ES2558338T3 - Método para aislamiento de polipéptidos solubles - Google Patents

Método para aislamiento de polipéptidos solubles Download PDF

Info

Publication number
ES2558338T3
ES2558338T3 ES10190143.7T ES10190143T ES2558338T3 ES 2558338 T3 ES2558338 T3 ES 2558338T3 ES 10190143 T ES10190143 T ES 10190143T ES 2558338 T3 ES2558338 T3 ES 2558338T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
vhs
protein
antibody fragment
human
vls
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10190143.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Jamshid Tanha
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Research Council of Canada
Original Assignee
National Research Council of Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Council of Canada filed Critical National Research Council of Canada
Application granted granted Critical
Publication of ES2558338T3 publication Critical patent/ES2558338T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID n.º 16.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para aislamiento de polipéptidos solubles
Campo de la invención
Esta invención se refiere al aislamiento, identificación y manipulación de polipéptidos, especialmente fragmentos monómeros de anticuerpos humanos. 5
Antecedentes de la invención
Los anticuerpos en los vertebrados se componen típicamente de cadenas pesada (H) y ligera (L) apareadas. El primer dominio de las cadenas H y L combinadas, el VH y VL, son de secuencia más variable, y esta es la porción del anticuerpo que reconoce el antígeno y se fija al mismo. Los dominios VH y VL reconocen el antígeno como un par.
El repertorio inmunológico de los Camélidos (camellos, dromedarios y llamas) es único en el sentido de que posee 10 tipos raros de anticuerpos a los que se hace referencia como anticuerpos de cadena pesada (Hamers, Casterman C. et al., 1993). Estos anticuerpos carecen de cadenas ligeras y por tanto sus sitios de combinación están constituidos por un solo dominio, denominado VHH.
Los anticuerpos VHH recombinantes de un solo dominio (sdAbs) proporcionan varias ventajas sobre los fragmentos FV monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Si bien los sdAbs son 15 comparables a sus contrapartidas scFv en términos de afinidad, los mismos superan a los scFv en términos de solubilidad, estabilidad, resistencia a la agregación, susceptibilidad de replegado, rendimiento de expresión, y facilidad de manipulación del DNA, construcción de bibliotecas y determinaciones estructurales 3-D. muchas de las propiedades mencionadas de los scAbs VHH son deseables en aplicaciones que implican anticuerpos.
Sin embargo, la naturaleza no humana de los VHHs limita su uso en inmunoterapia humana debido a inmunogenia. A 20 este respecto, los sdAbs VH y VL humanos son candidatos ideales para aplicaciones de inmunoterapia debido a que se espera que sean menos inmunógenos.
Los VHs y VLs humanos, sin embargo, son por lo general tendentes a agregación, una característica común a los VHs y VLs derivados de anticuerpos convencionales (Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward E.S. et al., 1989). Por ello, se han realizado intentos para obtener VHs y VLs humanos adecuados para aplicaciones de 25 anticuerpos. Tales VHs y VLs han exhibido también otras propiedades útiles típicas de los VHHs tales como alto rendimiento de expresión, alta susceptibilidad de replegado y resistencia a la agregación. Bibliotecas sintéticas construidas a base de estos VHs y VLs como armazones de biblioteca podrían servir como una fuente prometedora de proteínas terapéuticas.
La camelización y la llamización, que implican incorporar residuos importantes de solubilidad de los VHHs de camello 30 y llama, respectivamente, en VHs o VLs humanos se han empleado para generar VHs y VLs humanos monómeros. Se ha demostrado que bibliotecas sintéticas de sdAb construidas sobre la base de estos VHs y VLs y generadas por aleatorización de la CDR son funcionales en términos de producción de ligantes para diversos antígenos (Davies, J. et al., 1995; Tanha J. et al., 2001).
En otro enfoque, se aislaron VHs y VLs monómeros totalmente humanos de bibliotecas sintéticas humanas de VH y 35 VL sin recurrir a ingeniería de la clase arriba mencionada. En un experimento, se descubrió un VH humano monómero cuando una biblioteca de VH humano se lavó en batea contra lisozima de huevo de gallina (Jespers, L. et al., 2004b). Más recientemente, un método de selección basado en criterios de desplegado reversible y afinidad produjo un gran número de VHs monómeros a partir de bibliotecas humanas sintéticas de VH (Jespers, L. et al., 2004a). Este descubrimiento puso de manifiesto el hecho de que un método de selección apropiado es fundamental 40 para la captura eficiente de VHs humanos monómeros raros con propiedades biofísicas deseables.
Sumario de la invención
La invención tiene su origen en un método para aislar polipéptidos, preferiblemente fragmentos de anticuerpo, y lo más preferiblemente VHs y VLs de humano con propiedades biofísicas deseables (solubilidad, estabilidad, expresión alta, monomería, ausencia de agregación, especificidad de fijación). El método incluye las etapas de obtención de 45 una genoteca de exposición en fagos capaz de expresar una serie de secuencias polipeptídicas, lo que permite la infección de un césped bacteriano con la genoteca de fagos, y de identificación del fago que forma las calvas más grandes que la media en el césped bacteriano. A continuación, los fagos se aíslan y se llevan a cabo las etapas de secuenciar o si no caracterizar las secuencias polipeptídicas.
La invención da a conocer polipéptidos, en especial VHs monoméricos de humano, que podrían ser útiles para la 50 inmunoterapia y/o como agentes para diagnóstico o para detección. El VH monomérico de humano también se puede combinar para formar dímeros, trímeros, pentámeros u otros multímeros, que pueden ser útiles para la inmunoterapia y/o como agentes de diagnóstico o de detección.
Los polipéptidos identificados en la presente memoria, que incluyen las VHs de humano, se pueden manipular mediante métodos tales como el barajado de DNA para seleccionar los que tengan mejores propiedades biofísicas, tales como solubilidad, estabilidad, monomería, alta capacidad de expresión, especificidad de fijación y origen humano.
Los polipéptidos identificados en la presente memoria, que incluyen las VHs de humano, también se pueden utilizar 5 para generar otras genotecas de exposición, que a su vez se pueden utilizar entonces para aislar más polipéptidos mediante el método anterior.
En un primer aspecto, la presente invención da a conocer un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 16.
En un segundo aspecto, la presente invención da a conocer un fragmento VH de anticuerpo que comprende la 10 secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 16.
En un tercer aspecto, la presente invención da a conocer un método para producir polipéptidos con propiedades biofísicas deseables, que comprende las etapas de a) dar a conocer una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de anticuerpo tal y como se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; b) dar a conocer secuencias oligonucleotídicas con codones aleatorizados; c) incorporar los oligonucleótidos aleatorizados en la 15 secuencia de nucleótidos que codifica una o más una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal manera que se aleatoriza una o más de las CDR; y d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en la etapa (c).
Descripción Detallada de los Dibujos
Leyendas de las figuras 20
Figura 1. Una representación gráfica de los resultados de ejemplos seleccionados: el contraste en el tamaño de calva entre fagos que presentan un VH soluble (HVHP428) y aquéllos que presentan uno insoluble (BT32/A6). La fotografía muestra una parte de la placa de agar de césped bacteriano que se amplió para mejorar la visualización de la calva. Aunque la placa contenía un número igual de cada uno de los dos tipos de calva, la fotografía contiene esencialmente las calvas HVHP428, de tamaño grande. La mayoría de las calvas BT32/A6 eran demasiado 25 pequeñas para producir imágenes claras bien definidas en la fotografía. Por tanto, las calvas marcadas por flechas representan una proporción menor de fagos BT32/A6 que eran lo suficientemente grandes para ser visibles en esta imagen. Los asteriscos marcan tamaños de calva representativos para los fagos HVHP428. Las identidades de las calvas se determinaron por secuenciación del DNA.
Figura 2. Secuencia de aminoácidos de los VHs humanos seleccionados sobre la base de la afinidad para la 30 proteína A y el tamaño de la calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoácidos con HVHP2M10 o HVHP44. Se incluyen guiones para alineación de las secuencias. Los residuos en las posiciones de solubilidad principales y el residuo 57T que se asocia con VHs/VHHs con la propiedad de fijación de proteína A se muestran en negrilla. Se utiliza el sistema de numeración Kabat. El valor de la "frecuencia" total es 114
CDR = región determinante de la complementariedad; FR = región de entramado; gln seq = secuencia de la línea 35 germinal
Figura 3. Tendencias de agregación de los VHs humanos. Cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización de un VH humano aislado en este estudio (HVHP428) con el de un VHH de llama (H11C7) y un VH humano típico (BT32/A6). El pico que se eluye en último lugar en cada cromatograma corresponde al VH monomérico. El pico H11C7 dímero está marcado por una flecha. B, espectros 1H NMR unidimensionales de 40 HVHP414 a 800 MHz (i), HVHP423 a 500 MHz (ii) y HVHP428 a 800 MHz (iii). Los espectros en el panel izquierdo están aumentados a escala con un factor de dos a fin de permitir una mejor observación de las señales de baja intensidad.
Figura 4. Estabilidad de los VHs humanos en términos de su resistencia a tripsina a 37ºC y su integridad después de incubación larga a 37ºC. A, SDS-PAGE que compara las movilidades del VH HVHP414 sin tratar y tratado con 45 tripsina a los 15, 30 y 60 min con relación a un marcador de 21 kDa. HVHP414-cMyc denota VH de HVHP414 que carece del c-Myc. B, perfiles de masa molecular obtenidos por espectrometría de masas de VH de HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina (60 min). El perfil de la espectrometría de masas del VH tratado se ha superpuesto al correspondiente al del VH sin tratar para proporcionar una mejor comparación visual. La masa molecular experimental del VH sin tratar es 14.967,6 Da, que es esencialmente idéntica a la masa molecular esperada, 50 14.967,7 Da. La masa molecular observada del VH tratado con tripsina (13.368,5 Da) indica la pérdida de 13 aminoácidos en el término C por escisión en K (Lys) en la etiqueta de c-Myc para dar una masa molecular esperada de 13368,0 Da. El sitio de escisión de tripsina se muestra por una flecha vertical encima de la secuencia de aminoácidos de HVHP414. C, cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización del VH HVHP420 tratado a 37ºC (perfil superior) con el del VH sin tratar (perfil inferior). Los cromatogramas se desplazaron 55 verticalmente debido a que no podían distinguirse cuando estaban superpuestos. Los picos mayor y menor en cada
cromatograma corresponden a VHs monómeros y dímeros, respectivamente. El VH dímero constituye 3% de la proteína total. El recuadro muestra las superposiciones de sensogramas para la fijación de HVHP420 tratado a 37ºC a la proteína A a diversas concentraciones. Los VHs utilizados para estudios de estabilidad térmica procedían de stocks que habían estado ya a 4ºC durante varios meses.
Figura 5. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVHP423 nativo (líneas gruesas) y 5 replegado (líneas delgadas) a la proteína A inmovilizada a concentraciones de 75, 100, 150 y 200 nM. KDn y KDref se calcularon a partir de los sensogramas respectivos y se utilizaron para determinar RE como se describe más adelante.
