CN102942631A - 人源化抗c-met 拮抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人源化抗C-MET拮抗剂。本发明提供了治疗用抗C-MET抗体，以及含有这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。

Description

人源化抗C-MET 拮抗剂

本申请是申请日为2005年08月04日、中国申请号为200580033792.1、发明名称为“人源化抗C-MET拮抗剂”的发明申请的分案申请。 

相关申请 

此申请是根据37 CFR 1.53(b)(1)提交的非临时申请，根据35 USC 119(e)要求2004年8月5日提及的临时申请60/598,991的优先权，将其完整内容收入本文作为参考。 

技术领域

一般而言，本发明涉及分子生物学和生长因子调控领域。更具体的说，本发明涉及HGF/c-met信号途径的调节物，及所述调节物的用途。 

背景 

HGF是间充质衍生的多效因子，对许多不同细胞类型具有促有丝分裂、促运动和促形态发生活性。HGF作用是通过特定的酪氨酸激酶c-met介导的，而且在多种肿瘤中经常观察到异常HGF和c-met表达。参见例如Maulik et al.,Cytokine&Growth Factor Reviews(2002),13:41-59;Danilkovitch-Miagkova&Zbar,J.Clin.Invest.(2002),109(7):863-867。在肿瘤进展和转移中牵涉HGF/c-Met信号途径的调控。参见例如Trusolino&Comoglio,Nature Rev.(2002),2:289-300。 

HGF结合Met受体酪氨酸激酶(RTK)的胞外域并调控不同生物学过程，诸如细胞分散、增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发育是至关重要的，尤其是在肌肉祖细胞迁移及肝和神经系统发育中(Bladt et al.,1995;Hamanoue et al.,1996;Maina et al.,1996;Schmidt et al.,1995;Uehara et al.,1995)。Met和HGF敲除小鼠的发育表型非常相似，表明HGF是Met受体的关联配体(Schmidt et al.,1995;Uehara et al.,1995)。HGF-Met还在肝再生、 血管发生和伤口愈合中发挥作用(Bussolino et al.,1992;Matsumoto and Nakamura,1993;Nusrat et al.,1994)。Met受体前体经蛋白水解切割成由二硫键连接的胞外α亚基和跨膜β亚基(Tempest et al.,1988)。β亚基包含胞质激酶结构域，而且在Ｃ末端包含多底物停靠位点，衔接物蛋白质在此结合并起动信号传导(Bardelli et al.,1997;Nguyen et al.,1997;Pelicci et al.,1995;Ponzetto et al.,1994;Weidner et al.,1996)。HGF结合后，Met活化分别经由Gab1和Grb2/Sos介导的PI3激酶和Ras/MAPK活化而导致酪氨酸磷酸化和下游信号传导，它驱动细胞运动和增殖(Furge et al.,2000;Hartmann et al.,1994;Ponzetto et al.,1996;Royal and Park,1995)。 

Met据显示在经致癌原处理的骨肉瘤细胞系中正在转化(Cooper et al.,1984;Park et al.,1986)。已在多种人癌症中观察到Met过表达或基因扩增。例如，Met蛋白在结肠直肠癌中过表达至少5倍，且据报道在肝转移中有基因扩增(Di Renzo et al.,1995;Liu et al.,1992)。Met蛋白据报道还在口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、乳癌和肺癌中过表达(Jin et al.,1997;Morello et al.,2001;Natali et al.,1996;Olivero et al.,1996;Suzuki et al.,1994)。此外，已在肝细胞癌、胃癌和结肠直肠癌中观察到mRNA过表达(Boix et al.,1994;Kuniyasu et al.,1993;Liu et al.,1992)。 

已在肾乳头状癌中发现Met激酶结构域中的许多突变，它们导致组成性受体活化(Olivero et al.,1999;Schmidt et al.,1997;Schmidt et al.,1999)。这些活化突变造成组成性Met酪氨酸磷酸化，并导致MAPK激活、病灶形成和肿瘤发生(Jeffers et al.,1997)。此外，这些突变增强细胞运动和侵入(Giordano et al.,2000;Lorenzato et al.,2002)。转化细胞中HGF依赖性Met活化介导运动、分散和迁移增加，最终导致侵入性肿瘤生长和转移(Jeffers et al.,1996;Meiners et al.,1998)。 

Met已显示与驱动受体活化、转化和侵入的其它蛋白质相互作用。在肿瘤细胞中，Met据报道与κ6κ4整联蛋白相互作用以促进HGF依赖性侵入性生长，κ6κ4整联蛋白是胞外基质(ECM)组分诸如层粘连蛋白的受体(Trusolino et al.,2001)。此外，Met胞外域已显示与脑信号蛋白家族的成员丛蛋白B1相互作用，且增强侵入性生长(Giordano et al.,2002)。而且，已知牵涉肿瘤发生和转移的CD44v6据报道也与Met和HGF形成复合物并导致Met受体活化(Orian-Rousseau et al.,2002)。 

Met是包括Ron和Sea在内的RTK亚家族的成员(Maulik et al.,2002)。Met胞外域的结构预测表明它与脑信号蛋白和丛蛋白共享同源性。Met的N末端包含约500个氨基酸的Sema结构域，它在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和丛蛋白属于首先因其在神经发育中的作用而描述的一个分泌和膜结合蛋白质大家族(Van Vactor and Lorenz,1999)。不过，新近将脑信号蛋白过表达与肿瘤侵入和转移关联起来。在丛蛋白、脑信号蛋白和整联蛋白中发现的富含半胱氨酸PSI结构域（也称为Met相关序列结构域）邻近Sema结构域，随后是4个IPT重复片段，它们是在丛蛋白和转录因子中发现的免疫球蛋白样区。最近的研究表明Met Sema结构域足以使HGF和肝素结合(Gherardi et al.,2003)。此外，Kong-Beltran等人(Cancer Cell(2004),6:61-73)报道了Met的Sema结构域是受体二聚化和活化所必需的。 

已报道了靶向HGF/c-met途径的许多分子。这些分子包括抗体，诸如那些美国专利5,686,292中所描述的。c-met胞外域的一部分据显示还具有针对HGF/c-met途径的拮抗作用。不过，考虑到该途径在各种病理状态的病因学中所发挥的重要作用，显然继续需要具有最适于开发成治疗剂的临床特性的药剂。本文描述的发明满足这一需求并提供了其它好处。 

完整收入本文引用的所有文献，包括专利申请和出版物，作为参考。 

发明公开 

本发明部分基于HGF/c-met生物学途径的多种拮抗剂的鉴定，该途径是呈现为重要且有利治疗靶的生物学/细胞过程。本发明提供了以干扰HGF/c-met活化为基础的组合物和方法，包括但不限于干扰HGF与c-met胞外部分结合及受体多聚化。如本文所述，本发明的拮抗剂为靶向与异常或不想要的HGF/c-met途径信号传导有关的病理状况提供了重要的治疗剂和诊断剂。因此，本发明提供了与调节HGF/c-met途径有关的方法、组合物、试剂盒和制品，包括调节c-met配体结合、c-met二聚化、活化及其它与HGF/c-met信号传导有关的生物学/生理学活动。 

一方面，本发明提供了适于治疗用途且能实现HGF/c-met信号途径不同程度破坏的抗HGF/c-met治疗剂。例如，在一个实施方案中，本发明提供了人源化抗c-met抗体，其中所述抗体对人c-met的单价亲和力（例如Fab片段形式的抗体对人c-met的亲和力）与包含图7中所示轻链和重链可变区序 列（SEQ ID NO:9和10）、由其组成或基本上由其组成的鼠抗体的单价亲和力（例如Fab片段形式的鼠抗体对人c-met的亲和力）基本上相同。在另一个实施方案中，本发明提供了人源化抗c-met抗体，其中所述抗体对人c-met的单价亲和力（例如Fab片段形式的抗体对人c-met的亲和力）低于包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）、由其组成或基本上由其组成的鼠抗体的单价亲和力（例如Fab片段形式的鼠抗体对人c-met的亲和力），例如至少低3、5、7或10倍。在另一个实施方案中，本发明提供了抗c-met人源化抗体，其中所述抗体对人c-met的单价亲和力（例如Fab片段形式的抗体对人c-met的亲和力）高于包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）、由其组成或基本上由其组成的鼠抗体的单价亲和力（例如Fab片段形式的鼠抗体对人c-met的亲和力），例如至少高3、5、7、10或13倍。在一个实施方案中，鼠抗体对人c-met的单价亲和力与下述Fab片段的结合亲和力基本上相同，所述Fab片段包含于1995年5月23日以美国典型培养物保藏中心登记号ATCC HB-11894（杂交瘤1A3.3.13）或HB-11895（杂交瘤5D5.11.6）保藏的杂交瘤细胞系所生成的抗体的可变区序列。正如本领域完全确立的，配体对其受体的结合亲和力可使用多种测定法中的任一种来测定，并以各种定量数值形式表示。因此，在一个实施方案中，结合亲和力以Kd值表示，反映内在结合亲和力（例如具有最小化的亲合力效应）。普遍且优选的是，结合亲和力在体外测量，无论是无细胞设置或细胞相关设置。正如本文更为详细描述的，结合亲和力的倍数差异可量化成人源化抗体的单价结合亲和力数值（例如Fab形式）与参照/比照抗体（例如具有供体高变区序列的鼠抗体）的单价结合亲和力数值（例如Fab形式）的比率，其中结合亲和力数值是在相似测定条件下测定的。因此，在一个实施方案中，结合亲和力的倍数差异确定为Fab形式的人源化抗体与所述参照/比照Fab抗体的Kd值比率。例如，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(A)具有比参照抗体(M)“低3倍”的亲和力，那么若A的Kd值是3x，则M的Kd值将是1x，且A的Kd与M的Kd的比率将是3:1。相反，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(C)具有比参照抗体(R)“高3倍”的亲和力，那么若C的Kd值是1x，则R的Kd值将是3x，且C的Kd与R的Kd的比率将是1:3。本领域已知的许多测定法中的任一种，包括那些本文所描述的，都可用于获取结合亲和力的测量值，包括例如Biacore、放射免疫测定法(RIA)和ELISA。 

一方面，本发明的HGF/c-met拮抗剂包含抗c-met抗体，它包含：(a)至少一种、两种、三种、四种或五种选自下组的高变区(HVR)序列： 

(i)包含序列A1-A17的HVR-L1，其中A1-A17是 

KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:1) 

(ii)包含序列B1-B7的HVR-L2，其中B1-B7是WASTRES(SEQ ID NO:2) 

(iii)包含序列C1-C9的HVR-L3，其中C1-C9是QQYYAYPWT(SEQ ID NO:3) 

(iv)包含序列D1-D10的HVR-H1，其中D1-D10是GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:4) 

(v)包含序列E1-E18的HVR-H2，其中E1-E18是 

GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:5)，及 

(vi)包含序列F1-F11的HVR-H3，其中F1-F11是XYGSYVSPLDY(SEQ ID NO:6)且X不是R； 

及(b)至少一种变体HVR，其中所述变体HVR序列包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中所示序列的至少一个残基的修饰。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L1包含SEQ ID NO:1的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L2包含SEQ ID NO:2的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L3包含SEQ ID NO:3的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H1包含SEQ ID NO:4的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H2包含SEQ ID NO:5的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H3包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施方案中，HVR-H3包含TYGSYVSPLDY(SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，HVR-H3包含SYGSYVSPLDY(SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，包含这些序列（本文所述组合）的本发明抗体是人源化的或人源的。 

一方面，本发明提供了包含一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的抗体，其中各个HVR包含选自下组的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8，其中SEQ ID NO:1对应于HVR-L1，SEQ ID NO:2对应于HVR-L2，SEQ ID NO:3对应于HVR-L3，SEQ ID NO:4对应于HVR-H1，SEQ ID NO:5对应于HVR-H2，而SEQ ID NO:6、7或8对应于HVR-H3。在一个实施方案中，本发明的抗体包含HVR-L1、HVR-L2、 HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中各个依次包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和7。在一个实施方案中，本发明的抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中各个依次包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和8。 

本发明抗体中的变体HVR可在HVR内具有一个或多个残基的修饰。在一个实施方案中，HVR-L2变体包含以下位置任意组合的1-5个（1、2、3、4或5个）替代：B 1(M或L)、B2(P、T、G或S)、B3(N、G、R或T)、B4(I、N或F)、B5(P、I、L或G)、B6(A、D、T或V)、及B7(R、I、M或G)。在一个实施方案中，HVR-H1变体包含以下位置任意组合的1-5个（1、2、3、4或5个）替代：D3(N、P、L、S、A、I)、D5(I、S或Y)、D6(G、D、T、K、R)、D7(F、H、R、S、T或V)、及D9(M或V)。在一个实施方案中，HVR-H2变体包含以下位置任意组合的1-4个（1、2、3或4个）替代：E7(Y)、E9(I)、E10(I)、E14(T或Q)、E15(D、K、S、T或V)、E16(L)、E17(E、H、N或D)、及E18(Y、E或H)。在一个实施方案中，HVR-H3变体包含以下位置任意组合的1-5个（1、2、3、4或5个）替代：F1(T、S)、F3(R、S、H、T、A、K)、F4(G)、F6(R、F、M、T、E、K、A、L、W)、F7(L、I、T、R、K、V)、F8(S、A)、F10(Y、N)、及F11(Q、S、H、F)。各个位置后面括弧内的字母指出了例示替代（即置换）氨基酸；对本领域技术人员显而易见的是，可使用本领域已知的和/或本文描述的技术常规评估其它氨基酸在本文所述背景中作为替代氨基酸的适宜性。在一个实施方案中，HVR-L1包含SEQ ID NO:1的序列。在一个实施方案中，变体HVR-H3中的F1是T。在一个实施方案中，变体HVR-H3中的F1是S。在一个实施方案中，变体HVR-H3中的F3是R。在一个实施方案中，变体HVR-H3中的F3是S。在一个实施方案中，变体HVR-H3中的F7是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是T或S，F3是R或S，而F7是T。 

在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是T，F3是R，而F7是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是S。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是T，而F3是R。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是S，F3是R，而F7是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含 变体HVR-H3，其中F1是T，F3是S，F7是T，而F8是S。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是T，F3是S，F7是T，而F8是A。在有些实施方案中，所述变体HVR-H3抗体还包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1和HVR-H2，其中各自依次包含SEQ ID NO:1、2、3、4和5中所示序列。在有些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述框架共有序列包含第71、73和/或78位的替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链框架共有序列。 

在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-L2，其中B6是V。在有些实施方案中，所述变体HVR-L2抗体还包含HVR-L1、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中各自依次包含SEQ ID NO:1、3、4、5和6中所示序列。在有些实施方案中，所述变体HVR-L2抗体还包含HVR-L1、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中各自依次包含SEQ ID NO:1、3、4、5和7中所示序列。在有些实施方案中，所述变体HVR-L2抗体还包含HVR-L1、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中各自依次包含SEQ ID NO:1、3、4、5和8中所示序列。在有些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述框架共有序列包含第71、73和/或78位的替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链框架共有序列。 

在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H2，其中E14是T，E15是K，而E17是E。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H2，其中E17是E。在有些实施方案中，所述变体HVR-H2抗体还包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1和HVR-H3，其中各自依次包含SEQ ID NO:1、2、3、4和6中所示序列。在有些实施方案中，所述变体HVR-H2抗体还包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1和HVR-H3，其中各自依次包含SEQ ID NO:1、2、3、4和7中所示序列。在有些实施方案中，所述变体HVR-H2抗体还包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1和HVR-H3，其中各自依次包含SEQ ID NO:1、2、3、4和8中所示序列。在有些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中， 所述框架共有序列包含第71、73和/或78位的替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链框架共有序列。 

