CN103524620A - 成纤维细胞生长因子受体-3(fgfr-3)抑制物和治疗的方法 - Google Patents

成纤维细胞生长因子受体-3(fgfr-3)抑制物和治疗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与人FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)或其突变体形式特异性结合的分离的抗体或其片段。其他实施方案包括包含该抗体的药物组合物和使用该抗体来治疗癌症的方法。

Description

成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)抑制物和治疗的方法
本申请是中国专利申请200980141656.2的分案申请，原申请的申请日是2009年10月15日，发明名称是“成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)抑制物和治疗的方法”。
本发明属于免疫学和癌症治疗。更具体地，本发明涉及与人成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)(SEQ ID NO11)结合的人抗体。FGFR又称作CD333、ACH、CEK2、HSFGFR-3EX和JTK4。
FGFR-3已经显示参与癌症(包括多发性骨髓瘤、膀胱癌和尿道上皮细胞癌)的发展。FGF配体-受体结合诱导了受体二聚化和自身磷酸化，导致激活下游效应分子。FGFR-3信号传导能够调节广泛类型的细胞活动，如增殖、分化、移行、存活/凋亡、细胞骨架和细胞因子调节、以及内吞作用/胞吐作用。FGFR-3信号传导的过度激活已经被视为赋予肿瘤细胞生长或存活优势并因而有助于肿瘤恶性的重要事件。
全长FGFR-3具有2种剪接形式，称作FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)，它们因编码FGFR-3的第三IgG样结构域的备选外显子产生。FGFR-3也具有因DNA复制或翻译中错误所致的充分记录的突变体形式。鉴于FGFR-3信号传导途径在包括癌症的广泛类型疾病中的积极作用，故需要调节该途径的机制。
已经公开了阻断配体结合的抗FGFR-3抗体(Rauchenberger,R.等人,J.Biol.Chem.2003年10月3日;278(40):38194-205)。已经公开了与FGFR-3的野生型和突变体形式均结合的抗FGFR-3抗体(Martinez-Torrecuadrada,J等人,Clin.Cancer Res.2005年9月1日;11(17):6280-90；Trudel S等人,Blood2006年5月15日;107(10):4039-46)。已经公开了抑制配体介导的FGFR-3信号传导激活并抑制FGFR-3介导的肿瘤生长的抗FGFR-3抗体(Trudel S等人,Blood2006年5月15日;107(10):4039-46)。已经公开了作为联合疗法给予时增强顺铂的抗肿瘤作用的抗FGFR-3抗体(Deevi,D.等人,AACR2007年10月21-24日;Wang,W等人,EORTC200810月22-26)。
然而，本领域中需要具有一种或多种以下能力的抗体拮抗物：高度特异于FGFR-3的两种剪接形式(FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc))、内化FGFR-3和优选地还诱导FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)或其突变体形式降解并且与化学细胞毒剂联合使用时增强治疗功效和逆转化学抗药性。此外,所述抗体也优选对FGFR-3的突变体形式有活性、阻断FGF配体与FGFR-3结合、抑制配体诱导的FGFR-3信号传导途径、抑制FGFR-3介导的细胞活性或体外和体内抑制肿瘤生长。
本发明的抗体已经解决这些需求。所述抗体高度特异于FGFR-3的两种剪接形式(FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc))、内化FGFR-3并且优选地与细胞中的FGFR-3受体或受体突变体结合时还诱导受体降解、与化学细胞毒剂联合使用时增强治疗功效和逆转化学抗药性，以及对FGFR-3的突变体形式有活性、阻断FGF配体与FGFR-3结合、抑制配体诱导的FGFR-3信号传导途径、抑制FGFR-3介导的细胞活性并且抑制体外和体内抑制肿瘤生长。
本发明涉及与人FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)特异性结合的分离的抗体。
优选地，该抗体是在室温(20-25℃)具有约1×10-8M或更小KD的人抗体。
优选地，该抗体与人FGFR-3结构域2(SEQ ID NO12)特异性结合。
与人FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)特异性结合的本发明抗体包含具有序列GYMFTSYGIS(SEQ ID NO1)的CDRH1、具有序列WVSTYNGDTNYAQKFQG(SEQ ID NO2)的CDRH2、具有序列VLGYYDSIDGYYYGMDV(SEQ ID NO3)的CDRH3、具有序列GGNNIGDKSVH(SEQ ID NO4)的CDRL1、具有序列LDTERPS(SEQ IDNO5)的CDRL2和具有序列QVWDSGSDHVV(SEQ ID NO6)的CDRL3。
优选地，该抗体可以包含可变重链氨基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ IDNO7)和可变轻链氨基酸序列QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO8)。
优选地，该抗体可以包含可变重链氨基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ IDNO7)或可变轻链氨基酸序列QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO8)。
抗体重链恒定区可以来自人IgG1或抗体的FGFR-3结合片段。优选地，该抗体包含SEQ ID NO:9的重链和SEQ ID NO:10的轻链。优选地，该抗体包含SEQ ID NO:9的重链和SEQ ID NO:10的轻链，或抗体的FGFR-3结合片段。
该抗体也可以包含SEQ ID NO:9的两条重链和SEQ ID NO:10的两条轻链。该抗体也可以包含SEQ ID NO:9的两条重链和SEQ ID NO:10的两条轻链。优选地，该抗体包含SEQ ID NO:9的两条重链和SEQ ID NO:10的两条轻链，或抗体的FGFR-3结合片段。
抗体可以包含中和性人FGFR3结合片段。
在一个优选的方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其中所述抗体在竞争ELISA测定法中与竞争性抗体竞争对FGFR-3的胞外结构域的结合，其中所述的竞争性抗体在室温(20-25℃)以约1×10-8M或更小KD结合FGFR-3。
本发明还涉及与FGFR-3的突变体形式结合的抗体。
本发明涉及包含所述抗体或片段和可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
本发明也涉及产品，其含有抗体或片段和用于联合治疗以同时、分别或依次用于疗法中的额外抗癌药。
在本发明的另一个方面，该抗体或片段用作药物。在本发明的另一个方面，该抗体或片段用于癌症的治疗中。在本发明的另一个方面，该抗体或片段作为药物使用，其中癌症是膀胱癌或多发性骨髓瘤。
在本发明的另一个方面，该抗体或片段连同另一种药物用于癌症的治疗中。本发明的抗体或片断可以同时、分别或依次与有效量的另一种药物施用至患者。本发明可以包含药物组合物，其包含化合物连同可药用载体和任选地其他治疗成分。
本发明也涉及治疗患者中癌症的方法，包括施用有效量的本发明抗体至该患者。癌症可以膀胱癌或多发性骨髓瘤。在另一个方面，本发明包括治疗患者中癌症的方法，包括同时、分别或依次施用有效量的本发明抗体和另一种药物至该患者。所述的其他药物可以是顺铂。
因此，与FGFR-3的天然存在形式和突变体形式结合并诱导FGFR-3降解的本发明抗体能够通过作用于肿瘤细胞以及基质组分抑制肿瘤，在治疗癌症方面具广阔的治疗价值。
术语“抗体”包括包含四条多肽链即由二硫键相互连接两条相同重链(H)和两条相同轻链(L)的免疫球蛋白分子。各条链可以折叠成具有相似大小(110-125个氨基酸)及结构但具有不同功能的结构域。
