ES2550836T3 - Método para aislamiento de polipéptidos solubles - Google Patents

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Abstract

Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para aislamiento de polipéptidos solubles
Campo de la invención
Esta invención se refiere al aislamiento, identificación y manipulación de polipéptidos, especialmente fragmentos monómeros de anticuerpos humanos.
Antecedentes de la invención
Los anticuerpos en los vertebrados se componen típicamente de cadenas pesada (H) y ligera (L) apareadas. El primer dominio de las cadenas H y L combinadas, el VHy VL, son de secuencia más variable, y ésta es la porción del anticuerpo que reconoce el antígeno y se fija almismo. Los dominios VHy VLreconocen el antígeno como un par.
El repertorio inmunológico de los Camélidos (camellos, dromedarios y llamas) es único en el sentido de que posee tipos inusuales de anticuerpos a los que se hace referencia como anticuerpos de cadena pesada (Hamers, Casterman C. et al., 1993). Estos anticuerpos carecen de cadenas ligeras y por tanto sus sitios de combinación están constituidos por un solo dominio, denominado VHH.
Los anticuerpos VHH recombinantes de un solo dominio (sdAbs) proporcionan varias ventajas sobre los fragmentos FV monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Si bien los sdAbs son comparables a sus contrapartidas scFv en términos de afinidad, los mismos superan a los scFv en términos de solubilidad, estabilidad, resistencia a la agregación, susceptibilidad de replegado, rendimiento de expresión, y facilidad de manipulación del DNA, construcción de bibliotecas y determinaciones estructurales 3-D. muchas de las propiedades mencionadas de los sdAbs VHH son deseables en aplicaciones que implican anticuerpos.
Sin embargo, la naturaleza no humana de los VHHs limita su uso en inmunoterapia humana debido a inmunogenicidad. A este respecto, los sdAbs VH y VL humanos son candidatos ideales para aplicaciones de inmunoterapia debido a que se espera que sean menos inmunógenos.
Los VHs y VLs humanos, sin embargo, son por lo general tendentes a agregación, una característica común a los VHs y VLs derivados de anticuerpos convencionales (Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward E.S. et al., 1989). Por ello, se han realizado intentos para obtener VHs y VLs humanos monómeros adecuados para aplicaciones de anticuerpos. Tales VHs y VLs han exhibido también otras propiedades útiles típicas de los VHHs tales como alto rendimiento de expresión, alta susceptibilidad de replegado y resistencia a la agregación. Bibliotecas sintéticas construidas a base de estos VHs y VLs como andamiajes de biblioteca podrían servir como una fuente prometedora de proteínas terapéuticas.
La camelización y la llamización, que implican incorporar residuos importantes de solubilidad de los VHHs de camello y llama, respectivamente, en VHs o VLs humanos se han empleado para generar VHs y VLs humanos monómeros. Se ha demostrado que bibliotecas sintéticas de sdAb construidas sobre la base de estos VHs y VLs y generadas por aleatorización de CDR son funcionales en términos de producción de ligantes para diversos antígenos (Davies, J. et al., 1995; Tanha J. et al., 2001).
En otro enfoque, se aislaron VHs y VLs monómeros totalmente humanos de bibliotecas sintéticas humanas de VH y VL sin recurrir a ingeniería de la clase arriba mencionada. En un experimento, se descubrió un VH humano monómero cuando una biblioteca de VH humano se lavó en batea contra lisozima de huevo de gallina (Jespers, L. et al., 2004b). Más recientemente, un método de selección basado en criterios de desplegado reversible y afinidad produjo un gran número de VHs monómeros a partir de bibliotecas humanas sintéticas de VH (Jespers, L. et al., 2004a). Este descubrimiento puso de manifiesto el hecho de que un método de selección apropiado es fundamental para la captura eficiente de VHs humanos monómeros raros con propiedades biofísicas deseables.
Sumario de la invención
La invención es resultado de un método para aislamiento de polipéptidos, preferiblemente fragmentos de anticuerpo, y muy preferiblemente VHs y VLs humanos con propiedades biofísicas deseables (solubilidad, estabilidad, expresión alta, naturaleza monómera, ausencia de agregación, y especificidad de fijación). El método incluye los pasos de obtención de una biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de secuencias de polipéptidos, permisión de la infección de un césped bacteriano por el fago de la biblioteca, e identificación de fagos que forman calvas mayores que el tamaño medio en el césped bacteriano. Se aíslan luego los fagos, y se dan pasos para secuenciar o caracterizar de otro modo las secuencias de polipéptido.
La invención proporciona polipéptidos, especialmente VLs humanos monómeros, que pueden ser útiles para inmunoterapia, y/o como agentes de diagnóstico o detección. Los VLs humanos monómeros pueden combinarse también para formardímeros,trímeros,pentámerosotrosmultímeros,quepuedenserútiles para inmunoterapia y/o como agentes de diagnóstico o detección.
Los polipéptidos identificados en esta memoria, que incluyen VLs humanos, pueden manipularse por métodos tales como desordenamiento del DNA, a fin de seleccionar propiedades biofísicas mejoradas tales como solubilidad, estabilidad, naturaleza monómera, expresabilidad alta, especificidad de fijación y origen humano.
Los polipéptidos identificados en esta memoria, que incluyen VLs humanos, pueden utilizarse también para generar bibliotecasdepresentaciónadicionales,que puedenutilizarseluegoasuvezpara aislarpolipéptidos adicionalespor el método arriba indicado.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un fragmento de anticuerpo VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34.
En un tercer aspecto, la presente invención proporcionar un método para producir polipéptidos con propiedades biofísicas deseables, que comprende los pasos de a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de anticuerpo conforme a la reivindicación 1 o la reivindicación 2; proporcionar secuencias de oligonucleótidos con codones aleatorizados; c) incorporar los oligonucleótidos aleatorizados en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal modo que una o más de las CDRs está aleatorizada; y d) expresar lassecuencias de nucleótidos producidas en el paso (c).
Descripción Detallada de los Dibujos
Leyendas de las figuras
Figura 1. Una representación gráfica de los resultados de ejemplos seleccionados: el contraste en el tamaño de calva entre fagos que presentan un VH soluble (HVHP428) y aquéllos que presentan uno insoluble (BT32/A6). La fotografía muestra una parte de la placa de agar de césped bacteriano que se amplió para mejorar la visualización de la calva. Aunque la placa contenía un número igual de cada uno de los dos tipos de calva, la fotografía contiene esencialmente las calvas HVHP428, de tamaño grande. La mayoría de las calvas BT32/A6 eran demasiado pequeñas para producir imágenes claras bien definidas en la fotografía. Por tanto, las calvas marcadas por flechas representan una proporción menor de fagos BT32/A6 que eran lo suficientemente grandes para ser visibles en esta imagen. Los asteriscos marcan tamaños de calva representativos para los fagos HVHP428. Las identidades de las calvas se determinaron por secuenciación del DNA.
Figura 2. Secuencia de aminoácidos de los VHs humanos seleccionados sobre la base de la afinidad para la proteína A y el tamaño de la calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoácidos con HVHP2M10 o HVHP44. Se incluyen guiones para alineación de las secuencias. Los residuos en las posiciones de solubilidad principales y el residuo 57T que se asocia con VHs/VHHs con la propiedad de fijación de proteína A se muestran en negrilla. Se utiliza el sistema de numeración Kabat. El valor de la "frecuencia" total es 114
CDR = región determinante de la complementariedad; FR = región de entramado; gln seq = secuencia de la línea germinal
Figura 3. Tendencias de agregación de los VHs humanos. Cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización de un VH humano aislado en este estudio (HVHP428) con el de un VHH de llama (H11C7) y un VH humano típico (BT32/A6). El pico que se eluye en último lugar en cada cromatograma corresponde al VH monómero. El pico H11C7 dímero está marcado por una flecha. B, espectros 1HNMR unidimensionales de HVHP414 a 800 MHz (i), HVHP423 a 500 MHz (ii) y HVHP428 a 800 MHz (iii). Los espectros en el panel izquierdo están aumentados a escala con un factor de dos a fin de permitir una mejor observación de las señales de baja intensidad.
Figura 4. Estabilidad de los VHs humanos en términos de su resistencia a tripsina a 37ºC y su integridad después de incubación larga a 37ºC. A, SDS-PAGE que compara las movilidades del VH HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina a los 15, 30 y 60 min con relación a un marcador de 21 KDa. HVHP414-cMyc denota VHde HVHP414 quecarecedel c-Myc.B,perfiles demasa molecularobtenidosporespectrometría de masas de VH de HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina (60 min). El perfil de la espectrometría de masas delVHtratadose ha superpuestoalcorrespondientealdelVHsintratarpara proporcionaruna mejor comparación visual. La masa molecular experimental del VH sin tratar es 14.967,6 Da, que es esencialmente idéntica a la masa molecular esperada, 14.967,7 Da. La masa molecular observada del VH tratado con tripsina (13.368,5 Da) indica la pérdida de 13 aminoácidos en el término C por escisión en K (Lys) en el marcador c-Myc para dar una masa molecular esperada de 13368,0 Da. El sitio de escisión de tripsina se muestra por una flecha vertical encima de la secuencia de aminoácidos de HVHP414. C, cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización del VH HVHP420 tratado a 37ºC (perfil superior) con el del VH sin tratar (perfil inferior). Los cromatogramas se desplazaron verticalmente debido a queno podían distinguirse cuando estabansuperpuestos.Los picos mayorymenor en cada cromatograma corresponden a VHs monómeros y dímeros, respectivamente. El VH dímero constituye 3%delaproteína total.Elrecuadromuestralassuperposicionesdesensogramas paralafijación de HVHP420 tratado a 37ºC a la proteína A a diversas concentraciones. Los VHs utilizados para estudios de estabilidad térmica procedían de stocks que habían estado ya a 4ºC durante varios meses.
