KR101067328B1

KR101067328B1 - 분열효모용 발현벡터, 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101067328B1
Application number: KR1020080124502A
Authority: KR
Inventors: 정경숙; 원미선; 안지원; 최정해; 염영일; 이희구; 송은영; 송경빈; 강창모
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2008-12-09
Publication date: 2011-09-23
Also published as: KR20100065909A

Abstract

본 발명은 마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터; 마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자 및 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제공하며, 분열효모용 발현벡터 및 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터는 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능하도록 하며, 발현된 목적유전자의 분석이 용이하도록 하는 작용효과를 갖고, 본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터는 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능하며, 단시간에 대량의 유전자를 벡터내로 클로닝이 가능하도록 하는 분열효모용 발현벡터를 용이하게 다량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능한 분열효모용 발현벡터 및 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 용이하게 제조할 수 있다.

분열효모용 발현벡터, 분열효모용 게이트웨이 발현벡터

Description

분열효모용 발현벡터, 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 및 그 제조방법{Expression vector for fission yeast, gateway vector for fission yeast , and preparation method thereof}

본 발명은 마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터, 분열효모용 게이트웨이 발현벡터, 및 그 제조방법에 관한 것이다.

효모류는 진핵 세포 중 가장 간단한 모델 세포로써 저렴한 비용으로 배양이 가능하며 유전학적인 연구 및 조작이 용이하고 생화학적, 생리적 기능 분석 시스템의 확립이 잘 이루어져 있어 인간의 질병을 유발하는 유전자의 기능 연구 및 약물 개발을 위한 모델 세포로 이용되고 있다.

특히, 분열효모는 세포 주기 및 신호 전달과 관련된 유전자가 결손되거나 세포 내에 대량 발현되면 신호전달 체계 조절에 이상이 초래됨에 따라 세포주기 조절 이상 또는 대사 이상에 의한 세포의 생장속도 저해 및 형태학적 변화가 초래된다. 따라서 이러한 표현형의 변화를 탐색하여 해당 유전자의 기능을 유추할 수 있다.

마커유전자는 분열효모에서 돌연변이 균주를 만들거나 특정 유전자를 균주 내에 삽입하여 발현시켜 그 기능을 분석하거나 하는 다양한 연구에 중요한 도구로 이용되고 있다. 가장 이상적인 마커 유전자는 세포내 어떤 기능에도 영향을 주지 않고, 세포주와의 서열상의 유사성이 적어 무작위적인 염색체로의 삽입이나 재조합 등이 최소한으로 이루어지면서 효과적인 선별이 가능하여야 한다. 현재까지 분열효모에서는 선별마커로서 ura4, his3, arg6, LEU2 등의 영양마커 유전자를 발현벡터로 많이 이용하고 있으나, 영양 마커 유전자를 가진 벡터들은 그 사용 균주가 반드시 영양마커에 돌연변이가 있는 균주이어야 한다는 제약이 있을 뿐 아니라, 영양마커에 돌연변이가 있는 균주들은 정상균주와 비교하여 세포성장에 약간의 저해가 있으며, 기타 신호전달 과정에서 영향을 주기도 하므로 이상적이라고 볼 수는 없다.

영양마커 유전자 이외에 약물저항마커 유전자를 마커유전자로 사용하고 있으나, 발아효모에서 항생제 저항 마커유전자를 가진 벡터를 사용하고 있을 뿐, 분열효모에서는 제네티신 저항 유전자인 KanMX를 가진 발현벡터가 일반적이다.

그러나 분열효모는 제네티신에 대한 항생제 활성이 낮아, 제네티신 저항 유전자를 마커유전자로 사용할 경우 제네티신에 대한 민감도가 크지 않다는 문제점이 있다.

또한, 통상 영양 요구성 변이주를 선별하기 위해 최소배지에서 영양마커 유전자를 이용하나, 제네티신은 최소배지에서 그 활성을 잃어버리므로, 영양마커 유전자와 동시에 제네티신 저항 유전자를 마커유전자로 사용할 수 없다는 단점이 있다. 즉, 영양마커와 항생제 저항마커를 동시에 갖는 벡터를 사용하고자 할 경우 제네티신 저항 유전자를 항생제 마커유전자로 사용하기 어려워 분열효모를 모델시스템으로 하여 다수의 유전자를 동시에 발현시키거나 이미 다른 종류의 마커를 이용 하여 만들어진 돌연변이주를 이용하는 다양한 유전자의 기능연구 및 단백질 상호작용 연구에 마커 제한 없이 사용하기 어려웠다.

따라서, 분열효모에 대하여 활성이 충분하고, 최소배지에서 활성을 잃지 않는 항생제에 대한 저항 유전자를 마커유전자로 개발할 필요가 있으며, 그 마커 유전자를 포함하는 다양한 분열효모용 벡터의 개발이 필요하다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능하며 발현된 목적유전자의 분석이 용이하도록 하는 분열효모용 발현벡터, 및 상기 발현벡터에 의해 형질 전환된 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능한 분열효모용 발현벡터를 단시간에 클로닝이 가능하도록 하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터, 상기 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 목적유전자가 도입된 분열효모용 발현벡터, 및 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능한 분열효모용 발현벡터 및 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, "마커유전자"는 분열효모에서 돌연변이 균주를 만들거나 특정유전자를 균주 내에 삽입하여 발현시켜 그 기능을 분석하는 다양한 도구로 사용할 수 있는 유전자를 의미하며, 영양마커 유전자, 항생제마커 유전자 등이 있다.

본 발명에 있어서, "노르세오트리신 저항 유전자"는 항생제마커유전자로 항 생제의 일종인 노르세오트리신에 저항하는 유전자를 의미하며, 노르세오트리신 아세틸트랜스퍼라아제(nourseothricin acetyltransferase; Strptomyces noursei; NAT) 유전자 등이 있다.

본 발명에 있어서, "표지단백질 유전자"는 발현된 목적 유전자의 분석이 용이하도록 고안된 유전자로 목적 유전자와 융합하여 표지단백질 유전자의 목적 유전자의 발현 위치 등을 파악할 수 있도록 한다.

본 발명에 있어서, "분열효모용 발현벡터"는 분열효모에서 발현이 가능한 벡터를 의미하며, 분열효모에서 작동가능한 분열효모발현용 프로모터와 복제기점(replication origin)을 필수적으로 포함한다. 상기 프로모터는 pnmt 로서 배지내의 티아민(thiamine)의 농도에 의해 조절되며, pnmt 프로모터는 세 개의 버전(발현의 정도에 따라 강, 중, 약의 프로모터)이 있다.

본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터에 있어서, 노르세오트리신 저항 유전자의 염기서열은 서열번호 10일 수 있고, 표지단백질 유전자는 녹색형광단백질 유전자, 적색형광단백질 유전자, 및/또는 헤마글루티닌 에피토프 유전자 등일 수 있고, 바람직하게는 녹색형광단백질 유전자, 또는 적색형광단백질 유전자이다.

본 발명에 있어서, "녹색형광단백질 유전자"는 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)을 코딩하는 유전자로, 상기 유전자가 세포내에서 발현될 경우 녹색형광을 나타내게 되어 세포내에서 단백질의 위치를 파악할 수 있다. 상기 녹색형광단백질은 GFP, EGFP 등이 있으며, EGFP는 GFP를 개량한 Enhanced GFP이다.

본 발명에 있어서, "적색형광단백질 유전자"는 적색형광단백질(red fluorescent protein; RFP)을 코딩하는 유전자로, 상기 유전자가 세포내에서 발현될 경우 적색형광을 나타내게 되어 세포내에서 단백질의 위치를 파악할 수 있다.

본 발명에 있어서, "헤마글루티닌 에피토프 유전자"는 헤마글루티닌 에피토프(hemagglutinin epitope; HA)를 코딩하는 유전자로, 항원-항체반응을 활용하여 상기 유전자가 세포내에서 발현하였는지 여부를 확인할 수 있다.

상기 녹색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 3, 상기 적색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 6이고, 상기 헤마글루티닌 에피토프 유전자의 염기서열은 서열번호 7일 수 있다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터의 개열지도는 도 2의 (3), 도 3의 (6), 또는 도 4의 (4)에 도시된 것일 수 있다.

도 2의 (3)에 도시된 개열지도는 헤마글루티닌 에피토프 유전자와 노르세오트리신 저항성 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 일 예를 나타내는 것이다.

도 3의 (6)에 도시된 개열지도는 녹색형광단백질 유전자와 노르세오트리신 저항성 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 일 예를 나타내는 것이다.

도 4의 (4)에 도시된 개열지도는 적색형광단백질 유전자와 노르세오트리신 저항성 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 일 예를 나타내는 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 분열효모용 발현벡터에 의해 형질전환된 균주를 제공하며, 상기 균주는 박테리아, 또는 분열효모 등이다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터는 후술하는 실험예에서와 같이 최소배지에서도 항생제 활성을 잃지 않는 노르세오트리신에 대하여 저항하는 노르세오트리신저항유전자를 마커유전자로 포함하므로 최소배지에서도 선별이 가능하며, 표지단백질 유전자에 의해 목적유전자의 분석이 용이하게 된다. 상기 표지단백질 유전자가 녹색형광단백질 유전자, 적색형광단백질 유전자 등 형광을 나타내는 단백질의 유전자인 경우 단순히 세포내에서 발현시키는 것만으로도 단백질의 위치와 상호작용을 알 수 있다.

상기 최소배지는 통상 영양요구성 돌연변이주를 선택하기 위한 배지로, 야생형 균이 자라는데 필요한 최소한의 성분만을 함유한 배지를 의미하며, 일반적으로 단일 탄소원과 무기물만으로 이루어진다. 이러한 최소배지는 영양요구성 돌연변이체를 선별하는 목적으로 사용하므로, 최소배지에서 활성을 유지하는 항생제에 대한 마커유전자여야만, 최소배지에서 배양하는 영양마커 유전자와 동시에 사용할 수 있으므로, 돌연변이주를 이용하는 다양한 유전자의 기능연구 및 단백질 상호작용 연구에 마커 제한없이 사용할 수 있다.

