CN105452546A - 与真核细胞调节剂相关的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

一种用于鉴定真核细胞的蛋白调节剂的方法，其通过在真核细胞内表达潜在激动剂的组合库，然后直接选择靶分子的激动剂来实施。一些方法涉及共同培养表达潜在激动剂的组合库的细胞以及第二细胞，然后选择调节第二细胞的表型或调节在第二细胞中期望的细胞应答反应的剂。优选地，所述激动剂是被引入到初始细胞并在其中表达的抗体，例如激动剂抗-EpoR、抗-TpoR或G-CSFR抗体。本发明还公开了用于从组合抗体库选择能调节细胞表型的双特异性抗体的方法。

Description

与真核细胞调节剂相关的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求(于2012年8月31日提交的)美国临时申请号61/695527和(于2013年4月22日提交的)美国临时申请号61/814646的优先权。这些优先权申请的全文为了本文的目的以引用的方式整体并入本文中。
背景技术
功能性抗体是治疗多种疾病的重要治疗方法选择。目前，免疫化学领域将注意力转向更具挑战性的目标，例如产生其中有用分子可以是非常稀有的广谱中和抗病毒抗体。该频繁发生的问题很大程度上由于组合抗体库的出现而得以解决，其中如今人们可以从包含多达1011个不同的成员的组成库中选择。例如，该方法的功效已在流感病毒的研究中得到证实，其中稀有抗体的选择导致新的病毒中和模型的发现，从而为治疗并且甚至通用型疫苗的产生提供了先前未能实现的可能性。
然而，即使对该频繁发生的问题已有了解决方案，针对其功能远超过简单结合的抗体的分离仍是一个艰难的过程。因此在本领域中需要能从候选分子库中鉴别功能性抗体的更好的方法。本发明涉及该需求以及其它需求。
发明内容
在一方面，本发明提供了鉴定调节真核细胞的表型的调节蛋白剂(例如抗体或其它多肽)的方法。该方法要求首先在真核细胞类型的细胞群中表达候选剂(例如抗体或其抗原结合片段)的库。这将产生表达该候选剂的经修饰的异质细胞群体。优选地，在每种细胞表达不超过3种不同的候选剂的库的成员的条件下，将候选剂的库导入到所述起始同质的细胞群体中并被表达。在一些所述优选实施方案中，每种细胞表达仅所述导入的外源性剂中的一种。随后选择至少一种特定的表达剂(agent-expressing)的细胞，其具有与相同真核细胞类型的未修饰的对照细胞相比经修改的表型。这允许将在特定表达剂的细胞中表达的特定候选剂(例如激动剂抗体)鉴定为真核细胞类型的调节剂。
通常，候选剂的库是分泌的多肽或肽(例如分泌的抗体或胞内抗体)的组合库。在一些实施方式中，所述剂的组合库是通过慢病毒载体或逆转录病毒载体在细胞中表达的抗体库。在一些优选实施方式中，在所述方法中采用的细胞类型是哺乳动物细胞类型。在本发明的一些方法中，在选择期间，其调节抗体有待鉴定的细胞被培养在限制扩散介质中。本发明的一些方法进一步包括分离编码所述特定候选抗体的多核苷酸序列，以及测定该经鉴定的候选抗体的核苷酸序列以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
在一些实施方式中，有待调整或调节的表型是细胞的应答反应或细胞的信号传导活动。在一些实施方式中，所述真核细胞类型是干细胞类型，且所述表型是所述干细胞的分化。在本发明的一些方法中，通过靶分子介导该待调节的表型。在一些实施方式中，由肿瘤抑制基因或致癌基因编码该靶分子。在一些其它实施方式中，该靶分子是分泌的激素或细胞因子，例如促红细胞生成素，血小板生成素或IL-1。在一些实施方式中，所述靶分子是细胞的信号传导受体。例如，其可以是针对分泌的激素或细胞因子的受体。本发明的一些实施方式涉及鉴定表型调节剂，所述表型调节剂是异二聚体双特异性抗体。在一些实施方式中，所述经鉴定的双特异性抗体结合至靶分子上的两种不同的表位。
在一些实施方式中，所述经鉴定的调节剂抗体激活(agonize)所述靶分子。在一些其它实施方式中，所述经鉴定的调节剂抗体拮抗所述靶分子或拮抗所述靶分子的抑制剂。在一些子实施方式中，所述选择是在抑制剂的存在下实施。在一些实施方式中，所述选择可进一步包括在针对表型选择在所述细胞内表达所述结合剂抗体之前，筛选候选抗体的库，以鉴定所述靶分子的结合剂。例如可通过噬菌体展示方法鉴定该靶分子的结合剂抗体。在本发明的一些其它方法中，待调节的表型是在所述真核细胞类型中表达靶分子或标志基因。例如，所述经鉴定的抗体调节剂可调节细胞表面受体的表达。
在相关方面，本发明提供调节真核细胞表型的抗体的鉴定方法。这些方法涉及(a)在每种细胞表达不超过3种不同的抗体种类的条件下，在第二细胞类型的同质细胞群中表达候选抗体或其抗原结合片段的库，以产生表达抗体细胞的异质群体，(b)共同培养所述真核细胞类型的细胞群体以及表达抗体的细胞的群体，以及(c)选择特定表达抗体的细胞，该特定表达抗体的细胞改变所述真核细胞类型的表型。这导致将在特定表达抗体的细胞中表达的候选抗体鉴定为真核细胞类型的调节剂。在一些实施方式中，在表达抗体的细胞群体的每一种细胞中表达仅一种不同的抗体库成员。
一些所述方法涉及鉴定患病哺乳动物细胞的抗体调节剂。例如，所述方法可用于选择调节某些肿瘤细胞表型(例如停止或延缓肿瘤细胞生长)的抗体。在一些实施方式中，通过靶分子介导所述表型。在一些所述实施方式中，所述经鉴定的候选抗体是所述靶分子的拮抗剂。
在另一方面，本发明提供鉴定蛋白或多肽剂(抗体、多肽或肽)的方法，所述蛋白或多肽剂能沿着期望的途径重编程或转分化(reprogramingortrans-differentiating)靶细胞。这些方法涉及(1)在携带由所述靶细胞表达的信号传导受体的报告细胞中表达候选多肽剂的库，从而制备经修饰的表达剂的报告细胞的异质群体，(2)从所述细胞的异质群体中鉴定表达剂受体细胞亚群，其具有激活的信号传导的受体，(3)从所述经鉴定的细胞亚群分离激动剂组，以及(4)使所述激动剂组接触所述靶细胞群，并选择具有指示转分化的特定表型的细胞。
一些所述方法涉及重编程靶细胞，所述靶细胞为体细胞或谱系限制性干细胞(lineagerestrictedstemcells)。一些方法特别涉及鉴定用于重编程靶细胞的激动剂抗体或抗原结合片段。在一些方法中，所述候选剂和所述受体被共同整合入所述报告细胞的胞质膜中。在各实施方式中，在所述受体细胞中待共表达的受体是通常促进所述靶细胞中特定表型的受体。在一些方法中，用于鉴定激动剂的受体是G-CSFR，以及显示所述靶细胞的转分化的特定表型是神经形成。
在另一方面，本发明提供结合人促红细胞生成素受体的抗体或其抗原结合片段。这些抗体具有与包含以下项的抗体相同的结合特异性：(1)分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(2)分别如SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：14中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或(3)分别如SEQIDNO：15、SEQIDNO：16和SEQIDNO：17中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：18、SEQIDNO：19和SEQIDNO：20中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有基本上分别与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和基本上分别与SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。本发明的一些抗体具有分别与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。本发明的一些抗体具有分别如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列。
本发明的一些其它实施方式涉及特定的抗-TpoR激动剂抗体、抗-G-CSFR激动剂抗体或本文中描述的诱导干细胞分化的抗体。一些所述抗体具有与包含以下项的抗体相同的结合特异性：(1)分别如SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：38、SEQIDNO：13和SEQIDNO：39中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(2)分别如SEQIDNO：43、SEQIDNO：44和SEQIDNO：45中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：46、SEQIDNO：13和SEQIDNO：47中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(3)分别如SEQIDNO：51、SEQIDNO：52和SEQIDNO：53中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：54、SEQIDNO：55和SEQIDNO：56中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或(4)分别如SEQIDNO：60、SEQIDNO：61和SEQIDNO：62中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：63、SEQIDNO：64和SEQIDNO：65中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
一些本发明的所述抗体具有：(1)分别与SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37相同或基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：38、SEQIDNO：13和SEQIDNO：39相同或基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(2)分别与SEQIDNO：43、SEQIDNO：44和SEQIDNO：45相同或基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：46、SEQIDNO：13和SEQIDNO：47相同或基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(3)分别与SEQIDNO：51、SEQIDNO：52和SEQIDNO：53相同或基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：54、SEQIDNO：55和SEQIDNO：56相同或基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或(4)分别与SEQIDNO：61、SEQIDNO：62和SEQIDNO：63相同或基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：64、SEQIDNO：65和SEQIDNO：66相同或基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。一些所述抗体具有分别如以下所示的重链可变区序列和轻链可变区序列：(1)SEQIDNO：33和SEQIDNO：34；(2)SEQIDNO：41和SEQIDNO：42；(3)SEQIDNO：49和SEQIDNO：50；或(4)SEQIDNO：58和SEQIDNO：59。
在各实施方式中，本发明的受体激动剂抗体是scFv抗体片段。一些所述抗体包含融合至人IgG1的Fc部分的scFv抗体片段。在一些相关实施方式中，本发明提供分离的或重组的多核苷酸，其编码本文所公开的受体激动剂抗体的重链可变区或轻链可变区。
在另一方面，本发明提供二聚体双特异性抗体或其抗原结合片段，其结合人促红细胞生成素受体或人整合素α3链。这些双特异性抗体具有：(1)第一单体(monomer)，其包含分别与SEQIDNO：9-14基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，以及第二单体，其包含分别与SEQIDNO：15-20基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或(2)第一单体，其包含分别与SEQIDNO：69-74基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，以及第二单体，其包含分别与SEQIDNO：78-83基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
一些所述抗体结合人EpoR，并具有第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别与SEQIDNO：9-14相同或基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，所述第二单体包含分别与SEQIDNO：15-20相同或基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。一些本发明的所述抗-EpoR双特异性抗体具有第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别如SEQIDNO：21和SEQIDNO：22中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列，所述第二单体包含分别如SEQIDNO：23和SEQIDNO：24中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列。
一些本发明的双特异性抗体结合人整合素α3链，并具有第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别与SEQIDNO：69-74相同或基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，所述第二单体包含分别与SEQIDNO：78-83相同或基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。一些本发明的所述抗-整合素α3链双特异性抗体具有第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别如SEQIDNO：67和SEQIDNO：68中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列，所述第二单体包含分别如SEQIDNO：76和SEQIDNO：77中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列。
在一些实施方式中，所述双特异性抗体的每个单体是scFv抗体片段，且所述单体的每一个的可变区序列融合至人IgG1的Fc部分。在一些相关实施方式中，本发明提供分离的或重组的多核苷酸序列，其编码本文所公开的所述双特异性抗体的第一单体或第二单体的重链可变区或轻链可变区。
通过参考以下部分的说明书和权利要求书可进一步理解本发明的本质和优点。
附图说明
图1是显示从组合库中选择抗体激动剂的方案图。通过基于亲和性的选择，从在噬菌体中展示的抗体组合库中选择结合EpoR的抗体。源自所述选择的噬菌体的抗体基因被克隆入慢病毒载体，以允许在感染真核细胞以及将所述抗体基因整合入所述基因组之后选择表型。该转导的细胞被接种至甲基纤维素琼脂(methylcelluloseagar)，使得分泌的抗体聚集在产生所述抗体的细胞的周围。采用显微操作器(micromanipulator)收集已形成的集落，并通过PCR回收所述抗体基因。克隆并测序PCR产物，以及检测各抗体或抗体组合的活性。在哺乳动物细胞中表达所述活性抗体，并纯化，以作进一步的表征。
图2A-2B显示激动剂抗体的选择。(A)Western印迹分析显示EF1α是比UbC启动子更强的用于抗体合成的启动子。因此，在所有进一步的实验中采用具有EF1α启动子的慢病毒载体。在不含细胞因子的甲基纤维素琼脂中培养用hEpoR-T2A-GFP和抗体库共同转导的TF-1细胞2-3周。(B)显示了集落，其中采用亮场显微镜技术以研究所述集落的形态学和颜色或者采用荧光显微镜技术监控EpoR的表达。将用EPO基因转导的TF-1细胞用作为阳性对照。用显微操作器收集其生长不依赖于EPO的集落。将来自所述选择的细胞集落的单一抗体基因转染入HEK293T细胞，以产生抗体。
图3A-3B显示源自转染的抗体协同作用。(A)采用来自HEK293T细胞转染48小时后的条件培养基检测各个抗体诱导TF-1细胞增殖的能力。在微孔滴定板中将TF-1细胞与等体积条件培养基混合，并在无EPO的条件下培养72小时。通过MTS实验测定存活细胞的数量。抗体E-1是具有天然可信的EPO(authenticEPO)的活性的约60％的最强激动剂。(B)为了研究协同作用，将从相同集落分离得到的两种不同的抗体基因的组合转染入HEK293T细胞。采用转染48小时后获得的条件培养基检测TF-1细胞的增殖。将所述TF-1细胞与等体积的条件培养基混合，并在无EPO的条件下培养72小时。通过MTS实验测定存活细胞的数量。用所述V-1/V-3基因共同转染，可获得与EPO相同的最强活性。
图4A-4D显示在抗体蛋白质构建中的协同作用。从HEK293T细胞纯化所述采用“把手-孔洞”技术(″Knob-into-Hole″technology)产生的单一抗体V-1和V-3以及双特异性抗体V-1/V-3(BsAb)。(A)采用具有TA电泳缓冲液的7％Tris-醋酸盐凝胶分析该经纯化的蛋白。(B)采用″pulldown″实验检测结合EpoR的抗体。将不同的抗体与hEpoR-his标签的胞外域混合。用His-标签戴诺磁珠(His-tagDynabeads)捕获的复合物以及结合的抗体采用抗-Fc：HRP抗体进行检测。(C)针对异二聚体BsAb以及同型二聚体抗体E-1(最有效的单一抗体(图3A))刺激所述EPO-依赖的TF-1人红白血病细胞增殖的能力的剂量反应曲线图。所述BsAb的最大反应与EPO相同，表明其为完全激动剂，而最强的同型二聚体抗体E-1显示仅为天然EPO产生的最大反应的60％。(D)为了证明所述经纯化的EpoR胞外域Fc嵌合体抑制所述抗体激动剂活性，在增加浓度的EpoR胞外域Fc融合蛋白的存在下用10nM浓度的抗体处理TF-1细胞。
图5A-5C显示所述EpoR信号传导途径的激活。(A)将TF-1细胞保持在添加了EPO或各种浓度的所述BsAb的亚适浓度(suboptimalconcentration)的GM-CSF(O.1ng/mL)中1周。细胞形成团块，并通过观察所述细胞团块的颜色以及采用抗-血红蛋白抗体作为探针的Western印迹来分析裂解物中血红蛋白的产生。(B)为了研究诱导的JAK2和Stat5的磷酸化，在37℃用2ng/mLGM-CSF、4IU/mLEPO或所述BsAb处理细胞因子消减型TF-1细胞30分钟。未刺激的细胞用作为对照。将一半细胞裂解物与抗-JAK2抗体进行免疫沉淀(IP)，然后用抗-磷酸酪氨酸抗体(B)进行Western印迹分析(WB)。在剥离膜之后，用抗-JAK2抗体检测所述凝胶带中JAK2的总数。采用拮抗phospho-Stat5(Tyr694)和Stat抗体的抗体进行另一半细胞裂解物的Western印迹分析。对TF-1细胞(左边)或用wthEpoR补体致活的工程化TF-1细胞(右边)进行所述实验。(C)所述BsAb诱导人干细胞的红系细胞分化。将从骨髓新鲜分离的人CD34+造血干细胞与掺入软琼脂中的所述BsAb或Epo一起温育14天。呈现典型的红CFU-E集落。
图6显示由激动剂抗体激活EpoR的潜在机制。就EPO而言，有效的激动剂活性可能跟异二聚体双特异性抗体的不对称结合有关。不对称结合使所述D1和D2胞外域适应于通过所述JAK2/Stat5途径的最佳信号传导。对肽激动剂而言，同型二聚体抗体(E-1)仅是部分激动剂，表明更多的对称与更少的活化相互影响(Livnah等.，Science273：464，1996)。结合但不激活EpoR的抗体可能在阻止所述抗体的二价连接的方向上仅结合所述EpoR未结合配体的(unliganded)二聚体的一个臂。
图7A-7D显示构建用于表达svFv-Fv融合蛋白的质粒工具盒(toolkitplasmids)的结构的示例示意图。(A)噬菌粒载体。(B)具有任选的启动子和编码作为分泌信号序列的所述IL2信号肽的基因的慢病毒质粒。编码scFv的基因融合至编码IgG的Fc部分的基因。(C)具有融合至Fc的scFv的哺乳动物表达质粒。(D)通过T2A-介导的核糖体跳跃(skipping)共同翻译hEpoR和GFP的慢病毒载体。
图8A-8B显示在荧光报告子实验和细胞增殖实验中Tpo激动剂抗体的剂量反应。(A)在整个所述指示的浓度范围内用激动剂抗体或Tpo刺激表达所述TpoR-IL6ST嵌合受体的报告细胞5小时，在此之后所述细胞与LiveBLAzer-FRETB/G底物共同温育2小时。以荧光发射比率(460nm-至-530nm)对所述指示的浓度绘制图。HEK293TSIE-BLA细胞用作为阴性对照。(B)在整个所述指示的浓度范围内用激动剂抗体或Tpo刺激Tpo-依赖型Ba/F3-hMPL细胞72小时，并用MTS实验测定细胞增殖。Ba/F3细胞或EPO-依赖型TF-1细胞用作为阴性对照。为了计算EC50，用GraphPadPrism6将所述数据拟合至4-参数逻辑模型(4-parameterlogisticmodel)。
图9显示了由Tpo激动剂抗体介导的信号转导。利用与抗-JAK2琼脂糖的亲和性从细胞裂解物中纯化JAK2，并且利用抗-磷酸酪氨酸抗体通过Western印迹检测其磷酸化。由细胞裂解物的直接Western印迹检测激动剂抗体或rhTpo刺激诱导的STAT3、STAT5、Akt和MAPK的磷酸化。
图10显示在Balb/C小鼠中所述Tpo激动剂抗体3D9的体内活性。在第0天皮下(s.c.)注射150≠g/kg浓度的抗体、500≠g/kg浓度的抗体或所述PBS溶媒一次，并且采用Unopette在2周内每隔一天采集血液。用血细胞计数器(Hemacytometer)计数血小板。
图11A-11D显示由选择的抗体3B3识别并激活所述G-CSF受体。
图12A-12F显示连接至未涂覆的盖玻片的所述CD34+细胞，所述CD34+细胞已用指示神经发育的所述选择的G-CSFR激动剂抗体处理2周。
发明详述
I.概述
本发明是部分建立在本发明人开发的方法的基础上，该方法为了调节细胞表型的目的，利用抗体组合库赋予细胞新的结合能全景图(bindingenergylandscapes)。如在以下实施例中详细描述的，所述方法采用在细胞内表达的大型抗体组合库，其允许直接选择激动剂的有效拟表型。具体地，直接依据功能(即，表达所述抗体的细胞的改变的表型)而非简单结合选择在细胞中表达的抗体。为了确保调节的表型与特定种类抗体的容易关联，在允许每种细胞表达不超过约2或3种抗体的条件下将所述抗体库导入所述细胞并在其中表达。这可通过经由本文示例的基于慢病毒的载体系统将所述抗体库的成员导入所述细胞而得以实现。在一些实施方式中，以低的感染复数(MOI，multiplicityofinfection)(例如小于1)用编码抗体的病毒感染所述细胞。在这些条件下，各个细胞将可能仅表达一种不同的所述抗体库成员。在这些实施方式中选择的抗体通常是同型二聚体分子。在一些其它实施方式中，期望除了曾经导入所述细胞的初始组合多样性以外的所述抗体库的额外多样性，例如其对于产生如本文所示例的异二聚体双特异性抗体是期望的。这可通过在略高的MOI(例如，在约2或3)感染编码抗体的病毒而得以实现，其原因在于多于1种的慢病毒可感染单一细胞。在scFv抗体库的情况下，在细胞内所述抗体分子自身的不同Fv结构域发生重配(re-assortment)导致额外的多样性。