Figura 5. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVHP423 nativo (líneas gruesas) y replegado (líneas finas) a la proteína A inmovilizada a concentraciones de 75, 100, 150 y 200 nM. KDn y KDref se calcularon a partir de los sensogramas respectivos y se utilizaron para determinar RE como se describe más adelante.
Figura 6. Secuencias de aminoácidos de los VLs humanos seleccionados basadas en afinidad para la proteína L y tamaño de calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoácidos con HVLP333. Se incluyen guiones para alineación de la secuencia. Véase la BASE V (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/index.php?module=pagemaster&PAGE_user_op=view_page& PAGE_id=7&MMN_position=5:5) para numeración de secuencia y designación de la CDR. L6, A27, L2, L16, O2/O12, A30 y 1b son designaciones de la línea germinal V. Las designaciones de la línea germinal J aparecen entre corchetes. NF, no encontrado.
Figura 7. Cromatogramas de exclusión por tamaños de dominios VL humanos. En A, se aplicaron los VLs a una concentración de 0,6 mg/ml. En B, se aplicaron los VLs a su máxima concentración disponible: HVLP342, 1,0 mg/ml; HVLP3103, 5,9 mg/ml; HVLP335, 4,9 mg/ml, HVLP351, 0,89 mg/ml. "#" y "*" representan picos agregados y monómeros, respectivamente. Los agregados se eluyen en el volumen de exclusión. El pico marcado por una flecha en el panel HVLP342 (B) es el arrastre de una operación previa.
Figura 8. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de VLs a la proteína L inmovilizada a concentraciones de 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5 y 10 μM (HVLP389, HVLP351 y HVLP364); 1, 2, 3, 5, 7,5 y 10 nM (HVLP342); 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 5 y 10 μM (HVLP335); 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2 y 5 μM (HVLP325), 0,2, 0,5, 0,75, 1,1,5,2,3 y5 μM(HVLP3103) y 1, 2, 3, 4, 5 y 6 nM (HVLP324). Los sensogramas para las fijaciones de HVLP324 y HVLP342 al sitio de baja afinidad de la proteína L no se incluyen, pero los KDs calculados se registran en la Tabla 3.
Figura 9. Fijaciones de HVHP328PTV2 a proteína A y HVLP335PTV2 a proteína L en experimentos de resonancia de plasmones de superficie. (A) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVH28PTV2 a proteína A inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 nM. (B) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVLP335PTV2 a proteína L inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 4,5 nM. Los datos de fijación se registran en la Tabla 4.
Figura 10. Figura que muestra los resultados de los experimentos de microaglutinación con células de S. aureus. La concentración de los pentámeros disminuye dos veces desde el pocillo 1 al pocillo 11, teniendo el pocillo 12 los pentámeros reemplazados con tampón de PBS. Los pocillos de la fila superior contienen pentámero de HVHP328PTV2 y los del fondo pentámero HVLP335PTV2. Las concentraciones de los pentámeros en los pocillos 1 a 6 son 215, 108, 54, 27, 13 y 7 μg/ml, respectivamente.
Descripción Detallada de la Invención
Es deseable identificar polipéptidos, especialmente fragmentos de anticuerpo, que son de origen humano, solubles, estables, resistentes a la agregación, replegables, que se expresan fuertemente, se manipulan fácilmente al nivel del DNA, y son ideales para construcción de bibliotecas y para determinaciones de la estructura 3-D. Tales fragmentos de anticuerpo son útiles para una gran diversidad de aplicaciones inmunoterapéuticas, y también como agentes de diagnóstico y detección. Son particularmente interesantes los anticuerpos humanos monómeros dado que los mismos tendrán probablemente muchas de las propiedades arriba mencionadas.
Los polipéptidos con las propiedades arriba mencionadas pueden identificarse por cribado de alta capacidad de bibliotecas capaces de expresar una diversidad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, bibliotecas de presentación de fago (preferiblemente de fago filamentoso tal como M13 o fd) pueden cribarse por infección de un campo de bacterias sensibles al fago (un césped bacteriano) con el fago, seguido por determinación de qué fagos han lisado satisfactoriamente las bacterias buscando las áreas claras exentas de bacterias, conocidas como calvas. Los fagos que exhiben VHs y VLs monómeros llamizados forman calvas de mayor tamaño en los céspedes bacterianos que los fagos que exhiben VHs totalmente humanos con tendencias a la agregación. Así, el tamaño de calva puede utilizarse como medio de identificación de VHs y VLs monómeros raros existentes naturalmente del repertorio de VH humanos.
El método descrito en esta memoria es útil también en la identificación de fragmentos de proteínas de orígenes diferentes solubles y estables (la estabilidad abarca varias características, que incluyen, pero sin carácter limitante, eficiencia de replegado térmico alta, temperatura de fusión alta, mantenimiento de la funcionalidad después de larga incubación (de varios días) a 37ºC, resistencia a los desnaturalizantes químicos, resistencia a las proteasas, que tienen una vida útil larga a temperaturas inferiores a 0ºC, y 4ºC, y a la temperatura ambiente, mantenimiento de la funcionalidad en ambientes intracelulares, y mantenimiento de la funcionalidad en el interior del cuerpo humano, por ejemplo en el torrente sanguíneo) yque se expresan fuertemente, que incluyen:
1.
VHs, VLs, Fabs, scFvsy anticuerpos enteros talescomo IgGs,más específicamente humanos
2.
Variantes de proteínas basadas en andamiajes distintos de anticuerpos, receptores de células T monocatenarios, dominios de receptores de células T, transferrina, lipocalinas, dominios Kunitz, repeticiones de ankirina, y antígeno citotóxico asociado a los linfocitos T (CTLA-4), con inclusión de los humanos
3.
Vacunas, tales como vacunas de proteínas virales y bacterianas
4.
Proteínas terapéuticas, v.g., insulina, hormona del crecimiento, eritropoyetina
5.
Reactivos proteináceos de diagnóstico y bioquímicos, v.g., proteína A, proteína G.
Los polipéptidos identificados por este método pueden utilizarse para construir bibliotecas adicionales. Esto se hace por selección de una secuencia de ácido nucleico de, por ejemplo, un VH. Se crean oligonucleótidos con codones aleatorizados y se incorporan en la secuencia VH. De este modo, cada oligonucleótido singular se incorpora en un gen VH, y los genes VH modificados constituyen una biblioteca de secuencias con ligeras variaciones. Típicamente, los oligonucleótidos se diseñan de tal manera que las CDRs o bucles del VH están aleatorizados. Por ejemplo una, dos o las tres CDRs de VH pueden estar aleatorizadas. La biblioteca de VH se clona luego en un vector apropiado, que depende del tipo de biblioteca a utilizar, y las secuencias de ácido nucleico se expresan como polipéptidos. La biblioteca se somete a cribado respecto a moléculas que se fijan a los polipéptidos de la biblioteca, típicamente por lavado en batea. Las bibliotecas pueden ser bibliotecas de presentación de fago, u otras bibliotecas de presentación tales como presentación de ribosoma y presentación de levadura.
Los polipéptidos identificados por el método expuesto en esta memoria pueden utilizarse para inmunoterapia, por ejemplo por reticulación de los monómeros para formar dímeros, trímeros, pentámeros y otros multímeros. Esto puede dar como resultado mejor afinidad para moléculas de antígeno y tasas de disociación más lentas para algunos antígenos. Otro posible enfoque consiste en enlazar o fusionar polipéptidos a una diversidad de moléculas con diversas funciones. Por ejemplo, pueden enlazarse fragmentos de anticuerpo a radionucleidos, fármacos citotóxicos, toxinas, péptidos, proteínas, enzimas, liposomas, lípidos, superantígenos de células T o virus a fin de direccionar y destruir o modificar células o moléculas específicas.
Una vezque losVHs o VLs identificados por el métodode selección descritoen esta memoriahan sido aislados, los mismos pueden manipularse ulteriormente para seleccionar propiedades biofísicas mejoradas tales como solubilidad, estabilidad, naturaleza monómera, especificidad de fijación, origen humano o expresabilidad alta. Esto puede hacerse por técnicas de recombinación in vitro tales como desordenamiento del DNA o un proceso de extensión escalonada. El desordenamiento del DNA implica cortar la secuencia de ácido nucleico de los polipéptidos primero (donante) y segundo (aceptor), tales como fragmentos de anticuerpo, en fragmentos aleatorios y reensamblar luego los fragmentos aleatorios por una reacción de tipo PCR. Los fragmentos reensamblados se someten luego a cribado para seleccionar las propiedades deseadas.
Por ejemplo, uno o más VHs con estabilidad alta (donantes) pueden mezclarse con uno o más VHs que carecen de estabilidad suficiente (aceptores) y someterse a desordenamiento del DNA. Esto genera mutantes de los VHs aceptores que tienen incorporados residuos de estabilidad de los VHs donantes. Los nuevos mutantes estables pueden identificarse por los métodos descritos en esta memoria, o por otros sistemas evolutivos de cribado de proteínas tales como presentación de ribosoma, presentación de levadura, presentación de células bacterianas y presentación de fago. Análogamente, esta técnica puede utilizarse para transferir características deseables tales como solubilidad, naturaleza monómera, y expresión alta.
