RU2020122887A - Дрожжевой дисплей белков в периплазматическом пространстве - Google Patents

Дрожжевой дисплей белков в периплазматическом пространстве Download PDF

Info

Publication number
RU2020122887A
RU2020122887A RU2020122887A RU2020122887A RU2020122887A RU 2020122887 A RU2020122887 A RU 2020122887A RU 2020122887 A RU2020122887 A RU 2020122887A RU 2020122887 A RU2020122887 A RU 2020122887A RU 2020122887 A RU2020122887 A RU 2020122887A
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
yeast
periplasmic
protein
antibody
host cell
Prior art date
Application number
RU2020122887A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2802770C2 (ru
Inventor
Ричард Ю
Карлос Густаво ПЕШЕ
Родриго БАЛЬТАНАС
Бретт РОБИСОН
Original Assignee
Эбелоун Байо, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эбелоун Байо, Инк. filed Critical Эбелоун Байо, Инк.
Publication of RU2020122887A publication Critical patent/RU2020122887A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2802770C2 publication Critical patent/RU2802770C2/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C07K2319/912—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation containing a GPI (phosphatidyl-inositol glycane) anchor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Claims (147)

1. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея, содержащая множество дрожжевых клеток-хозяев, где каждая дрожжевая клетка-хозяин содержит
a) антитело для дисплея в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина, где экспонированное антитело является отличающимся в каждой дрожжевой клетке-хозяине, так что множество дрожжевых клеток-хозяев экспонирует множество антител;
b) периплазматический якорный белок, где периплазматический якорный белок связан с антителом так, что антитело экспонируется в периплазматическом пространстве; и c) представляющий интерес мембранный белок-мишень, где представляющий интерес мембранный белок локализуется на плазматической мембране дрожжевой клетки-хозяина и доступен для антитела, экспонированного в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина.
2. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.1, где антитело и периплазматический якорный белок нековалентно связаны вместе посредством молекулярных связывающих взаимодействий в комплексе или связаны посредством ковалентной непептидной связи в комплексе.
3. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.1, где антитело и периплазматический якорный белок ковалентно связаны вместе в слитом белке.
4. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-3, где периплазматический якорный белок дополнительно содержит сигнальную последовательность, которая обеспечивает транспорт периплазматического якорного белка в периплазму дрожжевой клетки-хозяина, на плазматическую мембрану или на клеточную стенку, так чтобы антитело экспонировалось в периплазме.
5. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-3, где периплазматический якорный белок содержит проходящий через мембрану трансмембранный домен или связанный с мембраной белковый домен, который выставляет антитело в периплазму.
6. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.5, где связанный с мембраной белковый домен представляет собой заякоривающий на плазматической мембране гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-домен.
7. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.6, где заякоривающий на плазматической мембране GPI-домен представляет собой заякоривающий на плазматической мембране GPI-домен япсина.
8. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.7, где заякоривающий на плазматической мембране GPI-домен япсина представляет собой заякоривающий на плазматической мембране GPI-домен япсина YPS1, YPS2, YPS3, YPS4, YPS5, YPS6 или YPS7.
9. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.2, где периплазматический якорный белок представляет собой белок, который связывается с внутренней поверхностью клеточной стенки, так что антитело выступает в периплазму.
10. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.3, где периплазматический якорный белок представляет собой белок, связывающийся с внутренней поверхностью клеточной стенки, который выставляет слитый белок в периплазму.
11. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.2, где периплазматический якорный белок является достаточно большим, чтобы периплазматический якорный белок и связанное антитело удерживались в периплазме.
12. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.3, где периплазматический якорный белок является достаточно большим, чтобы слитый белок удерживался в периплазме.
13. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея, содержащая множество дрожжевых клеток-хозяев, где каждая дрожжевая клетка-хозяин содержит
a) антитело для дисплея в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина, где экспонированное антитело является отличающимся в каждой дрожжевой клетке-хозяине, так что множество дрожжевых клеток-хозяев экспонирует множество антител, где антитело связано с сигнальной последовательностью, которая обеспечивает транспорт антитела в периплазму дрожжевой клетки-хозяина, на плазматическую мембрану или на клеточную стенку, так что антитело экспонируется в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина; и
b) представляющий интерес мембранный белок-мишень, где представляющий интерес мембранный белок локализуется на плазматической мембране дрожжевой клетки-хозяина и доступен для антитела, экспонированного в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина.
14. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-13, дополнительно содержащая репортерную систему, содержащую репортерный ген, функционально связанный с индуцибельным промотором, который активируется, когда активируется представляющий интерес мембранный белок-мишень, позволяя детекцию увеличения или снижения активности представляющего интерес мембранного белка-мишени при связывании антитела с представляющим интерес мембранным белком-мишенью.
15. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.14, где репортерный ген представляет собой алиментарный маркер, маркер резистентности к антибиотику, флуоресцентный маркер, биолюминесцентный маркер или маркер контрселекции.
16. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.15, где алиментарный маркер выбран из группы, состоящей из HIS3, HIS7, ARG6, LEU2, URA3 и TRP1.
17. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.15, где маркер резистентности к антибиотику сообщает резистентность к антибиотику, выбранному из группы, состоящей из генетицина, зеоцина, гигромицина B, ноурсеотрицина и биалафоса.
18. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.15, где флуоресцентный маркер выбран из группы, состоящей из зеленого флуоресцентного белка, красного флуоресцентного белка, синего флуоресцентного белка, голубого флуоресцентного белка, желтого флуоресцентного белка и оранжевого флуоресцентного белка.
19. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.15, где биолюминесцентным маркером является люцифераза или экворин.
20. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.15, где маркер контрселекции выбран из группы, состоящей из CAN1, URA3, MET15, TRP1 и TK.
21. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.14, где репортерный ген представляет собой селективный маркер, так что увеличение активности представляющего интерес мембранного белка-мишени при связывании антитела с представляющим интерес мембранным белком-мишенью поддается детекции посредством роста дрожжевых клеток-хозяев на среде для позитивной селекции.
22. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.14, где репортерный ген представляет собой маркер контрселекции, так что указанное снижение активности представляющего интерес мембранного белка-мишени при связывании антитела с представляющим интерес мембранным белком-мишенью поддается детекции по росту дрожжевых клеток-хозяев на среде для негативной селекции.
23. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-22, где представляющий интерес мембранный белок-мишень выбран из группы, состоящей из рецептора, ионного канала и переносчика.
24. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.23, где рецептор представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR).
25. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.24, где GPCR представляет собой экзогенный GPCR.
26. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.25, где дрожжевые клетки-хозяева дополнительно содержат эндогенный GPCR.
27. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.25 или 26, дополнительно содержащая сконструированную субъединицу Gα, способную активироваться посредством экзогенного GPCR, где активированная сконструированная субъединица Gα способна активировать поддающийся детекции ответ феромонов в дрожжевой клетке-хозяине.
28. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.27, где сконструированная субъединица Gα представляет собой химерную субъединицу G-белка альфа (Gα), содержащую N-концевой домен субъединицы Gα дрожжей и C-концевой домен экзогенной субъединицы Gα.
29. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.28, где субъединица Gα дрожжей принадлежит семейству G-белков Gα i, Gα q, Gα s или Gα o.
30. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.25-29, где экзогенный GPCR представляет собой GPCR млекопитающего.
31. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.30, где по меньшей мере пять C-концевых остатков субъединицы Gα дрожжей заменены соответствующими C-концевыми остатками субъединицы Gα млекопитающего, так что химерная субъединица Gα способна активироваться посредством GPCR млекопитающего.
32. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.31, где по меньшей мере 20 C-концевых остатков субъединицы Gα дрожжей заменены соответствующими C-концевыми остатками субъединицы Gα млекопитающего, так что химерная субъединица Gα способна активироваться посредством GPCR млекопитающего.
33. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.31 или 32, где субъединица Gα млекопитающего выбрана из группы, состоящей из G альфа-S, G альфа-I, G альфа-O, G альфа-T, G альфа-Z, G альфа-Q, G альфа-11, G альфа-12, G альфа-13 и трансдуцина.
34. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.28-33, где химерная субъединица Gα содержит по меньшей мере 41 N-концевой остаток субъединицы Gα дрожжей.
35. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.30-34, где GPCR млекопитающего представляет собой GPCR человека.
36. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.35, где GPCR человека выбран из группы, состоящей из CXCR4, CXCR5, SSTR2, MOR, AVPR2, FPR2/ALX, ADORA2A, CHRM3, CGRP2, CCR2, CCR4, CCR5, CHRM4, PAC1, b2AR, CXCR2, CYSLTR2, KSHV vGPCR, PKR1, PKR2, CB1, CB2, A3AR и AT1R.
37. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.24-36, где представляющий интерес мембранный белок GPCR, являющийся мишенью, обладает конститутивной лиганд-независимой активностью.
38. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.24-37, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм FAR1 для селекции антител-антагонистов представляющего интерес мембранного белка GPCR, являющегося мишенью.
39. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.24-36, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм Δfar1, содержащий феромон-индуцируемый промотор PRM1, функционально связанный с репортерным геном для селекции антител-агонистов представляющего интерес мембранного белка GPCR, являющегося мишенью.
40. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-39, где антитела выбраны из группы, состоящей из моноклональных антител, химерных антител, гуманизированных антител, наноантител, рекомбинантных фрагментов антител, Fab-фрагментов, Fab'-фрагментов, F(ab')2-фрагментов, Fv-фрагментов и scFv-фрагментов.
41. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-40, где представляющий интерес мембранный белок-мишень содержит мутацию, которая повышает или снижает его активность.
42. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-40, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм Δfar1, Δsst2, Δste14, Δste3 или Δmat.
43. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.42, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм Δmat, содержащий удаленный или инактивированный локус MATα или удаленный или инактивированный локус MATa.
44. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-43, где дрожжевая клетка-хозяин дополнительно содержит модифицированный белок CLN3, содержащий C-концевое укорочение, которое повышает содержание CLN3 в дрожжевой клетке-хозяине по сравнению с белком CLN3 дикого типа.
45. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.44, где в модифицированном белке CLN3 сохранены по меньшей мере N-концевые аминокислоты 1-387 белка CLN3 дикого типа.
46. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по п.44, где в модифицированном белке CLN3 сохранены по меньшей мере N-концевые аминокислоты 1-408 белка CLN3 дикого типа.
47. Библиотека дрожжевого периплазматического дисплея по любому из пп.1-46, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой гаплоидную или диплоидную дрожжевую клетку-хозяина.
48. Способ получения библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.1, причем способ включает
a) предоставление первого множества рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих антитела для дисплея в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина, где экспонированное антитело является отличающимся в каждой дрожжевой клетке-хозяине, так что множество дрожжевых клеток-хозяев экспонирует множество антител;
b) предоставление второго рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего периплазматический якорный белок, где периплазматический якорный белок связан с антителом так, что антитело экспонируется в периплазматическом пространстве;
c) трансфекцию множества дрожжевых клеток-хозяев первым множеством рекомбинантных полинуклеотидов и вторым рекомбинантным полинуклеотидом;
d) трансфекцию множества дрожжевых клеток-хозяев рекомбинантным полинуклеотидом, кодирующим представляющий интерес мембранный белок-мишень; и
e) культивирование множества дрожжевых клеток-хозяев в условиях, которые позволяют экспрессию антител, периплазматического якорного белка и представляющего интерес мембранного белка-мишени, где каждая дрожжевая клетка-хозяин экспонирует отличающееся антитело в периплазматическое пространство и представляющий интерес мембранный белок-мишень локализуется на плазматической мембране, с получением библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.1.
49. Способ по п.48, где рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие антитела, или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий периплазматический якорный белок или представляющий интерес мембранный белок-мишень предоставлены посредством экспрессирующих векторов.
50. Способ по п.48, где рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие антитела, или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий периплазматический якорный белок или представляющий интерес мембранный белок-мишень, встраиваются в геном дрожжевой клетки-хозяина в локусе-мишени.
