JP3375941B2 - 高効率抗体スクリーニング法 - Google Patents

高効率抗体スクリーニング法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高効率抗体スクリ
ーニング法、より詳しくは、種々の細胞画分等のタンパ
ク質混合物を二次元電気泳動により展開したうえで、こ
れに抗体ライブラリーを作用させ、分離された個々のタ
ンパク質スポットから直接的に特異抗体を高効率でスク
リーニングする高効率抗体スクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】全ゲノム構造解析プロジェクトは塩基配
列決定技術の急速な進歩により、多くの微生物において
全ゲノム配列決定に至り、ヒトにおいても来世紀初頭に
は終了すると言われている。しかし、塩基配列が決定さ
れても遺伝子発現産物のうちデータベースを利用した相
同タンパク質の検索などにより、機能が推定できる遺伝
子は極めて少なく、また、実際に細胞内において発現、
機能しているタンパク質の多くは細胞の状態によって、
その発現量の変化や翻訳後修飾によって様々に変動す
る。このように生命活動のある瞬間に存在するタンパク
質のセットはプロテオームという、PROTEin と genOME
を組み合わせた造語で表現される新たな概念として提唱
されており(Kahn, P. Science 270, 369-70(1995))、プ
ロテオームの全体像を把握し、別の瞬間の全体像と比較
することでその変動を解析することが行われている。こ
うしたプロテオームの動態を大規模に解析することで生
命現象を解析する試みがプロテオミクスと呼ばれるもの
で、ポストゲノムプロジェクトとして注目を集めてい
る。そのための手法はすでに確立されており、二次元電
気泳動法とアミノ酸配列解析・質量分析法とを組み合わ
せた方法が一般的に用いられている。
【０００３】二次元電気泳動法は、物質の有する２つの
性状面から分離を行う方法、例えば、あらかじめ等電点
に基づく電気泳動を行った後に、異なる媒体上において
分子量に基づく電気泳動を行う方法として知られており
(O'Farrell, P.H.,J.Biol.Chem. 250, 4007-21(197
5))、かかる二次元電気泳動法によると、等電点と分子
量という２つの性状に基づいて二次元に展開されるため
に、同じ分子量を持つ物質であっても、等電点が異なっ
ていれば違う座標に展開され、二次元の座標に各物質が
スポットとして分離することが可能となる。二次元電気
泳動法は、その優れた解像度のために、特にタンパク質
の分離手法としてよく用いられている。現在行われてい
るタンパク質の二次元電気泳動法は、一般的には、まず
キャピラリーゲルや市販のストリップゲルなどを分離媒
体として等電点電気泳動を行い、泳動を終了したゲルを
第２の平面状のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(slab
gel)に載せ、等電点電気泳動の展開方向に対して直角の
方向に電気泳動することにより行われている。このよう
に、等電点電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を組み合わせ、等電点に基づ
いて一次元方向に分離し、分子量に基づいて二次元方向
に展開する二次元電気泳動法により、既に多くのプロテ
オームが解析されている。そして、タンパク質群から分
離された各タンパク質スポットについて、アミノ酸配列
の決定やペプチドマス・フィンガープリント法による解
析結果が座標情報とともに既に数多く報告されている。
【０００４】他方、目的とするタンパク質に対する抗体
を入手することは、その同定・機能解析において重要な
位置を占めるが、動物に目的とする抗原を投与して免疫
する従来の方法は、多種・多量の抗原と長い時間、多大
な労力を要することから、近年、ファージ抗体ライブラ
リーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。か
かる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体
を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提
示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗
体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含む
ライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させる
ことによってファージディスプレイライブラリーとする
ことができ、この方法によるとヒトの抗原に対する抗体
の作製も可能である。このファージ抗体ライブラリーを
用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法
と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的
に結合するリガンドや種々の抗体を同定するために使用
されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそ
れを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法
等のスクリーニング法についても既に数多く報告されて
いる。(Scott, J. M. and Smith, G. P., Science, 24
9, 386-390 (1990); Smith, G. P. and Scott, J. K.,
Methodｓin Enzymology, 217, 228-257 (1993))。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前記のように、ポスト
ゲノムプロジェクトとして注目を集めているプロテオミ
クスには、二次元電気泳動法とアミノ酸配列解析・質量
分析法とを組み合わせた手法が多用されているが、かか
る手法にはいくつかの問題点があることが指摘されてい
る。二次元電気泳動法においては、サンプルの添付量の
限界、莫大なスポット数による解析の複雑さ、酸性・塩
基性側での分離能の限界、再現性、スポットの検出感度
の限界などの問題があり、アミノ酸配列解析・質量分析
法においては微量化が進んでいるとはいえ未だ十分では
なく、その解析も質量分析法においては熟練を要すると
されている。本発明の課題は、試料中の標的タンパク質
に対する抗体を高効率でスクリーニングする方法を提供
することにある。
【０００６】本発明者らは、上記課題を解決するために
鋭意検討し、ファージ抗体ライブラリーとして、１０9
の多様性をもったライブラリーがすでに作製されてお
り、理論上すぺての種類のタンパク質をカバーすること
ができる点に着目し、このファージ抗体ライブラリーを
用いるファージパニング法と二次元電気泳動法とを組み
合わせた２Ｄ−ファージパニング法（２Ｄ−ＰＰ）が、
現在のプロテオーム解析の主流となっている二次元電気
泳動法と質量分析法との組合せに十分対抗しうる新しい
プロテオーム解析法となり得るとの知見を得た。具体的
には、二次元電気泳動法で分離したタンパク質スポット
をニトロセルロース膜に転写し、金コロイド染色によっ
て可視化した後にスポットの部分だけを切り出し、この
スポット部分だけをファージ抗体ライブラリーと反応さ
せ、目的のタンパク質スポットに特異的に結合したファ
ージ抗体のみを回収し、この集めたファージ抗体を大腸
菌に感染させ、この特異的なファージ抗体を大量に産生
せしめ、さらに上記反応・回収操作を繰り返す、つまり
パニングをすることによって目的のタンパク質スポット
に対するモノクローナル抗体を高効率でスクリーニング
することができることを見い出し、本発明を完成するに
至った。
【０００７】すなわち本発明は、タンパク質群を含む試
料中の特定のタンパク質に対する抗体のスクリーニング
法であって、以下の工程(ａ)〜(ｃ)を備えることを特徴
とする高効率抗体スクリーニング法 (ａ)タンパク質群
を含む試料を二次元電気泳動処理し、前記タンパク質群
を二次元電気泳動ゲル上に各スポットタンパク質として
展開させる工程(ｂ)スポットタンパク質と抗体ライブラ
リーとを反応させる工程(ｃ)スポットタンパク質に結合
した抗体を複製し、該複製した抗体を前記スポットタン
パク質と反応させる操作を１又は２回以上行う工程（請
求項１）や、タンパク質群を含む試料として、細胞亜分
画をあらかじめ分離精製した試料を用いることを特徴と
する請求項１記載の高効率抗体スクリーニング法（請求
項２）や、タンパク質群を含む試料として、翻訳後修飾
を除去した試料を用いることを特徴とする請求項１又は
２記載の高効率抗体スクリーニング法（請求項３）や、
二次元電気泳動ゲル上に展開した各スポットタンパク質
を、固相上に転写したスポットタンパク質として、抗体
ライブラリーと反応させることを特徴とする請求項１〜
３のいずれか記載の高効率抗体スクリーニング法（請求
項４）や、固相上に転写したスポットタンパク質を可視
化し、個々のスポットタンパク質を単離した後、抗体ラ
イブラリーと反応させることを特徴とする請求項４記載
の高効率抗体スクリーニング法（請求項５）や、抗体ラ
イブラリーとして、ファージミド抗体ライブラリーを用
いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の高
効率抗体スクリーニング法（請求項６）や、スポットタ
ンパク質に結合したファージミド抗体を宿主細胞に感染
させ、ファージミド抗体を複製することを特徴とする請
求項６記載の高効率抗体スクリーニング法（請求項７）