종래의 최소배지에서 제네티신을 사용하는 경우 제네티신은 항생제 활성을 잃게 되나, 노르세오트리신은 항생제 활성을 잃지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 노르세오트리신 저항유전자를 마커유전자로 포함하는 발현벡테에 영양마커유전자를 동시에 사용하는 것이 가능하게 되어, 상기 발현벡터로 형질전환된 분열효모에 영 양마커유전자와 노르세오트리신 저항유전자를 동시에 포함하도록 하여 최소배지에서 영양요구성이면서 노르세오트리신에 저항하는 분열효모를 선택하는 것이 가능하게 된다.

따라서, 본 발명의 분열효모용 발현벡터는 최소배지에서 항생제 저항성을 이용하여 선별가능하도록 형질전환된 분열효모의 제조용일 수 있다.

또한, 본 발명의 분열효모용 발현벡터에 의해 형질전환된 균주는 최소배지에서 항생제 저항성에 의한 선별용 균주일 수 있다.

또한, 본 발명은 마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자 및 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, "분열효모용 게이트웨이 발현벡터"는 분열효모에 적용할 수 있는 게이트웨이 발현시스템 중 "목적 벡터(destination vector)"를 의미한다.

상기 게이트웨이 발현시스템은 엔트리벡터와 목적벡터로 구성되며, 상기 엔트리벡터는 목적유전자의 양말단에 attL1, attL2을 갖는 벡터이며, 목적벡터는 attR1, attR2를 포함하는 벡터이다. 상기 엔트리벡터와 상기 목적벡터는 재조합효소에 의해 LR반응을 일으키며, 목적벡터의 attR1과 attR2를 엔트리벡터의 attL1과 attL2로 치환하게 된다. 이 과정에서 엔트리벡터에 포함되어 있던 목적유전자가 목적벡터로 전달되게 된다.

본 발명에 있어서, "게이트웨이발현벡터 제조용 카세트"는 게이트웨이발현벡터를 제조할 수 있는 카세트를 의미하며, 제조하거나 시판되는 것을 이용할 수 있다.

상기 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트 중 시판되는 "attR1-Cm^R-ccdB-attR2" 카세트는 재조합(recombination) 되는 25 bp 의 서열(attR1, attR2), 클로람페니콜 저항 유전자(Cm^R), 독소유전자(ccdB; clever gene, F plasmid의 유전자로서 독소로서 작용하는 유전자이다. 따라서 ccdB에 의해 죽지 않는 특수한 박테리아를 사용하여서 증폭하고 필요없을시 일반 박테리아로 ccdB를 가지는 박테이라를 죽일수 있게 만든다)로 이루어진다.

본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 있어서, 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 염기서열은 서열번호 10이며, 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트의 염기서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 또는/및 서열번호 13 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터는 표지단백질 유전자를 추가로 포함할 수 있고, 상기 표지단백질 유전자는 녹색형광단백질 유전자, 적색형광단백질 유전자, 또는/및 헤마글루티닌 에피토프 유전자 등이며, 바람직하게는 녹색형광단백질 유전자, 또는 적색형광단백질 유전자이다.

상기 녹색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 3, 상기 적색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 6, 상기 헤마글루티닌 에피토프 유전자의 염기서열은 서열번호 7일 수 있다.

본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 개열지도는 도 6의 (2)에 도시된 것, 도 9의 (2)에 도시된 것, 도 7의 (1)에 도시된 것, 도 7의 (2)에 도시된 것, 또는 도 7의 (3)에 도시된 것일 수 있다.

도 7은 세가지 종류의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 개열지도를 나타낸 도이다.

상기 도 6의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터는 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하고, 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트가 삽입된 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 예이다.

상기 도 9의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터는 표지단백질유전자는 포함하지 않고 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하며, 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트가 삽입된 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 일 예이다.

상기 도 7의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터는 노르세오트리신 저항 유전자와 녹색형광단백질 유전자를 포함하고, 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트가 삽입된 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 일 예이다.

상기 도 7의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터는 노르세오트리신 저항 유전자와 적색형광단백질 유전자를 포함하고, 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트가 삽입된 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 일 예이다.

상기 도 7의 (3)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터는 노르세오트리신 저항 유전자와 헤마글루티닌 에피토프 유전자를 포함하고, 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트가 삽입된 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 일 예이다.

본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터는 최소배지에서도 항생제 활성을 잃지 않는 노르세오트리신에 대하여 저항하는 노르세오트리신저항유전자를 마커유 전자로 포함하므로 최소배지에서도 선별이 가능한 분열효모용 발현벡터를 제조할 수 있으며, 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트에 의해 목적유전자를 엔트리벡터로 부터 손쉽게 클로닝할 수 있어 다양한 형태의 클로닝이 가능하고 다량의 유전자를 클로닝할 때도 유리하다. 또한, 표지단백질 유전자를 추가로 포함함으로써, 목적유전자의 분석이 용이한 분열효모용 발현벡터를 제조할 수 있게 된다. 상기 표지단백질 유전자가 녹색형광단백질 유전자, 적색형광단백질 유전자 등 형광을 나타내는 단백질의 유전자인 경우 단순히 세포내에서 발현시키는 것 만으로도 단백질의 위치와 상호작용을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터는 최소배지에서 항생제 저항성을 이용하여 선별가능하도록 형질전환된 분열효모를 제조하기 위한 벡터의 제조용일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 엔트리벡터 중 목적 유전자가 재조합효소작용에 의해 도입된 분열효모용 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, "엔트리벡터"는 목적유전자와 목적유전자의 양말단 방향으로 attL을 포함하고 있어, 재조합효소작용에 의해 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 attR과 LR반응을 일으킬 수 있는 벡터를 의미한다.

LR반응에 의해 엔트리벡터 중 목적 유전자가 분열효모용 게이트웨이 발현벡터로 도입되며, 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 중 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트는 제거되어 목적유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터가 만들어질 수 있다.

일 예로, 도 10 내지 도 11에 도시한 바와 같이, 목적유전자를 포함하고 attL1, attL2를 포함하는 엔트리벡터와 attR1, attR2를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터는 재조합효소의 작용에 의해 LR반응(LR reaction)을 일으키며, 그 결과 목적 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터가 만들어진다.

상기 재조합효소는 DNA 이중나선에 특별히 상보성이 있는 작은 DNA 조각을 대체시켜 재조합하는 과정을 이루게 하는 효소로서 일반적으로 Recombinase (Excisionase, Integrase 라고도 한다)라고 하며, Invitrogen 사의 LR clonase일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 분열효모용 발현벡터에 의해 형질전환된 균주를 제공하며, 상기 균주는 박테리아 또는 분열효모일 수 있다.

또한, 본 발명은 (a1) 분열효모발현용 프로모터와 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하며, 상기 프로모터 3'말단에 상기 노르세오트리신 저항 유전자가 위치하고, 상기 프로모터의 5'말단과 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 3'말단에 동일한 제한효소절단부위를 갖는 벡터를 준비하는 단계; (b1) 분열효모발현용 프로모터, 영양마커 유전자, 및 표지단백질유전자를 포함하며, 상기 프로모터 3'말단에 상기 영양마커 유전자가 위치하고, 상기 프로모터의 5'말단과 상기 영양마커 유전자의 3'말단에 상기 (a1)단계와 동일한 제한효소절단부위를 갖는 벡터를 준비하는 단계; 및 (c1) 상기 (a1)단계와 상기 (b1)단계의 벡터를 상기 동일한 제한효소절단부위를 절단하는 제한효소로 절단하고, 각각의 절단물을 융합하는 단계를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, "영양마커"는 배지내의 무기질을 이용하여 균주가 필요로 하는 필수 아미노산을 만들어낼 수 있는 유전자를 의미하며, ura4, LEU2, ade6, his3, arg6 등이다.

본 발명에 있어서, "제한효소"는 DNA 이중나선의 특정 순열을 인식하여 자를수 있는 효소를 의미하며 EcoRI, HindIII, PstI, SalI, SmaI 등이다.

본 발명에 있어서, "제한효소절단부위"는 상기 제한효소에 의해 절단되는 부위를 의미한다.

상기 분열효모발현용 프로모터는 분열효모에서 발현을 촉진하는 프로모터인 한 제한되지 않으며, 상기 영양마커 유전자, 및 상기 표지단백질 유전자 또한 분열효모에서 발현하는 한 제한되지 않는다.

일 예로, 도 2에 도시한 바와 같이 노르세오트리신 저항 유전자, 및 표지단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터를 제조할 수 있다.

즉, 분열효모발현용 프로모터(pnmt)와 노르세오트리신 저항 유전자(NAT)를 포함하며, 상기 프로모터 3'말단에 상기 노르세오트리신 저항 유전자가 위치하고, 상기 프로모터의 5'말단과 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 3'말단에 동일한 제한효소절단부위(HindIII)를 갖는 벡터{도 2의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}를 준비하고(a1단계), 분열효모발현용 프로모터(pnmt), 영양마커 유전자(ura4), 및 표지단백질유전자(HA)를 포함하며, 상기 프로모터 3'말단에 상기 영양마커 유전자가 위치하고, 상기 프로모터의 5'말단과 상기 영양마커 유전자의 3'말단에 상기 벡터와 동일한 제한효소절단부위(HindIII)를 갖는 벡터{도 2의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}를 준비한 후(a2단계), 각각의 준비된 벡터를 상기 동일한 제한효 소절단부위를 절단하는 제한효소(HindIII)로 절단하고, 각각의 절단물을 리가아제로 융합하여 마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자를 갖고 표지단백질 유전자(HA)를 포함하는 분열효모용 발현벡터{도 2의 (3)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}를 제조할 수 있다.