Figura 6. Secuencias de aminoácidos de los VLs humanos seleccionados basadas en afinidad para la proteína L y tamaño de calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoácidos con HVLP333. Se 10 incluyen guiones para alineación de la secuencia. Véase la BASE V (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?module=pagemaster&PAGE_user_op=view_page& PAGE_id=7&MMN_position=5:5) para numeración de las secuencias y designación de la CDR. L6, A27, L2, L16, O2/O12, A30 y 1b son designaciones de la línea germinal V. Las designaciones de la línea germinal J aparecen entre paréntesis. NF, no encontrado. 15
Figura 7. Cromatogramas de exclusión por tamaños de dominios VL humanos. En A, se aplicaron los VLs a una concentración de 0,6 mg/ml. En B, se aplicaron los VLs a su máxima concentración disponible: HVLP342, 1,0 mg/ml; HVLP3103, 5,9 mg/ml; HVLP335, 4,9 mg/ml, HVLP351, 0,89 mg/ml. "#" y "*" representan picos agregados y monómeros, respectivamente. Los agregados se eluyen en el volumen de exclusión. El pico marcado por una flecha en el panel HVLP342 (B) es el arrastre de una operación previa. 20
Figura 8. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de VLs a la proteína L inmovilizada a concentraciones de 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5 y 10 μM (HVLP389, HVLP351 y HVLP364); 1, 2, 3, 5, 7,5 y 10 nM (HVLP342); 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 5 y 10 μM (HVLP335); 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2 y 5 μM (HVLP325), 0,2, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3 y 5 μM (HVLP3103) y 1, 2, 3, 4, 5 y 6 nM (HVLP324). Los sensogramas para las fijaciones de HVLP324 y HVLP342 al sitio de baja afinidad de la proteína L no se incluyen, pero los KDs calculados se registran en la Tabla 3. 25
Figura 9. Fijaciones de HVHP328PTV2 a proteína A y HVLP335PTV2 a proteína L en experimentos de resonancia de plasmones de superficie. (A) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVH28PTV2 a proteína A inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 nM. (B) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVLP335PTV2 a proteína L inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 4,5 nM. Los datos de fijación se registran en la Tabla 4. 30
Figura 10. Figura que muestra los resultados de los experimentos de microaglutinación con células de S. aureus. La concentración de los pentámeros decrece dos veces desde el pocillo 1 al pocillo 11, teniendo el pocillo 12 los pentámeros reemplazados con tampón de PBS. Los pocillos de la fila superior contienen pentámero de HVHP328PTV2 y los del fondo pentámero HVLP335PTV2. Las concentraciones de los pentámeros en los pocillos 1 a 6 son 215, 108, 54, 27, 13 y 7 μg/ml, respectivamente. 35
Descripción detallada de la invención
Es deseable identificar polipéptidos, en especial fragmentos de anticuerpo, que son de origen humano, solubles, estables, resistentes a la agregación, que se pueden volver a plegar, que se expresan mucho, cuyo DNA se manipula con facilidad, ideales para la construcción de genotecas y para las determinaciones estructurales tridimensionales. Tales fragmentos de anticuerpo son útiles para una amplia gama de aplicaciones inmunoterápicas 40 y también como agentes de diagnóstico y de detección. Los anticuerpos VH y VL monoméricos de humano son particularmente interesantes y probablemente tienen muchas de las propiedades mencionadas más arriba.
Los polipéptidos con las propiedades mencionadas más arriba se pueden identificar mediante el cribado de alto rendimiento de genotecas capaces de expresar muchas secuencias polipeptídicas diferentes. Por ejemplo, las genotecas de exposición en fagos (preferiblemente fagos filamentosos tales como M13 o fd) se pueden cribar 45 mediante la infección de una superficie de bacterias sensibles al fago (un césped bacteriano) con el fago, a continuación determinar qué fagos han lisado correctamente las bacterias mediante de búsqueda de áreas transparentes, sin bacterias, conocidas como calvas. Los fagos que exponen los VHs y VLs monoméricos llamizados forman en los céspedes bacterianos calvas más grandes que los fagos que exponen los VHs totalmente humanos con tendencia a la agregación. Así pues, el tamaño de las placas se puede utilizar como medio de identificación de 50 los VHs y VLs monoméricos que se producen de forma natural a partir del repertorio de VH de humano.
El método descrito en la presente memoria es también útil para identificar proteínas solubles, estables [la estabilidad abarca una serie de características, entre ellas, pero sin limitarse a ellas, la alta eficacia para volver a plegarse tras un incremento de la temperatura, alta temperatura de fusión, mantener la funcionalidad después de una incubación larga (varios días) a 37 ºC, resistencia a los desnaturalizantes químicos, resistencia a las proteasas, tener una 55 prolongada vida útil por debajo de 0 ºC y 4 ºC, y a temperatura ambiente, mantener la funcionalidad en el entorno intracelular, y mantener la funcionalidad dentro del cuerpo de un ser humano, tal como en el torrente circulatorio] y
que se expresan en gran cantidad, que tienen diferentes procedencias, entre ellas:
1. Anticuerpos VH, VL, Fab, scFv y completos, tales como IgG, más específicamente las de humano.
2. Variantes proteicas basadas en armazones que no son anticuerpos, receptores monocatenarios de los linfocitos T, dominios del receptor de los linfocitos T, transferina, lipocalinas, dominios de kunitz, repeticiones de anquirina y antígeno asociado al linfocito T citotóxico (CTLA-4), que incluye los humanos. 5
3. Vacunas tales como las vacunas con proteínas víricas y bacterianas.
4. Proteínas terapéuticas, p. ej., insulina, hormona del crecimiento, eritropoyetina.
5. Reactivos proteínicos de diagnóstico y bioquímicos, p. ej., proteína A, proteína G.
Los polipéptidos identificados con este método se pueden utilizar para construir otras genotecas. Esto se hace mediante la selección de una secuencia de ácido nucleico de, por ejemplo, un VH. Se crean oligonucleótidos con 10 codones aleatorizados y se incorporan a la secuencia del VH. Así pues, cada oligonucleótido único se incorpora en un gen de VH y los genes de VH modificados constituyen una genoteca de secuencias con ligeras variaciones. Típicamente, los oligonucleótidos se diseñan de tal manera que se aleatorizan las CDR o los bucles de la VH. Por ejemplo, se pueden aleatorizar una, dos o las tres CDR del VH. La genoteca de VH se clona a continuación en un vector adecuado, según el tipo de genoteca a utilizar, y las secuencias de ácido nucleico se expresan como 15 polipéptidos. La genoteca se criba en busca de moléculas que se fijan a los polipéptidos de la genoteca, típicamente mediante rondas de cribado. Las genotecas pueden ser genotecas de exposición en fagos u otras genotecas de exposición, tales como exposición en ribosomas y exposición en levaduras.
Los polipéptidos identificados mediante el método explicado en la presente memoria se pueden utilizar para la inmunoterapia mediante, por ejemplo, el entrecruzamiento de monómeros para formar dímeros, trímeros, 20 pentámeros u otros multímeros. Esto puede dar lugar a que algunos antígenos tengan una mayor afinidad por las moléculas de antígeno y una velocidad de disociación más lenta. Otra posible estrategia es unir o fusionar los polipéptidos a una serie de moléculas con diferentes funciones. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden unir a radionúclidos, fármacos citotóxicos, toxinas, péptidos, proteínas, enzimas, liposomas, lípidos, superantígenos de linfocitos T o virus, para dirigirlos selectivamente y destruir o modificar células o moléculas 25 específicas.
Una vez que se han aislado los VHs o VLs identificados con el método de selección descrito en la presente memoria, se pueden manipular adicionalmente para seleccionar las propiedades biofísicas mejoradas, tales como solubilidad, estabilidad, monomería, especificad de fijación, origen humano o alta capacidad de expresión. Esto se puede conseguir mediante técnicas de recombinación in vitro, tales como el barajado de DNA o un proceso de extensión 30 escalonado. El barajado de DNA implica cortar la secuencia de ácido nucleico del primer (donante) y segundo (aceptor) polipéptidos, tales como los fragmentos de anticuerpo, en fragmentos aleatorios, y a continuación volver a ensamblar los fragmentos aleatorios mediante una reacción de tipo PCR. Los fragmentos que se han vuelto a ensamblar se criban a continuación para seleccionar los que tienen las propiedades deseadas.
Por ejemplo, uno o varios VHs de alta estabilidad (donantes) se puede mezclar con uno o varios VHs que carecen de 35 suficiente estabilidad (aceptores) y someterlos al barajado de DNA. Esto genera mutantes de los VHs aceptores que han incorporado restos de estabilidad de los VHs donantes. Estos nuevos mutantes estables se pueden identificar con los métodos descritos en la presente memoria o a través de otros sistemas progresivos de cribado de proteínas, tales como exposición en ribosomas, exposición en levaduras, exposición en células bacterianas y exposición en fagos. De igual forma, esta técnica se puede utilizar para transferir rasgos deseables, tales como la solubilidad, la 40 monomería y la expresión elevada.
Esta técnica se puede utilizar cuando los VHs donante y aceptor tienen las propiedades deseables, para producir un VH con ambas propiedades. Por ejemplo, un VH donante inestable que se fija a un ligando diagnóstico o terapéutico importante se puede barajar con un VH aceptor estable. Para asegurarse de que los nuevos VHs estables generados tienen también la capacidad de fijarse al ligando, el sistema de cribado puede implicar una etapa de fijación al 45 ligando.
El barajado de DNA puede ser útil también para humanizar los VHs no humanos, tales como los dominios variables de cadena pesada de los anticuerpos de los camélidos y los dominios variables de tiburón nodriza y de tiburón béntico, o los VLs no humanos que se fijan a las dianas terapéuticas. Se pueden utilizar como donantes los VHs y VLs de humano con las propiedades deseables, tales como solubilidad, estabilidad, monomería y alta capacidad de 50 expresión. Por ejemplo, uno o varios VH de humano con una buena estabilidad (donantes) se puede mezclar con uno o varios VH terapéuticos no humanos (aceptores) y someterlos al barajado de DNA. Esto genera mutantes de los VH aceptores que son tanto estables como humanizados. Los nuevos mutantes estables y humanizados que se han generado se pueden identificar mediante los métodos descritos en la presente memoria, o a través de otros sistemas progresivos de cribado de proteínas, tales como exposición en ribosomas, exposición en levaduras, exposición en 55 células bacterianas y exposición en fagos. En otro ejemplo, el VH aceptor podría ser un VHH terapéutico (dominio
variable de la cadena pesada de los anticuerpos de los camélidos).
Además, esta técnica también es útil para seleccionar propiedades deseables de polipéptidos diferentes a los VH y VL. Tal y como se explicó más arriba, el polipéptido donante y el polipéptido aceptor pueden proceder los dos de humano, o el donante puede ser de humano y el aceptor no serlo.
Una posible estrategia para conferir solubilidad, monomería, alta capacidad de expresión o estabilidad a los VH y VL 5 puede ser a través de la inserción de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en los VH y VL aceptores. Ya que las CDR se sabe que intervienen en la solubilidad y en la estabilidad de anticuerpos con un solo dominio, y en consecuencia el injerto de estas regiones, tales como las CDR de los VH y VL aislados por los métodos descritos en la presente memoria, pueden conferir solubilidad y/o estabilidad a los VH y VL aceptores.
VHs y VLs humanos monómeros 10
Se identificaron varios VHs humanos monómeros con diferentes secuencias de la línea germinal y totales (véase Figura 1 y SEQ ID Nº 8 a 22) de una biblioteca de presentación de fago VH humano naíf por este método de selección basado en el tamaño de las calvas de fago. Los VHs se mantienen funcionales y en forma monómera después de tratamiento con tripsina a 37ºC, semanas de incubaciones a 37ºC o meses de almacenamiento a 4ºC, tienen altas eficiencias de replegado térmico, se producen con buenos rendimientos en E. coli y poseen actividad de 15 fijación de la proteína A.
Se identificaron además varios VLs humanos monómeros (véase la Figura 6 y SEQ ID Nº 23 a 54). Los VLs se producen también con buenos rendimientos en E. coli y poseen actividad de fijación de proteína L.
