JP2003536048A - タンパク質の単離および分析 - Google Patents

タンパク質の単離および分析

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Abstract

(57)【要約】 タンパク質の同定および／または配列決定のための新規方法を提供する。これらの方法は、特に直接または間接配列決定のための質量分光技法を使用する好ましい実施形態での抗体ライブラリのスクリーニングに適している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、特に質量分析によるタンパク質の単離および分析に関する。本発明
は、特に、抗体などの結合タンパク質の単離に適用する。本発明はまた、質量分
析および、または遺伝子ライブラリの構成要素によってコードされた特異的タン
パク質の単離を容易にするためのタンパク質またはタンパク質断片の修飾を提供
する。
【０００２】 タンパク質の単離に関し、本発明は特異的標的に対する結合によって、タンパ
ク質の複雑な混合物から特異的なタンパク質を単離する新規方法を提供する。特
に、本発明は特異的標的抗原に結合することによって遺伝子ライブラリから得た
ドメインの混合物から特異的抗体ドメインを単離する方法を提供する。タンパク
質の分析に関し、本発明は特に２種以上の異なる試料のタンパク質を比較してタ
ンパク質の複雑な混合物を分析する新規方法を提供する。
【０００３】 特異的標的との結合によって複合混合物からタンパク質を単離する場合、この
タンパク質の正体やアミノ酸配列が前もって公知でないと、タンパク質を直接特
徴付けるために十分な標的と結合するタンパク質を単離することは通常非常に困
難であった。天然、合成または半合成タンパク質の大きなライブラリから問題の
タンパク質を選択するために、「タンパク質ディスプレイ」法が開発され、それ
によって、タンパク質の回収によって遺伝子のその後の迅速な回収が可能になる
ように物理的に遺伝子とリンクした組換えタンパク質が生成される。このような
方法には、バクテリオファージ（「ファージディスプレイ」）、細菌および酵母
上のディスプレイなどの「ｉｎ−ｖｉｖｏ」ディスプレイ法が含まれ、またリボ
ソーム上のディスプレイ（「リボソームディスプレイ」）などの「ｉｎ ｖｉｖ
ｏ」ディスプレイ法が含まれる。回収された遺伝子は、回収されたタンパク質の
正体を決定するために配列決定され、または回収したタンパク質を再生するため
に使用することができる。遺伝子のライブラリにタンパク質ディスプレイ法を実
施し、それによって（抗体可変領域の）抗原に対する結合など特別な特性につい
てタンパク質が選択される場合、選択操作毎に、回収された遺伝子はこのような
特別な特性を示すタンパク質をコードする遺伝子を多く含むようになる。現在の
「ｉｎ−ｖｉｖｏ」ディスプレイ法の欠点には、ディスプレイされる機能性タン
パク質の量の限界（ファージディスプレイは通常４０ｋＤａ未満のポリペプチド
が限界である）、（組換えタンパク質の機能または結合を妨害する可能性のある
）宿主タンパク質に対する組換えタンパク質の融合が通常必要であること、ディ
スプレイ粒子当たりのディスプレイタンパク質の数を変化させることができない
ことが含まれ、後者はまたリボゾームディスプレイなど「ｉｎ−ｖｉｔｒｏ」デ
ィスプレイ法に伴う問題でもある。さらに、抗原への結合など特別な特性を有す
るタンパク質を選択する方法は、ディスプレイ粒子が小さいために限定され、し
たがって蛍光標示式細胞選別（ＦＡＣＳ）などの方法を容易に使用することがで
きない。したがって、複雑な混合物からのタンパク質の単離を改善する、特に抗
体可変領域（Ｆｖ）の複雑な混合物からのＦｖの単離を改善する新規方法の必要
性ある。そこで、本発明は複雑な混合物からタンパク質を単離する改善された方
法を提供する。特に、本発明は、遺伝子ライブラリから作製したタンパク質ライ
ブラリの使用と、質量分光法の改善、特にマトリックス支援レーザ脱離／イオン
化法飛行時間型質量分析法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄ
ｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ：
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）の改善およびタンデム質量分析法（ＭＳ−ＭＳ）により直
接ＴｏＦ分離ペプチドを配列決定できること、ごく最近は、ＴｏＦとＭＳ／ＭＳ
を１個の装置（Ｑ−ＴｏＦ）に組み合わせられることおよびＨＰＬＣをエレクト
ロンスプレイ（ＥＳ）タンデム質量分析法と組み合わせられることを組み合わせ
る。本発明にはまた、個々のタンパク質が標的との結合の最中または後のいずれ
においても「ディスプレイ」されず、すなわち対応する遺伝子と結合しない複合
体タンパク質混合物から個々のタンパク質をスクリーニングする新規方法が含ま
れる。本発明にはまた、個々のタンパク質も標的も「ディスプレイ」されず、す
なわちその他の分子または構造と結合しない、複合体タンパク質混合物から個々
のタンパク質をスクリーニングする新規方法が含まれる。本発明にはまた、個々
のタンパク質および対応する遺伝子が「会合部分」の添加または包含によって一
緒に結合し、それによってタンパク質は「会合部分」の添加の前後のいずれかに
おいて標的と結合する、複合体タンパク質混合物から個々のタンパク質をスクリ
ーニングする新規方法が含まれる。
【０００４】 したがって、第１の態様では、本発明は、それらの１種または複数が問題とす
る標的と結合することが可能な、個々のタンパク質のライブラリを提供すること
を含む、タンパク質同定、スクリーニングおよび／または配列決定法を提供する
ことであって、個々のタンパク質がその配列に「バーコード」配列を含み、それ
を使用してライブラリ中の個々のタンパク質それぞれを識別することができる方
法を提供する。
【０００５】 本発明のこの態様では、タンパク質、特にＦｖなど組換え抗体領域のライブラ
リが提供され、ライブラリの個々のタンパク質成分には、それらのアミノ酸配列
内に（「バーコード」）配列域が含まれ、これは特異的標的（または、Ｆｖの場
合は「抗原」）に結合したタンパク質（類）を同定するためにその後配列決定す
ることができる。この実施形態は、特にＦｖがヒト遺伝子由来である場合に適用
され、選択されたＦｖはヒトの治療または診断の用途に適する。この特別な適用
においては、Ｆｖの広範な遺伝子ライブラリは、ヒト末梢血Ｂ細胞から得られた
もの、または１箇所または複数箇所でセミランダム化（「コンビナトリアル」）
したＣＤＲ（相補性決定領域）を有するヒト可変領域を使用して合成的に作製し
たプールなどの免疫グロブリンｃＤＮＡプールから得ることが可能である。この
遺伝子ライブラリは、ランダム（またはセミランダム）遺伝子配列がＦｖコード
領域またはこの領域の末端に含まれるような方法で作製される場合、このような
ランダム／セミランダム遺伝子配列は、個々のＦｖに会合したランダム／セミラ
ンダムペプチド配列を生じるであろう。このようなランダム／セミランダム遺伝
子配列は、オリゴヌクレオチドプライマー／ＤＮＡポリメラーゼ伸張またはＰＣ
Ｒなどの標準的な方法を使用して作製され、ランダム／セミランダム合成オリゴ
ヌクレオチド配列は、Ｆｖ遺伝子ライブラリの作製中に免疫グロブリン遺伝子フ
ラグメントを増幅するために使用する１対のプライマーの１つとして使用される
。Ｆｖライブラリの成分が、１本鎖（ペプチドリンカーと結合したＶＨおよびＶ
Ｌ）と対立するものとして２本鎖（すなわち、重鎖および軽鎖由来の鎖（ＶＨお
よびＶＬ））を含む場合、個々のバーコードは、鎖のそれぞれに会合させること
ができる（または鎖の１つだけに会合させることができる）。ライブラリの作製
では、得られたＦｖにはそれぞれ、複合体ライブラリ内からの特別なＦｖまたは
Ｆｖの小さなサブセットに特有の１個または複数の「ペプチドバーコード」を含
む。好ましくは、このペプチドバーコードは、１本鎖Ｆｖ領域までＣ末端、また
はＶＨまたはＶＬまでＣ末端またはその両者であり、それ自身とＦｖ領域との間
に隣接して、１個または複数の、エンテロキナーゼ（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓの後で切断する）、ファクタＸａ（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇの後で切断する）またはその他のエンドペプチダーゼなどプロテア
ーゼ感受性部位を含む。このようなＦｖの混合物が適切な遺伝子ライブラリから
生じる場合、この混合物を、通常固定した標的抗原（または細胞上などの抗原）
と混合する。これによって、標的抗原に対して特異的Ｆｖが結合し、非結合体（
または洗浄の強さに応じ、弱い結合体）が洗浄除去される。過剰な抗体を洗浄除
去した後、残存する抗原／Ｆｖ複合体は通常、導入されたプロテアーゼ感受性部
位を切断するために使用するエンドプロテアーゼによる消化によってＦｖから遊
離させる。この遊離したバーコードペプチドは、直接的、または所望するならば
、後で固定したアビジンまたはストレプトアビジンを捕獲するようにビオチン化
できるシステイン残基など、固相上にペプチドを捕獲させる特異的アミノ酸また
はアミノ酸配列による捕獲の後で、質量分析／質量分析配列決定をする。あるい
は、配列特異的な方法でバーコードに結合する特異的リガンドを使用することを
含めて、他の方法を用いて、Ｆｖ内または遊離後のペプチドバーコードの配列を
決定することができる。結合Ｆｖから得られたバーコードの配列（または部分配
列）を決定して、対応する合成オリゴヌクレオチドを生成し、ライブラリから特
異的Ｆｖを特異的に増幅または強化するために使用する。次いで、これらの特異
的または強化Ｆｖ（またはＶＨおよびＶＬ）遺伝子をさらに使用して、個別にま
たは単離したＦｖ小プールの一部として、抗原結合を再試験することができる対
応するＦｖを生成する。最後に、この方法によって、所望する抗原結合特性、お
よび、ヒト由来の場合は臨床使用への可能性を有する特異的Ｆｖを生成すること
ができる。この態様にはまた、個々のタンパク質またはＦｖに会合した複数のバ
ーコードの使用を含む。たとえば２種のペプチドがプロテアーゼ消化によってそ
れぞれのＦｖから遊離するＦｖのＣ末端にある２種の隣接バーコードを、標的に
結合したＦｖの同一性を高めるため同時に使用すること、または標的に結合する
Ｆｖに対応するＦｖ遺伝子を後で増幅する異なる手段を提供するために異なるプ
ロテアーゼを使用して順番に消化して順番に使用する。この態様にはまた、バー
コード配列全体の相違を増加させて、個々のタンパク質に特異的なコードを提供
するために同時に分析する多数のバーコードの使用が含まれる。この態様にはま
た、個々のタンパク質内、たとえばＦｖの１種または複数のＣＤＲ部位内でのバ
ーコードの使用が含まれる。この態様にはまた、タンパク質：標的混合物のタン
パク質成分、または、さらに標的に固定するために使用するタンパク質剤もまた
消化することが可能なプロテアーゼを使用することが含まれるが、ただし結合し
た試験タンパク質（類）から遊離したバーコードペプチドはまだ他のペプチドの
バックグラウンド内で検出され、かつ配列決定することができる。この態様の好
ましい形式では、バーコードの可溶性Ｆａｂを形成する軽鎖のＣ末端にバーコー
ドの単一領域をもたらし、バーコード配列を使用してＶＨおよびＶＬ遺伝子の両
者にアクセスできるように同時発現するカセットまたはシストロンによってＶＨ
およびＶＬをコードする。このようなＦａｂフラグメントを、発現系、たとえば
Ｍ１３バクテリオファージベクター系の範囲を使用して都合よく生成し、分泌リ
ーダー配列の誘導によって、Ｆａｂの重鎖および軽鎖を宿主細菌のペリプラズマ
間隙に分泌させ、この間隙から集める。合成オリゴヌクレオチドの混合物中でク
ローニングすることによって、フレーム内バーコードを有するこのベクター系を
まず調製する。２種の隣接するバーコードの形成では、これは逐次クローニング
またはオリゴヌクレオチド突然変異誘発によって行われることが便利で、第１混
合バーコードを含むプールしたＭ１３組換え体は第２フレーム内バーコードの連
続クローニングの鋳型として調製される。このバーコードは、エンドヌクレアー
ゼ部位をコードしたタンパク質と隣接し、かつ２個のバーコードの間に含むよう
に設計され、またバーコードの１つに隣接した「スペーサ」領域が他のバーコー
ドより大きな分子量を有するバーコードを含むペプチドを生成するように設計さ
れることが好ましい。隣接したバーコードを設計し、この方法で多数のバーコー
ドを使用することによって、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析によってエンドプ
ロテアーゼ遊離ペプチドの分離量を簡単に分析するオプションが提供され、ペプ
チド配列は推論（またはほとんど推論）でき、したがって合成オリゴヌクレオチ
ドは、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析によって検出されるバーコードを有する特異的タ
ンパク質を単離（または強化）するために設計することができる。このようなこ
れらの配列の推論は、特定のアミノ酸だけがペプチドの１個または２個の箇所に
生じるように配列を設計することによって実現される。たとえば、天然のアミノ
酸２０個のうち１７個（ここではＡ―Ｑで示す）を使用してペプチドを設計する
場合、この配列は、以下のようにペプチド配列に添ったそれぞれの箇所で３個の
アミノ酸のいずれについても選択して設計することが可能である。
【０００６】
【表１】
【０００７】 この設計では、理論的に６５６１個の異なるペプチド配列バーコードがもたら
される。スペーサ領域を有する隣接したバーコードがまた、同じ基礎に基づいて
設計される場合、さらに６５６１個の異なるバーコードがもたらされるだろう。
組み合わせると、これによってこのようなサイズのタンパク質ライブラリの成分
ほとんどに独特に適したタグとなる４×１０7個のバーコード配列が生成される
だろう。さらに隣接したバーコードまたはより長いバーコードを使用すると、た
とえば配列の任意箇所で２個の特異的なアミノ酸を使用すると提供されるバーコ
ードの多様性が増加するだろう（したがって、１９個のアミノ酸を使用して２６
２１４４個の異なるバーコード配列が生成する）。実際には、混合した合成オリ
ゴヌクレオチドの設計中、配列のそれぞれの位置でコドン選択を熟慮することに
よってコドン重複が少なくなる。ＭＳ／ＭＳ配列のための８アミノ酸バーコード
ペプチドのオリゴヌクレオチドの一設計は、次の通りである。
【０００８】
【表２】
【０００９】 特異的なコドンはまた、不連続オリゴヌクレオチド合成によって取り込まれ、
特異的なコドンは以前に合成したオリゴヌクレオチドの別々の混合物に順次添加
される（「コドン突然変異誘発」）。一旦候補バーコード配列がＭＡＬＤＩ−Ｔ
ｏＦまたはＭＳ／ＭＳによって推論され、個々のバーコードの多様性がライブラ
リよりも少ない場合、バーコードを検出するタンパク質をコードした遺伝子を強
化するためにタンパク質またはベクター系から設計された反対のプライマーと相
まって対応する特異的なオリゴヌクレオチド（またはコドン使用における重複が
ある場合はオリゴヌクレオチドの混合物）をＰＣＲプライマーとして使用するこ
とが可能である。隣接したバーコードを使用する場合、第１プライマーから生成
した遺伝子フラグメントに結合している第２プライマーを次に使用して、実際の
検出タンパク質をコードする遺伝子を増加させることができる。必要ならば、前
記の方法は、所望するタンパク質をコードする特異的な遺伝子のオリゴヌクレオ
チドによる増強の特異性を増加させるために、３個以上のバーコードを取り込む
ことができる。本発明の第１の態様には、特異的なタンパク質は、特異的なタン
パク質と会合した、またはコードされた１種または複数のペプチドの質量分析ま
たは配列分析によってこのようなタンパク質のライブラリから回収されるという
根元的な原理を有するいくつかの変法が含まれ、したがって、この態様はペプチ
ド配列のみが決定され、または推論されている所望タンパク質をコードする遺伝
子を単離する際に広く使用できることを当業者等は理解しうる。
【００１０】 当業者等は、本発明の範囲内に第１態様の多くの変法があることを理解するだ
ろう。たとえば、結合に関わるタンパク質それぞれからバーコードを検出するこ
とによって、どのタンパク質が互いに結合するかを決定するためにペプチドバー
コードを結合させるタンパク質の組または群に取り込むことができることを理解
するだろう。複雑な混合物からタンパク質を単離するための他の方法として、Ｄ
ＮＡなど他の高分子と結合するなど、ある種の結合特性を示すこれらの複雑な混
合物内のタンパク質は、この方法を使用して検出することができる。この方法に
は、ペプチドバーコードをタンパク質に添加するための種々の方法が含まれ、タ
ンパク質をコードする遺伝子フラグメント内にバーコードをコードする方法が含
まれる。しかしながら、バーコードは、ペプチドの直接付着によって、このよう
なタンパク質または適切な分子混合物に添加することができる。たとえば、一連
の化学的な方法または光化学的な方法を使用して、特異的なペプチドを特異的な
抗体またはタンパク質に添加することができる。このような方法の一適用は、タ
ンパク質の１つの複合混合物を１つのバーコードで標識し、（または、たとえば
異なるタンパク質特異性を有するバーコードを選択し、）および他のタンパク質
複合混合物、たとえば後で混合する２種の異なる試料の別々のバーコードタンパ
ク質は他のバーコードで標識することである。当業者等は、タンパク質またはそ
の他の分子にペプチドバーコードを添加する原理は、非ペプチドバーコードに適
用することも可能で、このようなバーコードは質量または配列決定方法を使用し
て直接的に識別（またはほとんど識別）することができる。したがって、このバ
ーコードには、タンパク質または核酸を含めた他の分子に付着した核酸バーコー
ドが含まれる。ペプチドバーコードの場合と同じように、このような核酸バーコ
ードは質量分光法によって分析して、質量を正確に推定することができる。この
ようなバーコードは、プロテアーゼの代わりに制限酵素を用いて、タンパク質ま
たは他の分子から遊離することが可能である。
【００１１】 当業者等は、本発明の範囲内に、タンパク質の単離以外に第１態様を適用する
ことを理解されたい。たとえば、生きた生体内でのタンパク質または他のリガン
ドの分布は、生体内の特定の器官に会合するバーコードを質量または配列分析す
ることによって分析することができる。他の分子に特異的に結合したペプチドま
たはタンパク質の分析において、バーコードは、バーコードの質量または配列分
析によって特異性を分析するために、ペプチドまたはタンパク質結合領域の一部
として構築されることが可能である。たとえば、混合したペプチドバーコード配
列は、ＭＨＣ分子の公知のアンカー残基の周りに構築して、次いで特異的ＭＨＣ
分子に結合したペプチドのスペクトルはバーコードの溶出および質量または配列
分析によって測定することができる。
【００１２】 第２態様では、本発明は、１種または複数の所望する特性についてライブラリ
をスクリーニングし、次いで所望する特性を有するライブラリ中の１種または複
数の個々のタンパク質を同定するためにデレプリケーション（ｄｅｒｅｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ）することを含むタンパク質ライブラリのスクリーニング方法を提供
する。
【００１３】 本発明のこの態様は、タンパク質ライブラリ、とくにＦｖなどの組換え抗体の
ライブラリを提供し、このライブラリの個々の成分は、特異的標的に結合するた
めに単離され、ライブラリのタンパク質プールは個別にスクリーニングされ、次
いで陽性プールについては、標的に結合するライブラリ中の個々のタンパク質が
同定されるまで１回または複数回のデレプリケーションを実施する。具体的に、
この態様は、ディスプレイシステムを使用しないで、すなわち、対応する遺伝子
とタンパク質との物理的関与なしに、タンパク質ライブラリをスクリーニングす
ることに関する。この態様では、タンパク質プールは、標的に対する結合につい
てスクリーニングし、この標的はどのプールが結合するタンパク質を含むかを示
すために標識する、または標識せずに検出する。特に好ましい方法は、（タンパ
ク質の標的への結合に影響を及ぼすことが可能な）他の部分へ融合したり付着し
たりしないで溶液中のタンパク質プールをスクリーニングし、次いで、標的を表
し、したがって標的が結合するかどうかを示すイオン化ピークの「指紋」をスク
リーニングするために、特にＭＡＬＤＩ−ＴｏＦによる質量分析の前に（付着し
た標的と共に）総タンパク質プールを沈殿させることである。一旦１種または複
数の陽性結合プールを識別したら、これらを次にデレプリケーションし、プール
の複雑さを軽減したり、または標的への結合剤のスクリーニングのための個々の
タンパク質を分離したりすることができる。実際には、特に好ましいタンパク質
プールの集合方法は、まずこれらのタンパク質をコードする遺伝子のプールを集
めることである。遺伝子が、たとえばプラスミドまたはファージベクターにクロ
ーニングされる場合、個々の細菌コロニーまたはプラークを一緒に混合すること
によって、より便利には、コロニー／プラークのプールを別々の分離寒天プレー
トに（プレート当たり１０００コロニー／プラークなどの密度で）プレーティン
グし、これらのプレートからのコロニー／プラークをこすり取って溶出し、次い
