ES2565782T3

ES2565782T3 - Método para aislamiento de polipéptidos solubles

Info

Publication number: ES2565782T3
Application number: ES10190093.4T
Authority: ES
Inventors: Jamshid Tanha
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2026-03-24
Also published as: JP6374851B2; EP2316948A1; EP2368991B1; ES2375826T3; EP2330196A3; EP2368997A2; EP2336325A1; EP2338999A2; ES2558338T3; EP2322622A2; EP2338999A3; EP2322624A2; EP2360256B1; EP2368991A3; EP2336326A3; JP2018110583A; US20090220485A1; EP2386638A3; EP2368994A2; EP2338997A1

Abstract

Un fragmento de anticuerpo que comprende la porción de la región de entramado (FR) 1, FR2, FR3, y FR4 de la secuencia de SEC ID Nº: 12.

Description

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mismos. Además, la correlación observada entre el tamaño de las calvas de fago y el rendimiento de expresión de VH significa que es posible utilizar el presente enfoque para adquirir versiones de alta expresión de proteínas que tienen en caso contrario expresión pobre o insatisfactoria a partir de bibliotecas de presentación de fagos mutantes. Esta aplicación podría ser particularmente atractiva en el caso de proteínas terapéuticas o reactivos proteínicos de expresión pobre en los que el refuerzo de la expresión de proteínas podría contrarrestar significativamente el coste de producción de éstas.

Análisis de fijación de pentámeros

Tanto VLs como VHs son susceptibles de pentamerización, y la pentamerización puede utilizarse para convertir rápidamente un monómero de VL o VH de afinidad baja en un pentámero de VL o VH de afinidad alta. Tales pentámeros son agentes de diagnóstico y detección inestimables. En tales aplicaciones, la fijación de un pentámero de VL o VH a su diana puede ser detectada por una molécula informadora tal como una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina), o una molécula fluorescente conjugada al pentámero. Alternativamente, la fijación al pentámero puede ser detectada por una molécula secundaria que está conjugada a una molécula informadora. La molécula secundaria puede ser específica para el pentámero propiamente dicho o para una etiqueta del mismo, tal como una etiqueta 6His o una etiqueta c-Myc. Por ejemplo, una molécula secundaria típica es una inmunoglobulina.

Las interacciones entre los VHs con proteína A y los VLs con proteína L son fundamentalmente diferentes de las existentes entre VHs y VLs con sus antígenos diana. La fijación de antígeno de un VH o un VL implica tres bucles de fijación de antígeno que forman el sitio de combinación de un dominio de anticuerpo. La fijación de proteína A de un VH con actividad de fijación de proteína A y un VL con actividad de fijación de proteína L implican sitios de fijación y residuos en los dominios de anticuerpo que son totalmente distintos del sitio de combinación del anticuerpo. Así, un VH con actividad de fijación de proteína A puede fijarse simultáneamente a proteína A y su antígeno diana, y un VL con actividad de fijación de proteína L puede fijarse simultáneamente a proteína L y su antígeno diana. Dado que los presentes VHs y VLs tienen afinidad para proteína A y L, respectivamente, pueden utilizarse proteína A y L como la molécula secundaria para las aplicaciones de detección y diagnóstico arriba mencionadas. Los pentámeros de VH y VL humanos pueden utilizarse también para terapia.

Detección de patógenos por los pentámeros

La actividad de fijación de proteína A y L de los VHs y VLs puede utilizarse para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. La proteína A está presente en la superficie de la bacteria patógena Staphylococcus aureus. Así, los VHs con actividad de fijación de proteína A tales como los descritos en esta memoria pueden utilizarse para detectar S. aureus. Análogamente, los monómeros de VL y pentámeros de VL con actividad de fijación de proteína L pueden utilizarse para la detección de bacterias, en particular bacterias patógenas tales como Peptostreptococcus magnus, que tienen proteína L en su superficie celular.