Dichas propiedades serán manifestadas también por VHs de bibliotecas sintéticas que utilicen los VHs anteriores como armazón. Así, tales bibliotecas pueden producir VHs terapéuticos o de diagnóstico que podrían tener eficacia 20 satisfactoria a temperatura fisiológica, vida útil prolongada y una producción eficaz en costes. La característica de alta eficiencia de replegado térmico podría aumentar adicionalmente las aplicaciones biotecnológicas de etas bibliotecas a situaciones en las cuales se requieran fijadores de VH para mantener su actividad después de exposición a temperaturas altas transitorias. Los VHs podrían ser también muy adecuados para aplicaciones intracorpóreas debido a sus propiedades biofísicas deseables. La propiedad de fijación de la proteína A simplificará 25 la purificación y detección de VH en tests de diagnóstico, inmunotransferencia e inmunocitoquímica y puede aprovecharse para mejorar la eficiencia de las bibliotecas por retirada de los VHs no funcionales de las mismas. Análogamente, las bibliotecas que utilizan VHs como entramado producirán VLs terapéuticos o de diagnóstico que tengan propiedades análogamente deseables. Dado que los VLs se fijan con la proteína L, la purificación y detección de VL se simplifica aprovechando la ventaja de esta propiedad de fijación de la proteína L. 30
Las genotecas de exposición construidas con los presentes VH y VL también pueden ser una fuente útil de agentes de diagnóstico y detección.
Los VHs totalmente humanos consignados anteriormente con propiedades biofísicas favorables estaban basados en una secuencia de la línea germinal V simple: DP-47 ((Jespers, L. et al., 2004b; Jespers, L. et al., 2004a). La observación de que los VHs humanos monómeros de este estudio proceden de 6 secuencias de la línea germinal 35 diferentes con inclusión de DP-47, demuestra que los VHs estables no están restringidos en términos de uso de genes de la línea germinal. De hecho, es muy probable que los autores de la invención hubieran aislado VHs monómeros de familia y orígenes de línea germinal diferentes de los que se describen en esta memoria si no hubieran restringido la selección a un subconjunto de VHs de la familia VH3 con actividad de fijación de la proteína A. No es posible concretar aquí las mutaciones de aminoácidos (Tabla 1) responsables del comportamiento biofísico 40 observado de los presentes VHs debido a la aparición de mutaciones múltiples en VHs y al hecho de que se sabe también que CDR3 está implicado en la conformación de los perfiles biofísicos de sdAbs. Es posible, sin embargo, que mutaciones en las posiciones que se saben son importantes para la estabilidad y solubilidad de los sdAbs, v.g., V37F en HVHP423 y HVHP44B, o mutaciones que aparecen múltiples veces en la misma posición, v.g., L5V/Q y V5Q en nueve VHs, tengan un papel en la determinación de las propiedades biofísicas de VHs. En términos de 45 construcción de bibliotecas, sería deseable que el carácter monómero de los presentes VHs no sea dependiente de CDRs, en particular CDR3, a fin de que la aleatorización de CDR pueda realizarse sin la preocupación de comprometer la estabilidad de la biblioteca. A este respecto, los VHs con CDR3 menor, v.g., HVHP82, pueden ser armazones preferidos, dado que ello implicaría menos dependencia de CDR3 para la estabilidad.
La diversidad de los presentes VH y VL en términos de secuencia global y de longitud de la CDR3 debe permitir la 50 construcción de genotecas que funcionen mejor. Las genotecas de VH sintéticos se han construido en armazones únicos. Tal estrategia para generar repertorios contrasta mucho con la «estrategia» natural in vivo que utiliza muchos armazones. En función de las secuencias descritas aquí, se puede sacar partido de la disponibilidad del conjunto variopinto de VH y VL, y crear genotecas que se basan en muchos armazones de VH y VL. Tales genotecas emularían mejor los repertorios in vivo y, por lo tanto, tendrían una complejidad más óptima. De las tres CDR en los 55 sdAb, la CDR3 contribuye, en general, más significativamente a la diversidad de repertorios y, por esta razón, la aleatorización de la CDR3 en los armazones de VH y VL está típicamente acompañada de la variación concomitante
de la longitud de la CDR3. Aunque esto mejore significativamente la complejidad de las genotecas, también puede comprometer la estabilidad de las genotecas al alterar la longitud de la CDR3 del armazón parental. La heterogeneidad de los presentes VH y VL en términos de longitud del CDR3 permite crear genotecas con buena complejidad, buena estabilidad y buenas características biofísicas. Tales genotecas consistirían preferiblemente en subgenotecas, en donde cada subgenoteca se crea mediante la aleatorización de la CDR3 (y la aleatorización de la 5 CDR1 y/o de la CDR2, si se desea) en un único armazón de VH o VL sin alterar la longitud de la CDR3 parental.
La versatilidad de los presentes VH y VL también es beneficiosa en términos de elegir una región flanqueante óptima de VH o VL para humanizar los VHH, VH y VL que son específicos de dianas terapéuticas. Los VHH de camélidos de alta afinidad por las dianas terapéuticas se pueden obtener a partir de genotecas de VHH inmunitarios, sin inmunizar o sintéticos con relativa facilidad, y posteriormente someterlos a la humanización (injerto de CDR, remodelación de 10 la superficie, desinmunización) para retirar la posible capacidad inmunógena del VHH, con lo que se proporciona una alternativa a la estrategia de genoteca de VH de humanos para producir los VH terapéuticos. La generación de VH terapéuticos de alta afinidad mediante la última estrategia puede requerir a menudo otra maduración de afinidad in vitro tediosa y larga de los mejores fijadores seleccionados en las genotecas primarias de VH sintéticos de humano.
Los VH no humanos contra las dianas terapéuticas se pueden obtener a partir de genotecas de VH inmunitarios, sin 15 inmunizar o sintéticos con relativa facilidad y posteriormente someterlos a la humanización (injerto de CDR, remodelación de la superficie, desinmunización) para eliminar la capacidad inmunógena del VH no humano, con lo que se proporciona una alternativa a la estrategia de genoteca de VH de humano para producir los VH terapéuticos.
Los VL no humanos contra las dianas terapéuticas se pueden obtener de genotecas de VHH inmunitarios, sin inmunizar o sintéticos con relativa facilidad y posteriormente someterlos a la humanización (injerto de CDR, 20 remodelación de la superficie, desinmunización) para eliminar la capacidad inmunógena del VHH, con lo que se proporciona una alternativa a la estrategia de genoteca de VL de humanos para producir los VL terapéuticos.
Se han descrito cierto número de enfoques evolutivos para la selección de proteínas con propiedades biofísicas mejoradas (Forrer, P. et al., 1999; Waldo, G.S., 2003); (Jespers, L. et al., 2004a; Jung, S. et al., 1999; Matsuura, T. et al., 2003). Típicamente, se requiere una presión de estabilidad para asegurar la selección preferencial de las 25 variantes estables sobre las inestables o menos estables, de una población de biblioteca. Por ejemplo, en un trabajo afín, se requirió tratamiento térmico de bibliotecas de presentación del fago VH para seleccionar VHs resistentes a la agregación (Jespers, L. et al., 2004a). Ejemplos de enfoques de selección evolutivos que implican presentación de fago incluyen presentación de fago convencional, fagos selectivamente infectivos y los enfoques de proteólisis. En los dos primeros enfoques se utiliza selección por afinidad para seleccionar especies estables de una biblioteca, 30 basadas en la hipótesis de que las proteínas estables poseen mejores propiedades de fijación a su ligando que las inestables. Sin embargo, aun con la inclusión adicional de un paso de selección por estabilidad, estos enfoques pueden enriquecer fundamentalmente por mayor afinidad más que por mayor estabilidad (Jung, S. et al., 1999). Un requerimiento de pasos de fijación limita también la aplicabilidad de estos enfoques a proteínas con ligandos conocidos. El tercero, enfoque de proteólisis, está basado en el hecho de que las proteínas estables son 35 generalmente compactas y por consiguiente son resistentes a las proteasas, mientras que las inestables no lo son. El formato de presentación de fago se modifica por ingeniería genética de tal manera que la estabilidad a las proteasas de la proteína presentada se traduce en infectividad del fago. Así, cuando una biblioteca variante de presentación de fago se trata con una proteasa, únicamente los fagos que exhiben proteínas estables retienen su infectividad y pueden seleccionarse subsiguientemente por infección de un E. coli hospedador. Dado que este 40 enfoque es independiente de la fijación de ligandos, el mismo es de utilidad general. Sin embargo, incluso las proteínas estables y bien plegadas tienen sitios sensibles a las proteasas, v.g. bucles y enlazadores, y esto podría impedir en algunos casos la selección de especies estables en un enfoque de proteólisis (Ban, Y. et al., 2004).
En contraste, en el presente enfoque evolutivo, las proteínas con propiedades biofísicas superiores se identifican directamente a simple vista. El enfoque no requiere pasos de fijación de ligando, proteólisis o desestabilización, y 45 por consiguiente evita complicaciones que pueden encontrarse en los enfoques de selección indicados. La ausencia de requerimiento de un paso de fijación significa también que este enfoque tiene utilidad general. Como opción, puede incluirse un paso de fijación para asegurar que las proteínas seleccionadas sean funcionales. Sin embargo, la dependencia del presente enfoque respecto a la extensión en placas (para visualización de las calvas) introduce una posible limitación logística en términos de números de placas que pueden ser manipuladas y limita por tanto su 50 aplicación a bibliotecas más pequeñas. No obstante, la utilidad del presente enfoque puede extenderse a grandes bibliotecas, si la biblioteca se reduce primero a un tamaño manejable. Esto puede hacerse, por ejemplo, por incorporación en el sistema de selección de un paso que pudiera eliminar grandes poblaciones de especies inestables, v.g., la adsorción de la biblioteca en una superficie de proteína A, o en una columna de interacción hidrófoba para eliminar proteínas deficientemente plegadas con superficies hidrófobas expuestas (Matsuura, T. et 55 al., 2003). En este caso, el enfoque se utilizó para seleccionar VHs y VLs con buenas propiedades biofísicas en un fondo de VHs y VLs muy inestables. Sin embargo, puede ser más difícil seleccionar las especies "óptimas" de una biblioteca de mutantes que está poblada con proteínas que poseen estabilidades razonablemente satisfactorias. En este caso, las variantes principales pueden identificarse basándose en la tasa de formación de calvas utilizando tiempos de incubación más cortos, o basándose en criterios de tamaño de calva y frecuencia. 60
La presente estrategia de selección se puede extender a la identificación de fragmentos de anticuerpo estables y bien plegados, tales como los scFv y Fab, con la inclusión óptima, en el sistema de selección, de una etapa de fijación en la que intervenga la proteína L, A o cualquier ligando, así como armazones estables que no son de anticuerpo, y variantes de los mismos. Además, la correlación observada entre el tamaño de las calvas de los fagos y el rendimiento de la expresión del VH significa que se puede utilizar la presente estrategia para adquirir versiones 5 de alta expresión de proteínas que, si no, se expresaría poco o mal a partir de las genotecas de exposición en fagos de mutantes. Esta aplicación sería particularmente atractiva en el caso de las proteínas terapéuticas o de reactivos proteicos caros que se expresan mal, en donde el aumento de la expresión de la proteína compensaría significativamente el coste de producción de las proteínas.
Análisis de fijación de los pentámeros 10
Tanto los VL como los VH se prestan a la pentamerización, y la pentamerización se puede utilizar para convertir con rapidez un monómero de VL o VH de baja afinidad en un pentámero de VL o VH de alta afinidad. Tales pentámeros son agentes de detección y de diagnóstico muy valiosos. En tales aplicaciones, la fijación de un pentámero de VL o VH a su diana se puede detectar mediante una molécula indicadora, tal como una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina), o una molécula fluorescente conjugada al pentámero. Como alternativa, la 15 fijación del pentámero se puede detectar mediante una molécula secundaria que se conjuga a la molécula indicadora. La molécula secundaria puede ser específica del propio pentámero o de una etiqueta del mismo, tal como una etiqueta 6His o una etiqueta c-Myc. Por ejemplo, una molécula secundaria típica es una inmunoglobulina.