“分离的抗体”是一种抗体，其(1)已经部分地、基本上或完全地从组分的混合物中纯化；(2)已经从其自然环境的组分中鉴定、分离和/或回收；(3)是单克隆的；(4)不含来自相同物种的其他蛋白质；(5)由来自不同物种的细胞表达；或(6)不存在于自然界中。其天然环境的杂质组分是可能干扰该抗体的诊断性或治疗性用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。分离的抗体的实例包括已经被亲和纯化的抗体、已经由杂交瘤或其他细胞系体外产生的抗体或从转基因小鼠衍生的人抗体。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，例如，该群体中包含的各个抗体是基本上相同的，除了可能天然存在的突变或可以存在的少许翻译后变异之外。单克隆抗体是高度特异的，即针对单个抗原位点(也称作决定簇或表位)。另外，与一般包括针对不同决定簇的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”是指该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得的，并且不得解释为通过任何具体方法产生该抗体。
如本文中所用，术语“人抗体”包括抗体，其具有与如上文Kabat等人、Chothia等人和Martin中所述的人种系免疫球蛋白序列相对应的可变区和恒定区。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)，例如在互补决定区(CDR)中。人抗体可以具有不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如增强活性的氨基酸残基)替换的至少一个位置。然而，如本文中所用，术语“人抗体”不意图包括其中从另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系衍生的CDR序列已经移植到人构架序列上的抗体。
短语“重组人抗体”包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的人抗体，如使用转染入宿主细胞的重组表达载体所表达的抗体、从重组的组合人抗体文库分离的抗体、从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物分离的抗体、或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段所制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区。
轻链可以包含一个可变结构域(本文中缩写为VL)和/或一个恒定结构域(本文中缩写为CL)。抗体的轻链是kappa(κ)轻链或lambda(λ)轻链。如本文中所用，对VL的表达意图包括来自κ-型轻链的可变区(Vκ)和来自λ-型轻链的可变区(Vλ)。重链也可以包含一个可变结构域(本文中缩写为VH)和/或取决于抗体的类别或同种型，包含3个或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人中，同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中IgA和IgG进一步再划分成亚类或亚型(IgA1-2和IgG1-4)。
本发明包括任一前述类别或亚类的抗体。人IgG是本发明抗体的优选同种型。三个称作超变区或CDR的区域存在于每个VL和VH中，它们由称作构架区(本文中缩写为FR)的较少可变的区域支撑。
根据Kabat惯例(Kabat等人,Ann.NY Acad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat等人，免疫学目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第5版,美国健康和人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版号91-3242(1991))或Chothia惯例(C.Chothia和A.M.Lesk,J.Mol.Biol.196(4):901–917(1987))或Martin(Martin,A.C.R.计算机PROTEINS走入Kabat抗体序列数据库(Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by ComputerPROTEINS):Structure,Function and Genetics,25(1996),130-133)将氨基酸分配至特定的CDR区或结构域。
每个VH和VL包含从氨基端至羧基端按以下顺序：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列的3个CDR和4个FR。由VL和VH结构域组成的抗体部分命名为Fv(可变片段)并构成抗原结合位点。单链Fv(scFv)是在一条多肽链上含有VL结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个结构域的N末端和其余结构域的C末端由柔性接头连接(见，例如，美国专利号4,946,778(Ladner等人)、WO88/09344(Huston等人))。
片段具有与完整抗体的结合特征相同或可比较的结合特征。抗体的合适片段包括任意下述片段，其包含超变(即互补决定)区的足够部分以特异性地结合并具有足够亲和力以抑制细胞生长。此类片段可以例如含有一个或两个Fab片段或F(ab’)2片段。优选地，抗体片段含有完整抗体的全部6个互补决定区，但是也包括含有少于全部的此类区域如含有3、4或5个CDR的有功能片段。优选的片段是单链抗体或Fv片段。更优选的片段是双价的。单链抗体是至少包含抗体重链可变区和轻链可变区的具有或没有互连接头的多肽。因而，Fv片段包含全部的抗体组合位点。这些链可以在细菌或在真核细胞中产生。
Fab(结合抗原的片段)指由VL、CL、VH、CH1结构域组成的抗体片段。木瓜蛋白酶消化后所产生的那些片段简单地称作Fab并且不保留重链铰链区。在胃蛋白酶消化后，产生了保留重链铰链的多种Fab。带有完整链间二硫键的那些片段称作F(ab’)2，而二硫键不保留时产生单一Fab’。F(ab’)2片段比单价Fab片段对抗原具有更高的亲合力。
Fc(片段结晶)是对包含成对重链恒定结构域的抗体部分或片段的命名。例如，在IgG抗体中，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc还包含CH4结构域。Fc与Fc受体结合作用、补体介导的细胞毒性的激活和抗体依赖的细胞-细胞毒性(ADCC)相关。对于作为多个IgG样蛋白的复合物的抗体如IgA和IgM，复合物形成需要Fc恒定结构域。
铰链区分隔抗体的Fab和Fc部分，从而提供Fab彼此相对和相对于Fc的运动性，以及包括用于共价连接这两条重链的多个二硫键。
因而，本发明的抗体包括但不限于与抗原特异性结合的天然存在抗体、人抗体、重组人抗体、单克隆抗体、消化片段、双价片段如(Fab’)2、单价片段如Fab、单链抗体、单链Fv(scFv)、单结构域抗体、多价单链抗体、双体抗体（diabodies）、三体抗体（triabodies）等。
本发明的抗体是对FGFR-3特异的。抗体特异性指抗体针对抗原特定表位的选择性识别作用。抗体可以展示出物种选择性和分子选择性，或可以仅相对于分子有选择性和与多于一个物种的FGFR-3结合。本发明的抗体可以与人、小鼠、大鼠、犬和/或兔FGFR-3结合。优选地，该抗体与人FGFR-3结合。已经开发了保留结合特异性但还具有其他特征的抗体形式。
例如，本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。双特异性抗体(BsAbs)是具有2个不同抗原结合特异性或位点的抗体。多特异性抗体具有多于2个不同的抗原结合特异性或位点。在抗体具有多于一种特异性的情况下，识别的表位可以与单一抗原或与多于一种抗原缔合。
可以基于亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)确定FGFR-3抗体的特异性。由抗原与抗体的解离平衡常数(KD)代表的亲和力测量了抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合作用强度的度量。亲合力与表位与抗体上其抗原结合位点之间的亲和力及抗体的价态有关，其中所述的价态指特定表位的抗原结合位点的数目。抗体一般以约10-5至约10-11mol/升的解离常数(KD)(例如，KD<100M)结合。小于约10-4mol/升的任意KD通常视为表示非特异性结合—KD值越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度越强。
在某些方面，本发明的抗体以优选约1×10-8M或更小、更优选约1×10-9M或更小、更优选约1×10-10M或更小并且最优选约1×10-11M或更小的KD与FGFR-3结合。见下表1。
表1：抗体1对人和鼠FGFR-3剪接变体的结合亲和力
KD(M)
人FGFR-3(IIIb) 7.2×10-10
人FGFR-3(IIIc) 1.4×10-10
鼠FGFR-3(IIIb) N.D.