や、スポットタンパク質に結合したファージミド抗体の
ＣＤＲ領域を標的にＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅さ
れた領域を組み込んだファージミドベクターを宿主細胞
に感染させ、ファージミド抗体を複製することを特徴と
する請求項６記載の高効率抗体スクリーニング法（請求
項８）に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の高効率抗体スクリーニン
グ法としては、(ａ)タンパク質群を含む試料を二次元電
気泳動処理し、前記タンパク質群を二次元電気泳動ゲル
上に各スポットタンパク質として展開させる工程、(ｂ)
スポットタンパク質と抗体ライブラリーとを反応させる
工程、(ｃ)スポットタンパク質に結合した抗体を複製
し、該複製した抗体を前記スポットタンパク質と反応さ
せる操作を１又は２回以上行う工程を備える、タンパク
質群を含む試料中の特定のタンパク質に対する抗体のス
クリーニング法であれば特に制限されるものではなく、
また上記抗体には、イムノグロブリン、一本鎖抗体、抗
体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントが含まれる。抗体フラグメントとしては、モノクロ
ーナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ(ａ
ｂ′)2、Ｆ(ａｂ′)2を還元して得られるＦａｂ′、モ
ノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂ
などを例示することができる。
【０００９】上記タンパク質群を含む試料としては、複
数種のタンパク質を含む試料であればどのようなもので
もよいが、かかる試料を二次元電気泳動処理した場合
に、二次元電気泳動ゲル上に各スポットタンパク質とし
て展開させうる試料が好ましい。通常の二次元電気泳動
処理では、上限として数千個程度のタンパク質スポット
に分離することができるが、かかる二次元電気泳動処理
による分離能では、細胞内において発現・機能している
数万種類といわれる全タンパク質をカバーすることはで
きない。このように、二次元電気泳動処理した場合にタ
ンパク質スポットとしての検出限界を超える場合には、
あらかじめ分離精製・分画処理等を施してタンパク質ス
ポットとしての検出し得るようにしておくことが好まし
い。例えば、標的とする細胞亜分画（caveolae, clathr
in-coated pits, Golgi, lysosomeなど）を生化学的手
法等によりあらかじめ分離精製し、この分離精製された
タンパク質群を出発材料として二次元電気泳動上に各ス
ポットタンパク質として展開することが好ましい。かか
る前処理により、通常の二次元電気泳動処理による分離
能でも、各細胞亜分画に存在する数百〜数千のタンパク
質群を各スポットタンパク質として展開することができ
る。かかる細胞亜分画をあらかじめ分離精製したタンパ
ク質群を含む試料としては、例えば、ヒト神経芽細胞腫
を分離精製することにより得られる、細胞間および細胞
内情報伝達系分子に富み、かつ高度に疎水性を示す多種
の膜タンパク質により構成される細胞膜マイクロドメイ
ン“ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ”からなる画分や、多数の
受容体蛋白質を含有するclathrin-coated pits画分や、
それらに属さないが重要な細胞間情報伝達に関与する細
胞膜画分等を例示することができる。
【００１０】また、上記タンパク質群を含む試料とし
て、タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、
リン酸化、アセチル化、アミド化、ミリストイル化、フ
ァルネシル化、ゲラニルゲラニル化、硫酸化、glycopho
s-phatidyl inositol アンカー（ＧＰＩアンカー））
を除去した試料を用いることが好ましい。かかるタンパ
ク質の翻訳後修飾の除去処理により、通常の二次元電気
泳動条件下ではスポットにならないタンパク質も分離す
ることが可能になる。また、翻訳後修飾を除去する方法
としては特に制限されないが、タンパク質脱リン酸酵素
（ホスホプロテインホスファターゼ）、メチルエステラ
ーゼ、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ
Ｆ）、ホスファチジルイノシトール・ホスホリパーゼＣ
（ＰＩＰＬＣ）などの酵素処理や、化学物質による脱脂
処理等を適宜組み合わせることにより行うことができ
る。
【００１１】試料中のタンパク質群を二次元電気泳動ゲ
ル上に各スポットタンパク質として展開させる二次元電
気泳動処理としては、例えば等電点と分子量というタン
パク質の有する２つの物性面から分離を行う方法であれ
ば特に制限されるものではなく、一般的には、まずキャ
ピラリーゲルや市販のストリップゲルなどを分離媒体と
して等電点電気泳動を行い、泳動を終了したゲルを第２
の平面状のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(slab gel)
に載せ、等電点電気泳動の展開方向に対して直角の方向
に電気泳動することにより行うことができる。かかる二
次元電気泳動処理により、二次元電気泳動ゲル上に展開
した各スポットタンパク質を、ウエット式ウエスタンブ
ロッティング法等により、ニトロセルロース膜、ポリビ
ニルイリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜）などの固
相上に転写し、この固相上に転写したスポットタンパク
質と抗体ライブラリーとを反応させることが好ましい。
かかる固相への転写により、標的タンパク質スポットと
抗体ライブラリーとの反応を簡便に行うことができる。
【００１２】上記の固相上に転写したスポットタンパク
質を可視化し、個々のスポットタンパク質を単離した
後、抗体ライブラリーと反応させることがより好まし
い。この可視化した後に単離された個々のスポットで
は、タンパク質の存在しない部分が除去されることによ
り、目的とするタンパク質に対する抗体以外の抗体、例
えば固相膜（ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など）に
対する抗体を排除することができ、標的タンパク質に対
する抗体を効率よくスクリーニングすることができる。
上記スポットタンパク質を可視化する方法としては公知
のタンパク質の可視化方法であれば特に制限されるもの
ではなく、例えば金コロイド染色法、免疫染色法等を挙
げることができる。また、可視化した後に個々のスポッ
トタンパク質を切り出して単離する方法も特に制限され
るものではないが、再現性を高めるためにスポットカッ
ター等の市販の自動切出し装置を用いて、スポット部分
だけを切り出す方法が好ましい。
【００１３】本発明において用いられる抗体ライブラリ
ーとしては、多数の抗体を含むライブラリーであれば特
に制限されるものではないが、理論的にはあらゆるタン
パク質上の抗原エピトープに対応しうる、１０9程度の
多種多様なファージミド抗体からなるファージミド抗体
ライブラリー（ファージディスプレイライブラリー）を
用いることが好ましい。かかるファージミド抗体ライブ
ラリーとしては、市販のものを含め、通常のファージデ
ィスプレイ法において用いられる公知のファージライブ
ラリーであればどのようなライブラリーでもよく、例え
ばファージディスプレイヒト抗体ライブラリーは、ヒト
Ｂ細胞から、抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域（ＶH、
ＶL）をコードする遺伝子断片をＰＣＲで増幅し、この増
幅した遺伝子が、そのコートタンパクｐIII遺伝子の枠
内に挿入された繊維状ファージ（ファージミドベクタ
ー）を大腸菌に導入し、この大腸菌にＶＣＳ−１３等の
ヘルパーファージを感染させることにより構築すること
ができる（H.R.Hoogenboom et al., Immunotechnology,
4, 1-20(1998)）。
【００１４】また、ファージ抗体ライブラリーとして、
本発明者により作製され、シークエンス−アレイ・ライ
ブラリー（Sequence-arrayed library (ＳＡＬ)）と名
づけられたライブラリーを有利に用いることができる。
以下、ＳＡＬについて説明する。ファージ抗体ライブラ
リーにおいて抗原を特異的に認識するファージ抗体に
は、優先的に用いられているＦａｂ構造があり、ＶＨ鎖
はＤＰ４７、ＶＬ鎖はＤＰＫ２２であることが知られて
いる。またこれらの鎖のＣＤＲ領域において、特にＣＤ
Ｒ３領域のある限られた部位（ＶＨ鎖：９５、９６、９
７、９８残基目のアミノ酸／ＶＬ鎖：９１、９３、９
４、９６残基目のアミノ酸）が抗原との結合に深く関与
していることも知られている。そこで、それらの領域に
おいて使われているアミノ酸の使用頻度を調べてみたと
ころ、使用頻度に差があることを見い出した。また、そ
れらのアミノ酸を性質ごとに分類すると７種類のアミノ
酸（Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｙ、Ｐ）に限定することがで
きた。これらのアミノ酸をＣＤＲ３領域の抗原結合部位
にランダムに配置すると、５．８×１０6の多様性をも
ったライブラリーを作製することができ、また１種類の
ファージ抗体の量をこれまでの１０4から１０6まで増加
することができることがわかった。
【００１５】そこで、これらの多様性をカバーし、しか
も効率の良いプライマーの設計法を検討したところ、上
記７種類のアミノ酸を３種類のコドンで代用できること
を見い出した。３種類のコドンを抗原結合部位に配置す