상기 (a1)단계의 벡터는 양말단에 동일한 제한효소절단부위를 갖는 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 벡터로부터 노르세오트리신 저항 유전자를 제한효소로 절단하고, 상기 제한효소절단부위와 동일한 부위를 3'말단에 갖는 분열효모발현용 프로모터를 포함하는 벡터에 상기 절단된 노르세오트리신 저항 유전자를 삽입하여 제조된 것일 수 있다.

일 예로, 도 1에 도시한 바와 같이 상기 (a1)단계에서 준비된 분열효모발현용 프로모터와 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하며, 상기 프로모터 3'말단에 상기 노르세오트리신 저항 유전자가 위치하고, 상기 프로모터의 5'말단과 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 3'말단에 동일한 제한효소절단부위를 갖는 벡터{도 1의 (5)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}는 다음 과정으로 제조된 것일 수 있다.

즉, 양말단에 동일한 제한효소절단부위(PstI)를 갖는 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 벡터{도 1의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}로부터 노르세오트리신 저항 유전자를 제한효소(PstI)로 절단하고, 상기 제한효소절단부위와 동일한 부위(PstI)를 3'말단에 갖는 분열효모발현용 프로모터를 포함하는 벡터{도 1의 (4)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}에 상기 절단된 노르세오트리신 저항 유전자를 삽입하여 제조할 수 있다.

상기 도 1의 (4)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터의 제조는 이하의 방법에 의할 수 있다.

즉, 도 1의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터로부터 노르세오트리신 저항 유전자(NAT)의 5' promoter, 3'terminator, 및 NAT 개방해독판독틀(open reading frame; ORF)을 포함하는 절편을 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후, 제한효소(HindIII/PstI)로 소화하고 아가로즈 겔에 전기 영동하여 5' 프로모터 염기서열 일부 절편(HindIII-PstI절편)과 5' 프로모터 염기서열 일부와 3' 터미네이터(terminator) 염기서열 및 ORF을 포함하는 조각(PstI-PstI) 을 획득하고, 도 1의 (3)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터를 제한효소(HindIII/ PstI)로 소화하여 pnmt 1 프로모터 절편을 얻고, 도 1의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터를 HindIII로 소화하고 알카린포스파타아제(CIP)처리하여 3Kb절편을 획득한 후, 상기 3Kb절편, 5' 프로모터 염기서열 일부 절편(HindIII-PstI절편), 및 pnmt1 프로모터 절편을 리가아제를 이용하여 3중 결합시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터 제조방법은, 상기 (c1)단계의 결과물에 포함된 표지단백질유전자를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 결과 노르세오트리신 저항 유전자, 및 표지단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터에서 표지단백질 유전자가 제거된 상태의 분열효모용 발현벡터를 제조할 수 있다.

일 예로, 도 5에 도시된 바와 같이 도 2의 (3)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터{도 5의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}를 제한효소(XhoI/NotI)처리하고, 리가아제로 연결하여 도 5의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 분열효모용 발현벡터를 제조할 수 있다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터 제조방법은 표지단백질 유전자를 헤마글루티닌 에피토프 유전자로 하며, 상기 (c1)단계 이후에 상기 헤마글루티닌 에피토프 유전자를 절단하여 제거하고, 헤마글루티닌 에피토프 유전자가 제거된 벡터에 형광단백질 유전자 절편을 삽입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 결과 노르세오트리신 저항 유전자, 및 표지단백질 유전자로 형광단백질 유전자를 갖는 분열효모용 발현벡터를 제조할 수 있다.

일 예로, 도 3 또는 도 4에 도시한 바와 같이 헤마글루티닌 에피토프 유전자 양말단의 제한효소절단부위와 동일한 제한효소절단부위를 양 말단에 갖는 녹색형광단백질 유전자를 포함하는 벡터(도 3의 (4)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터), 또는 적색형광단백질 유전자를 포함하는 벡터(도 4의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터)를 준비한 후, 상기 벡터와 헤마글루티닌 에피토프 유전자를 포함하는 벡터(도 3의 (5) 또는 도 4의 (3)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터)를 동일한 제한효소(XhoI/BamHI)로 처리하고, 리가아제로 융합하여 도 3의 (6)에 도시된 개열지도를 갖는 분열효모용 발현벡터 또는 도 4의 (4)에 도시된 개열지도를 갖는 분열효모용 발현벡터를 제조할 수 있다.

상기 도 3의 (4)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터는 도 3의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터와 pEGFP-1 플라스미드부터 PCR에 의해 얻은 EGFP 절편을 동일한 제한효소(XhoI/BamHI)로 소화 후 리가아제로 융합하여 도 3의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터를 준비하고, 상기 벡터와 도 3의 (3)에 도시된 개열지도를 갖 는 벡터를 동일한 제한효소(XhoI/SmaI)으로 처리한 후 리가아제로 융합하여 제조할 수 있다.

상기 도 4의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터는 도 4의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터와 pDsRed-C1 플라스미드로부터 PCR에 의해 얻은 DsRed 절편을 동일한 제한효소(XhoI/SalI)로 소화 후 리가아제로 융합하여 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 분열효모용 발현벡터 제조방법에 의해 제조된 분열효모용 발현벡터에 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트를 삽입하는 단계를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 분열효모용 발현벡터에 게이트웨이벡터 제조용 카세트가 프로모터의 3'방향에 위치하고, 표지단백질 유전자의 3'방향에 위치하기에 적절한 위치에 제한효소처리를 하고, 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트를 리가아제로 삽입할 수 있다.

일 예로, 도 6에 도시한 바와 같이 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조할 수 있다. 도 6은 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터에 게이트웨이벡터제조용 카세트를 삽입하여 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다. 도 6의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터에 제한효소 처리하고, 시판되는 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트{게이트웨이 카세트 A(서열번호 11), 게이트웨이 카세트 B(서열번호 12), 게이트웨이 카세트 C.1(서열번호 13; 인비트로젠}를 리가아제로 상기 벡터에 삽입하여 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조할 수 있다.

본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법은 표지단백질유전자를 포함하고, 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트가 삽입된 벡터에서 표지단백질유전자를 제거하는 단계를 추가로 포함하여, 표지단백질유전자를 갖지 않는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터{도 6의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터}를 제조할 수 있다.

일 예로, 도 9에 도시한 바와 같이 도 9의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터의 표지단백질유전자 양말단에 존재하는 제한효소절단부위를 절단할 수 있는 제한효소로 처리한 후, 자가 결합하도록 함으로써 도 9의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 표지단백질유전자를 갖지 않는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트의 염기서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 및/또는 서열번호 13 등일 수 있다.

본 발명은 또한 (a2) 노르세오트리신 저항 유전자는 포함하지 않고, 영양마커유전자와 표지단백질유전자를 포함하며, 상기 표지단백질유전자 3'말단부에 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트 삽입용 제한효소절단부위를 갖는 분열효모용 발현벡터를 준비하는 단계; (b2) 상기 (a2)단계의 카세트 삽입용 제한효소절단부위를 제한효소로 절단하고 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트를 삽입하는 단계; 및 (c2) 상기 (b2)단계의 카세트가 삽입된 분열효모용 발현벡터에서 영양마커유전자를 노르세오트리신 저항 유전자로 교환하는 단계를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법을 제공한다.

일 예로, 도 8에 도시한 방법으로 제조할 수 있다. 도 8은 노르세오트리신 저항 유전자 및 헤마글루티닌 에피토프 유전자를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다. 도 8의 1에 도시된 개열지도를 갖는 분열효모용 발현벡터를 제한효소(Sma I)로 절단하고 시판하는 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트를 삽입하여 도 8의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터를 준비하고, 도 8의 (3)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터{도 8의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 벡터의 분열효모용 프로모터의 3'말단과 상기 프로모터의 5'방향에 위치하는 영양마커유전자의 3'말단에 위치하는 제한효소절단부위와 동일한 제한효소절단부위를 분열효모용 프로모터의 3'말단과 상기 프로모터의 5'방향에 위치하는 노르세오트리신 저항 유전자의 3'말단에 가짐}를 준비한 후, 양 벡터를 동일한 제한효소로 처리한 후 리가아제로 융합하여 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조할 수 있다.

상기 방법에 의해 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조함으로써, 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하나 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트가 삽입용 절단부위가 표지단백질 유전자 3'말단부에 존재하지 않는 벡터를 사용하여도 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법은 상기 (c2)단계의 결과물에서 표지단백질유전자를 제거하는 단계를 추가로 포함하여, 표지단백질유전자를 갖지 않는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조할 수 있다.

일 예로, 도 9에 도시한 바와 같이 도 9의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 벡 터의 표지단백질유전자 양말단에 존재하는 제한효소절단부위를 절단할 수 있는 제한효소로 처리한 후, 자가 결합하도록 함으로써 도 9의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 표지단백질유전자를 갖지 않는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조할 수 있다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터들은 공지의 형질전환방법(예를 들어, Methods in Enzymoogy Vol. 194에 개시된 방법)에 의해 분열효모에 형질전환할 수 있다.

본 발명의 노르세오트리신 저항 유전자의 서열, 표지단백질 유전자의 서열,게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트의 서열 등은 예시일 뿐 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 “실질적인 서열 동일성” 또는 “실질적인 서열 상동성”이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하는데 사용된다. 이러한 아치는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할 만한 정도가 된다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1,2,3, John Wiley & Sons, Inc.(1994)) 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 분열효모용 발현벡터는 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능하도록 하며, 발현된 목적유전자의 분석이 용이하도록 하는 작용효과를 가지며, 본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터는 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능하며, 단시간에 대량의 유전자를 벡터내로 클로닝이 가능하도록 하는 분열효모용 발현벡터를 용이하게 다량으로 제조할 수 있는 작용효과를 갖고, 본 발명의 제조방법에 의해 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능한 분열효모용 발현벡터 및 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 더 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예와 실험예에 공통적으로 적용되는 처리방법은 다음과 같다.

