ES2536995T3

ES2536995T3 - Método para aislamiento de polipéptidos solubles

Info

Publication number: ES2536995T3
Application number: ES10190248.4T
Authority: ES
Inventors: Jamshid Tanha
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2015-06-01
Anticipated expiration: 2026-03-24
Also published as: JP6374851B2; EP2316948A1; EP2368991B1; ES2375826T3; EP2330196A3; EP2368997A2; EP2336325A1; EP2338999A2; ES2558338T3; EP2322622A2; EP2338999A3; EP2322624A2; EP2360256B1; EP2368991A3; EP2336326A3; JP2018110583A; US20090220485A1; EP2386638A3; EP2368994A2; EP2338997A1

Abstract

Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 44

Description

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contribuye generalmente en grado más importante a la diversidad de repertorio y por esta razón la aleatorización de CDR3 en andamiajes VH y VL está acompañada típicamente por variación concomitante de la longitud de CDR3. Si bien esto aumenta significativamente la complejidad de la biblioteca, puede comprometer también la estabilidad de la biblioteca por rotura de la longitud del andamiaje parental CDR3. La heterogeneidad de los VHs y VLs descritos en esta memoria en términos de longitud de CDR3 permite la creación de bibliotecas que tienen a la vez complejidad satisfactoria, buena estabilidad y buenas características biofísicas. Tales bibliotecas estarían constituidas preferiblemente por sub-bibliotecas, donde cada sub-biblioteca está creada por aleatorización de CDR3 (y aleatorización de CDR1 y/o CDR2, en caso deseado) en un solo andamiaje de VH o VL sin romper la longitud de la CDR3 parental.

La versatilidad de los presentes VHs y VLs es beneficiosa también en términos de selección de un entramado de VH o VL óptimo para humanización de VHHs, VHs y VLs que son específicos para dianas terapéuticas. VHHs de camélido de afinidad alta contra dianas terapéuticas pueden obtenerse de bibliotecas de VHH inmunes, no inmunizadas o sintéticas con relativa facilidad y pueden someterse subsiguientemente a humanización (injerto de CDR, nuevo revestimiento de la superficie, desinmunización) para eliminar la posible inmunogenicidad de VHH, proporcionando con ello una alternativa al enfoque de bibliotecas de VHH humanas para producción de VHs terapéuticos. La generación de VHs terapéuticos de afinidad alta por el último enfoque puede requerir a menudo maduración adicional por afinidad in vitro, tediosa y que consume mucho tiempo, del o de los aglomerante(s) principales seleccionados de las bibliotecas de VH humanas sintéticas primarias.

Pueden obtenerse VHs no humanos contra dianas terapéuticas a partir de bibliotecas de VH inmunes, no inmunizadas o sintéticas con relativa facilidad, y someterse subsiguientemente a humanización (injerto de CDR, nuevo revestimiento de la superficie, desinmunización) para eliminar la inmunogenicidad del VH no humano, proporcionando con ello una alternativa al enfoque de bibliotecas de VH humanas para producción de VHs terapéuticos.

VLs no humanos contra dianas terapéuticas pueden obtenerse a partir de bibliotecas inmunes, no inmunizadas o sintéticas de VHH con relativa facilidad y someterse subsiguientemente a humanización (injerto de CDR, nuevo revestimiento de la superficie, desinmunización) para eliminar la inmugenicidad de VHH, proporcionando con ello una alternativa al enfoque de bibliotecas de VL humanas para producción de VLs terapéuticos.