Esta técnica puede utilizarse en los casos en que tanto los VHs donantes como los aceptores tienen propiedades deseables para producir un VH con ambas propiedades. Por ejemplo, un VH donante inestable que se fija a un ligando terapéutico o diagnóstico importante puede desordenarse con un VH aceptor estable. Con objeto de asegurarse de que los nuevos VHs estables generados tienen también la capacidad de fijarse al ligando, el sistema de cribado puede implicar un paso de fijación de ligando.
El desordenamiento del DNA puede ser útil también para humanización de VHs no humanos tales como dominios variables de anticuerpos de cadena pesada de camélido y dominios variables de tiburón nodriza y tiburón alfombra,
o VLs no humanos que se fijan a dianas terapéuticas. Pueden utilizarse como donantes VHs y VLs humanos con propiedadesdeseables talescomosolubilidad,estabilidad,naturaleza monómera yexpresabilidad alta. Por ejemplo,
uno o másVHshumanoscon estabilidad satisfactoria (donantes) pueden mezclarse con unoo más VHsterapéuticos no humanos (aceptores) ysometerse a desordenamiento del DNA. Esto genera mutantes de los VHs aceptores, que son a la vez estables y humanizados. Los nuevos mutantes generados humanizados y estables pueden identificarse por los métodos descritos en esta memoria o por otros sistemas de cribado de proteínas evolutivos tales como presentación de ribosomas, presentación de levaduras, presentación de células bacterianas y presentación de fago. En un ejemplo adicional, el VH aceptor podría ser un VHH terapéutico (dominio variable de anticuerpo de cadena pesada de camélido).
Adicionalmente, esta técnica es útil también para seleccionarpropiedades deseables de polipéptidos distintos de VHs y VLs. Como se ha expuesto anteriormente, el polipéptido donante y el polipéptido aceptor pueden ser ambos humanos, o el donante puede ser humano yel aceptor no humano.
Un posible enfoque para impartirsolubilidad,naturaleza monómera,expresabilidadaltao estabilidad alosVHs y VLs puede ser por injerto de regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) a los VHs y VLs aceptores. Dado que las CDRs están implicadas como se sabe en la solubilidad y estabilidad de anticuerpos monodominio, y de acuerdo con ello, el injerto de estas regiones, tales como las CDRs de VHs y VLs aislados por los métodos descritos en esta memoria, puede impartir solubilidad y/o estabilidad a los VHs y VLs aceptores.
VHs y VLs humanos monómeros
Se identificaron varios VHs humanos monómeros con diferentes secuencias de la línea germinal y globales (véase la figura 1 y SEQ ID NO. 8 a 22)apartirdeuna biblioteca de presentacióndefago VH humanonaíf por este método de selección basado en el tamaño de la calva de fago. Los VHs se mantienen funcionales y monómeros después de tratamiento con tripsina a 37°C, semanas de incubaciones a 37 ºC o meses de almacenamiento a 4ºC, tienen eficiencias de replegado térmico altas, y se producen con rendimientos satisfactorios in E. coli y posee actividad de fijación de proteína A.
Adicionalmente, se identificaron varios VLs humanos monómeros (véase la figura 6 y SEQ ID NO. 23 a 54). Los VLs se producen también con buenos rendimientos en E. coli and poseen actividad de fijación de proteína L
Dichas propiedades serán manifestadas también por VHs de bibliotecas sintéticas que utilicen los VHs anteriores como andamiaje. Así, tales bibliotecas pueden producir VHs terapéuticos o de diagnóstico que podrían tener eficacia satisfactoria a temperatura fisiológica, vida útil prolongada y una producción eficaz en costes. La característica de alta eficiencia de replegado térmico podría aumentar adicionalmente las aplicaciones biotecnológicas de estas bibliotecas a situaciones en las cuales se requieran fijadores de VH para mantener su actividad después de exposición a temperaturas altas transitorias. Los VHs podrían ser también muy adecuados para aplicaciones intracorpóreas debido a sus propiedades biofísicas deseables. La propiedad de fijación de la proteína A simplificará la purificación y detección de VH en tests de diagnóstico, inmunotransferencia e inmunocitoquímica y puede aprovecharse para mejorar la eficiencia de las bibliotecas por retirada de los VHs no funcionales de las mismas. Análogamente, las bibliotecas que utilizan VLs como andamiaje producirán VLs terapéuticos o de diagnóstico que tengan propiedades análogamente deseables. Dado que los VLs se fijan con la proteína L, la purificación ydetección de VLse simplifica aprovechando la ventaja de esta propiedad de fijación de la proteína L.
Las bibliotecas de presentación construidas a base de los presentes VHs y VLs puede ser también una fuente útil de agentes de diagnóstico y detección.
Los VHs totalmente humanos consignados anteriormente con propiedades biofísicas favorables estaban basados en una secuencia de la línea germinal V simple: DP-47 ((Jespers, L. et al., 2004b; Jespers, L. et al., 2004a). La observación de que los VHs humanos monómeros en este estudio proceden de 6 secuencias de la línea germinal diferentes con inclusión de DP-47, demuestra que los VHs estables no están restringidos en términos de uso de genes de la línea germinal. De hecho, es muy probable que los autores de la invención hubieran aislado VHs monómeros de familia y orígenes de línea germinal diferentes de los que se describen en esta memoria si no hubieranrestringido la selecciónaun subconjunto deVHs de la familia VH3 con actividaddefijacióndela proteína A. No es posible concretar aquí las mutaciones de aminoácidos (Tabla 1) responsables del comportamiento biofísico observado de los presentes VHs debido a la aparición de mutaciones múltiples en VHs y al hecho de que se sabe también que CDR3 está implicada en la conformación de los perfiles biofísicos de sdAbs. Es posible, sin embargo, que mutaciones en las posiciones que se sabe son importantes para la estabilidad y solubilidad de los sdAbs, v.g., V37F en HVHP423 y HVHP44B, o mutaciones que aparecen múltiples veces en la misma posición, v.g., L5V/Q y V5Q en nueve VHs, tengan un papel en la determinación de las propiedades biofísicas de VHs. En términos de construcción de bibliotecas, sería deseable que el carácter monómero de los presentes VHs no sea dependiente de CDRs, en particular CDR3, a fin de que la aleatorización de CDR pueda realizarse sin preocupación por comprometer la estabilidad de la biblioteca. A este respecto, los VHs con CDR3 menor, v.g., HVHP82, pueden ser andamiajes preferidos, dado que ello implicaría menos dependencia de CDR3 en cuanto a estabilidad.
La diversidad de los presentes VHs y VLs en términos de secuencia global y longitud de CDR3 debería permitir la construcción de bibliotecas de mejor comportamiento. Se han construido bibliotecas sintéticas de VH sobre andamiajes simples. Un enfoque de este tipo para la generación de repertorios está en contraste neto con el "enfoque" natural, in vivo, que utiliza una multiplicidad de andamiajes. Basándose en las secuencias aquí consignadas puedeaprovecharse la ventaja de la disponibilidad del conjunto diverso de VHs y VLs y crear bibliotecas que están basadas en andamiajes múltiples de VH y VL. Tales bibliotecas podrían ser una emulación mejor de repertorios in vivo y, por tanto, podrían tener una complejidad más óptima. De las 3 CDRs en sdAbs, CDR3 contribuye generalmente en grado más importante a la diversidad de repertorios y, por esta razón, la aleatorización de CDR3 en los andamiajes VH y VL va acompañada típicamente por variación concomitante de la longitud de CDR3. Si bien esto mejora significativamente la complejidad de la biblioteca, puede poner también en compromiso la estabilidad de la biblioteca por alteración de la longitud del andamiaje parental CDR3. La heterogeneidad de los VHs y VLs descrita en esta memoria en términos de longitud de CDR3 permite la creación de bibliotecas con complejidad satisfactoria, estabilidad satisfactoria y buenas características biofísicas. Tales bibliotecas estarían constituidas preferiblemente por sub-bibliotecas, donde cada sub-biblioteca está creada por aleatorización de CDR3 (y aleatorización de CDR1 y/o CDR2, en caso deseado) sobre un solo andamiaje VH o VL sin alterar la longitud del CDR3 parental.
La versatilidad de los presentes VHs y VLs es beneficiosa también en términos de elección de un entramado óptimo de VH o VL para humanización de VHHs, VHs y VLs que son específicos para dianas terapéuticas. VHHs de camélido de afinidad alta contra dianas terapéuticas pueden obtenerse a partir de bibliotecas inmunes, no humanizadas o sintéticas de VHH con relativa facilidad y someterse subsiguientemente a humanización (injerto de CDR, nuevo revestimiento de la superficie, desinmunización) para eliminar la posible inmunogenicidad del VHH proporcionando con ello una alternativa al enfoque de bibliotecas de VH humano para producción de VHs terapéuticos. La generación de VHs terapéuticos de afinidad alta por el último enfoque puede requerir a menudo maduración adicional por afinidad in vitro, tediosa y que consumemucho tiempo, del o los ligantes principales seleccionados de las bibliotecas humanas sintéticas de VH.