Las interacciones entre los VH y la proteína A, y los VL con la proteína L son fundamentalmente diferentes de las que se dan entre los VH y VL con sus antígenos diana. En la fijación al antígeno de un VH o un VL intervienen tres bucles 20 de fijación al antígeno que forman el sitio de combinación de un dominio de anticuerpo. En la fijación de la proteína A a un VH con actividad de fijación a la proteína A y a un VL con actividad de fijación a la proteína L intervienen sitios de fijación y restos de los dominios de anticuerpo que son totalmente independientes del sitio de combinación del anticuerpo. Así pues, un VH con actividad de fijación a la proteína A puede fijarse simultáneamente a la proteína A y a su antígeno diana, y un VL con actividad de fijación a la proteína L puede fijarse simultáneamente a la proteína L y 25 a su antígeno diana. Ya que los presentes VH y VL tienen afinidad por las proteínas A y L, respectivamente, las proteínas A y L se pueden utilizar como la molécula secundaria para las aplicaciones de detección y de diagnóstico mencionadas más arriba. Los pentámeros de VH y VL de humano también se pueden utilizar para el tratamiento.
Detección de patógenos mediante los pentámeros
La actividad de fijación a las proteínas A y L que tienen los VH y VL se puede utilizar para detectar bacterias que 30 tienen la proteína A y/o la proteína L en la superficie. La proteína A está presente en la superficie de la bacteria patógena Staphylococcus aureus. Así pues, los VH con actividad de fijación a la proteína A, tales como los descritos aquí, se puede utilizar para detectar S. aureus. De igual forma, los monómeros de VL y los pentámeros de VL con actividad de fijación a la proteína L se pueden utilizar para detectar bacterias, en particular bacterias patógenas, tal como Peptostreptococcus magnus, que tienen la proteína L en su superficie celular. 35
La proteína L está involucrada como factor de virulencia en la patogenia de P. magnus (Ricci, S. et al., 2001) en los humanos. En la vaginosis, se cree que la proteína L ejerce su efecto al entreconectarse con la IgE asociada a la superficie. Los monómeros y/o pentámeros de VL con actividad de fijación a la proteína L tienen potencial terapéutico, ya que podrían interferir con la acción de entrecruzamiento con la IgE que tiene la proteína L.
La proteína A está involucrada como factor de virulencia en la patogenia de S. aureus en los humanos (Fournier, B. 40 et al., 2004). Su virulencia se ha atribuido a su capacidad para interaccionar con componentes del hospedador, lo que incluye la fijación a anticuerpos. Los monómeros y/o los pentámeros de VH con actividad de fijación a la proteína A tienen la posibilidad de ser utilizados en tratamientos, ya que podrían interferir con la interacción de la proteína A con los componentes del hospedador.
EJEMPLOS 45
Identificación y análisis de secuencia de VHs humanos monómeros
Durante el curso de la construcción de bibliotecas de VH totalmente humanos y humanos llamizados, se descubrió que los fagos que exhibían VHs llamizados monómeros formaban calvas mayores en céspedes bacterianos que los fagos que exhibían VHs totalmente humanos con tendencias a agregación. Por ello, se utilizó el tamaño de las calvas como medio para la identificación de VHs monómeros raros, existentes naturalmente a partir del repertorio de VHs 50 humanos (Figura 1). A este fin, se construyó una biblioteca de fagos que exhibía VHs humanos con un tamaño de 6 x 108 y se propagó en forma de calvas en placas de agar. En las placas de titulación, la biblioteca estaba constituida esencialmente por pequeñas calvas intercaladas con algunas grandes. La PCR en 20 clones reveló que las calvas pequeñas correspondían a los fagos que presentaban VH, mientras que las grandes representaban los fagos de tipo salvaje, es decir, fagos que carecían de inserciones de la secuencia VH. No se encontró ninguno de los fagos que 55 presentaban VH con morfología de calvas grandes. Esto no era inesperado, dada la escasez de los VHs monómeros en el repertorio humano y el gran tamaño de la biblioteca. Para facilitar la identificación de VHs monómeros, se
decidió reducir la biblioteca a un tamaño manejable y eliminar los fagos de tipo salvaje causantes de interferencia con morfología de gran tamaño de calva por lavado en batea de la biblioteca contra proteína A que se fija a un subconjunto de VHs humanos de la familia VH3.
Después de unas cuantas tandas de lavado en batea, la biblioteca se enriqueció en fagos que producían calvas grandes, y la PCR y la secuenciación de más de 110 de dichas calvas demostraron que todas ellas tenían marcos 5 de lectura abiertos VH completos. El tamaño de las calvas grandes que se seleccionaron para análisis se representa en la Figura 1. La secuenciación reveló 15 VHs diferentes que pertenecían a la familia VH3 y utilizaban segmentos V de línea germinal DP-38, DP-47, V3-49, V3-53, YAC-5 u 8-1B (Tabla 1; Figura 2). Las secuencias de línea germinal DP-38 y DP-47 se han visto implicadas con anterioridad en fijación de proteína A. Adicionalmente, todos los VHs tenían un residuo Thr en la posición 57 (Figura 2), consistente por su actividad de fijación de proteína A. El 10 segmento V de la línea germinal utilizado más frecuentemente era DP-47, que existía en más del 50% de los VHs, pero el clon más frecuente (a saber, HVHP428; frecuencia relativa 46%) utilizaba el segmento V de la línea germinal V3-49. HVHP429, con una secuencia de línea germinal DP-47, era el segundo VH más abundante con una frecuencia relativa de 21% (Figura 2). Las longitudes de CDR3 VH abarcaban desde 4 aminoácidos para HVHB82 hasta 16 aminoácidos para los aminoácidos de HVHP430, teniendo HVHP430 un par de residuos Cys en CDR3. Se 15 observaron mutaciones de aminoácidos con respecto a las secuencias del segmento V de la línea germinal parental (residuos 1-94) y FR4 (residuos 103-113), en todos los VHs y estaban comprendidas entre dos mutaciones para HVHP44 (L5V y Q105R) y HVHB82 (E1Q y L5Q) hasta 16 mutaciones para HVHP426 (Tabla 1). Las mutaciones se concentraban en los segmentos V; se detectaron sólo dos mutaciones en la totalidad de los 15 FR4s, en las posiciones 105 y 108. HVHP44 y HVHB82 diferían de otros VHs en que los mismos tenían un aminoácido cargado 20 positivamente en la posición 105 en lugar de una Gln (Tabla 1; Figura 2). No obstante, si bien el aminoácido con carga positiva en HVHP44 se adquiría por mutación, el de HVHB82 estaba codificado en la línea germinal. Excepto en lo que respecta a HVHP423 y HVHP44B, los VHs restantes tenían los residuos de la línea germinal en las posiciones de solubilidad principales: 37V/44G/45L/47W o 37F/44G/45L/47W (HVHP428; HVHP423 y HVHP44B tenían una mutación V37F. Las mutaciones en otras posiciones que se demuestra o se supone son importantes en 25 la solubilidad de VH incluían siete E6Q, tres S35T/H, una R83G y una K83R, una A84P y una T84A y una M108L. Se observaban también mutaciones frecuentes en las posiciones 1 y 5 que incluían once E1Q, ocho L5V/Q y una mutación V5Q.
Caracterización biofísica de los VHs humanos
Todos los VHs excepto HVHP44B, que era esencialmente el mismo que HVHP423, se expresaban en volúmenes de 30 cultivo de 1 litro en la cepa TG1 de E. coli en fusión con el marcador c-Myc-His5 y se purificaron hasta homogeneidad de extractos periplásmicos por cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC). Los rendimientos de expresión oscilaban desde 1,8 a 62,1 mg de proteína purificada por litro de cultivo bacteriano en matraces de sacudidas, teniendo la mayoría de los VHs rendimientos de varios miligramos (Tabla 2). En el caso de HVHP423 y HVHP430, otra prueba en condiciones de expresión "aparentemente" iguales dieron rendimientos de 2,4 35 y 6,4 mg frente 62,1 y 23,7 mg, respectivamente. Esto implica que para muchos de los VHs descritos en esta memoria deberían alcanzarse condiciones de expresión optimas, sin mucho esfuerzo, dando como resultado rendimientos de expresión significativamente mayores que los valores consignados en la Tabla 2. Como era de espesar, la totalidad de los VHs se fijaban a la proteína A en análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR), con KDs de 0,2-3 μM, un intervalo y magnitud comparables a los consignados previamente para variantes de 40 VHH de llama con actividad de fijación de proteína A. Ninguno de los VHs se fijaba a la superficie de referencia de Fab.
La tendencia a la agregación de los VHs humanos se evaluó en términos de sus estados de oligomerización por cromatografía de filtración en gel y NMR (Tabla 2). Todos los VHs se sometieron a cromatografía de filtración en gel Superdex 75. Análogamente a un VHs de llama, es decir, H11C7, todos los VHs daban un soplo pico simétrico para el 45 volumen de elución esperado para un monómero, y estaban sustancialmente exentos de cualesquiera agregados (véase el ejemplo para HVHP428 en la Figura 3A). En contraste, un VH humano típico (a saber, BT32/A6) formaba una cantidad considerable de agregados. Para tres de los VHs, se observó también un pico menor con una movilidad esperada para un dímero de VH. Los análisis SPR de los picos menores daban valores de tasa de disociación que eran significativamente más lentos que los correspondientes a los VHs monómeros, consistentes con el hecho de 50 que se trataba de dímeros. El pico del dímero se observó también en el caso del VHH de llama, H11C7. Los estados de plegado y oligomerización de los VHs a concentraciones altas se estudiaron ulteriormente por espectroscopia NMR. Como se muestra en la Tabla II, todas las proteínas VH estudiadas parecían ser relativamente solubles y asumían una estructura tridimensional bien plegada. Los espectros NMR unidimensionales de los fragmentos VH (Fig. 3B) exhibían pliegues estructurales característicos de dominios VH. El estado de agregación de las proteínas se 55 evaluó también por el uso de un experimento de difusión PFG-NMR para el fragmento HVHP414 y dos isoformas, VH14 y VH14-cMyc- con y sin la secuencia c-Myc, del HVHP414. VH14 es una versión modificada de HVHP414 con una mutación c-Myc N132E y con un residuo metionina adicional en el término N. En resumen, los datos PFG-NMR (no presentados) indicaban que todas las muestras de proteína tenían los pesos moleculares monómeros esperados incluso a las concentraciones de proteína relativamente altas utilizadas para los experimentos NMR. 60
Se investigó ulteriormente la estabilidad de los VHs en términos de su resistencia a tripsina respecto a la integridad a 37ºC después de incubaciones largas a 37ºC. La tripsina escinde las cadenas principales amídicas de los polipéptidos en el término C de un residuo Arg o Lys. Existen 9-13 residuos Arg y Lys en los VHs humanos (Figura 2). Existe también un residuo Lys adicional en el marcador c-Myc del terminal C que es sensible a la digestión por tripsina. La Figura 4a es un análisis SDS-PAGE de HVHP414 durante la digestión con tripsina. En el transcurso de 5 una hora, la banda original se convertía completamente en un producto simple que tenía una movilidad esperada para el VH sin marcador c-Myc-His5 alguno. Se obtuvo el mismo resultado para otros 12 VHs después de una incubación de una hora con tripsina. La espectrometría de masas en una muestra seleccionada al azar de los VHs tratados con tripsina (a saber, HVHP414, HVHP419, HVHP420, HVHP423, HVHP429, HVHP430 y HVHM81) confirmó que en todos los casos la masa molecular del producto digerido correspondía a un VH con el c-Myc Lys 10 como el residuo C-terminal. HVHM41 daba un fragmento significativamente más corto que el resto después de digestión, y en este caso los experimentos de espectrometría de masas mapeaban el sitio de escisión al Arg 99 en CDR3 (datos no presentados).