ると、ＤＰ４７用の８１種類のプライマー（配列番号１
〜８１）、ＤＰＫ２２用の８１種類のプライマー（配列
番号８２〜１６２）ですべての多様性をカバーすること
ができる。さらにこれらのプライマーにおいて、使用す
るアミノ酸の数を減らしたり、それぞれのプライマーで
合成したＤＰ４７とＤＰＫ２２を組み合わせてサブライ
ブラリーを作製することによって１種類のファージ抗体
の量を１０6以上にすることも可能となる。したがっ
て、このＳＡＬは超微量な抗原に対するファージ抗体の
スクリーニングだけではなく、パニングを必要としない
ファージ抗体のスクリーニングの可能を有している。ま
た、このＳＡＬを用いて、特異性が低くても抗原をクロ
ーニングしてくることができれば、アフィニティーマチ
ュレーションによって特異性を強めていくことができ
る。
【００１６】前記スポットタンパク質とファージミド抗
体ライブラリーとの反応は、例えば約５×１０12ｃｆｕ
／ｍＬのファージ抗体を用いて常法により行うことがで
きる。スポットタンパク質とファージミド抗体ライブラ
リーとの反応後、目的とする各スポットタンパク質に付
着したファージミド抗体のみを回収して大腸菌に感染さ
せると、各スポットに反応するファージミド抗体を大量
に複製することができる。ファージミド抗体は、その抗
体部分のＤＮＡ配列情報がファージミド内に組み込まれ
ているため、大腸菌感染によりファージミドが複製され
る際に、その表面に発現している抗体も同時に複製され
ることから、目的の各タンパク質のスポットと反応する
抗体を大量に、かつ容易に複製することができる。実際
には、一回の反応で陽性抗体を同定できることは稀であ
り、この操作を数回繰り返すことで、目的とする各スポ
ットタンパク質に対応する抗体を得ることができる。こ
の繰り返しのサイクルはパニングと呼ばれ、通常このパ
ニング操作は数回、好ましくは３〜５回程度繰り返すこ
とにより、標的タンパク質と特異的に結合するファージ
抗体を濃縮し、スクリーニングすることができる。
【００１７】上記パニングの別法として、ファージミド
を直接大腸菌に感染させる方法に代えて、各スポットタ
ンパク質に結合しているファージミド抗体のＣＤＲ領域
（主にＣＤＲ３）を標的にＰＣＲを行い、ＰＣＲにより
増幅された領域を組み込んだファージミドベクターを宿
主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複製する方法を
挙げることができる。この方法の利点は、標的とするＣ
ＤＲ領域のサイズがほぼ一定であること、及びＰＣＲに
用いるプライマーの配列は共通であることから、通常Ｐ
ＣＲによる複製を行う際の大きな問題である、ＰＣＲに
よる増幅の不均一化が最小限に抑制できることである。
実際にこの方法を用いることで、ファージミドを直接大
腸菌に感染させる方法に比べて、約１０倍の効率を達成
することができる。
【００１８】また、スポットタンパク質とファージミド
抗体ライブラリーとの反応により、陽性抗体を同定する
に際し、好ましくない固相膜等に対する抗体を除去する
ための方法としては、先に述べた如く各スポット部分の
みを単離する方法以外に、パニング毎に異なる種類の固
相膜（ニトロセルロース膜とＰＶＤＦ膜など）を交代に
用いる方法や（Alternative membrane method）、ファ
ージミド抗体ライブラリーをあらかじめ固相膜等と反応
させておき、これらに対する抗体を除去する方法や、こ
れらを組み合わせた方法などを挙げることができる。
【００１９】上記スクリーニングにより得られた各標的
タンパク質に対する陽性抗体を用いて二次元電気泳動上
でイムノブロッティングを行い、それぞれの抗体と目的
とする各スポットタンパク質との反応性、特異性を確認
することが好ましい。また、各抗体のＤＮＡのフットプ
リントと抗体価の相関性を調べることで、抗体のモノク
ローナル化が可能である。
【００２０】また、スクリーニングにより得られた陽性
抗体を大腸菌に感染させることで、極めて容易に均質な
ファージミド抗体を大量に調製することができる。また
その際、大腸菌ＨＢ２１５１株などの特定の大腸菌株に
感染させると、これらのファージミド抗体を大腸菌から
遊離させて、抗体断片として溶液中に可溶化することも
できる。このような可溶化型抗体断片を調製する場合、
ｃ−ＭｙｃやＨｉｓ−ｔａｇと呼ばれるシークエンスタ
ッグ等を有する融合ペプチドとしておくことが、かかる
可溶化型抗体断片を精製する場合に有利である上に、こ
のタッグを特異的に認識する物質をあらかじめチップ上
に固定しておき、次に可溶化された各可溶化型抗体断片
を反応させることにより、これらの抗体断片をチップ上
に容易に固定することができ、チップ表面を細かく分画
しそれぞれの分画にそれぞれ異なるファージミド抗体を
固定させることにより抗体チップとすることもできる。
また、試料を種々の条件下で可溶化した後、蛍光プロー
ブや化学発光プローブ等を用いてタンパク標識した試料
を、通常の確立された抗原抗体反応と同様の条件下で上
記抗体チップと反応させ、次いで残存する標識プローブ
量を測定することにより、試料中のタンパク質の発現量
を定量することもできる。抗体チップ上の各分画に対応
する残存標識プローブ量を一括して測定することで、対
象試料中におけるタンパク質の発現プロファイルの一括
解析も可能になる。
【００２１】このようにして同定された陽性抗体を用い
て、タンパク質の発現ライブラリーを用いたスクリーニ
ングを行い、陽性抗体と反応する発現ライブラリー上の
陽性クローンを検出することができる。この陽性クロー
ンの塩基配列及び翻訳されたアミノ酸配列は、二次元電
気泳動上に展開された各スポットのタンパク質の配列と
相同であることから、標的とした各タンパク質のアミノ
酸配列情報やアミノ酸配列情報を得ることができる。こ
のスクリーニングの際に、発現ライブラリーのタンパク
質を二次元泳動と同様の条件で変性させることで、試料
と発現ライブラリーの両タンパク質の立体構造を相似化
できるため、抗原抗体反応における立体構造の問題を最
小限に押さえることができる。また、上記タンパク質発
現ライブラリーは元々翻訳後修飾を欠いているので、試
料中のタンパク質の翻訳後修飾を除去したタンパク質を
出発材料とすることがより好ましい。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例によって何
ら限定されるものではない。 実施例１［標的タンパク質画分の調製］ 標的タンパク質画分としては、ヒト神経芽細胞腫より、
細胞間および細胞内情報伝達系分子に富み、かつ高度に
疎水性を示す多種の膜タンパク質により構成される細胞
膜マイクロドメイン“ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ”を分画
して用いた。１０％ fetal bovine serum、および、L-
glutamine、penicillin/streptomycinを添加したEagle'
s ＭＥＭ培地で、５日間培養したヒト神経芽細胞ＳＫ−
Ｎ−ＭＣ(ATCC No. HTB10)を回収した。ｌｙｓｉｓバッ
ファー(２５ｍＭ ＭＥＳ；ｐＨ６．５、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００、proteas
e inhibitors)に懸濁させた後、ホモジナイザー（イウ
チ製）を用い、ペッスルを１５往復させて細胞を破砕
し、cell lysateを調製した。cell lysateに等量の８０
％ショ糖/ＭＥＳ-buffered saline(２５ｍＭ ＭＥＳ；
ｐＨ６．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）を加え、ショ糖濃度
を４０％にあわせてから遠沈管の底に注入し、さらに、
５％から３０％のショ糖勾配を重層後、水平式ローター
（Beckman Sw41Ti）にセットした。超遠心機（Beckman
Optima L-70K Ultracentrifuge）を用いて、３５０００
ｒｐｍ、２４時間、４℃でショ糖密度勾配遠心をおこな
った。ショ糖濃度１５％付近に収束したｌｉｐｉｄ ｒ
ａｆｔｓに富むfractionを回収することにより、標的タ
ンパク質画分（タンパク質濃度約１２０μｇ／ｍｌ）を
調製した。
【００２３】実施例２［二次元電気泳動］ 実施例１で得られた標的タンパク質画分を等電点電気泳
動とＳＤＳ−ＰＡＧＥからなる二次元電気泳動法により
分離・展開した。等電点電気泳動は、等電点ゲルとして
Immobiline Dry Strip（Amersham Pharmacia社製）を用
い、泳動装置としてIPGphor（Amersham Pharmacia社
製）により行った。９Ｍ Urea、 ２Ｍ Thiourea、４
％ ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、０．５
％ ＩＰＧバッファーからなる泳動溶液に標的タンパク
質画分を溶解し、６時間再膨潤させた後３０Ｖで６時
間、５００Ｖで１時間、１０００Ｖで１時間、８０００
Ｖで１２時間の順に電圧を印可した。ついで等電点ゲル
をＳＤＳ平衡化溶液中で２０分間振盪し、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルの上に密着させた後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っ
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはHoefer ＳＥ６００（Amersham
Pharmacia社製）にて行い、２０ｍＡで５時間通電させ
た。以上の操作により標的タンパク質画分に含まれるタ
ンパク質群を各タンパク質スポットに分離・展開した。
【００２４】実施例３［標的タンパク質スポットの固相
