CZ20013399A3 - Způsob izolace proteinů a analýzy proteinů, zejména hmotnostní analýzou - Google Patents
Způsob izolace proteinů a analýzy proteinů, zejména hmotnostní analýzou Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20013399A3 CZ20013399A3 CZ20013399A CZ20013399A CZ20013399A3 CZ 20013399 A3 CZ20013399 A3 CZ 20013399A3 CZ 20013399 A CZ20013399 A CZ 20013399A CZ 20013399 A CZ20013399 A CZ 20013399A CZ 20013399 A3 CZ20013399 A3 CZ 20013399A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- proteins
- library
- peptides
- binding
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 570
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 458
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 140
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 71
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 title description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 237
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 157
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 137
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 102
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 73
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 71
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 69
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 61
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 60
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 60
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 58
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 47
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 38
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 24
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 17
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 13
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 7
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 4
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 3
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 claims description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 399
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 48
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 43
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 43
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 39
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 22
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 21
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 21
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 21
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 18
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 14
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 14
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 13
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 12
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 12
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 9
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000006437 Proprotein Convertases Human genes 0.000 description 2
- 108010044159 Proprotein Convertases Proteins 0.000 description 2
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- SJFKGZZCMREBQH-UHFFFAOYSA-N methyl ethanimidate Chemical compound COC(C)=N SJFKGZZCMREBQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 108010059339 submandibular proteinase A Proteins 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGTSSIAUHVVZGA-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-N,N-dimethylaniline dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CN(C1=CC=C(C2=CC=C(N(C)C)C=C2)C=C1)C WGTSSIAUHVVZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100174180 Caenorhabditis elegans fos-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- SPJOZZSIXXJYBT-UHFFFAOYSA-N Fenson Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SPJOZZSIXXJYBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical group O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical group CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 101150100931 VI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- PNSLRKGIDHQUJW-UHFFFAOYSA-N ethoxycarbonyl methanesulfonate Chemical compound CCOC(=O)OS(C)(=O)=O PNSLRKGIDHQUJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000004464 hydroxyphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000002742 methionines Chemical group 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- -1 peroxy iodate Chemical compound 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000010377 protein imaging Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 description 1
- 238000007665 sagging Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000004826 seaming Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
- C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
- G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká izolace a analýzy proteinů obzvláště hmotnostní analýzou. Vynález má obzvláště použití pro izolaci vazných proteinů jako jsou protilátky. Vynález se také týká modifikace proteinů nebo jejich fragmentů k usnadnění hmotnostní analýzy a/nebo izolace specifických proteinů zakódovaných členy genové knihovny.
Vynález se týká nových způsobů izolace specifických proteinů ze složité směsi takových proteinů pomocí vazby na specifické cílové místo. Zejména se týká způsobu izolace specifických proti látkových domén ze směsi takových domén, odvozených z knihovny genů, pomocí vazby na specifický cílový antigen. Pro analýzu proteinů poskytuje vynález nové způsoby pro analýzu složitých směsí proteinů, obzvláště ke vzájemnému porovnání dvou nebo několika různých vzorků.
Dosavadní stav techniky
Pro izolaci proteinů z komplexních směsí pomocí vazby na specifické cílové místo, přičemž identita nebo aminokyselinová sekvence proteinu je předem neznámá, je obvykle velmi obtížné izolovat dostatek proteinu, který se váže na cílové místo, pro přímou charakterizaci proteinu. K selekci sledovaného proteinu z velké knihovny přírodních, syntetických nebo polosyntetických proteinů byly vyvinuty metody zobrazení proteinu (protein display), při kterých se produkují rekombinantní proteiny fyzicky vázané na své geny tak, že získání proteinů umožňuje následnou rychlou izolaci genů. Takové způsoby zahrnují metody in vivo jako je zobrazení na bakteriofágu Cphage dis play), na bakteriích a na kvasnicích a zahrnují displejové metody in vitro, jako je zobrazení na ribosomech (ribosome display”). Izolované geny se mohou sekvencovat ke stanovení 1dentity získaného proteinu nebo jich může být použito k regeneraci získaného proteinu. Je-li knihovna genů podrobena způsobům zobrazení proteinů, při kterých se proteiny vybírají pro zvláštní charakteristiky, jako je vazba na antigen, (pro protilátkové variabilní oblasti), pak při každém výběru, se izolované geny obohatí o takové zakódované proteiny vykazující takové zvláštní charakteristiky. Mezi nevýhody běžných způsobů zobrazení in vivo patří omezení na množství zobrazovaných funkčních proteinů (fágový displej je obvykle omezen na polypeptidy s méně než 40 kDa), na obvyklou potřebu fúze rekombinantního proteinu na hostitelský protein (což může interferovat s funkcí nebo vazbou rekombinantního proteinu) a na nemožnost měnit počet displeovaných proteinů na displejovanou částici; což je také problémem u způsobů displeje ”in vitro, jako je ribosomový displej. Kromě toho jsou způsoby selekce proteinů se zvláštními vlastnostmi, jako je vazba na antigen, omezeny díky malým rozměrům displejováných částic, takového druhu, že způsobů, jako je třídění fluorescencí aktivovaných buněk (FACS), není možno použít. Zůstává tedy potřeba nových způsobů ke zlepšení izolace proteinů z komplexních směsí, obzvláště ke zlepšení izolace protilátkových variabilních oblastí Fv' z komplexních směsí Fv'. Vynález se tedy týká zlepšených způsobů izolace proteinů z komplexních směsí. Vynález zejména kombinuje použití knihoven proteinů odvozených z genových knihoven se zlepšením v hmotnostní spektrometrii a zejména se zlepšeními ve spektrometrii MALDI-ToF (matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-f1ight spectrometry) a schopnost přímé sekvence ToF-separovaných peptidů tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS-MS) a nověji schopnost kombinovat ToF a MS/MS do jednoho zařízení (Q-ToF) a schopnost kombinovat HPLC a elektronovou sprejovou (ES) tandemovou hmotnostní spektrometrii. Vynález zahrnuje také nové způsoby vytřídění Cskrí ningu) jednotlivých proteinů z komplexních proteinových směsí, přičemž se tyto proteiny nedisplejují, tedy nevážou na své odpovídající geny buď během vazby nebo po vazbě na cílové místo. Vynález se týká také nových způsobů vytvřídění jednotlivých proteinů z komplexu proteinových směsí, přičemž se nedisplejují ani proteiny, ani cílové místo, vážou se tedy na jakékoukoli molekulu nebo strukturu. Vynález se tedy týká nových způsobů vytřídění jednotlivých proteinů z komplexu proteinových směsí, při kterém se proteiny a jejich odpovídající geny spolu vážou přidáváním nebo začleňováním přidružujícího podílu (associating moiety), přičemž se proteiny vážou na cílové místo buď před přidáním nebo po přiání přidružujícího podílu.
Podstata vynálezu
Způsob identifikace proteinu, vytřídění a/nebo sekvencování, při kterém se opatruje knihovny jednottlivých proteinů, z nichž se jeden nebo několik může vázat na sledované cílové místo, spočívá podle vynálezu v tom, že každý jednotlivý protein má ve své sekvenci sekvenci čárového kódu (barcode), které se může použít k identifikaci každého jednotlivého proteinu v knihovně.
Vynález se tedy týká předně ft způsobu identifikace proteinu, vytřídění a/nebo sekvencování zahrnujícího opatření knihovny jednotlivých proteinů, z nichž jeden nebo několik se může vázat na zamýšlené cílové místo, přičemž každý jednotlivý protein obsahuje ve své sekvenci sekvenci čárového kódu, které se může použít k identifikaci každého jednotlivého proteinu v knihovně.
Podle prvního význaku vynálezu se opatřuje pro knihovny proteinů, obzvláště rekombinantní protilátkové domény jako jsou Fv', přičemž Individuální proteinové členy knihovny obsahují, uvniř své aminokyselinové sekvence, oblast sekvence Cčá ·
rový kód), která může být následně sekvencována k identifikování, který protein se vázal na specifický cílové místo (nebo v případě Fv' antigen“).Toto provedení platí obzvláště tehdy, jsou-li Fv odvozeny z lidských genů, přičemž vybraná Fv může být vhodná pro použití v humánní medicíně jak pro terapii tak pro diagnostiku. V tomto zvláštním použití je vytvořena rozsáhlá knihovna Fv' z fondu imunoglobulinových cDNA' jako jsou cDNA1 odvozené z periferních krevních lidských buněk B nebo takových jako soubory vytvořené synteticky pomocí lidských variabilních regionů s polostatistickými (kombinatorickými) CDR (regionů určujícími komplementaritu) v jedné nebo v několika polohách. Je-li taková genová knihovna vytvořena takovým způsobem, že statistická (nebo polopolostatistická) genová sekvence je začleněna uvnitř Fv kódující blasti nebo zakončení k této oblasti, pak taková statistická nebo polo-statistická genová sekvence vytvoří statistickou nebo polostatistickou peptidovou sekvenci spojenou s jednotlivými Fv'.Taková statistická/polostatist,ická genová sekvence se vytvoří standardními způsoby, jako je polymerázová extense oligonukleotid primerová/DNA polymerázová extenze nebo PCR, přičemž státistické/polostatlstické sekvence syntetického oligonukleotidu je použito jako jednoho nebo páru příměrů použitých k zesílení fragmentů imunoglobulinového genu během vytváření knihovny genů Fv. Obsahuje- li knihovna Fv dva řetězce (řetězce (VH a VL) odvozené z těžkých nebo z lehkých řetězců) jako opozice k jednoduchému řetězci (VH a VL připojenému peptidovými spojovníky), mohou být jednotlivé čárové kódy spojeny s každým z těchto řetězců (nebo může být spojen s pouze jedním z obou řetězců). Při vytváření knihovny obsahuje výsledná každá Fv'jeden nebo několik peptidových čárových kódů výhradně pro tuto příslušnou Fv nebo pro malé podmnožiny Fv z vnitřku knihovny Fv' . S výhodou je peptidový čárový kód C-zakončeníem pro jednořetězcový region Fv nebo C-zakončení k VH a/nebo VL a zahrnuje, začleněný mezi sebou samou a regionem Fv, jedno nebo několik na proteázu citlivých míst, jako jsou místa pro enterokinázu (Štěpené po Asp
- .'* ·· ...» » · · ; · .····· . · ·» .....· ;
..............
-Asp-Asp-Asp-Lys, faktor Xa (Štěpený za Ile-Glu-/Asp-Gly-Arg) nebo jiné endopeptidázy. Je-li směs takových Fv' produkována ze vhodné genové knihovny, pak je taková směs smísena s cílovým místovým antigenem (nebo antigenem jako na buňkách), obvykle je-li antigen imobi 1 izován. To vede ke specifické vazbě Fv' na cílový antigen s nevazebnými činiteli (nebo se slabými vazebnými Činiteli v závislosti na přísnosti promývání), jež jsou vymyty. Při vymytí nadbytku protilátek, se obvykle zbývající komplex antigen/Fv z Fv uvolní digescí s endoproteázou, použitou k štěpení místa citlivého pro zavedenou proteázu. Tento uvolněný čárový kódový peptld se pak podrobí sekvencování hmotnostní analýzou/hmotnostní spektrometrií bud' přímo, nebo popřípadě po zachycení působením specifických aminokyselin nebo sekvencí aminokyselin, které připustí zachycení peptidů na pevnou fázi, jako jsou cysteinové zbytky, které mohou být biotinylovány k následnému zachycení na imobi1izovaném avidinu nebo streptavidlnu. Alternativně je možno použít jakéhokoli jiného způsobu ke stanovení sekvence peptidového čárového kódu buď uvnitř Fv nebo po uvolnění včetně použití specifických ligandfl, které se váží na čárový kód sekvenčně-specifickým způsobem. Když se stanoví sekvence (nebo částečné sekvence) Čárových kódů odvozených od vázaných Fv' , mohou se produkovat odpovídající syntetické oligonukleotidy a použít se ke specifickému zesílení nebo obohacení pro specifické Fv geny z knihovny. Tyto specifické nebo obohacené Fv (nebo VH a VL) geny se pak dále použijí k vytváření odpovídajících Fv, které by mohly být pak znovu testovány na vazbu antigenu individuálně nebo jako součást malé množiny izolovaných Fv. Tímto způsobem mohou být nakonec vytvářeny specifické Fv s žádoucími charakteristikami vázání protilátek a jsou-li z lidského zdroje, s potenciální klinickou užitečností. Vynález se týká také použití vícenásobných Čárových kódů, spojených s individuálními proteiny nebo Fv, například dva sousední čárové kódy u C-zakončení Fv, přičemž dva peptidy jsou z Fv uvolňovány proteázovou digescí, buď současně ke zlepšení identity Fv, která se váže k cílovému v ·
místu, nebo postupně, přičemž se použije různých proteáz v postupných stupních digesce k zajištění různých prostředků k následnému zesílení genů Fv odpovídajících Fv', které se vážou k cílovému místu. Vynález se také týká použití několikanásobných čárový kódů, které se analýzují současně ke zvýšení diversity celkových čárový kódových sekvencí k zajištění specifického kódování jednotlivých proteinů, týká se tedy také použití čárových kódů uvnitř jednotlivých proteinů, například uvnitř jednoho nebo několika CDR poloh jedné Fv. Vynález zahrnuje také použití proteáz, které by mohly digerovat proteinové složky směsi protein:cílové místo, nebo přídavně jakékoli proteinové činidlo k imobi1izování cílového místa s tím, že čárové kódové peptidy uvolněné z proteinů vazebního testu mohou ještě být zjištěny a sekvencovány uvnitř základu ostatních peptidfi. Ve výhodném provedení je zajištěn jediný region čárového kódu u C-zakončení lehkých řetězců tvořících rozpustný fragment Fab, přičemž VH a VL jsou kódovány stejnou expresní kazetou nebo cistronem takže čárové kódové sekvence může být použito k dostupnosti obou genů VH a VL. Takový fragment Fab může být pohodlně vyroben pomocí rady expresních systémů, například systémem bakteriofágového vektoru M13, kde jsou zavedením sekrečních vedoucích sekvencí sekretovány do perlplasmového prostoru hostitelské bakterie a izolují se z tohoto prostoru. Vektorový systém se napřed připraví v úseku čárového kódu klonováním ve směsích syntetických oligonukleotidů. Pro vytvoření dvou sousedních čárových kódů se to pohodlně provede sekvenčním klonováním oligonukleotidové mutagenese, přičemž shromážděné rekombinanty M13, obsahující první směsný čárový kód, jsou připraveny jako matrice pro následné klonování druhého úsekového čárového kódu. S výhodou je čárové kódování konstruováno tak, že zakódovaný protein obsahuje olemující endonukleázová místa a mezi dvěma čárovými kódy, přičemž také mezerníkový region sousedící s jedním z čárových kódů vytváří peptid obsahující čárový kód, který má vyšší molekulovou hmotnost než druhý čárový kód. Rozumnou konstrukcí čárových kódů a použitím násobných čárových kódů tímto způsobem je zajištěna možnost jednoduše analyzovat hmoty peptidů odvozených od endoproteázy, například MALDI-ToF, přičemž sekvence peptidů mohou být odvozeny (nebo téměř odvozeny) tak. že syntetické oligonukleotidy mohou být konstruovány k izolování Cnebo obohacení) pro specifické proteiny s čárovými kódy zjištěnýni analýzou MALDI-ToF. Taková dedukce těchto sekvencí se dosáhne konstrukcí sekvencí, přičemž specifické aminokyseliny se vy skytují pouze v jedné nebo ve dvou pozicích podél peptidu. Jeli například peptid konstruován s použitím 17 až 20 přírodních aminokyselin (zde označených A-Q), pak mohou být sekvence konstruovány s možností pro kteroukoli ze tří aminokyselin v každé poloze podél peptidové sekvence takto=
| poloha aa | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| možnosti | ||||||||
| ami nokyselin- | A | C | E | G | I | K | M | 0 |
| B | D | F | H | J | L | N | P | |
| C | E | G | I | K | M | 0 | ΰ |
Tato konstrukce by dávala teoreticky 6561 různých peptidových sekvenčních čárových kódů. Je-li konstruován sousední čárový kód s mezerníkovým regionem na stejné bázi, vytvořilo by se 4xl07 čárových kódových sekvencí, které by byly schopné jedinečně se přivěsit k většině z členů proteinové knihovny takové velikosti. Použití přídavných sousedních čárový kódů nebo delších čárových kódů spočívajících například na použití dvou specifických aminokyselin a každá posice v sekvenci (vytvářející tak 262144 různých čárový kódových sekvencí používajících 19 aminokyselin) by se zvýšila by se různost zajištěných čárových kódů. V praxi je kodonová redundance snížena rozumnou volbou kodonů na každé pozici v sekvenci během konstrukce smíšených syntetických oligonukleotidů. Jedna konstrukce ol iginukleotIdu pro 8 aminokyselinový čárový kódový peptid pro MS/MS sekvencování je následující:
« 9 •
«·4·
| Kodony | NAC | NCC | N6G | NTG | TKC | VAG | GNV | CNT |
| Aminokyseliny | N | T | R | L | F | Q | D | H |
| D | P | G | M | C | E | V | L | |
| H | A | V | V | K | A | P | ||
| Y | S | G | R |
kde kodony
N = A,
C, G, nebo T
K = G nebo T
V = A, C nebo G
13824 čárový kódových sekvencí
Specif ické kodony mohou být začleněny také nespojitou syntešou oligonukleotidů, při které dávají postupně k odděleným směsím se specifické kodony připředběžně syntetizovaných oliginukleotidů Ckodonová mutagenese ) . Jakmile je kandidátní Čárová kódová sekvence odvozena pomocí MALDI-ToF nebo MS/MS a kde je rozdílnost jednotlivých čárový kódů menší než rozdílnost knihovny, může být specifického oligonukleotidu Cnebo směsi ol igonukleotidň při redundanci v použití korlonu) použito jako primeru PCR ve spojení s protilehlým primerem konstruovaným z proteinu nebo z vektorového systému k obohacení genů kódujících protein, ze kterého doško k detekci Čárového kóduPoužije-li se sousedících čárových kódů, je možno použít sekundárního primeru zahnízděného uvnitř genového fragmentu, vytvořeného z prvního primeru k obohacení genu kódujícího aktuální zjištěný protein. Případně může uvedený způsob začlenit tři nebo více čárových kódů ke zvětšení specifičnosti oligonukleotidem řízeného obohacování specifických genů kódujících žádaný protein. Pracujícím v oboru je zřejmé, že tento první význak vynálezu může zahrnovat řadu variantních metod na základě principu, že specifický protein se získává z knihovny takových proteinů hmotnostní nebo sekvenční analýzou jednoho nebo několika peptidů spojených se specifickým proteinem nebo jím kódovaných a jako takový má tento význak široké uplatnění v izolování genů kódujících žádané proteiny, kde je stanovena nebo odvozena pouze peptidová sekvence.
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že v rozsahu vynálezu existuje mnoho variant shora probíraného prvního význaku vynálezu. Je například patrno, že peptidové čárový kódy by mohly být začleněny do párů nebo skupin proteinů, které se pak nechají vázat ke zjištění, které proteiny se vzájemně vážou pomocí detekce čárových kódů z každého proteinu, podílejícího se na vazbě. Jako alternativa k izolování proteinů z komplexních směsí je možno tímto způsobem zajistit detekci proteinů uvnitř těchto komplexních směsí, které vykazují určité vazební vlastnosti, jako je vazba na jiné makromolekuly jako je DNA. Způsob podle vynálezu zahrnuje radu cest přidávání peptidových čárových kódů k proteinům včetně způsobů, kdy čárový kód je zakódován do genového fragmentu kódujícího protein. Avšak čárové kódy mohou být k takovým proteinům nebo k jakýmkoli jiným směsím molekul přidávány přímým připojením peptidů. Například mohou být specifické peptidy přidány ke specifickým protilátkám nebo proteinům pomocí řady chemických nebo fotochemických způsobů. Jedním použitím takového způsobu je označení jedné komplexní směsi proteinů jedním čárovým kódem Cnebo selekcí čárových kódů, například s různými specifičnostmi proteinů) a druhým čárovýn kódem alternativní komplexní směsi proteinů, například k odlišní čárových kódových proteinů ze dvou rozdílných vzorků, které se pak smísí. Pracovníkům v oboru je zřejmé, že princip přidávání peptidových čárových kódů k proteinům nebo k jiným molekulám by mohl platit také pro nepeptidové čárové kódy, přičemž takové čárové kódy mohou být přímo identifikovány (nebo téměř Identifikovány) pomocí za použití hmotnostních nebo sekvenčních způsobů. Jako takové by mohly čárové kódy zahrnovat čárové kódy nukleových kyselin připojených k proteinům nebo k jiným molekulám včetně nukleových kyselinPokud jde o peptidové čárový kódy, lze takové čárové kódy nukleových kyselin analyzovat hmotnostní spektrometrtií k zajíš' 'e ·· ·♦♦· w τ · Λ « « · · · * · . ν ·· «·«··* · • · · · ···.
·.····· *· ·· ·· tění přesného určení hmotnosti. Takové čárové kódy by se mohly uvolňovat z proteinů nebo z jiných molekul za použití restrikčních enzymů místo proteáz.