Pueden obtenerse VHs no humanos contra dianas terapéuticas a partir de bibliotecas inmunes, no inmunizadas o sintéticas de VH con relativa facilidad y someterse subsiguientemente a humanización (injerto de CDR, nuevo revestimiento de la superficie, desinmunización) para eliminar la inmunogenicidad del VH no humano, proporcionando con ello una alternativa al enfoque de bibliotecas de VH humano para producción de VHs terapéuticos.
VLs no humanos contra dianas terapéuticas pueden obtenerse a partir de bibliotecas de VHH inmunes, no inmunizadas o sintéticas con relativa facilidad y someterse subsiguientemente a humanización (injerto de CDR, nuevo revestimiento de la superficie, desinmunización) para eliminar la inmunogenicidad del VHH, proporcionando con ello una alternativa al enfoque de bibliotecas de VL humano para producción de VLs terapéuticos.
Se han descrito cierto número de enfoques evolutivos para la selección de proteínas con propiedades biofísicas mejoradas (Forrer, P. et al., 1999; Waldo, G.S., 2003); (Jespers, L. et al., 2004a; Jung, S. et al., 1999; Matsuura, T. et al., 2003). Típicamente, se requiere presión de estabilidad para asegurar la selección preferencial de las variantes estables sobre las inestables o menos estables, de una población de biblioteca. Por ejemplo, en un trabajo afín, se requirió tratamiento térmico de bibliotecas de presentación del fago VH para seleccionar VHs resistentes a la agregación (Jespers, L. et al., 2004a). Ejemplos de enfoques de selección evolutivos que implican presentación de fago incluyen los enfoques de presentación de fago convencional, fago selectivamente infectivo y proteólisis. En los dos primeros enfoques se utiliza selección por afinidad para seleccionar especies estables de una biblioteca, basada en la hipótesis de que las proteínas estables poseen mejores propiedades de fijación a su ligando que las inestables. Sin embargo, aun con la inclusión adicional de un paso de selección por estabilidad, estos enfoques pueden enriquecer fundamentalmente para mayor afinidad más que para mayor estabilidad (Jung, S. et al., 1999). Un requerimiento de pasos de fijación limita también la aplicabilidad de estos enfoques a proteínas con ligandos conocidos. El tercer enfoque, la proteólisis, está basado en el hecho de que las proteínas estables son generalmente compactas y por consiguiente son resistentes a las proteasas, mientras que las inestables no lo son. El formato de presentación de fago se modifica por ingeniería genética de tal manera que la estabilidad a las proteasas de la proteína presentadase traduceen infectividaddel fago.Así,cuando unabiblioteca variante de presentación de fago se trata con una proteasa, únicamente los fagos que exhiben proteínas estables retienen su infectividad y pueden seleccionarse subsiguientemente por infección de un E. coli hospedador. Dado que este enfoque es independiente de la fijación de ligandos, el mismo es de utilidad general. Sin embargo, incluso las proteínas estables y bien plegadas tienen sitios sensibles a las proteasas, v.g. bucles y enlazadores, y esto podría impedir en algunos casos la selección de especies estables en un enfoque de proteólisis (Bai, Y. et al., 2004).
En contraste, en el presente enfoque evolutivo, las proteínas con propiedades biofísicas superiores se identifican directamente a simple vista. El enfoque no requiere pasos de fijación de ligando, proteólisis o desestabilización, y porconsiguiente evita complicaciones que puedenencontrarseenlosenfoquesdeselección indicados.La ausencia de requerimiento de un paso de fijación significa también que este enfoque tiene utilidad general. Como opción, puede incluirse un paso de fijación para asegurar que las proteínas seleccionadas sean funcionales. Sin embargo, la dependencia del presente enfoque respecto a la extensión en placas (para visualización de las calvas) introduce una posible limitación logística en términos del número de placas que pueden ser manipuladas y limita por tanto su aplicación a bibliotecas más pequeñas. No obstante, la utilidad del presente enfoque puede extenderse a grandes bibliotecas, si la biblioteca se reduce primero a un tamaño manejable. Esto puede hacerse, por ejemplo, por incorporación en el sistema de selección de un paso que pudiera eliminar grandes poblaciones de especies inestables, v.g., la adsorción de la biblioteca en una superficie de proteína A, o en una columna de interacción hidrófoba para eliminar proteínas deficientemente plegadas con superficies hidrófobas expuestas (Matsuura, T. et al., 2003). En este caso, el enfoque se utilizó para seleccionar VHs y VLs con buenas propiedades biofísicas en un fondo de fragmentos VHs y VLs muy inestables. Sin embargo, puede ser más difícil seleccionar las especies "óptimas" de una biblioteca de mutantes que está poblada con proteínas que poseen estabilidades razonablemente satisfactorias. En este caso, las variantes principales pueden identificarse basándose en la tasa de formación de calvas utilizando tiempos de incubación más cortos, o basándose en criterios de tamaño yfrecuencia de calva.
El presente enfoque de selección puede extenderse a la identificación de fragmentos de anticuerpo estables y bien plegados tales como scFvs y Fabs con la inclusión opcional, en el sistema de selección, de un paso de fijación que implica proteína L, A o cualquier ligando, así como andamiajes estables distintos de anticuerpos y variantes de los mismos. Además, la correlación observada entre el tamaño de las calvas de fago y el rendimiento de expresión de VH significa que es posible utilizar el presente enfoque para adquirir versiones de alta expresión de proteínas con expresión deficiente o insatisfactoria en caso contrario a partir de bibliotecas de presentación de fago mutantes. Esta aplicación podría ser particularmente atractiva en el caso de proteínas terapéuticas o reactivos proteínicos costosos y de expresión pobre, donde el refuerzo de la expresión de la proteína podría contrarrestar significativamente el coste de producción de la proteína.
Análisis de fijación de pentámeros
Tanto VLs como VHs son susceptibles de pentamerización, y la pentamerización puede utilizarse para convertir rápidamente un monómero de afinidad baja de VL o VH en un pentámero de afinidad alta de VL o VH. Tales pentámeros son agentes inestimables de diagnóstico y detección. En tales aplicaciones, la fijación de un pentámero de VL o VH a su diana puede ser detectada por una molécula informadora tal como una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina), o una molécula fluorescente conjugada al pentámero. Alternativamente, la fijación del pentámero puede ser detectada por una molécula secundaria que está conjugada a una molécula informadora. La molécula secundaria puede ser específica para el pentámero propiamente dicho o para unmarcadordel mismo,talcomo una marcador6Hiso marcadorc-Myc.Porejemplo,unmarcadorsecundario típico es una inmunoglobulina.
Las interacciones entre los VHs y proteína A y los VLs con proteína L son fundamentalmente diferentes de las que existen entre los VHs y VLs con sus antígenos diana. La fijación de antígeno de un VH o un VL implica 3 bucles de fijación de antígeno que forman el sitio de combinación de un dominio de anticuerpo. La fijación a proteína A de un VH con actividad de fijación de proteína A y un VL con actividad de fijación de proteína L implica sitios y residuos de fijación en los dominios de anticuerpo que son totalmente distintos del sitio de combinación del anticuerpo. Así, un VH con actividad de fijación de proteína A puede fijarse simultáneamente a proteína A y su antígeno diana y un VL con actividad de fijación de proteína L puede fijarse simultáneamente a proteína L y su antígeno diana. Dado que los presentes VHs y VLs tienen afinidad para proteína A y L, respectivamente, puede utilizarse proteína A y L como la molécula secundaria para las aplicaciones de detección y diagnóstico mencionadas anteriormente. Los pentámeros humanos de VH y VL pueden utilizarse también para terapia.
Detección de patógenos por los pentámeros
La actividad de fijación de proteína de los VHs y VLs puede utilizarse para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. La proteína A está presente en la superficie de la bacteria patógena Staphylococcus aureus. Así, los VHs con actividad de fijación de proteína A tales como los aquí descritos pueden utilizarse para detectar S. aureus. Análogamente, los monómeros de VL y pentámeros de VL con actividad de fijación de proteína L pueden utilizarse para detección de bacterias en particular bacterias patógenas tales como Peptostreptococcus magnus, que tienen proteína L en su superficie celular.
La proteína L está implicada como factor virulento en la patogénesis de P. magnus (Ricci, S. et al., 2001) en humanos.En lavaginosis,se cree quelaproteína L ejercesuefecto porreticulación de IgEasociada alasuperficie. Los monómeros y/o pentámeros de VL con actividad de fijación de proteína L tienen potencial como agentes terapéuticos dado que podrían interferir con la acción reticuladora de la IgE de la proteína L.
La proteína A está implicada como factor virulento en la patogénesis de S. aureus (Fournier, B. et al., 2004) en humanos. Su virulencia ha sido atribuida a su capacidad para interaccionar con componentes hospedadores que incluyen fijación a anticuerpos. Los monómeros y/o pentámeros de VH con actividad de fijación de proteína A tienen potencial como agentes terapéuticos dado que podrían interferir con la interacción de la proteína A con componentes del hospedador.