1. 제한효소 처리

제한효소는 Roche Co.의 제품을 사용하였고, 37℃에서 6~12시간 처리하였다.

2. 알카린 포스파타아제(Calf Intestional Alkaline Phosphatase; CIP)처리와 T4 DNA fragment I(Klenow 효소: M0120) 처리

CIP의 경우 New England Biolab(NEB)사의 CIP(M0290) 1ul를 사용하였고 37℃에서 30분간 처리하였다. 말단을 채워서 정리하기 위해 사용되는 효소인 Klenow (M0120)의 경우 5mM dNTP 2ul와 Klenow 효소 1ul 를 함께 사용하였으며, 37℃에서 30분간 처리하였다.

3. 전기영동

1% 의 agaroge gel(Biopure 사)을 사용하였고 150V로 전기영동 하였다.

4. 리가아제처리

New England Biolab(NEB, M0202)제품을 사용하였으며, 반응시키고자 하는 DNA 절편과 제조사에서 제공되는 buffer, 그리고 리가아제 1ul를 처리하고 16℃에서 8시간 이상 처리하였다.

5. 시퀀싱

솔젠트 회사에 의뢰하였다.

6. DNA 절편 정제, 컬럼, 순수 분리

Bioneer사의 Gel purification Kit(AccuPrep^TM)를 이용하였다. agarose gel에서 분리한 절편을 500ul 분리용액에 넣고 56℃에서 gel이 다 녹을 때까지 처리한 후 식혀 정제 컬럼에 부어 원심분리하여 컬럼에 DNA 절편을 결합시킨 후 순수 분리용액을 넣어 원심분리하여 DNA 절편을 회수하였다.

<실시예 1> 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자(헤마글루티닌 에피토프 유전자)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조

1-1. 노르세오트리신 저항 유전자 및 분열효모용 프로모터(pnmt1 프로모터)를 포함하는 벡터의 제조

노르세오트리신 저항 유전자 및 분열효모용 프로모터(pnmt1 프로모터)를 포함하는 벡터의 제조과정을 도 1에 나타내었다.

도 1은 노르세오트리신 저항 유전자, 및 분열효모용 프로모터를 포함하는 벡터의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

우선 pAG25(G OLDSTEIN, A. L., and J. H. M C C USKER, 1999 Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15: 1541-1553)으로 부터 노르세오트리신 저항 유전자인 노르세오트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자(nourseothricin acetyltransferase; Strptomyces noursei, 이하 NAT)의 5' promoter, 3'terminator, 및 NAT 개방해독판독틀(open reading frame; ORF)을 포함하는 절편을 PCR 방법을 이용하여 증폭하였다. 한쪽 프라이머(서열번호 8)는 HindIII site를 가지고 다른 한쪽 프라이머(서열번호 9)는 PstI site를 가지도록 디자인하였다.

첫 번째 NAT에 대한 PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 57℃에서 40초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 90초 동안 길이연장 반응(extension)을 27회 수행하고, 72℃에서 7분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다.

150ng의 첫 번째 PCR 산물, 2nM의 dATP, 1unit의 nTaq(Enzynomics사)를 함께 70℃에서 15분~30분 동안 반응하여 PCR 산물에 뉴클레오타이드 A를 붙인 후, 반응액의 2ul를 취하여 pGEM-T easy 벡터(Promega사)에 삽입한 후, PCR에 의한 염기 돌연변이의 가능성을 없애기 위하여 증폭된 PCR산물을 시퀀싱함으로써 염기순열을 확인하였다. 시퀀싱(솔젠트사 의뢰)으로 확인된 PCR산물을 제한효소 HindIII/PstI (Roche 사)으로 소화하여 아가로즈 겔에 전기 영동하여 5' 프로모터 염기서열 일부 절편(215bp 크기의 HindIII-PstI절편)과 5' 프로모터 염기서열 일부와 3' 터미네이터(terminator) 염기서열 및 ORF을 포함하는 1Kb조각 (PstI-PstI) 을 획득하였다.

별도로 분열효모용 프로모터인 pnmt1 프로모터를 가진 분열효모용 발현벡터 pREP2(PombeNet at the Forsburg lab)를 제한효소 HindIII와 PstI로 소화한 후, 아가로즈 겔에 전기영동하고, DNA 절편 정제용액과 컬럼 (Bioneer 사)을 사용하여 1Kb 크기의 pnmt1 프로모터 절편을 순수 분리하였다.

또한, pFA6A 벡터(PombeNet at the Forsburg lab)를 HindIII로 소화하고 CIP (NEB 사) 처리하여 3Kb절편을 획득하였다.

상기 3Kb절편, 5' 프로모터 염기서열 일부 절편(215bp 크기의 HindIII-PstI절편), 및 1Kb 크기의 pnmt1 프로모터 절편을 리가아제 (NEB 사)를 이용하여 3중 결합시켜 플라스미드 pFA6A-NAT(H-P)-pnmt를 제조하였다.

이렇게 제조된 플라스미드를 제한효소 PstI으로 소화하고 CIP 처리한 후, 상기 제조한 5' 프로모터 염기서열 일부와 3' 터미네이터(terminator) 염기서열 및 ORF을 포함하는 1Kb조각(PstI-PstI)을 아가로즈 젤을 이용하여 순수 분리하고 리가아제 (NEB 사)로 융합하여 pAG25으로부터 PCR 로 증폭시킨 NAT 절편을 완전히 포함하는 벡터 pFA6A-NAT-pnmt를 제조하였다(도 1).

1-2. 노르세오트리신 저항 유전자 및 헤마글루티닌 에피토피 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조

노르세오트리신 저항 유전자(NAT) 및 헤마글루티닌 에피토피 유전자(Hemaglutinin epitope; HA)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조과정을 도 2에 나타내었다.

도 2는 노르세오트리신 저항 유전자, 및 표지단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

상기 1-1에서 제조된 벡터 pFA6A-NAT-pnmt를 제한효소 HindIII로 소화하고, 전기영동하여 NAT-pnmt절편을 아가로스 겔로부터 분리하고 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다.

또한, ura4 영양마커유전자를 가지며 3xHA (3 copy 의 Hemaglutinin epitope; HA; 서열번호 7)를 표지(tagging)할 수 있는 분열효모용 발현벡터인 pSLF173(프로모터 강도 강함), pSLF273(프로모터 강도 중간) 및 pSLF373(프로모터 강도 약함)(ATCC, The global bioresource center)를 제한효소 HindIII로 소화하고, CIP 처리한 후, 전기영동하여 ura4를 제거한 나머지 벡터 염기서열을 아가로즈 겔로부터 분리하고 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다.

상기 순수 분리한 NAT-pnmt 절편과 ura4 영양마커를 제거한 pSLF173, pSLF273 및 pSLF373 벡터 염기서열을 리가아제로 각각 융합하여, 헤마글루티닌 에피토프 유전자와 노르세오트리신 저항 유전자(NAT)를 포함하는 분열효모용 발현벡터인 pSLF174, pSLF274 및 pSLF374를 제조하였다.

<실시예 2> 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자(녹색형광단백질 유전자)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조

노르세오트리신 저항 유전자 및 녹색형광단백질 유전자(Enhanced Green Florescence Protein; EGFP)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조과정을 도 3에 도시하였다.

도 3은 노르세오트리신 저항 유전자 및 녹색형광단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조과정을 나타낸 모식도이다.

EGFP의 개방해독판독틀(서열번호 3)를 포함하는 플라스미드인 100ng의 pEGFP-1(Clontech사) 벡터와 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 각각 50 pmole씩 Maxime PCR Premix(i-pfu, 인트론사)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 EGFP에 대한 PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 57℃에서 40초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 90초 동안 길이연장 반응(extension)을 27회 수행하고, 72℃에서 7분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다.

150ng의 EGFP PCR 산물, 2nM의 dATP, 1unit의 nTaq(Enzynomics사)를 함께 70℃에서 15분~30분 동안 반응하여 EGFP PCR 산물에 이옥시를 붙인 후, 반응액의 2ul를 취하여 pGEM-T easy 벡터(Promega사)에 삽입한 후, PCR에 의한 염기 돌연변이의 가능성을 없애기 위하여 증폭된 PCR산물을 시퀀싱(솔젠트사 의뢰)함으로써 염기순열을 확인하였다. 시퀀싱으로 확인된 PCR산물에서 제한효소 XhoI과 BamHI으로 소화하여 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사)을 사용하여 EGFP절편을 순수 분리하였다.

또한, pSLF273(ATCC, The global bioresource center)을 동일 제한효소(XhoI과 BamHI)로 절단한 후 CIP처리하고, 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다.

순수 분리된 EGFP절편과 순수 분리된 pSLF273을 T4 리가아제와 함께 16℃에서 하루 동안 반응하여 증폭이 가능한 박테리아 균주 DH5α(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후, 100ug의 암피실린이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 확인한 결과, 영양마커로서 ura4를 포함하면서, 3xHA tag는 제거하고 EGFP를 tagging할 수 있는 분열효모용 발현벡터인 pSLF277를 제조하였다(도 3의 (2)).

상기 제조된 pSLF277를 제한효소 XhoI과 SmaI으로 소화하여 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼을 사용하여 EGFP를 포함하는 DNA 절편(MCS를 포함)을 순수 분리하였다. 상기 절편과 XhoI/SmaI 제한효소로 소화하고 CIP로 정리한 pREP3X(PombeNet at the Forsburg lab)를 T4 리가아제와 함께 16℃에서 하루 동안 반응하여 증폭이 가능한 박테리아 균주 DH5α(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후, 100ug의 암피실린이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로 니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여) 최종 확인한 결과, 영양마커로서 LEU2를 포함하면서, 3xHA tag는 제거하고 EGFP를 tagging할 수 있는 분열효모용 발현벡터인 pSLF275를 제조하였다(도 3의 (4)).

