CN112041486A - 周质空间中蛋白质的酵母展示 - Google Patents

周质空间中蛋白质的酵母展示 Download PDF

Info

Publication number
CN112041486A
CN112041486A CN201880088782.5A CN201880088782A CN112041486A CN 112041486 A CN112041486 A CN 112041486A CN 201880088782 A CN201880088782 A CN 201880088782A CN 112041486 A CN112041486 A CN 112041486A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
yeast
periplasmic
antibody
yeast host
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880088782.5A
Other languages
English (en)
Inventor
R·于
C·G·佩斯
R·巴尔塔纳斯
B·罗宾逊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abalone Bio Inc
Original Assignee
Abalone Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abalone Bio Inc filed Critical Abalone Bio Inc
Publication of CN112041486A publication Critical patent/CN112041486A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C07K2319/912—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation containing a GPI (phosphatidyl-inositol glycane) anchor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

公开了用于在酵母细胞的周质空间中展示抗体的组合物和方法。具体地，将抗体连接到跨越细胞膜的跨膜结构域、在所述酵母细胞膜的外表面上的细胞膜结合蛋白结构域、结合酵母细胞壁的内表面的蛋白质或周质蛋白，以便将所述抗体展示在所述酵母周质空间中。此外，目的靶蛋白可以在酵母中共表达，使得其被定位到质膜或周质空间，并且是所展示的抗体可及的以与其结合。本公开文本还涉及使用酵母细胞周质展示进行抗体文库的高通量筛选。