鼠FGFR-3(IIIc) 2.2×10-10
在某些方面，本发明的抗体优选地具有约5.0×10-10M至约1.5×10-11M、约1.0×10-10M至约1.0×10-11M或约1.5×10-11M至约7.5×10-10M的KD。
如本文中所用,可互换使用的术语“阻断结合”和“抑制结合”指阻断/抑制细胞因子与其受体的结合，从而导致完全或部分抑制或降低细胞因子/受体信号途径的生物学功能。通过测量
Figure BDA0000374062850000081
活性的一种或多种体外或体内指示物(如受体结合作用、对细胞生长的抑制效应、趋化性、凋亡、胞内蛋白磷酸化或信号转导)的完全或部分抑制或减少来评估对FGF与FGFR-3结合的阻断/抑制。阻断FGF与FGFR-3结合的能力可以通过如本文中所述的ELISA测量。本发明的抗体是在活细胞内配体-诱导的激活作用中阻断FGFR-3受体的拮抗物。结合测定法可以使用多种本领域已知的方法实施，所述方法包括但不限于ELISA。如本文中所用。“竞争结合作用”指以下情况，其中抗体降低如本领域可用技术(例如竞争型ELISA或采用BIAcore的KD测量)所测量的结合作用或信号传导至少约20%、30%、50%、70%或90%，但是不意指完全消除结合。
重链氨基酸序列在SEQ ID NO.9中描述。轻链氨基酸序列在SEQ IDNO.10中描述。在另一方面，本发明的抗体具有抗体1的任一个CDR的1、2、3、4、5个或全部6个互补决定区。
本发明的抗体也包括已经通过直接突变、亲和力成熟方法、噬菌体展示或链改组改善了其结合特征的那些抗体。亲和力和特异性可以通过使CDR和/或构架残基突变并筛选具有想要特征的抗原结合位点进行修饰或改善(见，例如，Yang等人,J.Mol.Biol.254:392-403(1995))。一种方式是随机化各个残基或残基的组合，从而在否则具有相同抗原结合位点的群体中，在特定的位置存在来自2种至20种氨基酸的亚类。备选地，可以利用PCR方法通过错误在一定范围的残基内诱导突变(见，例如，Hawkins等人,J.Mol.Biol.,(1992)226:88996)。在另一个实例中，含有重链可变区基因及轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(E.coli)突变菌株中增殖(见，例如，Low等人,J.Mol.Biol.250:35968(1996))。
体外选择方法可以随后适当地用来对这些额外的可变区氨基酸序列筛选具有所要求保护的交叉反应性的Fab片段并在体外实施。以这种方式，鉴定了适于制备本发明的人源化抗体的其他Fab片段。优选地，构架内部的氨基酸替换限于本文中所公开的一个或每个构架序列内部的1、2个或3个位置。优选地，CDR内部的氨基酸替换限于一个或每个CDR内部的1至3个位置，更优选地在一个或每个CDR内部的1个或2个氨基酸位置处进行替换。进一步优选的，在重链可变区的CDR中1个或2个氨基酸位置处进行氨基酸替换。在Wu等人，J.Mol.Biol.,294:151-162中提供了使用本文中描述的抗体作为亲代抗体，组合CDR及构架替换以制备本发明备选抗体的合适方法。
本发明的抗体可以由本领域已知的方法产生。这些方法包括通过Kohleer和Milstein在Nature256:495-497(1975)和Campbell在“单克隆抗体技术，啮齿类和人杂交瘤的产生和表征(Monoclonal AntibodyTechnology,The Production and Characterization of Rodent and HumanHybridomas)”于Burdon等人编著,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第13卷,Elsevier Science Publishers,Amsterdam(1985)中所描述的免疫学方法以及通过Huse等人在Science246:1275-1281(1989)中所述的重组DNA方法产生。
也可以使用包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581(1991))在内的本领域已知的多种技术产生人抗体。Cole等人和Boemer等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，单克隆抗体和癌症疗法(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss,第77页(1985)和Boemer等人，J.Immunol.147(1):86-95(1991))。由亚克隆分泌的本发明抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化方法例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基或腹水分离或纯化。
通过标准分子生物学技术获得编码本发明抗体的多核酸。
本发明也包括用于载体转化和表达抗体的宿主细胞。优选的宿主细胞包括哺乳动物细胞，如NSO(非分泌性(o))小鼠骨髓瘤细胞、293及CHO细胞和其他淋巴源细胞系如淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。可以使用其他真核宿主，如酵母。
用于在细菌、尤其大肠杆菌中表达蛋白质的载体是已知的。此类载体包括由Dieckmann和Tzagoloff在J.Biol.Chem.260:1513-1520(1985)中描述的PATH载体。这些载体含有编码在羧基末端后接多接头的邻氨基苯甲酸合成酶(TrpE)的DNA序列。其他表达载体系统基于β-半乳糖苷酶(pEX)；λPL；麦芽糖结合蛋白(pMAL)；和谷胱甘肽S-转移酶(pGST)。见Gene67:31(1988)和Peptide Research3:167(1990)。
用于酵母中的载体是可获得的。合适实例是λZAP质粒。用于哺乳动物细胞中表达的合适载体也是已知的。此类载体包括SV-40、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列和穿梭载体的熟知衍生物，其中所述的穿梭载体从有功能的哺乳动物载体如那些上述哺乳动物载体和有功能的质粒及噬菌体DNA的组合衍生。
在本发明中有用的载体含有与待表达的DNA序列或片段连接的至少一个控制元件。将该控制元件插入载体以控制并调节克隆的DNA序列的表达。
在合适培养基中维持的宿主细胞中表达后，待表达的多肽可以从培养基回收并且通过本领域已知的方法纯化。如果所述多肽或肽没有分泌到培养基中，则在分离和纯化之前裂解宿主细胞。
本发明还提供药物组合物，其包含本发明的抗体、多核酸、载体或宿主细胞连同可药用载体、赋形剂或稀释剂。该药物组合物可以包含额外的治疗药。额外的药物可以是化疗药，例如顺铂。
本文中所用的载体包括在所用的剂量和浓度上对暴露于它们的细胞或哺乳动物无毒的可药用载体、赋形剂或稳定剂。生理可接受的载体经常是pH缓冲的水溶液。在本发明的另一个方面，抗FGFR-3抗体或抗体片段可以化学地或生物合成地与抗肿瘤药连接或与产生可检测信号的物质连接，特别当抗体内化时。针对FGFR-3的抗体可以抑制几种癌细胞如膀胱癌细胞中受体(磷酸化的FGFR-3)的激活以及包括磷酸MAPK和磷酸AKT在内的下游信号传导分子的激活，这导致抑制癌细胞的增殖能力。
本发明的抗体可以与天然存在的FGFR-3或其剪接形式或其突变体结合。FGFR-3的“剪接形式”意指编码FGFR-3第三IgG样结构域的外显子形式，称作FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)。突变FGFR-3包括因DNA复制或翻译错误而改变的那些形式的受体。突变可以是功能获得的突变，其通过机制如组成型活化、延长的半寿期和提高的配体灵敏度而增高突变受体的活性。
本发明的抗体可以与野生型FGFR-3结构域2(SEQ ID NO12)结合。人与小鼠FGFR-3序列在第173位置处的精氨酸残基不与其他家族成员共享，这表明该残基有可能负责抗体1所展示的FGFR-3特异性。
本发明的抗体诱导FGFR-3的降解。降解意指解体该受体，从而它可以不再履行其信号传导功能。