EJEMPLOS
Identificación y análisis de secuencia de VHs humanos monómeros
Durante el curso de la construcción de bibliotecas de VH totalmente humanos y humanos llamizados, se descubrió que los fagos que exhibían VHs llamizados monómeros formaban calvas mayores en céspedes bacterianos que los fagos que exhibían VHs totalmente humanos con tendencias a agregación. Por ello, se utilizó el tamaño de la calva como medio para la identificación de VHs monómeros raros, existentes naturalmente a partir del repertorio de VHs humanos (Figura 1). A este fin, se construyó una biblioteca de fagos que exhibía VHs humanos con un tamaño de 6 x 108 y se propagó en forma de calvas en placas de agar. En las placas de titulación, la biblioteca estaba constituida esencialmente por pequeñas calvas intercaladas con algunas grandes. La PCR en 20 clones reveló que las calvas pequeñas correspondían a los fagos que presentaban VH, mientras que las grandes representaban los fagos de tipo salvaje, es decir, fagos que carecían de inserciones de la secuencia VH. No se encontró ninguno de los fagos que presentaban VH con morfología de calvas grandes. Esto no era inesperado, dada la escasez de los VHs monómeros en el repertorio humano y el gran tamaño de la biblioteca. Para facilitar la identificación de VHs monómeros, se decidió reducir la biblioteca a un tamaño manejable y eliminar los fagos de tipo salvaje causantes de interferencia con morfología de gran tamaño de calva por lavado en batea de la biblioteca contra proteína A que se fija a un subconjunto de VHs humanos de la familia VH3.
Después de unas cuantas tandas de lavado en batea, la biblioteca se enriqueció en fagos que producían calvas grandes, y PCR y la secuenciación de más de 110 de dichas calvas demostraron que todas ellas tenían marcos de lectura abiertos VH completos. El tamaño de las calvas grandes que se seleccionaron para análisis se representa en la Figura 1.La secuenciación reveló 15 VHsdiferentes que pertenecían alafamiliaVH3 yutilizabansegmentosVde línea germinal DP-38, DP-47, V3-49, V3-53, YAC-5 u 8-1B (Tabla 1; Figura 2). Las secuencias de línea germinal DP-38 y DP-47 se han visto implicadas con anterioridad en fijación de proteína A. Adicionalmente, todos los VHs tenían un residuo Thr en la posición 57 (Figura 2), consistente con su actividad de fijación de proteína A. El segmento V de la línea germinal utilizado más frecuentemente era DP-47, que existía en más del 50% de los VHs, pero elclon másfrecuente (a saber,HVHP428;frecuenciarelativa 46%)utilizaba elsegmento Vdelalínea germinal V3-49. HVHP429, con una secuencia de línea germinal DP-47, era el segundo VH más abundante con una frecuencia relativa de 21% (Figura 2). Las longitudes de CDR3 VH abarcaban desde 4 aminoácidos para HVHB82 hasta 16 aminoácidos para los aminoácidos de HVHP430, teniendo HVHP430 un par de residuos Cys en CDR3. Se observaron mutaciones de aminoácidos con respecto a las secuencias del segmento V de la línea germinal parental (residuos 1-94) y FR4 (residuos 103-113), en todos los VHs y estaban comprendidas entre dos mutaciones para HVHP44 (L5VyQ105R)yHVHB82 (E1QyL5Q)hasta16 mutaciones paraHVHP426(Tabla 1).Lasmutacionesse concentraban en los segmentos V; se detectaron sólo dos mutaciones en la totalidad de los 15 FR4s, en las posiciones 105 y 108. HVHP44 y HVHB82 diferían de otros VHs en que ambos tenían un aminoácido cargado positivamente en la posición 105 en lugar de un Gln (Tabla 1; Figura 2). No obstante, si bien el aminoácido con carga positiva en HVHP44se adquiría pormutación,el de HVHB82 estaba codificado en la línea germinal.Excepto en lo que respecta a HVHP423 y HVHP44B, los VHs restantes tenían los residuos de la línea germinal en las posiciones de solubilidad principales: 37V/44G/45L/47W o 37F/44G/45L/47W (HVHP428); HVHP423 y HVHP44B tenían una mutación V37F. Las mutaciones en otras posiciones que se demuestra o se supone son importantes en la solubilidad de VHincluían siete E6Q, tres S35T/H, una R83G y una K83R, una A84P y una T84Ay una M108L. Se observaban también mutaciones frecuentes en las posiciones 1 y 5 que incluían once E1Q, ocho L5V/Q y una mutación V5Q.
Caracterización biofísica de los VHs humanos
Todos losVHsexcepto HVHP44B,que era esencialmente el mismo queHVHP423, se expresaronen volúmenes de cultivo de 1 litro en la cepa TG1 de E. coli en fusión con el marcador c-Myc-His5 y se purificaron hasta homogeneidad de los extractos periplásmicos por cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC). Los rendimientos de expresión oscilaban desde 1,8 a 62,1 mg de proteína purificada por litro de cultivo bacteriano en matraces de sacudidas, teniendo la mayoría de los VHs rendimientos de varios miligramos (Tabla 2). En el caso de HVHP423 y HVHP430, otra prueba en condiciones de expresión "aparentemente" iguales dio rendimientos de 2,4 y 6,4 mg frente a 62,1 y 23,7 mg, respectivamente. Esto implica que para muchos de los VHs descritos en esta memoria deberían alcanzarse condiciones de expresión óptimas, sin mucho esfuerzo, dando como resultado rendimientos de expresión significativamente mayores que los valores consignados en la Tabla 2. Como era de esperar, la totalidad de los VHs se fijaban a la proteína A en análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR), con KDs de 0,2-3 μM, un intervalo y magnitud comparables a los consignados previamente para variantes de VHH de llama con actividad de fijación de proteína A. Ninguno de los VHs se fijaba a la superficie de referencia de Fab.
La tendencia a la agregación de los VHs humanos se evaluó en términos de sus estados de oligomerización por cromatografía de filtración en gel y NMR (Tabla 2). Todos los VHs se sometieron a cromatografía de filtración en gel Superdex 75. Análogamente a un VHs de llama, es decir, H11C7, todos los VHs daban un solo pico simétrico en el volumen de elución esperado para un monómero, y estaban sustancialmente exentos de cualesquiera agregados (véase el ejemplo para HVHP428 en la Figura 3A). En contraste, un VH humano típico (a saber, BT32/A6) formaba una cantidad considerable de agregados. Para tres de los VHs, se observó también un pico menor con una movilidad esperada para un dímero de VH. Los análisis SPR de los picos menores daban valores de tasa de disociación que eran significativamente más lentos que los correspondientes a los VHs monómeros, consistentes con el hecho de que se trataba de dímeros. El pico del dímero se observó también en el caso del VHH de llama, H11C7. Los estados de plegado y oligomerización de los VHs a concentraciones altas se estudiaron ulteriormente por espectroscopia NMR. Como se muestra en la Tabla II, todas las proteínas VH estudiadas parecían ser relativamente solubles y asumían una estructura tridimensional bien plegada. Los espectros NMR unidimensionales de los fragmentos VH (Fig. 3B) exhibían pliegues estructurales característicos de dominios VH. El estado de agregación de las proteínas se evaluó también por el uso de un experimento de difusión PFG-NMR para el fragmento HVHP414 y dos isoformas, VH14 y VH14-cMyc-con y sin la secuencia c-Myc, del HVHP414. VH14 es una versión modificada de HVHP414 con una mutación c-Myc N132E y con un residuo metionina adicional en el término N. En resumen, los datos PFG-NMR (no presentados) indicaban que todas las muestras de proteína tenían los pesos moleculares monómeros esperados incluso a las concentraciones de proteína relativamente altas utilizadas para los experimentos NMR.
Se investigó ulteriormente la estabilidad de los VHs en términos de su resistencia a tripsina a integridad a 37ºC después de incubaciones largas a 37ºC. La tripsina escinde las cadenas principales amídicas de los polipéptidos en el término C de un residuo Arg o Lys. Existen 9-13 residuos Arg y Lys en los VHs humanos (Figura 2). Existe también un residuo Lys adicional en el marcador c-Myc del terminal C que es sensible a la digestión por tripsina. La Figura 4a es un análisis SDS-PAGE de HVHP414 durante la digestión con tripsina. En el transcurso de una hora, la banda original se convertía completamente en un producto simple que tenía una movilidad esperada para el VH sin marcador c-Myc-His5 alguno. Se obtuvo el mismo resultado para otros 12 VHs después de incubación de una hora con tripsina. La espectrometría de masas en una muestra seleccionada al azar de los VHs tratados con tripsina (a saber, HVHP414, HVHP419, HVHP420, HVHP423, HVHP429, HVHP430 y HVHM81) confirmó que en todos los casos la masa molecular del producto digerido correspondía a un VH con el c-Myc Lys como el residuo C-terminal. HVHM41 daba un fragmento significativamente más corto que el resto después de digestión, y en este caso los experimentos de espectrometría de masasmapeaban el sitio de escisión al Arg 99 en CDR3 (datos no presentados).
