMのFGF−9に15分間、曝露する。これらの処理および曝露後、細胞を溶解させ、それらをSDS−PAGEおよびウェスタンブロットにかける。抗ホスホチロシン抗体を用いてFGFR−3の活性化を調べる。抗体1単独では、活性化されたFGFR−3およびMAPKのシグナルは増加も減少もせず、FGF−9リガンド曝露により、活性化されたFGFR−3およびMAPKのシグナルが同じ程度まで増加する。従って、これらの結果は、抗体1が、生細胞中のリガンドにより誘発された活性化においてFGFR−3受容体をブロックするアンタゴニストであることを実証する。
(細胞表面FGFR−3は抗体1に対する結合の際に内在化する)
抗体1は、受容体シグナル伝達を下方調節する機構を構成する、FGFR−3の内在化を引き起こす。これを試験するために、抗体1/FGFR−3複合体の位置を追跡するために、市販のAlexa Fluor(登録商標)色素(Invitrogen)で抗体を標識する。抗体1およびアイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体を蛍光色素と結合させる。FGFR−3発現L6細胞を、非常に低い濃度の血清(0.1%)を含む培地中で一晩休眠させる。
細胞を等しいサイズの8つのサンプルに分割し、6ウェル組織培養プレートのウェルに播種する。それらのサンプルを3つの別個の処理に供する:1)結合する工程であって、細胞を、4℃で1時間、1mLの200nMの複合体化された抗体とインキュベートする、工程。温度はエンドサイトーシスに関して禁止的に低いが、抗体−抗原相互作用を生じる;2)内在化する工程であって、細胞を、37℃で1時間、1mLの200nMの複合体化された抗体とインキュベートする、工程。この温度はエンドサイトーシスを可能にする;3)剥離する工程であって、細胞を、4℃で30分間、1mLの0.2Mグリシン−0.15MのNaCl、pH3で処理する工程。この条件において、内在化しない抗体は、表面受容体にもはや結合できず、培地中に放出される。8つのFGFR−3によりトランスフェクトしたL6細胞サンプルを、以下の記載に従って処理する:サンプル1は、4℃で1時間、複合体化したコントロール抗体(200nM,1mL)とともにインキュベートする;サンプル2は、4℃で1時間、複合体化したコントロール抗体(200nM,1mL)とともにインキュベートし、その後、剥離する;サンプル3は、37℃で1時間、複合体化したコントロール抗体(200nM,1mL)で処理する;サンプル4は、37℃で1時間、複合体化したコントロール抗体(200nM,1mL)で処理し、その後、剥離する;サンプル5は、4℃で1時間、複合体化した抗体1(200nM,1mL)で処理する。サンプル6は、4℃で1時間、複合体化した抗体1(200nM,1mL)で処理し、その後、剥離する;サンプル7は、37℃で1時間、複合体化した抗体1(200nM,1mL)で処理する。サンプル8は、37℃で1時間、複合体化した抗体1(200nM,1mL)で処理し、その後、剥離する。これらの処理後、全ての細胞を、1mLの氷冷PBSで3回洗浄し、相対的蛍光強度を検出するためにOdyssey Infrared Imagingシステムに供した。サンプル1〜8の読み出しは以下の通りである:1.5、0.6、1.1、1、3.3、1.5、5および5.8。サンプル1および5を処理する条件は、抗体−細胞表面結合を可能にするが、内在化を可能にしない。サンプル2および6を処理する条件は、細胞−表面結合も内在化のいずれも可能にしない。サンプル3および7を処理する条件は、細胞−表面結合および内在化を可能にする。サンプル4および8を処理する条件は、内在化を可能にするが、細胞−表面結合を可能にしない。サンプル1〜4およびサンプル6によって生成されるシグナルは非特異性に起因するバックグランドとみなされる。
インキュベーション後、一部のサンプルに「酸洗浄」工程を実施して、細胞内に輸送されたものに影響を与えずに表面結合抗体を剥離する。これにより、内在化抗体の定量化が可能となる。同様に標識したコントロール抗体(非特異的hIgG)は、インキュベーション温度にも、洗浄工程にも関わらず、保持されない。抗体1は洗浄前に両方の温度で保持されるが、後記のように37℃でインキュベートされたものが残り;細胞による抗体の内在化を実証する。
(抗体1は細胞内のFGFR3−受容体分解を誘発する)