상기 제조된 pSLF275를 제한효소 XhoI과 BamHI으로 소화하여 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼을 사용하여 EGFP의 ORF 절편을 순수분리하였다.

실시예 1-2에서 제조한 pSLF174, pSLF274, 또는 pSLF374(항생제 저항 유전자(NAT)를 포함) 각각을 XhoI/BamHI 제한효소로 소화하고 CIP 로 정리한 후 순수분리하고, 상기 EGFP의 ORF 절편과 T4 리가아제와 함께 16℃에서 하루 동안 반응하여 증폭이 가능한 박테리아 균주 DH5α(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후, 100ug의 암피실린이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 확인한 결과, 노르세오트리신 저항 유전자 및 녹색형광단백질 유전자(Enhanced Green Florescence Protein; EGFP)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 pSLF178, pSLF278, 및 pSLF378를 제조하였다(도 3의 (6)).

<실시예 3> 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자(적색형광단백 질 유전자)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조

노르세오트리신 저항 유전자 및 적색형광단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조과정을 도 4에 도시하였다.

도 4는 노르세오트리신 저항 유전자 및 적색형광단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

RFP의 ORF(서열번호 6)를 포함하는 플라스미드인 100ng의 pDsRed-C1(Clontech사), 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머를 각각 50pmole씩 Maxime PCR Premix(i-pfu, 인트론사)을 이용하여 PCR로써 증폭하였다. 상기 RFP에 대한 PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 57℃에서 40초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 90초 동안 길이연장 반응(extension)을 27회 수행하고, 72℃에서 7분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다.

상기 PCR 산물은 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다. 순수분리된 150ng의 RFP PCR 산물, 2nM의 dATP, 1unit의 nTaq(Enzynomics사)를 함께 70℃에서 15분~30분 동안 반응하여 RFP PCR 산물에 뉴클레오타이드 A를 붙인 후, 반응액의 2ul를 취하여 pGEM-T easy 벡터(Promega사)에 삽입한 후, PCR에 의한 염기 돌연변이의 가능성을 없애기 위하여 증폭된 PCR산물을 시퀀싱함으로써 염기순열을 확인하였다. 시퀀싱으로 확인된 PCR산물에서 제한효소 XhoI과 SalI로 소화하고, 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사) 을 사용하여 RFP 절편(DsRed PCR fragment)을 순수 분리하였다.

순수분리한 RFP 절편과 XhoI과 SalI 제한효소로 절단하고 CIP 로 정리한 pREP3X를 T4 리가아제와 함께 16℃에서 하루 동안 반응시켜 증폭이 가능한 박테리아 균주 DH5α(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후, 100ug의 암피실린이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 확인한 결과, 영양마커로서 LEU2를 포함하면서, 3xHA tag는 제거하고 RFP를 tagging할 수 있는 분열효모용 발현벡터 pREP5X를 제조하였다(도 4의 (2)).

상기 제조된 pREP5X를 제한효소 XhoI과 SalI으로 소화하고, RFP 를 포함하는 DNA 절편을 아가로즈 겔로부터 정제용액과 컬럼을 사용하여 순수 분리하였다.

또한, 실시예 1-2의 pSLF174, pSLF274 및 pSLF374를 XhoI/SalI 제한효소로 소화하고 CIP처리한 후 DNA 절편을 아가로즈 겔로부터 정제용액과 컬럼을 사용하여 pSLF174, pSLF274 및 pSLF374절편을 순수 분리하였다.

상기 순수 분리한 RFP를 포함하는 DNA절편과 XhoI/SalI 제한효소로 소화한 pSLF174, pSLF274, 또는 pSLF374 절편 각각을 T4 리가아제로 융합하여 노르세오트리신 저항 유전자 및 적색형광단백질 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터인 pSLF176, pSLF276 및 pSLF376를 제조하였다(도 4의 (4)).

<실시예 4> 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하고 표지단백질 유전자를 포함하지 않는 분열효모용 발현벡터 제조

노르세오트리신 저항 유전자를 포함하고 표지단백질을 포함하지 않는 분열효모용 발현벡터 제조과정을 도 5에 도시하였다.

도 5는 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하고 표지단백질을 포함하지 않는 분열효모용 발현벡터 제조과정을 나타낸 모식도이다.

실시예 1-2에서 제조된 pSLF174, pSLF274, 또는 pSLF374 벡터 각각을 XhoI/Not1 제한효소로 소화하고 T4 DNA polymerase fragment I(Klenow)처리(효소 1ul, 5mM dNTP 2ul, 37도 30분 반응)한 후 6.5kb 와 1.2kb DNA 절편을 아가로즈 겔로부터 정제용액과 컬럼을 사용하여 순수 분리하고, 상기 두 DNA절편을 T4 리가아제와 함께 16℃에서 하루 동안 반응시켜 증폭이 가능한 박테리아 균주 DH5α(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후, 100ug의 암피실린이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 확인한 결과, 3xHA tag 가 제거된 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터인 pREP6X, pREP46X 및 pREP86X를 제조하였다(도 5의 (2)).

<실시예 5> 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자(헤마글루티닌 에피토프 유전자)를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조

노르세오트리신 저항 유전자 및 헤마글루티닌 에피토프 유전자를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 제조과정을 도 8에 도시하였다.

ura4 영양마커유전자를 가지며 3xHA (3 copy 의 Hemaglutinin epitope; HA)를 표지(tagging)할 수 있는 분열효모용 발현벡터인 pSLF173(프로모터 강도 강함), pSLF273(프로모터 강도 중간) 및 pSLF373(프로모터 강도 약함)(ATCC, The global bioresource center)를 제한효소 SmaI으로 자르고 CIP로 정리하여 만든 각각의 절편 20 ~ 50ng에, 게이트웨이벡터제조용 카세트 B(Invitrogen사, 서열번호 12) 10ng, 및 T4 DNA 리가아제 1unit를 섞어 16℃에서 하루 동안 반응시킨 후 반응액의 2~5ul를 취하여 박테리아균주 DB3.1(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 형질전환 하였다. 얼음에서 30분~1시간동안 반응시킨 후 37℃ 항온 진탕 배양기에서 1시간 동안 진탕배양한 후 게이트웨이 벡터 제조용 카세트 내에 있는 클로람페니콜에 대한 저항성을 이용하여 형질전환된 균주를 선별하기 위해 25ug의 클로람페니콜이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니에서 플라스미드를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 그 구조를 최종 확인하였다. 결과적으로 3xHA 표지(Tagging) 유전자, ura4 영양마커유전자, 및 attR1-Cm^R-ccdB-attR2 카세트를 가지는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조하였고 pDES173, pDES273 및 pDES373 벡터로 명명하였다(도 8의 (2)).

attR1-Cm^R-ccdB-attR2 카세트는 인비트로젠사에서 시판되는 게이트웨이 벡터 제조용 카세트로, attR1, attR2는 재조합(recombination) 되는 25 bp 의 서열을 의미하며, Cm^R은 클로람페니콜 저항 유전자를 의미하고, ccdB는 독소유전자(clever gene, F plasmid의 유전자로서 독소로서 작용하는 유전자이다. 따라서 ccdB에 의해 죽지 않는 특수한 박테리아를 사용하여서 증폭하고 필요없을 시 일반 박테리아로 ccdB를 가지는 박테이라를 죽일수 있게 만든다)를 의미한다.

상기 각각의 pDES173, pDES273 및 pDES373 벡터를 제한효소 HindIII로 소화하고, CIP 처리한 후, 전기영동하여 ura4를 제거한 나머지 벡터 염기서열을 아가로즈 겔로부터 분리하고 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다.

별도로 실시예 1-1에서 제조된 벡터 pFA6A-NAT-pnmt를 제한효소 HindIII로 소화하고, 전기영동하여 NAT-pnmt절편을 아가로스 겔로부터 분리하고 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다.

상기 순수 분리한 NAT-pnmt 절편과 ura4 영양마커를 제거한 pDES173, pDES273 및 pDES373 벡터 염기서열을 리가아제로 각각 융합하여, 헤마글루티닌 에피토프 유전자(3xHA)와 노르세오트리신 저항 유전자(NAT)를 포함하는 분열효모용 게이트웨이발현벡터인 pDES174, pDES274 및 pDES374를 제조하였다(도 8의 (4)).

<실시예 6> 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자(녹색형광단백 질 유전자)를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조

실시예 2에서 제조한 pSLF178, pSLF278, pSLF378 벡터 각각을 제한효소 BamHI으로 소화하고 Klenow (NEB 사)와 dNTP (Sigma 사)를 처리하여 말단을 정리하였다. 상기 제한효소 처리된 벡터 각각 20 ~ 50ng, 게이트웨이벡터 제조용 카세트 B(Invitrogen사; 서열번호 12) 10ng, 및 T4 DNA 리가아제 1unit (NEB 사), T4리가아제 반응용액 (NEB 사)을 함께 16℃에서 하루 동안 반응시킨 후 반응액의 2~5ul를 취하여 박테리아균주 DB3.1(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 항온 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후 게이트웨이 벡터 제조용 카세트 내에 있는 클로람페니콜 (Sigma 사) 에 대한 저항성을 이용하기 위해 25ug의 클로람페니콜이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 확인하여 도 7의 (1)에 도시한 바와 같이 노르세오트리신 저항 유전자(NAT), 및 녹색형광단백질 유전자(EGFP)를 포함하며 attR1-Cm^R-ccdB-attR2 카세트를 가지는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터인 pDES178, pDES278 및 pDES378를 제조하였다.