Once VHs comprendidos en concentración desde 0,32 mg/ml (HVHP428) hasta 3,2 mg/ml (HVHP420) se incubaron a 37ºC durante 17 días. Su estabilidad se determinó subsiguientemente en términos de estado de oligomerización y 15 fijación de proteína A. Como se demostró por cromatografía de permeación en gel, el tratamiento de VHs a 37ºC no producía formación alguna de agregados: todos los VHs daban perfiles de cromatograma que eran virtualmente idénticos a los de VHs sin tratar y se mantenían esencialmente como monómeros (véase el ejemplo para HVHP420; Figura 4c). Para asegurar que los VHs mantenían su plegamiento nativo después del tratamiento a 37ºC, se seleccionaron al azar dos VHs, a saber, HVHP414 (1,2 mg/ml) y HVHP420 (3,2 mg/ml), y se determinaron sus KDs 20 de fijación a la proteína A por SPR (datos presentados para HVHP420; recuadro en la Figura 4c) y se compararon con los KDs obtenidos para VHs sin tratar (Tabla 2). Los KDs calculados para los VHs tratados térmicamente eran 1,4 μM y 1,0 μM para HVHP414 y HVHP420, respectivamente. Estos valores son esencialmente idénticos a los valores correspondientes para los VHs sin tratar (Tabla 2), demostrando que el tratamiento de VHs a 37ºC no afectaba a su plegamiento nativo. La posibilidad de que los VHs puedan haber estado en un plegamiento no nativo menos 25 compacto durante los periodos de incubación a 37ºC y hayan adquirido nuevamente su plegamiento nativo después de volver a la temperatura ambiente durante los experimentos de filtración en gel y SPR es poco probable en vista del hecho de que los VHs eran resistentes a tripsina a 37ºC (véase arriba), una propiedad asociada típicamente para proteínas nativas bien plegadas.
La eficiencia de replegado (RE) de los VHs humanos se investigó por comparación de los valores KDs de la fijación 30 de los VHs nativos (KDn) y los replegados y tratados térmicamente (KDref) a la proteína A (Tanha, J. et al., 2002). Cuando se desactiva una fracción del VH por tratamiento térmico, el valor KD medido sería mayor, dado que este parámetro está basado en la concentración de fragmento de anticuerpo plegado, es decir, activo. Así, la ratio de KDn a KDref da una medida de la RE de VH. La Figura 5 compara sensogramas para fijación de HVHP423 a proteína A inmovilizada en estados nativo (líneas gruesas) y replegado (líneas delgadas) para varias concentraciones de VH 35 seleccionadas. Como puede verse, la fijación del VH replegado a la proteína A es menor en todos los casos, lo que indica que el desplegado no es totalmente reversible. Para cada uno de los 14 VHs, se midió la fijación a la proteína A en ambos estados nativo y replegado a varias concentraciones, y se determinaron los valores KDs y subsiguientemente REs (Tabla 2, no se muestran los valores KDref). Se determinaron también los valores KDs y REs de dos VHHs anti-idiotípicos de llama, H11F9 y H11B2, que se utilizaron como referencias. Cuatro VHs tenían REs en 40 el intervalo de 92%-95%, similares a las REs para H11F9 y H11B2, 95% y 100%, respectivamente. Otros cinco tenían REs en el intervalo de 84%-88% y tres superiores a 70%. Únicamente dos tenían RE significativamente menor: HVHP413 (52%) y HVHP421 (14%). Varios VHHs publicados examinados con anterioridad tenían RE próxima a 50% (van der Linden, R.H. et al., 1999).
Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago VH humanas. Se sintetizó cDNA a partir 45 de mRNA de bazo humano (Ambion Inc., Austin, TX) utilizando iniciadores hexanucleotídicos aleatorios y el kit de DNA de la Primera Cadena™ (GE Healthcare, Baie d'Urfé, QC, Canadá). Utilizando los cDNAs como molde, genes de VH con secuencias CH flanqueantes se amplificaron por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en nueve reacciones separadas utilizando iniciadores específicos de la región de entramado 1 (FR1) de VH y un iniciador específico de inmunoglobina M (de Haard, H.J. et al., 1999). Los productos se purificaron en gel y se utilizaron 50 como el molde en la segunda tanda de PCR para construir genes de VH utilizando los iniciadores específicos de FR1 y FR4 (de Haard, H.J. et al., 1999) que introdujeron también sitios de restricción flanqueantes ApalI y NotI para propósitos de clonación. Los DNAs resultantes del repertorio VH se clonaron en el vector de fago fd-tetGIIID y se construyó una biblioteca de presentación de fago de VH (Tanha, J. et al., 2001). El lavado en batea contra proteína A (Amersham Biosciences Inc.) se realizó como ha sido descrito (Tanha, J. et al., 2001). La asignación de 55 secuencias de la línea germinal de los VHs seleccionados se realizó utilizando el software DNAPLOT, Version 2.0.1 y V BASE Version 1.0. (
http://vbase.dnaplot.de/cqi-bin/vbase/vsearch.pl). Se aislaron los VHHs de llama H11C7, H11F9 y H11B2 de una biblioteca de presentación de fagos VHH de llama por lavado en batea contra H11 scFv como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2002).
Expresión y purificación de VH. Se clonaron VHs en vectores de expresión pSJF2 por técnicas estándar de 60 clonación (Sambrook, J. Fritsch E.F. y Maniatis P, 1989). La expresión periplásmica de sdAbs y la purificación subsiguiente por cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC) se realizaron como se ha descrito
(Muruganandam, A. et al., 2002). Las concentraciones de proteínas se determinaron por medidas de A280 utilizando los coeficientes de absorción molar calculados para cada proteína (Pace, C.N. et al., 1995). La cromatografía de filtración en gel de los VHs purificados se realizó en una columna Superdex 75 (GE Healthcare) como ha sido descrito (Deng, S.J. et al., 1995).
Experimentos de eficiencia de fijación y replegado. Las constantes de disociación de equilibrio (KDs) y las 5 eficiencias de replegado (REs) de VHs/ VHHs se derivaron de datos de resonancia de plasmones de superficie (SPR) recogidos con el sistema biosensor BIACORE 3000 (Biacore Inc., Piscataway, NJ). Para medir la fijación de VHs a la proteína A, se inmovilizaron 2000 unidades de resonancia (RUs) de proteína A o un fragmento de fijación de antígeno (Fab) de referencia sobre chips sensores CM5 de grado investigación (Biacore Inc.). Las inmovilizaciones se realizaron a concentraciones de 25 μg/ml (proteína A) o 50 μg/ml (Fab) en tampón de acetato de sodio 10 mM de 10 pH 4,5, utilizando el kit de acoplamiento de aminas proporcionado por el fabricante. Para medir la fijación de los VHHs anti-idiotípicos de llama a H11 scFv, se inmovilizaron 4100 RUs de H11 scFv de 50 μg/ml o 3000 Rus de Se155-4 IgG de referencia de 10 μg/ml, como se ha descrito arriba. En todos los casos, los análisis se realizaron a 25ºC en HEPES 10 mM, de pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005% de P20 a un régimen de flujo de 40 μl/min, y las superficies se regeneraron por lavado con el tampón de desplazamiento. Para determinar las 15 actividades de fijación de las proteínas replegadas, se desnaturalizaron VHs o VHHs por incubación a 85ºC durante 20 min a concentraciones de 10 μg/ml. Las muestras de proteína se enfriaron luego a la temperatura ambiente durante 30 min y se replegaron y centrifugaron subsiguientemente en una microcentrífuga a 14000 rpm durante 5 min a la temperatura ambiente para eliminar cualesquiera precipitados de proteína. Se recuperaron los sobrenadantes y se analizaron respecto a actividad de fijación por SPR como se ha descrito arriba. Tanto para las 20 proteínas plegadas como para las replegadas, se ajustaron los datos a un modelo de interacción 1:1 simultáneamente utilizando software BIAevaluation 4.1 (Biacore Inc.) y se determinaron subsiguientemente los valores KDs. Los valores REs se determinaron a partir de
donde KDn es el valor KD de la proteína nativa y KDref es el valor KD de la proteína replegada. 25
Experimentos de digestión con tripsina. Se añadieron 3 μl de una tripsina de grado secuenciación de 0,1 μg/ml recién preparada (Hoffmann-La Roche Ltd., Mississauga, ON, Canadá) en HCl 1 mM a 60 μg de VH en tampón Tris-HCl 100 mM de pH 7,8. Las reacciones de digestión se realizaron en un volumen total de 60 μl durante 1 hora a 37ºC y se pararon por adición de 5 μl de inhibidor de tripsina de 0,1 μg/μl (Sigma, Oakville, ON, Canadá). Una vez completada la digestión, se retiraron 5 μl y se analizaron por SDS-PAGE; el resto se desaló utilizando ZipTipC4 30 (Millipore, Nepean, ON, Canadá), se eluyó con ácido acético al 1% en metanol:agua 50:50 y se sometió a determinación de la masa de VH por espectrometría de masas MALDI.
Estudios de estabilidad de las proteínas a 37ºC. Anticuerpos mono-dominio (sdAbs) a concentraciones de 0,32-3,2 mg/ml se incubaron a 37ºC en tampón PBS durante 17 días. Después de la incubación, las muestras de proteína se centrifugaron en una microcentrífuga a la velocidad máxima durante 5 min incluso en ausencia de cualquier 35 formación visible de agregados. Las muestras se aplicaron luego a una columna de exclusión por tamaños Superdex 75 (GE Healthcare) y los picos de monómero se recogieron para análisis SPR contra proteína A. Los análisis SPR se efectuaron como se ha descrito arriba excepto que se inmovilizaron 500 RUs de proteína A o Fab de referencia y que las inmovilizaciones se realizaron a concentración de 50 μg/ml.
Experimentos NMR. Muestras de VH para análisis NMR se disolvieron en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, 40 EDTA 0,5 mM, y NaN3 al 0,02% a pH 7,0. Las concentraciones de proteína eran 40 μM-1,0 mM. Todos los experimentos NMR se realizaron a 298 K en un espectrómetro Bruker Avance-800 o Bruker Avance-500 NMR. Los espectros 1H NMR unidimensionales (1D) se registraron con 16384 puntos de datos y las anchuras espectrales eran 8992,81 Hz a 500 MHz y 17605,63 Hz a 800 MHz, respectivamente. Se adquirieron espectros 1H-1H-NOESY bidimensionales de 2048 x 400 puntos de datos en un espectrómetro Bruker Avance-800 NMR con una anchura 45 espectral de 11990,04 Hz y un tiempo de mezcla de 120 ms. En todos los experimentos NMR, la supresión del agua se consiguió utilizando el método WATERGATE implementado por el tren de impulsos 3-9-19 (Piotto, M. et al., 1992; Sklenar, V. et al., 1993). Los datos NMR se procesaron y analizaron utilizando el paquete de software Bruker XWINNMR. Todas las medidas de difusión PFG-NMR se realizaron con la secuencia LED previa supresión del agua (Altieri, A.S. et al., 1995), en un espectrómetro Bruker Avance-500 NMR, equipado con una sonda de resonancia 50 triple con gradientes triaxiales. Los espectros unidimensionales de protones se procesaron y analizaron utilizando el paquete de software Bruker XWINNMR. Las intensidades de las señales NMR se obtuvieron por integración de los espectros NMR en la región de los protones de metilo y metileno (2,3 ppm a -0,3 ppm), donde todas las señales NMR se atenuaban uniformemente para todas las concentraciones de PFG dadas.