OPM−2は、複数の骨髄種の癌細胞から最初に単離された細胞株である。OPM−2細胞は、K650E点突然変異の機能獲得を保有するFGFR−3受容体を発現することが知られている。低血清培地(0.1%FBS)中で一晩、OPM−2細胞を休眠させる。次の日、これらの細胞を5群に分ける。群1をすぐに溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。従って、この群を0時間のサンプルに指定する。群2〜5の各々を、等しいサイズの3つのサンプルにし、群2、3、4および5をサンプルA、BおよびCと名付ける。群2〜5のサンプルAは、いかなるさらなる処理にも供さないが、37℃でインキュベートする。群2〜5のサンプルBを、37℃にて30ng/mlのFGF−1で処理する。群2〜5のサンプルCを、37℃にて30μg/mlの抗体1で処理する。処理の1時間後、群2の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を1時間のサンプルと指定する。処理の4時間後、群3の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を4時間のサンプルと指定する。8時間の処理後、群4の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を8時間のサンプルと指定する。24時間の処理後、群5の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−20℃に維持する。この群を24時間のサンプルと指定する。全ての溶解物を調製して、それらをSDS−PAGE、続いてウェスタンブロット実験に供する。群1のFGFR−3シグナルおよび群2の全てのサンプルは同様である。群3において、サンプルAおよびCのFGFR−3シグナルは群1のものと同様であり、さらにサンプルBのシグナルは著しく低い。群4において、サンプルAのFGFR−3シグナルは群1のものと同様であり、さらにサンプルBおよびCのシグナルは著しく低い。群5において、サンプルAのFGFR−3シグナルは群1のものより低く、さらにサンプルBおよびCのシグナルはほとんど存在しない。従って、FGFR分解を誘発することが知られている、FGF−1と同様に、抗体1は時間依存性様式においてFGFR−3分解を誘発でき、これは出願人がデータに示されていないと考える特徴である。
(抗体1は細胞表面由来の変異FGFR−3受容体の枯渇を誘発する)
膀胱癌において特定される多くのFGFR−3活性化突然変異は受容体の細胞外ドメインに位置する。これらの変異(例えばR248CまたはS249C)は、リガンド非依存性様式においてジスルフィド結合されたFGFR−3二量体の形成を導く、新規の、対になっていないシステイン残基を生じる。最も頻度の高い変異は、S249C、Y375CおよびR248Cであり、それらは一緒に、膀胱癌においてFGFR−3変異全ての91%の割合を占める。さらに、FGFR−3(IIIc)上のS249Cはまた、FGFR3(IIIc)の構成的活性化を導く。抗体1は内在化し得、野生型(WT)FGFR−3だけでなく、最も多く見られる腫瘍関連FGFR−3変異体もまた枯渇させ得る。
3つの最も一般的なFGFR3変異体およびWT FGFR−3の各々を安定に発現するNIH−3T3およびBa/F3細胞株を生成するために、完全長ヒトFGFR−3(IIIb)または(IIIc)をコードするcDNAを、pMSCVプロレトロウイルスベクター(Clontech Laboratories,Mountain View,CA)内にクローニングして、pMSCVプロ−FGFR−3(IIIb)または(IIIc)を生成する。特定の変異体、すなわちS249C、Y375CおよびR248Cを、QickChange(Stratagene,La Jolla,CA)によりcDNA内に導入する。WTまたは変異FGFR−3を発現するNIH3T3およびBa/F3安定細胞を生成するために、種々のpMSCVneo構築物を、リポフェクタミン(Invitrogen)を用いてパッケージング細胞Phoenix−Eco(ATCC,Manassas,VA)内にトランスフェクトする。レトロウイルスを収集し、NIH−3T3およびBa/F3細胞を感染させるために使用する。2週間、2μg/μlのピューロマイシンを用いた選択後、WTまたは変異FGFR−3を発現する細胞を、Alexa Fluor488により複合体化した抗ヒトFGFR−3で染色し、蛍光標識細胞分取(FACS)を用いて解析する。
