WO2015163745A1 - 바코드 이동 분석을 위한 이중 리포터 시스템을 보유한 효모 균주 - Google Patents

바코드 이동 분석을 위한 이중 리포터 시스템을 보유한 효모 균주 Download PDF

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WO2015163745A1
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protein
vector
sequence
yeast
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PCT/KR2015/004183
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황병준
김성훈
박성균
김병규
유해용
기윤
권남훈
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재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
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    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention relates to a yeast strain having a dual reporter system for barcode transfer analysis, and more particularly, using a yeast strain and a yeast strain simultaneously comprising a c—myc reporter expression cassette and a Cre reporter expression cassette. To detect a library-library-protein interaction.
  • One or two or more proteins in a cell exhibit biological function through interaction (non-covalent, physical binding) with each other.
  • understanding protein interactions is of great importance in understanding biological function.
  • Efforts to identify the interactions between proteins have continued to date in various disciplines such as biochemi stry, proteomics, molecular dynamics, and signal transduct ion.
  • methods for determining the interactions between proteins include Co—i— unoprecipi tat ion (Co-IP), Fluorescence resonance energy transfer (FRET), Yeast two-hybr id, and the recently designed Bimolecular Fluorescence Comlementat ion (BiFC). ) Is well known.
  • Yeast two-hybr id Fields S, Song 0, 1989
  • DBD DNA binding domain
  • AD Active domain
  • the two domains are separated by any interaction even though they are expressed independently of each other. It is based on the principle that normal functions as full signers are possible when maintaining close distance.
  • Saccharomyces cerevi siae S. yeast two-hybr id mothod. cerevisiae
  • GAL4 transcription factor is mainly used and is widely used for screening interactions between specific proteins or interactions for one protein. Therefore, by recombining the gene of the protein to be studied in each domain of the GAL4 transcription factor, it is a method to know the interaction by inducing expression in the same yeast.
  • Bait bait
  • Prey feeding
  • Bait mainly interacts with Bait proteins by recombining a gene for one type of protein to be studied and Prey mainly for cDNA library. This is done by selecting a partner.
  • DNA binding domain (DBD), Bait, active site (AD) and Prey are each transformed into yeast in the form of independent vector (Vector), and ADH1 promoter (ADH1 promoter present in each vector after introduction) ) Is always expressed (Constitutive express ion).
  • the expressed DBD-Bait, AD-Prey binding protein is transferred to the nucleus of the yeast by NLS (Nuclear Localization Signal) present at the N-terminus of the DNA binding domain and the active domain. If Bait and Prey do not interact with each other in the nucleus, DBD-Bait and AD-Prey do not form a complex, and thus cannot function as normal GAL4 transcription factors.
  • Bait and Prey interact with each other by expressing reporter genes.
  • the reporter in the yeast genome is composed of the GAL4 UAS (Upstream Activation Sequence) and reporter genes to which the DNA binding domain of the GAL4 transcription factor can bind, typically LacZ, MELKColormetric repoter (HIS3), ADE2, URA3 (Authotrophic reporter) Is used.
  • GAL4 UAS Upstream Activation Sequence
  • reporter genes to which the DNA binding domain of the GAL4 transcription factor can bind typically LacZ, MELKColormetric repoter (HIS3), ADE2, URA3 (Authotrophic reporter) Is used.
  • HIS3 MELKColormetric repoter
  • ADE2 Authotrophic reporter
  • Yeast two-hybrid The advantage of Yeast two-hybrid is that it can be performed in vivo, and because it uses yeast as a higher eukaryote, it is more advantageous when using bacteria (Bacteria). There are few elements needed to do this, and the ability to simultaneously screen interactions between thousands of proteins.
  • Y2H the existing Yeast two-hybrid system
  • the first limitation is that mass screening is difficult. Specific proteins through Y2H When screening to find interacting proteins for proteins, a protein library with high diversity is used. For example, when using a protein library with a diversity of 1.0 X 10 7 in screening for interacting proteins for a specific protein A, a thousand (1.0 X 10 3 ) yeast colonies can be selected from one agar medium. If so, the experimenter should use 10,000 agar plates for screening. This consumes a considerable amount of labor for the experimenter and is inefficient in terms of time and cost. Therefore, this problem has a limitation that the mass screening is difficult.
  • the second limitation is the analysis of the data obtained through the screening.
  • agar cells were used to select positive candidates (yeasts with interactions between proteins), and then plasmids were obtained to analyze prey gene data through Sanger sequencing. Using this approach, analyzing all of the positive candidates obtained through mass screening requires a lot of labor and time and cost is also very inefficient.
  • the third limitation is the sensitivity of the existing reporter system.
  • c-myc epitope is added to the yeast strain cell wall by the interaction of two proteins, bait and prey. Constructing a dual reporter Yeast two-hybrid system in which the 1st reporter system and the 2nd reporter system in which Cre recombinase is expressed are operated simultaneously, and the yeast strain having the dual reporter system of the present invention simultaneously binds pairs of proteins at the library level.
  • the present invention has been completed by confirming that a means for efficiently searching can be provided.
  • an object of the present invention is to simultaneously include expression cassettes of (i) and ( ⁇ ).
  • Is to provide a dual reporter yeast strain (i) a c-myc reporter expression cassette sequentially operably linked comprising a GAL4 UAS (upstream activation sequence), a GALl promoter, a MF ⁇ 1 gene, a c-myc epitope coding polynucleotide and an Agal gene;
  • a Cre reporter expression cassette sequentially operably linked and comprising a GAL4 UAS (upstream activation sequence), a GAL1 promoter and a Cre recombinase expression gene.
  • Another object of the present invention is to perform the steps of (a) transforming the bait library and prey library to the dual reporter yeast strain; And (b) detecting whether the double reporter is expressed from the transformed yeast strain and detecting bait-prey protein binding pairs.
  • the present invention provides a dual reporter yeast strain comprising simultaneously the expression cassette of the following ( ⁇ ) and ( ⁇ ); (i) a c-myc reporter expression cassette sequentially operably linked comprising a GAL4 upstream activation sequence (UAS), a GALl promoter, a MF ⁇ 1 gene, a c-myc epitope coding polynucleotide and an Agal gene; And ( ⁇ ) a sequentially operably linked Cre reporter expression cassette comprising a GAL4 UAS (upstream activation sequence), a GALl promoter and a Cre recombinase expression gene.
  • UAS upstream activation sequence
  • Cre Cre reporter expression cassette
  • the present invention comprises the steps of (a) transforming the bait library and prey library to the double reporter yeast strain; And (b) providing a protein interaction detection method comprising the step of detecting the bait-prey protein binding pairs by examining whether the reporter expression from the transformed yeast strain.
  • the term "two-hybrid system” means a method for analyzing protein interaction by confirming protein binding using activation of a reporter gene and a series of constructs used therefor.
  • double-low The hybrid system uses a transcription factor capable of activating a reporter gene into two physically separated mother domains, a DNA-binding domain and a transcriptional activation domain.
  • the DNA-binding domain and the transcriptional activation domain are fused to the bait and prey proteins for which the interaction is to be expressed, respectively, and the recombinant protein is expressed.
  • the interaction between the two proteins can be confirmed by expressing the reporter gene while showing activity by binding the DNA-binding domain and the transcriptional activation domain by the Ray protein interaction.
  • the term “ba i t” refers to a protein of interest or a nucleotide sequence encoding the target protein to be identified when the protein binding in the study of protein interaction.
  • the bait protein may be fused with a DNA-binding domain or a transcriptional activation domain of a transcription factor that activates a reporter gene to confirm protein interaction.
  • the bait protein is fused with the DNA-binding domain of the transcription factor.
  • the term "prey” refers to a protein that is expected to bind to a target protein or a nucleotide sequence encoding the same when confirming protein binding in the study of protein interaction.
  • the prey protein may be fused with a DNA-binding domain or a transcriptional activation domain of a transcription factor that activates a reporter gene to confirm protein interaction.
  • the prey protein is fused with the transcriptional activation domain of the transcription factor.
  • the term 'library' refers to a mixture, collection or set of heterologous polypeptides or nucleic acids.
  • the library consists of members, each with a single polypeptide or nucleic acid sequence. Sequence differences between library members are responsible for the diversity present in the library.
  • the library may take the form of a simple mixture of polypeptides or nucleic acids, or may be in the form of an organism or cell transformed with a library of nucleic acids, eg, bacterial virus, yeast, animal or plant cells.
  • the term 'vector' is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and is essential for operably linked to express a gene insert. Genetic constructs comprising regulatory elements. Such vectors include plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, yeast vectors, viral vectors and the like. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, "pl asmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • each vector is described in the 5 'to 3' direction on the basis of the strand of one of the double strands constituting the plasmid, unless otherwise specified.
  • the order of description of the genetic building blocks that make up the vector may be substantially inconsistent with the direction in which the genome is transferred, while the direction of transcription of the dielectric contained in the vector is from the promoter to the structural gene operably linked to the promoter. to be. Therefore, in the present invention, the terms “upstream” and “downstream” refer to the relative position of each nucleic acid unit on the reference strand unless otherwise specified.
  • the term 'DBD vector' refers to a recombinant protein expressed in a host in a form in which a nucleotide sequence encoding a bait protein is inserted into a multiple cloning site and fused with a DBD of a specific transcription factor (eg, GAL4). It means a vector configured to be able to talk.
  • a specific transcription factor eg, GAL4
  • the term 'AD vector' refers to a recombinant protein expressed in a host in a form in which a nucleotide sequence encoding a Frey protein is inserted into a multiple cloning site and fused with AD of a specific transcription factor (eg, GAL4).
  • a specific transcription factor eg, GAL4
  • operably linked means that specific sequences interact directly or indirectly to perform an intended function, such as mediating or regulating gene expression. Interaction of operably linked sequences can be mediated, for example, by proteins that interact with operably linked sequences. When the transcriptional regulatory region and the sequence of interest are operably linked, these sequences can be functionally linked so that transcription of the sequence of interest can be mediated or regulated by the transcriptional regulatory region.
  • the term 'drug resistance gene' refers to a gene that gives a selectable phenotype of a transformant appropriately transformed by a specific drug treatment, wherein the drug includes an antibiotic, a cytotoxic agent, or the like.
  • the drug resistance gene means an antibiotic resistance gene, for example, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, streptomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, gentamycin resistance gene, carbeni Silin resistant genes, and the like, but are not limited thereto.
  • the fluorescent protein is not particularly limited as long as it is a protein known in the art that emits fluorescent light.
  • the term 'nutrient requirement marker gene' is used interchangeably with the term 'nutritive marker' in the present invention, and can compensate for the nutritional requirements of the cells and thus provide It is a marker sequence that encodes a gene product that gives nutrition.
  • "nutrition” means that the cells must be grown in a medium containing essential nutrients that cannot be produced by the trophogenic cell itself. Genetic production of trophic marker genes promotes the synthesis of essential images lost in trophic cells. It is not necessary to attach essential nutrients to the culture medium in which cells are grown by successfully expressed trophic marker genes.
  • Preferred nutritional markers include URA3, LEU2, CAN1, CYH2, TRP1, ADE1, ADE2 and MET5 and the like.
  • the term 'promoter' is a broad concept and may mean a region of initiation from a structural gene, and more specifically, a specific nucleotide sequence When linked, it means a DNA sequence capable of controlling the transcription of the specific nucleotide sequence to mR A.
  • a promoter is not applied in all cases but provides a site at 5 'of the desired nucleotide sequence to be transcribed into mRNA and specifically binding to a transcription factor for RNA polymerase and other transcription initiation.
  • the term 'barcode sequences' is added in different vectors, so that any short one can be used to indicate or distinguish each foreign gene (or gene of interest) added to the vector.
  • the gene of interest corresponds to a bait or prey protein, and a person skilled in the art can arbitrarily select a barcode sequence in advance for each bait and prey protein (or nucleic acid sequence encoding the same) to know the correlation. Add and establish their relationship.
  • the barcode sequence can be arbitrarily set so that those skilled in the art can display it according to the bait or prey protein inserted into the vector.
  • the number of nucleotides constituting the barcode sequence is not particularly limited, but may be composed of 1 to 20 nucleotides, and preferably 5 to 15 nucleotides.
  • the term 'adjacent' may refer to a position within about 1 to lOObp with respect to the positional relationship of genetic elements (elements) in the construct, preferably May mean within 1 to 50bp apart.
  • the term 'expression cassette' is used interchangeably with the 'expression construct' and means a nucleic acid construct capable of expressing a desired structural gene, and is appropriately linked to an appropriate promoter and operably linked thereto. Multi-including structural genes
  • NGS Next Generat Ion Sequencing'
  • the present invention provides a dual reporter yeast strain comprising simultaneously the expression cassettes of (i) and (); (I) a c-myc reporter expression cassette sequentially operably linked comprising a GAL4 UASCupstream activation sequence, a GALl promoter, an MF ⁇ 1 gene, a c-myc epitope encoding polynucleotide and an Agal gene; And
  • Cre reporter expression cassettes which are operably linked in sequence and comprising a GAL4 UAS (upstream activation sequence), a GALl promoter and a Cre recombinase expression gene.
  • the c-myc reporter system shown in FIG. 11A) by the expression cassette (i) and the Cre reporter system (B in FIG. 11) by the expression cassette of (ii) It is characterized by having a binary reporter system of the present invention.
  • the yeast strain of the present invention can be any strain that can be used in the yeast two hybrid, for example Saccharomyces ⁇ Saccharomyces spp., Kluyberomyces ⁇ U uyveromyces spp.), Schi zosaccharomyces spp., Pichy 0 1 " ⁇ (Pichia spp.), Papi ⁇ ] ⁇ ⁇ -(Paffia spp.), Candida spp.), Talatomys Genus alaromyces spp.), Bretanomyces genus (Brettanowyces spp.), Pachysolen ⁇ iPachysolen spp.) Or Debaryomyces genus (Debaryomyces spp.) And the like.
  • Saccharomyces ⁇ Saccharomyces spp. Kluyberomyces ⁇ U uyveromyces spp.
  • Schi zosaccharomyces spp.
  • the strain may be of the genus Saccharomyces, and more preferably, it may be Saccharomyces cerevisiae ccAs / ces cerevisiae strain.
  • the c-myc reporter expression cassette of (0) is referred to herein as '1st reporter' or
  • a '1st reporter system' includes a GAL4 upstream activation sequence (UAS), a GALl promoter, a MF ⁇ 1 gene, a c-myc epitope coding polynucleotide and an Agal gene, which are operably linked in sequence.
  • UAS GAL4 upstream activation sequence
  • GALl promoter a GALl promoter
  • MF ⁇ 1 gene a MF ⁇ 1 gene
  • a c-myc epitope coding polynucleotide and an Agal gene, which are operably linked in sequence.
  • the GAL4 UAS may bind to the DNA binding domain (DBD) of the GAL4 transcription factor.
  • DBD DNA binding domain
  • DBD-Bait and AD-Prey are fused with bait and prey proteins, respectively (these are commonly called DBD-Bait and AD-Prey, respectively).
  • DBD-Bait and AD-Prey are commonly called DBD-Bait and AD-Prey, respectively.
  • DBD-Bait and AD-Prey are expressed in yeast strains.
  • DBD-Bait and AD-Prey interact, GAL4 transcription factor is activated Transcription of the report sequence that is operably linked to one another occurs.
  • the nucleic acid sequence of the GAL1 promoter in the present invention is not limited to this, for example, may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the MFal gene is a secretory signaling factor for the secretion of proteins by foreign genes (in the present invention c-myc epitopes) in yeast.
  • Nucleic acid sequence of the MFal gene in the present invention is not limited thereto, for example, may be made of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25.
  • the c-myc epitope encoding polynucleotide was configured to express only a specific epitope in Myc protein.
  • the sequence configuration of the c-myc epitope encoding polynucleotide of the present invention is not limited thereto, but may be, for example, consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26.
  • the c-myc epitope may mean a repeat of an epitope in c-myc (ie, it is linked to the first c-myc epitope and expressed several times). The number of repetitions is not particularly limited, but may be 1 to 20 times, preferably 1 to 10 times.
  • the Agal gene is a gene that expresses alpha -aglutinin, a cell surface glycoprotein of the yeast strain.
  • the Agal gene is linked to c-myc epitope coding polynucleotide. Therefore, when bait and prey interact in the yeast two hybrid experiment, alpha-aglutinin is expressed on the cell surface along with c-myc epitope, thereby exposing c-myc epitope on the cell surface.
  • the nucleic acid sequence of the Agal gene is not limited thereto, but may be, for example, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28.
  • the c-myc epitope encoding polynucleotide and the Agal gene may be directly linked to the nucleic acid or may be linked by a linker.
  • the term 'linker' refers to any nucleic acid sequence connecting two nucleic acids.
  • the linker linking the c-myc epitope encoding polynucleotide and the Agal gene is not particularly limited in sequence structure, and preferably a nucleic acid encoding a peptide fragment consisting of glycine or glycerin and / or serine. May be a sequence.
  • the peptide fragment consisting of glycine or / and serine is not particularly limited in the number and combination of glycine and serine constituting the peptide fragment.
  • the linker connecting the c-myc epitope encoding polynucleotide and the Agal gene may be formed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27.
  • the c - myc reporter expression cassette of (i) may be operably linked to a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 13 downstream of GAL4 UAS.
  • the DNA sequence of SEQ ID NO: 13 is characterized in that the 10-time repeat of the c-myc epitope is inserted.
  • the lower Myc protein (especially c-myc epitope) is expressed on the cell surface and is detected by a method of detecting the same. You can check whether bait and prey interact.
  • the method for detecting the cell surface expression of the Myc protein may be by a known protein detection method, preferably an antibody and identification that specifically binds to Myc protein (especially c-myc epitope). It may be a detection method by an antibody including a possible label and specifically binding to the antibody.
  • a known cell detection or cell selection method using the binding specificity of the antibody may be used, but is not limited thereto.
  • Magnetic-activated cell sorting (MACS) method may be.
  • the identifiable label may be preferably a fluorescent substance, more preferably a cyanine-based fluorescent substance.
  • the method for detecting the expression of the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a known fluorescence analysis method.
  • the fluorescence analysis and the fluorescence-activated cell sorting (FACS) method capable of classifying fluorescence-expressing cells, fluorescence microscopy, etc. can do.
  • the Cre reporter expression cassette of ( ⁇ ) is referred to herein as a '2nd reporter' or '
  • 2nd reporter system and the like, and are sequentially operably linked and include a GAL4 upstream activation sequence (UAS), a GAL1 promoter, and a Cre recombinase expression gene.
  • UAS GAL4 upstream activation sequence
  • GAL1 promoter a GAL1 promoter
  • Cre recombinase expression gene a GAL4 upstream activation sequence
  • the GAL4 upstream activation sequence (UAS) and the GAL1 promoter are as described above.
  • the 'Cre recombinase expression gene' is used herein It is used interchangeably with terms such as the 'CRE gene'.
  • the Cre recombinase is a tyrosine recombinase derived from P1 bacteriophage, and is known as an enzyme utilized to induce Cre-Lox sit recombination.
  • the specific base sequence of the Cre recombinase expression gene in the present invention is not particularly limited, but may be, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 29. have.
  • the Cre reporter expression cassette of (i) may be operably linked to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 14 downstream of GAL4 UAS.
  • Cre recombinase is expressed when bai t and prey introduced into the strain of the present invention interact with the GAL4 transcription factor. Therefore, by detecting the Cre recombinase directly (detection), or by detecting the genetic change generated in the cell due to the expression of the Cre recombinase it can be confirmed whether the interaction of Bai t and prey.
  • the method for directly detecting the Cre recombinase may be by a known protein detection method, and preferably includes an antibody and an identifiable label that specifically binds to the Cre recombinase, and is specific for the antibody. It may be a detection method by the antibody to bind.
  • the identifiable label is not particularly limited as long as it is used as a protein or antibody labeling material in the art, but may preferably be a fluorescent material.
  • the method for detecting the expression of the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a known fluorescence analysis method, preferably, a fluorescence analysis and a fluorescence-act ivated cel l sorting (FACS) method capable of fluorescence analysis and fluorescence-expressing cells, a fluorescence microscope, and the like. You can.
  • the Cre-lox recominat ion system is introduced into the yeast of the present invention. It may be a method of detecting changes in nucleic acids. This may require prior work to introduce one or more loxes to the genome of the yeast strain and / or foreign nucleic acids (eg, vectors, etc.) to be introduced into the yeast strain, before the Bai t and prey proteins are expressed in the yeast cells. It may be necessary.
  • the kind is not particularly limited, but for example ⁇ ⁇ loxL, loxR, ⁇ , 1 ⁇ 3, 1 ⁇ 23 (also referred to in the art as 1 ⁇ 23) ⁇ 1 ⁇ ⁇ 86, 1 ⁇ ⁇ 117, 1 ⁇ 511 (also referred to in the art as 1 ⁇ 511), loxC2, 1 ⁇ 2272 (also referred to in the art as 10x2272), 1 ⁇ 5171 (also referred to as 1 ⁇ 51 in the art), 1 ⁇ 71 (in the art 1 ox group), 1 ⁇ 66 (also known as 1 ⁇ 66 in the art), M2, M3, M7 and Mil.
  • ⁇ or ⁇ variant UoxP mutant Preferably ⁇ or ⁇ variant UoxP mutant).
  • Cre recombinase When Cre recombinase is expressed, recombination occurs between nucleic acid regions containing lox si te, resulting in a change in nucleic acid sequence, and the changed nucleic acid sequence may exhibit a substantial change phenotype.