本发明的所述方法的优点部分得自选择而非筛选。本文中公开的选择方案使得可直接将改变的表型与特定抗体调节剂或配体(例如，EpoR抗体或TpoR抗体)关联。这样的效果难以通过仅针对结合而进行筛选或通过设计而获得。这也有别于一些传统的高通量筛选方案，所述传统的高通量筛选方案中不同的组合的编码抗体的序列被转染入相同宿主细胞，以用于功能分析(参见例如美国专利号7,884,054)。一旦在这样的筛选方案中鉴定了阳性克隆，需要分离抗体序列并进行额外实验，以鉴定呈现观察到的表型的特定分子。
本发明的所述选择方法的优点还可表示为能选择非常稀有的抗体(例如，双特异性EpoR抗体或转分化G-CSFR抗体)。这些稀有的抗体中的一些是有效的完全促红细胞生成素激动剂，其个体发生依赖于：所述相同细胞中表达的抗体对的蛋白水平上的所述重组，以产生异二聚体双特异性抗体。在所述抗体的单体亚单位的不同结合特异性之间的专性协同作用呈现复制天然促红细胞生成素(Epo)的不对称结合机制。例如，本文选择的所述双特异性EpoR抗体具有完全激动剂活性，并且呈现需要两种不同的结合特异性协作，所述两种不同的结合特异性的激动剂机制类似于EPO与所述EpoR的不对称相互作用。因此，事实上虽然具有两种特异性的抗体可结合所述EpoR，但是当它们在所述相同分子中被组合时它们仅是激动剂，这表明了它们的功能远超过所述EpoR的简单二聚化；或者它们与由部分激动剂、拮抗剂、拮抗剂或未结合配体的二聚体(图6)产生的其它二聚体构造不同。
由于在细胞内部新蛋白结合能的表达对细胞表型产生干扰，本发明的所述选择系统可呈现多种效果。如在以下实施例中所证实的，本发明的方法允许识别细胞表型的同型二聚体单特异性抗体激动剂和异二聚体双特异性抗体调节剂和信号传导级联反应。在一些优选的实施方式中，在构建所述抗体库中采用的所述病毒是疱疹性口腔炎病毒(vesicularstomatitisvirus)/慢病毒假型。这些病毒具有广谱宿主，因此可用于多种细胞。尽管本发明用抗体作为示例，但是本申请还包括其它多肽的库的直接表型选择，每一种多肽在细胞群内表达后具有不同的结合可能性。
在相关实施方式中，本发明证实了所述选择方案可允许人们鉴定能重新编程已分化的靶细胞或谱系限制性干细胞的蛋白激动剂。本发明的示例是选择G-CSFR抗体激动剂，所述G-CSFR抗体激动剂可将人髓系CD34+干细胞转分化成神经前体细胞。具体地，从细胞内库选择作为粒细胞集落刺激因子受体的激动剂的抗体，这种选择是基于其在报告细胞中能激活信号传导途径的能力。通过专门的“邻近”方法(″nearneighbor″approach)，所述整个抗体库及其靶受体被共同整合入报告细胞群的胞质膜。这种形式有利于受体和它们的蛋白配体之间的罕见的相互作用，并确保所述抗体以自分泌的方式对产生其的细胞起作用。因此，已发现，与激活细胞以沿着预定途径分化的天然粒细胞集落刺激因子不同的是，一些分离的激动剂抗体将人髓系CD-34+骨髓细胞转分化成神经前体细胞。这种由激动剂抗体介导的转分化不同于较常规使用的方法，因为启动是非遗传的(agenetic)。在所述胞质膜起作用的抗体可具有治疗潜能，用作为转分化自体细胞的药剂。
作为本文的示例，一种强效的形式采用阳性选择，这是因为其提供自身用于容易回收功能性抗体。然而，针对对发现癌症治疗新靶标是重要的阴性选择事件(诸如细胞死亡)，还允许在该形式中有轻微的变化。在一些所述实施方式中，可采用共同培养产生抗体的差异标记的饲养细胞(“生产细胞”)和靶细胞(“指示细胞”)，然后选择其中由于靶细胞已被杀死从而仅存在饲养细胞的集落或斑块(plaques)。在一些实施方式中，未预先选择任何靶标的抗体库可用于分离通过干扰调节分子间接起作用的抗体激动剂。例如，这可能对以下是有用的：选择调节干细胞分化的抗体，鉴定肿瘤抑制基因产物，或产生治疗激动剂而不是其它现有的(例如，促血小板生成素拟表型)。本文示例包括选择促血小板生成素激动剂抗体，基于形态发生表型选择干细胞分化的抗体调节剂，以及基于自分泌信号传导选择粒细胞集落刺激因子(GCSF)激动剂抗体。最后，本发明的方法在鉴定新的治疗靶标方面是有用的，甚至是在抗体不能靶向所述新的治疗靶标时亦是有用的。因此，当鉴定的是专门在细胞内的分子时，它们可以是用于小分子治疗法的新颖的靶标。这对于癌症可能是尤为重要，其中靶标对某些类型癌症或甚至是从个体患者分离的肿瘤可能是专有的。
一些本文示例的抗体是有用的具有新颖功能性质和结构性质(例如EpoR双特异性抗体或转分化G-CSFR抗体)的免疫化学试剂。例如，本发明的选择方法是有效的，足以鉴定强效的双特异性异二聚体Epo-激动剂抗体，该激动剂抗体复制在天然细胞因子受体信号传导途径中采用的复杂的不对称结合机制。
II.定义
除非另有说明，本文所采用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本发明中采用的多数术语的通常定义：AcademicPressDictionaryofScienceandTechnology，Morris(Ed.)，AcademicPress(1sted.，1992)；OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology，Smith等.(Eds.)，OxfordUniversityPress(reviseded.，2000)；EncyclopaedicDictionaryofChemistry，Kumar(Ed.)，AnmolPublicationsPvt.Ltd.(2002)；DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology，Singleton等.(Eds.)，JohnWiley&Sons(3rded.，2002)；DictionaryofChemistry，Hunt(Ed.)，Routledge(1sted.，1999)；DictionaryofPharmaceuticalMedicine，Nahler(Ed.)，Springer-VerlagTelos(1994)；DictionaryofOrganicChemistry，KumarandAnandand(Eds.)，AnmolPublicationsPvt.Ltd.(2002)；和ADictionaryofBiology(OxfordPaperbackReference)，MartinandHine(Eds.)，OxfordUniversityPress(4thed.，2000).此外，还提供以下定义，以帮助读者理解本发明的案例。
术语“抗体”或“抗原结合片段”是指多肽链，其显示强的结合至给定抗原、表位或各表位的一价、二价或多价结合价。除非另有说明，在本发明中采用的抗体或抗原结合片段可具有衍生自任意脊椎动物、骆驼科、鸟类或鱼类动物的序列。它们可通过采用任何适当的技术制备，例如杂交瘤技术，核糖体展示技术，噬菌体展示技术，基因改组库(geneshufflinglibraries)，半合成或全合成库或其组合。除非另有说明，本发明中采用的术语“抗体”包括完整的抗体、抗原结合多肽片段以及下文中描述的或本领域中(参见，例如Serafini，JNucl.Med.34：533-6，1993)公知的其它设计抗体。
完整的“抗体”通常包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链(约50-70kD)和两条轻(L)链(约25kD)。公认的编码抗体链的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、α、γ、δ、ε、和μ恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为kappa或lambda型。重链被分为γ、μ、α、δ或ε型，其依次定义所述免疫球蛋白类型分别为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
抗体的每一条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区由三个区，即CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个结构域，即CL组成。重链可变区和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞和经典补体系统的第一组分(Clq)。
抗体的VH和VL区可进一步细分为超变区，又称为互补决定区(CDR)，其之间分布着更保守的骨架区(FR)。每一条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR和FR区的定位以及编号系统为如在例如Kabat等.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，U.S.GovernmentPrintingOffice(1987and1991)中所定义。
在本发明中待采用的抗体还包括抗体片段或抗原结合片段，其包含保留结合所述同源抗原的能力的完整抗体的抗原结合部分。所述抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含由二硫桥键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由完整抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)二硫键稳定的Fv(dsFv)，其具有在结构上保守的骨架区之间工程化的链间二硫键；(vi)由VH结构域组成的单一结构域抗体(dAb)(参见，例如Ward等，Nature341：544-546，1989)；(vii)分离的互补决定区(CDR)。
适用于实施本发明的抗体还包括单链抗体。术语“单链抗体”是指包含以多肽连接的(通常通过间隔肽连接的)VH结构域和VL结构域的多肽，并且其可在氨基末端和/或羧基末端包含额外的结构域或氨基酸序列。例如单链抗体可包含用于连接至所述编码多肽的系链部分(tethersegment)。例如，单链可变区片段(scFv)是单链抗体。与由独立基因编码的所述Fv片段的VL和VH结构域相比较，scFv具有由合成的连接子(例如通过重组体方法)连接的两个结构域。这使得它们能被制备成单蛋白链，其中所述VL和VH结构域配对以形成一价分子。
在本发明的实践中可采用的抗体还可包括具有骆驼科动物支架(camelidscaffold)的单结构域抗原结合单元。骆驼科中的动物包括骆驼、美洲驼(llama)和羊驼。骆驼科动物产生不含轻链的功能性抗体。重链可变(VH)结构域自发折叠并独立地起抗原结合单元的作用。与经典的抗原结合分子(Fab)或单链可变片段(scFv)中的六个CDR相比，其结合表面仅涉及三个CDR。骆驼科动物抗体能获得与传统抗体相似的结合亲和性。
本文所描述的各种抗体或抗原结合片段可通过以下方式制备：完整抗体的酶修饰或化学修饰，或者采用重组DNA方法从头合成，或者采用噬菌体展示库鉴定。用于产生这些抗体或抗原结合片段的方法是本领域中公知的。例如，单链抗体可采用以下方式鉴定：噬菌体展示库或核糖体展示库、基因改组库(参见，例如，McCafferty等，Nature348：552-554，1990；和U.S.Pat.No.4,946,778)。尤其是，scFv抗体的制备可采用在以下中描述的方法：例如，Bird等，Science242：423-426，1988；和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883，1988。Fv抗体片段可采用如在Skerra和Plückthun，Science240：1038-41，1988中描述的方法制备。二硫键稳定的Fv片段(dsFv)可采用如在Reiter等，Int.J.Cancer67：113-23，1996中描述的方法制备。类似地，单结构域抗体(dAb)可通过多种方法制备，例如在Ward等，Nature341：544-546，1989；和Cai和Garen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：6280-85，1996中描述的方法。骆驼科单结构域抗体可采用本领域中公知的方法制备，例如Dumoulin等，NatureStruct.Biol.11：500-515，2002；Ghahroudi等，FEBSLetters414：521-526，1997；和Bond等，JMolBiol.332：643-55，2003中描述的方法。其它类型的抗原结合片段(例如Fab、F(ab′)2或Fd片段)还可通过常规免疫学方法容易制备得到。参见，例如Harlow&Lane，UsingAntibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1998.
胞内抗体(intrabody)是一种在细胞内起作用以结合至胞内蛋白的抗体。由于缺乏用于将抗体从细胞外环境带入细胞的可靠机制，其通常需要在所述靶细胞内表达所述抗体。由于抗体通常被设计成从所述细胞分泌，胞内抗体需要进行特殊修饰，包括采用单链抗体(scFv)，修饰免疫球蛋白VL结构域的超稳定性，选择耐受更缩小的(reducing)细胞内环境的抗体，或者表达为与麦芽糖结合蛋白或其它稳定细胞内蛋白融合的融合蛋白。
亲和性通常用缔合平衡常数或解离平衡常数(分别为Ka或Kd)来表示，其依次为解离速率常数和缔合速率常数(分别为Kd和Ka)的反比。因此，只要所述速率常数的比率保持相同，等效亲和性可对应于不同的速率常数。
术语“接触”具有其通常的含义，并且是指结合两种或两种以上的剂(例如多肽或噬菌体)、结合剂和细胞，或者结合两种不同细胞群体。接触可发生在体外，例如在试管或生长培养基中将两种多肽混合或将抗体群与细胞群混合。接触还可发生在细胞内或发生在原位，例如，通过在编码两种多肽的重组多核苷酸的细胞中共同表达使得所述两种多肽在细胞内接触，或者在细胞裂解物中使两种多肽接触。
“融合”蛋白或多肽是指由至少两种多肽以及可操作地将所述两种多肽连接成一种连续多肽的连接序列或连接键(linkage)组成的多肽。被连接成融合多肽的所述两种多肽通常衍生自两种独立的来源，因此融合多肽包含两种连接的多肽，该两种连接的多肽通常在自然界中未经发现是连接的。
“异源性”，在用于提及两种多肽时，指示在自然界中未发现所述两种多肽存在于相同细胞中或相同微生物中。等位基因变异或天然发生的突变事件不会产生如本文所述的异源性生物分子或序列。载体构建物的“异源性”区域是在更大的多核苷酸分子内的多核苷酸的可识别部分，该多核苷酸未被发现与自然界中所述更大分子相关联。因此，当所述异源性区域编码哺乳动物基因时，所述基因通常具有多核苷酸侧翼，该多核苷酸侧翼在所述有机体源的基因组中不以所述哺乳动物基因组多核苷酸作为侧翼。
“配体”是由特定抗原、受体或靶分子识别的分子。本发明的实施中可采用的配体的实例包括，但不限于细胞膜受体的激动剂和拮抗剂，毒素和毒液，病毒表位，激素，激素受体，多肽，肽，酶，酶底物，辅因子，药物(例如阿片制剂，类固醇类等)，凝集素，糖，多核苷酸，核酸，寡聚糖，蛋白，和单克隆抗体。
“键合(linkage)”是指可操作地或功能上连接两种生物分子(例如多肽或编码两种多肽的多核苷酸)的方式，包括，但不限于，重组融合，共价键结合，二硫键结合，离子键结合，氢键结合，以及静电结合。“融合”是指通过共价键结合的键合。“连接子”或“间隔基”是指将两种生物分子连接并用于使该两种分子处于具有最小空间位阻的优选构型的分子或分子群。
感染复数或MOI是指传染剂(例如噬菌体或病毒)与感染靶标(例如细胞)的比率。例如，当提到用传染性病毒颗粒接种的细胞群时，所述感染复数或MOI是在限定空间内传染性病毒颗粒数量与靶细胞数量的比率。
术语“可操作连接”，在提及核酸时，是指处于功能关系的各多核苷酸元件的键合。当核酸与另一核酸序列被放置处于功能关系时，所述核酸是“可操作连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，所述启动子或增强子可操作连接至所述编码序列。将DNA序列连接的可操作连接方式通常是邻接的，并且当必须将两个蛋白编码区连接时，所述可操作连接方式是邻接的并且位于阅读框内。
如本文中所采用的，表型选择或选择改变的表型是指一种方法，其中检测在生产细胞(真核细胞类型细胞群)内表达的候选抗体库引起指示细胞的特定表型发生变化的能力。所述指示细胞可以是相同的产生所述抗体的细胞(生产细胞)或不同的细胞。待改变的所述指示细胞的特定表型可以是除了所述抗体特异性结合至靶分子以外任意的活动或者细胞过程。在所述抗体库(或表达抗体的生产细胞)接触指示细胞的同质群体之后，那些引起感兴趣表型的改变的抗体随后被鉴定为所述指示细胞的表型调节剂。
本文所采用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的多聚形式，其包含嘌呤碱基和嘧啶碱基，或者其它天然的、化学修饰的或生物化学修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基。本发明的实施方式的多核苷酸包括脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，核糖核苷酸(RNA)序列，或核糖核苷酸的DNA复制((cDNA)，其可以是从天然来源分离得到，可以是重组制备得到，或者人工合成得到。本发明的实施方式的多核苷酸的进一步实例可以是多酰胺多核苷酸(PNA)。所述多核苷酸或核酸可以单链或双链形式存在。所述多核苷酸的骨架可包括如通常可在RNA或DNA中发现的糖基和磷酸酯基，或者修饰的或取代的糖基或磷酸酯基。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸序列可被非核苷酸组分间断。由核苷酸构成的聚合物(例如核酸、多核苷酸)以及多核苷酸还可被称为“核苷酸聚合物”。
多肽是由通过酰胺键(肽键)相互连接的氨基酸残基单体组成的聚合物链。所述氨基酸可以是L-旋光异构体或D-旋光异构体。通常，多肽是指氨基酸残基的长链聚合物，例如那些由至少大于10、20、50、100、200、500或以上氨基酸残基单体组成的长链聚合物。然而，除非另有说明，本文所采用的术语多肽还包括短肽，其通常包含两种以上氨基酸单体，但通常不多于10、15或20个氨基酸单体。
蛋白质是通过肽键连接的氨基酸的长聚合物，其可包含两条或两条以上的多肽链。更具体地，术语“蛋白质”是指包含一条或多条处于特定顺序的氨基酸链的分子；例如，所述顺序是如通过在编码所述蛋白的基因中核苷酸的碱基序列所测定的。蛋白质是体细胞、组织和器官的结构、功能和调节所必需的，并且每一种蛋白具有独特的功能。实例为激素、酶和抗体。在一些实施方式中，术语多肽和蛋白质可相互替换使用。
除非另有说明，术语“受体”泛指具有针对给定配体的亲和性的分子。受体可以是天然形成的分子或人造分子。并且，它们可以其未修饰的状态被利用，或者以与其它物质聚集的形式被利用。受体可以直接或通过特定结合物质(共价或非共价)连接至结合元件。在本发明的实施中可采用的受体的典型实例是细胞表面信号传导受体。
术语“受试者”是指人或非人类动物(尤其是非人类哺乳动物)。除了人类之外，其还包括其它非人类动物，例如牛，马，羊，猪，猫，狗，小鼠，大鼠，兔，豚鼠，猴。
转分化，又称为谱系重编程，是一种其中一种成熟体细胞或谱系限制性干细胞未经历中间的多能态或前体细胞类型而转化成另一种成熟体细胞的方法。其是一种类型的组织转化，包括包含干细胞互换的所有细胞命运转换。转分化的现有用途包括疾病建模和药物发现，并且在将来可包括基因治疗和再生医疗。术语“转分化”最初由Selman和Kafatos创造(Celldifferentiation3：81-94，1974)，由于在蚕蛾中角质层形成细胞经历变形而变成分泌盐的细胞，因此其被创造用来描述细胞性质中的变化。
术语“靶标”、“靶分子”或“靶细胞”是指有待分析或检测的感兴趣分子或生物细胞，例如诸如细胞因子或激素之类的配体、多肽、细胞受体或细胞。
在外源性或异源性多核苷酸已被导入到细胞时，所述细胞已被所述外源性或异源性多核苷酸“转化”。转化DNA可以被或可以不被整合(共价连接)入所述细胞的基因组。在例如原核生物、酵母或哺乳动物细胞中，所述转化多核苷酸可被保持在诸如质粒之类的附加体元件(episomalelement)上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是其中所述转化多核苷酸已被整合入染色体使得其通过染色体复制经由子细胞而被遗传的细胞。通过所述真核细胞能建立由包含所述转化多核苷酸的子细胞群组成的细胞系或克隆的能力来证明该稳定性。“克隆”是由单一细胞或共同祖先经过有丝分裂衍生得到的细胞群。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。
肿瘤抑制基因或抗癌基因是防止细胞发展成癌的基因。当该基因发生突变导致其功能缺失或降低时，通常结合其它基因变化，细胞可发展成癌。肿瘤抑制基因的实例包括所述p53基因和所述p27Kipl细胞周期抑制基因。
“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其可连接另一种多核苷酸部分，以便实现所述连接的部分的复制。能指导编码一种或多种多肽的基因的表达的载体被称为“表达载体”。
III.在真核细胞内表达组合的抗体库
本发明提供允许人们直接选择真核细胞中的功能抗体的新颖方法。所述方法依赖于组合的抗体库的(通过例如慢病毒载体)构建，所述组合的抗体库在感染之后，导致抗体在所述真核宿主细胞内的有效表达。在所述细胞内表达的抗体可从所述细胞分泌或保持在所述细胞内作为细胞内抗体。因此，可实现通过所述抗体对细胞内和细胞外靶标的调节。通常，为了将观察到的表型变化与特定抗体分子或编码抗体的序列直接关联，在每种细胞表达不超过约2或3种不同的抗体或编码抗体的序列(例如scFv序列)的条件下将所述抗体库导入所述细胞并在其中表达。在一些实施方式中，重组产生的细胞的异质群中的每个细胞表达不超过一种所述抗体库的不同成员。采用如本文所示例的基于慢病毒或逆转录病毒的载体系统，其可通过以下得以实现：在相对低的感染复数(MOI)(例如不高于2或3)用表达所述抗体的病毒感染所述生产细胞或指示细胞。仅为了选择同型二聚体抗体，可在较低MOI(例如小于约1)实施所述病毒对所述细胞的感染。为了允许选择双特异性异二聚体抗体调节剂，可在较高MOI(例如约2或3)将所述表达抗体的序列转导入所述细胞。在这些条件下，对在表型实验中从阳性克隆分离的抗体进行很少的实验或不进行进一步实验，可直接从观察到的表型变化鉴定抗体。
本文所描述的方法可用于选择调节真核细胞的各种表型的抗体。在一些实施方式中，所述鉴定的抗体调节剂是靶分子的拟表型，该靶分子调节宿主真核细胞(例如促红细胞生成素)表型或引起宿主真核细胞(例如促红细胞生成素)中的细胞反应。通常，所述表型由靶分子(例如受体或信号传导配体)直接或间接介导，针对该靶分子，要在本发明的方法中选择抗体调节剂。可为激动所述靶分子(例如Epo或EpoR)的调节剂选择候选抗体。还可为拮抗所述靶分子(例如TNFα或致癌基因产物)或拮抗所述靶分子(例如IL-1α或IL-1β)的抑制剂(例如IL-1受体拮抗剂IL-1Rα)的调节剂选择候选抗体。
在一些实施方式中，所述组合的抗体库被表达在细胞群内，以选择相同类型细胞(“指示细胞”)的表型的抗体调节剂。在这些实施方式中，所述抗体可从所述细胞分泌或保留在细胞内作为细胞内抗体。在一些其它实施方式中，所述抗体在第二细胞类型(“生产细胞”)的细胞群中表达并分泌，用于选择所述指示细胞的表型的调节剂。在这些实施方式中，所述指示细胞通常与表达抗体的生产细胞在适当的条件下共同培养，以允许所述分泌的抗体与所述指示细胞相互作用。