Description

周质空间中蛋白质的酵母展示
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月11日提交的美国临时申请号62/597,388的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府支持下在美国国家科学基金会授予的批准号1747391下进行的。政府享有本发明的一定权利。
技术领域
本公开文本涉及细胞展示和蛋白质文库的高通量筛选的方法。具体地，本公开文本涉及用于在酵母的周质空间中展示蛋白质的方法以及此类方法用于针对特定结合或功能特征筛选蛋白质文库的用途。
背景技术
已经证明了分子展示技术对于发现、生产和优化用于各种生物技术和生物医学应用的蛋白质和肽是非常有价值的。已经开发了各种方法，包括噬菌体展示(Smith(1985)Science 228:1315-1317)、mRNA(Wilson等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-3755)和DNA展示(Yonezawa等人(2003)Nucleic Acids Res.31:e118)、核糖体展示(Hanes和Pluckthun(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937-4942)、真核病毒展示(Bupp和Roth(2002)Mol.Ther.5:329-335；Muller等人(2003)Nat.Biotechnol.21:1040-1046)、细菌展示(Lu等人(1995)Biotechnology 13:366-372)以及酵母展示(Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15:553-557)，以针对所需特征筛选重组蛋白的组合文库。此类展示技术已经广泛用于蛋白质工程化以鉴定具有改善的稳定性和所需的结合亲和力和酶促活性的蛋白质，并且已经用于各种应用，包括定向进化、亲和力成熟、治疗性蛋白质和抗体工程化、生物燃料生产、环境污染物的吸附、表位定位以及蛋白质-蛋白质相互作用的研究。
具体地，酵母展示已经用于展示广泛种类的原核和真核蛋白(Cherf等人(2015)Methods Mol.Biol.1319:155-175)。在酵母细胞中的表达提供允许真核蛋白的适当折叠和糖基化的优点。在常规酵母展示中，重组蛋白是通过与细胞壁蛋白融合在酵母细胞的表面上展示。虽然酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是用于细胞表面展示的最常用物种，但是其他酵母物种，包括毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)和耶氏酵母属(Yarrowia)菌株已经用于一些应用(Tanaka等人(2012)Appl.Microbiol.Biotechnol.95(3):577-591,Buerth等人(2016)Appl.Microbiol.Biotechnol.100(16):6981-6990,Madzak(2015)Appl.Microbiol.Biotechnol.99(11):4559-4577)。
仍然需要用于更有效地展示蛋白质，特别是用于与膜蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用的高通量筛选的改善方法。
发明内容
本公开文本涉及通过在酵母细胞的周质空间中展示蛋白质针对特定结合或功能特征进行蛋白质文库的高通量筛选。
在一方面，本发明包括一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：a)用于在所述酵母宿主细胞周质空间中展示的蛋白质变体，其中所展示的蛋白质变体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种蛋白质变体；b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白与所述蛋白质变体连接，使得所述蛋白质变体展示在所述周质空间中；以及c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述蛋白质变体可及的。所述酵母宿主细胞可以是单倍体或二倍体。
在某些实施方案中，所述蛋白质变体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。在其他实施方案中，所述蛋白质变体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起。在其他实施方案中，所述蛋白质变体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过非肽键连接。在一些实施方案中，所述非肽键是二硫键。
在某些实施方案中，所述周质锚定蛋白包含信号序列，所述信号序列引导所述融合蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述融合的蛋白质变体展示在所述周质中。可以使用的示例性信号序列是前原α因子信号序列。
在某些实施方案中，所述周质锚定蛋白包含跨越膜的跨膜结构域，所述跨膜结构域将所述融合的蛋白质变体伸出至周质中。
在某些实施方案中，所述周质锚定蛋白包含细胞膜结合蛋白结构域，所述结构域定位到所述细胞膜的外表面，使得所展示的蛋白质变体被伸出至所述周质中。在某些实施方案中，所述细胞膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。例如，所述GPI-质膜锚定结构域可以是yapsin GPI质膜锚定结构域，诸如但不限于YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。
在某些实施方案中，所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所展示的蛋白质变体被伸出至所述周质中的蛋白质。
在某些实施方案中，所述周质锚定蛋白包含信号序列，所述信号序列引导所述融合蛋白向所述酵母宿主细胞周质的转运，并且所述周质锚定蛋白足够大而使得所述融合蛋白保留在所述周质中。
在某些实施方案中，所述锚定蛋白是周质蛋白复合物的组分，其足够大而使得所述复合物在所述周质中的形成导致所述融合蛋白保留在所述周质中。
在另一个实施方案中，所述融合蛋白还包含标签。
在某些实施方案中，所述蛋白质变体是抗体、抗体模拟物、适体、抗原、酶、受体、激素、底物、激动剂、拮抗剂或配体。
在某些实施方案中，所述蛋白质变体是选自以下的抗体：单克隆抗体、嵌合抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
在某些实施方案中，所述酵母周质展示文库中的每个酵母宿主细胞还包含目的靶蛋白，所述靶蛋白在所展示的蛋白质变体可及的位置中表达(例如，对于所展示的蛋白质变体而言足够接近以结合目的靶蛋白)。例如，所述目的靶蛋白可以定位在所述酵母宿主细胞质膜或周质中。所述目的靶蛋白可以是例如膜蛋白、受体、离子通道或转运蛋白。在一个实施方案中，所述目的靶蛋白是G蛋白偶联受体(GPCR)。
在某些实施方案中，每个酵母宿主细胞还包含用于检测目的靶蛋白对于与所展示的蛋白质变体的蛋白质-蛋白质相互作用的应答的报告系统。在某些实施方案中，所展示的蛋白质变体是目的靶蛋白的拮抗剂，并且所述应答是所述拮抗剂与所述目的靶蛋白结合时所述目的靶蛋白的活性降低，其中所述报告系统检测所述拮抗剂与所述目的靶蛋白结合时所述目的靶蛋白的活性降低。在其他实施方案中，所展示的蛋白质变体是目的靶蛋白的激动剂，并且所述应答是所述激动剂与所述目的靶蛋白结合时所述目的靶蛋白的活性增加，其中所述报告系统检测所述激动剂与所述目的靶蛋白结合时所述目的靶蛋白的活性增加。
在某些实施方案中，所述目的靶蛋白的激活增加所述酵母宿主细胞的生长。在这种情况下，可以通过在培养基中培养所述酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集来针对所述目的靶蛋白的激动剂筛选所述酵母周质展示文库，其中所述培养基中酵母宿主细胞的生长指示所述酵母宿主细胞中展示的蛋白质变体是所述目的靶蛋白的激动剂。
在其他实施方案中，所述目的靶蛋白的激活降低所述酵母宿主细胞的生长。在这种情况下，可以通过在培养基中培养所述酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集来针对所述目的靶蛋白的拮抗剂筛选所述酵母周质展示文库，其中所述培养基中酵母宿主细胞的生长指示所述酵母宿主细胞中展示的蛋白质变体是所述目的靶蛋白的拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明包括一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：a)融合蛋白，其包含与用于在所述酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体融合的周质锚定蛋白，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；以及b)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
所述目的靶膜蛋白可以是例如受体、离子通道和转运蛋白。在一些实施方案中，所述目的靶膜蛋白包含增加或降低其活性的突变。
可以通过所述目的靶膜蛋白展示的抗体可以包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
在某些实施方案中，所述酵母周质展示文库还包含报告系统，所述报告系统包含可操作地连接到当激活所述目的靶膜蛋白时被激活的诱导型启动子的报告基因，以便允许检测在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性增加或降低。例如，所述报告基因可以是营养标记(例如，HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1)、抗生素抗性标记(例如，赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素诸如遗传霉素(例如，aphA1)、zeocin(例如，ble)、潮霉素B、诺尔斯菌素或双丙氨膦)、荧光标记(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白的荧光标记)、生物发光标记(例如，萤光素酶或水母发光蛋白)或反向可选择标记(例如，CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK)。在某些实施方案中，所述报告基因是可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性增加可通过阳性选择培养基上酵母宿主细胞的生长来检测。在其他实施方案中，所述报告基因是反向可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性增加可通过包含反向选择剂的培养基上酵母宿主细胞的生长来检测。
在某些实施方案中，所述目的靶膜蛋白是G蛋白偶联受体(GPCR)，例如外源性GPCR，诸如哺乳动物GPCR(例如，来自人或非人灵长类动物、啮齿类动物、实验室动物、家畜)。在某些实施方案中，所述哺乳动物GPCR是选自以下的人GPCR：CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR和AT1R。
在某些实施方案中，所述酵母周质展示文库还包含能够被GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
在某些实施方案中，所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。例如，所述酵母Gα亚基可以属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。在嵌合Gα亚基中，酵母Gα亚基的至少5个C末端残基可以被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在一些实施方案中，酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在另一个实施方案中，所述嵌合Gα亚基包含酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。
示例性哺乳动物Gα亚基包括Gα-S、Gα-I、Gα-O、Gα-T、Gα-Z、Gα-Q、Gα-11、Gα-12、Gα-13和转导蛋白。
在一些实施方案中，所述目的靶GPCR具有组成型非配体依赖性活性。在其他实施方案中，添加配体以激活目的靶GPCR。
在某些实施方案中，所述酵母宿主细胞是单倍体或二倍体酵母宿主细胞。在某些实施方案中，所述酵母宿主细胞是Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3或Δmat菌株。Δmat菌株可以包含例如缺失或失活的MATα基因座或者缺失或失活的MATa基因座。
在另一个实施方案中，所述酵母宿主细胞还包含经修饰的CLN3蛋白，所述经修饰的CLN3蛋白包含与野生型CLN3蛋白相比增加所述酵母宿主细胞中CLN3的丰度的C末端截短。例如，经修饰的CLN3蛋白可以至少保留野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-387或1-408，或这些范围内任何数量的N末端氨基酸，诸如1-388、1-389、1-390、1-391、1-392、1-393、1-394、1-395、1-396、1-397、1-398、1-399、1-400、1-401、1-402、1-403、1-404、1-405、1-406、1-407或1-408，其中所述C末端截短包括野生型CLN3蛋白的剩余残基的全部或一些的缺失。
在另一个实施方案中，所述酵母宿主细胞是用于选择GPCR的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
在另一个实施方案中，所述酵母宿主细胞是用于选择GPCR的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
在另一方面，本发明提供了一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：a)用于在所述酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体，其中所述抗体连接到信号序列，所述信号序列引导所述抗体向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述酵母宿主细胞周质空间中；以及b)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
在另一方面，本发明包括一种制备本文所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：a)提供多个编码融合蛋白的重组多核苷酸，其中每个重组多核苷酸编码不同的融合蛋白，所述融合蛋白包含与用于展示的不同抗体融合的周质锚定蛋白；b)用多个编码融合蛋白的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞；c)用编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞；以及d)在允许表达融合蛋白和目的靶膜蛋白的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在周质空间中展示不同抗体，并且目的靶膜蛋白定位到质膜(即，在所展示的抗体可及以结合的位置)。在某些实施方案中，所述编码融合蛋白的重组多核苷酸或所述编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸通过表达载体提供。在其他实施方案中，所述编码融合蛋白或目的靶膜蛋白的重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
在另一方面，本发明提供了一种制备酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：a)提供第一多个编码用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体的重组多核苷酸，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；b)提供编码周质锚定蛋白的第二重组多核苷酸，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在周质空间中；c)用第一多个重组多核苷酸和第二重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；d)用编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及e)在允许表达抗体、周质锚定蛋白和目的靶膜蛋白的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在周质空间中展示不同抗体，并且目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生所述酵母周质展示文库。
融合蛋白和目的靶膜蛋白的表达通常将依赖于启动子的存在，所述启动子可以包含在载体中或包含在整合重组多核苷酸的染色体基因座处。启动子可以是组成型或诱导型启动子。在某些实施方案中，每个重组多核苷酸包含可操作地连接到编码融合蛋白或目的靶膜蛋白的多核苷酸的启动子。所述重组多核苷酸可以通过包含启动子的载体提供。在其他实施方案中，染色体靶基因座包含可操作地连接到在染色体靶基因组处整合的编码融合蛋白或目的靶膜蛋白的多核苷酸的启动子。
在另一个实施方案中，所述方法还包括将编码能够被GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到多个酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
在另一个实施方案中，本发明包括一种周质靶向表达载体，其包含：a)编码信号肽的多核苷酸；b)适于在编码信号肽的多核苷酸之后框内插入编码蛋白质变体的多核苷酸的克隆位点；c)编码糖磷脂酰肌醇(GPI)质膜锚定结构域的多核苷酸，所述多核苷酸的定位使得所述载体能够产生包含信号肽和与GPI质膜锚定结构域融合的蛋白质变体的融合蛋白；以及d)可操作地连接到编码融合蛋白的序列的启动子。在一个实施方案中，所述信号肽包含前原α因子信号序列。在另一个实施方案中，所述克隆位点包含一个或多个限制性位点。在某些实施方案中，所述GPI质膜锚定结构域是yapsin GPI质膜锚定结构域，诸如但不限于YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。在另一个实施方案中，所述周质靶向表达载体还包含编码接头的多核苷酸，其中所述编码接头的多核苷酸定位在克隆位点与编码GPI质膜锚定结构域的多核苷酸之间。所述接头还可以包含标签。在另一个实施方案中，所述周质靶向表达载体还包含可选择标记。
在另一方面，本发明包括一种制备本文所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：a)提供多个编码抗体变体的重组多核苷酸，其中每个重组多核苷酸编码不同的抗体变体；b)用本文所述的周质靶向表达载体转染多个酵母宿主细胞；c)用多个编码抗体变体的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞，其中在每个酵母宿主细胞中，编码抗体变体的重组多核苷酸通过同源重组被整合到周质靶向表达载体的克隆位点中，以允许表达包含与用于展示的抗体变体融合的周质锚定蛋白的融合蛋白；c)用编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞；以及d)在允许表达融合蛋白和目的靶膜蛋白的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在周质空间中展示不同抗体，并且目的靶膜蛋白定位到质膜(即，在所展示的抗体可及以结合的位置)。在另一个实施方案中，所述方法还包括将编码能够被GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到多个酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
在另一方面，本发明包括一种针对调节目的靶膜蛋白的活性的抗体筛选如本文所述的包含报告系统的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在选择培养基中培养本文所述的酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集；以及检测报告基因的表达，其中报告基因的表达增加指示所述抗体增加目的靶膜蛋白的活性，并且报告基因的表达减少指示所述抗体降低目的靶膜蛋白的活性。
示例性报告基因包括营养标记(例如，HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1)、抗生素抗性标记(例如，赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素诸如遗传霉素(aphA1)、zeocin(ble)、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦)、荧光标记(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白的荧光标记)、生物发光标记(例如，萤光素酶或水母发光蛋白)以及反向可选择标记(例如，CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK)。
在另一个实施方案中，所述方法还包括对于营养标记的表达的阳性选择，其中营养缺乏选择培养基中酵母宿主细胞的生长指示目的靶膜蛋白被激活。
在另一个实施方案中，所述方法还包括对于抗生素抗性标记的表达的阳性选择，其中包含抗生素的选择培养基中酵母宿主细胞的生长指示目的靶膜蛋白被激活。
在另一个实施方案中，所述方法还包括对于荧光标记的表达的阳性选择，其中检测到由酵母宿主细胞发射的荧光指示目的靶膜蛋白被激活。
在另一个实施方案中，所述方法还包括对于生物发光标记的表达的阳性选择，其中检测到由酵母宿主细胞发射的生物发光指示目的靶膜蛋白被激活。
在另一个实施方案中，所述方法还包括对于反向可选择标记的表达的阴性选择，其中在所展示的抗体与目的靶膜蛋白结合时目的靶膜蛋白的活性降低可通过培养基中酵母宿主细胞的生长来检测，所述培养基包含针对表达反向可选择标记的细胞进行选择的药剂。
在另一个实施方案中，本发明包括一种针对调节目的靶GPCR的活性的抗体筛选酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在培养基中培养所述酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集，其中与不具有展示在周质空间中的抗体的对照酵母宿主细胞相比在至少一个酵母宿主细胞中检测到信息素应答的激活或抑制指示所述至少一个酵母宿主细胞中所展示的抗体结合所述GPCR并调节所述GPCR的活性。在一些实施方案中，所述方法还包括使人GPCR与配体接触。在其他实施方案中，所述GPCR具有组成型非配体依赖性活性。
在某些实施方案中，所述酵母宿主细胞包含能够被GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。在某些实施方案中，所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。例如，所述酵母Gα亚基可以属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。在嵌合Gα亚基中，酵母Gα亚基的至少5个C末端残基可以被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在一些实施方案中，酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在另一个实施方案中，所述嵌合Gα亚基包含酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。示例性哺乳动物Gα亚基包括Gα-S、Gα-I、Gα-O、Gα-T、Gα-Z、Gα-Q、Gα-11、Gα-12、Gα-13和转导蛋白。
在某些实施方案中，所述酵母宿主细胞是FAR1菌株，其中通过充当结合并抑制酵母宿主细胞中的GPCR的拮抗剂的抗体对信息素应答的抑制导致细胞周期阻滞停止和酵母宿主细胞生长。在其他实施方案中，酵母宿主细胞是Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子，其中通过充当结合并激活酵母宿主细胞中的GPCR的激动剂的抗体对信息素应答的激活导致报告基因的表达增加。
在另一方面，本发明提供了一种酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞包含：a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体；b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在周质空间中；以及c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在酵母宿主细胞质膜中并且是酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
在另一方面，本发明提供了一种连接到周质锚定蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述抗体在酵母宿主细胞中产生，所述抗体定位到酵母宿主细胞周质空间。在一些实施方案中，所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。在一些实施方案中，所述非肽键是二硫键。在一些实施方案中，所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
在另一方面，本发明提供了一种将抗体定位到酵母宿主细胞周质空间的方法，所述方法包括将所述抗体连接到周质锚定蛋白，使得所述抗体被定位到周质空间。在一些实施方案中，所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。在一些实施方案中，所述非肽键是二硫键。在一些实施方案中，所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所述的酵母周质展示文库以及用于针对蛋白质变体结合目的靶蛋白和/或调节目的靶蛋白的活性的能力筛选多种蛋白质变体的说明书。
本领域技术人员根据本文的公开文本易于想到本发明的这些和其他实施方案。
附图说明
图1A-图1D示出了用于筛选调节GPCR的功能的抗体的新型酵母细胞展示方法。图1A示出了1)功能人GPCR-酵母偶联与2)亲和分子分泌和3)亲和分子定位在高通量、高度可工程化的酵母细胞平台中一起的独特组合。功能性的适当折叠的GPCR产生更可能在人有机体环境中充当治疗剂的ScFv(其可以容易地转化为IgG抗体)或纳米抗体。图1B示出了使用“拮抗剂选择菌株”来寻找拮抗剂。图1C示出了使用“激动剂选择菌株”来寻找激动剂。通过改变与信息素应答系统输出偶联的报告物和可选择标记的逻辑，所述平台可以用于选择激动剂或拮抗剂。图1D示出了直接功能性筛选产生通常在传统筛选中遗漏的治疗性抗体候选物，其可以产生GPCR靶的新型结合模式和功能性调节。由于易于在酵母中进行基因工程，我们可以调整抗体和GPCR表达水平二者，并且将可选择和可筛选报告物调谐为非常敏感的。这两者使我们能够找到低亲和力但功能性的候选物，其随后可以易于进行亲和力成熟。
图2示出了减少“晕轮测定(halo assay)”中的背景/假阳性的方法。将亲本菌株(左)和当前平台菌株(NIY326，右)的107个细胞铺板在琼脂培养基上。将滤纸盘放置到板上并且用3μl的1mMα因子点样。在两者中观察到响应于配体的无生长区(所需的表型应答)，但是在亲本菌株(左)中，出现抑制突变体并在信息素的存在下生长为菌落(晕轮区中的菌落)。在平台菌株NI326(右)中，我们将背景率降低至约10-7，如在清楚的晕轮区中和在拮抗剂选择中充当假阳性的背景抑制突变的缺乏所证明。
图3示出了亲和分子靶向载体结构和概念。我们将亲和分子克隆在分泌信号的下游以及接头和来自GPI的细胞外膜锚定结构域的上游。当在细胞中表达时，蛋白质被分泌到细胞外空间中，然后对GPI结构域进行处理以留下结合膜的具有GPI的结构域，所述结构域将亲和分子栓系到此细胞并使所述亲和分子与细胞的细胞外表面上的靶GPCR自由相互作用。
图4A和图4B示出了亲和分子表达/靶向载体的验证。图4A示出了如果表达的抗GFP纳米抗体适当地折叠并定位，则从细胞外施加的GFP(在细胞壁消化之后)将标记细胞膜。图4B示出了在细胞壁消化并施加纯化的GFP蛋白之后使用我们的靶向载体表达抗GFP纳米抗体的酵母的图像指示在膜处的GFP结合。在对照细胞中没有观察到荧光(数据未示出)左，明视场；右，GFP通道。
图5A和图5B示出了α因子抗性克隆的质粒依赖性的验证。图5A示出了策略的示意图。图5B示出了“候选”克隆的例子，其展现出α因子抗性生长(如通过晕轮测定分析)，然后在迫使质粒脱落(drop)之后没有显示抗性。
图6示出了工作流程示意图。
图7示出了使用以各种方式在周质空间中展示的VHH结构域激动剂激活2型大麻素受体(CB2受体)对酵母细胞的生长速率的影响。
具体实施方式
诸如癌症和炎症的疾病中的大量治疗性靶标涉及细胞膜结合蛋白。然而，许多对于高影响疾病具有最大治疗潜力的细胞膜结合蛋白难以成药。虽然容易找到影响这些蛋白质的功能的小分子，但是它们通常是非特异性的。与小分子不同，抗体和相关的亲和分子(例如，纳米抗体和ScFv和Fab)由于其潜在优异的特异性、功能多样性和药理学特性而成为有吸引力的治疗药类别。另外，抗体可以更好地与细胞外结构域和环相互作用，从而可以以比小分子更精细的方式调节细胞膜结合蛋白(诸如GPCR)的结构(并且因此调节其功能)。然而，目前为止在美国还没有一种被批准的GPCR抗体治疗剂，并且在世界范围内仅在日本有一种。
当前的酵母或噬菌体展示工作流程鉴定紧密地结合细胞膜结合蛋白(诸如GPCR)但通常不影响其功能的抗体。所使用的抗原通常是不表示体内抗体可及的功能性蛋白质的片段，或者是异质性结构化的全长蛋白质制剂。所述工作流程还忽略了极大部分的总功能多样性，因为大多数抗体从未在功能上被测定过。需要的是高通量平台以直接选择调节细胞膜结合蛋白(诸如GPCR)的功能的抗体。
开发改变细胞膜结合蛋白(诸如GPCR)的功能的抗体更复杂(Jo 2015,Hutchings2010)。这主要是由于许多当前解决方案的以下问题所致：1)缺乏所使用的抗原。来源于细胞外肽或片段的抗原可能对于开发用于蛋白质印迹法的抗体是良好抗原，但是在结构上不表示治疗相关的靶标。此外，脂质或洗涤剂中同质功能性折叠的全长蛋白可能难于以对于免疫、噬菌体展示或酵母展示足够的量来制备。2)针对高亲和力选择的抗体大多数是非功能性的；它们结合蛋白质中不影响功能的区域。3)工作流程在所选抗体中损失显著的抗体多样性，并且因此损失功能性。由于首先选择紧密结合的抗体并丢弃其余的抗体，丧失了大量的功能多样性。创建哺乳动物细胞系统，以便以自分泌方式在功能上筛选抗体候选物子集(Zhang 2014)，其部分地解决了问题2，但是由于可选择/可筛选读出的转换效率(约104)和受限的可工程化性，它们被局限于筛选候选物的小子集。
我们的创新包括将细胞膜结合蛋白-酵母信息素应答偶联与在高通量平台中在同一细胞中表达顺式作用的亲和分子组合。这使得能够在酵母周质空间中进行亲和分子的直接和高通量功能性选择。抗体和相关亲和分子是具有复杂折叠模式的大分子，必须维持所述复杂折叠模式以保留结合活性。虽然非结构化的短肽可能能够被定位到酵母周质空间，但是先前并不知道抗体和相关亲和分子可以展示在酵母周质空间中并保留结合活性。
除非另外指示，否则本发明的实践将采用本领域内的药理学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。此类技术在文献中有充分说明。参见例如，HighThroughput Screening:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,W.P.Janzen编,Humana Press,第3版,2016)；G Protein-Coupled Receptors:Structure,Signaling,and Physiology(S.Siehler和G.Milligan编,Cambridge University Press,2010)；Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers,Inc.,现行版)；Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)。
无论是上文或是下文，本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体特此并入。
I.定义
在描述本发明时，将采用以下术语，并且意图如以下指示定义。
必须指出，如在此说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非内容另外清楚地规定。因此，提及“一种细胞”时包括两种或更多种细胞的混合物，等等。
在具体地关于给定量时，术语“约”意味着涵盖加或减5％的偏差。
在具体地关于给定量时，术语“约”涵盖并描述给定量本身。
术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在所述定义内。所述定义涵盖了全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、羟基化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰(诸如缺失、添加和取代)的蛋白质。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(诸如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