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že v rozsahu vynálezu existují aplikace prvního význaku vynálezu jiné, než je izolace proteinů. Například rozdělování proteinů a jiných ligandů uvnitř živého organismu se může analyzovat analýzou čárových kódů podle hmotnosti nebo sekvence, které jsou přidruženy se specifickými orgány uvnitř organismu. Při analyzování specifičnosti vazby peptidů nebo proteinů na jiné molekuly se mohou konstruovat čárové kódy jako součást peptidových nebo proteinových vzebních regionů k analyzování specifičnosti hmotnostní nebo sekvenční analýzou čárových kódů. Například smíšené čárové kódové sekvence mohou být konstruovány kolem známých kotevních zbytků molekul MHC a spektrum peptidů, které se vážou na specifické molekuly MHC může pak být určeno elucí nebo hmotnostní nebo sekvenční analýzou čárových kódů.
Podle druhého význaku se vynález týká A způsobu vytřídění knihovny proteinů zahrnující vytřídění z takové knihovny jedné nebo několika žádaných vlastností, následovanéo dereplikací k identifikování jednoho nebo několika jednotlivých proteinů v knihovně majících žádanou vlastnost.
Podle tohoto význaku se vynález obzvláště rekombinantních protilátek jednotlivé členy knihoven se izolují týká knihoven proteinů, jako jsou Fv', přičemž k vázání na specifické cílové místo, přičemž množiny proteinů z knihovny se vytřídí individuálně a pak se pozitivní množina podrobí jednomu nebo několika stupňům dereplikace, dokud se neidentifikují jednotlivé proteiny v knihovně, které se váží na cílové místo. Specificky se tento význak vynálezu týká vytříďování knihoven proteinů bez použití displejového systému, tedy kde není ani fyzická souvislost proteinů s odpovídajícími geny. Při tomto význaku se množiny proteinů vytříďují z hlediska vazby na cílové místo, přičemž se označí buď cílové místo k vyznačení, která množina nebo množiny obsahují proteiny, které vážou, nebo kde se cílové místo zjistí bez značení. Obzvlášť výhodným způsobem je vytríďovat množiny proteinů v roztoku bez jakékoli fúze nebo připojení na ostatní podíly (což může ovlivnit vazbu proteinů k jejich cílovým místům) a pak vysrážet celou množinu proteinů (spolu s jakýmkoli připojeným cílové místem) před hmotnostní analýzou, obzvláště způsobem MALDI-ToF, k vytříďování pro peptidovou mapu (fungerprint) ionizovaných píků, což je reprezentativní pro cílové místo a proto indikuje, zda se cílové místo vázalo. Jakmile se zjistí jedna nebo několik pozitivně vázaných množin, mohou se pak dereplikovat buď ke snížení složitosti množiny nebo k vysrážení jednotlivých proteinů pro vytřídění vazebních činidel na cílové místo. V praxi je obzvlášť výhodnou cestou seskupování množin proteinů shromáždit napřed množiny genů kódujících tyto proteiny. Jsou-11 například geny klonovány do plasmidu nebo do fágového vektoru, mohou být shromážděny vzájemným smísením jednotlivých bakteriálních kolonií nebo destiček, nebo výhodněji vysrážením množin kolonií/destiček nanesením na separátní agarové destičky (v hustotách 1000 kolonií/plak na agarovou destičku) a seškrabán ím/eluováním kolonií/plak z těchto agarových destiček do jedné směsi, které se pak použije pro syntézu proteinů buď bakteriální/fágovou expresí nebo transkripcí/translací in vitro. Podobným způsobem by se dalo k syntéze proteinů použít jiných mikroorganismů nebo syntezních systémů in vitro. Tento význak vynálezu zahrnuje také použití komplexních cílových míst jako jsou směsi molekul, celé buňky nebo buněčné membrány, přičemž molekulární cílový místový výtěžek poskytuje hmotnostní analyse peptidové mapy, které jsou charakteristické pro vazbu specifického molekulárního cílového místa uvniř komplexního cílového místa- Tento význak zahrnuje také pro případ, že cílovým místem je protein, použití proteáz k digerování cílového místa (cílové místo) k vytvoření peptidové mapy peptido-
vé hmoty indikativní pro cílové místo a které, při současné digesci proteázy i proteinu Cproteinů) z knihovny, může být stále ještě zjištěno i v pozadí ostatních peptidů odvozených z knihovny. Tento význak zahrnuje také různé typy cílových míst a kriteria pro výběr množin proteinů nebo jednotlivých proteinů jiná než vázáním na cílové místo. Význak zahrnuje například použití biologických zkušebních systémů jako kriteria pro výběr proteinů, například když se proteiny vybírají pro schopnost stimulovat nebo inhibovat biologickou aktivitu. Jiné formáty vazbových zkoušek by zahrnovaly inhibování nebo vázání ligandu na jeho receptor a výběr proteinů, které se vážou k určitým místům nebo na cílové místo, přičemž cílovým místem může být například molekula, buňka nebo úsek tkáně.
Podle druhého význaku se vynález týká A způsobu identifikace a/nebo sekvencování proteinu, který je založen na poskytování knihovny jednotlivých proteinů, z nichž může být jeden nebo několik vázáno na sledované cílové místo, přičemž každý jedotlivý protein je s genem vázán na přidružující podíl.
Vynález se tedy týká poskytování knihovny proteinů, obzvláště rekomblnantních protilátek, jako jsou Fv' , přičemž jsou proteiny a jejich odpovídající geny vzájemně vázány přidáním nebo začleněním přidružil jícího podílu, přičemž proteiny nebo Fv' se vážou na cílové místo buď před přidáním nebo po přidání přidružujícího podílu. Přidružující podíl slouží k umožnění regenerace proteinů nebo Fv cestou přidruženého odpovídajícího genu například zesílením PCR (nebo jinými způsoby zesílení jako je cesta bakteriální transformace nebo přímým sekvencováním a následnou regenerací cestou této sekvence). Jestliže jsou proteiny nebo Fv generovány jako množina s odpovídající množinou genů, pak genů spojených s proteiny nebo Fv, které se vážou k cílovému místu (nebo se případně nevážou) je použito jako báze pro regeneraci jednotlivých nebo menších množin proteinů nebo Fv, k opakování vytřídění k identifikaci ·* · ·
specifických proteinů (cestou odpovídajících genfl), které se vážou k cílové místo.
Zvláštní formou tohoto třetího význaku vynálezu je částice, přičemž rekombinantní proteiny a jejich odpovídající geny jsou koimobi1izovány na částicích a výtěžek jednotlivé částice slouží k identifikaci genu nebo genů kódujících rekombinantní protein. Tato forma vede obzvláště ke způsobům, kde geny kódující rekombinantní proteiny jsou kolmobi1izovány na stejné částici jako jejich odpovídající proteiny tak, že po výběru rekombinantního proteinu bude také vybrán odpovídající gen, takže může být stanovena identita vybraného proteinu Csekvencováním genu) nebo tak, že další rekombinantní protein může být generován z genu. Způsob podle vynálezu zahrnuje prostředky k řízení počtu podílů na částici, na kterou se rekombinantní protein naváže. Vynález poskytuje opatření ke kodispleji ostatních molekul na částice ve spojení s rekombinantním proteinem včetně jiných proteinů nebo proteinových řetězců a zahrnuje molekuly, ke kterým se rekombinantní proteiny vážou jako antigeny.
V základní operaci třetího význaku vynálezu je poskytnuta řada genů nebo směsí genů, ze kterých jsou syntetizovány rekorabinantní proteiny použitím způsobů, jako je transkripce nebo translace in vitro nebo fagový displej, přičemž takové proteiny jsou znázorňovány variabilními regiony protilátek CFv'). Následně jsou geny a rekombinantní proteiny koimobi1izovány na částicích, jeden nebo několik llgandů se spojí s genem buď jako DNA nebo mRNA, přičemž takové ligandy se stanou vázanými na receptor na povrchu Částice, nebo kde se takové ligandy nechají reagovat s povrchem částic k vytvoření kovalentní nebo iontové vazby- Alternativně je gen imobilizován přímo na částici vytvořením jedné nebo několika kovalentních nebo iontových vazeb na reaktivní skupiny přírodních DNA nebo RNA. Výsledné rekombinantní proteiny kódované geny mohou mít jeden ne• · bo několik přidružených ligandů (takové ligandy jsou podíly na proteinech, kterými lze imobilizace dosáhnout) jako jsou přívěsky proteinové sekvence (kódované geny) nebo biotinové skupiny (začleněné transkripcí nebo translací in vitro za použití biotinylového lysinu) tak, že také ony se mohou stát vázanými na receptor povrchu částice, nebo kde se takové ligandy nechají reagovat s povrchem částic k vytvoření jedné nebo několika kovalentních nebo iontových vazeb. Ligandy na genech a proteinech mohou být stejnými nebo odlišnými ligandy s imobilizací na stejných nebo odlišných receptorech. K užitečnému vykonávání tohoto význaku vynálezu se geny nebo množiny genů buď jako DNA nebo mRNA nebo uvnitř živých mikroorganismů jako je fág, rozdělí do skupin (nebo několika reakčních nádob) a v takových skupinách se vytvoří rekombinantní proteiny (například transkripcí a translací in vitro nebo růstem fágu). Řídicích skupin obsahujících geny je možno použít jako zdroje k vytváření rekorabinantních proteinů, přičemž vzorky genů nebo proteinů jsou rozděleny do serverových skupin, takže pro každý gen nebo množinu proteinů je zachováno umístění skupiny. Před tímto procesem, v jeho průběhu nebo po něm se do každé polohy ve skupině zavede jedna nebo několik částic poskytujících receptory, na které se geny a proteiny mohou vázat. V jedné variantě vynálezu jsou geny připojeny k částicím na začátku a proteiny produkované přímo z těchto genů jako tyto rekombinantní proteiny se postupně imobllizují na tytéž částice. Před tímto připojování rekombinantních proteinů, k částicím nebo v jeho průběhu, mohou být proteiny případně podrobeny modifikaci, například fosforylací jinými kinázami nebo vazbou jiných proteinů. Ve variantě třetího význaku obsahují skupiny kapky jako jsou kapky oleje v emulzi nebo liposomy, do kterých jsou segregovány geny nebo živé mikroorganismy (obvykle vytvářením kapek před syntézou proteinů a tudíž uspořádání genů uvnitř kapek). Proteiny se vytvářejí uvnitř kapek a jsou pak kopripojovány k částicím obsahujícím geny. V tomto případě kapek, může být částice, ke které se geny a proteiny kopřipojují, buď φφ *
φ ·Φ
Φ ♦· « *φ •·♦· *« zavedena do kapky nebo může být částice samotnou kapkou. Například v případě liposomů by se mohly proteiny produkovat s lipofilními přívěsky, které se kombinují s liposomovými membránami, obzvláště kde to vede k dispeji proteinů na vnějším povrchu liposomů. Podobným příkladem je použití translace mRNA in vitro, přičemž se mikrosomální membrány mohou začlnit do reakce a proteiny s lipofilními přívěsky se mohou integrovat do takových membrán, které mohou být postupně dispergovány do malých Částic.
Je-li žádoucí shromáždit, pak částice pro selekční proces, dostávají se částice zpět ze skupin a směšují se; rekombinantní proteiny na částicích se pak podrobí výběru, typicky vystavením cílovému místu, které váže na vybrané proteiny na částicích. Určité rekombinantní proteiny by mohly být také podrobeny modifikaci v tomto stadiu. Částice, držící vybrané a modifikované proteiny, by pak mohly být získány řadou způsobů; například je-li cílové místo značené fluorescencí, může se použít FACS k oddělení částic s cílovým místem nebo bez cílového místa. V prvním hlavním význaku vynálezu je pak možno geny kódující rekombinantní proteiny takových vybraných částic izolovat například PCR zesílením koimobi1izovaných DNA nebo RNA.
Je mnoho typů přidružujících podílů ke spojování proteinů s jejich odpovídajícími geny, kterých by bylo možno použít, podle třetího význaku vynálezu- K použitelným Částicím se radí latex a magnetické částice a částice na kterých jsou syntetické oligonukleotidy syntetizovány přímo. Takové částice by mohly být obvykle opatřeny receptorem, ke kterému se mohou syntetizované polypeptidy vázat. Jinými přidružujícími podíly mohou být jednotlivé molekuly nebo molekulové komplexy, které mohou působit jako můstky ke spojení s molekulami genů na syntetizované proteiny. Například obě genové molekuly a syntetizované proteiny mohou obsahovat biotinové skupiny, které by mohly pak být zesítěny přísadou streptavidinu, přičemž streptavidin působí jako přidružující podíl. Podobným způsobem mohou být zesíťovány sekvenční přívěsky na proteinech a ligandu na genových molekulách použitím například bispecifického vazebního činidla jako je bispecifická protilátka Cvazba jak na sekvenční přívěsek tak ligand) nebo konjugát protilátka-streptauidín (přičemž protilátka se váže buď k ligandu nebo na protein nebo gen a streptavidin se váže na biotin na proteinu, nebo genu, který je nevázán). Jinými přidružujícími podíly mohou být bakterie nebo bakteriofág, přičemž syntetizovaný polypeptid se váže na specifický ligand na bakterii nebo bakterlofágu. Například může být použito expresního systému M13 k produkci Fv fragmentu specifické protilátky v E.coli, která se pak může vázat na specifickou proteinovou protilátku na M13 samotný, obzvláště když je displejován na fagové hlavě fúzované na kapsidový protein. Testováním na M13 fág, ke kterému se Fv vázal, může být gen kódující specifický Fv stanoven sekvencováním genu Fv zakódovaného M13. Podobně expresního systému M13 může být použito k produkci proteinu, který se váže na specifický protein displejovaný na M13 samotném. V každém případě je jedinečným projevem třetího význaku, že se připojí molekuly rekombinantního proteinu po syntesi na odpovídající geny cestou přidružujícího podílu- Toto přidružení po syntezi obzvláště umožňuje nebráněnou syntézu proteinových molekul bez například potřeby syntézy jako fúze s jinými proteinovými molekulami, které by mohly změnit uspořádání nebo interferovat s jejich poznáním nebo funkcí.
Vynález se týká několika způsobů k vytváření rekombinantních proteinů před spojením na připojovací podíly. Tyto způsoby zahrnují syntézu proteinů transkripcí a translací in vitro a syntézu proteinu v bakterii řízenou plasmidem nebo fágem. Při řízení fágem je výhodou vynálezu, že generovaný protein nemusí být fúzován s fágovýro proteinem, jelikož generovaný protein podle vynálezu je následně imobilizován na oddělené ·« »· »» • · · · * • · 9 ♦ ♦ · • · · · · · ' · · · · « ·*« částici. Na rozdíl od běžných způsobů pro fágový displej proteinů, kdy jsou takové proteiny fúzovány na povrch fágového proteinu nebo na protein, který může dosáhnout k povrchu, třetí význak vynálezu by vyžadoval buď lýzi fágu nebo pro sekreci a uvolňování rekombinantního proteinu z fágové hlavy k zajištění jeho následné imobilizace na částici. Použít by se dalo i jiných způsobů vytváření proteinů in vivo jako je exprese do bakterie, kvasnic nebo dokonce do savčích buněk podle třetího význaku vynálezu, který má proto přednost, že je víceúčelový než jednotlivé displejové způsoby. Rekombinantní proteiny by se tedy daly modifikovat zvláštním hostitelem, například glykosilováním savčích buněk před imobilizací. Jedním obzvlášť, významným význakem vynálezu je schopnost řídit počet molekul rekombinantního proteinu na přidružujícím podílu, zvláště je-li jím částice, řízením počtu receptorových molekul na částici. V případě proti látkových variabilních regionů se může mocnost jednotlivých protilátek nebo množin protilátek měnit podle výběrových kriterií. Další alternativou přidružujícího podílu by mohla být živá buňka samotná, přičemž rekombinantní protein je připojován k ligandu na povrchu živé buňky nebo v jeho blízkosti jako signální znak buněčného povrchu bakteria nebo savčí buňky se zakotvením expresního plasmidu, nebo kde by se po sekreci protein vázal na buňku, ze které byl expresován. Protein by se pak mohl nechat reagovat s cílovým místem a buňky se zakotvenou expresní kazetou pro specifické Fv vážící cílové místo by mohly být izolovány.
Třetí význak poskytuje obzvlášť užitečný prostředek pro výběr rekombinantních proteinů, které se vážou na cílové místo, nebo pro výběr rekombinantních proteinů, které jsou modifikovány specifickým zpracováním, například buněčnými nebo tkáňovými lyzáty. Způsob je v souhlase s tím obzvlášť užitečný pro molekulový vývoj rekombinantních proteinů, přičemž postupné stupně výběru zaručují pouze proteiny s přísnými vlastnostmi, jako je vysoká afinita vazby na cílové místo. Způsob může ♦
* « · • 9· • 99
9999 •9 »9 tedy zahrnovat postupné stupně mutagenese vybraných genů k maximalizaci rozmanitosti vývojového výběru. Pracovníkům v oboru je zřejmé, že existuje nnoho variant, kterých se může použít na základě třetího význaku vynálezu, avšak spadajících do rozsahu vynálezu. Například přidružující podíly obzvláště částice použité k zachycení genů a rekombinantních proteinů by samy mohly být vázány jiným polypeptidovýn řetězcem, přičemž dojděli k vazbě protein-protein, není rekombinantní protein zachycen částicí přímo, ale spíše polypeptidovým řetězcem již na částici. Vhodného přívěsku nebo ligandů na rekombinantním proteinu se pak může použít k zajištění prostředků k detekci vazebního případu protein-protein. Stejným způsobem by mohly být Částice vázány syntetickými oligonukleotidy, kterých se použije k připojení genů jako prostředků k jejich uchycení na částicích.
Ctrvrtý význak vynálezu se týká A způsobu identifikace a/nebo sekvence proteinu, při kterém se pořizuje knihovna jednotlivých proteinů, z nichž jeden nebo několik se mohou vázat k žádoucímu cílovému místu, přičemž každý jednotlivý protein je připojen k Individuálnímu kódujícímu podílu.
Vynález se tedy týká rekombinantních proteinů syntetizovaných z genové knihovny, které jsou pak připojeny ke kódujícím podílům, jako jsou částice, které jsou odlišitelné jednou nebo několika kodizačními způsoby tak, že kódování se týká 1dentity genu, který kóduje rekombinantní protein připojený k ástici. Jestliže jsou rekombinantní proteiny mobilizovány na kódovaných částicích, mohou mít rekombinantní proteiny jeden nebo několik ligandů spojených jako sekvenční přívěsky nebo biotinové skupiny tak, že mohou být vázány k receptoru na povrchu kódované částice nebo jestliže se ligandy nechají reagovat s povrchem částice, k vytvoření kovalentní nebo iontové vazby. Při provádění tohoto význaku vynálezu se syntetizují rekombinantní proteiny nebo množiny proteinů nebo se segregují
| • Φ | ·· | ||||||
| • · | ·· | • Φ | » · | • | • | ·· | |
| • | • | • | • · | • | ♦ | • | |
| • | ♦ · | • | ··· | • · | • | ||
| • | * | • | • | • | « | • | |
| ··«« | ·· | ·· | ··· |
ve velkých skupinách. Do každé polohy ve skupině se pak zavedou částice s jedinečnými kódy. K těmto kodflm patří například různé poměry měřitelných signálních podílů, jako je fluorescenční, chemiluminiscenční nebo radioaktivní značení nebo různé fyzikální charakteristiky, které částice odliší podle rozdílných tvarů nebo značení, jako je například kód nebo jedinečná značka vyleptaná na částici. V každém případě se však jednotlivé kódované částice dají navzájem rozlišit. Částicemi pro použití podle vynálezu jsou všechny takové částice, komplexy nebo molekuly s vlastností umožňující připojení proteinů. Po shromáždění částic a vázání směsí proteinů na kódovaných částicích ke specifickému cílovému místu, by se mohlo stanovit kódování vybraných částic ke stanovení jejich původní polohy a tedy seskupení genů kódujících vybrané rekombinantní proteiny. Jako varianta tohoto způsobu podle vynálezu by mohly být identifikovány vybrané proteiny na částicích přímo pomocí způsobu hmotnostní spektroskopie MALDI-TOF nebo použitím značených protilátek k identifikaci známých proteinů- Provádění a rozsah tohoto čtvrtého význaku vynálezu zahrnuje mnoho hledisek a rozsah shora uvedených tří význaků vynálezu.
35. Pátý význak vynálezu se týká A způsobu A pro analyzování směsí proteinů, při kterém se ¢1) digeruje nebo štěpí směs proteinů, (ii) frakcionují se výsledné peptidy a analyzují se výsledné peptidy na základě hmotnosti a/nebo sekvence.