Se han descrito cierto número de enfoques evolutivos para la selección de proteínas con propiedades biofísicas mejoradas (Forrer, P. et al., 1999; Waldo, G.S., 2003); (Jespers, L. et al., 2004a; Jung, S. et al., 1999; Matsuura, T. et al., 2003). Típicamente, se requiere una presión de estabilidad para asegurar la selección preferencial de las variantes estables sobre las inestables o menos estables, de una población de biblioteca. Por ejemplo, en un trabajo afín, se requirió tratamiento térmico de bibliotecas de presentación del fago VH para seleccionar VHs resistentes a la agregación (Jespers, L. et al., 2004a). Ejemplos de enfoques de selección evolutivos que implican presentación de fago incluyen presentación de fago convencional, fagos selectivamente infectivos y los enfoques de proteólisis. En los dos primeros enfoques se utiliza selección por afinidad para seleccionar especies estables de una biblioteca, basadas en la hipótesis de que las proteínas estables poseen mejores propiedades de fijación a su ligando que las inestables. Sin embargo, aun con la inclusión adicional de una etapa de selección por estabilidad, estos enfoques pueden enriquecer fundamentalmente por mayor afinidad más que por mayor estabilidad (Jung, S. et al., 1999). Un requerimiento de etapas de fijación limita también la aplicabilidad de estos enfoques a proteínas con ligandos conocidos. El tercero, enfoque de proteólisis, está basado en el hecho de que las proteínas estables son generalmente compactas y por consiguiente son resistentes a las proteasas, mientras que las inestables no lo son. El formato de presentación de fago se modifica por ingeniería genética de tal manera que la estabilidad a las proteasas de la proteína presentada se traduce en infectividad del fago. Así, cuando una biblioteca variante de presentación de fago se trata con una proteasa, únicamente los fagos que exhiben proteínas estables retienen su infectividad y pueden seleccionarse subsiguientemente por infección de un E. coli hospedador. Dado que este enfoque es independiente de la fijación de ligandos, el mismo es de utilidad general. Sin embargo, incluso las proteínas estables y bien plegadas tienen sitios sensibles a las proteasas, v.g. bucles y enlazadores, y esto podría impedir en algunos casos la selección de especies estables en un enfoque de proteólisis (Ban, Y. et al., 2004).

En contraste, en el presente enfoque evolutivo, las proteínas con propiedades biofísicas superiores se identifican directamente a simple vista. El enfoque no requiere etapas de fijación de ligando, proteólisis o desestabilización, y por consiguiente evita complicaciones que pueden encontrarse en los enfoques de selección indicados. La ausencia de requerimiento de una etapa de fijación significa también que este enfoque tiene utilidad general. Como opción, puede incluirse una etapa de fijación para asegurar que las proteínas seleccionadas sean funcionales. Sin embargo, la dependencia del presente enfoque respecto a la extensión en placas (para visualización de las calvas) introduce una posible limitación logística en términos de números de placas que pueden ser manipuladas y limita por tanto su aplicación a bibliotecas más pequeñas. No obstante, la utilidad del presente enfoque puede extenderse a grandes bibliotecas, si la biblioteca se reduce primero a un tamaño manejable. Esto puede hacerse, por ejemplo, por incorporación en el sistema de selección de una etapa que pudiera eliminar grandes poblaciones de especies inestables, v.g., la adsorción de la biblioteca en una superficie de proteína A, o en una columna de interacción hidrófoba para eliminar proteínas deficientemente plegadas con superficies hidrófobas expuestas (Matsuura, T. et al., 2003). En este caso, el enfoque se utilizó para seleccionar VHs y VLs con buenas propiedades biofísicas en un

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EJEMPLOS

Identificación y análisis de secuencia de VHs humanos monómeros

Durante el curso de la construcción de bibliotecas de VH totalmente humanos y humanos llamizados, se descubrió que los fagos que exhibían VHs llamizados monómeros formaban calvas mayores en céspedes bacterianos que los fagos que exhibían VHs totalmente humanos con tendencias a agregación. Por ello, se utilizó el tamaño de las calvas como medio para la identificación de VHs monómeros raros, existentes naturalmente a partir del repertorio de VHs humanos (Figura 1). A este fin, se construyó una biblioteca de fagos que exhibía VHs humanos con un tamaño de 6 x 108 y se propagó en forma de calvas en placas de agar. En las placas de titulación, la biblioteca estaba constituida esencialmente por pequeñas calvas intercaladas con algunas grandes. La PCR en 20 clones reveló que las calvas pequeñas correspondían a los fagos que presentaban VH, mientras que las grandes representaban los fagos de tipo salvaje, es decir, fagos que carecían de inserciones de la secuencia VH. No se encontró ninguno de los fagos que presentaban VH con morfología de calvas grandes. Esto no era inesperado, dada la escasez de los VHs monómeros en el repertorio humano y el gran tamaño de la biblioteca. Para facilitar la identificación de VHs monómeros, se decidió reducir la biblioteca a un tamaño manejable y eliminar los fagos de tipo salvaje causantes de interferencia con morfología de gran tamaño de calva por lavado en batea de la biblioteca contra proteína A que se fija a un subconjunto de VHs humanos de la familia VH3.