术语“抗体”涵盖单克隆抗体以及杂合抗体、改变的抗体、嵌合抗体和人源化抗体。术语抗体包括：杂合(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等人(1991)Nature 349:293-299；和美国专利号4,816,567)；F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异二聚体，参见例如，Inbar等人(1972)Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662；以及Ehrlich等人(1980)Biochem19:4091-4096)；单链Fv分子(scFv)(参见例如，Huston等人(1988)Proc Natl Acad SciUSA 85:5879-5883)；纳米抗体或单结构域抗体(sdAb)(参见例如，Wang等人(2016)Int JNanomedicine 11:3287-3303,Vincke等人(2012)Methods Mol Biol 911:15-26；二聚和三聚抗体片段构建体；微型抗体(参见例如，Pack等人(1992)Biochem 31:1579-1584；Cumber等人(1992)J Immunology 149B:120-126)；人源化抗体分子(参见例如，Riechmann等人(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyan等人(1988)Science 239:1534-1536；以及英国专利公开号GB 2,276,169，1994年9月21日公开)；以及从此类分子获得的任何功能片段，其中此类片段保留亲本抗体分子的特异性结合特性。
关于抗体与抗原(例如，GPCR)的结合的短语“特异性地(或选择性地)结合”是指决定蛋白质和其他生物制品的异质群体中抗原的存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定抗体与特定抗原以背景的至少两倍结合，并且不以显著量与样品中存在的其他抗原实质性结合。在此类条件下与抗原的特异性结合可能需要针对对特定抗原的特异性而选择的抗体。例如，可以选择针对来自特定物种(诸如大鼠、小鼠或人)的抗原产生的抗体，以便仅获得与所述抗原而非其他蛋白质(多态变体和等位基因除外)特异性免疫反应的那些抗体。此选择可以通过减去与来自其他物种的分子交叉反应的抗体来实现。各种免疫测定形式可以用于选择与特定抗原特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如，Harlow和Lane.Antibodies,A Laboratory Manual(1988))。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更通常是背景的超过10至100倍。
如果蛋白质特异性地(例如，以锁钥型机制)结合、非特异性地结合或呈特异性结合与非特异性结合的某种组合，则称所述蛋白质与另一种蛋白质“相互作用”。如果第一蛋白质与第二蛋白质的(非特异性和/或特异性)结合的亲和力和/或特异性大于其与其他蛋白质结合的亲和力和/或特异性，则第一蛋白质与第二蛋白质“优先相互作用”。术语“亲和力”是指结合强度，并且可以定量地表示为解离常数(Kd)。应理解，特异性结合不一定需要每种蛋白质的特定氨基酸残基和/或基序之间的相互作用。例如，在某些实施方案中，第一蛋白质可以优先与第二蛋白质相互作用，但是仍然可能能够以较弱但可检测的水平(例如，对于目的多肽所示的结合的10％或更低)结合其他多肽。通常，例如通过使用适当的对照，弱结合或背景结合可易于与对目的化合物或多肽的优先相互作用相区分。
如本文所用，术语“结合对”是指彼此特异性地结合的第一分子和第二分子。样品中结合对的第一成员与结合对的第二成员的“特异性结合”是通过第一成员与第二成员的结合(或反之亦然)的亲和力和特异性大于与样品中的其他组分的亲和力和特异性来证明。结合对的成员之间的结合通常是非共价的。例子包括抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、受体-激动剂和受体-拮抗剂结合对。
如本文所用，术语“配体”是指结合另一种分子的分子，例如结合抗体的抗原，结合受体的激素、激动剂或拮抗剂，结合离子通道的神经递质，或者结合酶的底物、抑制剂或变构效应子，并且包括天然和合成生物分子，诸如蛋白质、多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、糖、脂质、脂蛋白、小分子、天然和合成有机和无机材料、合成聚合物、适体等。
如本领域已知，术语“多核苷酸”通常是指核酸分子。“多核苷酸”可以包括双链和单链序列两者，并且是指但不限于原核序列、真核mRNA、来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒(例如，RNA和DNA病毒和逆转录病毒)、原核DNA或真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组RNA和DNA序列，以及尤其是合成DNA序列。所述术语还涵盖包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，并且包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(通常在性质上是保守的)。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(诸如通过包含编码用于展示的变体多肽的多核苷酸的宿主的突变)。多核苷酸的修饰可以具有任何数量的作用，包括例如有利于多肽产物在宿主细胞中的表达。
多核苷酸可以编码生物活性的蛋白质或多肽。根据由多核苷酸编码的多肽的性质，多核苷酸可以包含少至10个核苷酸，例如在所述多核苷酸编码抗原或表位的情况下。通常，多核苷酸编码至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或甚至更多个氨基酸的肽。
术语“变体”、“类似物”和“突变蛋白”是指参考分子的保留如本文所述的所需活性(例如，有效的多肽展示)的生物活性衍生物。通常，术语“变体”和“类似物”是指具有天然多肽序列和结构的化合物，其相对于天然分子具有一个或多个氨基酸添加、取代和/或缺失，只要所述修饰不破坏生物活性即可，并且所述化合物与如下定义的参考分子是“基本上同源的”。通常，当此类类似物的氨基酸序列与参考序列比对时，这两个序列将具有高度序列同源性，例如超过50％，通常超过60％-70％，甚至更具体地80％-85％或更多，诸如至少90％-95％或更多的氨基酸序列同源性。通常，类似物包含相同数量的氨基酸，但是将包含取代，如本文所解释。术语“突变蛋白”还包括具有一个或多个氨基酸样分子的多肽，包括但不限于仅包含氨基和/或亚氨基分子的化合物、含有氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)的一个或多个类似物的多肽、具有取代的键联以及本领域已知的其他修饰的多肽、天然存在和非天然存在的(例如，合成的)、环化的支链分子等。所述术语还包括包含一个或多个N取代的甘氨酸残基的分子(“类肽”)和其他合成氨基酸或肽。(关于类肽的描述，参见例如，美国专利号5,831,005；5,877,278；和5,977,301；Nguyen等人,Chem.Biol.(2000)7:463-473；以及Simon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:9367-9371)。用于制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的并且进一步描述于下文中。
类似物通常包含性质上保守的取代，即在侧链相关的氨基酸家族内发生的那些取代。具体地，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳族氨基酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸孤立置换亮氨酸、用谷氨酸孤立置换天冬氨酸、用丝氨酸孤立置换苏氨酸、或用结构上相关的氨基酸类似地保守置换氨基酸，将不会对生物活性具有重大影响。例如，目的多肽可以包含高达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至高达约15-25个保守或非保守氨基酸取代，或5-25之间的任何整数，只要分子的所需功能保持完整。通过参考本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle图，本领域技术人员可以容易地确定目的分子中可以耐受变化的区域。
如本文所用的描述核酸分子的“重组”意指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，所述多核苷酸凭借其来源或操纵不与其在自然界中与之缔和的多核苷酸的全部或一部分缔和。如关于蛋白质、多肽或肽所用的术语“重组”意指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。通常，克隆目的基因，然后在转化的有机体中表达，如下文进一步描述。宿主有机体在表达条件下表达外来基因以产生蛋白质。
“多核苷酸编码序列”或“编码”所选多肽的序列是当置于适当调控序列(或“控制元件”)的控制下时在体内被转录(在DNA的情况下)并且翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。转录终止序列可以位于编码序列的3'。典型的“控制元件”包括但不限于转录调控因子，诸如启动子、转录增强子元件、转录终止信号和聚腺苷酸化序列；和翻译调控因子，诸如用于优化翻译起始的序列，例如Shine-Dalgarno(核糖体结合位点)序列、Kozak序列(即，用于优化翻译的序列，位于例如编码序列的5')、前导序列(异源的或天然的)、翻译起始密码子(例如，ATG)和翻译终止序列。启动子可以包括诱导型启动子(在可操作地连接到启动子的多核苷酸序列的表达通过分析物、辅因子、调控蛋白等诱导的情况下)、阻抑型启动子(在可操作地连接到启动子的多核苷酸的表达通过分析物、辅因子、调控蛋白等诱导的情况下)和组成型启动子。
“可操作地连接”是指元件的布置，其中如此描述的组分被配置来执行其常见功能。因此，当存在适当的酶时，可操作地连接到编码序列的给定启动子能够实现编码序列的表达。启动子不必与编码序列邻接，只要启动子起作用以引导编码序列的表达即可。因此，例如，在启动子序列与编码序列之间可以存在中间的未翻译但被转录的序列，并且仍然可以认为所述启动子序列“可操作地连接”到所述编码序列。
“片段”意图是指仅由完整全长序列和结构的一部分组成的分子。片段可以包括肽的C末端缺失、N末端缺失和/或内部缺失。特定蛋白质或肽的活性片段通常将包括全长分子的至少约5-10个连续氨基酸残基，优选地全长分子的至少约15-25个连续氨基酸残基，并且最优选地全长分子的至少约20-50个或更多个连续氨基酸残基，或5个氨基酸与全长序列之间的任何整数，前提是所讨论的片段保留生物活性。
“基本上纯化的”通常是指将物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)分离，使得所述物质占其所存在于的样品的大部分。通常在样品中，基本上纯化的组分占样品的50％，优选地80％-85％，更优选地90-95％。用于纯化目的多核苷酸和多肽的技术是本领域熟知的，并且包括例如离子交换色谱法、亲和色谱法和根据密度的沉降。
当涉及多肽时，“分离的”意指，所指示分子与所述分子在自然界中一起被发现的完整有机体是分开的和分立的，或者在基本上不存在相同类型的其他生物大分子的情况下存在。关于多核苷酸的术语“分离的”是完全或部分缺乏在自然界中通常与之缔和的序列的核酸分子；或保持在自然界中的原样但是与异源序列缔和的序列；或从染色体解离的分子。
“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽分子之间的同一性百分比。当两个核酸或两个多肽序列在分子的限定长度上展现出至少约50％，优选地至少约75％，更优选地至少约80％-85％，优选地至少约90％，并且最优选地至少约95％-98％的序列同一性时，所述序列彼此“基本上同源”。如本文所用，基本上同源还是指示出与指定序列的完全同一性的序列。
通常，“同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列各自的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的精确对应性。同一性百分比可以通过两个分子(参考序列和与参考序列具有未知同一性％的序列)之间序列信息的直接比较确定，其通过以下进行：将序列进行比对，计数两个比对序列之间的精确匹配数量，除以参考序列的长度，并且将结果乘以100。易于获得的计算机程序可以用于帮助分析，诸如ALIGN(Dayhoff,M.O.，Atlas of Protein Sequenceand Structure M.O.Dayhoff编,5增刊3:353-358,National biomedical ResearchFoundation,华盛顿特区)，其针对肽分析修改Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.2:482-489,1981)。用于确定核苷酸序列同一性的程序可在Wisconsin序列分析软件包第8版(可从Genetics Computer Group，麦迪逊市，威斯康星州获得)中获得，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，它们也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序易于用制造商推荐并且在以上提及的Wisconsin序列分析软件包中所述的默认参数来使用。例如，特定核苷酸序列与参考序列的同一性百分比可以使用Smith和Waterman的同源性算法以及默认评分表和6个核苷酸位置的空位罚分来确定。
在本发明的情况下建立同一性百分比的另一种方法是使用MPSRCH程序软件包，其版权由爱丁堡大学所有，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并且由IntelliGenetics,Inc.(山景城，加利福尼亚州)分销。根据这个软件包套装，可以采用Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，并且空位为6)。根据所生成的数据，“匹配”值反映“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适程序通常是本领域已知的，例如另一种比对程序是BLAST，以默认参数使用。例如，BLASTN和BLASTP可以使用以下默认参数来使用：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的细节可易于获得。
替代地，同源性可以通过以下来确定：在同源区之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，接着用一种或多种单链特异性核酸酶消化，以及进行消化片段的大小确定。可以在例如严格条件(如针对此特定系统所定义的)下在Southern杂交实验中鉴定基本上同源的DNA序列。定义适当的杂交条件在本领域技术人员的能力范围之内。参见例如，Sambrook等人,同上；DNA Cloning,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上。
“表达盒”或“表达构建体”是指能够引导一种或多种目的序列或基因的表达的组件。表达盒通常包含如上所述的控制元件，诸如可操作地连接到一种或多种目的序列或基因(以便引导其转录)的启动子，并且通常还包含聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方案内，本文所述的表达盒可以容纳在质粒或病毒载体构建体内。除表达盒的组分以外，所述构建体还可以包含一种或多种可选择标记、允许构建体作为单链DNA存在的信号(例如，M13复制起点)、至少一个多克隆位点以及复制起点(例如，酵母中的自主复制序列)。
术语“转染”用于是指细胞对外来DNA的摄入。当外源DNA被引入细胞膜内时，细胞被“转染”。多种转染技术通常是本领域已知的。参见例如，Graham等人(1973)Virology,52:456,Sambrook等人(2001)Molecular Cloning,a laboratory manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratories,纽约,Davis等人(1995)Basic Methods in Molecular Biology,第2版,McGraw-Hill,以及Chu等人(1981)Gene 13:197。此类技术可以用于将一种或多种外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。所述术语是指遗传物质的稳定和瞬时摄入两者，并且包括肽连接的DNA或抗体连接的DNA的摄入。
“载体”能够将核酸序列转移到靶细胞中(例如，病毒载体、非病毒载体、颗粒载剂和脂质体)。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够引导目的核酸的表达并且可以将核酸序列转移到靶细胞中的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物，以及质粒和病毒载体。
术语“转化”是指将外源多核苷酸插入到宿主细胞中，与用于插入的方法无关。例如，包括直接摄入、转导或f-配对。外源多核苷酸可以作为非整合载体，例如质粒来维持，或者替代地，可以整合到宿主基因组中。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和表示作为单细胞实体培养的微生物或真核细胞系的其他此类术语是指可以或已经用作重组载体或其他转移DNA的接受者的细胞，并且包括已经转染的初始细胞的初始后代。
“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是当置于适当调控序列(或“控制元件”)的控制下时在体内被转录(在DNA的情况下)并且翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界可以由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。
典型的“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3')、用于优化翻译起始的序列(位于编码序列的5')和翻译终止序列。
术语“标记”和“可检测标记”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、稳定(非放射性)重同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”是指能够展现出可检测范围的荧光的物质或其部分。可以用于本发明的标记的具体例子包括但不限于放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、稳定(非放射性)重同位素(例如，13C或15N)、藻红蛋白、荧光素、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)、YPet、CyPet、喀斯喀特蓝(Cascade blue)、别藻蓝蛋白、Alexa染料(例如，Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 594、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 680和Alexa 750)、Atto染料(例如，Atto 488、Atto 532、Atto 550、Atto 565、Atto 590、Atto 610、Atto 620、Atto 635、Atto647、Atto 655和Atto 680)、菁染料(例如，Cy3、Cy5和Cy7)、TYE 563、TYE 665、TYE 705、TEX615、JOE、TET、HEX、TAMRA、ROX、罗丹明、丹酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺(luminol)、吖啶酯、生物素或其他链霉亲和素结合蛋白、磁珠、电子致密试剂、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、TagRFP、Dronpa、Padron、mApple、mCherry、rsCherry、rsCherryRev、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰基转移酶和脲酶。酶标签与其同源底物一起使用。与本发明的实践相关联的许多标准程序一样，技术人员将知道可以使用的其他标记。
II.实施本发明的模式
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于具体的配制品或工艺参数，因为这些当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案的目的，而不意图具有限制性。
虽然在本发明的实践中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的多种方法和材料，但本文描述了优选材料和方法。
本发明是基于在酵母蛋白的周质空间中展示重组蛋白的方法的开发。具体地，将重组蛋白连接到跨越细胞膜的跨膜结构域、位于酵母细胞膜的外表面上的细胞膜结合蛋白结构域、结合酵母细胞壁的内表面的蛋白质或周质蛋白，以便在酵母周质空间中展示蛋白质。还可以通过将重组蛋白连接到分泌信号来将重组蛋白靶向到周质。此外，目的靶蛋白可以在酵母中共表达，使得其被定位到质膜或周质空间，并且是所展示的蛋白质可及的。在具体实施方案中，发明人使用他们的酵母周质展示的方法来筛选结合人GPCR并调节其功能的抗体(参见实施例)。展示在酵母细胞的周质空间中的抗体足够接近以结合细胞膜中表达的GPCR。发明人还开发了一种通过将人GPCR与酵母信息素应答途径偶联使用周质展示针对拮抗剂和激动剂对GPCR进行高通量筛选的方法。
为了进一步理解本发明，下文关于酵母周质展示和使用其对蛋白质文库进行高通量筛选的方法提供了更详细的讨论。
A.酵母中重组蛋白的周质展示
在一方面，本发明涉及在酵母宿主细胞的周质空间中展示蛋白质。在一些实施方案中，酵母宿主细胞包含用于在酵母周质空间中展示的蛋白质、连接到有待在周质空间中展示的蛋白质的周质锚定蛋白以及定位在酵母宿主细胞的周质空间中的目的靶膜蛋白。在一些实施方案中，酵母宿主细胞可以用于确定有待在周质空间中展示的蛋白质是否特异性地结合目的靶膜蛋白或影响其功能。有待在酵母宿主细胞的周质空间中展示的蛋白质可以通过将重组蛋白连接到周质锚定蛋白来制备，所述周质锚定蛋白将重组蛋白定位到酵母细胞的周质空间。键联可以是共价的或非共价的。例如，重组蛋白可以在融合蛋白中共价连接到周质锚定蛋白。替代地，重组蛋白变体可以与周质锚定蛋白形成复合物，其中所述重组蛋白和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接。替代地，重组蛋白变体和周质锚定蛋白在复合物中通过非肽键共价连接。在一些实施方案中，所述非肽键是二硫键。有待在酵母宿主细胞的周质空间中展示的蛋白质还可以通过将有待展示的蛋白质连接到分泌信号来制备。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶氏酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属是酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的物种是酿酒酵母。
在另一方面，本发明涉及一种连接到周质锚定蛋白的抗体。在一些实施方案中，连接到周质锚定蛋白的抗体还包含另外的修饰、部分或相互作用蛋白。在一些实施方案中，所述另外的修饰是翻译后修饰。在一些实施方案中，所述部分是亲和标签、表位、标记等。在一些实施方案中，所述抗体定位到酵母宿主细胞周质空间。在一些实施方案中，当所述抗体在酵母宿主细胞中产生或被引入到酵母宿主细胞中时，所述抗体定位到酵母宿主细胞周质空间。在一些实施方案中，所述抗体连接到周质锚定蛋白，使得所述抗体被定位到周质空间。抗体与周质锚定蛋白的键联可以是共价的或非共价的。例如，抗体可以在融合蛋白中共价连接到周质锚定蛋白。替代地，抗体可以与周质锚定蛋白形成复合物，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接。替代地，抗体和周质锚定蛋白在复合物中通过非肽键共价连接。在一些实施方案中，所述非肽键是二硫键。还提供了包含如本文所述的抗体的酵母宿主细胞。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶氏酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属是酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的物种是酿酒酵母。
在另一方面，本发明涉及将抗体定位到酵母宿主细胞周质空间的方法，所述方法包括将所述抗体连接到周质锚定蛋白，使得所述抗体被定位到周质空间。在一些实施方案中，所述抗体连接到周质锚定蛋白，使得所述抗体被定位到周质空间。抗体与周质锚定蛋白的键联可以是共价的或非共价的。例如，抗体可以在融合蛋白中共价连接到周质锚定蛋白。替代地，抗体可以与周质锚定蛋白形成复合物，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接。替代地，抗体和周质锚定蛋白在复合物中通过非肽键共价连接。在一些实施方案中，所述非肽键是二硫键。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶氏酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属是酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的物种是酿酒酵母。
在另一方面，本发明涉及通过在酵母的周质空间中展示蛋白质针对特定结合或功能特征对蛋白质文库进行高通量筛选的方法。酵母周质展示文库可以通过将重组蛋白连接到周质锚定蛋白来制备，所述周质锚定蛋白将重组蛋白定位到酵母细胞的周质空间。键联可以是共价的或非共价的。例如，重组蛋白可以在融合蛋白中共价连接到周质锚定蛋白。替代地，重组蛋白变体可以与周质锚定蛋白形成复合物，其中所述重组蛋白和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接。替代地，重组蛋白变体和周质锚定蛋白在复合物中通过非肽键共价连接。在一些实施方案中，所述非肽键是二硫键。酵母周质展示文库还可以通过将重组蛋白连接到分泌信号来制备。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶氏酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的属是酵母属。在一些实施方案中，酵母宿主细胞的物种是酿酒酵母。
定位到周质空间可以各种方式来实现。在某些实施方案中，通过将重组蛋白连接到分泌信号来将重组蛋白定位到周质，所述分泌信号使重组蛋白被分泌到细胞外空间中。在某些实施方案中，周质锚定蛋白包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得连接的重组蛋白展示在所述周质中。例如，周质锚定蛋白可以包含信号序列，所述信号序列引导周质锚定蛋白和连接的重组蛋白向酵母宿主细胞周质的转运。优选地，周质锚定蛋白足够大而使得周质锚定蛋白和连接的重组蛋白保留在周质中。替代地，周质锚定蛋白可以是周质蛋白复合物的组分，其足够大而使得所述复合物在周质中的形成导致保留在周质中。在其他实施方案中，周质锚定蛋白包含跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域，所述膜结合蛋白结构域定位到细胞膜的外表面，使得连接的重组蛋白被伸出至周质中。例如，定位到质膜的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结构域可以用于此目的。在一个实施方案中，所述GPI-质膜锚定结构域是yapsin GPI质膜锚定结构域，诸如但不限于YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。在另一个实施方案中，周质锚定蛋白是结合细胞壁的内表面，使得所展示的蛋白质变体被伸出至周质中的蛋白质。在某些实施方案中，周质锚定蛋白和重组蛋白在融合蛋白变体中共价连接，并且周质锚定蛋白包含信号序列，所述信号序列引导融合蛋白向酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得融合的蛋白质变体展示在周质中。例如，周质锚定蛋白可以包含信号序列，所述信号序列引导融合蛋白向酵母宿主细胞周质的转运。优选地，周质锚定蛋白足够大而使得融合蛋白保留在周质中。替代地，周质锚定蛋白可以是周质蛋白复合物的组分，其足够大而使得所述复合物在周质中的形成导致融合蛋白保留在周质中。在其他实施方案中，周质锚定蛋白包含跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域，所述膜结合蛋白结构域定位到细胞膜的外表面，使得融合的蛋白质变体被伸出至周质中。例如，定位到质膜的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结构域可以用于此目的。在一个实施方案中，所述GPI-质膜锚定结构域是yapsin GPI质膜锚定结构域，诸如但不限于YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。在另一个实施方案中，周质锚定蛋白是结合细胞壁的内表面，使得所展示的蛋白质变体被伸出至周质中的蛋白质。在某些实施方案中，周质锚定蛋白是全长蛋白的保留定位到周质的能力的片段。
任何类型的蛋白质可以展示在酵母细胞的周质空间中，包括但不限于抗体、抗体模拟物、适体、抗原、酶、受体、转运蛋白、离子通道、激素、底物、激动剂、拮抗剂或配体。酵母周质展示文库呈递多种此类蛋白质，可以针对在目的靶分子的存在下的结合和/或生物活性对所述蛋白质进行筛选。如果定位在细胞外，则靶分子必须能够穿透酵母细胞壁以到达用于筛选的展示的蛋白质。在某些实施方案中，目的靶蛋白与展示的蛋白质变体在酵母细胞中在所展示的蛋白质变体可及的位置处(例如，对于展示的蛋白质变体而言足够接近以结合目的靶蛋白和/或调节其活性)共表达。例如，所述目的靶蛋白可以定位到酵母宿主细胞质膜或周质中在展示蛋白质变体的地方附近。具体地，此方法适用于定位到质膜的受体、离子通道、转运蛋白和其他膜蛋白。因此，酵母周质展示可以用于将蛋白质呈递到在与其天然环境基本上相似的环境中的靶膜蛋白。
包含在融合构建体中的任何多肽(包括周质锚定蛋白和展示的蛋白质变体)可以通过肽键彼此直接连接，或者可以通过中间的氨基酸序列或接头分开。接头氨基酸序列通常较短，例如20个或更少氨基酸(即，20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)。例子包括有利于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、组氨酸标签(Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、由甘氨酸和丝氨酸残基构成的接头(其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)、GSAT、SEG和Z-EGFR接头。接头可以包含限制性位点，其有助于克隆和操纵。其他合适的接头氨基酸序列对于本领域技术人员而言是清楚的。(参见例如，Argos(1990)J.Mol.Biol.211(4):943-958；Crasto等人(2000)Protein Eng.13:309-312；George等人(2002)Protein Eng.15:871-879；Arai等人(2001)Protein Eng.14:529-532；以及the Registry of StandardBiological Parts(partsregistry.org/Protein_domains/Linker)。
任选地，在融合构建体中可以包含标签。可以在本发明的实践中使用的标签包括但不限于His-标签、Strep-标签、TAP-标签、S-标签、SBP-标签、Arg-标签、钙调蛋白结合肽标签、纤维素结合结构域标签、DsbA标签、c-myc标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、FLAG标签、HAT-标签、麦芽糖结合蛋白标签、NusA标签和硫氧还蛋白标签。
B.编码周质锚定蛋白变体和靶蛋白的多核苷酸和文库构建
编码周质锚定蛋白变体和目的靶蛋白的多核苷酸可以任何数量的方式产生，所述方式全部是本领域熟知的。例如，多核苷酸可以使用本领域熟知的重组技术生成。本领域技术人员可以使用标准方法和本文的传授内容容易地确定编码所需的蛋白质的核苷酸序列。
可以基于已知的基因序列来设计寡核苷酸探针并且用于探测基因组或cDNA文库。然后可以使用标准技术和例如用于在全长序列的所需部分处截短基因的限制性酶来进一步分离具有所需序列的多核苷酸。类似地，可以使用已知的技术(诸如酚提取)从含有具有目的序列的多核苷酸的细胞和组织直接分离所述多核苷酸，并且对序列进行进一步操纵以产生所需的蛋白质变体。关于用于获得并分离DNA的技术的描述，参见例如Sambrook等人，同上。
还可以例如基于已知序列合成地产生编码蛋白质变体的序列。可以用适当密码子设计所需特定氨基酸序列的核苷酸序列。完整序列通常由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装并且组装成完整编码序列。参见例如，Edge(1981)Nature 292:756；Nambair等人(1984)Science 223:1299；Jay等人(1984)J.Biol.Chem.259:6311；Stemmer等人(1995)Gene 164:49-53。
重组技术易于用于克隆编码在要求保护的本发明中可用的蛋白质变体(例如，抗体)的序列，然后可以在体外通过置换一个或多个适当的碱基对对所述序列进行诱变处理，以产生所需氨基酸的密码子。这种变化可以包括少至一个碱基对，从而实现单一氨基酸的变化，或者可以涵盖若干碱基对变化。替代地，可以在低于错配双链体的解链温度的温度下使用与亲本核苷酸序列(通常是对应于RNA序列的cDNA)杂交的错配引物实现突变。可以通过将引物长度和碱基组成保持在相对较窄的限度内以及通过使突变体碱基保持位于中心，使得所述引物具有特异性。参见例如，Innis等人,(1990)PCR Applications:Protocolsfor Functional Genomics；Zoller和Smith,Methods Enzymol.(1983)100:468。使用DNA聚合酶、克隆的产物和含有突变DNA的克隆来实现引物延伸，通过分离引物延伸链进行衍生，并进行选择。选择可以使用突变体引物作为杂交探针来完成。所述技术还适用于生成多点突变。参见例如，Dalbie-McFarland等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79:6409。