で細菌／ファージ発現法またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳法のいずれかでタン
パク質合成のために使用することによってコロニー／プラークのプールを分離す
ることによって、これらをプールすることができる。同様の方法で、他の微生物
またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成システムをタンパク質合成のために使用することが
できる。この態様にはまた、分子、全細胞または細胞膜の混合物など複合体標的
を使用することが含まれ、この分子標的が、複合体標的内の特異的な分子標的に
結合することで特徴付けられるの質量分析の「指紋」を生じる。この態様にはま
た、標的がタンパク質の場合、標的を示し、かつこのプロテアーゼがまたライブ
ラリから得たペプチド（類）を消化する場合、ライブラリから得た他のペプチド
のバックグラウンド内でさえ検出できるペプチド質量指紋を生成するために、標
的を消化するプロテアーゼを使用することが含まれる。この態様にはまた、異な
る種類の「標的」の範囲および標的に結合すること以外のタンパク質プールまた
は個々のタンパク質を選択する基準が含まれる。たとえば、この態様には、たと
えばタンパク質を生物活性を刺激または阻害する能力について選択する場合、タ
ンパク質選択基準として生物学的アッセイ・システムを使用することが含まれる
。結合アッセイの他の形式には、受容体に対するリガンドの結合阻害および、た
とえば標的が分子、細胞または組織部分である場合、標的のある位置に結合する
タンパク質の選択が含まれる。
【００１４】 第３の態様では、本発明は、１種または複数が問題の標的に結合することが可
能な個々のタンパク質のライブラリであって、個々のタンパク質それぞれが遺伝
子と一緒に「会合部分」に結合するライブラリを提供することを含むタンパク質
の同定および／または配列決定方法を提供する。
【００１５】 本発明の態様は、タンパク質、特にＦｖなどの組換え抗体のライブラリを提供
し、このタンパク質および対応する遺伝子は「会合部分」を添加または包含する
ことによって一緒に結合し、タンパク質またはＦｖは「会合部分」の添加前後い
ずれかに標的に結合する。この会合部分は、会合した対応遺伝子を介して、たと
えばＰＣＲ増幅（または細菌の形質転換などによる他の増幅手段または直接配列
を決定し、この配列を介して次に再生すること）によって、タンパク質またはＦ
ｖの再生成を可能にする目的に役立つ。タンパク質またはＦｖを遺伝子プールと
対応したプールとして再生成させる場合、標的に結合する（または所望によって
は結合しない）タンパク質またはＦｖに会合する遺伝子は、スクリーニングを繰
り返して標的に結合する（対応遺伝子による）特異的なタンパク質またはＦｖを
識別するためにタンパク質またはＦｖの個々の、または小プールの再生として使
用される。
【００１６】 第３の態様の特別な形式では、会合部分が粒子で、組換えタンパク質および対
応する遺伝子が粒子上に一緒に固定され、個々の粒子の回収によって遺伝子およ
び組換えタンパク質をコードする遺伝子の識別がもたらされる。この形式は特に
、組換えタンパク質をコードする遺伝子が対応するタンパク質と同じ粒子上に一
緒に固定されて、したがって（遺伝子を配列決定することによって）選択された
タンパク質の正体を突き止めることが可能で、またはさらに組換えタンパク質を
この遺伝子から生じることが可能であるように、組換えタンパク質の選択におい
て、対応する遺伝子もまた選択される方法に関する。本発明の方法には、通常組
換えタンパク質が結合する粒子上部分の数を制御することによってディスプレイ
されるタンパク質量の制御を準備することが含まれる。本発明には、他のタンパ
ク質またはタンパク質鎖を含み、抗原など組換えタンパク質が結合する分子を含
む、組換えタンパク質と一緒に粒子上に他の分子を共にディスプレイのための用
意が含まれる。
【００１７】 本発明の第３態様の基本的操作において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳ま
たはファージディスプレイなどの方法を使用して、組換えタンパク質が合成され
る遺伝子または遺伝子混合物のアレイが実施され、このようなタンパク質は抗体
可変領域（Ｆｖ）によって例示される。その後、遺伝子および組換えタンパク質
を粒子上に一緒に固定し、１種または複数のリガンドがＤＮＡまたはｍＲＮＡの
ような遺伝子に会合しており、このようなリガンドは粒子上の「受容体」に結合
するようになるか、またはこのようなリガンドは粒子表面と反応して、共有結合
またはイオン性の付着を生じている。あるいは、遺伝子が、天然ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ反応基に対する１種または複数の共有結合またはイオン結合の形成を介して
、直接粒子上に固定される。遺伝子によってコードされた結果得られた組換えタ
ンパク質は、（遺伝子によってコードされた）タンパク質配列タグまたは（ビオ
チニルリジンを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写または翻訳によって取り込まれた
）ビオチン基など１種または複数の会合するリガンド（このようなリガンドはそ
れによって固定ができるタンパク質上の部分である）を有することが可能で、し
たがってそれらはまた粒子表面上の「受容体」に結合するようになっているかま
たは、このようなリガンドは粒子表面と反応して共有結合またはイオン付着を形
成する。遺伝子およびタンパク質上のリガンドは、同一または異なる受容体に固
定した同一または異なるリガンドであることが可能である。本発明のこの態様を
有用に操作するためには、ＤＮＡ、ｍＲＮＡとして、またはファージのような生
きた微生物内の遺伝子または遺伝子プールをアレイ（または多反応管など）に分
配し、組換えタンパク質を（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳または
ファージの増殖によって）このようなアレイに生成する。遺伝子を含んだマスタ
ーアレイを組換えタンパク質を生成する材料源として使用することができ、遺伝
子またはタンパク質の試料を、それぞれの遺伝子またはタンパク質プールのアレ
イ位置が保存されるように、サーバアレイに分配する。この方法を行う前、その
間またはその後に、遺伝子およびタンパク質が結合することのできる受容体を提
供するアレイの各部位に１つまたは複数の粒子を導入する。本発明の変法では、
これらの組換えタンパク質がすぐに同一粒子に固定されるように、遺伝子を開始
時に粒子に付着させ、タンパク質をこれらの遺伝子から直接生成する。組換えタ
ンパク質を粒子に付着する前後に、このタンパク質を任意に修飾、たとえば他の
キナーゼによってリン酸化または他のタンパク質によって結合させる。第３態様
の変法では、このアレイは（通常タンパク質合成の前に小滴を生成し、したがっ
て小滴内に遺伝子をアレイすることによって）遺伝子または生きた微生物が分離
されるエマルジョン油型小滴またはリポソームなど小滴を含む。タンパク質は小
滴内に生成され、次いでこれらは遺伝子を含む粒子に一緒に付着する。小滴の場
合、遺伝子およびタンパク質が一緒に付着した粒子が小滴内に導入されるか、ま
たは粒子が小滴自体であることが可能である。たとえば、リポソームの場合、特
にリポソームの外表面上へのタンパク質の「ディスプレイ」が引き起こされ、タ
ンパク質は、リポソーム膜と結合した親油性タグと共に生成されることが可能で
ある。関連した例では、ミクロソーム膜を反応に導入できる場合にｍＲＮＡのｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用することで、親油性タグを有するタンパク質をその後
小粒子内に分散することができるような膜に組み込むことが可能である。
【００１８】 次に選択過程で粒子をプールすることが望ましい場合、粒子はその後アレイか
ら取り戻して混合する。粒子上の組換えタンパク質はその後、一般に粒子上の選
択されたタンパク質に結合する標的に暴露することによって選択される。ある種
の組換えタンパク質はまた、この段階で修飾することが可能である。選択して修
飾したタンパク質を保持した粒子は、次に種々の方法によって取り戻すことが可
能である。たとえば、標的が蛍光標識で標識されている場合、ＦＡＣＳを使用し
て標的を有する（または有さない）粒子を分離することが可能である。本発明の
第１の主要な態様では、次いでこのような選択粒子上の組換えタンパク質をコー
ドする遺伝子を、たとえば一緒に固定したＤＮＡまたはｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に
よって回収することが可能である。
【００１９】 本発明の第３の態様で使用することができる対応遺伝子とタンパク質を結合さ
せる「会合部分」には多くの種類がある。使用する粒子には、ラテックスおよび
磁性粒子、および合成オリゴヌクレオチドを直接合成した粒子が含まれる。この
ような粒子は、通常合成ポリペプチドが結合できる「受容体」を備えている。そ
の他の会合部分は、遺伝子分子を合成タンパク質に接合させる橋として役立つ単
一の分子または分子複合体であることが可能である。たとえば、遺伝子分子およ
び合成タンパク質はいずれも、その後ストレプトアビジンの添加によって架橋結
合することが可能なビオチン基を含むことが可能で、ストレプトアビジンは会合
部分として働く。同様の方法で、タンパク質上の配列タグおよび遺伝子分子上の
リガンドは、たとえば（配列タグおよびリガンドの両方に結合する）両特異的抗
体または抗体−ストレプトアビジン複合体（この抗体はタンパクまたは遺伝子上
のリガンドに結合し、ストレプトアビジンはタンパクまたは遺伝子上のビオチン
に結合し、いずれもリガンドが付いていない）など両特異的結合試薬を使用して
架橋結合させることができる。他の会合分子は、細菌またはバクテリオファージ
であることが可能で、合成ポリペプチドは細菌またはバクテリオファージ上の特
異的リガンドに結合する。たとえば、特にこれはキャプシドタンパク質と融合し
たファージ頭部上でディスプレイされる場合、Ｍ１３発現系を使用して、Ｅ．ｃ
ｏｌｉでＭ１３自身の特異的タンパク質抗原に結合することができる特異的抗体
のＦｖフラグメントを生成することができる。Ｆｖが結合したＭ１３ファージを
試験することによって、特異的Ｆｖをコードした遺伝子は、Ｍ１３によってコー
ドされたＦｖ遺伝子を配列決定することによって決定することができる。同様に
、Ｍ１３発現系を使用して、Ｍ１３自身にディスプレイした特異的タンパク質に
結合するタンパク質を生成することができる。いずれの場合も、第３態様特有の
特性は、組換えタンパク分子が合成の後で会合部分を介して対応遺伝子に付着す
るようになることである。このような合成後の付着によって、特にたとえば、タ
ンパク質構造を変化させたり、認識または機能を妨害したりする他のタンパク分
子と融合して合成させることを必要としないで、タンパク分子を妨害されずに合
成することが可能になる。
【００２０】 本発明には、会合部分を結合する前に組換えタンパク質を生成するいくつかの
方法が含まれる。これらの方法は特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳による
タンパク質合成、およびプラスミドまたはファージを導入した細菌におけるタン
パク合成が含まれる。後者の場合、本発明は、本発明で生成したタンパク質はそ
の後別々の粒子に固定されるので、生成したタンパク質をファージタンパク質と
融合させる必要がないという利点をもたらす。このようなタンパク質をファージ
表面タンパク質または表面に到達させることが可能なタンパク質に融合させる現
在のタンパク質ファージディスプレイ方法とは対照的に、本発明の第３態様は、
粒子上にその後固定を実施するためにファージの溶解またはファージ頭部からの
組換えタンパク質の分泌または漏出を必要とする。したがって、細菌、酵母また
はさらにほ乳類細胞での発現などタンパク質を生成するためのその他のｉｎ ｖ
ｉｖｏ法はまた、個々のディスプレイ法よりも変化に富むという利点を有し、第
３態様で使用することができる。したがって、組換えタンパク質は、固定前に特
定の宿主によって修飾することが可能で、たとえばほ乳類細胞によってグリコシ
ル化することが可能である。本発明の特に有用な１態様は、特に粒子の場合、粒
子上の「受容体」分子の数を制御することによって、会合部分上の組換えタンパ
ク質の分子数を制御する能力である。したがって、抗体可変領域の場合、個々の
抗体または抗体プールの価は選択基準に応じて変化させることが可能である。さ
らに他の会合部分はそれ自体生きた細胞であることが可能で、組換えタンパク質
が、発現プラスミドを含む細菌またはほ乳類細胞の細胞表面マーカーなどの生き
た細胞の表面上または近くのリガンドに結合するか、または分泌に際して、その
後タンパク質は発現した細胞に結合する。このタンパク質はその後標的と反応す
ることができ、標的に結合する特異的Ｆｖの発現カセットを含む細胞を単離する
ことができる。
【００２１】 第３態様では、本明細書の標的に結合する組換えタンパク質の選択または特定
の処理、たとえば細胞または組織溶解物による処理によって修飾する組換えタン
パク質の選択の特に有用な手段が提供される。したがって、この方法は組換えタ
ンパク質の分子進化に特に有用であることが明らかになり、連続的選択によって
標的に結合する高い親和性など厳密な特性を有するタンパク質だけが確実に回収
される。この方法にはまた、選択した遺伝子を連続突然変異し、進化選択の差異
を最大にすることが含まれる。本発明に基づいて使用することができる多くの変
更が本発明の範囲に含まれることは当業者にとって明らかであろう。たとえば、
遺伝子および組換えタンパク質を捕獲するために使用する会合部分、特に粒子は
それ自体他のポリペプチド鎖を結合しており、タンパク質−タンパク質結合が生
じるとき、組換えタンパク質がこの粒子に直接捕獲さず、すでに粒子上にあるポ
リペプチド鎖に捕獲されることが可能である。次いで、組換えタンパク質上の適
切なタグまたはリガンドを使用して、タンパク質−タンパク質結合事象を検出す
る手段を提供する。同様の方法で、粒子は、その後粒子上に遺伝子を捕獲する手
段として遺伝子とアニールするために使用する合成オリゴヌクレオチドを結合す
ることが可能である。
【００２２】 第４態様では、本発明は、１種または複数が問題の標的に結合することが可能
で、それぞれが個々の「コーディング部分」を付着した個々のタンパク質のライ
ブラリを提供することを含むタンパク質の同定および／または配列決定の方法を
提供する。
【００２３】 本発明のこの態様では、遺伝子ライブラリから合成した組換えタンパク質は、
その後、粒子に付着した組換えタンパク質をコードする遺伝子の識別にコーディ
ングが関与するような方法で、１種またはその他のコーディング方法によって区
別できる粒子などの「コーディング部分」に付着する。組換えタンパク質をコー
ド粒子に固定する場合、組み合えタンパク質は、これらがコード粒子表面上の「
受容体」に結合できるようになるように、タンパク質配列タグまたはビオチン基
など会合した１種または複数のリガンドを有することが可能で、このようなリガ
ンドは粒子表面と反応して共有またはイオン性付着を引き起こす。本発明のこの
態様を操作する際、組換えタンパク質またはタンパク質のプールは大きなアレイ
で合成または分離する。次いで、独自のコードを有する粒子をアレイのそれぞれ
の箇所に導入する。このようなコードには、たとえば、異なる比率の蛍光、化学
ルミネセンスまたは放射活性標識または異なる形状またはマークなど粒子を区別
する異なった物理特性、たとえば粒子にエッチングされたコードまたは独特のマ
ークなどの測定可能なシグナリング部分が含まれる。それぞれの場合において、
個々のコード粒子は互いに区別することができる。本発明で使用される粒子には
、タンパク質が付着できる特性を備えた粒子、複合体または分子が含まれる。粒
子を集め、コード粒子上のタンパク質混合物を特異的標的に結合させた後、元の
アレイ位置、したがって選択した組換えタンパク質をコードした遺伝子のアレイ
座を決定するために選択した粒子のコードを測定することができる。本発明のこ
れらの態様の変法として、粒子上の選択したタンパク質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（
質量分析法）などの方法を使用して、または公知のタンパク質を識別する標識抗
体を使用して直接識別することができる。本発明の第４態様の操作および範囲は
、本発明の前記第３態様と態様および範囲を共有している。
【００２４】 ３５．第５態様では、本発明は （ｉ）タンパク質混合物の消化または切断、 （ｉｉ）得られたペプチドの分画、および得られたペプチドを質量および／ま
たは配列によって分析することを含むタンパク質混合物の分析方法を提供する。
【００２５】 本発明のこの態様は、タンパク質混合物の分析方法に関する。特に、本発明は
、異なる細胞および組織のタンパク質を比較する方法に関する。本発明には、タ
ンパク質混合物の消化または切断、タンパク質結合試薬のライブラリを使用した
ペプチドの分画、および、さらにペプチド画分の質量または配列による分析の組
み合わせが含まれる。本発明には、タンパク質結合試薬による分画に加えて、タ
ンパク質またはペプチドフラグメントの任意の物理的分画が含まれる。ほ乳類細
胞または組織などタンパク質の複合混合物全般を分析する現在の方法は、タンパ
ク質を２次元（２Ｄ）ゲル電気泳動などの技法によって分離することが必要であ
る。この技法によって、細胞性タンパク質は通常電荷に基づいて１方向に、大き
さに基づいてもう１つの方向に分離される。タンパク質は公知のタンパク質の電
気泳動移動パターンを参考にするか、または電気泳動的に分離したスポットから
タンパク質を溶出し、質量分析および核磁気共鳴などの方法によって分析するこ
とによって識別することができる。しかし、２Ｄタンパク質ゲル法の限界には、
細胞からのタンパク質の溶出および検出の限界（一般的に明確に検出されるのは
ほんの５０００個の細胞性タンパク質である）、分離タンパク質の識別の限界（
たとえば、質量分光法は同定のために通常１００ｆｍｏｌｅ以上のタンパク質を
必要とする）、この技法の技術者の能力および非常に高処理タンパク質分析を実
現するための技術の自動化の困難さが含まれる。したがって、特にゲル電気泳動
を使用しない方法および自動化が容易な方法で、タンパク質複合混合物全般を分
析する優れた方法が必要とされている。
【００２６】 第５態様の中心は、タンパク質を小さなペプチドフラグメントに消化または切
断し、次いでタンパク質親和性試薬ライブラリを使用して分画し、次いで特に質
量分光法によって質量分析することである。任意に、タンパク質またはペプチド
フラグメントはタンパク質親和性試薬による分画に加えて物理的に分画すること
が可能で、分画を支援するために１種または複数の「化学的タグ」と結合させる
こともまた可能である。
【００２７】 第５態様の主要な態様では、プロテアーゼまたは化学的方法を用いたタンパク
質の切断、それによって生成したペプチド混合物の分画およびその後の質量分析
が提供される。ペプチドの分画は、タンパク質親和性試薬、特に組換え抗体フラ
グメントのライブラリを使用して実現する。任意に、この方法には、物理的方法
あるいは抗体または固相など特異的な親和性試薬を使用してタンパク質またはペ
プチドをさらに分画し、または化学的反応基などを用いてその後の質量分析のた
めにペプチドまたはペプチドの混合物を単離することが含まれる。タンパク質親
和性試薬を用いて、その後の質量分析のためにペプチド混合物から個々のペプチ
ドまたは一連のペプチドを取り出す。他に、または追加的に、タンパク質親和性
試薬を用いて混合物からペプチドを除去し、その後混合物自体を質量分析するこ
とが可能である。タンパク質親和性試薬は、ペプチドの天然の構成として、また
は切断前後にペプチドに添加された化学的タグとして、ペプチドの特異的配列ま
たは構造によって、または特異的化学基によって結合することができる。
【００２８】 より大きなペプチド混合物の分析では、抗体Ｆｖフラグメントの組換え体ライ
ブラリ（単鎖Ｆｖを含む）によってもたらされたものなどタンパク質親和性試薬
のパネルを、その後の分析のためにペプチドのサブセットを単離するために使用
することが可能である。このようなＦｖのパネルには、たとえば、問題のペプチ
ド試料に対する抗体ライブラリを予備吸収することによって、または問題のペプ
チド試料で動物を免役し、この動物のＢ細胞から組換えＦｖライブラリを作製す
ることによって実現することが可能な広範囲のペプチド特異性が含まれる。ある
いは、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体のパネルを免疫動物から
調製し、ペプチドの分画に使用することができる。次いで、選択した抗体のそれ
ぞれまたは混合物を使用して、試験試料からペプチドの特異的サブセットを単離
（または除去）する。その後の一連のペプチドの質量分析により、試料間の特異
的タンパク質の差異の検出が容易にすることができる。
【００２９】 混合物中のペプチド全てに対する組換えＦｖまたは抗体の作製は困難で、混合
物中のペプチドの数および抗体に合理的な親和性で結合する個々のペプチドの能
力（抗原性）に大きく左右される。非常に大きなペプチド混合物では、重複が限
界となり、同じペプチド特異性を有する抗体が繰り返し現れ、他のペプチド特異
性に対する抗体が不十分であるかまたは存在しない。これは、特定のタンパク質