La proteína L está implicada como factor virulento en la patogénesis de P. magnus (Ricci, s. et al., 2001) en humanos. En la vaginosis, se cree que la proteína L ejerce su efecto por reticulación de la IgE asociada a la superficie. Los monómeros y/o pentámeros de VL con actividad de fijación de proteína L tienen potencial como agentes terapéuticos dado que podrían interferir con la acción reticuladora de IgE de la proteína L.

La proteína A está implicada como factor virulento en la patogénesis de s. aureus en humanos (Fournier, B. et al., 2004). Su virulencia ha sido atribuida a su capacidad de interaccionar con componentes hospedadores que incluye fijación a anticuerpos. Los monómeros y/o pentámeros de VH con actividad de fijación de proteína A tienen potencial como agentes terapéuticos, dado que podrían interferir con la interacción de la proteína A con componentes hospedadores.

EJEMPLOS

Identificación y análisis de secuencia de VHs humanos monómeros

Durante el curso de la construcción de bibliotecas de VH totalmente humanos y humanos llamizados, se descubrió que los fagos que exhibían VHs llamizados monómeros formaban calvas mayores en céspedes bacterianos que los fagos que exhibían VHs totalmente humanos con tendencias a agregación. Por ello, se utilizó el tamaño de las calvas como medio para la identificación de VHs monómeros raros, existentes naturalmente a partir del repertorio de VHs humanos (Figura 1). A este fin, se construyó una biblioteca de fagos que exhibía VHs humanos con un tamaño de 6 x 108 y se propagó en forma de calvas en placas de agar. En las placas de titulación, la biblioteca estaba constituida esencialmente por pequeñas calvas intercaladas con algunas grandes. La PCR en 20 clones reveló que las calvas pequeñas correspondían a los fagos que presentaban VH, mientras que las grandes representaban los fagos de tipo salvaje, es decir, fagos que carecían de inserciones de la secuencia VH. No se encontró ninguno de los fagos que presentaban VH con morfología de calvas grandes. Esto no era inesperado, dada la escasez de los VHs monómeros en el repertorio humano y el gran tamaño de la biblioteca. Para facilitar la identificación de VHs monómeros, se decidió reducir la biblioteca a un tamaño manejable y eliminar los fagos de tipo salvaje causantes de interferencia

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polipéptidos en el término C de un residuo Arg o Lys. Existen 9-13 residuos Arg y Lys en los VHs humanos (Figura2). Existe también un residuo Lys adicional en el marcador c-Myc del terminal C que es sensible a la digestión por tripsina. La Figura 4a es un análisis SDS-PAGE de HVHP414 durante la digestión con tripsina. En el transcurso de una hora, la banda original se convertía completamente en un producto simple que tenía una movilidad esperada para el VH sin marcador c-Myc-His5 alguno. Se obtuvo el mismo resultado para otros 12 VHs después de una incubación de una hora con tripsina. La espectrometría de masas en una muestra seleccionada al azar de los VHs tratados con tripsina (a saber, HVHP414, HVHP419, HVHP420, HVHP423, HVHP429, HVHP430 y HVHM81) confirmó que en todos los casos la masa molecular del producto digerido correspondía a un VH con el c-Myc Lys como el residuo C-terminal. HVHM41 daba un fragmento significativamente más corto que el resto después de digestión, y en este caso los experimentos de espectrometría de masas mapeaban el sitio de escisión al Arg 99 en CDR3 (datos no presentados).