  • the changed nucleic acid sequence can be detected (identified) by known sequencing methods.
  • the sequencing method is not limited thereto, but may be performed by a method such as Sanger sequencing or NGS (Next generat ion sequencing).
  • the change phenotype may be detected to determine the interaction between bai t and prey protein.
  • the change phenotype is meant to include all of the newly-expressed phenotypes or combinations of phenotypes.
  • Newly represented phenotypes for example, where one or more lox si tees are located near marker genes that do not belong to any translation frame in advance, may result in bai t and prey protein interactions.
  • lox si te recombination occurs by the expressed Cre recombinase, the position of the nucleic acid sequences may be switched in the frame so that the marker gene enters the translation frame, thereby not being expressed. Marker genes are not expressed, resulting in a change in phenotype.
  • the combination of phenotypes is loxed by Cre recombinase expressed due to bai t and prey protein interactions, for example when placing one or more lox si tees near one translation frame for a marker gene.
  • si te recombination occurs, the entire translation frame of the marker gene may be switched to another location on the genome to represent a plurality of phenotypes.
  • the marker gene is not particularly limited in kind, and includes, for example, a drug resistance gene, a fluorescent protein coding gene, a nutritional requirement marker gene, and the like.
  • a fluorescent protein coding gene is used as the marker gene, in which case fluorescence analysis and classification of fluorescence-expressing cells are possible.
  • the cells can be easily selected through methods such as Fluorescence-act ivated Cel l sorting (FACS).
  • the 1st reporter system and the 2nd reporter system may be located at different regions in the yeast genome.
  • the 1st reporter system and the 2nd reporter system are on different chromosomes.
  • the double reporter yeast strain of the present invention was deposited by KCTC12792BP by the inventors.
  • the deposited strain contains the c-myc reporter expression cassette on the chromosome 15 of the yeast genome operably linked to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 13 downstream of the GAL4 UAS as an i st reporter system, and as a 2nd reporter system.
  • Downstream of GAL4 UAS a Cre reporter expression cassette operably linked to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 14 is contained on chromosome 5.
  • the dual reporter yeast strain of the present invention when applied to a 'double-hybrid system', detects and selects protein interactions at the library level, and provides convenient and high accuracy in processing a large amount of information related to their relationship. It provides the benefits of doing so.
  • Such advantages of the dual reporter yeast strain of the present invention will be described in detail in the following description of an example in which the dual reporter yeast strain of the present invention is applied to a dual-hybrid system.
  • the 'bait library' refers to a total collection of nucleic acids encoding different bait proteins, and specifically, a DNA binding domain (DBD) and a bait protein of a transcription factor (GAL4 in the present invention).
  • Vector or its containing genes Means an aggregate.
  • the DBD of the transcription factor and the bait protein are expressed in a linked (fused) form.
  • the vector used for the production of the bait library may be a known DBD vector using GAL4 as a transcription factor, and includes, for example, pGBKT7, pAS2-l c , pGBT9, pBr idge, and pDEST TM 32. However, it is not limited thereto.
  • the bait library removes multiple cloning sites (MCS) in plasmid pGBKT7, replaces multiple cloning sites (MCS) with two Sf i I restriction enzyme sequences, followed by 10 ⁇ 2272 sequence and barcode insertion site, Kanamycin antibiotic resistance gene and promoter, GFP gene and ⁇ may be produced using a pDBD-donor vector characterized in that the sequence was introduced.
  • a different bait protein coding sequence may be inserted between two Sf i I restriction enzyme sites in the pDBD-donor vector, and a barcode sequence indicating each bait protein may be inserted into the barcode insertion site.
  • the pDBD-donor vector was prepared by genetic modification based on the pGBKT7 vector to remove the multiple cloning site (MCS) and replace the multiple cloning site (MCS) with two Sf i I restriction sites. Then, 10x2272 sequence, barcode insertion site, kanamycin antibiotic resistance gene and promoter, GFP gene and ⁇ sequence were introduced sequentially.
  • the pGBKT7 vector is a yeast two hybr id vector designed so that a target protein can be expressed by binding (fusion) to a GAL4 DNA binding domain (DBD) and has a structure as shown in FIG. 4. .
  • ⁇ sequence and 1 ⁇ 2272 sequence are sequences recognized and swept by Cre recombinase.
  • the pDBD-donor vector of the present invention comprises a ⁇ sequence and a 10 ⁇ 2272 sequence recognized and recombined by Cre recombinase, wherein the ⁇ sequence and 1 ⁇ 2272 sequence are preferably at intervals ranging from 500 to 4000bp (base pai r) between each other. It may be located. More preferably, the ⁇ sequence and the 10x2272 sequence may be positioned at intervals of 750 to 3500 bp, and most preferably at intervals of 1500 to 2500 bp.
  • the ⁇ sequence and 1 ox2272 sequence of the pDBD-donor vector are located in the same orientation (same or i entat i on).
  • a GFP gene and a barcode sequence insertion site are introduced between the ⁇ sequence and the 10 ⁇ 2272 sequence.
  • the GFP (green f luorescent protein) gene is expressed by the LEU2 promoter and exhibits fluorescence.
  • the barcode sequence of the pDBD-donor vector is constructed so that it can be identified in connection with (or adjacent to) the barcode sequence of the pAD-acc vector described below (see FIG. 18).
  • the 'replacement of the multiple cloning site (MCS) with two Sf i I restriction enzyme sites' means to make the MCS of the existing vector as a gene insertion site for the target protein.
  • the gene insertion site is a site into which a gene of the target protein constituting the library can be inserted, and it is preferable to introduce a desired gene including any restriction enzyme recognition site, and the restriction enzyme is a known restriction enzyme.
  • the kind is not particularly limited, but preferably two Sf i I.
  • the gene inserted into the gene insertion site is a gene to be introduced into the pAD-acc vector to be described later and a target gene to know the interacting ion, and the type thereof is not particularly limited.
  • the barcode sequence insertion site is a sequence representing the bait protein gene introduced into the gene insertion site (between two Sf i restriction sites) of the pDBD-donor vector, but the number of nucleotides is not particularly limited. It may be composed of 5 to 20 nucleotides, preferably 5 to 15 nucleotides.
  • the barcode sequence insertion site includes any restriction enzyme recognition site so as to introduce a desired bar code, and the restriction enzyme is a known restriction enzyme, but the type thereof is not particularly limited, but preferably Af l II and Age I.
  • the pDBD-donor vector of the present invention may preferably be represented by the cleavage map of [FIG. 2].
  • the pDBD-donor vector shown in the cleavage map of FIG. 2 includes a set of Sf i I restriction enzyme sites as the first cloning site for bait protein insertion, and AII II and Age as a second cloning site for barcode insertion. I sets of restriction enzyme recognition sequences are included.
  • the pDBD-donor vector represented by the cleavage map of FIG. 2 may preferably consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, and was deposited by the inventor with the deposit number KCTC12790BP.
  • the 'prey library' refers to the total aggregate of nucleic acids encoding different prey proteins, and specifically, the transcriptional activity of the transcription factor (GAL4 in the present invention). Means a vector or a combination thereof comprising a gene encoding a sex domain (AD) and a Prey protein. In the prey library, the transcription factor AD and the prey protein are expressed in a linked (fused) form.
  • the vector used in the preparation of the prey library may be a known AD vector using GAL4 as a transcription factor.
  • GAL4 as a transcription factor.
  • pACT2 pGADT7
  • pGADIO pGADIO
  • pGAD424 pGAD GH
  • PGAD GL pDEST TM 22 and pEXP TM- AD502, and the like.
  • the prey library inserts the ⁇ ⁇ sequence at the LEU2 gene terminus (transcriptional basis) of plasmid pGADT7 and replaces the multiple cloning site (MCS) with two Sf i I restriction sites.
  • Barcode insertion site, 10x2272 sequence may be prepared using a pAD-acc vector characterized in that the sequence is introduced.
  • the PAD-acc vector may be prepared by inserting different prey protein coding sequences between two Sf i I restriction enzyme sites and inserting barcode sequences representing the respective prey proteins into the barcode insertion site. Can be.
  • the pAD-acc vector was produced by genetic modification based on the pGADT7 vector, inserts the ⁇ sequence at the LEU2 gene terminus (transcriptional basis), and provides multiple cloning sites (MCS) with two Sf i I restriction enzymes. It is replaced with a site, and then the barcode insertion site 10x2272 sequence is characterized in that it was introduced sequentially.
  • MCS multiple cloning sites
  • the pGADT7 vector is a yeast two hybr id vector designed to be expressed by binding (fusion) the target protein to the GAL4 act ivat ion domain (AD) and has a structure as shown in FIG. 3.
  • the LEU2 gene is an upst ream regulator of leucine and is generally included in the PGADT7 vector, which is generally used for screening yeast.
  • the LEU2 gene is regulated by the LEU2 promoter which is operably linked thereto.
  • the ⁇ sequence and 1 ⁇ 2272 sequence are located at a distance from each other at regular intervals, and may be preferably located at intervals of 500 to 4000bp (base pai r). More preferably, the ⁇ sequence and 1 ⁇ 2272 sequence may be positioned at intervals of 500 to 3000 bp, and most preferably in a range of 700 to 1200 bp.
  • the ⁇ sequence and 1 ⁇ 2272 sequence of the pAD-acc vector are in the same orientation. (same or i ent at ion) All.
  • the ⁇ sequence and 1 ⁇ 2272 sequence of the pAD-acc vector are preferably arranged (or positioned) in the same relative orientation with the ⁇ sequence and 10x2272 sequence of the pDBD-donor vector.
  • a sequence of ⁇ is located at the bottom of the LEU2 gene (transfer direction reference), and expression is generated when another gene sequence is bound to the bottom of the LEU2 by Cre recombinase.
  • the LEU2 gene terminal into which the ⁇ sequence is introduced is configured to remove the stop codon so that expression is not interrupted at the LEU2 terminal during expression.
  • a barcode sequence insertion site is introduced before the 10x2272 sequence so that the barcode sequence inserted at the barcode sequence insertion site is combined with or adjacent to another barcode sequence (ie, a barcode sequence from a pDBD-donor vector) transferred by Cre recombinase. It is configured to be.
  • FIG. 5 shows a cleavage map of the vector after some sequences from the pDBD-donor vector by Cre recombinase (sequences at which both ends are fl anking by ⁇ and 1 ⁇ 2272) are swi tched into the pAD-acc vector.
  • Cre recombinase sequences at which both ends are fl anking by ⁇ and 1 ⁇ 2272
  • the swi tch process and the result of is shown in FIG.
  • the 'replacement of the multiple cloning site (MCS) with two Sf i I restriction enzyme sites' means to make the MCS of the existing vector as a gene insertion site for the target protein.
  • the gene insertion site is a site into which a gene of the target protein constituting the library can be inserted, and it is preferable to introduce a desired gene including any restriction enzyme recognition site, and the restriction enzyme is a known restriction enzyme.
  • the kind is not particularly limited, but preferably two Sf i I.
  • the gene inserted into the gene insertion site is a target gene for understanding the interaction ion with the gene introduced into the pDBD-donor vector, and the type thereof is not particularly limited.
  • the barcode sequence insertion site is a sequence representing a prey protein gene introduced into the gene insertion site (between two Sf i I restriction sites) of the pAD-acc vector, and the number of nucleotides is not particularly limited. One, may be composed of 1 to 20 nucleotides, preferably 5 to 15 nucleotides.
  • the barcode sequence insertion site may include any restriction enzyme recognition site so as to introduce a desired barcode, and the restriction enzyme is a known restriction enzyme, but the type thereof is not particularly limited, but preferably BsiW I , Xbal and Sac II, and for example, a set of BsiW I and Sac II or a set of Xbal and Sac II can be used.
  • the pAD-acc vector of the present invention may preferably be represented by a cleavage map of FIG. 1 or FIG.
  • the cleavage maps of FIGS. 1 and 10 differ in the restriction enzyme recognition sequence included in the barcode insertion site, and all other configurations are the same.
  • the barcode insertion site of the pAD-acc vector shown in the cleavage map of FIG. 1 includes restriction enzyme recognition sequences of BsiW I and Sac II, and the Xbal barcode insertion site of the pAD-acc vector shown in the cleavage map of FIG. And restriction enzyme recognition sequences of Sac II.
  • the pAD-acc vector represented by the cleavage map of FIG. 1 may be preferably composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the pAD-acc vector represented by the cleavage map of FIG. 10 may preferably consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, and was deposited by the present inventor with accession number KCTC12791BP.
  • the transformation may include any method of introducing a nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and may be performed by transformation techniques known to those skilled in the art.
  • transformation techniques known to those skilled in the art.
  • calcium phosphate calcium chloride method chlorochloride dandruff method, microprojectile bombardment, electroporation, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, ultrasonic To be performed by sonication, PEG-mediated fusion, microinjection, liposome-mediated method, magnetic nanopart icle-mediated method, etc.
  • the Myc protein (especially c-myc epitope) is expressed on the cell surface by the 1st reporter system, and thus, the method is used to detect this.
  • the method for detecting cell surface expression of the Myc protein is as described above.
  • Cre recombinase is expressed by the 2nd reporter system, it is possible to directly detect the Cre recombination enzyme, or to detect a genetic change generated in the cell due to the Cre recombinase expression. You can check whether prey interacts with.
  • the method for directly detecting Cre recombinase and the method for detecting genetic changes generated in cells due to the expression of Cre recombinase are as described above.
  • the three most preferred method of implementation may be as follows;
  • ⁇ i5i> (a) introducing different barcode sequences into the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector, and recombining genes expressing different target proteins to construct first and second libraries;
  • a protein expressed from a gene introduced into the pAD-acc vector and a protein expressed from a gene introduced into the pDBD-donor vector are derived from a yeast strain into which the first library and the second library are introduced. Selecting yeast strains to interact;
  • (D) providing a method for detecting the interaction between proteins comprising identifying the barcode sequence of the selected yeast strain and selecting the interacting protein.
  • step (a) different barcode sequences are introduced into the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector, respectively, and the first and second libraries are constructed by recombining genes expressing different target proteins.
  • the pAD-acc vector, pDBD-donor vector and barcode sequence are as described above. same.
  • a schematic diagram for the vectors is provided in FIGS. 14A and 14B.
  • the barcode is a sequence introduced to identify a gene to be recombined, and it is preferable that a different barcode sequence is introduced according to a target protein gene (ie, a bait protein gene or a prey protein gene) to be recombined into each vector.
  • the barcode sequence is inserted at the barcode sequence insertion site of the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector.
  • the target protein gene refers to a DNA (gene) encoding a protein to be confirmed whether or not to interact, and gene insertion sites (between two Sf i I si te) of the pAD-acc vector and pDBD-donor vector Is inserted into
  • the method of recombining the barcode sequence and the gene into the vector of the present invention may be by a known gene manipulation method.
  • the first library of the present invention refers to the pAD-acc vector group into which the target protein gene (especially the Frey protein gene) and the barcode sequence are introduced.
  • the second library refers to the target protein gene (especially the bait protein gene). And pDBD-donor vector groups into which barcode sequences are introduced.
  • the first and second libraries are introduced into the dual reporter yeast strain of the present invention.
  • the method of introducing the library of the present invention into a yeast strain may be by a known yeast transformation method.
  • step (c) the protein expressed from the gene introduced into the pAD-acc vector
  • AD- Prey proteins expressed from genes introduced into the pDBD-donor vector (DBD-Bai t) 'screen for interacting yeast strains.
  • the yeast strain of the present invention has a dual reporter system of (i) and (ii) described above, when A and Prey interact with DBD-Bai t, the reporter of (i) The c-myc epitope is expressed on the surface of the yeast cell wall by the system, and the (?) Reporter system expresses various phenotypes such as expression of GFP, barcode sequence combination, and resistance to two or more antibiotics.
  • Cre recombinase produced by the expression of the CRE gene of the reporter system (ii) is used in the yeast two hybi rd process. Recognize and recombine ⁇ and 1 ox2272 sequences of pAD-acc and pDBD-donor vectors introduced into yeast strains. Expression of GFP Protein by Recombination with Cre Recombinase of Two Vectors (Recombination) GFP is expressively linked to the bottom of LEU2 by.
  • a combination of the GFP in frame and the barcode sequence (the barcode sequence of the pDBD-donor vector is transferred to the pAD-acc vector) occurs in the LEU2 translation frame, and the expression of the GFP protein occurs.
  • Detect ion may be used to sel ect ion the strain that interacted with Bait and prey, and to identify the barcode sequence included in the combined pAD-acc vector and pDBD-donor vector to determine what protein interacted with You can check.
  • the identification refers to identifying a polynucleotide sequence of a barcode, and can be identified by a known sequence method.
  • the method of detecting the expression of the GFP protein is not particularly limited as long as it is a known fluorescence analysis method.
  • the fluorescence analysis and the fluorescence-expressed cel l sort i ng (FACS) method capable of classifying fluorescence-expressing cells are possible. You can.
  • the combination of the barcode sequence can detect the presence or absence of the interaction of the protein through PCR, as well as the interaction between proteins in the simultaneous analysis of a large number of proteins between the library and library through barcode reading through NGS Intensity differences in action are also detectable.
  • the phenotypes may be used to select yeast strains with which AD-Prey and DBD-Bait interact.
  • FIG. 14C when the AD-Prey and DBD-Bai t interact with each other, a schematic diagram of the vector recombined by the reporter system of ( ⁇ ) is shown, and specifically, the cleavage map is shown in FIG. 5.
  • the yeast strain screening method is not particularly limited as long as the phenotype is used, for example, binding a primary antibody specifically binding to Myc protein (especially c-tnyc epitope) to Myc protein. After binding to the primary antibody specifically bound to a secondary antibody labeled with a fluorescent material (especially cyanine series) and screened using a fluorescence microscope or FACS round, the primary binding specifically to Myc protein Method of screening by conducting MACS using magnetic beads coated with an antibody that binds the antibody to the protein and then specifically binds to the primary antibody, Method of screening by treating two or more antibiotics, Fluorescence microscopy for GFP The method of screening by performing observation or FACS etc. can be used.
  • the method using the MACS or FACS in the present invention can process a large amount of strain with much less time and labor without using agar medium compared to the conventional yeast two hybr id screening using agar medium. useful. : 174>
  • step (d) the barcode sequences of the selected yeast strains are identified to identify and select which genes interact with each other.
  • the barcode sequence of step (d) is a combination of each barcode sequence introduced with the genes encoding Prey and Bai t in the pAD-acc vector and the pDBD donor vector in step (a).
  • Cre recombinase is generated when Prey and Bai t interact with each other to bind (or adjacent) barcode sequences included in the pAD-acc vector and the pDBD-donor vector. That is, since the barcode sequences included in the pDBD-donor vector are transfer into the pAD-acc vector, each barcode sequence is contiguous to represent a specific nucleic acid combination.
  • the protein interaction detection method of the present invention is based on a barcode transfer assay.
  • the method of identifying the barcode sequence may be performed by sequencing (for example, Sanger sequencing, NSG), which is a known method of identifying polynucleotide sequences.
  • the dual reporter yeast strain of the present invention when applied to detect the interaction between proteins, the yeast cells to which Prey and Bai t proteins interact can be rapidly separated with high accuracy.
  • By analyzing the barcode sequence it is possible to easily identify which proteins interact with each other, thereby enabling mass information processing at the library level.
  • the dual reporter yeast strain of the present invention when applied to protein interaction detection, provides a means to efficiently process large amounts of information about protein binding pairs at the library level.
  • 1 is a cleavage map of the pAD-acc vector of the present invention.
  • ⁇ 184> 2 is a cleavage map (accession number KCTC12790BP) of the pDBD-donor vector of the present invention.
  • FIG. 3 is a cleavage map of a pGAADT7 AD vector, which is a basic vector for fabricating a pAD-acc vector of the present invention.
  • FIG. 4 is a cleavage map of a pGBKT7 vector, which is a basic vector for fabricating a pDBD-donor vector of the present invention.
  • FIG. 5 is a cleavage map of a vector after a partial sequence is switched from the pDBD-donor vector to the pAD-acc vector by Cre recombinase of the present invention.
  • the vector shows a cleavage map after recombination occurs by the lox site between the pAD-acc vector having the cleavage map of FIG. 1 and the pDBD-donor vector having the cleavage map of FIG.
  • 6 and 7 are fluorescence micrographs confirming that the reporter gene of the yeast is normally operated after transformation of the vector of the present invention into which the p53 and SV40 large T antigens are introduced into the yeast strain of the present invention (p53 (T): wild type).
  • FIG. 8A p53 (WT) and Sv40 T
  • FIG. 8B D278GC34 ⁇ 3 ⁇ 4
  • Sv40 T FIG. 8C: V144G (4.9D and Sv40 T ⁇
  • FIG. 8D E255K (1.5 and Sv40 T, FIG. 8E) : Lamin A and Sv40 T).
  • FIG. 9 shows the present invention incorporating p53 and SV40 large T antigens into the yeast strain of the present invention.
  • the result of the detection and separation of yeast cells in which protein interaction occurred after transformation was performed using FACS (X axis: GFP expression intensity, Y axis: Cy5 expression intensity, FIG. 9A: p53 (WT) and Sv40 T ⁇ FIG. 9B: D278G (34%) and Sv40 T, FIG. 9C: V144G (4.9%) and Sv40 T, FIG. 9D: E255 (1.5 3 ⁇ 4 and Sv40 T, FIG. 9E: Lamin A and Sv40 T).
  • FIG. 10 is a cleavage map of another form of pAD-acc vector (Accession No. KCTC12791BP) in the present invention.