細胞表面由来の変異およびWT FGFR−3の、抗体1により誘発された内在化/枯渇に関して、6ウェル組織培養プレート(Costar,#3598)のウェルに、2mLの培地(DMEM(Invitrogen);10%(v/v)FCS(Invitrogen);2mMのL−グルタミン(Invitrogen);100U/500mLのペニシリンG、および100μg/500mLのストレプトマイシン(Invitrogen))中の1.5×10のNIH−3T3−FGFR−3変異体を播種する。プレートを、95%の相対湿度および5%(v/v)CO下で、37℃にて24時間インキュベートする。次いで、抗体1を5μg/mLの最終濃度でウェルに加える。2時間の処理後、培地をウェルから除去し、1mLの酵素を含まない細胞解離溶液(Chemicon,#S−014−B)と取り替える。細胞を、室温にて5分間インキュベートした後、遠心分離管中に収集し、培地中で一度洗浄し、続いて、結合緩衝液(1%(w/v)BSAおよび0.01%(w/v)アジ化ナトリウムを含むDPBS)中で1回以上洗浄する。細胞を染色する前に、抗体1由来の異なるエピトープを認識するFGFR−3抗体を、供給者の指示書に従って、Alexa Fluor 488モノクローナル抗体標識キット(Molecular Probes,Eugene,OR)を用いて標識する。2μg/mLのAlexa Fluor 488で標識した抗体を含有する100μLの結合緩衝液を細胞に加え、次いでそれを、氷上で60分間インキュベートする。次いで、細胞を結合バッファーで一度洗浄し、(死細胞を染色するために)2μg/mLのヨウ化プロピジウムを含有するDPBSに再懸濁する。細胞表面に残存しているFGFR−3分子の量をFACS解析により解析し、1,000事象を各々のサンプルについて獲得する。
細胞表面上の平均蛍光強度は、抗体1での処理後、細胞表面上に残存しているFGFR−3分子の量を反映する。細胞表面上のFGFR−3の枯渇の割合を、ヒトIgG1で処理した細胞の平均蛍光強度で割った抗体1で処理した細胞の平均蛍光強度を用いて算出する。抗体1は、細胞表面由来のFGFR−3のWTおよび変異体の両方で著しく減少する。
Ba/F3−FGFR3細胞増殖アッセイに関して、80,000細胞/ウェルを、10%FBSを補足したRPMI 1640倍地中に播種する。抗体1を、ヘパリン(StemCell Technologies,Vancouver,カナダ)とともに0.005〜10μg/mlの濃度で加える。72時間のインキュベーション後、細胞を、37℃、5%CO2で6時間、20μl(2μCi)/200μlのメチル−3Hチミジンでパルスした。細胞を収集し、3Hチミジン導入を計数した。抗体1は、Ba/F3−FGFR−3−R248C増殖を著しく阻害した。
(FGFR−3抗体アンタゴニストは、インビトロにおいてFGFR−3発現腫瘍細胞中のFGFシグナル伝達を阻害する)
抗体1が一次抗体であるフローサイトメトリーを用いて野生型または変異FGFR−3(IIIbおよび/またはIIIc)を発現する腫瘍細胞株を同定する。3つの膀胱腫瘍細胞株、RT112、RT4およびBFTC905は、有意なFGFR−3発現を示す。K650E点突然変異の機能獲得を保有するFGFR−3受容体を発現することが知られているOPM−2細胞もまた、この研究において高レベルの発現を示す。2つのさらなる細胞株、GEOおよびFADUは、中程度であるが、なお有意なレベルの受容体を発現することが見出される。これらの腫瘍細胞中のFGFR−3シグナル伝達を、ウェスタンブロットを用いて特徴付ける。
OPM−2はヒト多発性骨髄腫由来の細胞株である。低血清培地(0.1%FBS)中で一晩、細胞を休眠させる。次の日、これらの細胞を、等しいサイズの4つのサンプルに分ける。サンプル1を、コントロールサンプルとして37℃にて1時間、取っておき、維持する。サンプル2を、37℃にて1時間、200nMの抗体1とともにインキュベートする。サンプル3を、37℃にて1時間、取っておき、次いでその同じサンプルを、15分間、0.2nMのFGF−9リガンドに曝露する。サンプル4を、37℃にて1時間、200nMの抗体1とともにインキュベートし、次いでその同じサンプルを37℃にて15分間、0.2nMのFGF−9に曝露する。次に、全ての4つのサンプルを溶解し、それらをSDS−PAGE、続いてウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化チロシン抗体を用いてFGFR−3の活性化を調べる。