<실시예 7> 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자(적색형광단백질 유전자)를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조

실시예 3에서 제조한 pSLF176, pSLF276, pSLF376 벡터 각각을 제한효소 SalI 으로 소화한 것과 게이트웨이벡터 제조용 카세트 C(Invitrogen사; 서열번호 13)를 사용한 것을 제외하고, 실시예 6과 동일한 방법으로 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조하였다.

그 결과 도 7의 (2)에 도시한 바와 같이 노르세오트리신 저항 유전자(NAT) 및 적색형광단백질 유전자(RFP)를 포함하며 attR1-Cm^R-ccdB-attR2 카세트를 가지는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터인 pDES176, pDES276 및 pDES376을 제조하였다.

<실시예 8> 표지단백질 유전자를 포함하지 않으며, 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조

표지단백질 유전자를 포함하지 않으며, 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조과정을 도 9에 나타내었다.

도 9는 표지단백질 유전자를 포함하지 않으며, 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

실시예 5에서 제조된 pDES174, pDES274 및 pDES374 벡터를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 소화하고, Klenow 효소와 dNTP를 사용하여 말단을 정리한 후 (효소 1ul, 5mM dNTP 2ul 를 사용하여 37도에서 30분 처리) 자가 결합시켜 헤마글루티닌 에피토프 유전자(3xHA)를 제거함으로써, 표지단백질 유전자를 포함하지 않으며, 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 pDES6X, pDES46X, 및 pDES86X를 제조하였다(도 9의 (2)).

<실시예 9> 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 이용한 외래 단백질 클로닝

분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 엔트리벡터에 포함된 목적 유전자를 도입하는 과정을 도 10에 나타내었다.

도 10은 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 엔트리벡터에 포함된 목적 유전자를 도입하는 과정을 나타낸 모식도이다.

목적 유전자(Gene X)가 들어 있는 엔트리벡터(pENTR3C-Gene X)와 분열효모용 게이트웨이 발현벡터(pDES)를 재조합효소(recombinase)와 섞어 재조합효소작용(LR반응)을 일으켜 목적 유전자를 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 도입함으로써, 목적 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터를 제조한다.

구체적인 과정은 G3BP1 유전자를 목적유전자로 하여, 엔트리벡터에 포함된 G3BP1을 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 도입하는 과정을 도 11에 나타내었다.

도 11은 엔트리벡터에 포함된 G3BP1을 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 도입하는 과정을 나타낸 모식도이다.

목적 유전자는 인간 G3BP1유전자를 선택하였고, 각 표지(Tag)별로 클로닝이 정확히 완성되었는지 확인하기 위해서 분열효모용 게이트웨이 발현 벡터 중 프로모터의 세기가 강한 pDES174 (3xHA, NAT), pDES176 (RFP. NAT), pDES178 (EGFP, NAT), pDES6X(No Tag, NAT)를 사용하였다. 또한 재조합효소는 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Kit(Invitrogen사)를 이용하였다.

우선 상기 게이트웨이 발현 벡터 각각 150ng과 G3BP1이 들어있는 엔트리 클 론(pEntry-G3BP1) 50~150ng을 1.5ml 튜브에 넣고 TE 용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)으로 총 반응용액의 양이 8ul가 되도록 하였다. 2ul의 LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen 사)를 넣고 잘 섞어준 후 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1ul의 Proteinase K(Invitrogen 사) 를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 그런 다음 37℃에서 10분 동안 배양한 후 각 LR 반응물을 1ul씩 취해 박테리아 균주 DH5α (RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 항온 진탕 배양기에서 1시간 동안 진탕 배양한 후 각 게이트웨이 발현 벡터의 항생제 저항 유전자에 대한 항생제가 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 형질 전환된 클론들을 확보함으로써 LR반응을 통하여 엔트리벡터의 목적 유전자 G3BP1를 상기 제조된 게이트웨이 발현벡터에 삽입되어 있음을 확인하였다. 그 결과 노르세오트리신 저항 유전자와 목적유전자(G3BP1)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 pDES174-G3BP1 (3xHA, NAT, G3BP1), pDES176-G3BP1 (RFP, NAT, G3BP1), pDES178-G3BP1 (EGFP, NAT, G3BP1), pDES6X-G3BP1(No Tag, NAT, G3BP1)를 제조하였다(도 11의 (2)).

상기 엔트리 클론(pEntry-G3BP1)은 하기 과정으로 제조한 것을 사용하였다.

G3BP1 유전자가 들어 있는 pCMV-SPORT6-G3BP1 클론은 21C frontier Human Gene Bank 로부터 구입하였다. pEntry-G3BP1 을 제조하기 위하여 프라이머 5’-TAGGATCCatggtgatggagaagcctag-3’ 과 5’-ataCCCGGGtcactgccgtggcgc aagc-3’각각 50 pmole씩 Maxime PCR Premix(i-pfu, 인트론사)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 G3BP1에 대한 PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 55℃에서 40초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 90초 동안 길이연장 반응(extension)을 30회 수행하고, 72℃에서 7분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다. 상기 절편을 BamHI/SmaI 으로 소화하고, BamHI/SmaI 제한효소로 소화한 후 순수분리한 플라스미드 pEntry (invitrogen) 각각을 T4 리가아제와 함께 16℃에서 하루 동안 반응하여 증폭이 가능한 박테리아 균주 DH5α(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후, 50ug/ml의 카나마이신(Sigma 사)이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 확인, pEntry-G3BP1 플라스미드를 제조하였다.

<실시예 10> 분열효모용 발현벡터를 이용하여 형질전환된 분열효모의 제조

실시예 9에서 제조된 분열효모용 발현벡터 pDES174-G3BP1 (3xHA, NAT, G3BP1), pDES176-G3BP1 (RFP, NAT, G3BP1), pDES178-G3BP1 (EGFP, NAT, G3BP1), pDES6X-G3BP1(No Tag, NAT, G3BP1), 하나의 콘트롤 벡터 pDES6X 각각 1ug을 대표적 인 분열효모 균주 ED665(일배체, Fanter PA 실험실, UK)에 리튬아세티이트 형질 전환 방법(Methods in Enzymology Vol. 194)으로 형질 전환하여, 노르세오트리신 100ug/ml이 들어있는 최소배지[3G/l 포타슘 하이드로젠 프탈레이트(Potassium Hydrogen phthallate), 2.2g/L Na2HPO4, 5g/L NH4Cl, 20g/L 글루코오스, 0.26M MgCl2, 4.99mM CaCl2, 0.67M KCl, 14.1mM Na2SO4, 4.2mM 판토테틱 산(pantothetic acid), 81.2mM 니코틴산(Nicotinic acid), 55.5mM 이노시톨(Inositol), 40.8uM 비오틴(Biotin), 80.9mM 붕산(Boric acid), 23.7mM MnSO4, 13.9mM ZnSO4, 7.4mM FeCl2, 2.47mM 몰리브덴산(molybdic acid), 6.02mM KI, 1.6mM CuSO4, 47.6mM 씨트르산(Citric acid); Sigma사), 아가 20g/L]에 도말하여 30℃에서 2~3일 동안 배양한 후, 형질 전환된 콜로니를 확인하였다.

그 결과 실시예 9에서 제조된 분열효모용 발현벡터에 의해 분열효모를 형질전환할 수 있음을 확인하였고, 상기 형질전환된 분열효모는 최소배지에서도 항생제저항균주의 선택을 위해 사용가능함을 확인할 수 있었다.

<실험예 1> 형질전환된 분열효모 균주에서 목적 유전자 발현 확인

실시예 10의 분열효모용 발현벡터 pDES174-G3BP1 (3xHA, NAT, G3BP1), pDES176-G3BP1 (RFP, NAT, G3BP1), pDES178-G3BP1 (EGFP, NAT, G3BP1), 또는 pDES6X-G3BP1(No Tag, NAT, G3BP1)로 각각 형질 전환된 분열효모와 실시예 8에서 제조한 pDES6X로 실시예 10에서와 동일한 방법으로 형질전환한 분열효모를 200ug/ml의 티아민(thiamine)이 포함되어 있는 액체 최소배지에 각각 접종하여 30 ℃ 항온 진탕 배양기에서 하루 동안 배양한 후 다시 새로운 배지에 배양하여 200ug/ml의 티아민(thiamine)이 포함되어 있지 않은 액체 최소배지에 접종하였고, 1X 10⁷세포수/ml 될 때까지 티아민(thiamine)이 없는 배지에서 배양하여 단백질을 발현시켰다. 단백질이 발현된 분열효모를 1.5ml 튜브에 담아 원심분리기에 돌려 세포를 회수하고, 멸균된 물로 찌꺼기를 제거한 다음, Lysis 용액(50mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM 2-mercaptoethanol, 10% 글리세롤, 50mM NaF, 1mM Na₃VO₄, 1mM PMSF)과 유리 bead를 넣고 beadbeater 를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄된 세포가 담긴 튜브를 14,000g로 원심 분리하고 상등액(단백질)을 새 튜브로 옮겨 정량한 후 6X SDS sample buffer를 넣어 95℃에서 15분 동안 끓여 단백질 시료를 준비하였다. 상기 준비된 단백질 시료를 12% SDS-PAGE gel에 전기 영동하여 단백질을 PVDF membrane (Millipore 사)에 옮긴 다음 G3BP1 항체(Anti-G3BP1, Santa Cruz 사), HA 항체(Anti-HA, Santa Cruz 사), GFP 항체(Anti-GFP, Santa Cruz 사), RFP 항체(Anti-RFP, Santa Cruz 사)를 이용하여 웨스턴블랏(Western blot)을 실시하였다. 각각의 2차 항체 (Snata cruz 사)를 붙인 후 ECL 용액(Millipore 사)으로 발색시켜 X-ray (kodak) 필름에 감광하여 단백질 밴드를 확인하였다. 그 결과, 본 발명에서 제조한 표지(Tag)가 없거나 3xHA, EGFP, RFP 를 표지(Tag)할 수 있는 게이트웨이 발현벡터에서 발현된 단백질이 정확한 크기로, Tag 단백질이 결합된 단백질로 발현되었음을 알 수 있었다. 따라서 본 발명에서 제조한 벡터들이 제대로 활용 가능함을 확인하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12는 실시예 10에서 제조한 G3BP1 유전자를 가지는 분열효모용 발현벡터로 형질전환된 분열효모에서 발현된 단백질을 웨스턴블럿으로 확인한 결과 사진이다. 도 12의 SDS-PAGE는 단백질을 분리한 polyacrylamide gel 을 staining 용액 (0.25% Coomassie brilliant blue (R250, sigma), 10% 아세트산, 45% 메탄올)으로 염색하여 촬영한 것으로, 각 샘플간의 사용량 차이가 없음을 보여준다.