本发明的抗体可以中和FGFR-3的激活。中和某受体意指使该受体转导某信号的内在激酶活性失活。中和可以例如通过以下方式发生，即抗体阻断某些表位接近配体或以某种方式改变FGFR-3的构象，从而配体、尤其FGF不能激活该受体，即便配体可以与该受体结合也不能激活该受体。当表达FGFR-3的细胞(例如通过诱导内化或该受体降解或抑制FGFR-3表达)减少FGFR-3受体在它们表面上的数目时，下调可以发生。因此，中和具有多种作用，包括抑制、减低、失活和/或破坏生长(增殖和分化)、血管生成(血管募集、侵入和转移)和细胞运动与转移(细胞黏附和侵入)。
FGFR-3中和作用的一种方法是抑制该受体的酪氨酸激酶活性。可以使用熟知的方法确定酪氨酸激酶抑制作用；例如通过测量重组激酶受体的自身磷酸化水平和/或天然或合成底物的磷酸化。因此，磷酸化测定法用于本发明上下文中确定中和抗体。可以例如使用对磷酸酪氨酸特异的抗体在ELISA测定法中或在蛋白质印迹中检测磷酸化。用于酪氨酸激酶活性的一些测定法在Panek等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.283:1433-44(1997)和Batley等人,Life Sci.62:143-50(1998)中描述。
此外，由于许多肿瘤细胞在它们的细胞表面上具有FGFR-3，故本发明的抗体可以抑制肿瘤细胞本身的信号传导。本发明的抗体可以用来治疗有需求的哺乳动物。“治疗”疾病包括抑制该疾病、停滞或延缓其发展；减轻该疾病或引起该疾病的症状退行。
本发明的抗体和组合物可以用来治疗癌症。癌症可以是难治或一线的。癌症包括但不限于脑癌、肺癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、肾脏癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、结直肠癌、食管癌、妇科癌(卵巢癌、子宫内膜癌)、前列腺癌、胃癌或甲状腺癌、白血病和淋巴瘤。另外,可以被本发明抗体和组合物治疗的癌症包括多发性骨髓瘤、结直肠癌、Ewing肉瘤、绒毛膜癌。
通过任何合适的施用途径(包括注射、输注、口服、肠胃外、皮下、肌内或静脉内途径)实现施用。
本文中所述的治疗方法可以用与另一个疗法(如抗肿瘤药)施用的抗体实施。抗肿瘤治疗药可以包括有机小分子。此类有机小分子的实例包括细胞毒性药和/或化学治疗药，如紫杉酚、多柔比星、放线菌素-D、顺铂、甲氨蝶呤、依立替康(CPT-11)、吉西他滨、奥沙利铂、氟尿嘧啶(5-FU)、leucourin(LU)、顺铂、紫杉醇、紫杉萜、长春碱、埃坡霉素（epothilone）、顺铂/卡铂和PEG化阿霉素。本发明的一个优选疗法是施用抗体连同顺铂。
抗肿瘤药也可以是放射线，放射源可以对正在接受治疗的患者是外在的(外照射放疗法–EBRT)或内在的(近距离疗法(brachytherapy-BT)。所施用抗肿瘤药的剂量取决于众多因素，包括例如该药物的类型、正在治疗的肿瘤的类型与严重性和该药物的施用途径。本发明不限于任何特定的剂量。
FGFR-3抗体连同其他抗体和/或疗法的施用可以同时或分别地经相同或不同途径在相同或不同的时间上进行。此外，抗体可以与一种或多种其他物质缀合用于施用。
本文中所述的治疗方法可以用来治疗任意任何合适的哺乳动物，包括灵长类如猴和人、马、奶牛、猫、犬、兔和啮齿类动物如大鼠和小鼠。优选地，待治疗的哺乳动物是人。
实施例
以下的实施例仅出于说明目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。所述实施例不包括对常规方法(如那些在构建载体和质粒、插入编码多肽的基因至此类载体和质粒或将质粒导入宿主细胞中所用的常规方法)的详细描述。此类方法是本领域普通技术人员熟知的并且在包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press的众多出版物中描述。
实施例1
FGFR-3特异性抗体拮抗物的产生
重组人FGFR-Fc、重组人FGF、定制合成的引物、限制酶和DNA聚合酶可以从供应商获得或通过已知的方法制备。
根据公布的淘选方案，用10μg FGFR-3(IIIc)胞外结构域(ECD)-Fc重组蛋白包被的管淘选针对人FGFR-3胞外结构域的天然人Fab噬菌体文库。洗脱来自该淘选过程的滞留噬菌体并用滞留噬菌体感染细菌性宿主细胞。收集由该宿主细胞产生的噬菌体。再一次重复上述过程。转移感染的宿主细胞的单菌落至含有100μl/孔2xYTAG的96孔平板中并且在10μlM13KO7辅助噬菌体(5x1010pfu/ml)存在下培育噬菌体。平板在37℃无振摇下孵育30分钟，随后在振摇下(100转/分钟)孵育30分钟。通过在2500转/分钟离心10分钟制备细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于200μl的2xYTAK中并且在30℃振摇(100转/分钟)下孵育过夜。平板在2,500转/分钟离心10分钟。转移上清液至新鲜平板中并且与6x封闭缓冲液(18%乳/PBS)混合1小时。使用如下文所述的ELISA结合及阻断测定法筛选噬菌体克隆。选择与FGFR-3(IIIb)或FGFR-3(IIIc)结合的噬菌体克隆，随后从该汇集物中选出阻断该受体与FGF-1配体结合的那些噬菌体克隆。根据标准序列技术确定结合并阻断受体的克隆的DNA序列。保留每个独特的DNA序列并将相应的噬菌体克隆命名为FGFR-3阻断噬菌体候选者。从这些噬菌体候选者中制备可溶性Fab。使用纯化的Fab重复ELISA结合及阻断测定法以证实阻断活性。根据公布的技术，通过克隆CDR(SEQ ID NO.1-6)入人IgG1构架中而将证实的Fab阻断物工程化到完整大小的抗体中。使用ELISA结合测定法来确定抗体1与FGFR-1(IIIb)、FGFR-1(IIIc)、FGFR-2(IIIb)、FGFR-2(IIIc)和FGFR-4胞外结构域重组可溶性蛋白的结合。选择对FGFR-3的b和c剪接形式显示高亲和结合作用，但是对其他FGFR受体显示低亲和结合作用的抗体。
实施例2
抗体1
抗体1可以使用熟知方法在合适的哺乳动物表达系统中生物合成并且它可以通过熟知的方法纯化。
下文给出抗体1的氨基酸序列。
Figure BDA0000374062850000151
测定法
ELISA结合测定法
重组FGFR以PBS中的1μg/ml浓度在96孔平板上在室温包被2小时。平板用0.2%吐温20/PBS洗涤3次并在使用前用5%乳/PBS封闭2小时。添加噬菌体、Fab或抗体至该平板并连续地稀释于0.2%吐温20/PBS中。该平板在室温孵育另外2小时。使用适宜的市售第二抗体检测捕获的分子并且根据供应商的说明书检测。
ELISA阻断测定法
在
Figure BDA0000374062850000161
2B微量滴定平板(ThermoLab Systems,Franklin,MA)上以浓度0.5-2μg/ml室温包被重组FGF2小时。平板用0.2%吐温20/PBS洗涤并在使用前用5%乳/PBS封闭2小时。用5μg/ml肝素，5%乳，PBS连续稀释噬菌体、Fab或抗体。添加FGFR-3(IIIb)或(IIIc)ECD(胞外结构域)Fc标记的可溶性重组蛋白质至终浓度1μg/ml。混合物在室温孵育1小时，随后转移至FGF-1包被的平板并在室温孵育额外的2小时。平板用0.2%吐温20/PBS洗涤3次。使用根据供应商说明书制备的与辣根过氧化物酶偶联(HRP)的抗人Fc单克隆抗体溶液检测结合的受体。阻断活性导致降低的信号。
抗体1对人及小鼠FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)的结合亲和力。
使用
Figure BDA0000374062850000162
3000生物传感器(BiaCore,Inc.,Piscataway,NJ)在室温按照制造商建议的标准方案确定该抗体对FGFR-3(IIIb)和(IIIc)的结合动力学。表1中所述结果的概述表明该抗体与人FGFR-3的b和c-剪接形式均结合以及与小鼠FGFR-3(IIIc)受体以小于10-9M的亲和力充分地交叉反应。
抗体1对膜结合的FGFR-3的特异性
将鼠FGFR-3(IIIc)的cDNA克隆到含有嘌呤霉素选择基因的pBABE表达载体中。在L6细胞中进行所得质粒的逆转录病毒表达。将细胞选择出并且在含有10%FBS和2μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基中培养。将表达FGFR-3的L6细胞悬浮于1%BSA/PBS中。添加抗体1至终浓度1-30μg/ml。在冰上孵育1小时后,将细胞在1%BSA/PBS中洗涤并与相同缓冲液中适宜的第二检测抗体或Fab片段在冰上孵育1小时。仅用这种第二抗体染色对照样品。用FACSvantage SE流式细胞仪(BD Biosciences)分析全部样品。抗体1是对FGFR-3特异的，如仅使用FGFR-3转染的细胞(R3-L6)时产生阳性染色信号，但使用FGFR-3阴性L6亲代细胞时不产生阳性染色信号所示。