Once VHs comprendidos en concentración desde 0,32 mg/ml (HVHP428) hasta 3,2 mg/ml (HVHP420) se incubaron a 37ºC durante 17 días. Su estabilidad se determinó subsiguientemente en términos de estado de oligomerización y fijación de proteína A. Como se demostró por cromatografía de permeación en gel, el tratamiento de VHs a 37ºC no producía formación alguna de agregados: todos los VHs daban perfiles de cromatograma que eran virtualmente idénticos a los de VHs sin tratar y se mantenían esencialmente como monómeros (véase el ejemplo para HVHP420; Figura 4c). Para asegurar que los VHs mantenían su plegamiento nativo después del tratamiento a 37ºC, se seleccionaron al azar dos VHs, a saber, HVHP414 (1,2 mg/ml) y HVHP420 (3,2 mg/ml), y se determinaron sus KDs de fijación a la proteína A por SPR (datos presentados para HVHP420; recuadro en la Figura 4c) y se compararon con los KDs obtenidos para VHs sin tratar (Tabla 2). Los KDs calculados para los VHs tratados térmicamente eran 1,4 μM y 1,0 μM para HVHP414 y HVHP420, respectivamente. Estos valores son esencialmente idénticos a los valores correspondientes para los VHs sin tratar (Tabla 2), demostrando que el tratamiento de VHs a 37ºC no afectaba a su plegamiento nativo. La posibilidad de que los VHs puedan haber estado en un plegamiento no nativo menos compacto durante los periodos de incubación a 37ºC y hayan adquirido nuevamente su plegamiento nativo después de volver a la temperatura ambiente durante los experimentos de filtración en gel y SPR es poco probable en vista del hecho de que los VHs eran resistentes a tripsina a 37ºC (véase arriba), una propiedad asociada típicamente para proteínas nativas bien plegadas.

La eficiencia de replegado (RE) de los VHs humanos se investigó por comparación de los valores KDs de la fijación de los VHs nativos (KDn) y los replegados y tratados térmicamente (KDref) a la proteína A (Tanha, J. et al., 2002). Cuando se desactiva una fracción del VH por tratamiento térmico, el valor KD medido sería mayor, dado que este parámetro está basado en la concentración de fragmento de anticuerpo plegado, es decir, activo. Así, la ratio de KDn a KDref da una medida de la RE de VH. La Figura 5 compara sensogramas para fijación de HVHP483 a proteína A inmovilizada en estados nativo (líneas gruesas) y replegado (líneas delgadas) para varias concentraciones de VH seleccionadas. Como puede verse, la fijación del VH replegado a la proteína A es menor en todos los casos, lo que indica que el desplegado no es totalmente reversible. Para cada uno de los 14 VHs, se midió la fijación a la proteína A en ambos estados nativo y replegado a varias concentraciones, y se determinaron los valores KDs y subsiguientemente REs (Tabla 2, no se muestran los valores KDref). Se determinaron también los valores KDs y REs de dos VHHs anti-idiotípicos de llama, H11F9 y H11B2, que se utilizaron como referencias. Cuatro VHs tenían REs en el intervalo de 92%-95%, similares a las REs para H11F9 y H11B2, 95% y 100%, respectivamente. Otros cinco tenían REs en el intervalo de 84%-88% y tres superiores a 70%. Únicamente dos tenían RE significativamente menor: HVHP413 (52%) y HVHP421 (14%). Varios VHHs publicados examinados con anterioridad tenían RE próxima a 50% (van der Linden, R.H. et al., 1999).

Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago VH humanas. Se sintetizó cDNA a partir de mRNA de bazo humano (Ambion Inc., Austin, TX) utilizando iniciadores hexanucleotídicos aleatorios y el kit de DNA de la Primera Cadena™ (GE Healthcare, Baie d'Urfé, QC, Canadá). Utilizando los cDNAs como molde, genes de VH con secuencias CH flanqueantes se amplificaron por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en nueve reacciones separadas utilizando iniciadores específicos de la región de entramado 1 (FR1) de VH y un iniciador específico de inmunoglobina M (de Haard, H.J. et al., 1999). Los productos se purificaron en gel y se utilizaron como el molde en la segunda tanda de PCR para construir genes de VH utilizando los iniciadores específicos de FR1 y FR4 (de Haard, H.J. et al., 1999) que introdujeron también sitios de restricción flanqueantes ApalI y NotI para propósitos de clonación. Los DNAs resultantes del repertorio VH se clonaron en el vector de fago fd-tetGIIID y se construyó una biblioteca de presentación de fago de VH (Tanha, J. et al., 2001). El lavado en batea contra proteína A (Amersham Biosciences Inc.) se realizó como ha sido descrito (Tanha, J. et al., 2001). La asignación de secuencias de la línea germinal de los VHs seleccionados se realizó utilizando el software DNAPLOT, Version 2.0.1 y V BASE Version 1.0. (http://vbase.dnaplot.de/cqi-bin/vbase/vsearch.pl). Se aislaron los VHHs de llama H11C7, H11F9 y H11P2 de una biblioteca de presentación de fagos VHH de llama por lavado en batea contra H11 scFv como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2002).