からのペプチドが抗体に結合しなければ、特定のタンパク質が質量分析されない
原因となる可能性がある。したがって、特に有用な方法は、タンパク質をＮおよ
び／またはＣ末端を介して切断前に固相に予備吸着させることによって、または
切断後単離するためＮおよび／またはＣ末端に化学的タグをつけることによって
、タンパク質からＮまたはＣ末端ペプチド（または両者）を単離することである
。原則として、これによって試料からのタンパク質全てを表すＮおよび／または
Ｃ末端ペプチド全ての回収が導かれよう。このようなＮおよび／またはＣ末端ペ
プチドの単離は、内部アミノ基およびカルボキシル基に比べて、タンパク質中の
Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシル基の異なる反応性のため非常に容易で
ある。このように単離したＮおよび／またはＣ末端ペプチドは、特異的ペプチド
配列を認識するかまたはペプチド上の化学的タグを認識する他の親和性試薬を使
用してさらに分画でき、またはＨＰＬＣなど物理的手段によってさらに分画でき
る。このように単離したＮおよび／またはＣ末端ペプチドは次に、質量分析の前
にタンパク質親和性試薬を使用して分画される。本発明はまた、特にＮまたはＣ
末端がタンパク質／ペプチドの特異的切断によって連続的に露出した場合、タン
パク質／ペプチド混合物に連続的に異なる化学的タグを結合することを可能にし
、ＮまたはＣ末端（または両者）の末端露出部に特異的な化学的タグが結合する
。したがって、本発明のこの態様では、末端に導入された一連の結合化学的タグ
を有する一連のタンパク質画分が提供され、このような画分は、タグに結合する
親和性試薬を使用して単離される。タンパク質分子の末端の化学的タグの代わり
となる特に有用な方法として、化学的タグは、内部ペプチドが内部化学的タグに
よって単離できるように、非末端アミノ酸に特異的に付着することもできる。独
特の化学的性質は、いくつかの特異的なアミノ酸、たとえばリジンのε−アミノ
基、システインのチオール基およびアスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボ
キシル基に対するリガンドの付着に有用である。非末端タグによるペプチド単離
の１つの利点は、タグが付着する特異的アミノ酸を含む可能性が多いより大きな
ペプチドを選択することができ、したがって質量分析の最中に大きなバックグラ
ウンドノイズを伴う低分子質量を上回る質量を有するペプチドを単離することが
できることである。他の利点は、化学的タグ、特にビオチンタグを提供する試薬
をタンパク質またはペプチド上の特異的アミノ酸に導入するためにすでに有用で
ある試薬のアレイである。
【００３０】 第５態様の他の実施形態では、連続タンパク質切断段階およびその後の質量分
析の最中または後で、プロテアーゼまたはタンパク質親和性試薬による分画を伴
う化学的方法を用いる連続タンパク質切断過程を提供する。この場合、タンパク
質混合物の分析は、連続切断過程によって支援され、タンパク質およびペプチド
のスペクトルは、タンパク質親和性試薬で分画され、切断過程それぞれの後で分
析される。この方法にはまた、切断過程の間に質量を増加させるための化学的タ
グを取り付ける過程または質量を減少させるための炭水化物基など側鎖を除去す
る段階を含むことが可能である。次いで、この一連のタンパク質フラグメントの
質量を（化学的タグ取り付け、切断または他の修飾を伴って、または伴わないで
）切断過程それぞれの最後に測定すれば、一連の質量分布がそれぞれの過程につ
いて得られる。適切な一連の質量修飾過程では、単一のタンパク質または混合物
の結果は、連続過程で変化するタンパク質／ペプチドフラグメントの質量スペク
トルである。これらの変化パターンは、混合物中の特異的タンパク質／ペプチド
の「指紋」を提供する。化学的タグ取り付け、切断または他の修飾を伴うか、ま
たは伴わない特異的切断過程に続くある質量の特別なタンパク質／ペプチドフラ
グメントの出現または消失によって、このような指紋のデータベースを参考にし
てフラグメント配列を識別するための指紋がもたらされる。異なる会合試料から
のタンパク質／ペプチドフラグメントのスペクトルを比較すると、これらの試料
の間のタンパク質／ペプチド画分の差異の識別が可能である。本発明のこの態様
において特に有用なのは、２個のアミノ酸を特異的に認識し、結果としてタンパ
ク質を切断するプロテアーゼである。このようなプロテアーゼの例は、二塩基ア
ミノ酸対の間を切断するホルモン前駆体コンバターゼである。したがって、本発
明の第５態様では、タンパク質消化または切断を組合わせて使用したタンパク質
混合物の分析、タンパク質親和性試薬を使用した分画および質量分析の新規方法
が提供される。
【００３１】 第５態様に関連した態様では、タンパク質は切断する前に分画する。大きなタ
ンパク質混合物、特に全細胞または組織から直接単離したものでは、その後切断
、ペプチド分画および質量分析を行う混合物の複雑さを減じるために、タンパク
質を予備画分することが望ましいであろう。タンパク質／ペプチド内の配列また
は構造に直接結合するタンパク質親和性試薬が主として有用である一方、他の、
または追加的なものは、１組のタンパク質親和性試薬によって結合した部分をも
たらす化学的タグのライブラリを使用することである。予備画分のより便利な手
段には、ゲルの部分を切り離して、その後内部のタンパク質を切断し質量分析す
る１または２方向のいずれかのゲル電気泳動を使用することが含まれる。他の予
備画分法には、リン酸化、糖鎖形成、タンパク質−タンパク質（またはペプチド
）相互作用など自然な修飾によるタンパク質の単離が含まれる。あるいは、膜タ
ンパク質または細胞内の特定の区分のタンパク質は予備分画が可能である。他の
重要な予備分画法は、非常に豊富なタンパク質を結合除去する抗体などの親和性
試薬を使用して、このようなタンパク質を混合物からを除去することである。予
備画分の別法として、切断後生じたペプチドはまた、ＨＰＬＣを使用したサイズ
／電荷分画法も含めたこれらの多くの手段によって分画することが可能である。
このような方法は、特にタンパク質親和性試薬を適用して混合物からすでに選択
したペプチドを分画するため有用である。特に、ＨＰＬＣは、ＨＰＬＣ分離から
得られたペプチド画分を直接質量分析できるように、質量分析と接続することが
できる。切断後生じたペプチドはまた、たとえばペプチド内のリン酸化アミノ酸
に結合する抗体を使用した天然の修飾によって分画することができる。タンパク
質の予備分画はまた、その後の切断および質量分析のために特異的タンパク質を
単離するため、モノクローナル／ポリクローナル抗体などタンパク質親和性試薬
を使用することによって実施することが可能である。タンパク質の大きな混合物
のこのような分析では、Ｆｖの組換え体ライブラリによってもたらされたものな
どの抗体ライブラリが、その後の質量分析用にタンパク質のサブセットまたは切
断ペプチドのサブセットを単離するために好ましい。このような抗体ライブラリ
には、広い範囲のタンパク質またはペプチド特異性が含まれるが、問題とする特
別な試料中の問題とするタンパク質／ペプチドに結合するために予備強化するこ
とも可能である。ペプチドでは、試料中の単一または小数のペプチドへの選択的
結合について、個々のＦｖを試験することによって実現することが好ましい。あ
るいは、問題の混合タンパク質／ペプチド試料に対して抗体ライブラリを予備吸
収し、次いでタンパク質またはペプチドのサブセットを単離するために選択した
抗体のそれぞれまたは混合物を使用することによって予備強化を実現することが
可能である。タンパク質親和性試薬は、一連の異なるタンパク質／ペプチド画分
の質量スペクトルを提供し、したがって特異的タンパク質の試料間の差異の検出
を容易にする。
【００３２】 化学的タグを使用する他の利点は、その後の親和性試薬によるペプチドの分画
により、タンパク質分子から選択されるペプチドの数を大幅に減少し、したがっ
て残りの分子を質量分析から排除することができる。選択的にタグを付ける特に
便利な方法は、混合物中のタンパク質のＮおよびＣ末端のいずれか（または両方
）にタグを付け、次いでアミノ酸または（エンドペプチダーゼＡｒｇ−Ｃなど）
配列特異的プロテアーゼなど適切に選択した試薬または（Ａｓｐ−Ｐｒｏで切断
する酸性ｐＨなど）切断試薬でタンパク質分子を消化または切断することである
。親和性試薬を使用して、次いで元のタンパク質からＮまたはＣ末端ペプチド（
またはその両者）を単離し、内部ペプチドを全て廃棄することができる。したが
って、このような複雑さを減少させることは、特にタンデム質量分光法を連結し
たＨＰＬＣを使用した質量分析に十分で、混合物から個々のペプチドを識別する
ためにペプチド全般が分析できる。
【００３３】 あるいは、化学的タグの取り付けは、たとえば２塩基切断剤、ホルモン前駆体
コンバターゼで消化／切断の後のみに実施することができる。これによって元の
タンパク質の１個または複数の内部部位にだけタグがもたらされる。次にタンパ
ク質混合物に異なる酵素または切断試薬で第２の消化／切断段階を実施するなら
ば、タグを付けたペプチドの大きさは、切断部位が元のタンパク質に存在するよ
うに減少させる。その後タグの付いたペプチドをタンパク質親和性試薬を使用し
て分画し、質量分析を行う。
【００３４】 第５態様の他の実施形態では、タンパク質混合物にタグ付け、消化／切断およ
び質量分析の過程を行い、タンパク質親和性試薬による分画および質量分析を、
特異的化学的タグを結合した親和性試薬を使用することによって得られた混合物
の一部だけに実施し、主たる混合物は次に異なる化学的タグでタグ付けし、消化
／切断を行う。これによって、一連の異なるフラグメントが連続してもたらされ
る。この方法の他の変法には、前記と同様であるが、切断後新しいＮおよびＣ末
端を暴露する初期段階が含まれ、これらの新しい末端の１個（または両方）は、
その後任意に元のタンパク質では内部部位にタグ付けする異なった化学物質でタ
グ付けされることが可能である。必要であれば、このプロセスは異なるプロテア
ーゼまたは切断試薬で１回または複数回繰り返し、毎回異なる化学的タグをＮま
たはＣ末端に添加することが可能である。この方法の一形式では、まず、タンパ
ク質の全混合物のＮおよびＣ末端それぞれに２種の異なる化学的基をタグ付けし
、次いで特異的アミノ酸の近隣で特異的に切断するものなどのプロテアーゼで切
断し、新しいＮおよびＣ末端にさらに他の２種の化学的基を再びタグ付けする。
これによって、それぞれが末端に化学的タグを有するペプチド混合物が生じる。
ＮおよびＣ末端ペプチドが特異的タグを有するので、次いで適切な親和性試薬を
使用して混合物からこれらを単離することができる。最初のＮまたはＣ末端タグ
のいずれも有さない内部ペプチドは、特異的タグを使用して単離することができ
る。次いで、消化およびタグ付けの方法を繰り返して、さらにタグを有するペプ
チドを生成することができる。特異的タグに親和性試薬を特異的に組み合わせて
使用すると、元のタンパク質からＮまたはＣ末端または特異的内部ペプチドを単
離し、選択したペプチドを廃棄して複雑さの軽減を実現することができる。化学
的タグをペプチド内の２個以上のアミノ酸に添加する場合、親和性タグを連続使
用することによって、アミノ酸の特異的組み合わせを含んだペプチド画分を単離
することができる。たとえば、平均長２０アミノ酸で、リジンおよびフェニルア
ラニンで別々にタグ付けされたペプチド混合物で、この混合物がリジンもフェニ
ルアラニンも有さないペプチド２５％、リジンだけ有するもの２５％、フェニル
アラニンだけを有するもの２５％、両者を有するもの２５％を含む場合、リジン
またはフェニルアラニンに特異的な親和性試薬を別々に、または連続的に使用す
ると、ペプチドは４つの等しい画分に分画される。実際には、これらのペプチド
は１種または複数の特異的なタグ付きアミノ酸を含みやすいので、このような分
画スキームは、より大きなペプチドの親和性試薬への結合に好ましい。これは、
分子量１０００ダルトン未満を有するものなど非常に小さいペプチドには不利で
、質量分光分析を行うとき、断片化したペプチドおよびその他の小さな分子によ
ってバックグラウンドのノイズが同時に生じやすい。
【００３５】 複雑なタンパク質混合物の分析に、ほ乳類細胞または組織が必要な場合、本発
明はタンパク質親和性試薬を切断の前後に使用してタンパク質を切断し、次いで
ペプチドを質量分析する主な方法を提供する。タンパク質またはペプチドの複雑
な混合物の分画には、複雑な混合物に応じたタンパク質親和性試薬が必要で、分
画に基づいたタンパク質／ペプチドの特性を認識できる１種または複数の追加的
親和性試薬で補助することができる。切断を分画まえに実施する場合、本発明に
使用するもっとも一般的な方法は、トリプシンまたはＶ８（Ｇｌｕ−Ｃ）プロテ
アーゼなどプロテアーゼでタンパク質混合物全体を切断し、次いである種のペプ
チドを選択的に単離し、質量分析することである。通常、ペプチド混合物からの
ＮまたはＣ末端ペプチド（またはその両方）は、一般的に切断前にタンパク質の
Ｎおよび／またはＣ末端に化学的タグを添加し、化学的タグを有するペプチドを
単離する親和性試薬を使用することによって単離される。あるいは、特異的ペプ
チド（Ｎ／Ｃ末端であろうとなかろうと）は、特異的タンパク質内の特異的ペプ
チドに結合するために選択され、親和性試薬を使用して単離することができ、次
いでこれらは混合物からこのようなペプチドを選択する。もっと複雑なタンパク
質混合物では、大きさ、電荷または疎水性に基づいたＨＰＬＣ分画などさらなる
分画段階を質量分析の前に、特に質量分析に接続できるように行うことが好まし
い。次いで、ペプチドの選択的単離によって、他のタンパク質混合物から得た特
異的ペプチドの（それぞれの混合物中のタンパク質の相対濃度に関する）相対量
および、ある種の場合では、ペプチド修飾を比較分析することが可能になる。
【００３６】 ＮまたはＣ末端ペプチドの分画では、タンパク質親和性試薬の調製および使用
は、本発明の重要な態様であり、タンパク質のＮまたはＣ末端の標識は他の重要
な態様である。ほ乳類細胞または組織または多くの生体からの一般的なタンパク
質混合物では、末端への化学的タグの添加を阻止できるように、これらのタンパ
ク質のＮ末端（およびいくつかのＣ末端）のいくつかは（たとえば、メチル化に
よって）修飾される。さらに、ほ乳類細胞または組織、または多くの生体からの
一般的なタンパク質混合物、このタンパク質は、通常確実に非常に豊富なタンパ
ク質を含む豊富さの相対レベルが異なって生じる。ほ乳類細胞または組織または
多くの生体からのタンパク質混合物をタンパク質親和性試薬の初期選択に使用す
る場合、このような非常に豊富なタンパク質は親和性試薬によって優位に選択さ
れることが可能で、質量分析用の最終的ペプチド混合物で優位を占めることが可
能である。これらの両問題の解決には、親和性試薬を単離するために人工の混合
タンパク質源を使用することである。一般に、これは遺伝子発現系であり、遺伝
子（通常ｃＤＮＡ）ライブラリを使用して、ＮまたはＣ末端修飾のないタンパク
質を生成する。さらに、遺伝子発現系を使用すると、遺伝子ライブラリが「標準
化」されてライブラリ内の非常に豊富な遺伝子が減少または除去される。これは
、一般にライブラリの構築の前にＤＮＡ（またはＲＮＡ）を自己アニーリングす
ることによって実現される。したがって、本発明の通常の方法は、（通常、標準
化された）遺伝子ライブラリを発現することよってタンパク質を生成することで
、その結果著しいＮまたはＣ末端修飾のないタンパク質が得られ、標準化されて
いる場合は、特異的タンパク質によって支配されないタンパク質混合物が得られ
る。遺伝子ライブラリに使用する一般的な発現系は、真核性リボゾーム調製物を
使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳である。これによってまた、発現した
タンパク質に修飾したアミノ酸が取り込まれる可能性がもたらされる。発現した
タンパク質混合物を、次に直接ＮまたはＣ末端標識に使用することができる。Ｎ
末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基が修飾されず、その後の化学的タグ付
けから保護されない場合、他の発現系もまた使用することができる。修飾が生じ
る場合、場合によってはＮ末端修飾を、ヒストン脱アセチラーゼなど酵素を使用
するか、または限定臭化シアン切断など化学的方法を用いて除去し、Ｎ末端メチ
オニンを除去することができる。
【００３７】 Ｎ／Ｃ末端修飾のないタンパク質混合物を生成し、次いで化学的タグをこのＮ
／Ｃ末端アミノ基に添加することができる。Ｎ末端では、リジンのεアミノ基を
シトラコン酸無水物またはメチルａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅなど試薬を用いて最初
に保護し、次いでＮ末端アミノ基だけを反応させることができる。あるいは、リ
ジンのεアミノ基は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳など発現系に修飾リジンを取
り込み、たとえばビオチン修飾リジンは直接リジンの代わりに取り込ませて保護
することができる。次いで、化学的タグを、たとえば親和性試薬が有用な特異的
分子のイソチオシアネートを使用して、選択的にタンパク質のＮ末端に添加する
ことができる。このような１例には、タンパク質とフルオレセインイソチオシア
ネートとの反応によって取り込まれ、その後抗フルオレセイン抗体で生成するこ
とが可能なフルオレセインがある。あるいは、ポリカルボン酸キレート剤は、イ
ソチオシアネートとして取り込まれ、その後特異的金属で精製することが可能で
ある。混合物中のタンパク質のＮおよび／またはＣ末端が一旦タグ付けされると
、タンパク質はその後総合的かつ特異的に、トリプシンなどプロテアーゼまたは
他の切断剤を用いて、化学的または酵素的に切断される。このような切断によっ
て、それぞれのタンパク質から個々のタグの付いた末端ペプチドフラグメントが
遊離し、このようなフラグメントを集めて、次いで化学的タグに特異的な抗体な
ど適切な親和性試薬を使用してタグの付いていないペプチドの混合物から精製す
ることができる。必要であれば、化学的タグの大きさは、分析のためにより大き
な質量を生成するために増加させることができる。このことは、化学的タグの極
近隣で切断して得られたペプチドフラグメントで、得られたフラグメントが低分
子量「ノイズ」内で質量分析されるほど小さい場合に有用である。たとえば、こ
の化学タグは、核酸の合成中に導入された反応基によってペプチドに付着した核
酸の断片を含む。このような核酸分子はまた、核酸を相補的配列にアニールする
ことによってタグの付いたペプチドを単離するために有用である。
【００３８】 化学的タグ付けおよび単離に続いて、回収されたＮ／Ｃ末端ペプチドの混合物
は、その後ほ乳類細胞または組織または他の生体から直接得られたタンパク質か
らのこれらと同じペプチドに結合するタンパク質親和性試薬の単離のための「餌
」として使用される。このような親和性試薬は、一般に抗体をコードする対応遺
伝子を含む粒子の一部としてディスプレイした組換えＦｖのライブラリから得ら
れる。このような粒子の例は、リボゾームディスプレイ粒子またはファージディ
スプレイ粒子であり、いずれの場合も特定の抗体を増殖させるために選択した抗
体から遺伝子を取り出すことができる。別法として、（組換え１本鎖またはＦａ
ｂ、Ｆｖなど）抗体の大きなアレイを、Ｎ／Ｃ末端ペプチド混合物を使用してス
クリーニングすることができ、ペプチドに結合してディスプレイする抗体を対応
遺伝子によって回収することができる。さらに他の別法として、Ｎおよび／また
はＣ末端ペプチドを使用して、動物を適切に免疫化することによって直接ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体を生成することができる。これらの手段によ
って、ほ乳類細胞または組織またはその他の生体からなどのタンパク質混合物の
分析に使用することができるタンパク質親和性試薬のライブラリを選択する。こ
のような分析には、ほ乳類細胞または組織またはその他の生体から得られたタン
パク質からＮ／Ｃ末端ペプチドを選択するために親和性試薬のライブラリを使用
すること、または個々のペプチドを選択するために個々の親和性試薬を使用する
ことのいずれかが含まれることが可能である。その後選択されたペプチドは、一
般にＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間型）
によって質量分析することが可能で、個々のペプチドは個々の電荷：質量比を与
え、次いでペプチドアミノ酸組成の識別に使用することができる。ＭＳ−ＭＳ（
２重質量分光法）ペプチド配列決定は、連続的に使用して、単離できるならば、
ペプチドを識別することができる。あるいは、新しいＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｔ
ｏＦ ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ（「Ｑ−ＴｏＦ」）装置の作製によって、同一装置内で
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦおよびＭＳ−ＭＳを連続して提供することができる。実際に
、個別のまたは混合物中のタンパク質親和性試薬は直接的または間接的にＭＡＬ
ＤＩ−ＴｏＦ装置に挿入された脱離チップに固定することができ、ペプチドはチ
ップ上の親和性試薬にその後結合することができる。この方法では、異なる座の