一方面，本发明提供了包含图2、3和/或4（SEQ ID NO:56-163）中所示一种、两种、三种、四种、五种或所有HVR序列的抗体。 

用于宿主受试者的治疗剂优选在所述受试者中引起很弱的针对所述药剂的免疫应答或不引起针对所述药剂的免疫应答。在一个实施方案中，本发明提供了这样的药剂。例如，在一个实施方案中，本发明提供了与包含SEQID NO:9和10的序列的抗体相比，在宿主受试者中以实质性降低的水平引起和/或预期引起人抗小鼠抗体应答(HAMA)的人源化抗体。在另一个实施例中，本发明提供了引起和/或预期引起最低限度的人抗小鼠抗体应答(HAMA)或不引起人抗小鼠抗体应答(HAMA)的人源化抗体。在一个实施例中，本发明的抗体以处于或低于临床可接受水平引起抗小鼠抗体应答。 

本发明的人源化抗体可在其重链和/或轻链可变区中包含一个或多个人的和/或人共有的非高变区（例如框架）序列。在有些实施方案中，在人的和/或人共有的非高变区序列中存在一个或多个另外的修饰。在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区包含人共有框架序列，它在一个实施方案中是亚型III共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含在至少一个氨基酸位置处有修饰的变体亚型III共有框架序列。例如，在一个实施方案中，变体亚型III共有框架序列可在第71、73和/或78位的一个或多个位置包含替代。在一个实施方案中，所述替代是R71A、N73T和/或N78A的任意组合。 

正如本领域已知的及下文更为详细描述的，根据背景和本领域已知的多种定义（正如下文所描述的），界定抗体高变区的氨基酸位置/边界可有所变化。可变区内的有些位点可视为杂合高变位置，因为这些位置根据一套标准可认为是在高变区内，但根据一套不同的标准则认为是在高变区外。在延伸的高变区（如下文进一步定义的）内也可找到一个或多个这些位置。本发明提供了在这些杂合的高变位置包含修饰的抗体。在一个实施方案中，这些杂合高变位置包括重链可变区中第26-30、33-35B、47-49、57-65、93、94和102位中的一个或多个位置。在一个实施方案中，这些杂合高变位置包括轻链可变区中第24-29、35-36、46-49、56和97位中的一个或多个位置。在一 个实施方案中，本发明的抗体包含在一个或多个杂合高变位置有修饰的变体人亚型共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述重链可变区，所述重链可变区包含在第27-28、30、33-35、49、57-65、94和102位中的一个或多个位置有修饰的变体人亚型III共有框架序列。在一个实施方案中，所述抗体包含F27Y替代。在一个实施方案中，所述抗体包含T28N、P、L、S、A或I替代。在一个实施方案中，所述抗体包含S30I、T或Y替代。在一个实施方案中，所述抗体包含A33W替代。在一个实施方案中，所述抗体包含M34L或M34V替代。在一个实施方案中，所述抗体包含S35H替代。在一个实施方案中，所述抗体包含T57I替代。在一个实施方案中，所述抗体包含Y58R替代。在一个实施方案中，所述抗体包含Y59F替代。在一个实施方案中，所述抗体包含A60N替代。在一个实施方案中，所述抗体包含D61P、T或Q替代。在一个实施方案中，所述抗体包含S62N、D、K、T或V替代。在一个实施方案中，所述抗体包含V63F或V63L替代。在一个实施方案中，所述抗体包含K64E、H、N、D或Q替代。在一个实施方案中，所述抗体包含G65D、Y、E或H替代。在一个实施方案中，所述抗体包含R94T或R94S替代。在一个实施方案中，所述抗体包含Y102Q、S、H或F替代。在一个实施方案中，包含所述R94T或R94S修饰的本发明抗体还在第96和/或100位包含一个或多个修饰。在一个实施方案中，所述修饰包括G96R和/或S 100T替代（即在HVR-H3中）。在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述轻链可变区，所述轻链可变区包含在第24、25、29和56位中的一个或多个位置有修饰的变体人κ亚型I共有框架序列。在一个实施方案中，所述抗体包含R24K替代。在一个实施方案中，所述抗体包含A25S替代。在一个实施方案中，所述抗体包含I29Q替代。在一个实施方案中，所述抗体包含S56R、I、M或G替代。 

在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述重链可变区，所述重链可变区包含在第27-28、30、33-35、49、57-65、94和102位中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个或所有位置有修饰的变体人亚型III共有框架序列。在一个实施方案中，修饰选自F27Y、T28(N、P、L、S、A或I)、S30(I、T或Y)、A33W、M34(L、V)、S35H、T57I、Y58R、Y59F、A60N、D61(P、T、Q)、S62(N、D、K、T、V)、V63(F、L)、K64(E、H、N、D、Q)、G65(D、Y、E、H)、R94(T、S)、及Y102(Q、S、H、F)。 在一个实施方案中，包含所述R94T或R94S修饰的本发明抗体还在第96和/或100位包含一个或多个修饰。在一个实施方案中，所述修饰包括G96R和/或S100T替代（即在HVR-H3中）。 

在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述轻链可变区，所述轻链可变区包含在第24、25、29和56位中的1、2、3个或所有位置有修饰的变体人κ亚型I共有框架序列。在一个实施方案中，修饰选自R24K、A25S、I29Q、及S56(R、I、M、G)。 

本发明的抗体可包含任何合适的人的或人共有的轻链框架序列，只要该抗体呈现所需生物学特性（例如想要的结合亲和力）。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人κ轻链框架序列的至少一部分（或整个）。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人κ亚型I框架共有序列的至少一部分（或整个）。 

在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述重链和/或轻链可变区，所述重链和/或轻链可变区包含SEQ ID NO:13和/或16（图1）中所示框架序列，只要重链中的第94位不是R（且优选但非必需是S或T）。 

一方面，本发明的抗体是人源化抗c-met抗体，它比包括嵌合抗c-met抗体的参照抗体更好的抑制人肝细胞生长因子与其受体的结合，所述嵌合抗c-met抗体包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）。例如，在一个实施方案中，本发明的抗体抑制HGF结合且IC50值小于所述嵌合抗体该数值的约一半。在一个实施方案中，本发明抗体的IC50值是所述嵌合抗体该数值的约0.1、0.2、0.3或0.4。对抑制HGF与其受体结合的能力的比较可依照本领域已知的多种方法进行，包括下文实施例中所描述的。在一个实施方案中，IC50值是跨越约0.01nM至1000nM左右的抗体浓度范围测定的。 

一方面，本发明的抗体是人源化抗c-met抗体，它比包括嵌合抗c-met抗体的参照抗体更好的抑制人肝细胞生长因子(HGF)受体的活化，所述嵌合抗c-met抗体包含图7中所示轻链和重链可变序列（SEQ ID NO:9和10）。例如，在一个实施方案中，本发明的抗体抑制受体活化且IC50值小于所述嵌合抗体该数值的约一半。在一个实施方案中，本发明抗体的IC50值是所述嵌合抗体该数值的约0.1、0.2、0.3或0.4。对抑制HGF受体活化的能力的比较可依照本领域已知的多种方法进行，包括下文实施例中所描述的。在一个实施方案中，IC50值是跨越约0.1nM至约100nM的抗体浓度范围测定的。 

一方面，本发明的抗体是人源化抗c-met抗体，它比包括嵌合抗c-met抗体的参照抗体更好的抑制c-met依赖性细胞增殖，所述嵌合抗c-met抗体包含图7中所示轻链和重链可变序列（SEQ ID NO:9和10）。例如，在一个实施方案中，本发明的抗体抑制细胞增殖且IC50值小于所述嵌合抗体该数值的约一半。在一个实施方案中，本发明抗体的IC50值是所述嵌合抗体该数值的约0.1、0.2、0.3或0.4。对抑制细胞增殖的能力的比较可依照本领域已知的多种方法进行，包括下文实施例中所描述的。在一个实施方案中，IC50值是跨越约0.01nM至约100nM的抗体浓度范围测定的。 

在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体都是单价的。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体都包含与Fc区连接的单一Fab区。在一个实施方案中，参照嵌合抗体包含与人Fc区连接的图7中所示可变区序列（SEQ ID NO:9和10）。在一个实施方案中，人Fc区是IgG（例如IgG1、2、3或4）的Fc区。 

一方面，本发明提供了包含下述重链可变区的抗体，所述重链可变区包含图13中所示HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列。在一个实施方案中，所述可变区包含图13中所示FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列。在一个实施方案中，所述抗体包含图13中所示CH1和/或Fc序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述重链可变区，所述重链可变区包含图13中所示HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述重链可变区，所述重链可变区包含图13中所示HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，及CH1和/或Fc序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含下述重链可变区，所述重链可变区包含图13中所示HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列，及图13中所示CH1和/或Fc序列。在一个实施方案中，本发明抗体的Fc区包含两种多肽之间的复合物，一种多肽包含图13中的Fc序列，另一种多肽包含图14中的Fc序列。 

一方面，本发明提供了包含下述轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含图13中所示HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列。在一个实施方案中，所述可变区包含图13中所示FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列。在一个实施方案中，所述抗体包含图13中所示CL1序列。 

在一个实施方案中，本发明的抗体包含前两段中描述的轻链和重链可变区。在一个实施方案中，所述抗体是单价的且包含Fc区。在一个实施方案中，Fc区包含至少一个突起(protuberance)（隆起(knob)）和至少一个腔(cavity)（穴(hole)），其中突起和腔的存在增强了包含突起的Fc多肽和包含腔的Fc多肽之间复合物的形成，例如WO 2005/063816中所述。在一个实施方案中，本发明抗体的Fc区包含第一和第二Fc多肽，其中第一和第二多肽各自包含相对于野生型人Fc的一个或多个突变。在一个实施方案中，腔突变是T366S、L368A和/或Y407V。在一个实施方案中，突起突变是T366W。在一个实施方案中，第一多肽包含图13中所示Fc序列，而第二多肽包含图14中所示Fc序列。 

本发明的拮抗剂可用于调节HGF/c-met相关作用的一个或多个方面，包括但不限于c-met活化、下游分子信号传导（例如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化）、细胞增殖、细胞迁移、细胞存活、细胞形态发生和血管发生。这些作用可通过任何生物学相关机制来调节，包括破坏结合c-met的配体（例如HGF）、c-met磷酸化和/或c-met多聚化。因此，在一个实施方案中，本发明提供了抑制HGF与c-met结合的c-met拮抗性抗体。在一个实施方案中，本发明的c-met拮抗性抗体破坏c-met多聚化（例如二聚化）。在一个实施方案中，本发明的c-met拮抗性抗体破坏c-met Sema结构域的二聚化。在一个实施例中，c-met拮抗性抗体干扰c-met Sema结构域实现c-met二聚化的能力。干扰可以是直接的或间接的。例如，c-met拮抗性抗体可结合c-met Sema结构域内的序列，从而抑制所述结合结构域与其结合配偶（诸如另一c-met分子）的相互作用。在另一实施例中，c-met拮抗性抗体可结合不在c-met Sema结构域内的序列，但其中所述结合导致c-met Sema结构域与其结合配偶（诸如另一c-met分子）相互作用的能力遭到破坏。在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体结合c-met（例如胞外域），使得c-met二聚化遭到破坏。在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体结合c-met，使得c-met Sema结构域实现c-met二聚化的能力遭到破坏。例如，在一个实施方案中，本发明提供了在结合c-met分子后抑制所述分子二聚化的拮抗性抗体。在一个实施方案中，本发明的c-met拮抗性抗体特异结合c-met Sema结构域中的序列。 

在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体破坏包括同型二聚化在内的 c-met二聚化。在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体破坏包括异型二聚化（即c-met与非c-met分子的二聚化）在内的c-met二聚化。 

在有些情况中，c-met拮抗性抗体不干扰配体（诸如HGF）与c-met结合可能是有利的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了不结合c-met上HGF结合位点的抗体。在另一实施方案中，本发明的抗体没有实质性抑制HGF与c-met的结合。在一个实施方案中，本发明的抗体没有实质性与HGF竞争与c-met的结合。在一个实施例中，本发明的拮抗性抗体可与一种或多种其它拮抗剂联合使用，其中所述拮抗剂靶向HGF/c-met轴内的不同过程和/或功能。因此，在一个实施方案中，本发明的c-met拮抗性抗体结合c-met上不同于另一c-met拮抗剂（诸如以美国典型培养物保藏中心登记号ATCCHB-11894保藏的杂交瘤细胞系（杂交瘤1A3.3.13）所生成的单克隆抗体的Fab片段）所结合之表位的表位。在另一实施方案中，本发明的c-met拮抗性抗体不同于（即不是）以美国典型培养物保藏中心登记号ATCC HB-11894保藏的杂交瘤细胞系（杂交瘤1A3.3.13）所生成的单克隆抗体的Fab片段。 

在一个实施方案中，本发明提供了既破坏c-met多聚化又破坏配体结合的c-met拮抗性抗体。例如，抑制c-met多聚化（例如二聚化）的本发明拮抗性抗体还可具有与HGF竞争与c-met结合的能力。 

在本发明c-met拮抗性抗体的一个实施方案中，拮抗剂与c-met的结合抑制HGF对c-met的活化。在本发明c-met拮抗性抗体的另一实施方案中，拮抗剂与细胞中c-met的结合抑制细胞的增殖、存活、分散、形态发生和/或运动。 

在一个实施方案中，本发明的c-met拮抗性抗体特异结合c-met Sema结构域的至少一部分或其变体。在一个实施例中，本发明的拮抗性抗体特异结合至少一种选自下组的序列：LDAQT(SEQ ID NO:15)(例如c-met的残基269-273)、LTEKRKKRS(SEQ ID NO:16)(例如c-met的残基300-308)、KPDSAEPM(SEQ ID NO:17)(例如c-met的残基350-357)、及NVRCLQHF(SEQ ID NO:18)(例如c-met的残基381-388)。在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体特异结合由至少一种选自下组的序列的部分或整个形成的构象表位：LDAQT(例如c-met的残基269-273)、LTEKRKKRS(例如c-met的残基300-308)、KPDSAEPM(例如c-met的残基350-357)、及NVRCLQHF(例如c-met的残基381-388)。在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体特异结 合与序列LDAQT、LTEKRKKRS、KPDSAEPM和/或NVRCLQHF具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。 

在一个实施方案中，本发明的抗体特异结合第一种动物物种的HGF受体，而不特异结合第二种动物物种的HGF受体。在一个实施方案中，第一种动物物种是人类和/或灵长类（例如猕猴），而第二种动物物种是鼠类（例如小鼠）和/或犬类。在一个实施方案中，第一种动物物种是人。在一个实施方案中，第一种动物物种是灵长类，例如猕猴。在一个实施方案中，第二种动物物种是鼠类，例如小鼠。在一个实施方案中，第二种动物物种是犬类。 

一方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种拮抗性抗体及载体的组合物。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。 

一方面，本发明提供了编码本发明c-met拮抗性抗体的核酸。 

一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。 

一方面，本发明提供了包含本发明核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 

一方面，本发明提供了制备本发明拮抗剂的方法。例如，本发明提供了制备c-met拮抗性抗体（根据本文定义，包括全长及其片段）的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体（或其片段）的本发明重组载体，并回收所述抗体。 

一方面，本发明提供了包括容器及该容器内所装有的组合物的制品，其中所述组合物包含本发明的一种或多种c-met拮抗性抗体。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含拮抗性抗体的组合物还包含载体，它在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品还包括关于对受试者施用所述组合物（例如拮抗性抗体）的说明书。 

一方面，本发明提供了包括第一容器和第二容器的试剂盒，其中第一容器装有包含本发明一种或多种c-met拮抗性抗体的组合物，而第二容器装有缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是药学可接受的。在一个实施方案 中，包含拮抗性抗体的组合物还包含载体，它在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，试剂盒还包括关于对受试者施用所述组合物（例如拮抗性抗体）的说明书。 