所述抗体库可表达完整全长抗体或者包含完整抗体的抗原结合部分的抗原结合片段(即，保留结合同源抗体的能力的抗体片段)。由所述抗体库产生的抗体可以是单链或双链。在一些实施方式中，在真核生产细胞内表达单链抗体库。单链抗体库可包括单独的抗体重链或轻链或其可变结构域。更典型地，可由在单一邻接的蛋白内由适当的间隔基分隔开的重链可变结构域和轻链可变结构域的融合产生单链抗体库的成员。参见，例如Ladner等，WO88/06630；McCafferty等，WO92/01047。在其它实施方式中，通过非共价键连接独立表达的重链或轻链或其结合片段，可在所述生产细胞内形成双链抗体。从天然来源(例如免疫的或未经免疫的B细胞的非克隆群)获得编码抗体的序列可导致抗体库的多样性。替代地，或额外地，可通过对针对靶分子的抗体进行人工致突变，引入多样性。通常，在本发明中采用的抗体库包含至少102、103、104、105、106、107、108、109、1010或更多的不同成员或种类。
可根据本发明的选择方法的实施的需要，采用并修饰各种已知的抗体库。所述抗体库可包括与天然抗体库不相关的抗体。例如，天然抗体库(例如来自人脾脏细胞的scFv库)可根据如以下中所述的方法制备：Feldhaus等，Nat.Biotechnol.21：163-170，2003；和Lee等，Biochem.Biophys.Res.Commun.346：896-903，2006。Park等(AntiviralRes.68：109-15，2005)也描述了单链可变区片段(scFv)形式的大型未经免疫的人噬菌体抗体库。采用如Kausmally等(J.Gen.Virol.85：3493-500，2004)中描述的方法，可从提取自具有特定疾病的患者的外周血淋巴细胞的RNA制备衍生自所述患者的抗体库。替代地，所述抗体库可包括合成的抗体或(通过例如DNA改组或致突变)衍生自特定抗体的抗体。例如，Griffiths等(EMBOJ13：3245-3260，1994)描述了从大型合成抗体库(lox库)产生的人抗体库。本发明的一些实施方式可采用衍生自特定支架抗体的抗体库。这些抗体库可通过采用本文所描述的方法或本领域中公知的其它方法对所述参考抗体进行重组操作来制备。例如，Persson等(J.Mol.Biol.357：607-20，2006)描述了用于基于已知的半抗原-特异性scFv的改进的半抗原识别的关注的抗体库的构建。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抗体库表达诸如单链可变区片段(scFv)之类的单链抗体。适用于本发明的特定scFv库描述于以下的实施例中，并且还描述于本领域中的现有技术，例如Gao等，Proc.Natl.Acad.Sci.99：12612-6，2002。可用本领域中公知的各种载体产生或表达这样的抗体库。优选地，本发明中采用的抗体库通过基于慢病毒或逆转录病毒的载体构建。可根据本文中示例的技术或其它本领域中公知的方法实施用于在真核宿主细胞内表达的所述抗体库的构建。在一些实施方式中，用慢病毒载体构建所述抗体库。慢病毒载体是能转导或感染分裂细胞或非分裂细胞并通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。适用于本发明的基于慢病毒的载体的实例包括，例如本文所示例的慢病毒载体pLV2。例如，如在下文实施例中所详细描述的，可通过将编码所述scFv的SfiI消化的基因克隆入SfiI消化的pLV2载体以在与人IgG1的Fc部分相同的阅读框(从铰链至CH3)内表达scFv，从而产生基于慢病毒的组合的scFv抗体库。针对本发明的实施采用并修饰的其它慢病毒载体包括，例如pLVX-Puro，pLVX-IRES-Neo，pLVX-IRES-Hyg，和pLVX-IRES-Puro。具有克隆的抗体序列的各种慢病毒载体可被导入到用于表达所述抗体库的适当的宿主细胞。例如，在本发明中示例的TF-1细胞系和HEK293T细胞系以及其它本领域中公知的包装细胞系(例如Lenti-X293T细胞系)可用来表达本发明的所述抗体库。除了基于慢病毒的载体和宿主细胞，在本发明的方法的实施中还可采用基于其它基于逆转录病毒的载体和表达系统。这些包括基于MMLV的载体pQCXIN、pQCXIQ和pQCXIH，以及相容性生产细胞系，例如基于HEK293的包装细胞系GP2-293、EcoPack2-293和AmphoPack293，以及基于NIH/3T3的包装细胞系RetroPackPT67。
如上所述，从所述宿主或生产细胞产生的抗体可被包含在所述细胞内(即，作为细胞内抗体)或从所述细胞分泌。在一些实施方式中，所述产生抗体的细胞与为了获得其表型的抗体调节剂而将要研究的细胞相同。在一些实施方式中，根据要调节的特定表型，所述抗体可从所述细胞分泌或作为细胞内抗体存在于所述细胞内。由于抗体通常被设计为从所述生产细胞分泌，细胞内抗体需要进行特殊变化，包括使用单链抗体(scFv)，针对超稳定性修饰免疫球蛋白VL结构域，选择耐受更缩小的细胞内环境的抗体，或表达为与麦芽糖结合蛋白或其它稳定细胞内蛋白融合的融合蛋白。这样的最优化可改善细胞内抗体的稳定性和结构。在通过细胞内靶标分子选择细胞表型调节剂中可采用表达细胞内抗体的库。例如，细胞内抗体的组合库可用于选择在健康细胞或病变细胞中细胞内途径的调节剂。这种抗体调节剂的鉴定可反过来导致新颖药物靶标的发现，针对该新颖药物靶标，可设计或筛选更小的可渗透细胞的化合物(例如siRNA或有机小分子剂)。
在一些实施方式中，所述抗体库被构建用于分泌所述经表达的抗体，使得所述抗体可被选择为胞外靶分子或存在于细胞表面的靶分子(例如细胞表面受体或整联蛋白)的调节剂。在一些实施方式中，表达所述抗体的指示细胞(或用于本文所描述的共同培养选择形式的指示细胞和表达抗体的细胞)优选生长并保持在扩散限制基质(例如甲基纤维素或琼脂糖)中。所述扩散限制培养基可将所述分泌的抗体捕集在所述细胞周围，以确保所述抗体与所述指示细胞在选择方法期间的物理相互作用。
在一些实施方式中，所述抗体库表达在第二细胞类型(“生产细胞”)的细胞群中。如上所述，为了允许将观察到的表型与特定抗体分子直接关联，在每种细胞表达不超过约2或3种不同的抗体种类的条件下通常将所述抗体库导入所述生产细胞。在一些实施方式中，每个细胞仅表达所述抗体库的一种不同的成员。尽管第二细胞类型可与指示细胞的细胞类型相同或不同，所述生产细胞和所述指示细胞通常是不同的细胞类型或细胞株。在这些实施方式中，第二细胞(产生抗体的细胞)通常存在于所述指示细胞的附近，例如，可通过在诸如甲基纤维素琼脂之类的扩散限制介质中共同培养该两种细胞来实现。例如，所述指示细胞可以是肿瘤细胞(或其它病变细胞)，针对该肿瘤细胞，要选择生长抑制或刺激凋亡的抗体调节剂。因此，在一些这样的共同培养选择形式中，在第二细胞中表达并从其分泌的抗体被选择为杀死或抑制(延缓或停止)指示细胞的生长的调节剂。本发明的一些实施方式涉及为各种肿瘤中的靶分子鉴定功能抗体。例如，为在结肠癌中靶向EGF受体的治疗抗体或在一些类型的癌症(例如结直肠癌、肺癌和转移性乳腺癌)中靶向VEGF的治疗抗体选择候选抗体。在一些其它实施方式中，可为靶向HER1/EGFR的治疗拮抗剂抗体选择候选抗体，所述治疗拮抗剂抗体用于抑制肿瘤细胞能动性、粘连性和转移潜能。在一些其它实施方式中，可为靶向在乳腺癌中涉及的HER2和HER3的剂选择抗体。仍在一些实施方式中，在生产细胞内表达的抗体库可应用于选择靶向用于在各种肿瘤细胞中诱导选择性细胞凋亡的TRAIL-R1、TRAIL-R2或者其它的死亡受体的激动剂抗体。
如在本文中所公开的，本发明的选择方法通常不需要事先知道待鉴定的抗体的靶分子。然而，本发明的一些实施方式涉及由特定已知的靶分子介导的表型的调节剂的鉴定。所述靶分子可以是所述指示细胞的同源或异源分子。例如，所述表型可以是由位于细胞内或其表面的受体(例如EpoR或IL-1R)或所述受体对应的配体介导的信号传导活动。例如，本发明的所述选择方法适用于鉴定各种分泌的细胞因子或激素的抗体调节剂。实例包括Epo，促血小板生成素(Tpo)，IL-1β，TNFα和胰高血糖素样肽-1(GLP-I)。由这些分子介导的表型调节剂通常包括所述靶分子(受体或配体)的激动剂或拮抗剂，以及靶分子的抑制剂的调节剂(例如中和抗体)。例如可为如本文所示例的EpoR或IL-1R激动剂选择所述抗体库。还可为靶分子(例如IL-1R)的抑制剂(例如IL-1Rα)的拮抗剂选择候选抗体。在一些其它实施方式中，为中和信号传导配体(例如TNFα)的拮抗剂选择候选抗体，所述信号传导配体介导不期望的细胞反应(例如不期望的炎性反应或细胞凋亡)。在一些其它实施方式中，为用于肿瘤抑制基因产物(例如p53)的激动剂抗体或者针对致癌产物的拮抗剂抗体选择候选抗体。例如，erbB2致癌基因编码生长因子受体。在这些实施方式中，为所述受体的拮抗剂选择候选抗体。
在待调节的表型通过已知的靶分子介导时，在本发明的选择方法中采用的组合的抗体库可包括针对特定靶分子而产生的抗体。各种靶分子适合应用于本发明的实施。它们可以是任意的生物分子，例如蛋白质、碳水化合物、脂类或核酸。所述靶分子可与细胞(“细胞表面表达的”)或诸如病毒之类的其它颗粒(“颗粒表面表达的”)相关联。它们可以是细胞内的或细胞外的。适当的靶分子包括，例如诸如细胞因子或生长激素之类的信号传导配体以及它们的细胞受体，病毒蛋白和宿主受体，维生素受体，细胞表面标志物(例如CD41)，以及细胞酶和它们的底物。在一些实施方式中，所述选择方法涉及鉴定感兴趣的分泌蛋白的调节剂，所述感兴趣的分泌蛋白为例如细胞因子和趋化因子，如白介素(IL-1至IL-18)，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α、β和γ，转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)，集落刺激因子(CSF)，肿瘤坏死因子和粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。可根据本领域中公知的标准技术或本文中具体示例的技术实施针对任意这些已知的靶分子的抗体库的制备以及其在真核宿主细胞内的表达。
尽管通过功能选择(表型选择)鉴定所述指示细胞的表型的抗体调节剂，但是可在功能选择之前可选地首先为结合活性筛选所述候选抗体。因此，在知道所述靶分子针对哪一种待选的抗体调节剂时，本发明的方法可包括额外的步骤，即筛选所述组合的抗体库，以扩充用于识别所述靶分子的成员以及提高针对所述靶分子的所期望的亲和性。可采用本领域中公知的多种方法为结合靶分子的结合剂实施抗体筛选。例如，可通过噬菌体展示表达组合的抗体库，以为靶多肽的结合亲和性进行选择。噬菌体系统已成功应用于展示诸如抗体片段(scFv或Fab′)、激素、酶和酶抑制剂之类的功能蛋白，以及基于功能相互作用(抗体-抗原；激素-激素受体；酶-酶抑制剂)的特定噬菌体的选择。参见，例如Paschke，Appl.Micbiol.Biotechnol.70：2-11，2006；和Kehoe和Kay，ChemRev.105：4056-72，2005.本文示例了用于通过噬菌体展示为结合靶分子(例如Epo)的结合剂筛选组合的scFv抗体库的详细操作。本领域提供了针对采用噬菌体展示平台的更多常规指导。参见，例如Barbas等，PhageDisplay：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)。
IV.抗体调节剂的表型选择
本发明提供用于鉴定在真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)中感兴趣表型的抗体调节剂(激动剂或拮抗剂)的方法。所述选择方法可应用于鉴定在所述细胞中各种感兴趣表型的抗体调节剂，所述各种感兴趣表型包括任意的细胞反应，细胞(所述指示细胞)的生理学活动或生物特征。例如，经调节的表型可以是与信号转导级联反应连接的过程或活动的启动或改变，特定基因的表达的诱导或抑制(例如，如下文所述的指示标志基因的分化)，病变状态或病理学条件的变化，所述细胞的改变的形态学或其它物理属性(例如，在条件培养基中集落的形成)，以及在与细胞分化或增殖相关的活动中的变化。如本文中所示例的，有待由候选抗体调节的指示细胞的表型还可以是改变的生长(停止或延缓的生长)，细胞凋亡，或特定处理或抑制的存活。然而，需要知晓的是在本发明的选择方法中有待由候选抗体调节的表型不包括所述抗体与任意靶分子或抗原的特异性结合或物理相互作用。
为了选择感兴趣细胞(“指示细胞”或“靶细胞”)的抗体调节剂，可在与指示细胞株相同的细胞群内表达候选抗体库。替代地，可在所述抗体与指示细胞接触之前，在第二细胞类型(“生产细胞”)的细胞群内表达所述抗体。在后一种情况下，通常在适当的条件下共同培养表达所述抗体的生产细胞以及其表型有待检测的指示细胞。通常通过与不经历与所述抗体相互作用的对照细胞的相同表型相比较，确定在检测细胞中的表型的调节。与特定抗体接触的细胞中相对于所述对照细胞的表型的显著偏离或变化，将所述特定抗体鉴定为所述细胞的调节剂。除了选择细胞内抗体以外，所述表达抗体的指示细胞(或所述共同培养形式的生产细胞和指示细胞)可优选在选择过程中生长并保持在扩散限制基质中。这是为了确保所述分泌的抗体与所述指示细胞之间充分接触并相互作用，以允许潜在的抗体调节剂对所述细胞发挥它们的作用。因此，本发明的一些实施方式可采用扩散限制生长介质，例如甲基纤维素或琼脂糖。
在本发明的选择方法中可采用各种细胞类型作为指示细胞。这些包括已建立的细胞系以及从真核生物(例如哺乳动物，如人类)分离的原代细胞。如本文所示例的，从受试者的骨髓分离的诸如干细胞之类的原代细胞可以容易地用作为指示细胞，以为其表型(例如，分化)的抗体调节剂进行选择。在一些所述实施方式中，可使指示细胞与表达在生产细胞中的候选抗体库接触。类似地，诸如TF-1和HEK293T之类的已建立的哺乳动物细胞系可容易地用于选择哺乳动物细胞的多种表型的抗体调节剂，例如细胞信号转导途径的激动剂或拮抗剂。可采用并修饰的用于实施本发明的方法的其它公知的哺乳动物细胞系包括，例如CHO，HeLa，D10S，COS，MDCK，293，WI38和JurkatE6细胞。在一些其它方法中，可采用原代细胞来选择所述细胞的特定表型的抗体调节剂。例如，从哺乳动物种类(例如，人)分离的干细胞可用来选择促进所述细胞的增殖或分化的抗体调节剂。这些细胞适用于鉴定各种细胞反应和信号传导途径的抗体调节剂，例如用于促进造血干细胞分化的促血小板生成素激动剂抗体。同样地，从哺乳动物受试者分离的肿瘤细胞可应用于选择抑制所述细胞的生长或刺激细胞凋亡的抗体调节剂。可通过本领域中多种公知的方法容易地评价所述指示细胞的凋亡或改变的生长。例如，可通过溴化乙锭同型二聚体(EthD-1)实验监测指示细胞的凋亡，所述溴化乙锭同型二聚体(EthD-1)实验是用于检测死亡或垂死的细胞的常规操作实验。在一些其它实施方式中，为所述指示细胞的其它表型的调节剂对在生产细胞中表达并从该细胞分泌的抗体进行选择。如下文中所详细描述的，可通过本领域中容易获得的标准技术检测所述指示细胞的各种表型的变化和/或形态的变化。这些包括将受体基因或特定生物标志物引入可容易被检测(例如通过免疫荧光法)的所述指示细胞。
可通过阳性或阴性选择实施表型选择。在阳性表型选择中，相对于未经受与抗体相互作用的对照细胞，通过细胞中的阳性反应或活性鉴定抗体调节剂。作为本文中示例的用于选择Epo激动剂抗体，可为阳性细胞生长或增殖选择指示细胞，所述阳性细胞生长或增殖取决于经由相关信号传导途径的激动剂抗体的激活。此外，可为处在特定启动子(例如TNF-β启动子或GLP-1反应性启动子)的控制下的报告基因的表达选择引发信号传导途径的激动剂抗体，该报告基因的表达经由所述信号传导途径(例如IL-2介导的Jak-STAT信号途径)激活。在该种选择中采用的报告基因可以是，例如赋予所述细胞可检测的物理属性(例如GFP和β-内酰胺酶)的基因或赋予细胞耐受抗生素(例如氨基糖苷磷酸转移酶)的基因。例如，可在表达抗体的受体细胞系中选择Tpo激动剂抗体，在所述表达抗体的受体细胞系中TpoR信号传导途径控制荧光标志基因的表达。
在阴性表型选择中，为抗体调节剂抑制或压制在不接受所述抗体的对照细胞中另外可检测的表型、活性或反应的能力，鉴定抗体调节剂。例如，可使编码毒素的报告基因(例如白喉毒素基因)处于在由信号传导级联反应(例如IL-2介导的Jak-STAT信号途径)激活的启动子(例如TNF-β启动子)的控制下。可为其抑制所述信号传导途径且从而抑制毒素的表达以及确保细胞的生长的能力选择所述信号传导途径的拮抗剂抗体。因此，相对于由于毒素表达而抑制对照细胞(其未接触所述抗体)的生长，正常抑制的或较少抑制的细胞的生长将鉴定在所述细胞中特定信号传导途径的拮抗剂抗体调节剂。
为了鉴定靶细胞的各种表型的抗体调节剂，可修改和改编多种实验以应用于本发明的选择方法。用于评价细胞表型的示例性方法包括显微镜学检查法(例如光、共聚焦、荧光、扫描电子、透射电子显微镜)，基于荧光的细胞分选，差速离心，差异结合，免疫测定，酶的测定，生长测定法，以及体内测定法。作为本文中针对Tpo激动剂抗体的示例，基于荧光的细胞分选可用来选择细胞中信号传导级联反应的抗体调节剂，所述细胞中荧光标志基因的表达连接所述信号传导途径的激活。在一些实施方式中，可通过目测检查或显微镜检查监控诸如趋化性、形态变化或细胞凋亡之类的细胞的表型特性。可选地，可利用计算机软件程序自动检测具有改变的表型的细胞。为此，已开发了多种高内涵筛选(″HCS″；high-contentscreens)来解决关于更详细的细胞成分和方法的时空动态过程的信息的需求。高内涵筛选自动提取衍生自结合入细胞的基于荧光的特定试剂的彩色荧光信息(参见，例如Giuliano和Taylor，CurroOp.CellBiol.7：4，1995)。采用可测定空间以及时间动态过程的光学系统分析细胞。此外，多种荧光生理学指示剂和“生物传感器”可用于监测细胞内生物化学或分子活动的变化(参见，例如Giuliano等.，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24：405，1995)。
在本发明的多种实施方式中，可采用与所期望的表型相关的生物化学检验法或其它指示剂来评估所述指示细胞的表型。例如，在下文中的实施例描述了特定的TF-1细胞增殖测定，用于监测人干细胞的红系细胞分化的集落形成实验，用于监测TF-1细胞分化的血红素蛋白表达实验，以及用于监测EpoR信号传导途径的STAT5磷酸化实验。根据本发明的实施的需要，这些实验均可被采用并修改。因此，在一些实施方式中，通过适当的增殖测定，鉴定导致细胞以相对于对照细胞的改变的速率增殖的抗体调节剂。例如，可通过从IL-1Rα的抑制效果恢复由适当的指示细胞(例如D10Scell；Orencole等，Cytokine1：14-22，1989)的IL-1β介导的细胞增殖活性，来选择针对IL-IRα的拮抗剂抗体。在一些实施方式中，通过与特定信号传导途径相对应的生物化学检验法或其它受体检验法鉴定对刺激信号(例如，生长因子或其它促细胞分裂剂)具有改变的反应的细胞。用于检测和评估采用表达细胞表面受体且包含报告基因构建物的重组细胞进行胞外信号的胞内转导的实验是本领域中公知的(参见，例如U.S.Pat.Nos.5,401,629和5,436，128)。
在一些其它实施方式中，选择细胞分化的抗体调节剂。可采用合适的标志蛋白调节多种细胞的分化和增殖性能，所述细胞包括干细胞，例如ES细胞和成体干细胞。通过本领域中公知的多种技术容易地检查细胞(例如，干细胞)的分化。例如，可利用标志基因和标志蛋白的表达来评价细胞分化。这些标志物的实例包括：用于造血干细胞分化成巨核细胞的CD41；用于内皮细胞的FLK1(Cho等，Blood98：3635-42，2001；Nishikawa等，Development125：1747-1757，1998)，用于平滑肌的血管平滑肌细胞-特异性肌球蛋白重链(Drab等，FASEBJ.11：905-15，1997)，用于成骨细胞的骨-特异性碱性磷酸酶(BAP)和骨钙素(osteocalci)(Demers等，Cancer88：2919-26，2000)，用于白细胞的CD4、CD8和CD45(Ody等，Blood96：3988-90，2000；和Martin等，Blood96：2511-9，2000)，用于造血干细胞的Flk-2和CD34(Julie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：14541-14546，2001；Woodward&Jenkinson.Eur.J.Immunol.31：3329-38，2001；和George等，Blood97：3925-30，2001)，用于造血干细胞和MSC前体细胞的CFU(Frimberger等，Exp.Hematol.29：643-52，2001)，用于骨髓成纤维细胞的Muc-18(CDl46)(Filshie等，Leukemia12：414-21，1998)，用于软骨细胞的II型胶原蛋白、IV型胶原蛋白和软骨细胞表达的蛋白-68(Carlberg等，Differentiation67：128-38，2001，Steck等，Biochem.J.353：169-74，2001)，用于脂肪细胞的脂肪细胞脂类结合蛋白(ALBP)和脂肪酸转运蛋白(Amri，等，J.Biol.Chem.270：2367-2371，1995；Bastie等，J.Biol.Chem.274：21920-5，1999；Frohnert等，J.Biol.Chem.274：3970-3977，1999；和Teboul等，Biochem.J.360：305-312，2001)，用于神经干细胞的CD133(UchidaN等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：14720-5，2000)，用于星形胶质细胞的GFAP(Dai等，GenesDev.15：1913-25，2001)，以及用于神经元的与微管相关的蛋白-2(Roy等，Nat.Med.6：271-7，2000)。
本发明的方法还可用于选择哺乳动物细胞的其它性质(例如抗肿瘤形成、改变的细胞凋亡、以及抗病毒表型)的抗体调节剂。例如，可改变所述方法使其适应于选择赋予细胞耐受病毒感染或病毒产生的抗体调节剂。同样地，可通过采用与细胞信号传导途径的活动或静止相关的探针或者与该途径的活动或静止相关的可观察到的指示，检测导致细胞信号传导途径发生变化的调节剂。在一些其它实施方式中，所述选择旨在鉴定引起指示细胞中感兴趣化合物(例如代谢物，分泌蛋白，和翻译后修饰蛋白)的表达或合成发生改变的调节剂。可通过多种方法，包括利用反应细胞(respondercell)、微阵列、化学检测检验法以及免疫测定法，来鉴定所述抗体调节剂。在一些实施方式中，为增强病毒或病毒载体进入指示细胞的转染率，选择抗体调节剂。这样的表型调节剂的选择可通过以下实施：用极限浓度的报告子构建物或标志物构建物转染细胞，以及选择促进细胞摄取报告子构建物的抗体。
在一些实施方式中，选择方法涉及鉴定调节干细胞增殖或分化的抗体调节剂。所述抗体调节剂可通过对关键细胞因子和生长因子施加作用(抑制或激活)来调节干细胞增殖或分化。能控制干细胞的分化和增殖性能的能力允许(尤其是)提供大量的未经分化的细胞，以及经调节的分化成特定细胞类型。因此，在本发明的一些实施方式中，可为以下调节剂选择在生产细胞内表达的候选抗体的组合库：促进干细胞分化成限定的有丝分裂后的细胞亚型(例如多巴胺能神经元和胆碱能神经元)的调节剂，或者引导胚胎干(ES)细胞分化成限制性谱系(例如神经元前体细胞或造血干细胞)的调节剂。在一些实施方式中，为以下调节剂选择候选抗体：导致分化细胞采取不同的分化状态或允许分化细胞采取非分化状态，从而例如产生干细胞或多能前体细胞的调节剂。在一些其它实施方式中，为提高自我更新潜能的调节剂、防止分化的调节剂或指导分化程度和特征的调节剂，选择候选抗体。在用于选择干细胞的调节剂的多种实施方式中，所述抗体可在所述干细胞或干细胞前体细胞内表达，随后评价所述细胞的特定表型。