展示文库的多样性取决于所使用的诱变方法。盒式诱变可以用于通过将诱变盒插入核酸中来快速生成大量突变(参见例如，Worrall(1994)Methods Mol.Biol.30:199-210,Kegler-Ebo等人(1994)Nucleic Acids Research.22(9):1593-1599)。此外，随机诱变也可以用于生成用于展示文库的大量变体。合适的随机诱变方法包括但不限于易错PCR、滚环易错PCR、化学诱变、在具有缺陷DNA修复途径的增变株中诱变、使用转座子系统的插入诱变或DNA改组(参见例如，McCullum等人(2010)Methods Mol.Biol.634:103-109,Fujii等人(2014)Methods Mol.Biol.1179:23-29,Muteeb(2010)Methods Mol.Biol.634:411-419,Bose(2016)Methods Mol.Biol.1373:111-115,Labrou(2010)Curr Protein Pept Sci.11(1):91-100,Wilson等人(2011)Methods Mol.Biol.765:359-371)。此类方法可以用于有效地生成具有对亲本核酸分子的修饰的大量变体。在一些实施方案中，使用本领域已知的方法构建含有至少106个，优选地至少108个，并且更优选地至少1010个具有独特序列的变体的DNA文库。
在一些实施方案中，通过从血液供体获得的B淋巴细胞克隆天然抗体来构建用于酵母周质展示的抗体文库。可以通过PCR扩增编码含有可变结构域互补决定区的抗体轻链和重链或其片段(例如，Fab)的核酸并且克隆到载体中。可以通过克隆到在一个开放阅读框中经由接头连接轻链和重链的载体中来生成ScFv抗体。血液供体可以是任何物种。在一些实施方案中，人血液供体用于生成人抗体的文库。在其他实施方案中，骆驼血液供体用于生成骆驼抗体的文库。骆驼抗体可以来源于例如单峰驼、双峰驼、美洲驼和羊驼。此类骆驼产生缺乏轻链的独特类型的抗体。这些重链抗体(HCAb)或其可变结构域片段(例如，单结构域抗体或纳米抗体)可以用于构建抗体文库(参见例如，Vincke等人(2012)MethodsMol.Biol.911:15-26,Krah等人(2016)Immunopharmacol.Immunotoxicol.38(1):21-8；通过引用并入本文)。
一旦分离和/或合成了蛋白质变体(例如，抗体)的编码序列，可以将它们克隆到任何合适的载体或复制子中用于在酵母中表达。“载体”是可以用于将目的核酸递送到细胞内部的物质组合物。多种载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔和的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。表达构建体可以在活细胞中复制，或者其可以合成地制备。出于本申请的目的，术语“表达构建体”、“表达载体”和“载体”可互换地用于以一般说明性意义显示本发明的应用，并且不意图限制本发明。
在某些实施方案中，编码目的多核苷酸的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”是指由细胞的合成机构或引入的合成机构识别的起始基因的特异性转录所需的DNA序列。术语启动子在此用于是指在RNA聚合酶I、II或III的起始位点周围聚簇的转录控制模块组。增强子元件可以与启动子结合使用来增加构建体的表达水平。在某些实施方案中，表达构建体包含“可操作地连接”到编码融合蛋白或目的靶蛋白的多核苷酸的启动子。如本文所用的术语“可操作地连接”或“在转录控制下”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向上，以控制通过RNA聚合酶进行的转录起始和融合蛋白或目的靶蛋白的表达。
通常，转录终止子/聚腺苷酸化信号也存在于表达构建体中。此类序列的例子包括但不限于来源于SV40的那些(如Sambrook等人，同上中所述)，以及牛生长激素终止子序列(参见例如，美国专利号5,122,458)。另外，5'-UTR序列可以与编码序列相邻放置，以便增强编码序列的表达。此类序列可以包括包含内部核糖体进入位点(IRES)的UTR。
包含IRES允许从载体翻译一个或多个开放阅读框。IRES元件吸引真核核糖体翻译起始复合物并促进翻译起始。参见例如，Kaufman等人,Nuc.Acids Res.(1991)19:4485-4490；Gurtu等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996)229:295-298；Rees等人,BioTechniques(1996)20:102-110；Kobayashi等人,BioTechniques(1996)21:399-402；以及Mosser等人,BioTechniques(1997 22 150-161。大量IRES序列是已知的并且包括来源于众多种病毒的序列，诸如来自小核糖核酸病毒诸如脑心肌炎病毒(EMCV)UTR的前导序列(Jang等人J.Virol.(1989)63:1651-1660)、脊髓灰质炎前导序列、甲型肝炎病毒前导序列、丙型肝炎病毒IRES、2型人鼻病毒IRES(Dobrikova等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(2003)100(25):15125-15130)、来自口蹄疫病毒的IRES元件(Ramesh等人,Nucl.Acid Res.(1996)24:2697-2700)、贾第虫病毒IRES(Garlapati等人,J.Biol.Chem.(2004)279(5):3389-3397)等。各种非病毒IRES序列也可在本文中使用，包括但不限于来自酵母的IRES序列以及人血管紧张素II 1型受体IRES(Martin等人,Mol.Cell Endocrinol.(2003)212:51-61)、成纤维细胞生长因子IRES(FGF-1IRES和FGF-2IRES，Martineau等人(2004)Mol.Cell.Biol.24(17):7622-7635)、血管内皮生长因子IRES(Baranick等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(12):4733-4738,Stein等人(1998)Mol.Cell.Biol.18(6):3112-3119,Bert等人(2006)RNA 12(6):1074-1083)以及胰岛素样生长因子2IRES(Pedersen等人(2002)Biochem.J.363(Pt 1):37-44)。这些元件易于在例如由Clontech(山景城，加利福尼亚州)、Invivogen(圣地亚哥，加利福尼亚州)、Addgene(剑桥，马萨诸塞州)和GeneCopoeia(罗克维尔，马里兰州)销售的质粒中商购获得。还参见IRESite：实验验证的IRES结构的数据库(iresite.org)。IRES序列可以包含在载体中，例如以从表达盒表达包含与目的靶蛋白组合的融合蛋白，所述融合蛋白包含与用于展示的蛋白质变体融合的周质锚定蛋白。
替代地，编码病毒T2A肽的多核苷酸可以用于允许从单一载体产生多种蛋白质产物。在多顺反子构建体中的编码序列之间插入2A接头肽。自切割的2A肽允许以等摩尔水平产生从多顺反子构建体共表达的蛋白质。可以使用来自各种病毒的2A肽，包括但不限于来源于口蹄疫病毒、马甲型鼻炎病毒、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)和猪捷申病毒-1的2A肽。参见例如，Kim等人(2011)PLoS One 6(4):e18556,Trichas等人(2008)BMC Biol.6:40,Provost等人(2007)Genesis 45(10):625-629,Furler等人(2001)GeneTher.8(11):864-873；通过引用以其整体并入本文。
在某些实施方案中，表达构建体包含适用于转化酵母细胞的质粒。酵母表达质粒通常含有酵母特异性复制起点(ORI)和营养选择标记(例如，HIS3、URA3、LYS2、LEU2、TRP1、MET15、ura4+、leu1+、ade6+)、抗生素选择标记(例如，aphA1或ble)、荧光标记(例如，mCherry、绿色荧光蛋白)、生物发光标记(例如，萤光素酶)或用于选择转化的酵母细胞的其他标记。酵母质粒还可以含有允许在细菌宿主(例如，大肠杆菌(E.coli))与酵母细胞之间穿梭的组分。可获得多种不同类型的酵母质粒，包括酵母整合质粒(YIp)，其缺乏ORI并且通过同源重组整合到宿主染色体中；酵母复制质粒(YRp)，其含有自主复制序列(ARS)并且可以独立地复制；酵母着丝粒质粒(YCp)，其为含有一部分ARS和一部分着丝粒序列(CEN)的低拷贝载体；以及酵母游离质粒(YEp)，其为包含来自2微米圆形物(天然酵母质粒)的片段的高拷贝数质粒，所述质粒允许每个细胞稳定繁殖50或更多个拷贝。
包含调控序列也可以是希望的，这允许相对于宿主细胞的生长调控蛋白质序列的表达。此类调控序列是本领域技术人员已知的，并且例子包括响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)致使基因表达打开或关闭的那些。例如，信息素诱导型启动子(诸如PRM1或FUS2启动子)可以用于使转录依赖于信息素信号传导途径的激活。控制序列和其他调控序列可以在插入到载体中之前连接到编码序列。替代地，编码序列可以直接克隆到已经含有控制序列和适当的限制性位点的表达载体中。
在一些情况下，可能需要修饰编码序列，使得它可以以适当的取向附接至控制序列；即，维持正确的阅读框。突变体或类似物可以通过使编码蛋白质的序列的一部分缺失、通过插入序列和/或通过取代序列内一个或多个核苷酸来制备。用于修饰核苷酸序列的技术(诸如定点诱变)是本领域技术人员熟知的。参见例如，Sambrook等人,同上；DNACloning,第I和II卷,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上。
在一个实施方案中，将编码蛋白质变体的重组多核苷酸克隆到周质靶向表达载体中，所述周质靶向表达载体包含：a)编码信号肽的多核苷酸；b)适于在编码信号肽的多核苷酸之后框内插入编码蛋白质变体的多核苷酸的克隆位点；c)编码糖磷脂酰肌醇(GPI)质膜锚定结构域的多核苷酸，所述多核苷酸的定位使得所述载体能够产生包含信号肽和与GPI质膜锚定结构域融合的蛋白质变体的融合蛋白；以及d)可操作地连接到编码融合蛋白的序列的启动子。在某些实施方案中，所述GPI质膜锚定结构域是yapsin GPI质膜锚定结构域，诸如但不限于YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。周质靶向表达载体还可以包含编码接头的多核苷酸，所述接头定位于所述克隆位点与编码GPI质膜锚定结构域的多核苷酸之间。所述克隆位点可以包括一个或多个限制性位点。周质靶向表达载体还可以包含可选择标记。
在一些实施方案中，将亲和标签、表位、标记等添加到蛋白质变体以允许测量酵母细胞中的总展示水平。如本文所用，术语“亲和标签”是指生物分子，诸如多肽区段，其可以附接到第二生物分子以提供第二生物分子的纯化或检测，或提供用于将第二分子附接至衬底的位点。亲和标签的例子包括聚组氨酸段、蛋白质A(Nilsson等人(1985)EMBO J.4:1075；Nilsson等人(1991)Methods Enzymol.198:3)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson(1988)Gene67:31)、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等人,(1985)PNAS USA 82:7952)、物质P、FLAG肽(Hopp等人(1988)Biotechnology 6:1204)、链霉亲和素结合肽或其他抗原表位或结合结构域等(Ford等人(1991)Protein Expression and Purification 2:950)，所有上述文献通过引用并入本文。如本文所用，“标记”是分子或原子，其可以与生物分子缀合以使得生物分子或生物分子的一种形式(诸如缀合物)可检测或可测量。标记的例子包括荧光剂、生物发光蛋白、光敏剂、放射性同位素、顺磁离子、螯合剂等。
表达载体用于转化适当的酵母宿主细胞。多种酵母宿主是本领域已知的，包括但不限于树生酵母(Saccharomyces arboricolus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)、里约酵母(Saccharomyces cariocanus)、卡里奥库斯酵母(Saccharomyces cariocus)、酿酒酵母、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、大连糖酵母(Saccharomyces dairenensis)、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、佛罗伦糖化酵母(Saccharomyces florentinus)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、库德里亚夫酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、马提尼酒糖酵母(Saccharomyces martiniae)、米卡塔酵母(Saccharomyces mikatae)、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、斯潘思龙酵母(Saccharomyces spencerorum)、图列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、左娜图酵母(Saccharomyces zonatus)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、艾斯卡乐菲假丝酵母(Candida ascalaphidarum)、暗牧菲克假丝酵母(Candidaamphixiae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、耐银假丝酵母(Candida argentea)、大西洋假丝酵母(Candida atlantica)、大气假丝酵母(Candida atmosphaerica)、耳道假丝酵母菌(Candida auris)、蟑螂假丝酵母(Candida blattae)、凤梨假丝酵母(Candidabromeliacearum)、嗜果实假丝酵母(Candida carpophila)、卡瓦哈尔假丝酵母(Candidacarvajalis)、天牛假丝酵母(Candida cerambycidarum)、果生假丝酵母(Candidachauliodes)、延胡索假丝酵母(Candida corydali)、多西假丝酵母(Candida dosseyi)、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)、Candida ergatensis、果实假丝酵母(Candidafructus)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、发酵假丝酵母(Candida fermentati)、吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、吉利蒙假丝酵母(Candida haemulonii)、扁平云假丝酵母(Candida humilis)、昆虫门假丝酵母(Candida insectamens)、昆虫假丝酵母(Candida insectorum)、中型假丝酵母(Candida intermedia)、杰弗里西假丝酵母(Candida jeffresii)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、煤油假丝酵母(Candidakeroseneae)、克鲁斯氏假丝酵母(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candidalusitaniae)、莱克苏菲拉假丝酵母(Candida lyxosophila)、麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)、海生假丝酵母(Candida marina)、膜醭假丝酵母(Candida membranifaciens)、蒙奇假丝酵母(Candida mogii)、橄榄假丝酵母(Candida oleophila)、俄勒冈假丝酵母(Candida oregonensis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、桔假丝酵母(Candidaquercitrusa)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、清酒假丝酵母(Candida sake)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatea)、泰姆诺珂假丝酵母(Candida temnochilae)、纤维假丝酵母(Candida tenuis)、蛾假丝酵母(Candida theae)、忍耐假丝酵母(Candida tolerans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、土屋假丝酵母(Candida tsuchiyae)、中难假丝酵母(Candida sinolaborantium)、大豆假丝酵母(Candida sojae)、萨卜哈释假丝酵母(Candida subhashii)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、阿坝塔苯斯假丝酵母(Candida ubatubensis)、增普琳假丝酵母(Candidazemplinina)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、黑迪氏毕赤酵母(Pichia heedii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、挪威毕赤酵母(Pichianorvegensis)、奥默毕赤酵母(Pichia ohmeri)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、亚膜毕赤酵母(Pichia subpelliculosa)、海泥克鲁维酵母(Kluyveromyces aestuarii)、非洲克鲁维酵母(Kluyveromyces africanus)、杆状孢子克鲁维酵母(Kluyveromyces bacillisporus)、蟑螂克鲁维酵母(Kluyveromycesblattae)、多勃赞斯基克鲁维酵母(Kluyveromyces dobzhanskii)、湖北克鲁维酵母(Kluyveromyces hubeiensis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、洛德克鲁维酵母(Kluyveromyces lodderae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、非发酵克鲁维酵母(Kluyveromyces nonfermentans)、云杉克鲁维酵母(Kluyveromyces piceae)、中华克鲁维酵母(Kluyveromyces sinensis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、克鲁雄酵母(Kluyveromyces waltii)、威客克鲁维酵母(Kluyveromyceswickerhamii)、耶氏克鲁维酵母(Kluyveromyces yarrowii)、布布拉耶氏酵母(Yarrowiabubula)、畸形耶氏酵母(Yarrowia deformans)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、猪耶氏酵母(Yarrowia porcina)和屋久耶氏酵母(Yarrowia yakushimensis)，其可用于本发明的表达构建体。在一些实施方案中，所述酵母是酵母属物种。在一些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母。
为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体递送到酵母细胞中。此递送可以使用本领域熟知的用于转化酵母细胞的实验室程序在体外完成，所述实验室程序诸如原生质球转化、碱性离子处理(例如，Cs+或Li+)、电穿孔、跨界缀合(trans-kingdomconjugation)、电穿孔以及生物弹道学和玻璃珠方法(参见例如，Kawai等人(2010)Bioeng.Bugs.1(6):395-403,Gietz等人(1995)Yeast 11(4):355-360,Gietz等人(2007)Nat.Protoc.2(1):38-41,Hinnen等人(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929-1933,Avery等人(1995)Mol.Med.1(4):344-365,Ito等人(1983)J.Bacteriol.153:163-168,Johnston等人(1988)Science 240:1538-1541,Dohmen等人(1991)Yeast 7(7):691-246,Hayama等人(2002)J.Biosci.Bioeng.94(2):166-171,以及Wang等人(2001)Crit.Rev.Biotechnol.21(3):177-218；通过引用并入本文)。
一旦表达构建体被递送到细胞中，编码目的基因的核酸就可以在不同位点处定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可以经由同源重组稳定地整合到细胞的基因组中，此整合可以处于同源位置和取向(基因替换)、在基因内(基因破坏)或在随机的非特异性位置(基因增强)。破坏基因的在靶基因座处整合构建体可能是可接受的，只要所述基因破坏不干扰细胞生长或酵母周质展示文库的筛选(例如，如果在筛选中使用，避免信息素应答的破坏)。在又另外的实施方案中，核酸可以作为DNA的单独游离区段稳定维持在细胞中。此类核酸区段或“游离体”编码足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步的维持和复制的序列。将表达构建体递送到细胞中的方式以及核酸保持在细胞中的位置取决于所采用的表达构建体的类型。
在某些实施方案中，表达构建体可以仅由裸重组DNA或质粒组成。构建体的转移可以通过以上提及的物理地或化学地将细胞膜渗透化处理的任何方法来进行。
在又另一个实施方案中，裸DNA表达构建体可以通过粒子轰击来转移到细胞中。此方法依赖于将DNA包被的微射弹加速至高速，以允许它们在不杀伤细胞的情况下穿过酵母细胞壁和细胞膜并进入细胞的能力(Armaleo等人(1990)Curr.Genet.17(2):97-103)。已经开发了若干用于加速小粒子的装置。一种这类装置依赖于高压放电来生成电流，电流进而提供动力(Yang等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9568-9572)。微射弹可以由生物惰性物质(诸如钨或金珠)组成。
在一个实施方案中，生成编码蛋白质变体的线性DNA分子的集合。并非在转化之前将线性DNA分子克隆到载体中，而是用空载体与编码蛋白质变体的线性DNA分子的集合一起转化酵母细胞，随后所述线性DNA分子例如通过酵母宿主细胞中的同源重组，在体内整合到所述载体中。
C.试剂盒
试剂盒可以包括如本文所述的酵母周质展示文库或用于制备酵母周质展示文库的药剂(诸如用于克隆编码蛋白质变体的核酸以产生连接到周质锚定蛋白的蛋白质变体的合适载体)、酵母细胞、转染剂、适用于生长酵母细胞的培养基、用于细胞的阳性和阴性选择的药剂，以及所需要的其他试剂。试剂盒中通常将包括用于生产和/或筛选如本文所述的酵母周质展示文库的说明书(例如，书面的、CD-ROM、DVD、蓝光、闪存驱动器、数字下载等)。
试剂盒可以包括如本文所述的酵母周质展示文库或用于制备酵母周质展示文库的药剂(诸如用于克隆编码蛋白质变体的核酸以产生与周质锚定蛋白的融合体的合适载体)、酵母细胞、转染剂、适用于生长酵母细胞的培养基、用于细胞的阳性和阴性选择的药剂，以及所需要的其他试剂。试剂盒中通常将包括用于生产和/或筛选如本文所述的酵母周质展示文库的说明书(例如，书面的、CD-ROM、DVD、蓝光、闪存驱动器、数字下载等)。
在一个实施方案中，试剂盒包括周质靶向表达载体，所述表达载体包含：a)编码信号肽的多核苷酸；b)适于在编码信号肽的多核苷酸之后框内插入编码蛋白质变体(例如，抗体)的多核苷酸的克隆位点；c)编码糖磷脂酰肌醇(GPI)质膜锚定结构域的多核苷酸，所述多核苷酸的定位使得所述载体能够产生包含信号肽和与GPI质膜锚定结构域融合的蛋白质变体的融合蛋白；以及d)可操作地连接到编码融合蛋白的序列的启动子。在另一个实施方案中，所述信号肽包含前原α因子信号序列。在某些实施方案中，所述GPI质膜锚定结构域是yapsin GPI质膜锚定结构域，诸如但不限于YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7yapsin GPI质膜锚定结构域。在另一个实施方案中，所述周质靶向表达载体还包含编码接头的多核苷酸，其中所述编码接头的多核苷酸定位在克隆位点与编码GPI质膜锚定结构域的多核苷酸之间。所述接头还可以包含标签。在另一个实施方案中，所述周质靶向表达载体还包含可选择标记。在另一个实施方案中，所述克隆位点包含一个或多个限制性位点。
在另一个实施方案中，试剂盒包括酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，每个酵母宿主细胞包含：a)融合蛋白，其包含与用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的蛋白质变体(例如，抗体)融合的周质锚定蛋白，其中所展示的蛋白质变体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种蛋白质变体；b)目的靶G蛋白偶联受体(GPCR)，其中所述目的靶GPCR定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是酵母宿主细胞周质空间中展示的蛋白质变体可及的；以及c)能够被GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。在某些实施方案中，所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。例如，所述酵母Gα亚基可以属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。在嵌合Gα亚基中，酵母Gα亚基的至少5个C末端残基可以被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在一些实施方案中，酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在另一个实施方案中，所述嵌合Gα亚基包含酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。在某些实施方案中，哺乳动物GPCR是小鼠GPCR。在某些实施方案中，所述哺乳动物GPCR是选自以下的人GPCR：CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR和AT1R。
在另一个实施方案中，试剂盒包括酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含：多个酵母宿主细胞，每个酵母宿主细胞包含融合蛋白，所述融合蛋白包含与用于展示的蛋白质变体融合的周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得融合蛋白保留在周质中，并且所展示的蛋白质变体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得多个酵母宿主细胞展示多种蛋白质变体。
在另一个实施方案中，试剂盒包括酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含：多个酵母宿主细胞，每个酵母宿主细胞包含融合蛋白，所述融合蛋白包含与目的靶膜蛋白连接的到用于展示的蛋白质变体，其中所展示的蛋白质变体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得多个酵母宿主细胞展示具有目的靶膜蛋白的多种蛋白质变体。
D.应用
本发明可以广泛地应用于筛选执行有用的或所需的功能(包括结合、催化、组装、转运等)的蛋白质。例如，酵母周质展示可以用于鉴定受体的激动剂和拮抗剂，对治疗性蛋白质和抗体进行工程化，鉴定蛋白质-蛋白质相互作用以及表位定位。
酵母周质展示尤其非常适于针对结合靶蛋白和/或调节其功能的候选物筛选蛋白质文库，所述靶蛋白是膜蛋白，诸如受体、离子通道或转运蛋白。将蛋白质定位到膜使得所述蛋白质是周质空间中展示的蛋白质变体可及的(例如，对于展示的蛋白质变体而言足够接近以结合目的靶蛋白)。
在某些实施方案中，所述目的靶蛋白的激活增加所述酵母宿主细胞的生长。在这种情况下，可以通过在培养基中培养所述酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集来针对所述目的靶蛋白的激动剂筛选所述酵母周质展示文库，其中所述培养基中酵母宿主细胞的生长指示所述酵母宿主细胞中展示的蛋白质变体是所述目的靶蛋白的激动剂。
在其他实施方案中，所述目的靶蛋白的激活降低所述酵母宿主细胞的生长。在这种情况下，可以通过在培养基中培养所述酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集来针对所述目的靶蛋白的拮抗剂筛选所述酵母周质展示文库，其中所述培养基中酵母宿主细胞的生长指示所述酵母宿主细胞中展示的蛋白质变体是所述目的靶蛋白的拮抗剂。
在某些实施方案中，每个酵母宿主细胞还包含报告系统，所述报告系统包含可操作地连接到当激活目的靶蛋白时被激活的诱导型启动子的报告基因，以便允许检测在所展示的蛋白质变体与目的靶蛋白结合时目的靶蛋白的活性增加或降低。例如，所述报告基因可以是营养标记(例如，HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1)、抗生素抗性标记(例如，赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素诸如遗传霉素(例如，aphA1)、zeocin(例如，ble)、潮霉素B、诺尔斯菌素或双丙氨膦)、荧光标记(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白)、生物发光标记(例如，萤光素酶或水母发光蛋白)或反向可选择标记(例如，CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK)。
例如，阳性选择(即，针对报告基因表达的激活的选择)可以用于检测所展示的蛋白质变体与目的靶膜蛋白结合时目的靶膜蛋白的活性增加。可以例如通过营养缺乏的选择培养基中酵母宿主细胞的生长来检测营养标记的表达。可以例如通过包含抗生素的选择培养基中酵母宿主细胞的生长来检测抗生素抗性标记的表达。可以例如通过酵母宿主细胞发射的荧光来检测荧光标记的表达。可以例如通过酵母宿主细胞发射的生物发光来检测生物发光标记的表达。
替代地，反向选择(即，针对报告基因表达的丧失的基于生长的选择)可以用于检测所展示的蛋白质变体与目的靶膜蛋白结合时目的靶膜蛋白的活性降低。反向可选择标记可以通过诱导细胞凋亡、将非毒性药物转化为毒性化合物或将毒性分子转运到细胞中来杀伤细胞。反向选择可以通过在包含选择性地杀伤表达反向可选择标记的细胞的药剂的培养基中培养酵母宿主细胞来进行。示例性反向可选择标记包括CAN1(用刀豆氨酸进行反向选择)、URA3(用5-氟-乳清酸(5-FOA)进行反向选择)、MET15(用甲基汞进行反向选择)、TRP1(用5-氟邻氨基苯甲酸(5-FAA)进行反向选择)以及人疱疹病毒胸苷激酶TK(用氟尿苷(FUDR)进行反向选择)。
具体地，酵母周质展示文库可以用于筛选结合GPCR并调节其功能的抗体。在一些实施方案中，酵母宿主细胞中的GPCR被哺乳动物GPCR，例如人GPCR替换。在一些实施方案中，酵母宿主细胞表达哺乳动物GPCR(例如人GPCR)和内源性酵母GPCR。在一些实施方案中，使用报告系统来鉴定拮抗剂和激动剂，所述报告系统将GPCR对所展示的抗体的结合的应答与酵母信息素分泌水平偶联(参见实施例)。出于此目的，酵母宿主细胞可以进行基因修饰以表达能够被GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。在某些实施方案中，所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。例如，所述酵母Gα亚基可以属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。在嵌合Gα亚基中，酵母Gα亚基的至少5个C末端残基可以被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在一些实施方案中，酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得嵌合Gα亚基能够被哺乳动物GPCR激活。在另一个实施方案中，所述嵌合Gα亚基包含酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。示例性哺乳动物Gα亚基包括Gα-S、Gα-I、Gα-O、Gα-T、Gα-Z、Gα-Q、Gα-11、Gα-12、Gα-13和转导蛋白。