可以从Invitrogen(Carlsbad,CA)购买人胚肾(HEK)293细胞、293fectin、FreeStyle293培养基和OptiMEM培养基。可以从GE Healthcare购买蛋白-A亲和纯化介质。产生FGFR(IIIb)-Fc的DNA构建体。
FGFR-3(IIIb)-Fc、FGFR-3(IIIb)-Fc Ig结构域截短物和FGFR-3(IIIb)-Fc单一残基丙氨酸突变体的产生
FGFR-3(III)b结构域边界可以基于已知的FGFR-3(IIIb)胞外结构域3D模型以及FGFR的晶体结构定义。设计了5个截短的FGFR-3(IIIb)ECD构建体，即D1(25-148)、D2(149-245)、D3(250-372)、D1-2(25-245)和D2-3(149-372)，以及野生型FGFR-3(IIIb)D1-3(25-372)。将所述构建体亚克隆到带Fc标签的pGS载体中并证实其序列，其中将所述的Fc标签工程化在多克隆位点的3’端处。如已知的那样基于FGFR-3(IIIb)ECD模型和FGFR-3(IIIc)结构，选择靠近推定的配体结合区的20个FGFR-3(IIIb)残基以及参与肝素结合和受体-受体二聚化的那些FGFR-3(IIIb)残基。使用全长FGFR(IIIb)ECD构建体作为模板，通过重叠PCR产生FGFR-3(IIIb)ECD单一残基丙氨酸突变体并且随后将其亚克隆到pGS-Fc载体中。使用293fectinTM(Invitrogen)转染后，在293细胞中瞬时表达所述结构域截短物和丙氨酸突变体。转染后6日收获培养上清液，并且含有Fc的蛋白质通过蛋白-A亲和柱被纯化，缓冲液交换入PBS，由SDS-PAGE分析定量并评价以证实结构完整性。
FGFR-3(IIIb)-Fc Mesoscale结合测定法：将纯化的抗体-1溶液在PBS中稀释至浓度2mg/ml。MSD磺基-TAG NHS-酯(MesoScale Discovery,#R91AN2)(一种钌-三-双吡啶N-羟基琥珀酰亚胺酯)用冷蒸馏水重构至浓度10nmol/μl。对于该反应，使用MSD磺基-TAG NHS-酯对抗体1的12:1摩尔比。孵育在室温、避光进行2小时。使用脱盐树脂，从缀合的抗体1除去未反应的MSD磺基-TAG NHS-酯。钌缀合的抗体1贮存在-80℃。使用牛血清白蛋白针对标准曲线确定缀合抗体1的浓度。
在磷酸盐缓冲的盐水PBS中稀释截短的、突变的、或野生型FGFR-3(IIIb)-Fc至5μg/mL。标准96孔平板以25ng/孔的受体包被并且在室温孵育1小时。为封闭孔中的非特异性结合，添加150μL的5%MSD封闭剂A(MesoScale Discovery,#R93Ba-1)至各孔。平板在室温孵育1小时。移去封闭液并且用200μL PBS,pH7.4,0.02%吐温
Figure BDA0000374062850000182
洗涤平板5次。对正在被测试的每种蛋白质一式三份添加25μL体积的钌标记抗体1的3倍连续稀释物(250-0.001nM)。在室温伴以轻微振荡和避光孵育1小时后，通过用每孔200μL PBS,pH7.4,0.02%吐温-20进行另一轮5次洗涤来除去游离的钌标记抗体。在这次洗涤后，添加150μL的1×读数缓冲液(MesoScale Discovery,#R92TC-2)至每个孔。在电化学刺激后，结合抗体上的钌标记物在620nm处发射冷光。电化学发光ECL信号由SECTOR成像仪2400平板读数仪(MesoScale Discovery,#1250)中的电荷偶联的设备照相机检测并且表示为ECLU。将ECL信号在5.0版GraphPad Prism软件中绘图。通过该软件的单一位点–特异性结合函数的非线性回归曲线拟合分析来计算KD值。使用钌标记抗体1对野生型FGFR-3(IIIb)-Fc的结合作为截短的或突变的FGFR的相对结合亲和力分析的标准，绘制为野生型的百分数。
Mab B9ELISA结合测定法：96孔ELISA微量滴定平板的诸孔用100μL PBS，pH7.2中的200ng抗FGFR-3单克隆抗体B9(Santa Cruz sc-13121)在4℃伴以轻微振荡下包被过夜。包被后，倾析抗体溶液并且诸孔用100μL含有0.1%吐温(PBST)、5%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水在室温封闭2小时，伴以轻微振荡。封闭后，诸孔用200μL PBST洗涤5次。随后对正在测试的每种蛋白质一式三份添加100μL PBST,1%BSA中的突变或野生型FGFR-3(IIIb)-Fc的3倍连续稀释物(100–0.006nM)，轻微振荡下在室温温育1小时。诸孔用200μL PBST再洗涤5次。辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗小鼠IgG在100μL PBST，5%BSA中的1:5000稀释物在室温伴以轻微振荡下于每孔中孵育1小时。诸孔用200μL PBST最终洗涤5次，随后用100μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺过氧化物酶(TMB)生色底物显色5分钟。反应用每孔100μL的1N H2SO4终止。在450nm处分光光度地测量吸光度。将吸光度读数在5.0版GraphPad
Figure BDA0000374062850000181
软件中绘图。通过该软件的单一位点–特异性结合函数的非线性回归曲线拟合分析来计算KD值。使用B9对野生型FGFR-3(IIIb)-Fc的结合作为截短或突变FGFR的相对结合亲和力分析的标准，绘制为野生型的百分数。
人FGFR-3(IIIb)的分子建模：为辅助指导诱变研究，使用
Figure BDA0000374062850000191
产生FGFR-3(IIIb)ECD的结构域2和3的三维模型。使用
Figure BDA0000374062850000192
方法比对人FGFR-3(IIIb)和人FGFR-3(IIIc)的序列，并且使用FGFR-3(IIIc)的X射线晶体结构(蛋白质数据库代码1RY7)作为模板，构建该模型。
抗体1的表位包含于FGFR-3的第二免疫球蛋白样(Ig)结构域内部：FGFR受体家族的配体结合位点包含于定义胞外结构域的3个氨基端Ig结构域内部(Chellaiah等人,J.Biol.Chem.1999年12月3日；274(49):34785-34794)。为确定这3个Ig结构域中哪一个结构域含有抗体1的表位，使用一组结构域截短物。编码人Ig结构域的DNA序列以多种形式被截短并且表达为带人Fc标签的同二聚体融合蛋白。从瞬时转染的细胞的条件上清液纯化出编码的蛋白质并且通过SDS-PAGE证实每种纯化的结构域截短物的同二聚体结构。随后在Mesoscale结合测定法(Meso ScaleDiscovery,Gaithersburg,MD)中检测所述截短物与抗体1的结合。尽管抗体1不显示与截短物D1和D3的可检测结合作用，然而它显示与截短物D1-2和D2的显著结合，如Mesoscale结合测定法(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)中和由BIAcoreTM(Pharmacia,Piscataway,NJ)所确定。B9识别该受体结构域1中的构象敏感表位，因此如果总体结构未被破坏，则含有结构域1的那些截短物预期会结合该抗体。D1和D1-2截短物显示与对照Mab B9显著结合，从而证实如Mesoscale结合测定法(Meso ScaleDiscovery,Gaithersburg,MD)中和由BIAcoreTM(Pharmacia,Piscataway,NJ)所确定的这两种蛋白质的结构完整性。截短物结合数据揭示FGFR-3的第二Ig结构域足以结合抗体1并且因而含有对该表位重要的残基。
鉴定FGFR-3在抗体1所识别的表位内部的氨基酸：基于FGFR-3(IIIc)的晶体结构产生FGFR-3(IIIb)ECD的结构域2和3的三维模型。基于分子模型鉴定了FGFR-3的第二结构域内部接近于或直接参与配体结合、受体二聚化或肝素结合的20个氨基酸(D160、K161、K162、L163、L164、V166、P167、P220、R223、D244、N170、T171、R158、R173、R175、K205、R207、L246、E247、S249)并且产生单一残基丙氨酸突变。