Construcción y lavado en batea de bibliotecas de presentación de fago humanas VL. Se sintetizaron cDNAs a 55 partir de mRNA de bazo humano como se ha descrito arriba para los VHs humanos. Se utilizó el cDNA como molde
en la PCR para amplificar los genes VL en volúmenes de reacción de 50 μl utilizando seis iniciadores VK inversos, once iniciadores Vλ inversos (de Haard, H.J. et al., 1999), cuatro iniciadores Vκ directos y dos iniciadores Vλ directos (Sblattero, D. et al., 1998). Los iniciadores inversos y directos se modificaron de modo que tuvieran sitios de restricción flanqueantes Apa LI y Not I, respectivamente, para propósitos de clonación subsiguientes. Los iniciadores directos se agruparon en ratios que reflejaban su grado de degeneración. Los genes Vλ se sometieron a PCR en 5 once reacciones separadas utilizando los iniciadores directos Vλ agrupados y once iniciadores inversos Vλ individuales. Análogamente, los genes Vλ se amplificaron en seis reacciones separadas utilizando los iniciadores directos VK agrupados y seis iniciadores inversos Vλ individuales. Los productos PCR se agruparon, se purificaron en gel y se digirieron con las endonucleasas de restricción Apa LI y Not I. La biblioteca se construyó como se describe para los VHs humanos. La PCR de las calvas se realizó sobre colonias de bibliotecas individuales y los genes VL 10 amplificados se secuenciaron como se ha descrito (Tanha, J. et al., 2003). El lavado en batea contra la proteína L (Biolynx Inc., Brockville, ON, Canadá) y la asignación de la secuencia de la línea germinal de los VHs seleccionados se realizaron como se ha descrito arriba para la biblioteca VH humana.
Expresión y purificación de VL. La expresión, purificación, determinación de la concentración y cromatografía de filtración en gel de VL se realizaron como se ha descrito para VHs en "expresión y purificación de VH". 15
Expresión y purificación de pentámeros de VL y VH. Se utilizaron iniciadores específicos en una PCR para amplificar los genes HVHP328 VH y HVLP335 VL. Se utilizaron técnicas estándar de clonación para clonar los genes HVHP328 y HVLP335 en fusión con el gen del dominio de pentamerización VT1B en un vector de expresión para producir pentámeros HVHP328PVT2 y HVLP335PTV2, (Zhang, J. et al., 2004). Los pentámeros se expresaron y purificaron como se ha descrito (Zhang, J. et al., 2004). Las concentraciones de proteína se determinaron como 20 anteriormente.
Resonancia de plasmones de superficie de VLs. Las cinéticas de fijación para la interacción de los VLs a la proteína L se determinaron por SPR utilizando el sistema biosensor BIACORE 3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ). 680 RUs de proteína L u 870 RUs de una referencia Fab se inmovilizaron sobre chips sensores CM5 de grado investigación (Biacore). Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a una concentración de proteína de 50 μg/ml en 25 tampón de acetato 10 mM de pH 4,5 utilizando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante. Todas las medidas se realizaron a 25ºC en tampón HEPES 10 mM de pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005% de P20 a un régimen de flujo de 50 μl/min o 100 μl/min. Las superficies se regeneraron por lavado con el tampón de desplazamiento. Los datos se evaluaron utilizando el software BIAevaluation 4.1 (Biacore, Inc.).
Resonancia de plasmones de superficie de los pentámeros de VL y VH. Se determinaron también por SPR las 30 cinéticas de fijación para la interacción de HVHP328PVT2 con proteína A y HVLP335PTV2 con proteína L. Se inmovilizaron como anteriormente 520 RUs de proteína A o una Fab de referencia. Para el pentámero de VL, se utilizaron las mismas superficies preparadas anteriormente. Las medidas se efectuaron como anteriormente pero a un régimen de flujo de 20 μl/min. Las superficies se regeneraron por lavado con HCl 50 mM durante 3 s. Los datos se evaluaron como se ha descrito para los monómeros. 35
Microaglutinación de células
Se utilizó una sola colonia de S. aureus de una placa BHI para inocular 15 ml de medio BHI. Las bacterias se dejaron crecer durante una noche a 37ºC a 200 rpm. A la mañana siguiente, se centrifugó el cultivo en una centrífuga Sorvall RT6000B refrigerada de cubeta oscilante a 4000 rpm durante 10 min, se retiró el sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió en tampón PBS. Se centrifugaron de nuevo las células, se retiró el 40 sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió de nuevo en tampón PBS. Se diluyeron las células a un valor A600 de 1,0, y se extendieron diluciones en serie de las células en placas BHI a 37ºC para crecimiento durante la noche. A la mañana siguiente se determinó el título de células. Un valor A600 de 1,0 correspondía a 1,5 x 109 células ml-1. Se dieron pasos idénticos para preparar células de la cepa TG1 de E. coli para ensayos subsiguientes de microaglutinación, excepto que el medio de crecimiento era 2 x YT. Los recuentos viables fueron similares, A600 45 1,0 = 2,1 x 109 células ml-1.
Para realizar los ensayos de microaglutinación, se realizaron diluciones al doble de HVHP328PVT2 en PBS de los pocillos 1 a 11 en una placa de microtitulación. El pocillo 12 (blanco) tenía únicamente PBS. El volumen total en cada pocillo era 50 μl. Subsiguientemente, se añadieron 1 x 108 células de S. aureus en 50 μl de PBS a todos los pocillos, y la placa se incubó durante una noche a 4ºC. Para lograr un registro permanente de los resultados, se 50 tomó una fotografía de la placa durante la mañana. Para el experimento de control de pentámeros, se reemplazó HVHP328PVT2 con el pentámero de VL, HVLP335PTV2. En los experimentos de control de células, se repitieron las dos mismas series de experimentos con células TG1 de E. coli.
Identificación y análisis de la secuencia de VLs humanos monómeros
Se aplicó esencialmente el mismo método de selección empleado para aislar VHs solubles de una biblioteca de 55 presentación de fago VH humana a una biblioteca VL humana para aislar los VLs solubles monómeros. Se construyó una biblioteca VL humana con un tamaño de 3 x 106. Se seleccionaron 24 calvas de las placas de titulación de la
biblioteca y sus genes VL se sometieron a PCR y se secuenciaron. Las secuencias eran diversas en términos de origen de la línea germinal, aunque el 75% de los VLs eran de origen Vλ (datos no presentados). Tres tandas de lavado en batea contra la proteína L dieron como resultado el enriquecimiento de calvas grandes. Treintainueve de las calvas grandes se secuenciaron y se identificaron treinta y dos secuencias singulares (Figura 6). HVLP325, HVLP335 y HVLP351 aparecían con frecuencia de 3, 4 y 2, respectivamente. Excepto HVLP389 que es de la clase 5 lambda (subgrupo Vλ1, línea germinal 1b), los 31 VL restantes pertenecían a la clase Vκ. De los 31 VLs Kappa, 24 caen dentro del subgrupo VκIII y 7 dentro del subgrupo Vκ1. Dieciséis de las 24 secuencias VκIII utilizan la secuencia de línea germinal L6, utilizando las restantes las secuencias de línea germinal A27, L2 y L6. Los VLs del subgrupo Vκ1 se originan a partir de la secuencia de línea germinal O2/O12 o A30. En la posición 96 se producían mutaciones notables. Los aminoácidos de la línea germinal en esta posición son aminoácidos aromáticos e 10 hidrófobos Trp, Phe, Tyr, Leu o Ile para VLs kappa y Tyr, Val o Ala para los VLs lambda. Pero en la agrupación seleccionada de VLs kappa únicamente 5 de 31 tienen sus aminoácidos de la línea germinal en la posición 96: HVLP325, HVLP349, HVLP388, HVLP3109 y HVLP393. Veintiún aminoácidos en la posición 96 están cargados, de los cuales 20 tienen carga positiva: Arg, Lys o His. Dos aminoácidos son Pro, uno Gln, uno Ser y uno Thr. De siete VLs kappa analizados por cromatografía de filtración en gel respecto a carácter monómero, seis que tenían Arg o Lys 15 en la posición 96 eran también monómeros, en tanto que HVLP325 con el aminoácido Leu de la línea germinal en la posición 96 formaba agregados (véase más adelante). Análogamente, HVLP389 que era de la clase lambda y tenía una mutación de la línea germinal a Ser era también monómero (véase más adelante). Estos datos correlacionan la desviación de los aminoácidos de la línea germinal en la posición 96 (27 de 32) con propiedades biofísicas mejoradas de VLs tales como el carácter monómero. 20
Dieciocho VLs de la clase kappa tenían sus tres últimos residuos (105-107) reemplazados con aminoácidos Thr, Val y Leu que se encuentran únicamente en los VLs lambda. Estas sustituciones pueden haber tenido un papel en la mejora de las propiedades biofísicas de los VLs kappa, dando como resultado la selección de los VLs mencionados anteriormente sobre los clones parentales con los residuos kappa originales en la posición 105-107.
Caracterización de los VLs humanos 25
Ocho de los VLs seleccionados con orígenes diferentes de la línea germinal V se expresaron en E. coli en cultivos de 1 litro y se purificaron: HVLP324, HVLP325, HVLP335, HVLP342, HVLP351, HVLP364, HVLP389 y HVLP3103 (Tabla 6). Todos ellos se expresaban con buenos rendimientos comprendidos entre 6,2 mg para HVLP324 y alrededor de 75 mg para HVLP335 y HVLP364.
La tendencia a la agregación de los VLs humanos se evaluó en términos de su estado de oligomerización por 30 cromatografía de filtración en gel. Los VLs se sometieron a cromatografía de filtración en gel Superdex 75 a una concentración de 0,6 mg/ml. Todos excepto HVLP325 estaban esencialmente exentos de agregados y daban picos simples simétricos con el peso molecular medio aparente de 12,7 kDa (intervalo, 6,2-19,2 kDa) (Figura 7a y Tabla 3). Esto está de acuerdo con la masa molecular esperada para VLs monómeros, 13,4-13,8 kDa. La variación de masa molecular aparente para anticuerpos mono-dominio ha sido consignada previamente (Jespers, L. et al., 2004a; 35 Stevens, F.J. et al., 1980). Para HVLP325, los agregados formaban 11% de la proteína total (agregado más monómero). HVLP351, HVLP342, HVLP335 y HVLP3103 eran todavía monómeros cuando se testaron a su máxima concentración disponible, a saber, 0,89 mg/ml, 1,0 mg/ml, 4,9 mg/ml y 5,9 mg/ml, respectivamente (Figura 7B).
Se sometieron los VLs a cromatografía con Superdex-75 antes del análisis BIACORE y los picos de monómero purificados se recogieron incluso en ausencia de cualquier evidencia de material agregado. En el análisis SPR, 40 todos los VLs seleccionados se fijaban a proteína L (Figura 8). Esto no era inesperado, dado que los VLs se aislaron por lavado en batea contra proteína L. Para todos ellos, los valores KDs de fijación a proteína L estaban comprendidos entre 0,6 y 3 μM (Tabla 3). HVLP324 y HVLP342 tenían valores KDs adicionales más pequeños, 10 nM y 40 nM, respectivamente. Las fijaciones de afinidad baja y de afinidad alta de los VLs del subgrupo VκI a la proteína L han sido consignadas previamente (referencia). Ambos, HVHP324 y HVLP342, pertenecen al subgrupo 45 VκI (Tabla 3). Como era de esperar, los datos cinéticos y de equilibrio eran consistentes con el hecho de que pico monómero fuera realmente monómero.