Expresión y purificación de VH. Se clonaron VHs en vectores de expresión pSJF2 por técnicas estándar de clonación (Sambrook, J. Fritsch E.F. y Maniatis P, 1989). La expresión periplásmica de sdAbs y la purificación subsiguiente por cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC) se realizaron como se ha descrito (Muruganandam, A. et al., 2002). Las concentraciones de proteínas se determinaron por medidas de A280 utilizando los coeficientes de absorción molar calculados para cada proteína (Pace, C.N. et al., 1995). La cromatografía de

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filtración en gel de los VHs purificados se realizó en una columna Superdex 75 (GE Healthcare) como ha sido descrito (Deng, S.J. et al., 1995).

Experimentos de eficiencia de fijación y replegado. Las constantes de disociación de equilibrio (KDs) y las eficiencias de replegado (REs) de VHs/ VHHs se derivaron de datos de resonancia de plasmones de superficie (SPR) recogidos con el sistema biosensor BIACORE 3000 (Biacore Inc., Piscataway, NJ). Para medir la fijación de VHs a la proteína A, se inmovilizaron 2000 unidades de resonancia (RUs) de proteína A o un fragmento de fijación de antígeno (Fab) de referencia sobre chips sensores CM5 de grado investigación (Biacore Inc.). Las inmovilizaciones se realizaron a concentraciones de 25 μg/ml (proteína A) o 50 μg/ml (Fab) en tampón de acetato de sodio 10 mM de pH 4,5, utilizando el kit de acoplamiento de aminas proporcionado por el fabricante. Para medir la fijación de los VHHs anti-idiotípicos de llama a H11 scFv, se inmovilizaron 4100 RUs de H11 scFv de 50 μg/ml o 3000 Rus de Se1554 IgG de referencia de 10 μg/ml, como se ha descrito arriba. En todos los casos, los análisis se realizaron a 25ºC en HEPES 10 mM, de pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005% de P20 a un régimen de flujo de 40 μl/min, y las superficies se regeneraron por lavado con el tampón de desplazamiento. Para determinar las actividades de fijación de las proteínas replegadas, se desnaturalizaron VHs o VHHs por incubación a 85ºC durante 20 min a concentraciones de 10 μg/ml. Las muestras de proteína se enfriaron luego a la temperatura ambiente durante 30 min y se replegaron y centrifugaron subsiguientemente en una microcentrífuga a 14000 rpm durante 5 min a la temperatura ambiente para eliminar cualesquiera precipitados de proteína. Se recuperaron los sobrenadantes y se analizaron respecto a actividad de fijación por SPR como se ha descrito arriba. Tanto para las proteínas plegadas como para las replegadas, se ajustaron los datos a un modelo de interacción 1:1 simultáneamente utilizando software BIAevaluation 4.1 (Biacore Inc.) y se determinaron subsiguientemente los valores KDs. Los valores REs se determinaron a partir de

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donde KDn es el valor KD de la proteína nativa y KDref es el valor KD de la proteína replegada.

Experimentos de digestión con tripsina. Se añadieron 3 μl de una tripsina de grado secuenciación de 0,1 μg/ml recién preparada (Hoffmann-La Roche Ltd., Mississauga, ON, Canadá) en HCl 1 mM a 60 μg de VH en tampón Tris-HCl 100 mM de pH 7,8. Las reacciones de digestión se realizaron en un volumen total de 60 μl durante 1 hora a 37ºC y se pararon por adición de 5 μl de inhibidor de tripsina de 0,1 μg/μl (Sigma, Oakville, ON, Canadá). Una vez completada la digestión, se retiraron 5 μl y se analizaron por SDS-PAGE; el resto se desaló utilizando ZipTipC4 (Millipore, Nepean, ON, Canadá), se eluyó con ácido acético al 1% en metanol:agua 50:50 y se sometió a determinación de la masa de VH por espectrometría de masas MALDI.