一方面，本发明提供了本发明的c-met拮抗性抗体在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫（诸如自身免疫）紊乱和/或血管发生相关紊乱。 

一方面，本发明提供了本发明的核酸在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫（诸如自身免疫）紊乱和/或血管发生相关紊乱。 

一方面，本发明提供了本发明的表达载体在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫（诸如自身免疫）紊乱和/或血管发生相关紊乱。 

一方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫（诸如自身免疫）紊乱和/或血管发生相关紊乱。 

一方面，本发明提供了本发明的制品在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫（诸如自身免疫）紊乱和/或血管发生相关紊乱。 

一方面，本方面提供了本发明的试剂盒在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫（诸如自身免疫）紊乱和/或血管发生相关紊乱。 

本发明提供了可用于调节与HGF/c-met信号轴调控异常有关的疾病状态的组合物。HGF/c-met信号途径牵涉多种生物学和生理学功能，包括例如细胞增殖和血管发生。因此，一方面，本发明提供了包括对受试者施用本发明抗体在内的方法。 

一方面，本发明提供了抑制c-met激活的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的本发明抗体，由此与c-met活化作用相关的细胞增殖受到抑制。 

一方面，本发明提供了治疗受试者中与c-met活化作用调控异常有关的病理状态的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明抗体，由此所述疾病得到治疗。 

一方面，本发明提供了抑制表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明抗体，由此引起所述细胞的生长抑制。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF（例如通过旁分泌作用）。 

一方面，本发明提供了治疗性处理患癌性肿瘤的哺乳动物的方法，所述肿瘤包含表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明抗体，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF（例如通过旁分泌作用）。 

一方面，本发明提供了用于治疗或预防与c-met或肝细胞生长因子或二者的表达或活性增加有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明抗体，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。在一个实施方案中，所述增殖性紊乱是癌症。 

一方面，本发明提供了用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长增效作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF（例如通过旁分泌作用）。 

治疗性处理哺乳动物中肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长增效作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF（例如通过旁分泌作用）。 

本发明的方法可用于影响任何合适的病理状态，例如与HGF/c-met信号途径调控异常有关的细胞和/或组织。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可选自乳癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞（例如甲状腺的）、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨源性肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、头和颈鳞状癌细胞、黑素瘤细胞和白血病细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是过度增殖的和/或过度增生的细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是发育异常的细胞。在另一实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是转移的细胞。 

本发明的方法还可包括另外的处理步骤。例如，在一个实施方案中，该 方法还包括其中将靶细胞和/或组织（例如癌细胞）暴露于放射处理或化疗剂的步骤。 

如本文所述，c-met的活化作用是重要的生物学过程，它的调控异常导致许多病理状态。因此，在本发明方法的一个实施方案中，所靶向的细胞（例如癌细胞）是其中c-met的活化作用与相同组织起源的正常细胞相比增强的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法引起靶细胞的死亡。例如，与本发明拮抗剂的接触可导致细胞不能通过c-met途径发信号，这导致细胞死亡。 

c-met活化作用（及由此信号传导）的调控异常可源自许多细胞变化，包括例如HGF（c-met的关联配体）和/或c-met自身的过表达。因此，在有些实施方案中，本发明的方法包括靶向这样的细胞，其中与相同组织起源的正常细胞相比，由所述细胞（例如癌细胞）表达的c-met或肝细胞生长因子或二者更丰富。表达c-met的细胞可受到来自多种来源的HGF调控，即以自分泌或旁分泌的方式。例如，在本发明方法的一个实施方案中，使靶细胞受到不同细胞所表达的肝细胞生长因子的接触/结合（例如通过旁分泌作用）。所述不同细胞可以是相同或不同组织起源的。在一个实施方案中，使靶细胞受到靶细胞自身所表达的HGF的接触/结合（例如通过自分泌作用/环）。C-met活化和/或信号传导也可不依赖配体而发生。因此，在本发明方法的一个实施方案中，靶细胞中的c-met活化不依赖配体而发生。 

附图简述 

图1描绘了以下轻链和重链可变区的序列比对：轻链人亚型I共有序列、重链人亚型III共有序列、鼠5D5抗c-met抗体和5D5移植型“人源化”抗体。 

图2描绘了从具有各自随机化HVR的文库中选择的亲和成熟抗体的各种HVR序列。 

图3描绘了从包括6个文库组合的文库集合中选择的亲和成熟抗体的HVR-H3序列，所述6个文库组合涵盖所有6个HVR，其中各个文库在单一HVR中随机化。 

图4描绘了所选抗c-met抗体的Biacore分析结果。 

图5A、5B和6A、6B描绘了用于实践本发明的例示性受体人共有框架序列，序列标识符如下： 

重链可变区(VH)共有框架（图5A、B）

人VH亚型I共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:19) 

人VH亚型I共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:20-22) 

人VH亚型II共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:23) 

人VH亚型II共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:24-26) 

人VH亚型III共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:27) 

人VH亚型III共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:28-30) 

人VH受体框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:31) 

人VH受体框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:32-33) 

人VH受体2框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:34) 

人VH受体2框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:35-37) 

轻链可变区(VL)共有框架（图6A、B）

人VL κ亚型I共有框架(SEQ ID NO:38) 

人VL κ亚型II共有框架(SEQ ID NO:39) 

人VL κ亚型III共有框架(SEQ ID NO:40) 

人VL κ亚型IV共有框架(SEQ ID NO:41) 

图7描绘了供体（鼠抗体5D5）轻链(LC)和重链(HC)可变区序列。 

图8描绘了本发明抗体阻断HGF与其受体结合的绘图数据。 

图9描绘了本发明抗体抑制HGF受体活化的绘图数据。 

图10描绘了本发明抗体抑制细胞增殖的绘图数据。“rchOA5D5 HGF”指嵌合单臂5D5抗体加HGF；“rhuOA5D5v2HGF”指OA5D5.v2加HGF；“rhuOA5D5v1 HGF”指OA5D5.v1加HGF。“rchOA5D5对照”指嵌合单臂5D5抗体但没有HGF；“rhuOA5D5v2对照”指OA5D5.v2但没有HGF；“rhuOA5D5v1对照”指OA5D5.v1但没有HGF。 

图11A、11B描绘了在存在本发明抗体时抑制受体磷酸化的数据。图11A描绘了H358细胞的受体磷酸化。图11B描绘了经HGF转染的H358细胞的受体磷酸化。 

图12描绘了显示本发明抗体体内功效的绘图数据。“TI”指肿瘤发生率。TI=8/10指一组10只小鼠中有8只小鼠患肿瘤。TI=2/8指一组8只小鼠中有2只小鼠患肿瘤。 

图13描绘了本发明抗体一个实施方案（5D5.v2）的框架(FR)、高变区 (HVR)、第一恒定区(CL或CH1)和Fc区(Fc)的氨基酸序列。所描绘的Fc序列包含“穴”（腔）突变T366S、L368A和Y407V，如WO 2005/063816中所述。 

图14描绘了包含“隆起”（突起）突变T366W的Fc多肽的序列，如WO 2005/063816中所述。在一个实施方案中，包含此序列的Fc多肽与含图13的Fc序列的Fc多肽形成复合物以生成本发明抗体的Fc区。 

实行本发明的模式 

本发明提供了用于鉴定和/或利用HGF/c-met信号途径之抑制剂的方法、组合物、试剂盒和制品。 

本文提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的细节。 

通用技术 

除非另有说明，本发明的实行将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分解释了这些技术，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook et al.,1989);“Oligonucleotide Synthesis”,(M.J.Gait,ed.,1984);“Animal Cell Culture”,(R.I.Freshney,ed.,1987);“Methods in Enzymology”,(Academic Press,Inc.);“Current Protocols in Molecular Biology”,(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,and periodic updates);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.,ed.,1994);“A Practical Guide to Molecular Cloning”,(Perbal Bernard V,1988);“Phage Display:A Laboratory Manual”,(Barbas et al.,2001)。 

定义 

氨基酸残基/位点的“修饰”在用于本文时指一级氨基酸序列与起始氨基酸序列相比的变化，其中所述改变源自牵涉所述氨基酸残基/位点的序列改变。例如，典型的修饰包括用另一种氨基酸替代所述残基（或者在所述位置）（例如保守或非保守替代）、在所述残基/位置插入一个或多个（通常少于5个或3个）氨基酸、及删除所述残基/位置。“氨基酸替代”或其变体指用不同氨基酸残基置换预定的（起初的）氨基酸序列中现有的氨基酸残基。通常且优选的是，修饰导致与包含起始（或“野生型”）氨基酸序列的多肽相比， 变体多肽的至少一种物理生化活性发生变更。例如，在抗体的情况中，发生改变的物理生化活性可以是对靶分子的结合亲和力、结合能力和/或结合效应。 

“分离的”抗体指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。 

术语“依照Kabat的可变区残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及其变体指Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中的抗体编辑用于重链可变区或轻链可变区的编号系统。利用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变区FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变区可包括H2残基52后的单一氨基酸插入（依照Kabat是残基52a）及重链FR残基82后的插入残基（例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等）。指定抗体的Kabat残基编号可通过将此抗体序列与“标准”Kabat编号序列在同源区进行比对来确定。 

短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值（通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体）之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选小于约50%，优选小于约40%，优选小于约30%，优选小于约20%，优选小于约10%。 

“结合亲和力”通常指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体和抗原）之间1:1 相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域已知的普通方法来测量，包括那些本文所描述的。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原且趋向于容易解离，而高亲和力抗体通常较快结合抗原且趋向于保持较长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的例示性实施方案。 

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下述测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的(¹²⁵I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen,et al.,(1999)J Mol Biol 293:865-881)。为了确定测定条件，用溶于50mM碳酸钠(pH 9.6)的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用溶于PBS的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温（约23℃）封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的目的Fab（例如与Presta et al.,(1997)Cancer Res.57:4593-4599中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）混合。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间（例如65个小时）以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温（例如1小时）。然后除去溶液，并用含0.1% Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20;Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05% Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至 500nM）。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.,et al.,(1999)J Mol Biol 293:865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M^-1S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即在根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，存在浓度渐增的抗原的条件下，测量溶于PBS,pH 7.2的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。 

依照本发明的“结合速率”（on-rate,rate of association,association rate）或“k_on”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05% Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.,et al.,(1999)J Mol Biol 293:865-881。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率优选使用荧光淬灭技术来测定，即在根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，存在浓度渐增的抗原的条件下，测量溶于PBS,pH 7.2的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下述测定法所述使用Fab型式的抗体和抗原分子进行 的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的(¹²⁵I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen,et al.,(1999)J Mol Biol 293:865-881)。为了确定测定条件，用溶于50mM碳酸钠(pH9.6)的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用溶于PBS的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温（约23℃）封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的目的Fab（例如与Presta et al.,(1997)Cancer Res.57:4593-4599中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）混合。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间（例如65个小时）以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温1小时。然后除去溶液，并用含0.1% Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20;Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05% Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.,et al.,(1999)J Mol Biol 293:865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即在根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，存在浓度渐增的抗原的条件下，测量溶于PBS,pH 7.2的20nM抗抗原抗体（Fab形 式）在25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。 

在一个实施方案中，依照本发明的“结合速率”（on-rate,rate of association,association rate）或“k_on”是通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测定的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05% Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.,et al.,(1999)J Mol Biol 293:865-881。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率优选使用荧光淬灭技术来测定，即在根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，存在浓度渐增的抗原的条件下，测量溶于PBS,pH 7.2的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。 

短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值（通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体）之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值（例如Kd值、HAMA反应）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选大于约10%，优选大于约20%，优选大于约30%，优选大于约40%，优选大于约50%。 

关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基 相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本文的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中下文表A中提供了ALIGN-2程序的全部源代码。ALIGN-2序列对比计算机程序由Genentech,Inc.编写，且下文表A中所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech,Inc.(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文图8中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。 

在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（任选可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算： 

分数X/Y乘100 

其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可预料到若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。 

除非另有具体说明，本文所用的所有%氨基酸序列同一性值均是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。 

表A 

术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制（如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（如非附加型哺乳动物载体）可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简称为“重组载体”）。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。 

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合 酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分阻断。多核苷酸还可以在合成后修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然发生核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接（如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等）和具有带电荷连接（如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)，诸如例如蛋白质（如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等）的修饰、具有嵌入剂（如吖啶、补骨脂素等）的修饰、含有螯合剂（如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等）的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接（如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等）的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与另外核苷酸的另外连接，或者可偶联至固相或半固相支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S（“硫代酸酯”(thioate)）、P(S)S（“二硫代酸酯”(dithioate)）、(O)NR₂（“酰胺酯”(amidate)）、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂（“甲缩醛”(formacetal)）替代，其中R或R'各自独立为H或者取代或未取代的烷基（1-20个C)，任选含有醚（-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。 

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短多核苷酸，通常是单链，通常是合成的，长度通常但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。 

除非另有明确或背景说明，术语“肝细胞生长因子”或“HGF”在用于本文时指能够在容许HGF/c-met信号途经发生的条件下激活所述过程的任何天然或变异的（或是天然的或是合成的）HGF多肽。术语“野生型HGF”通常指包含天然发生HGF蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型HGF序列”通常指在天然发生HGF中发现的氨基酸序列。 

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体（如全长或完整单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体（如双特异性抗体，只要它们展示期望的生物学活性），且还可包括抗体片段（如本文中更为详细描述的）。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。 

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，由此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与所述Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本上相似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连的一个抗原结合臂。在一个实施方案中，本发明的抗体是如WO2005/063816中所述的单臂抗体。在一个实施方案中，单臂抗体包含如WO2005/063816中所述构成“隆起”和“穴”的Fc突变。例如，穴突变可以是Fc多肽中的T366A、L368A和/或Y407V中的一个或多个，而腔突变可以是T366W。 

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即构成群体的抗体个体是相同的，只是可能以极小数量存在可能的天然发生突变。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。 

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展示期望的生 物学活性（美国专利4,816,567;及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)）。 

非人（如鼠源）抗体的“人源化”形式是最低限度含有衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是如下人免疫球蛋白（受体抗体），其中受体高变区的残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基替换。在有些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含没有在受体抗体中或在供体抗体中发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个基本上整个可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白中的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。更多详情参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见下列综述性论文及其引用的参考文献：Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。 

“抗原”是抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然发生的或合成的化合物。优选的是，靶抗原是多肽。就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。当存在预先存在的氨基酸变化时，优选存在不超过5个，优选4个或更少，或者3个或更少预先存在的氨基酸变化。当VH中存在预先存在的氨基酸变化时，优选那些变化只位于71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。 

“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，所述人免疫球蛋白VL或VH选集来自可变区 序列亚型。通常，所述序列亚型是如Kabat等人所述的亚型。在一个实施方案中，对于VL，所述亚型是如Kabat等人所述的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚型是如Kabat等人所述的亚型III。 

“VH亚型III共有框架”包含获自Kabat等人所述的可变重链亚型III中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VH亚型III共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整个全部： 

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:42)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC(SEQ ID NO:44)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:45)。 

“VL亚型I共有框架”包含获自Kabat等人所述的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VL亚型I共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整个： 

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:46)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:48)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:49)。 

“未修饰的人框架”是具有与受体人框架相同的氨基酸序列的人框架，例如在受体人框架中没有人到非人的氨基酸替代。 

“改变的高变区”就本文目的而言是其中包含一个或多个（例如1个至约16个）氨基酸替代的高变区。 

“未修饰的高变区”就本文目的而言是具有与衍生它的非人抗体相同的氨基酸序列的高变区，即其中没有一个或多个氨基酸替代的高变区。 

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变区中序列上高度可变且/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含6个高变区：三个在VH中（H1、H2、H3），三个在VL中（L1、L2、L3）。本文使用且包括许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列可变性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular's AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以可获得复杂晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一 个的残基。 