Análisis de fijación de pentámeros
Las fijaciones del pentámero HVHP328PVT2 a proteína A y del pentámero HVLP335PTV2 a proteína L se determinaron por resonancia de plasmones de superficie (Figura 9). Las tasas de asociación se calcularon 50 independientemente a partir de gráficas de kobs frente a la concentración. Pudo calcularse más de una tasa de disociación (kd) debido a la heterogeneidad en fijación multivalente entre la población de pentámeros. Por esta razón, pudo obtenerse más de una constante de disociación de equilibrio, KD. HVHP328PTV2 y HVLP335PTV2 tenían valores KDs mínimos de 2 mM y 200 pM, respectivamente (Tabla 4). Con KDs más lentas, HVHP328PTV2 y HVLP335PTV2 tenían valores KDs tan bajos como 900 y 90 pM, respectivamente. 55
Detección de patógenos por VLs y VHs
La actividad de fijación a proteína A y L de los VHs y VLs puede utilizarse para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. Esto es posible si los VHs y VLs son solubles y monómeros (falta de tendencia a agregarse) tales como los VHs y VLs de esta invención. Los dominios variables derivados de anticuerpos que carecen de cadenas ligeras tales como los anticuerpos de cadena pesada de Camélidos o los IgNARs de tiburón nodriza o tiburón alfombra son naturalmente solubles y monómeros. De éstos, los que poseen actividad de fijación a 5 proteína A y L pueden utilizarse también para detectar bacterias que tienen proteína A y/o L en sus superficies. La proteína A está presente en la superficie de las bacterias patógenas, Staphylococcus aureus. Así, los VHs con actividad de fijación a proteína A tales como los descritos en esta memoria pueden utilizarse para detectar S. aureus. Los inventores realizaron un ensayo de microaglutinación para detectar la capacidad del pentámero de VH HVHP328PVT2 para fijarse a S. aureus. Se incubaron un número constante de células bacterianas con diluciones al 10 doble de HVHP328PVT2 en pocillos de microtitulación (pocillos 1-11) (Figura 10). El pocillo 12 contenía tampón en lugar del pentámero. Si los VHs se fijan a las células bacterianas, entonces el pentámero, debido a su naturaleza multímera, debería ser capaz de reticular las células y dar como resultado aglutinación celular. Las células aglutinadas aparecerán como células difusas en un pocillo de microtitulación (Figura 10). En ausencia de cualquier fijación, no ocurriría aglutinación alguna, es decir ausencia de aglutinación, y las células aparecerán como una 15 mancha en el fondo del pocillo. Como se muestra en la Figura 10, el pentámero se fija al S. aureus, dado que existe aglutinación de células. La aglutinación se observa hasta el pocillo 7. Más allá del pocillo 7, la concentración del pentámero es demasiado baja para la fijación, por lo que no se produce ya aglutinación alguna. El pentámero de control VL no exhibe aglutinación alguna, demostrando la especificidad del pentámero VH para S. aureus (Figura 10). La fijación es también específica en cuanto a las células, dado que el pentámero VH, como era de esperar, no 20 aglutina células de E. coli (cepa TG1) o de Salmonella (datos no presentados). Análogamente, los monómeros de VL y pentámeros de VL con actividad de fijación para proteína L pueden utilizarse para la detección de bacterias, en particular bacterias patógenas tales como Peptostreptococcus magnus, que tienen proteína L en la superficie de sus células.
25
Lista de referencias
Bai, Y. y Feng, H. (2004). Selection of stably folded proteins by phage-display with proteolysis. Eur.J.Biochem. 271: 1609-1614.
Davies, J. y Riechmann, L. (). 'Camelising' human antibody fragments: NMR studies on VH domains. FEBS Lett 339: 285-290. 30
Davies, J. y Riechmann, L. (1995). Antibody VH domains as small recognition units. Biotechnology N.Y. 13: 475-479.
de Haard, H. J., van Neer, N., Reurs, A., Hufton, S. E., Roovers, R. C., Henderikx, P., de Bruine, A. P., Arends, J. W. y Hoogenboom, H. R. (). A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J.Biol.Chem. 274: 18218-18230.
Deng, S. J., MacKenzie, C. R., Hirama, T., Brousseau, R., Lowary, T. L., Young, N. M., Bundle, D. R. y Narang, S. A. 35 (). Basis for selection of improved carbohydrate-binding single-chain antibodies from synthetic gene libraries. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 92: 4992-4996.
Forrer, P., Jung, S. y Pluckthun, A. (1999). Beyond binding: using phage display to select for structure, folding and enzymatic activity in proteins. Curr.Opin.Struct.Biol. 9: 514-520.
Fournier, B. y Klier, A. (2004). Protein A gene expression is regulated by DNA supercoiling which is modified by the 40 ArlS-ArlR two-component system of Staphylococcus aureus. Microbiology 150: 3807-3819.
Hamers, C. C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E. B., Bendahman, N. y Hamers, R. (6-3-1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363: 446-448.
Jespers, L., Schon, O., Famm, K. y Winter, G. (2004a). Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat.Biotechnol. 22: 1161-1165. 45
Jespers, L., Schon, O., James, L. C., Veprintsev, D. y Winter, G. (4-2-2004b). Crystal Structure of HEL4, a Soluble, Refoldable Human V(H) Single Domain with a Germ-line Scaffold. J.Mol.Biol. 337: 893-903.
Jung, S., Honegger, A. y Pluckthun, A. (). Selection for improved protein stability by phage display. J.Mol.Biol. 294: 163-180.
Matsuura, T. y Pluckthun, A. (). Selection based on the folding properties of proteins with ribosome display. 50 FEBS Lett. 539: 24-28.
Muruganandam, A., Tanha, J., Narang, S. y Stanimirovic, D. (2002). Selection of phage-displayed llama single-domain antibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothelium. FASEB J. 16: 240-242.
Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. y Gray, T. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4: 2411-2423.
Ricci, S., Medaglini, D., Marcotte, H., Olsen, A., Pozzi, G. y Bjorck, L. (2001). Immunoglobulin-binding domains of peptostreptococcal protein L enhance vaginal colonization of mice by Streptococcus gordonii. Microb.Pathog. 30: 229-235. 5
Sambrook, J. F. E. F. a. M. T. (1989). "Molecular Cloning: A laboratory Manual (2nd ed.)", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY..
Sblattero, D. y Bradbury, A. (1998). A definitive set of oligonucleotide primers for amplifying human V regions. Immunotechnology. 3: 271-278.
Tanha, J., Dubuc, G., Hirama, T., Narang, S. A. y MacKenzie, C. R. (5-1-2002). Selection by phage display of llama 10 conventional V(H) fragments with heavy chain antibody V(H)H properties. J.Immunol.Methods 263: 97-109.
Tanha, J., Muruganandam, A. y Stanimirovic, D. (2003). Phage Display Technology for Identifying Specific Antigens on Brain Endothelial Cells. Methods Mol.Med. 89: 435-450.
Tanha, J., Xu, P., Chen, Z. G., Ni, F., Kaplan, H., Narang, S. A. y MacKenzie, C. R. (7-6-2001). Optimal design features of camelized human single-domain antibody libraries. J.Biol.Chem 276: 24774-24780. 15
van der Linden, R. H., Frenken, L. G., de Geus, B., Harmsen, M. M., Ruuls, R. C., Stok, W., de Ron, L., Wilson, S., Davis, P. y Verrips, C. T. (). Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochim.Biophys.Acta 1431: 37-46.
Waldo, G. S. (2003). Genetic screens and directed evolution for protein solubility. Curr.Opin.Chem.Biol. 7: 33-38.
Ward, E. S., Gussow, D., Griffiths, A. D., Jones, P. T. y Winter, G. (). Binding activities of a repertoire of 20 single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli [véanse comentarios]. Nature 341: 544-546.
Zhang, J., Li, Q., Nguyen, T. D., Tremblay, T. L., Stone, E., To, R., Kelly, J. y MacKenzie, C. R. (). A pentavalent single-domain antibody approach to tumor antigen discovery and the development of novel proteomics reagents. J.Mol.Biol. 341: 161-169.
25
Tabla 1. Desviaciones de secuencia de VH respecto a las secuencias de la línea germinal parental
Desviación de aminoácidos de las secuencias de línea germinal V y FR4
Líneas germinales V/J
Tabla 2. Características biofísicas de los VHs humanos
Resistencia
a tripsina
# Rendimiento de expresión por litro de cultivo bacteriano 5
* KDs y REs se determinaron contra H11 scFv.
Tabla 3. Características de los VLs humanos
VL
Subgrupo Expresióna KD Estado de oligomerizaciónb
mg μM
HVLP324
VκI 6,9 0,2, 0,01c Monómero
HVLP325
VκIll 6,2 1 Monómero/Agregado
HVLP335
VκIll 73,5 2 Monómero
HVLP342
VκI 7,7 0,6, 0,04c Monómero
HVLP351
VκIll 8,9 2 Monómero
HVLP364
VκIll 77,1 3 Monómero
HVLP389
VλI 16,7 1 Monómero
HVLP3103
VκIll 19,0 1 Monómero
a Rendimiento de expresión por litro de cultivo bacteriano. 10
b El estado de oligomerización se determinó por cromatografía de filtración en gel.
c Los valores KD más pequeños corresponden a la fijación de HVLP324 y HVLP342 a los sitios de afinidad alta en la proteína L.
Tabla 4. Constantes cinéticas y de equilibrio para las fijaciones de HVHLP328PTV2 y HVLP335PTV2 a 5 proteína A y L, respectivamente
Pentacuerpo
HVHP328PTV2 HVLP335PTV2
ka (M-1s-1)
4,3 x 105 1,7 x 106
kd (s)
<1 x10-3 < 4 x 10-4
KD (M)
<2 x 10-9 <2 x 10-10

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID n.º 16.
  2. 2. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento de anticuerpo es un VH.
  3. 3. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 2.
  4. 4. Un multímero que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
  5. 5. Un dímero que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
  6. 6. Un trímero que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
  7. 7. Un pentámero que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2. 10
  8. 8. Un vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.
  9. 9. Una célula hospedadora transformada con el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 8.
  10. 10. Una genoteca de exposición que comprende la secuencia de fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde una o más de una región determinante de la complementariedad está aleatorizada.
  11. 11. Un método para producir la genoteca de fragmentos de anticuerpo, que comprende: 15
    a) dar a conocer una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2;
    b) dar a conocer secuencias oligonucleotídicas con codones aleatorizados;
    c) incorporar los oligonucleótidos aleatorios en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal manera que 20 una o más de una de las CDR está aleatorizada; y
    d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en la etapa c).
  12. 12. Utilización de una genoteca de fragmentos de anticuerpo obtenida mediante el método de la reivindicación 11, para cribar las secuencias expresadas en función de su capacidad de fijación a un polipéptido deseado.
  13. 13. La utilización de la reivindicación 12, en donde el cribado comprende la expresión del fragmento de 25 anticuerpo y rondas de cribado con a una molécula deseada.
ES10190143.7T 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles Active ES2558338T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US66495405P 2005-03-25 2005-03-25
US664954P 2005-03-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2558338T3 true ES2558338T3 (es) 2016-02-03

Family

ID=37023360

Family Applications (8)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06721715T Active ES2375826T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles.
ES10190242.7T Active ES2531537T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190155.1T Active ES2534305T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190225.2T Active ES2546788T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190093.4T Active ES2565782T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190248.4T Active ES2536995T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190187.4T Active ES2550836T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190143.7T Active ES2558338T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles

Family Applications Before (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06721715T Active ES2375826T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles.
ES10190242.7T Active ES2531537T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190155.1T Active ES2534305T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190225.2T Active ES2546788T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190093.4T Active ES2565782T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190248.4T Active ES2536995T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles
ES10190187.4T Active ES2550836T3 (es) 2005-03-25 2006-03-24 Método para aislamiento de polipéptidos solubles

Country Status (10)

Country Link
US (5) US8293233B2 (es)
EP (46) EP2377936A3 (es)
JP (7) JP5171611B2 (es)
AT (1) ATE531800T1 (es)
AU (1) AU2006227536B9 (es)
CA (8) CA2602028C (es)
ES (8) ES2375826T3 (es)
PL (1) PL2360255T3 (es)
PT (1) PT2360255E (es)
WO (1) WO2006099747A1 (es)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA03009415A (es) 2001-04-16 2004-01-29 Wyeth Corp ESTRUCTURAS NOVEDOSAS DE LECTURA ABIERTA DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE QUE CODIFICAN ANTIGENOS DE POLIPePTIDOS Y USOS DE LAS MISMAS.