<실험예 2> 형질전환된 분열효모 균주에서 표지단백질(형광단백질) 발현 확인

목적유전자 G3BP1에 녹색형광단백질(EGFP)가 표지된 벡터와 또 다른 목적유전자 SCC112에 녹색형광단백질(EGFP)이 표지된 벡터를 이용하여 세포내 다양한 위치에서 발현하는 단백질들의 정확한 분포(localization)를 알아보았다. SCC112 단백질은 핵에 발현되며, G3BP1 단백질은 세포막과 세포질에 골고루 분포하는 성질을 이용하여 분포를 확인할 수 있는 것이다.

우선, 실시예 9의 분열효모용 발현벡터 pDES178-G3BP1(EGFP, NAT, G3BP1)로 형질 전환된 분열효모를 준비하였다.

그리고, 인간유전자인 SCC112가 들어있는 엔트리 클론(pEntry-SCC112)을 사용한 것을 제외하고, 실시예 9의 pDES178-G3BP1 벡터 제조와 동일한 방법으로 노르세오트리신 저항 유전자와 목적유전자(SCC112)를 포함하는 분열효모용 발현벡터 pDES178-SCC112 (EGFP, NAT, SCC112)를 제조하였다.

상기 pDES178-SCC112로 실시예 10의 형질전환방법과 동일한 방법으로 분열효 모 균주 ED665(일배체, Fanter PA 실험실, UK)에 리튬아세티이트 형질 전환 방법(Methods in Enzymology Vol. 194)으로 형질 전환하여 pDES178-SCC112로 형질전환된 분열효모를 준비하였다.

또한, 실시예 6에서 제조된 분열효모용 게이트웨이 발현 벡터 pDES178로 실시예 10 중 형질전환방법과 동일한 방법으로 분열효모 균주 ED665(일배체, Fanter PA 실험실, UK)에 리튬아세티이트 형질 전환 방법(Methods in Enzymology Vol. 194)으로 형질 전환하여 형질전환된 분열효모를 대조군(control)으로 준비하였다.

상기 준비된 pDES178-G3BP1(EGFP, NAT, G3BP1)로 형질 전환된 분열효모, pDES178-SCC112로 형질전환된 분열효모, 대조군 각각을 실험예 1 중 단백질 발현법과 동일한 방법으로 단백질을 발현시킨 후 형광현미경(Olympus)으로 분열효모 내의 녹색형광단백질(EGFP)의 위치를 확인하였고 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13은 녹색형광단백질로 표지된 목적유전자의 발현위치를 확인하기 위해, 형광현미경을 이용하여 촬영한 사진이다. 그 결과 G3BP1 단백질은 핵막과 세포질에서 발현되었고 SCC112 단백질은 핵 내에서 발현되었다. 따라서, 목적 유전자가 원하는 위치에 발현됨을 확인할 수 있다.

상기 엔트리 클론(pEntry-SCC112)의 제조과정은 다음과 같다.

SCC112 유전자가 들어 있는 pCMV-SPORT6-SCC112 클론은 21C frontier Human Gene Bank 로부터 구입하였다. pEntry-SCC112 을 제조하기 위하여 프라이머 5’-agGGATCCatgattcacctgctagccc-3’ 과 5’-ggCCCGGGttacctttgtaagtcaatttg-3’각각 50 pmole씩 Maxime PCR Premix(i-pfu, 인트론사)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 SCC112에 대한 PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 55℃에서 40초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 90초 동안 길이연장 반응(extension)을 30회 수행하고, 72℃에서 7분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 아가로즈 겔에 전기 영동하여 DNA 절편 정제용액과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer사)을 사용하여 순수 분리하였다. 상기 절편을 BamHI/SmaI 으로 소화하고, BamHI/SmaI 제한효소로 소화한 후 순수분리한 플라스미드 pEntry (invitrogen) 각각을 T4 리가아제와 함께 16℃에서 하루 동안 반응하여 증폭이 가능한 박테리아 균주 DH5α(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 넣고 얼음에서 30분~1시간동안 반응시키고 37℃ 진탕 배양기에서 1시간동안 진탕배양한 후, 50ug/ml의 카나마이신 (Sigma 사)이 포함되어 있는 LB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 최종 확인, pEntry-SCC112 플라스미드를 제조하였다.

<실험예 3> 복합배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 비교 시험

대표적인 분열효모 균주 ED665(일배체, Fanter PA 실험실, UK.)와 SP286(이배체, Paul Nurse 실험실, UK)을 액체 복합배지(5g/l 효모 추출물(Difco), 30g/l 글루코오스(덕산), 225mg/l 아데닌(시그마))를 이용하여 30℃ 배양기에서 하루동안 진탕배양하여 5×10⁷/ml 세포로 만들고 순차적으로 4배씩 희석하여 항생제 제네티신(Promega), 또는 노르세오트리신(Werner Bioagents, Jena-Cospeda, Germany)이 첨가된 복합배지(상기 액체복합배지+ 20g/l 아가)에 스팟팅(spotting)하고 30℃ 배양기에서 2일간 배양한 후 그 성장 정도를 비교하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14는 복합배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 시험 결과를 나타낸 사진이며, 도 14의 농도는 각 항생제의 농도를 의미하고, 대조군(control)은 항생제가 포함되지 않은 복합배지에서의 결과를 의미한다. 그 결과 제네티신에 비교하여 노르세오트리신이 첨가된 배지에서 분열효모 균주가 더 민감함을 알 수 있었다. 따라서, 마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 발현벡터로 분열효모를 형질전환할 경우, 제네티신 저항 유전자의 경우에 비해 항생제 저항 균주의 선택도가 높음을 알 수 있다.

<실험예 4> 최소배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모의 민감도 비교시험

복합배지 대신 최소배지 (3g/l 포타슘 하이드로젠 프탈레이트(Potassium Hydrogen phthallate), 2.2g/l Na₂HPO₄, 5g/l NH₄Cl, 20g/l 글루코오스, 0.26M MgCl₂, 4.99mM CaCl₂, 0.67M KCl, 14.1mM Na₂SO₄, 4.2mM 판토테틱산(pantothetic acid), 81.2mM 니코틴산(Nicotinic acid), 55.5mM 이노시톨, 40.8uM 비오 틴(Biotin), 80.9mM 붕산(Boric acid), 23.7mM MnSO₄, 13.9mM ZnSO₄, 7.4mM FeCl₂, 2.47mM 몰리브덴산(molybdic acid), 6.02mM KI, 1.6mM CuSO₄, 47.6mM 씨트르산(Citric acid); Sigma사)를 사용하고, 스폿팅(spotting)한 후 30도 배양기에서 3일간 배양한 것을 제외하고, 상기 참고예 1과 동일하게 실시하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15는 최소배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 시험 결과를 나타낸 사진이며, 도 15의 농도는 각 항생제의 농도를 의미하고, 대조군(control)은 항생제가 포함되지 않은 복합배지에서의 결과를 의미한다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 제네티신의 경우 항생제가 첨가되지 않은 배지에서와 비교하여 약간의 성장저해가 있었으나, 시간이 지나면서 세포성장이 거의 대조군(control)과 같아지는 현상을 나타내는 반면, 노르세오트리신의 경우 항생제가 첨가된 배지에서 분열효모 균주의 성장이 완벽하게 저해됨을 알 수 있어 노르세오트리신은 최소배지에서도 활성을 유지함을 알 수 있다. 따라서, 최소배지에서도 노르세오트리신 저항 유전자를 마커유전자로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

상기 결과로부터 본 발명의 분열효모용 발현벡터는 최소배지에서 항생제 저항성을 이용하여 선별가능하도록 형질전환된 분열효모를 제조할 수 있으며, 본 발명의 분열효모용 발현벡터에 의해 형질전환된 균주는 최소배지에서 항생제 저항성을 이용하여 선별이 가능함을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 의해 최소배지에서 항생 제 저항성을 이용하여 선별가능하도록 분열효모를 형질전환시키기 위한 벡터를 제조할 수 있음을 알 수 있다.

도 6은 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터에 게이트웨이벡터제조용 카세트를 삽입하여 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 8은 노르세오트리신 저항 유전자 및 헤마글루티닌 에피토프 유전자를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 12는 실시예 10에서 제조한 G3BP1 유전자를 가지는 분열효모용 발현벡터로 형질전환된 분열효모에서 발현된 단백질을 웨스턴블럿으로 확인한 결과 사진이다.

도 13은 녹색형광단백질로 표지된 목적유전자의 발현위치를 확인하기 위해, 형광현미경을 이용하여 분열효모를 촬영한 사진이다.

도 14는 복합배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 시험 결과를 나타낸 사진이다.