51. Способ получения библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.3, причем способ включает
a) предоставление множества рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих слитые белки, где каждый рекомбинантный полинуклеотид кодирует отличающийся слитый белок, содержащий периплазматический якорный белок, связанный с отличающимся антителом, для дисплея;
b) трансфекцию множества дрожжевых клеток-хозяев множеством рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих слитые белки;
c) трансфекцию множества дрожжевых клеток-хозяев рекомбинантным полинуклеотидом, кодирующим представляющий интерес мембранный белок-мишень; и
d) культивирование множества дрожжевых клеток-хозяев в условиях, которые позволяют экспрессию слитых белков и представляющего интерес мембранного белка-мишени, где каждая дрожжевая клетка-хозяин экспонирует отличающееся антитело в периплазматическое пространство и представляющий интерес мембранный белок-мишень локализуется на плазматической мембране, с получением библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.3.
52. Способ по п.51, где рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие слитые белки, или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес мембранный белок-мишень, предоставлены посредством экспрессирующих векторов.
53. Способ по п.51, где рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие слитые белки или представляющий интерес мембранный белок-мишень, встраиваются в геном дрожжевой клетки-хозяина в заданном локусе.
54. Способ по любому из пп.48-53, где представляющий интерес мембранный белок-мишень выбран из группы, состоящей из рецептора, ионного канала и переносчика.
55. Способ по п.54, где рецептор представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR).
56. Способ по любому из пп.48-55, дополнительно включающий введение в множество дрожжевых клеток-хозяев рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего сконструированную субъединицу Gα, способную активироваться посредством GPCR, где активированная сконструированная субъединица Gα способна активировать поддающийся детекции ответ феромонов в дрожжевой клетке-хозяине.
57. Способ по п.56, где сконструированная субъединица Gα представляет собой химерную субъединицу G-белка альфа (Gα), содержащую N-концевой домен субъединицы Gα дрожжей и C-концевой домен экзогенной субъединицы Gα.
58. Способ по п.57, где субъединица Gα дрожжей принадлежит семейству G-белков Gα i, Gα q, Gα s или Gα o.
59. Способ по п.57 или 58, где экзогенная субъединица Gα представляет собой субъединицу Gα млекопитающего.
60. Способ по п.59, где по меньшей мере пять C-концевых остатков субъединицы Gα дрожжей заменены соответствующими C-концевыми остатками субъединицы Gα млекопитающего, так что химерная субъединица Gα способна активироваться посредством GPCR млекопитающего.
61. Способ по п.60, где по меньшей мере 20 C-концевых остатков субъединицы Gα дрожжей заменены соответствующими C-концевыми остатками субъединицы Gα млекопитающего, так что химерная субъединица Gα способна активироваться посредством GPCR млекопитающего.
62. Способ по любому из пп.55-61, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм FAR1 для селекции антител-антагонистов представляющего интерес GPCR-мишени.
63. Способ по любому из пп.55-61, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм Δfar1, содержащий феромон-индуцируемый промотор PRM1, функционально связанный с репортерным геном, для селекции антител-агонистов GPCR.
64. Способ скрининга библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.14 в отношении антитела, которое модулирует активность представляющего интерес мембранного белка-мишени, причем способ включает культивирование по меньшей мере подгруппы дрожжевых клеток-хозяев библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.14 в селективной среде; и детекцию экспрессии репортерного гена, где увеличенная экспрессия репортерного гена указывает на то, что антитело повышает активность представляющего интерес мембранного белка-мишени, и сниженная экспрессия репортерного гена указывает на то, что антитело снижает активность представляющего интерес мембранного белка-мишени.
65. Способ по п.64, где репортерный ген представляет собой алиментарный маркер, маркер резистентности к антибиотику, флуоресцентный маркер, биолюминесцентный маркер или маркер контрселекции.
66. Способ по п.65, дополнительно включающий проведение позитивной селекции в отношении экспрессии алиментарного маркера, где рост дрожжевых клеток-хозяев в селективной среде с дефицитом питательных веществ, указывает на то, что представляющий интерес мембранный белок-мишень активирован.