EP2340848A3 (en) 2004-10-21 2011-09-14 Wyeth LLC Immunogenic compositions of Staphylococcus epidermidis polypeptide and polynucleotide antigens
EP2377936A3 (en) * 2005-03-25 2012-06-13 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
CN103435696B (zh) 2007-06-25 2016-10-12 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体
WO2009089295A2 (en) * 2008-01-07 2009-07-16 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Anti-hiv domain antibodies and method of making and using same
US20110269148A1 (en) * 2008-11-26 2011-11-03 National Cheng Chung University Nanoaggregate Embedded Beads Conjugated To Single Domain Antibodies
WO2012055030A1 (en) * 2010-10-25 2012-05-03 National Research Council Of Canada Clostridium difficile-specific antibodies and uses thereof
AU2012211011A1 (en) 2011-01-28 2013-08-15 National Research Council Of Canada Engineering of immunoglobulin domains
JP2015531350A (ja) * 2012-09-13 2015-11-02 ノバルティス アーゲー 末端修飾を有する抗原結合分子
WO2014173975A1 (en) 2013-04-23 2014-10-30 The University Court Of The University Of Aberdeen Isolation of therapeutic target specific vnar domains to icosl
ES2924282T3 (es) 2014-12-19 2022-10-05 Medimmune Ltd Moléculas de transporte a través de la barrera hematoencefálica y usos de las mismas
BR112017015582A2 (pt) 2015-01-23 2018-03-13 Helix Biopharma Corp conjugados de anticorpo-urease para propósitos terapêuticos
BR112018008891A8 (pt) 2015-11-03 2019-02-26 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a pd-1 e tim-3 e seus usos
AU2019231654A1 (en) * 2018-03-06 2020-10-01 Precigen, Inc. Human papillomavirus vaccines and uses of the same
CN112135622A (zh) * 2018-03-06 2020-12-25 普莱西根股份有限公司 乙型肝炎疫苗及其用途
WO2020041360A1 (en) 2018-08-21 2020-02-27 Quidel Corporation Dbpa antibodies and uses thereof
AU2020408213A1 (en) 2019-12-19 2022-06-23 Quidel Corporation Monoclonal antibody fusions
AR124914A1 (es) * 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0542810A1 (en) * 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5766886A (en) * 1991-12-13 1998-06-16 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5965408A (en) * 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6596850B1 (en) * 1998-01-30 2003-07-22 Ixsys, Incorporated Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
US5994511A (en) * 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
PT1171468E (pt) 1999-04-09 2008-10-08 Univ Zuerich Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado
GB9911569D0 (en) * 1999-05-18 1999-07-21 Oxford Biomedica Ltd Antibodies
CA2396534C (en) * 1999-12-28 2012-10-02 Esbatech Ag Intrabodies with defined framework that is stable in a reducing environment and applications thereof
US6855810B2 (en) * 2000-03-27 2005-02-15 The Regents Of The University Of California Ligands directed to the non-secretory component, non-stalk region of plgR and methods of use thereof
EP2368902A3 (en) 2000-03-29 2011-12-21 DGI Bio Technologies LLC Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
ATE365749T1 (de) 2000-05-12 2007-07-15 Gpc Biotech Ag Humane peptide/proteine, die das töten von zellen,einschliesslich lymphoide tumorzellen, herbeiführen oder bewirken
KR101287395B1 (ko) * 2000-06-16 2014-11-04 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
JP3375941B2 (ja) * 2000-11-24 2003-02-10 科学技術振興事業団 高効率抗体スクリーニング法
ES2376454T3 (es) 2000-12-22 2012-03-14 Grad, Carole, Legal Representative Of Howard, Kaplan Librer�?as de expresión en fago de fragmentos vh humanos.
WO2002059340A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 The Scripps Research Institute Immunopolypeptides to hepatitis c virus
DE10123041A1 (de) * 2001-05-11 2002-11-28 Tobias Heintges Humane hochaffine Antikörperfragmente gegen essentielle Proteine von Hepatitis-C-Virus
JP2004538324A (ja) 2001-08-03 2004-12-24 メディカル リサーチ カウンシル 細胞内抗体
WO2003019187A1 (fr) * 2001-08-22 2003-03-06 Institute For Antibodies Co., Ltd Procede de selection d'une molecule de liaison
GB0124317D0 (en) * 2001-10-10 2001-11-28 Celltech R&D Ltd Biological products
AU2003205125A1 (en) 2002-01-14 2003-07-30 George W. Gokel Synthetic ion channels
CA2476625A1 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
GB0226727D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intrabodies
NZ536412A (en) 2002-05-22 2008-10-31 Esbatech Ag Immunoglobulin frameworks which demonstrate enhanced stability in the intracellular environment and methods of identifying same
WO2003102136A2 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to neurokinin b
WO2003104425A2 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Novel stable anti-cd22 antibodies
EP1517921B1 (en) * 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
JP4660189B2 (ja) * 2002-07-03 2011-03-30 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 抗血小板自己抗体およびそのインヒビターに関連する組成物、方法およびキット
AU2003282247A1 (en) * 2002-11-15 2004-06-15 Medical Research Council Anti-activated ras antibodies
AU2004221876B2 (en) * 2003-03-14 2011-05-26 Cambridge Antibody Technology Limited Antibodies against human IL-21 receptor and uses therefor
CA2524737A1 (en) 2003-05-06 2005-02-24 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
AR045614A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el recepctor de la interleuquina- 1 y los usos de los mismos
TWI333977B (en) * 2003-09-18 2010-12-01 Symphogen As Method for linking sequences of interest
WO2005094879A2 (en) 2004-03-23 2005-10-13 Amgen, Inc. Monoclonal antibodies specific for human ox40l (cd 134l)
NZ552485A (en) * 2004-08-05 2009-11-27 Genentech Inc Humanized anti-cmet antagonists
CA2576886A1 (en) 2004-08-12 2006-02-23 Dyax Corp. Tie complex binding proteins
EP2377936A3 (en) 2005-03-25 2012-06-13 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
US20110269148A1 (en) * 2008-11-26 2011-11-03 National Cheng Chung University Nanoaggregate Embedded Beads Conjugated To Single Domain Antibodies
AU2012211011A1 (en) * 2011-01-28 2013-08-15 National Research Council Of Canada Engineering of immunoglobulin domains
JP2015531350A (ja) * 2012-09-13 2015-11-02 ノバルティス アーゲー 末端修飾を有する抗原結合分子

Also Published As

Publication number Publication date
EP1869182A4 (en) 2008-08-13
CA2873906C (en) 2020-11-24
US11993643B2 (en) 2024-05-28
US20090220485A1 (en) 2009-09-03
CA2873906A1 (en) 2006-09-28
EP2368994A3 (en) 2012-04-18
PL2360255T3 (pl) 2015-05-29
EP2316945A1 (en) 2011-05-04
WO2006099747A1 (en) 2006-09-28
EP2386638A2 (en) 2011-11-16
EP2374886B1 (en) 2015-11-11
EP2368997A3 (en) 2012-02-22
EP2322624A3 (en) 2012-03-14
EP2336324A2 (en) 2011-06-22
EP2336328A1 (en) 2011-06-22
US20190092840A1 (en) 2019-03-28
US20160052995A1 (en) 2016-02-25
EP2368997A2 (en) 2011-09-28
EP2336323A2 (en) 2011-06-22
EP2338999A2 (en) 2011-06-29
EP2351841A1 (en) 2011-08-03
AU2006227536B2 (en) 2011-08-11
JP5171611B2 (ja) 2013-03-27
EP2360255A1 (en) 2011-08-24
EP2322623A3 (en) 2011-10-19
EP2322624B1 (en) 2015-09-23
EP2339000A1 (en) 2011-06-29
EP2368991A2 (en) 2011-09-28
ATE531800T1 (de) 2011-11-15
EP2333066B1 (en) 2015-02-18
CA2873939C (en) 2020-11-10
ES2534305T3 (es) 2015-04-21
EP1869182A1 (en) 2007-12-26
CA2873899A1 (en) 2006-09-28
EP2368995A3 (en) 2012-01-18
EP2368992A3 (en) 2012-03-14
EP2316947A1 (en) 2011-05-04
JP2012070748A (ja) 2012-04-12
EP2374887A3 (en) 2012-07-18
EP2368992A2 (en) 2011-09-28
US10150807B2 (en) 2018-12-11
EP2374886A2 (en) 2011-10-12
EP1869182B1 (en) 2011-11-02
CA2868867A1 (en) 2006-09-28
EP2368994A2 (en) 2011-09-28
EP2360256B1 (en) 2014-12-31
EP2345723A1 (en) 2011-07-20
JP2018110583A (ja) 2018-07-19
EP2322624A2 (en) 2011-05-18
EP2338999A3 (en) 2012-05-23
EP2316948A1 (en) 2011-05-04
JP2014144010A (ja) 2014-08-14
EP2368991A3 (en) 2012-07-25
EP2333068A1 (en) 2011-06-15
JP5731956B2 (ja) 2015-06-10
EP2371961A1 (en) 2011-10-05
EP2368995A2 (en) 2011-09-28
EP2322622A3 (en) 2012-03-07
EP2322623A2 (en) 2011-05-18
CA2602028C (en) 2015-01-13
ES2546788T3 (es) 2015-09-28
EP2322622A2 (en) 2011-05-18
EP2336323A3 (en) 2012-05-23
EP2333067A1 (en) 2011-06-15
EP2330196A3 (en) 2012-04-18
EP2338998A1 (en) 2011-06-29
ES2536995T3 (es) 2015-06-01
ES2565782T3 (es) 2016-04-06
JP5901679B2 (ja) 2016-04-13
US11091536B2 (en) 2021-08-17
EP2377935B1 (en) 2015-07-15
EP2360256A1 (en) 2011-08-24
EP2368993A2 (en) 2011-09-28
CA2873939A1 (en) 2006-09-28
EP2368996A3 (en) 2011-12-14
EP2351842A1 (en) 2011-08-03
AU2006227536A1 (en) 2006-09-28
CA2868865A1 (en) 2006-09-28
EP2339001A2 (en) 2011-06-29
CA2868774A1 (en) 2006-09-28
EP2330195A2 (en) 2011-06-08
EP2368996A2 (en) 2011-09-28
JP6878508B2 (ja) 2021-05-26
EP2377936A3 (en) 2012-06-13
US8293233B2 (en) 2012-10-23
EP2371960A3 (en) 2012-01-11
JP2019187439A (ja) 2019-10-31
EP2322621A3 (en) 2012-09-12
EP2377935A1 (en) 2011-10-19
JP2016103998A (ja) 2016-06-09
EP2360255B1 (en) 2015-01-28
AU2006227536B9 (en) 2011-08-18
PT2360255E (pt) 2015-04-08
ES2531537T3 (es) 2015-03-17
EP2330196A2 (en) 2011-06-08
EP2316946A1 (en) 2011-05-04
EP2374887A2 (en) 2011-10-12
EP2338997A1 (en) 2011-06-29
EP2377936A2 (en) 2011-10-19
EP2333066A1 (en) 2011-06-15
EP2336326A2 (en) 2011-06-22
EP2368993A3 (en) 2012-06-13
JP2016073284A (ja) 2016-05-12
EP2363485A1 (en) 2011-09-07
EP2330195A3 (en) 2012-05-23
EP2336325A1 (en) 2011-06-22
EP2336327A1 (en) 2011-06-22
CA2602028A1 (en) 2006-09-28
EP2368990A1 (en) 2011-09-28
US20220017603A1 (en) 2022-01-20
JP6628822B2 (ja) 2020-01-15
EP2368991B1 (en) 2016-02-17
ES2375826T3 (es) 2012-03-06
EP2386638A3 (en) 2012-08-15
US20130142780A1 (en) 2013-06-06
JP2008536490A (ja) 2008-09-11
EP2374886A3 (en) 2011-11-23
ES2550836T3 (es) 2015-11-12
CA2873899C (en) 2020-11-10
CA2868781A1 (en) 2006-09-28
JP6374851B2 (ja) 2018-08-15
EP2371960A2 (en) 2011-10-05
EP2336326A3 (en) 2012-02-15
EP2322621A2 (en) 2011-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2558338T3 (es) Método para aislamiento de polipéptidos solubles
AU2011247831B8 (en) Method for isolation of soluble polypeptides