多数の親和性試薬によって吸着した多数のペプチド画分を１本のチップで分析す
ることができる。タンパク質親和性試薬を単離するための「餌」としての組換え
タンパク質の使用によってまた、これらのタンパク質に他のタグに付着すること
が期待され、このタグは遺伝子配列によってコードされており、たとえば（その
後ニッケルキレートを使用してタグの付いたフラグメントを精製することが可能
になる）Ｃ末端ポリヒスチジンタグは、たとえばＰＣＲ媒介取り込みによって遺
伝子配列に取り込ませることができる。
【００３９】 組換えタンパク質をタンパク質親和性試薬の単離のための「餌」として使用す
ることはまた、組換えタンパク質によってコードされたタグを使用したペプチド
を特異的に単離する本発明の第５態様の他の通常方法となる。このようなタグは
、このようなタグをコードする特異的ＰＣＲプライマーを使用して構築中に遺伝
子（通常ｃＤＮＡ）ライブラリの成分、または個々のクローンまたはそれらのク
ローン群に有利に取り込まれることができ、得られた発現タンパク質にこのよう
なタグを取り込むように設計することができる。このようなタグは、タグタンパ
ク質を豊富に生産するためにリーディングフレーム全ての中に発現したタンパク
質に取り込むことが好ましい。このようなタグは、ＰＣＲ反応の下流プライマー
によって取り込まれることが好ましく、（クローンによっては上流の終末コドン
はこれを妨害すること可能性があるが）通常の結果ではタグは発現タンパク質の
Ｃ末端に生成される。しかしながら、タグはまた、Ｎ末端またはＮおよびＣ末端
の両者に取り込まれることが可能である。
【００４０】 ペプチド混合物から特異的なペプチドを単離するために、ペプチド配列を合成
（または組換えＤＮＡ）によって生成し、次いで、前記のように、特異的タンパ
ク質親和性試薬を捕獲する「餌」として使用することができる。次いで、これら
の親和性試薬を使用して、たとえばほ乳類細胞または組織、またはその他の生体
から得られた切断タンパク質混合物からこれらと同様のペプチドを単離すること
ができる。
【００４１】 ＮまたはＣ末端ペプチドまたは特異的内部ペプチドを選択的に分画する別法と
しては、リン酸化アミノ酸（チロシン、トレオニンまたはセリンまたはそれらの
組み合わせ）に特異的に結合する抗体を使用して、あるいは負に荷電したペプチ
ドを捕らえるために固定したＦｅ3 +を使用して単離することができるリン酸化ア
ミノ酸を含むペプチドなどペプチドを修飾する。同様に、単離を容易にするため
にペプチド修飾をさらに誘導した場合、糖鎖形成および他の修飾によって修飾さ
れたペプチドを単離できる。たとえば炭化水素は、フルオレセインなど化学的タ
グを添加するための中間体として、過ヨウ素酸反応によって容易に修飾されるこ
とが可能である。本発明の特に重要な態様は、選択的に修飾したペプチドの分画
であり、このようなペプチドは、切断前に元のタンパク質環境内でタグに対して
異なって暴露することによって選択的にタグ付けされる。たとえば、生細胞上の
表面露出タンパク質は、細胞を特異的なアミノ基と優先的に反応するタグ付け剤
と反応させることによって、たとえばビオチンで選択的にタグ付けすることがで
きる。他の刺激によって自然に細胞内でタグ付けされるタンパク質でこのような
タグ付けを実施する間接的な方法は、タンパク質のタグ付けを実施するためにこ
のような刺激を細胞に与えることである。たとえば、細胞内の受容体会合チロシ
ンキナーゼ分子は、細胞に受容体リガンドを添加することによってタグ付け（た
とえば、リン酸化）される可能性がある。修飾後、ペプチドは切断によってタン
パク質から切断され、その後直接質量分析するか、または質量分析の前に前記の
ようにタンパク質親和性試薬で分画を行う。
【００４２】 本発明によるタンパク質およびペプチドの質量分析は、質量分光計を使用して
実施することが好ましい。特に、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析は、個々のペプチドの
特異的質量：電荷比を非常に正確に測定する性能を有する。この方法は、ペプチ
ドが数千個の場合、同時分析することが可能である。４ｋＤを上回ると、個々の
ペプチド（およびタンパク質）の解像度は悪くなり、したがって良好な解像度を
実現するためにはタンパク質のペプチドフラグメントへの切断が必要である。（
ＨＰＬＣなど）液体クロマトグラフィ分離法をタンデム質量分光計法と接続する
最近の方法によって、すでに２００個までのタンパク質を含むタンパク質混合物
の質量分析が可能になっている。このようなタンパク質はプロテアーゼ消化後分
析されるので、タンパク質当たり平均１０個のペプチドがあると仮定すると、こ
の方法は２０００個のペプチドを分析できる。本発明の方法を使用して、たとえ
ば、Ｎ末端だけタグ付けしたペプチドを分析すると、２０００個までのタンパク
質から得られた２０００個のＮ末端ペプチドを同時に分析することができる。こ
れは、細胞から得られたほ乳類タンパク質（一般的に細胞当たり５００００個）
の全般的な分析に十分な感度ではないので、これらの画分全てを分析するために
はペプチドを少なくとも２５画分に分離しなければならない。このようなさらな
る分画は、タンパク質親和性試薬の選択ライブラリを直接使用するか、または連
続タンパク質消化／切断の段階後、標識内部末端に試薬を使用し、次に特異的タ
ンパク質親和性試薬を使用してタグによってペプチドを分画して実施することが
できる。標準質量分光法の別法として、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦを使用して、異なる
細胞のタンパク質混合物と比較することが可能なタンパク質質量特性を掴むこと
ができる。
【００４３】 化学的タグは、タンパク質に通常ＮまたはＣ末端で共有的に付着することが可
能な一般的な部分である。Ｎ末端の化学的タグ付けは、通常末端アミン基に実施
される。リジンのεアミノ基にタグが付くことを回避する必要がある場合は、シ
トラコン酸無水物またはメチルアセチミデートなどの試薬を使用して最初に保護
することが可能である。次いで、末端アミノ基を広範囲の化学試薬、特にイソチ
オシアネートを使用して反応させる。これによって、ジニトロフェノールおよび
フルオレセインなどの通常の抗体認識リガンドがこれらのＮ末端に付着し、その
後抗体親和性試薬を使用して分画することができる。たとえば、通常使用される
エドマン試薬、フェニルイソチオシアネートを使用して、特異的にタンパク質の
Ｎ末端に付着させ、必要ならば、その後親和性試薬と結合させるために部分を誘
導化することができる。Ｃ末端の化学的タグを付ける場合は、通常カルボジイミ
ド活性化に基づく方法を使用して、親和性試薬によって結合したリガンドを導入
する。あるいは、タンパク質のＣ末端への部分の添加は、タンパク質分解逆反応
を使用することが記載されており、カルボキシペプチダーゼＹおよびリシルエン
ドペプチダーゼなどある種のプロテアーゼは、親和性試薬と結合するためのタグ
を備えた誘導アミノ酸としてのアミノ酸によって、または親和性試薬によって特
異的に結合することができる自然配列アミノ酸によって、逆に作用して化学的タ
グを添加することができる。広範囲の内部アミノ酸はまた、ε−アミノ酸による
Ｌｙｓ、カルボキシル基によるＧｌｕ／Ａｓｐ、チオール基によるＣｙｓ、ヒド
ロキシル基によるＳｅｒ／Ｔｈｒおよびヒドロキシフェニル基によるＴｙｒを含
めて、化学的にタグを付けることができることが認識されるべきである。ほとん
どの他のアミノ酸の特異的な誘導体化は記載されている。翻訳後のタンパク質修
飾を、特に、糖残基が通常過ヨウ素酸塩によって、その後アミンを含んだ分子と
反応できるホルムアルデヒドに酸化される糖鎖形成を伴う化学的タグの添加に使
用できることがまた認識される。化学的タグを添加するために使用可能な他の修
飾には、脂質形成、リン酸化および金属イオン添加が含まれる。当業界には一種
または複数の化学的タグをタンパク質分子またはペプチド内の特異的部位に導入
する数多くの方法があることが認識されよう。
【００４４】 第５態様で使用するためのタンパク質親和性試薬は、通常モノクローナル抗体
である。タンパク質またはペプチド内の特異的配列または構造のために、通常Ｆ
ａｂ、Ｆｖまたは１本鎖Ｆｖの形態の組換え抗体結合部位のライブラリが使用さ
れ、抗体結合部位は通常、個々の抗体結合部位をコードする遺伝子を回収できる
ように、たとえばバクテリオファージまたはリボソーム複合体を使用して「ディ
スプレイ」される。本発明で使用する場合、抗体結合部位のライブラリは、たと
えばアレイしたファージプラークを掻き取るか、またはリボソームディスプレイ
のためにベクター中の遺伝子を掻き取ってアレイすることによって、群の中に分
散させることができる。このようなプールは、通常いくつかのタンパク質または
ペプチドに対する抗体結合部位を含み、したがってこのプールを分画のために使
用することができる。あるいは、抗体親和性試薬のライブラリを必要とするタン
パク質またはペプチド混合物は固定することができ、その後プールに分散して、
個々の試薬として使用される適切な親和性試薬の予備選択のために標的として使
用することができる。化学的タグでは、個々のモノクローナル抗体を使用して、
その後の分画を実施するために個々のタグを特異的に結合することができる。
【００４５】 本発明の第５態様には、モノクローナル抗体以外のタンパク質親和性試薬の使
用が含まれ、このような試薬は質量分析の前にペプチドまたはタンパク質の分画
を容易にすることができる。このような親和性試薬には、主要組織適合タンパク
質およびＴ細胞受容体などある種のペプチドに選択的に結合する免疫分子が含ま
れる。他のタンパク質親和性試薬には、ＳＨ１領域など通常タンパク質−タンパ
ク質相互反応に関与するタンパク質領域が含まれる。本発明には、たとえば還元
条件下でシステイン残基を結合することによって、特に固相に結合したときに、
混合物内に含まれるペプチドの環状化の概念が含まれる。このための１方法は、
たとえばＣ末端固定ペプチドの場合は、ペプチド合成の標準条件を使用して、ま
たはカルボキシルペプチダーゼＹおよびリシルエンドペプチダーゼなどある種の
プロテアーゼの逆タンパク質分解を使用して、固定したペプチド上の暴露したＮ
またはＣ末端に追加にシステイン残基を添加することである。第５態様にはまた
、通常Ｎ末端に、２個またはアミノ酸の配列認識部位で切断するプロテアーゼの
認識配列の一部を形成したアミノ酸を添加して、プロテアーゼ認識部位の一種ま
たは複数の末端アミノ酸を出発タンパク質またはペプチドに形成して、タンパク
質またはペプチドをさらに分画する方法が含まれる。このように、新しいアミノ
酸が添加されたタンパク質またはペプチドの１画分だけが、その後新しく形成し
た配列によって末端プロテアーゼの切断を受ける。このように、タンパク質また
はペプチドは、このようにタグ付けした混合物の画分中で、通常特異的プロテア
ーゼ切断部位を形成したＮ末端において追加的アミノ酸でタグ付けすることがで
きる。次いで、タンパク質またはペプチドはたとえば、新しい末端を介して、た
とえばタグ付けした末端アミノ酸または末端に化学的タグを添加することによっ
て固定することができ、次いで親和性試薬を使用してタグ付けした部分を固定す
る。固定していないタグの付いていない分子を除去した後で、タンパク質または
ペプチドは、合成によって得られたアミノ酸および元のタンパク質またはペプチ
ドから得られたアミノ酸の組み合わせによって生じた切断部位だけを切断する特
異的プロテアーゼで切断させる。次いで、切断したペプチドを、タンパク質親和
性試薬を使用して分画し、質量分析（または質量分析の前にさらに処理）するこ
とが可能で、したがってペプチド混合物のサブセットが表される。並行して特異
的アミノ酸を暴露した末端に合成し、その後の固定および切断を使用することに
よって、タンパク質またはペプチドの大きな混合物を末端アミノ酸に基づいて分
画することができる。プロテアーゼ認識部位の例は、ｉｌｅ、ｇｌｕ、ｇｌｙ、
ａｒｇで、ｇｌｙおよびａｒｇの間がＸａ因子によって切断される。ｉｌｅ、ｇ
ｌｕ、ｇｌｙの配列はタンパク質またはペプチドのＮ末端に合成することができ
、したがってタンパク質またはペプチド配列内の隣接したアミノ酸がａｒｇの場
合、切断部位が形成され、Ｘａ因子によって切断することが可能である。プロテ
アーゼ切断部位の他の例は、ａｓｐ、ａｓｐ、ａｓｐ、ａｓｐ、ｌｙｓであり、
エンテロキナーゼによってａｓｐおよびｌｙｓの間が切断され、ｐｒｏ、ｇｌｙ
、ａｌａ、ａｌａ、ｈｉｓ、ｔｙｒはｈｉｓとｔｙｒの間でｇｅｎｅａｓｅＩに
よって切断され、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｒｏ、ａｒｇ、ｇｌｙ、ｓｅｒはａｒｇと
ｇｌｙの間でトロンビンによって切断される。部分配列ａｓｐ、ａｓｐ、ａｓｐ
、ａｓｐのＮ末端付加を使用して、（エンテロキナーゼで切断される）Ｎ末端ｌ
ｙｓを有するタンパク質またはペプチドを同定することができ、ｐｒｏ、ｇｌｙ
、ａｌａ、ａｌａ、ｈｉｓでは、（ｇｅｎｅａｓｅで切断される）Ｎ末端ｔｙｒ
を有するタンパク質／ペプチドを同定することができ、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｒｏ
、ａｒｇでは、Ｎ末端ｇｌｙ、ｓｅｒを同定することができ、またはｌｅｕ、ｖ
ａｌ、ｐｒｏ、ａｒｇ、ｇｌｙでは、（トロンビンで切断される）Ｎ末端ｓｅｒ
を同定することができる。特異的認識部位を有するＭＭＰ（マトリックスメタロ
プロテナーゼ）など他のプロテアーゼを使用して、他のＮ末端アミノ酸を有する
タンパク質を分画することができる。したがって異なるプロテアーゼ認識部位を
、Ｎ末端アミノ酸によってタンパク質またはペプチドを分画するプロテアーゼと
組み合わせて使用することができる。別法として、一種または複数のアミノ酸を
ペプチドの遊離のＮ末端に添加して、親和性試薬によって結合する部位を形成す
るために使用することができ、このような部位はペプチドの一種または複数のＮ
末端アミノ酸に応じている。したがって、異なるペプチドまたはペプチドの群は
、Ｎ末端アミノ酸に応じた方法でアミノ酸をＮ末端に添加し、プロテアーゼ消化
部位または親和性試薬によって結合する部位を形成することによって区別するこ
とができる。特にほ乳類細胞から得たタンパク質を出発物質として使用する場合
、Ｎ末端タンパク質はメチオニンで、これは必要であれば、たとえばホルミル化
し、末端ホルミルメチオニンの除去に特異的な細菌性プロテアーゼによる切断に
よって除去することができる。
【００４６】 タンパク質親和性試薬は、本発明の第５態様の重要な態様であり、タンパク質
／ペプチド両群の広範な分画のため、または個々のタンパク質／ペプチドの特異
的分画のために使用することができる。分画では、まず特異的画分または特異的
ペプチドに結合するが、他の画分／ペプチドには結合しない画分または個々のタ
ンパク質親和性試薬を調製することが必要である。都合のよい方法は、タンパク
質親和性試薬の単離の前にタンパク質またはペプチドを分画することである。タ
ンパク質親和性試薬としての抗体の場合、このようなタンパク質／ペプチドはそ
の後ライブラリからディスプレイされた抗体を結合するため、または抗血清産生
のために動物を免役するために使用することができる。１本鎖Ｆｖなど組換え抗
体結合部位のライブラリを使用する場合、これらをコードする遺伝子クローンは
、タンパク質／ペプチド画分に結合した後、取り出すことができ、特異的タンパ
ク質／ペプチド画分をその後単離するための親和性試薬の再生可能な原料を提供
する。並行して、個々の１本鎖Ｆｖを結合特異性について、たとえばＭＡＬＤＩ
−ＴｏＦによって結合するペプチドを分析することによってスクリーニングする
ことが可能である。この場合、大きなタンパク質混合物から単一のペプチドに結
合する１本鎖Ｆｖは、その後タンパク質／ペプチド画分を混合物から単離するた
め、単独で使用するか、または混合物内で使用する遺伝子クローンとして保持さ
れる（実際には、３種までのペプチドを結合したものもまた保持される）。タン
パク質からの遊離のＮ末端は、非常に特異的な抗体の単離のために良好な標的で
あることが多く、したがってタンパク質からＮ末端ペプチドを捕獲または遊離す
ることは特にその後の抗体単離に好ましいことが理解されよう。ある種のＦｖは
、混合物から多量のタンパク質もしくはペプチドを除去するために有用である。
１本鎖Ｆｖの結合性の保持または特徴付けはまた、他のＦｖと同様な特異性を有
するＦｖを除去することによって重複を減少させる手段を提供することが可能で
あることが理解されよう。
【００４７】 本発明の第５態様の様々な実施形態は、タンパク質消化／切断の組み合わせ、
タンパク質親和性試薬による分画およびタンパク質またはペプチド中の特異的な
配列または構造用の親和性タグを使用した任意の分画段階を有する質量分析、お
よびこれらのタグによる分画を有する化学的タグ付けの任意段階が含まれる。異
なる態様には、以下のようなこれらの段階の異なる手順が含まれる。
【００４８】 １−反復消化／切断過程および質量分析 ２−消化／切断、タンパク質親和性試薬での分画、質量分析 ３−タンパク質親和性試薬での分画、消化／切断、質量分析 ４−末端化学的タグ付け、消化／切断、タンパク質親和性試薬での分画、質量
分析 ５−３と同様であるが、タグ付け、消化／切断、分画の追加的過程を有する ６−４と同様であるが、反復タグ付け、消化／切断過程および質量分析を有す
る 本発明の第５態様は、得られたタンパク質／ペプチド画分の質量分析を実施す
るために、タンパク質混合物の複雑さの軽減を中心目的としたこれらの段階およ
び会合するタンパク質／ペプチド処理段階が含まれるものと考えられたい。
【００４９】 本発明の操作の現在一般的な方法には、（天然またはｃＤＮＡライブラリによ
ってコードされた）タンパク質混合物のＮおよび／またはＣ末端のタグ付け、プ
ロテアーゼでの切断、Ｎおよび／またはＣ末端ペプチドフラグメントの固定、お
よびペプチドの遊離および質量分析の実施が含まれる。あるいは、ＮまたはＣ末
端は、配列特異的プロテアーゼで切断する前に、アミノ酸を添加することによっ
て修飾することが可能である。質量分析の前に、このペプチドを使用して抗体な
どタンパク質親和性試薬を結合させ、これらの抗体はペプチドを分画するために
予備選択され、親和性試薬としてそれ自身保持されている。タンパク質の混合物
は、たとえば大きさによって予備分画されることが可能で、またはクローンの分
離によって予備分画されたｃＤＮＡライブラリから生成することが可能である。
次に保持されたタンパク質親和性試薬を使用してタンパク質の複合試料を分析し
、抗体を使用して次に質量分析するペプチドを結合する。
【００５０】 本明細書でタンパク質の消化／切断、分画および質量分析について記載した同
様の原理はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡなど他の高分子に適用することができる。
ＤＮＡまたはＲＮＡの場合、５’および３’末端の遊離のリン酸基およびヒドロ
キシル基は、化学的タグの非常に特異的な添加または固相への直接的結合の手段
となる。配列特異的制限酵素または修飾酵素は、ＤＮＡ分子の切断または修飾を
もたらす。ＤＮＡまたはＲＮＡに有用な親和性試薬はそれ自体、ハイブリダイゼ
ーションの前後に固相に付着され、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に特異的にハ
イブリダイズすることができる核酸である。このような方法を使用して、核酸の
複合混合物を分画し、次いで特に質量分光法を使用して質量分析を行うことがで
きる。
【００５１】 本発明は、範囲を限定するものとのは考えられない以下の実施例によって例示
される。
【００５２】 実施例１ この実施例で記載した実験は、一対の修飾した１本鎖抗体（ｓｃＡｂ）遺伝子
を使用して実施した。２つの修飾ｓｃＡｂは、Ｎ−末端エピトープタグ、重鎖可
変領域（ＶＨ）、１４アミノ酸リンカー（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ）、軽
鎖可変領域（ＶＬ）から成り、それぞれがｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓ遺伝子の
いずれかのｂ−ｚｉｐ領域に融合して調製された。
【００５３】 これらの構築体を、Ｔ７プロモータとそれに続くＴ７遺伝子１０のリボソーム
結合部位を備えたｐＥＴ５ｃベクター（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＡＨ他、Ｇｅｎｅ
、５６：１２５―１３５、１９８７）にクローニングした。ｓｃＡｂ構築体をＮ
ｄｅＩ部位でベクターに挿入し、エピトープタグをコードする配列はＴ７遺伝子
１０の最初のＡＴＧに続いて配置された。第１の構築体は、ＦＬＡＧエピトープ
（ＭＤＹＫＤＤＤＫ）（Ｋｎａｐｐｉｋ ＡおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ、Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：７５４―７６１、１９９４）をＮ末端に添加
し、タンパク質のＣ末端領域にｃ−ｆｏｓのｂ−ｚｉｐ領域（Ａｂａｔｅ、Ｃ．
他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：１０３２―１０３
６、１９９０）を添加したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対