如上所述，可通过采用报告子构建物检查所述指示细胞的多种表型的调节。所述报告子构建物被引入到所述指示细胞，以提供对所述细胞的对应表型(例如在细胞表面受体的信号传导活动)的调节反应的可测定的信号(可检测的标记)。在所述报告子构建物中的报告基因可编码酶(例如，β-内酰胺酶或β-半乳糖苷酶)，其可催化可检测的酶反应(例如连接至可检测的显色反应或荧光反应的酶反应)。所述报告子构建物还可表达提供可检测荧光信号或化学发光的分子(例如，绿色荧光蛋白GFP)。
根据本领域中公知的方法，可产生用于监测各种信号传导级联反应的活性的报告子构建物，并将其导入所述指示细胞内。例如，适用于制备所述报告子构建物的载体可以是质粒(例如pUC18、pYES2、pCDM8)或诸如腺病毒之类的病毒基因组，AAV或逆转录病毒载体(莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMuLV))，长臂猿白血病病毒(GaLV)。根据要调节的表型，使报告基因(例如编码可定位酶(addressableenzyme)、毒素或GFP的基因)处于多种对表型调节响应的启动子的控制下。实例包括bcl-x启动子(用于促红细胞生成素途径)，TNF-β启动子(用于IL-2信号传导)，U6或tRNAmet启动子，逆转录酶长末端重复序列，以及T7RNA聚合酶启动子。其他适用于所述报告子构建物的合适载体和启动子元件以及用于克隆、转染、瞬时基因表达以及获得稳定转染的细胞系的实验操作方法在本领域中有描述，例如Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，N.Y.，(3rded.，2000)；和Brent等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，Inc.(ringboued.，2003)。
V.通过蛋白激动剂转分化靶细胞
本发明提供用于选择能重编程或转分化靶细胞(例如分化的成体细胞或谱系限制性干细胞)的蛋白剂的方法。本发明的一些相关实施方式涉及采用这些蛋白剂(例如受体激动剂抗体)来重编程或转分化所述靶细胞的方法。例如，可针对沿着不同途径(例如重编程至转分化成神经前体细胞)重编程靶细胞(例如髓系CD34+细胞)的活性选择蛋白剂(例如多肽或抗体激动剂)。如本文中所证实的，本发明的选择形式允许鉴定诸如抗体激动剂之类的蛋白剂，所述抗体激动剂具有罕见的性质，例如以与所述受体的天然配体不同的方式调节靶受体的能力。以本发明人选择的G-CSF激动剂抗体作为示例，虽然选择的G-CSF激动剂抗体和G-CSF结合至所述G-CSFR并且诱导细胞增殖，但是仅所述选择的G-CSF抗体可启动神经形成。
为了重编程靶细胞以沿着期望的途径转分化，首先需要鉴定蛋白调节剂(例如激动剂抗体或多肽剂)，例如在报告细胞中的蛋白调节剂，其可激活信号传导途径或指示所期望的分化途径的活动。经鉴定的剂随后可接受进一步的检测，以确定它们实际上能以所期望的方法重编程所述靶细胞。通常，在共同表达通常存在于所述靶细胞上的信号传导受体的报告细胞系内表达候选多肽。选定的信号传导受体应为在靶细胞中通常介导或激活反映或对应于所期望的分化途径的细胞事件或特定信号传导途径的信号传导受体。所述候选蛋白剂可以是例如针对受体产生的介导或激活特定信号传导途径的抗体或其抗原结合片段的库。所述候选剂还可以是其它能调节所述受体的多肽或肽，例如所述受体的天然配体的变体或衍生物。在该选择中有待监测的信号传导途径应反映或对应于细胞事件，该细胞事件启动或激活靶细胞的期望的分化途径，例如指示期望的分化途径的特定分子标志物的表达。例如，转分化靶细胞成神经元或神经前体细胞，有待在所述报告细胞内共同表达的受体可以是G-CSFR，这是因为该受体的激活可导致在中枢神经系统中诱导神经形成。在所述携带G-CSFR的报告细胞中可首先选择细胞内表达的抗体剂库，以获得针对所述受体的一种或多种激动剂。经鉴定的激动剂随后在适当的条件下被施加至靶细胞，以选择具有表明神经谱系的表型或信号传导活动(例如神经元微管蛋白的存在)的细胞。所述经鉴定的剂可额外地接受其它实验，以确定它们实际上能沿着所述期望的分化途径转分化所述靶细胞。
在一些实施方式中，候选多肽剂的库与所述选定的受体共整合入报告细胞群的胞质膜。这种共同定位的形式有利于受体和它们的蛋白配体之间的罕见的相互作用，并确保所述蛋白剂(例如抗体)以自分泌的方式对产生其的细胞起作用。本发明具有示例性的通过选择激活所述共同定位的G-CSFR的激动剂重编程CD34+髓系细胞以变成神经前体细胞。在本文中描述的该通用选择方案可广泛应用于鉴定可通过调节其它细胞受体来转分化靶细胞的剂。在GPCR和细胞因子受体的情况下，多潜能的信号传导是药理学的发展领域，其中其目的在于寻找通过受体将信号传导偏离(bias)至特定下游途径的激动剂。为了实现该目的，需要检测大量的激动剂。虽然这对于小分子配体而言是相对容易的，然而蛋白激动剂的大型多样性库的产生和研究存在有更多的问题。本发明的方法提供了解决该问题的技术方案，其中其有利于研究结合所述受体的不同区域的大量潜在蛋白激动剂，并且有利于可替代的下游信号传导途径。如本文中所示例的，通过FACS的筛选自分泌系统极大地促进罕见事件(例如，转分化)以及能介导所述罕见事件的蛋白剂的表型选择。进一步地，由于这些相互作用发生在受体的天然环境中，因此它们具有更高可能的生理相关性。
本发明的方法和抗体可具有多种治疗应用，例如在再生医疗中的应用。作为治疗剂，诸如抗体之类的蛋白剂具有的优点是它们具有长的寿命并且不需要进入细胞来起作用。所述抗体剂可在体内或体外转分化自体干细胞，以产生自身的经分化的细胞。这些细胞可以多种方式起有用的作用，包括脑或脊髓受损区域的修复。
VI.双特异性抗体
通过控制感染复数(MOI)，超过一种的编码抗体的慢病毒或其它逆转录病毒可感染单一细胞。在如本文中所示例的scFv-Fc融合抗体的情况下，这允许所述抗体Fv结构域自身在细胞内重配，以获得异二聚体的抗体。因此，本发明的一些实施方式涉及鉴定靶向两种不同抗原表位的异二聚体双特异性抗体。虽然本发明的双特异性抗体包括识别存在于两种不同分子上的两种抗原结合表位(反式-反应性)的抗体，但是它们通常是指在相同分子内结合两种不同位点(顺式-反应性)的异二聚体。这些抗体的调节剂功能(激动剂或拮抗剂)取决于必须包含在相同抗体分子内的两种不同抗原结合特异性之间的专性协同作用。正如本发明对抗-Epo双特异性激动剂抗体所举例的，异二聚体抗体的不对称结合复制了天然靶分子(例如Epo)的机制，该天然靶分子的完整激动剂活性取决于不对称结合至其受体上的两种结合位点。
从表达超过一种抗体的细胞直接选择协同的抗体的能力提供了第二种组合的自由度，其在完整scFv抗体水平操作并可增加已由相当大量的抗体重链和轻链的随机缔合获得的多样性。因此，第一组合参数是所述抗体分子的重链和轻链的随机缔合，以提供大量的单特异性变体片段。由于scFv-Fc融合物的缔合退化，从所述抗体分子自身的多结合结构域(multiplebindingdomains)(scFv)的随机重配衍生了第二种组合参数，以获得双特异性异二聚体。如本文中所应用的，术语双特异性是指所述异二聚体能结合至位于相同分子内的两种不同位点(顺式-反应性)的能力，其与该术语在免疫化学中通常使用的方式不同，该术语在免疫化学中通常是指结合至两种不同分子的可能性(反式-反应性)。
可容易地采用本文所述的抗体库和选择方案，并对其修改以适应于获得真核细胞的任意表型的双特异性抗体调节剂，尤其适应于选择要求在与配体的同源细胞受体结合中的专性协同作用的配体的抗体调节剂(例如激动剂)以及激活相应的信号传导途径。除了本文所示例的抗-Epo双特异性抗体以外，本发明的双特异性激动剂抗体还包括由形态学选择鉴定并能诱导干细胞分化的抗体(例如12-1/12-2双特异性抗体)。为了确保多抗体链(例如scFv链)在相同细胞内的重配以及产生用于选择的双特异性抗体，将在略高的MOI的编码抗体的病毒载体导入所述生产细胞。MOI是转导病毒颗粒(例如，慢病毒颗粒)的数量/待转导的细胞。在高MOI转导的情况下，可产生同型二聚体抗体和异二聚体抗体，用于功能选择。在一些实施方式中，选择方案可要求测试MOI的范围，以获得最佳的抗体制备以及所期望的同型二聚体/异二聚体抗体的比率。因此，在主要期望异二聚体抗体时，在病毒感染中使用的MOI可以是，例如约2或3。一旦抗体被引入到所述生产细胞或指示细胞内并在其中表达，可进行与待选择的抗体调节剂针对的表型相对应的适当的实验。与本文示例的异二聚体Epo抗体的选择相似的是，还可根据本领域中常规操作的方法获得用于为真核细胞的其它表型选择双特异性抗体调节剂的指示细胞系和表型检测实验。
除了控制MOI以外，可将某些修饰引入到抗体链，以促进异二聚体形成。例如，通过单一残基替代，如本文所示例的用于EpoR的scFv-Fc融合抗体的Fc部分中的T366Y和Y407T，促进异二聚体的形成。所述T366Y和Y407TFc突变体优先形成异二聚体，这是因为在一条IgG；链(Knob)中的Tyr366的较大侧链优先与另一抗体链的Thr407的较小侧链相互作用。根据所采用的抗体库的特定结构，还可设计其它修饰，以加强异二聚体的形成。例如，融合scFv至亮氨酸拉链Fos/Jun可促进双特异性抗体异二聚体的产生。
VII.信号传导受体或表面标志物的激动剂抗体
如进一步例示的，本发明提供了特异地结合到细胞信号传导的受体并调节细胞信号传导的受体的抗体或抗原结合分子，细胞信号传导的受体如促红细胞生成素受体(EpoR)，促血小板生成素受体(TpoR)和粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)。这些激动剂抗体能够激活通过各自的受体(例如，如在以下实施例部分描述的用于调节Jak2的磷酸化和活动(activation)、干细胞增殖或血红蛋白合成的EpoR)介导的信号传导活动。用于制备单克隆或多克隆抗体的一般方法是公知的现有技术。见，例如，Harlow&Lane，UsingAntibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1998；Kohler&Milstein，Nature256：495-497，1975；Kozbor等人，ImmunologyToday4：72，1983；和Cole等人，pp.77-96在MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，1985。通过针对在由相应的受体(例如，EpoR)介导的激活信号传导通路中的活动从基于慢病毒载体的抗体库中选择抗体，来鉴定本文所公开的特定激动剂抗体(例如，抗-EpoR的抗体)。如在下面的实施例中详述，一些被鉴定的EpoR激动剂抗体是同型二聚体抗体，而有些则是异型二聚体双特异性抗体。除了抗-EpoR的功能抗体，在本发明中还提供了是促血小板生成素受体(TpoR)或粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的激动剂的功能抗体。
本发明的抗体激动剂(例如，抗-EpoR的功能抗体)优选是如在下面的实施例中列举的抗体之类的单克隆抗体。优选地，它们具有与例示的功能抗体(例如，本文例示的E-1，V-1和V-3的抗-EpoR的抗体，3D9和14F12抗-TpoR抗体，3B3抗G-CSFR抗体，和9-3，11-3和12-1/12-2抗体)相同的结合特异性。这些抗体通常包含有与例示的抗体相同或基本相同的可变区序列。除了包含衍生自例示的抗体的可变区序列，本发明的一些激动剂抗体还可以包含融合到所述可变区序列的其它抗体序列。例如，该抗体可以包含如本文实施例中所述的人IgG1序列(从铰链到CH3)的Fc部分。另外，针对所需性质可向所述抗体的序列引入各种修改。例如，为了提高异二聚体抗体的形成，scFv-Fc融合能包含有“把手-孔洞”CH3突变(例如，T366Y和/或Y407T突变)。
一些抗-EpoR的激动剂抗体衍生自特定同型二聚体scFv抗体(E-1)，它包括分别在SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中所示的重链和轻链可变区序列。这种抗体的重链可变区的CDR序列为GYTFTGYY(CDR1；SEQIDNO：1)，INPNSGGT(CDR2；SEQIDNO：2)，和CARLSSGWTFDYW(CDR3；SEQIDNO：3)。其轻链可变区的CDR序列为QSVLYSPNNKNY(CDR1；SEQIDNO：4)，WAS(CDR2；SEQIDNO：5)，和CQQSYSLPFTF(CDR3；SEQIDNO：6)。本发明的一些其它抗-EpoR的激动剂抗体衍生自特定的异二聚体scFv抗体(V-1/V-3)，其包括含有分别在SEQIDNO：21和SEQIDNO：22中示出的重链和轻链可变区序列的第一单体(V-1)，和含有分别在SEQIDNO：23和SEQIDNO：24中示出的重链和轻链可变区序列的第二单体(V-3)。第一单体(V-1单体)的重链可变区的CDR序列是GGTFSSYA(CDR1；SEQIDNO：9)，IIPIFGTA(CDR2；SEQIDNO：10)，和CARDQGYYYGSGGLDYW(CDR3；SEQIDNO：11)。其轻链可变区的CDR序列为QSISSY(CDR1；SEQIDNO：12)，AAS(CDR2；SEQIDNO：13)，和CLQDYNYPLTF(CDR3；SEQIDNO：14)。第二单体(V2单体)的重链可变区的CDR序列为GYTFTSYG(CDR1；SEQIDNO：15)，ISAYNGNT(CDR2；SEQIDNO：16)，和CARGVAAALSYW(CDR3；SEQIDNO：17)。其轻链可变区的CDR序列为SSDVGAYNY(CDR1；SEQIDNO：18)，EVT(CDR2；SEQIDNO：19)，和CISFTASSTWAF(CDR3；SEQIDNO：20)。
本发明的一些抗-TPOR激动剂抗体衍生自3D9scFv抗体，其将在下面的实施例详细说明。这种scFv抗体具有在SEQIDNO：32中所示的氨基酸序列。ScFv的重链和轻链部分的序列分别如SEQIDNO：33和SEQIDNO：34中所示。这种抗体的重链可变区的CDR序列是RDTFNTYG(CDR1；SEQIDNO：35)，IIPIFGTA(CDR2；SEQIDNO：36)，和CARDRKLGGSDYW(CDR3；SEQIDNO：37)。其轻链可变区的CDR序列是QGLGRW(CDR1；SEQIDNO：38)，AAS(CDR2；SEQIDNO：13)，和QQSNSFPWT(CDR3；SEQIDNO：39)。
本发明的一些抗-G-CSFR激动剂抗体衍生自本文实施例中例示的3B3抗体。这种scFv抗体具有如SEQIDNO：40中所示的氨基酸序列。scFv的重链和轻链部分的序列分别在SEQIDNO：41和SEQIDNO：42中显示。这种抗体的重链可变区的CDR序列是GGSISSGGYY(CDR1；SEQIDNO：43)，IYYSGST(CDR2；SEQIDNO：44)，和CARWNGVNNAFDI(CDR3；SEQIDNO：45)。其轻链可变区的CDR序列是QGISSW(CDR1；SEQIDNO：46)，AAS(CDR2；SEQIDNO：13)，和LQHNTYPFT(CDR3；SEQIDNO：47)。
本发明的一些激动剂抗体衍生自能够诱导干细胞分化的特定抗体，如抗体9-3，11-3，12-1和12-2。如下面的实施例详述，这些例示的抗体经由天然抗体库的直接形态选择鉴定。这四个scFv抗体的氨基酸序列分别示于SEQIDNO：48，57，66和75。这些抗体的重链可变区和轻链可变区序列分别显示于SEQIDNO：49和50(抗体9-3)，SEQIDNO：58和59(抗体11-3)，SEQIDNO：67和68(抗体12-1)，和SEQIDNO：76和77(抗体12-2)。抗体9-3的重链可变区的CDR序列是GFSFTTYG(CDR1；SEQIDNO：51)，ISSSSST(CDR2；SEQIDNO：52)，和ARGGDNSRGYYYIAGGDY(CDR3；SEQIDNO：53)。抗体9-3的轻链可变区的CDR序列是SSIRY(CDR1；SEQIDNO：54)，DTS(CDR2；SEQIDNO：55)，和QEWSGYPYT(CDR3；SEQIDNO：56)。抗体11-3的重链可变区的CDR序列是GYTFTGYY(CDR1；SEQIDNO：60)，INPNSGGT(CDR2；SEQIDNO：61)，和ARGGPSYGDYFRWFDP(CDR3；SEQIDNO：62)。抗体11-3的轻链可变区的CDR序列是HAVSSNS(CDR1；SEQIDNO：63)，GAS(CDR2；SEQIDNO：64)，和QQYGSSPPIT(CDR3；SEQIDNQ：65)。抗体12-1的重链可变区的CDR序列是GFTFSSYE(CDR1；SEQIDNO：69)，ISSSGST(CDR2；SEQIDNO：70)，和AREVAAAGFNDAFDI(CDR3；SEQIDNO：71)。抗体12-1的轻链可变区的CDR序列是SSIRY(CDR1；SEQIDNO：72)，DTS(CDR2；SEQIDNO：73)，和QEWSGYPYT(CDR3；SEQIDNO：74)。抗体12-2的重链可变区的CDR序列是GYIFTSYD(CDR1；SEQIDNO：78)，IFPGEGST(CDR2；SEQIDNO：79)，和ARGDYYRRYFDL(CDR3；SEQIDNO：80)。抗体12-2的轻链可变区的CDR序列是QDIDDD(CDR1；SEQIDNO：81)，EPT(CDR2；SEQIDNO：82)，和LQHGDFLTWT(CDR3；SEQIDNO：83)。在各种实施方案中，这些衍生自9-3，11-3或12-1/12-2抗体的抗体可用于以谱系特异性方式诱导干细胞分化(例如，人CD34+细胞)，以例如形成树突细胞。
典型的完整抗体与靶抗原主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR′s)的氨基酸残基相互作用。本发明的功能激动剂抗体(例如，抗-EpoR的抗体)包括具有其重链CDR序列和轻链CDR序列中的至少一个的抗体或抗原结合片段，所述重链CDR序列和轻链CDR序列中的至少一个与例示的抗-EpoR，抗-TpoR，抗-G-CSFR或干细胞诱导的抗体(例如，抗体9-3)的相应CDR序列是相同或基本相同。一些本发明的激动剂抗体具有与在下面的实施例中公开的例示的抗体相同的结合特异性。这些抗体可与例示的抗体竞争结合相应的受体(例如，EpoR)。抗体可另外具有与例示的抗体相同或相似的功能特性，例示的抗体为例如，用于激动EpoR信号传导途径的抗-EpoR的抗体。本发明的一些激动剂抗体是在其重链和轻链可变区中具有所有CDR序列的同型二聚体，所述所有CDR序列分别与例示的抗体(例如，3D9抗TpoR抗体，3B3抗G-CSFR抗体，或抗-EpoR抗体E-1，V-1或V-3)的对应的CDR序列相同。在其他实施方式中，抗体是具有三个重链和轻链CDR序列的异二聚体，所述三个重链和轻链CDR序列分别与V-1/V-3抗-EpoR异二聚体抗体的第一单体或第二单体的相应CDR序列相同。一些其它抗-EpoR的抗体是具有两种单体的异二聚体，两种单体具有分别与例示的V-1/V-3的双特异性抗体的两种单体的CDR序列相同的重链和轻链CDR。除了它们的结合特异性，本发明的激动剂抗体(例如，抗-EpoR的抗体)中的一些还可以在调节(例如，激动)由相应的受体(例如，EpoR)介导的信号传导活动中是功能上活跃的。
除了具有分别与示例的抗体(例如，E-1，V-3或V-1/V-3抗-EpoR抗体，3D9抗-TpoR抗体，3B3抗-G-CSFR抗体或12-1/12-2的抗-整联蛋白α3抗体)的相应CDR序列相同的CDR序列，本发明的激动剂抗体中的一些具有其完整的分别与例示的抗体的相应可变区序列相同的重链和轻链可变区序列。在一些其他实施方式中，除了相同的CDR序列之外，抗体包含与例示的抗体的相应氨基酸残基不同的在可变区的框架部分中的氨基酸残基。相对于例示的抗体，本发明的激动剂抗体可以经历在可变区中非关键氨基酸的替代、添加或缺失，而不会损失结合特异性或效应子功能，或没有无法忍受的结合亲和性或受体激动活性的减少。通常，引入这种改变的抗体表现出与它们的衍生来源参考抗体(例如，3B3抗-G-CSFR抗体，3D9抗-TpoR抗体，抗-EpoR抗体E-1，V-1，V-3或V-1/V-3或抗-整联蛋白α3抗体12-1和12-2)基本上的序列同一性。例如，一些本发明的激动剂抗体的成熟轻链可变区具有与例示的抗体的成熟轻链可变区的序列的至少75％，或至少85％的序列同一性。同样地，抗体的成熟重链可变区通常显示与例示的激动剂抗体的成熟重链可变区的序列至少75％，或至少85％的序列同一性。在各种实施方式中，抗体通常具有与例示的抗体的相应可变区序列基本上相同的(例如，75％，85％，90％，95％，或99％)完整可变区序列。如果与例示的抗体相比(例如，3B3，3D9，E-1，V-1，V-3，12-1和12-2)，本发明的一些激动剂抗体具有相同的特异性，但改善的亲和性或受体激动活性。
VIII.用于产生抗-EpoR激动剂抗体的多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明提供了基本上纯的多核苷酸(DNA或RNA)，其编码的多肽包含本文所描述的受体激动剂抗体链或抗原结合分子的片段或结构域。一些本发明的多核苷酸包括如在SEQIDNO：25，27或29中所显示的编码重链可变区的核苷酸序列和/或在SEQIDNO：26，28或30中所显示的编码轻链可变区序列的核苷酸序列。本发明的一些其它多核苷酸包含与SEQIDNO：25-30中所示的核苷酸序列中之一基本上相同(例如，具有至少65，80％，95％，或99％一致性)的核苷酸序列。当从合适的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示抗原结合能力。
本发明还提供编码来自以下实施例中所描述的激动剂抗体的重链或轻链的至少一个CDR区和通常全部三个CDR区的多核苷酸。一些其它多核苷酸编码例示的抗体的重链和/或轻链的所有或基本上所有的可变区的序列。例如，这些多核苷酸中的一些编码在SEQIDNO：7，21或23所示的重链可变区的氨基酸序列，和/或在SEQIDNO：：8，22或24中所示的轻链可变区的氨基酸序列。一些其它的本发明的多核苷酸包含编码如在SEQIDNO：33，41，49，58，67或76中所示的重链可变区的核苷酸序列和/或编码如在SEQIDNO：34，42，50，59，68或77中所示的轻链可变区序列的核苷酸序列。因为密码子的简并性，多种核酸序列将编码免疫球蛋白氨基酸序列中的每一种。
本发明的多核苷酸可以仅编码激动剂抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区两者。本发明的核酸的多核苷酸序列中的一些编码成熟的重链可变区序列，所述成熟的重链可变区序列与在SEQIDNO：7，21，23，33，41，49，58，67或76中所示的成熟的重链可变区序列基本相同(例如，具有至少80％，90％，或99％的一致性)。一些其它多核苷酸序列编码成熟的轻链可变区序列，所述成熟的轻链可变区序列与在SEQIDNO：8，22，24，34，42，50，59，68或77中所示的成熟的轻链可变区序列基本上相同。一些多核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含例示抗-EpoR抗体中的一个的重链和轻链两者的可变区。一些其它多核苷酸编码两种多肽片段，所述两种多肽片段分别与例示抗体(例如，3B3，3D9，E-1，V-1，V-3或9-3)中的一个的重链和轻链的可变区基本相同。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成(denovosolid-phaseDNAsynthesis)或通过现有的编码抗-EpoR抗体或抗原结合片段的序列(例如，如下面实施例中所述序列)的PCR诱变来制备。核酸的直接化学合成可通过本领域中已知的方法来完成，例如：Narang等人的磷酸三酯法，Meth.Enzymol.68：90，1979；Brown等人的磷酸二酯法，Meth.Enzymol.68：109，1979；Beaucage等人的二乙基亚磷酰胺法，Tetra.Lett.，22：1859，1981；和美国专利No.4,458,066的固相支持法。如在下列文献中所描述的可以进行通过PCR引入突变到多核苷酸序列：例如PCR技术：DNA扩增的原理和应用(PCRTechnology：PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification)，H.A.Erlich(Ed.)，FreemanPress，NY，NY，1992；PCR实验方案：方法和应用指南(AGuidetoMethodsandApplications)，Innisetal.(Ed.)，AcademicPress，SanDiego，CA，1990；Mattilaetal.NucleicAcidsRes.19：967，1991；和Eckert等人，PCRMethodsandApplications1：17，1991。