高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)，及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照文献Kabat等人（见上文）所述编号的。 

“框架”或“FR”残基是可变区中除了如本文所定义的高变区残基以外的那些残基。 

“人抗体”是具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列且/或使用本文所公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。 

“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个CDR中具有导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知流程生成。Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了经由通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献描述了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。 

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。 

“激动性抗体”在用于本文时是模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。 

“紊乱”是将受益于本发明物质/分子或方法的治疗的任何状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论紊乱的病理状况。本文中待治疗的紊乱的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的病症；及炎性、免疫学和其它血管发生相关的紊乱。 

术语“细胞增殖性紊乱”和“增殖性紊乱”指与一定程度的异常细胞增殖有关的紊乱。在一个实施方案中，所述细胞增殖性紊乱是癌症。 

“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性紊乱”、“增殖性紊乱”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。 

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。这样的癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝的癌及各种类型的头和颈癌。 

血管发生调节异常可导致可用本发明组合物和方法治疗的许多紊乱。这些紊乱包括非肿瘤性的和肿瘤性的两类状况。肿瘤性的包括但不限于上文所描述的。非肿瘤性紊乱包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新生血管性青光眼、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成（发红）、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生（包括格雷夫 斯氏(Graves)病）、角膜和其它组织的移植、慢性炎症、急性肺损伤/ARDS、脓毒病、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿（例如与急性中风/闭合性头部损伤/外伤有关的）、滑液炎症、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊性卵巢病、子宫内膜异位、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)（胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病）、子宫平滑肌瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD（克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎）、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长（非癌性的）、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液（诸如与心包炎有关的）、以及胸腔积液。 

在用于本文时，“治疗”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或紊乱的发展。 

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的数量。 

本发明物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的数量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的数量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。 

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星 (doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒性剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。 

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和 环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)（屈大麻酚(dronabinol)， 

）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan) 

CPT-11（伊立替康(irinotecan)， 

）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝 脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)）；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、 

多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧 啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)； 

多糖复合物（JHS Natural Products,Eugene,OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)（ 

）；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如 

紫杉醇(paclitaxel)（Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.）、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇（American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois）和 多西他塞(doxetaxel)（ 

Rorer,Antony,France）；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)（ 

）；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)（ 

）；铂；依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)（ 

）；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)（ ）；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine) 

任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生 物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN^TM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。 

该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括 

他莫昔芬)、 

雷洛昔芬(raloxfene)、屈洛昔芬(droloxfene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxfene)、那洛昔芬(keoxfene)、LYll70l 8、奥那司酮(onapristone)和 

托瑞米芬(toremfene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如 

和 

醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、 

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、 

依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、 伏罗唑(vorozole)、 

来曲唑(letrozole)和 

阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如 或 

)、 

依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、 

唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、 

阿伦膦酸盐(alendronate)、 帕米膦酸盐(pamidronate)、 

替鲁膦酸盐(tiludronate)或 

利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如 

疫苗和基因疗法疫苗，例如 

疫苗、 

疫苗和 

疫苗； 

拓扑异构酶1抑制剂； 

lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。 

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制其生长依赖于HGF/c-met活化的细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期的HGF/c-met依赖性细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vinca)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxane)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)和ara-C。其它信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类（紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）皆为衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛 

Rhone-Poulenc Rorer）是紫杉醇（ 

Bristol-Myers Squibb）的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞有丝分裂的抑制。 

“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione)。 

生成展示HAMA应答降低或缺失的变体抗体 

HAMA应答降低或消除是合适治疗剂的临床开发的一个重要方面。参见例如Khaxzaeli et al.,J.Natl.Cancer Inst.(1988),80:937;Jaffers et al.,Transplantation(1986),41:572;Shawler et al.,J.Immunol.(1985),135:1530;Sears et al.,J.Biol.Response Mod.(1984),3:138;Miller et al.,Blood(1983),62:988;Hakimi et al.,J.Immunol.(1991),147:1352;Reichmann et al.,Nature (1988),332:323;Junghans et al.,Cancer Res.(1990),50:1495。正如本文所述， 本发明提供了经人源化使得HAMA应答降低或消除的抗体。这些抗体的变体还可使用本领域已知的常规方法获得，其中有些在下文中有进一步描述。 

例如，来自本文所述抗体的氨基酸序列可充当框架和/或高变序列多样化的起始（亲本）序列。起始高变序列所连接的选定框架序列在本文中称为受体人框架。尽管受体人框架可来自或衍生自人免疫球蛋白（其VL和/或VH区），优选受体人框架来自或衍生自人共有框架序列，因为这样的框架已证实在人类患者中具有最小免疫原性或者没有免疫原性。 

当受体衍生自人免疫球蛋白时，可任选根据它与供体框架序列的同源性来选择人框架序列，即将供体框架序列与人框架序列集合中的各种人框架序列比对，并选择最具同源性的框架序列作为受体。 

在一个实施方案中，本文中的人共有框架来自或衍生自VH亚型III和/或VL κ亚型I共有框架序列。 

因此，VH受体人框架可包含一种、两种、三种或所有如下框架序列： 

包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:42)的FR1， 

包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:43)的FR2， 

包含RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:50)的FR3，其中X1是A或R，X2是T或N，而X3是A或L， 

包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:45)的FR4。 

VH共有框架的例子包括： 

人VH亚型I共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:19)； 

人VH亚型I共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:20-22)； 

人VH亚型II共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:23)； 

人VH亚型II共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:24-26)； 

人VH亚型III共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:27)； 

人VH亚型III共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:28-30)； 

人VH受体框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:31)； 

人VH受体框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:32-33)； 

人VH受体2框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO:34)；或 

人VH受体2框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO:35-37)。 

在一个实施方案中，VH受体人框架包含一种、两种、三种或所有如下框架序列： 

包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:42)的FR1， 

包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:43)的FR2， 

包含RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:51)、 

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA(SEQ ID NO:52)、 

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:53)、 

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS(SEQ ID NO:54)或 

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR(SEQ ID NO:55)的FR3， 

包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:45)的FR4。 

VL受体人框架可包含一种、两种、三种或所有如下框架序列： 

包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:46)的FR1， 

包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:47)的FR2， 

包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:48)的FR3， 

包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:49)的FR4。 

VL共有框架的例子包括： 

人VLκ亚型I共有框架(SEQ ID NO:38)； 

人VLκ亚型II共有框架(SEQ ID NO:39)； 

人VLκ亚型III共有框架(SEQ ID NO:40)；或 

人VLκ亚型IV共有框架(SEQ ID NO:41)。 

虽然受体可在序列上与选定的人框架序列相同，无论它是来自人免疫球蛋白或人共有框架，本发明设想了受体序列可包含相对于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列而言预先存在的氨基酸替代。这些预先存在的替代优选是最小限度的；通常只是相对于人免疫球蛋白序列或共有框架序列而言的四个、三个、两个或一个氨基酸差异。 

将非人抗体的高变区残基掺入VL和/或VH受体人框架。例如，可掺入对应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、Abm残基和/或接触残基的残基。任选的是，掺入如下延伸的高变区残基：24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。 

当本文中讨论高变区残基的“掺入”时，应当领会这可以各种方式实现，例如编码期望氨基酸残基的核酸可通过突变编码小鼠可变区序列的核酸使得其框架残基改变成受体人框架残基，或者通过突变编码人可变区序列的核酸使得高变区残基改变成非人残基，或者通过合成编码期望序列的核酸等等 而产生。 

在本文的实施例中，高变区移植变体是使用各个高变区的个别寡核苷酸通过编码人受体序列的核酸的Kunkel诱变而产生的。Kunkel et al.,Methods Enzymol.154:367-382(1987)。可利用常规技术在框架和/或高变区内引入合适的改变以纠正和重建正确的高变区－抗原相互作用。 

噬菌体（噬菌粒）展示（本文在有些内容中也称为噬菌体展示）可作为方便快捷的方法用于在通过序列随机化构建的文库中生成和筛选许多不同的潜在变体抗体。不过，熟练技术人员可利用其它方法来制备和筛选改变的抗体。 

噬菌体（噬菌粒）展示技术为生成和选择与配体诸如抗原结合的新蛋白质提供了有力的工具。噬菌体（噬菌粒）展示技术的使用使得能够构建大型蛋白质变体文库，可从中快速分拣以高亲和力与靶分子结合的那些序列。通常将编码变体多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白诸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已经开发出了其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码一部分基因III蛋白的核酸序列融合的单价噬菌粒展示系统(Bass,S.,Proteins,8:309(1990);Lowman and Wells,Methods:A Companion to Methods in Enzymology,3:205(1991))。在单价噬菌粒展示系统中，基因融合物以低水平表达，而且野生型基因III蛋白也表达，从而保留了粒子的侵染性。许多专利中已经公开了构建肽库和筛选那些文库的方法（例如美国专利5,723,286；美国专利5,432,018；美国专利5,580,717；美国专利5,427,908；和美国专利5,498,530）。 

已经以许多方式制备了抗体或抗原结合多肽文库，包括改变单个基因、插入随机DNA序列，或克隆一个家族的相关基因。美国专利5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727中记载了利用噬菌体（噬菌体粒）展示来展示抗体或抗原结合片段的方法。然后对文库筛选具期望特性的抗体或抗原结合蛋白的表达。 

本领域已经建立了在模板核酸中替代选定氨基酸的方法，其中有些在本文有描述。例如，可用Kunkel法替代高变区残基。参见例如Kunkel et al.,Methods Enzymol.154:367-382(1987)。 

寡核苷酸序列包含待改变高变区残基的一个或多个期望密码子集合。密码子集合是用于编码期望变体氨基酸的不同核苷酸三联体序列的集合。密码 子集合可用如下所示依照IUB密码指定特定核苷酸或等摩尔核苷酸混合物的符号来表示。 

IUB密码

G  鸟嘌呤 

A  腺嘌呤 

T  胸腺嘧啶 

C  胞嘧啶 

R  (A或G) 

Y  (C或T) 

M  (A或C) 

K  (G或T) 

S  (C或G) 

W  (A或T) 

H  (A或C或T) 

B  (C或G或T) 

V  (A或C或G) 

D  (A或G或T) 

N  (A或C或G或T) 

例如，在密码子集合DVK中，D可以是核苷酸A或G或T；V可以是A或G或C；而K可以是G或T。此密码子集合可呈现18种不同的密码子，而且可编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。 

寡核苷酸或引物集合可用标准方法合成。可通过例如固相合成来合成包含代表密码子集合所提供的核苷酸三联体所有可能组合且将编码期望氨基酸集合的序列的一套寡核苷酸。在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的。具有某些密码子集合的此类核苷酸集合可使用商品化核酸合成仪（可从例如Applied Biosystems,Foster City,CA购买）来合成，或者可通过商业途径获得（例如Life Technologies,Rockville,MD）。因此，具有特定密码子集合的合成寡核苷酸集合将通常包括具有不同序列的众多寡核苷酸，所述差异由整个序列内的密码子集合确定。依照本发明使用时，寡核苷酸具有能够与可变区核酸模板杂交的序列且还可包含用于 克隆目的的限制酶位点。 

在一种方法中，可通过寡核苷酸介导的诱变来产生编码变体氨基酸的核酸序列。此技术是本领域众所周知的，如Zoller et al.,Nucleic Acids Res.10:6487-6504(1987)中所述。简单的说，编码变体氨基酸的核酸序列是如下产生的，将编码期望密码子集合的寡核苷酸集合与DNA模板杂交，其中模板是包含可变区核酸模板序列的单链形式质粒。杂交后，用DNA聚合酶合成模板的完整第二条互补链，其由此将掺入寡核苷酸引物，并将含有寡核苷酸集合所提供的密码子集合。 

通常使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳寡核苷酸将有12至15个核苷酸与编码突变的核苷酸任一侧的模板完全互补。这确保了寡核苷酸将与单链DNA模板分子正确杂交。寡核苷酸易于使用本领域已知的技术合成，诸如Crea et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,75:5765(1978)中所述。 

DNA模板是由衍生自噬菌体M13载体（商品化M13mp18和M13mp19载体是合适的）的那些载体或如Viera et al.,Meth.Enzymol.,153:3(1987)中所述包含单链噬菌体复制起点的那些载体产生的。因此，为了产生单链模板，可将待突变的DNA插入这些载体之一。Sambrook等人（见上文）在第4.21-4.41节中记载了单链模板的产生。 

为了改变天然DNA序列，在合适的杂交条件下将寡核苷酸与单链模板杂交。然后加入DNA聚合酶，通常是T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段，以所述寡核苷酸作为合成的引物合成所述模板的互补链。由此形成异源双链体分子，其中DNA的一条链编码基因1的突变形式，另一条链（最初的模板）编码天然的、未改变的基因1序列。然后将此异源双链体分子转化到合适的宿主细胞中，通常是原核生物，诸如大肠杆菌JM101。培养细胞后，将它们涂布到琼脂糖平板上，并用32-磷酸盐放射性标记的寡核苷酸引物进行筛选，以鉴定包含突变DNA的细菌菌落。 

可修改上文刚刚描述的方法，以便产生其中质粒两条链均包含突变的同源双链体分子。修改如下：如上所述将单链寡核苷酸与单链模板退火。将三种脱氧核糖核苷酸：脱氧核糖腺苷酸(dATP)、脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)和脱氧核糖胸苷酸(dTT)的混合物与称为dCTP-(aS)（可从Amersham购买）的修饰硫代脱氧核糖胞苷酸混合。将此混合物加入模板-寡核苷酸复合物中。向此混合物中添加DNA聚合酶后，产生了除突变碱基外与模板相同的一条DNA 链。此外，这条新的DNA链将包含dCTP-(aS)替代dCTP，这用于保护它不受限制性内切核酸酶的消化。在用恰当的限制酶对双链异源双链体的模板链造成缺刻后，可用ExoIII核酸酶或其它适当的核酸酶消化模板链，越过包含待诱变位点的区域。然后终止反应，剩下只有部分是单链的分子。然后在存在所有四种脱氧核糖核苷三磷酸、ATP和DNA连接酶的条件下用DNA聚合酶形成完全是双链的DNA同源双链体。然后可将此同源双链体转化到合适的宿主细胞中。 

正如先前所指出的，寡核苷酸集合的序列在长度上足以与模板核酸杂交，而且还可以，但不是必需的，包含限制性位点。可由衍生自噬菌体M13载体或如Viera et al.,Meth.Enzymol.,153:3(1987)中所述包含单链噬菌体复制起点的载体的那些载体生成DNA模板。因此，为了生成单链模板，必须将待突变DNA插入这些载体之一。Sambrook等人（见上文）在第4.21-4.41节中记载了单链模板的产生。 

依照另一种方法，可如下构建文库，即提供上游和下游寡核苷酸集合，每个集合含有具不同序列的众多寡核苷酸，所述不同序列由寡核苷酸序列内所提供的密码子集合确定。上游和下游寡核苷酸集合，与可变区模板核酸序列一起，可用于聚合酶链式反应，以产生PCR产物“文库”。PCR产物可称为“核酸盒”，因为利用已建立的分子生物学技术，可将它们与其它相关或不相关的核酸序列融合，例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域。 

PCR引物序列包含高变区中溶剂可达且高度多样位置的一个或多个设定密码子集合。如上所述，密码子集合是用于编码期望变体氨基酸的不同核苷酸三联体序列的集合。 

通过适当的筛选/选择步骤选定的符合预期标准的抗体选出物(selectant)可使用标准重组技术进行分离和克隆。 

载体、宿主细胞和重组方法 

为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆（DNA扩增）或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序（如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针）。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核（通常是哺乳动物）起源的。 