Estudios de estabilidad de las proteínas a 37ºC. Anticuerpos mono-dominio (sdAbs) a concentraciones de 0,323,2 mg/ml se incubaron a 37ºC en tampón PBS durante 17 días. Después de la incubación, las muestras de proteína se centrifugaron en una microcentrífuga a la velocidad máxima durante 5 min incluso en ausencia de cualquier formación visible de agregados. Las muestras se aplicaron luego a una columna de exclusión por tamaños Superdex 75 (GE Healthcare) y los picos de monómero se recogieron para análisis SPR contra proteína A. Los análisis SPR se efectuaron como se ha descrito arriba excepto que se inmovilizaron 500 RUs de proteína A o Fab de referencia y que las inmovilizaciones se realizaron a concentración de 50 μg/ml.

Experimentos NMR. Muestras de VH para análisis NMR se disolvieron en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, y NaN3 al 0,02% a pH 7,0. Las concentraciones de proteína eran 40 μM-1,0 mM. Todos los experimentos NMR se realizaron a 298 K en un espectrómetro Bruker Avance-800 o Bruker Avance-500 NMR. Los espectros 1H NMR unidimensionales (1D) se registraron con 16384 puntos de datos y las anchuras espectrales eran 8992,81 Hz a 500 MHz y 17605,63 Hz a 800 MHz, respectivamente. Se adquirieron espectros 1H-1H-NOESY bidimensionales de 2048 x 400 puntos de datos en un espectrómetro Bruker Avance-800 NMR con una anchura espectral de 11990,04 Hz y un tiempo de mezcla de 120 ms. En todos los experimentos NMR, la supresión del agua se consiguió utilizando el método WATERGATE implementado por el tren de impulsos 3-9-19 (Piotto, M. et al., 1992; Sklenar, V. et al., 1993). Los datos NMR se procesaron y analizaron utilizando el paquete de software Bruker XWINNMR. Todas las medidas de difusión PFG-NMR se realizaron con la secuencia LED previa supresión del agua (Altieri, A.S. et al., 1995), en un espectrómetro Bruker Avance-500 NMR, equipado con una sonda de resonancia triple con gradientes triaxiales. Los espectros unidimensionales de protones se procesaron y analizaron utilizando el paquete de software Bruker XWINNMR. Las intensidades de las señales NMR se obtuvieron por integración de los espectros NMR en la región de los protones de metilo y metileno (2,3 ppm a -0,3 ppm), donde todas las señales NMR se atenuaban uniformemente para todas las concentraciones de PFG dadas.

Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago humanas VL. Se sintetizaron cDNAs a partir de mRNA de bazo humano como se ha descrito arriba para los VHs humanos. Se utilizó el cDNA como molde en la PCR para amplificar los genes VL en volúmenes de reacción de 50 μl utilizando seis iniciadores VK inversos, once iniciadores Vλ inversos (de Haard, H.J. et al., 1999), cuatro iniciadores Vκ directos y dos iniciadores Vλ directos