도 15는 최소배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 시험 결과를 나타낸 사진이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Expression vectors for fission yeast, gateway vector for fission yeast, and preparation method thereof <130> P08-085-KRI <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer for ORF of EGFP <400> 1 gctctcgaga tggtgagcaa gggcgaggag 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer for ORF of EGFP <400> 2 tcaggatccc ttgtacagct cgtccatgcc 30 <210> 3 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF of EGFP <400> 3 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 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10 <211> 1302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAT <400> 10 agattgtact gagagtgcac catacataat catcgatgaa ttcgagctcg ttttcgacac 60 tggatggcgg cgttagtatc gaatcgacag cagtatagcg accagcattc acatacgatt 120 gacgcatgat attactttct gcgcacttaa cttcgcatct gggcagatga tgtcgaggcg 180 aaaaaaaata taaatcacgc taacatttga ttaaaataga acaactacaa tataaaaaaa 240 ctatacaaat gacaagttct tgaaaacaag aatcttttta ttgtcagtac tgattagggg 300 cagggcatgc tcatgtagag cgcctgctcg ccgtccgagg cggtgccgtc gtacagggcg 360 gtgtccaggc cgcagagggt gaaccccatc cgccggtacg cgtggatcgc cggtgcgttg 420 acgttggtga cctccagcca gaggtgcccg gcgccccgct cgcgggcgaa ctccgtcgcg 480 agccccatca acgcgcgccc gaccccgtgc ccccggtgct ccggggcgac ctcgatgtcc 540 tcgacggtca gccggcggtt ccagccggag tacgagacga ccacgaagcc cgccaggtcg 600 ccgtcgtccc cgtacgcgac gaacgtccgg gagtccgggt cgccgtcctc cccggcgtcc 660 gattcgtcgt ccgattcgtc gtcggggaac accttggtca ggggcgggtc caccggcacc 720 tcccgcaggg tgaagccgtc cccggtggcg gtgacgcgga agacggtgtc ggtggtgaag 780 gacccatcca 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ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 180 tataatgtgt ggattttgag ttaggatccg tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa 240 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 300 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 360 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 420 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 480 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 540 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 600 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 660 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 720 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 780 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 840 gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 900 agatctggat ccggcttact aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt 960 tgcggtataa gaatatatac tgatatgtat acccgaagta 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gtaaaatgat ataaatatca 60 atatattaaa ttagattttg cataaaaaac agactacata atactgtaaa acacaacata 120 tccagtcata ttggcggccg cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc 180 gtataatgtg tggattttga gttaggatcc gtcgagattt tcaggagcta aggaagctaa 240 aatggagaaa aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga 300 acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga 360 tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat 420 tcacattctt gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg 480 tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga 540 aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata 600 ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga 660 gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt 720 ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg 780 cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca 840 tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta 900 aagatctgga tccggcttac taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt 960 ttgcggtata agaatatata ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtatgct 1020 atgaagcagc gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat 1080 atgatgtcaa tatctccggt ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc cgtcgtctgc 1140 gtgccgaacg ctggaaagcg gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc cggtttattg 1200 aaatgaacgg ctcttttgct gacgagaaca ggggctggtg aaatgcagtt taaggtttac 1260 acctataaaa gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg tacagagtga tattattgac 1320 acgcccgggc gacggatggt gatccccctg gccagtgcac gtctgctgtc agataaagtc 1380 tcccgtgaac tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa gctggcgcat gatgaccacc 1440 gatatggcca gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag tggctgatct cagccaccgc 1500 gaaaatgaca tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg gaatataaat gtcaggctcc 1560 cttatacaca gccagtctgc aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg ttttacagta 1620 ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta 1680 cgtttctcgt tcagctttct tgtacaaagt ggttgat 1717

Claims

마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자 및 표지단백질 유전자를 포함하며, 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 염기서열은 서열번호 10이고, 상기 표지단백질 유전자는 녹색형광단백질 유전자, 적색형광단백질 유전자, 및 헤마글루티닌 에피토프 유전자 중에서 선택된 하나 이상인 분열효모용 발현벡터.
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제1항에 있어서, 상기 표지단백질 유전자는 녹색형광단백질 유전자 또는 적색형광단백질 유전자인 분열효모용 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 녹색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 3인 분열효모용 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 적색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 6인 분열효모용 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 헤마글루티닌 에피토프 유전자의 염기서열은 서열번호 7인 분열효모용 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터의 개열지도는 도 2의 (3), 도 3의 (6), 또는 도 4의 (4)에 도시된 것인 분열효모용 발현벡터.
제1항, 제4항 내지 제8항 중 어느 한항의 분열효모용 발현벡터에 의해 형질전환된 균주.
제9항에 있어서, 상기 균주는 박테리아 또는 분열효모인 균주.
마커유전자인 노르세오트리신 저항 유전자 및 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제11항에 있어서, 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 염기서열은 서열번호 10인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제11항에 있어서, 상기 게이트웨이발현벡터 제조용 카세트의 염기서열은 서열번호 11 내지 서열번호 13중에서 선택된 하나 이상인 분열효모용 게이트웨이 발 현벡터.
제11항에 있어서, 상기 분열효모용 게이트웨이 발현벡터는 표지단백질 유전자를 추가로 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제14항에 있어서, 상기 표지단백질 유전자는 녹색형광단백질 유전자, 적색형광단백질 유전자, 및 헤마글루티닌 에피토프 유전자 중에서 선택된 하나 이상인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제15항에 있어서, 상기 표지단백질 유전자는 녹색형광단백질 유전자 또는 적색형광단백질 유전자인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제15항에 있어서, 상기 녹색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 3인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제15항에 있어서, 상기 적색형광단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 6인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제15항에 있어서, 상기 헤마글루티닌 에피토프 유전자의 염기서열은 서열번호 7 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제11항에 있어서, 상기 벡터의 개열지도는 도 6의 (2)에 도시된 것인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제11항에 있어서, 상기 벡터의 개열지도는 도 9의 (2)에 도시된 것인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제14항에 있어서, 상기 벡터의 개열지도는 도 7의 (1), 도 7의 (2), 또는 도 7의 (3)에 도시된 것인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터.
제11항 내지 제22항 중 어느 한 항의 분열효모용 게이트웨이 발현벡터에 엔트리벡터 중 목적 유전자가 재조합효소작용에 의해 도입된 분열효모용 발현벡터.
제23항의 분열효모용 발현벡터에 의해 형질전환된 균주.
제24항에 있어서, 상기 균주는 박테리아 또는 분열효모인 균주.
(a1) 분열효모발현용 프로모터와 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하며, 상기 프로모터 3'말단에 상기 노르세오트리신 저항 유전자가 위치하고, 상기 프로모터의 5'말단과 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 3'말단에 동일한 제한효소절 단부위를 갖는 벡터를 준비하는 단계;

(b1) 분열효모발현용 프로모터, 영양마커 유전자, 및 표지단백질유전자를 포함하며, 상기 프로모터 3'말단에 상기 영양마커 유전자가 위치하고, 상기 프로모터의 5'말단과 상기 영양마커 유전자의 3'말단에 상기 (a)단계와 동일한 제한효소절단부위를 갖는 벡터를 준비하는 단계; 및

(c1) 상기 (a1)단계와 상기 (b1)단계의 벡터를 상기 동일한 제한효소절단부위를 절단하는 제한효소로 절단하고, 각각의 절단물을 융합하는 단계를 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 (a1)단계의 벡터는 도 2의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 것인 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 (b1)단계의 벡터는 도 2의 (2)에 도시된 개열지도를 갖는 것인 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 (a1)단계의 벡터는 양말단에 동일한 제한효소절단부위를 갖는 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 벡터로부터 노르세오트리신 저항 유전자를 제한효소로 절단하고, 상기 제한효소절단부위와 동일한 부위를 3'말단에 갖는 분열효모발현용 프로모터를 포함하는 벡터에 상기 절단된 노르세오트리신 저항 유전자를 삽입하여 제조된 것인 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제29항에 있어서, 상기 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 벡터는 도 1의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 것인 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제29항에 있어서, 상기 분열효모발현용 프로모터를 포함하는 벡터는 도 1의 (4)에 도시된 개열지도를 갖는 것인 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 (c1)단계의 결과물에 포함된 표지단백질유전자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제32항에 있어서, 상기 (c1)단계의 결과물은 도 5의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 것인 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제32항에 있어서, 상기 표지단백질 유전자는 헤마글루티닌 에피토프 유전자이며, 상기 (c1)단계 이후에 상기 헤마글루티닌 에피토프 유전자를 절단하여 제거하고, 헤마글루티닌 에피토프 유전자가 제거된 벡터에 형광단백질 유전자 절편을 삽입시키는 단계를 추가로 포함하는 분열효모용 발현벡터 제조방법.
제26항 내지 제34항 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조된 분열효모용 발현벡터에 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트를 삽입하는 단계를 포함하는 분 열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법.
제35항에 있어서, 표지단백질유전자 및 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트를 포함하는 벡터에서 표지단백질유전자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법.
제35항에 있어서, 상기 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트의 염기서열은 서열번호 11 내지 서열번호 13중에서 선택된 하나 이상인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법.
(a2) 노르세오트리신 저항 유전자는 포함하지 않고, 영양마커유전자와 표지단백질유전자를 포함하며, 상기 표지단백질유전자 3'말단부에 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트 삽입용 제한효소절단부위를 갖는 분열효모용 발현벡터를 준비하는 단계;

(b2) 상기 (a2)단계의 카세트 삽입용 제한효소절단부위를 제한효소로 절단하고 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트를 삽입하는 단계; 및

(c2) 상기 (b2)단계의 카세트가 삽입된 분열효모용 발현벡터에서 영양마커유전자를 노르세오트리신 저항 유전자로 교환하는 단계를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법.
제38항에 있어서, 상기 (c2)단계의 결과물에서 표지단백질유전자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법.
제38항에 있어서, 상기 (a2)단계의 발현벡터는 도 8의 (1)에 도시된 개열지도를 갖는 것인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법.
제38항에 있어서, 상기 (b2)단계의 게이트웨이 발현벡터 제조용 카세트의 염기서열은 서열번호 11 내지 서열번호 13중에서 선택된 하나 이상인 분열효모용 게이트웨이 발현벡터 제조방법.