测定了FGFR-3结构域2的野生型序列(SEQ ID NO12)。每个所示的氨基酸由位点-定向诱变法逐个突变成丙氨酸并且在编码完整ECD的FGFR(IIIb)-Fc蛋白的背景下表达。从瞬时转染的细胞的条件上清液纯化出编码的突变蛋白并且通过SDS-PAGE证实每种纯化突变体的同二聚体结构。
如果上述的丙氨酸突变导致对抗体1的结合作用明显丧失，则认为某残基对该表位为关键。随后对显示结合作用明显丧失的全部突变蛋白测试与Mab B9的结合以检查蛋白质整体结构的总体变化。在所测试的20个位置中，丙氨酸对第173位置处精氨酸的替换(R173A)导致与抗体1的结合作用几乎完全丧失(与WT相比结合作用下降>90%)；而其他替换保留结合作用(与WT相比结合作用下降<20%)。后续测试显示与Mab B9的结合不受R173A替换影响，这表明第173位置构成抗体1特异性识别该受体的一个关键残基。通过
Figure BDA0000374062850000201
分析测定抗体1对R173突变体的亲和力。抗体1对R173突变体的结合作用比抗体对野生型蛋白的亲和力差7倍。
序列比较揭示人与小鼠FGFR-3序列在第173位置处的精氨酸残基不被其他家族成员共享，这表明该残基有可能负责抗体1所展示的FGFR-3特异性。
FGFR-3抗体拮抗物阻断FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)介导的FGF结合和细胞信号传导
来自前述ELISA阻断测定法的结果显示抗体1以1-10nM范围内的IC50阻断FGF-1/FGFR-3结合作用。使用上述的表达FGFR-3的L6细胞来测试活细胞中该抗体对FGFR-3信号传导的活性。使表达FGFR-3的L6细胞在含有极低浓度血清(0.1%)的培养基中休眠过夜。次日将细胞分成大小相同的5份样品。用同种型匹配的非特异性对照抗体(200nM)和抗体1(200nM)将样品1和2分别处理1小时。使样品3暴露于0.6nM的FGF-9持续15分钟。首先用同种型匹配的非特异性对照抗体(200nM)和抗体1(200nM)将样品4和5分别处理1小时，随后暴露于0.6nM的FGF-9持续15分钟。在这些处理和暴露后，将细胞裂解并将它们进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。用抗磷酸酪氨酸抗体探查FGFR-3的激活。单独的抗体1既不增加也不降低激活的FGFR-3和MAPK的信号，并且FGF-9配体暴露增加了激活的FGFR-3和MAPK的信号至相同程度。这些结果因而显示抗体1是活细胞内配体诱导的激活作用中阻断FGFR-3受体的拮抗物。
细胞表面FGFR-3与抗体1结合后被内化。
抗体1触发FGFR-3的内化，这构成下调该受体信号传导的机制。为测试此情况，用市售的Alexa
Figure BDA0000374062850000211
染料(Invitrogen)标记该抗体，旨在追踪抗体1/FGFR-3复合物的定位。将抗体1和同种型匹配的非特异性对照抗体与该荧光染料缀合。使表达FGFR-3的L6细胞在含有极低浓度血清(0.1%)的培养基中休眠过夜。
将细胞分成大小相同的8份样品并接种到6孔组织培养平板的孔中。这些样品经历3种不同的流程：1)结合，其中细胞在4℃与1mL200nM缀合的抗体孵育1小时。该温度对于内吞作用是抑制性低的，但是有助于抗体-抗原相互作用；2)内化，其中细胞在37℃与1mL200nM缀合的抗体孵育1小时。该温度会引起内吞作用；3)剥离，其中细胞在4℃用1mL的0.2M甘氨酸-0.15M NaCl,pH3处理30分钟。在这种条件下，未内化的抗体可能不再与表面受体结合并且被释放到介质中。8份FGFR-3转染的L6细胞样品根据以下描述处理：样品1在4℃与缀合的对照抗体(200nM，1mL)孵育1小时；样品2在4℃与缀合的对照抗体(200nM，1mL)孵育1小时，随后剥离；样品3在37℃用缀合的对照抗体(200nM，1mL)处理1小时；样品4在37℃用缀合的对照抗体(200nM，1mL)处理1小时，接着剥离；样品5在4℃用缀合的抗体1(200nM，1mL)处理1小时。样品6在4℃用缀合的抗体1(200nM，1mL)处理1小时，随后剥离；样品7在37℃用缀合的抗体1(200nM，1mL)处理1小时。样品8在37℃用缀合的抗体1(200nM，1mL)处理1小时，随后剥离。在这些处理后，全部细胞用1mL冰冷的PBS洗涤3次并接受Odyssey红外成像系统处理以检测相对荧光强度。样品1-8的读数如下：1.5、0.6、1.1、1、3.3、1.5、5和5.8。处理样品1和样品5的条件引起抗体-细胞表面结合作用，但不引起内化。处理样品2和样品6的条件既不引起细胞表面结合作用，也不引起内化。处理样品3和样品7的条件引起细胞表面结合作用和内化。处理样品4和样品8的条件引起内化，但不引起细胞表面结合作用。将样品1-4以及样品6产生的信号视为背景，原因是非特异性。
对孵育后的一些样品执行“酸洗涤”步骤以剥离表面结合的抗体，而不影响已经运输到细胞内部的那些抗体。这能够量化内化的抗体。类似标记的对照抗体(非特异性hIgG)未保留，无论孵育温度或洗涤步骤是什么。虽然洗涤之前抗体1在两个温度上留存，但是仅在37℃孵育的那些抗体随后留下；表明抗体被细胞内化。
抗体1诱导细胞中的FGFR-3受体降解
OPM-2是最初从多发性骨髓瘤的癌细胞分离的细胞系。已知OPM-2细胞表达携带获得功能的K650E点突变的FGFR-3受体。使OPM-2细胞在低血清培养基(0.1%FBS)中休眠过夜。次日，将这些细胞分成5个组。将第1组立即裂解并且将裂解物维持在-20℃直至进行蛋白质印迹分析。该组因此命名为第0小时时间样品。第2-5组各自具有大小相同的3份样品，命名为第2、3、4和5组的样品A、B和C。第2-5组的样品A不作任何进一步处理，但是在37℃孵育。第2-5组的样品B用30ng/ml FGF-1在37℃处理。第2-5组的样品C用30μg/ml抗体1在37℃处理。第2组的全部样品在处理1小时后裂解，并且将裂解物维持在-20℃直至进行蛋白质印迹分析。该组因此命名为第1小时时间样品。第3组的全部样品在处理4小时后裂解，并且将裂解物维持在-20℃直至进行蛋白质印迹分析。该组因此命名为第4小时时间样品。第4组的全部样品在处理8小时后裂解，并且将裂解物维持在-20℃直至进行蛋白质印迹分析。该组因此命名为第8小时时间样品。第5组的全部样品在处理24小时后裂解，并且将裂解物维持在-20℃直至进行蛋白质印迹分析。该组因此命名为第24小时时间样品。当全部裂解物准备好时，将它们进行SDS-PAGE随后进行蛋白质印迹实验。第1组的FGFR-3信号和第2组的全部样品的FGFR-3信号是相似的。在第3组中，样品A和C的FGFR-3信号与组1的FGFR-3信号相似；然而样品B的信号显著地更低。在第4组中，样品A的FGFR-3信号与组1的FGFR-3信号相似；然而样品B和C的信号显著地更低。在第5组中，样品A的FGFR-3信号低于组1的FGFR-3信号；然而样品B和C的信号几乎不存在。因此，与已知诱导FGFR降解的FGF-1相似，抗体1能够以时间依赖性方式诱导FGFR-3降解；这是一种我们相信迄今未证明的特征。
抗体1诱导来自细胞表面的突变FGFR-3受体耗尽
膀胱癌中鉴定到的大部分激活FGFR-3的突变位于该受体的胞外结构域中。这些突变(例如R248C或S249C)产生新的、不成对的半胱氨酸残基，从而导致二硫键连接的FGFR-3二聚体以配体非依赖方式形成。最常见的突变是S249C,Y375C和R248C，其总共占膀胱癌中全部FGFR-3突变的91%。此外，FGFR-3(IIIc)上的S249C还导致FGFR3(IIIc)的组成型活化。抗体1可以内化和耗尽野生型(WT)FGFR-3及最具优势的肿瘤相关性FGFR-3突变体。
为产生稳定表达3种最常见FGFR3突变变体中每一种变体和WTFGFR-3的NIH-3T3和Ba/F3细胞系，将编码全长人FGFR-3(IIIb)或(IIIc)的cDNA克隆到pMSCVpuro逆转录病毒载体(Clontech Laboratories,Mountain View,CA)以产生pMSCVpuro-FGFR-3(IIIb)或(IIIc)。通过QickChange(Stratagene,La Jolla,CA)将特定突变即S249C、Y375C和R248C导入该cDNA。为产生表达WT或突变FGFR-3的NIH3T3和Ba/F3稳定细胞，用Lipofectamine(Invitrogen)将多个pMSCVneo构建体转染到包装细胞Phoenix-Eco(ATCC,Manassas,VA)中。收集逆转录病毒并用来感染NIH-3T3和Ba/F3细胞。用2μg/μl嘌呤霉素选择2周后，表达WT或突变FGFR-3的细胞用Alexa Fluor488-缀合的抗人FGFR-3染色并使用荧光激活细胞分选法(FACS)进行分析。