本发明还提供了用于制造本文所述的受体激动剂抗体的表达载体和宿主细胞。在以下实施例中描述了用于表达抗体的基于慢病毒的载体的具体示例(参见图7)。各种其它的表达载体也可用于表达编码激动剂抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的和非病毒的表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒，附加型载体，其通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒和人类人工染色体(见，例如，Harrington等人，Nat.Genet.15：345，1997)。例如，用于在哺乳动物(如人类)细胞中表达抗-EpoR的多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHisA，B和C，pcDNA3.1/His，pEBVHisA，B和C(Invitrogen，圣地亚哥，加利福尼亚州)，MPSV载体和本领域中已知的用于表达其它蛋白质的许多其它载体。有用的病毒载体包括基于慢病毒的载体或基于其它逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP埃巴病毒的载体，痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)载体。参见，Brent等人，supra；Smith，Annu.Rev.Microbiol.49：807，1995；和Rosenfeld等人，Cell68：143，1992。
表达载体的选择取决于其中载体要被表达的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有可操作地连接到编码激动剂抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列(例如，增强子)。在一些实施方式中，采用诱导型启动子以防止除了在诱导条件以外的插入序列的表达。诱导型启动子包括，例如，阿拉伯糖，lacZ，金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可以在非诱导条件下扩增培养转化生物体物，而无需偏倚用于编码其表达产物更好地被宿主细胞耐受的序列的群。除了启动子，也可能需要或期望其他调控元件用于有效表达激动剂抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其它序列。另外，表达的效率可通过包含适用于在用细胞系统的增强子来增强(见，例如Scharf等人ResultsProbl.CellDiffer.20：125，1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.，153：516，1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以形成具有通过插入的激动剂抗体序列编码的多肽的融合蛋白。更多的时候，插入的激动剂抗体序列在包含到载体中之前被连接到信号序列。要用来接收编码激动剂抗体轻链和重链可变域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这种载体允许可变区的表达为具有恒定区的融合蛋白从而导致产生完整抗体或其片段。通常，此类恒定区是人。
用于包含并表达激动剂抗体链的宿主细胞可以是原核生物或真核生物。在一些优选的实施方式中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗体多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或包含有外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，在下文举例的TF-1细胞或HEK293T细胞)。这些包括任何正常致死的或正常的或不正常的永生化动物或人细胞。除了本文例示的细胞系，一些能够分泌完整免疫球蛋白的其它合适的宿主细胞系也是本领域已知的。这些细胞系包括，例如，CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。在例如，Winnacker，FromGenestoClones，VCHPublishers，N.Y.，N.Y.，1987中总体讨论了利用哺乳动物组织细胞培养物表达多肽。哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点，启动子，和增强子，以及必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。这些表达载体通常含有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的，细胞类型特异性的，阶段特异性的，和/或可调制的或可调节的。有用的启动子包括(但不限于)本文例示的EF1α和人类UbC启动子，金属硫蛋白启动子，组成型腺病毒主要晚期启动子，地塞米松诱导型MMTV启动子，SV40启动子，MRPpolIII启动子，组成型MPSV启动子，四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)，组成型CMV启动子和本领域中公知的启动子-增强子组合。
用于导入含有受关注的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主(一般参见Sambrook等人，同上)。其它方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导转化、注射和微注射，弹击方法(ballisticmethods)、病毒体，免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒颗粒(artificialvirions)、融合到疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliot和O′Hare，Cell88：223，1997)，试剂增强的DNA摄取，和体外(exvivo)传导。对于重组蛋白的长期高产率生产，稳定的表达往往是期望的。例如，稳定表达抗体链或结合片段的细胞系可以使用本发明的含有复制或内源表达元件和可选择标志基因的病毒源的表达载体来制备。随着载体的引入，细胞可以被允许在被切换到选择性培养基之前在加富培养基中生长1-2天。可选择的标志物的目的是赋予选择抗性，并且其存在允许成功地表达引入的序列的细胞在选择性培养基中生长。耐受的、稳定转染的细胞可以使用适合于细胞类型的组织培养技术增殖。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本发明，但不限制其范围。本发明的其它变型对于本技术领域的普通技术人员而言将是显而易见的，并由所附的权利要求涵盖。
实施例1用于功能选择激动剂抗体的材料和方法
该实施例描述在选择Epo激动剂抗体使用的一些材料和方法。
细胞系。TF-1细胞系保持在含有10％胎牛血清(FCS)(Gibco-Invitrogen)、青霉素和链霉素(Gibco-Invitrogen)和2ng/mLGM-CSF(R&DSystem)的RPMI1640(Gibco-Invitrogen)中。HEK293T细胞系保持在含有10％FCS、青霉素和链霉素(Gibco-Invitrogen)的DMEM培养基中。HEK293F细胞系保持在具有4mMGlutamax(Gibco-Invitrogen)的Freestyle293表达培养基中。
质粒的构建。构建质粒工具盒(toolkitplasmids)用于建立慢病毒组合抗体库和scFv-Fc融合蛋白的表达。在如图7所示的载体绘图中标记质粒的相关特征。所有载体被设计成用简单的SfiI消化和连接使抗体基因能在彼此之间交换。
慢病毒组合抗体库的构建。与噬菌粒载体相容的成对的SfiI位点被引入慢病毒载体。在30℃下将用噬菌体感染的细菌接种。噬菌粒从分离的细菌直接制成。将噬菌粒用SfiI消化，将～800bp插入物连接入SfiI消化的慢病毒载体。
scFv-Fc融合表达载体的构建。编码scFv和人IgG1的Fc部分(从铰链至CH3)的基因通过重叠PCR被融合并克隆到pFUSE蛋白表达载体(Invitrogen)中。
工程技术设计bsAb表达的“把手-孔洞”CH3突变。含有突变的残基T366Y和Y407T的免疫球蛋白分子的CH3区分别在scFv-Fc融合的表达载体中构建。突变由氨基酸残基和跟在编号后面的置换的氨基酸表示。
scFv-Flag表达载体的构建。对应于标志标签的寡核苷酸被合成，退火并连接到scFv-Fc表达载体，以替代Fc。为了产生含有Thoseaasigna病毒2A(T2A)的构建物从而使EpoR和GFP可以被共同翻译，EpoR和编码肽GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQIDNO：31)的T2A寡核苷酸以及GFP用重叠PCR组装，并克隆到含有Ubc启动子的慢病毒载体。
结合来自噬菌体中的组合抗体库的抗体的EpoR的选择。使用两种筛选实验方案。在第一实验方案中，在第一轮中使用磁性蛋白G珠(NEB)在EpoRECDFc融合蛋白上选择在噬菌体中的组合抗体scFv库。在第二轮和第三轮中使用镍包被的磁珠(Invitrogen)在EpoRECD-his标签单体蛋白上选择噬菌体，并用甘氨酸-盐酸(pH值2.2)洗脱。在第二实验方案中，将在噬菌体中展示的组合抗体scFv库与EpoR胞外域Fc融合蛋白共同温育。用磁G蛋白珠捕获噬菌体抗体-EpoR的复合物，未结合的噬菌体通过洗涤去除。用EPO或甘氨酸-HCl(pH为2.2)洗脱结合的噬菌体。用洗脱的噬菌体感染XL1-蓝色细胞，并在30℃下生长过夜。从平板刮下细菌，并加入辅助噬菌体VCSM13以扩增噬菌体，用于下一轮的筛选。在第二轮和第三轮的筛选之前，将噬菌体与不相关的人IgG1预温育以除去结合到Fc的噬菌体。噬菌体是在EpoRECDFc融合蛋白上选择的，仅用EPO洗脱结合的噬菌体。收获来自每个实验方案的48个克隆体，并且通过噬菌体ELISA分析它们结合到EpoR的能力。所选噬菌粒由Sanger测序法进行测序。序列用Vbase2进行分析。用ClustalX对重链CDR3进行比对，用Njplot构建进化树。
制备慢病毒。通过以1∶1∶1的比率的慢病毒载体与pCMVD8.9和pVSVg病毒包装载体的共转染在HEK293T细胞中制备病毒。在转染后48小时收集包含病毒的上清液。细胞碎片通过离心去除，并通过0.22umPES膜过滤装置(Millipore)过滤。使用Lenti-Xp24ELISA试剂盒(Clontech公司)测定慢病毒制备物的滴度。病毒制备物被等分并在-80℃下冷冻。
用慢病毒转导TF-1细胞。将慢病毒加入在含有5μg/mL聚凝胺和2纳克/毫升GM-CSF的1ml培养基中的TF-1细胞。通过以1200g在30℃下离心慢病毒和细胞混合物持续90分钟进行“离心法感染病毒(Spinoculation)”。在37℃下将细胞与慢病毒温育过夜。除去过量的病毒，第二天加入无GM-CSF的新鲜培养基。
免疫荧光染色。在室温下用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞持续20分钟，封闭，并用1ng/mL抗-人IgG1Fc：PE抗体在室温下染色30分钟。在室温下用在PBS中的0.1％Triton透化处理细胞20分钟，并与抗-人IgG1Fc：PE抗体在室温下共孵育30分钟。在封闭溶液中洗涤3次持续15分钟，然后使用Zeiss倒置荧光显微镜收集图像。
通过采用甲基纤维素为基础的培养基的集落形成细胞(CFC)实验选择EpoR激动剂抗体。以感染复数(MOI)2用慢病毒抗体库转导过表达wthEpoR的TF-1细胞(TF-1/hEpoR)。如通过用抗-人IgG1Fc：PE抗体进行免疫荧光分析所确定的，该MOI导致80％的转导效率。将用抗体库诱导的TF-1/hEpoR细胞加入甲基纤维素培养基，使得甲基纤维素最终浓度为1.27％，细胞浓度为约3×104细胞/mL。将1.5毫升的细胞悬浮液加入直径为35-mm的培养皿。将细胞在软琼脂中培养2-3周。在显微操作器(型号MM33A/L萨特仪器公司)辅助下收获菌落并在50℃下用含蛋白酶K的裂解缓冲液裂解持续1小时。来自每个集落的抗体基因通过PCR以及针对我们的慢病毒载体定制的引物对进行扩增。在UV3TEPAPCR操作柜中进行PCR(TSS增量)。扩增的抗体基因通过电泳进行分析并回收。用SfiI消化后，将基因连接到慢病毒载体中，转化X1-1蓝色细菌。用Sanger测序(EtonBioscience或BATJ)对从每个细菌转化选择的四个克隆进行测序。通过Vbase2获得重链CDR3序列。
TF-1增殖试验。用RPMI洗涤TF-1细胞以除去任何残留的GM-CSF，在有10％热灭活的FBS的RPMI1640中以每孔2×104细胞接种在96孔微量培养板中。加入来自转染的HEK293T细胞的条件培养基，各种浓度的纯化的抗体或Epo并且将孔达到100μl的体积，在37℃温育72小时。将20ul的MTS溶液(CellTiter96Aqueous非放射性细胞增殖检测试剂，Promega公司)加入每个孔中。2小时后，测量在490nm的吸光度。
用EpoR胞外域抑制。在1μg/mLBsAb和增加浓度的截断(蛋氨酸1-Pro250)的EpoR-Fc受体的存在下以每孔2×104个细胞将TF-1细胞接种在微量滴定孔中。将细胞在37℃温育72小时。将MTS溶液加入每个孔中，2小时后测量在490nm的吸光度。
scFv-Fc融合和scFv-fiag蛋白的表达和纯化。对于单抗体，将抗体的表达载体转染到HEK293F细胞。对于BsAb，“把手-孔洞”抗体对的质粒被共转染到HEK293F细胞。利用AKTAxpress纯化器使用HiTrap蛋白GHP柱(GE)纯化来自合并的上清液的抗体。编码scFv-flag标签融合蛋白的载体被转染到HEK293F细胞用于瞬时表达。在重力流作用下用抗-FlagM2亲和凝胶(Sigma-Aldrich公司)填充柱从培养基纯化scFv-flag。将缓冲液换成DPBS，pH7.4，并在4℃下储存。
磷酸化实验。TF-1细胞在含有5％FBS和无GM-CSF的RPMl1640培养基中饥饿24小时。5×106个细胞用于每个实验。用含有4units/ml的EPO、2ng/mL的GM-CSF或各种浓度的BsAb的RPMI无血清培养基在37℃处理细胞30分钟。将细胞用冰冷的含1×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的PBS洗涤一次，并在冰上在500μl的含2×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的PierceIP裂解缓冲液中伴以偶尔涡旋下裂解30分钟。通过在～13,000g持续10分钟离心除去细胞碎片。STAT-5的磷酸化状态通过使用抗-磷酸STAT-5(Tyr694)抗体(CellSignalingTechnology公司，目录号9356)对细胞裂解物进行Western印迹分析来测定，用抗-总STAT-5抗体(CellSignalingTechnology公司，目录号9363)对蛋白质在凝胶带中的量进行定量。将细胞裂解物的另一半与每个样品2μg抗-JAK2抗体(SantaCruzBiotechnology公司，目录号HR-758)在4℃下孵育过夜，以形成免疫复合物。在室温下孵育1小时后，抗原-抗体复合物用蛋白A/G磁珠捕获。洗涤3次后，免疫复合物用低pH值洗脱缓冲液(Pierce，目录号88804)洗脱。利用抗-磷酸酪氨酸抗体(克隆4G10Millipore公司目录号05-321X)作为探针通过Western印迹分析免疫沉淀物，并用抗-总JAK2抗体定量凝胶带中的蛋白质的量。
TF-1细胞分化检测。在0.1ng/mL的GM-CSF加上EPO(4IU/mL)或各种浓度的BsAb的存在下在37℃下培养TF-1细胞2周。观察团块的细胞的颜色。然后将细胞在RIPA中裂解，使用抗-血红蛋白的抗体通过Western印迹法分析血红蛋白的表达。
从人类造血干细胞形成红细胞集落。CD34+干细胞是利用直接免疫CD34Microbead标签系统(AllCells，目录号ABM010)从人骨髓分离的。在EPO(4IU/mL)或不同浓度的BsAb的存在下在补充有50ng/mLrh-SCF、20ng/mLrh-IL-3和20ng/mLrh-IL-6的3毫升Methoclut甲基纤维素培养基(目录号H4230，StemCellTechnologies)中以1∶10稀释在具有2％FBS(StemCellTechnologies，目录号07700)的Iscove的MDM中的CD34+细胞。一式两份地将3000-4000细胞接种在35毫米培养皿中并在第14天对集落形成进行评分。
使用生物层干涉测量法(BLI)进行动力学表征。使用OctetRed(Fortebio公司)进行实验。用抗-人IgGCapture(AHC)生物传感器(动力学分级(kineticsgrade)目录号18-5060)捕获scFvFc融合蛋白。针对在缔合/解离的循环中固定的scFvFc测量经纯化的EpoR胞外域的单体蛋白质的滴定系列。数据集被拟合至1∶1结合模型，以确定ka、kd和Kd。
实施例2从组合库分离EpoR结合抗体
该方法的初始目标是在真核细胞内表达尽可能大的抗体库，其中所述的抗体可以被包含在细胞质或被分泌。为了以给予最大自由度的方式实现这一点，我们使用被构建以使抗体基因可以很容易地被交换的M-13噬菌体和慢病毒载体两者(图7)。通常对这个问题有两种方法，依赖于该靶标是否是已知的。一种方法可以使用在噬菌体中的组合抗体库的常规的淘选以使针对靶蛋白的抗体富集，然后将所选基因转换入慢病毒，或者我们可以在没有事先选择的情况下直接使用慢病毒库(图1)。在靶标是已知的情况下，在噬菌体中的初始选择是最优的，因为与在真核系统中可能询问的多样性相比，噬菌体系统可探询(interrogate)更大的多样性空间(约1.0×1011)。然而，在对有关途径的分子组分所知甚少的情况下，真核细胞中的直接表型选择是优选的选项。在此处报道的实验中，已经知道，促红细胞生成素受体(EpoR)是促红细胞生成素(EPO)的靶标，因此，我们首先从在噬菌体的组合库中选择结合到EpoR的抗体。因为，对EpoR的正确构型选择抗体可能是至关重要的，因此只尝试了在溶液中的筛选。靶蛋白是构建成Fc融合或His标记的单体EpoR的EpoR二聚体。两种不同的实验方案被使用。第一实验方案(P1)被设计成定位不与EPO结合位点直接竞争但在二聚体中仍可访问的表位。首先两个筛选回合在EpoR二聚体-Fc融合和His标记的单体的EpoR之间交替。这些回合之后，接着进行第三回合，使用单体EpoR以消除任何靶向构建物的Fc区的残余噬菌体。使用甘氨酸-HCl(pH为2.2)来洗脱结合的噬菌体。因此，在第一回合中该结合至EpoR二聚体Fc-融合蛋白的所有抗体被选择，并在第二回合中库(pool)被缩小以除去其反应活性依赖于Fc融合配偶体的抗体。在第二实验方案(P2)中，连接到EPOR二聚体Fc-融合的噬菌体在G蛋白珠上收集，之后用EPO进行特异性洗脱。该实验方案被用来富集结合在EpoR的EpoR结合位点上或其附近的抗体。为了对筛选的结果取样，从每个实验方案随机挑出48个克隆用于使用吸附His-标记的单体的EpoR作为抗原的噬菌体ELISA。相对于非特异性结合到BSA，约一半的来自每一个过程的克隆特异性结合到EpoR。通过噬菌体ELISA确定反应性的图谱。反应性克隆的序列分析表明，它们可以分成21个不同的家族。在某些情况下，使用两种实验方案选择相同的抗体，而在其他情况下所选择的抗体只来自一个实验方案(P1与P2比较)。
实施例3激动剂抗体的选择
编码通过每个实验方案在噬菌体中选择的结合到EpoR的抗体的基因被分别转移到慢病毒，慢病毒用于感染我们已经工程化以过表达野生型EpoR的TF-1细胞。在TF-1细胞中野生型EpoR(wtEpoR)的表达对用于持续细胞生长的其内源性截短的EpoR是必要的补充。为了方便EpoR表达的研究，wtEPOR和GFP用T2A连接子连接(图7)。在用慢病毒感染的细胞中的抗体的表达使用EF1α或UbC启动子，该抗体的表达通过Western印迹分析进行分析(图2A)。利用EF1α启动子表达的抗体的量较高。(图2A)。
我们工程化以表达wtEpoR的人TF-1细胞需要EPO用于生长。为了确定是否有任何表达的抗体可替代EPO，被感染的细胞和对照细胞被接种在无EPO的软琼脂中并在14天之后观察红色集落(redcolonies)的生长(图2B)。仅有用编码抗体的病毒感染的细胞产生红色集落(图2B)。只编码GFP的对照载体不诱导任何集落生长的事实表明：所观察到的集落生长不是通过慢病毒基因组的整合所诱导的插入式突变的结果。尽管天然可信的EPO诱导大多数接种的细胞的生长，但是即使超过80％的细胞被感染，仅含有抗体基因的细胞的生长更少见。挑选来自感染的细胞的三十三个集落并通过PCR回收抗体基因，并克隆入慢病毒载体(图7)。分析编码抗体的CDR3区的基因，以确定在给定的克隆(clone)中不同序列的数量。这种分析表明，从每个集落中回收一至四种不同的慢病毒。由于从结合到EpoR的噬菌体分离出的抗体基因的初始测序仅是可用的多样性的采样，所以在由慢病毒感染选择的克隆物中发现了一些新的序列。
进行相似的实验以选择促血小板生成素(Tpo)的抗体激动剂。以下的在用编码荧光标志物的嵌合受体构建的Tpo报告子细胞系中抗体库表达之后，通过荧光激活细胞分选来选择Tpo模拟抗体。请参阅下面的详细信息。
实施例4选择的抗体的Epo激动活性
由慢病毒编码的抗体通过HEK-293T细胞的瞬时转染产生并测试它们诱导TF1细胞增殖的能力。两种抗体是活性EpoR激动剂，其具有天然可信的EPO的活性的约60％的活性。虽然它们是在不同的日子从不同的集落收集的，但它们具有相同的序列(图3A)。
实施例5选择的Epo激动剂抗体的专性双特异性
由于许多克隆表达一个以上的抗体，所以有一种可能性，即观察到的激动剂活性是依赖于不同抗体特异性之间的协同作用。为了测试这种想法，通过MTS实验，观察用源自同一集落的两种抗体转染的HEK293T细胞的条件培养基中其细胞增殖。例如，对于具有抗体序列A、B和C的集落，共转染的对包含序列AB、AC和BC。共测试了49个组合(图3B)。这些组合中的一些产生显着增强的激动剂活性，在一种情况(V-1/V-3)中与天然可信的EPO一样强(图3B)。
这些协同作用有两种可能的途径。在一种方案中，两种不同的同型二聚体抗体分子可以是在效果上简单相加。然而，由于这里使用的形式，其中scFv融合至免疫球蛋白分子的Fc片段，所以存在另一种可能性，即将在表达一个以上的抗体的细胞中形成异质二聚体。