化］ 実施例２で分離・展開された各タンパク質スポットを一
般的なウエット式ウエスタンブロッティング法により、
ニトロセルロース膜（Amersham Pharmacia社製・Hybond
‐ECL）上に転写・固相化した。ウエスタンブロッティ
ングはＴＥ６２Ｘ（Amersham Pharmacia社製）を用い
て、１５０ｍＡで１６時間通電し行った。ウエスタンブ
ロッティングのニトロセルロース膜を、金コロイド染色
液（Bio-Rad社製）中にて１時間振盪し固相化されたタ
ンパク質スポットを可視化した。可視化した５０個のス
ポットをSpot Cutter（Bio-Rad社製）にて切り出し、フ
ァージディスプレイ法の抗原サンプルとした。
【００２５】実施例４［標的タンパク質を認識するファ
ージ抗体の選択］ 実施例３で調製した標的タンパク質の固相化物を２ｍＬ
容のエッペンドルフ（Ｅｐ）チューブに移し、まず１％
のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを加え室温にて１時間穏
やかに振盪（renature）した。この後、溶液を１０％の
スキムミルクと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
（ＭＰＢＳＴ）に交換し、１時間室温で穏やかに振盪
（blocking）した。次にこの液を除き、後述する実施例
７と同様の方法で調製した２種の可溶化型の抗ニトロセ
ルロース抗体断片を分泌した大腸菌ＨＢ２１５１株の培
地上清それぞれ３００μＬを含む５％ＭＰＢＳＴ（計８
００μＬ）を加え、室温で２時間穏やかに振盪させた。
これを除いた後、波長２６０ｎｍの吸光度が５である濃
度（およそ５×１０12ｃｆｕ／ｍＬに相当）のファージ
抗体（パニング１ラウンド目の場合はライブラリーファ
ージ、２ラウンド目以降は前ラウンドで回収したファー
ジを用い、計４〜５ラウンドのパニングを実施）と上記
可溶化型抗ニトロセルロース抗体断片（２種の培地上清
それぞれ２５μＬ）を含む５％ＭＰＢＳＴの２００μＬ
を加え室温にて３時間振盪、反応させた。パニング１ラ
ウンド目のファージライブラリーには、１０9種以上の
多様性をもつファージミド系抗体ライブラリーであるヒ
ト合成Ｆｖライブラリー“Ｇｒｉｆｆｉｎ．１”（英国
ＭＲＣのG. Winter博士より供与）を使用した。この反
応液を０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１０分
間の振盪３回、ＰＢＳで同じく１０分間１回洗浄し、非
特異反応性ファージを除去した。
【００２６】標的タンパク質に特異的に結合したファー
ジは１００μＬの１００ｍＭトリエチルアミンに１０分
間振盪させて溶出し、この溶液を５０μＬの１Ｍ−Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の入った１．５ｍＬ容Ｅｐ
チューブに移し中和した。また、ファージ溶出後のスポ
ットが入ったチューブには２０μＬの１Ｍ−Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えこれも中和した。これらに
対し、波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５から１．
０になるまで培養した大腸菌ＴＧ１株をファージ溶出液
チューブには８５０μＬ、スポット入りチューブには４
００μＬそれぞれ加え、３７℃に３０分間静置しファー
ジを感染させた。これらを混合した計１４２０μＬを１
００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１％のグルコースを含
むＬＢプレート（１Ｌ中に１０ｇのトリプトン、５ｇの
酵母エキス、１０ｇのＮａＣｌ、１５ｇのアガーを含
む）（ＬＢ／Ａｍｐ・Ｇｌｃプレート）にプレーティン
グし、３０℃にて一晩培養しコロニーを形成させた。
【００２７】実施例５［ファージ抗体の調製］ 実施例４による、ＬＢ／Ａｍｐ・Ｇｌｃプレート上の大
腸菌ＴＧ１株コロニー全体をかき取り、１００μｇ／ｍ
Ｌのアンピシリンと１％のグルコースを含む２×ＴＹ
（１Ｌ中に１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、
５ｇのＮａＣｌを含む）（２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃ）
２５ｍＬに波長６００ｎｍの吸光度が１．０程度以下に
なるように懸濁し、３７℃にて１時間攪拌培養した。こ
のうち３ｍＬを２．４×１０10ｐｆｕのヘルパーファー
ジＶＣＳ−Ｍ１３（Stratagene社製）の入ったチューブ
に移し、３７℃に３０分間静置した後、３２５０×ｇで
１０分間遠心分離して上清を除いた。沈殿した大腸菌は
１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２５μｇ／ｍＬのカ
ナマイシンを含む１２．５ｍＬの２×ＴＹ（２×ＴＹ／
Ａｍｐ・Ｋａｎ）に懸濁し、３０℃で一晩振盪培養し
た。この培養液を４℃、１０７５０×ｇで１０分間遠心
分離して沈殿を除去した後、培養上清にその１／５容の
ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％のポリエチレングリコー
ルと２．５ＭのＮａＣｌを含む）を加え混合し、４℃に
３０分以上放置した。その後４℃、１０７５０×ｇで１
０分間遠心分離し上清をデカンテーションで除いた後、
さらに１０７５０×ｇで遠心し上清を完全に吸引して取
り除いた。沈殿したファージは０．５ｍＬのＰＢＳに溶
解し、これを１１６００×ｇで１０分間遠心分離して不
溶物を沈殿させ、上清を他のチューブに移してファージ
抗体溶液を得た。このようにして得られたファージ抗体
溶液は、波長２６０ｎｍにおける吸光度がおよそ１０か
ら１５程度になる濃度であった。
【００２８】実施例６［ウェスタンブロットによる特異
性の確認］ 実施例５によるポリクローナルファージ抗体からモノク
ローナル・ファージ抗体を調製することもできる。パニ
ング後のＬＢ／Ａｍｐ・Ｇｌｃプレート上のシングルコ
ロニーをポリプロピレン製９６ウェルマイクロタイター
プレート中の１００μＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃに
接種し、３７℃で一晩振盪培養した。次にこのうち２μ
Ｌをポリプロピレン製９６ウェルマイクロタイタープレ
ート中の２００μＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃに接種
し、３７℃にて２時間振盪培養後これに２×１０9ｐｆ
ｕのＶＣＳ−Ｍ１３を含む５０μＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ
・Ｇｌｃを加え３７℃に３０分間静置した。これを室温
で２３８０×ｇ、１５分間遠心分離し上清を除き、菌体
をＦａｌｃｏｎ１４ｍＬラウンドチューブ中１．８ｍＬ
の２×ＴＹ／Ａｍｐに懸濁し、３０℃にて一晩培養し
た。このうち上清１．５ｍＬを用い実施例５と同様にフ
ァージ抗体溶液（１００から２００μＬ）を得た。
【００２９】このようにして得たモノクローナル・ファ
ージ抗体あるいは実施例５によるポリクローナルファー
ジ抗体を用いて、ウェスタンブロットによりその特異性
を確認した。すなわち“ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ”を一
次元（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）あるいは二次元（等電点電気
泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に展開し、ニトロセルロース
膜（Amersham Pharmacia社製・Hybond‐ECL）に転写し
たものについて、まずこれを１０％のＴｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳで１時間 renature させ、さらに１０％ＭＰ
ＢＳＴで１時間ブロッキングした。これを脱イオン水で
洗浄後、波長２６０ｎｍでの吸光度が０．０５になるよ
うな濃度のファージ抗体を含む１０％ＭＰＢＳＴを加
え、室温で１時間振盪・反応させた。このメンブレンを
脱イオン水で３回、さらにＰＢＳＴで５分間ずつ３回洗
浄した後、５％ＭＰＢＳＴ中に７０００倍希釈したＨＲ
Ｐ（ホースラディッシュパーオキシデース）標識抗Ｍ１
３抗体（Amersham Pharmacia社製）を加え、室温で３０
分から１時間振盪した。これをＰＢＳＴで５分間ずつ３
回、ＰＢＳＴで５分間１回洗浄し、ＥＣＬ検出試薬を加
えたのち、その化学発光シグナルをフィルムに露光し
た。これによりパニング操作を通じて選択されたポリク
ローナルおよびモノクローナルファージ抗体は、スクリ
ーニングに用いた標的タンパク質スポットに高い特異性
をもって反応していることを確認した。またこの一連の
操作は他の複数のスポットについても検証の結果同様の
効果を示したことから、これにより二次元分離し膜上に
固相化されたタンパク質群より、ファージ抗体ライブラ
リーのスクリーニングを通して直接特異抗体を取得でき
ることを確認した。
【００３０】実施例７［可溶化型抗体断片の調製］ 実施例６で特異性を確認したファージ抗体クローンを、
１ｍＬの２×ＴＹ／Ｇｌｃ（１％）中に波長６００ｎｍ
における吸光度が０．５から１．０になるまで培養した
大腸菌ＨＢ２１５１株の培養液に加え、３７℃に３０分
間静置した。これにアンピシリンを終濃度１００μｇ／
ｍＬになるように加え３７℃で一晩振盪培養した。この
うち０．５ｍＬをあらかじめ３７℃に保温しておいた５
０ｍＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃ（０．１％）に接種
し、３７℃にて対数増殖期終期に至るまで振盪培養した
のち、これにＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄチオガラク
トピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように加えて発現
を誘導し、３０℃にて一晩振盪培養して培地中に可溶化
型抗体断片を分泌させた。これを１０７５０×ｇで１０
分間遠心分離して菌体を除き、可溶化型抗体断片を含む
培地上清を得た。この可溶化型抗体断片はそのカルボキ
シ末端にヒスチジン６残基からなるタグを有するため、
これを利用した金属キレートアフィニティークロマトグ
ラフィーにより必要に応じてこの分子を精製した。すな
わち中性条件において可溶化型抗体断片を含む培地上清
をＴＡＬＯＮ樹脂（CLONTECH社製）を充填したカラムに
通した後、Ｗａｓｈバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム・ｐＨ７．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭイミ
ダゾールを含む）で洗浄後、吸着した抗体断片をＥｌｕ
ｔｉｏｎバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム・ｐＨ
７．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾー
ルを含む）で溶出させ、精製標品を得た。
【００３１】実施例８［ＶＨ鎖ＤＰ４７およびVＬ鎖Ｄ
ＰＫ２２のクローニング］ ＳＡＬファージ抗体ライブラリーを作製するために、そ
の出発材料となるＶＨ鎖ＤＰ４７クローンおよびVＬ鎖
ＤＰＫ２２クローン（ＤＰ４７−ＤＰＫ２２ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：配列番号１６３）のクローニングを前記ヒト
合成Ｆｖライブラリー“Ｇｒｉｆｆｉｎ．１”を基に行
った（図１参照）。ファージミドベクターおよびプライ
マー［ＤＰ４７（配列番号１６４）はＤＰ４７−Ｎ／Ｎ
ｃｏ（配列番号１６５）とＤＰ４７−Ｃ（配列番号１６
６）、ＤＰＫ２２（配列番号１６７）はＤＰＫ２２−Ｎ
／Ａｐａ（配列番号１６８）とＤＰＫ２２−Ｃ（配列番
号１６９）］を用いてＰＣＲを行い、ＶＨ鎖ＤＰ４７お
よびＶＬ鎖ＤＰＫ２２を増幅し、ＴＡ−クローニングベ
クターを使ってクローニングした後、ファージミドを回
収し、シーケンスを行った（ＤＰ４７−４（配列番号１
７０）およびＤＰＫ２２）。ＶＨ鎖ＤＰ４７クローンに
ついては、期待された配列が得られなかったために、新
たに変異を入れるためのプライマー［ＤＰ４７−５′−
１（配列番号１７１）、−３′−１（配列番号１７
２）、−５′−２（配列番号１７３）、−３′−２（配
列番号１７４）］を合成し、Stratagene社のQuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kitを使ってＰＣＲ法でポ
イントミューテーションを導入し、再度シーケンスを行
い、変異を確認した（Mutated ＤＰ４７）。これによ
り、Mutated ＤＰ４７（配列番号１７５）はＤＰ４７と
塩基配列は異なるが、期待されたアミノ酸配列と相同の
クローンが得られた。これらのクローンをもとに、抗原
抗体反応において重要な８ヶ所（ＶＨ鎖Mutated ＤＰ４
７及びＶＬ鎖ＤＰＫ２２各々４ヶ所ずつ）のアミノ酸に
実施例９に示すようにアミノ酸変異を導入し、ＳＡＬフ
ァージ抗体ライブラリーを作製した。
【００３２】実施例９［ファージ抗体ライブラリーＳＡ
Ｌの作製］ ＶＨ鎖ＤＰ４７用プライマーとして、配列番号１〜８１
で示される塩基配列からなる８１種類のプライマーと、
VＬ鎖ＤＰＫ２２用プライマーとして、配列番号８２〜
１６２で示される塩基配列からなる８１種類のプライマ
ーを常法により合成した。これらのプライマーを用いて
ＰＣＲを行い、（１）ランダム領域（抗原抗体反応にお
いて重要な８ヶ所における）の作製［ＤＰ４７−Ｎ／Ｎ
ｃｏとＤＰ４７−Ｃ／ｒａｎｄｏｍ（配列番号１〜８
１）、およびＤＰＫ２２−Ｎ／ＡｐａとＤＰＫ２２−Ｃ
／ｒａｎｄｏｍ（配列番号８２〜１６２）］と、（２）
ファージミドへの組み込みに必要な制限酵素部位の付加
［ＤＰ４７−Ｎ／ＮｃｏとＤＰ４７−Ｃ／Ｘｈｏ（配列
番号１７６）、およびＤＰＫ２２−Ｎ／ＡｐａとＤＰＫ
２２−Ｃ／Ｎｏｔ（配列番号１７７）］を行った。これ
らのプライマーによって、図１に「ＮＮＮ」で示される
ＶＨ鎖ＤＰ４７の９５、９６、９７、９８残基、および
VＬ鎖ＤＰＫ２２の９１、９３、９４、９６残基に7種類
のアミノ酸（G、S、D、N、R、Y、P）のいずれかがラン
ダムに配置される。これらのプライマーを用いてＰＣＲ
法でＶＨ鎖ＤＰ４７とVＬ鎖ＤＰＫを合成し、これらの
増幅断片を制限酵素で切断した後に、常法に準じてファ
ージディスプレイライブラリーを作製した。これにより
１０6の多様性の一本鎖抗体断片を繊維状ファージ表面
に提示しているシーケンス−アレイド・ライブラリーを
得た。なお、図１のＤＰ４７−Ｃ／ｒａｎｄｏｍプライ
マーおよびＤＰＫ２２−Ｃ／ｒａｎｄｏｍプライマーに
おける「ＮＮＮ」にはＡＴＨ（ＨはＣ，Ｔ又はＡ；ＡＴ
Ｃ＝Ａｓｐ，ＡＴＴ＝Ａｓｎ，ＡＴＡ＝Ｔｙｒ）、ＡＣ
Ｂ（ＢはＴ，Ｇ又はＣ；ＡＣＴ＝Ｓｅｒ，ＡＣＧ＝Ａｒ
ｇ，ＡＣＣ＝Ｇｌｙ）、ＣＧＧ（Ｐｒｏ）のいずれかか
ら選択されるが、上記実施例により作製したライブラリ
ーはＡＴＨとＡＣＢとの組合せのみを用いたので、各プ
ライマーで３×３×３×３＝８１種類の合成プライマー
を使用することになる。また、ＡＴＨとＡＣＢとの組合
せは、ＤＰ４７及びＤＰＫ２２のそれぞれにおいて１６
通りあることから、このライブラリーの多様性は全部で
（８１×１６）×（８１×１６）＝１．７×１０6とな
る。
【００３３】
【発明の効果】個々のタンパク質についてその局在や詳
細な機能、他分子や細胞にもたらす相互作用を解析する
にあたっては、その特異抗体が不可欠である。本発明に
よると、試料中の標的タンパク質に対する抗体を高効率
でスクリーニングすることができ、得られた抗体を用い
て、標的タンパク質の同定のみならず、得られた特異抗
体を用いての対象タンパク質分子の活性阻害や細胞への
刺激導入などの検討を行うことができ、今後のプロテオ
ミクス研究を推進する上できわめて有用である。また、
スクリーニングにより得られた抗体を用いて、タンパク
質のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするこ
とができ、二次元電気泳動により分離したタンパク質群
より、質量分析・アミノ酸シークエンス等の従来のプロ
テオミクス解析法を用いることなく、タンパク質を効率
よく同定することができる。また本発明によると、標的
タンパク質は、抗体スクリーニングにおける反応系全体
を通じて、分子全体が水相中に露出する状態を免れるた
め、通常ファージ抗体系において要求される抗原の親水
性について無視することができ、さらにスクリーニング
により得られた抗体を用いて、タンパク質のｃＤＮＡ発
現ライブラリーをスクリーニングすることができるの
で、標的スポットタンパク質が断片化したタンパク質の
一部であっても、全長配列を確定することも可能とな
る。
【００３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> High efficiency screening method for antibodies <130> A081P12 <140> <141> <160> 177 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 1 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath athathtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 2 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath athacbtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 3 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 3 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath athcggtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 4 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath acbathtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 5 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath acbacbtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 6 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath acbcggtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 7 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath cggathtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 8 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 8 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath cggacbtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 9 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 9 ggttccctgg ccccagtagt caaaathath cggcggtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 10 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 10 ggttccctgg ccccagtagt caaaathacb athathtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 11 ggttccctgg ccccagtagt caaaathacb athacbtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 12 ggttccctgg ccccagtagt caaaathacb athcggtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 13 ggttccctgg ccccagtagt caaaathacb acbathtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 14 ggttccctgg ccccagtagt caaaathacb acbacbtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 15 ggttccctgg ccccagtagt caaaathacb acbcggtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 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Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 21 ggttccctgg ccccagtagt caaaathcgg athcggtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 22 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 22 ggttccctgg ccccagtagt caaaathcgg acbathtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 23 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 23 ggttccctgg ccccagtagt caaaathcgg acbacbtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 24 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 24 ggttccctgg ccccagtagt caaaathcgg acbcggtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 25 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 25 ggttccctgg ccccagtagt caaaathcgg cggathtttc gcacagtaat atacg 55 <210> 26 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/random <400> 26 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athcggacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 90 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 90 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg athcggaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 91 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 91 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg acbathacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 92 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 92 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg acbathacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 93 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 93 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg acbathaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 94 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 94 caccttggtc ccttggccga 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104 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg cggacbacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 105 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 105 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg cggacbaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 106 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 106 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg cggcggacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 107 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 107 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg cggcggacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 108 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 108 caccttggtc ccttggccga acgtathcgg cggcggaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 109 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 109 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athathacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 110 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 110 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athathacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 111 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 111 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athathaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 112 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 112 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athacbacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 