具体地，Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3或Δmat酵母菌株可用于筛选GPCR的拮抗剂和激动剂。Δmat菌株可以包含例如缺失或失活的MATα基因座或者缺失或失活的MATa基因座。酵母宿主细胞还可以包含经修饰的CLN3蛋白，所述经修饰的CLN3蛋白包含与野生型CLN3蛋白相比增加所述酵母宿主细胞中CLN3的丰度的C末端截短。例如，经修饰的CLN3蛋白可以至少保留野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-387或1-408，或这些范围内任何数量的N末端氨基酸，诸如1-388、1-389、1-390、1-391、1-392、1-393、1-394、1-395、1-396、1-397、1-398、1-399、1-400、1-401、1-402、1-403、1-404、1-405、1-406、1-407或1-408，其中所述C末端截短包括野生型CLN3蛋白的剩余残基的全部或一些的缺失。用于制备周质展示文库的酵母宿主细胞可以是单倍体或二倍体。被设计用于拮抗剂和激动剂选择的示例性酵母菌株分别在实施例2和5中描述。
在某些实施方案中，所述酵母宿主细胞是FAR1菌株，其中通过充当结合并抑制酵母宿主细胞中的GPCR的拮抗剂的抗体对信息素应答的抑制导致细胞周期阻滞停止和酵母宿主细胞生长。在其他实施方案中，酵母宿主细胞是Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子，其中通过充当结合并激活酵母宿主细胞中的GPCR的激动剂的抗体对信息素应答的激活导致报告基因的表达增加。
来自任何物种的任何类型的GPCR可以使用如本文所述的周质展示来筛选。在一些实施方案中，目的靶GPCR是哺乳动物GPCR(例如，来自人或非人灵长类动物、啮齿类动物、实验室动物、家畜)。例如，哺乳动物GPCR可以是人GPCR(例如，CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR和AT1R)。目的靶GPCR可以具有组成型非配体依赖性活性。替代地，可以添加配体以在筛选激动剂或拮抗剂期间激活目的靶GPCR。在一些实施方案中，酵母宿主细胞表达目的靶GPCR(例如目的人GPCR)和内源性酵母GPCR。
在一些实施方案中，蛋白质变体是抗体。可以通过本文所述的方法使用酵母周质展示筛选任何类型抗体，包括单克隆抗体、杂合抗体、改变的抗体、嵌合抗体和人源化抗体以及：杂合(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等人(1991)Nature 349:293-299；和美国专利号4,816,567)；F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异二聚体，参见例如，Inbar等人(1972)Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662；以及Ehrlich等人(1980)Biochem 19:4091-4096)；单链Fv分子(sFv)(参见例如，Huston等人(1988)Proc Natl Acad Sci USA85:5879-5883)；纳米抗体或单结构域抗体(sdAb)(参见例如，Wang等人(2016)Int JNanomedicine 11:3287-3303,Vincke等人(2012)Methods Mol Biol 911:15-26；二聚和三聚抗体片段构建体；微型抗体(参见例如，Pack等人(1992)Biochem 31:1579-1584；Cumber等人(1992)J Immunology 149B:120-126)；人源化抗体分子(参见例如，Riechmann等人(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyan等人(1988)Science 239:1534-1536；以及英国专利公开号GB 2,276,169，1994年9月21日公开)；以及从此类分子获得的任何功能片段，其中此类片段保留亲本抗体分子的特异性结合特性。
在其他实施方案中，蛋白质变体是适体。适体可以从组合文库分离并且通过定向突变或重复轮次的诱变和选择来改进。关于生产适体的方法的描述，参见例如，Aptamers:Tools for Nanotherapy and Molecular Imaging(R.N.Veedu编,Pan Stanford,2016),Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methods and Protocols(Methods in MolecularBiology,G.Mayer编,Humana Press,2009),Aptamers Selected by Cell-SELEX forTheranostics(W.Tan,X.Fang编,Springer,2015),Cox等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9(10):2525-2531；Cox等人(2002)Nucleic Acids Res.30(20):e108,Kenan等人(1999)Methods Mol.Biol.118:217-231；Platella等人(2016)Biochim.Biophys.Acta Nov16pii:S0304-4165(16)30447-0,以及Lyu等人(2016)Theranostics 6(9):1440-1452；通过引用以其整体并入本文。
在又其他的实施方案中，蛋白质变体是抗体模拟物。可以使用任何类型的抗体模拟物，包括但不限于亲合体分子(Nygren(2008)FEBS J.275(11):2668-2676)、affilin(Ebersbach等人(2007)J.Mol.Biol.372(1):172-185)、affimer(Johnson等人(2012)Anal.Chem.84(15):6553-6560)、affitin(Krehenbrink等人(2008)J.Mol.Biol.383(5):1058-1068)、α体(Desmet等人(2014)Nature Communications 5:5237)、anticalin(Skerra(2008)FEBS J.275(11):2677-2683)、avimer(Silverman等人(2005)Nat.Biotechnol.23(12):1556-1561)、darpin(Stumpp等人(2008)Drug Discov.Today 13(15-16):695-701)、fynomer(Grabulovski等人(2007)J.Biol.Chem.282(5):3196-3204)、单抗体(Koide等人(2007)Methods Mol.Biol.352:95-109)。
此外，可以通过酵母周质展示进行多轮诱变和筛选来进行定向进化，以针对以高亲和力结合目的靶蛋白的蛋白质变体(例如，抗体)富集文库。定向进化对于改进具有所需功能活性但结合亲和力较弱的候选物的结合特征可以特别有用。
III.示例性实施方案
本文所提供的实施方案包括：
1.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；
b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；以及
c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
2.根据实施方案1所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
3.根据实施方案1所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
5.根据实施方案1-3中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
6.根据实施方案5所述的酵母周质展示文库，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
7.根据实施方案6所述的酵母周质展示文库，其中所述GPI-质膜锚定结构域是yapsin GPI质膜锚定结构域。
8.根据实施方案7所述的酵母周质展示文库，其中所述yapsin GPI质膜锚定结构域是YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。
9.根据实施方案2所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
10.根据实施方案3所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面的将所述融合蛋白伸出至所述周质中的蛋白质。
11.根据实施方案2所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
12.根据实施方案3所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述融合蛋白保留在所述周质中。
13.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体，其中所述抗体连接到信号序列，所述信号序列引导所述抗体向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述酵母宿主细胞周质空间中；以及
b)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的酵母周质展示文库，其还包含报告系统，所述报告系统包含可操作地连接到当激活所述目的靶膜蛋白时被激活的诱导型启动子的报告基因，以便允许检测在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性增加或降低。
15.根据实施方案14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
16.根据实施方案15所述的酵母周质展示文库，其中所述营养标记选自HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1。
17.根据实施方案15所述的酵母周质展示文库，其中所述抗生素抗性标记赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素选自遗传霉素、zeocin、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦。
18.根据实施方案15所述的酵母周质展示文库，其中所述荧光标记选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。
19.根据实施方案15所述的酵母周质展示文库，其中所述生物发光标记是萤光素酶或水母发光蛋白。
20.根据实施方案15所述的酵母周质展示文库，其中所述反向可选择标记选自CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK。
21.根据实施方案14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性增加可通过阳性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
22.根据实施方案14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是反向可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性降低可通过阴性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
24.根据实施方案23所述的酵母周质展示文库，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
25.根据实施方案24所述的酵母周质展示文库，其中所述GPCR是外源性GPCR。
26.根据实施方案25所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞还包含内源性GPCR。
27.根据实施方案25或26所述的酵母周质展示文库，其还包含能够被所述外源性GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
28.根据实施方案27所述的酵母周质展示文库，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
29.根据实施方案28所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
30.根据实施方案25-29中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述外源性GPCR是哺乳动物GPCR。
31.根据实施方案30所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
32.根据实施方案31所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
33.根据实施方案31或32所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物Gα亚基选自Gα-S、Gα-I、Gα-O、Gα-T、Gα-Z、Gα-Q、Gα-11、Gα-12、Gα-13和转导蛋白。
34.根据实施方案28-33中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述嵌合Gα亚基包含所述酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。
35.根据实施方案30-34中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物GPCR是人GPCR。
36.根据实施方案35所述的酵母周质展示文库，其中所述人GPCR选自CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR和AT1R。
37.根据实施方案24-36中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的GPCR靶膜蛋白具有组成型非配体依赖性活性。
38.根据实施方案24-37中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的GPCR靶膜蛋白的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
39.根据实施方案24-36中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的GPCR靶膜蛋白的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白包含增加或降低其活性的突变。
42.根据实施方案1-40中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3或Δmat菌株。
43.根据实施方案42所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是包含缺失或失活的MATα基因座或者缺失或失活的MATa基因座的Δmat菌株。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞还包含经修饰的CLN3蛋白，所述经修饰的CLN3蛋白包含与野生型CLN3蛋白相比增加所述酵母宿主细胞中CLN3的丰度的C末端截短。
45.根据实施方案44所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-387。
46.根据实施方案44所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-408。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是单倍体或二倍体酵母宿主细胞。
48.一种制备根据实施方案1所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：
a)提供第一多个编码用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体的重组多核苷酸，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；
b)提供编码所述周质锚定蛋白的第二重组多核苷酸，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；
c)用所述第一多个重组多核苷酸和所述第二重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；
d)用编码所述目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及
e)在允许所述抗体、所述周质锚定蛋白和所述目的靶膜蛋白表达的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在所述周质空间中展示不同抗体，并且所述目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生根据实施方案1所述的酵母周质展示文库。
49.根据实施方案48所述的方法，其中编码所述抗体的所述重组多核苷酸或编码所述周质锚定蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸通过表达载体提供。
50.根据实施方案48所述的方法，其中编码所述抗体的所述重组多核苷酸或编码所述周质锚定蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
51.一种制备根据实施方案3所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：
a)提供多个编码融合蛋白的重组多核苷酸，其中每个重组多核苷酸编码不同的融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到用于展示的不同抗体的周质锚定蛋白；
b)用所述多个编码所述融合蛋白的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞；
c)用编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及
d)在允许所述融合蛋白和所述目的靶膜蛋白表达的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在周质空间中展示不同抗体，并且所述目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生根据实施方案3所述的酵母周质展示文库。
52.根据实施方案51所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述重组多核苷酸或编码所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸通过表达载体提供。
53.根据实施方案51所述的方法，其中编码所述融合蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
54.根据实施方案48-53中任一项所述的方法，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
56.根据实施方案48-55中任一项所述的方法，其还包括将编码能够被所述GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到所述多个酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
58.根据实施方案57所述的方法，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
59.根据实施方案57或58所述的方法，其中所述外源性Gα亚基是哺乳动物Gα亚基。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
62.根据实施方案55-61中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的靶GPCR的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
63.根据实施方案55-61中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述GPCR的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
64.一种针对调节目的靶膜蛋白的活性的抗体筛选根据实施方案14所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在选择培养基中培养根据实施方案14所述的酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集；以及检测报告基因的表达，其中所述报告基因的表达增加指示所述抗体增加所述目的靶膜蛋白的活性，并且所述报告基因的表达减少指示所述抗体降低所述目的靶膜蛋白的活性。
65.根据实施方案64所述的方法，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
66.根据实施方案65所述的方法，其还包括针对所述营养标记的表达进行阳性选择，其中营养缺乏选择培养基中所述酵母宿主细胞的生长指示所述目的靶膜蛋白被激活。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述营养标记是HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1。
68.根据实施方案65所述的方法，其还包括针对所述抗生素抗性标记的表达进行阳性选择，其中包含抗生素的选择培养基中所述酵母宿主细胞的生长指示所述目的靶膜蛋白被激活。
69.根据实施方案68所述的方法，其中所述抗生素抗性标记赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素选自遗传霉素、zeocin、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦。
70.根据实施方案65所述的方法，其还包括针对所述荧光标记的表达进行阳性选择，其中检测到由所述酵母宿主细胞发射的荧光指示所述目的靶膜蛋白被激活。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述荧光标记选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。
72.根据实施方案65所述的方法，其还包括针对所述生物发光标记的表达进行阳性选择，其中检测到由所述酵母宿主细胞发射的生物发光指示所述目的靶膜蛋白被激活。
73.根据实施方案72所述的方法，其中所述生物发光标记是萤光素酶或水母发光蛋白。
74.根据实施方案65所述的方法，其还包括针对所述反向可选择标记的表达进行阴性选择，其中在所展示的抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性降低可通过培养基中所述酵母宿主细胞的生长来检测，所述培养基包含针对表达所述反向可选择标记的细胞进行选择的药剂。
75.根据实施方案74所述的方法，其中所述反向可选择标记选自CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK。
76.一种针对调节目的靶GPCR的活性的抗体筛选根据实施方案27所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在培养基中培养根据实施方案27所述的酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集，其中与不具有展示在周质空间中的抗体的对照酵母宿主细胞相比在至少一个酵母宿主细胞中检测到信息素应答的激活或抑制指示所述至少一个酵母宿主细胞中所展示的抗体结合所述GPCR并调节所述GPCR的活性。
77.根据实施方案76所述的方法，其中所述目的靶GPCR是人GPCR。
78.根据实施方案77所述的方法，其还包括使所述人GPCR与配体接触。
79.根据实施方案78所述的方法，其中所述GPCR具有组成型非配体依赖性活性。
80.根据实施方案76-79中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是FAR1菌株，其中通过充当结合并抑制所述酵母宿主细胞中的所述GPCR的拮抗剂的抗体对所述信息素应答的抑制导致细胞周期阻滞停止和所述酵母宿主细胞生长。
81.根据实施方案76-79中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子，其中通过充当结合并激活所述酵母宿主细胞中的所述GPCR的激动剂的抗体对所述信息素应答的激活导致所述报告基因的表达增加。
82.根据实施方案73所述的方法，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
83.根据实施方案1-82中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。
84.根据实施方案83所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
85.根据实施方案84所述的方法，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母。
86.一种酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，
b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；以及
c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
87.根据实施方案86所述的酵母宿主细胞，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
88.根据实施方案86所述的酵母宿主细胞，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
89.根据实施方案86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
90.根据实施方案86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
91.根据实施方案86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
92.根据实施方案86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
93.根据实施方案86-92中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
94.根据实施方案93所述的酵母宿主细胞，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
95.根据实施方案86-94中任一项所述的酵母宿主细胞，其还包括将编码能够被所述GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到所述酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
96.根据实施方案95所述的酵母宿主细胞，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
97.根据实施方案96所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
98.根据实施方案96或97所述的酵母宿主细胞，其中所述外源性Gα亚基是哺乳动物Gα亚基。
99.根据实施方案98所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
100.根据实施方案99所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
101.根据实施方案86-100中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的靶GPCR的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
102.根据实施方案86-101中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述GPCR的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
103.根据实施方案86-101中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。
104.根据实施方案103所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
105.根据实施方案104所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母。
106.一种抗体，所述抗体连接到周质锚定蛋白。
107.根据实施方案106所述的抗体，其中所述抗体定位到酵母宿主细胞周质空间。
108.根据实施方案106所述的抗体，其中当所述抗体在酵母宿主细胞中产生时，所述抗体定位到所述酵母宿主细胞周质空间。
109.根据实施方案106-108中任一项所述的抗体，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
110.根据实施方案106-108中任一项所述的抗体，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
111.根据实施方案107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
112.根据实施方案107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
113.根据实施方案112所述的抗体，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
114.根据实施方案107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
115.根据实施方案107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
116.根据实施方案106-115中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
117.根据实施方案107-116中任一项所述的抗体，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。
118.根据实施方案117所述的抗体，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
119.根据实施方案118所述的抗体，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母。
120.一种酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞包含根据实施方案106-119中任一项所述的抗体。
121.一种将抗体定位到酵母宿主细胞周质空间的方法，所述方法包括将所述抗体连接到周质锚定蛋白，使得所述抗体被定位到所述周质空间。
122.根据实施方案121所述的方法，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
123.根据实施方案122所述的方法，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
124.根据实施方案121-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
125.根据实施方案121-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
126.根据实施方案125所述的方法，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
127.根据实施方案121-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
128.根据实施方案120-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
129.根据实施方案121-128中任一项所述的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
130.根据实施方案121-129中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。
131.根据实施方案130所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
132.根据实施方案131所述的方法，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母。
133.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；
b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；以及
c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
134.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
135.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白通过分子结合相互作用非共价连接在一起。