するｓｃＡｂ（Ｍｏｌｌｏｙ Ｐ．他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、７８：３５９―３６５、１９９５）から成る。第
２の構築体は、ポリ−ヒスチジンタグをＮ末端に備え、ｃ−ｊｕｎのｂ−ｚｉｐ
領域（Ａｂａｔｅ Ｃ．他、同文献）をタンパク質のＣ末端領域に備えた抗胎児
抗原抗体３４０（Ｄｕｒｒａｎｔ ＬＧ他、Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｉｓ、１４：１３１―１４０、１９９４）から構築されたｓｃＡｂから成る。
【００５４】 抗Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（α−Ｐｓ−ｆｏｓ）ｓｃ
Ａｂおよび３４０−ｊｕｎ ｓｃＡｂは以下に記載したように構築する。
【００５５】 ｐＰＭ１Ｈｉｓベクター（Ｍｏｌｌｏｙ Ｐ他、同文献）中のα−Ｐｓ ｓｃ
ＡｂのＤＮＡを、それぞれ５’ＦＬＡＧエピトープ配列を導入し、続いて３’停
止コドンを除去したＲＤ５’ＦＬＡＧ：５’ｇｃｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇｇａ
ｃｔａｃａａａｇａｃｇａｔｇａｃｇａｃａａａｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａ
ｇ３’（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌ
ｔｄ、Ｃａｍｂｉｄｇｅ、ＵＫ）およびＲＤ３’：５’ｇｃｇａａｔｔｃｇｔｇ
ｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｔｇａｃｔｃｔｃｃ３’プライマー（Ｇｅｎｏ
ｓｙｓ）で増幅した。この反応混合物には、鋳型ＤＮＡ０．１μｇ、Ｅｘｐａｎ
ｄ（商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ酵素混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ルイス、イギリス）２．６単位、Ｅｘｐａｎｄ ＨＦ
緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ
、デオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）２００μＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペーズリー、イギリス）および各プライマー２５ｐｍｏｌ
が含まれた。サイクルは、９６℃５分、次いで［９５℃１分、５０℃１分、７２
℃１分］５回、［９５℃４５秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒］８回、［９５
℃４５秒、５０℃１分、７２℃２分］５回、最後に７２℃５分であった。得られ
た１１２３ｂｐ生成物を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１９ベ
クター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にクローニングした。この
ＤＮＡ配列は、［33Ｐ］ジデオキシヌクレオチドを有するＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑ
ｕｅｎａｓｅ放射標識ターミネータサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、アマシャム、イギリス）を使用して確認
した。この構築体をＮｄｅＩからＥｃｏＲＩまでのフラグメントとして（「Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ
」Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １
９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ参照）ｐＥＴ５ｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ
ＵＫ Ｌｔｄ、サウサンプトン、ＵＫ）にクローンした。プラスミドＤＮＡは
、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製
システム（Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＫ Ｌｔｄ）または大量の場合は、Ｑｉａｇｅｎ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ、Ｃｒａｗｌｅｙ
、ＵＫ）を使用して調製した。新しく生成したプラスミドはｐＥＴ５ｃ ＦＬＡ
Ｇ−αＰｓ ｓｃＡｂと名付けた。
【００５６】 ｆｏｓカセットは重複オリゴヌクレオチドのＰＣＲによって組み立てた。
【００５７】 Ｆｏｓ１ｆｏｒ５’−ａｔｇｇａａｔｔｃｃｔｃｇａｇａｃｃｇａｃａｃｃｃ
ｔａｃａｇｇｃｇｇａａａｃｃｇａｃｃａｇｃｔｇｇａ Ｆｏｓ８０ｒｅｖ５’−ｔｃｇｃｇａｔｔｔｃｇｇｔｔｔｇｃａｇｃｇｃｇｇ
ａｔｔｔｔｔｃｇｔｃｔｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｃｇｇｔｔ Ｆｏｓ７１ｆｏｒ５’−ａａａｃｃｇａａａｔｃｇｃｇａａｃｃｔｇｃｔｇａ
ａａｇａａａａａｇａａａａｇｃｔｇｇａｇｔｔｃａｔｃ Ｆｏｓ１５５ｒｅｖ５’−ｇｇａａｇｃｔｔｇａａｔｔｃｃｇｃｃｇｇａｃｇ
ｇｔｇｔｇｃｃｇｃｃａｇｇａｔｇａａｃｔｃｃａｇｃｔｔ 前記のオリゴヌクレオチドは、それぞれ１ｐｍｏｌで反応混合物に含まれ、こ
の反応は、Ｆｏｓ１ｆＳ；５’−ａｔｇｇａａｔｔｃｃｔｃｇａｇａｃｃおよび
Ｆｏｓ１５５ｒＳ５’−ｇｇａａｇｃｔｔｇａａｔｔｃｃｇｃｃプライマー１０
ｐｍｏｌを使用し、高適合ポリメラーゼおよび前述のような反応成分を使用して
行われた。得られた１５５ｂｐ生成物は、標準手順を使用して配列分析するため
にＥｃｏＲＩで消化し、精製して、ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１９にクローニングし
た（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ 同文献参照）。Ｆｏｓカセットは、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント
として、存在するヒト定常領域ドメインを備えた３２０ｂｐＸｈｏＩ−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメントの代わりにｐＥＴ５ｃＦＬＡＧ−αＰｓ ｓｃＡｂプラスミドに
サブクローニングした。
【００５８】 ３４０ｓｃＡｂは、ｐｐＭ１Ｈｉｓ中のα−Ｐｓ ＶＨおよびＶＫの代わりに
３４０抗体のＶＨおよびＶＫを置換することによって生成した。この３４０ＶＨ
は、５’ｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｔａｇ３’（Ｇ
ｅｎｏｓｙｓ）および５’ｔｃａｇｔａｇａｃｇｇｔｇａｃｃｇａｇｇｔｔｃｃ
ｔｔｇａｃｃｃｃａｇｔａ３’（Ｇｅｎｏｓｙｓ）プライマーで増幅した。反応
混合物には、鋳型ＤＮＡ０．１μｇ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅ
ｌｉｔｙ ＰＣＲ酵素混合物２．６単位、Ｅｘｐａｎｄ ＨＦ緩衝液、ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ、ｄＮＴＰ２００μＭおよび各プライマー２５ｐｍｏｌが含まれ
た。サイクルは、９６℃５分、次いで［９５℃１分、５０℃１分、７２℃１分］
５回、［９５℃４５秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒］８回、［９５℃４５秒
、５０℃１分、７２℃２分］５回、最後に７２℃５分であった。３５７ｂｐ生成
物はＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩ切断ｐ
ＰＭ１Ｈｉｓにクローニングした（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、同文献参照）。同様に、３４０ＶＫ
は、プライマー５’ｇｔｇａｃａｔｔｇａｇｃｔｃａｃａｃａｇｔｃｔｃｃｔ３
’および５’ｃａｇｃｃｃｇｔｔｔｔａｔｃｔｃｇａｇｃｔｔｇｇｔｃｃｇ３’
で増幅した。この３３９ｂｐ生成物は、ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、（前
記の通り生成した）ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩ切断修飾ｐＰＭ１Ｈｉｓにクローニ
ングした。ＤＮＡ配列は、［33Ｐ］ジデオキシヌクレオチドを有するＴｈｅｒｍ
ｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ放射標識ターミネータサイクルシークエンシングキット
を使用して確認した。ｐＰＭ１Ｈｉｓベクター中の３４０ｓｃＡｂのＤＮＡは、
それぞれ５’末端に６個のヒスチジン残基を導入し、３’停止コドンを除去した
プライマーＲＤ５’ＨＩＳ：５’ｇｃｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇｃａｃｃａｔｃ
ａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇ３’（Ｇｅｎｏｓｙｓ
）および（前記で挙げた）ＲＤ３’で増幅した。増幅試薬および条件は、α−Ｐ
ｓ構築と全く同じである。得られた１１１４ｂｐ生成物は、ＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩで切断し、ベクターｐＵＣ１９にクローニングした（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 同文献参照）
。ＤＮＡ配列を、前述のように確認し、プラスミドｐＥｔ５ｃＨＩＳ３４０ｓｃ
Ａｂを生成したＮｄｅＩからＥｃｏＲＩフラグメントとしてこの構築体をｐＥＴ
５ｃベクターにクローニングした。
【００５９】 Ｊｕｎカセットは重複オリゴヌクレオチドのＰＣＲによって組み立てた。
【００６０】 Ｊｕｎ１ｆｏｒ５’−ａｔｇａｇａａｔｔｃｔｃｇａｇｃｇｔａｔｃｇｃｔｃ
ｇｔｃｔｇｇａａｇａａａａａｇｔｔａａａａｃｃｃｔ Ｊｕｎ８５ｒｅｖ５’−ｔａｇｃｇｇｔｇｇａａｇｃｃａｇｔｔｃｇｇａｇｔ
ｔｃｔｇａｇｃｔｔｔｃａｇｇｇｔｔｔｔａａｃｔｔｔｔ Ｊｕｎ７１ｆｏｒ５’−ｔｇｇｃｔｔｃｃａｃｃｇｃｔａａｃａｔｇｃｔｇｃ
ｇｔｇａａｃａｇｇｔｔｇｃｔｃａｇｃｔｇａａａｃａｇ Ｊｕｎ１４６ｒｅｖ５’−ｃａｔｇｃｇａａｔｔｃｇｔｇｇｔｔｃａｔａａｃ
ｔｔｔｃｔｇｔｔｔｃａｇｃｔｇａｇｃａａｃｃ 前記のオリゴヌクレオチドは、それぞれ１ｐｍｏｌで反応混合物に含まれ、こ
の反応は、Ｊｕｎ １ｆｏｒ−Ｓ；５’−ａｔｇａｇａａｔｔｃｔｃｇａｇｃｇ
およびＪｕｎ１４６ｒｅｖ−Ｓ；５’−ｃａｔｇｃｇａａｔｔｃｇｔｇｇｔｔｃ
プライマー１０ｐｍｏｌを使用し、高適合ポリメラーゼおよび前述のような反応
成分を使用して行われた。得られた１４６ｂｐ製品は、標準手順を使用して配列
分析するためにＥｃｏＲＩで消化し、精製して、ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１９にク
ローニングした（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ 同文献参照）。Ｊｕｎカセットは、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントとして、存在するヒト定常領域ドメインを備えた３２０ｂｐＸｈｏ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントの代わりにｐＥｔ５ｃＨＩＳ３４０ ｓｃＡｂプラ
スミドにサブクローニングした。
【００６１】 プラスミドｈｉｓ３４０−ｊｕｎおよびＦＬＡＧ−αＰｓ−ｆｏｓは、ビオチ
ン化プライマーＢｉｏＴ７；５’−ａｇａｔｃｔｃｇａｔｃｃｃｇｃａａａｔｔ
ａおよびプライマーｐｅｔｒｅｖ；−５’−ａａａｔａｇｇｃｇｔａｔｃａｃｇ
ａｇｇｃｃを使用して、ＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーはＧｅｎｏＳ
ｙｓ（ケンブリッジ、イギリス）によって供給され、１ｐｍｏｌの濃度で反応に
使用した。成分およびＰＣＲ条件は前述の通りであった。ｈｉｓ−３４０−ｊｕ
ｎ反応生成物は、９９２ｂｐであり、ＦＬＡＧ−αＰｓ−ｆｏｓ反応生成物は１
００２ｂｐであった。この生成物は、スピン精製カートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ、
クローリー、イギリス）を使用して精製し、１００ｎｇ／μｌの濃度まで希釈し
た。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度で定量した。ビオチン標識ＤＮＡ５００ｎｇをス
トレプトアビジンコーティング磁性粒子（Ｂａｎｇｓ ｌａｂｓ、フィッシャー
ズ、米国）１０μｌと反応させた。反応は、シリコナイズされたミクロ遠心管に
入れて、ＰＢＳ１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ５００μｌ中で、室温で１０分間実施した
。結合に続いて、粒子を磁石（Ｄｙｎａｌ、Ｂｒｏｍｂｏｒｏｕｇｈ、イギリス
）で集め、ＰＢＳ１％ＢＳＡを使用して３回洗浄した。
【００６２】 最終洗浄後、ビオチニルリジンｔＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を補ったＴ７Ｑｕ
ｉｃｋ ｃｏｕｐｌｅｄ 転写翻訳混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ、サウサンプトン、
イギリス）２５μｌを添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応を開始
した。翻訳反応は３０℃で６０分間実施した後、氷上に置いた。粒子を磁石で集
め、氷冷した１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。
【００６３】 いくつかの実験では、非磁性ストレプトアビジン粒子をＩＶＴＴ反応で使用し
た（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｓ、フィッシャーズ、米国）。このような場合、粒子は
遠心による洗浄過程中で回収された。
【００６４】 いくつかの実験では、磁性および非磁性の着色したストレプトアビジン粒子（
Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｓ）をＩＶＴＴ反応に使用した。
【００６５】 いくつかの実験では、粒子に結合した翻訳生成物は、遺伝子構造モデルそれぞ
れに構築したＦｌａｇまたはｈｉｓ６エピソードのいずれかに対する抗体を使用
して検出した。抗体を、ＰＢＳで希釈した洗浄済み粒子に添加した。４℃で６０
分間ゆっくり混合してインキュベートした。第２試薬（抗マウスＨＲＰ複合体）
を推奨希釈度でＰＢＳで希釈し、さらに４℃で３０分間インキュベートした。色
素原での発色前に、粒子をＰＢＳ２００μｌを使用して３回洗浄した。反応は４
９２ｎｍで読み取った。
【００６６】 タンパク質−タンパク質結合反応は、粒子表面に結合したＩＶＴＴタンパク質
を使用して実施した。このような実験では、非磁性ストレプトアビジン粒子を、
タンパク質による（ｆｏｓ：ｊｕｎ）の磁性粒子の表面への結合によって「捕獲
」した。ｆｏｓＩＶＴＴ生成物を有する磁性粒子を、表面にｊｕｎを結合した非
磁性粒子と共にゆっくり混合した。反応は、ＰＢＳ、ＢＳＡ１００μｌ中で実施
し、室温で３０分間進行させた。陰性対照反応では、Ｓｃａタンパク質（α−Ｐ
ｓ ｓｃＡｂ；Ｍｏｌｌｏｙ Ｐ他、同文献）を表面に結合した非磁性粒子をｆ
ｏｓＩＶＴＴ生成物でコーティングした磁性粒子と共に混合した。インキュベー
ション後、粒子を磁石によって捕獲し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡを使用して６回洗浄
した。
【００６７】 捕獲した標的タンパク質遺伝子の存在は、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によっ
て確認した。ｊｕｎモデル遺伝子を検出する場合は、ｊｕｎ特異的プライマーＪ
ｕｎ １ｆｏｒ−ＳおよびＪｕｎ１４６ｒｅｖ−をＰＣＲアッセイに使用した。
このアッセイは、粒子１０％（ｖ／ｖ）をＰＣＲ混合物に直接添加することによ
って開始した。成分および反応条件は前記の通りだった。１４６ｂｐｊｕｎ特異
的生成物はゲル電気泳動によって検出した。ｆｏｓモデル遺伝子を検出する場合
は、プライマーＦｏｓ１ｆＳおよびＦｏｓ１５５ｒＳをＰＣＲアッセイで使用し
た。反応条件および１５５ｂｐｆｏｓ特異的生成物の検出は前記の通りであった
。陰性対照タンパク質を検出する場合は、プライマーＳｅｑ１ｓｃａｂ５’ａｇ
ａｔｃｃｃｔａｃｔａｔａｇｇｔａおよびＳｅｑ２ｓｃａｂ；５’−ｇｇｔｇａ
ｇｃｔｃｇａｔｇｔａｔｃｃを使用して、α−Ｐｓ ｓｃＡｂタンパク質遺伝子
中の１１５ｂｐ生成物を検出した。
【００６８】 前記の実験では、ＪｕｎＰＣＲ生成物は、α−Ｐｓ ｓｃＡｂＰＣＲ生成物が
ｆｏｓ磁性粒子との相互反応に続いて検出されない条件下で、ｆｏｓ磁性粒子に
よる捕獲の後で検出された。
【００６９】 実施例２ この実施例では、１本鎖抗体ライブラリは独特のペプチド「バーコード」を含
んで生成した。ヒト抹消血リンパ球ＲＮＡを標準方法によって調製した。手短に
いうと、リンパ球を１６名の健常な提供者から得たヘパリン処理血液１０ｍｌか
ら調製した。リンパ球は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地（Ｓｉｇｍａ、プール、イ
ギリス）を使用した密度勾配遠心法の後で集めた。ＱｕｉｃｋＰｒｅｐシステム
および供給元（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、セントオールバンズ、イギリス）によって
提供された装置を使用してＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成
キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、セントオールバンズ、イギリス）およびランダム
ヘキサマープライマーを使用して供給元の推奨条件で実施した。免疫グロブリン
重鎖可変領域（Ｖｈ）および免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖｌ）は、Ｖｈおよ
びＶｌレパートリーを最大限にするように考案されたプライマーセットを使用し
て、分離ＰＣＲ混合物中でｃＤＮＡから増幅した。プライマーセットは以前に記
載された通りである（Ｍａｒｋｓ Ｊ．Ｄ．他、１９９１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｕ
ｍｕｎｏｌ．２１：９８５）。ＶｈおよびＶlＰＣＲ反応は、Ｅｘｐａｎｄ（商
標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ酵素混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ルイス、イギリス）２．６単位、Ｅｘｐａｎｄ ＨＦ緩衝液
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ、デオキシヌクレオチド三
リン酸塩（ｄＮＴＰ）２００μＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａ
ｉｓｌｅｙ、ＵＫ）および各プライマープール２５ｐｍｏｌを使用して実施した
。サイクルは、９６℃５分、次いで［９５℃１分、５０℃１分、７２℃１分］５
回、［９５℃４５秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒］８回、［９５℃４５秒、
５０℃１分、７２℃２分］５回、最後に７２℃５分であった。
【００７０】 分離ＰＣＲでは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3の形態のリンカーフラグメント（Ｈｕｓ
ｔｏｎ Ｊ．Ｓ．他、１９８８、ＰＮＡＳ、８５：５８７９―５８８３）を以前
に詳述したプライマーセット（Ｍａｒｋｓ、Ｊ．Ｄ著「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」ｅｄ Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ Ｃ．Ａ．Ｋ Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ Ｏ．Ｕ．Ｐ．、１９９５）を使用してクローンニングした鋳型ｐＳＷ１−Ｓ
ｃＦｖＤ１．３から増幅した（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他、１９９０、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４８：５２２―５５４）。９３ｂｐリンカーフラグメント生成物を等モル