Tento význak vynálezu se týká způsobů analyzování směsí proteinů. Zejména se vynález týká způsobů porovnávání proteinů mezi různými buňkami a tkáněmi. Vynález zahrnuje kombinaci digesce nebo štěpení směsí proteinů, frakcionači peptidů pomocí knihovny proteinů vázajících reakční činidla a následnou analýzu peptidových frakcí podle hmotnosti nebo sekvence. Vynález zahrnuje případnou fyzikální frakcionaci proteinů nebo pepti-
| 9· | • | ||||||
| • r | ·· | • · | • · | • · | |||
| • | * | a | • | • · | 9 | • | • |
| • | • | • · | * | • · | 9 | • | |
| • | • | • | • | • | • · | • | |
| ♦ ··· | ·· | «· | • 9 | ··· |
dových fragmentů přídavně k frakcionači s proteiny vázajícími reakční činidla. Běžné způsoby analyzování ve hmotě komplexních směsí proteinů, jako jsou savčí buňky nebo tkáně vyžadují, aby proteiny byly separovány technologiemi jako je dvojrozměrná (2D) gelová elektroforéza. U této technologie se obvykle separují buněčné proteiny na bázi šarže v jednom rozměru a na bázi velikosti ve druhém rozměru. Proteiny mohou být identif ikovány bud' s odkazem na elektroforézní migrační model známého proteinu nebo elucí proteinu z elektroforeticky separované skvrny a analýzou způsoby jako je hmotnostní spektrometrie a nukleární magnetická rezonance. Avšak omezením dvourozměrné 2D proteinové gelové elektrofořezy je omezená rozlišitelnost a detekce proteinů z buněk (typicky pouze 5000 buněčných proteinů se zřetelně zjistí), omezená identifikace separovaných proteinů (například hmotnostní spektrometrie vyžaduje lOOfmol nebo více proteinu pro identifikaci), specializovaná povaha techniky a obtížná automatizace techniky k získání velmi vysokého proteinového analyzového prosazení. Existuje tedy potřeba vynikajících způsobů k analyzování komplexních směsí proteinů ve hmotě zvláště pomocí metod bez gelové elektroforézy a metod, které se dají snadno zautomatizovat.
Jádrem pátého význaku je, že proteiny jsou buď digerovány nebo fyzicky štěpeny pomocí knihovny reakčních činidel s afinitou k proteinu a pak se podrobí hmotnostní analyse, obzvláště hmotnostní spektroskopii. Případně mohou být proteiny nebo peptidové fragmenty frakcionovány fyzikálně přídavně k frakci onací reakčními činidly s afinitou k proteinu a mohou být také spojeny s jedním nebo několika chemickými přívěsky pomocnými při frakcionaci.
Hlavní hledisko pátého význaku spočívá ve štěpení proteinů pomocí proteáz nebo chemickými způsoby, ve frakci onač i vytvořené peptidové směsi a v následné hmotnostní analýze. Frakcionace peptidů se dosáhne použitím proteinových afinitních
| «4 | « ·· | ·· | 9« | ||||
| • | • · | • | 9 | • 9 | • | 9 | 99 |
| * | • | • | 9 | • * | 9 | 9 | 9 |
| • | • | 9 · | 9 | • •9 | 9 9 | 9 | • |
| • | 9 | 9 | • | 9 | 9 | a | 9 |
| 99·· | *99 | 99 | 9* | 99 | 999 |
reakčních Činidel, obzvláště knihoven rekombinantních protilátkových fragmentů. Popřípadě způsob zahrnuje přídavnou frakcionaci proteinů nebo peptidů použitím fyzikálních metod nebo specifických afinitních reakčních činidel, jako jsou protilátky nebo pevné fáze nebo reaktivní chemické skupiny k izolování peptidů nebo směsí peptidů pro následnou hmotnostní analýzu. Proteinových afinitních reakčních Činidel se používá k izolaci jednotlivých peptidů nebo peptidových souborů ze směsí peptidů pro následnou hmotnostní analýzu. Alternativně nebo přídavně může být použito proteinových afinitních reakčních činidel k vyloučení peptidů ze směsi, přičemž směs je pak sama podrobena hmotnostní analyse- Proteinová afi nitni reakční činidla se mohou vázat bud' pomocí specifických sekvencí nebo struktur na peptidy nebo pomocí speciálních chemických skupin buď jako přírodní součásti peptidů nebo chemickými přívěsky, které se přidají do peptidů před štěpením nebo po štěpení.
Pro analýzu může být použito větších směsí peptidů, panelu proteinových afinitních reakčních činidel, jako jsou činidla poskytnutá rekorobinantními knihovnami proti látkových Fv fragmentů Cvčetně jednořetězcových Fv') k izolování podmnožin peptidů pro následnou analýzu- Takové panely Fv zahrnují široký rozsah peptidových specifičností, kterých by bylo možno získat například preabsorbováním proti látkových knihoven na sledované peptidové vzorky nebo imunizací zvířat sledovanými vzorky peptidů a generováním rekombinantních knihoven Fv ze zvířecích B buněk. Alternativně by mohly být připravena polyklonální antisera nebo panely monoklonálnich protilátek z imunizovaných zvířat a použít jich k frakcionování peptidů. Pak se použijí jednotlivé protilátky nebo směsi vybraných protilátek k izolování (nebo k vyloučení) specifických podmnožin peptidů z testovaného vzorku. Následná hmotnostní analýza řady peptidů může usnadnit detekci rozdílů ve specifických proteinech mezi testovanými vzorky.
| « | «« | • | ||||
| • · | • t | * · | 9 ♦ | • | 9 | • · |
| * | • | • * | « · | • | • | • |
| • | 9 | • · · | ··· | • 9 | • | • |
| • | 9 | • t | • | 9 | • | • |
| ··*♦ | ··· | ·· | *· | 99 | ··· |
Vytváření rekombinantních Fv' nebo protilátek ke všem peptidfim ve směsi je obtížné a silně závisí na počtu peptidů ve směsi a na snadnosti jednotlivých peptidů s rozumnou afinitou vázat se na protilátky <antigenicity). Ve velmi velké směsi peptidů je limitace přebytečná, když protilátky se stejnou peptidovou specifičností se opakovaně vyskytují a protilátky k jiným peptidovým specifičnostem jsou málo zastoupeny nebo chybí. To může způsobit, že příslušný protein nebyl hmotnostně analyzován, není-li žádný z peptidů z příslušného proteinu protilátkou vázán. Proto je obzvlást výhodné izolovat N a/nebo C koncové peptidy z proteinu preabsorpcí proteinu na pevné fázi prostřednictvím jeho dusíkového a/nebo uhlíkového zakončení před štěpením nebo chemickým přívěskem na N nebo C konci k následné izolaci po štěpení. V zásadě by to mělo vést k izolaci všech peptidů s N a/nebo C zakončením zastupujících všechny proteiny ze vzorku. Taková izolace N a/nebo C koncových peptidů je silně usnadněna odlišnou reaktivní povahou N koncové aminoskupiny a C koncové karboxylové skupiny proteinu v porovnání s vnirtními aminoskupinámi a karboxylovými skupinami. Takové izolované N a/nebo C koncové peptidy mohou být dále frakcionovány za použití afinitních reakčních činidel, která buď rozeznají specifické peptidové sekvence nebo která rozeznají chemické značení na peptidech nebo jsou dále frakcionovány fyzikálními prostředky jako je chromatografie HPLC. Takové izolované N a/nebo C koncové peptidy jsou pak frakciovány pomocí proteinových afinitních reakčních činidel před hmotnostní analýzou. Vynález se týká také sekvenční konjugace různých chemických značení ke směsi protein/peptid, obzvláště když jsou N nebo C zakončení sekvenčně vystavena specifickým štěpením protein/peptidové směsi a kdy N a/nebo C zakončení jsou kojugována se specifickým chemičkám značením při exposici těchto zakončení. Vynález se tedy týká série proteinových frakcí s řadou konjugovaných chemických přívěsků zavedených na těchto koncích, přičemž jsou takové frakce izolovány pomocí afinitních reakčních činidel, která se vážou k přívěskům. Jako
| 4* « 9 | 4 9 4 | * v • 4 | 4 · | 9 | 9 | ♦ 9 |
| * | v | 4 t | • * | 4 | 4 | 4 |
| • | • | • 9 4 | 4*4 | 4 9 | 4 | • |
| • | 4 | • 4 | • | • | 9 | 4 |
| 4·4· | • 94 | 44 | 4· | 44 | 944 |
obvlášt vhodný způsob jako alternativa k chemickým přívěskům na konci proteinové molekuly, mohou být přívěsky také specificky připojeny k nekoncovým aminokyselinám, takže vnitrní peptidy mohou být izolovány cestou interních chemických přívěsků. Existuje jedinečná chemie pro připojování ligandů k některým specifickým aminokyselinám, například k E-aminoskupinám lysinfi, k thiolovým skupinám cysteinů a ke karboxylovým skupinám asparagové a glutamové kyseliny. Jednou předností izolování peptidů prostřednictvím nezakončujících přívěsků je, že selekce může být provedena pro větší peptidy, u nichž je větší pravděpodobnost., že obsahují specifické amlnokysel iny, ke kterým jsou přívěsky připojeny, a je možná izolace peptidů s hmotou vyšší ve srovnání s nízkými molekulovými hmotnostmi s větším šumem pozadí během hmotnostní analýzy. Jinou výhodou je skupina reakčních činidel schopných zavést chemické přívěsky na specifické aminokyseliny uvnitř proteinů nebo peptidů, obzvláště reakčních činidel, která poskytují biotinový přívěsekDalším provedením pátého význaku jsou sekvenční cykly proteinového štěpení pomocí proteáz nebo chemických způsobů s frakcionací proteinovými afinitnímih reakčními činidly buď během postupných proteinových štěpných kroků nebo po nich a následnou hmotnostní analýzou. V tomto případě je analýza směsi proteinů podporována sekvenčními cykly štěpení, přičemž spektrum proteinů a peptidů je frakclonováno reakčními činidly s proteinovou afinitou a analyzuje se po každém štěpném cyklu. Tento způsob může také zahrnovat cykly chemického přivěšování mezi cykly štěpení ke zvýšení hmoty nebo kroky k odstranění bočních skupin jako jsou uhlohydrátové skupiny ke snížení hmotnosti. Je-li hmotnost skupiny proteinových fragmentů stanovena na konci každého štěpného cyklu <buď s chemickým privěšováním nebo bez něho, štěpení nebo jiné modifikace), získá se rozsah hmotových distribucí pro každý cyklus. S vhodnou sérií cyklů hmotnostní modifikace, je výsledkem pro samotný protein nebo pro směs hmotnostní spektrum fragmentů protein/peptid,
| • 9 | • | 4» | ||
| • * | «4 | 4 · · · · | 4 · | |
| 4 | • · » · · | • | ||
| • | • | »4 φ ··♦ · | 4 | |
| 4 | 0 0 · · | 4 | ||
| M ·· | «4 | 0 |
které se mění při následných cyklech; obrazec těchto aIterací zajistí peptidovou mapu pro specifické protein/peptidy ve směsi. Výstyt nebo nevýskyt jednotlivého fragmentu protein/ peptid určité hmotnosti následovaný po specifických cyklech štěpení s chemickým přivěšováním nebo bez něho, štěpení nebo jiných modifikací poskytne peptidovou mapu pro identifikaci sekvence fragmentů obzvláště se zřetelem na databázi takových peptidových map. Porovnání spektra fragmentů protein/peptid z různých příbuzných vzorků přispívá k identifikaci rozdílů fragmentů protein/peptid mezi těmito vzorky. Z tohoto význaku vynálezu jsou vlášt výhodné proteázy, které specificky rozeznají dvě aminokyseliny a jako výsledek rozštěpí protein. Příkladem takových proteáz jsou prohormonové konvertázy, které štěpí mezi páry dibázických aminokyselin. Pátý význak vynálezu poskytuje proto nové cesty analýzy proteinových směsí za použití kombinace digesce nebo štěpení proteinů, frakcionace pomocí reakčních činidel s afinitou k proteinům a hmotnostní analýzou.
Podobně podle pátého význaku jsou proteiny frakcionovány před štěpením. 1J velkých směsí proteinů, zejména u směsí, které jsou izolovány přímo z úplných buněk nebo tkání, může být předběžná frakcionace proteinů žádoucí, aby se snížila složitost směsí podrobených následnému štěpení, frakcionaci peptidů a hmotnostní analýze. Zatímco reakční činidla s afinitou k proteinu, která vážou sekvence nebo struktury v systémech protein/peptld přímo, jsou přednostně užitečná, je alternativou nebo adicí použití knihovny chemických přívěsků k zajištění podílů vázaných množinou reakčních činidel s afinitou k proteinu. Mezi běžnější prostředky předběžné frakcionace patří použití jednorozměrové nebo dvourozměrové gelové elektroforézy, kde sekce gelu jsou izolovány a proteiny uvnitř se pak prodrobují štěpení a hmotnostní analýze. Jinými způsoby předběžné frakcionace jsou izolace proteinů pomocí přírodních modifikací jako je fosforylace, glykosylace, interakce
| ·· | • | ·* | 99 | ||
| • · | ·♦ | • · | • · · | • · | |
| • | • | « · | • < · | • | |
| • | • | • · | • | · | • |
| • | • | • | • | • · | • |
| ···· | ··· | 99 | ·· · |
protein/protein (nebo peptid); alternativně mohou být předběžně frakcionovány membrány proteinů nebo proteiny ze zvláštních oddělení uvnitř buňky. Jiným významným způsobem předběžné frakcionace je odstranění vysoce hojných proteinů ze směsi použitím afinitních reakčních činidel, jako jsou protilátky k vázání a k odstranění takových proteinů. Jako alternativa předběžné frakcionace mohou být také frakcionovány peptidy generované po štěpení mnoha z uvedených způsobů a také zavedením způsobů frakcionace velikost/náboj za použití HPLC. Takové způsoby jsou obzvlášť, vhodné k frakci onač i peptidů, které byly již vytříděny ze směsi použitím reakčních činidel s afinitou k proteinům. Obzvlášť může být HPLC vystřídána s hmotnostní analýzou tak, že peptidové frakce ze separace HPLC jsou přímo podrobeny hmotnostní analýze. Peptidy, generované po štěpení, mohou být frakcionovány účinkem přírodních modifikací za použití například protilátek, které vážoou fosforylované aminokyseliny uvnitř peptidů. Předběžné frakcionace proteinů se dá dosáhnout také použitím reakčních činidel s afinitou k proteinu, jako jsou monoklonální/polyklonální protilátky k izolování specifických proteinů pro následné štěpení a hmotnostní analýzu. Pi'o takové analýzy větších směsí proteinů se dává přednost knihovnám protilátek poskytovanýchm rekombinantními knihovnami Fv', k izolování podmnožin proteinů nebo podmnožin rozštěpených peptidů pro následnou hmotnostní analýzu. Taková knihovna protilátek obsahuje široký obor proteinových nebo peptidových specifičností, může však být také předběžně obohacena pro vázání uvažovaných proteinů/peptidů v přílušmém sledovaném vzorku. U peptidů se toho dosahuje s výhodou testováním jednotlivých Fv na selektivní vazbu na jednotlivý peptid nebo na malý počet peptidů ve vzorku. Alternativně je možno předběžného obohacení dosáhnout předběžným absorbováním proti látkových knihoven na sledovaném vzorku smíšených proteinů/peptidů a pak použitím jednotlivých proteinů/peptidů nebo směsí vybraných protilátek dospět k izolování podmnožin proteinů nebo peptidů. Frakcionace rekačními činidly s afinitou k proteinu poskytuje
| ·· | ·· ·· · | |||
| • · | • · | • · · · | ·· | |
| • | • | • · | • · · · | • |
| • | • · · | ♦ ·· · · · | • | |
| • | • | • · | • · · | • |
| ···« | tt· | 9« ·· |
hmotnostní spektra pro radu různých proteinových/peptidových frakcí, čímž se usnadňuje detekce rozdílů specifických proteinů mezi vzorky.
Další výhodou použití chemických přívěsků je, že postupná frakcionace peptidů afinitními reakčními činidly může silně snížit počet vybraných peptidů z proteinové molekuly s tím, že zbytek molekuly je tak z hmotnostní analýzy vyloučen. Obzvlášť výhodným způsobem pro selektivní chemické přivěšování je přivěšování k N- a/nebo k C-zakončení proteinových molekul ve směsi a pak digerování nebo štěpení proteinových molekul rozumně selektivními reakčními činidly jako je aminokyselina nebo sekvence specifické proteázy (jako je endopeptidáza Arg-C) nebo štěpné reakční činidlo Cjako je kyselá hodnota pH ke štěpení u Asp-Pro). Použitím afinitního činidla mohou pak být z původního proteinu izolovány peptidy s N- a/nebo s C-zakončením a všechny interní peptidy se mohou vyloučit. Toto snížení složitosti je pak postačující pro hmotnostní analýzu obzvláště použitím chromatografie HPLC spojené v tandemu s hmotnostním spektrometrem k analýze peptidů ve hmotě k identifikaci jednotlivých peptidů ze směsi.
Alternativně by se mohlo chemické přivěšování provádět, pouze po digescí/štěpení , například dibazickými řezy, prohormonovými konvertázami. To by poskytovalo pro přivěšování pouze jedno nebo několik vnitrních míst původních proteinů. Je-li pak směs proteinů podrobena operaci sekundárního digerování/ štěpení s různým enzymem nebo štěpným reakčním činidlem, pak by se velikost přivěšených peptidů snížila, kde bylo štěpné místo přítomno v původním proteinu. Přivěšené peptidy by pak mohly být frakcionovány použitím reakčních činidel s afinitou k proteinu a podrobeny hmotnostní analyse.
V jiném provedení pátého význaku je proteinová směs podrobena cyklům přivěšování, digerování/štěpení a hmotnostní
9*9 9*99 9 · 99
9« ······· « · 9 · ····· · 9 • 9 99 9 9 · · ···· 999 99 ·· 99 ♦ ·· analýzy, přičemž frakclonace Činidly s afinitou k proteinu a hmotnostní analýza se provádí pouze na podílu směsi, vzniklé z použití afinitních reakčních činidel, vázaných na specifický chemický přívěšek, přičemž hlavní směs se pak podrobí privěšování různých chemických přívěšků a dlgesci/štěpení. Tak se získá následně radu různých fragmentů. Jiná varianta způsobu zahrnuje stejné počáteční kroky jako shora, přičemž se vystaví nové N- a/nebo C- zakončení po štěpení působení různých chemikálií k dodání přívěšků na vnitřní místa v původním proteinu. Proces se může popřípadě opakovat jednou nebo několikrát s různými proteázovými nebo štěpnými reakčními činidly pokaždé se zavedením N- nebo U- zakončení různým chemickým přívěškem. V jednom provedení způsobu podle vynálezu se celá směs proteinů opatří přívěsky dvou různých chemických skupin na každém Nnebo C- zakončení a pak se štěpí proteázou, která specificky řeže přilehlé specifické aminokyseliny a znovu se zavedou přívěsky na nových N- a C zakončeních dvěma dalšími odlišnými chemickými skupinami. Získá se směs peptidů, z nichž každý má chemický přívěšek na zakončení. Kdyby N- a C- zakončení peptidů měla specifický přívěsky, mohly by se peptidy ze směsi izolovat vhodnými afinitními Činidly. Vnitřní peptidy bez počátečních N- nebo C-koncových přívěsků by mohly být izolovány pomocí specifických přívěsků. Proces digerování a přivěšování se může opakovat k vytvoření dalších peptidů s přívěsky. Použitím specifických kombinací afinitních reakčních činidel ke specifickým přívěskům se pak mohou izolovat peptidy s N- a s C-zakončením nebo specifické vnitřní peptidy z původního proteinu a vybrané peptidy se mohou vyhodit ke snížení složitosti analyzované směsi. Tam, kde se přidávají chemické přívěsky ke dvěma nebo více vedlejším skupinám aminokyselin uvnitř peptidů, postupné používání afinitních přívěsků umožní izolovat frakce peptidu obsahující specifické kombinace aminokyselin. Jestliže například směs peptidů obsahuje středně 20 aminokyselin a je odděleně opatřena přívěsky na lysinu a fenylalaninu a směs obsahuje 25 % peptidů, které nemají ani ly• · «·«*··· • · · « * Μ· · · · ·
O · ·· · · · · ··· ··· ·· ι· »· ··· sin ani fenylalanin, 25 % peptidů s obsahem pouze lysinu, 25 % peptidů s obsahem pouze fenylalaninu a 25 % peptidů s obsahem jak lysinu tak fenylalaninu, získá se separátním nebo postupným použitím specifických afinitních činidel buď pro lysin nebo pro fenylalanin rozdělení peptidů do čtyř stejných frakcí. V praxi by takové schéma frakcionace podpořilo vazbu větších peptidů k afinitním reakčním činidlům, neboť tyto peptidy obsahují pravděpodobněji jednu nebo několik specifických přivěšených aminokyselin- To by vedlo k velmi malým peptidům například s molekulovou hmotností menší než 1000 daltonů, které, jsou-li podrobeny analyse hmotnostní spektrometrií, splynou s větší pravděpodobností se šumem pozadí díky fragmentovaným peptidům a ostatním malým molekulám.
Tam kde se požaduje analýza komplexních proteinových směsí, jako je tomu u savčích buněk nebo tkání, poskytuje vynález hlavní způsob, kde jsou proteiny frakcionovány pomocí reakčních činidel s afinitou k proteinu buď před štěpením nebo po něm a peptidy jsou pak hmotově analyzovány. Frakcionace komplexní směsi proteinů nebo peptidů vyžaduje reakční činidla s afinitou k proteinu odpovídající komplexní směsi a může být doprovázena jedním nebo několika reakčními činidly s afinitou k proteinu, která mohou rozeznat význaky protelnů/peptidQ, které jsou základem pro frakcionaci. Provádí-li se štěpení před frakcionaci, je nejběžnějším způsobem použitým podle vynálezu rozštěpit celou směs proteinů proteázou, jako je trypsin nebo proteáza V8 (Glu-C), a pak selektivně izolovat určité peptidy a podrobit je hmotnostní analyse.