使用原核宿主细胞生成抗体：

载体构建 

可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能（扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之）及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。 

一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。 

另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。 

本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游（5'）的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型和组成性。诱导型启动子指响应培养条件的变化（如营养物的存在与否或温度变化）而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。 

众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序 列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。 

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子（诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子）也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接（Siebenlist et al.,Cell 20:269(1980)）。 

在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。 

在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（如大肠杆菌trxB^-菌株）提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba and Pluckthun,Gene 159:203(1995)）。 

本发明提供了可调控所表达多肽构件的数量比率，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化的表达系统。这种调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。 

Simmons等人，美国专利5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核苷酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变 氨基酸序列的密码子变化（尽管优选核苷酸序列中的沉默变化）从而生成TIR变体。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”（即变化是沉默的）。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura et al.,METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158(1992)中详细记载了这种诱变方法。 

优选的是，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。 

适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌（Archaebacteria）和真细菌（Eubacteria），诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属（Escherichia）（如大肠埃希氏菌E.coli）、芽孢杆菌属（Bacillus）（如枯草芽孢杆菌B.subtilis）、肠杆菌属（Enterobacteria）、假单胞菌属（Pseudomonas）（如铜绿假单胞菌P.aeruginosa）物种、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形菌属（Proteus）、志贺氏菌属（Shigella）、根瘤菌属（Rhizobium）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、或副球菌属（Paracoccus）。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110（Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington,D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325）及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Ia lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kan^R的菌株33D3（美国专利号5,639,635）。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294（ATCC 31,446）、大肠杆菌B、大肠杆菌_λ1776（ATCC 31,537）和大肠杆菌RV308（ATCC 31,608）也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.,Proteins 8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中 的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。 

抗体生成 

用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。 

转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。 

在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。 

除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。 

在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。 

如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基（参见例如Simmons et al.,J.Immunol.Methods 263:133-147(2002)）。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。 

在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmotic shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。 

在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖（优选的碳源/能源）。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。 

在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度（如OD₅₅₀约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期）后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。 

为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG）或FkpA（具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式,反式-异构酶）的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.,J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美国专利6,083,715;Georgiou等人，美国专利6,027,888;Bothmann and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);Ramm and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arie et al.,Mol.Microbiol.39:199-210(2001)）。 

为了将所表达异源蛋白质（尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质）的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如 蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.,(1998)见上文;Georgiou等人，美国专利5,264,365;Georgiou等人，美国专利5,508,192;Hara et al.,Microbial Drug Resistance 2:63-72(1996)。 

在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。 

抗体纯化 

在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。 

在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureas）的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白A固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。 

作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。 

使用真核宿主细胞生成抗体：

载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。 

(i)信号序列构件 

在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。 

将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。 

(ii)复制起点 

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。 

(iii)选择基因构件 

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。 

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。 

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。 

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤（Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂）的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系（如ATCC CRL-9096）。 

或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源DHFR的野生型宿主）。参见美国专利4,965,199。 

(iv)启动子构件 

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。 

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒（诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如2型腺病毒）、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40)）基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子（如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。 

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载了该系统的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.,Nature 297:598-601(1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。 

(v)增强子元件构件 

常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因（球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子（bp100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。 

(vi)转录终止构件 

在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。 

(vii)宿主细胞的选择和转化 

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养（组织培养）中的繁 殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）、人胚肾系（293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59(1977)）、幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL 10）、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)）、小鼠塞托利(Sertoli)细胞（TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980)）、猴肾细胞（CV1，ATCC CCL 70）、非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL 1587）、人宫颈癌细胞（HELA，ATCCCCL 2）、犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL 34）、牛鼠(buffalo rat)肝细胞（BRL3A，ATCC CRL 1442）、人肺细胞（W138，ATCC CCL 75）、人肝细胞（HepG2，HB 8065）、小鼠乳瘤（MMT 060562，ATCC CCL 51）、TRI细胞（Mather et al.,Annals N.Y. Acad.Sci.383:44-68(1982)）、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系（Hep G2）。 

为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。 

(viii)宿主细胞的培养 

可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10（Sigma）、极限必需培养基（MEM，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基（DMEM，Sigma）适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO 87/00195;或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCIN^TM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。 

(ix)抗体的纯化 

在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。 

可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析（优选的纯化技术是亲和层析）来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体（Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3（Guss et al.,EMBO J.5:1567-1575(1986)）。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含C_H3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。 

在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度（如约0-0.25M盐）进行。 

活性测定法

可通过本领域知道的多种测定法对本发明的抗体鉴定它们的物理/化学特性和生物学功能。 

可通过一系列测定法进一步鉴定纯化的免疫球蛋白，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。 

在本发明的某些实施方案中，对本文在生成的免疫球蛋白分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试它们的抗原结合活性。本领域知道的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如 Western印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的任何直接或竞争性结合测定法。下文在实施例部分中提供了例示性的抗原结合测定法。 

在一个实施方案中，本发明设想了具有一些但非所有效应物功能的改良抗体，这使得它在抗体体内半衰期是重要的但某些效应物功能（诸如补体和ADCC）是不必要的或有害的许多应用中成为期望的候选物。在某些实施方案中，测量所生成免疫球蛋白的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定法以确认抗体缺乏FcγR结合（因此有可能缺乏ADCC活性）但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利5,500,362或5,821,337中记载了用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的。还可进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。还可使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定，例如实施例部分中所描述的。 

人源化抗体

本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化（Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988)），即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（美国专利4,816,567），其中显著少于完整的人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下 人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。 

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架（Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901(1987)）。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体（Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993)）。 

更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的牵涉对抗原结合的影响。 

抗体变体

一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽界面中包含修饰的抗体片段，其中该修饰推动和/促进异多聚化。这些修饰包括将突起导入第一Fc多肽和将腔导入第二Fc多肽，其中突起可位于腔中，从而促进第一和第二Fc多肽的复合。本领域知道生成具有这些修饰的抗体的方法，例如美国专利5,731,168中所述。 

在有些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。 可在制备序列时将氨基酸改变引入主题抗体氨基酸序列。 

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基（如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸）并用中性或带负电荷的氨基酸（最优选丙氨酸或多聚丙氨酸）替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。 

氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶（如用于ADEPT）或延长抗体血清半衰期的多肽融合。 

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也设想了FR改变。表2中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表2中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。 

表2 

对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如（折叠）片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，氨基酸可如下分组（A.L.Lehninger，《Biochemistry》，第2版，第73-75页，Worth Publishers，New York，1975）： 

(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M) 

(2)不带电荷、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q) 

(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E) 

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H) 

或者，根据共同的侧链特性，天然发生残基可如下分组： 

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； 

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； 

(3)酸性的：Asp、Glu； 

(4)碱性的：His、Lys、Arg； 

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro； 

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。 

非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。还可将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是引入剩余（非保守）位点。 

一类替代变体牵涉替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点（例如6-7个位点）突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。 

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离（在天然发生氨基酸序列变体的情况中），或者通过对较早制备的变体或非变异型式的抗体进行寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。 

可能希望在本发明免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置（包括铰链半胱氨酸）包含氨基酸修饰（如替代）的人Fc区序列（如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。 

依照此描述和本领域的教导，设想了在有些实施方案中，本发明方法中所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）改变（即或是增强或是削弱）的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它实例的Duncan and Winter,Nature 322:738-40(1988);美国专利5,648,260;美国专利5,624,821;及WO94/29351。 

免疫偶联物

本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（即放射偶联物）。 

抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递毒害细胞剂或抑制细胞试剂（即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物）的用途（Syrigos and Epenetos,Anticancer Research 19:605-614(1999);Niculescu-Duvaz and Springer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997);美国专利4,975,278）理论上能将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平（Baldwin et al.,Lancet 603-05(1986年5月15日);Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，在《Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985）。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略（Rowland et al.,Cancer Immunol.Immunother.21:183-87(1986)）。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)（Rowland et al.,1986,见上文）。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)（Mandler et al.,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000);Mandler et al.,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000);Mandler et al.,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002)）、美登木素生物碱类（EP 1391213;Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)）、和加利车霉素（Lode et al.,Cancer Res.58:2928(1998);Hinman et al.,Cancer Res.53:3336-3342(1993)）。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。 

（ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec）是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的¹¹¹In或⁹⁰Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶 联物（Wiseman et al.,Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77(2000)；Wiseman et al.,Blood 99(12):4336-42(2002);Witzig et al.,J.Clin.Oncol.20(10):2453-63(2002);Witzig et al.,J.Clin.Oncol.20(15):3262-69(2002)）。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG^TM（gemtuzumab ozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals），即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病（Drugs of the Future 25(7):686(2000);美国专利4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001）。Cantuzumab mertansine（Immunogen Inc.），即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704（Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.），即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96（对癌上的Lewis Y特异）和cAC10（对恶性血液肿瘤上的CD30特异）偶联（Doronina et al.,Nature Biotechnology 21(7):778-784(2003)），且正在进行治疗性开发。 

上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和 ¹⁸⁶Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚 氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。 

本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的偶联物。 

美登素和美登木素生物碱类

在一个实施方案中，本发明的抗体（全长或片段）与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。 

美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）分离得到（美国专利3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利4,151,042）。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533，明确将其公开内容收入本文作为参考。 

美登木素生物碱-抗体偶联物

在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途：美国专利5,208,020;5,416,064;及欧洲专利EP0425235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992)记载了其 中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x10⁵个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。 

抗体-美登木素生物碱偶联物（免疫偶联物）

抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。 

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1及Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。 

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)（Carlsson et al.,Biochem.J.173:723-737(1978)）和N-琥珀酰亚氨基 -4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。 

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。 

加利车霉素

另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296（都授予美国Cyanamid公司）。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁（Hinman et al.,Cancer Research 53:3336-3342(1993);Lode et al.,Cancer Research 58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利）。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。 

其它细胞毒剂

可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)（美国专利5,877,296）。 

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Pytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端 孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。 

本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物（如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。 

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振（NMR）成像（也称为磁共振成像，mri），诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。 

可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc^99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法（Fraker et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978)）可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》（Chatal,CRC Press,1989）详细记载了其它方法。 

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头（Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992);美国专利5,208,020）。 

本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化 （如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A.）的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB（琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯）。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第467-498页。 

抗体-药物偶联物的制备

在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。 

Ab-(L-D)_p            I 

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。 

还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰（醛和酮）基团，它可与药物上的适宜基团反应（Hermanson，Bioconjugate Techniques）。在另 一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛（Geoghegan&Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-146(1992);US 5362852）。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。 

同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。 

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。 

在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”（诸如链霉亲和素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（如放射性核苷酸）偶联的“配体”（如亲合素）。 

抗体衍生物

可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质部分。优选的是，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。 

药用配制剂 

可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明抗体的治疗用配制剂，以水溶液、冻干或其它干燥剂型的形式贮存（《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980）。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。 

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。 

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物传递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980。 

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。 

可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯（美国专利3,773,919）、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构 成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。 

用途 

本发明的抗体可用于例如体外、回体(ex vivo)和体内治疗方法。本发明的抗体可用作拮抗剂，在体外、离体和/或体内部分或完全阻断特异抗原活性。此外，至少有些本发明抗体可中和来自其它物种的抗原活性。因此，本发明的抗体可用于抑制特异抗原活性，例如在含有抗原的细胞培养物中、在人受试者中或在具有本发明抗体与之交叉反应的抗原的其它哺乳动物受试者（如黑猩猩、狒狒、狨猴、猕猴和恒河猴、猪或小鼠）中。在一个实施方案中，本发明的抗体可用于抑制抗原活性，即使抗体接触抗原，使得抗原活性受到抑制。优选的是，抗原是人蛋白质分子。 

在一个实施方案中，本发明的抗体可用于在患有某种紊乱的受试者中抑制抗原的方法，在所述紊乱中抗原活性是有害的，包括对受试者施用本发明的抗体，使得受试者中的抗原活性受到抑制。优选的是，抗原是人蛋白质分子且受试者是人受试者。或者，受试者可以是表达本发明抗体所结合的抗原的哺乳动物。又或者，受试者可以是其中导入了抗原（如通过施用抗原或通过表达抗原转基因）的哺乳动物。可出于治疗目的将本发明的抗体施用于人受试者。此外，可出于兽医目的将本发明的抗体施用于表达免疫球蛋白与之交叉反应的抗原的非人哺乳动物（如灵长类、猪或小鼠），或是人疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可用于评估本发明抗体的治疗功效（如测试施药的剂量和时程）。在治疗上有用的本发明阻断性抗体包括但不限于例如抗HER2、抗VEGF、抗IgE、抗CD11、抗干扰素和抗组织因子抗体。本发明的抗体可用于治疗、抑制、延迟其发展、预防/延迟其复发、改善、或预防与一种或多种抗原分子的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或状况，包 括但不限于恶性和良性肿瘤；非白血病性和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的紊乱；及炎性、血管发生性和免疫学紊乱。 

一方面，本发明的阻断性抗体对配体抗原特异，且通过阻断或干扰牵涉配体抗原的配体-受体相互作用来抑制抗原活性，由此抑制相应的信号途经和其它分子或细胞事件。本发明的特色还有受体特异抗体，它们不必阻止配体结合但干扰受体活化，由此抑制通常由配体结合启动的任何应答。本发明还涵盖优选或专门结合配体-受体复合物的抗体。本发明的抗体还可担当特定抗原受体的激动剂，由此加强、增强或激活配体介导的受体活化的全部或部分活性。 

在某些实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的抗体的免疫偶联物施用于患者。在有些实施方案中，免疫偶联物和/或它所结合的抗原由细胞内在化，导致免疫偶联物杀伤它所结合的靶细胞的治疗功效提高。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。此类细胞毒剂的实例包括本文所述任何化疗剂（诸如美登木素生物碱或加利车霉素）、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA内切核酸酶。 

在治疗中，本发明的抗体可单独使用，或是联合其它组合物。例如，本发明的抗体可与另一种抗体、化疗剂（包括化疗剂混合物）、其它细胞毒剂、抗血管发生剂、细胞因子、和/或生长抑制剂联合施用。当本发明的抗体抑制肿瘤生长时，可能特别希望将其联合一种或多种同样抑制肿瘤生长的其它治疗剂。例如，在例如治疗本文所述任何疾病的治疗方案中，包括结肠直肠癌、转移性乳癌和肾癌，可将本发明的抗体联合抗VEGF抗体（如AVASTIN）或抗ErbB抗体（如 

抗HER2抗体）。或者/另外，患者可接受联合放射疗法（如外部射束照射或使用放射性标记药剂诸如抗体的疗法）。上文所述此类联合疗法包括联合施药（当相同或分开配制剂中包含两种或多种药剂时）和分开施药，在后一种情况中，本发明抗体的施用可发生在附属疗法的施用之前和/或之后。 

可通过任何合适手段来施用本发明的抗体（和附属治疗剂），包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，以及损伤内（如果希望局部治疗的话）施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，脉冲输注抗体也是合适的，特别是抗体剂量衰减时。可通过任何合适路径服 药，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施药是短期的还是长期的。 

可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体紊乱、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、紊乱的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前用于预防或治疗所讨论紊乱的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的本发明抗体的量、紊乱或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99%。 

对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适宜剂量（在单独使用或联合其它药剂诸如化疗剂时）将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治疗将抗体施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至15mg/kg（如0.1mg/kg-10mg/kg）抗体，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。由此，可对患者施用约0.5mg/g、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg（或其任意组合）的一剂或多剂。这些剂量可间歇施用，例如每周或每三周（例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂抗体）。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周一剂约2mg/kg的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。 

制品 

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述紊乱的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料 制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口（例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它细胞毒剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二（或第三）容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。 