  • FIG 11 shows two reporter systems included in the yeast cells of the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing the expression of c-myc epitopes on the yeast cell wall when the two proteins of interest interact with the c-myc reporter system.
  • FIG. 13 shows various embodiments of the c-myc reporter expression system for the c-myc reporter system (A: 10 repetitions of c-myc, B: 5 repetitions of c-myc, C: c- myc 1)
  • FIG. 15 shows signal strength according to the number of c-myc epitope repetitions in the c-myc reporter system.
  • FIG. 16 shows MACS selection and its results according to protein interaction in yeast to which the dual repoter Y2H system of the present invention is applied.
  • FIG. 17 shows the results of confirming MACS screening results according to protein interaction with fluorescent signals by repeatedly performing MACS once and twice in yeast to which the dua repoter Y2H system of the present invention is applied.
  • Figure 18 is used to detect barcode combinations in the present invention generated as a result of barcode transfer by Cre recombinase expression in the present invention. It represents the position of pr imer A, B, C binding.
  • FIG. 20 is a result of detecting whether barcodes are combined according to protein interaction by PCR for the colonies generated after two antibiotic treatments to the yeast to which the dual repoter Y2H system of the present invention is applied.
  • 21 shows barcode read values according to protein interaction intensities using NGS analysis.
  • FIG. 22 shows barcode read values according to library-library cross-protein interaction intensity using NGS analysis.
  • FIG. 23 is a higher order of NGS result bacord reads in relation to FIG. 22.
  • FIG. 24 is a data showing that cell selection ability varies when performing MACS according to protein interaction intensity. As the protein interaction intensity increases, cell selection is better by MACS (FIG. 24).
  • 24a p53 (WT) and Sv40 T
  • FIG. 24b D278G (34%) and Sv40 T
  • FIG. 24c V144G (4.9%) and Sv40 T
  • FIG. 24d E255 (1.5 3 ⁇ 4) and Sv40 T
  • FIG. 24e Lami n A and Sv40 T).
  • a c-myc reporter system was constructed in which the expression construct (expression cassette) of the Gal l promoter MF ⁇ 1-myclO repeats-Glycine / Ser ine l inker—Ag I (C one term) 'was connected.
  • an expression construct (see FIG. 13) having a number of myc repeats of 0, 1, 5, and 10 (myclO repeats) in the expression construct is introduced into the yeast and expressed, and expressed in the yeast.
  • the primary antibody, mouse a -myc antibody (c-Myc Ant ibody (9E10) (sc-40 from Santa cruz)) and goat a -mouse IgG-Cy5 (A10524 from Mol ecular probe) Treated and observed by fluorescence microscope.
  • a Cre reporter system was constructed in which the GAL1 promoter-CRE recombinase 'was linked.
  • ⁇ 1> 5 > ⁇ 1-3> Yeast Strains Containing a c-myc Reporter Expression Cassette and a Cre Reporter Expression Cassette
  • yeast strains in which the expression constructs 1-1 and 1-2 were permanently expressed were prepared.
  • the expression construct of 'Gal l promoter MF ⁇ 1-myc 10 repeats- Glycine / Ser ine l inker- Ag a KC-term' of SEQ ID NO: 13 was obtained by GAL4 UAS (upstream act ivat ion sequence) at chromosome 15. )
  • the 'GAL1 promoter-CRE recombinase' expression construct of SEQ ID NO: 14 is located downstream of GAL4 UAS (upstream act i vat ion sequence) in chromosome 5.
  • the c-myc reporter and the Cre reporter co-expression yeast strain 'SK10-CRE (Accession No. KCTC12792BP)' was produced, and the yeast strain has the genotype shown in Table 1 below.
  • the production method of the yeast is as follows. First having the genotype of Table 2
  • PC_pGALl-MF a I-myclO-GS-Ag a (350a.a) was introduced into the yeast strain JC-993 (ATCC 204097) to prepare a yeast SK10 having a GALl-Agal-myclO repoter system. Since pRS_pGALl-MFaI-myclO-GS-Agal (350a.a) has a homology to his3 gene on the yeast genome, the reporter was introduced by inducing recombination.
  • the genotype of the SK10 yeast thus produced is shown in Table 2 below, by replacing LacZ of the URA3 :: GALl-LacZ portion on the yeast genome with the CRE gene in the SK10 yeast, SK10- having the double reporter of the present invention.
  • Cre yeast strains were prepared. Using a Cas9-gRNA, a dsDNA cleavage site was made at the LacZ site of the genome, and a Donor DNA having 300 bp at the 5 'end of the CRE gene and 500 bp at the 3' end of the LacZ gene was used. The homologous recombination was induced by PCR and put together during transformation.
  • SK10 yeast strain 200 ng P 414-TEFlp-Cas9-CYClt (Cas9 expression vector) was transformed into SK10 yeast strain and selected from SD / -Ura, -His, -Trp agar medium to obtain SK10 + Cas9 transformant.
  • Cre Donor DNA was amplified and prepared by PCR, and 6 ug of DNA was used after ethanol was precipitated and precipitated.
  • the donor DNA was transformed with the yeast strain SK10 + Cas9 transformant (on the SD / -Ura, -His, -Trp) together with 200 ng and a guide RNA expression vector. Transformants were selected through SD / -Ura, -His, -Trp, and -Leu agar medium, and the introduction of reporter genes confirmed CRE genes present in the genome of the transformants through PCR.
  • the vector of the present invention consists of a pair of two types of pAD-acc and pDBD-donor, 'the two vectors contain a sequence that is swipped by the barcode sequence and CRE recombinase.
  • the pDBD-donor vector contains fluorescence-emitting protein genes (GFP).
  • GFP fluorescence-emitting protein genes
  • ⁇ salt sequence (SEQ ID NO: 21) was inserted and removed the stop codon of the Leu2 gene.
  • ⁇ and 10x2272 were arranged to be about lOOOObp apart, and the ⁇ and 10x2272 were positioned in the same orientation (orientat ion).
  • a pAD-acc vector having an open map of FIG. K ful l sequence (SEQ ID NO: 16) or FIG. 10 (ful l sequence: SEQ ID NO: 17) was prepared.
  • ⁇ and 10 ⁇ 2272 were arranged to be about 2000 bp apart, and the ⁇ and 1 ⁇ 2272 were positioned in the same orientation (or ientat ion).
  • a pDBD-donor vector having a cleavage map of FIG. 2 full sequence: SEQ ID NO: 15 was prepared.
  • a barcode for inserting into the constructed vector was prepared.
  • a barcode template ol igo and a primer for amplifying it by PCR are prepared.
  • Bio-rad T100 thermal cycler (Cat. No 186-1096) was used as a PCR machine, and a PCR reaction solution was prepared using the composition shown in Table 3 below, and specific PCR conduits were as follows; 95 ° C / 30 sec-[95 ° C / 20 sec -65 ° C / 30 sec] xl5 cycles -72 ° C / 60 sec -4 ° C
  • Each restriction enzyme was treated with the product obtained through PCR.
  • the barcode for AD processes restriction enzymes Bs i WI (NEB) and Sac II (NEB) for pAD-acc, and the barcode for DBD for restriction enzymes Af l II (NEB) and for DBB-donor Age I (NEB) was treated.
  • Shr imp alkal ine phosphatase (78390, USB) was treated to remove both phosphate groups.
  • Fully restricted sections (about 30 bp) were purified purely through 10% polyacryl amide gel (IX TBE).
  • the clones were inoculated in 0.3% seaPrep agarose (Lonza 50302) LB medium prepared in advance and incubated at 37 ° C for 36 hours, followed by insertion of bar codes using Pl asmid Maxi ki t (12165 from Qi agen). Get the library.
  • a total of 27 genes used for recombination are involved in the synthesis of Amino-acyl tRNA.
  • the genes were targeted. Specifically, AIMP genebank NM.004757.3), AI MP2 (NM_006303.3) ⁇ AI MP3 (NM_004280), DRS (NM_001349.2), FRS a (NM_004461.2), FRSP (NM_005687.3), HRS (NM_002109.3 ), NRS (NM_004539.3), SRS (NM_006513.3), WRS (NM_004184.3), YRS (M_003680.3), CS (NM_139273.3), GRS (NM_002047.2), LRS ( ⁇ _020117.9 ) Gene is too large to be cloned, so it is divided into two parts, LRS-A (1-520 aa) and LRS-B (521-1176 aa), MRS (NM_00499 (L3) ⁇ QRS
  • cDNA of each gene as a template
  • the nucleic acids were amplified by PCR in the same manner as in Example ⁇ 2-3>, except for the primers used, and the primers used in this experiment are shown in Table 5.
  • the gene was amplified using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 9, and the gene to be inserted into the pDBD-donor vector was amplified using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8.
  • a total of 54 PCR products (27 AD-aaRS, 27 DBD-aaRS), and pAD-acc and pDBD-donor were digested using restriction enzyme Sfi I (R0123 from Neb). After the cleavage, only the desired product was purified using Expin Gel SV (Geneall 102-150). Then, the ratio of the number of molecules of the aaRS gene and the vector treated with the restriction enzyme was 3: 1, and the recombination was induced by treating the T4 DNA ligase (NE020, M0202).
  • Recombinant reaction was performed at 4 ° C for 1 hour and after reaction, the bacteria ( ⁇ ) Recombinant clones were selected by resistance to Ampicillin and kanamycin antibiotics in LB agar medium.
  • the relationship between aars gene and barcode sequence introduced in each vector by Sanger sequencing method was established by Cosmotechtech Co., Ltd. (Refer to [Table 6]). Briefly, the sequencing used a BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Cat.No. 4337455, life technologies) and an ABI 3730XL Sequencing machine (capi 1 lary 96ea X 50 cm).
  • p53 protein SEQ ID NO: 19
  • SV40 l arge T antigen SEQ ID NO: 18
  • the introduced vector was introduced into the double reporter yeast strain of the present invention (the yeast strain of Example 1, ie, the yeast strain having both the reporter gene, the CRE gene and the c-myc gene as the reporter gene), and observed fluorescence.
  • p53 mutants having limited binding to Sv40 were prepared and introduced into the vector to construct a test library.
  • the method of introducing the gene into the vector for constructing the library was performed in the same manner as in Example 2.
  • G (Glycin) -mutated mutation reduced binding to SV40 L.T by 34%
  • V144G Mutation converting 144th amino acid V (Valine) of p53 protein to G (Glycin), reduced binding force with SV40 L.T to 4.9%
  • Lamin A Protein that does not interact with SV40 LT protein at all (Negative control, SEQ ID NO: 23)
  • SV40 LT Protein known to interact with wild type Murine p53 (SEQ ID NO: 18)
  • Transformation of yeast prepared in Example 1 is Yeastmaker TM Yeast Transformation
  • the medium was based on Lur i a-Bertani (LB) Broth, Mi Her (Company: Di fco, Cat.No: 244620), which consisted of 10 g Tryptone, 5 g Yeast extract, lOg NaCl, and 1 L standard. It is prepared to a concentration of 50 ug / ml or / and 15 ug / ml kanamycin.
  • the mouse In order to confirm whether the c—myc reporter gene is normally operated in the cultured transformant yeast, the mouse a-c-myc antibody binding to Myc expressed primarily in the cultured transformant yeast and the The secondary antibody that binds to the c-myc antibody was treated with Alexa Fluor 568 Goat Ant i-Mouse IgG antibody (Mol ecul ar probe) and observed with a fluorescence microscope.
  • ⁇ 335> Fluorescently expressed yeast strains can be detected and isolated without agar media by the interaction of known p53 protein introduced into yeast strain and known p53 protein introduced into pDBD-donor vector and SV40 l ar T antigen.
  • yeast strain transformed in Example 3-2 cultured in a liquid medium cells were separated, suspended in a buffer and subjected to FACS analysis.
  • the culture medium after the culture was centrifuged to completely remove the medium and obtained only the yeast.
  • the yeast was washed twice using 5 ml WB buffer (IX PBS, 5% BSA, 5 mM EDTA) and the mouse ⁇ -myc antibody (c-Myc Ant ibody (9E10)) was used as the primary antibody in 1 ml m buf fer.
  • SC-40 from Santa cruz was diluted to 1: 500 and added to the washed yeast and mixed well.
  • the tube containing the sample was kept on ice and reacted to bind the primary antibody for 30 minutes while keeping it cold.
  • the yeast was washed with 5 ml WB buffer, and the goat a -mouse IgG-Cy5 (A10524 from Molecul ar probe), a secondary antibody labeled with fluorescent dye in 1 ml buf fer, was 1: 500. Diluted and added to the yeast to which the primary antibody was attached and mixed well. This was also kept in ice and reacted for 30 minutes while maintaining a cold state. After staining, the cells were washed twice with 5 ml IX PBS once with 5 ml WB buf fer, and the yeast cells were completely released with 3 ml IX PBS, and then transferred to a 14 ml FACS tube (352017 by BD fal con).
  • the prepared samples were analyzed using FACS Mof lo XDPCBackman Coulter) and fluorescence appeared through expression of reporter genes induced by protein interactions.
  • Yeast groups with (GFP, Cy5) were isolated separately.
  • the cells to be selected were to be at least 1.0 x 10 or more.
  • Bio-rad T100 thermal cycler (Cat. No 186-1096) was used as a PCR machine, and high-fidelity DNA polytnerase (NEB, Cat. No M0530) was used as a DNA polymerase.
  • PCR reaction solution was prepared. Specific PCR conditions are as follows; 95 ° C / 30 sec-[95 ° C / 20 sec -65 ° C / 30 sec] x25 cycles -72: / 60 sec-4: / ⁇ .
  • Yeast from colonies that did not express GFP was used as a control.
  • the pair of primers A and C of Table 10 detects a combination of a barcode sequence (ie, a sequence representing a bait protein) and an AD-acc vector barcode sequence introduced from a DBD-donor vector.
  • the pairs of primers A and B of Table 10 below were used in control experiments to confirm the presence of plasmids. Specific experimental groups and controls are shown in Table 11 below.
  • FIG. 19 shows a result of amplifying a barcode obtained by PCR in the vicinity of loxP.
  • Yeoteuna protein interaction arose GFP is expressed yeast (l ane 1)
  • Cre recombinase recombination "arose and having a Barcode PCR product of 115bp Barcode in yeast (lane 2) of the colonies did not express GFP PCR products were not detected.
  • Lane 3 and lane 4 were used as contr to confirm the presence of plasmids (48 bp).
  • nucleic acid was extracted from the cells selected by the method of Example 3-3 and PCR was performed in the same manner as described above. As a result, as shown in FIG. 20, it was confirmed that Barcode PCR products are normally detected in yeasts that have a protein interaction and are resistant to both ampi ci l in and kanamycin.
  • cells expressing the c-myc reporter were selected through MACS, and confirmed by fluorescence microscopy observation that GFP fluorescence occurred in these cells. Therefore, even without the agar medium, it was possible to select yeasts that are interacting with protein through the work of MACS.
  • a vector was prepared as shown in Table 13 and the yeast of the present invention (Duplicate of Example 1). Reporter yeast) was transformed, and MACS was carried out in the same manner as described above.
  • pHAB210 pDBD-donor-p53 VS PHAB215 : pAD-acc-SV40 T
  • PHAB211 P DBD-donor-p53-E255K (1.5) pHAB212 pDBD-donor-p53-V144G (4.9%)
  • Example 4-1 As a method of selecting yeast cells (ie, pos it ive cel l) which actually interacted with proteins, it was examined whether the method using fluorescence or the method using MACS enables more accurate selection.
  • the fluorescence of Cy5 and GFP was reduced to FACS (Mo flow).
  • FIG. 17A it was difficult to know whether the protein interaction was performed through fluorescence expression at 36 hours after each vector was introduced into the yeast in the transformed yeast without MACS. Indeed, it was possible to separate the positive cells in which the protein interaction occurred, and in particular, it was confirmed that the positive cell selection power increased as the number of MACSs was increased (FIG. 17B). Using MACS, it was confirmed that positive cells can be selected with high accuracy.
  • the library of Table 7 was constructed by the above-described method and introduced into the yeast of the present invention. After obtaining a barcode DNA sample recombined in the same manner as in Example 3-6, it was requested to NGS analysis to Celelemix Co., Ltd. Briefly, the NGS analysis, MiSeq Reagent Kit v2 (300 cycle) (Illumina, Cat. No. MS-102-2001) was used for sample preparation, and each barcode read number was analyzed using an Illumine MiSeq Desktop Sequencer.
  • the Y2H of the present invention is directed to the ARS library (see Table 6).
  • the system was run and commissioned by Salemix Co., Ltd. to check the results of reading barcodes with NGS.
  • AD-acc vector is fixed to express AIMP2 and the ARS library applied to the DBD-doner vector (Fig. 22A)
  • DBD-doner vector is fixed to express the AIMP2 and ARS library applied to the D-acc vector It was confirmed by two methods (Fig. 22B).
  • the present invention provides a novel dual-hybrid system (tWO).
  • the dual reporter yeast strain of the present invention when applied to the detection of protein interactions, provides a means to efficiently process large amounts of information about protein binding pairs at the library level. This is high.
  • accession number KCTC12791BP
  • accession number KCTC12792BP

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Abstract

본 발명은 새로운 이중-하이브리드 시스템 (two hybrid system)을 위한 이중 리포터 시스템을 가지는 효모 균주에 관한 것으로， 좀 더 상세하게는 c-myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포함하는 효모 균주 및 상기효모 균주를 이용하여 라이브러리-라이브러리 간 단백질 상호작용을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이중리포터 효모 균주는 단백질 상호작용 검출에 적용 시， 라이브러리 수준에서의 단백질 결합 쌍들에 대한 대량의 정보를 효율적으로 처리할 수 있도록 하는 수단을 제공한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
바코드 이동 분석을 위한 이중 리포터 시스템을 보유한 효모 균주
【기술분야】
<ι> 본 출원은 2014년 4월 25일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0049726 호 및 2015년 3월 19일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0037979호를 우선권 으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
<2>
<3> 본 발명은 바코드 이동 분석을 위한 이증 리포터 시스템을 보유한 효모 균주 에 관한 것으로， 좀 더 상세하게는 c— myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포함하는 효모 균주 및 상기효모 균주를 이용하여 라이브러리-라 이브러리 간 단백질 상호작용을 검출하는 방법에 관한 것이다.
<4>
【배경기술】
<5> 세포 내에서 하나 또는 두 개 이상의 단백질은 서로 상호작용 (비공유결합, 물리적인 결합)을 통하여 생물학적인 기능을 나타낸다. 따라서 단백질 간의 상호작 용에 대한 이해는 생물학적인 기능을 이해하는데 있어서 매우 중요한 의미를 갖는 다. 생화학 (biochemi stry) , 단백질체학 (Proteomics) , 분자 동력학 (molecular dynamics) , 신호 전달 (signal transduct ion) 등의 다양한 학문에서 단백질 간의 상 호작용을 밝히기 위한 노력이 현재까지 지속되고 있다. 최근 사용되고 있는 단백질 간의 상호작용을 알아보기 위한 방법들은 Co— i睡 unoprecipi tat ion(Co-IP) , Fluorescence resonance energy transfer (FRET) , Yeast two-hybr id 그리고 최근에 고안된 Bimolecular Fluorescence Com lementat ion (BiFC) 등이 잘 알려져 있다.
<6> 그 중에서도 Yeast two-hybr id(Fields S, Song 0, 1989)는 1989년에 송옥규 박사와 Stanley Fields에 의하여 고안된 방법으로서 일반적인 전사인자 (Transcript ion factor)가 갖는 modular한 특징을 이용한 방법이다. 여기서 modular라는 것은 전사인자의 구조는 DNA 결합 도메인 (DNA binding domanin, DBD) 과 활성 도메인 (Act ivat ion domain, AD)으로 구성이 되며 서로 독립적으로 분리되 어 발현되어도 어떠한 상호작용에 의하여 두 도메인이 가까운 거리를 유지할 때 전 사인자로서의 정상적인 기능이 가능하다는 원리를 이용한 방법이다.
<7> 일반적으로 Yeast two-hybr id mothod에서는 Saccharomyces cerevi siae (S. cerevisiae)의 GAL4 전사인자를 주로 사용하며 특정 단백질 간의 상호작용 또는 하 나의 단백질에 대한 상호작용 파트너를 선별 (screening)하는데 널리 사용되고 있 다. 따라서 GAL4 전사인자의 각각의 도메인에 연구하고자하는 단백질의 유전자를 재조합하여 동일한 효모 내에서 발현을 유도하여 상호작용 유무를 알 수 있는 방법 이다. 일반적으로 DNA 결합 도메인에는 Bait (미끼)를 활성 도메인에는 Prey (먹이) 를 결합하게 되는데 Bait에는 주로 연구하고자하는 한 종류의 단백질에 대한 유전 자를 Prey에는 주로 cDNA library를 재조합하여 Bait 단백질에 대한 상호작용 파트 너를 선별하는 방식으로 진행된다. DNA 결합 도메인 (DBD)과 Bait, 활성 부위 (AD)와 Prey는 각각 독립적인 백터 (Vector)의 형태로 효모에 형질전환 (transformat ion)되 고 도입 후 각각의 백터에 존재하는 ADH1 프로모터 (ADH1 promoter)에 의하여 항시 발현 (Constitutive express ion)된다. 발현된 DBD-Bait, AD-Prey 결합 단백질은 DNA 결합 도메인과 활성 도메인의 N-말단 (N-terminus)에 존재하는 NLS(Nuclear Localization Signal)에 의하여 효모의 핵으로 이동하게 된다. 그 후 핵 내에서 Bait와 Prey가 서로 상호작용하지 않을 경우에는 DBD-Bait, AD-Prey가 복합체를 이 루지 못하므로 정상적인 GAL4 전사인자의 기능을 할 수 없다. 그러나 Bait와 Prey 가 서로 상호작용하는 경우에는 DBD-Bait-Prey-AD 복합체 (DBD-Bai t-Prey-AD complex)가 형성되어 GAL4 전사인자의 정상적인 기능을 수행할 수 있게 되어 효모 의 유전체 내에 존재하는 리포터 (Reporter)의 발현을 유도하게 된다.