Obecně se N a/nebo C-koncové peptidy izolují ze směsí peptidů typicky přidáním chemického přívěsku k N- a/nebo C-zakončení proteinů před štěpením a použitím afinitních reakčních Činidel, která izolují peptidy s chemickým přívěskem. Alternativně mohou být specifické peptidy Cs N- a/nebo s C-zakončením nebo s jiným zakončením) izolovány pomocí afinitních reakčních
Činidel, která se vybrou k vazbě na specifické peptidy uvnitř specifických proteinů; tím se vytřídí jednotlivé peptidy ze směsi. U složitějších směsí proteinů je výhodný další frakcionacní krok například frakcionace chromatografií HPLC na základě velikosti, šarže nebo hydrofobicity před hmotnostní analýzou obzvláště jelikož to může být porovnáno s hmotnostní analýzou. Selektivní izolace peptidů umožňuje pak porovnávací analýzu specifických peptidů odvozených z alternativních směsí proteinů pro jejich relativní množství (odvozených z relativních úrovní proteinů v jejich příslušných směsích) a v některých případech modifikaci proteinů.
Pro frakcionaci N-a C-koncových peptidů je významným význakem tohoto vynálezu příprava a použití činidel s afinitou k proteinům a značení N- nebo C- zakonČeníní proteinů je dalším významným význakem. U typické směsi proteinů ze savčích buněk nebo tkání nebo z četných živých oganismů několik N-zakončení těchto proteinů (a některá C-zakončení) se modifikuje (například methylací) tak, že přísada chemického přívěsku k zakončení může být blokována- Kromě toho se v typické směsi proteinů ze savčích buněk nebo tkání nebo z mnoha živých organismů objeví proteiny v různé relativní úrovni hojnosti, zahrnující obvykle určitě vysoce hojné proteiny. V případě použití směsí proteinů ze savčích buněk nebo tkání nebo z četných živých organismů k počáteční selekci reakčních činidel s afinitou k proteinu, mohou takové silně obohacené proteiny dominovat výběru afinitních reakčních činidel a mohou převládat v konečné směsi peptidů pro hmotnostní analýzu. Řešením obou těchto problémů je použití umělého zdroje smíšených proteinů k izolování afinitních reakčních činidel. Typicky tím může být gen expresující systém, u kterého se použije knihovny genů (obvykle cDNA) k vytvoření proteinů bez modifikací N- nebo Czakončeníní. Kromě toho umožňuje použití gen expresního systému, aby genová knihovna byla normalizována ke snížení nebo k odstranění vysoce hojných genů uvnitř knihovny. Toho se • · ·*·»·· • 9 · · Φ····· · * • · ♦ · · · · · ·»·· ··· ·· ·« ♦* ··· zpravidla dosahuje teplotní samohybridizací DNA (nebo RNA) před zkonstruováním knihovny. Proto je obvyklým způsobem podle vynálezu vytvořit proteiny expresí knihoven genů (obvykle normalizované), což vede k proteinům prostým významných modifikací N- nebo C-zakončeníní a v případě normalizace ke směsi proteinů prosté převládání specifických proteinů. Typickým expresním systémem, používaným s knihovnou genů, je in vitro transkripce a translace s použitím eukaryotického ribosomového prostředku; to zahrnuje také možnost začlenění modifikovaných aminokyselin do expresovaných proteinů. Směsi expresovaných proteinů může pak být použito přímo pro značení N- nebo C-zakončeníní. Použít se dá i jiných expresních systémů kde N-koncové aminoskupiny a C-koncové karboxylové skupiny nejsou modifikovány nebo chráněny od následného chemického přivěšování. Když se vyskytne modifikace, může být v některých příkladech modifikace N-zakončení odstraněna buď použitím enzymů, jako je histondiacetyláza nebo chemickým způsobem, jako je omezené štěpení bromkyanem k odstranění N-koncových methioninů.
Když se vytvořila směs proteinů prostá N/C koncových modifikací, mohou se přidat chemické přívěsky na N/C koncové aminoskupiny. U N-zakončení může být C-aminoskupina lysinů napřed blokována pomocí činidel jako je citrakonanhydrid nebo methylacetimidát, aby se pak nechaly reagovat pouze N-koncové aminoskupiny. Nebo být může C-aminoskupina lysinů blokována začleněním modifikovaných lysinů do expresního systému, jako je in vitro transkripce/translace, přičemž například mohou být blotlnem modifikované lysiny začleněny přímo, místo lysinů. Chemické přívěsky se pak mohou přidat selektivně k N-končení proteinů například použitím isothiokyanátů specifických molekul, ke kterým je afinitní reakční činidlo k disposici. Jedním takovým příkladem je fluorescein, který je začleněn reakcí proteinů s fluorescelnisothiokyanátem umožňujícím následné čištění antifluoresceinovými protilátkami- Alternativně mohou být začleněna polykarboxylová chelatační činidla jako isothio kyanáty umožňující následnou izolaci specifickými kovy. Jsouli N- a/nebo C-zakončení proteinů ve směsi opatřena přívěsky, může být protein úplně a specificky štěpen chemicky nebo enzymaticky pomocí proteáz jako je trypsin nebo jiné štěpné činidlo. Takové štěpení tím uvolní z každého proteinu individuální přivěšený zakončenu j ící peptidový fragment, jako je soubor' fragmentů, které pak mohou být izolovány ze směsi nepřivěšených peptidů použitím příslušného afinitního reakčního činidla, jako je protilátka specifická pro chemický přívěsek. Popřípadě může být velikost chemického přívěsku zvýšena k vytvoření vetší hmoty pro analýzu; to by bylo výhodné pro peptidové fragmenty pocházející ze štěpení velmi blízko u chemického přívěsku, pričenmž výsledný fragment by mohl být tak malý, aby byl hmotnostně analyzován uvnitř nižší molekulové hmotnosti šumu (noise). Chemickým přívěskem může být kus nukleové kyseliny připojený k peptidů reaktivní skupinou zavedenou během syntézy nukleové kyseliny- Taková molekula nukleové kyseliny může být také užitečná při izolaci přivěšeného peptidů teplotní hybridizací nukleové kyseliny do komplementární sekvence.
Po chemickém přivěšení a izolaci, se izolované směsi N/C koncových peptidů znovu použijí jako prostředek Cbait) pro izolaci reakčních činidel s afinitou k proteinu k vázání na tytéž peptidy z proteinů odvozených přímo ze savčích buněk nebo tkání nebo z živých organismů- Taková afinitní reakční činidla se typicky odvozují z knihovny rekombinantních Fv' vystavených jako součást částice obsahující odpovídající gen kódující protilátku. Příklady takových částic jsou ribosomu vystavené částice nebo fágové displeyové částice, v každém případě kde geny z vybraných protilátek mohou být ochráněny k propagování těch specifických protilátek. Jako alternativa může být vytříděn velký počet protilátek (takových jako rekombinantní jediný řetězec nebo Fab nebo Fv) použitím směsi N/C koncových peptidů a protilátky, které jsou schopny vazby na peptidy se izolují cestou odpovídajících genů. Jako jiná al ternativa by mohlo být použito N- a/nebo C-koncových peptidů k přímému vytvoření monokloná1 nich nebo polyklonálních protilátek vhodnou imunizací zvířete. Těmito prostředky se vybere knihovna reakčních činidel s afinitou k proteinu, které je pak možno použít k analýze směsí proteinů, jako jsou savčí buňky nebo tkáně nebo jiné živé organismy. Taková analýza může zahrnovat buď použití knihovny afinitních reakčních činidel k vybráni dusíkových a/nebo uhlíkových koncových peptidů z proteinů odvozených ze savčích buněk nebo tkání nebo z jiných živých organismů nebo použitím individuálních afinitních reakčních činidel k vybrání jednotlivých peptidů. Vybrané peptidy se pak mohou podrobit hmotnostní analýze obvykle MALDI-ToF (matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-f1ight), kde jednotlivé peptidy poskytují individuální poměry šarže:hmotnost., kterých je pak možno použít k identifikaci součástí peptiové aminokyseliny. K identifikaci případně izolovaného pept-idu, může pak být použito MS-MS (dvojité hmotnostní spektroskopie). Alternativně může nová generace přístrojů Quadrupole-ToF LC-MS-MS(Q-ToF) zajistit sekvenční MALDI-ToF a MS-MS v témže přístroji. Reakční činidla s afinitou k proteinu mohou být imobl1izována buď jednotlivě nebo ve směsích buď nepřímo, nebo přímo na desorpčním čipu vloženém do přístroje MALDI-ToF a peptidy mohou pak být vázány cestou afinitních reakčních činidel na čipu. Tímto způsobem může být analyzováno několik peptidových frakcí absorbovaných mnoha afinitními reakčními činidly v různých místech na jediném čipu. Použití rekomblnantních proteinů jako prostředku k izolování reakčních činidel s afinitou k proteinu poskytuje také možnost připojení jiných přívěsků k těm proteinům, přičemž jsou takové přívěsky kódovány genovou sekvencí; například by mohl být začleněn uhlíkový koncový polyhistidinový přívěsek (umožňující následné izolace přívěskových fragmentů pomocí chelátů niklu) například PCR zprostředkovaným začleněním do genových sekvencíPoužití rekombinantních proteinů jako prostředku • · k izolování reakčních činidel s afinitou k protein poskytuje ještě další obecný způsob pátého význaku vynálezu pro obzvlášt specifické izolování peptidů použitím přívěsků kódovaných rekombinantními proteiny. Takové přívěsky mohou být pohodlně začleněny do Členů genové knihovny (obvykle cDNA) během její konstrukce nebo do individuálních klonů nebo skupin klonů pomocí speifických příměrů PCR kódujících takové přívěsky a určených k začlenění takových přívěsků do výsledných expresovaných proteinů. S výhodou se takové přívěsky začleněnují do expresovaných proteinů ve všech čtecích rámech k produktivní produkci proteinu s přívěskem. Takové přívěsky se s výhodou začleňují ve směru primeru reakce PCR s obvyklým výsledkem, že přívěsek je produkován směrem k C-zakončení expresovaného proteinu (ačkoli proti směru zakončené kodony tomu mohou v některých klonech bránit). Přívěsky však mohou také být začleňovány na N- nebo na N- i C-zakončení.
K izolování specifických peptidů ze směsi peptidů mohou být peptidové sekvence vyráběny synteticky (nebo cestou rekombinantní DNA) a pak, stejně jako shora, použity jako prostředek k zachycení specifických reakčních činidel s afinitou k proteinu. Těchto afinitních reakčních činidel může pak být použito k izolování těchže peptidů ze štěpené směsi proteinů, pocházejících například ze savčích buněk nebo tkání nebo z jiných živých organismů.
Jako alternativa k selektivní frakcionaci N- nebo C-koncových peptidů nebo specifických interních peptidů se mohou izolovat modifikované peptidy, jako jsou peptídy zahrnující fosforylované aminokyseliny, použitím protilátek, které se selektivně vážou k fosforylovanýro aminokyselinám (tyrosín, threonin nebo šeřin nebo jejich kombinace), nebo použitím imobi1izovaného Fe3 + k zachycení peptidů se záporným nábojem. Podobně mohou být izolovány peptidy modifikované glykosylací a nebo modifikacemi v některých případech, kdy je peptidová modifikace «· dále derivatizována k usnadnění izolace. Například uhlohydráty se dají snadno modifikovat cestou peroxyjodátových reakcí jako meziprodukt k připojení chemických přívěsků jako je fluorescein. Obzvlášť výhodným význakem vynálezu je frakcionace selektivně modifikovaných peptidů, přičemž takové peptidy jsou selektivně přivěšovány prostřednictvím svého diferencovaného vystavení přivěšování uvnitř původního proteinového prostředí před štěpením. Například povrchu vystavené proteiny na živých buňkách mohou být selektivně přivěšovány, například biotinem, zpracováním buněk přivěšovacím Činidlem, které preferenčně reaguje se specifickými skupinami aminokyselin. Nepřímý způsob dosahování takového přivěšování v proteinech, které jsou přirozeně přivěšeny prostřednictvím jiných stimulů uvnitř buněk, je použít takových stimulů k uskutečnění přivěšení proteinů. Například s receptorem asociované tyrosinkinázové molekuly uvnitř buněk mohou být potenciálně přivěšeny (například fosforylovány) přidáním receptorového ligandu k takovým buňkám. Po modifikaci se peptidy uvolní z proteinů štěpením a pak se přímo podrobují hmotnostní analyse nebo frakcionaci s činidly s afinitou k proteinu jako shora před hmotnostní analýzou.
Hmotnostní analýza proteinů a peptldů se podle vynálezu provádí s výhodou hmotnostní spektroskopií. Obzvláště MALDI-ToF analýza může velmi přesně změřit poměr měrná hmotnost: šarže pro jednotlivé peptidy. Tak je možno analyzovat současně tisíce peptidů. Nad 4kD se stává rozlišování jednotlivých peptidů (a proteinů) horší, takže je nutné štěpení proteinů na peptidové fragmenty aby se zajistilo jemné rozlišení- Nejnovější separační způsoby mezi fázové kapalinové chromatografie (jako je chromatografie HPLC) spolu se hmotnostní spektroskopií již umožnily hmotnostní spektrální analýzu proteinových směsí až 200 proteinů. Jelikož jsou takové proteiny analyzovány po proteázové digesci za předpokladu, že připadá na jeden protein přibližně 10 peptidů, může způsob analyzovat až 2000 peptidů. Při použití způsobu podle vynálezu se analyzují na ··· příklad pouze N-konocvé peptidy s přívěskem a najednou se může analyzovat až 2000 koncových peptidů odvozených z až 2000 proteinů. Jelikož to není dostatečně citlivé pro hmotnostní analýzu savčích proteinů z buněk (zpravidla 50 000 na buňku), segregují se peptidy do nejméně 25 frakcí, aby všechny frakce byly analyzovány. Takové další frakcionace lze dosáhnout buď přímo pomocí předběžně vybrané knihovny proteinových afinitních reakčních činidel, nebo použitím reakčních činidel ke značení interních konců po postupných krocích digesce/štěpení, po kterých se použije proteinových afinitních reakčních činidel, k frakcionaci peptidů podle jejich přívěsků. Jako alternativa ke standardní hmotnostní spektroskopii, může být použito MALDI-ToF k vytvoření hmotnostních profilů proteinů, které mohou být porovnány pro proteinové směsi z různých buněk.
Chemickými přívěsky jsou zpravidla podíly, které mohou být kovalentně připojeny k proteinům obvykle u N- nebo C-zakončéní. Pokud jde o chemické přivěšování na N-zakončení, dochází k němu obvykle na koncové aminoskupině. Je-li nutno zabránit přivěšování C-aminoskupiny lysinů, mohou být tyto skupiny na počátku blokovány reakčními činidly, jako je anhydrid kyseliny citrakonové nebo methylacetimidát. Koncové aminoskupiny se reaktivují velkým oborem chemických reakčních činidel zejména použitím isothiokyanátů- Tím mohou obecné protilátkou rozlišené llgandy, jako je dlnitrofenol a fluorescein, být připojeny k N-zakončení pro následující frakcionaci pomocí reakčního činidla s afinitou k protilátce. Například může být použito obecne používaného Edmanova Činidla fenylisothiokyanátů ke specifickému připojení na N-zakončení proteinů a může být popřípadě derivát.izováno podílem zajištovaným následné vázání na afinitní reakční činidlo. K chemickému přivěšování na C-zakončení se používá obvykle způsobů založených na aktivaci karbodiimidu k zavedení ligandů, které jsou vázány afinitními reakčními činidly. Alternativně bylo popsáno přidávání podílů k Czakončení proteinů za pomoci reversní proteolýzy, přičemž ur ♦ · ««*»*· • · · · ·«*«·· · • * ♦ · » · · ···· ·*· ·· «· ·· čité proteázy jako karboxypeptidáza Y a lysylendopeptidáza mohou působit reversně k připojení chemických přívěsků, obvykle prostřednictvím aminokyselin buď jako derivátizovaných aminokyselin s přívěsky pro vazbu na afinitní reakční Činidla nebo prostřednictvím přírodních sekvencí aminokyselin, které mohou být specificky vázány afinitním reakčním činidlem. Je zřejmé, že může být také chemicky přlvěšován velký obor interních aminokyselin včetně Lys prostřednictvím E-aminoskupiny, Glu/Asp prostřednictvím karboxylové skupiny, Cys prostřednictvím thiolové skupiny. Ser/Thr prostřednictvím hydroxylové skupiny a Tyr prostřednictvím hydroxyfenylové skupiny. Byly popsány specifické derivatizace většiny aminokyselin. Může být také použito posttranslačních proteinových modifikací k přidání chemických přívěsků zvláště glykosylací. přičemž jsou cukrové zbytky obykle oxidovány peroxidovými nebo formaldehydovým1 skupinami, které pak mohou reagovat s molekulami obsahujícími aminoskupinu. Mezi ostatní modifikace, kterých je možno použít k připojení chemických přívěsků, patří lipidace, fosforylace a přidávání kovových iontů. Je zřejmé, že v oboru je velký počet způsobů zavádění jednoho nebo několika chemických přívěsků na specifická místa uvnitř proteinových molekul nebo peptidflReakčními činidly s afinitou k proteinu k použití podle pátého význaky vynálezu jsou obecně monoklonální protilátky. Pro specifické sekvence nebo struktury uvnitř proteinů nebo peptidů, se používá knihovny reklombinantních vazebních míst obvykle ve formě Fab nebo Fv nebo jednořetězcových Fv*, kde jsou obecně proti látková vazební místa displejována, použitím například bakteriofágu nebo ribosomových komplexů tak, že je možno znovu získat gen kódujících individuálních proti látkových vazebních míst. K použití podle vynálezu je možno knihovny proti látkových vazebních míst rozdělit do skupin, například vybíráním a seřazováním fagových destiček nebo vybíráním a řazením genů ve vektory pro ribosomový displej- Takové množiny obsahují obvyklle proti látková vazební místa pro řadu • φ φφ φφφφ « φ φ * · φ · φ · · · • φφφφ φφφ « φ φ φ φ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φ proteinů nebo peptidů tak, že těchto množin je možno použít k frakcionaci. Alternativně směs proteinů nebo peptidů, ke kterým jsou požadovány knihovny reakčních činidel s afinitou k protilátkám, může být imobi1izována a použita jako cílové místo pro preselekci vhodných afinitních reakčních činidel, která pak mohou být dispergována v množinách nebo použita jako individuální reakční činidla. Pro chemické přívěsky se používá individuálních monoklonálních protilátek ke specifické vazbě na individuální přívěsky k dosažení následné frakcionace.