抗リン酸化MAPK抗体を用いて下流のエフェクター分子MAPKの活性化を調べる。抗リン酸化Akt抗体を用いて下流のエフェクター分子Aktの活性化を調べる。サンプル2および4由来の蛍光体FGFR−3のシグナルは、刺激されていない状態の受容体を表す、サンプル1由来のものに相当する。サンプル3のシグナルはサンプル1の3倍より大きい。これにより、抗体1が、FGFR−3活性化に対するFGF−9の効果を拮抗するという結論が下され得る。サンプル2および4由来の蛍光体MAPKのシグナルは、刺激されていない状態の受容体を表す、サンプル1由来のものに相当する。サンプル3のシグナルは、サンプル1の2倍より大きい。これにより、抗体1が、MAPK活性化に対するFGF−9の効果を拮抗するという結論が下され得る。GEOはヒト大腸腫瘍由来の細胞株である。低血清培地(0.1%FBS)中で一晩、細胞を休眠させる。次の日、これらの細胞を等しいサイズの6つのサンプルに分ける。サンプル1をコントロールサンプルとして37℃にて1時間、取っておき、維持する。サンプル2を、37℃にて1時間、200nMのアイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体の200nMとともにインキュベートする。サンプル3を、37℃にて1時間、200nMの抗体1とともにインキュベートする。サンプル4を、37℃にて1時間、取っておき、次いでその同じサンプルを、37℃にて15分間、0.67nMのFGF−1リガンドに曝露する。サンプル5を、37℃にて1時間、200nMのコントロール抗体とともにインキュベートし、次いでその同じサンプルを、37℃にて15分間、0.67nMのFGF−1に曝露する。サンプル6を、37℃にて1時間、200nMの抗体1とともにインキュベートし、次いでその同じサンプルを、37℃にて15分間、0.67nMのFGF−1に曝露する。6つのサンプル全てを溶解し、それらをSDS−PAGE、続いてウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化チロシン抗体を用いてFGFR−3の活性化を調べる。サンプル1、2および4は、同様の低レベルの蛍光体FGFR−3を有するが、サンプル3のみは、全ての3種類の分子に相当する著しく高いシグナルを有する。従って、1)FGF−9曝露はFGFR−3のリン酸化を増加させ;2)抗体1はそれらの増加を拮抗し、3)抗体1のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。
RT−112はヒト膀胱癌由来の細胞株である。細胞を、低血清培地(0.1%FBS)中で一晩、休眠させる。次の日、これらの細胞を、等しいサイズの4つのサンプルに分ける。サンプル1を、コントロールサンプルとして37℃にて1時間、取っておき、維持する。サンプル2を、37℃にて1時間、200nMの抗体1とともにインキュベートする。サンプル3を、37℃にて1時間、取っておき、次いで、その同じサンプルを37℃にて15分間、1.3nMのFGF−1リガンドに曝露する。サンプル4を、37℃にて1時間、200nMの抗体1とともにインキュベートし、次いで、その同じサンプルを、37℃にて15分間、0.13nMのFGF−1に曝露する。次に、4つのサンプル全てを溶解し、各々の溶解したサンプルの10%をSDS−PAGE、続いてウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化MAPK抗体を用いて、下流のエフェクター分子MAPKの活性化を調べる。抗リン酸化Akt抗体を用いて、下流のエフェクター分子Aktの活性化を調べる。各々の溶解物の他の90%を免疫沈降実験に供する。サンプルを、4℃にて4〜16時間、市販の抗FGFR−3抗体とともに混合し、抗体に溶解物中でFGFR−3受容体を収集させ、次いで、20μgのプロテインA−プロテインGビーズ混合物(50:50,V:V)とサンプルとを、4℃にて一晩混合することによって、抗FGFR−3抗体が結合したFGFR−3を回収する。それらのビーズをPBSで3回洗浄し、その後、それらをSDS−PAGEおよびウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化チロシン抗体を用いて、FGFR−3の活性化を調べる。サンプル1、2および4は、同様の低レベルの蛍光体FGFR−3および蛍光体MAPKを有するが、サンプル3のみは、全ての3種類の分子に相当する著しく高いシグナルを有する。従って、1)FGF−1曝露はFGFR−3およびMAPKのリン酸化を増加させ、2)抗体1はそれらの増加を拮抗し、3)抗体1のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。サンプル4のみは、残りのものより低い蛍光体Aktシグナルを有し、抗体1は同様にAktシグナル伝達を拮抗できることを示す。