<8> 이러한 원리로 리포터 유전자의 발현을 통하여 Bait와 Prey의 상호작용을 확 인하는 방법이다. 효모 유전체 내의 리포터는 GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인이 결합할 수 있는 GAL4 UAS (Upstream Activation Sequence)와 리포터 유전자로 구성 되는데 대표적으로 LacZ, MELKColormetric repoter), HIS3, ADE2, URA3(Authotrophic reporter) 등의 유전자가 사용된다. 따라서 결과 적으로 Bait와 Prey가 서로 상호작용하는 경우 DBD-Bai t-Prey—AD 복합체가 리포터의 GAL4 UAS에 결합하여 리포터 유전자의 발현을 유도하게 된다.
<9> 이러한 Yeast two-hybrid가 가지는 장점 증에는 in vivo 에서 수행이 가능하 다는 점, 고등진핵생물 (Higher eukaryote)인 효모를 이용하므로 박테리아 (Bacteria)를 이용할 때 보다 유리하다는 점， 실험을 수행하는데 필요한 요소가 많 지 않다는 점, 수천가지 단백질 간의 상호작용을 동시에 선별할 수 있다는 점 등이 있다. 반면 기존의 Yeast two-hybrid system (이하 Y2H)은 몇 가지 한계를 가지고 있었다.
<ιο> 첫 번째 한계는 대량 선별이 어렵다는 것이다. Y2H를 통하여 특정 단백질에 대한 상호작용 단백질을 찾기 위한 선별 (screening)을 수행할 경우 높은 다양성 (diversity)을 갖는 단백질 라이브러리가 사용된다. 예를 들어 특정 단백질 A에 대 한 상호작용 단백질을 찾기 위한 선별에서 1.0 X 107의 다양성을 갖는 단백질 라이 브러리를 사용할 경우 1개의 한천배지에서 천 (1.0 X 103)개의 효모 colony를 선별할 수 있다고 하면 실험자는 선별을 위해서 만개의 한천배지를 사용하여야 한다. 이는 실험자에게 상당히 높은 노동력이 소모됨과 동시에 시간 그리고 비용적인 측면에서 상당히 비효율적이다. 따라서 이러한 문제로 인하여 대량 선별이 어렵다는 한계를 가지고 있다.
<ιι> 두 번째 한계는 선별을 통하여 얻은 데이터의 분석이다. 기존의 방법에서는 한천배지를 이용하여 positive candidate (단백질 간의 상호작용이 존재하는 효모) 를 선별한 후에 plasmid를 얻어 Sanger sequencing을 통하여 prey 유전자의 데이터 를 분석하는 방식으로 진행되었다. 이러한 방식을 사용 할 경우 대량 선별을 통하 여 얻은 positive candidate를 모두 분석하는 것은 많은 노동력을 필요로 하며 시 간과 비용 또한 상당히 비효율 적이다.
<12> 세 번째 한계는 기존의 reporter system의 민감도 (sensitivity) 문제이다.
기존의 Y2H에 사용되는 reporter system (예를 들어 β -galactosidase, HIS3, ADE2 등)을 사용하였을 경우 약한 단백질 간의 상호작용을 선별할 수 없다는 단점을 가 지고 있다. 그 외 자동화가 어렵다는 점 단백질 자체가 스스로 활성화 되어 전사 (transcription)를 활성화 할 경우 사용 할 수 없다는 점， 단백질 간의 상호작용에 보인자 (Co-factor)가 필요한 경우 선별하기 어렵다는 점 등이 있다.
<13>
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
<14> 본 발명자들은 기존 투 -하이브리드 시스템 (two-hybrid system)의 단점을 보 완하는 새로운 방법을 연구하던 중, bait 및 prey 두 단백질의 상호작용에 의해 효 모 균주 세포벽에 c-myc 에피토프가 발현되는 1st 리포터 시스템 및 Cre recombinase가 발현되는 2nd 리포터 시스템이 동시에 작동하는 dual repot er Yeast two-hybrid 시스템을 구축하고, 본 발명의 이중 리포터 시스템을 가지는 효모 균주 가 라이브러리 수준에서 단백질들의 결합 쌍들을 동시에 효율적으로 검색하기 위한 수단을 제공 할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
<15>
<16> 따라서 본 발명의 목적은 하기 (i) 및 (Π)의 발현 카세트를 동시에 포함하 는， 이중 (dual) 리포터 효모 균주를 제공하는 것이다; (i) 순차적으로 작동 가능하 게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GALl 프로모터， MF α 1 유전 자， c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Agal 유전자를 포함하는 c-myc 리 포터 발현 카세트; 및 (Π) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence) , GALl 프로모터 및 Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 Cre 리포터 발현 카세트.
<17>
<18> 본 발명의 다른 목적은 (a) 상기 이증 리포터 효모 균주에 베이트 (bait) 라 이브러리 및 프레이 (prey) 라이브러리를 형질전환하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 된 효모 균주로부터 이중 리포터 발현 여부를 조사하여 베이트-프레이 단백질 결합 쌍들을 검출하는 단계를 포함하는, 단백질 상호작용 검출 방법을 제공하는 것이다.
<19>
【기술적 해결방법】
<20> 상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 (ί) 및 (Π)의 발현 카세트를 동시에 포함하는, 이중 (dual) 리포터 효모 균주를 제공한다; (i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GALl 프로모터 , MF α 1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Agal 유전자를 포함하는 c- myc 리포터 발현 카세트; 및 (Π) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS( upstream activation sequence), GALl 프로모터 및 Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 Cre 리포터 발현 카세트.
<21>
<22> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 (a) 상기 이중 리포터 효 모 균주에 베이트 (bait) 라이브러리 및 프레이 (prey) 라이브러리를 형질전환하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 효모 균주로부터 이증 리포터 발현 여부를 조사하여 베이트-프레이 단백질 결합 쌍들을 검출하는 단계를 포함하는, 단백질 상호작용 검 출 방법을 제공한다.
<23>
<24> 이하 본 발명을 상세히 설명한다 .
<25>
<26> 본 발명에서 용어 "이증 -하이브리드 시스템 (two-hybrid system)' '은 리포터 유전자의 활성화를 이용하여 단백질 결합을 확인함으로써 단백질 상호작용을 분석 하는 방법 및 이를 위해 사용되는 일련의 구성물을 의미한다. 일반적으로， 이중-하 이브리드 시스템은 리포터 유전자를 활성화할 수 있는 전사인자를 두 개의 물리적 으로 분리되는 모들 도메인， 즉 DNA-결합 도메인과 전사활성 도메인으로 나누어 사 용한다. 이들을 이용하여 단백질 상호작용을 분석하기 위해서는, 상기 DNA-결합 도 메인과 전사활성 도메인을 상호작용을 알아보고자 하는 베이트 및 프레이 단백질에 각각 융합하여 재조합 단백질을 발현시키고, 발현된 재조합 단백질은 베이트 및 프 레이 단백질의 상호작용에 의해 DNA-결합 도메인과 전사활성 도메인이 결합하여 활 성을 나타내면서 리포터 유전자를 발현시킴으로써 두 단백질의 상호작용을 확인할 수 있다.
<27>
<28> 본 발명에서 용어 "베이트 (ba i t ) "는 단백질 상호작용에 대한 연구에 있어 단 백질 결합을 확인할 때， 상호작용을 알아보고자 하는 목적 단백질 또는 이를 암호 화하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 베이트 단백질은 단백질 상호작용을 확인하기 위하여 리포터 유전자를 활성화시키는 전사인자의 DNA-결합 도메인 또는 전사활성 도메인과 융합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에세 베이트 단 백질은 전사인자의 DNA-결합 도메인과 융합된다.
<29>
<30> 본 발명에서 용어 "프레이 (prey) "는 단백질 상호작용에 대한 연구에 있어 단 백질 결합을 확인할 때, 목적 단백질과 결합할 것으로 예상되는 단백질 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 프레이 단백질은 단백질 상호작용 을 확인하기 위하여 리포터 유전자를 활성화시키는 전사인자의 DNA-결합 도메인 또 는 전사활성 도메인과 융합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 프레이 단백질은 전사인자의 전사활성 도메인과 융합된다.
<31>
<32> 본 발명에서 용어 '라이브러리' 는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 흔합물， 수집물 또는 세트를 의미한다. 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서 열을 지니는 일원으로 구성된다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이는 라이브러리 에 존재하는 다양성을 책임진다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 흔 합물의 형태를 취하거나， 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어 박테리아 바이러스， 효모， 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다.
<33>
<34> 본 발명에서 용어 '백터' 란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 백터로서， 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 백터는 플라스미드 백터, 코 즈미드 백터, 박테리오파아지 백터, 효모 백터, 바이러스 백터 등을 포함한다. 적 당한 숙주로 형질전환되면, 백터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거 나， 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 백터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (p l asmid) " 및 "백터 (vector ) "는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적 상, 플라스미드 백터를 이용하는 게 바람직하다.
<35> 본 명세서에서 각 백터의 구성은 특별한 언급이 없는 한， 플라스미드를 이루 는 이중 가닥 중 하나의 가닥 (strand)을 기준으로하여 5' 에서 3' 방향으로 기술된 다. 따라서 백터를 구성하는 유전적 구성 단위의 기술 순서는 실질적으로 유전체가 전사되는 방향과 일치하지 않을 수 있으몌 백터에 포함된 유전체의 전사 방향은 프로모터로부터 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 구조유전자로 향하는 방향이 다. 그러므로 본 발명에서 용어 '상류' ， '하류' 는, 특별한 언급이 없는 한 상기 기준가닥 상에서 각 핵산 단위들의 상대적 위치를 나타낸다. 당업자라면 전사배향 에 의하여 당해 유전자가 본 발명에서 기술하는 기준 가닥 (sense st rand)에서 발현 되는지， 이의 상대 가닥 (ant i sense strand)에서 발현되는지 자명하게 이해 가능하 다.
<36>
<37> 본 발명에서 용어 'DBD 백터' 는 베이트 단백질을 코딩하는 염기서열이 다증 클로닝 부위 내에 삽입되어 특정 전사인자 (예를 들어 GAL4)의 DBD와 융합된 형태로 재조합 단백질이 숙주 내에서 발현될 수 있도톡 구성된 백터를 의미한다.
<38>
<39> 본 발명에서 용어 'AD 백터' 는 프레이 단백질을 코딩하는 염기서열이 다증 클로닝 부위 내에 삽입되어 특정 전사인자 (예를 들어 GAL4)의 AD와 융합된 형태로 재조합 단백질이 숙주 내에서 발현될 수 있도록 구성된 백터를 의미한다.
<40>
<41 > 본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된 "은 유전자 발현의 매개나 조절과 같은 의도된 기능을 수행하기 위해 특정 서열들이 직접적으로 또는 간접적으로 상 호작용하는 것을 의미한다. 작동 가능하게 연결된 서열들의 상호작용은， 예를 들어 작동 가능하게 연결된 서열들과 상호작용하는 단백질에 의해 매개될 수 있다. 전사 조절영역과 관심 서열이 작동 가능하게 연결된 경우， 이 서열들이 기능적으로 연결 됨으로써 전사 조절영역에 의해 관심 서열의 전사가 매개되거나 조정될 수 있다ᅳ <42>
<43> 본 발명에서 용어 '약물 저항성 유전자' 는 특정 약물처리에 의하여 적절히 형질전환된 형질전환체의 선택가능 표현형을 부여하는 유전자를 의미하는 것으로 서， 상기 약물로는 항생제， 세포 독성제 등이 사용될 수 있다. 바람직하게 상기 약 물 저항성 유전자는 항생제 저항성 유전자를 의미하는 것으로， 예를 들어 앰피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자， 클로람페니콜 저항성 유전자， 스트렙토 • 마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자， 겐타마이신 저항성 유전자， 카베니실린 저항성 유전자 등을 포함하나， 이에 제한되지 않는다.
<44>
<45> 본 발명에서 용어 '형광 단백질 코딩 유전자' 에 있어서， 상기 형광 단백질 은.형광을 내는 것으로 당업계에 공지된 단백질이면 그 종류가 특별히 제한되지 않 으나， 녹색 형광 단백질 (GFP) , 변형된 녹색 형광 단백질 (modi f i ed green f luorescent protein) , 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green f luorescent protein ; EGFP) , 적색 형광 단백질 (RFP) , 증강된 적색 형광 단백질 (ERFP)ᅳ 청색 형 광 단백질 (BFP) , 증강된 청색 형광 단백질 (EBFP) , 황색 형광 단백질 (YFP) , 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP) , 남색 형광 단백질 (CFP) , 및 증강된 남색 형광 단백질 (ECFP)을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하는 것 일 수 있다.
<46>
<47> 본 발명에서 용어 '영양 요구성 표지 유전자' 는 본 명에서에서 용어 '영양 성 표지자' 와 호환성 있게 사용되며， 세포의 영양 요구성을 보상할 수 있고 그래 서 그 영양요구성 세포에 원영양성을 부여하는 유전자 생산물을 암호화하고 있는 표지자 서열이다. 본 발명에 따라 "영양요구성 " 은 세포가 반드시 영양요구성 세 포 스스로에 의해서는 생산될 수 없는 필수 영양소를 가지고 있는 배지에서 길러져 야 한다는 것을 의미한다. 영양성 표지자 유전자의 유전자 생산물은 영양요구성 세 포에서 상실한 필수 영상소의 합성을 촉진한다 . 성공적으로 발현한 영양성 표지자 유전자에 의해 세포가 길러지는 배양 배지에 필수 영양소를 첨부할 필요는 없을 것 이다. 바람직한 영양요구성 표지자는 URA3 , LEU2 , CAN1 , CYH2 , TRP1 , ADE1 , ADE2 및 MET5 등을 포함한다.
<48>
<49> 본 발명에서 용어 '프로모터 ' 는 광의의 개념으로서 구조 유전자로부터의 전 사개시의 영역을 의미할 수 있으며， 좀 더 구체적으로는 특정 뉴클레오티드 서열과 연결된 경우 상기 특정 뉴클레오티드 서열이 mR A로 전사되는 것을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로, 프로모터는 모든 경우에 적용되는 것은 아니나 mRNA로 전사될 목적하는 뉴클레오티드 서열의 5' 에 존재하고 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 개시를 위한 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다.
<50>
<5 i> 본 발명에서 용어 '바코드 서열 (barcode sequences)' 은 서로 다른 백터 내 에 부가되어， 상기 백터에 부가된 각각의 외래 유전자 (또는 관심 유전자)를 표시 또는 구분할 수 있도톡 하는 임의의 짧은 핵산서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 의래 유전자 (또는 관심 유전자)는 베이트 또는 프레이 단백질에 해당하는 것으로 서 당업자는 상호관계를 알고자하는 각각의 베이트 및 프레이 단백질 (또는 이들을 코딩하는 핵산 서열)에 대하여 사전에 임의로 바코드 서열을 부가하고 이들의 관계 를 정립한다. 상기 바코드 서열은 백터에 삽입된 베이트 또는 프레이 단백질에 따 라 당업자가 이를 표시할 수 있도록 임의로 설정할 수 있다. 상기 바코드 서열에 있어서 이를 구성하는 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나, 1개 내지 20 개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티 드로 구성될 수 있다.
<52>
<53> 본 발명에서 용어 '인접한다' 는, 컨스트럭트 (construct ) 내의 유전적 요소 ( 엘리먼트, element )의 위치 관계에 관해서, 약 1 내지 lOObp 내로 떨어져 있는 것 을 의미할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50bp 내로 떨어져 있는 것을 의미할 수 있다.
<54>
<55> 본 발명에서 용어 '발현 카세트' 는 '발현 구조체' 와 호환성 있게 사용되 며， 목적하는 구조 유전자를 발현할 수 있는 핵산 구조체를 의미하는 것으로, 세포 에 따라 적절한 프로모터 및 이와 작동가능 하게 연결된 구조 유전자 등을 포함한 다-
<56>
<57> 본 발명에서 용어 'NGS(Next generat ion sequencing) ' 은， 당업계에 알려진 바와 같이 용어 '병렬적 시퀀싱 (paral lel sequencing)' 과 호환적으로 사용된다.
<58>
<59> 본 발명은 하기 ( i ) 및 ( )의 발현 카세트를 동시에 포함하는 이중 (dual ) 리포터 효모 균주를 제공한다; <60> (i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UASCupstream activation sequence), GALl 프로모터， MF α 1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Agal 유전자를 포함하는 c-myc 리포터 발현 카세트; 및
<6i> (ii) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GALl 프로모터 및 Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자를 포 함하는 Cre 리포터 발현 카세트.
<62>
<63> 본 발명의 효모 균주는, 상기 (i)의 발현 카세트에 의한 c-myc 리포터 시스 템 (도 11의 A에 도시) 및 (ii)의 발현 카세트에 의한 Cre 리포터 시스템 (도 11의 B 에 도시)의 이증 리포터 시스템을 가지는 것이 그 특징이다.
<64>
<65> 본 발명의 효모 균주는 효모 이증 보합계 (yeast two hybrid)에 사용될 수 있 는 균주는 어떤 것이든 가능하며， 예를 들어 사카로마이세스 쏙 Saccharomyces spp.), 클루이베로미세스 ^U uyveromyces spp.), 시조사카로마이세스 속 ( Schi zosaccharomyces spp.), 피키 01" ^{Pichia spp.), 파피 ο]· ^-{Paffia spp.), 칸디다 쏙 Candida spp.), 탈라로미세스 속 alaromyces spp.), 브레타노미세스 속 {Brettanowyces spp.), 파키솔렌 쏙 iPachysolen spp.) 또는 데바리오미세스 속 {Debaryomyces spp.) 등을 포함하며， 이에 제한하지 않는다.
<66> 바람직하게는 사카로마이세스 속 균주일 수 있으며， 더욱 바람직하게는 사카 로마이세스 세레비지애 ccAs/ ces cerevisiae) 균주 일 수 있다.
<67>
<68> 상기 (0의 c-myc 리포터 발현 카세트는 본 명세서에서 '1st 리포터' 또는
'1st 리포터 시스템' 등으로 지칭 될 수 있으며， 순차적으로 작동 가능하게 연결 되어있는 GAL4 UAS( upstream activation sequence), GALl 프로모터， MF α 1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 플리뉴클레오티드 및 Agal 유전자가 포함된 것이 그 특징이 다.
<69>
<70> 상기 GAL4 UAS는 GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인 (DBD)이 결합 할 수 있는
• 서열을 말한다. GAL4 전사인자를 이용하는 이중 -하이브리드 시스템에 있어서, GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인 (DBD)과 전사활성 도메인 (AD)은 각각 베이트 및 프레이 단백질과 융합 (이들은 통상 각각 DBD-Bait 및 AD-Prey로 불림)되어 효모 균주 내에 서 발현되며, DBD-Bait 및 AD-Prey가 상호작용하면 GAL4 전사인자가 작동하여 하위 에 작동 가능하게 연결된 리포트 (report) 서열의 전사가 일어나게 된다.
<7i> GAL1 프로모터는 GAL4 UAS의 하류에 작동가능하게 연결되며， 본 발명에서 상 기 GAL1 프로모터의 핵산서열은 이에 제한되지 않으나， 예를 들어 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
<72> MFal 유전자는 효모에서 외래 유전자에 의한 단백질 (본 발명에서 c-myc 에 피토프)의 분비를 위한 분비 신호 인자이다. 본 발명에서 상기 MFal 유전자의 핵 산 서열은 이에 제한되지 않으나， 예를 들어 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다.
<73> c-myc 에피토프 (epitope, 항원결정기) 코딩 폴리뉴클레오티드는 Myc 단백질 중 특정 에피토프만을 발현하도록 구성되었다. 본 발명의 상기 c-myc 에피토프 코 딩 폴리뉴클레오티드의 서열구성은 이에 제한되지 않으나ᅤ 예를 들어 서열번호 26 의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다. 상기 c-myc 에피토프는, 상기 c-myc 에 피토프의 반복체 (즉, 첫번째 c-myc 에피토프에 연결되어 수회 반복하여 발현된 것) 를 의미하는 것 수 있다. 상기 반복 횟수는 특별히 제한되지 아니하나， 1회 내지 20회 일 수 있으며, 바람직하게는 1회 내지 10회 일 수 있다.
<74> Agal 유전자는 효모 균주의 세포 표면 당단백질인 알파 -아글루티닌 (α- agglutinin)을 발현하는 유전자이다. 상기 Agal 유전자는 c-myc 에피토프 코딩 폴 리뉴클레오티드와 연결되어 있다. 따라서 yeast two hybrid 실험 시 bait와 prey가 상호작용하는 경우， 알파-아글루티닌이 c-myc 에피토프와 함께 세포 표면에 발현되 므로 세포 표면에 c-myc 에피토프가 노출된다. 본 발명에서 상기 Agal 유전자의 핵산 서열은 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 서열번호 28의 염기서열로 이루어지 는 것 일 수 있다.