Después de unas cuantas tandas de lavado en batea, la biblioteca se enriqueció en fagos que producían calvas grandes, y la PCR y la secuenciación de más de 110 de dichas calvas demostraron que todas ellas tenían marcos de lectura abiertos VH completos. El tamaño de las calvas grandes que se seleccionaron para análisis se representa en la Figura 1. La secuenciación reveló 15 VHs diferentes que pertenecían a la familia VH3 y utilizaban segmentos V de línea germinal DP-38, DP-47, V3-49, V3-53, YAC-5 u 8-1B (Tabla 1; Figura 2). Las secuencias de línea germinal DP-38 y DP-47 se han visto implicadas con anterioridad en fijación de proteína A. Adicionalmente, todos los VHs tenían un residuo Thr en la posición 57 (Figura 2), consistente por su actividad de fijación de proteína A. El segmento V de la línea germinal utilizado más frecuentemente era DP-47, que existía en más del 50% de los VHs, pero el clon más frecuente (a saber, HVHP428; frecuencia relativa 46%) utilizaba el segmento V de la línea germinal V3-49. HVHP429, con una secuencia de línea germinal DP-47, era el segundo VH más abundante con una frecuencia relativa de 21% (Figura 2). Las longitudes de CDR3 VH abarcaban desde 4 aminoácidos para HVHB82 hasta 16 aminoácidos para los aminoácidos de HVHP430, teniendo HVHP430 un par de residuos Cys en CDR3. Se observaron mutaciones de aminoácidos con respecto a las secuencias del segmento V de la línea germinal parental (residuos 1-94) y FR4 (residuos 103-113), en todos los VHs y estaban comprendidas entre dos mutaciones para HVHP44 (L5V y Q105R) y HVHB82 (E1Q y L5Q) hasta 16 mutaciones para HVHP426 (Tabla 1). Las mutaciones se concentraban en los segmentos V; se detectaron sólo dos mutaciones en la totalidad de los 15 FR4s, en las posiciones 105 y 108. HVHP44 y HVHB82 diferían de otros VHs en que los mismos tenían un aminoácido cargado positivamente en la posición 105 en lugar de una Gln (Tabla 1; Figura 2). No obstante, si bien el aminoácido con carga positiva en HVHP44 se adquiría por mutación, el de HVHB82 estaba codificado en la línea germinal. Excepto en lo que respecta a HVHP423 y HVHP44B, los VHs restantes tenían los residuos de la línea germinal en las posiciones de solubilidad principales: 37V/44G/45L/47W o 37F/44G/45L/47W (HVHP428; HVHP423 y HVHP44B tenían una mutación V37F. Las mutaciones en otras posiciones que se demuestra o se supone son importantes en la solubilidad de VH incluían siete E6Q, tres S35T/H, una R83G y una K83R, una A84P y una T84A y una M108L. Se observaban también mutaciones frecuentes en las posiciones 1 y 5 que incluían once E1Q, ocho L5V/Q y una mutación V5Q.