对于抗体1-诱导的来自细胞表面的突变的和野生型FGFR-3内化/耗尽，6孔组织培养平板(Costar,#3598)的孔用2mL培养基(DMEM(Invitrogen)；10%(v/v)FCS(Invitrogen)；2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)；100U/500mL青霉素G和100μg/500mL链霉素(Invitrogen))中的1.5×105个NIH-3T3-FGFR-3突变体接种。平板在37℃于95%相对湿度和5%(v/v)CO2下孵育24小时。抗体1随后以终浓度5μg/mL添加至诸孔。在处理2小时后，将培养基从孔中除去并替换为1mL无酶的细胞解离溶液(Chemicon,#S-014-B)。细胞在室温孵育5分钟后被收集到离心管中并在培养基中洗涤一次，随后在结合缓冲液(含1%(w/v)BSA和0.01%(w/v)叠氮钠的DPBS)中再洗涤一次。在着染细胞之前，通过使用Alexa Fluor488单克隆抗体标记试剂盒(Molecular Probes,Eugene,OR)，根据供应商的说明书标记了识别不同于抗体1的表位的FGFR-3抗体。添加100μL含有2μg/mL Alexa Fluor488标记抗体的结合缓冲液至细胞，所述细胞随后在冰上孵育60分钟。细胞随后用结合缓冲液洗涤一次并重悬于含有2μg/mL碘化丙啶(以染色死细胞)的DPBS中。通过FACS分析法分析仍在细胞表面上的FGFR-3分子的量，并且对每份样品获得10,000个事件。
细胞表面上的平均荧光强度反映仍在用抗体1处理后的细胞表面上的FGFR-3分子的量。通过使用抗体1所处理细胞的平均荧光强度除以人IgG1所处理细胞的平均荧光强度而计算FGFR-3在细胞表面上耗尽的百分数。抗体1显著减少来自细胞表面的WT和突变FGFR-3。
对于Ba/F3-FGFR3细胞增殖测定法，将80,000个细胞/孔接种在补充有10%FBS的RPMI1640培养基中。抗体1以浓度0.005至10ug/ml连同肝素一起添加(StemCell Technologies,Vancouver,Canada)。在孵育72小时后，细胞以20μl(2μCi)/200μl甲基-3H胸苷在37℃,5%CO2下脉冲标记6小时。收获细胞并对3H胸苷掺入计数。抗体1显著地抑制Ba/F3-FGFR-3-R248C增殖。
FGFR-3抗体拮抗物体外抑制表达FGFR-3的肿瘤细胞中的FGF-信号传导。
使用其中抗体1是第一抗体的流式细胞术鉴定表达野生型或突变FGFR-3(IIIb和/或IIIc)的肿瘤细胞系。3个膀胱肿瘤细胞系RT112、RT4和BFTC905显示明显的FGFR-3表达。已知表达了携带获得功能的K650E点突变的FGFR-3受体的OPM-2细胞在本研究中也显示高水平的表达。发现2个额外细胞系GEO和FADU表达中等但仍明显水平的该受体。使用蛋白质印迹表征这些肿瘤细胞中的FGFR-3信号传导途径。
OPM-2是从人多发性骨髓瘤肿瘤衍生的细胞系。使细胞在低血清培养基(0.1%FBS)中休眠过夜。次日，将这些细胞分成大小相同的4份样品。将样品1放在一边并在37℃保持1小时作为对照样品。样品2与200nM抗体1在37℃孵育1小时。将样品3置于37℃持续1小时,随后使相同样品在37℃暴露于0.2nM FGF-9配体持续15分钟。将样品4与200nM抗体1在37℃孵育1小时,随后使相同样品在37℃暴露于0.2nM的FGF-9持续15分钟。随后，将全部4份样品裂解并对它们进行SDS-PAGE，随后进行蛋白质印迹。用抗磷酸酪氨酸抗体探查FGFR-3的激活。用抗磷酸MAPK抗体探查下游效应分子MAPK的激活。用抗磷酸Akt抗体探查下游效应分子Akt的激活。来自样品2和4的磷酸FGFR-3的信号可比于来自样品1的相应信号，其中所述的样品1代表该受体的非刺激状态。样品3的信号三倍于样品1的信号。可以得出结论，抗体1拮抗FGF-9对FGFR-3激活的影响。来自样品2和4的磷酸MAPK的信号可比于来自样品1的相应信号，其中所述的样品1代表该受体的非刺激状态。样品3的信号是大于2倍的样品1的信号。可以得出结论，抗体1拮抗FGF-9对MAPK激活的影响。GEO是从人结直肠肿瘤衍生的细胞系。使细胞在低血清培养基(0.1%FBS)中休眠过夜。次日，将这些细胞分成大小相同的6份样品。将样品1放在一边并在37℃保持1小时作为对照样品。样品2与200nM同种型匹配的非特异性对照抗体在37℃孵育1小时。样品3与200nM抗体1在37℃孵育1小时。将样品4置于37℃持续1小时,随后使相同样品在37℃暴露于0.67nM FGF-1配体持续15分钟。将样品5与200nM对照抗体在37℃孵育1小时,随后使相同样品在37℃暴露于0.67nM FGF-1持续15分钟。将样品6与200nM抗体1在37℃孵育1小时,随后使相同样品在37℃暴露于0.67nM FGF-1持续15分钟。将全部6份样品裂解并对它们进行SDS-PAGE，随后进行蛋白质印迹。用抗磷酸酪氨酸抗体探查FGFR-3的激活。样品1、2和4具有相似的低水平的磷酸FGFR-3，而唯独样品3具有显著更高的对应于全部3种类型分子的信号。因此，1)FGF-9暴露增加FGFR-3的磷酸化；2)抗体1拮抗这些增加，并且3)抗体1单独没有任何激动剂活性。
RT-112是从人膀胱肿瘤衍生的细胞系。使细胞在低血清培养基(0.1%FBS)中休眠过夜。次日，将这些细胞分成大小相同的4份样品。将样品1放在一边并在37℃保持1小时作为对照样品。样品2与200nM抗体1在37℃孵育1小时。将样品3置于37℃持续1小时,随后使相同样品在37℃暴露于1.3nM FGF-1配体持续15分钟。将样品4与200nM抗体1在37℃孵育1小时,随后使相同样品在37℃暴露于0.13nM的FGF-1持续15分钟。随后，将全部4份样品裂解并将10%每份裂解的样品进行SDS-PAGE，随后进行蛋白质印迹。用抗磷酸MAPK抗体探查下游效应分子MAPK的激活。用抗磷酸Akt抗体探查下游效应分子Akt的激活。将其余90%的每份裂解物进行免疫沉淀实验。将样品与市售的抗FGFR-3抗体在4℃混合4-16小时以允许该抗体收集裂解物中的FGFR-3受体，并且随后通过将20μg蛋白A-蛋白G珠混合物(50:50，V:V)混合至样品在4℃过夜来回收结合抗FGFR-3抗体的FGFR-3。这些珠子用PBS洗涤3次，随后将它们进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。用抗磷酸酪氨酸抗体探查FGFR-3的激活。样品1、2和4具有相似的低水平的磷酸FGFR-3和磷酸MAPK，而唯独样品3具有显著更高的对应于全部3种类型分子的信号。因此，1)FGF-1暴露增加了FGFR-3和MAPK的磷酸化；2)抗体1拮抗这些增加，并且3)抗体1单独没有任何激动剂活性。样品4单独具有比其余更低的磷酸Akt信号，表明抗体1也可以拮抗Akt信号传导。
使用GEO细胞来制备上述的6份样品，随后如上裂解它们并进行SDS-PAGE，随后进行蛋白质印迹。但是，用抗磷酸MAPK抗体探查下游效应分子MAPK的激活。用抗磷酸Akt抗体探查下游效应分子Akt的激活。样品1、2、3和6具有相似的低水平的磷酸MAPK，而样品4和5具有显著更高的对应于全部3种类型分子的信号。因此，1)FGF-1暴露增加了MAPK的磷酸化；2)抗体1拮抗这种增加，并且3)抗体1单独没有任何激动剂活性。
抗体1体外抑制肿瘤细胞生长和存活
使用细胞增殖测定法来显示抗体1对肿瘤细胞生长的抑制性影响。使单层RT112细胞在低血清培养基(0.1%胎牛血清，5μg/mL肝素)中休眠24-72小时。将细胞分成4份样品。添加FBS(胎牛血清)至样品1至终浓度10%(V:V)。将样品2留在饥饿培养基中。添加FGF-1至样品3至终浓度1nM。添加抗体1至样品4至终浓度200nM，在37℃孵育1小时。随后，添加FGF-1至终浓度1nM。如上所述制备样品1-4后，所述样品在设置于37℃并含有5%CO2(v:v)的组织培养孵育箱中孵育48小时。使用标准3H-胸苷掺入测定法检测细胞生长。用1nM外源FGF-1刺激体内RT112细胞时，肿瘤细胞生长增加了一倍。实验也显示抗体1有效地减少这种外源刺激的生长。