<75> 상기 (i) c-myc 리포터 발현 카세트에서， c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오 티드 및 Agal 유전자는 상기 핵산이 직접 연결되는 것 일 수 있고 또는 링커에 의 해 연결되는 것 일 수 있다ᅳ
<76> 본 발명에서 상기 용어 '링커 (linker)' 는 두 핵산 사이를 연결하는 임의의 핵산서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Agal 유전자를 연결하는 링커는 그 서열구성이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하 게 글리신 (Glycine) 또는 / 및 세린 (Serine)으로 이루어지는 펩타이드 단편을 코딩 하는 핵산서열 일 수 있다. 상기 '글리신 또는 / 및 세린으로 이루어지는 펩타이드 단편' 은 펩타이드 단편을 이루는 글리신과 세린의 개수 및 조합이 특별히 제한되 지 않으몌 당업자라면 목적하는 바에 따라 상기 링커의 구성을 용이하게 설정할 수 있음이 자명하다. 일례로 본 발명에서 상기 c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오 티드 및 Agal 유전자를 연결하는 링커는 서열번호 27의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다.
<77> '
<78> 가장 바람직하게 상기 (i)의 c-myc 리포터 발현 카세트는 GAL4 UAS의 하류에 서열번호 13으로 표시되는 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 것 일 수 있다. 상기 서열번호 13의 DNA 서열은 c-myc 에피토프의 10회 반복체가 삽입되어있는 것이 특 징이다.
<79>
<80> 본 발명의 균주에 도입된 bait와 prey가 상호작용하여 GA 전사인자를 작동 시키면 하위 Myc단백질 (특히, c-myc 에피토프)이 세포 표면에 발현이 되고， 이를 검출 (detection)하는 방법으로 bait와 prey의 상호작용 여부를 확인할 수 있다.
<8i> 상기 Myc 단백질의 세포 표면 발현을 검출하는 방법은 공지의 단백질 detection 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 Myc 단백질 (특히， c-myc 에피토 프)에 특이적으로 결합하는 항체 및 식별가능한 표지를 포함하며 상기 항체에 특이 적으로 결합하는 항체에 의한 검출 방법일 수 있다.
<82> 상기 항체를 사용하는 경우， 항체의 결합 특이성을 이용하는 공지의 세포 검 출 또는 세포 선별 방법을 사용하는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나
Magnetic-activated cell sorting (MACS) 방법에 의한 것 일 수 있다.
<83> 상기 식별 가능한 표지는 바람직하게는 형광물질 일 수 있으며, 더욱 바람직 하게는 시아닌 계열의 형광물질 일 수 있다. 상기 형광물질의 발현을 detection하 는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아니하며， 바람직하게는 형 광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 방법， 형광현미경 등에 의할 수 있다.
<84>
<85> 상기 (Π)의 Cre 리포터 발현 카세트는 본 명세서에서 '2nd 리포터' 또는 '
2nd 리포터 시스템' 등으로 지칭 될 수 있으며， 순차적으로 작동 가능하게 연결되 며 GAL4 UAS( upstream activation sequence), GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 것이 특징이다.
<86>
<87> 상기 GAL4 UAS(upstream activation sequence) 및 GAL1 프로모터는 전술한 바와 같다. 상기 'Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자' 는 본 명세서에 서 'CRE 유전자' 등의 용어와 호환성 있게 사용된다. 상기 Cre 재조합효소는 P1 박 테리오파지에서 유래되는 티로신 재조합 효소로서, Cre-Lox si te 재조합을 유발하 는데 활용되는 효소로서 알려져 있다. 공지의 Cre 재조합효소 활성을 가지는 단백 질을 코딩 하는 한, 본 발명에서 상기 Cre 재조합효소 발현 유전자의 구체적인 염 기서열은 특별히 제한되지 않으나 예를 들어 서열번호 29의 염기서열로 이루어지 는 것 일 수 있다.
<88>
<89> 가장 바람직하게 ( i i )의 Cre 리포터 발현 카세트는 GAL4 UAS 의 하류에 서열 번호 14로 표시되는 DNA서열이 작동가능하게 연결된 것 일 수 있다.
<90>
<9i> 본 발명의 균주에 도입된 bai t와 prey가 상호작용하여 GAL4 전사인자를 작동 시키면 Cre 재조합효소가 발현된다. 따라서 상기 Cre 재조합효소를 직접 검출 (detect ion)하거나, 상기 Cre 재조합효소가 발현됨으로 인해 세포 내에 발생된 유 전적인 변화를 탐지하는 방법으로 bai t와 prey의 상호작용 여부를 확인할 수 있다.
<92> 상기 Cre 재조합효소를 직접 검출하는 방법은 공지의 단백질 검출 방법에 의 할 수 있으며 ᅳ 바람직하게는 Cre 재조합효소에 특이적으로 결합하는 항체 및 식별 가능한 표지를 포함하며 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 의한 검출 방법 일 수 있다. 상기 식별 가능한 표지는 당업계에 단백질 또는 항체표지 물질로 사용 되는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 형광물질 일 수 있다. 상기 형광물질의 발현을 검출하는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아니하며, 바람직하게는 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACS(Fluorescence-act ivated cel l sort ing) 방법， 형광현미경 등에 의할 수 있다.
<93> 상기 Cre 재조합효소가 발현됨으로 인해 세포 내에 발생된 유전적인 변화를 탐지하는 방법으로는， 구체적으로 Cre-lox 재조합 시스템 (Cre-lox recominat ion system)을 본 발명의 효모에 도입하여 세포 내 핵산들의 변화를 탐지하는 방법일 수 있다. 이를 위해서는 bai t 및 prey 단백질을 효모 세포 내에 발현시키기 전에, 효모 균주의 유전체 또는 /및 상기 효모 균주에 도입될 외래 핵산 (예를들어, 백터 등)에 하나 이상의 lox si te를 도입하는 사전 작업이 필요할 수 있다.
<94> 상기 lox si te는 당업계에 공지된 것이라면, 그 종류가 특별히 제한되지 않 으나 예를 들어 ΙοχΒᅳ loxL , loxR, ΙοχΡ, 1οχΡ3 , 1οχΡ23(당업계에 1οχ23으로도 표 기)ᅳ 1οχ Δ 86 , 1οχ Δ 117, 1οχΡ511(당업계에 1οχ511로도 표기) , loxC2 , 1οχΡ2272(당 업계에 10x2272로도 표기)， 1οχΡ5171(당업계에 1οχ51기로도 표기)， 1οχΡ71(당업계 에 1 ox기로도 표기)， 1οχΡ66(당업계에 1οχ66으로도 표기) , M2 , M3 , M7 및 Mil 등 을 포함한다. 바람직하게 ΙοχΡ 또는 ΙοχΡ 변이체 UoxP mutant )를 사용하는 것 일 수 있다.
<95>
<96> Cre 재조합효소가 발현되면 lox s i t e를 함유하는 핵산 영역 간에 재조합이 일어나 핵산 서열에 변화가 생기게 되며, 상기 변화된 핵산 서열은 실질적인 변화 표현형 (phenotype)을 나타낼 수 있다.
<97> 상기 변화된 핵산서열은 공지의 시뭔싱 (sequencing) 방법에 의하여 탐지 (규 명) 될 수 있다. 상기 시¾싱 방법으로는 이에 제한되지 않으나， Sanger sequencing 또는 NGS(Next generat ion sequencing)등의 방법에 의해 수행될 수 있 다.
<98> 또한, 상기 변화된 핵산서열로 인하여 세포에 변화된 표현형이 나타나는 경 우에는 상기 변화 표현형을 검출하여 bai t 및 prey 단백질 간에 상호작용을 판정할 수 있다ᅳ
<99> 상기 변화 표현형이란, 기존에 나타내지 않던 표현형을 새롭게 나타내는 것 또는 표현형의 조합을 모두 포함하는 의미이다.
<100> 기존에 나타내지 않던 표현형을 새롭게 나타내는 경우는, 예를 들어 사전에 어떠한 번역 프레임 ( frame)에도 속하지 않는 마커 유전자 근처에 하나 이상의 lox si te를 위치시키는 경우， bai t 및 prey 단백질 상호작용으로 인해 발현된 Cre 재조 합효소에 의하여 lox si te 재조합이 일어났을 때 상기 마커 유전자가 번역 프레임 에 들어오도록 ( in frame) 핵산 서열들의 위치가 스위칭 (swi tching)될 수 있으며, 이에 따라 기존에 발현되지 않던 마커 유전자가 발현되므로 표현형의 변화를 가져 오게 된다.
<ιοι> 표현형의 조합은， 예를 들어， 어떤 마커 유전자에 대한 하나의 번역 프레임 근처에 하나 이상의 lox si te를 위치시키는 경우 bai t 및 prey 단백질 상호작용으 로 인해 발현된 Cre 재조합효소에 의하여 lox s i te 재조합이 일어났을 때, 상기 마 커 유전자의 번역 프레임 전체가 유전체 상의 다른 위치로 스위칭 (swi tching)되어 복수의 표현형을 나타낼 수 있다.
<102> 상기 마커 유전자는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 , 예를 들어 약물 저 항성 유전자， 형광 단백질 코딩 유전자, 영양 요구성 표지 유전자 등을 포함한다. 본 발명에서 상기 마커 유전자로는 형광 단백질 코딩 유전자가 사용되는 것이 바람 직할 수 있으며， 이 경우 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACS(Fluorescence-act ivated cel l sort ing) 등의 방법을 통하여 손쉽게 해당 세포 들을 선별할 수 있다.
<103>
<104> 본 발명의 상기 이중 리포터 효모 균주에서， 상기 1st 리포터 시스템과 2nd 리포터 시스템은 효모 유전체 내에서 서로 상이한 영역에 위치하는 것 일 수 있다. 즉 1st 리포터 시스템과 2nd 리포터 시스템은 서로 다른 염색체 (chromosome) 상에
. 위치하는 것 일 수 있다.
<105>
<106> 본 발명의 상기 이중 리포터 효모 균주는 본 발명자에 의해 KCTC12792BP로 기탁되었다. 상기 기탁균주는 is t 리포터 시스템으로서 GAL4 UAS 의 하류에 서열번 호 13으로 표시되는 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 c-myc 리포터 발현 카세트가 효모 유전체 중 15번 염색체에 포함되어있으며, 2nd 리포터 시스템으로서 GAL4 UAS 의 하류에 서열번호 14로 표시되는 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 Cre 리포터 발 현 카세트가 5번 염색체에 포함되어있다.
<107>
<108> 본 발명의 상기 이중 리포터 효모 균주는 '이중 -하이브리드 시스템' 에 적용 할 시， 라이브러리 수준에서의 단백질 상호작용을 검출 및 선별하고 이들의 관계 규명과 관련된 대량의 정보처리를 편리하고 높은 정확도로 수행할 수 있도록 하는 이점을 제공한다. 이와 같은 본 발명 이중 리포터 효모 균주의 이점은， 이중 -하이 브리드 시스템에 본 발명의 이중 리포터 효모 균주를 적용한 일례에 관한 이하의 내용에서 구체적으로 설명한다.
<109>
<1 10> 따라서 본 발명은
<i i i> (a) 상기 본 발명의 이중 리포터 효모 균주에 베이트 (bai t ) 라이브러리 및 프레이 (prey) 라이브러리를 형질전환하는 단계; 및
<1 12> (b) 상기 형질전환 된 효모 균주로부터 이중 리포터 발현 여부를 조사하여 베이트-프레이 단백질 결합 쌍들을 검출하는 단계를 포함하는 단백질 상호작용 검 출 방법을 제공한다.
<1 13>
<1 14> 상기 '베이트 라이브러리' 는 서로 상이한 베이트 단백질을 코딩하는 핵산의 총 집합체를 의미하는 것으로， 구체적으로 전사인자 (본 발명에서는 GAL4)의 DNA 결 합 도메인 (DBD) 및 베이트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 백터 또는 이의 집합체를 의미한다. 상기 베이트 라이브러리에서는 전사인자의 DBD와 베이트 단백 질이 연결 (융합)된 형태로 발현된다.
<Π 5> 상기 베이트 라이브러리의 제작에 사용되는 백터는 전사인자로 GAL4를 사용 하는 공지의 DBD 백터일 수 있으며, 예를 들어 pGBKT7 , pAS2-lc , pGBT9 , pBr idge 및 pDEST™32 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
<Π6> 바람직하게 상기 베이트 라이브러리는 플라스미드 pGBKT7에 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 제거하고， 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자 리로 대체하고, 그 뒤로 10x2272 서열과 바코드 삽입 부위， 카나마이신 항생제 저 항성 유전자와 프로모터, GFP 유전자 및 ΙοχΡ 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징 으로 하는 pDBD-donor 백터를 사용하여 제작되는 것 일 수 있다. 구체적으로 상기 pDBD-donor 백터에서 두 개의 Sf i I 제한효소 자리 사이에 각각 서로 다른 베이트 단백질 코딩 서열을 삽입하고， 상기 바코드 삽입 부위에 상기 각각의 베이트 단백 질을 표시하는 바코드 서열을 삽입함으로서 제작될 수 있다.
<1 17>
<ι ΐ 8> 상기 pDBD-donor 백터는 pGBKT7 백터를 기본으로 유전자 변형을 통하여 제조 된 것으로 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 제거하고， 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체하고， 그 뒤로 10x2272 서열과 바코드 삽입 부 위 , 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터 , GFP 유전자 및 ΙοχΡ 서열이 순 차적으로 도입된 것을 특징으로 한다.
<ι ΐ9> 상기 pGBKT7 백터는 목적 단백질이 GAL4 DNA binding 도메인 (DBD)에 결합 (융 합)하여 발현될 수 있도톡 디자인 된 yeast two hybr id 백터로 [도 4]의 개열지도 와 같은 구조를 가진다.
<120> ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 Cre recombinase에 인식되고 swi tching 되는 서열이다. 본 발명의 상기 pDBD-donor 백터는 Cre recombinase에 의해 인식되고 재 조합되는 ΙοχΡ 서열 및 10x2272 서열을 포함하며， 상기 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열 은 바람직하게 상호 간에 500 내지 4000bp(base pai r ) 범위의 간격으로 위치되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 ΙοχΡ 서열 및 10x2272 서열은 상호 간에 750 내지 3500bp 범위의 간격으로， 가장 바람직하게는 1500 내지 2500bp 범위의 간격으 로 위치되는 것일 수 있다. 상기 pDBD-donor 백터의 ΙοχΡ 서열 및 1 ox2272 서열은 동일 배향 (same or i entat i on)으로 위치된다.
<i2i> 상기 ΙοχΡ 서열 및 10x2272 서열 사이에 GFP 유전자 및 바코드 서열 삽입부 위가 도입되어 있다. <122> Cre recombinase에 의해 loxP 서열 및 1οχ2272 서열 사이의 부분이 후술하는 pAD-acc 백터로 도입되면, 상기 GFP(green f luorescent protein) 유전자는 LEU2 프 로모터에 의해 발현이 되어 형광을 나타내며， 상기 pDBD-donor 백터의 바코드 서열 은 후술하는 pAD-acc 백터의 바코드 서열과 연결 (또는 인접)되어 식별될 수 있도록 구성되어 있다 (도 18 참조) .
<123> 상기 '멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체' 는, 상기 기존 백터의 MCS를 목적 단백질에 대한 유전자 삽입부위로 만드는 것을 의미한다. 상기 유전자 삽입부위는 라이브러리를 구성하는 목적 단백질의 유전자가 삽입될 수 있는 부위로 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 유전자를 도 입할 수 있게 하는 것이 바람직하며， 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류 가 특별히 제한되지 아니하나， 바람직하게는 두 개의 Sf i I 일 수 있다. 상기 유전 자 삽입부위에 삽입되는 유전자는 후술하는 pAD-acc 백터에 도입되는 유전자와 상 호 interact ion을 알고자 하는 목적 유전자로 그 종류는 특별히 제한되지 아니한 다.
<124> 상기 바코드 서열 삽입부위는 상기 pDBD-donor 백터의 유전자 삽입부위 (두 개의 Sf i I 제한효소 자리 사이)에 도입되는 베이트 단백질 유전자를 표시하는 서 열로 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나, 1개 내지 20개의 뉴클레오티드 로 구성될 수 있으며， 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있 다. 상기 바코드 서열 삽입부위는 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 바 코드를 도입할 수 있게 하는 것이 바람직하며， 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류가 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 Af l I I 및 Age I 일 수 있다.
<125>
<126> 본 발명의 pDBD-donor 백터는 바람직하게는 [도 2]의 개열지도로 나타내어질 수 있다. 도 2의 개열지도로 표시되는 pDBD-donor 백터는 베이트 단백질 삽입을 위 한 제 1 클로닝 부위로서 한 세트의 Sf i I 제한효소 자리가 포함되며， 바코드 삽입 을 위한 제 2 클로닝 부위로서 ΑΠ I I 및 Age I 세트의 제한효소 인식서열이 포함 되어있다. 도 2의 개열지도로 표시되는 pDBD-donor 백터는 바람직하게 서열번호 15 의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있으며， 본 발명자에 의하여 기탁번호 KCTC12790BP로 기탁되었다.
<127>
<128> 상기 '프레이 라이브러리' 는 서로 상이한 프레이 단백질을 코딩하는 핵산의 총 집합체를 의미하는 것으로， 구체적으로 전사인자 (본 발명에서는 GAL4)의 전사활 성 도메인 (AD) 및 프레이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 백터 또는 이의 집 합체를 의미한다. 상기 프레이 라이브러리에서는 전사인자의 AD와 프레이 단백질이 연결 (융합)된 형태로 발현된다.
<129> 상기 프레이 라이브러리의 제작에 사용되는 백터는 전사인자로 GAL4를 사용 하는 공지의 AD 백터일 수 있으몌 예를 들어 pACT2 , pGADT7 , pGADIO , pGAD424 , pGAD GH , PGAD GL , pDEST™22 및 pEXPTM-AD502 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다.
<130> 바람직하게 상기 프레이 라이브러리는 플라스미드 pGADT7의 LEU2 유전자 말 단 (전사방향 기준)에 Ι οχΡ 서열을 삽입하고, 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 바코드 삽입 부위, 10x2272 서열이 순차 적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pAD-acc 백터를 사용하여 제작되는 것 일 수 있 다. 구체적으로 상기 pAD-acc 백터에서 두개의 Sf i I 제한효소 자리 사이에 각각 서로 다른 프레이 단백질 코딩 서열을 삽입하고， 상기 바코드 삽입 부위에 상기 각 각의 프레이 단백질을 표시하는 바코드 서열을 삽입함으로서 제작될 수 있다.
<131>
<132> 상기 pAD-acc 백터는 pGADT7백터를 기본으로 유전자 변형을 통하여 제조된 것으로 LEU2 유전자 말단 (전사방향 기준)에 ΙοχΡ 서열을 삽입하고， 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체하고， 그 뒤로 바코드 삽입 부 위 10x2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 한다.
<133> 상기 pGADT7 백터는 목적 단백질이 GAL4 act ivat ion 도메인 (AD)에 결합 (융 합)하여 발현될 수 있도록 디자인 된 yeast two hybr id 백터로 [도 3]의 개열지도 와 같은 구조를 가진다.
<134> 상기 LEU2 유전자는 류신의 upst ream 조절 인자로 일반적으로 효모의 스크리 닝에 사용되몌 PGADT7백터에 기본적으로 포함된다. 상기 LEU2 유전자는 이와 작동 가능하게 연결되어있는 LEU2 프로모터에 의해 발현이 조절된다.
<135> ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 Cre recombinase에 인식되고 스위칭
(swi tching) 되는 서열이다. 상기 pAD-acc 백터에서 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 상호 간에 일정 간격으로 떨어져 백터 내에 위치되며， 바람직하게 상호 간에 500 내지 4000bp(base pai r ) 범위의 간격으로 위치되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 상호 간에 500 내지 3000bp 범위의 간격으로, 가장 바람직하게는 700 내지 1200bp의 범위로 위치되는 것일 수 있다ᅳ 상기 pAD- acc 백터의 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 동일 배향 ( same or i ent at ion)으로 위치된 다. 또한 상기 pAD-acc 백터의 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은, 상기 pDBD-donor 백 터의 ΙοχΡ 서열 및 10x2272 서열과 서로 동일한 상대배향으로 배열 (또는 위치)되는 것이 바람직하다.
<136> 본 발명의 백터는 LEU2 유전자 하단 (전사방향 기준)에 ΙοχΡ 서열이 위치하 여, Cre recombinase에 의해 다른 유전자 서열이 LEU2 하단에 결합하면 발현이 이 루어지게 구성되어 있다. 이를 위하여 ΙοχΡ 서열이 도입되는 LEU2 유전자 말단은 종결코돈을 제거하여， 발현시 LEU2 말단에서 발현이 중단되지 않도록 구성되어 있 다. 또한 10x2272 서열 앞에 바코드 서열 삽입부위를 도입하여, 상기 바코드 서열 삽입부위에 삽입된 바코드 서열이 Cre recombinase에 의해 이동된 다른 바코드 서 열 (즉， pDBD-donor 백터로부터의 바코드 서열)과 함께 결합 또는 인접 되도록 구성 되어 있다. 도 5에서 Cre recombinase에 의하여 pDBD-donor 백터로부터 일부 서열 ( 양 말단이 각각 ΙοχΡ 및 1οχ2272에 의하여 f l anking 되어있는 서열)이 pAD-acc 백 터로 swi tch 된 후의 백터의 개열지도를 도시하며, 이러한 백터의 swi tch 과정 및 결과물을 도 14에서 도시한다.