下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可实行多种其它实施方案。 

实施例

材料和方法 

残基编号依照Kabat（Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)）。使用了单字母氨基酸缩写。使用IUB代码代表DNA简并性（N=A/C/G/T,D=A/G/T,V=A/C/G，B=C/G/T,H=A/C/T,K=G/T,M=A/C,R=A/G，S=G/C,W=A/T，Y=C/T）。 

受体人共有框架上的直接高变区移植－用于此项工作的噬菌粒是具有在phoA启动子控制下的2个可读框的单价Fab-g3展示载体（pV0350-2B），基本上如Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-93(2004)中所述。第一个可读框由与受体轻链VL和CL结构域融合的stII信号序列组成，而第二个由与受体重链VH和CH1结构域融合的stII信号序列及随后的截短的次要噬菌体外壳蛋白P3组成。参见Lee et al.,见上文。 

将来自鼠5D5（参见杂交瘤5D5.11.6，ATCC保藏号HB-11895，保藏日1995年5月23日）的VL和VH结构域与人共有κI(huKI)和人亚型III共有VH(huIII)结构域进行比对。为了进行HVR移植，使用在3个位置：R71A、 N73T和L78A与人亚型III共有VH结构域不同的受体VH框架（Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)）。将来自鼠5D5(mu5D5)的高变区移植到受体人共有框架中以生成5D5的直接HVR移植物（5D5移植物)。在VL结构域中，将下列区域移植到人共有受体中：位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)。在VH结构域中，移植位置26-35(H1)、49-65(H2)和95-102(H3)（图1）。 

直接移植变体是通过Kunkel诱变生成的，对每个高变区使用了个别的寡核苷酸。通过DNA测序评估了正确克隆。 

高变区的模糊随机化－使用维持倾向于小鼠高变区序列趋势的模糊随机化(soft randomization)策略将序列多样性引入各个高变区。这是使用中毒寡核苷酸合成策略(poisoned oligonucleotide synthesis strategy)实现的，如Gallop et al.,J.Med.Chem.37:1233-1251(1994)所述。对于待突变高变区内的指定位置，用70-10-10-10的核苷酸混合物使编码野生型氨基酸的密码子中毒，导致各个位置的平均50%突变率。 

以模糊随机化寡核苷酸模仿鼠高变区序列，且涵盖由直接高变区移植物所限定的相同区域。通过使用密码子RGC将VH结构域中H2起始处（第49位）的氨基酸位置在序列多样性上限定为A、G、S或T。 

噬菌体文库的构建－将为各个高变区设计的随机化寡核苷酸集合分开在六份含660ng寡核苷酸、50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl₂、1mM ATP、20mM DTT和5U多核苷酸激酶的20μl反应液中于37℃磷酸化1小时。然后将这六份磷酸化寡核苷酸集合与20μg Kunkel模板在50mM Tris pH 7.5,10mM MgCl₂中混合，终体积500μl，导致寡核苷酸与模板的比率为3。将混合液在90℃退火4分钟，50℃5分钟，然后在冰上冷却。使用QIAQUICK PCR纯化试剂盒（Qiagen kit 28106）以改良方案清除过量的未退火寡核苷酸以防止已退火DNA的过度变性。向500μl退火混合液中加入150μl PB，并将混合液分到2个硅土柱上。用750μl PE清洗各个柱并将柱额外甩干后，用110μl10mM Tris,1mM EDTA,pH 8洗脱各个柱。然后将已退火并经清洗的模板（220μl）通过添加1μl 100mM ATP，10μl 25mM dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各25mM）,15μl 100mM DTT，25μl 10X TM缓冲液（0.5M Tris pH 7.5,0.1M MgCl₂)、2400U T4连接酶和30U T7聚合酶在室温补平3小时。 

在Tris-醋酸盐-EDTA/琼脂糖凝胶（Sidhu et al.,Methods in Enzymology  328:333-363(2000)）上分析补平产物。通常可见三条带：底部带是正确补平并连接的产物，中间带是补平但未连接的产物，而底部带是链置换产物。顶部带是由于T7聚合酶的内在副活性产生的，且难以避免（Lechner et al.,J.Biol.Chem.258:11174-11184(1983)）；然而，此带比底部带的转化效率低30倍，且通常对文库的贡献很小。中间带是由于缺乏用于最终连接反应的5'磷酸盐而造成的；此带高效转化且主要生成野生型序列。 

然后清洗补平产物并电穿孔进入SS320细胞，并在存在M13/KO7辅助噬菌体时繁殖，如Sidhu et al.,Methods in Enzymology 328:333-363(2000)所述。文库的大小在1-2x 10⁹个独立克隆的范围内。对起始文库的随机克隆进行测序以评估文库质量。 

噬菌体选择－制备人HGF受体并用作Fc融合物（HGFR-Fc）（Mark et al.,J.Biol.Chem.267:26166-26171(1992)）。以溶于PBS的5μg/ml HGFR-Fc包被到MaxiSorp微量滴定板（Nunc）上。对于第一轮选择，使用8个孔的靶物；单个孔的靶物用于连续多轮选择。将孔用酪蛋白封闭剂（Pierce）封闭1小时。从培养物上清液收获噬菌体并悬浮于含1%BSA和0.05% TWEEN20的PBS (PBSBT)。与孔结合2小时后，通过用含0.05% TWEEN 20的PBS(PBST)彻底清洗，清除未结合的噬菌体。通过将孔与50mM HCl,0.5M KCl一起保温30分钟,洗脱结合的噬菌体。使用Top10细胞和M13/KO7辅助噬菌体扩增噬菌体，在2YT，50μg/ml羧苄西林(carbenicillin)中于37℃培养过夜。将从靶物包被孔洗脱的噬菌体的滴度与从非靶物包被孔洗脱的噬菌体的滴度进行比较以评估富集程度。 

对于亲和力成熟，使用溶液分拣法分拣噬菌体文库。通过将500μl溶于PBS的3.6mg/ml HGFR-Fc和10μl 1M磷酸钾pH 8与20μl 4mMSulfo-NHS-LC-生物素（Pierce）混合使HFGR-Fc生物素化。使用PBS中的NAP5柱（Amersham Biosciences）纯化生物素化的HGFR-Fc (b-HGFR-Fc)。用溶于PBS的10μg/ml中性亲合素(neutravidin)将微量滴定孔于4℃包被过夜，然后用酪蛋白封闭剂（Pierce）封闭1小时。在第一轮淘选中，将200μl悬浮于含0.05% Tween 20(PBST)和1%BSA的PBS的噬菌体与10nMb-HGFR-Fc混合1小时。将与b-HGFR-Fc结合的噬菌体用中性亲合素包被的孔捕捉10分钟，而用PBST洗去未结合的噬菌体。用20mM HCl,500mMKCl对噬菌体洗脱45分钟，中和，并在XL1蓝色细胞(blue cells)（Stratagene） 中在存在KO7辅助噬菌体（New England Biolabs）时繁殖。除以下例外之外类似进行后续各轮分拣：第2轮中的b-HGFR-Fc终浓度是5.6nM，第3轮中b-HGFR-Fc终浓度是0.1nM，第4轮中b-HGFR-Fc终浓度是0.5nM并在用中性亲合素进行捕捉前向混合液中加入780nM未生物素化的HGFR-Fc达1小时。 

噬菌体ELISA－将MaxiSorp微量滴定板用溶于PBS的5μg/ml人HGFR-Fc包被过夜，然后用酪蛋白封闭剂封闭。将来自培养物上清液的噬菌体在组织培养微量滴定板中与在含1%BSA的PBST中连续稀释的HGFR-Fc一起保温1小时，然后将80μl混合液转移到靶物包被孔中达15分钟以捕捉未结合的噬菌体。用PBST洗板并加入偶联有HRP的抗M13（Amersham Pharmacia Biotech）（在含1%BSA的PBST中1:5000稀释）达40分钟。用PBST洗板，并通过加入四甲基联苯胺底物（Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD）来显色。将405nm处的吸光度作为溶液中靶物浓度的函数作图以确定IC₅₀。将这用作噬菌体表面上展示的Fab克隆的亲和力估算值。 

Fab制备和亲和力测定－为了表达Fab蛋白用于亲和力测量，在噬菌体展示载体的重链和g3之间引入一个终止密码子。将克隆转化到大肠杆菌34B8细胞中并在AP5培养基中于30℃培养（Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)）。通过离心收获细胞，悬浮于10mM Tris,1mM EDTA pH 8，并用微量流化仪(microfluidizer)破开。通过蛋白G亲和层析纯化Fab。 

使用BIAcore^TM-2000通过表面等离振子共振进行亲和力测定。将HGFR-Fc固定（约1000个反应单位(RU)）到CM5芯片上，并注入溶于PBST的不同浓度Fab（4-500nM）。每次注射后，用100mM HCl使芯片再生。通过扣除来自空白流动池(blank flow cell)的RU校正结合应答。将同时拟合k_on和k_off的1:1 Languir模型用于动力学分析。 

OA5D5阻断HGF/cMet结合的电-化学发光测定法 

使用生物素-X-NHS（Research Organics,Cleveland,OH）通过与20倍摩尔过量的溶于0.1M NaHCO₃,pH 8.5的NHS-X-生物素一起保温将Genentech（South San Francisco,CA）所生产的经纯化cMet-Ig蛋白生物素化。用BV-TAG（产品目录编号110034）通过NHS-酯化学依照制造商的说明书（Bio Veris International,Gaithersburg,MD）标记Genentech所生产的经纯化人2链HGF。cMet-Ig-生物素（500ng/mL）、HGF-钌标签（250ng/mL）和抗 体滴度范围3333-0.21nM的OA5D5抗体在100μl体积的测定稀释液：PBS+0.5% BSA/0.5% Tween 20/0.033% Proclin（Supelco Inc.Bellefonte PA）中一起保温。将混合液在密封的聚丙烯圆底96孔板（Corning）中于室温震荡保温2-4小时。加入链霉亲和素磁珠（Dynabeads,BioVeris）。最后45分钟保温剧烈摇动后，使用Bio Veris M系列仪器（BioVeris International,Gaithersburg,MD）对平板进行读数。 

KIRA（HGF依赖性Met磷酸化） 

在生长培养基（含10%胎牛血清（FBS,Sigma,St.Louis,MO）的Ham’sF12/DMEM 50:50[Gibco,Grand Island,NY])中维持A549细胞（ATCC,Manassas,VA）。为了制备用于测定的细胞，将培养至汇合的细胞用Accutase（ICN,Aurora,OH）脱离并以每孔50,000个细胞的密度接种到96孔板中。37℃培养过夜后，除去生长培养基并使细胞在含0.1% FBS的培养基中血清饥饿处理30-60分钟。为了测定OA-5D5抑制cMet磷酸化的能力，将该分子在培养基+0.1% FBS中连续稀释，从200nM至0.19nM并加到测定板中。37℃保温15分钟后，加入HGF（50ng/ml）。然后将板于37℃另外保温10分钟，除去培养基并加入细胞裂解缓冲液（Cell Signaling Technologies,Cat#9803,Beverly,MA；补充了蛋白酶抑制剂混合物，购自Calbiochem,Cat#539131,San Diego,CA）。通过电化学发光测定法使用BioVeris M系列仪器（BioVeris International,Gaithersburg,MD）对裂解物分析磷酸化c-Met。用BV-TAG通过NHS-酯化学依照制造商的说明书（Bio Veris）标记抗磷酸酪氨酸mAb（克隆4G10,Upstate,Lake Placid,MY）。用生物素-X-NHS（Research Organics,Cleveland,OH）将针对c-Met胞外域的抗体生物素化。将BV-TAG标记的4G10和生物素化的抗c-Met mAb在测定缓冲液（PBS/0.5% Tween-20/0.5% BSA）中稀释并作为混合液加到细胞裂解物中。于室温剧烈摇动保温1.5-2小时后，加入链霉亲和素磁珠（Dynabeads,Bio Veris）。最终45分钟保温后，在Bio Veris仪器上对平板进行读数。 

细胞培养和增殖测定法 

BaF3是通常不表达cMet且不响应HGF的鼠IL-3依赖性淋巴样细胞。然而，在通过用人c-Met的正常全长cDNA转染而衍生的BaF3-hMet中（Schwall et al.,J.Cell Biol.133:709-718(1996)），HGF刺激在缺乏IL-3时增殖和存活。将BaF3-hMet和BaF3-neo细胞在RPMI 1640,5%胎牛血清,4μl/L β- 巯基乙醇,100U/ml青霉素,100μg/ml硫酸链霉素,2mM L-谷氨酰胺和5%WEHI条件培养基中常规传代，作为IL-3的来源。为了测量HGF依赖性增殖，通过加入25μl Alarma Blue（Trek Diagnostic Systems;Cleveland,OH）并在6小时后测量荧光强度对处理3天后的细胞数进行量化。对照实验是这些细胞在缺乏HGF时的增殖。将H358-PSF2和HGF-PSF8细胞在RPMI 1640,10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml硫酸链霉素,2mM L-谷氨酰胺中传代。测定培养基是RPMI 1640分别加0.1%、0.5%BSA或10% FBS。测定如上所述进行。 

免疫沉淀和Western印迹 

H358细胞是衍生自人非小细胞肺癌(NSCLC)的细胞系。H358-PSF2、H358-PSF8细胞是人HGF稳定转染的H358细胞（Tsao et al.,Neoplasia,Vol.2,No.3,2000），在RPMI 1640,10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml硫酸链霉素,2mM L-谷氨酰胺中培养。cMet酪氨酸磷酸化检测基本上如前所述进行（Zioncheck,J Bio Chem 270(28):16871-8,1995）。简而言之，将细胞涂布于60mm平板上过夜，将培养基换成含0.5% BSA的RPMI 1640，之后加入有或无1nM HGF或竞争物OA5D5.v2抗体的组合。37℃ 10分钟后，除去培养基并用裂解缓冲液（150mM NaCl,1.5mM MgCl₂,1% Triton X-100,1x蛋白酶抑制剂混合物,1x磷酸酶抑制剂混合物（Sigma,St.Louis,MO））裂解细胞。甩动(spinning)后，将裂解物上清液与结合至蛋白G-Sepharose的抗cMetIgG多克隆抗体（c-28;Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA）一起于4℃保温1小时。清洗免疫复合物并在1x样品缓冲液中煮沸，之后通过SDS-PAGE分开并电印迹至硝酸纤维素上。用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10;Upstate Biotechnology,Waltham,MA）及随后偶联有HRP的山羊抗小鼠Fab（1∶10,000;Jackson Labs,West Grove,PA）使含磷酸酪氨酸的蛋白质显现，在总cMet的情况中，使用c-28抗体（1:400;Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA）及随后的山羊抗兔Fc-HRP（1:10,000;Jackson Labs,West Grove,PA），并通过化学发光进行检测。 

肿瘤异种移植研究 

用5百万KP4胰腺癌细胞皮下接种无胸腺雌性小鼠。当肿瘤达到150-200mm³时，将小鼠分成两组，每组10只。第1组每周两次IP注射载体。第2组每周两次IP注射30mg/kg OA5D5.v2。每周两次测量肿瘤大小。 当肿瘤体积超过起始肿瘤体积两倍时，或者如果肿瘤溃烂时处死小鼠。结果和讨论 

5D5的人源化－用于5D5人源化的人受体框架包含共有人κI VL结构域和人亚型III共有VH结构域的变体。变体VH结构域与人共有序列具有3处改变：R71A、N73T和L78A。将鼠5D5的VL和VH结构域与人κI和亚型III结构域进行比对；鉴定各个HVR，然后移植到人受体框架中以生成可作为Fab展示在噬菌体上的5D5移植物。在对展示5D5移植物的噬菌体测试与固定化HGFR-Fc的结合时，未观察到结合。 