67. Способ по п.66, где алиментарный маркер представляет собой HIS3, HIS7, ARG6, LEU2, URA3 и TRP1.
68. Способ по п.65, дополнительно включающий проведение позитивной селекции в отношении экспрессии маркера резистентности к антибиотику, где рост дрожжевых клеток-хозяев в селективной среде, содержащей антибиотик, указывает на то, что представляющий интерес мембранный белок-мишень активирован.
69. Способ по п.68, где маркер резистентности к антибиотику сообщает резистентность к антибиотику, выбранному из группы, состоящей из генетицина, зеоцина, гигромицина B, ноурсеотрицина и биалафоса.
70. Способ по п.65, дополнительно включающий проведение позитивной селекции в отношении экспрессии флуоресцентного маркера, где детекция флуоресценции, испускаемой дрожжевыми клетками-хозяевами, указывает на то, что представляющий интерес мембранный белок-мишень активирован.
71. Способ по п.70, где флуоресцентный маркер выбран из группы, состоящей из зеленого флуоресцентного белка, красного флуоресцентного белка, синего флуоресцентного белка, голубого флуоресцентного белка, желтого флуоресцентного белка и оранжевого флуоресцентного белка.
72. Способ по п.65, дополнительно включающий проведение позитивной селекции в отношении экспрессии биолюминесцентного маркера, где детекция биолюминесценции, испускаемой дрожжевыми клетками-хозяевами, указывает на то, что представляющий интерес мембранный белок-мишень активирован.
73. Способ по п.72, где биолюминесцентным маркером является люцифераза или экворин.
74. Способ по п.65, дополнительно включающий проведение негативной селекции в отношении экспрессии маркера контрселекции, где снижение активности представляющего интерес мембранного белка-мишени при связывании экспонированного антитела с представляющим интерес мембранным белком-мишенью, поддается обнаружению по росту дрожжевых клеток-хозяев в среде, содержащей средство, которое осуществляет селекцию против клеток, экспрессирующих маркер контрселекции.
75. Способ по п.74, где маркер контрселекции выбран из группы, состоящей из CAN1, URA3, MET15, TRP1 и TK.
76. Способ скрининга библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.27 в отношении антитела, которое модулирует активность представляющего интерес GPCR-мишени, причем способ включает культивирование по меньшей мере подгруппы дрожжевых клеток-хозяев библиотеки дрожжевого периплазматического дисплея по п.27 в среде, где детекция активации или ингибирования ответа феромонов по меньшей мере в одной дрожжевой клетке-хозяине по сравнению с контрольной дрожжевой клеткой-хозяином, не имеющей антитела, экспонированного в периплазматическом пространстве, указывает на то, что экспонированное антитело с указанной по меньшей мере одной дрожжевой клетке-хозяине связывает и модулирует активность GPCR.
77. Способ по п.76, где представляющий интерес GPCR-мишень представляет собой GPCR человека.
78. Способ по п.77, дополнительно включающий приведение в контакт GPCR человека с лигандом.
79. Способ по п.78, где GPCR обладает конститутивной лиганд-независимой активностью.
80. Способ по любому из пп.76-79, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм FAR1, где ингибирование ответа феромонов посредством антитела, действующего в качестве антагониста, который связывает и ингибирует GPCR в дрожжевой клетке-хозяине, приводит к прекращению остановки клеточного цикла и росту дрожжевой клетки-хозяина.
81. Способ по любому из пп.76-79, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм Δfar1, содержащий феромон-индуцируемый промотор PRM1, функционально связанный с репортерным геном, где активация ответа феромонов посредством антитела, действующего в качестве агониста, который связывает и активирует GPCR в дрожжевой клетке-хозяине, приводит к повышению экспрессии репортерного гена.
82. Способ по п.73, где репортерный ген представляет собой алиментарный маркер, маркер резистентности к антибиотику, флуоресцентный маркер, биолюминесцентный маркер или маркер контрселекции.
83. Способ по любому из пп.1-82, где род дрожжевой клетки-хозяина выбран из группы, состоящей из Saccharomyces, Candida, Pichia, Kluyveromyces и Yarrowia.
84. Способ по п.83, где род дрожжевой клетки-хозяина представляет собой Saccharomyces.