<137> 상기 '멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체' 는, 상기 기존 백터의 MCS를 목적 단백질에 대한 유전자 삽입부위로 만드는 것을 의미한다. 상기 유전자 삽입부위는 라이브러리를 구성하는 목적 단백질의 유전자가 삽입될 수 있는 부위로 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 유전자를 도 입할 수 있게 하는 것이 바람직하며， 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류 가 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 두 개의 Sf i I 일 수 있다. 상기 유전 자 삽입부위에 삽입되는 유전자는 pDBD-donor 백터에 도입되는 유전자와 상호 interact ion을 알고자 하는 목적 유전자로서 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다.
<138> 상기 바코드 서열 삽입부위는 상기 pAD-acc 백터의 유전자 삽입부위 (두 개의 Sf i I 제한효소 자리 사이)에 도입되는 프레이 단백질 유전자를 표시하는 서열로 뉴클레 오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나， 1개 내지 20개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며， 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 상기 바코드 서열 삽입부위는 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 바코드를 도 입할 수 있게 하는 것이 바람직하며, 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류 가 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 BsiW I , Xbal 및 Sac I I의 제한효소 일 수 있으며, 예를 들어 BsiW I 및 Sac I I의 세트 또는 Xbal 및 Sac I I 세트를 사 용할 수 있다.
<139> 140> 본 발명의 pAD-acc 백터는 바람직하게는 [도 1] 또는 [도 1이의 개열지도로 나타내어질 수 있다. 도 1과 도 10의 개열지도는 바코드 삽입부위에 포함되는 제한 효소 인식 서열에서 차이가 있을 뿐 이외의 다른 구성은 모두 동일하다. 도 1의 개 열지도로 표시되는 pAD-acc 백터의 바코드 삽입부위에는 BsiW I 및 Sac II의 제한 효소 인식 서열이 포함되어있으며 도 10의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 백터의 바 코드 삽입부위에는 Xbal 및 Sac II의 제한효소 인식서열이 포함되어 있다.
<i4i> 상기 도 1의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 백터는 바람직하게 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다.
<142> 상기 도 10의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 백터는 바람직하게 서열번호 17 의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있으며, 본 발명자에 의하여 기탁번호 KCTC12791BP로 기탁되었다.
<143>
<144> 한편 상기 라이브러리의 제조에 있어서, 본 발명에서 사용되는 표준 재조합
DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 다음 문헌에 기재되 어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989)； by Silhavy, T. J. , Bennan, M. L. and Enquist , L. W. , Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984)； and by Ausube 1 , F. M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wileyᅳ lnterscience (1987)) .
<145>
<146> 상기 형질전환은 핵산을 유기체， 세포， 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방 법도 포함되며， 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들 면， 인산칼슘법 염화칼슘법， 염화루비듬법, 미세사출법 (microprojectile bombardment ) , 일렉트로포레이션 (electroporation) , 입자 총 층격 (particle gun bombardment ) , 실리콘 탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers) , 초음파 처리 (sonication), PEG-매개 융합법 (PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법 (liposome-mediated method), 자성나노입자 매개 법 (magnetic nanopart icle-mediated method) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제 한되지 않는다.
<147> <148> 상기 '이중리포터 발현 여부' 를 조사하는 방법으로는， 먼저 1st 리포터 시스템에 의하여 Myc단백질 (특히， c-myc 에피토프)이 세포 표면에 발현이 되므로, 이를 검출 (detect ion)하는 방법으로 bai t와 prey의 상호작용 여부를 확인할 수 있 다. 상기 Myc 단백질의 세포 표면 발현을 검출하는 방법은 전술한 바와 같다. 그리 고 2nd 리포터 시스템에 의하여 Cre 재조합효소가 발현되므로， 상기 Cre 재조합효 소를 직접 검출 (detect ion)하거나， 상기 Cre 재조합효소가 발현됨으로 인해 세포 내에 발생된 유전적인 변화를 탐지하는 방법으로 bai t와 prey의 상호작용 여부를 확인할 수 있다. Cre 재조합효소를 직접 검출하는 방법 및 Cre 재조합효소가 발현 됨으로 인해 세포 내에 발생된 유전적인 변화를 탐지하는 방법에 대해서는 전술한 바와 같다.
<149>
<150> 본 발명의 이중 리포터 효모를 이용하여 단백질 상호작용을 검출하는 방법에 있어세 가장 바람직한 실시 방법은 하기와 같을 수 있다;
<i5i> (a) 상기 pAD-acc 백터 및 상기 pDBD-donor 백터에 각각 상이한 바코드 서열 을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1， 제 2 라이브러리를 구성하는 단계;
<152> ( b) 상기 제 1 및 제 2라이브러리를 상기 이중 리포터 효모 균주에 도입하는 단계;
<153> ( c ) 상기 제 1라이브러리 및 제 2라이브러리가 도입된 효모 균주로부터， 상기 pAD-acc 백터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질과 상기 pDBD-donor 백터에 도 입된 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 상호작용하는 효모균주를 선별하는 단계;
<154> (d) 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 상기 상호작용하는 단 백질을 선택하는 단계를 포함하는 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한 다.
<155>
<156> 이하 상기 방법에 관하여 단계별로 설명한다 .
<157>
<i58> (a) 단계에서는 전술한 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor백터에 각각 상이한 바코 드 서열을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1 및 제 2라이브러리를 구성한다.
<159> 상기 pAD-acc 백터， pDBD-donor백터 및 바코드 서열에 관해서는 전술한 바와 같다. 도 14의 A 및 B에서 상기 백터들에 대한 모식도가 제공된다.
<160> 바코드는 재조합되는 유전자를 식별하기 위하여 도입되는 서열로서, 각 백터 에 재조합 되는 목적 단백질 유전자 (즉, 베이트 단백질 유전자 또는 프레이 단백질 유전자)에 따라 상이한 바코드 서열이 도입되는 것이 바람직하다. 바코드 서열은 상기 pAD-acc 백터 및 상기 pDBD-donor 백터의 바코드 서열 삽입부위에 삽입된다. <161> 상기 목적 단백질 유전자는 상호작용 여부를 확인하고자 하는 단백질을 코딩 하는 DNA (유전자)를 말하며， pAD-acc 백터 및 pDBD-donor백터의 유전자 삽입부위( 두개의 Sf i I s i te 사이에)에 삽입된다.
<162> 본 발명의 백터에 바코드 서열 및 유전자를 재조합하는 방법은 공지의 유전 자 조작 방법에 의할 수 있다.
<163> 본 발명의 제 1라이브러리는 목적 단백질 유전자 (특히, 프레이 단백질 유전 자) 및 바코드 서열이 도입된 pAD-acc 백터군을 말하몌 제 2라이브러리는 목적 단 백질 유전자 (특히， 베이트 단백질 유전자) 및 바코드 서열이 도입된 pDBD-donor 백 터군을 말한다.
<164>
<165> 상기 (b) 단계에서는 상기 제 1 및 제 2라이브러리를 본 발명의 이중 리포터 효모 균주에 도입한다. 본 발명의 라이브러리를 효모 균주에 도입하는 방법은 공지 의 효모 형질전환 방법에 의할 수 있다.
<166>
<167> 상기 (c ) 단계에서는 pAD-acc 백터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질
(AD— Prey)과 pDBD-donor 백터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질 (DBD-Bai t )이 ' 상호작용 하는 효모균주를 선별한다.
<168> 상기 본 발명의 효모균주는 전술한 ( i ) 및 ( i i )의 이중 (dua l ) 리포터 시스템 을 가지므로, 상기 A으 Prey와 DBD-Bai t이 상호작용하는 경우， ( i )의 리포터 시스템 에 의하여 c-myc에피토프가 효모 세포벽 표면에 발현하고， ( Π )의 리포터 시스템에 의해 GFP의 발현， 바코드 서열 조합， 두 개 이상의 항생제에 대한 내성을 가지는 등 다양한 표현형이 발현된다.
<169> 상기 ( i i )의 리포터 시스템에의한 표현형과 관련하여 좀 더 구체적으로 설명 하면 상기 ( i i )리포터 시스템의 CRE 유전자의 발현에 의해 생성된 Cre recombinase는 yeast two hybi rd 과정에서 본 발명의 효모 균주에 도입된 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터의 ΙοχΡ 및 1 ox2272서열을 인식하고 이들을 재조합한다. 상기 두 백터의 Cre recombinase에 의한 재조합에 의해 GFP 단백질의 발현 (재조합 에 의해 LEU2 하단에 GFP가 발현 가능하도록 연결됨 . 즉, LEU2 번역 프레임에 GFP 가 인프레임 ( in frame) 됨 ) 및 바코드 서열의 조합 (pDBD-donor 백터의 바코드 서열 이 pAD-acc 백터로 이동 ( transfer )됨)이 일어나게 되며， 상기 GFP 단백질의 발현을 detect ion하여 bai t와 prey간 상호작용이 일어난 균주를 sel ect ion 할 수 있으며， 상기 조합된 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터에 포함된 바코드 서열을 식별하여 상호작용이 일어난 단백질이 어떤 것인지 확인이 가능하다. 상기 식별은 바코드의 폴리뉴클레오티드 서열을 식별하는 것을 말하며, 공지의 시뭔싱 방법에 의하여 식 별할 수 있다. 상기 GFP 단백질의 발현을 detect i on하는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아니하며， 바람직하게는 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACS(Fhiorescence-act ivated cel l sort i ng) 방법에 의할 수 있다. 또한 상기 바코드 서열의 조합은 PCR을 통하여 해당 단백질의 상호작용의 유무를 검출 할 수 있을 뿐만아니라， NGS를 통한 바코드 리딩 (bacord reading)을 통하여 라이브러리-라이브러리간 대량의 단백질 동시 분석 시에 단백질간 상호작용의 세기 차이 또한 검출 가능하다.
<170>
<i 7i> 상기 표현형들을 이용하여 AD-Prey와 DBD-Bai t가 상호작용하는 효모균주를 선별할 수 있다. 도 14의 C에서 상기 AD-Prey와 DBD-Bai t이 상호작용하는 경우， ( Π )의 리포터 시스템에의해 재조합된 백터의 모식도를 도시하며, 구체적으로 도 5 에서 그 개열지도를 도시한다.
<172>
<173> 상기 효모균주 선별은 상기 표현형을 이용하는 한 그 방법이 특별히 제한되 지 않으나， 예를 들어， Myc 단백질 (특히, c-tnyc 에피토프)에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 Myc 단백질에 결합시킨 후 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하며 형광 물질 (특히 시아닌 계열)로 표지된 2차 항체를 결합시키고 형광현미경 또는 FACS 둥 을 이용하여 선별하는 방법， Myc 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 단백질 에 결합시킨 후 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체로 코팅된 자성 비드를 사용하여 MACS를 수행하여 선별하는 방법， 2종 이상의 항생제를 처리하여 선별하는 방법， GFP에 대하여 형광현미경 관찰 또는 FACS 등을 수행하여 선별하는 방법 등을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서 MACS 또는 FACS를 사용하는 방법은 기존의 한 천배지를 이용한 yeast two hybr id 스크리닝에 비하여 한천 배지를 사용하지 않고 도 월등히 적은 시간과 노동력으로도 많은 양의 균주를 처리할 수 있어 매우 유용 하다. :174>
d 75> 상기 (d) 단계에서는 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 어떤 유전자의 단백질들이 서로 상호작용을 하였는지 확인하여 선택한다.
<176> 상기 (d) 단계의 바코드 서열은, 상기 (a) 단계에서 pAD-acc 백터 및 pDBD- donor 백터에 Prey 및 Bai t를 코딩하는 유전자와 함께 도입한 각 바코드 서열의 조 합이다. 본 발명의 효모균주는 Prey 및 Bai t가 상호작용하는 경우 Cre recombinase 가 생성되어 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터에 포함된 바코드 서열을 결합 (또는 인접)시킨다. 즉， pDBD-donor 백터에 포함된 바코드 서열이 pAD-acc 백터 내로 이 동 (t ransfer )되므로 각 바코드 서열들이 인접되어 특수한 핵산 조합을 나타낸다. 이처럼 본 발명의 단백질 상호작용 검출 방법은 바코드 이동 분석 (barcode transfer assay)에 기반을 두는 것으로 이해될 수 있다.
<177> 라이브러리 구성시 각 백터에 도입되는 유전자가 어떤 바코드 서열과 매칭
(matching)되었는지 조사되므로， 상기 선별된 효모 균주의 바코드 서열의 식별을 통하여 어떤 단백질이 서로 상호작용하여 해당 효모균주에서 형광물질이 발생한 것 인지 손쉽게 확인 할 수 있다. 상기 바코드 서열을 식별하는 방법은 공지의 폴리뉴 클레오티드 서열의 식별 방법인 시뭔싱 (예를들어 Sanger sequencing , NSG)등에 의 할 수 있다.
<178>
<179> 이처럼 본 발명의 이중리포터 효모 균주를 단백질간의 상호작용을 검출에 적 용하는 경우， Prey 및 Bai t 단백질이 상호작용하고 있는 해당 효모세포를 신속하게 높은 정확도로 분리할 수 있으며， 기 도입된 바코드 서열의 분석을 통하여 상호작 용하는 단백질이 어떤 것인지 손쉽게 확인이 가능하여, 라이브러리 수준에서의 대 량 정보처리가 가능하다.
<180>
【유리한 효과】
<181> 본 발명의 이중리포터 효모 균주는 단백질 상호작용 검출에 적용 시, 라이브 러리 수준에서의 단백질 결합 쌍들에 대한 대량의 정보를 효율적으로 처리할 수 있 도록 하는 수단을 제공한다.
<182>
【도면의 간단한 설명】
<183> 도 1은 본 발명의 pAD-acc 백터의 개열지도이다.
<184> ；185> 도 2는 본 발명의 pDBD-donor 백터의 개열지도 (기탁번호 KCTC12790BP)이다.
<186>
<187> *
<188> 도 3은 본 발명의 pAD-acc 백터 제작을 위한 기본 백터인 pGAADT7 AD 백터의 개열지도이다.
<189>
<190> 도 4는 본 발명의 pDBD-donor 백터 제작을 위한 기본 백터인 pGBKT7 백터의 개열지도이다.
<191>
<192> 도 5는 본 발명의 Cre recombinase에 의하여 pDBD-donor 백터로부터 일부 서 열이 pAD-acc 백터로 switch 된 후 백터의 개열지도이다. 구체적으로 도 1의 개열 지도를 가지는 pAD-acc 백터와 도 2의 개열지도를 가지는 pDBD-donor 백터 사이에 서 lox site에 의해 재조합이 일어난 후의 백터 개열지도를 나타낸다.
<193>
<194> 도 6 및 도 7은 본 발명 효모 균주에 p53과 SV40 large T 항원을 도입한 본 발명 백터를 형질전환 후 효모의 리포터 유전자가 정상작동 하는지를 확인한 형광 현미경 사진이다 (p53 ( T): 야생형 Murine p53; p53 (D278G, 34 %) ： p53 단백질의 278번째 아미노산 D(aspartic acid)를 G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 34%로 감소; p53 (V144G, 4.9%) ： p53 단백질의 144번째 아미노산 V(Valine)를 G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이， SV40 L.T와 결합력이 4.9%로 감소; p53 (E255 , 1.5%) ： p53 단백질의 255번째 아미노산 E(Glutamic acid)를 K(Lysine)으 로 바꾼 돌연변이， SV40 L.T와 결합력이 1.5%로 감소; Lamin A ： p53 단백질과 전 혀 상호작용하지 않는 단백질 (Negative control)).
<195>
<196> 도 8은 본 발명 효모 균주에 p53(wild type 및 이의 muatant)과 SV40 large
T 항원을 도입한 본 발명 백터를 형질전환 후, 단백질 상호작용이 일어난 효모세포 를 FACS로 검출 분리한 결과그래프로서， 붉은색은 Cy5(AgaI-myclO 발현확인)를 초 록색은 GFKCre recombinase 발현확인) 분석 결과를 나타낸다 (도 8a: p53 (WT)와 Sv40 T, 도 8b: D278GC34 <¾)와 Sv40 T, 도 8c: V144G (4.9D와 Sv40 Tᅳ 도 8d: E255K (1.5 와 Sv40 T, 도 8e: Lamin A와 Sv40 T) .
<197>
<i98> 도 9는 본 발명 효모 균주에 p53과 SV40 large T 항원을 도입한 본 발명 백 터를 형질전환 후 단백질 상호작용이 일어난 효모세포를 FACS로 검출 분리한 결과 그래프이다 (X 축 ： GFP 발현강도, Y 축 : Cy5 발현강도， 도 9a : p53 (WT)와 Sv40 Tᅳ 도 9b : D278G(34 %)와 Sv40 T, 도 9c : V144G (4.9%)와 Sv40 T , 도 9d: E255 ( 1 .5 ¾ 와 Sv40 T , 도 9e : Lamin A와 Sv40 T) .
<199>
<200> 도 10은 본 발명에서 또다른 형태의 pAD-acc 백터 (기탁번호 KCTC12791BP)의 개열지도이다.
<201>
<202> 도 11은 본 발명의 효모 세포에 포함된 두 개의 리포터 시스템을 나타낸다
(A: c-myc 리포터 시스템 B : Cre 리포터 시스템)
<203>
<204> 도 12는 c-myc 리포터 시스템에 의해, 목적하는 두 단백질이 상호작용하는 경우 효모 세포벽에 c-myc 에피토프가 발현되는 것을 나타내는 모식도이다.
<205>
<206> 도 13은 c-myc 리포터 시스템을 위한 c-myc 리포터 발현 시스템의 여러 가지 구현형태를 도시한다 (A: c-myc 10개 반복, B : c-myc 5개 반복, C: c-myc 1개 )
<207>
<208> 도 14는 cre 리포터 시스템에 의하여 , pDBD-donor 백터 (A) 및 pAD-acc 백터
(B)가 재조합 (C)되는 것을 보여주는 모식도이다.
<209>
<2i o> 도 15는 c-myc 리포터 시스템에서， c-myc 에피토프 반복 갯수에 따른 신호강 도를 나타낸다.
<21 1>
<212> 도 16은 본 발명 ,의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에서, 단백질 상 호작용에 따른 MACS 선별 및 이의 결과를 GFP로 확인한 것이다.
<213>
<214> 도 17은 본 발명의 dua l repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에서, MACS를 1 회 및 2회 반복 수행하여 단백질 상호작용에 따른 MACS 선별 결과를 형광신호로 확 인한 결과이다.
<215>
<216> 도 18은 본 발명에서 Cre recombinase 발현에 의해 바코드 이동 (barcode transfer ) 결과로서 생성된 본 발명에서 바코드 조합을 검출하기 위해 사용된 pr imer A, B , C의 결합위치를 나타낸다.
<217>
<218> 도 19는 PCR 방법으로 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에 서， 단백질 상호작용 여부에 따른 바코드 조합여부를 검출한 결과이다.
<219>
<220> 도 20은 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에 2종의 항생제 처리 후 생성된 콜로니에 대하여， PCR 방법으로 단백질 상호작용에 따른 바코드 조 합여부를 검출한 결과이다.
<221>
<222> 도 21는 NGS 분석 방법을 이용하여， 단백질 상호작용 강도에 따른 바코드 리 드 (bacord read) 수치를 나타낸다.
<223>
<224> 도 22는 NGS 분석 방법을 이용하여, 라이브러리 -라이브러리 간 단백질 상호 작용 강도에 따른 바코드 리드 (bacord read) 수치를 나타낸다.
<225>
<226> 도 23은 상기 도 22와 관련하여 NGS결과 bacord read 수가 높은 순서로 상위
36개를 정렬한 결과이다.
<227>
<228> 도 24는 단백질 상호작용 세기에 따라 MACS 수행시 세포 선별능이 달라지는 것을 나타내는 것을 보여주는 데이터로서， 단백질 상호작용 세기가 강할수록 MACS 에 의해 세포 선별이 잘되몌 이를 형광강도로 확인한 결과이다 (도 24a : p53 (WT) 와 Sv40 T, 도 24b : D278G(34 %)와 Sv40 T, 도 24c : V144G (4.9%)와 Sv40 T, 도 24d: E255 ( 1.5 ¾)와 Sv40 T, 도 24e : Lami n A와 Sv40 T) .
<229>
【발명의 실시를 위한 형태】
<230> 이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
<231> 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<232>
<233> <실시예 1>
<234> 이중 리포터 시스템을 가지는 Mega-throughput Y2H 효모 균주 개발
<235> <236> <1-1> c-myc 에피토프를 발현하는 1st repot er 발현 카세트
<237> GAL4 UAS( upstream act ivat ion sequence)의 downstrea 에 서열번호 13의 '
Gal l promoter MF α 1- myclO repeats- Glycine/Ser ine l inker— Ag a I (C一 term)' 의 발현 구조체 (발현 카세트)가 연결된 형태의 , c-myc 리포터 시스템을 제작하였다.
<238> 이때, 상기 발현 구조체 중 myc repeat의 개수를 0개， 1개 5개, 10개 (myclO repeats)로 하는 발현 구조체 (도 13 참조)를 제작 및 효모에 도입하여 발현시키고， 상기 효모에 1차 항체인 mouse a -myc 항체 (c-Myc Ant ibody (9E10) (Santa cruz사 의 sc-40) )와 2차 항체인 goat a -mouse IgG-Cy5(Mol ecular probe사의 A10524) 항 체를 처리하여, 형광현미경으로 관찰하였다.
<239>
<240> 그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이 c-myc 10 repeat에서 형광 발현이 강한 것을 확인하였고, 이를 이후의 실험에서도 확인하였다.
<241>
<242> <1-2> Cre recombinase를 발현하는 2nd repot er 발현 카세트
<243> GAL4 UAS(upstream act ivat ion sequence)의 downstream에 서열번호 14의 '
GAL1 promoter- CRE recombinase' 가 연결된 형태의 , Cre 리포터 시스템을 제작하 였다.