构建了其中5D5移植物的每个HVR区进行了模糊随机化的文库。淘选此文库，即对固定化HGFR-Fc进行4轮选择。挑选克隆进行DNA序列分析并揭示出选择了单一克隆。此克隆在VH结构域第94位有单一改变（R94S），恰好在诱变所针对的HVR-H3预期区域之外。通过噬菌体ELISA对此克隆的分析表明它具有与鼠5D5单价亲和力相似的亲和力。当作为Fab表达并通过Biacore测试时，Kd测定为9.8nM，比较而言鼠5D5的单价亲和力为8.3nM。因此，此未预料到的替代恢复了5D5移植物的全部结合亲和力，而5D5移植物加R94S（hu5D5.v1）代表完全人源化抗体。有趣的是，在鼠抗体的此位置发现了同源氨基酸苏氨酸。MacCallum等人（MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)）分析了抗体和抗原复合物的晶体结构，发现重链的第93和94位是接触区的一部分，因此在人源化抗体时H3高变区(HVR-H3)的定义中包括这些位置似乎是合理的。 

hu5D5.v1的亲和力成熟－为了提高hu5D5.v1的亲和力，在hu5D5.v1的背景中构建了六个噬菌体展示文库，各自针对单一HVR进行模糊随机化。为了避免从可能的高背景野生型模板中重新选择hu5D5.v1，在构建各个文库之前在待突变HVR中引入了终止密码子。使用溶液分拣法来增强基于亲和力的噬菌体选择过程的效率。通过操作生物素化靶物浓度、缩短噬菌体捕捉时间以降低背景、和加入未生物素化靶物以消除具有较快解离速率的克隆，可熟练的选择高亲和力克隆。Lee et al.,见上文。自第一轮选择起就观察到富集（靶物依赖性噬菌体捕捉），表明各个文库中存在对HGFR-Fc具有相当高亲和力的很多克隆。在后续各轮中提高选择的严谨性（见上文方法），并在第3轮时将所有6个文库组合起来以产生第7个文库集合。经过4轮选择后，分析来自7个文库集合中每一个的克隆。针对HVR-L1和HVR-L3的文 库中的所有克隆与hu5D5.v1是相同的；然而，在针对HVR-L2、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的文库中观察到新的序列（图2）。由所有6个文库的组合组成的文库集合以来自HVR-H3文库的序列占优势，表明这些序列使得对HGFR-Fc的亲和力得到最大的提高（图3）。通过噬菌体ELISA筛选选定的克隆，然后作为Fab蛋白表达并使用Biacore测定其亲和力。来自组合文库、在HVR-H3中有改变的数个克隆具有与hu5D5.v1或鼠5D5单价亲和力相比有所提高的亲和力（图4）。这些克隆或者在第94位具有S/T，或者在第96位具有R/S及第100位具有T/S及第100a位具有P/S/A。最好的克隆，克隆78（hu5D5.v2）相对于hu5D5.v1而言有3个改变（94T、96R和100T），且亲和力提高了13倍。 

因此，从将6个小鼠5D5HVR移植到人受体骨架中起，延伸HVR-H3以包括第94位（苏氨酸）并在HVR-H3中添加两个改变导致完全人的5D5抗体对HGFR的结合亲和力至少提高13倍。此外，本文描述的选定的人源化抗体经测定具有至少与亲本5D5抗体可比的生物学活性，例如在受体磷酸化测定法等中（数据未显示）。 

本发明抗体的鉴定–鉴定了“单臂”（也称为“OA”）抗Met抗体。测试了本发明的两种抗体。具体而言，“OA-5D5.v2”抗体包含单一Fab臂，它包含图13中所示可变区序列，其中Fab臂与Fc区融合，且其中Fc区是包含图13中所示Fc序列的Fc多肽与包含图14中所示Fc序列的Fc多肽之间的复合物。抗体鉴定如下： 

(1)在测试OA-5D5.v2阻断HGF结合其受体的能力的测定法中，OA-5D5.v2至少能够像两种参比抗体－即嵌合单臂抗体（它包含与人Fc区融合的来自鼠亲本5D5抗体（图7中所示可变区）的Fab臂），及本发明的另一抗体（OA-5D5.v1）那样阻断HGF结合其受体。在跨越抗体浓度范围大约3333至0.21nM测试时，在上文材料和方法部分所述条件下，发现OA-5D5.v2的IC50值小于参比抗体诸如嵌合单臂抗体和OA-5D5.v1该数值的大约一半。特别是，OA-5D5.v1还以比参比嵌合抗体更好的IC50进行阻断。参见图8。 

(2)在测试OA-5D5.v2抑制HGF受体活化的能力的测定法中，OA-5D5.v2至少能够像上文(1)中所述两种参比抗体那样抑制激酶受体活化。在跨越抗体浓度范围大约200至0.19nM测试时，在上 文材料和方法部分所述条件下，发现OA-5D5.v2的IC50小于参比抗体诸如嵌合单臂抗体和OA-5D5.v1该数值的大约一半。参见图9。   (3)还对OA-5D5.v2测试了在人、灵长类（猕猴）、犬科动物和鼠科动物（小鼠）间的跨物种结合。发现OA-5D5.v2特异性结合人和灵长类（猕猴）HGF受体，但不结合犬科动物和鼠科动物（小鼠）。（数据未显示。） 

(4)还对OA-5D5.v2测试了在存在HGF时抑制细胞增殖的能力。如图10所示，OA-5D5.v2至少能够像其嵌合抗体对应物和OA-5D5.v1（如上文(1)所述）那样抑制细胞增殖。在跨越抗体浓度范围大约0.01至100nM测试时，在上文材料和方法部分所述条件下，发现OA-5D5.v2的IC50值小于参比抗体诸如嵌合单臂抗体和OA-5D5.v1该数值的大约一半。参见图10。通过FACs分析证实了OA-5D5.v2与Met转染细胞的特异结合。（数据未显示。） 

(5)对OA-5D5.v2测试了在存在HGF时抑制受体酪氨酸磷酸化的能力。如图11A和11B所示，在抗体浓度范围大约10至1000nM测试时，OA-5D5.v2抑制受体酪氨酸磷酸化。参见图11A和11B。 

(6)使用基于胰腺肿瘤细胞系（KP4）的肿瘤异种移植物模型对OA-5D5.v2测试了体内功效。来自此功效研究的结果显示OA-5D5.v2抗体能够在体内抑制肿瘤和引起肿瘤消退。如图12所示，在大多数用此抗体治疗的动物中肿瘤完全消失。 

部分参考文献 

Angeloni,D.,Danilkovitch-Miagkova,A.,Miagkov,A.,Leonard,E.J.,and Lerman,M.I.(2003).The soluble sema domain of the Ron receptor inhibits MSP-induced receptor activation.J Biol Chem. 

Antipenko,A.,Himanen,J.P.,van Leyen,K.,Nardi-Dei,V.,Lesniak,J.,Barton,W.A.,Rajashankar，K.R.,Lu,M.,Hoemme,C.,Puschel,A.W.,and Nikolov,D. 

B.(2003).Structure of the semaphorin-3A receptor binding module.Neuron 39,589-598. 

Bardelli,A.,Longati,P.,Gramaglia,D.,Stella,M.C.,and Comoglio,P.M.(1997).Gab 1coupling to the HGF/Met receptor multifunctional docking site requires binding  of Grb2 and correlates with the transforming potential.Oncogene 15,3103-3111. 

Bertotti,A.,and Comoglio,P.M.(2003).Tyrosine kinase signal specificity:lessons from the HGF receptor.Trends Biochem Sci 28,527-533. 

Bladt,F.,Riethmacher,D.,Isenmann,S.,Aguzzi,A.,and Birchmeier，C.(1995).Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud.Nature 376,768-771. 

Blechman,J.M.,Lev,S.,Barg,J.,Eisenstein,M.,Vaks,B.,Vogel,Z.,Givol,D.,and Yarden,Y.(1995).The fourth immunoglobulin domain of the stem cell factor receptor couples ligand binding to signal transduction.Cell 80,103-113.Boix,L.,Rosa,J.L.,Ventura,F.,Castells,A.,Bruix,J.,Rodes,J.,and Bartrons,R.(1994).c-met mRNA overexpression in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 19,88-91. 

Bottaro,D.P.,Rubin,J.S.,Faletto,D.L.,Chan,A.M.,Kmiecik,T.E.,Vande Woude,G.F.,and Aaronson,S.A.(1991).Identification ofthe hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product.Science 251,802-804. 

Bussolino,F.,Di Renzo,M.F.,Ziche,M.,Bocchietto,E.,Olivero,M.,Naldini,L.,Gaudino,G.,Tamagnone,L.,Coffer,A.,and Comoglio,P.M.(1992). 

Hepatocyte growth factor is a potent angiogenic factor which stimulates endothelial cell motility and growth.J Cell Biol 119,629-641. 

Coltella,N.,Manara,M.C.,Cerisano,V.,Trusolino,L.,Di Renzo,M.F.,Scotlandi,K.,and Ferracini,R.(2003).Role of the MET/HGF receptor in proliferation and invasive behavior of osteosarcoma.Faseb J 17,1162-1164.Cooper,C.S.,Park,M.,Blair,D.G.,Tainsky,M.A.,Huebner，K.,Croce,C.M.,and Vande Woude,G.F.(1984).Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line.Nature 311,29-33. 

Di Renzo,M.F.,Olivero,M.,Giacomini,A.,Porte,H.,Chastre,E.,Mirossay,L.,Nordlinger，B.,Bretti,S.,Bottardi,S.,Giordano,S.,and et al.(1995).Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer.Clin Cancer Res 1,147-154. 

Ferguson,K.M.,Berger,M.B.,Mendrola,J.M.,Cho,H.S.,Leahy,D.J.,and Lemmon,M.A.(2003).EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibit ectodomain dimerization.Mol Cell 11,507-517. 

Furge,K.A.,Zhang,Y.W.,and Vande Woude,G.F.(2000).Met receptor tyrosine kinase:enhanced signaling through adapter proteins.Oncogene 19,5582-5589.Garrett,T.P.,McKern,N.M.,Lou,M.,Elleman,T.C.,Adams,T.E.,Lovrecz,G.O.,Zhu,H.J.,Walker，F.,Frenkel,M.J.,Hoyne,P.A.,et al.(2002).Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain  bound to transforming growth factor alpha.Cell 110,763-773. 

Gherardi,E.,Youles,M.E.,Miguel,R.N.,Blundell,T.L.,Iamele,L.,Gough,J.,Bandyopadhyay,A.,Hartmann,G.,and Butler,P.J.(2003).Functional map and domain structure of MET,the product of the c-met protooncogene and receptor for hepatocyte growth factor/scatter factor.Proc Natl Acad Sci U S A. 

Giancotti,F.G.,and Ruoslahti,E.(1999).Integrin signaling.Science 285,1028-1032. 

Giordano,S.,Corso,S.,Conrotto,P.,Artigiani,S.,Gilestro,G.,Barberis,D.,Tamagnone,L.,and Comoglio,P.M.(2002).The semaphorin 4D receptor controls invasive growth by coupling with Met.Nat Cell Biol4,720-724.Giordano,S.,Di Renzo,M.F.,Narsimhan,R.P.,Cooper,C.S.,Rosa,C.,and Comoglio,P.M.(1989).Biosynthesis of the protein encoded by the c-met proto-oncogene.Oncogene 4,1383-1388. 

Giordano,S.,Maffe,A.,Williams,T.A.,Artigiani,S.,Gual,P.,Bardelli,A.,Basilico,C.,Michieli,P.,and Comoglio,P.M.(2000).Different point mutations in the met oncogene elicit distinct biological properties.Faseb J 14,399-406.Hamanoue,M.,Takemoto,N.,Matsumoto,K.,Nakamura,T.,Nakajima,K.,and Kohsaka,S.(1996).Neurotrophic effect of hepatocyte growth factor on central nervous system neurons in vitro.J Neurosci Res 43,554-564. 

Hartmann,G.,Weidner,K.M.,Schwarz,H.,and Birchmeier,W.(1994).The motility signal of scatter factor/hepatocyte growth factor mediated through the receptor tyrosine kinase met requires intracellular action of Ras.J Biol Chem 269,21936-21939. 

Jeffers,M.,Rong,S.,and Vande Woude,G.F.(1996).Enhanced tumorigenicity and invasion-metastasis by hepatocyte growth factor/scatter factor-met signalling in human cells concomitant with induction of the urokinase proteolysis network.Mol Cell Biol 16,1115-1125. 

Jeffers,M.,Schmidt,L.,Nakaigawa,N.,Webb,C.P.,Weirich,G.,Kishida,T.,Zbar,B.,and Vande Woude,G.F.(1997).Activating mutations for the met tyrosine kinase receptor in human cancer.Proc Natl Acad Sci U S A 94,11445-11450. 

Jin,L.,Fuchs,A.,Schnitt,S.J.,Yao,Y.,Joseph,A.,Lamszus,K.,Park,M.,Goldberg,I.D.,and Rosen,E.M.(1997).Expression of scatter factor and c-met receptor in benign and malignant breast tissue.Cancer 79,749-760.Kuniyasu,H.,Yasui,W.,Yokozaki,H.,Kitadai,Y.,and Tahara,E.(1993).Aberrant expression of c-met mRNA in human gastric carcinomas.Int J Cancer  55,72-75. 

Lev,S.,Yarden,Y.,and Givol,D.(1992).A recombinant ectodomain of the receptor for the stem cell factor (SCF)retains ligand-induced receptor dimerization and antagonizes SCF-stimulated cellular responses.J Biol Chem 267,10866-10873. 

Liu,C.,Park,M.,and Tsao,M.S.(1992).Overexpression of c-met proto-oncogene but not epidermal growth factor receptor or c-erbB-2in primary human colorectal carcinomas.Oncogene 7,181-185. 

Lokker，N.A.,Mark,M.R.,Luis,E.A.,Bennett,G.L.,Robbins,K.A.,Baker,J.B.,and Godowski,P.J.(1992).Structure-function analysis of hepatocyte growth factor :identification of variants that lack mitogenic activity yet retain high affinity receptorbinding.Embo J 11,2503-2510. 

Lorenzato,A.,Olivero,M.,Patane,S.,Rosso,E.,Oliaro,A.,Comoglio,P.M.,and Di Renzo,M.F.(2002).Novel somatic mutations of the MET oncogene in human carcinoma metastases activating cell motility and invasion.Cancer Res 62,7025-7030. 

Love,C.A.,Harlos,K.,Mavaddat,N.,Davis,S.J.,Stuart,D.I.,Jones,E.Y.,and Esnouf，R.M.(2003).The ligand-binding face of the semaphorins revealed by the high-resolution crystal structure of SEMA4D.Nat Struct Biol 10,843-848. 

Maina,F.,Casagranda,F.,Audero,E.,Simeone,A.,Comoglio,P.M.,Klein,R.,and Ponzetto,C.(1996).Uncoupling of Grb2 from the Met receptor in vivo reveals complex roles in muscle development.Cell 87,531-542. 

Matsumoto,K.,and Nakamura,T.(1993).Roles of HGF as a pleiotropic factor in organ regeneration.Exs 65,225-249. 

Maulik,G.,Shrikhande,A.,Kijima,T.,Ma,P.C.,Morrison,P.T.,and Salgia,R.(2002).Role of the hepatocyte growth factor receptor，c-Met,in oncogenesis and potential for therapeutic inhibition.Cytokine Growth Factor Rev 13,41-59. 

Meiners,S.,Brinkmann,V.,Naundorf，H.,and Birchmeier，W.(1998).Role of morphogenetic factors in metastasis of mammary carcinoma cells.Oncogene 16,9-20. 