使用也称作集落形成测定法或集落生成测定法的软琼脂测定法来显示抗体1对肿瘤细胞存活的抑制性影响。在含有(10%FBS培养基中的)200nM抗体1的软琼脂中培育的RT112细胞形成比那些在只含有10%FBS培养基的软琼脂或含有(10%FBS培养基中的)200nM同种型匹配的非特异性对照抗体的软琼脂中所培育的RT112细胞少大约50%集落。这显示抗体1对所述肿瘤细胞的抗存活作用。
抗体1对携带FGFR-3的实体瘤显示抗肿瘤作用。
通过皮下注射与0-100%Matrigel混合的1-20百万个肿瘤细胞至每只雌性无胸腺裸小鼠的常规方法开发了RT112和GEO异种移植肿瘤模型。一旦皮下肿瘤的平均体积达到大约400mm3，开始抗体疗法。与对照组中相同类型的肿瘤相比，对应于2个肿瘤细胞系RT112和GEO的异种移植肿瘤均被每周3次40mg/kg抗体1腹膜内注射治疗有效抑制。为表明这些作用因FGFR-3信号传导途径的表现而产生，使用同位PC-3肿瘤模型实施功效研究，在所述的同位PC-3肿瘤模型中如来自蛋白质印迹分析的FGFR-3受体磷酸化阴性结果所提示，肿瘤细胞缺乏FGFR-3信号传导。通过借助外科手术直接注射萤光素酶转染的PC-3细胞(PC-3LP)至Nu/nu小鼠(雄性，7-8周龄，1X106个细胞/小鼠)的前列腺背叶来产生同位PC-3模型。细胞植入后2周，捕获处于腹位(动物仰卧)的动物的生物发光图像并使用IVIS系统根据制造商说明书(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)将其定量。带有成功移植物的小鼠随机化分组以在预定的时间表腹膜内接收多种试验药物。IVIS捕获的信号用作肿瘤负荷复合的代用物并且每周记录。使用重复的ANOVA进行统计分析。抗体1显示不显著影响PC-3肿瘤的生长。因此，抗体1抑制具备有功能的FGFR-3信号传导途径的那些实体瘤生长。
抗体1对携带突变FGFR-3受体的髓系肿瘤显示抗肿瘤作用。
OPM-2和KMS-11是表达FGFR-3的多发性骨髓瘤细胞系。此外，两个细胞系中的受体是携带单点突变(OPM-2中的K650E和KMS-11中的Y373C)的突变体。这2个突变是获得功能的突变并且通过机制如组成型活化、延长的半寿期和提高的配体灵敏度而增高突变受体的活性。通过其中皮下注射与0-100%Matrigel混合的1-20百万个肿瘤细胞至每只雌性无胸腺裸小鼠的常规方法开发了OPM-2异种移植模型。一旦皮下肿瘤的平均体积达到大约400mm3，开始注射疗法。每周治疗3次。每周测量肿瘤体积3次。治疗4周后进行终末测量。抗体1所治疗动物的平均肿瘤尺寸比对照组小64%。开展Student t-检验。P值小于0.0001。因此，研究结果是高度显著的。根据Xin X等人，Clin Cancer Res.2006年8月15日;12(16):4908-15建立KMS-11骨植活模型。肿瘤细胞注射后1周，开始抗体治疗。每周治疗3次。研究期间几次测量由肿瘤细胞发射的信号。在首次注射后33日进行终末测量。来自抗体1所治疗动物的平均信号是来自对照动物的平均信号的1/4。实施对数秩(Mantel-Cox)检验。P值是0.0002。因此，研究结果是高度显著的。在两个模型中，与对照组相比，3次每周40mg/kg抗体1腹膜内注射治疗显著抑制肿瘤生长。抗体1似乎是首个针对拥有K650E的肿瘤细胞及拥有FGFR-3的Y373C突变形式的那些肿瘤细胞显示体内抗肿瘤活性。
抗体1增强细胞毒性剂的治疗功效
顺铂是癌症治疗中广泛使用的细胞毒性剂。它引起DNA交联并诱导细胞凋亡。探索了顺铂与FGFR-3抗体联合在三个膀胱异种移植模型中的治疗益处。通过其中皮下注射与0-100%Matrigel混合的1-20百万个肿瘤细胞至每只雌性无胸腺裸小鼠的常规方法开发了RT112、RT4和BFTC905异种移植肿瘤模型。一旦皮下肿瘤的平均体积是大约400mm3，则开始抗体疗法。使用40mg/kg每周3次注射抗体1和最大耐受剂量(MTD)的顺铂。每周测量肿瘤体积3次直至研究结束。在下表中记录RT112肿瘤模型数据的总结：
表3：各个RT-112肿瘤体积(mm 3 )–顺铂治疗
实施RM ANOVO统计检验。比较顺铂治疗的功效与顺铂-抗体1组合的功效。P值是0.018。因此抗体1对顺铂功效增加的影响是高度显著的。
在下表中记录RT4肿瘤模型数据的总结：
表4：各个RT4肿瘤体积(mm3)–顺铂治疗
Figure BDA0000374062850000301
实施RM ANOVO统计检验。比较顺铂治疗的功效与顺铂-抗体1组合的功效。P值是0.0162。因此抗体1对顺铂功效增加的影响是高度显著的。
在下表中记录BFTC905肿瘤模型数据的总结：
表5：各个BFTC-905肿瘤体积(mm3)–顺铂治疗
Figure BDA0000374062850000302
实施RM ANOVO统计检验。比较顺铂治疗的功效与顺铂-抗体1组合的功效。P值是0.0209。因此抗体1对顺铂功效增加的影响是高度显著的。
这些研究的整个过程期间，没有一只动物因治疗死亡，这表明添加抗体1至MTD的顺铂增强后者的功效，而没有显著加剧这两种药物的不良作用。
Figure IDA0000374062900000011
Figure IDA0000374062900000021
Figure IDA0000374062900000031
Figure IDA0000374062900000041
Figure IDA0000374062900000051
Figure IDA0000374062900000061
Figure IDA0000374062900000071
Figure IDA0000374062900000081
Figure IDA0000374062900000091
Figure IDA0000374062900000101
Figure IDA0000374062900000111
Figure IDA0000374062900000121
Figure IDA0000374062900000131
Figure IDA0000374062900000141

Claims (13)

1.与人FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)特异性结合的抗体，其包含SEQID NO1所示序列GYMFTSYGIS的CDRH1、SEQ ID NO2所示序列WVSTYNGDTNYAQKFQG的CDRH2、SEQ ID NO3所示序列VLGYYDSIDGYYYGMDV的CDRH3、SEQ ID NO4所示序列GGNNIGDKSVH的CDRL1、SEQ ID NO5所示序列LDTERPS的CDRL2和SEQ ID NO6所示序列QVWDSGSDHVV的CDRL3，其中所述抗体内化并降解人FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)。
2.权利要求1所述的抗体，其是在20-25℃的室温具有1×10-8M或更小KD的人抗体。
3.权利要求1所述的抗体，其与SEQ ID NO12所示的人FGFR-3结构域2特异性结合。
4.权利要求1-3任一项的抗体的中和性人FGFR-3结合片段。
5.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项中所述的抗体或片段和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
6.权利要求1-4任一项中所述的抗体或片段的用途，用作药物。
7.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项中所述的化合物和可药用载体以及任选地其他治疗成分。
8.权利要求1-4任一项中所述的抗体，其中所述抗体与一种或多种其他物质缀合。
9.权利要求1-4任一项中所述的抗体，其中所述一种或多种其他物质是抗瘤剂。
10.权利要求1-4任一项中所述的抗体，其中所述抗体化学地或生物合成地与一种抗肿瘤剂连接。
11.权利要求1-4任一项中所述的抗体，其中所述抗体化学地或生物合成地与多种抗肿瘤剂连接。
12.权利要求1-4任一项中所述的抗体，其中所述抗体化学地或生物合成地与一种产生可检测信号的物质连接。
13.权利要求1-4任一项中所述的抗体，其中所述抗体化学地或生物合成地与多种产生可检测信号的物质连接。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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