K pátému význaku vynálezu patří také použití proteinových afinitních reakčních činidel jiných než monoklonálních protilátek, ppřičemž mohou taková reakční činidla usnadnit frakcionaci peptidů nebo proteinů před hmotnostní analýzou. Taková afinitní reakční činidla by zahrnovala imunitní molekuly, které selektivně vážou určité peptidy jako hlavní histokompatibilltní proteiny a receptoi'y T-buněk. Jiná proteinová afinitní reakční činidla by zahrnovala proteinové domény společně se účastí protein-protein vazebních interakcí jako jsou domény SH1. Vynález se také týká konceptu cyklizace peptidů zahrnutých uvnitř směsí a speciálně ppřípadně vázaných na pevné fáze, například vazebních cysteinových zbytků za redukčních podmínek. Jinak by bylo nutno přidat přídavný cysteinový zbytek na vystavená N- nebo C-zakončení na imobi1izovaných peptidech použitím například pro imobi1izované peptidy na C-zakončení standardních podmínek peptidové syntézy nebo použitím reversní proteolýzy určitých proteáz jako je karboxypeptidáza Y a lysy lendopept,idáza. Pátý význak se týká také způsobu pro další frakcionaci proteinů nebo peptidů přidáním obvykle na N-zakonČení aminokyselin, které tvoří část rozeznávací sekvence proteázy, která specificky štěpí při rozlišovací sekvenci proteázy dvou aminokyselin, přičemž jedna nebo několik zakončujících aminokyselin v proteázovém rozeznávacím místě je zajištěna výchozím proteinem nebo peptidem. Tímto způsobem bude pak pouze frakce proteinů nebo peptidů, ke kterým se nové aminokyse• 9 9 9 9 ·99 · 9 9
9 · 9 • 9 99 9· <
ι·«· « ·· líny přidávají, subjektem pro štěpení koncové proteázy pomocí nově vytvořené sekvence. Tímto způsobem mohou být přivěšovány na proteiny nebo peptidy adiční aminokyseliny obvykle na Nzakončení vytvářející ve frakcí takto přivěšené směsi specifické místo štěpení protázy. Proteiny nebo peptidy mohou pak být imobi1izovány cestou nového zakončení například použitím přivěšené zakončující aminokyseliny nebo přidáním chemického přívěsku k zakončení, přičemž se pak použije aflnitního reakčního činidla k imobi1izování přivěšených podílů. Po odstranění neimobi1izovaných nepřivěšených molekul mohou pak být proteiny nebo peptidy podrobeny štěpení specifickou proteázou, která pak může štěpit, pouze v místech, kde byla štěpná místa vytvořena kombinováním ze syntézy odvozených aminokyselin a amlnokyselin odvozených z původního proteinu nebo peptidu. Rožštěpené peptidy pak mohou být frakcIonovány pomocí afinitních reakčních Činidel a hmotnostně analyzovány (nebo dále zpracovány před hmotnostní analýzou), čímž reprezentují podmnožinu peptidové směsi. Použitím paralelní syntézy specifických aminokyselin k exponovaným zakončením následované imobilizací a štěpením mohou být frakcionovány velké směsi proteinů nebo peptidů na bázi svých koncových amininokyselin. Příkladem proteázového rozeznávacího místa je ile, glu, gly, arg, které se štěpí mezi gly a arg faktorem Xa. Sekvence ile, glu, gly by mohla být syntetizována na N-zakončení proteinu nebo peptidu a tedy kdyby sousedící aminokyselina v proteinové nebo peptidové sekvenci byla arg, bylo by štěpné místo vytvořeno a mohlo by být štěpeno faktorem Xa. Jinými příklady štěpných proteázových míst jsou asp, asp, asp, asp, lys, štěpené enterokinázou mezi asp a lys; pro, gly, ala, ala, his, tyr, štěpené mezi his a tyr geneázou I; leu, val, pro, arg, gly, ser, štěpené mezi arg a gly thrombinem. Dusíková koncová adice parciální sekvence asp, asp, asp, asp by mohla být použita k identifikaci proteinů nebo peptidů s dusíkovým koncovým lys (štěpených enterokinázou) pro, gly. ala, ala, his k identifikaci proteinů/peptidů s N-koncovým tyr (štěpeným geneázou), leu, »· *44« · 4 4 ·
4 4 4 »4· · 4 4
44* ·· *·
val, pro, arg k identifikaci N-koncového gly, ser,; nebo leu, val, pro, arg, gly k identifikování N-koncového ser (štěpený thrombinem). Jiných proteáz jako MMP' (matricové metal loproteinázy) se specifickými rozeznávacími místy by bylo možno použít k frakcionování proteinů s jinými N-koncovými aminokyselinami. Bylo by tedy možno použít různých proteázových rozeznávacích míst v kombinaci s proteázami k frakcionování proteinů nebo peptidů podle N-koncových aminokyseliny- Jako alternativa se přidá jedna nebo několik aminokyselin k volnému N-zakončení peptidů k vytvoření místa pro vazbu afinitním reakční činidlem, přičemž je takové místo závislé na jedné nebo několika N-koncových aminkyselinách peptidů. Je tedy možno rozlišit různé peptidy nebo skupiny peptidů přidáním aminokyselin k N-zakončení, které vytvoří, způsobem závislým na N-konových aminokyselinách místo pro proteázovou digesci nebo místo pro vazbu afinitním reakčním Činidlem. Při použití proteinů jako výchozího materiálu, obzvláště ze savčích buněk, přičemž N-koncovým proteinem je methionin, může být methlonin popřípadě odstraněn například formylací a štěpením bakteriální proteázou specifickou pro odstranění koncového formylmethioninu.
Proteinová afinitni reakční činidla jsou významným hlediskem pátého význaku vynálezu a může se jich používat jak k Široké frakcionaci skupin proteinů/peptidů tak pro specifickou frakcionaci jednotlivých proteinů/peptidů. K frakcionaci je třeba napřed připravit, frakce jednotlivých proteinových afinitních reakčních Činidel, která se vážou na specifické frakce nebo na specifické peptidy a nikoli na jiné frakce/peptidy. Vhodným způsobem je frakcionovat proteiny nebo peptidy před 1zolací proteinových afinítních reakčních činidel. V případě protilátek jako součástí proteinových afinítních reakčních činidel může pak být použito takových proteinů/peptidů buď k vazbě dlsplejovaných protilátek z knihovny nebo může jich být použito k imunizaci zvířat pro generaci antiser. Při pou-
Φ *··· žití knihovny rekombinantních proti látkových vazebních míst, jako jsou jednořetězcové Fv' , mohou být genové klony, které je klonují, izolovány po vazbě na proteinové/peptidové frakce za předpokladu replikovatelného zdroje afinitních reakčních činidel pro následnou izolaci specifické frakce proteinu/peptidu. Jednotlivé jednořetězcové Fv' mohou být paralelně vytříděny na vazební specifičnost, například analazováním peptidové vazby MALDI-ToF. V tomto případě se ponechají jednořetězcové Fv*, které se vážou k samotnému peptidu z velké směsi proteinů (v praxi se uchovají také ty, které se vážou až ke třem peptidům> jako genové klony k následnému individuálnímu použití nebo k použití uvnitř směsi Fv pro izolaci proteinové/peptidové frakce ze směsi. Je zřejmé, že volné N-zakončení z proteinů jsou Často dobrým cílové místoem pro izolaci velmi specifických protilátek, a proto zachycují a uvolňují N-koncové peptidy z proteinu a obzvlášť dobře podpoří následnou izolaci protilátky. Některé Fv* mohou být užitečné pro eliminaci hojných proteinů nebo peptidů ze směsi. Retence a charakterizace vazby jednořetězcových Fv' může také poskytovat prostředky ke snížení prebytečnosti vyloučením Fv' se stejnou specifičností jako ostatní Fv*,
Různá provedení pátého význaku vynálezu zahrnují kombinace proteinové digesce/štěpení, frakcionaci proteinovými afinitními reakčními činidly a hmotnostní analýzu s případným krokem frakcionace s použitím afinitních přívěsků pro specifické sekvence nebo struktury v proteinech nebo v peptidech a případný krok chemického přivěšování s frakcionaci působením těchto přívěsků. Různá hlediska zahrnují různé sekvence těchto kroků následujícím způsobem:
1- opakované cykly digesce/štěpení a hmotnostní analýza
2- digesce/štěpení, frakcionace proteinovými afinitními reakčními činidly, hmotnostní analýza
3- frakcionace proteinovými afinitními reakčními činidly, digesce/stěpení, hmotnostní analýza • « ·· · · · · 9 9 99 • · 9999999 • · 9 9 9 999 · « > 9 • ♦ · 9 9 9 9 9 ·99· ··· ·9 99 99 999
4- chemické privěšování na zakončení, digesce/štěpení, frakcionace afinitními reakčními činidly, hmotnostní analýza
5- jako 3, avšak s přídavnými cykly privěšování, digesce/ štěpení, frakcionace
6- jako 4, avšak s opakovaným přivěsováním, cykly digesce/štěpení a hmotnostní analýza
Pátý význak vynálezu tedy zahrnuje tyto a podobné kroky zpracování proteinu/peptidu za účelem snížení složitosti proteinových směsí k dosažení hmotnostní analýzy výsledných frakcí protein/peptid.
Běžně známým způsobem provádění vynálezu je privěšování N- a/nebo C-zakončení směsi proteinů (buď přírodních nebo kódovaných knihovnami cDNA), štěpení proteázou, imobilizace peptidových fragmentů N- a/nebo C-zakončení a uvolnění a podrobení peptidů hmotnostní analyse. Alternativně mohou být Na C-zakončení modifikována přidáním aminokyselin před štěpením sekvenčně-specifickou proteázou. Před hmotnostní analýzou je peptidů použito k vázání proteinových afinitních reakčních činidel, jako jsou protilátky, přičemž tyto protilátky byly preselekt-ovány k frakcionaci peptidů, nebo jsou samy afinitními reakčními činidly. Směs proteinů může být prefrakcionována například podle velikosti nebo může být vyrobena z knihoven cDNA, které jsou prefrakcionovány segregací klonů. Ponechaných proteinových afinitních reakčních činidel může pak být použito k analýze komplexních vzorků proteinů, přičemž je použito protilátek k vázání peptidů, které se pak hmotnostně analýzují.
Je zřejmé, že mnohé z principů zde popsaných pro digesci/štěpení, frakcionaci a hmotnostní analýzu proteinů lze také aplikovat na jiné polymerní molekuly, jako je DNA nebo RNA. V případě DNA nebo RNA, poskytují volné fosfátové a hydroxylové skupiny na 5 a 3 zakončení prostředky pro velmi specifickou adici chemických přívěsků nebo přímou vazbu k pev···· • · φ φ • · ♦ φ φ · φ φ » φφφ φ · φ • φ φφφ • ·· φφ φφ * né fázi. Sekvenční specifické omezení nebo modifikační enzymy zalistují štěpení nebo modifikaci molekul DNA. Užitečnými afinitními reakčními činidly pro DNA nebo RNA jsou nukleové kyseliny samotné, které mohou být specificky hybridizovány na doplňkové sekvence DNA nebo RNA s připojením k pevné fázi buď před hybridizací nebo po ní. Pomocí takových způsobů mohou být frakcionovány komplexní směsi nukleových kyselin a pak podrobeny hmotnostní analyse obzvláště s použitím hmotnostní spektrometrie .
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Pokusy uvedené v tomto příkladu se provedly s párem modifikovaných jednořetězcových proti látkových genů (scAb). Dva modifikované scAb se připraví z N-zakončení epitopových přívěsků, z variabilního regionu <VH) s těžkým řetězcem a ze spojovníku 14 aminkolyselin (EGKSSGSGSESKVD), lehkého řetězcového variabilního regionu (VL), každého fúzovaného na b-zip doménu buď z genu c-jun nebo c-fos.
Tyto konstrukty se klonují na vektor- pET 5c CRosenberg A-Η. a kol. Gene, 56, st.r. 125 až 135, 1987), který poskytuje promotor T7 následovaný rlbosomovým vazebním místem z T7 genu 10. Konstrukty scAb se začlení do vektoru na místě Ndel tak, že sekvenmce kódující přivěšený epitop následuje za prvním ATG T7 genu 10. První konstrukt sestává z scAb proti Pneumonia aeruginosa CMolloy P. a kol., Journal of Applied Bacteriology 78, str. 359 až 365, 1995) s epitopem FLAG (MDYKDDDK) CKnappik A. a Pluckthun A., Bio Techniques 17= str. 754 až 761, 1994) přidaného u N-zakončení a z domény b-zip c-fos CAbate C. a • · f »··· • »9· • ♦ ·· • ·♦·· • ·· «·99 ·· · kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87, str. 1032 až 1036, 1990) v regionu C-zakončení proteinu. Druhý konstrukt tvoří scAb, zkonstruovaný z antifetální antigenové protilátky 340 (Durant L.G. a kol., Prenatal Diagnosis 14, str. 131 až 140, 1994) s polyhistidinovým přívěskem na N zakončení a b-zip doménou c-jun (Abate C. a kol. shora) u C-koncového regionu proteinu.
Anti-Pseudomonas aeruginosa (a-Ps-fos)scAb a 340-jun scAb se konstruují jak dále popsáno.
DNA pro α-Ps scAb ve vektoru pPMIHis (Molloy P. a kol., shora) se zesílí příměry RD 5 FLAG:
z z gcggatcccatatggactacaaagacgatgacgacaaacaggtgcagctgcag3 (Genosys Biotechnologies Europe Ltd. Cambridge, UK) a RD3 5 gcgaattcgtggtggtggtggtggtgtgactctcc3 (Genosys), který zavádí epitopovou sekvenci 5 FLAG a odstraňuje 3 stop kodon. Reakční směs obsahuje 0,1 pg matrice DNA, 2,6 jednotek Expand™ High Fiděli ty PCR enzymové směsi (Boehringer, Mannheim, Lewes, UK), pufr Expand HF (Boehringer Mannheim), 1,5 mM chloridu hořečnatého, 200 juM deoxynukleotidtrifosfátfl (dNTP) (Life Technologies, Paisley, UK) a 25 pmol každého příměru. Cykly jsou o o o při teplotě 96 C 5 minut, následovaný [95 C 1 minuta, 50 C minuta, 72 Cl minuta] čas 5,[95 C 45 sekund, 50 Cl minuta, 72 C 1 minuta 30 sekund] čas 8, [95 C 45 sekund, 50 C o o minuta, 72 C 2 minuty] čas 5, končící se 72 C 5 minut. Získaný produkt 1123 bp se rozřeže BainHI a EcoRI a klonuje se do vektoru pUC19 (Boehringer Mannheim). Sekvence DNA se potvrdí použitím soupravy Thermo Sequenase radiolabelled terminátor cycle sequencing kit vith [33P] dideoxy nukleotides (Amersham Life Science, Amersham, UK). Konstrukt se klonuje do vektoru pETSc (Promega UK Ltd. Southampton, UK) jako Ndel do fragmentu EcoRI (Molecular Cloning A Laboratory Manual, vydavatel Sambrook J. Fritsch E.F., Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA), Plasmid DNA se připraví pomocí VizardR Plus SV Minipreps DNA purification Systém (Promega UK
| • * | f· | * | 0 0« 0 | • | • 0 | |
| • | • | • | 0 | • 0 « | 0 | • |
| • | • | • · | 0 | 00« · · | 0 | 0 |
| • | • | 0 | 0 | • 0 | 0 | 0 |
| ···« | 0·# | • 0 | ·· | «00 |
Ltd.) nebo ve větším měřítku Qlagen Plasmld Midi Kit (Qiagen, Ltd. Crawley, UK). Nový generovaný plasmid je pojmenován pET5c FLAG-otPs scAb.
Kazeta fos se shromáždí PCR překrytím oligonukleotidů:
Fos 1 pro
-atggaattcctcgagaccgacaccct-acaggcggaaacgaccagctgga
Fos 80 řev
-tcgcgatttcggttttgcagcgcggatttttcgtcttccagctggtcggtt
Fos 71 pro
-aaaccgaaatcgcgaacctgctgaaagaaaaagaaaagctggagttcatc
Fos 155 řev
-ggaagcttgaat.tccgccggacggtgtgccgccaggatgaactccagctt
Uvedené oligonukleotidy se začlení do reakční směsi po 1 pmol a reakce probíhá za pomoci 10 pmol příměrů FoslfS;
z
-atggaattcctcgagacc a Fos 155rS 5 -ggaagcttgaattccgcc s použitím high fidelity polymerázy a reakčních složek jako shora. Výsledný produkt. 155bp se digeruje s EcoRI, izoluje se a klonuje se do EcoRI úseku pUC19 prosekvenční analýzu za použití standardních postupů CMolecular Cloning, A Laboratory Manual, viz shora). Fos kazeta se subklonuje do plasmidu pET5cFLAG-«Ps scAb jako fragment Xhol-EcoRI substitucí stávajícího fragmentu 320 bp Xhol-EcoRI nesoucího lidskou konstantní region doménu.
Vyrobí se 340 scAb substitucí VH a VK 340 protilátek místo α-Ps VH a VK v ppMIHis. 340 VH se zesílí příměry * z cagct.gcaggagtctgggggaggcttag3 (Gemosys) a tcagtagacggtgaccgaggttccttgaccccagta3 (Genosys).
Reakční směs obsahuje 0,2 pg matrice DNA, 2,6 jednotek Expand™ High Fidelity PCR enzymové směsi, Expand HF pufru, 1,5 mM chloridu horečnatého, 2000 μΜ dNTP a 25 pmol každého příměru.
O Ů Q
Cykly jsou 96 C 5 minut, následované [95 C 1 minuta, 50 C minuta, 72 *C 1 minuta] krát 5, [95 °C 45 sekund, 50 °C 1 minuta, 72 Cl minuta, 30 sekund! krát 8, [95 C 45 sekund, * 4 • · · 4 • ♦·· 4 4 • · 4 4 4 4 4
4444 444 4« «4 <4
Η·
Cl minuta, 72 C 2 minuty] krát 5, končící 72 C 5 minut. Produkt 357 bp se odřízne Pstl a BstEII a klonuje se do Pstl a BstEII odříznut pPMIHis (Molecular Cloning, A. Laboratory Manuál, viz shora). Podobně 340 VK se zesílí primery gtgacattgagctcacacagtctcct3 a
Z 4» cagcccgttttatctcgagcttggtccg3 (Genosys). Produkt 339 bp se odřízne Sstl a Xhol a klonuje se do Sstl a Xhol odříznutý modifikovaným pPMIHis (připraveným shora). Sekvence DNA je potvrzena, použitím Thermo Seguenase radioznačený terminátorový cyklus sekvencovaný soupravou [33P] dideoxynukleotidy jako shora. DNA pro 340 scAb ve vektoru pPMIHis se zesílí primery RD 5 HIS: 5 gcggatcccatatgcaccatcatcaccatcaccaggtgcagctgcag3 (Genosys) a RD3 (udaného shora), které zavedly 6 histidinové zbytky na 5 konci a odstraní se 3 stop kodon. Reakční činidla a podmínky pro zesílení jsou přesně jako pro konstrukt a-Ps. Získaný produkt 1114 bp se odřízne BamHI a EcoRI a klonuje se do vektoru pUC19 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, viz shora). Sekvence DNA se potvrdí jako prve a konstrukt se klonuje do vektoru pET5c jako Ndel do fragmentu EcoRI k vytvoření plasmidu pEtc HIS 340 scAb.
Kazeta jun se shromáždí PCR překrytím oligonukleotidyJuni pro
-atgagaattctcgagcgtatcgctcgtctggaagaaaaagttaaaaccct
Jun 85 rev
-tagcggtggaagccagttcggagttctgagcttttcagggttttaactttt
Jun 71 pro z
-tggcttccaccgctaacatgctgcgtgaacaggttgctcagctgaaacag
Jun 146 řev
-catgcgaattcgtggttcataactttctgtttcagctgagcaacc
Uvedené oligonukleotidy se začlení do reakční směsi po 1 pmol a reakce se nechá probíhat za použití 10 pmolfl příměrů Jun 1 proS; 5 -atgagaattctcgagcg a Jun 146rev-S;
-catgcgaattcgtggttc s použitím polymerázy High Těch a shora *±'J • 0 0 0 0 0·· ♦ ♦ 0 0 «··»«· · • · · * *· · • 0*0 000 0» f» 00 uvedených reakčních činidel. Výsledný produkt 146bp se digeruje s EcoRI, vyčistí se a klonuje do EcoRI úsek pUC19 pro sekvenční analýzu za použití standardních postupů (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, viz shora). Kazeta Jun se subklonuje do plasmidu pEt5c HIS 340 scAb jako fragment Xhol-EcoRI substitucí stávajícího fragmentu 320bpXhoI-EcoRI nesoucího lidskou doménu konstantního regionu.
Plasniidů his-340-jun a FLAG-aPs-fos se použije jako matrice pro PCR za použití biotlnylového primeru BioT7;
-agatctctcgatcccgcaaatta a primeru petrev;
-aaataggcgtatcacgaggcc. Příměry jsou dodány od GenoSys (Cambridge, UK) a použijí se v reakci při koncentraci 1 pmol. Složky a PCR podmínky jsou jako shora. Produktem reakce his-340-jun je 992bp a produktem reakce FLAG-aPs-fos je 1002bp.
Produkty se izolují použitím spin purificatlon cartridge (Qiagen, Crawley.UK) a zředí se na koncentraci 100 ng/pl- Kvantifikace se provede UV absorbancí při 260nm. Nechá se reagovat 500 ng biotinem značené DNA s 10 pl streptavidinem povlečených magnetických částic (Bangs lab, Fishers, USA). Reakce se provádí v silikonem povlečené mikroodstředivkové zkumavce o objemu 500 pl PBS 1% (hmotnost/objem) BSA 10 minut při teplotě místnosti. Po vazbě se částice shromáždí magnetem (Dynal, Bromborough. UK) a promyjí se třkrát PBS obsahující 1¾ BSA.
Po koncovém promytí se zahájí trans lační reakce in vitro přidáním 25 pl T7 Quick spojené transkripční, trans lační směsi (Promega, Southamton, UK) doplněné biotinlysinem tRNA (Promega). Translační reakce probíhá 60 minut při teplotě 30 C, načež se uloží k ledu. Částice se shromáždí magnetem a promyjí se ledově studenou PBS obsahující 1¾ BSA.
V některých pokusech se použije nemagnetických streptavidinových částic v reakcích IVTT (Bangs Labs. Fishers, USA).
V takových případech se částice získají během promývacích cyklů odstředěním.
V některých pokusech se v reakcích IVTT použije barvených streptavidi nových částic, magnetických a nemagnetických (Banks Lab. )
V některých pokusech dochází k detekci translačních produktů vázaných na částicích pomocí protilátek pro epitop bud' Flag nebo his6 zabudovaných do každého modelového genu kon- o
struktů. Inkubace po dobu 60 minut při teplotě 4 C probíhá za mírného míchání. Přidá se sekundární reakční činidlo Canti-myŠí-HRP conjugate) při doporučeném zředění v PBS a inkubuje se dalších 30 minut při teplotě 4 C- Částice se promyjí třikrát 200 pl PBS před vyvoláním barvy chromogenickým substrátem. Reakce se čtou při 492 nm.
Vazební reakce protein-protein se provádějí za použití proteinů IVTT vázaných na povrch částic. V takových pokusech se nemagnetické částice streptavidinu ‘'zachycují vazbou na povrch magnetických částic zprostředkovanou proteinem <fos:jun). Magnetické částice s produktem fos IVTT se mírně smísí s nemagnetickými částicemi s vazbou jun na povrchu. Reakce probíhá ve 100 jul PBS, BSA 30 minut při teplotě místnosti. V kontrolní negativní reakci se smísí nemagnetické částice s Sca proteinem Ca-Ps scAb; Molloy P. a kol.shora) vázané na povrchu s magnetickými částicemi povlečenými produktem fos IVTT. Po inkubaci se částice zachytí magnetem a promyjí se šestkrát v PBS, 1¾ BSA.