Once VHs comprendidos en concentración desde 0,32 mg/ml (HVHP428) hasta 3,2 mg/ml (HVHP420) se incubaron a 37ºC durante 17 días. Su estabilidad se determinó subsiguientemente en términos de estado de oligomerización y fijación de proteína A. Como se demostró por cromatografía de filtración en gel, el tratamiento de VHs a 37ºC no producía formación alguna de agregados: todos los VHs daban perfiles de cromatograma que eran virtualmente idénticos a los de VHssin trataryse mantenían esencialmentecomomonómeros(véaseelejemplopara HVHP420; Figura 4c). Para asegurar que los VHs mantenían su plegamiento nativo después del tratamiento a 37ºC, se seleccionaron al azar dos VHs, a saber, HVHP414 (1,2 mg/ml) y HVHP420 (3,2 mg/ml), y se determinaron sus KDs de fijación a la proteína A por SPR (datos presentados para HVHP420; recuadro en la Figura 4c) y se compararon con los KDs obtenidos para VHs sin tratar (Tabla 2). Los KDs calculados para los VHs tratados térmicamente eran 1,4 μM y 1,0 μM para HVHP414 y HVHP420, respectivamente. Estos valores son esencialmente idénticos a los valores correspondientes para los VHs sin tratar (Tabla 2), demostrando que el tratamiento de VHs a 37ºC no afectaba a su plegamiento nativo. La posibilidad de que los VHs puedan haber estado en un plegamiento no nativo menos compacto durante los periodos de incubación a 37ºC y hayan adquirido nuevamente su plegamiento nativo después de volver a la temperatura ambiente durante los experimentos de filtración en gel y SPR es poco probable en vista del hecho de que los VHs eran resistentes a tripsina a 37ºC (véase arriba), una propiedad asociada típicamente para proteínas nativas bien plegadas.
La eficiencia de replegado (RE) de los VHs humanos se investigó por comparación de los valores KDs de la fijación de los VHs nativos (KDn) y los replegados y tratados térmicamente (KDref) a la proteína A (Tanha, J. et al., 2002). Cuando se desactiva una fracción del VH por tratamiento térmico, el valor KD medido sería mayor, dado que este parámetro está basado en la concentración de fragmento de anticuerpo plegado, es decir, activo. Así, la ratio de KDn a KDref da una medida de la RE de VH. La Figura 5 compara sensogramas para fijación de HVHP423 a proteína A inmovilizada en estados nativo (líneas gruesas) y replegado (líneas finas) para varias concentraciones de VH seleccionadas. Como puede verse, la fijación del VH replegado a la proteína A es menor en todos los casos, lo que indica que el desplegado no es totalmente reversible. Para cada uno de los 14 VHs, se midió la fijación a la proteína A en ambos estados nativo y replegado a varias concentraciones, y se determinaron los valores KDs y subsiguientemente REs (Tabla 2, no se muestran los valores KDref). Se determinaron también los valores KDs y REs de dos VHHs anti-idiotípicos de llama, H11F9 y H11B2, que se utilizaron como referencias. Cuatro VHs tenían REs en el intervalo de 92%-95%, similares a las REs para H11F9 y H11B2, 95% y 100%, respectivamente. Otros cinco tenían REs en el intervalo de 84%-88% y tres superiores a 70%. Únicamente dos tenían RE significativamente menor: HVHP413 (52%) y HVHP421 (14%). Varios VHHs publicados examinados con anterioridad tenían RE próxima a 50% (van der Linden, R.H. et al., 1999).
Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago VH humanas. Se sintetizó cDNA a partir de mRNA de bazo humano (Ambion Inc., Austin, TX) utilizando cebadores hexanucleotídicos aleatorios y el kit de DNA de la Primera Cadena™ (GE Healthcare, Baie d'Urfé, QC, Canadá). Utilizando los cDNAs como molde, se amplificaron genes de VH con secuencias CH flanqueantes por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en nueve reacciones separadas utilizando cebadores específicos de la región de entramado 1 (FR1) de VH y un cebador específico de inmunoglobina M (de Haard, H.J. et al., 1999). Los productos se purificaron en gel y se utilizaron
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como el molde en la segunda tanda de PCR para construir genes de VH utilizando los cebadores específicos de FR1 y FR4 (de Haard, H.J. et al., 1999) que introducían también sitios de restricción flanqueantes ApalI y NotI para propósitos de clonación. Los DNAs resultantes del repertorio VH se clonaron en el vector de fago fd-tetGIIID y se construyó una biblioteca de presentación de fago de VH (Tanha, J. et al., 2001). El lavado en batea contra proteína A (Amersham Biosciences Inc.) se realizó como ha sido descrito (Tanha, J. et al., 2001). La asignación de secuencias de la línea germinal de los VHs seleccionados se realizó utilizando el software DNAPLOT, Version 2.0.1 y V BASE Version 1.0. (http://vbase.dnaplot.de/cqi-bin/vbase/vsearch.pl). Se aislaron los VHHs de llama H11C7, H11F9 y H11B2 de una biblioteca de presentación de fagos VHH de llama por lavado en batea contra H11 scFv como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2002).
Expresión y purificación de VH. Se clonaron VHs en vectores de expresión pSJF2 por técnicas estándar de clonación (Sambrook, J. Fritsch E.F. y Maniatis P, 1989). La expresión periplásmica de sdAbs y la purificación subsiguiente por cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) se realizaron como se ha descrito (Muruganandam, A. et al., 2002). Las concentraciones de proteínas se determinaron por medidas de A280 utilizando los coeficientes de absorción molar calculados para cada proteína (Pace, C.N. et al., 1995). La cromatografía de filtración en gel de los VHs purificados se realizó en una columna Superdex 75 (GE Healthcare) como ha sido descrito (Deng, S.J. et al., 1995).
Experimentos de eficiencia de fijación y replegado. Las constantes de disociación de equilibrio (KDs) y las eficiencias de replegado (REs) de VHs/ VHHs se derivaron de datos de resonancia de plasmones de superficie (SPR) recogidos con elsistemabiosensorBIACORE3000 (BiacoreInc.,Piscataway,NJ).Para medirlafijación de VHsa la proteína A, se inmovilizaron 2000 unidades de resonancia (RUs) de proteína A o un fragmento de fijación de antígeno (Fab) de referencia sobre chips sensores CM5 de grado investigación (Biacore Inc.). Las inmovilizaciones se realizaron a concentraciones de 25 μg/ml (prote ínaA)o 50μg/ml (Fab) en tamp ón de acetato de sodio 10 mM de pH 4,5, utilizando el kit de acoplamiento de aminas proporcionado por el fabricante. Para medir la fijación de los VHHs anti-idiotípicos de llama a H11 scFv, se inmovilizaron 4100 RUs de H11 scFv de 50 μg/ml o 3000 Rus de Se155-4 IgG de referencia de 10 μg/ml, como se ha descrito arriba. En todos los casos, los an álisis se realizaron a 25ºC en HEPES 10 mM, de pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mMy 0,005% de P20 a un régimen de flujo
de 40 μl/min, y las superficies se regeneraron por lavado con el tamp
ón de desplazamiento. Para determinar las actividades de fijación de las proteínas replegadas, se desnaturalizaron VHs o VHHs por incubación a 85ºC durante
20 min a concentraciones de 10 μg/ml. Las muestras de prote
ína se enfriaron luego a la temperatura ambiente durante 30 min y se replegaron y centrifugaron subsiguientemente en una microcentrífuga a 14000 rpm durante 5 min a la temperatura ambiente para eliminar cualesquiera precipitados de proteína. Se recuperaron los sobrenadantes y se analizaron respecto a actividad de fijación por SPR como se ha descrito arriba. Tanto para las proteínas plegadas como para las replegadas, se ajustaron los datos a un modelo de interacción 1:1 simultáneamente utilizando software BIAevaluation 4.1 (Biacore Inc.) y se determinaron subsiguientemente los valores KDs. Los valores REs se determinaron a partir de
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donde KDn es el valor KD de la proteína nativa y KDref es el valor KD de la proteína replegada.
Experimentos de digestión con tripsina. Se añadieron 3 μl de una tripsina de grado secuenciación de 0,1 μg/μl reciénpreparada (Hoffmann-La RocheLtd.,Mississauga,ON,Canadá)enHCl 1mMa 60 μg de VH en tampón Tris-HCl 100 mM de pH 7,8. Las reacciones de digestión se realizaron en un volumen total de 60 μl durante 1 hora a 37ºC y se pararon por adición de 5 μl de inhibidor de tripsina de 0,1 μg/μl (Sigma, Oakville, ON, Canadá). Una vez completada la digestión, se retiraron 5 μl y se analizaron por SDS-PAGE; el resto se desaló utilizando ZipTipC4 (Millipore, Nepean, ON, Canadá), se eluyó con ácido acético al 1% en metanol:agua 50:50 y se sometió a determinación de la masa de VHpor espectrometría de masas MALDI.
Estudios de estabilidad de las proteínas a 37ºC. Anticuerpos mono-dominio (sdAbs) a concentraciones de 0,323,2 mg/mlse incubaron a 37ºC en tampón PBS durante 17 días. Después de la incubación, lasmuestras de proteína se centrifugaron en una microcentrífuga a la velocidad máxima durante 5 min incluso en ausencia de cualquier formación visible de agregados. Las muestras se aplicaron luego a una columna de exclusión por tamaños Superdex 75 (GE Healthcare) y los picos de monómero se recogieron para análisis SPR contra proteína A. Los análisis SPR seefectuaron como se ha descrito arriba excepto quese inmovilizaron500 RUs de proteína Ao Fab de referencia y que las inmovilizaciones se realizaron a concentración de 50 μg/ml.