GEO細胞を使用して、上記の6つのサンプルを調製し、次いで溶解し、それらを上記のようにSDS−PAGE、続いてウェスタンブロッティングに供する。しかしながら、抗リン酸化MAPK抗体を用いて下流のエフェクター分子MAPKの活性化を調べる。抗リン酸化Akt抗体を用いて下流のエフェクター分子Aktの活性化を調べる。サンプル1、2、3および6は、同様の低レベルの蛍光体MAPKを有するが、サンプル4および5は、3種類全ての分子に相当する著しく高いシグナルを有する。従って、1)FGF−1曝露はMAPKのリン酸化を増加させ;2)抗体1はこの増加を拮抗し、3)抗体1のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。従って、1)FGF−1曝露はMAPKのリン酸化を増加させ;2)抗体1はこの増加を拮抗し、3)抗体1のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。
(抗体1は腫瘍細胞増殖を阻害し、インビトロにおいて生存する)
腫瘍細胞の増殖に対する抗体1の阻害効果を示すために、細胞増殖アッセイを使用する。単層RT112細胞を、24〜72時間、低血清培地(0.1%のウシ胎仔血清、5μg/mLのヘパリン)中で休眠させる。細胞を4つのサンプルに分ける。FBS(ウシ胎仔血清)を、10%(V:V)の最終濃度までサンプル1に加える。サンプル2を飢餓培地中に静置する。FGF−1を、1nMの最終濃度までサンプル3に加える。抗体1を、200nMの最終濃度までサンプル4に加え、37℃にて1時間、インキュベートする。次に、FGF−1を1nMの最終濃度まで加える。上記のようにサンプル1〜4を調製後、37℃にて5% CO(v:v)で48時間、組織培養インキュベーターセット中でサンプルをインキュベートする。標準的なH−チミジン導入アッセイを用いて、細胞増殖を検出する。インビトロにおいてRT112細胞を1nMの外因性FGF−1で刺激した場合、腫瘍細胞増殖は2倍になる。この実験はまた、抗体1が、この外因性に刺激した増殖を効果的に減少させることを示す。
コロニー形成アッセイまたはコロニゲニックアッセイ(colonigenic assay)としても知られている、軟寒天アッセイを、腫瘍細胞の生存に対する抗体1の阻害効果を示すために使用する。200nMの抗体1(10%のFBS培地中)を含有する軟寒天中のRT112細胞増殖は、10%のFBS培地のみを含有するか、または200nMのアイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体(10%のFBS培地中)を含有する軟寒天中で増殖したものより約50%少ないコロニーを形成する。これは、腫瘍細胞に対する抗体1の抗生存効果を示す。
(抗体1はFGFR−3を保有する固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を示す)
慣例の方法によってRT112およびGEO異種移植腫瘍モデルを成長させる。この方法において、0〜100%のマトリゲルと混合した100万〜2000万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均値がほぼ400mmになると、抗体処置を開始する。両方とも異種移植腫瘍に相当する2つの腫瘍細胞株、RT112およびGEOは、コントロール群中の同じタイプの腫瘍と比較して、週に3回の40mg/kgの抗体1の腹腔内注射処理によって効果的に阻害する。これらの効果がFGFR−3シグナル伝達経路の付与から生じることを実証するために、同所性(Orthotopic)PC−3腫瘍モデルを用いて有効性研究を行い、ここで、腫瘍細胞は、FGFR−3受容体リン酸化のウェスタンブロット解析からの陰性結果によって示唆されるようにFGFR−3シグナル伝達経路を欠く。同所性PC−3モデルを、ルシフェラーゼをトランスフェクトしたPC−3細胞(PC−3LP)を、外科手術によりNu/nuマウス(雄、7〜8週、1×10細胞/マウス)の背葉前立腺に直接注入することにより生成した。