为了确定观察到的协同作用的分子状态，我们研究了两种不同的结合特异性是否必须是存在于相同的免疫球蛋白分子中。为了纯化可能的抗体组合，细胞用表达载体转染，该表达载体编码同二聚体抗体或异二聚体，所述同二聚体抗体或异二聚体的配偶体通过Fc片段的“把手-孔洞”的工程化决定(Ridgway等人，ProteinEngineering9：617，1996)。该“把手-孔洞”工程化通过分别将T366Y突变和Y407T突引入到两种不同单体的Fc部分的CH3区来促进异源二聚体形成。幸运的是，潜在的抗体的配偶体尺寸略微不同，使得在蛋白质G层析后“把手-孔洞构建物”的纯度可通过丙烯酰胺凝胶分析来确认(图4A)。虽然所有纯化的抗体结合到EpoR(图4B)，无论是单独的抗体还是两种不同抗体的简单混合物都没有任何激动剂作用(图4C)。然而，当两种特异性合并在单个的抗体分子中时，蛋白具有强的类似EPO活性，所述活性等效于当在细胞内通过共转染生成多种抗体物种时所观察到的活性(图4C)。双特异性异源二聚体抗体和EPO的最大反应是相似的(图4C)。重要的是，不同于任何的同二聚体抗体，异二聚体双特异性抗体(V-1/V-3)是完全激动剂；尽管事实上同型二聚体抗体之一(抗体的E-1)的确显示为约60％的最大激动剂作用(图4C)。激动剂作用的特异性是通过表明它可以被纯化的EpoR胞外域(图4D)完全抑制来证实的。此外，该抗-EpoR的抗体的结合特异性通过表明它们没有与包括促血小板生成素受体的其他蛋白反应得到证实。
为了确认各种抗体构建物的激动剂活性，在TF-1和TF-1wtEpoR细胞中研究了所述抗体构建物诱导血红蛋白合成和蛋白磷酸化的能力(图5A-5B)。异二聚体双特异性抗体诱导血红蛋白合成(图5A)，以及与EPO或GM-CSF本身相比诱导JAK-2和STAT-5的磷酸化更强(图5B)。由于需要GM-CSF用于维持TF-1细胞，其对JAK-2和STAT-5磷酸化的作用也进行了研究，作为附加的阳性对照(图5B)。
实施例6选择的Epo激动剂抗体的不对称协同性
组分抗体的结合参数的生物层干涉测量分析表明，每个抗体结合到EpoR，其中V-1具有26nM的亲和性，而V-34具有45nM的亲和性。针对结合到EpoR，天然可信的EPO与抗体V-3竞争，但不与V-1竞争，这表明只有抗体中的一个结合在EPO结合位点的附近处，而另一个在其他位置结合。因此，EPO和双特异性抗体两者实现对于完全激动剂活性所必需的专性不对称结合EpoR，尽管以不同的方式实现。在EPO的情况下，不对称性是通过使用以不同的亲和性结合到在同二聚体EpoR中的单个位点的两种不同的界面(位点1和位点2)来实现的(Watowich，J.Invest.Med.59：1067，2011)。与之相反的是，异源二聚体双特异性抗体通过使用其两种不同的结合特异性以与EpoR上的不同位点相互作用来实现不对称性(图6)。
为了确定两种不同的特异性之间的结合协同性的性质，设计了竞争实验，允许研究每个抗体对其它抗体与EpoR单体的结合的影响。因此，未标记的scFv-Flag融合物和生物素化的scFv-Flag融合物之间的竞争可用HRP-标记的链霉亲和素进行监测，以测定一个抗体的结合对另一抗体的解离率的影响。正如所期望的，在二聚物的每个臂中具有相同特异性的同二聚体抗体对相互竞争。这一发现与具有不同特异性的同型二聚体对不互相竞争的结果形成显著对比，从而再次确认它们结合到EpoR的不同区域。该结果还表明，两种不同的抗体不是变构配偶体。
实施例7人骨髓干细胞的诱导
我们在这里研究的TF-1细胞广泛地用于测定各种细胞因子(30)的活动。然而，作为细胞系，它们可能不是骨髓中的实际红细胞祖细胞的准确代表。因此，我们想证实我们的激动剂抗体从人骨髓的造血干细胞诱导红细胞生成。双特异性激动剂抗体用于刺激从人骨髓中新鲜分离的CD34+干细胞。一周后，细胞增殖和血红蛋白合成已经是明显的(图5C)。为了使结果更加定量，在14天后对诱导的集落数进行计数。发现，天然EPO和双特异性抗体诱导的集落数大致相同。
实施例8选择促血小板生成素(Tpo)激动剂抗体
该实施例描述了抗体激动剂的选择，该抗体激动剂是完整促血小板生成素拟表型。为了用于激活细胞通路，而不是细胞复制，直接选择抗体。如下面详细描述的，该选择方法利用在单细胞水平操作的荧光报告子系统。报告子系统基于信号传导通路的激活，并允许人们在数周中直接选择涉及(engage)所有由天然Tpo激活的下游途径的抗体激动剂。因为编码候选激动剂分子的基因与他们的靶标共包装，每个细胞本身就是一个选择系统。
嵌合TpoR报告子系统的构建：人们可以使用表达wtTpoR细胞的生长作为可选参数来研究潜在的抗体激动剂。然而，这样的系统不如人们所希望的那么稳健，因为可以探询的可选择的事件数不匹配来自库的潜在输入事件的大量的数量。而且，这样的选择可被由突变体细胞的出现而引起的高背景打乱，突变体细胞在不存在激动剂的情况下在体外保持细胞增殖。为了增加可观察事件的数量，我们构建了荧光报告子系统，该系统允许在单个细胞水平筛选。在Sis-诱导元件(SIE)启动子序列的控制下，从包含整合的β-内酰胺酶基因的HEK293T细胞系开始构建响应于Tpo的两种报告细胞系。这些HEK293T(Sie-bla)细胞可以通过IL6经由Jak-Stat信号传导途径来激活。不幸的是，Tpo不激活在这些细胞中的新生荧光报告子系统，即使在野生型Tpo受体(TpoR)被引入到这些细胞中时亦是如此。为了克服这个问题，我们通过在两个不同的交叉点将TpoR胞外域拼接到IL6st(gp130)信号转导胞内结构域来构建嵌合受体。在一种情况下，TpoR的从N-末端到框I区(氨基酸1-527)的胞外结构域被连接到从框I区之后到C-末端(氨基酸651-918)的IL6st信号转导细胞内结构域。可替代地，从N末端至跨膜螺旋之前(氨基酸1-491)的TpoR胞外域连接到从跨膜螺旋到C末端(氨基酸605-918)的IL6st结构域。当TpoR结合到这些嵌合受体的TpoR胞外域时，应涉及它们的细胞内的IL6信号转导组分从而导致途径的激活，途径的激活可通过产生独特的基于FRET的荧光信号来检测。事实上，如通过流式细胞术，对在细胞中OD460nm至OD530nm比率的分析，以及转导的细胞的荧光显微镜检查法所确定的，含有这些嵌合受体的细胞现在对Tpo产生应答反应。可以通过荧光激活细胞分选(FACS)来容易地选择表达信号的细胞，由此允许选择性回收激活的克隆。第一构建物给出最强的荧光增强，这表明框1元件对于有效的信号转导是重要的，并且它被用于进一步的实验。
单个细胞形式的检验：由于我们希望利用单个细胞选择形式，因此使用两种方案来将抗体限制在产生它们的细胞内。在一种方案中，将细胞涂有一薄层琼脂以限制抗体扩散到邻近的细胞。在另一种方案中，内质网(E.R.)滞留信号肽赖氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸(KEDL)被附加(appended)到抗体分子的C末端，以便它被保留在E.R.腔中。
通过两轮筛选针对他们结合到纯化的TpoR的能力最初选择噬菌体中的抗体候选者。通过噬菌体ELISA，随后通过对阳性克隆的采样进行核酸测序来表征所选择的抗体。回收22个序列。在这些序列中，两个不同的序列被认为是分别重复3和9次，这表明强大的富集参数。
为了选择是激动剂的抗体，来自所选择的噬菌体的整个富集群的抗体基因被转移到用于感染报告子细胞的慢病毒载体。因为抗体基因被整合入基因组，所以每个候选抗体保持连接至单个报告细胞。在抗体库的分析之前，暴露于FRET底物之后观察信号的诱导的最佳时间是由动力学分析来确定的。具体地，用慢病毒抗体库转导表达嵌合受体的细胞，该慢病毒抗体库含有在Tpo或甘氨酸从TpoR洗脱之后从噬菌体中回收的基因。在转导后的不同的时间点，收集细胞并装载FRET底物。用流式细胞仪检测分析细胞。不处理或Tpo处理用作阴性对照或阳性对照。在约20小时观察到最大460nm发射，并在48小时消失。
在用分泌形式的抗体库感染后的16小时，将报告细胞与FRET底物孵育并通过流式细胞术分选。用针对TpoR的两轮筛选之后所选择的抗体感染的细胞的诱导频率与用天然的未选择的库感染的细胞作比较。天然Tpo作为阳性对照。正如所预期的，在TpoR上预先选择的抗体比来自未选择的库的抗体诱导远远更多的细胞。
单独的荧光细胞被沉积到微滴度孔中并生长至汇合。从这些克隆中收获的生长培养基被用来测试哪些产生活性抗体，如通过含有wtTpoR的细胞的增殖和在含有嵌合受体的报告细胞中荧光的产生两者所确定的。两种测定实验有很强的正相关性。应当指出的是，虽然细胞增殖试验对于选择并不稳健，但一旦获得候选激动剂它是有用的试验。来自正产生活性抗体的所选择的细胞克隆的抗体基因通过PCR回收，并克隆到用于测序的pFUSE哺乳动物表达载体中。大多数克隆携带了在许多不同的克隆中明显地重复的单个序列。如在前面我们的Epo系统的研究中看到的，一些克隆具有一个以上的序列，与所用的感染复数相一致。
如果可以选择存在于各种亚细胞区室的活性的抗体，则该系统将是最有用的。为了验证这一点，将激动剂抗体(3D9)构建成分泌形式和E.R.滞留形式。携带滞留信号的抗体的细胞内限制通过分析生长培养基和来自产生它的细胞的细胞裂解产物来证实。具有E.R.滞留序列的抗体以高浓度存在于细胞裂解物中，但在生长培养基中没有检测到。与此相反，大量的具有分泌信号的抗体存在于生长培养基中。针对从两种形式表达的抗体，观察细胞的诱导。这些结果表明，对于通过细胞内表达的抗体激活受体，分泌不是必需的(obligatory)，很可能是因为不论抗体是否被滞留在E.R.腔或锚定在质膜中，该受体具有相同的整体拓扑结构。在分泌途径中，受体活性位点被定向面向E.R.腔，而当锚定在质膜中时其面向胞外环境，但在两种情况下，信号转导结构域面向细胞质。
由选择的抗体引起的血栓形成：最活跃的抗体中的两种抗体(3D9和14F12)在HEK293F细胞中被表达并使用蛋白-G亲和层析纯化。使用细胞增殖和荧光报告基因测定法两者来确定抗体的EC50(图8A和8B)。这两种抗体是完全激动剂。在短期荧光测定中，相比内源蛋白激动剂Tpo的EC50(其为约20pM)，抗体3D9和14F12的EC50分别为约10和500pM。相比之下，在长期增殖测定中，相比Tpo在该测定中具有的EC50为约70pM，抗体3D9和14F12的EC50分别为5和50pM。在这些测定中的差异可反映抗体分子优异的稳定性，与天然Tpo在血清中的半衰期(为约20-40小时)相比，抗体分子具有数个星期的半衰期。为了确定抗体和Tpo是否作用在TpoR中的相同位点上，我们研究不同的激动剂抗体和天然Tpo之间是否有协同作用。没有观察到协同作用，并且当内源性激动剂Tpo和激动剂抗体以次最大浓度被使用时，两者的活性是简单地相加，这表明激动剂抗体和Tpo结合到不同的相互排斥的结合位点，或TpoR中的相同的结合位点。
为了确定抗体是否能够从人骨髓干细胞中诱导巨核细胞的形成，用抗体或Tpo处理新鲜的CD34阳性细胞，并通过使用针对与白细胞标志物CD45RA相比较的巨核细胞标志物CD41的抗体的流式细胞术来进行分析。两种抗体3D9和Tpo明显地诱导从人干细胞形成巨核细胞。这些研究通过使用不同通道的共聚焦显微镜成像和使用核染色和流式细胞仪测量成熟的巨核细胞的特征多核特性来证实。
Tpo激活细胞，伴随有蛋白质磷酸化的特征模式，其中涉及Jak2-Stat3/Stat5、PI3K-Akt和MAPK途径。我们使用表达野生型人TpoR的BAF-3细胞，研究了Tpo和激动剂抗体两者激活这些途径的能力，BAF-3细胞不同于未改性的HEK293T(Sie-bla)细胞，其能对Tpo产生应答反应。重要的是，如天然Tpo所做的，激动剂抗体激活所有三种途径，这表明它们的作用机理是相似的(图9)。而在其他研究中，抗体3D9相比于抗体14F12具有较低的EC50。
作为整体机制(mechanistic)相似度的正交测定法，用细胞增殖试验研究高度特异性的激酶抑制剂。如果激动剂抗体和天然Tpo在相同的途径上操作，那么抑制的概况也应该是相同的。我们研究了对磷脂酰肌醇3(PI3)、Jak2和MEK-1介导的途径具有特异性的激酶抑制剂LY294002、PD98059和SD-1029。由激动剂抗体和天然Tpo诱导的细胞增殖通过PI3K和JAK2而不是MEK-1抑制剂以剂量依赖性方式被抑制，这再次表明它们激活相似的途径。
体内血小板生成的激活：鼠和人TpoR之间的序列相似性程度高。这种相关性使我们对激动剂抗体在小鼠中的活性的研究是可行的，从而大大简化了其推定治疗效用的评估。免疫化学研究表明，抗体3D9与人和小鼠TpoR两者反应。另外，纯化的小鼠和人TpoR的胞外结构域都可通过激动剂抗体来抑制荧光报告细胞的激活。我们采取这种交叉反应性以研究在小鼠内激动剂抗体诱导血小板体内形成的能力。以每千克540微克的单剂量的激动剂抗体3D9经过八天增加血小板计数三倍(图10)。这种诱导程度比在小鼠中用rhTpo观察到的血栓形成更好，即使连续五天给药每天两次亦是如此。
下面提供在该实施例中采用的材料和方法的更详细的描述。
细胞系：鼠白介素3依赖型细胞系Ba/F3(目录号ACC300，DSMZ)被保持在含有10％(体积/体积)FCS(LifeTechnologies)、青霉素和链霉素(LifeTechnologies)和2ng/mLrmIL3(R&DSystem，目录号403-ML-010)的RPMI-1640(LifeTechnologies)中。HEK293F细胞系被保持在具有4mMGlutaMAX(LifeTechnologies)的FreeStyleF17培养基中。SIE-BLAHEK293T细胞系(LifeTechnologies，目录号K1649)被保持在含有10％(体积/体积)透析的胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素、非必需氨基酸和HEPES(LifeTechnologies)的DMEM中。
从在噬菌体中的组合抗体库选择EPOR结合抗体：用EZ-LinkNHS-PEG4-生物素和生物素化试剂盒(ThermoScientific，目录号21455)将重组纯化人促血小板生成素受体(TpoR)胞外域(Ser25-Trp491)(R&DSystem，目录号4444-TR-050)生物素化，生物素化的蛋白质被用于在溶液中筛选。在噬菌体中的组合抗体scFv库用生物素化的TpoR胞外结构域孵育，之后添加包覆链霉亲和素的DynabeadsM-280(LifeTechnologies，目录号11205)以拆开TpoR-噬菌体复合物。通过洗涤除去未结合的噬菌体。用促血小板生成素(Tpo)(SinoBiologicalInc.，目录号10381-H08C)或甘氨酸-盐酸(pH值2.2)洗脱结合的噬菌体。用洗脱的噬菌体感染XL1-蓝细胞，并在30℃下生长过夜。从板上刮下细菌，加入辅助噬菌体VCSM13以扩增噬菌体用于下一轮的筛选。从每个实验方案收获二十四个克隆，通过噬菌体ELISA分析它们与TpoR的结合。所选噬菌粒由Sanger测序法进行测序。用Vbase2分析序列。用ClustalW对重链CDR3进行比对。
TpoR应答报告细胞系的建立和TpoR-IL6ST嵌合受体的构建：由人TpoR和人IL6信号转导子(IL6ST，GP130)胞内结构域组成的两种嵌合受体被构建。在一种情况下，TpoR的胞外结构域[从N-末端到框I区(氨基酸1-527)]被连接到IL6信号转导子胞内结构域[从框I区之后到C末端(氨基酸651-918)]。可替代地，TpoR胞外域[从N末端到跨膜螺旋之前(氨基酸1-491)]被连接到到IL6ST域[从跨膜螺旋到C末端(氨基酸605-918)]。嵌合受体被克隆到使用泛素C启动子(UbC)以驱动该受体的表达的慢病毒载体。
用携带TpoR-IL6st嵌合受体基因的慢病毒感染含有在SIE应答元件的控制下的β-内酰胺酶报告基因的CellSensorSIE-blaHEK293T细胞系。用重组Tpo刺激转导的细胞，使用MoFloXDP流式细胞分选仪将对Tpo显示出最大反应(具有最高OD460nm至OD530nm的比率)的细胞挑选到96孔微量滴定板。单细胞克隆被允许达到汇合，使用荧光板读数器(Tecan，InfiniteM200Pro)在黑色壁的、透明底的试验板中测量单克隆对Tpo的反应，该荧光板读数器使用409nm的激发滤光器以及460nm和530nm的发射滤光片。具有对Tpo有最高反应的克隆被指定为CR2-9。
BaF3/hMPl细胞系的建立：将野生型人TpoR基因克隆入慢病毒载体并在UbC启动子的控制下表达。用携带TpoR基因的慢病毒转导鼠白介素3依赖型细胞Ba/F3，在含有20ng/mL的rhTpo的RPMI1640培养基(R&D系统，目录号288-TP-005)中选择Tpo依赖性细胞。
慢病毒组合抗体库的构建：scFv基因是从噬菌体载体剪切下来的，并在如先前所描述的相容的不对称SfiI位点被亚克隆到慢病毒载体。
使用FACS对TpoR激动剂抗体进行单细胞选择筛选：用G蛋白磁珠(NewEnglandBiolabs，目录号S1430S)移除在慢病毒制备过程中产生的分泌抗体。抗体耗竭的完全性是用HRP缀合的抗-人Fc抗体通过Western印迹来证实的。在转导的前一天，以低密度接种Tpo应答的HEK293T细胞CR2-9。在用慢病毒转导细胞之后，将甲基纤维素基培养基置于细胞层的顶部，然后过夜培养以将分泌的抗体限制在产生它们的细胞之内。在收获细胞之前，使用过量的培养基溶解甲基纤维素基培养基并丢弃。分离细胞并加入LiveBLAzerFRETB/G负载底物(LifeTechnologies，目录号K1095)。使用MoFloXDP流式细胞分选仪将具有最高OD460nm至OD530nm的比率的细胞挑选到96孔微量滴定板。单细胞克隆被允许达到汇合，并将从他们收获的条件培养基加入至含CR2-9细胞的384孔黑色壁、透明底微滴定测定板用于二次筛选。还在含有Ba/F3-hMPl细胞的384孔微滴定板中测试所述条件培养基。使用CellTiter96Aqueous非放射性细胞增殖实验(Promega公司，目录号G3580)测定对细胞增殖的影响。来自给出最高信号的克隆的抗体基因通过PCR回收，并克隆到用于测序的pFUSE哺乳动物表达载体，独特抗体序列被转染到HEK293F细胞以产生抗体。使用HiTrap蛋白GHP柱(GEHealthcareBiosciences，目录No.17-0405-01，)与纯化器纯化抗体。
人CD34+造血干细胞(HSC)的分化：用来自2个不同供体的HSC细胞进行本实验(一式两份)。CD34+干细胞是利用直接免疫的CD34微珠标记系统(AllCells，目录号ABM010)从人骨髓中分离的。在仅补充有50ng/mL的人干细胞因子(SCF)或补充有SCF加上不同浓度的人Tpo激动剂抗体3D9或14F12的StemSpan无血清培养基(SFEM)(Stemtechnologies，目录号09600)中培养约50,000的CD34+HSC细胞持续14天。对于免疫荧光实验，用在PBS中3％多聚甲醛将细胞固定，并在2％BSA的PBS中封闭30分钟。用100ug/mL浓度的来自人血清的纯化的IgG(SigmaLifeScience，目录号14506)将在细胞上的Fc受体封闭10分钟。细胞用PE缀合的抗-人CD41(Biolegend，目录号303705)和APC缀合的抗-人CD45RA(eBioscience，目录号17-0458-41)染色。
用Hoechst染料染色细胞核，用PBS洗涤，并用LSRII流式细胞仪(BectonDickinson)进行分析。对于通过共聚焦显微镜法成像，除了染色核，还用WGALectinFITC(Genetex，目录号GTX01502)染色细胞表面。对采用细胞离心涂片机而被沉积在载玻片上的细胞进行共聚焦显微成像。
磷酸化分析：使Ba/F3-hMpl细胞在含有5％FBS而无Tpo的RPMI-1640培养基中饥饿18小时。每个实验采用总共8×106个细胞。用含有50ng/mLTpo、100ng/mL激动剂抗体3D9或200ng/mL的激动剂抗体14F12的RPMI无血清培养基在37℃下处理细胞20分钟。将细胞用冰冷的含有1×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(PierceChemical，目录号78428)的PBS洗涤一次，并在冰上在500μl的含2×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的免疫沉淀裂解缓冲液中伴以偶尔涡旋下裂解30分钟。通过在13,000×g持续10分钟的离心除去细胞碎片。Stat3、Stat5、Akt和P44/42MAPK的磷酸化状态通过使用抗-磷酸-Stat3(Tyr705)(D3A7)XP抗体(CellSignalingTechnology，目录号9145P)，抗-磷酸-Stat5(Tyr694)(D47E7)XP抗体(CellSignalingTechnology，目录号4322P)，抗-磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/tyr204)(197G2)抗体(CellSignalingTechnology，目录号4377S)和抗-磷酸-Akt(Thr308)(244F9)抗体(CellSignalingTechnology，目录号4056S)通过Western印迹分析来测定。用抗-总Stat3(C-20)(SantaCruzBiotechnology，目录号sc-482)，抗-总Stat5(C-17)(SantaCruzBiotechnology，目录号sc-835)，抗-Akt(CellSignalingTechnology，目录号9272S)和抗-p44/42MAPK抗体(CellSignalingTechnology，目录号9102S)对蛋白质在凝胶带中的量进行定量。
通过在4℃用抗JAK2琼脂糖(EMDMillipore，目录号16-121)免疫沉淀3小时从细胞裂解物中纯化JAK2。用低pH值的洗脱缓冲液(Pierce，目录号88804)洗脱JAK2，并用2MTries缓冲液中和。使用抗-磷酸-JAK2(Tyrl007/1008)(C80C3)抗体(CellSignalingTechnology，目录号3776)和抗-总JAK2抗体(C-14)(SantaCruzBiotechnology，目录号SC-34479)通过Western印迹分析免疫沉淀物。
小鼠中的血栓形成：9周龄的正常Balb/C小鼠被分为3组，每组6只小鼠。在0天用150微克/千克或500微克/千克的3D9激动剂抗体或PBS皮下注射处理小鼠组作为对照。抗体制剂含有由显色LAL内毒素测定(GenscriptCorporation，产品编号L00350)确定的每微克蛋白小于0.0025EU的内毒素。每只小鼠被麻醉，每隔一天使用设有UnopetteReplacement的毛细管(MEDIX，目录号BTP-4015)从眼眶后静脉窦收集10微升的血液，持续14天(注射前第0天，处理后第2，4，6，8，10，13天)。将血液转移到预先充满1mL裂解缓冲液的离心机管中。使用40×物镜和10×目镜蔡司镜头用C-ChipINCYTO一次性血细胞计数器(SKCInc.America，目录号DHC-N01)对血小板计数。
在此实施例中描述的研究表明，通过JAK/STAT信号传导激活的细胞因子途径可通过FACS和回收的(多个)抗体基因来选择。该系统还适用于选择其它重要的抗体，如那些调节GPCR途径的抗体，其中通过采用此处所使用的相同FRET底物可以研究例如基于β-抑制蛋白的系统。
尽管基于途径激活的发现系统是针对小分子使用的，但这里报告的系统的不同之处在于在感染慢病毒的过程中它可在抗体中同时询问更多的潜在激动剂，因为库的大小是非常大的，并且可以采用单细胞形式询问。另一个重要的区别是，候选激动剂复制，从而允许所选择的分子能被鉴定和批量生产，而不需要任何初始定位(addressability)。
因为我们采用基于遗传学的方法，大量的潜在激动剂在单个细胞的非常小体积的元件的或者其细胞的区室中产生，使得它们在由相同细胞表达的受体处的摩尔浓度很高。事实上，如本文所述，我们已经使用了这种方法来迅速产生针对其他细胞因子受体、整合素和离子通道的激动剂抗体，以及那些调节形态发生和抑制病毒复制的物质。在这些情况中的某些情况中，使用针对已知靶标的预选择，而在其他的情况中选择是盲目的。这些研究还表明，该方法并不局限于只作用于质膜的外表面的分泌的抗体，从而将其概括为涉及与在各种亚细胞区室中的抗体共存的任何分子。