Caracterización biofísica de los VHs humanos

Todos los VHs excepto HVHP44B, que era esencialmente el mismo que HVHP423, se expresaban en volúmenes de cultivo de 1 litro en la cepa TG1 de E. coli en fusión con el marcador c-Myc-His5 y se purificaron hasta homogeneidad de extractos periplásmicos por cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC). Los rendimientos de expresión oscilaban desde 1,8 a 62,1 mg de proteína purificada por litro de cultivo bacteriano en matraces de sacudidas, teniendo la mayoría de los VHs rendimientos de varios miligramos (Tabla 2). En el caso de HVHP423 y HVHP430, otra prueba en condiciones de expresión "aparentemente" iguales dieron rendimientos de 2,4 y 6,4 mg frente 62,1 y 23,7 mg, respectivamente. Esto implica que para muchos de los VHs descritos en esta memoria deberían alcanzarse condiciones de expresión optimas, sin mucho esfuerzo, dando como resultado rendimientos de expresión significativamente mayores que los valores consignados en la Tabla 2. Como era de espesar, la totalidad de los VHs se fijaban a la proteína A en análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR), con KDs de 0,2-3 μM, un intervalo y magnitud comparables a los consignados previamente para variantes de VHH de llama con actividad de fijación de proteína A. Ninguno de los VHs se fijaba a la superficie de referencia de Fab.

La tendencia a la agregación de los VHs humanos se evaluó en términos de sus estados de oligomerización por cromatografía de filtración en gel y NMR (Tabla 2). Todos los VHs se sometieron a cromatografía de filtración en gel Superdex 75. Análogamente a un VHs de llama, es decir, H11C7, todos los VHs daban un soplo pico simétrico para el volumen de elución esperado para un monómero, y estaban sustancialmente exentos de cualesquiera agregados (véase el ejemplo para HVHP428 en la Figura 3A). En contraste, un VH humano típico (a saber, BT32/A6) formaba

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una cantidad considerable de agregados. Para tres de los VHs, se observó también un pico menor con una movilidad esperada para un dímero de VH. Los análisis SPR de los picos menores daban valores de tasa de disociación que eran significativamente más lentos que los correspondientes a los VHs monómeros, consistentes con el hecho de que se trataba de dímeros. El pico del dímero se observó también en el caso del VHH de llama, H11C7. Los estados de plegado y oligomerización de los VHs a concentraciones altas se estudiaron ulteriormente por espectroscopia NMR. Como se muestra en la Tabla II, todas las proteínas VH estudiadas parecían ser relativamente solubles y asumían una estructura tridimensional bien plegada. Los espectros NMR unidimensionales de los fragmentos VH (Fig. 3B) exhibían pliegues estructurales característicos de dominios VH. El estado de agregación de las proteínas se evaluó también por el uso de un experimento de difusión PFG-NMR para el fragmento HVHP414 y dos isoformas, VH14 y VH14-cMyc-con y sin la secuencia c-Myc, del HVHP414. VH14 es una versión modificada de HVHP414 con una mutación c-Myc N132E y con un residuo metionina adicional en el término N. En resumen, los datos PFG-NMR (no presentados) indicaban que todas las muestras de proteína tenían los pesos moleculares monómeros esperados incluso a las concentraciones de proteína relativamente altas utilizadas para los experimentos NMR.

Se investigó ulteriormente la estabilidad de los VHs en términos de su resistencia a tripsina respecto a la integridad a 37ºC después de incubaciones largas a 37ºC. La tripsina escinde las cadenas principales amídicas de los polipéptidos en el término C de un residuo Arg o Lys. Existen 9-13 residuos Arg y Lys en los VHs humanos (Figura2). Existe también un residuo Lys adicional en el marcador c-Myc del terminal C que es sensible a la digestión por tripsina. La Figura 4a es un análisis SDS-PAGE de HVHP414 durante la digestión con tripsina. En el transcurso de una hora, la banda original se convertía completamente en un producto simple que tenía una movilidad esperada para el VH sin marcador c-Myc-His5 alguno. Se obtuvo el mismo resultado para otros 12 VHs después de una incubación de una hora con tripsina. La espectrometría de masas en una muestra seleccionada al azar de los VHs tratados con tripsina (a saber, HVHP414, HVHP419, HVHP420, HVHP423, HVHP429, HVHP430 y HVHM81) confirmó que en todos los casos la masa molecular del producto digerido correspondía a un VH con el c-Myc Lys como el residuo C-terminal. HVHM41 daba un fragmento significativamente más corto que el resto después de digestión, y en este caso los experimentos de espectrometría de masas mapeaban el sitio de escisión al Arg 99 en CDR3 (datos no presentados).