Experimentos NMR. Muestras de VH para análisis NMR se disolvieron en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, y NaN3 al 0,02% a pH 7,0. Las concentraciones de proteína eran 40 -1,0 mM. Todos los
μM
experimentos NMR se realizaron a 298 K en un espectrómetro Bruker Avance-800 o Bruker Avance-500 NMR. Los espectros 1HNMR unidimensionales (1D) se registraron con 16384 puntos de datos y las anchuras espectrales eran 8992,81 Hz a 500 MHz y 17605,63 Hz a 800 MHz, respectivamente. Se adquirieron espectros 1H-1H-NOESY bidimensionales de 2048 x 400 puntos de datos en un espectrómetro Bruker Avance-800 NMR con una anchura espectralde11990,04 Hzyun tiempodemezcla de 120ms.Entodoslosexperimentos NMR,la supresión delagua se realizó utilizando el método WATERGATE implementado por el tren de impulsos 3-9-19 (Piotto, M. et al., 1992; Sklenar, V. et al., 1993). Los datos NMR se procesaron y analizaron utilizando el paquete de software Bruker XWINNMR. Todas las medidas de difusión PFG-NMR se realizaron con la secuencia LED previa supresión del agua (Altieri, A.S. et al., 1995), en un espectrómetro Bruker Avance-500 NMR, equipado con una sonda de resonancia triple con gradientes triaxiales. Los espectros unidimensionales de protones se procesaron y analizaron utilizando el paquete de software Bruker XWINNMR. Las intensidades de las señales NMR se obtuvieron por integración de los espectros NMR en la región de los protones de metilo y metileno (2,3 ppm a -0,3 ppm), donde todas las señales NMR se atenuaban uniformemente para todas las concentraciones de PFG dadas.
Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago humanas VL. Se sintetizaron cDNAs a partirdemRNAde bazo humano como se ha descrito arriba para los VHshumanos.Se utilizó elcDNAcomo molde en la PCR para amplificar los genes VL en volúmenes de reacción de 50 μl utilizando seis cebadores VK inversos, once cebadores Vλ inversos (de Haard, H.J. et al., 1999), cuatro cebadores Vκ directos y dos cebadores Vλ directos (Sblattero, D. et al., 1998). Los cebadores inversos y directos se modificaron de modo que tuvieran sitios de restricción flanqueantes Apa LI y Not I, respectivamente, para propósitos de clonación subsiguientes. Los cebadores directos se agruparon en ratios que reflejaban su grado de degeneración. Los genes Vλ se sometieron a PCR en once reacciones separadas utilizando los cebadores directos Vλ agrupados y once cebadores inversos Vλ individuales. Análogamente, los genes Vλ se amplificaron en seis reacciones separadas utilizando los cebadores directos VK agrupados y seis cebadores inversos Vλ individuales. Los productos PCR se agruparon, se purificaron en gel y se digirieron con las endonucleasas de restricción Apa LI y Not I. La biblioteca se construyó como se describe para los VHs humanos. La PCR de las calvas se realizó sobre colonias de bibliotecas individuales y los genes VL amplificados se secuenciaron como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2003). El lavado en batea contra la proteína L (Biolynx Inc., Brockville, ON, Canadá) y la asignación de la secuencia de la línea germinal de los VHs seleccionadosse realizaron como se ha descrito arriba para la biblioteca VHhumana.
Expresión y purificación de VL. La expresión, purificación, determinación de la concentración y cromatografía de filtración en gel de VL se realizaron como se ha descrito para VHs en "expresión y purificación de VH".
Expresión y purificación de pentámeros de VL y VH. Se utilizaron cebadores específicos en una PCR estándar para amplificar los genes HVHP328 VH y HVLP335 VL. Se utilizaron técnicas estándar de clonación para clonar los genes HVHP328 y HVLP335 en fusión con el gen del dominio de pentamerización VT1B en un vector de expresión para producir pentámeros HVHP328PVT2 y HVLP335PTV2, (Zhang, J. et al., 2004). Los pentámeros se expresaron y purificaron como se ha descrito (Zhang, J. et al., 2004). Las concentraciones de proteína se determinaron como anteriormente.
Resonancia de plasmones de superficie de VLs. Las cinéticas de fijación para la interacción de los VLs a la proteína L se determinaron porSPR utilizandoelsistema biosensorBIACORE3000 (Biacore,Inc.,Piscataway,NJ). 680 RUs de proteína L u 870 RUs de una referencia Fab se inmovilizaron sobre chips sensores CM5 de grado investigación (Biacore). Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a una concentración de proteína de 50 μg/ml en tampón de acetato 10 mM de pH 4,5 utilizando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante. Todas las medidas se realizaron a 25ºC en tampón HEPES 10 mM de pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005% de P20 a un régimen de flujo de 50 μl/min o 100 μl/min. Las superficies se regeneraron por lavado con el tampón de desplazamiento. Los datos se evaluaron utilizando el software BIAevaluation 4.1 (Biacore, Inc.).
Resonancia de plasmones de superficie de los pentámeros de VL y VH. Se determinaron también por SPR las cinéticas de fijación para la interacción de HVHP328PVT2 con proteína A y HVLP335PTV2 con proteína L. Se inmovilizaron como anteriormente 520 RUs de proteína A o una Fab de referencia. Para el pentámero de VL, se utilizaron las mismas superficies preparadas anteriormente. Las medidas se efectuaron como anteriormente pero a un régimen de flujo de 20 μl/min. Las superficies se regeneraron por lavado con HCl 50 mM durante 3 s. Los datos se evaluaron como se ha descrito para los monómeros.
Microaglutinación de células
Se utilizó una sola colonia de S. aureus de una placa BHI para inocular 15 ml de medio BHI. Las bacterias se dejaron crecer durante una noche a 37ºC a 200 rpm. A la mañana siguiente, se centrifugó el cultivo en una centrífuga Sorvall RT6000B refrigerada de cubeta oscilante a 4000 rpm durante 10 min, se retiró el sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió en tampón PBS. Se centrifugaron de nuevo las células, se retiró el sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió de nuevo en tampón PBS. Se diluyeron las células a un valor A600 de 1,0, y se extendieron diluciones en serie de las células en placas BHI a 37ºC para crecimiento durante la noche. A la mañana siguiente se determinó el título de células. Un valor A600 de 1,0 correspondía a 1,5 x 109 células ml-1. Se dieron pasos idénticos para preparar células de la cepa TG1 de E. coli para ensayos subsiguientes de microaglutinación, excepto que el medio de crecimiento era 2 x YT. Los recuentos viables fueron similares, A600 1,0 = 2,1 x 109 células ml-1 .
Para realizar los ensayos de microaglutinación, se realizaron diluciones al doble de HVHP328PVT2 en PBS de los pocillos 1 a 11 en una placa de microtitulación. El pocillo 12 (blanco) tenía únicamente PBS. El volumen total en cada pocillo era 50 μl. Subsiguientemente, se añadieron 1 x 108 células de S. aureus en 50 μl de PBS a todos los pocillos, y la placa se incubó durante una noche a 4ºC. Para tenerun registro permanente de los resultados,se tomó una fotografía de la placa durante la mañana. Para el experimento de control de pentámeros, se reemplazó HVHP328PVT2 con el pentámero de VL, HVLP335PTV2. En los experimentos de control de células, se repitieron las dos mismas series de experimentos con células TG1 de E. coli.
Identificación y análisis de la secuencia de los VLs humanos monómeros
Se aplicó esencialmente el mismo método de selección empleado para aislar VHs solubles de una biblioteca de presentación de fago VH humana a una biblioteca VL humana para aislar los VLs solubles monómeros. Se construyó una biblioteca VL humana con un tamaño de 3 x 106. Se seleccionaron 24 calvas de las placas de titulación de la biblioteca y sus genes VL se sometieron a PCR y se secuenciaron. Las secuencias eran diversas en términos de origen de la línea germinal, aunque el 75% de los VLs eran de origen Vλ (datos no presentados). Tres tandas de lavado en batea contra la proteína L dieron como resultado el enriquecimiento de calvas grandes. Treinta ynueve de las calvas grandes se secuenciaron y se identificaron treinta y dos secuencias singulares (Figura 6). HVLP325, HVLP335 y HVLP351 aparecían con frecuencia de 3, 4 y 2, respectivamente. Excepto HVLP389 que es de la clase lambda (subgrupo Vλ1, línea germinal 1b), los 31 VL restantes pertenecían a la clase Vκ.De los 31 VLs Kappa, 24 caen dentro del subgrupo VκIII y 7 dentro del subgrupo Vκ1. DiecisκIII utilizan la
éis de las 24 secuencias Vsecuencia de línea germinal L6, utilizando las restantes las secuencias de línea germinal A27, L2 y L6. Los VLs del subgrupo Vκ1 se originan a partir de la secuencia de línea germinal O2/O12 o A30. En la posición 96 se producían mutaciones notables. Los aminoácidos de la línea germinal en esta posición son aminoácidos aromáticos e hidrófobos Trp, Phe, Tyr, Leu o Ile para VLs kappa y Tyr, Val o Ala para los VLs lambda. Pero en la agrupación seleccionada de VLs kappa únicamente 5 de 31 tienen sus aminoácidos de la línea germinal en la posición 96: HVLP325, HVLP349, HVLP388, HVLP3109 y HVLP393. Veintiún aminoácidos en la posición 96 están cargados, de los cuales 20 tienen carga positiva: Arg, Lys o His. Dos aminoácidos son Pro, uno Gln, uno Ser y uno Thr. De siete VLs kappa analizados por cromatografía de filtración en gel respecto a caráctermonómero, seis que tenían Arg o Lys en la posición 96 eran también monómeros, entanto queHVLP325conelaminoácido Leu de lalínea germinalen la posición 96 formaba agregados(véasemás adelante).Análogamente,HVLP389 que era de la clase lambdaytenía una mutación de la línea germinal a Ser era también monómero (véase más adelante). Estos datos correlacionan la desviación de los aminoácidos de la línea germinal en la posición 96 (27 de 32) con propiedades biofísicas mejoradas de VLs tales como el carácter monómero.