Morello,S.,Olivero,M.,Aimetti,M.,Bernardi,M.,Berrone,S.,Di Renzo,M.F.,and Giordano,S.(2001).MET receptor is overexpressed but not mutated in oral squamous cell carcinomas.J Cell Physiol 189,285-290. 

Naka,D.,Ishii,T.,Yoshiyama,Y.,Miyazawa,K.,Hara,H.,Hishida,T.,and Kidamura,N.(1992).Activation of hepatocyte growth factor by proteolytic conversion of a single chain form to a heterodimer.J Biol Chem 267, 20114-20119. 

Naldini,L.,Weidner，K.M.,Vigna,E.,Gaudino,G.,Bardelli,A.,Ponzetto,C., 

Narsimhan,R.P.,Hartmann,G.,Zarnegar,R.,Michalopoulos,G.K.,and et al.(1991).Scatter factor and hepatocyte growth factor are indistinguishable ligands for the MET receptor.Embo J 10,2867-2878. 

Natali,P.G.,Prat,M.,Nicotra,M.R.,Bigotti,A.,Olivero,M.,Comoglio,P.M.,and Di Renzo,M.F.(1996).Overexpression of the met/HGF receptor in renal cell carcinomas.Int J Cancer 69,212-217. 

Nguyen,L.,Holgado-Madruga,M.,Maroun,C.,Fixman,E.D.,Kamikura,D.,Fournier，T.,Charest,A.,Tremblay,M.L.,Wong,A.J.,and Park,M.(1997).Association of the multisubstrate docking protein Gab 1with the hepatocyte growth factor receptor requires a functional Grb2 binding site involving tyrosine 1356.J Biol Chem 272,20811-20819. 

Nusrat,A.,Parkos,C.A.,Bacarra,A.E.,Godowski,P.J.,Delp-Archer,C.,Rosen,E.M.,and Madara,J.L.(1994).Hepatocyte growth factor/scatter factor effects on epithelia.Regulation of intercellular junctions in transformed and nontransformed cell lines,basolateral polarization of c-met receptor in transformed and natural intestinal epithelia,and induction of rapid wound repair in a transformed model epithelium.J Clin Invest 93,2056-2065. 

Ogiso,H.,Ishitani,R.,Nureki,O.,Fukai,S.,Yamanaka,M.,Kim,J.H.,Saito,K.,Sakamoto,A.,Inoue,M.,Shirouzu,M.,and Yokoyama,S.(2002).Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains.Cell 110,775-787. 

Olivero,M.,Rizzo,M.,Madeddu,R.,Casadio,C.,Pennacchietti,S.,Nicotra,M.R.,Prat,M.,Maggi,G.,Arena,N.,Natali,P.G.,et al.(1996).Overexpression and activation of hepatocyte growth factor/scatter factor in human non-small-cell lung carcinomas.Br J Cancer 74,1862-1868. 

Olivero,M.,Valente,G.,Bardelli,A.,Longati,P.,Ferrero,N.,Cracco,C.,Terrone,C.,Rocca-Rossetti,S.,Comoglio,P.M.,and Di Renzo,M.F.(1999).Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family.Int J Cancer82,640-643. 

Orian-Rousseau,V.,Chen,L.,Sleeman,J.P.,Herrlich,P.,and Ponta,H.(2002).CD44 is required for two consecutive steps in HGF/c-Met signaling.Genes Dev 16,3074-3086. 

Park,M.,Dean,M.,Cooper，C.S.,Schmidt,M.,O'Brien,S.J.,Blair，D.G.,and Vande Woude,G.F.(1986).Mechanism of met oncogene activation.Cell 45,895-904. 

Peek,M.,Moran,P.,Mendoza,N.,Wickramasinghe,D.,and Kirchhofer,D.(2002).Unusual proteolytic activation of pro-hepatocyte growth factor by plasma kallikrein and coagulation factor XIa.J Biol Chem 277,47804-47809.Pelicci,G.,Giordano,S.,Zhen,Z.,Salcini,A.E.,Lanfrancone,L.,Bardelli,A.,Panayotou,G.,Waterfield,M.D.,Ponzetto,C.,Pelicci,P.G.,and et al.(1995). 

The motogenic and mitogenic responses to HGF are amplified by the Shc adaptor protein.Oncogene 10,1631-1638. 

Plotnikov,A.N.,Schlessinger,J.,Hubbard,S.R.,and Mohammadi,M.(1999). 

Structural basis for FGF receptor dimerization and activation.Cell 98,641-650. 

Ponzetto,C.,Bardelli,A.,Zhen,Z.,Maina,F.,dalla Zonca,P.,Giordano,S., 

Graziani,A.,Panayotou,G.,and Comoglio,P.M.(1994).A multifunctional docking site mediates signaling and transformation by the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor family.Cell 77,261-271. 

Ponzetto,C.,Zhen,Z.,Audero,E.,Maina,F.,Bardelli,A.,Basile,M.L.,Giordano,S.,Narsimhan,R.,and Comoglio,P.(1996).Specific uncoupling of GRB2 from the Met receptor.Differential effects on transformation and motility.J Biol Chem 271,14119-14123. 

Robertson,S.C.,Tynan,J.A.,and Donoghue,D.J.(2000).RTK mutations and human syndromeswhen good receptors turn bad.Trends Genet 16,265-271. 

Royal,I.,and Park,M.(1995).Hepatocyte growthfactor-induced scatter of Madin-Darby canine kidney cells requires phosphatidylinositol 3-kinase.J Biol Chem 270,27780-27787. 

Schmidt,C.,Bladt,F.,Goedecke,S.,B rinkmann,V.,Zschiesche,W.,Sharpe,M.,Gherardi,E.,and Birchmeier，C.(1995).Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development.Nature 373,699-702. 

Schmidt,L.,Duh,F.M.,Chen,F.,Kishida,T.,Glenn,G.,Choyke,P.,Scherer,S.W.,Zhuang,Z.,Lubensky,I.,Dean,M.,etal.(1997).Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas.Nat Genet 16,68-73. 

Schmidt,L.,Junker，K.,Nakaigawa,N.,Kinj erski,T.,Weirich,G.,Miller,M.,Lubensky,I.,Neumann,H.P.,Brauch,H.,Decker,J.,et al.(1999).Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas.Oncogene 18,2343-2350. 

Suzuki,K.,Hayashi,N.,Yamada,Y.,Yoshihara,H.,Miyamoto,Y.,Ito,Y.,Ito,T.,Katayama,K.,Sasaki,Y.,Ito,A.,and et al.(1994).Expression of the c-met protooncogene in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 20,1231-1236. 

Tamagnone,L.,Artigiani,S.,Chen,H.,He,Z.,Ming,G.I.,Song,H.,Chedotal,A.,Winberg,M.L.,Goodman,C.S.,Poo,M.,etal.(1999).Plexins are a large family of receptors for transmembrane,secreted,and GPI-anchored semaphorins in vertebrates.Cell 99,71-80. 

Tempest,P.R.,Stratton,M.R.,and Cooper，C.S.(1988).Structure of the met protein and variation of met protein kinase activity among human tumour cell lines.Br J Cancer 58,3-7. 

Trusolino,L.,Bertotti,A.,and Comoglio,P.M.(2001).A signaling adapter function for alpha6beta4 integrin in the control of HGF-dependent invasive growth.Cell 107,643-654. 

Uehara,Y.,Minowa,O.,Mori,C.,Shiota,K.,Kuno,J.,Noda,T.,and Kitamura,N.(1995).Placental defect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor.Nature 373,702-705. 

Van Vactor，D.V.,and Lorenz,L.J.(1999).Neural development:The semantics of axon guidance.Curr Biol 9,R201-204. 

Weidner,K.M.,Di Cesare,S.,Sachs,M.,Brinkmann,V.,Behrens,J.,and Birchmeier,W.(1996).Interaction between Gab1and the c-Met receptor tyrosine kinase is responsible for epithelial morphogenesis.Nature 384,173-176.Wiesmann,C.,Fuh,G.,Christinger，H.W.,Eigenbrot,C.,Wells,J.A.,and de Vos,A.M.(1997).Crystal structure at 1.7A resolution of VEGF in complex with domain 2ofthe Flt-1receptor.Cell91,695-704. 

Wiesmann,C.,Ultsch,M.H.,Bass,S.H.,and de Vos,A.M.(1999).Crystal structure of nerve growth factor in complex with the ligand-binding domain of the TrkA receptor.Nature 401,184-188. 

Claims (54)

1.抗c-met抗体，其包含：

(a)至少一种选自下组的HVR序列：

(i)包含序列A1-A17的HVR-L1，其中A1-A17是KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:1)

(ii)包含序列B1-B7的HVR-L2，其中B1-B7是WASTRES(SEQ ID NO:2)

(iii)包含序列C1-C9的HVR-L3，其中C1-C9是QQYYAYPWT(SEQ ID NO:3)

(iv)包含序列D1-D10的HVR-H1，其中D1-D10是GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:4)

(v)包含序列E1-E18的HVR-H2，其中E1-E18是GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:5)

(vi)包含序列F1-F11的HVR-H3，其中F1-F11是XYGSYVSPLDY(SEQ ID NO:6)且X不是R；及

(b)至少一种变体HVR，其中所述变体HVR包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中所示序列的至少一个残基的修饰。

2.权利要求1的抗体，其中所述变体HVR-H3中的F1是T或S，F3是R或S，而F7是T。

3.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化的。

4.权利要求1的抗体，其中至少一部分框架序列是人共有框架序列。

5.权利要求1的抗体，其中所述修饰是替代、插入或删除。

6.权利要求1的抗体，其中HVR-L2变体包含以下位置任意组合的1-5个（1、2、3、4或5个）替代：B 1(M或L)、B2(P、T、G或S)、B3(N、G、R或T)、B4(I、N或F)、B5(P、I、L或G)、B6(A、D、T或V)、及B7(R、I、M或G)。

7.权利要求1的抗体，其中HVR-H1变体包含以下位置任意组合的1-5个（1、2、3、4或5个）替代：D3(N、P、L、S、A、I)、D5(I、S或Y)、D6(G、D、T、K、R)、D7(F、H、R、S、T或V)、及D9(M或V)。

8.权利要求1的抗体，其中HVR-H2变体包含以下位置任意组合的1-4个（1、2、3或4个）替代：E7(Y)、E9(I)、E10(I)、E14(T或Q)、E15(D、K、S、T或V)、E16(L)、E17(E、H、N或D)、及E18(Y、E或H)。

9.权利要求1的抗体，其中HVR-H3变体包含以下位置任意组合的1-5个（1、2、3、4或5个）替代：F1(T、S)、F3(R、S、H、T、A、K)、F4(G)、F6(R、F、M、T、E、K、A、L、W)、F7(L、I、T、R、K、V)、F8(S、A)、F10(Y、N)、及F11(Q、S、H、F)。

10.权利要求1的抗体，其包含具有SEQ ID NO:1序列的HVR-L1。

11.权利要求1的抗体，其包含具有SEQ ID NO:3序列的HVR-L3。

12.权利要求1的抗体，其中变体HVR-H3中的F1是T。

13.权利要求1的抗体，其中变体HVR-H3中的F3是R或S。

14.权利要求1的抗体，其中变体HVR-H3中的F7是T。

15.人源化抗c-met抗体，其中所述抗体对人c-met的单价亲和力与包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）的鼠抗体的单价亲和力基本上相同。

16.人源化抗c-met抗体，其中所述抗体对人c-met的单价亲和力比包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）的鼠抗体的单价亲和力至少高3倍。

17.权利要求15或16的人源化抗体，其中所述鼠抗体是由以美国典型培养物保藏中心登记号ATCC HB-11894（杂交瘤1A3.3.13）或HB-11895（杂交瘤5D5.11.6）保藏的杂交瘤细胞系生成的。

18.权利要求15-17任一项的抗体，其中结合亲和力以Kd值表示。

19.权利要求15-18任一项的抗体，其中结合亲和力通过Biacore或放射免疫测定法来测量。

20.权利要求1的抗体，其包含人κ亚型I共有框架序列。

21.权利要求1的抗体，其包含重链人亚型III共有框架序列。

22.权利要求21的抗体，其中框架序列包含第71、73和/或78位的替代。

23.权利要求22的抗体，其中所述替代是R71A、N73T和/或N78A。

24.人源化抗c-met抗体，其中所述人源化抗体比包括嵌合抗c-met抗体的参照抗体更好的抑制人肝细胞生长因子与其受体的结合，所述嵌合抗c-met抗体包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）。

25.权利要求24的抗体，其中所述人源化抗体抑制结合且IC50值小于所述嵌合抗体该数值的一半。

26.权利要求25的抗体，其中IC50是跨越约0.01nM至1000nM左右的抗体浓度范围测定的。

27.人源化抗c-met抗体，其中所述人源化抗体比包括嵌合抗c-met抗体的参照抗体更好的抑制人肝细胞生长因子(HGF)受体的活化，所述嵌合抗c-met抗体包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）。

28.权利要求27的抗体，其中所述人源化抗体抑制受体活化且IC50值小于所述嵌合抗体该数值的一半。

29.权利要求28的抗体，其中IC50是跨越约0.1nM至约100nM的抗体浓度范围测定的。

30.人源化抗c-met抗体，其中所述人源化抗体比包括嵌合抗c-met抗体的参照抗体更好的抑制c-met依赖性细胞增殖，所述嵌合抗c-met抗体包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10）。

31.权利要求30的抗体，其中所述人源化抗体抑制细胞增殖且IC50值小于所述嵌合抗体该数值的一半。

32.权利要求31的抗体，其中IC50是跨越约0.01nM至约100nM的抗体浓度范围测定的。

33.前述权利要求的抗体，其中所述人源化抗体和嵌合抗体都是单价的。

34.前述权利要求的抗体，其中所述人源化抗体和嵌合抗体都包含与Fc区连接的单一Fab区。

35.包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含图13中所示HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列（SEQ ID NO:191-193）。

36.权利要求35的抗体，其中所述可变区包含图13中所示FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列（SEQ ID NO:187-190）。

37.权利要求35或36的抗体，其中所述抗体包含图13中所示CH1和/或Fc序列（SEQ ID NO:194和/或195）。

38.包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含图13中所示HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列（SEQ ID NO:183-185）。

39.权利要求38的抗体，其中所述可变区包含图13中所示FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列（SEQ ID NO:179-182）。

40.权利要求38或39的抗体，其中所述抗体包含图13中所示CL1序列（SEQID NO:186）。

41.包含权利要求35-37任一项的重链可变区和权利要求38-40任一项的轻链可变区的抗体。

42.权利要求41的抗体，其中所述抗体是单价的且包含Fc区。

43.权利要求42的抗体，其中Fc区包含第一和第二多肽，其中所述第一和第二多肽各自包含相对于野生型人Fc的一个或多个突变。

44.权利要求43的抗体，其中所述第一多肽包含图13中所示Fc序列（SEQ IDNO:195），而所述第二多肽包含图14中所示Fc序列（SEQ ID NO:196）。

45.抑制c-met激活的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的前述权利要求任一项的抗体。

46.调节与HGF/c-met信号轴调控异常有关的疾病的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的前述权利要求任一项的抗体。

47.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的前述权利要求任一项的抗体。

48.权利要求47的方法，其中所述癌症是肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、结肠直肠癌和/或胰腺癌。

49.治疗受试者中增殖紊乱的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的前述权利要求任一项的抗体。

50.权利要求49的方法，其中所述增殖性紊乱是癌症。

51.编码权利要求1-44任一项的抗体的核酸。

52.包含权利要求51的核酸的宿主细胞。

53.包含权利要求1-44任一项的抗体的组合物。

54.权利要求53的组合物，其中所述组合物包含载体。

Images