Přítomnost zachyceného cílového proteinového genu se potvrdí použitím sekvencování PCR a DNA. K detekci jun modelového genu se při zkoušce PCR použije jun specifických primerů Jun 1 pro-S a Junl46rev. Zkouška se zahájí přidáním objemově 10¾ částic přímo do směsi PCR. Složky a podmínky reakce jsou stejné jako shora. K detekci specifického produktu jun 146bp se použije gelové elektrtoforézy. K detekci fos modelového genu se použije při zkoušce PCR příměrů FoslfS a Fos 155rS. Reakční podmínky a detekce 155bp fos specifického produktu jsou stejné jako shora. K detekci negativního kontrolního proteinu se použije primerů Seqlscab 5 -agatccctactataggta a Seq2scab. K detekci produktu 115bp v proteinovém genu α-Ps scAb se použije 5'- ggtgagct-cgatgtatcc
V uvedených pokusech byly zjištěny produkty Jun PCR po zachycení fos magnetických částic za podmínek, kde nemohly být zjištěny po následující interakci s fos magnetickými částicemi žádné produkty a-Ps scAb PCR.
Příklad 2
V tomto příkladu je vyprodukována jednořetězcová knihovna protilátek obsahující jedinečné peptidové čárové kódy. Standardními způsoby se připraví lymfocytová RNA lidské periferní krve. V podstatě se lymfocity připraví z 10 ml heparinisované krve 16 normálních zdravých dárců. Lymfocyty se shromáždí po odstředění podle gradientu hustoty pomocí prostředku Lymphoprep (Sigma, Poole, UK). Systémem QuickPrep a podle doporučení dodavatele (Pharmacia, St Albans, UK) se připraví RNA. Syntéza cDNA se provede pomocí soupravy cDNA synthesis kit (Pharmacia, St Albans, UK) a statistické hexamerové příměry za podmínek doporučených dodavatelem. Variabilní region (Vh) těžkého řetězce iraunoglobulinu a variabilní regiony lehkých řetězců (VI) se zesílí z cDNA v oddělených směsích PCR pomocí množin primerO určených k maximalizaci repertoáru Vh a VI. Sady příměrů jsou jak shora popsáno (Marks J.D. a kol., Eur.J.Immunol. 21:985, 1991). Reakce Vh a VI PCR se provádějí pomocí 2,6 jednotek Expand™ High F idei i ty PCR enzymové směsi (Boehringer Mannheim, Leues, UK), Expand HF pufr (Boehringer), 1,5 mM chloridu hořečnatého, 200 μΜ deoxynukleotidotrifosfátů (dNTP) (Life Technologies, Paisley, UK) a 25 pmol každé příměrové množiny. Cykly jsou 96 C 5 minut, následuje [95 C 1 minuta, 50 C 1 minuta, 72 Cl minuta] krát 5, [95 C, 45 sekund, 50
C 1 minuta, 72 C 1 minuta, 30 sekund] krát 8, [95 C 45 sekund, 50 C 1 minuta, 72 C 2 minuty] krát 5, s ukončením 72 o
C 5 minut.
V oddělené PCR se zesílí fragment spojovníku tvaru C01y4Ser)3 (Huston J.S. a kol., PNAS 85= str- 5879 až 5883, 1988) z klonované matrice pSVl-ScFvDl.3 (MxcCafferty a kol., Nátuře 348, str. 522 až 554, 1990) pomocí množin primerů popsaných shora (Marks J.D. v Ant-ibody Engineering, vydavatel Borrebaek C.A.K New Vork O.U.P. 1995). Připravený produkt 93bp fragmentu spojovníku se tepelně hybridizuje spolu s ekvimolární směsí produktů Vh a VI PCR. Směs se dále zesílí v protlačovaní (pull through) reakci s použitím lemováních primerů HuVHBACKsfi a HuFORNot, jak podrobně popsal Vaughan a kol. (Vaughan T.J. a kol.,Nátuře Blotech 14^ str.309 až 314, 1996). Všechny fragmenty, použité v protlačovací reakci se izolují od svých počátečních primerů před zavedením do reakce. Izolace se provede pomocí systému Vizard PCR Preps od Promega (Promega, Southampton UK).
Shromážděné množství formy Vh-spojovník-VI se digeruje s restr ikčníuii enzymy Sf i I a Notl (Boehringer) za použití standardních podmínek a izoluje se jak shora uvedeno. Izolovaný fragment se tepelně hybridizuje s adapt-erovou směsí dvojitého syntetického oligonukleotidu určené k zavedení štěpného místa V8 proteázy umístěné vedle traktu náhodné sekvence v rámci s C-koncem genem VI. Tato V8/jedinečná sekvence čárového kódu se získá teplotní hybridizací páru množin syntetického oligonukleotidu tvaru
-ggccgcqaqqaagaqqaaí (atg) (can) (agn) (aan) (gan) (ttn)];>gc-3 a 5 -qqccgc[ (naa) (ntc) (ngt) (nct) (nag) (cat) 12ctccttctcct.cgc-3 Tento spojovník má Notl kompatibilní konce (podtržené) a usnadňuje tudíž začlenění úplné protilátky s jedním řetězcem
V8/fragmentu barcode jedinečné sekvence do Sfil-Notl připraveného fagemidového vektoru pCANTAB 5 (Pharmacia).
Jedinečná sekvence čárového kódu je konstruována ke bránění zavedení stop kodonů a dále aby měla sklon k vylučování kódovaných zbytků s více než dvěma různými kodony. Touto strategií je minimalizován počet specifických oligonukleotidů potřebných k identifikaci daně sekvence dekódovaného peptidů. Kromě toho je jedinečná sekvence čárového kódu schopná kódovat 11 ze 20 aminokyselin. Vedle štěpného místa V8 peptidázy (zbývá šňůra 4-gluatmové kyseliny) je sekvence čárového kódu dlouhá 12 kodonů. Tudíž z repertoáru 11 aminokyselin Cz nichž 10 je zakódovaných jedním z obou kodonů) je schopna zakódovat ll12/2 - ~ l,5xl012 různých peptidů.
Shromážděný fragment sefv CVh-spojovník-VI) se Sfil a Notl připravenými konci se tepelně hybridizují a připojí na adapter Notl sekvenci-čárový kód a znovu se izolují. K experimentům expresujícím lidskou knihovnu scfv fagovým displejem se úplný fragment napojí na Sfil-Notl připravený fagemid vektor pCANTAB 5 CPharmacia) a transformuje se na kompetentní TG1 E-coli.
Při jiných experimentech používajících transkripci in vitro a translaci (IVTT) se shromážděná knihovna scfv subklonuje do Sfil-Notl připravené pCANTAB5-T7. Tento vektor je totožný s komerčně dosažitelným vektorem pCANTABS s tím rozdílem, že je modifikován k zahrnutí sekvence promotoru T7 Cttaatacgactcactata) vloženého do místa HindlII v poloze 2235. Modifikace se dosáhne vazbou dvoupramenného syntetického spojovníku DNA sekvence 5 -agctaatacgactcactata do řezu HindlII a defosforylovaného pCANTABS. Rekombinantní klony obsahující promotér T7 se vybírají podle diagnostiky PCR.
Po navázání a transformaci do kompetentní TG1 E.coli, se buňky nechají růst 1 hodinu v 1 ml media SOC a pak nanáší na
X medium TYE se 100 ug/ml ampicillinu. Kolonie se z destiček seškrabou do 5 ml živného roztoku 2xTY obnsahujícího ampicillin. Vypěstovaná knihovna se pak použije k přípravě DNA pro reakce IVTT.
Knihovny pCANTAB5-T7 Scfv DNA se použije k translační reakci in vitro. IVTT se použitím T7 Quick kopulované transkripční translační (Proroega, Southapton, UK) a 10 pg knihovny PCANTAB5-T7 Scfv DNA v celkovém objemu 50 jul . Translační reako ce se vede při teplotě 30 C 90 minut a směs se umístí na led. V některých experimentech se reakce monitorují na přítomnost t-ranslačních produktů pomocí zkoušek vnášení 35S-meth i on i nu.
a
Reakční směsi se skladují při teplotě -70 C před použitím ve vazebních a vytříďovacích zkouškáchKnihovny jednořetězcových protilátek se použije ve vazební reakci na rekombinantním lidském proteinu p53 (Oncogene Research Products-Calbiochem, Nottingham, UK)- Směs IVTT se zředí desetinásobně v PBS a použije se jí ve vazební zkoušce na lidský rekombinantní protein p53, zmobilizovaný v 96-důlkové mikrodestičce. Protein p53 se imobilizuje přes noc inkubací při koncentraci 100 pg/ml ve fosfátovém pufru při teplotě 4 C. Destičky se omyjí PBS 0,5 Chmotnost k objemu) BSA a přidá se zředěná směs IVTT do kontrolní důlku k vazhě.
o
Vazební reakce trvá 90 minut při teplotě 37 C. Destička se omyje třikrát s použitím PBS-T (PBS+ objemově 0,05¾ tveen 20) a podrobí se digesci V8 proteázoou (Takara, Vokingham, UK). Proteinové fragmenty se shromáždí ze supernatantu a frakcionují se podle velikosti k vyloučení proteázy V8 a ostatních velkých druhů před analýzou MALDI-Tof.
Analysa fragmenů MALDI-Tof identifikuje řadu peptidových fragmentů- Peptidových sekvencí se použije ke konstrukci sady odpovídajících syntetických oligonukleotidů. 01igonukleotidů se použije ve vytriďování na bázi PCR jednoretězcové knihovny.
- 3Z • ·
DNA polymerázy P£u turbo (Stratagene Europe) se použije k syntéze komplementárních kmenů ve členech knihovny DNA lidských jednořetězcových protilátek. Po 15 bězích tepelného cyklování se produkt podrobí DpnI digesci- Tento krok vyčerpá směs parentálních plasmidových molekul k zajištění, že pouze nově syntetizované produkty se projevily. Do kompetentních buněk TG1 se transformuje 1 pl reakční směsi a nanese se na destičky LB obsahující 100 pg/ml ampicillinu. Vyberou se individuální klony, expandují se a připraví se DNA standardními způsoby. DNA se použije přímo ve druhém kole vytříďování, zahrnujícím IVTT, antigenovou vazbu, digesci proteázy VB, MALDI-tof fragmentové analýzy. Po dvou kolech selekce se izoluje 6 scFv', které se vážou na rekombinantní p53.
Příklad 3
Pokusy popsané v tomto příkladu jsou vedeny s použitím Fab expresního vektoru pC5A8-03, jehož konstrukce je dále popsána. Vektor pC5A8-01 je založen na vektoru pLITMUS28 (New England Biolabs. MA, USA), který poskytuje indukovatelný promotér lac a M13 původ replikace. Fab oblast protilátek se shromáždí ze dvou fragmentů DNA kódujících variabilní region (VH) a první konstantní region (CHI) těžkého řetězce a variabilní region (VK) a konstantní region (CK) kappa lehkého řetězce humanizované monoklonální protilátky 5A8 zaměřené proti CD4 (Reimann K.A. a kol., Aids Research and human retroviruses 13,11: str. 933, 1997). Tyto fragmenty byly fúzovány na vůdčí sekvenci pelB (Lei S-P a kol., Journal Bacteriology 169, 9, str. 4379 až 4383, 1987) začleněnou mezi BglII a Bst981 restrikční místa PLITMUS28, jak je popsáno níže. Všechny následující procesy molekulární biologie jsou pracovníkům v oboru běžné a lze je nalézt v literatuře (Moleular Cloning, A Laborartory Manual, vydavatel Sambrook J. Fritsch EF a Maniatis TCold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA). Všechny oligonukleotidy byly syntetizovány Genosy Biotechnolo4 4 4 4 » • · · « ·
44 4
gles Europe Ltd. Cambridge, UK. Pokud není uvedeno jinak, byly restrikční endonukleázy dodány společností Life Technologies, Paisley. UK). Všechny reakce polymerázového řetězce byly provedeny pomocí pfu DNA polymerázy (Promega Southampton, UK).
Ke shromáždění fragmentu lehkého řetězce se zesílí vůdčí sekvence pelB pomocí polymerázové řetězcové reakce CPCR) za použití Hyhaid Touchdown Thermal Cycler, z klonu pPMl-HIS, který obsahuje jednořetězcový proti látkový fragment (scAb) proti Pseudomonas aeruginosa (Molloy P. a kol., Journal of Applied Bacteriology 78, str. 359 až 365, 1995). Tato počáteční reakce se provádí pomocí oligonukleotidů 0L001, které kódují restrikční místo BglII na N-koncové zbytky vůdčí sekvence pelB a sekvence Shine Dalgarno a DL002, která kóduje C-zakončení vůdčí sekvence pelB a N-koncové zbytky lehkého řetězce kappa od pDIVKV3 Cref.). Produkt této reakce se Izoluje od NuSieve GTC agarózy CFlowgen, Lichfield, UK) pomocí VizardR PCR izolační soupravy (Promega UK Ltd., Southampton, UK), denaturuje a použije ve shodě s 0L004, která kóduje spojení variabilních a konstantních regionů lehkého řetězcre kappa, k zesílení variabilního regionu řetězce kappa od klonu pDIVKV3, PCR za použití standardního protokolu. Konstantní region lehkého řetězce kappa se zesílí, PCR, od klonu ρΡΜΙ-HIS (Molloy a kol.) použitím 0L003, která kóduje C-koncové zbytky variabilního regionu a N-koncové zbytky konstantního regionu a 0L005, který kóduje C-koncové zbytky konstantních regionů lehkého řetězce kappa a restrikční místo enzymu EcoRl. Tyto dva fragmenty se postupně zesílí překrytím PCR pomocí 0L001 a 0L005 digerovaných BglII a EcoRl a klonovaných do PLITMUS28 k vytvoření pC5A8-Ol.
Těžký řetězec se shromáždí zesílením vůdčí sekvence pelB od shromážděného lehkého řetězce pomocí 0L006, která kóduje místo EcoRl a sekvenci Shine Dalgarno a 0L007, která kóduje C-koncové zbytky vůdčí sekvence pel Ba N-koncové zbytky těžkého řetězce od pDIVHV4. Produktu této reakce se použije podél ··♦· •V 99·· • · · · ·* · • · · 9 99 * ♦ * ··· · 99 ♦ · 9 99 ·· ·· ««* místa 0L009, které kóduje spojení variabilního a konstantního regionu těžkého řetězce k zesílení variabilního regionu těžkého řetězce lgGl od klonu pDIVHV4. Exon 1 konstantního regionu těžkého řetězce se zesílí PCR z klonu pSVgptHulgGI použitím OLOG8 a 0L010, které kódují C-koncové zbytky variabilních regionů těžkého řetězce a N-konce konstantního řezězce COLOO8) a C-koncové zbytky exonu 1 a restrikční místo pro Sstl COLO1O). Produkt těchto reakcí se zesílí překrytím PCR použitím 0L006 a 0L010 digerovaných EcoRI a SStl a klonuje se do PLITMUS28 obsahující fragmenty lehkého řetězce k získání PC5A8-02.
Přidají se C-koncové zbytky CH1 a C-koncová FLAG přívěsová sekvence (DYKDDDDK) (Knapik A. a Pluckthun A. Biotechniques 17; str. 754 až 761, 1991) použitím OLOU a 0L012, které obsahují restrikční místa EcoICRI a Bs98I k proukci pC5A8-03. Alternativně by mohly tyto přívěsky obsahovat přívěsek 6HIS nebo príměsky MS (viz příklad).
Dále jsou uvedeny oligonukleotidy použité k produkci
PC5A8-0,PC5A8-02 a pC5A8-03
OLOOl; 5’ GGGCAGATCTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGG 3’
OL002; 5’ GGGTCTGGGTCATAACGATATCGGCCATCGCTGGTTGGGCAGC 3’
OL003; 5* GGTACCAAACTGGAGATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCT 3’
OL004; 5’ AGATGGTGCAGCCACAGTCCGTITGATCTCCAGTTTGGTACC 3’
OUJ05; 5’ OATCGAATTCCTAACACTCTCCGCGGTTGAAGCTCTTTG 3'
OL006; 5’ OATCGAATTCTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG 3’
OL007;5* GGACTGAACCAGTTGGACTTCGGCCATCGCTGGTTGGGCAGC 3’
OL008; 5’ ACCCTGGTTACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC 3’
OLOQ9; 5' GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTAACCAGGGTAC 3’
OLOIO; 5’GATCGAGCTCTGCTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC 3’
OLOl 1; 5’ CCCAAATCTTGCGCrGCAGACTACAAAGACGACGACGACAAATAGCrCGAGC 3*
OL012:5’ TTAAGCTCGAGCTATTTGTCGTCGTCGTCTTTGTAGTCTGCAGCGCAAGATTTGGG 3’
Produkce funnkčního Fab je předvedena pomocí ELISA. V podstatě se uvedený vektor transferuje do kmene E-coli DH5« a kultivuje se při teplotě 37 c v přítomnosti 100 pg/ml ampicilllnu a 1 % glukózy až do dosažení ODsoo 0,5. Produkce proteinu se vyvolá přidáním ImM isopropylthio-p-D-galaktosldu
·♦·♦ ··· (IPTG) v nepřítomnosti glukózy. Periplasmická frakce se uvolní osmotickýrn šokem použitím 30mM Tris HCI. 20 % sacharozy, pH 8,0, lmM EDTA následované 5 mM síranu horečnatého (Molloy P. a kol., Journal of Applied Bacteriology 78, str. 359 až 365. 1995) a přidá se přímo na destičku Immulon 4 ELISA (Dynex). která byla před tím povlečena pres noc rozpustným lidským CD4 (Intracel Corp., Isaaquah, VA) při koncentraci lug/ml fosfátem pufrované solanky (PBS), pH 7,4 při teplotě místnosti ve zvlhčovači komoře. Alternativně by mohla být periplasmická frakce uvolněna lyží buněk nebo přísadou lmM EDTA. Žádná specifická vazba se nesníží inkubací destičky 1 hodinu při teplotě místnosti PBS obsahující 0,05¾ Tveen 20, 2 % albuminu hovězího séra (BSA) a 0,05¾ thimerosalu (Sigma) před přidáním rozpustné Fab. Detekce anti-CD4 specifické Fab se provede použitím kozího antlhumánního IgG Fab specifického konjugátu křenové peroxldázy (Sigma,UK), který je sám detekován použitím 5,5 tetramethylbenzidindihydrochlorldu ve fosfát/citrátovém pufru, pH 5,0. Vývoj barviva se ukončí po 30 minutách použitím 0,2N kyseliny sírové a absorbance se monitoruje při 450 nm. Alternativně by mohlo být k detekci použito ABTS/citrátu (Sigma,UK).
K vytvoření knihovny sekvencí CDR3, se do vektoru pC5A8 zavedou jedinečná restrlkční místa olígonukleotldem řízenou mutagenesí (Kunkel T.A., Proč. Nat. Sci. USA, str. 488 až 492, 1985, a Current Protocols in Molecular Biology, vydavatelé Ausubel FM, Brent R., Kinqston RE, Moore DD, Seidmann JG, Smith JA, Struhl K. John Willey & Sons. Inc.) pomocí dále uvedených oligonukleotidfl. Přítomnost restrikčních míst AatlI a HindlII (5' a 3' k LCDR3) a BssHII a SanDI (5' a 3' k HCDR3) lehkého řetězce kappa a těžkého řetězce se potvrdí digescí se příslušnými restrikčními enzymy. Tyto plasmidy, z nichž každý obsahuje přídavné restrlkční místo, jsou označeny pC5A8-04 a PC5A8-07.
OL013; 5’ GAAGACGTCGCTGTTTAC 3’
OL014; 5’ GGTACCAAGCTTGAGATC 3’ OL015; 5’ CTACTGCGCGCGTGAAAAAG 3’ OL016; 5’ GGGTCAGGGGACCCTGG 3’ *
- 3b * ···· • · ·*·
Po digescí pC5A8-07 restrikčních míst AatlI a HindlII se vysoce variabilní zbytky v CDR3 variabilních regionech kappa lehkého řetězcese učiní statistickými použitím směsi degenerovaných oligonukleotidů nesoucích další zbytky Caa 83-88 a aa 97-103) a 10 nukleotidovou pa 1 indromovou sekvenci na svém 3 konci což obklíčí restrickční endonukleázové místo pro Hind-
III. Tyto oligonukleotidy hybridizují na svých 3 koncích a působí pak jako substrát pro polymerázu DNA vedoucí k produkci dvoukmenového homoduplexu. který se digeruje se dvěma restrikčními enzymy a klonuje do digerovaného vektoru pomocí standardních protokolů (Curent. Protocols in Molecular Biology, vydavatelé Ausubel FM, Brent R. , Kingston RE, Moore DD. Seidmann JG. Smith JA, Struh 1 K. Jolin Villey & Sons, lne.). 01 igonukleotidy se připraví tak, že zbytky 91, 92, 93, 94, 95, 95A, 95B a 96 se stanou statistickými zavedením stejných koncentrací každého nukleotidu v každém kroku syntesy oligonukleotldfl (Genosys, Cambridge, UK).