136.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其还包含报告系统，所述报告系统包含可操作地连接到当激活所述目的靶膜蛋白时被激活的诱导型启动子的报告基因，以便允许检测在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性增加或降低。
137.根据实施方案136所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
138.根据实施方案137所述的酵母周质展示文库，其中所述营养标记选自HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1。
139.根据实施方案137所述的酵母周质展示文库，其中所述抗生素抗性标记赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素选自遗传霉素、zeocin、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦。
140.根据实施方案137所述的酵母周质展示文库，其中所述荧光标记选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。
141.根据实施方案137所述的酵母周质展示文库，其中所述生物发光标记是萤光素酶或水母发光蛋白。
142.根据实施方案137所述的酵母周质展示文库，其中所述反向可选择标记选自CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK。
143.根据实施方案136所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性增加可通过阳性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
144.根据实施方案136所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是反向可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性降低可通过阴性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
145.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
146.根据实施方案145所述的酵母周质展示文库，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
147.根据实施方案146所述的酵母周质展示文库，其中所述GPCR是外源性GPCR。
148.根据实施方案147所述的酵母周质展示文库，其还包含能够被所述外源性GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
149.根据实施方案148所述的酵母周质展示文库，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
150.根据实施方案149所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
151.根据实施方案149所述的酵母周质展示文库，其中所述外源性GPCR是哺乳动物GPCR。
152.根据实施方案151所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
153.根据实施方案152所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
154.根据实施方案151所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物Gα亚基选自Gα-S、Gα-I、Gα-O、Gα-T、Gα-Z、Gα-Q、Gα-11、Gα-12、Gα-13和转导蛋白。
155.根据实施方案149所述的酵母周质展示文库，其中所述嵌合Gα亚基包含所述酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。
156.根据实施方案151所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物GPCR是人GPCR。
157.根据实施方案156所述的酵母周质展示文库，其中所述人GPCR选自CXCR4、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB2、A3AR和AT1R。
158.根据实施方案146所述的酵母周质展示文库，其中所述GPCR具有组成型非配体依赖性活性。
159.根据实施方案146所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述GPCR的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
160.根据实施方案146所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述GPCR的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
161.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
162.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白包含增加或降低其活性的突变。
163.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3或Δmat菌株。
164.根据实施方案163所述的酵母周质展示文库，其中所述Δmat菌株包含缺失或失活的MATα基因座或者缺失或失活的MATa基因座。
165.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞还包含经修饰的CLN3蛋白，所述经修饰的CLN3蛋白包含与野生型CLN3蛋白相比增加所述酵母宿主细胞中CLN3的丰度的C末端截短。
166.根据实施方案165所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-387。
167.根据实施方案166所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-408。
168.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是单倍体或二倍体酵母宿主细胞。
169.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述融合蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述融合的蛋白质变体展示在所述周质中。
170.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白包含将所述融合的蛋白质变体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
171.根据实施方案170所述的酵母周质展示文库，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
172.根据实施方案171所述的酵母周质展示文库，其中所述GPI-质膜锚定结构域是yapsin GPI质膜锚定结构域。
173.根据实施方案172所述的酵母周质展示文库，其中所述yapsin GPI质膜锚定结构域是YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。
174.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所展示的蛋白质变体被伸出至所述周质中的蛋白质。
175.根据实施方案133所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述融合蛋白保留在所述周质中，
176.一种制备根据实施方案134所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：
a)提供多个编码融合蛋白的重组多核苷酸，其中每个重组多核苷酸编码不同的融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到用于展示的不同抗体的周质锚定蛋白；
b)用所述多个编码所述融合蛋白的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞；
c)用编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及
d)在允许所述融合蛋白和所述目的靶膜蛋白表达的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在周质空间中展示不同抗体，并且所述目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生根据实施方案134所述的酵母周质展示文库。
177.根据实施方案176所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述重组多核苷酸或编码所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸通过表达载体提供。
178.根据实施方案176所述的方法，其中编码所述融合蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
179.根据实施方案176所述的方法，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
180.根据实施方案179所述的方法，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
181.根据实施方案180所述的方法，其还包括将编码能够被所述GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到所述多个酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
182.根据实施方案181所述的方法，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
183.根据实施方案182所述的方法，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
184.根据实施方案182所述的方法，其中所述外源性Gα亚基是哺乳动物Gα亚基。
185.根据实施方案184所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
186.根据实施方案185所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
187.根据实施方案181所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的靶GPCR的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
188.根据实施方案181所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述GPCR的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
189.一种针对调节目的靶膜蛋白的活性的抗体筛选根据实施方案136所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在选择培养基中培养根据实施方案136所述的酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集；以及检测报告基因的表达，其中所述报告基因的表达增加指示所述抗体增加所述目的靶膜蛋白的活性，并且所述报告基因的表达减少指示所述抗体降低所述目的靶膜蛋白的活性。
190.根据实施方案189所述的方法，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
191.根据实施方案190所述的方法，其还包括针对所述营养标记的表达进行阳性选择，其中营养缺乏选择培养基中所述酵母宿主细胞的生长指示所述目的靶膜蛋白被激活。
192.根据实施方案191所述的方法，其中所述营养标记是HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1。
193.根据实施方案190所述的方法，其还包括针对所述抗生素抗性标记的表达进行阳性选择，其中包含抗生素的选择培养基中所述酵母宿主细胞的生长指示所述目的靶膜蛋白被激活。
194.根据实施方案193所述的方法，其中所述抗生素抗性标记赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素选自遗传霉素、zeocin、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦。
195.根据实施方案190所述的方法，其还包括针对所述荧光标记的表达进行阳性选择，其中检测到由所述酵母宿主细胞发射的荧光指示所述目的靶膜蛋白被激活。
196.根据实施方案195所述的方法，其中所述荧光标记选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。
197.根据实施方案190所述的方法，其还包括针对所述生物发光标记的表达进行阳性选择，其中检测到由所述酵母宿主细胞发射的生物发光指示所述目的靶膜蛋白被激活。
198.根据实施方案197所述的方法，其中所述生物发光标记是萤光素酶或水母发光蛋白。
199.根据实施方案190所述的方法，其还包括针对所述反向可选择标记的表达进行阴性选择，其中在所展示的抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性降低可通过培养基中所述酵母宿主细胞的生长来检测，所述培养基包含针对表达所述反向可选择标记的细胞进行选择的药剂。
200.根据实施方案199所述的方法，其中所述反向可选择标记选自CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK。
201.一种针对调节目的靶GPCR的活性的抗体筛选根据实施方案148所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在培养基中培养根据实施方案148所述的酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集，其中与不具有展示在周质空间中的抗体的对照酵母宿主细胞相比在至少一个酵母宿主细胞中检测到信息素应答的激活或抑制指示所述至少一个酵母宿主细胞中所展示的抗体结合所述GPCR并调节所述GPCR的活性。
202.根据实施方案201所述的方法，其还包括使所述人GPCR与配体接触。
203.根据实施方案201所述的方法，其中所述GPCR具有组成型非配体依赖性活性。
204.根据实施方案201所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是FAR1菌株，其中通过充当结合并抑制所述酵母宿主细胞中的所述GPCR的拮抗剂的抗体对所述信息素应答的抑制导致细胞周期阻滞停止和所述酵母宿主细胞生长。
205.根据实施方案201所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子，其中通过充当结合并激活所述酵母宿主细胞中的所述GPCR的激动剂的抗体对所述信息素应答的激活导致所述报告基因的表达增加。
206.根据实施方案205所述的方法，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
IV.实验
通过参考用于实施本发明的具体实施方案的以下实施例来更完全地理解本发明。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。根据其进行的各种修改或改变将为本领域技术人员知晓，并且应包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是当然应该允许一些实验误差和偏差。
实施例1
用于选择调节GPCR功能的抗体的酵母展示
概述
诸如癌症和炎症的疾病中的大量治疗性靶标涉及G蛋白偶联受体(GPCR)。然而，许多对于高影响疾病具有最大治疗潜力的GPCR难以成药。虽然易于找到影响GPCR功能的小分子，但是它们通常由于GPCR配体结合袋之间的相似性而是非特异性的，从而可能导致显著的脱靶副作用。与小分子不同，抗体和相关的亲和分子(例如，纳米抗体和ScFv和Fab)由于其潜在优异的特异性、功能多样性和药理学特性而成为有吸引力的治疗药类别。另外，抗体可以更好地与细胞外结构域和环相互作用，从而可以以比小分子更精细的方式调节GPCR的结构(并且因此调节其功能)。然而，目前为止在美国还没有一种被批准的GPCR抗体治疗剂，并且在世界范围内仅在日本有一种。
当前的酵母或噬菌体展示工作流程鉴定紧密地结合GPCR但通常不影响其功能的抗体。所使用的抗原通常是不表示体内抗体可及的功能性GPCR的GPCR片段，或者是异质性结构化的全长蛋白质制剂。所述工作流程还忽略了极大部分的总功能多样性，因为大多数抗体从未在功能上被测定过。需要的是高通量平台以直接选择调节GPCR功能的抗体。
然而，开发改变GPCR的功能的抗体更复杂(Jo 2015,Hutchings 2010)。这主要是由于许多当前解决方案的以下问题所致：1)缺乏所使用的抗原。来源于细胞外GPCR肽或片段的抗原可能有利于开发用于蛋白质印迹法的抗体，但是不能在结构上表示治疗相关的靶标。此外，脂质或洗涤剂中同质功能性折叠的全长蛋白可能难于以对于免疫、噬菌体展示或酵母展示足够的量来制备。2)针对高亲和力选择的抗体大多数是非功能性的；它们结合GPCR中不影响功能的区域。3)工作流程在所选抗体中损失显著的抗体多样性，并且因此损失功能性。由于首先选择紧密结合的抗体并丢弃其余的抗体，丧失了大量的功能多样性。创建哺乳动物细胞系统，以便以自分泌方式在功能上筛选抗体候选物子集(Zhang 2014)，其部分地解决了问题2，但是由于可选择/可筛选读出的转换效率(约104)和受限的可工程化性，它们被局限于筛选候选物的小子集。
我们的创新包括将GPCR-酵母信息素应答偶联与在高通量平台中在同一细胞中表达顺式作用的亲和分子组合。这使得能够进行亲和分子的直接和高通量功能性选择(图1)。为此，我们将对于酵母而言最佳的两种策略组合：
1.与酵母信息素应答读出偶联的人GPCR的功能性表达
酵母是用于体外生物化学和结构研究的针对表达来自人的全长功能性GPCR的选择系统。值得注意的是，酵母已经成功地用于将人GPCR与酵母信息素应答途径功能性地偶联，并且根据读出筛选/选择与GPCR功能性地相互作用的小分子、肽或蛋白质配体(King1990,Brown 2000,Erlenbach 2001,Minic 2005,Dowell 2009,Dong 2010,Liu 2016)。最“普遍的”偶联方法是通过移植同源人Gα的5个C末端残基以替换Gpa1中的5个天然C末端氨基酸以制备“Gα移植物”来修改酵母Gα亚基Gpa1，以结合人GPCR并转导信号(Conklin 1993,Brown 2000,Erlenbach 2001)。其他方法包括用人受体的全长同源Gα完全替换Gpa1(King1990)，或者用各自组合成杂合人/酵母Gα的不同部分构建更复杂的Gpa1/Gα嵌合体(Klein1998,Price 1995)。
2.亲和分子-抗体、纳米抗体和ScFv的酵母展示
还存在大量关于在酵母中表达并分泌亲和分子(像IgG、ScFv、Fab和纳米抗体)的知识(Horwitz 1988,Hamilton 2006,Jeong 2011)。基于酵母展示的公司(像Adimab)开发了多种抗体临床候选物。许多学术实验室和公司改善了表达这些分子的方法并且通过将亲和分子与共价附接到细胞壁的细胞外表面的蛋白质(例如，Aga1和Aga2)融合来将所述亲和分子“展示”在酵母上(Boder 1997,Bidlingmaier 2015)。已经在酵母中常规开发了具有109的复杂度的文库，其足以用于正常结合研究并且对于我们的功能性选择平台而言绰绰有余(由于图1中所述的原因)。
此外，我们尽力不像在常规酵母展示的情况下一样将分泌的亲和分子栓系到朝外的细胞壁，而是将其栓系到细胞膜的细胞外表面。以这种方式，亲和分子可以与膜中的GPCR功能性地顺式相互作用。我们测试了四个不同的结构域，并且基于评估表达GFP与所测试结构域的融合体的细胞的膜荧光而确定了YPS1的GPI锚定结构域(Frieman 2003)是最佳的。
实施例2
低背景酵母菌株
我们产生了一种酵母菌株，其在用GPCR配体处理时不生长，并且不易于产生允许生长的常见突变。我们的目标是10-7背景/假阳性率。
当配对信息素α因子(α因子)激活其同源GPCR受体Ste2时，配对类型“a”的单倍体酵母(“MATa”细胞)经历细胞周期阻滞。此生长阻滞信息素可以用于选择Ste2拮抗剂。遗憾的是，自发“信息素抗性”突变体以令人震惊的比率出现。我们的亲本单倍体菌株中背景或“假阳性”率为约10-4，即当在α因子板上铺展106个细胞时约100个菌落生长。为了减少背景，我们对信息素应答性二倍体基础菌株进行工程化(Herskowitz 1989)。由功能丧失型突变导致的假阳性在二倍体中的出现频率低得多。然而，正常二倍体酵母携带MATa和MATα两种基因；a/α细胞不表达Ste2，对信息素也无应答。我们通过使整个MATα基因座从其基因组中缺失来构建行为与MATα二倍体相似的二倍体。MATa/Δmatα二倍体具有低约100倍的背景率。
二倍体菌株中几乎没有“假阳性”对信息素产生应答。据推测，它们携带使信号传导级联失活的功能获得型突变。因此，我们开发了仅在具有发挥功能的信息素应答途径的细胞中具有活性的可选择标记。此标记依赖于所述途径对其表达的信号传导的基础水平，此信号传导不需要信息素或信息素受体，而是依赖于同源G蛋白的随机“基线”激活(Hagen1991；Oehlen 1995)。此较低的基础信号传导不足以触发细胞周期阻滞；此应答需要通过α因子激活GPCR Ste2。一些组成型表达的酵母基因依赖于待表达的信息素应答途径的基础活性。我们通过放置一个这种基因MFA1的启动子来构建我们的可选择标记，所述启动子驱动HIS3(细胞合成其自身的组氨酸所需的基因)的表达。(Daniel 2006)。只有在细胞可以从G蛋白向下传递信号至信息素应答转录因子Ste12时，P(MFA1)-HIS3构建体才可以使所述细胞在缺乏组氨酸的培养基(H-培养基)中生长。携带P(MFA1)-HIS3并铺板在具有α因子的H-培养基中的工程化二倍体菌株(NIY326)具有10-7的背景率。
表1.降低背景率的菌株开发的总结。背景是每107个铺板在含信息素的琼脂上的细胞所形成的菌落
Figure BDA0002621079740000621
Figure BDA0002621079740000631
实施例3
周质定位的纳米抗体文库的构建
我们构建了一组驱动嵌合体的表达的周质靶向表达载体，所述嵌合体具有N末端分泌信号MFαPrePro(Brake 1984)，接着是含有单一FLAG表位(DYKDDDDK)的18个氨基酸接头，并以YPS1糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定结构域结束。PrePro信号靶向用于易位到内质网中并分泌的蛋白质，并且随后被切除，而在ER中对YPS1 GPI结构域的处理产生N末端GPI锚，所述N末端GPI锚将所述嵌合体保持栓系到质膜(Frieman 2003)。紧接在MFαPrePro编码序列之后的限制性位点允许亲和分子的克隆(例如，用于产生纳米抗体cDNA文库)。所述载体携带可选择标记URA3，其允许尿嘧啶缺乏培养基中的阳性选择并且还允许反向选择(参见下文)。
我们确认了这些表达载体通过克隆抗GFP纳米抗体将纳米抗体定位到膜的细胞外表面(Kirchhoffer 2009)。当我们消化这些细胞的细胞壁并在细胞外施加GFP时，我们观察到与其细胞膜重合的绿色荧光(图4)，这确认了抗GFP纳米抗体的周质定位。
我们接下来构建了纳米抗体文库。我们使用先前在大肠杆菌载体中克隆的具有106克隆效价的纳米抗体文库作为来源(Salema 2013)。我们通过PCR扩增纳米抗体编码序列，并且使用低背景平台菌株NIY326通过酵母同源重组将它们克隆到质膜靶向载体中(vanLeeuwen 2015)。我们在尿嘧啶和组氨酸缺乏(U-/H-)琼脂培养基上获得了约1×106个独立的菌落。我们用低温储存培养基刮取菌落并且在-80℃下以等分试样储存浆液(文库001)。
实施例4
充当Ste2自分泌拮抗剂的纳米抗体的选择
A.从纳米抗体文库选择信息素抗性克隆：
我们从实施例3中所述的文库001选择信息素抗性克隆。我们将108个细胞铺板到具有α因子的若干U-/H-板上并将它们孵育5天。我们从大约300个生长的菌落分析90个菌落的随机样品。我们接下来确定它们在α因子上生长的能力是否是质粒依赖性的。我们通过将克隆铺板在含有对于表达URA3的细胞具有毒性的5-FOA的培养基上来选择自发地丧失质粒的克隆。然后我们测试了在5-FOA选择之前生长但在之后不生长的克隆。我们进行了晕轮测定并且发现，在晕轮测定中，在90个初始分离的克隆中有12个在5-FOA选择之后丧失了其在含有α因子的琼脂培养基上生长的能力(图5)。
B.特异性和作用位点测试：
为了测试候选纳米抗体亲和分子是否是特异性的(即，需要靶受体Ste2来阻断信息素应答)，我们在MATα菌株中表达所述候选物。MATα细胞表达a因子受体Ste3并且不表达Ste2。Ste3是仅与Ste2较远相关的GPCR，并且其配体a因子信息素是与α因子完全不同的糖基化肽。由于这两个原因，受体下游的MATa和MATα的信息素信号传导级联是相同的。MATa和MATα细胞两者都响应于其同源信息素而阻滞其细胞周期，并且激活信息素诱导型基因。我们的MATa和MATα测试细胞携带信息素诱导型转录报告物P(PRM1)-YFP，其可以用于测试拮抗剂候选物不存在和存在情况下的途径功能。因此，我们通过测量暴露于其同源信息素的MATa和MATα细胞中的细胞周期阻滞和YFP诱导以比较拮抗剂候选物的作用来评估特异性。如果候选物仅在MATa(Ste2)菌株中充当拮抗剂，则我们发展所述候选物。
C.通过在细胞外施加纯化的纳米抗体来评估作用位点
虽然不太可能，但是GPCR拮抗可能由细胞内结合和Ste2向质膜定位的破坏来产生。因为任何“结合剂”抗体可能潜在地以这种方式起作用，所以我们测试了候选物在外源性添加时调节GPCR功能的能力。
我们表达并纯化纳米抗体蛋白，在信息素存在的情况下将它们施加到细胞，并且在信息素和报告物诱导测定中使用生长来测量其对于Ste2(和Ste3)功能的作用。我们使用载体pET28b和BL21(DE3)细胞在细菌中表达具有C末端6xHis标签的候选物，并且使用非变性6His亲和纯化来纯化候选物(Bornhorst 2000)。由于其大小较小(15kDa)，所以纳米抗体能够穿过酵母细胞壁扩散(Ries 2012)。除此功能性测试以外，我们用荧光染料(Alexa488，与GFP波长兼容；试剂盒#A20181，Thermo-Fisher Scientific)标记重组纳米抗体，并且测试其对表达Ste2的细胞而不是表达Ste3的对照细胞的质膜染色的能力。免疫荧光实验还允许我们比较具有和不具有其细胞壁(其可以易于用裂解酶酶促处理来去除)的固定细胞的染色，并且因此确认了纳米抗体可以有效地穿过细胞壁扩散。最后，免疫荧光用于确认拮抗剂候选物直接结合受体而非配体来发挥其作用。
实施例5
激动剂选择菌株
我们构建了需要Ste2刺激来生长的激动剂选择菌株。在我们的缺乏P(MFA1)-HIS3标记的平台菌株的形式中，我们通过使用CRISPR-Cas9方法使FAR1的两个基因组拷贝缺失来使信息素诱导的细胞周期阻滞功能失效(Horwitz 2015)。接下来，我们用HIS3 ORF替换此二倍体菌株中PRM1等位基因中的一个中的PRM1开放阅读框，从而产生P(PRM1)-HIS3可选择标记。我们将P(PRM1)-HIS3并入其他菌株中并且没有观察到显著的“泄露”，即这些细胞仅在α因子存在的情况下在H-板上生长。我们产生此菌株的MATa和MATα形式用于特异性测试。如所预期，P(PRM1)-HIS3菌株的假阳性率远低于拮抗剂选择菌株，因为开启信息素级联的突变比关闭信息素级联的突变更罕见(Brown 2000)。在铺板表达纳米抗体文库的细胞时我们在H-板中观察到大量弱“生长者”的情况下，我们使用凭经验确定的最小浓度的His3抑制剂3-氨基三唑来阻断所述细胞由于HIS3表达的泄露所致的生长(酵母HIS3选择应用的标准策略)。
与拮抗剂筛选相似，我们基于H-板中的生长针对Ste2选择表达候选激动剂纳米抗体的酵母克隆。我们通过测试Ste3激动剂选择菌株中的命中(使用P(PRM1)-HIS3和P(PRM1)-YFP报告物)来测试生长是否是质粒/表达依赖性的并且确认特异性。另外，如上，我们在细菌中产生纳米抗体并且将它们直接添加到细胞中以测试其有效性。
实施例6
将人GPCR与酵母信息素途径偶联
A.Gpa1-移植物组
用于将人GPCR与酵母信息素途径偶联的广泛使用的方法是修饰酵母Gα(Gpa1)，使得其5个C末端氨基酸改变为人Gα的那些，从而生成“GPA1移植物”(Brown 2000,Erlenbach2001)。对于每个受体，通常凭经验找到合适的Gα(Dowell 2009)。在大多数情况下，使用Gαi、Gαq、Gαs或Gαo的移植物实现偶联(Dong 2010)。使用CRISPR方法(Horwitz 2015)，针对这4种Gα移植物菌株，我们产生一组二倍体激动剂和拮抗剂GPA1-移植物菌株。
B.在我们的系统中测试人GPCR
在大多数情况下，来自由温和启动子(像P(ACT1))驱动的基因组整合的构建体的人GPCR在酵母中表达最佳(Shiroishi 2012,Schutz 2016)。通常，良好表达的GPCR是具有N末端可切割的分泌信号(通常为MFαPrePro)，接着是用于免疫检测的FLAG表位标签以及C末端GFP(有时)的嵌合体。我们已经构建了具有这些特征的载体，并且可以视情况容易地进行修饰。我们将表2中的受体克隆到这些载体中，并且通过荧光显微镜检查和/或抗FLAG免疫荧光来测试所述受体的表达水平和质膜定位。
我们用表达GPCR的构建体转化移植物菌株。对于每个GPCR，还在激动剂选择菌株中使用P(PRM1)-HIS3和P(PRM1)-YFP报告物来测试它们与信息素应答偶联的强度。
表2.用于偶联和拮抗剂/激动剂发现的候选人治疗性GPCR靶标
Figure BDA0002621079740000661
Figure BDA0002621079740000671
实施例7
针对调节GPCR功能的抗体的筛选
A.将所选的GPCR提交到抗体选择工艺
我们遵循与先前针对Ste2的工作类似的方法，不同的是以下内容。我们使用多样化的人ScFv文库(确保108-109多样性，Oak Biosciences)。我们将此文库在与之前相同的亲和分子载体中克隆，从而在质膜中表达作为YPS1 GPI锚定嵌合体的ScFv。对于拮抗剂选择，预期来自偶联受体的信号传导不会强至足以触发细胞周期阻滞。因此，我们使用P(FUS2)-CAN1反向可选择标记(Erlenbach 2001)。P(FUS2)是信息素诱导型启动子，像P(PRM1)。CAN1编码精氨酸以及毒性精氨酸类似物刀豆氨酸的质膜转运蛋白。如果细胞携带与信息素应答偶联的激活的人GPCR，则携带P(FUS2)-CAN1的细胞无法在刀豆氨酸板中生长。此表型使我们能够在刀豆氨酸板中选择针对人GPCR的拮抗性抗体。对于激动剂选择，我们使用与之前一样的P(PRM1)-HIS3标记。在选择候选物之后，如上，我们分离这些克隆的不含质粒的衍生物，以测试它们的信息素阻断表型的质粒依赖性。
B.测试候选抗体的特异性和作用位点
1)对其他GPCR测试
我们通过在表达其他受体的菌株中转化质粒来验证质粒依赖性候选物的特异性。在这种情况下，我们在MATa(Ste2)和MATα(Ste3)菌株上以及在表达至少2种其他经由GPA1移植物与信息素应答偶联的人GPCR的菌株中测试所述候选物(即，以便检查激动剂或拮抗剂不作用于其他GPCR)。
2)通过细胞外施加纯化的纳米抗体蛋白进行测试
虽然纳米抗体(15kDa)可以穿过酵母细胞壁扩散(Ries 2012)，但是较大的ScFv(27kDa)可能显著地受到限制。我们在消化和不消化细胞壁的情况下在酵母中用标记的候选ScFv进行免疫荧光。
实施例8
测试抗CB2 VHH结构域激动剂呈递对于生长速率的影响
为了确定激动剂呈递对于酵母细胞的生长速率的作用，我们构建表达人GPCR蛋白(人2型大麻素受体(CB2受体))的酵母菌株，并且用空质粒(没有VHH)或用其中以不同方式呈递单结构域VHH抗体Ab101的激动剂表达质粒转化所述酵母菌株。我们测试了四种不同的激动剂VHH表达质粒，其中通过以下方式呈递VHH结构域：1)连接到Yps1质膜锚的短接头，2)连接到Yps1质膜锚的长接头，3)连接到可溶性周质酶Suc2的N末端融合体，以及4)将未标记的VHH直接分泌到周质中。二至五个独立的克隆在不进行选择的情况下生长至饱和。使用饱和细胞在96孔微滴定板中以技术复制开始培养，以用于在板读取器中进行自动化吸光度测量(OD630)。使用两种培养基配制品。第一培养基配制品不需要从信息素应答报告物表达(无选择)。第二培养基配制品与第一培养基配制品相同，但是缺乏可以仅由于信息素应答报告物表达而产生的一种氨基酸(选择)。每5分钟进行吸光度测量，持续48小时。对于每个技术复制，通过计算从原始吸光度测量值求出最大生长速率。对所生成的所有数据进行作图，并且通过水平条形指示中值生长速率(图7)。图下方的草图描绘每种呈递模式(图7)。
与用空质粒(无VHH)转化的细胞相比，四种激动剂VHH表达质粒中的每一种增加在第二培养基配制品中的生长速率。这证明了在周质中呈递激动剂的不同方式可以用于激活GPCR蛋白CB2受体的活性。具体地，我们证明了CB2受体可以通过VHH结构域抗体来激活，所述VHH结构域抗体通过长接头或短接头共价连接到质膜锚定蛋白。我们还证明了可以通过将功能性VHH结构域激动剂抗体融合到周质蛋白Suc2来将所述抗体定位到周质，所述周质蛋白Suc2足够大而使得融合蛋白保留在周质中。Suc2形成包含通过非共价相互作用连接的多个Suc2蛋白的寡聚物，并且需要此多聚化来将Suc2保留在周质中。因此，此条件还证明了部分通过抗体与锚定蛋白之间的非共价相互作用保留在周质中。最后，此实验证明了将未标记的VHH结构域抗体直接分泌到周质中可以激活CB2受体。
虽然已经在一定细节中描述了本发明的优选实施方案，但是应理解，可以在不偏离如本文所述的本发明的精神和范围的情况下做出各种明显改变。