113 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 113 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athacbacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 114 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 114 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athacbaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 115 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 115 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athcggacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 116 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 116 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athcggacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 117 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 117 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg athcggaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 118 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 118 caccttggtc ccttggccga acgtacbcgg acbathacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 119 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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ccttggccga acgtcggcgg acbcggaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 154 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 154 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggathacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 155 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 155 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggathacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 156 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 156 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggathaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 157 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 157 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggacbacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 158 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 158 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggacbacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 159 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 159 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggacbaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 160 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 160 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggcggacca thctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 161 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 161 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggcggacca cbctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 162 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/random <400> 162 caccttggtc ccttggccga acgtcggcgg cggcggaccc ggctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 163 <211> 742 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-DPK22 Sequence <400> 163 ccatggccga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggttt ggtacagcct ggggggtccc 60 tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttagtag ttatgccatg agctgggtcc 120 gccaagctcc agggaagggg ctggagtggg tctctgctat tagtgggagt ggtggtagca 180 catattatgc agactctgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaac tccaagaaca 240 ccctgtatct gcaaatgaac agtctgagag ccgaggacac ggccgtatat tactgtgcga 300 aannnnnnnn nnnntttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tccagtggct 360 cgagtggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tagtgcacag gaaattgtgt 420 tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca 480 gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg 540 ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca 600 gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt 660 ttgcagtgta ttactgtcag cagnnnggtn nnnnnccgnn nacgttcggc caagggacca 720 aggtggaaat caaagcggcc gc 742 <210> 164 <211> 364 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 ccatggccga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct ggggggtccc 60 tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttagcag ctatgccatg agctgggtcc 120 gccaggctcc agggaagggg ctggagtggg tctcagctat tagtggtagt ggtggtagca 180 catactacgc agactccgtg aagggccggt tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca 240 cgctgtatct gcaaatgaac agcctgagag ccgaggacac ggccgtatat tactgtgcga 