のＶｈおよびＶｌＰＣＲ生成物の混合物と一緒にアニーリングした。この混合物
をさらにＶａｕｇｈａｎ他（Ｖａｕｇｈａｎ Ｔ．Ｊ．他、１９９６、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９―３１４）が詳述したフランキングプライ
マーＨｕＶＨＢＡＣＫｓｆｉおよびＨｕＦＯＲＮｏｔを使用した「貫通（：ｐｕ
ｌｌ ｔｈｒｏｕｇｈ）」反応で増幅した。貫通反応で使用したフラグメントは
全て、反応に入れる前に最初のプライマーを除いて精製した。精製は、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ ＵＫ）のＷｉｚａｒｄ Ｐ
ＣＲ Ｐｒｅｐｓシステムを使用して実施した。
【００７１】 Ｖｈ−リンカー−Ｖｌの形態の集合コンティグは、制限酵素ＳｆｉＩおよびＮ
ｏｔＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を標準条件で使用して消化し、前記の通り精製
した。精製したフラグメントを、Ｖ８プロテアーゼ切断部分をＶｌ遺伝子のＣ末
端を有するフレームのランダム配列域に近接して導入するように設計された２本
鎖合成オリゴヌクレオチドアダプタ混合物とアニーリングした。このＶ８／独特
配列バーコードは、５’−ｇｇｃｃｇｃｇａｇｇａａｇａｇｇａａ［（ａｔｇ）
／（ｃａｎ）／（ａｇｎ）／（ａａｎ）／（ｇａｎ）／（ｔｔｎ）］2 ｇｃ−３
’および５’−ｇｇｃｃｇｃ［（ｎａａ）／（ｎｔｃ）／（ｎｇｔ）／（ｎｃｔ
）／（ｎａｇ）／（ｃａｔ）］2ｃｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃｇｃ−３’の形態の
１対の合成オリゴヌクレオチドプールをアニーリングすることによって形成した
。このリンカーは、ＮｏｔＩ適合末端（下線）を有し、したがって完全な１本鎖
抗体−Ｖ８／独自配列バーコードフラグメントをＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ調製ｐＣＡ
ＮＴＡＢ５（ｐｈａｒｍａｃｉａ）ファージミドベクターに挿入することが容易
である。
【００７２】 この独特の配列バーコードは、停止コドンの導入を回避するために設計されて
おり、２種の他のコドンよりも大きなコード残基を排除するためにさらに偏向し
ている。この戦略によって、所与の解読ペプチド配列を同定するために必要な特
異的オリゴヌクレオチドの数は最小限に抑えられる。全部で、独特配列バーコー
ドは、２０アミノ酸の１１個をコードすることができる。Ｖ８ペプチダーゼ切断
部位（４グルタミン酸残基の列）に加えて、配列バーコードは、１２個の長さの
コドンである。したがって、１１アミノ酸のレパートリー（そのうち１０個は２
個のコドンのいずれかによってコードされている）は１１12／２＝〜１．５×１
０12の異なるペプチドをコードすることができる。
【００７３】 ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ調製末端を備えた集合ｓｃｆｖフラグメント（Ｖｈ−
リンカー−ＶｌをＮｏｔＩ配列バーコードアダプタとアニーリングし、結合して
、再度精製した。ファージディスプレイによってヒトｓｃｆｖライブラリを発現
する実験では、完全なフラグメントをＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ調製ｐＣＡＮＴＡＢ５
（ｐｈａｒｍａｃｉａ）ファージミドベクターに結合し、コンピテントＴＧ１Ｅ
．ｃｏｌｉに形質転換した。
【００７４】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ）を使用した他の実験では、集合ｓｃｆ
ｖライブラリはをＳｆｉＩ ＮｏｔＩ調製ｐＣＡＮＴＡＢ５−Ｔ７にサブクロー
ニングした。このベクターは、２２３５位のＨｉｎｄＩＩＩに挿入されたＴ７プ
ロモータ配列（ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａ）を含むように修飾され
たこと以外は市販のｐＣＡＮＴＡＢ５と同様である。この修飾は、配列５’−ａ
ｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａの２本鎖合成ＤＮＡリンカーをＨｉｎ
ｄＩＩＩ切断し、脱リン酸ｐＣＡＮＴＡＢ５にライゲーションすることによって
実施した。Ｔ７プロモータを含む組換えクローンは、診断ＰＣＲを使用して選択
した。
【００７５】 コンピテントＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉへの結合および形質転換に続いて、細胞を
ＳＯＣ培地１ｍｌ中で１時間増殖させ、次いでアンピシリン１００μｇ／ｍｌを
有するＴＹＥ培地にプレーティングした。プレートからコロニーを掻き取り、ア
ンピシリンを含んだ２ｘＴＹ培地５ｍｌに接種した。培養したライブラリを使用
して、ＩＶＴＴ反応用ＤＮＡを調製した。
【００７６】 ｐＣＡＮＴＡＢ５−Ｔ７ ＳｃｆｖライブラリＤＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻
訳反応で使用した。ＩＶＴＴは、Ｔ７Ｑｕｉｃｋ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、サウサ
ンプトン、イギリス）およびｐＣＡＮＴＡＢ５−Ｔ７ ＳｃｆｖライブラリＤＮ
Ａ１０μｇを全量５０μｌで使用して実施した。翻訳反応は、３０℃で９０分実
施し、氷上に置いた。いくつかの実験では、35Ｓ−メチオニン取り込みアッセイ
を使用して翻訳生成物の存在を監視した。結合およびスクリーニングアッセイで
使用する前に反応物を−７０℃で保存した。
【００７７】 １本鎖抗体ライブラリを、組換えヒトｐ５３タンパク質（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ノッティンガム
、イギリス）の結合反応に使用した。ＩＶＴＴ混合物をＰＢＳで１０倍希釈し、
ヒト組換えｐ５３タンパク質を９６ウェルマイクロプレートに固定した結合アッ
セイで使用した。ｐ５３タンパク質をリン酸緩衝液中１００μｇ／ｍｌの濃度で
４℃で一晩インキュベートすることによって固定した。このプレートをＰＢＳ０
．５％（ｗ／ｕ）ＢＳＡで洗浄し、希釈したＩＶＴ混合物を被験ウェルおよび対
照ウェルに加えて結合させた。結合反応は３７℃で９０分間実施した。このプレ
ートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖｔｗｅｅｎ−２０）を使用して３
回洗浄し、Ｖ８タンパク質消化（Ｔａｋａｒａ、ウォーキンガム、イギリス）を
行った。タンパク質フラグメントを上清から集め、大きさで分画して、Ｖ８プロ
テアーゼおよびその他の大きな種をＭＡＬＤＩ−ｔｏｆによる分析の前に排除し
た。
【００７８】 ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆフラグメント分析によって、ペプチドフラグメントの数を
識別した。このペプチド配列を使用して、１組の対応する合成オリゴヌクレオチ
ドを設計した。このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲに基づいた１本鎖ライブラリ
スクリーンで使用した。Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｇｅｎｅ Ｅｕｒｏｐｅ
）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ヒト１本鎖抗体ライブラリＤＮＡの中に相補
鎖を合成した。１５回の熱サイクルに続いて、この生成物をＤｐｎＩで消化した
。この段階では、親プラスミド分子の混合物を消耗して、新たに合成したプライ
マー生成物の増殖を確実にした。反応物１μｌをＴＧ１コンピテント細胞に形質
転換して、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに接種した。標準
方法によって個々のクローンを採取して、増殖させ、ＤＮＡを調製した。ＤＮＡ
を直接２回目のＩＶＴＴ、抗原結合、Ｖ８プロテアーゼ消化、ＭＡＬＤＩ−ｔｏ
ｆフラグメント分析を含むスクリーニングに使用した。選択を２回行った後、組
換え体ｐ５３に結合した６ｓｃＦｖを単離した。
【００７９】 実施例３ 本発明の実施例で記載した実験は、Ｆａｂ発現ベクターｐＣ５Ａ８−０３を使
用して実施し、その構築は以下の通りである。このｐＣ５Ａ８−０１ベクターは
、誘導性ｌａｃプロモータおよびＭ１３複製起点を提供するｐＬＩＴＭＵＳ２８
ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ．ＵＳＡ）に基づい
ている。抗体のＦａｂ領域は、重鎖の可変領域（ＶＨ）および第１定常領域（Ｃ
Ｈ１）およびＣＤ４に指向するヒトモノクローナル抗体５Ａ８のカッパ軽鎖の可
変領域（ＶＫ）および定常領域（ＣＫ）をコードする２種のＤＮＡフラグメント
から組み立てられた（Ｒｅｉｍａｎｎ ＫＡ．他、Ａｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １３、１１：ｐ９３３、１
９９７）。これらのフラグメントは、ｐｅｌＢリーダー配列（Ｌｅｉ Ｓ−Ｐ．
他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１６９：９：４３７９
―４３８３、１９８７）に融合され、以下に示すように、ｐＬＩＴＭＵＳ２８の
ＢｇｌＩＩとＢｓｔ９８Ｉの間に挿入された。以下の分子生物学的方法は全て、
当業者になじみ深いものであり、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ ＥＦ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９、ニューヨーク、合衆国）
に見いだすことができよう。オリゴヌクレオチドは全て、Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、イギリ
スによって合成された。特に記載がなければ、制限エンドヌクレアーゼは全て、
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペーズリー、イギリス）から購入した。
ポリメラーゼ鎖反応は全て、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、サ
ウサンプトン、イギリス）を使用して実施した。
【００８０】 軽鎖フラグメントを集めるために、ｐｅｌＢリーダー配列を、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、Ｈｙｂａｉｄ Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ Ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
に対する１本鎖抗体フラグメント（ｓｃＡｂ）を含むｐＰＭ１−ＨＩＳクローン
から増幅した（Ｍｏｌｌｏｙ、Ｐ．他、Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、７８：３５９―３６５、１９９５）。ＢｇｌＩＩ制
限部位、ｐｅｌＢリーダー配列のＮ末端残基およびＳｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎ
ｏ配列をコードするオリゴヌクレオチドＯＬ００１、およびｐｅｌＢリーダーの
Ｃ末端およびｐＤＩＶＫＶ３（ｒｅｆ）からのカッパ軽鎖のＮ末端残基をコード
するＯＬ００２を使用して初期反応を実施した。この反応の生成物を、Ｗｉｚａ
ｒｄ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＫ Ｌｔｄ．、サウサ
ンプトン、イギリス）を使用して、ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ アガロース（Ｆｌ
ｏｗｇｅｎ、リッチフィールド、イギリス）から精製し、変性し、カッパ軽鎖の
可変領域と定常領域の結合部をコードするＯＬ００４と併用して使用して、標準
プロトコールを使用したＰＣＲによってｐＤＩＶＫＶ３クローンからカッパ鎖の
可変領域を増幅した。カッパ軽鎖の定常領域は、可変領域のＣ末端残基および定
常領域のＮ末端残基をコードするＯＬ００３およびカッパ軽鎖の定常領域のＣ末
端残基および制限酵素部位ＥｃｏＲＩをコードするＯＬ００５を使用して、ｐＰ
Ｍ１−ＨＩＳ（Ｍｏｌｌｙ他）からＰＣＲによって増幅した。これらの２種のフ
ラグメントは、その後ＯＬ００１およびＯＬ００５を使用した重複ＰＣＲによっ
て増幅し、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣ５Ａ８−０１を形成する
ためにｐＬＩＴＭＵＳ２８にクローニングした。
【００８１】 重鎖は、ＥｃｏＲＩ部位およびＳｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列をコードす
るＯＬ００６およびｐｅｌＢリーダー配列のＣ末端残基をコードし、ｐＤＩＶＨ
Ｖ４の重鎖のＮ末端残基をコードするＯＬ００７を使用して、組み立てた軽鎖か
らｐｅｌＢリーダーの増幅によって集めた。重鎖の可変および定常領域の結合部
をコードするＯＬ００９と一緒にこの反応生成物を使用して、ｐＤＩＶＨＶ４ク
ローンからＩｇＧ１重鎖の可変領域を増幅した。重鎖定常領域のエキソン１を、
重鎖の可変領域のＣ末端残基および定常領域のＮ末端（ＯＬ００８）とエキソン
１のＣ末端残基およびＳｓｔＩの制限部位（ＯＬ０１０）をコードするＯＬ００
８およびＯＬ０１０を使用して、ｐＳＶｇｐｔＨｕＩｇＧ１クローンからＰＣＲ
によって増幅した。これらの反応の生成物をＯＬ００６およびＯＬ０１０を使用
して重複ＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＳＳｔＩで消化し、ｐＣ５Ａ
８−０２を形成するために軽鎖フラグメントを含むｐＬＩＴＭＵＳ２８にクロー
ニングした。
【００８２】 ＣＨ１のＣ末端残基およびＣ末端ＦＬＡＧタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（Ｋ
ｎａｐｐｉｋ Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、１７；７５４―７６１、１９９０）を、ｐＣ５Ａ８−０３を形成するため
に制限部位ＥｃｏＩＣＲＩおよびＢｓｔ９８Ｉを含むＯＬ０１１およびＯＬ０１
２を使用して添加した。あるいは、これらのタグは６ＨＩＳタグまたはＭＳタグ
を含むことが可能である（実施例参照）。
【００８３】 ｐＣ５Ａ８−０、ｐＣ５Ａ８−０２およびｐＣ５Ａ８−０３の精製に使用した
オリゴヌクレオチドを以下に挙げる。
【００８４】 ＯＬ００１；５’ＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧ
ＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧ３’ ＯＬ００２；５’ＧＧＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＧＧＣＣＡ
ＴＣＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣ３’ ＯＬ００３；５’ＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴ
ＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴ３’ ＯＬ００４；５’ＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡＴ
ＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＡＣＣ３’ ＯＬ００５；５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＧＣＧＧＴ
ＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧ３’ ＯＬ００６；５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡ
ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧ３’ ＯＬ００７；５’ＧＧＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＣＣＡＴ
ＣＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣ３’ ＯＬ００８；５’ＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣ
ＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ３’ ＯＬ００９；５’ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧ
ＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＧＧＴＡＣ３’ ＯＬ０１０；５’ＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴ
ＴＧＧＴＧＴＴＧＣ３’ ＯＬ０１１；５’ＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＡ
ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＡＴＡＧＣＴＣＧＡＧＣ３’ ＯＬ０１２；５’ＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
ＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ３’ 機能的Ｆａｂの生成は、ＥＬＩＳＡによって示された。要約すると、前記のベ
クターをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αに入れ、ＯＤ600が０．５になるまで、アンピ
シリン１００μｇ／ｍｌおよびグルコース１％存在下で、３７℃で増殖させた。
タンパク質生成は、グルコース無しで、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（ＩＰＴＧ）１ｍＭを添加することによって誘導した。ペリプラズム画分をＴ
ｒｉｓＨＣｌ ３０ｍＭ、２０％シュクロース、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ１ｍＭ次
いでＭｇＳＯ4 ５ｍＭを使用して浸透圧衝撃によって遊離し（Ｍｏｌｌｏｙ、
Ｐ．他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
７８：３５９―３６５、１９９５）、あらかじめリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐ
Ｈ７．４に１μｇ／ｍｌの濃度で溶かした溶解性ヒトＣＤ４（Ｉｎｔｒａｃｅｌ
Ｃｏｒｐ．、Ｉｓｓｑｕａｈ、ＷＡ）で、湿潤容器内で室温で一晩コーティン
グしたＩｍｍｕｌｏｎ４ ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｄｙｎｅｘ）に、直接添加し
た。あるいは、ペリプラズム画分は、細胞溶解によって、またはＥＤＴＡ１ｍＭ
を添加することによって遊離することが可能である。非特異的結合は、プレート
を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５
％チメロサール（Ｓｉｇｍａ）を含んだＰＢＳで可溶性Ｆａｂを添加する前に１
時間インキュベートすることによって減少させた。抗ＣＤ４特異的Ｆａｂは、５
、５’テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ
）を使用して検出されるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ特異性西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）およびリン酸／クエン酸緩衝液ｐＨ５．０に
溶かした過酸化水素を使用して検出された。発色は３０分後、０．２Ｎ Ｈ2Ｓ
Ｏ4を使用して停止し、吸光度を４５０ｎｍで記録した。あるいは、ＡＢＴＳ／
クエン酸塩（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を使用して検出することも可能だった。
【００８５】 ＣＤＲ３配列ライブラリを生成するために、以下に挙げたオリゴヌクレオチド
を使用して、独特の制限部位をオリゴヌクレオチド誘導突然変異によってｐＣ５
Ａ８−０３ベクターに導入した（Ｋｕｎｋｅｌ ＴＡ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：４８８―４９２（１９８５）および「Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕ
ｂｅｌ ＦＭ．、Ｂｒｅｎｔ Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ．、Ｍｏｏｒｅ
ＤＤ．、Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ．、Ｓｍｉｔｈ ＪＡ．著、Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ．
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）。カッパ軽鎖および重鎖それ
ぞれに、ＡａｔＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＬＣＤＲ３への５’および３’）お
よびＢｓｓＨＩＩおよびＳａｎＤＩ（ＨＣＤＲ３への５’および３’）制限部位
が存在することを、適切な制限酵素で消化することによって確認した。これらの
プラスミドは、それぞれ追加的制限部位を含んでおり、ｐＣ５Ａ８−０４からｐ
Ｃ５Ａ８−０７と名付けられた。
【００８６】 ＯＬ０１３；５’ＧＡＡＧＡＣＧＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣ３’ ＯＬ０１４；５’ＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣ３’ ＯＬ０１５；５’ＣＴＡＣＴＧＣＧＣＧＣＧＴＧＡＡＡＡＡＧ３’ ＯＬ０１６；５’ＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧ３’ ＡａｔＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでのｐＣ５Ａ８−０７の消化に続いて、カッ
パ軽鎖可変領域のＣＤＲ３中の非常に変化に富んだ残基を、アンカー残基（ａａ
８３―８８およびａａ９７―１０３）およびＨｉｎｄＩＩＩの制限エンドヌクレ
アーゼ部位を含む３’末端に１０個のヌクレオチドの回文配列を有する変質した
オリゴヌクレオチドの混合物を使用してランダム化した。これらのオリゴヌクレ
オチドは、３’末端にハイブリダイズし、次いでＤＮＡポリメラーゼの基質とし
て働き、２本のホモ２重鎖の生成が引き起こされ、２種の制限酵素で消化して、
標準の方法で消化したベクターにクローニングされる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌ
ＦＭ．、Ｂｒｅｎｔ Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ．、Ｍｏｏｒｅ ＤＤ．
、Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ．、Ｓｍｉｔｈ ＪＡ．著、Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ．Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．参照）。残基９１、９２、９３、９４
、９５、９５Ａ、９５Ｂおよび９６がオリゴヌクレオチド合成の各段階でそれぞ
れの同濃度のヌクレオチドを含めることによってランダム化されるように、オリ
ゴヌクレオチドを調製した（Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。
【００８７】 突然変異オリゴヌクレオチドの配列は、１０残基の長さのＣＤＲ３に基づいて
いる。残基８９および９０は比較的保存されており、したがってこの実施例に適
している。無作為化する残基はイタリックで示す。ＣＤＲ３の６、７、８または
９残基を有する追加的ライブラリはまた、ランダム化した領域の長さを変えるこ
とによって生成することができる。
【００８８】 プラス鎖；５’ ＧＡＡＧＡＣＧＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＮＮＳＮＮＳ ＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳ ＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧ
ＣＴＴＧＧ３’ マイナス鎖；５’ ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳ ＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮ ＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＡＡＣＡＧＣＧＡＣＧ
ＴＣＴＴＣ３’ 重鎖のＣＤ３は、制限エンドヌクレアーゼ部位ＢｓｓＨＩＩおよびＳａｎＤＩ
、および以下に挙げた突然変異オリゴヌクレオチドを使用して、前部で説明した
同様の方法でランダム化した。この場合、９５―１００Ｄ残基がランダム化され
る。ランダム化される残基はイタリック（下線で表記）で示す。ＣＤＲ３の９、
１１または１２残基を有する追加的ライブラリはまた、ランダム化した領域の長
さを変えることによって生成することができる。
【００８９】 プラス鎖；５’ ＣＴＡＣＴＧＣＧＣＧＣＧＴＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮ ＳＮＮＳＮＮＳ ＴＴＣＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴ マイナス鎖；５’ ＡＧＧＧＧＴＣＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＡＡＧＣＧＡＡＳＮＮＳＮＮＳＮＮ ＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮ ＡＣＧＣＧＣＧＣＡＧＴＡＧ３’ 重鎖および軽鎖両者が無作為化したＣＤＲ３を含むライブラリは、前述した重
鎖および軽鎖両者の突然変異方法を実施することによって作製した。
【００９０】 高い親和性結合剤の選択効率を高めるために、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
ＩおよびＸｈｏＩを使用して前述したＦＬＡＧタグを質量タグに置き換えた。ラ
イブラリの大きさを大きくするために、さらに２種のタグを使用することが可能
である。この場合、タグ１および２をＸａ因子などプロテアーゼで除去した後区
別するために、タグの長さが少なくとも２残基分違わなければならない。オリゴ
ヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｈｏＩを含む３’で回文配列を
設計した。このオリゴヌクレオチドは３’末端にハイブリダイズし、次いでＤＮ
Ａポリメラーゼの基質として働き、２本のホモ２重鎖の生成を引き起こし、２種
の制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化して、標準プロトコールを使用して消
化したベクターにクローニングされる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ．、Ｂｒ
ｅｎｔ Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ．、Ｍｏｏｒｅ ＤＤ．、Ｓｅｉｄｍａ
ｎ ＪＧ．、Ｓｍｉｔｈ ＪＡ．著、Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．参照）。
【００９１】 例として、８残基のタグは、オリゴヌクレオチド５’ＮＡＣ ＮＣＣ ＮＧＧ
ＮＴＧ ＴＫＣ ＶＡＧ ＧＮＶ ＧＮＴ ３’を使用して作製することがで
きる。８残基の第２タグがまた、イタリックで示したプロテアーゼＸａ因子部位
の取り込みによって含まれる場合、このタグの長さは１１残基に増加する。
【００９２】 単一タグ 前方オリゴ；５’ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＹ ＧＧＮ ＣＧＮ ＮＡＣ
ＮＣＣ ＮＧＧ ＮＴＧ ＴＫＣ ＶＡＧ ＧＮＶ ＣＮＴ ＴＡＧ ＣＴＣ
ＧＡＧ ＣＴＡ ３’ 後方オリゴ；５’ ＴＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＮＧ ＢＮＣ ＣＴＢ
ＧＭＡ ＣＡＮ ＣＣＮ ＧＧＮ ＧＴＮ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＣＴＧ
ＣＡＧ ＣＧＣ ３’ ２重タグ 前方オリゴ；５’ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＹ ＧＧＮ ＣＧＮ ＮＡＣ
ＮＣＣ ＮＧＧ ＮＴＧ ＴＫＣ ＶＡＧ ＧＮＶ ＣＮＴ ＧＡＹ ＧＧＮ ＣＧＮ ＮＡＣ ＮＣＣ ＮＧＧ ＮＴＧ ＴＫＣ ＶＡＧ ＧＮＶ ＣＮＴ
ＴＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ３’ 後方オリゴ；５’ＴＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＮＧ ＢＮＣ ＣＴＢ
ＧＭＡ ＣＡＮ ＣＣＮ ＧＧＮ ＧＴＮ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＡＮＧ
ＢＮＣ ＣＴＢ ＧＭＡ ＣＡＮ ＣＣＮ ＧＧＮ ＧＴＮ ＣＣＧ ＣＣＣ
ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ３’ 実施例４ 高い親和性の結合剤を選択するために、初期ライブラリをエレクトロポレーシ
ョン（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに移し、アンピシリン
１００μｇ／ｍｌおよび１％グルコースを含んだＬアガーに接種し、３７℃で一
晩インキュベートした。形質転換した細胞を集め、アンピシリン１００μｇ／ｍ
ｌを含んだＬ培地の新鮮バッチに接種するために使用した。ライブラリの残りは
、−７０℃で保持保存して、後で記載するように高い親和性クローンを取り出す
ための出発物質として使用した。新たに接種した培養物を、イソプロピルチオ−
β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して最終濃度０．１ｍＭにする前に、
３７℃で２時間インキュベートした。次いで、この培養物を３７℃でさらに３時
間インキュベートした。
【００９３】 溶解性Ｆａｂライブラリを作製する細菌の培養物１００ｍｌを４℃、４０００
ｒｐｍで２０分間遠心し、得られたペレットをＥＤＴＡ１ｍＭを含んだリン酸緩
衝食塩水に再懸濁した。５―２０分間氷上で攪拌すると、ＥＤＴＡは外膜を透過
性にし、ペリプラズム内容物を漏出させる。次いで、上清を遠心にすることによ
り透明にし、この上清を次の段階に使用した。ペリプラズム内容物を放出させる
他の方法もまた使用することが可能であった（Ｍｏｌｌｙ、Ｐ．他、Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、７８：３５９―３６
５、１９９５および「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ．お
よびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９、ニューヨーク、米国）。
【００９４】 Ｆａｂライブラリを含んだペリプラズム抽出物を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）ｐＨ７．４に１μｇ／ｍｌの濃度で溶かした溶解性ヒトＣＤ４（Ｉｎｔｒａｃ
ｅｌ Ｃｏｒｐ．、Ｉｓｓｑｕａｈ、ＷＡ）で、湿潤容器内で室温で一晩コーテ
ィングしたＮｕｎｃ−イムノチューブに等分に分けた。非特異的結合は、チュー
ブを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０
５％チメロサール（Ｓｉｇｍａ）を含んだＰＢＳで可溶性Ｆａｂを添加する前に
１時間室温でインキュベートすることによって減少させた。ＦａｂをＣＤ４抗原
に室温で１時間結合させた後、チューブをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で
２０回洗浄することによって非結合Ｆａｂを排除した。
【００９５】 結合したままＦａｂのアミノ酸配列を同定するために、質量タグを標準の方法
でＸａ因子で除去した。次いで質量タグをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＭＳ／ＭＳ）分
光法によって分析し、次いで各タグの分子量によって、第２イオン化事象の分析
によって得られる配列情報を特定した。この情報を組み合わせることによって、
タグのアミノ酸配列を割り当てることができた。
【００９６】 場合によっては、結合Ｆａｂを溶出し、製造者の指示に従って調製したセファ
ロース−抗Ｃｋカラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｗａｒｒｉｎｅｒ、チェシア、イギリス
）を使用してアフィニティー精製することによって他のＥ．ｃｏｌｉタンパク質
からＦａｂを中和し精製することによってプロテアーゼ切断の効率を増加させる
ことが必要なことがある。次に、質量タグをＸａ因子を使用して結合Ｆａｂから
除去することができる。
【００９７】 質量タグの識別後、さらに２種のオリゴヌクレオチドを作製した。この３’オ
リゴヌクレオチドは質量タグの配列をコードし、一方５’オリゴヌクレオチドは
、ＦａｂのＮ末端で配列をコードするＯＬ００１である。 プラス鎖；５’ＧＧ ＧＣＡ ＧＡＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＣＴＴ ＴＡＡ ＧＡ
Ａ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＴ
Ｇ ＣＣＴ ＡＣＧ Ｇ３’ マイナス鎖；５’ＴＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＮＧ ＢＮＣ ＣＴＢ
ＧＭＡ ＣＡＮ ＣＣＮ ＧＧＮ ＧＴＮ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＡＮＧ
ＢＮＣ ＣＴＢ ＧＭＡ ＣＡＮ ＣＣＮ ＧＧＮ ＧＴＮ ＣＣＧ ＣＣＣ
ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ３’ 高い親和性の結合剤を含むクローンは、Ｅ．ｃｏｌｉライブラリ１０μｌを前
述したオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ反応物に添加することによって取り出し
た。この反応に必要な条件は、使用したオリゴヌクレオチドに応じて変化させる
ことが可能である。増幅後、ＰＣＲ生成物を配列決定し、その後低融点アガロー
スから精製し、カッパ軽鎖のＣＤＲ３のＮ末端をＡａｔＩＩ、およびｐＣ５Ａ８
−０７ベクターの重鎖のＣＤＲ３のＣ末端をＳａｎＤＩで消化し、標準の方法で
、同様の制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＣ５Ａ８−０７ベクターに移した
（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ．、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ Ｔ．著Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ １９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ参照）。得られたプラスミドを
エレクトロポレーションによって標準の方法でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに移し、
−７０℃で保存した。あるいは、ＰＣＲ反応の生成物をいくつかの他の制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、Ｆａｂ発現用の他のベクターに移した。
【００９８】 場合によっては、いくつかの質量タグが初回パニング後に存在することが可能
である。この場合、クローンのライブラリを保存ライブラリから３’オリゴヌク
レオチドの混合物を使用して増幅する。この限定されたライブラリは、その後さ
らにパニングを行うことが可能で、結合したクローンはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによ
って再分析することができ、内部タグの配列を使用して、限定されたＰＣＲプラ
イマーのレパートリーを作製した。
【００９９】 選択した抗ＣＤ４特異的Ｆａｂの親和性を確認するために、ペリプラズム抽出
物を前記のように調製し、すぐにＣＤ４特異的ＥＬＩＳＡに使用するべきである
。見かけの親和性は、実際の親和性とＦａｂの濃度を組み合わせたもので、した
がってＦａｂの濃度は同じ抽出物についてさらなる捕獲ＥＬＩＳＡを実施するこ
とによって確認され、標準濃度曲線は、ＦＬＡＧタグまたはヒトＣｋ領域に対し
て作製される（ＭｃＧｒｅｇｏｒ ＤＰ．、Ｍｏｌｌｏｙ ＰＥ．、Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍ Ｃ．ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ ＷＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ３１、２１９―１１６．１９９４）。
【０１００】 実施例５ この実施例では、ヒトｐ５３タンパク質をＮ末端で化学的タグで修飾し、プロ
テアーゼで切断して、その後タグ特異的モノクローナル抗体を使用して化学的タ
グの付いたペプチドを回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦでこのペプチドを分析した。
ｐ５３タンパク質はＢｏｒｅｋ Ｖｏｊｉｓｅｋ博士（Ｂｒｎｏ大学、チェコ共
和国）から恵与された。Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ７（１９９６）ｐ１５０―１５８に従って、リジン側鎖を
保護するためにｐ５３タンパク質１００μｇを（メチルスルホニル）炭酸エチル
のスクシニミドエステルで処理した。保護したタンパク質を０．１Ｍ重炭酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ８．５に１ｍｇ／ｍｌで溶解し、ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐ
ｉｅｒｃｅ、チェスター、イギリス）を最終的に１００μｇ／ｍｌ添加した。こ
の反応を室温で６時間行い、エタノールアミンで停止した。次いで、タンパク質
混合物をＰＢＳを用いたセファデックスＧ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ミ
ルトン キーンズ、イギリス）に通過させ、空隙容量を溶出液のＡ２８０測定を
使用して集めた。次いでｐ５３を２μｇ含む溶出液４０μｌを加熱変性し（９５
ｃ、５分）、３７ｃまで冷却し、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（Ｃ．ｈｉｓｔ
ｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ノッティンガム、イギリス）１μｇ
を添加して、混合物を３７ｃで１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳに溶
かしたストレプトアビジン−アガロース（Ｓｉｇｍａ、プール、イギリス）１０
μｌを添加して、混合物を１０分間振盪した。このアガロースを１６０００ｇで
１分間によりペレットにして、ＴＳＯ緩衝液（Ｔｒｓ．ＨＣｌ ７５ｍＭ、Ｎａ
Ｃｌ ２００ｍＭ、Ｎ−オクチルグルコシド０．５％、ｐＨ８）で３回、ＴＳＭ
Ｋ（Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ２００ｍＭ、２−メルカプトエタ
ノール５ｍＭ、ｐＨ８）で３回洗浄した。最後に、１％トリフルオロ酢酸／アセ
トニトリル（１：１ｖ／ｖ）に溶かしアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮
酸飽和水溶液１０μｌを洗浄したビーズに添加して、この１μｌを質量分光器の
チップに載せた。Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅ
ｒ−ＤＥ ＳＴＲ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ
（Ｐｅｒｓｐｅｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析を実施した。
２００レーザーショットからスペクトルを添加することによって、質量スペクト
ルを集めた。
【０１０１】 この結果は、６５アミノ酸Ｎ末端Ａｒｇ−Ｃエンドプロテアーゼフラグメント
に対応し、他のｐ５３Ａｒｇ−Ｃピークは有意なレベルではなかった。
【０１０２】 実施例６ Ｎ末端ビオチンタグペプチドを使用して、１本鎖Ｆｖのファージディスプレイ
ライブラリから１本鎖Ｆｖ抗体フラグメントを単離すること以外は実施例５の方