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tandas de lavado en batea contra la proteína L dieron como resultado el enriquecimiento de calvas grandes. Treintainueve de las calvas grandes se secuenciaron y se identificaron treinta y dos secuencias singulares (Figura6). HVLP325, HVLP335 y HVLP351 aparecían con frecuencia de 3, 4 y 2, respectivamente. Excepto HVLP389 que es de la clase lambda (subgrupo Vλ1, línea germinal 1b), los 31 VL restantes pertenecían a la clase Vκ. De los 31 VLs Kappa, 24 caen dentro del subgrupo VκIII y 7 dentro del subgrupo Vκ1. Dieciséis de las 24 secuencias VκIII utilizan la secuencia de línea germinal L6, utilizando las restantes las secuencias de línea germinal A27, L2 y L6. Los VLs del subgrupo Vκ1 se originan a partir de la secuencia de línea germinal O2/O12 o A30. En la posición 96 se producían mutaciones notables. Los aminoácidos de la línea germinal en esta posición son aminoácidos aromáticos e hidrófobos Trp, Phe, Tyr, Leu o Ile para VLs kappa y Tyr, Val o Ala para los VLs lambda. Pero en la agrupación seleccionada de VLs kappa únicamente 5 de 31 tienen sus aminoácidos de la línea germinal en la posición 96: HVLP325, HVLP349, HVLP388, HVLP3109 y HVLP393. Veintiún aminoácidos en la posición 96 están cargados, de los cuales 20 tienen carga positiva: Arg, Lys o His. Dos aminoácidos son Pro, uno Gln, uno Ser y uno Thr. De siete VLs kappa analizados por cromatografía de filtración en gel respecto a carácter monómero, seis que tenían Arg o Lys en la posición 96 eran también monómeros, en tanto que HVLP325 con el aminoácido Leu de la línea germinal en la posición 96 formaba agregados (véase más adelante). Análogamente, HVLP389 que era de la clase lambda y tenía una mutación de la línea germinal a Ser era también monómero (véase más adelante). Estos datos correlacionan la desviación de los aminoácidos de la línea germinal en la posición 96 (27 de 32) con propiedades biofísicas mejoradas de VLs tales como el carácter monómero.

Dieciocho VLs de la clase kappa tenían sus tres últimos residuos (105-107) reemplazados con aminoácidos Thr, Val y Leu que se encuentran únicamente en los VLs lambda. Estas sustituciones pueden haber tenido un papel en la mejora de las propiedades biofísicas de los VLs kappa, dando como resultado la selección de los VLs mencionados anteriormente sobre los clones parentales con los residuos kappa originales en la posición 105-107.

Caracterización de los VLs humanos

Ocho de los VLs seleccionados con orígenes diferentes de la línea germinal V se expresaron en E. coli en cultivos de 1 litro y se purificaron: HVLP324, HVLP325, HVLP335, HVLP342, HVLP351, HVLP364, HVLP389 y HVLP3103 (Tabla 6). Todos ellos se expresaban con buenos rendimientos comprendidos entre 6,2 mg para HVLP324 y alrededor de 75 mg para HVLP335 y HVLP364.

La tendencia a la agregación de los VLs humanos se evaluó en términos de su estado de oligomerización por cromatografía de filtración en gel. Los VLs se sometieron a cromatografía de filtración en gel Superdex 75 a una concentración de 0,6 mg/ml. Todos excepto HVLP325 estaban esencialmente exentos de agregados y daban picos simples simétricos con el peso molecular medio aparente de 12,7 kDa (intervalo, 6,2-19,2 kDa) (Figura 7a y Tabla 3). Esto está de acuerdo con la masa molecular esperada para VLs monómeros, 13,4-13,8 kDa. La variación de masa molecular aparente para anticuerpos mono-dominio ha sido consignada previamente (Jespers, L. et al., 2004a; Stevens, F.J. et al., 1980). Para HVLP325, los agregados formaban 11% de la proteína total (agregado más monómero). HVLP351, HVLP342, HVLP335 y HVLP3103 eran todavía monómeros cuando se testaron a su máxima concentración disponible, a saber, 0,89 mg/ml, 1,0 mg/ml, 4,9 mg/ml y 5,9 mg/ml, respectivamente (Figura 7B).