300 aannnnnnnn nnnntttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcgagtggct 360 cgag 364 <210> 165 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-N/Nco <400> 165 catgccatgg ccgaggtgca gctgttggag tctggg 36 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C <400> 166 tttcgcacag taatatacgg ccg 23 <210> 167 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 gtgcacagga aattgtgttg acgcagtctc caggcaccct gtctttgtct ccaggggaaa 60 gagccaccct ctcctgcagg gccagtcaga gtgttagcag cagctactta gcctggtacc 120 agcagaaacc tggccaggct cccaggctcc tcatctatgg tgcatccagc agggccactg 180 gcatcccaga caggttcagt ggcagtgggt ctgggacaga cttcactctc accatcagca 240 gactggagcc tgaagatttt gcagtgtatt actgtcagca gnnnggtnnn nnnccgnnna 300 cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aagcggccgc 340 <210> 168 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-N/Apa <400> 168 ggtagtgcac aggaaattgt gttgacgcag tctcc 35 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C <400> 169 acagtaatac actgcaaaat c 21 <210> 170 <211> 302 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 ccatggccga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggtgt ggtacggcct ggggggtccc 60 tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttgatga ttatggcatg agctgggtcc 120 gccaagctcc agggaagggg ctggagtggg tctctggtat taattggaat ggtggtagca 180 caggttatgc agactctgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaact 240 ccctgtatct gcaaatgaac agtctgagag ccgaggacac ggccgtatat tactgtgcga 300 aa 302 <210> 171 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-5'-1 <400> 171 gtctggggga ggtttggtac agcctggggg gtcc 34 <210> 172 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-3'-1 <400> 172 cccagctcat ggcataacta ctaaaggtga atcc 34 <210> 173 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-5'-2 <400> 173 gggtctctgc tattagtggg agtggtggta gcacatatta tgcagac 47 <210> 174 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-3'-2 <400> 174 gcagatacag ggtgttcttg gagttgtctc tggag 35 <210> 175 <211> 302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Mutated DP47 <400> 175 ccatggccga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggttt ggtacagcct ggggggtccc 60 tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttagtag ttatgccatg agctgggtcc 120 gccaagctcc agggaagggg ctggagtggg tctctgctat tagtgggagt ggtggtagca 180 catattatgc agactctgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaac tccaagaaca 240 ccctgtatct gcaaatgaac agtctgagag ccgaggacac ggccgtatat tactgtgcga 300 aa 302 <210> 176 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DP47-C/Xho <400> 176 accactcgag ccactggaga cggtgaccag ggttccctgg ccccagtagt c 51 <210> 177 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DPK22-C/Not <400> 177 acttgcggcc gctttgattt ccaccttggt cccttggccg aacg 44
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＰ−４７とＤＰＫ−２２の配列情報を示す図
である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−160384（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−267297（ＪＰ，Ａ) 国際公開00／9464（ＷＯ，Ａ１) 国際公開98／59361（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/15 G01N 33/50 G01N 37/00 103

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質群を含む試料中の特定のタン
    パク質に対する抗体のスクリーニング法であって、以下
    の工程(ａ)〜(ｃ)を備えることを特徴とする高効率抗体
    スクリーニング法。 (ａ)タンパク質群を含む試料を二次元電気泳動処理し、
    前記タンパク質群を二次元電気泳動ゲル上に各スポット
    タンパク質として展開させる工程 (ｂ)スポットタンパク質と抗体ライブラリーとを反応さ
    せる工程 (ｃ)スポットタンパク質に結合した抗体を複製し、該複
    製した抗体を前記スポットタンパク質と反応させる操作
    を１又は２回以上行う工程
  2. 【請求項２】 タンパク質群を含む試料として、細胞亜
    分画をあらかじめ分離精製した試料を用いることを特徴
    とする請求項１記載の高効率抗体スクリーニング法。
  3. 【請求項３】 タンパク質群を含む試料として、翻訳後
    修飾を除去した試料を用いることを特徴とする請求項１
    又は２記載の高効率抗体スクリーニング法。
  4. 【請求項４】 二次元電気泳動ゲル上に展開した各スポ
    ットタンパク質を、固相上に転写したスポットタンパク
    質として、抗体ライブラリーと反応させることを特徴と
    する請求項１〜３のいずれか記載の高効率抗体スクリー
    ニング法。
  5. 【請求項５】 固相上に転写したスポットタンパク質を
    可視化し、個々のスポットタンパク質を単離した後、抗
    体ライブラリーと反応させることを特徴とする請求項４
    記載の高効率抗体スクリーニング法。
  6. 【請求項６】 抗体ライブラリーとして、ファージミド
    抗体ライブラリーを用いることを特徴とする請求項１〜
    ５のいずれか記載の高効率抗体スクリーニング法。
  7. 【請求項７】 スポットタンパク質に結合したファージ
    ミド抗体を宿主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複
    製することを特徴とする請求項６記載の高効率抗体スク
    リーニング法。
  8. 【請求項８】 スポットタンパク質に結合したファージ
    ミド抗体のＣＤＲ領域を標的にＰＣＲを行い、ＰＣＲに
    より増幅された領域を組み込んだファージミドベクター
    を宿主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複製するこ
    とを特徴とする請求項６記載の高効率抗体スクリーニン
    グ法。
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