Dieciocho VLs de la clase kappa tenían sus tres últimos residuos (105-107) reemplazados con aminoácidos Thr, Val y Leu que se encuentran únicamente en los VLs lambda. Estas sustituciones pueden haber tenido un papel en la mejora de las propiedades biofísicas de los VLs kappa, dando como resultado la selección de los VLs mencionados anteriormente sobre los clones parentales con los residuos kappa originales en la posición 105-107.
Caracterización de los VLs humanos
Ocho de los VLs seleccionados con orígenes diferentes de la línea germinal V se expresaron en E. coli en cultivos de 1 litro y se purificaron: HVLP324, HVLP325, HVLP335, HVLP342, HVLP351, HVLP364, HVLP389 y HVLP3103 (Tabla 6). Todos ellos se expresaban con buenos rendimientos comprendidos entre 6,2 mg para HVLP324 y alrededor de 75 mg para HVLP335 yHVLP364.
La tendencia a la agregación de los VLs humanos se evaluó en términos de su estado de oligomerización por cromatografía de filtración en gel. Los VLs se sometieron a cromatografía de filtración en gel Superdex 75 a una concentración de 0,6 mg/ml. Todos excepto HVLP325 estaban esencialmente exentos de agregados y daban picos simples simétricos con el peso molecular medio aparente de 12,7 KDa (intervalo, 6,2-19,2 KDa) (Figura 7a y Tabla 3). Esto está de acuerdo con la masa molecular esperada para VLs monómeros, 13,4-13,8 KDa. La variación de masa molecular aparente para anticuerposmono-dominio ha sido consignada previamente (Jespers, L. et al., 2004a; Stevens, F.J. et al., 1980). Para HVLP325, los agregados formaban 11% de la proteína total (agregado más monómero). HVLP351, HVLP342, HVLP335 y HVLP3103 eran todavía monómeros cuando se testaron a su máxima concentración disponible, a saber, 0,89 mg/ml, 1,0 mg/ml, 4,9 mg/ml y 5,9 mg/ml, respectivamente (Figura 7B).
Se sometieron los VLs a cromatografía con Superdex-75 antes del análisis BIACORE y los picos de monómero purificados se recogieron incluso en ausencia de cualquier evidencia de material agregado. En el análisis SPR, todos los VLs seleccionados se fijaban a proteína L (Figura 8). Esto no era inesperado, dado que los VLs se aislaron por lavado en batea contra proteína L. Para todos ellos, los valores KDs de fijación a proteína L estaban comprendidos entre 0,6 y 3 μM (Tabla 3). HVLP324 y HVLP342 tenían valores KDs adicionales más pequeños, 10 nM y 40 nM, respectivamente. Las fijaciones de afinidad baja y de afinidad alta de los VLs del subgrupo VκI a la proteína L han sido consignadas previamente (Referencia). Ambos, HVLP324 y HVLP342, pertenecen al subgrupo VκI (Tabla 3). Como era de esperar, los datos cinéticos y de equilibrio eran consistentes con el hecho de que el pico monómero fuera realmente monómero.
Análisis de fijación de pentámeros
Las fijaciones del pentámero HVHP328PVT2 a proteína A y del pentámero HVLP335PTV2 a proteína L se determinaron por resonancia de plasmones de superficie (Figura 9). Las tasas de asociación se calcularon independientemente a partir de gráficas de kobs frente a la concentración. Pudo calcularse más de una tasa de disociación (KD) debido a la heterogeneidad en fijación multivalente entre la población de pentámeros. Por esta razón, pudo obtenerse más de una constante de disociación de equilibrio, KD. HVHP328PTV2 y HVLP335PTV2 tenían valores KDs mínimos de 2 nM y 200 pM, respectivamente (Tabla 4). Con KDs más lentas, HVHP328PTV2 y HVLP335PTV2 tenían valores KDs tan bajos como 900 y 90 pM, respectivamente.
Detección de patógenos por VLs y VHs
La actividad de fijación a proteína A y L de los VHs y VLs puede utilizarse para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. Esto es posible si los VHs y VLs son solubles y monómeros (falta de tendencia a agregarse) tales como los VHs y VLs de esta invención. Los dominios variables derivados de anticuerpos que carecen de cadenas ligeras tales como los anticuerpos de cadena pesada de Camélidos o los IgNARs de tiburón nodriza y tiburón alfombra sonnaturalmente solubles ymonómeros.De éstos,losqueposeenactividaddefijacióna proteína A y L pueden utilizarse también para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. La proteína A está presente en la superficie de las bacterias patógenas Staphylococcus aureus. Así, los VHs con actividad de fijación a proteína A tales como los descritos en esta memoria pueden utilizarse para detectar S. aureus. Los inventores realizaron un ensayo de microaglutinación para detectar la capacidad del pentámero de VH HVHP328PVT2 para fijarse a S. aureus. Se incubaron un número constante de células bacterianas con diluciones al doble de HVHP328PVT2 en pocillos de microtitulación (pocillos 1-11) (Figura 10). El pocillo 12 contenía tampón en lugar del pentámero. Si los VHs se fijan a las células bacterianas, entonces el pentámero, debido a su naturaleza multímera, debería ser capaz de reticular las células y dar como resultado aglutinación celular. Las células aglutinadas aparecerán como células difusas en un pocillo de microtitulación (Figura 10). En ausencia de cualquier fijación, no ocurriría aglutinación alguna, es decir ausencia de aglutinación, y las células aparecerán como una manchaen el fondodel pocillo.Como se muestra en la Figura 10,elpentámerose fija a S. aureus, dado que existe aglutinación de células. La aglutinación se observa hasta el pocillo 7. Más allá del pocillo 7, la concentración del pentámero es demasiado baja para la fijación, por lo que no se produce aglutinación alguna. El pentámero de control VL no exhibe aglutinación alguna, demostrando la especificidad del pentámero VH para S. aureus (Figura 10). La fijación es también específica en cuanto a las células, dado que el pentámero VH, como era de esperar, no aglutina células de E. coli (cepa TG1) o de Salmonella (datos no presentados). Análogamente, los monómeros de VL y pentámeros de VL con actividad de fijación de proteína L pueden utilizarse para la detección de bacterias, en particular bacterias patógenas tales como Peptostreptococcus magnus, que tienen proteína L en la superficie de sus células.
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Tabla 1. Desviaciones de secuencia de VH respecto a las secuencias de la línea germinal parental
imagen2
Tabla 2. Características biofísicas de los VHs humanos
imagen3
# Rendimiento de expresión por litro de cultivo bacteriano
* KDs y REs se determinaron contra H11 scFv.
Tabla 3. Características de los VLs humanos
VL
Subgrupo Expresióna KD Estado de oligomerizaciónb
mg
μM
HVLP324
VκI 6,9 0,2, 0,01c Monómero
HVLP325
VκIll 6,2 1 Monómero/Agregado
HVLP335
VκIll 73,5 2 Monómero
HVLP342
VκI 7,7 0,6, 0,04c Monómero
HVLP351
VκIll 8,9 2 Monómero
HVLP364
VκIll 77,1 3 Monómero
HVLP389
VλI 16,7 1 Monómero
HVLP3103
VκIll 19,0 1 Monómero
aRendimiento de expresión por litro de cultivo bacteriano. bEl estado de oligomerización se determinó por cromatografía de filtración en gel. c Los valores KD más pequeños corresponden a la fijación de HVLP324 y HVLP342 a los sitios de afinidad alta en la
proteína L.
Tabla 4. Constantes cinéticas y de equilibrio para las fijaciones de HVHLP328PTV2 y HVLP335PTV2 a proteína A y L, respectivamente
Pentacuerpo
HVHP328PTV2 HVLP335PTV2
ka (M-1s -1)
4,3 x 105 1,7 x 106
KD (s)
<1 x10-3 < 4 x 10-4
KD (M)
<2 x 10-9 <2 x 10-10

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34.
  2. 2.
    El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 en el que el fragmento de anticuerpo es un VL.
  3. 3.
    Una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2.
    5 4. Un multímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.
  4. 5.
    Un dímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.
  5. 6.
    Un trímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.
  6. 7.
    Un pentámero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.
  7. 8.
    Un vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3.
    10 9. Una célula hospedadora transformada con el vector recombinante de la reivindicación 8.
  8. 10. Un método para producir una biblioteca de fragmentos de anticuerpo, que comprende:
    a) proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2; b) proporcionar secuencias de oligonucleótidos con codones aleatorizados;
    15 c) incorporar los oligonucleótidos aleatorizados en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal modo que una o más de una de las regiones determinantes de la complementariedad está aleatorizada; y
    d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en el paso c).
  9. 11. Uso de la biblioteca de fragmentos DE anticuerpo obtenida por el método de la reivindicación 10, para 20 cribar las secuencias expresadas respecto a fijación a un polipéptido diana.
  10. 12. El uso de la reivindicación 11, en el que el cribado comprende lavado en batea contra una molécula diana.
    45
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