Claims (132)

1.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；
b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；以及
c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
2.根据权利要求1所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
3.根据权利要求1所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
6.根据权利要求5所述的酵母周质展示文库，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
7.根据权利要求6所述的酵母周质展示文库，其中所述GPI-质膜锚定结构域是yapsinGPI质膜锚定结构域。
8.根据权利要求7所述的酵母周质展示文库，其中所述yapsin GPI质膜锚定结构域是YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6或YPS7 yapsin GPI质膜锚定结构域。
9.根据权利要求2所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
10.根据权利要求3所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面的将所述融合蛋白伸出至所述周质中的蛋白质。
11.根据权利要求2所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
12.根据权利要求3所述的酵母周质展示文库，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述融合蛋白保留在所述周质中。
13.一种酵母周质展示文库，所述酵母周质展示文库包含多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体，其中所述抗体连接到信号序列，所述信号序列引导所述抗体向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述酵母宿主细胞周质空间中；以及
b)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的酵母周质展示文库，其还包括报告系统，所述报告系统包含可操作地连接到当激活所述目的靶膜蛋白时被激活的诱导型启动子的报告基因，以便允许检测在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性增加或降低。
15.根据权利要求14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
16.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述营养标记选自HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1。
17.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述抗生素抗性标记赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素选自遗传霉素、zeocin、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦。
18.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述荧光标记选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。
19.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述生物发光标记是萤光素酶或水母发光蛋白。
20.根据权利要求15所述的酵母周质展示文库，其中所述反向可选择标记选自CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK。
21.根据权利要求14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性增加可通过阳性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
22.根据权利要求14所述的酵母周质展示文库，其中所述报告基因是反向可选择标记，使得在所述抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的所述活性降低可通过阴性选择培养基上所述酵母宿主细胞的生长来检测。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
24.根据权利要求23所述的酵母周质展示文库，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
25.根据权利要求24所述的酵母周质展示文库，其中所述GPCR是外源性GPCR。
26.根据权利要求25所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞还包含内源性GPCR。
27.根据权利要求25或26所述的酵母周质展示文库，其还包含能够被所述外源性GPCR激活的工程化Gα亚基，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
28.根据权利要求27所述的酵母周质展示文库，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
29.根据权利要求28所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述外源性GPCR是哺乳动物GPCR。
31.根据权利要求30所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
32.根据权利要求31所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
33.根据权利要求31或32所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物Gα亚基选自Gα-S、Gα-I、Gα-O、Gα-T、Gα-Z、Gα-Q、Gα-11、Gα-12、Gα-13和转导蛋白。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述嵌合Gα亚基包含所述酵母Gα亚基的至少41个N末端残基。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述哺乳动物GPCR是人GPCR。
36.根据权利要求35所述的酵母周质展示文库，其中所述人GPCR选自
CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR和AT1R。
37.根据权利要求24-36中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的GPCR靶膜蛋白具有组成型非配体依赖性活性。
38.根据权利要求24-37中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的GPCR靶膜蛋白的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
39.根据权利要求24-36中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的GPCR靶膜蛋白的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述目的靶膜蛋白包含增加或降低其活性的突变。
42.根据权利要求1-40中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3或Δmat菌株。
43.根据权利要求42所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是包含缺失或失活的MATα基因座或者缺失或失活的MATa基因座的Δmat菌株。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞还包含经修饰的CLN3蛋白，所述经修饰的CLN3蛋白包含与野生型CLN3蛋白相比增加所述酵母宿主细胞中CLN3的丰度的C末端截短。
45.根据权利要求44所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-387。
46.根据权利要求44所述的酵母周质展示文库，其中所述经修饰的CLN3蛋白至少保留所述野生型CLN3蛋白的N末端氨基酸1-408。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的酵母周质展示文库，其中所述酵母宿主细胞是单倍体或二倍体酵母宿主细胞。
48.一种制备根据权利要求1所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：
a)提供第一多个编码用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体的重组多核苷酸，其中所展示的抗体在每个酵母宿主细胞中是不同的，使得所述多个酵母宿主细胞展示多种抗体；
b)提供编码所述周质锚定蛋白的第二重组多核苷酸，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；
c)用所述第一多个重组多核苷酸和所述第二重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；
d)用编码所述目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及
e)在允许所述抗体、所述周质锚定蛋白和所述目的靶膜蛋白表达的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在所述周质空间中展示不同抗体，并且所述目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生根据权利要求1所述的酵母周质展示文库。
49.根据权利要求48所述的方法，其中编码所述抗体的所述重组多核苷酸或编码所述周质锚定蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸通过表达载体提供。
50.根据权利要求48所述的方法，其中编码所述抗体的所述重组多核苷酸或编码所述周质锚定蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
51.一种制备根据权利要求3所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括：
a)提供多个编码融合蛋白的重组多核苷酸，其中每个重组多核苷酸编码不同的融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到用于展示的不同抗体的周质锚定蛋白；
b)用所述多个编码所述融合蛋白的重组多核苷酸转染多个酵母宿主细胞；
c)用编码目的靶膜蛋白的重组多核苷酸转染所述多个酵母宿主细胞；以及
d)在允许所述融合蛋白和所述目的靶膜蛋白表达的条件下培养所述多个酵母宿主细胞，其中每个酵母宿主细胞在周质空间中展示不同抗体，并且所述目的靶膜蛋白定位到质膜，使得产生根据权利要求3所述的酵母周质展示文库。
52.根据权利要求51所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述重组多核苷酸或编码所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸通过表达载体提供。
53.根据权利要求51所述的方法，其中编码所述融合蛋白或所述目的靶膜蛋白的所述重组多核苷酸整合到酵母宿主细胞基因组中的靶基因座处。
54.根据权利要求48-53中任一项所述的方法，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
56.根据权利要求48-55中任一项所述的方法，其还包括将编码能够被所述GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到所述多个酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述外源性Gα亚基是哺乳动物Gα亚基。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
62.根据权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的靶GPCR的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
63.根据权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述GPCR的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
64.一种针对调节目的靶膜蛋白的活性的抗体筛选根据权利要求14所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在选择培养基中培养根据权利要求14所述的酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集；以及
检测报告基因的表达，其中所述报告基因的表达增加指示所述抗体增加所述目的靶膜蛋白的活性，并且所述报告基因的表达减少指示所述抗体降低所述目的靶膜蛋白的活性。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
66.根据权利要求65所述的方法，其还包括针对所述营养标记的表达进行阳性选择，其中营养缺乏选择培养基中所述酵母宿主细胞的生长指示所述目的靶膜蛋白被激活。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述营养标记是HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3和TRP1。
68.根据权利要求65所述的方法，其还包括针对所述抗生素抗性标记的表达进行阳性选择，其中包含抗生素的选择培养基中所述酵母宿主细胞的生长指示所述目的靶膜蛋白被激活。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述抗生素抗性标记赋予对于抗生素的抗性，所述抗生素选自遗传霉素、zeocin、潮霉素B、诺尔斯菌素和双丙氨膦。
70.根据权利要求65所述的方法，其还包括针对所述荧光标记的表达进行阳性选择，其中检测到由所述酵母宿主细胞发射的荧光指示所述目的靶膜蛋白被激活。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述荧光标记选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。
72.根据权利要求65所述的方法，其还包括针对所述生物发光标记的表达进行阳性选择，其中检测到由所述酵母宿主细胞发射的生物发光指示所述目的靶膜蛋白被激活。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述生物发光标记是萤光素酶或水母发光蛋白。
74.根据权利要求65所述的方法，其还包括针对所述反向可选择标记的表达进行阴性选择，其中在所展示的抗体与所述目的靶膜蛋白结合时所述目的靶膜蛋白的活性降低可通过培养基中所述酵母宿主细胞的生长来检测，所述培养基包含针对表达所述反向可选择标记的细胞进行选择的药剂。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述反向可选择标记选自CAN1、URA3、MET15、TRP1和TK。
76.一种针对调节目的靶GPCR的活性的抗体筛选根据权利要求27所述的酵母周质展示文库的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求27所述的酵母周质展示文库的酵母宿主细胞的至少一个子集，其中与不具有展示在周质空间中的抗体的对照酵母宿主细胞相比在至少一个酵母宿主细胞中检测到信息素应答的激活或抑制指示所述至少一个酵母宿主细胞中所展示的抗体结合所述GPCR并调节所述GPCR的活性。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述目的靶GPCR是人GPCR。
78.根据权利要求77所述的方法，其还包括使所述人GPCR与配体接触。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述GPCR具有组成型非配体依赖性活性。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是FAR1菌株，其中通过充当结合并抑制所述酵母宿主细胞中的所述GPCR的拮抗剂的抗体对所述信息素应答的抑制导致细胞周期阻滞停止和所述酵母宿主细胞生长。
81.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞是Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子，其中通过充当结合并激活所述酵母宿主细胞中的所述GPCR的激动剂的抗体对所述信息素应答的激活导致所述报告基因的表达增加。
82.根据权利要求73所述的方法，其中所述报告基因是营养标记、抗生素抗性标记、荧光标记、生物发光标记或反向可选择标记。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
86.一种酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞包含：
a)用于在酵母宿主细胞周质空间中展示的抗体，
b)周质锚定蛋白，其中所述周质锚定蛋白连接到所述抗体，使得所述抗体展示在所述周质空间中；以及
c)目的靶膜蛋白，其中所述目的膜蛋白定位在所述酵母宿主细胞质膜中并且是所述酵母宿主细胞周质空间中展示的所述抗体可及的。
87.根据权利要求86所述的酵母宿主细胞，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
88.根据权利要求86所述的酵母宿主细胞，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
90.根据权利要求86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
91.根据权利要求86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
92.根据权利要求86-88中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
93.根据权利要求86-92中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述目的靶膜蛋白选自受体、离子通道和转运蛋白。
94.根据权利要求93所述的酵母宿主细胞，其中所述受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。
95.根据权利要求86-94中任一项所述的酵母宿主细胞，其还包括将编码能够被所述GPCR激活的工程化Gα亚基的重组多核苷酸引入到所述酵母宿主细胞中，其中所述激活的工程化Gα亚基能够激活所述酵母宿主细胞中的可检测的信息素应答。
96.根据权利要求95所述的酵母宿主细胞，其中所述工程化Gα亚基是嵌合G蛋白α(Gα)亚基，其包含酵母Gα亚基的N末端结构域和外源性Gα亚基的C末端结构域。
97.根据权利要求96所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母Gα亚基属于Gαi、Gαq、Gαs或Gαo家族G蛋白。
98.根据权利要求96或97所述的酵母宿主细胞，其中所述外源性Gα亚基是哺乳动物Gα亚基。
99.根据权利要求98所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母Gα亚基的至少5个C末端残基被哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
100.根据权利要求99所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母Gα亚基的至少20个C末端残基被所述哺乳动物Gα亚基的对应C末端残基替换，使得所述嵌合Gα亚基能够被所述哺乳动物GPCR激活。
101.根据权利要求86-100中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述目的靶GPCR的抗体拮抗剂的FAR1菌株。
102.根据权利要求86-101中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞是用于选择所述GPCR的抗体激动剂的Δfar1菌株，所述Δfar1菌株包含可操作地连接到报告基因的信息素诱导型PRM1启动子。
103.根据权利要求86-101中任一项所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。
104.根据权利要求103所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
105.根据权利要求104所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母。
106.一种抗体，所述抗体连接到周质锚定蛋白。
107.根据权利要求106所述的抗体，其中所述抗体定位到酵母宿主细胞周质空间。
108.根据权利要求106所述的抗体，其中当所述抗体在酵母宿主细胞中产生时，所述抗体定位到所述酵母宿主细胞周质空间。
109.根据权利要求106-108中任一项所述的抗体，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
110.根据权利要求106-108中任一项所述的抗体，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
111.根据权利要求107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
112.根据权利要求107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
113.根据权利要求112所述的抗体，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
114.根据权利要求107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
115.根据权利要求107-110中任一项所述的抗体，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
116.根据权利要求106-115中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
117.根据权利要求107-116中任一项所述的抗体，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。
118.根据权利要求117所述的抗体，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
119.根据权利要求118所述的抗体，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母。
120.一种酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞包含根据权利要求106-119中任一项所述的抗体。
121.一种将抗体定位到酵母宿主细胞周质空间的方法，所述方法包括将所述抗体连接到周质锚定蛋白，使得所述抗体被定位到所述周质空间。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在复合物中通过分子结合相互作用非共价连接在一起，或者在复合物中通过共价非肽键连接。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述抗体和所述周质锚定蛋白在融合蛋白中共价连接在一起。
124.根据权利要求121-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白还包含信号序列，所述信号序列引导所述周质锚定蛋白向所述酵母宿主细胞周质、质膜或细胞壁的转运，使得所述抗体展示在所述周质中。
125.根据权利要求121-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白包含将所述抗体伸出至所述周质中的跨越膜的跨膜结构域或膜结合蛋白结构域。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述膜结合蛋白结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-质膜锚定结构域。
127.根据权利要求121-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白是结合所述细胞壁的内表面，使得所述抗体被伸出至所述周质中的蛋白质。
128.根据权利要求120-123中任一项所述的方法，其中所述周质锚定蛋白足够大而使得所述周质锚定蛋白和连接的抗体保留在所述周质中。
129.根据权利要求121-128中任一项所述的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
130.根据权利要求121-129中任一项所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和耶氏酵母属。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述酵母宿主细胞的属是酵母属。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述酵母属的物种是酿酒酵母。
CN201880088782.5A 2017-12-11 2018-12-10 周质空间中蛋白质的酵母展示 Pending CN112041486A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762597388P 2017-12-11 2017-12-11
US62/597,388 2017-12-11
PCT/US2018/064775 WO2019118362A1 (en) 2017-12-11 2018-12-10 Yeast display of proteins in the periplasmic space