Se sometieron los VLs a cromatografía con Superdex-75 antes del análisis BIACORE y los picos de monómero purificados se recogieron incluso en ausencia de cualquier evidencia de material agregado. En el análisis SPR, todos los VLs seleccionados se fijaban a proteína L (Figura 8). Esto no era inesperado, dado que los VLs se aislaron por lavado en batea contra proteína L. Para todos ellos, los valores KDs de fijación a proteína L estaban comprendidos entre 0,6 y 3 μM (Tabla 3). HVLP324 y HVLP342 tenían valores KDs adicionales más pequeños, 10 nM y 10 nM, respectivamente. Las fijaciones de afinidad baja y de afinidad alta de los VLs del subgrupo VκI a la proteína L han sido consignadas previamente (referencia). Ambos, HVHP324 y HVLP342, pertenecen al subgrupo VκI (Tabla 3). Como era de esperar, los datos cinéticos y de equilibrio eran consistentes con el hecho de que pico monómero fuera realmente monómero.

Análisis de fijación de pentámeros

Las fijaciones del pentámero HVLP328PVT2 a proteína A y del pentámero HVLP335PTV2 a proteína L se determinaron por resonancia de plasmones de superficie (Figura 9). Las tasas de asociación se calcularon independientemente a partir de gráficas de kobs frente a la concentración. Pudo calcularse más de una tasa de disociación (kd) debido a la heterogeneidad en fijación multivalente entre la población de pentámeros. Por esta razón, pudo obtenerse más de una constante de disociación de equilibrio, KD. HVHP328PTV2 y HVLP335PTV2 tenían valores KDs mínimos de 2 mM y 200 pM, respectivamente (Tabla 4). Con KDs más lentas, HVHP328PTV2 y HVHP335PTV2 tenían valores KDs tan bajos como 900 y 90 pM, respectivamente.

Detección de patógenos por VLs y VHs

La actividad de fijación a proteína A y L de los VHs y VLs puede utilizarse para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. Esto es posible si los VHs y VLs son solubles y monómeros (falta de tendencia a agregarse) tales como los VHs y VLs de esta invención. Los dominios variables derivados de anticuerpos que

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carecen de cadenas ligeras tales como los anticuerpos de cadena pesada de Camélidos o los IgNARs de tiburón nodriza o tiburón alfombra son naturalmente solubles y monómeros. De éstos, los que poseen actividad de fijación a proteína A y L pueden utilizarse también para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. La proteína A está presente en la superficie de las bacterias patógenas, Staphylococcus aureus. Así, los VHs con actividad de fijación a proteína A tales como los descritos en esta memoria pueden utilizarse para detectar S. aureus. Los inventores realizaron un ensayo de microaglutinación para detectar la capacidad del pentámero de VH HVHP328PVT2 para fijarse a S. aureus. Se incubaron un número constante de células bacterianas con diluciones al doble de HVHP328PVT2 en pocillos de microtitulación (pocillos 1-11) (Figura 10). El pocillo 12 contenía tampón en lugar del pentámero. Si los VHs se fijan a las células bacterianas, entonces el pentámero, debido a su naturaleza multímera, debería ser capaz de reticular las células y dar como resultado aglutinación celular. Las células aglutinadas aparecerán como células difusas en un pocillo de microtitulación (Figura 10). En ausencia de cualquier fijación, no ocurriría aglutinación alguna, es decir ausencia de aglutinación, y las células aparecerán como una mancha en el fondo del pocillo. Como se muestra en la Figura 10, el pentámero se fija al S. aureus, dado que existe aglutinación de células. La aglutinación se observa hasta el pocillo 7. Más allá del pocillo 7, la concentración del pentámero es demasiado baja para la fijación, por lo que no se produce ya aglutinación alguna. El pentámero de control VL no exhibe aglutinación alguna, demostrando la especificidad del pentámero VH para S. aureus (Figura 10). La fijación es también específica en cuanto a las células, dado que el pentámero VH, como era de esperar, no aglutina células de E. coli (cepa TG1) o de Salmonella (datos no presentados). Análogamente, los monómeros de VL y pentámeros de VL con actividad de fijación para proteína L pueden utilizarse para la detección de bacterias, en particular bacterias patógenas tales como Peptostreptococcus magnus, que tienen proteína L en la superficie de sus células.

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Claims

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