細胞注入の2週間後、動物の生物発光画像を、腹側位置(後方に寝かせている動物)において捕捉し、製造業者の指示書(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)に従ってIVISシステムを用いて定量化する。移植が成功したマウスを、所定のスケジュールで腹腔内に種々の試験薬剤を与える群にランダム化する。IVISによって捕捉したシグナルを、全身腫瘍組織量の代用物として用い、週に一度記録する。統計的解析を、反復ANOVAを用いて実施する。抗体1は、PC−3腫瘍の増殖に対して有意な効果を示さない。従って、抗体1は、機能的FGFR−3シグナル伝達経路を保有するそれらの固形腫瘍の増殖を阻害する。
(抗体1は変異FGFR−3受容体を有する骨髄腫瘍に対する抗腫瘍効果を示す)
OPM−2およびKMS−11は、FGFR−3を発現する多発性骨髄腫細胞株である。さらに、両方の細胞株における受容体は、単一の点突然変異:OPM−2中のK650EおよびKMS−11中のY373Cを保有する変異体である。2つの変異体は機能獲得型変異であり、構成的活性化、延長した半減期および増加したリガンド感受性などの機構を介して変異受容体の活性を増加させる。慣例の方法によってOPM−2異種移植モデルを成長させる。この方法において、0〜100%のマトリゲルと混合した100万〜2000万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均体積がほぼ400mmになると、注射処置を開始する。週に3回処置する。週に3回、腫瘍体積を測定する。処置の4週間後に最終測定を行う。抗体1で処置した動物の平均腫瘍サイズは、コントロール群のものより64%小さい。スチューデントt検定を実施する。P値は0.0001未満である。従って、実測値は非常に有意である。KMS−11骨生着モデルを、Xin Xら,Clin Cancer Res.2006年,8月15日;12(16):4908−15に従って確立する。腫瘍細胞注入後、1週間で抗体処置を開始する。週に3回処置する。研究の間に、腫瘍細胞によって放出されたシグナルを数回測定する。最初の注入の33日後、最終測定を行う。抗体1で処置した動物からの平均シグナルは、コントロール動物からのものの1/4である。ログランク(マンテル−コックス)検定(Long−rank(Mantel−Cox)Test)を実施する。P値は0.0002である。従って、実測値は非常に有意である。両方のモデルにおいて、週に3回の40mg/kgの抗体1の腹腔内注射処置は、コントロール群と比べて腫瘍増殖を著しく阻害する。抗体1は、最初に、インビボにおいて、K650Eを有する腫瘍細胞およびFGFR−3のY373C変異型を有するものに対する抗腫瘍活性を示すように見える。
(抗体1は細胞毒性剤の治療効果を高める)
シスプラチンは、癌治療において広範囲に使用される細胞毒性剤である。これはDNA架橋を生じ、細胞アポトーシスを誘発する。3つの膀胱異種移植モデルにおいてシスプラチンとFGFR−3抗体とを混合する治療的有用性を調べる。慣例の方法によってRT112、RT4およびBFTC905異種移植腫瘍モデルを成長させる。この方法において、0〜100%のマトリゲルと混合した100万〜2000万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均体積がほぼ400mmになると、抗体処置を開始する。週に3回、40mg/kgの抗体1およびシスプラチンの最大耐容量(MTD)の注射を使用する。研究の終わりまで、週に3回、平均腫瘍体積を測定する。RT112腫瘍モデルのデータの概要を以下の表に記録する。
表3:個々のRT−112腫瘍体積(mm)−シスプラチン処置
Figure 2012505912
RM ANOVO統計的検定を実施する。シスプラチン処置の効果と、シスプラチン−抗体1の組み合わせの効果とを比較する。P値は0.018である。従って、シスプラチンの高い有効性に対する抗体1の効果は非常に有意である。
RT4腫瘍モデルのデータの概要を以下の表に記録する。
表4:個々のRT4腫瘍体積(mm)−シスプラチン処置
Figure 2012505912
RM ANOVO統計的検定を実施する。シスプラチン処置の効果と、シスプラチン−抗体1の組み合わせの効果とを比較する。P値は0.0162である。従って、シスプラチンの増加した効果に対する抗体1の効果は非常に有意である。