85. Способ по п.84, где вид Saccharomyces представляет собой Saccharomyces cerevisiae.
86. Дрожжевая клетка-хозяин, содержащая
a) антитело для дисплея в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина,
b) периплазматический якорный белок, где периплазматический якорный белок связан с антителом так, что антитело экспонируется в периплазматическом пространстве; и c) представляющий интерес мембранный белок-мишень, где представляющий интерес мембранный белок локализуется на плазматической мембране дрожжевой клетки-хозяина и доступен для антитела, экспонированного в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина.
87. Дрожжевая клетка-хозяин по п.86, где антитело и периплазматический якорный белок нековалентно связаны вместе посредством молекулярных связывающих взаимодействий в комплексе или связаны посредством ковалентной непептидной связи в комплексе.
88. Дрожжевая клетка-хозяин по п.86, где антитело и периплазматический якорный белок ковалентно связаны вместе в слитом белке.
89. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-88, где периплазматический якорный белок дополнительно содержит сигнальную последовательность, которая обеспечивает транспорт периплазматического якорного белка в периплазму дрожжевой клетки-хозяина, на плазматическую мембрану или на клеточную стенку, так чтобы антитело экспонировалось в периплазме.
90. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-88, где периплазматический якорный белок содержит проходящий через мембрану трансмембранный домен или связанный с мембраной белковый домен, который выставляет антитело в периплазму.
91. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-88, где периплазматический якорный белок представляет собой белок, который связывается с внутренней поверхностью клеточной стенки, так что антитело выступает в периплазму.
92. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-88, где периплазматический якорный белок является достаточно большим, чтобы периплазматический якорный белок и связанное антитело удерживались в периплазме.
93. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-92, где представляющий интерес мембранный белок-мишень выбран из группы, состоящей из рецептора, ионного канала и переносчика.
94. Дрожжевая клетка-хозяин по п.93, где рецептор представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR).
95. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-94, дополнительно включающая введение в дрожжевую клетку-хозяина рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего сконструированную субъединицу Gα, способную активироваться посредством GPCR, где активированная сконструированная субъединица Gα способна активировать поддающийся детекции ответ феромонов в дрожжевой клетке-хозяине.
96. Дрожжевая клетка-хозяин по п.95, где сконструированная субъединица Gα представляет собой химерную субъединицу G-белка альфа (Gα), содержащую N-концевой домен субъединицы Gα дрожжей и C-концевой домен экзогенной субъединицы Gα.
97. Дрожжевая клетка-хозяин по п.96, где субъединица Gα дрожжей принадлежит семейству G-белков Gα i, Gα q, Gα s или Gα o.
98. Дрожжевая клетка-хозяин по п.96 или 97, где экзогенная субъединица Gα представляет собой субъединицу Gα млекопитающего.
99. Дрожжевая клетка-хозяин по п.98, где по меньшей мере пять C-концевых остатков субъединицы Gα дрожжей заменены соответствующими C-концевыми остатками субъединицы Gα млекопитающего, так что химерная субъединица Gα способна активироваться посредством GPCR млекопитающего.
100. Дрожжевая клетка-хозяин по п.99, где по меньшей мере 20 C-концевых остатков субъединицы Gα дрожжей заменены соответствующими C-концевыми остатками субъединицы Gα млекопитающего, так что химерная субъединица Gα способна активироваться посредством GPCR млекопитающего.
101. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-100, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм FAR1 для селекции антител-антагонистов представляющего интерес GPCR-мишени.
102. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-101, где дрожжевая клетка-хозяин представляет собой штамм Δfar1, содержащий феромон-индуцируемый промотор PRM1, функционально связанный с репортерным геном для селекции антител-агонистов GPCR.
103. Дрожжевая клетка-хозяин по любому из пп.86-101, где род дрожжевой клетки-хозяина выбран из группы, состоящей из Saccharomyces, Candida, Pichia, Kluyveromyces и Yarrowia.
104. Дрожжевая клетка-хозяин по п.103, где род дрожжевой клетки-хозяина представляет собой Saccharomyces.