<244>
<245> <1-3> c-myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포함 하는 효모 균주 제작
<246>
<247> 상기 실시에 1—1 및 1-2의 발현 구조체가 영구적으로 발현되는 효모균주를 제작하였다. 서열번호 13의 'Gal l promoter MF α 1- myc 10 repeats- Glycine/Ser ine l inker- Ag a KC-term)' 의 발현 구조체는 15번 크로모 (chromosome)에서 GAL4 UAS(upstream act ivat ion sequence)의 downstream에 위치하 며 , 서열번호 14의 'GAL1 promoter- CRE recombinase' 발현 구조체는 5번 크로모 좀 (chromosome)에서 GAL4 UAS(upstream act i vat ion sequence)의 downstream에 위치 한다.
<248> 구체적으로 c-myc 리포터 및 Cre 리포터 동시발현 효모 균주인 'SK10-CRE( 기탁번호 KCTC12792BP) ' 를 제작하였으며， 상기 효모 균주는 하기 표 1의 유전자 형을 가진다.
<249> 【표 1】 규주명 유저자형 (GenotvDe)
SKIO— CRE MATa, ga A , gal80A , trpl-901, ura3-52, leu2-3, leu2-112,
iS3:： GALl-Aea 1-mvclO. 飄 3:： GALl-CREl
<250> 상기 효모의 제작방법은 하기와 같다. 먼저 하기 표 2의 유전자형을 가지는
JC-993 (ATCC 204097) 효모 균주에 pRS_pGALl-MF a I-myclO-GS-Ag a l(350a.a)를 도 입하여 GALl-Agal-myclO repoter 시스템을 가지는 효모인 SK10을 제작하였다. 상 기 pRS_pGALl-MFaI-myclO-GS-Agal(350a.a)는 효모 게놈상의 his3 유전자에 상동 성이 있는 부분이 있어 이를 이용하여 재조합을 유도하여 리포터를 도입하였다. 구체적으로, 5ug pRS_pGALl-MFaI-myclO-GS-Agal(350a.a)를 제한효소 Msc I(His3 유전자의 증간을 자름)를 처리하여 완전히 반웅한 후 에탄을 침전을 사용하여 DNA 를 모두 가라 앉힌 후 형질전환에 사용 하였다. 형질전환체의 선별은 SD I -Ura, -His + 25mM 3-AT media 선택배지에서 진행하였으며 선별된 후보군 증 게놈상에 리 포터가 삽입된 효모를 PCR과 GAL4를 지속적으로 발현하는 백터를 형질전환하여 리 포터의 정상적인 작동을 확인 하였다.
<25i> 이렇게 제작된 SK10 효모의 유전자형은 하기 표 2와 같으며, 상기 SK10 효모 에서 효모 게놈상의 URA3::GALl-LacZ 부분의 LacZ 를 CRE 유전자로 바꾸어주어， 본 발명의 이중리포터를 가지는 SK10-Cre 효모 균주를 제작하였다. Cas9-gRNA를 이용 하여 게놈상의 LacZ 부위에 dsDNA 절단부위를 만들고 여기에 CRE 유전자의 5 '말단 에 Gall 프로모터의 끝부분의 300 bp와 3' 말단에 LacZ 유전자의 끝부분 500 bp를 갖는 Donor DNA를 PCR을 통하여 제작하여 형질전환시에 함께 넣어 상동성 재조합을 유도하였다. 구체적으로 먼저 200 ng P414-TEFlp-Cas9-CYClt (Cas9 발현백터)을 SK10 효모 균주에 형질전환하고 SD/-Ura，- His,-Trp 한천배지에서 선별하여， SK10 + Cas9 형질전환체를 얻었다. PCR을 통하여 Cre Donor DNA를 증폭하여 준비하고, 6 ug의 DNA를 에탄을 침전을 통하여 침전후 층분히 말린 후 사용하였다. 그리고 상기 효모 균주 SK10 + Cas9 형질전환체 (on the SD/ -Ura, -His, -Trp)에 상기 Donor DNA와 200 ng과 Guide RNA expression vector를 함께 형질 전환 하였다. 형질전환 체는 SD/ -Ura, -His, -Trp, -Leu 한천배지를 통하여 선별 하였고 리포터 유전자의 도입은 형질전환체의 게놈에 존재하는 CRE유전자를 PCR을 통하여 확인하였다.
<252> 【표 2】
규주명 유저자형 (GenotvDe)
JC-993 MATa ga!4 gal 80 trpl-901 ura3-52 leu2-3 leu2-112 his3 (ATCC 204097) rURA3::DGALl-LacZᅵ
SK10 MATa, gal4A , gal80A , trpl-901, ura3-52, leu2-3, leu2-112,
[HI S3：： GALl-Aeal-mvclO. URA3:： GAL1— LacZl <실시예 2>
Mega-throughput Y2H vector 구죽
본 발명의 Mega-through put Y2H system에 사용되는 vector를 제작하였다. 본 발명의 vector는 pAD-acc 및 pDBD-donor의 두 종류가 한 쌍으로 이루어져 있으 며，'상기 두 백터 모두 barcode sequence와 CRE recombinase에 의해 swi tching 되 는 서열을 포함하고 있다. pDBD-donor 백터에는 형광을 방출하는 단백질의 유전자 (GFP)가 포함되어 있는 것이 특징으로서， Cre recombinase에 의해 swi tching되면 pDBD-donor 백터에 포함되어있던 식별용 barcode 및 GFP 유전자가 pAD-acc 백터로 이동되어, 각각 검출 및 발현이 가능한 상태로 만들어진다.
<2-1> pAD-acc vector의 구축
기존의 Y2H vector인 pGADT7 vector(Clontech, 도 3 참조)를 바탕으로 하여 본 발명의 목적에 맞게 변형하였다. 먼저 MCS 부분을 모두 제거하고， 두 개의 Sf i I 제한효소 인식자리를 포함하는 유전자 삽입 부위를 도입하였다. 그 다음 NGS 분 석을 통하여 삽입된 유전자가 무엇인지 파악하기 위하여 바코드 삽입부위 (제한효 소 BsiW I 및 Sac I I [도 1의 개열지도 참조] , 또는 제한효소 Xbal 및 Sac I I [도 10 의 개열지도 참조] )와 CRE recombinase에 의하여 재조합을 유도할 수 있는 1οχ2272 염기서열 (서열번호 20)을 두 번째 Sf i I 인식부위 바로 뒤에 삽입하였다. ΙοχΡ 염 기서열 (서열번호 21)은 Leu2 유전자의 종결코돈을 제거하고 삽입하였다. 그 결과 ΙοχΡ와 10x2272 사이는 약 lOOObp 떨어져 있도록 배열되었으며， .상기 ΙοχΡ와 10x2272는 동일한 배향 (orientat ion)으로 위치되었다. 전술한 과정을 통하여， 각각 도 K ful l sequence: 서열번호 16) 또는 도 10(ful l sequence: 서열번호 17)의 개 열지도를 가지는 pAD-acc vector를 제조하였다.
<2-2> pDBD-donor vector의 구축
기존의 Y2H vector인 pGBKT7 vector(Clontech, 도 4참조)를 바탕으로 하여 본 발명의 목적에 맞게 변형하였다. 먼저 MCS 부분을 모두 제거하고 두 개의 Sf i I 제한효소 인식자리를 포함하는 유전자 삽입부위를 도입하였다. 그 다음 CRE recombinase에 의하여 재조합을 유도할 수 있는 1οχ2272 염기서열과 함께 NGS 분석 을 통하여 삽입된 유전자가 무엇인지 파악하기 위한 바코드 삽입 부위 (제한효소 Af l I I/ Age I )를 두 번째 Sf i I 인식부위 뒤에 삽입하였다. 그 뒤로 항생제 카나 마이신 (Kanamycin) 저항성 유전자와 프로모터 그리고 GFP 유전자와 ΙοχΡ 염기서열 을 차례로 삽입 하였다. 그 결과 ΙοχΡ와 10x2272 사이는 약 2000bp 떨어져 있도록 배열되었으며, 상기 ΙοχΡ와 1οχ2272는 동일한 배향 (or ientat ion)으로 위치되었다. 전술한 과정을 통하여, 도 2( ful l sequence : 서열번호 15)의 개열지도를 가지는 pDBD-donor vector를 제조하였다.
<263>
<264> <2-3> Barcode 및 백터 준비
<265> 상기 구축한 vector에 삽입하기 위한 barcode를 준비하였다. barcode 주형 ol igo와 이를 PCR을 통하여 증폭하기 위한 프라이머를 제작한다. High— f idel i ty Phusion DNA polymerase(NEB, Cat . No M0530)를 사용하여 PCR을 통해 Barcode를 합
TM
성하였다. PCR machine으로 Bio-rad T100 thermal cycler (Cat . No 186-1096)를 사 용하였고， 하기 표 3과 같은 조성으로 PCR 반웅액을 만들었으며， 구제적인 PCR Condi t ion 은 다음과 같다; 95°C/30초 -[95°C /20초 -65°C/30초] xl5 cycles-72°C/60초 -4°C
I co ,
<266>
<267> 【표 3】
<268> PCR 반웅액의 조성
Figure imgf000032_0001
【표 4】
Barcode 제작에 사용된 주형 을리고 및 프라이머 서열
Figure imgf000033_0001
<272> PCR을 통하여 얻은 산물에 각 각 제한효소를 처리하였다. AD 용 바코드는 pAD-acc에 맞도록 제한효소 Bs i W I (NEB사) 및 Sac I I (NEB사)를 처리하며, DBD용 바코드는 pDBD-donor에 맞도록 제한효소 Af l I I (NEB사) 및 Age I (NEB사)를 처리 하였다.
<273> 제한효소 처리 후 Shr imp alkal ine phosphatase(USB사의 78390)를 처리하여 양 말단의 인산기를 모두 제거하였다. 완전히 제한된 절편 (약 30 bp)을 10% polyacryl amide gel ( IX TBE)을 통하여 순수하게 정제하였다.
<274>
<275> 실시예 2-1 및 2— 2를 통하여 구축한 vector에 각각 제한효소를 처리하였다.
pAD-acc vector는 제한효소 Bs iW I (NEB사) 및 Sac I I (NEB사)를 처리하며, pDBD- donor vector는 제한효소 Af l I I (NEB사) 및 Age I (NEB사)를 처리하였다.
<276> 효소 처리 후 완전히 제한된 절편을 Expin Gel SV(Geneal l사의 102-150)를 사용하여 정제하였다.
<277>
<278> <2-4> Barcode 삽입 라이브러리 구축
<279> 상기 과정을 통하여 얻은 vector와 barcode를 분자 수의 비율을 1 : 10이 되도 록 섞은 후 T4 DNA Hgase(NEB사의 M0202)를 처리하여 재조합을 유도한다. (4°C에 서 12시간) 반웅을 마친 후 박테리아 (ΤορΙΟΓ )에 형질전환을 하여 총 1.0 X 107개의 박테리아 클론을 얻을 수 있는 양을 준비한다.
<280> 준비된 클론을 미리 준비한 0.3% seaPrep agarose(Lonza사의 50302) LB 배지 에 접종하여 37°C에서 36시간 동안 배양 후 Pl asmid Maxi ki t (Qi agen사의 12165)를 사용하여 bar code가 삽입 된 라이브러리를 얻는다.
<281>
<282> <2-5> PCR을 통한 재조합 유전자 준비
<283> 재조합에 사용된 유전자는 총 27종으로서 Amino-acyl tRNA 합성에 관여하는 유전자를 대상으로 하였다. 구체적으로 AIMP genebank NM.004757.3) , A I MP2 ( NM_006303.3 )ᅳ A I MP3 ( NM_004280 ), DRS( NM_001349.2), FRS a ( NM_004461.2), FRSP(NM_005687.3), HRS(NM_002109.3) , NRS(NM_004539.3) , SRS(NM_006513.3) , WRS(NM_004184.3), YRS( M_003680.3) , C S(NM_139273.3) , GRS(NM_002047.2) , LRS (剛 _020117.9)는 유전자의 크기가 너무 커 클로닝에 어려움이 있어 LRS-A( 1-520 aa) 및 LRS-B(521-1176 aa)의 두 부분으로 나누어 실험함， MRS(NM_00499(L3)ᅳ QRS(NM_005051.1), RRS(NM_002887.3) , TRS(NM_152295.4) , PRS(NM_004446.2에서 753-1512 aa), IRS(NM_013417.2) , ARS(NM_001605.2) , ERS(NM_004446.2에서 1-953 aa), KRS(NM_001130089.1), VRS(NM_006295.2)는 유전자의 크기가 너무 커 클로닝에 어려움이 있어 VRS-A( 1-938 aa) 및 VRS-B( 939- 1265 aa)의 두 부분으로 나누어 실험 함 DX2(AIMP2-DX2, 서열번호 22)의 유전자가 사용되었으며, 유전자의 목록은 [표 6]에 표시하였다. 상기 각각의 유전자의 cDNA를 주형으로 하여, 사용된 프라이머를 제외하고는 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하였다. 본 실험 에서 사용된 프라이머는 하기 표 5와 같다. pAD-acc vector에 삽입될 유전자는 서 열번호 7 및 9번의 프라이머를 이용하여 증폭하고, pDBD-donor vector에 삽입될 유 전자는 서열번호 7 및 8번의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
【표 5】
라이브러리 제작에 사용된 프라이머 서열
Figure imgf000034_0001
<2-6> 유전자 재조합
상기 얻은 PCR 산물 총 54종 (AD-aaRS 27종, DBD— aaRS 27종)과 pAD-acc와 pDBD— donor를 제한효소 Sfi I (NEB사의 R0123)을 사용하여 절단한다. 절단을 마친 후 Expin Gel SV(Geneall사의 102-150)를 사용하여 원하는 산물만을 정제하였다. 이후 제한효소를 처리한 aaRS 유전자와 vector의 분자 수의 비율을 3:1로 하여 섞 어 주었고 T4 DNA ligase(NEB사의 M0202)를 처리하여 재조합을 유도하였다. 재조합 반웅은 4°C에서 1시간 동안 진행하였고 반웅을 마친 후 박테리아 (ΤορΙΟΓ)에 형질 전환 하였고 LB 한천배지 내에서 각각 Ampicillin과 kanamycin 항생제에 대한 저 항성을 통하여 재조합 클론을 선별하였다. (주) 코스모진텍에 의뢰하여 Sanger sequencing 방법으로 각각의 백터에 도입된 aars 유전자와 barcode의 서열의 연관 관계를 정립 하였다 ([표 6] 참고). 간략하게 상기 sequencing에는 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Cat .No. 4337455 , life technologies) 및 ABI 3730XL Sequencing machine(capi 1 lary 96ea X 50cm)이 사용되었다.
<292>
<293> 【표 6】
<294> 제작된 라이브러리의 유전자와 이들에 부여된 Barcode
DNA Binding Domain Act ivat ion Domain
Gene Barcode Gene Barcode
AIMP1 G TTGACGAG AIMP1 GA TGATTGG
AIMP2 TACTCACAGT AIMP2 CATGCCATCT
AIMP3 GGGCGCTCTT AIMP3 TTGGGATTA
DRS CTACTGAGC DRS GTGTGTGGCC
FRS a GGCMTGTTG FRS Q AGTAGGAGAA
FRS GAACGAGTCA FRSP ATACGTCGTG
HRS TCAGCGTGGG HRS TGGGTGTGCG
NRS ATGGAAGAGC NRS CGATGAACGG
SRS GTTTAGTATG SRS GTAGTTGTGG
WRS GTTTGGCGGG WRS ACTGGATAAG
YRS TGTCAGCHC YRS GACGATGCGA
CRS GTTGGA1TTA CRS TGTTGGTGGG
GRS CTCGAGCGGG GRS GCGCATCGGA
LRS-A TAGGTGTTGT LRS-A GAGCTCTCCC
LRS-B TTTGGTTGGC LRS-B ATAGAACCCA
MRS GAGTTAGGGG MRS TGGCAGGGAT
QRS TGGCTGGGGG QRS CTATATCATT
RRS GCATTAAGGC RRS ACGTGTAGGA
TRS TAATCTCCTA TRS GTGTGCTTG
PRS GATAAGCGCG PRS GTCATAAGAA
IRS TGACGGGGAC IRS GGTGATATCG
ARS AGTTMGAAT ARS TGTAGGGGGA ERS GCAGACGGCC ERS CCTGTTGTGC
KRS TGCGGACGGG KRS CAGTAGAGTA
VRS-A GACACCTAGG VRS-A TTGGGGTTGG
VRS-B ATATGAGTCA VRS-B CAATAGTCAG
DX2 GGTAGGAGGC DX2 GGGACCGGTG
<295>
<296> <실시예 3>
<297> dua l repoter Mega— throughout Y2H system 구축 및 시스템 작동 확? 1
<298> 스크리닝 시스템 작동 시험을 하기 위하여 이미 단백질간 상호작용하는 것으 로 알려진 p53 단백질 (서열번호 19) 및 SV40 l arge T 항원 (서열번호 18)을 각각 본 발명의 백터에 도입하고 상기 각 단백질이 도입된 백터를 본 발명의 이중 리포터 효모 균주 (실시예 1의 효모 균주, 즉 리포터 유전자인 CRE유전자 및 c-myc 유전자를 모두 리포터 유전자로 가지는 효모 균주)에 도입하여 형광 발색을 관찰하였다.
<299>
<300> <3-1> 라이브러리 구성
<301> 우선 표 7에 기재된 바와 같이, Sv40과의 결합력이 제한된 p53 돌연변이를 제조하고， 이를 백터에 도입하여 시험용 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 구 축을 위하여 유전자를 백터에 도입하는 방법은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.
<302>
<303> 【표 7】
<304> 시험용 라이브러리 구성
Figure imgf000037_0001
<305>
<306> 【표 8】 DNA Binding Domain Act i vat ion Domain
Gene Barcode Gene Barcode p53(WT) TTATCAACGC SV40 LTag TGAAGGGTTC p53(D278G) AGATGAGAGG p53(V144G) GTTTTTGGGC p53(E255 ) AGTHAGGCG
Lamin A GGGGTGAAGG
<307>
<308> 상기 표의 기재에 관한 설명은 다음과 같다.
<309> P53 (W.T): 야생형 Murine p53(서열번호 19)
<3io> p53 (D278G, 34 %) ： p53 단백질의 278번째 아미노산 E aspartic acid)를
G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이， SV40 L.T와 결합력이 34%로 감소
<3ii> p53 (V144G, 4.9%) ： p53 단백질의 144번째 아미노산 V(Valine)를 G(Glycin) 으로 바꾼 돌연변이， SV40 L.T와 결합력이 4.9%로 감소
<3i2> p53 (E255K, 1.5%) ： p53 단백질의 255번째 아미노산 E(Glutamic acid)를
K(Lysine)으로 바꾼 돌연변이 , SV40 L.T와 결합력이 1.5%로 감소
<3i3> Lamin A ： SV40 LT 단백질과 전혀 상호작용하지 않는 단백질 (Negative control, 서열번호 23)
<3i4> SV40 LT ： 야생형 Murine p53와 상호작용하는 것으로 알려진 단백질 (서열번 호 18)
<315>
<316> <3-2> 효모 균주의 형질전환 및 GFP를 통한 CRE 리포터의 작동 여부 확인
<317> 실시예 1에서 제작한 효모의 형질전환은 Yeastmaker™ Yeast Transformation
System 2(Clontech 사의 Cat no.630439)을 사용하여 진행하였다. 형질전환에 사용 된 재조합 DNA는 표 7에 따라 plasmid 하나 당 100 rig 씩 섞은 후 사용하였다. (총 11종의 실험군) 상기 실시예 1에서 제조한 효모에 형질전환시킨 후 형질전환체 선별 을 위하여 SD/ -U,Hᅳ L,T 한천 배지에서 배양하였다. 3일간 배양 후 배양이 진행된 한천배지를 형광현미경으로 관찰하였다.
<318>
<319> 실험 결과, [도 6]에서 보는 바와 같이 상호작용이 일어난 세포에서 성공적 으로 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 단백질 간의 결합력이 강할수록 리포 터 유전자의 발현 수준이 증가하여 결론적으로 형광의 강도가 강해지는 것을 확인 하였다.
<320>
<32 i> <3-3>항생제 처리에 의한 CRE 리포터의 작동 여부 확인
<322> 전술한 바와 같이 형질전환된 세포에서， 단백질 간의 상호작용이 일어나는 경우 CRE recombinase에 의하여 Ampi ci l l in과 kanamycin 모두에 저항성을 갖는 plasmid가 재조합된다. 이를 확인하기 위하여, 구체적으로 상기 실시예 3-2와 같은 방법을 통하여 얻은 형질전환 효모에서， Easy Yeast Plasmid Isolat ion Ki t (Clontech, Cat . No ： 630467)를 이용하여 plasmid를 정제한 후에， 박테리아 (ΤορΙΟΓ )에 형질전환하고 이를 LB-엠피실린 배지 또는 LB—엠피실린 및 카나마이신 배지 접종한 후 생성된 콜로니를 측정하였다. 상기 배지는 1L기준 10g Tryptone , 5g Yeast extract , lOg NaCl의 조성으로 이루어지는 Lur i a-Bertani (LB) Broth, Mi Her (Company ： Di fco , Cat . No ： 244620)를 기초로 하여, 각각 엠피실린 50 ug/ml 또는 /및 카나마이신 15 ug/ml의 농도가 되도록 제조한 것이다.