BFTC905腫瘍モデルのデータの概要を以下の表に記録する。
表5:個々のBFTC−905腫瘍体積(mm)−シスプラチン処置
Figure 2012505912
RM ANOVO統計的検定を実施する。シスプラチン処置の効果と、シスプラチン−抗体1の組み合わせの効果とを比較する。P値は0.0209である。従って、シスプラチンの増加した効果に対する抗体1の効果は非常に有意である。
これらの研究の全過程の間の処置に死んだ動物はなく、抗体1をシスプラチンのMTDに加えることは、2つの薬物の副作用を著しく悪化させずに、後者の効果を高めることを示唆している。

Claims (19)

  1. ヒトFGFR−3(IIIb)およびFGFR−3(IIIc)に対して特異的に結合する、単離された抗体。
  2. 室温(20〜25℃)にて約1×10−8M以下のKを有するヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
  3. ヒトFGFR−3ドメイン2(配列番号12)に対して特異的に結合する、請求項1または2に記載の抗体。
  4. 配列GYMFTSYGIS(配列番号1)を有するCDRH1、配列WVSTYNGDTNYAQKFQG(配列番号2)を有するCDRH2、配列VLGYYDSIDGYYYGMDV(配列番号3)を有するCDRH3、配列GGNNIGDKSVH(配列番号4)を有するCDRL1、配列LDTERPS(配列番号5)を有するCDRL2、および、配列QVWDSGSDHVV(配列番号6)を有するCDRL3を含むヒトFGFR−3に対して特異的に結合する、請求項1から3のうちいずれか一項に記載の抗体。
  5. 重鎖可変アミノ酸配列:EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS(配列番号7)、および、軽鎖可変アミノ酸配列:QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG(配列番号8)を含む抗体である、請求項1から4のうちいずれか一項に記載の抗体。
  6. 配列番号9の重鎖および配列番号10の軽鎖を含む、請求項1から5のうちいずれか一項に記載の抗体。
  7. 配列番号9の2本の重鎖および配列番号10の2本の軽鎖を含む、請求項1から6のうちいずれか一項に記載の抗体。
  8. 請求項1から7のうちいずれか一項に記載の抗体における中和ヒトFGFR−3結合フラグメント。
  9. 単離された抗体またはそのフラグメントであって、当該抗体は、請求項5から8のうちいずれか一項に記載の競合抗体を用いる競合ELISAアッセイにおいてFGFR−3の細胞外ドメインに対する結合と競合し、当該競合抗体は、室温(20〜25℃)にて約1×10−8M以下のKでFGFR−3と結合することを特徴とする、単離された抗体またはそのフラグメント。
  10. 変異FGFR−3に対して特異的に結合する、請求項9に記載の抗体。
  11. 請求項1から9のうちいずれか一項に記載された抗体またはフラグメントと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
  12. 治療における同時使用、別個使用または連続使用のための、請求項1から9のうちいずれか一項に記載された抗体またはフラグメントと、治療のための追加の抗癌剤とを組み合わせて含有する製品。
  13. 医薬として用いられる、請求項1から9のうちいずれか一項に記載の抗体またはフラグメント。
  14. 癌の治療に用いられる、請求項1から9のうちいずれか一項に記載の抗体またはフラグメント。
  15. 前記癌が膀胱癌または多発性骨髄腫である、請求項13に記載の抗体またはフラグメント。
  16. 別の薬剤と共に用いられる請求項14に記載の抗体またはフラグメント。
  17. 患者に対して有効量の別の薬剤を、同時投与、別個投与、または、連続投与することを含む、請求項16に記載の抗体。
  18. 前記薬剤はシスプラチンである、請求項17に記載の抗体。
  19. 請求項1から18のうちいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に受容可能な担体および必要に応じて他の治療成分を共に含む、薬学的組成物。
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