105. Дрожжевая клетка-хозяин по п.104, где вид Saccharomyces представляет собой Saccharomyces cerevisiae.
106. Антитело, связанное с периплазматическим якорным белком.
107. Антитело по п.106, где антитело локализуется в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина.
108. Антитело по п.106, где, когда антитело продуцируется в дрожжевой клетке-хозяине, антитело локализуется в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина.
109. Антитело по любому из пп.106-108, где антитело и периплазматический якорный белок нековалентно связаны вместе посредством молекулярных связывающих взаимодействий в комплексе или связаны посредством ковалентной непептидной связи в комплексе.
110. Антитело по любому из пп.106-108, где антитело и периплазматический якорный белок ковалентно связаны вместе в слитом белке.
111. Антитело по любому из пп.107-110, где периплазматический якорный белок дополнительно содержит сигнальную последовательность, которая обеспечивает транспорт периплазматического якорного белка в периплазму дрожжевой клетки-хозяина, на плазматическую мембрану или на клеточную стенку, так чтобы антитело экспонировалось в периплазме.
112. Антитело по любому из пп.107-110, где периплазматический якорный белок содержит проходящий через мембрану трансмембранный домен или связанный с мембраной белковый домен, который выставляет антитело в периплазму.
113. Антитело по п.112, где связанный с мембраной белковый домен представляет собой заякоривающий на плазматической мембране гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-домен.
114. Антитело по любому из пп.107-110, где периплазматический якорный белок представляет собой белок, который связывается с внутренней поверхностью клеточной стенки, так что антитело выступает в периплазму.
115. Антитело по любому из пп.107-110, где периплазматический якорный белок является достаточно большим, чтобы периплазматический якорный белок и связанное антитело удерживались в периплазме.
116. Антитело по любому из пп.106-115, где антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела, наноантитела, рекомбинантного-фрагмента антитела, Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента и scFv-фрагмента.
117. Антитело по любому из пп.107-116, где род дрожжевой клетки-хозяина выбран из группы, состоящей из Saccharomyces, Candida, Pichia, Kluyveromyces и Yarrowia.
118. Антитело по п.117, где род дрожжевой клетки-хозяина представляет собой Saccharomyces.
119. Антитело по п.118, где вид Saccharomyces представляет собой Saccharomyces cerevisiae.
120. Дрожжевая клетка-хозяин, содержащая антитело по любому из пп.106-119.
121. Способ локализации антитела в периплазматическом пространстве дрожжевой клетки-хозяина включающий связывание антитела с периплазматическимм якорным белком, так чтобы антитело локализовалось в периплазматическом пространстве.
122. Способ по п.121, где антитело и периплазматический якорный белок нековалентно связаны вместе посредством молекулярных связывающих взаимодействий в комплексе или связаны посредством ковалентной непептидной связи в комплексе.
123. Способ по п.122, где антитело и периплазматический якорный белок ковалентно связаны вместе в слитом белке.
124. Способ по любому из пп.121-123, где периплазматический якорный белок дополнительно содержит сигнальную последовательность, которая обеспечивает транспорт периплазматического якорного белка в периплазму дрожжевой клетки-хозяина, на плазматическую мембрану или на клеточную стенку, так чтобы антитело экспонировалось в периплазме.
125. Способ по любому из пп.121-123, где периплазматический якорный белок содержит проходящий через мембрану трансмембранный домен или связанный с мембраной белковый домен, который выставляет антитело в периплазму.
126. Способ по п.125, где связанный с мембраной белковый домен представляет собой заякоривающий на плазматической мембране гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-домен.
127. Способ по любому из пп.121-123, где периплазматический якорный белок представляет собой белок, который связывается с внутренней поверхностью клеточной стенки, так что антитело выступает в периплазму.
128. Способ по любому из пп.120-123, где периплазматический якорный белок является достаточно большим, чтобы периплазматический якорный белок и связанное антитело удерживались в периплазме.
129. Способ по любому из пп.121-128, где антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела, наноантитела, рекомбинантного-фрагмента антитела, Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента и scFv-фрагмента.