Sekvence mutagenických oligonukleotidů je založena na délce CDR3 deseti zbytků. Zbytky 89 a 90 jsou relativně konzervovány a jsou tedy fixní v tomto příkladu. Zbytky které mají být učiněny nahodilými jsou uvedeny šikmými písmeny. Přídavné knihovny s CDR3 zbytky 6. 7, 8 nebo 9 mohou být také vytvořeny měněním délky náhodného regionu.
Kladný kmen5’ GAÁGAČGTCGCTGnTACTACTGCCAGCAGW5W5^MW5WAMW5AC CTTCGGTGGTGGTACCAAGCTTGG 3’
Negativní kmen;5__ . _______
CCAAGC7ITGGTACCACCACCGAAGGTlS'W6W5,W6W5AW1W1SWCTGCTG GCAGTAGTAAACAGCGACGTCTTC 3’
Na nahodilý je převeden CDR3 těžkého řetězce použitím restrikčních endonukleázových míst BssHII a SanDI a mutagenických níže uvedených oligonukleotidů podobným způsobem, jaký je popsán v předchozím odstavci. V těchto případech zbytky • φ • · ·· φφφφ • ♦ · · φ φ φφ * φφφφ φφφ · φ φ • * · · φφφ ···· φφφ φφ ·· Μ
95-100D jsou převedeny na nahodilé. Zbytky určené k převedení na nahodilé jsou uvedeny šikmými písmeny. Přídavné knihovny CDR3 se zbytky 9, 11 nebo 12 mohou také být vytvořeny měněním délky nahodilého regionu.
Kladný kmen;5 CTACTGCGCGCGTWÁWWyWW^WSW^jWAW^AWyiTCGCTTACTG gggtcaggggacccct
Negativní kmen;5 AGGGGTCCCCTGACCCCAGTAAGCGAAW/^WS/W^AWÍTVY^AWSWSAWSíV· mWACGCGCGCAGTAG 3’
Knihovna ve které těžké i lehké řetězce obsahují nahodilý převedený CDR3 se vyrábějí provedením mutagenese těžkého a lehkého řetězce shora popsaným způsobem.
Ke zvýšení účinnosti výběru pojiv s velkou afinitou se nahradí shora uvedený přívěsek hmotnostním přívěskem FLAG použitím restrikčních endonukleáz Pstl a Xhol. Ke zvětšení knihovny může být dále použito dvou přívěsků. V tomto případě se musejí přívěsky lišit délkou alespoň svou zbytků, aby mohly být rozlišeny po odstranění přívěsků 1 a 2 proteázou jako Factor Xa. 01 igonukleotidy jsou konstruovány s pal indrolnickou sekvencí ve svém 3 konci, který zahrnuje restrikci endonukleázového místa pro Xhol- 01igonukleotidy hybridizují na svých 3 koncích a pak působí jako substrát pro polymerázu DNA vedoucí k produkci dvoukmenového homoduplexu, který je digerován dvěma restrikčními enzymy Pstl a Xhol a klonují se do digestovaného vektoru použitím standardních protokolů (Current Protocols in Molecular Biology, vydavatelé Ausubel FM, Brent R., Kingston RE, Moore DD, Seidmann JG, Smith JA, Struhl K. John Villey & Sons,Inc.).
Jako příklad může být vytvořen přívěsek 8 zbytků použitím oligonukleotIdu 5 NACNCCNGGNTGTKCVAGGNVGNT3'. Délka tohoto přívěsku se zvětší na 11 zbytků jestliže druhý přívěsek 8 zbytků je také zařazen v důsledku začlenění místa pro proteá-
• · ···· zový faktor Xa, což je uvedeno šikmými písmeny. To umožňuje 1dentifikování přívěsku jako přívěsek 1 nebo 2 po jejich odstranění a analýzu hmotnostní spektroskopií.
Samotný přívěsek
| Forvard | 01igo:GCG CTG CAG GAY | GGN | CGN | NAC | NCC | NGG | NTG | TKC ’ | VAG | ||
| GNV CNT | TAG CTC | GAG | CTA 3' | ||||||||
| Reverse | 01lgo;5 | 'tag | CTC GAG i | CTA ANG | BNC | CTB | GMA | CAN | CCN | GGN | |
| GTN CCG | CCC GTC | CTG | CAG CGC 3 | ||||||||
| Dvo jitý | přívěsek; | ||||||||||
| F orvard | 01igo;5 | GCG CTG CAG | Gň¥ | GGN | CGN | NAC | NCC | : NGG | NTG | TKC |
VAG GNV CNT 6’71Y GGN CGN NAC NCC NGG NTG TKC VAG GNV CNT TAG CTC
GAG CTA 3
Reversní 01igo;5'TAG CTC GAG CTA ANG BNC CTB GNA CAN CCN GGN GTN CCG CCC GTC ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCC GTC CTG CAG CGC 3'
Příklad 4
K výběru vazebních činitelů s vysokou afinitou se počáteční knihovna transferuje do E.coli DH5cí elektroporací CBio-rad) a nanese se na L agar obsahující 100 jag/ml ampicillinu a 1 % o glukózy a inkubuje se přes noc při teplotě 37 C. Transformované buňky se shromáždí a použije se jich k naočkování čerstvé lázně L živného roztoku obsahujícího 100 ng/ml ampicillinu.
o Zbytek knihovny se uchová a uskladní se při teplotě -70 C a použije se jako výchozí materiál pro zachování klonů s velkou afinitou, jak je dále popsáno. Nově naočkované kultury se o inkubují 2 hodiny při teplotě 37 C před přidáním isopropylthio-p-D-galaktosidu CIPTG) v konečné koncentraci 0,1 mM. Kulo tury se inkubují další 3 hodiny při teplotě 37 C.
| • · | « 4 | * · | • · | 4 4 4 |
| • | • | • 4 | 4 4 | 4 4 |
| « | • | ♦ · 4 | • 44 | • · 4 |
| • | 4 | • 4 | 4 | • · |
| • 44 4 | t·· | 4» | 4 · | 44 · |
Odstreďuje se 100 ml kultur bakterií, produkujících knihovnu rozpustných Fab, 20 minut při 4000 otáčkách za minutu o při teplotě 4 Ca výsledná peleta se resuspenduje ve fosfátem pilířované solance obsahující 1 mM EDTA. Po 5 až 20-minutovém míchání na ledu EDTA permeabi1izuje vnější membránu a nechá periplasmické obsahy uniknout. Supernatant. se pak vyčerí odstředěním a supernatant se použije v dalších stupních. Využít se dá také alternativních protokolů k vypuštění periplasmických obsahů CMolloy P. a kol.Journal of Applied Bacteriology 78, str. 359 až 365 1995 a Molecular Cloning A Laboratory Manuál, vydavatel Sambrook J. Fritsch E.F., Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. New York, USA).
Periplasmický extrakt obsahující knihovnu Fab se jako aliquot přenese do Nuncimmuno zkumavek, které byly povlečeny přes noc rozpustným lidským CD4 (Intracel Corp. Issaquah, VA) v koncentraci 1 pg/ml ve fosfátem pilířované solance CPBS), pH «ν'
7,4, při teplotě místnosti ve zvlhčovači komoře. Žádné specifické pojivo se neredukovalo inkubací zkumavek 1 hodinu při teplotě místnosti PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20, 2 % albuminu CBSA) hovězího séra a 0,05 % thimerosalu CSigma) před přidáním rozpustné Fab. Po umožnění vazby Fab na antigen CD4 1 hodinu při teplotě místnosti, se nevázaná Fab odloučí vymytím zkumavek 20-krát PBS, 0,05¾ Tweenu 20.
K Identifikaci sekvencí aminokyselin Fab, které zůstanou vázány se hmotnostní přívěsek, se přívěšek odstraní Faktorem Xa s použitím standardních protokolů. Hmotový přívěsek se pak analyzuje MALDI-TOF CMS/MS) spektrometrií při které se stanoví molekulová hmotnost každého přívěsku, pak sekvenční informace získaná analýzou sekundárního ionizačního děje. Kombinací této informace je možno popsat sekvenci aminokyselin přívěsků.
V některých případech může být nutno zvýšit účinnost proteázového štěpení eluováním vázané Fab, neutralizací a izolací
- - ·· * » * φ · •φ·· φ · • · · ·φφ « * · « « φφφ « « ♦
··· ·
- bU Fab od ostatních E.coli proteinů afinitním čištěním s použitím sefarozového sloupce anti-Ck CPierce Warriner, Cheshire, UK) připraveného podle výrobcových instrukcí. Hmotový přívěsek pak může být odstraněn z vazby Fab pomocí Faktoru Xa.
Po identifikaci hmotnostního přívěsku se připraví další dva oligonukleotidy. 01igonukleotid 3 kóduje sekvenci hmotnostního přívěsku, zatímco 5 oligonukleotid je 0L001, který kóduje sekvenci na N-konci Fab.
Pozitivní kmen <;GG GCA GAT CTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA
CAT ATG AAA TAC CTA TTG CCT AGG G 3'
| Negativní kmen 5 ; TAG | CTC | GAG | CTA | ANG | BNC | CTB GMA CAN CCN |
| GGN | GTN | CCG | CCC | GTC | ANG | BNC CTB GMA CAN CCN |
| GGN | GTN | CCG | CCC | GTC | CTG | CAG CGC 3' |
Klon obsahující vazební činidlo s velkou afinitou se zachrání přidáním 10 pl knihovny E.coli k reakci PCR obsahující shora popsané oligonukleotidy. Podmínky potřebné k této reakci se mohou měnit v závislosti na použitých oligonukleotidech. Po zesílení se produkt PCR sekvencuje a pak čistí od agarózy s nízkou teplotou tání, digeruje se AatlI, který je na N-zakončení CDR3 lehkého řetězce kappa a SanDI, který je na Czakončení CDR3 těžkého řetězce ve vektoru pC5A8-07 a transferuje se do vektoru pC5A8-07, který byl digerován se stejnými restrikčními endonukleázami za použití standardního protokolu (Molecular Cloning A Laboratory Manual, vydavatelé Sambrook, J Fritsch EF a Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA) Výsledný plasmid se transferuje do E.coli DH5<z elektropoi'ací s použitím standardního protokolu a uloží o
se při teplotě -70 C. Alternativně by mohl být produkt reakce PCR digerován s řadou alternativních restrikčních endo nukleáz a převeden do alternativních vektorů pro expresi FabDl
| t · | ·· | • | • | a a | w a a | * • a | |
| • | • | • | • | « a | • · | • | |
| * | • | • a | • | ··· | a a | • | a |
| • | ♦ | • | • | • | a | Λ | |
| ···» | aaa | •a |
V některých případech může být obsaženo několik hmotnostních přívěsků po počátečním běhu panelování Cpanning). V tomto případě je knihovna klonů zesílena z uložené knihovny použitím směsi 3 oligonukleotidů. Tato omezená knihovna může pak být podrobena dalším průběhům panelování, vázané klony mohou být znovu analysovány MALDI-TOF a sekvence interních přívěsků použita k vytvoření omezeného repertoáru primerů PCR.
K potvrzení afinity vybraných anti-CD4 specifických Fab, se připraví periplasmické extrakty jak shora popsáno a okamžitě se jich použije v CD4 specifické ELISA. Zdánlivá afinita je kombinací skutečné afinity a koncentrace Fab, proto má být koncentrace Fab ustavena provedením dodatečné zachycené ELISA na tomtéž extraktu, ve kterém křivka standardní koncentrace je vytvořena proti FLAG přívěsku nebo lidské Ck doméně (McGregor DP. Molloy PE, Cunningham C. a Harris VE. J. Molecular Iiumunology 31, str. 216 až 219, 1994).
Příklad 5
V tomto příkladu se modifikuje lidský protein p53 chemickým přívěskem na svém N-zakonČení, štěpí se proteázou peptid s chemickým přívěskem se získá použitím monoklonální protilátky specifické pro přívěsek a peptid se pak analyzuje MALDI-ToF Protein p53 je darem od Dr. Bořka Vojíska (univerzita Brno, Česká republika). Použije se 100 ug proteinu p53 s sukcinimidesterem (methylsulfonyl)ethylkarbonátu podle Mikolajčika a kol. (Bioconjugate Chem. sv 7, str. 150 až 158, 1996) k blokování lysinových bočních řetězců. Blokovaný protein se rozpustí v 1 mg/ml 0.1M pufru hydrogenuhličitanu sodného, pH 8,5, a přidá se NHS-SS-biotin (Pierce, Chester, UK) do konečných 100 ug/ml. Reakce probíhá 6 hodin při teplotě místnosti a je ukončena ethanolaminem. Směs proteinů se pak nechá projítsloupcem Sephadexu (Pharraacia, Milton Keynes, UK) PBS G25 a shromáždí se prázdný objem za použití A280 měření eluátů. De-
eluátu obsahujícího 2 ochladí se na 37
C-hystoliticum,
C 1 náturuje se 40 ul po dobu 5 minut), teinázy Arg-C (od a směs se inkubuje při 37 streptavidinagarosy (Sigma Poole, pává 10 minut, myje se sodného, TrisHCl, pH 0). roztoku trifluoroctová směsi se vloží provede za spectrometry spektra se
Agarosa se peletuje při třikrát pufrem TSO (75 mM
0,5%N-oktylglukosidu, pH8 )
200 mM chloridu sodného,
Nakonec se do promytých kuliček ug p53 teplem (95 C C a přidá se 1 ug endoproCalniochera, Nottingham, UK) hodinu. Pak se přidá 10 ul UK) v PBS a směs se protře16000 g 1 minutu a proTrisHCl, 200 mM chloridu třikrát v TSMK (10 mM mM 2-sulfanylethanolu, přidá 10 ul nasyceného kyseliny v 1¾ vodné směsi (objemově 1=1) a 1 ul této spektrometru. Analysa se Voyager-DE STR BioB i osystems). Hmotová laserových střel a-kyano-4-hydroxyskořicové kysel ina/acetonitri 1 na čip hmotnostního použití Perseptive Biosystems Workstation (Perseptive shromáždí přidánáním spekter z 200
Výsledky ukazují hlavní pík odpovídající 65 aminokyselině
N-koncového Arg-C endoproteázového fragmentu bez žádných vý znamných úrovní ostatních vrcholů p53 Arg-C.
Příklad 6
Opakuje se způsob z příkladu 5 s tou výjimkou, že peptidů biotinového přívěsku na N-zakončení se použije k izolování Fv proti látkového fragmentu s jedním řetězcem z fágem displejové knihovny Fv s jedním řetězcem. Potom se jednořetězcové Fv použije k izolování N-koncového peptidového fragmentu z proteazové dlgesce testovaného proteinu jak, je potvrzeno MALDI-ToF. Extrakt z normálního lidského mozku připravený podle příkladu 4 se konjuguje na KLH podle autorů Harlow a Lané (Antibodies ,1988, Cold Spring Harbor Publications) a použije se ho k imunizaci dvou myší BalbC. Dvě dávky se podají intraperitoneálně v intervalu 4 týdnů. Tři až čtyři dny po druhé inokulaci se myši usmrtí a sleziny se vyříznou. Slezinová příprava mRNA se uo • · ·»····· • · · · » ··· · · · · • · · · · · · · »··· ··· ·· ·· ·· ··♦ pak započne použitím čisticí soupravy Qu ickPrep™mRNA purification kit (Pharmacia) podle instrukcí výrobce.
K připravení knihovny myší jednořetězcové Fv (ScTv) se použije Pharmacía Recombinant Phage Antibody Systém (Pharmacia). První kmen cDNA se získá z mRNA pomocí M-MuLV reversní transkriptázy a nahodilých hexamerových primerů. Těžký a lehký řetězec genů protilátky se zesílí pomocí specifických příměrů s těžkým a lehkým řetězcem doplňkových ke konzervovaným sekvencím obklopujícím variabilní domény protilátky. Separátně se Čistí 340 a 325 základních párových produktů generovaných pro těžký a lehký řetězec DNA po agarové gelové elektroforéze. Produkty se pak shromáždí do jednho ScFv konstruktu použitím DNA spojovník-primerové směsi k získání BVH regionu spojeného s (Gly4Ser)3 peptidem k VL regionu. Shromážděné ScFv se zesílí příměry konstruovanými k začlenění míst Sfil a Not 1 u konců 5 a 3 , což dává 8D0 bp produktu. Tento fragment se uzoluje, postupně se digeruje Sfil a Notl a znovu se izoluje. Fragment se pak váže do fagemidového vektoru Sfil a Notl řezu pCANTABS. PCANTAB5 obsahuje gen kódující protein Phage Gene 3 (g3p) a ScFv se vloží vedle g3 signální sekvence tak, že se expresuje jako g3p fúzní protein. Kompetentní buňky E.coli TG1 se transformují s pCantab 5/ScFv fagemidem a následně infikují pomocným fágem M13K07. Výsledný rekombinantní fág obsahuje DNA kódující geny ScFv a vytvoří jednu nebo více kopií rekombinantní protilátky jako fúzní proteiny na svých koncích.
Fágem displejovaný ScFv, který se váže na peptidy, se pak vybere nebo obohatí panelování. Blotinylováný a proteázou zpracovaný prostředek p53 z příkladu 1 se nanese na streptavidinem povlečené sklíčko (Rádius Biosciences, Valtham, USA) a sklíčko se omyje čtyřikrát PBS. Po blokování netučným 2¾ sušeným mlékem v PBS se fágový prostředek nanese a inkubuje se 1 hodinu. Po 10-násobném promytí TBS/0,05 % Tveenu 20, se detekuje reaktivní rekombinantní fág křenovou peroxidázou časo64 vanou protilátkou anti-M13 a vyvolá se o-fenylendiaminovým chromogenním substrátem. Tyto fágy se eluují 0.1M glycinhydrochloridem, pH 2,2, a lmg/rol BSA a neutralizují se zásadou 2M Tris. Eluovaný fág se zesílí v JM103 pěstovaném v 25 ml J živném roztoku. Provedou se dva běhy panelování a nakonec se izoluje 10 jednotlivých desek spojených a dále zesílených. Podíl 1010 zesíleného fágu se inkubuje 2 hodiny při 4 C s 0,1 ug biotinylováného a endoproteinázového Arg-C digerovaného p-53 v pufru TSO, Po 2 hodinách se přidá 0,5 ug anti-M13 (Pharmacia) v TSO a inkubuje se 1 hodinu, přidá se 5 ul protein A/G agarozy (Sigma) a směs se inkubuje další 0,5 hodin za víření. Agarosové kuličky se pak peletují, promyjí se jako v příkladu 1 a analyzují se hmotnostní spektrometr!íVýsledky ukazují stejný hlavní vrchol jako v příkladu 1 odpovídající 65 aminokyselinovému N-zakončeníu Arg-C endoproteázovému f ragmentu.
Příklad 7
V tomto příkladu se podrobí fragment kódující testovaný protein senzibi1izaci (priming) se syntetickým oligonukleotidem kódujícím polyhistidinový přívěšek. Expresují se cDNA in vitro transkripcí a translací (IVTT) a přivěšené peptidové fragmenty se izolují použitím niklchelátového sloupce. Tyto fragmenty pak slouží k izolování jednoretězcového Fv proti látkového fragmentu. Jednořetězcový Fv se použije k izolování peptidového fragmentu z proteázového digestu testovaného proteinu, jak je potvrzeno hmotnostní spektrometrií.
Příklad 8
Způsob podle příkladu 6 se opakuje za použití přípravy totálního proteinu z buněk a peptidů s chemickým přívěskem se použije k izolování souboru jednořetězcových Fv proti látkových
- «Μ • · <
fragmentů. Směs 12 těchto jednoretězcových Fv' se použije k 1zolaci peptidových fragmentů z proteázového digestu testovaného proteinu a analyzuje se hmotnostní spektrometrií.
Průmyslová využitelnost
Způsoby identifikace a/nebo sekvencování proteinů zvláště vhodné pro vytřídění knihovny protilátek. Použití hmotnostní spektrometrie pro přímé a nepřímé sekvencování. Způsoby izolace specifických proteinů ze složité směsi proteinů pomocí vazby na specifický cílové místo. Způsoby izolace specifických proti látkových domén ze směsi domén odvozených z knihovny genů pomocí vazby na specifický cílovový antigen.
Claims (45)
1. Způsob identifikace proteinu, vytřídění a/nebo sekvencování, při kterém se opatřuj^ knihovny jednotlivých proteinů, z nichž se jeden nebo několik může vázat na sledované cílové místo,vyznačuj ící se tím, že každý jednotlivý protein má ve své sekvenci sekvenci čárového kódu, které se může použít k identifikaci každého jednotlivého proteinu vý kn i hovně.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že individuální čárové kódové sekvence jsou zakódovány jednou nebo několika sekvencemi nukleových kyselin začleněných do genů kódujících jednotlivé proteiny v knihovně-
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že čárová kódová sekvence nebo čárové kódové sekvence jsou lemovány jedním nebo několika rozeznávacími místy pro endoproteázovou digesci.
4- Způsob podle nároku 3,vyznačující se t. í m, že rozeznávací místo je místem pro endopeptidázu, jako je enterokináza nebo Factor Xa.