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112041486A true CN112041486A (zh) 2020-12-04

Family

ID=66819728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880088782.5A Pending CN112041486A (zh) 2017-12-11 2018-12-10 周质空间中蛋白质的酵母展示

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11795579B2 (zh)
EP (1) EP3724378A4 (zh)
JP (2) JP7419248B2 (zh)
CN (1) CN112041486A (zh)
AU (1) AU2018383600A1 (zh)
CA (1) CA3084315A1 (zh)
IL (1) IL275239A (zh)
WO (1) WO2019118362A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10392674B2 (en) 2015-07-22 2019-08-27 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
WO2017019895A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 President And Fellows Of Harvard College Evolution of talens
US11795579B2 (en) 2017-12-11 2023-10-24 Abalone Bio, Inc. Yeast display of proteins in the periplasmic space
WO2019241649A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
WO2023010050A1 (en) * 2021-07-28 2023-02-02 The Broad Institute, Inc. Methods of periplasmic phage-assisted continuous evolution

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050202403A1 (en) * 1993-03-31 2005-09-15 Cadus Technologies, Inc. Yeast cells expressing modified G proteins and methods of use therefor
CN101454013A (zh) * 2006-04-13 2009-06-10 阿姆布罗泽有限公司 用于生产发酵产物和剩余物的组合物和方法
US20110076752A1 (en) * 2007-02-09 2011-03-31 Medimmune, Llc Antibody library display by yeast cell plasma membrane
US20150316561A1 (en) * 2012-08-31 2015-11-05 The Scripps Research Institute Methods and compositions related to modulators of eukaryotic cells
US20160060642A1 (en) * 2013-04-16 2016-03-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation G Protein Coupled Receptor Libraries

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE122391T1 (de) 1987-01-30 1995-05-15 Harvard College Periplasmische protease-mutanten von escherichia coli.
US4946783A (en) 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
US5210019A (en) 1990-03-30 1993-05-11 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Pseudomonas screening assay
CA2528202C (en) 1998-10-28 2012-01-10 Genentech, Inc. Process for recovering heterologous polypeptides from bacterial cells
US7094571B2 (en) 2000-10-27 2006-08-22 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Combinatorial protein library screening by periplasmic expression
US7083945B1 (en) 2000-10-27 2006-08-01 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Isolation of binding proteins with high affinity to ligands
US7094579B2 (en) 2002-02-13 2006-08-22 Xoma Technology Ltd. Eukaryotic signal sequences for prokaryotic expression
US6916474B2 (en) 2002-07-15 2005-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies with increased affinities for anthrax antigens
US7611866B2 (en) 2002-07-15 2009-11-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Selection of bacterial inner-membrane anchor polypeptides
CN1701119A (zh) * 2002-09-20 2005-11-23 Cym1P有限公司 增加宿主细胞重组多肽产量的方法
US20050147962A1 (en) 2002-11-19 2005-07-07 Wagstrom Christopher R. Display of dimeric proteins on phage
BRPI0406678A (pt) 2003-01-07 2005-12-20 Symphogen As Método para produzir proteìnas policlonais recombinantes
JP4773947B2 (ja) 2003-01-09 2011-09-14 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 細菌細胞及び哺乳動物細胞における抗体発現のための二重発現ベクター系
AU2005235991A1 (en) 2004-03-18 2005-11-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial protein library screening by periplasmic expression
WO2005095988A2 (en) 2004-03-18 2005-10-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Selection of bacterial inner-membrane anchor polypeptides
WO2006023248A2 (en) 2004-07-28 2006-03-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for producing and crystallizing g-protein coupled receptors
US7435804B2 (en) 2004-10-19 2008-10-14 Phage Biotechnology, Inc. Method for obtaining single chain antibodies to human interferon α2b
US20070026012A1 (en) 2005-08-01 2007-02-01 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for monitoring and altering protein folding and solubility
CA2671264C (en) 2006-11-30 2015-11-24 Research Development Foundation Improved immunoglobulin libraries
US8722584B2 (en) 2007-01-12 2014-05-13 Cornell University Genetic selection for protein folding and solubility in the bacterial periplasm
EP2134841B9 (en) 2007-03-15 2014-06-11 Inserm Methods for producing active scfv antibodies and libraries therefor
JP5444553B2 (ja) 2007-04-27 2014-03-19 フェネックス インコーポレイテッド 微生物宿主を迅速にスクリーニングして、異種タンパク質発現の収率および／または質が改善されている特定の株を同定する方法
EP2155789B1 (en) 2007-05-01 2013-07-24 Research Development Foundation Immunoglobulin fc libraries
CA2715212A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Glycofi, Inc. Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes
JP5683581B2 (ja) 2009-06-30 2015-03-11 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 免疫グロブリンＦｃポリペプチド
ES2682254T3 (es) 2011-08-18 2018-09-19 Affinity Biosciences Pty Ltd Polipéptidos solubles
US9582627B2 (en) 2014-11-25 2017-02-28 International Business Machines Corporation Enhanced parameter tuning for very-large-scale integration synthesis
CN107810197B (zh) 2015-04-24 2022-10-25 豪夫迈·罗氏有限公司 鉴定包含结合多肽的细菌的方法
EP3087992A1 (en) * 2015-04-29 2016-11-02 Institut National d'Etudes Superieures Agronomiques de Montpellier (Montpellier SupAgro) Compositions comprising yeast cells and polyphenols and their use
US20170145061A1 (en) 2015-11-20 2017-05-25 Massachusetts Institute Of Technology Engineered bacteroides outer membrane vesicles
GB201617270D0 (en) 2016-10-11 2016-11-23 Argen-X N V And Fairjourney Biologics Triple vector for expressing antibody molecules in full therapeutic format
US11746374B2 (en) * 2017-06-15 2023-09-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and platform for screening and selecting metabolites and their receptors
EP3661959A2 (en) 2017-08-04 2020-06-10 Abcam Plc Methods and compositions for ligand directed antibody design
KR102048037B1 (ko) 2017-10-20 2019-11-22 국민대학교 산학협력단 세포막 유동성을 이용한 다중체 단백질 디스플레이 시스템
US11795579B2 (en) 2017-12-11 2023-10-24 Abalone Bio, Inc. Yeast display of proteins in the periplasmic space
SG11202006842RA (en) * 2018-05-31 2020-08-28 Kangti Pte Ltd A yeast phenotypic screening method for isolation of functional antibodies against g-protein coupled receptors

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050202403A1 (en) * 1993-03-31 2005-09-15 Cadus Technologies, Inc. Yeast cells expressing modified G proteins and methods of use therefor
CN101454013A (zh) * 2006-04-13 2009-06-10 阿姆布罗泽有限公司 用于生产发酵产物和剩余物的组合物和方法
US20110076752A1 (en) * 2007-02-09 2011-03-31 Medimmune, Llc Antibody library display by yeast cell plasma membrane
US20150316561A1 (en) * 2012-08-31 2015-11-05 The Scripps Research Institute Methods and compositions related to modulators of eukaryotic cells
CN105452546A (zh) * 2012-08-31 2016-03-30 斯克利普斯研究院 与真核细胞调节剂相关的方法和组合物
US20160060642A1 (en) * 2013-04-16 2016-03-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation G Protein Coupled Receptor Libraries

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024050591A (ja) 2024-04-10
AU2018383600A1 (en) 2020-06-18
JP7419248B2 (ja) 2024-01-22
US20210198806A1 (en) 2021-07-01
JP2021505675A (ja) 2021-02-18
WO2019118362A1 (en) 2019-06-20
US20240102202A1 (en) 2024-03-28
CA3084315A1 (en) 2019-06-20
RU2020122887A (ru) 2022-01-13
IL275239A (en) 2020-07-30
EP3724378A1 (en) 2020-10-21
EP3724378A4 (en) 2021-12-08
US11795579B2 (en) 2023-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7419248B2 (ja) ペリプラズム空間中におけるタンパク質の酵母ディスプレイ
US6562576B2 (en) Yeast two-hybrid system and use thereof
Inouye et al. Mutational analysis of STE5 in the yeast Saccharomyces cerevisiae: application of a differential interaction trap assay for examining protein-protein interactions
US5928868A (en) Three hybrid screening assay
JP5754135B2 (ja) 関心対象のタンパク質の細胞表面ディスプレイ、スクリーニング、および産生
US20160146786A1 (en) Method of monitoring cellular trafficking of peptides
US10683559B2 (en) G-protein coupled receptor (GPCR)-based biosensors and uses thereof
Araki et al. The Saccharomyces cerevisiae spindle pole body (SPB) component Nbp1p is required for SPB membrane insertion and interacts with the integral membrane proteins Ndc1p and Mps2p
Bugnicourt et al. Antagonistic roles of ESCRT and Vps class C/HOPS complexes in the recycling of yeast membrane proteins
US9150850B2 (en) Compositions and methods for analyzing protein interactions
Bogorodskiy et al. Accessing mitochondrial protein import in living cells by protein microinjection
Yumerefendi et al. Library-based methods for identification of soluble expression constructs
Shaw et al. Identifying a species-specific region of yeast TFIIB in vivo
RU2802770C2 (ru) Дрожжевой дисплей белков в периплазматическом пространстве
EP2516702A1 (en) Protein display
EP1808495A1 (en) Method and kit for detecting interactions between transcriptionally active proteins
Ivanusic et al. Improved split-ubiquitin screening technique to identify surface membrane protein-protein interactions
CN109666698B (zh) 一种基于Tim-3/Galectin-9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法
EP1847604A1 (en) Intracellular method for selecting a peptide or polypeptide which binds to a bait peptide or polypeptide
WO2009088991A2 (en) Flow cytometric gfp-based yeast two hybrid system
US20070178460A1 (en) Method for the identification of suitable fragmentation sites in a reporter protein
Lo Nuclear export and cytoplasmic maturation of the large ribosomal subunit
Bailey Improving the Yeast Three-Hybrid System for High-Throughput Target Discovery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40043087

Country of ref document: HK