130. Способ по любому из пп.121-129, где род дрожжевой клетки-хозяина выбран из группы, состоящей из Saccharomyces, Candida, Pichia, Kluyveromyces и Yarrowia.
131. Способ по п.130, где род дрожжевой клетки-хозяина представляет собой Saccharomyces.
132. Способ по п.131, где вид Saccharomyces представляет собой Saccharomyces cerevisiae.
RU2020122887A 2017-12-11 2018-12-10 Дрожжевой дисплей белков в периплазматическом пространстве RU2802770C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762597388P 2017-12-11 2017-12-11
US62/597,388 2017-12-11
PCT/US2018/064775 WO2019118362A1 (en) 2017-12-11 2018-12-10 Yeast display of proteins in the periplasmic space

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2020122887A true RU2020122887A (ru) 2022-01-13
RU2802770C2 RU2802770C2 (ru) 2023-09-01

Family

ID=

Also Published As

Publication number Publication date
IL275239A (en) 2020-07-30
CA3084315A1 (en) 2019-06-20
JP2021505675A (ja) 2021-02-18
CN112041486A (zh) 2020-12-04
US11795579B2 (en) 2023-10-24
JP2024050591A (ja) 2024-04-10
US20240102202A1 (en) 2024-03-28
WO2019118362A1 (en) 2019-06-20
EP3724378A1 (en) 2020-10-21
EP3724378A4 (en) 2021-12-08
US20210198806A1 (en) 2021-07-01
AU2018383600A1 (en) 2020-06-18
JP7419248B2 (ja) 2024-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240102202A1 (en) Yeast display of proteins in the periplasmic space
Davis et al. Cis-and trans-acting functions required for endocytosis of the yeast pheromone receptors
Cheeseman et al. Mitotic spindle integrity and kinetochore function linked by the Duo1p/Dam1p complex
US6562576B2 (en) Yeast two-hybrid system and use thereof
US5846722A (en) System to detect small molecule/peptide interaction
Ren et al. Hse1, a component of the yeast Hrs-STAM ubiquitin-sorting complex, associates with ubiquitin peptidases and a ligase to control sorting efficiency into multivesicular bodies
Oestreich et al. Characterization of multiple multivesicular body sorting determinants within Sna3: a role for the ubiquitin ligase Rsp5
JP2001519157A (ja) 改変ｇ蛋白質を発現する酵母細胞及びそれらの利用方法
Nakamura et al. Simultaneous method for analyzing dimerization and signaling of G‐protein‐coupled receptor in yeast by dual‐color reporter system
US7090991B2 (en) System for detection of a functional interaction between a compound and a cellular signal transduction component
US7223533B2 (en) Cell surface proteins and use thereof as indicators of activation of cellular signal transduction pathways
Ishii et al. Improved identification of agonist-mediated Gαi-specific human G-protein-coupled receptor signaling in yeast cells by flow cytometry
DE60216721T2 (de) Verfahren zum Nachweis von Protein-Proteininteraktionen in Membranen
Wang et al. Functional expression of CXCR4 in Saccharomyces cerevisiae in the development of powerful tools for the pharmacological characterization of CXCR4
Froissard et al. Heterologous expression of a plant uracil transporter in yeast: improvement of plasma membrane targeting in mutants of the Rsp5p ubiquitin protein ligase
JP4977012B2 (ja) レセプター結合性物質のスクリーニング方法
US7022513B2 (en) Cell based signal generation
Cao et al. A multiple ATG gene knockout strain for yeast two-hybrid analysis
RU2802770C2 (ru) Дрожжевой дисплей белков в периплазматическом пространстве
JP5224491B2 (ja) レセプター結合性物質のスクリーニング方法
EP1808495A1 (en) Method and kit for detecting interactions between transcriptionally active proteins
US20020164637A1 (en) Screen for ecdysone receptor ligands
JP5392992B2 (ja) 自己リン酸化受容体のアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング方法、遺伝子組換え酵母
IL166345A (en) Cellular method for identifying substances capable of influencing the activity of a target molecule
Meng et al. Engineered yeast multicellularity via synthetic cell-cell adhesion and direct-contact signalling