实施例9转分化人干细胞的抗体激动剂的选择
该实施例描述了从转分化人干细胞的细胞内组合库中产生和选择抗体激动剂。我们使用他们“邻近”形式的组合抗体库来共表达抗体和粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)。值得注意的是，使用这种方法，我们分离针对G-CSFR的激动剂抗体，其能诱导人CD34+干细胞形成神经祖细胞。因为CD34+干细胞是骨髓谱系的，所以这种抗体显出诱导转分化过程。
“邻近”抗体库的构建：许多定位不同的细胞区室的不同的抗体形式可以用于细胞内组合库。在我们以前的使用连接到单细胞选择系统的细胞内库的研究中，我们生产许多是自然激动剂拟表型的抗体。由于抗体激动剂具有以与天然激动剂不同的方式结合到受体的潜能，它们潜在地能够起到多效性作用。为了有利于选择以不寻常的方式结合到受体的抗体，我们产生了其中组合抗体库的成员被整合到靶细胞的质膜的新的形式。使用锚定抗体的选择是基于其中可确保抗体在产生它的细胞上起作用的自分泌机制。
通过所附加的Fc结构域二聚化的单链ScFv经由柔性连接子连接到血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域，使得抗体分子被整合为进入质膜的二聚体，它们的结合位点朝向溶剂。我们将这些库称之为“邻近”库，因为抗体的反应性可能受限于相邻分子的可用的区域。中心概念是通过使用“邻近”库，可能有利于在溶液中进行选择时通常未见的罕见抗体，这是因为有限的反应几何构型与非常高的有效摩尔浓度结合，用于相互作用的对。该方法也具有重要的优点：靶受体存在于它的天然环境中，从而确保存在生理学相关构象。
然后，我们测试了抗体在与其促血小板生成素受体(TpoR)靶标共表达并锚定在质膜中时发挥作用的潜力，该抗体是一种可溶形式的已知的促血小板生成素(Tpo)拟表型。当抗体被整合到质膜时，它仍充当激动剂，这表明它可激活邻近TpoR。使用两个独立的实验。在一个实验中，研究了FRET荧光报告子实验，其测量信号转导途径的激活。第二个实验测量细胞生长的刺激。为了确认抗体激活表达它的相同的细胞，而不是通过细胞-细胞相互作用激活相邻的一个细胞，将细胞以低浓度接种，以便它们可以被单独地研究。当培养物暴露于FRET底物时，发现隔离的细胞被激活，这强烈表明了膜结合抗体通过结合到邻近的受体来激活表达该抗体的细胞。在仅用表达红色荧光蛋白的病毒感染的细胞中没有观察到激活。
G-CSF抗体拟表型的分离：为了增加不常见抗体的分离的潜力，使用双重选择方案。在第一步骤中，从在噬菌体中表达的含有约1.0×109个成员的组合库中选择结合到在溶液中的G-CSFR胞外域的抗体。这一步骤的目的是为了从大的多样性系统中选择结合抗体，从而输入最高数量的候选者到更严格的二次筛选中。我们预计这种富集库具有大量针对可容易获得的抗原表位的抗体而具有较少的针对其他区的抗体。基于功能而不是简单结合的二次“邻近”筛选被设计成既直接地隔离预先选择库中是激动剂的那些成员，又发现那些可能具有不寻常功能的罕见的抗体。因此，在两轮筛选后在噬菌体中预先选择的抗体被转换成质膜结合形式，并转移到用于感染报告细胞的慢病毒。这些具有约5.0×105个成员的选择的抗体的整个池(pool)被用于感染报告细胞系，其中锚定的G-CSFR共同定位于质膜。在这些报告细胞系中，BaF3细胞的生长或SIE/BLA/SIG细胞中的FRET信号的诱导严格依赖于G-CSFR激动剂的存在。用抗体库感染或暴露于天然G-CSF都激活在这些细胞中的G-CSFR。再次，仅用编码红色荧光蛋白的病毒感染并不激活细胞。
虽然当所选择的抗体整合到质膜时是激动剂，但是证明它们也以类似于内源性GCSF激动剂的方式用作为可溶蛋白是重要的，该内源性GCSF激动剂是分泌的生长因子。为了研究这一点，所选择的抗体基因被转化为在被用来转染在96孔板中的HEK-293细胞的表达载体中的分泌形式。收获分泌的抗体，并测试其结合到G-CSFR和激活报告细胞的能力。对来自阳性克隆的抗体基因进行的测序表明，它们都衍生自单个的克隆，这强烈地表明发生可选择的事件。该克隆以少于10％的频率存在于原始池中，如通过来自50个随机挑选的细菌菌落的抗体基因的序列所确定的，并且如果选择仅限于在噬菌体中的更多轮筛选，则该克隆很容易被遗失。通过Western印迹和FACS对亲和纯化的抗体的分析表明，它强烈地结合到G-CSFR(图11A)，并且是一种激动剂(图11B-11D)。另外的研究表明，纯化的抗体诱导报告细胞系中的G-CSFR的下游信号传导和生长。为了完成此循环，该抗体在慢病毒中重新转化为其膜系链形式(membranetetheredformat)(MTA)并在感染后再次能够选择性激活报告细胞。
为了确定抗体及其受体靶标实际上是否共定位在质膜中，对表达G-CSFR和所选择的抗体克隆3B3两者的细胞进行荧光显微镜法研究。这些研究表明，抗体分子和G-CSFR两者在质膜上同时强烈表达并在由交联诱导共定位在典型的膜片(classicalpatches)中。通过G-CSF或激动剂抗体的受体激活又严格依赖于G-CSFR的存在。通过G-CSF或激动剂抗体没有激活模拟转染的细胞。
人干细胞的转分化：由于发展“邻近”组合抗体库的主要目的是选择可能以不寻常的方式作用的激动剂，我们测试了这些以其可溶形式存在的G-CSFR结合抗体的激活人CD-34+干细胞的能力。我们认为，它们可能会更有效和/或进一步沿骨髓谱系的途径推动分化。然而，实际发生的是，不像天然配体，抗体引发在这些干细胞中的神经形成。
通过从五个个体分选的细胞在不同的场合时机分离CD-34+干细胞。分选的细胞具有96-99％的纯度。在第一个实验中，用G-CSF处理一半的细胞，用所选择的可溶抗体3B3处理另一半的细胞。正如预期的那样，G-CSF引起未附着到培养皿的并具有骨髓谱系特征形貌的细胞增殖。与此相反，抗体引起附着到培养皿的细胞广泛形成。在第八天开始附着，在第14天，约40％的细胞附着并显示出具有与那些经历神经发育的细胞最一致的特征(图12A-12F)。这些细胞是能动的，有长神经突(neuritis)，并表现出多种形态，包括双极构型和广泛发育的锥形生长锥(图12E-12F)。对这些细胞进行了扫描电子显微镜分析，以获得进一步的形态学细节。这些研究表明，在神经突端部上的生长锥具有广泛形成的丝状伪足和片状伪足的经典形态。
在来自CD34+细胞的不同供体的重复的实验中观察到神经细胞的诱导。当相同的细胞群用G-CSF、不相干抗体，或者针对CD-34+细胞上的其它受体的激动剂抗体(如整合素)处理时，并没有观察到类似的形态特征。为了确认这些细胞是属于神经谱系的，针对以下项的存在：作为高度特异性的神经元标志物的神经元微管蛋白(Tuj1)、作为神经祖细胞的瞬变标志物的巢蛋白、作为生长锥的组分的F-肌动蛋白、以及作为包括成纤维细胞的其它谱系的细胞标志物的CD-29，通过荧光显微镜法对细胞进行了研究。采用针对F-肌动蛋白、Tuj1微管蛋白和巢蛋白的抗体，观察到细胞的强染色。与此相反，细胞不表达成纤维细胞标志物CD-29。F-肌动蛋白和神经元特异性Tuj1蛋白被组织成在神经祖细胞的生长锥中观察到的典型模式。Tuj1微管蛋白延伸到生长锥的边缘并在肌动蛋白束终止。在生长锥的端部的肌动蛋白丝以从钉状到更钝圆排列的形态排列。
微管蛋白染色的强度允许人们能清楚地观察发育中的轴突的显着长度，轴突是神经元谱系的细胞的显著特征。在培养基中神经母细胞的另一特征是它们的生长锥能动性。为了研究这个特征，以1小时的间隔观察细胞。即使在这么短的时间间隔中，还可以很容易地观察到伴随着轴突延伸的生长锥的延伸能动性(extensivemotility)。
信号转导途径和基因表达的差别激活：由于抗体明显地转分化干细胞，所以人们可能会期望信号转导途径的激活与那些由如G-CSF之类细胞因子通常使用的不同。为了测试这一点，用G-CSF或激动剂抗体处理新鲜分离的人CD34+骨髓干细胞，并且使用可选择的抗-磷酸-抗体来分析主要的G-CSF受体信号传导途径(如STAT5、AKT和ERK)的激活。G-CSF诱导STAT5、AKT和ERK的磷酸化，而抗体诱导AKT的更强的磷酸化，但并不影响STAT5或ERK。因此，我们观察到的细胞的命运可能是一种信号转导途径与损失的其他的信号转导途径相结合的协同增强的结果。有趣的是，已知PI3激酶/AKT途径在神经形成中是很重要的。
使用基于RT-PCR阵列的神经发生分析对基因表达的诱导进行更全面的分析，其中研究了已知对神经形成而言是重要的84个基因的表达。该结果被表示为由抗体或G-CSF引起的诱导与由未经处理的细胞引起的诱导的比率。相对于那些未被诱导的细胞或由G-CSF诱导的细胞，通过抗体上调许多对神经发生是重要的基因的表达。这种上调的表达包括编码蛋白的基因，所述蛋白促进神经突增生和粘附(NRP1、NRP2以及NRCAM)和切口信号传导(NRP2、HEY1、DLL1和ADORA1)，以及其他。虽然一些基因表达的诱导对于G-CSF和抗体是常见的，但许多表达是独特的并仅通过抗体被高度激活。一种受关注的基因是诺里病(NDP)涉及的基因，其表达被上调远远超过除了ADORAJ(229倍)以外的任何其他的基因。该基因编码一种分泌蛋白，所述分泌蛋白是Wnt/β-连环蛋白通路中的配体，并且可以在神经外胚层的早期发育中发挥作用。
该实施例描述了从转分化人干细胞的细胞内组合库中产生抗体激动剂。如下面详细描述的，根据抗体激活在报告细胞中的信号传导途径的能力，从细胞内库选择作为针对粒细胞集落刺激因子受体的激动剂的抗体。我们使用了专门的“邻近”的方法，其中整个抗体库和其靶标受体被共整合入报告细胞群的质膜。这种形式有利于受体和它们的蛋白配体之间不同寻常的相互作用，并确保抗体以自分泌的方式在产生它的细胞上起作用。与天然粒细胞集落刺激因子激活细胞以沿着预定途径分化不同，分离的激动剂抗体转分化人骨髓谱系CD-34+骨髓细胞成神经祖细胞。因为启动是非遗传的(agenetic)，所以这种通过激动剂抗体的转分化不同于较常用的方法。在质膜起作用的抗体可具有如转分化自体细胞的药剂一样的治疗潜力。
这些研究结果表明，结合到相同的受体的抗体激动剂和天然配体可以从相同的起始细胞群诱导不同的细胞命运。
实施例10基于形态学的调节选择抗体试剂
在本发明中描述的表型筛选是一种通用的方法，并可用于选择针对存在于对于选择系统是可用的任何细胞途径中的已知或未知的蛋白的激动剂。该实施例描述了根据胞内抗体改变在软琼脂中生长的干细胞集落的形态的能力来选择抗体激动剂。这些抗体的抗原性靶标和激动剂性质允许能鉴定参与干细胞命运的蛋白质。本质上，这是一种在蛋白质水平上操作的正向遗传学方法，重要区别在于该抗体探针本身有可能成为治疗剂。
在生物学中一种通常的看法是细胞在发育和分化过程中改变形态。如果可以设计运用这种细胞发育的一般特征的选择形式，那么它也可能是选择诱导分化的抗体的一种新的筛选形式。这与我们以前的选择显示为细胞因子拟表型的抗体激动剂在概念上类似，但它有其他的难度，因为靶标空间可能是大的并大多未知。此外，在对未知靶标的搜索中，在回收激动剂的频率将必须比预选用于结合到已知蛋白质的库所观察到的频率更低的情况下，必须使用无偏库(unbiasedlibraries)。另一方面，因为靶标是未知的，所以新发现的可能性是很高的。
在软琼脂中生长的细胞的集落的生长和形态已被广泛地用作已失去定着依赖性的癌细胞的恶性状态的量度，或用于测定生长因子对细胞增殖的影响。我们的理由是，这种方法可以扩展到干细胞的研究，其中作为它们分化形态的功能，干细胞集落的形态会发生变化。因此，可从抗体库感染的干细胞中选择诱导细胞集落中的形态变化的激动剂抗体。这种方法可以告知为已被成功地用于选择细胞因子拟表型的方法的范围是否可以扩展到将途径的蛋白质组分与细胞表型相关联的更一般的生物的问题。
在这里，我们表明用无偏组合抗体库感染的干细胞造成在软琼脂中集落的生长表现出各种形态。当新鲜干细胞用从这些集落回收的抗体处理时，它们在软琼脂中的生长和形态特征被复制。使用质谱法，所回收的抗体的靶标被表明为通道或整合素。在每一种情况下，如通过其下游途径的激活所揭示的，抗体用作受体激动剂。作为整合素激动剂的抗体使细胞分化成巨噬细胞谱系的细胞，巨噬细胞谱系的细胞包括那些具有树突和泡沫细胞的表型的细胞。整个选择过程的功效通过以下事实显示，它伴随着趋同进化，其中所选择的抗体在它们的CDR-H3中具有整合素结合序列，RGD。当RGD序列突变为RGE时，所有激动剂活性丢失。
用无偏组合抗体库选择抗体的方案：为了针对影响细胞的表型的未知靶选择活性抗体，我们设计了一种方法，该方法基于传染性组合抗体库、集落形成测定法和质谱(MS)分析，而无需常规的抗体筛选。首先，为了构建慢病毒抗体库，我们从天然(naive)人组合抗体噬菌体库收获噬菌粒池。然后，我们在慢病毒载体中构建scFv-Fc的抗体基因。库的大小为108。然后，为了产生慢病毒，我们将病毒包装的慢病毒抗体库和质粒瞬时转染到HEK293T细胞。病毒滴定后，我们将慢病毒库感染到TF-1成红细胞并加载到甲基纤维素琼脂用于形态筛选。与对照组相比，有几种类型的集落，如无定形、散布的、线形或圆形。
基于形态发生表型选择抗体：基于形态标准，我们挑选了两周后表明具体的形态的30个集落。然后每个抗体基因通过PCR被扩增，并回收20种抗体基因。分析编码抗体重链CDR3(CDR-H3)区域的基因，以测定每个克隆的不同序列的数目。每一集落表现出1至4种不同的抗体。通过用单个或两个基因的组合瞬时转染HEK293T细胞来产生由慢病毒编码的抗体，以及针对它们影响TF-1细胞的增殖的能力对51种合并的上清液进行了测试。八个抗体具有～50％的GM-CSF活性。有趣的是，三种活性抗体是双特异性的。对于接下来的过程，我们任意选择代表独特形态的三种抗体(9-3、11-3和12-1/12-2)。
靶蛋白的鉴定：我们将编码3种活性抗体(例如9-3，11-3和12-1/12-2)的抗体基因转染至293F细胞用于产生抗体并纯化它们。如果抗体激活细胞功能，则对它们进行测试。它们增加TF-1细胞的增殖和关键信号传导分子(如AKT和ERK)的磷酸化。此外，尤其是9-3激活STAT5的磷酸化。然后，我们通过每个抗体免疫沉淀TF-1细胞裂解液。免疫沉淀的蛋白质样品通过这些抗体或银染色进行免疫印迹。银染色的凝胶带(其与免疫印迹匹配)被切片并被胰蛋白酶化，用于nano-LCMS/MS分析。我们确定了抗体作为主要的蛋白(数据未示出)，并在带的分析中也得到了各种不同的非抗体蛋白。在蛋白列表中，我们按照一些标准(如预期大小，细胞定位)选择了候选靶蛋白。针对这些标准拟合整合素α3、HVCN1和TRPM7作为每个抗体的候选靶蛋白。因为由于整合素在病理生理学中的重要性是众所周知的，我们选择了这个靶标用于进一步表征活性抗体，从而证明我们的方法。使用过度表达人整合素α3的裂解物，我们通过免疫印迹证实了12-1/12-2与人整合素α3相互作用。接下来，我们测试12-1/12-2是否结合到其他主要类型的整合素α，如整合素αV或α5。12-1/12-2也与整合素αV相互作用。这一观察表明12-1/12-2不是整合素α3的特异性结合剂，它可与其它整合素α相关联。
提高人骨髓CD34+细胞的迁移的抗体：TF-1细胞广泛用于与各种细胞因子的功能相关的研究。然而，TF-1细胞是其中主要细胞群体注定要分化成红细胞的成红细胞，因此，它不适合用于在细胞类型和表型的宽范围研究激动剂的潜力。我们将人骨髓CD34+细胞装载到含有12-1/12-2的甲基纤维素琼脂中。一周后，与对照相比，12-1/12-2增强细胞的散布和足(podia)的形成。为了具体表征细胞，我们通过扫描电子显微镜(SEM)分析了每个单细胞。根据SEM，12-1/12-2-处理的细胞显示增加的足的形成。接着，我们测试这些效果是否影响被称为是整合信号传导的关键细胞功能之一的细胞运动。当12-1/12-2被处理到人骨髓CD34+细胞时，提高了骨髓CD34+细胞从上腔到下腔的迁移，有力地增加AKT和ERK的磷酸化(被称为整合素信号传导的关键下游分子)。这些观察表明，通过增强被认为是通过整合素信号传导主要调节的足的形成，12-1/12-2可能影响人骨髓CD34+细胞的运动性。
诱导人骨髓CD34+细胞分化为树突状细胞的抗体：由于骨髓CD34+细胞含有产生血液中所有细胞类型的多能干细胞，它可通过细胞外刺激物(如免疫细胞因子)来分化各种谱系。因此，我们检查12-1/12-2是否有能力诱导干细胞的特异谱系。结果表明，12-1/12-2增加表现独特的形态的细胞(如树突状细胞)的种群。我们通过免疫细胞化学研究观察到细胞表达CD11c，树突状细胞的特异性标志物。这些观察表明，12-1/12-2可从骨髓CD34+细胞特异性诱导树突状细胞。
趋同进化：有趣的是，12-1/12-2的12-2在CDR-H3中包含天然配体的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)整合素识别基序。为了检查12-1/12-2的细胞功能中CDR-H3的RGD基序的贡献，该序列通过定点诱变突变为RGE。在RGD基序内的D(ASP)到E(Glu)的置换被认为减少或取消通过整合素α亚基对配体的识别。通过RGE突变显著抑制由12-1/12-2对主要的整合素信号传导分子(如AKT和ERK)的磷酸化作用。此外，通过流式细胞术分析，RGE突变体抗体显示出减少的树突状细胞的分化。这种发现意味着，12-2的RGD对于抗体-整合素结合是关键的。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实例在某些细节上描述了前述发明，但显而易见，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，本技术领域的普通技术人员根据本发明的教导可以做出某些变化和修改。
在本说明书中引用的所有的公开内容、数据库、GenBank序列、专利和专利申请都通过引用并入本文，如同每个被具体地和单独地指出以通过引用并入本文。
一些示例的激动剂抗体的序列表
EpoR抗体E-1氨基酸序列
重链(SEQIDNO：7)
MAQVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARLSSGWTFDYWGQGTLVTVSS
轻链(SEQIDNO：8)
EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSPNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPERFSGSGSGTDFTLTISSLHAEDVALYYCQQSYSLPFTFGPGTKVEIKR
EpoR抗体V-1氨基酸序列
重链(SEQIDNO：21)
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轻链(SEQIDNO：22)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPLTFGGGTKVEIK
EpoR抗体V-3氨基酸序列
重链(SEQIDNO：23)
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轻链(SEQIDNO：24)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVTKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCISFTASSTWAFGGGTKLTVLG(SEQIDNO：24)
EpoR抗体E-1核苷酸序列
重链(SEQIDNO：25)
ATGGCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTAGCAGTGGCTGGACCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
轻链(SEQIDNO：26)
GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCCCCAACAATAAGAACTATTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTACTCATTTACTGGGCGTCTACCCGGGAGTCCGGGGTCCCCGAGCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCACGCTGAAGATGTGGCACTTTATTACTGTCAGCAGTCTTATAGTCTTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGT
EpoR抗体V-1核苷酸序列
重链(SEQIDNO：27)
ATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATTACTATGGTTCGGGGGGGCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
轻链(SEQIDNO：28)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAAGATTACAATTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
EpoR抗体V-3核苷酸序列
重链(SEQIDNO：29)
ATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGTAGCAGCAGCTTTATCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
轻链(SEQIDNO：30)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGCTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGGTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCATCTCTTTTACAGCCTCCTCCACTTGGGCGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
3D9TpoR激动剂抗体氨基酸序列
scFv序列(SEQIDNO：32)
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重链可变区序列(SEQIDNO：33)
MAQVQLVQSGAEVRKVGSSVKVSCKASRDTFNTYGISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTADYAQKFRGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDRKLGGSDYWGQGTLVTVSS
轻链可变区序列(SEQIDNO：34)
DIVMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQGLGRWLAWYQQEPGKAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPWTFGQGTKLEIKR
3B3抗-G-CSFR激动剂抗体氨基酸序列
scFv序列(SEQIDNO：40)
MAQVQLLESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWNGVNNAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGWGTELTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPFTFGQGTKVTVLG
重链可变区序列(SEQIDNO：41)
MAQVQLLESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWNGVNNAFDIWGQGTLVTV
轻链可变区序列(SEQIDNO：42)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGWGTELTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPFTFGQGTKVTVLG
9-3激动剂抗体氨基酸序列
scFv序列(SEQIDNO：48)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFTTYGMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYTDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLSAGDTAVYYCARGGDNSRGYYYIAGGDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVAPGVPFRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKVEIKR
重链可变区序列(SEQIDNO：49)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFTTYGMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYTDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLSAGDTAVYYCARGGDNSRGYYYIAGGDYWGQGTLVTVS
轻链可变区序列(SEQIDNO：50)
EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVAPGVPFRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKVEIKR
11-3激动剂抗体氨基酸序列
scFv序列(SEQIDNO：57)
QVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRVTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGPSYGDYFRWFDPWGQGTLVTVSSSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGETATLSCRASHAVSSNSLAWYQQRPGQTPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPITFGQGPSWRSN
重链可变区序列(SEQIDNO：58)
QVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRVTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGPSYGDYFRWFDPWGQGTLVTVSSS
轻链可变区序列(SEQIDNO：59)
EIVLTQSPGTLSLSPGETATLSCRASHAVSSNSLAWYQQRPGQTPRLLIYGASSRATGiPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPITFGQGPSWRSN
12-1激动剂抗体氨基酸序列
scFv序列(SEQIDNO：66)
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVAAAGINDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSETTLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVAPGVPFRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKVDIKR
重链可变区序列(SEQIDNO：67)
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVAAAGINDAFDIWGQGTMVTVSS
轻链可变区序列(SEQIDNO：68)
ETTLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVAPGVPFRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKVDIKR
12-2激动剂抗体氨基酸序列
scFv序列(SEQIDNO：75)
QVQLQQSGTEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYDINWVRQTPEQGLEWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGRATLSVDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYFCARGDYYRRYFDLWGQGTLVTVSSRGGGGSETTLTQSPAFKSATPGDKVTISCKASQDIDDDMNWQHKPGAAAIFTTQEPTPLVPGIPPRFSGSGSGTNFTLTIINIESEDAPYYFCLQHGDFLTWTFGQGTKVDIK
重链可变区序列(SEQIDNO：76)
QVQLQQSGTEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYDINWVRQTPEQGLEWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGRATLSVDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYFCARGDYYRRYFDLWGQGTLVTVSSR
轻链可变区序列(SEQIDNO：77)
ETTLTQSPAFKSATPGDKVTISCKASQDIDDDMNWQHKPGAAAIFTTQEPTPLVPGIPPRFSGSGSGTNFTLTIINIESEDAPYYFCLQHGDFLTWTFGQGTKVDIK

Claims (57)

1.一种用于鉴定真核细胞类型的表型的调节剂抗体的方法，包括(a)在所述真核细胞类型的细胞群中表达候选抗体或其抗原结合片段的库，以产生经修饰的表达抗体的细胞的异质群体，以及(b)选择具有与未经修饰的所述真核细胞类型的对照细胞相比经修改的表型的特定表达抗体的细胞；从而将在特定表达抗体的细胞内表达的候选抗体鉴定为所述真核细胞类型的调节剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述候选抗体库在每种细胞表达不超过3种不同的抗体种类的条件下在所述细胞内被表达。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述候选抗体库是分泌的抗体或细胞内抗体的组合库。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述组合抗体库通过慢病毒载体或逆转录病毒载体在所述细胞内被表达。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞类型是哺乳动物细胞类型。
6.如权利要求1所述的方法，其中在选择期间在扩散限制介质中培养所述表达抗体的细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测定所述经鉴定的候选抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述表型是所述细胞的细胞反应或信号传导活动。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞类型是干细胞类型，以及所述表型是细胞分化。
10.如权利要求1所述的方法，其中通过靶分子介导所述表型。
11.如权利要求10所述的方法，其中由肿瘤抑制基因或致癌基因编码所述靶分子。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述靶分子是分泌的激素或细胞因子。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述分泌的激素或细胞因子是促红细胞生成素、促血小板生成素或IL-1。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述靶分子是所述细胞类型的信号传导受体。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述受体是分泌激素或细胞因子的受体。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述经鉴定的抗体是异二聚体双特异性抗体。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述双特异性抗体结合靶分子上的两种不同表位。
18.如权利要求10所述的方法，其中所述调节剂抗体激活所述靶分子。
19.如权利要求10所述的方法，其中所述调节剂抗体拮抗所述靶分子或拮抗所述靶分子的抑制剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述选择是在所述抑制剂的存在下实施的。
21.如权利要求10所述的方法，其进一步包括在所述结合剂抗体被表达在所述用于表型选择的细胞群内之前，筛选候选抗体的库，以鉴定所述靶分子的结合剂。
22.如权利要求21所述的方法，其中通过噬菌体展示鉴定所述靶分子的所述结合剂抗体。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述表型是靶分子或标志基因在所述细胞类型中的表达。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述靶分子是细胞表面受体。
25.一种用于鉴定真核细胞类型的抗体分子的方法，包括(a)在每种细胞表达不超过3种不同的抗体种类的条件下，在第二细胞类型的细胞同质群中表达候选抗体或其抗原结合片段的库，以产生表达抗体细胞的异质群体，(b)共同培养所述真核细胞类型的细胞群和表达抗体细胞的群体，以及(c)选择特定的表达抗体细胞，所述特定表达抗体细胞改变所述真核细胞类型的表型；从而将在该特定的表达抗体细胞中表达的所述候选抗体鉴定为所述真核细胞类型的调节剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述表达抗体细胞群的每一种细胞表达仅一种不同的候选抗体库的成员。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述真核细胞是病变的哺乳动物细胞。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述真核细胞类型是肿瘤细胞类型。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述改变的表型是所述真核细胞类型停止生长或延缓生长。
30.如权利要求25所述的方法，其中通过靶分子介导所述表型。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述经鉴定的候选抗体是所述靶分子的拮抗剂。
32.一种用于鉴定能重编程或转分化靶细胞的多肽剂的方法，包括(1)在携带由所述靶细胞表达的信号传导受体的报告细胞中表达候选多肽剂的库，以产生经修饰的表达剂的报告细胞的异质群，(2)鉴定具有激活的信号传导的所述受体的表达剂的报告细胞亚群，(3)从所鉴定的所述细胞亚群分离激动剂组，以及(4)使所述激动剂组接触所述靶细胞群，并选择具有指示转分化的特定表型的细胞；从而鉴定能重编程或转分化所述靶细胞的多肽剂。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述靶细胞是体细胞或谱系限制性干细胞。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述候选多肽剂是抗体或其抗原结合片段。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述候选剂和所述受体被共同整合入所述报告细胞的胞质膜。
36.如权利要求32所述的方法，其中在所述靶细胞中所述受体的激活促进所述特定的表型。
37.如权利要求32所述的方法，其中所述受体是G-CSFR以及所述特定的表型是神经形成。
38.一种抗体或其抗原结合片段，其以与包含以下的抗体相同的结合特异性结合至人促红细胞生成素受体：(1)分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(2)分别如SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：14中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或者(3)分别如SEQIDNO：15、SEQIDNO：16和SEQIDNO：17中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：18、SEQIDNO：19和SEQIDNO：20中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
39.如权利要求38中所述的抗体或其抗原结合片段，其包括分别与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及分别与SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
40.如权利要求38中所述的抗体或其抗原结合片段，其包括分别与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及分别与SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
41.如权利要求38中所述的抗体或其抗原结合片段，其包括分别如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列。
42.如权利要求38中所述的抗体或其抗原结合片段，其为scFv抗体片段。
43.如权利要求38中所述的抗体或其抗原结合片段，其包括融合至人IgG1的Fc部分的scFv抗体片段。
44.编码如权利要求38中所述的抗体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。
45.一种抗体或其抗原结合片段，其具有与包含以下的抗体相同的结合特异性：(1)分别如SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：38、SEQIDNO：13和SEQIDNO：39中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(2)分别如SEQIDNO：43、SEQIDNO：44和SEQIDNO：45中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：46、SEQIDNO：13和SEQIDNO：47中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(3)分别如SEQIDNO：51、SEQIDNO：52和SEQIDNO：53中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：54、SEQIDNO：55和SEQIDNO：56中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或者(4)分别如SEQIDNO：60、SEQIDNO：61和SEQIDNO：62中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQIDNO：63、SEQIDNO：64和SEQIDNO：65中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
46.如权利要求45所述的抗体或其抗原结合片段，其包括(1)分别与SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：38、SEQIDNO：13和SEQIDNO：39基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(2)分别与SEQIDNO：43、SEQIDNO：44和SEQIDNO：45基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：46、SEQIDNO：13和SEQIDNO：47基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(3)分别与SEQIDNO：51、SEQIDNO：52和SEQIDNO：53基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：54、SEQIDNO：55和SEQIDNO：56基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或(4)分别与SEQIDNO：60、SEQIDNO：61和SEQIDNO：62基本上一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：63、SEQIDNO：64和SEQIDNO：65基本上一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
47.如权利要求45所述的抗体或其抗原结合片段，其包括(1)分别与SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：38、SEQIDNO：13和SEQIDNO：39一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(2)分别与SEQIDNO：43、SEQIDNO：44和SEQIDNO：45一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：46、SEQIDNO：13和SEQIDNO：47一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(3)分别与SEQIDNO：51、SEQIDNO：52和SEQIDNO：53一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：54、SEQIDNO：55和SEQIDNO：56一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或(4)分别与SEQIDNO：60、SEQIDNO：61和SEQIDNO：62一致的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别与SEQIDNO：63、SEQIDNO：64和SEQIDNO：65一致的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
48.如权利要求45所述的抗体或其抗原结合片段，其包括分别如以下所示的重链可变区序列和轻链可变区序列：(1)SEQIDNO：33和SEQIDNO：34；(2)SEQIDNO：41和SEQIDNO：42；(3)SEQIDNO：49和SEQIDNO：50；或(4)SEQIDNO：58和SEQIDNO：59。
49.如权利要求45所述的抗体或其抗原结合片段，其为scFv抗体片段。
50.编码如权利要求45所述的抗体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。
51.异二聚体双特异性抗体或其抗原结合片段，其包括：(1)包含分别与SEQIDNO：9-14基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的第一单体，以及包含分别与SEQIDNO：15-20基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的第二单体；或(2)包含分别与SEQIDNO：69-74基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的第一单体，以及包含分别与SEQIDNO：78-83基本上一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的第二单体。
52.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其结合至人促红细胞生成素受体，包括第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别与SEQIDNO：9-14一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，以及所述第二单体包含分别与SEQIDNO：15-20一致的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
53.如权利要求51所述的抗体，其结合至人促红细胞生成素受体，其包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别如SEQIDNO：21和SEQIDNO：22中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列，以及所述第二单体包含分别如SEQIDNO：23和SEQIDNO：24中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列。
54.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其结合至人整合素α3，其包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别如SEQIDNO：69-74中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，以及所述第二单体包含分别如SEQIDNO：78-83中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
55.如权利要求51所述的抗体，其结合至人整合素α3，其包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含分别如SEQIDNO：67和SEQIDNO：68中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列，以及所述第二单体包含分别如SEQIDNO：77和SEQIDNO：78中所示的重链可变区序列和轻链可变区序列。
56.如权利要求51所述的抗体，其中每条单体是scFv抗体片段，且每条单体的可变区序列融合至人IgG1的Fc部分。
57.编码如权利要求51所述的抗体的所述第一单体或第二单体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。
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