法を繰り返した。その後、１本鎖Ｆｖを使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦによって
確認したように、試験タンパク質のプロテアーゼ消化物からＮ末端ペプチドフラ
グメントを単離した。実施例４のように調製した正常ヒト脳の抽出物は、Ｈａｒ
ｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（１９８８）（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）によってＫＬＨに
結合させ、２匹のＢａｌｂＣマウスを免役するために使用した。腹腔内に４週間
隔で２回投与した。２回目の接種の後３から４日して、マウスを殺処分し、脾臓
を摘出した。次いでＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（商標）ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を使用して製造元の指示に従って、脾臓ｍＲＮＡの調製を開始した
。
【０１０３】 Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、マウス１本鎖Ｆｖｓ（
ＳｃＦｖ）のライブラリを作製した。１本鎖ｃＤＮＡをｍＲＮＡからＭ−ＭｕＬ
Ｖ逆転写酵素およびランダムヘキサマープライマーを使用して生成した。次いで
、抗体可変領域に隣接した保存配列に相補的な重鎖および軽鎖特異的プライマー
を使用して抗体の重鎖および軽鎖を増幅した。重鎖および軽鎖ＤＮＡから生成し
た３４０および３２５塩基対生成物それぞれを、別々にアガロースゲル電気泳動
後精製した。次いで、ＤＮＡリンカー−プライマー混合物を使用して、これらを
単一のＳｃＦｖ構成物に組み込み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドによってＶＨ
領域をＶＬ領域に結合させた。５’および３’末端それぞれにＳｆｉ１およびＮ
ｏｔ１部位を挿入するために設計されたプライマーで組み立てたＳｃＦｖを増幅
して、８００ｂｐ生成物を生成した。このフラグメントを精製し、ＳｆｉＩおよ
びＮｏｔＩで順次消化し、再度精製した。次いで、このフラグメントをＳｆｉＩ
およびＮｏｔＩ切断ｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドベクターにライゲーションし
た。ＰＣＡＮＴＡＢ５は、ファージ遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）をコードする
遺伝子を含み、ｇ３ｐ融合タンパク質として発現するように、ｇ３単一配列に隣
接してＳｃＦｖを挿入した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞をｐＣａｎｔ
ａｂ５／ＳｃＦｖファージミドで形質転換し、次いでＭ１３ＫＯ７ヘルパーファ
ージで感染させた。得られた組換えファージはＳｃＦｖ遺伝子をコードするＤＮ
Ａを含み、融合タンパク質として１種または複数の組換え抗体をチップにディス
プレイした。
【０１０４】 ペプチドに結合するファージディスプレイしたＳｃＦｖを次いで選択し、パニ
ングによって強化した。手短かにいうと、実施例１のビオチン化したプロテアー
ゼ処理ｐ５３調製物をストレプトアビジンコーティングガラススライド（Ｒａｄ
ｉｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウォルサム、米国）に載せ、このスライドを
ＰＢＳで４回洗浄した。ＰＢＳに溶かした２％無脂肪乾燥乳でブロックした後、
ファージ調製物を載せ、１時間インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で１０回洗浄後、ペプチド反応組換えファージを西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合抗Ｍ１３抗体で検出し、ｏ−フェニレンジアミン色素原基質で明らか
にした。これらのファージをその後、グリシン．ＨＣｌ ０．１Ｍ ｐＨ２．２
およびＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌで溶出し、Ｔｒｉｓ塩基２Ｍで中和した。溶出したフ
ァージをＪ培地２５ｍｌで増殖したＪＭ１０３で増幅した。パニングをさらに２
回行って、最後に１０個の単一プラークを単離し、プールしてさらに増幅した。
１０10増幅ファージの１部を、ＴＳＯ緩衝液に溶かしたビオチン化したエンドプ
ロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ消化ｐ５３ ０．１μｇと共に４ｃで２時間インキュベ
ートした。２時間後、ＴＳＯに溶かした抗Ｍ１３（ｐｈａｒｍａｃｉａ）０．５
μｇを添加し、１時間インキュベートして、次いでタンパク質Ａ／Ｇアガロース
（Ｓｉｇｍａ）５μｌを添加して、混合物を攪拌しながらさらに０．５時間イン
キュベートした。次いでこのアガロースビーズをペレットにして、前記実施例１
のように洗浄して、質量分光によって分析した。
【０１０５】 結果は、６５アミノ酸Ｎ末端Ａｒｇ−Ｃエンドプロテアーゼフラグメントに対
応する実施例１と同じ主なピークを示した。
【０１０６】 実施例７ この実施例では、試験タンパク質をコードする遺伝子フラグメントをポリヒス
チジンタグをコードする合成オリゴヌクレオチドでプライミングさせた。このｃ
ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ）によって発現させ、次いでタグ
の付いたペプチドフラグメントをニッケルキレートカラムを使用して単離した。
次いで、これらのフラグメントを使用して１本鎖Ｆｖ抗体フラグメントを単離し
た。その後、１本鎖Ｆｖを使用して、質量分光によって確認した試験タンパク質
のプロテアーゼ消化物からペプチドフラグメントを単離した。
【０１０７】 実施例８ 細胞からの全タンパク質調製物を使用して実施例６の方法を繰り返し、化学的
にタグ付けしたペプチドを使用して１本鎖Ｆｖ抗体フラグメントの集合体を単離
した。その後、これら１本鎖Ｆｖの１２種の混合物を使用して、試験タンパク質
のプロテアーゼ消化物からペプチドフラグメントを単離し、質量分光によって分
析した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/554 Ｇ０１Ｎ 33/554 33/566 33/566 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (31)優先権主張番号 ９９０７６４１．６ (32)優先日 平成11年４月６日(1999．4．6) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９１４８７４．４ (32)優先日 平成11年６月28日(1999．6．28) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９１５３６３．７ (32)優先日 平成11年７月２日(1999．7．2) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９１５６７７．０ (32)優先日 平成11年７月６日(1999．7．6) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９１６５１１．０ (32)優先日 平成11年７月14日(1999．7．14) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９２０５０３．１ (32)優先日 平成11年８月31日(1999．8．31) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９２２２８５．３ (32)優先日 平成11年９月21日(1999．9．21) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA39 BB22 DA36 FB01 FB03 HA12 4B024 AA11 BA44 CA04 HA15

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １種または複数が問題の標的に結合することが可能な個々の
    タンパク質のライブラリを提供することを含むタンパク質の同定、スクリーニン
    グおよび／または配列決定の方法であって、個々のタンパク質がそれぞれ、ライ
    ブラリの個々のタンパク質をそれぞれ同定するために使用することができる「バ
    ーコード」配列を配列内に含む方法。
  2. 【請求項２】 前記個々の「バーコード」配列が、ライブラリ内の個々のタ
    ンパク質をコードする遺伝子に挿入された１種または複数の核酸配列によってコ
    ードされる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記「バーコード」配列または配列類に１種または複数のエ
    ンドプロテアーゼ消化認識部位が隣接している請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記認識部位がエンテロキナーゼまたはＸａ因子などのエン
    ドペプチダーゼのための部位である請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記タンパク質ライブラリを、１種または複数の標的部分、
    たとえば標的タンパク質と接触／会合させる請求項３または４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記タンパク質と１種または複数の標的部分が溶液内で結合
    する請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 結合後、前記タンパク質／標的部分の複合体を単離し、続い
    てエンドプロテアーゼ消化によって「バーコード」配列または配列類を遊離する
    請求項５または６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 標的部分（類）に結合するタンパク質をコードする１種また
    は複数の遺伝子の回収または増幅のために、前記遊離「バーコード」配列または
    配列類を使用して、１種または複数の合成オリゴヌクレオチド、たとえばプライ
    マーを設計する請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 質量分光法を使用して、遊離「バーコード」配列の質量を測
    定し、次に遊離配列または配列類を識別することが可能であるか、または質量分
    光法を使用して遊離「バーコード」配列を直接決定する請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記タンパク質ライブラリが抗体ライブラリである請求項
    １から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質ライブラリが抗体領域、たとえば抗体可変
    領域を含むＦｖなど組換え抗体領域である請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ライブラリが、２種の鎖（重鎖および軽鎖から得た鎖
    ＶＨおよびＶＬ）からなるＦｖを含む請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＶＨおよびＶＬ鎖それぞれが独自の「バーコード」配列を
    有する請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記「バーコード」配列がＦｖ配列までのＣ末端である請
    求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１から１４のいずれか一項で定義されたタンパク質
    ライブラリ。
  16. 【請求項１６】 １種または複数の所望の特性について前記ライブラリをス
    クリーニングし、続いて所望する前記特性を有するライブラリの１種または複数
    の個々のタンパク質を同定するためにデレプリケーションすることを含むタンパ
    ク質ライブラリのスクリーニング方法。
  17. 【請求項１７】 標的部分への結合について前記ライブラリをスクリーニン
    グする請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 質量分光法、特にマトリックス支援レーザ脱離／イオン化
    法飛行時間型質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）によって結合を検出する請求項
    １７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ライブラリを特異的生物学的活性についてスクリーニ
    ングする請求項１６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記標的が複雑な混合物、たとえば分子、全細胞または細
    胞膜である請求項１７または１８に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 １種または複数が問題の標的に結合することが可能な個々
    のタンパク質のライブラリを提供することを含むタンパク質の同定および／また
    は配列決定の方法であって、個々のタンパク質それぞれが、その遺伝子と共に「
    会合部分」に結合している方法。
  22. 【請求項２２】 前記タンパク質ライブラリを、前記「会合部分」前後で問
    題の前記標的部分に接触させる請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記標的への結合についてスクリーニングした後に、前記
    ライブラリをデレプリケーションして、所望の特性を有し、標的に結合する１種
    または複数のタンパク質を識別する請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記「会合部分」が粒子である請求項２１から２３のいず
    れか一項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記粒子がラテックスビーズである請求項２４に記載の方
    法。
  26. 【請求項２６】 前記「会合部分」がタンパク質またはタンパク質複合体で
    ある請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記「会合部分」がアビジンまたはストレプトアビジンで
    あり、ライブラリ中のタンパク質および会合した遺伝子がビオチン化されている
    請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記「会合部分」がタンパク質および遺伝子の両者に結合
    することが可能な両特異的結合分子である請求項２１または２２に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記「会合部分」が細菌またはバクテリオファージなど生
    細胞または細胞性ウイルスである請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】 前記ライブラリ内の前記タンパク質の前記特性を変化させ
    る１個または他の分子が「会合部分」に結合している請求項２１から２９のいず
    れか一項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記ライブラリ内の前記タンパク質をコードする前記遺伝
    子が、個々のタンパク質の合成前に「会合部分」に付着する請求項２１から３０
    のいずれか一項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記タンパク質ライブラリが抗体タンパク質ライブラリ、
    たとえばＦｖなどの抗体領域のライブラリである請求項２１から３１のいずれか
    一項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 １種または複数が問題の標的に結合することが可能な個々
    のタンパク質ライブラリを提供するタンパク質の同定および／または配列決定方
    法であって、個々のタンパク質がそれぞれ個々の「コーディング部分」に付着し
    ている方法。
  34. 【請求項３４】 前記「コーディング部分」が独特の識別子「コード」を有
    する粒子である請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記「コード」が異なる比の測定可能シグナル、たとえば
    蛍光、化学ルミネセンスまたは放射標識、または独特の印などの物理的特性であ
    る請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 （ｉｉｉ）タンパク質混合物を消化または切断すること、 （ｉｖ）前記得られたペプチドを分画すること、および （ｖ）その質量および／または配列によって前記の得られたペプチドを分析す
    ることを含むタンパク質混合物の分析方法。
  37. 【請求項３７】 段階（ｉｉ）における前記分画をタンパク質結合剤のライ
    ブラリを使用して実施する請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 得られた前記ペプチドに、前記分画段階の一部として物理
    的分画および／または化学的タグ付けを行う請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 得られたペプチドに、前記分画段階の一部として１種また
    は複数のアミノ酸の添加を実施する請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記タンパク質結合剤のライブラリが抗体または抗体フラ
    グメントのライブラリである請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記タンパク質結合剤が、主要組織適合タンパク質、Ｔ細
    胞受容体およびＳＨ１領域などのタンパク質−タンパク質結合相互反応に関わる
    天然タンパク質またはタンパク質領域である請求項３７から３９のいずれか一項
    に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記タンパク質結合剤のライブラリが、分析する前記タン
    パク質混合物または会合タンパク質混合物から得られた１種または複数のタンパ
    ク質またはペプチドに対する結合について予備選択されている請求項４０または
    ４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記タンパク質混合物が標準化組換え遺伝子ライブラリか
    ら得られる請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記タンパク質混合物が消化または切断前に、最初にＮま
    たはＣ末端または特異的アミノ酸またはアミノ酸の特異的配列によって固相に結
    合している請求項３６から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 タンパク質に認められた特異的アミノ酸または修飾アミノ
    酸が、固相への結合まえに誘導体化され、このような結合が前記タンパク質混合
    物の消化または切断前後に生じる請求項３６から４３のいずれか一項に記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 前記特異的、または修飾したアミノ酸が、アビジンまたは
    ストレプトアビジンへの結合前に、ビオチンで誘導体化される請求項４５に記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 特異的、または修飾したアミノ酸が、リガンド特異的親和
    性薬剤に結合する前に、リガンドで誘導体化される請求項４５に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 タンパク質中に認められた特異的な自然修飾アミノ酸が修
    飾特異的親和性薬剤を使用して固相に結合し、このような結合が前記タンパク質
    混合物の消化または切断前後に生じる請求項３６から４３のいずれか一項に記載
    の方法。
  49. 【請求項４９】 １種または複数の消化／切断および誘導体化サイクルが実
    施される請求項４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 質量分析が消化または切断サイクルそれぞれの後に実施さ
    れる請求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 消化／切断後に遊離されたペプチドを、タンパク質結合剤
    を使用した分画の前後にＨＰＬＣなどの物理的方法を使用して分画する請求項３
    ６から５０のいずれか一項に記載の方法。
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