5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačuj íc í se t. í m, Že knihovna proteinů je uváděna do styku/asoc iace s jedním nebo s několika cílovými podíly, například s cílovými proteiny.
6. Způsob podle nároku 5,vyznačuj ící se t í m, že proteiny a jeden nebo několik cílových podílů se vážou v roztoku.
7.
Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačuj íc í se t í n, že po vazbě jsou komplexy protein/cílový podíl izolovány a následuje digesce s endoproteázou k uvolnění čárové kódové sekvence nebo sekvencí.
8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se t í m, že se čárové kódové sekvence nebo sekvencí použije ke konstrukci jednoho nebo několika syntetických oligonukleotidů, například primerů k získání nebo zesílení jednoho nebo několika genů kódujících proteiny, které se vážou k cílovému podílu.
►
9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že se použije hmotnostní spektrometrie pro stanovení hmotnosti každé uvolněné čárové kódové sekvence, která může okamžitě identifikovat uvolněnou sekvenci nebo sekvence, nebo se použije hmotnostní spektrometrie k přímému určení sekvence kteréhokoli uvolněného čárového kódu.
10. Způsob podle nároku 1 až 9, vyznačující se
t. í m, že knihovnou proteinů je knihovna protilátek.
11- Způsob podle nároku 10,vyznačující se t í m, že knihovnou proteinů je knihovna proti látkových domén, například domén rekombinantní protilátky jako je Fv, který obsahuje proti látkové variabilní regiony.
12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se t t í m, že knihovna obsahuje Fv, sestávající ze dvou řetězců, odvozených z těžkého a z lehkého řetězce VH a VL.
s
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í a, že každý z řetězců VH a VL má vlastní čárovovou kódovou sekvenc i.
14. Způsob podle nároku 10 až 13,vyznačující se t í a, že čárovou kódovou sekvencí je C-zakončení k Fv sekvenci- btJ -
16. Způsob vytříďování proteinové knihovny, vyznačující se tím, že se knihovna vytřiďuje pro jednu nebo několik žádoucích vlastností a dereplikuje se k identifikování jednoho nebo několika proteinů v knihovně majících žádoucí vlastnost.
*
17. Způsob podle nároku 16,vyznačující se t í m, že se knihovna vytřiďuje k nalezení vazby k cílovému podílu.
18. Způsob podle nároku 17,vyznačuj ící se t í m, že se zjišťuje vazba hmotnostní spektrometrií, obzvláště spektrometrií matrix-assisted laser desorption/ionisation t-ime-of-flight. MALDI-ToF.
19.
Způsob podle nároku 16, vyznač u j íc í tím, že se knihovna vytřiďuje k nalezení specifické biologické aktivity.
20. Způsob podle nároku 17 nebo 18, vyznačuj ící se tím, že cílovým místem je komplexní směs molekul, úplných buněk nebo buněčných membrán.
21. Způsob identifikace proteinu, vytříďování a/nebo sekvencování zahrnující poskytnutí knihovny jednotlivých proteinů, z nichž jeden nebo několik se mohou vázat na sledované cílové místo, vyznačující se tím, že každý jednotlivý protein, spolu se svým genem je vázán na přidružující podíl.
22. Způsob podle nároku 21,vyznačující se t. í m, že se knihovna proteinů uvádí do styku s cílovým mís- θ'* • 9
9 9 • ···♦ • 99 *9·· ·· 9 · 9 99 • »99· ·· • 9 9 9 Μ· 99· • 9 9 · ··
999 ·· ···* tem buď před nebo po přidružujícím podílu.
23. Způsob podle nároku 21 nebo 22, vyznačuj íc í se t í m , že po vytvřídění pro vázání na cílové místo je knihovna derepli kována k identifikování jednoho nebo několika proteinů s žádoucí vlastností, proteiny, které se vážou k cílovému místu.
24. Způsob podle nároku 21 až 23, vyznačuj í c í se t í n, že přidružujícím podílem je částice.
25- Způsob podle nároku 24,vyznačující se tím, že částicí je latexová kulička.
26. Způsob podle nároku 21 až 23, vyznačuj í c í se t í m, že přidruŽujícím podílem je protein nebo proteinový komplex.
27. Způsob podle nároku 26,vyznačující se tím, že přidružujícím podílem je avidin nebo steptavidin a každý z proteinů v knihovně a jejích související geny jsou biotinylovány.
28. Způsob podle nároku 21 nebo 22,vyznačuj ící se t í b, že přidružujícím podílem je bispecifická vazební molekula schopná vazby jak na proteiny tak na geny.
29. Způsob podle nároku 21 až 23, vyznaču j íc í se t í b, že přidružujícím podílem je živá buňka nebo buněčný virus, bakterie nebo bakteriofág.
30- Způsob podle nároku 21 až 29, vyznačující se t i m , že jedna nebo jiné molekuly, které mění vlastnosti proteinu v knihovně jsou vázány na přidružující podíl.
31. Způsob podle nároku 21 až 30, vyznaču j íc í se t í n, že geny kódující proteiny v knihovně jsou připojeny k přidružujícímu podílu před syntézou jednotlivých proteinů.
32.
Způsob podle nároku 21 až 31, vyznaču j í c í t í n, že knihovna proteinů je knihovnou proti látkových proteinů například knihovnou proti látkových domén, jako jsou
Fv.
33. Způsob identifikace proteinu a/nebo sekvencování, v yznačující se tím, že se vytváří knihovna jednotlivých proteinů, z nichž jeden nebo několik se mohou vázat na záměrné cílové místo, přičemž každý jednotlivý protein je připojen k individuálnímu kódujícímu podílu.
klad fluorescenční, chemiluminiscenční nebo radioaktivní značky nebo fyzikální význak, jako je jedinečné značení.
36. Způsob analyzování směsi proteinů vyznačuj íc í se t í m, že se
Cíli? digeruje nebo Štěpí proteinové směsi,
Civ) frakcionují se výsledné peptidy a
Cv) analyzují se výsledné peptidy pomocí jejich hmotnosti a/nebo sekvence.
37. Způsob podle nároku 36,vyznaču jící se t. í m, že frakcionace podle stupně C ii) se provádí s použitím knihovny činidel vázajících protein.
38.
Způsob podle nároku 36, vyznaču j íc í
t í n, že výsledné peptidy jsou předmětem fyzické frakcionace a/nebo chemického přivěšování jako součásti frakcionačního stupně.
39. Způsob podle nároku 36,vyznačující se t í m , že se na výsledné peptidy aduje jedna nebo několika aminokyselin jako součást frakcíonačního stupně.
40. Způsob podle nároku 37 až 39, vyznaču j íc í se t í b , že knihovnou činidel vázajících protein je knihovna protilátek nebo proti látkových fragmentů.
Způsob podle nároku 37 až 39, vy jící t í m, že činidly, vázajícími protein, jsou větší histokompatibi1 itni proteiny, receptory T-bunek a přírodní proteiny nebo proteinové domény zapojené do vazebních interakcí protein-protein, jako jsou
SH1 domény.
42. Způsob podle nároku 40 až 41, vyznačuj ící se t í m, že knihovna činidel vázajících protein je preselektována pro vazbu jednoho nebo několika proteinů nebo peptidů odvozených ze směsi proteinů nebo příbuzná právě analyzované proteinové směsi.
43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že proteinová směs je odvozena z knihovny normalizovaných rekombinantních genů.
44. Způsob podle nároku 36 až 43, vyznaču j í c í se t í m, že proteinová směs se napřed váže na pevnou fázi před digescí nebo štěpením buď cestou N nebo C zakončení nebo cestou specifických aminokyselin nebo cestou specifických sekvencí aminokyselin4 ·”♦ • · · • ··· • · ·
• 4 • ··· • ·· • · ·4
4 4*
44444
45. Způsob podle nároku 36 až 43.vyznačuj ící se t í «, že specifické aminokyseliny nebo modifikované aminokyseliny nacházející se v proteinech jsou před vazbou na pevnou fázi derivatizovány, takže k vazbě dochází buď před nebo po di gesci nebo Štěpení proteinové směsi.
46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se t í a , že specifické nebo modifikované aminokyseliny jsou derivatizovány biotinem před vazbou na avidln nebo streptavidin.
47- Způsob podle nároku 45, vyznačující se t í m , že specifické nebo modifikované aminokyseliny jsou derivát Izovány ligandy před vazbou na afinitni reakční činidla specifická pro llgand.
48. Způsob podle nároku 36 až 43, v y z n a č u j í c í se t í m, že specifické přírodně modifikované aminokyseliny v proteinech jsou vázány na pevnou fázi použitím modifikace reakčních činidel se specifickou afinitou, jako je vazba, ke které dochází buď před nebo po digesci nebo Štěpení proteinových směsí.
49. Způsob podle nároku 45 až 48, vyznačuj ící se t í m, že se provádí několik cyklů digesce/štěpení a derivát izace .
frakcionovány pomocí fyzikálních metod jako je HPLC před nebo po frakcionaci používající proteinových vázajících činidel.
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9906551.8A GB9906551D0 (en) | 1999-03-23 | 1999-03-23 | Display of proteins |
| GBGB9907057.5A GB9907057D0 (en) | 1999-03-29 | 1999-03-29 | Protein analysis |
| GBGB9907641.6A GB9907641D0 (en) | 1999-04-06 | 1999-04-06 | Protein analysis |
| GBGB9914874.4A GB9914874D0 (en) | 1999-06-28 | 1999-06-28 | Protein analysis |
| GBGB9915363.7A GB9915363D0 (en) | 1999-07-02 | 1999-07-02 | Protein analysis |
| GBGB9915677.0A GB9915677D0 (en) | 1999-07-06 | 1999-07-06 | Protein analysis |
| GBGB9916511.0A GB9916511D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-07-14 | Protein analysis |
| GBGB9920503.1A GB9920503D0 (en) | 1999-08-31 | 1999-08-31 | Protein analysis |
| GBGB9922285.3A GB9922285D0 (en) | 1999-09-21 | 1999-09-21 | Protein analysis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20013399A3 true CZ20013399A3 (cs) | 2002-01-16 |
Family
ID=27576378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20013399A CZ20013399A3 (cs) | 1999-03-23 | 2000-03-17 | Způsob izolace proteinů a analýzy proteinů, zejména hmotnostní analýzou |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1163519B1 (cs) |
| JP (1) | JP2003536048A (cs) |
| KR (1) | KR20020021779A (cs) |
| CN (1) | CN1344370A (cs) |
| AT (1) | ATE334391T1 (cs) |
| AU (1) | AU772069B2 (cs) |
| BR (1) | BR0009206A (cs) |
| CA (1) | CA2366559C (cs) |
| CZ (1) | CZ20013399A3 (cs) |
| DE (1) | DE60029572T2 (cs) |
| ES (1) | ES2265917T3 (cs) |
| HK (1) | HK1045561A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0200400A3 (cs) |
| MX (1) | MXPA01009567A (cs) |
| NO (1) | NO20014584L (cs) |
| PL (1) | PL350318A1 (cs) |
| SK (1) | SK13242001A3 (cs) |
| WO (1) | WO2000057183A1 (cs) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE0001670D0 (sv) * | 2000-05-04 | 2000-05-04 | Forskarpatent I Syd Ab | Mass-spectrometry-based biosensor |
| WO2002035241A2 (en) * | 2000-10-23 | 2002-05-02 | Altus Biologics Inc. | High throughput screening for protein formulations |
| WO2003052101A1 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-26 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Sample tracking using molecular barcodes |
| EP1504267B1 (de) * | 2002-05-10 | 2007-12-12 | Proteome Factory AG | Festphasenassisitierte spektroskopische und spektrometrische analyse komplexer biopolymergemische |
| EP1361438A1 (de) * | 2002-05-10 | 2003-11-12 | Proteome Factory AG | Festphasenassistierte spektroskopische und spektrometrische Analyse komplexer Peptidgemische |
| DE10227599B4 (de) * | 2002-06-20 | 2005-04-28 | Proteome Factory Ag | Verfahren und Reagenz zur spezifischen Identifizierung und Quantifizierung von einem oder mehreren Proteinen in einer Probe |
| CN1314968C (zh) * | 2004-03-11 | 2007-05-09 | 复旦大学 | 痕量多肽或蛋白质富集及其直接分析方法 |
| US20090136966A1 (en) * | 2005-07-28 | 2009-05-28 | Biosystems International Sas | Normalization of Complex Analyte Mixtures |
| US8148085B2 (en) * | 2006-05-15 | 2012-04-03 | Sea Lane Biotechnologies, Llc | Donor specific antibody libraries |
| US20080014205A1 (en) * | 2006-05-15 | 2008-01-17 | Lawrence Horowitz | Neutralizing Antibodies to Influenza Viruses |
| KR100698466B1 (ko) * | 2006-11-30 | 2007-03-21 | 한국정보통신대학교 산학협력단 | 질량 변화량 목록을 이용한 상향식 단백질 변형 탐색 방법및 프로그램 저장 매체 |
| US8530182B2 (en) * | 2007-12-05 | 2013-09-10 | Centers For Disease Control And Prevention | Viral protein quantification process and vaccine quality control therewith |
| WO2011020247A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | Cyagen Biosciences (Guangzhou) Inc. | Replica barcode selection assay |
| SG178973A1 (en) * | 2009-09-07 | 2012-04-27 | Hoffmann La Roche | Es-ms of glycopeptides for analysis of glycosylation |
| EP2436766A1 (en) * | 2010-09-29 | 2012-04-04 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Means and methods for improved protein interaction screening |
| JP6066924B2 (ja) * | 2010-12-29 | 2017-01-25 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | Ｄｎａ配列のデータ解析法 |
| EP3415619B1 (en) * | 2011-04-28 | 2020-12-16 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Identification of polynucleotides associated with a sample |
| CN102703442A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-10-03 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种检测犬细小病毒的生物条形码及其应用 |
| WO2014071182A1 (en) * | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Directed evolution of synthetic gene cluster |
| WO2015163744A1 (ko) * | 2014-04-25 | 2015-10-29 | 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 | 다수의 단백질-단백질 상호작용 동시 분석을 위한 백터 |
| EP3155426B1 (en) | 2014-06-13 | 2023-07-19 | Immudex ApS | General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules |
| CN105277638A (zh) * | 2014-07-22 | 2016-01-27 | 沈鹤霄 | 一种单克隆抗体IgG质谱测序方法 |
| MX2018000615A (es) | 2015-07-13 | 2018-08-01 | Pivot Bio Inc | Metodos y composiciones para mejorar atributos de plantas. |
| WO2017062412A1 (en) | 2015-10-05 | 2017-04-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Nitrogen fixation using refactored nif clusters |
| CN106855477A (zh) * | 2015-12-09 | 2017-06-16 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于埃德曼降解的蛋白质c-末端肽富集方法 |
| CN105651852A (zh) * | 2016-01-11 | 2016-06-08 | 南昌大学 | 一种利用质谱数据分析蛋白交联位点的方法 |
| JP7120630B2 (ja) | 2016-05-02 | 2022-08-17 | エンコディア， インコーポレイテッド | 核酸エンコーディングを使用した巨大分子解析 |
| CA3041406A1 (en) * | 2016-10-31 | 2018-05-03 | Universitat Zurich | Protein screening and detection method |
| CN110799474B (zh) | 2017-01-12 | 2022-07-26 | 皮沃特生物公司 | 用于改良植物性状的方法及组合物 |
| US11993778B2 (en) | 2017-10-25 | 2024-05-28 | Pivot Bio, Inc. | Methods and compositions for improving engineered microbes that fix nitrogen |
| CA3081441C (en) | 2017-10-31 | 2023-08-29 | Encodia, Inc. | Kits for analysis using nucleic acid encoding and/or label |
| EP3752832A1 (en) * | 2018-02-12 | 2020-12-23 | 10X Genomics, Inc. | Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations |
| GB2607197B (en) * | 2018-06-06 | 2023-04-26 | Bruker Daltonics Gmbh & Co Kg | Targeted protein characterization by mass spectrometry |
| US11963530B2 (en) | 2018-06-27 | 2024-04-23 | Pivot Bio, Inc. | Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes |
| EP3963070A4 (en) | 2019-04-30 | 2023-02-22 | Encodia, Inc. | METHODS OF PREPARATION OF ANALYTES AND RELATED KITS |
| CN114651065A (zh) * | 2019-09-03 | 2022-06-21 | 五松尖端医疗产业振兴财团 | 导入用于提高蛋白质生产性的单个条形码系统的信号肽超高速筛选方法 |
| AU2020382621A1 (en) * | 2019-11-13 | 2022-06-02 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Barcoded XTEN polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same |
| EP4073263A4 (en) | 2020-01-07 | 2023-11-08 | Encodia, Inc. | METHODS FOR FORMING A STABLE COMPLEX AND ASSOCIATED KITS |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2105300C (en) * | 1991-03-01 | 2008-12-23 | Robert C. Ladner | Process for the development of binding mini-proteins |
| JPH09508355A (ja) * | 1993-12-09 | 1997-08-26 | チバ−ガイギー アクチェンゲゼルシャフト | 組合せ化合物ライブラリーの製法 |
-
2000
- 2000-03-17 DE DE60029572T patent/DE60029572T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-17 AT AT00911077T patent/ATE334391T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-17 CA CA2366559A patent/CA2366559C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-17 BR BR0009206-1A patent/BR0009206A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-03-17 MX MXPA01009567A patent/MXPA01009567A/es unknown
- 2000-03-17 CZ CZ20013399A patent/CZ20013399A3/cs unknown
- 2000-03-17 AU AU33073/00A patent/AU772069B2/en not_active Ceased
- 2000-03-17 CN CN00805178A patent/CN1344370A/zh active Pending
- 2000-03-17 WO PCT/GB2000/001015 patent/WO2000057183A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-03-17 JP JP2000607007A patent/JP2003536048A/ja active Pending
- 2000-03-17 PL PL00350318A patent/PL350318A1/xx unknown
- 2000-03-17 EP EP00911077A patent/EP1163519B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-17 HU HU0200400A patent/HUP0200400A3/hu unknown
- 2000-03-17 ES ES00911077T patent/ES2265917T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-17 SK SK1324-2001A patent/SK13242001A3/sk unknown
- 2000-03-17 KR KR1020017012099A patent/KR20020021779A/ko not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-09-21 NO NO20014584A patent/NO20014584L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-09-24 HK HK02106963.8A patent/HK1045561A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE334391T1 (de) | 2006-08-15 |
| AU772069B2 (en) | 2004-04-08 |
| WO2000057183A1 (en) | 2000-09-28 |
| SK13242001A3 (sk) | 2002-09-10 |
| NO20014584D0 (no) | 2001-09-21 |
| HUP0200400A3 (en) | 2006-06-28 |
| KR20020021779A (ko) | 2002-03-22 |
| DE60029572T2 (de) | 2007-07-26 |
| CA2366559C (en) | 2011-03-08 |
| HUP0200400A2 (hu) | 2002-05-29 |
| HK1045561A1 (zh) | 2002-11-29 |
| JP2003536048A (ja) | 2003-12-02 |
| DE60029572D1 (de) | 2006-09-07 |
| BR0009206A (pt) | 2001-12-26 |
| CN1344370A (zh) | 2002-04-10 |
| NO20014584L (no) | 2001-11-19 |
| CA2366559A1 (en) | 2000-09-28 |
| EP1163519A1 (en) | 2001-12-19 |
| ES2265917T3 (es) | 2007-03-01 |
| PL350318A1 (en) | 2002-12-02 |
| EP1163519B1 (en) | 2006-07-26 |
| AU3307300A (en) | 2000-10-09 |
| MXPA01009567A (es) | 2003-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20013399A3 (cs) | Způsob izolace proteinů a analýzy proteinů, zejména hmotnostní analýzou | |
| JP4870667B2 (ja) | 組換えポリクローナルタンパク質またはポリクローナル細胞株を構造上特徴付ける方法 | |
| JP3210342B2 (ja) | 全合成親和性試薬 | |
| US20140256579A1 (en) | Protein Arrays | |
| EP2970952B1 (en) | An integrated system for library construction, affinity binder screening and expression thereof | |
| US20130288900A1 (en) | Combinatorial libraries of conformationally constrained polypeptide sequences | |
| US20050130320A1 (en) | Method for identifying the proteome of cells using an antibody library microarray | |
| EP1996942A1 (en) | Multiplex protein fractionation | |
| US20090233806A1 (en) | Protein isolation and analysis | |
| US10954550B2 (en) | Method and system for screening nanobody | |
| US7351540B1 (en) | Protein isolation and analysis | |
| RU2678421C2 (ru) | Обнаружение антигена-мишени, фенотипический скрининг и его применение для идентификации специфичных эпитопов-мишеней клеток-мишеней | |
| JP7185929B2 (ja) | タンパク質のスクリーニングおよび検出方法 | |
| JP2008515419A (ja) | 抗体ライブラリーをスクリーニングする方法 | |
| US20020090606A1 (en) | Method and specific phage library for high throughput proteomics | |
| AU2004201047A1 (en) | Protein isolation and analysis | |
| RU2777769C2 (ru) | Обнаружение антигена-мишени, фенотипический скрининг и его применение для идентификации специфичных эпитопов-мишеней клеток-мишеней | |
| Nygren | Affinity ligands from biological combinatorial libraries | |
| EA044916B1 (ru) | Способ скрининга и детекции белка |