Once VHs comprendidos en concentración desde 0,32 mg/ml (HVHP428) hasta 3,2 mg/ml (HVHP420) se incubaron a 37ºC durante 17 días. Su estabilidad se determinó subsiguientemente en términos de estado de oligomerización y fijación de proteína A. Como se demostró por cromatografía de permeación en gel, el tratamiento de VHs a 37ºC no producía formación alguna de agregados: todos los VHs daban perfiles de cromatograma que eran virtualmente idénticos a los de VHs sin tratar y se mantenían esencialmente como monómeros (véase el ejemplo para HVHP420; Figura 4c). Para asegurar que los VHs mantenían su plegamiento nativo después del tratamiento a 37ºC, se seleccionaron al azar dos VHs, a saber, HVHP414 (1,2 mg/ml) y HVHP420 (3,2 mg/ml), y se determinaron sus KDs de fijación a la proteína A por SPR (datos presentados para HVHP420; recuadro en la Figura 4c) y se compararon con los KDs obtenidos para VHs sin tratar (Tabla 2). Los KDs calculados para los VHs tratados térmicamente eran 1,4 μM y 1,0 μM para HVHP414 y HVHP420, respectivamente. Estos valores son esencialmente idénticos a los valores correspondientes para los VHs sin tratar (Tabla 2), demostrando que el tratamiento de VHs a 37ºC no afectaba a su plegamiento nativo. La posibilidad de que los VHs puedan haber estado en un plegamiento no nativo menos compacto durante los periodos de incubación a 37ºC y hayan adquirido nuevamente su plegamiento nativo después de volver a la temperatura ambiente durante los experimentos de filtración en gel y SPR es poco probable en vista del hecho de que los VHs eran resistentes a tripsina a 37ºC (véase arriba), una propiedad asociada típicamente para proteínas nativas bien plegadas.

La eficiencia de replegado (RE) de los VHs humanos se investigó por comparación de los valores KDs de la fijación de los VHs nativos (KDn) y los replegados y tratados térmicamente (KDref) a la proteína A (Tanha, J. et al., 2002). Cuando se desactiva una fracción del VH por tratamiento térmico, el valor KD medido sería mayor, dado que este parámetro está basado en la concentración de fragmento de anticuerpo plegado, es decir, activo. Así, la ratio de KDn a KDref da una medida de la RE de VH. La Figura 5 compara sensogramas para fijación de HVHP423 a proteína A inmovilizada en estados nativo (líneas gruesas) y replegado (líneas delgadas) para varias concentraciones de VH seleccionadas. Como puede verse, la fijación del VH replegado a la proteína A es menor en todos los casos, lo que indica que el desplegado no es totalmente reversible. Para cada uno de los 14 VHs, se midió la fijación a la proteína A en ambos estados nativo y replegado a varias concentraciones, y se determinaron los valores KDs y subsiguientemente REs (Tabla 2, no se muestran los valores KDref). Se determinaron también los valores KDs y REs de dos VHHs anti-idiotípicos de llama, H11F9 y H11B2, que se utilizaron como referencias. Cuatro VHs tenían REs en el intervalo de 92%-95%, similares a las REs para H11F9 y H11B2, 95% y 100%, respectivamente. Otros cinco tenían REs en el intervalo de 84%-88% y tres superiores a 70%. Únicamente dos tenían RE significativamente menor: HVHP413 (52%) y HVHP421 (14%). Varios VHHs publicados examinados con anterioridad tenían RE próxima a 50% (van der Linden, R.H. et al., 1999).

Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago VH humanas. Se sintetizó cDNA a partir de mRNA de bazo humano (Ambion Inc., Austin, TX) utilizando iniciadores hexanucleotídicos aleatorios y el kit de DNA de la Primera Cadena™ (GE Healthcare, Baie d'Urfé, QC, Canadá). Utilizando los cDNAs como molde, genes de VH con secuencias CH flanqueantes se amplificaron por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en nueve reacciones separadas utilizando iniciadores específicos de la región de entramado 1 (FR1) de VH y un iniciador

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Tabla 1. Desviaciones de secuencia de VH respecto a las secuencias de la línea germinal parental

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