<323>
<324> 【표 9】
<325> 항생제 처리 결과
Figure imgf000039_0001
<326>
<327>
<328> 그 결과 상기 표 9에서 보는 바와 같이, 단백질 간의 상호작용이 강할수록
CRE에 의한 recombinat ion 비율이 높아지기 때문에 두 종의 항생제에 저항성을 갖 는 pl asmi d가 증가하게 되고， 더 많은 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
<329>
<330> <3-4> 효모 균주의 Myc 리포터 작동 여부 확인
<331> 상기 배양한 형질전환체 효모에서 c— myc 리포터 유전자가 정상 작동하는지 여부를 확인하기 위하여 상기 배양한 형질전환체 효모에 1차로 발현된 Myc과 결합 하는 mouse a - c-myc 항체와 상기 c-myc 항체에 결합하는 2차 항체로 Alexa Fluor 568 Goat Ant i -Mouse IgG 항체 (Mol ecul ar probe)를 처리한 후 형광현미경으로 관찰 하였다.
<332> 실험결과 [도 기에서 보는 바와 같이, 효모 균주의 Myc가 단백질간 상호작용 에 의해 정상 작동하여 붉은색 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Cre recombinase 정상 발현에 의하여 GFP 형광 발현도 함께 관찰되었다.
<333>
<334> <3-5> 형광표지 효모세포의 선별 process 작동 여부 확인
<335> 효모 균주에 도입된 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터에 도입된 알려진 p53 단백질과 SV40 l arge T 항원의 상호작용에 의해 형광이 발현된 효모균주를 한천배 지 작업 없이 검출하고 분리할 수 있는지 확인하기 위하여 실시예 3-2에서 형질전 환 한 효모균주 실험군을 액상배지에서 배양 후， 세포를 분리하여 버퍼에 현탁하고 FACS 분석을 하였다.
<336> 구체적으로， 실시예 3-2에서 형질전환시킨 효모균주 실험군들에서 배양을 마 친 배양액을 원심분리하여 배지를 완전히 제거하고 효모만을 얻었다. 여기에 5 ml WB 버퍼 ( IX PBS , 5% BSA , 5mM EDTA)를 이용하여 2 번 효모를 세척하고 1 ml m buf fer에 1차 항체인 mouse α -myc 항체 (c-Myc Ant ibody (9E10) (Santa cruz사의 sc-40) )를 1 : 500으로 희석하여 세척한 효모에 넣고 잘 섞어 주었다. 얼음에 시료가 담긴 튜브를 보관하여 차가운 상태를 유지하면서 30분간 1차 항체가 결합하도록 반 응시켰다. 30분 후 5 ml WB 버퍼를 이용하여 효모를 세척한 후 1 ml buf fer에 형광 염료가 표지된 2차 항체인 goat a -mouse IgG-Cy5(Molecul ar probe사의 A10524) 항 체를 1 : 500으로 희석하여 1차 항체를 부착한 효모에 넣고 잘 섞어 주었다. 이 또한 얼음에 보관하여 차가운 상태를 유지하면서 30분간 반응시켰다. 염색을 마친 후 5 ml WB buf fer로 한번 5 ml IX PBS로 두 번 세척한 후 3 ml IX PBS로 효모 세포를 완전히 풀어 준 후 14 ml FACS tube(BD fal con사의 352017)에 옮겼다.
<337> 준비된 시료를 FACS Mof lo XDPCBackman Coul ter )를 이용하여 분석하고 단백 질 간의 상호작용에 의하여 유도된 레포터 유전자의 발현을 통하여 나타나는 형광 (GFP, Cy5)을 가지는 효모 군을 따로 분리하였다. 선별되는 세포는 최소 1.0 x 10 이상이 되도록 하였다.
<338>
<339> 그 결과 [도 8] 및 [도 9]에서 보는 바와 같이， 상호작용이 일어나는 1번ᅳ 2 번 실험군의 경우 리포트 유전자의 정상 발현에 의해 세포들이 분리되는 반면 (도
8a 및 도 8b, 도 9a 및 도 9b 참조), 형질전환된 단백질이 상호작용하지 않는 3번 내 지 5번 실험군 (각각 도 8c, 도 8d 및 도 8e 참조， 및 각각 도 9c，도 9d 및 도 9e 참조)의 경우 대조군 (6번 내지 11번， 데이터 미도시)과 동일한 분포를 나타내는 것을 확인 하였다.
<340>
<341> <3-6> 선별된 효모의 barcord reading 가능 여부 확인
<342> 단백질 상호작용이 일어난 효모에서 바코드가 재조합을 통하여 PCR이 가능한 상태로 조합되었는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-5에서 GFP를 발현하는 콜로니 의 효모 세포로부터, Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech, Cat. No ： 630467)를 이용하여 Plasmid를 정제하고, 하기 표 10의 프라이머들을 사용하여 PCR
TM
을 수행하였다. PCR machine으로 Bio-rad T100 thermal cycler (Cat. No 186-1096) 를 사용하였고， DNA 중합효소로는 High-fidelity DNA polytnerase(NEB, Cat. No M0530)를 사용하였으며， 상기 표 3과 같은 조성으로 PCR 반응액을 제조하였다. 구 체적인 PCR Condition은 다음과 같다; 95°C/30초 -[95°C/20초 -65°C/30초] x25 cycles-72 :/60초-4 :/∞.
<343> GFP를 발현하지 않았던 콜로니의 효모는 대조군으로 사용되었다. 도 18에서 보는 바와 같이， 하기 표 10의 프라이머 A 및 C의 쌍은 DBD-donor vector로부터 도 입된 바코드 서열 (즉， 베이트 단백질을 표시하는 서열)과 AD-acc vector의 바코드 서열의 조합여부를 검출하기 위해 사용되었으며, 하기 표 10의 프라이머 A 및 B의 쌍은 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위한 대조군 실험에 사용되었다. 구체적 인 실험군 및 대조군은 하기 표 11에 나타내었다.
<344>
<345> 【표 10]
<346> 프라이머 서열 서열번호 명칭 seauence
10 pr imer A GGCCeTCGAcTaaTtGAGTGACGTACGCTTGGG
11 Dr imer B seccATGCCGCGGTGGAAA
12 Dr i mer C GCCCCAAGGGGmTGCTAGmTOTAAG
<347>
<348> 【표 11】
Figure imgf000042_0001
<349>
<350> 도 19는 loxP 인근에서 재조합 된 Barcode를 PCR을 통하여 증폭한 결과를 나 타낸다. 단백질 상호작용이 일어나 GFP가 발현되는 효모 ( l ane 1)에서는 Cre recombinase에 의해 재조합 '이 일어나 115bp의 Barcode PCR 산물이 형성된 것을 확 인하였으나, GFP 를 발현하지 않았던 콜로니의 효모 ( lane 2)에서는 Barcode PCR 산 물이 검출되지 않았다. lane 3 및 lane 4는 plasmid가 있다는 것을 확인하기 위한 contr 로서 사용되었다 (48 bp) .
<351>
<352> 이를 좀 더 알아보기 위하여 상기 실시예 3-3의 방법으로 선별된 세포로부터 핵산을 추출하고 전술한 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 도 20 에서 보는 바와 같이, 단백질 상호작용이 일어나 ampi ci l l in과 kanamycin 모두에 저항성을 갖는 효모들에서는 정상적으로 Barcode PCR 산물이 검출되는 것을 확인하 였다.
<353> 이로서 본 발명의 효모균주 및 백터를 이용한 단백질간의 상호작용을 검출하 는 system이 정상 작동하는 것을 확인하였다.
<354>
<355> <실시예 4>
<356> dual repoter Mega-throughput Y2H system을 이용하. 단백질 상호작용 조사
<357>
<358> <4-1> MACS(Magnet ic-act ivated cel l sort ing)를 이용한, 단백질 상호작용 효모의 선별
<359> 전술한 표 6에서와 같이 총 27 종의 ARS 유전자 및 상기 각각의 단백질을 표 시하는 바코드 서열을 pADᅳ acc vector와 pDBD-donor vector에 재조합 후에 실험을 진행하였다. 또한 negat ive cont rol 로서 Lamin A와 SV40 T를 사용하였다. 전술한 바와 같이 각 각의 백터를 제조하고 본 발명의 효모에 형질전환하여, 하기 표 12와 같은 실험군으로 실험을 진행하였다. l .OxlO8개의 효모 세포에 80ng c-Myc 항체
(9el0 , SantaCruz , sc-40)를 처리하여 효모 세포 표면에 발현된 Ag a l-myclO에 결 합하도톡 하였고， 그 후에 BioMag Goat Ant i -Mouse IgG (Ant i -mouse IgG 항체가 코 팅된 자성비드, qi agen, Cat . No . 310007) 1 ml과 함께 섞어 최종적으로 효모와 자 성비드가 항원 -항체 결합을 통하여 결합된 상태가 되도록 하였다. 자석을 이용하여 자성비드를 바닥으로 모두 가라앉힌 후 비드에 부착하지 않은 효모를 제거 한 후, SD/-U,H,L J 한천 배지를 넣고 비드에 결합한 효모를 30°C에서 24시간 동안 배양 하였다. 선별된 세포들은 형광현미경을 통하여 분석하였다.
<360>
<361> 【표 12】
Figure imgf000043_0001
<362> 도 16에서 보는 바와 같이 , MACS를 통하여 c-myc 리포터가 발현된 세포들을 선별하였으며， 이들 세포에서 GFP 형광발현이 일어나는 것을 형광현미경 관찰을 통 해 확인하였다. 따라서 한천배지 작업 없이도， MACS 등의 작업을 통해 단백질 상호 작용이 일어나고 있는 효모들을 선별할 수 있었다.
<363>
<364> 또한, 단백질 상호작용 세기와 관련하여 MACS 방법이 얼마나 효율적으로 효 모 세포들을 선별할 수 있는지 확인하기 위하여， 하기 표 13과 같이 백터를 제조하 고 본 발명의 효모 (실시예 1의 이중 리포터 효모)에 형질전환하여， 전술한 방법과 동일하게 MACS수행하였다.
<365>
<366> 【표 13】 pHAB210 ： pDBD-donor-p53 VS PHAB215 ： pAD-acc-SV40 T
PHAB211 ： PDBD-donor-p53-E255K ( 1 .5 ) pHAB212 pDBD-donor-p53-V144G (4.9%)
pHAB213 pDBD-donor-p53-D278G (34 %)
PHAB214 pDBD-donor-Lamin A
<367>
<368> 【표 14】
Figure imgf000044_0001
<369>
<370> 그 결과 상기 표 14 및 도 24에서 보는 바와 같이, 단백질 사이의 상호작용 세기가 강할수록 MACS에 의해서 선별되는 세포의 양이 다른 것을 알 수 있다. 따라 서 MACS를 수행함으로써 단백질 상호작용이 강한 것들이 더 잘 선별되며 이는 본 발명의 Y2H system 정확도 향상에 기여하는 것으로 생각되었다.
<371>
<372> <4-2> 단백질 상호작용 효모의 선별에 있어서， 형광 이용 방법과 MACS 이용 방법의 효율 비교
<373> 실제로 단백질 상호작용이 일어난 효모 세포 (즉, pos i t ive cel l )를 선별하는 방법으로서， 형광을 이용하는 방법과 상기 MACS를 이용하는 방법 중 어느 방법이 더욱 정확한 선별을 가능하게 하는지 알아보았다. 먼저， 상기 실시예 4-1과 같이 본 발명의 효모를 형질전환하고 36시간 후에 Cy5 및 GFP의 형광을 FACS( Mo flow
XDP, Beckman coulter)를 통하여 조사하였다. 그리고 상기 실시예 4-1과 같이 본 발명의 효모를 형질전환하고 MACS를 1회 및 2회 시행하여 선별한 세포들에서 24시
TM
간 후에 Cy5 및 GFP의 형광을 FACS( Mo flow XDP, Beckman coulter)를 통해 조사하 였다.
<374>
<375> 도 17에서 보는 바와 같이 MACS를 수행하지 않은 형질전환 효모에서는 각 백터들을 효모에 도입한지 36시간째에 형광발현을 통하여 단백질 상호작용 여부를 알기 어려웠으나 (도 17의 A), MACS는 실제로 단백질 상호작용이 일어난 positive cell들을 분리 가능하였으며 특히 MACS 시행 횟수가 증가할수록 positive cell 선 별력이 증가되는 것이 확인되었다 (도 17의 B). MACS를 이용하면, 높은 정확도로 positive cell들을 선별 가능함을 확인하였다.
<376>
<377> <4-3> 상호작용하는 단백질들의 규명을 위한 바코드 리딩 (reading)
<378> 본 발명의 dual repoter Mega-throughput Y2H system에서 어떤 단백질들이 상호작용을 하고 있는지 규명하기 위하여, 이들의 바코드 서열을 분석하였다. 구체 적으로 먼저， 전술한 방법으로 표 7의 라이브러리를 구축하고 이들을 본 발명의 효 모에 도입하였다. 실시예 3-6과 동일한 방법으로 재조합된 barcode DNA 시료를 얻 은 후, 이를 (주)셀레믹스에 NGS 분석 의뢰하였다. 간략하게， 상기 NGS 분석은， Sample 준비에 MiSeq Reagent Kit v2(300 cycle) (Illumina, Cat. No MS- 102-2001) 가 사용되었고， Illumine MiSeq Desktop Sequencer를 이용하여 각 barcode read 수 가 분석되었다.
<379>
<380> 그 결과 도 21에서 보는 바와 같이, LaminA, SV40 T의 p53과의 친화도에 따 라서 바코드 리드 (barcode reads) 수가 현격히 차이가 나는 것을 확인하였다. 즉， 단백질의 친화도 (상호작용 세기)가 감소될수록 바코드 리드수가 감소되었다.
<381>
<382> <4-4> 라이브러리 -라이브러리 단백질 상호작용 분석
<383> 본 발명의 dual repoter Mega-throughput Y2H system이 라이브러리-라이브러 리 간의 각 단백질 상호작용에 대한 정보를 제공할 수 있는지 확인하기 위하여， ARS 라이브러리 (표 6 참조)를 대상으로 본 발명의 Y2H system을 작동시키고 (주) 샐레믹스에 의뢰하여 NGS로 바코드를 리딩 (reading)한 결과를 확인하였다. 실험은 AD-acc 백터는 AIMP2가 발현되도록 고정하고 DBD-doner 백터에 ARS 라이브러리를 적용하는 방법 (도 22의 A) , DBD-doner 백터는 AIMP2가 발현되도록 고정하고 D-acc 백터에 ARS 라이브러리를 적용하는 방법 (도 22의 B)의 두 가지로 확인하였다.
<384>
<385> 그 결과 도 22 및 도 23에서 보는 바와 같이, 라이브러리를 이용한 대량의 단백질 동시 분석 실험에서 바코드 read 정도를 비교함에 따라 단백질간 상호작용 세기의 분석이 가능하였다.
<386>
【산업상 이용가능성】
<387> 이상 살펴본 바와 같이 , 본 발명은 새로운 이증 -하이브리드 시스템 ( tWO
hybr id system)을 위한 이중 리포터 시스템을 가지는 효모 균주에 관한 것으로， 좀 더 상세하게는 c-myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포 함하는 효모 균주 및 상기효모 균주를 이용하여 라이브러리 -라이브러리 간 단백질 상호작용을 검출하는 방법에 관한 것이다.
<388> 본 발명의 이중리포터 효모 균주는 단백질 상호작용 검출에 적용 시, 라이브 러리 수준에서의 단백질 결합 쌍들에 대한 대량의 정보를 효율적으로 처리할 수 있 도록 하는 수단을 제공하므로, 산업상 이용가능성이 높다.
<389>
<390> [수탁정보]
<391> 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원
<392> 수탁번호 ： KCTC12790BP
<393> 수탁일자 ： 20150408
<394>
<395> 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원
<396> 수탁번호 ： KCTC12791BP
<397> 수탁일자 ： 20150408
<398>
<399> 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원
<400> 수탁번호 ： KCTC12792BP
<401 > 수탁일자 ： 20150408
<402> 국 제 양 식
특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규칙 7.1에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증
수신: 황 병 준
대한민국 200-701 강원도춘천시 강원대학길 1, 강원대학교
L 미생불의 표시
기탁자가 첨부한 미생울 식별에 대한 시:
국제 기탁기관이 부여한 수탁번호:
Escherichia coli Donor
KCTC 12790BP
Π.과학적 성질의 설명 및 /또는 분류학상의 위지
항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음 사항이 포함되어 있다:
[X] 과학적 성질의 설명
[ ] 제안된 분류학상의 위지
(적용시 X 표시)
m 기탁 및 수탁 본국제기탁기관은 2015년 04월 08일에 기탁된 항목 I에 표시된 미생울을 수탁하였다.
IV. 이관청구의 수령 본 국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을 수탁하였으며 , 에 원기탁의 부다페스트 조약하의 기탁으로의 이관청구를 수령하였다.
V.국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을
명징: Korean Collection for Type Cultures
또는 권한을 부여받은 공무원 서명:
주소: 대한민국 305-806 대전 유성구
과학로 125 한국생명공학연구원 (KRIBB) 박 두 상 이사
서명일: 2015. 04. 23.
BP/4 형식 (KCTC Form 17) 단ᅳ일 페이지 (원문과 상위 없음을 확인함) 대리인 : 변리사 이 희 숙 김 석 만 국 제 양 식
특허출원을 위한 부다패스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규직 7.1에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증 수신:황 병 준
대한민국 200-701 강원도춘천시 강원대학길 1, 강원대학교
L 미생울의 표시
기탁자가 첨부한 미생울 식별에 대한 표시:
국제 기탁기관이 부여한 수탁번호:
Escherichia coli Acc
KCTC 12791BP
Π.과학적 성질의 설명 및 /또는 분류학상의 위지
항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음 사항이 포함되어 있다:
[X] 과학적 성질의 설명
[ ] 제안된 분류학상의 위지
(적용시 X 표시)
DL 기탁 및 수탁 본 국제기탁기관은 2015년 04월 08일에 기탁된 항목 10)| 표시된 미생울을 수탁하였다.
IV. 이관청구의 수령 본 국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을 수탁하였으며, 에 원기탁의 부다페스트 조약하의 기탁으로의 이관청구를 수령하였다.
V.국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을
¾ ¾: Korean Collection for Type Cultures
또는 권한을 부여받은 공무원 서명:
주소: 대한민국 305-806 대전 유성구
과학로 125 한국생명공학연구원 (KRIBB) 박 두 상 이사
서명일: 2015. 04. 23.
BP/4형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지 원문과 상위 없음을 확인함) 대리인 ： 변리사 이 희 숙 김 석 만 국 제 양 식
특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생을 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규직 7.1에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증
수신: 황 병 준
대한민국 200-701 강원도춘천시 강원대학길 1, 강원대학교
L 미생물의 표시
기탁자가 점부한 미생물 식별에 대한 표시:
국제 기탁기관이 부여한 수탁번호:
Saccharomyces cerevisiae SK10-CRE
KCTC 12792BP
Π.과학적 성질의 설명 및 /또는 분류학상의 위지
항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음 사항이 포함되어 있다:
[X] 과학적 성질의 설명
[ ] 제안된 분류학상의 위지
(적용시 X 표시)
m 기탁 및 수탁 본국제기탁기관은 2015년 04월 08일에 기탁된 항목 I에 표시된 미생물을 수탁하였다.
IV. 이관청구의 수령 본 국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생울을 수탁하였으며, 에 원기탁의 부다페스트 조약하의 기탁으로의 이관청구를 수령하였다.
V.국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을
명¾: Korean Collection for Type Cultures
또는 권한을 부여받은 공무원 서명:
주소: 대한민국 305-806 대전 유성구
과학로 125 한국생명공학연구원 (KRIBB) 박 두 상 이사
서명일: 2015. 04. 23.
BP/4 형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지 (원문과 상위 없음을 확인함) 대리인 ： 변리사 이 희 숙 김 석 만

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
하기 (i) 및 (Π)의 발현 카세트를 동시에 포함하는 이중 (dual) 리포터 효모 균주;
(i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GAL1 프로모터， MF α 1 유전자, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Agal 유전자를 포함하는 c-myc 리포터 발현 카세트; 및
(ii) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UAS( upstream activation sequence), GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자를 포 함하는 Cre 리포터 발현 카세트.
【청구항 2]
제 1항에 있어세 상기 (i) c-myc 리포터 발현 카세트의 c-myc 에피토프는 1 내지 20개 반복 되는 것을 특징으로 하는， 효모 균주.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 (i) c-myc 리포터 발현 카세트의 c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Agal 유전자는 링커로 연결되는 것을 특징으로 하는， 효모 균주.
【청구항 4]
게 1항에 있어서， 상기 효모 균주는 KCTC12792BP로 기탁된 균주인 것을 특징 으로 하는 효모 균주.
【청구항 5】
(a) 제 1항의 이중 리포터 효모 균주에 베이트 (bait) 라이브러리 및 프레이 (prey) 라이브러리를 형질전환하는 단계 ; 및
(b) 상기 형질전환된 효모 균주로부터 이중 리포터 발현 여부를 조사하여 베 이트-프레이 단백질 결합 쌍 i:을 검출하는 단계를 포함하는
단백질 상호작용 검출 방법 .
【청구항 6] 제 5항에 있어서， 상기 베이트 라이브러리는 DNA 결합 도메인과 베이트 단백 질을 코딩하는 유전자를 포함하는 백터이고, 상기 프레이 라이브러리는 전사활성 도메인 및 프레이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 백터인 것을 특징으로 하 는 단백질 상호작용 검출 방법.
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