JP7419248B2 - ペリプラズム空間中におけるタンパク質の酵母ディスプレイ - Google Patents
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Description
本出願は、2017年12月11日に出願した米国仮出願第62/597,388号に対する優先権を主張するものであり、その内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、アメリカ国立科学財団が授与した助成金No.1747391の下で、政府の支援を得て行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
(a)酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体に融合したペリプラズムアンカータンパク質を含む融合タンパク質であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記融合タンパク質;及び
(b)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される前記抗体が異なり、抗体が酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への抗体の輸送を指示するシグナル配列に連結されている、前記抗体;及び
(b)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
(a)融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が融合したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程;
(b)融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(c)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(d)前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜(つまり、提示された抗体が結合するためにアクセス可能である場所)に局在する、前記工程。
特定の実施形態において、融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドは発現ベクターによって準備する。他の実施形態において、融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる。
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体をコードする第1の複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記工程;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質をコードする第2の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記工程;
(c)第1の複数の組み換えポリヌクレオチド及び第2の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(d)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(e)前記抗体、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程。
(a)シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの後(下流)における、タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドのインフレーム挿入に適したクローニング部位;
(c)グリコホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドであって、ベクターが、シグナルペプチド及びGPI原形質膜アンカードメインに融合したタンパク質変異体を含む融合タンパク質の生成が可能であるように、配置されている前記ポリヌクレオチド;並びに
(d)前記融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター。
1つの実施形態において、前記シグナルペプチドは、プレプロアルファ因子シグナル配列を含む。別の実施形態において、クローニング部位は、1つ以上の制限酵素部位を含む。特定の実施形態において、GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。別の実施形態において、前記ペリプラズム標的化発現ベクターは、リンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、リンカーをコードする前記ポリヌクレオチドは、クローニング部位とGPI原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドとの間に配置される。前記リンカーはさらにタグを含むことができる。別の実施形態において、前記ペリプラズム標的化発現ベクターは、選択可能なマーカーをさらに含む。
(a)各組み換えポリヌクレオチドが異なる抗体変異体をコードする、抗体変異体をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程;
(b)本明細書に記載のペリプラズム標的化発現ベクターを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(c)抗体変異体をコードする複数の前記組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程であって、各酵母宿主細胞において、抗体変異体をコードする組み換えポリヌクレオチドが、提示するための抗体変異体に融合されたペリプラズムアンカータンパク質を含む融合タンパク質の発現を可能にするために、相同組み換えによってペリプラズム標的化発現ベクターのクローニング部位に組み込まれる、前記工程;
(c)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(d)前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜(つまり、提示された抗体が結合するためにアクセス可能である場所)に局在する、前記工程。
別の実施形態において、前記方法は、GPCRによって活性化することが可能な操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入することをさらに含み、ここで、活性化された操作されたGαサブユニットは、前記酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である。
(a)酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;及び
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
本発明の記載の中で、下記の用語を使うが、以下に示すように定義されるものとする。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の構成又は工程のパラメータに限定されず、そのようなものは、当然のことながら、変更し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明することだけを目的としており、それを限定する意図はないことも理解されたい。
一態様において、本発明は、酵母宿主細胞のペリプラズム空間におけるタンパク質の提示に関する。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、酵母ペリプラズム空間に提示するためのタンパク質、このペリプラズム空間に提示するタンパク質に連結されたペリプラズムアンカータンパク質、及び、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に位置する目的の標的膜タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ペリプラズム空間に提示されるタンパク質が目的の標的膜タンパク質に特異的に結合し、又はその機能に影響を及ぼすかどうかを判定するために、前記酵母宿主細胞を使用することができる。酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるタンパク質は、組み換えタンパク質を酵母細胞のペリプラズム空間に局在化するペリプラズムアンカータンパク質に、組み換えタンパク質を連結することによって調製することができる。連結は、共有結合でも非共有結合でもよい。例えば、組み換えタンパク質は、融合タンパク質中でペリプラズムアンカータンパク質と共有結合で連結されてもよい。あるいは、組み換えタンパク質変異体はペリプラズムアンカータンパク質と複合体を形成し、ここで、組み換えタンパク質とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で分子結合相互作用によって非共有結合で連結されてもよい。あるいは、組み換えタンパク質変異体とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結されてもよい。いくつかの実施形態において、この非ペプチド結合はジスルフィド結合である。酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるタンパク質は、提示されるタンパク質と分泌シグナルとを連結することによっても調製することができる。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属は、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属はサッカロマイセス(Saccharomyces)である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の種は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。
ペリプラズムアンカーを付したタンパク質変異体及び目的の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意の数々の方法で生成することができ、これらは全て当技術分野でよく知られている。例えば、ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の組み換え技術を使用して作製することができる。当業者は、標準的な方法論及び本明細書の教示を使用して、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を容易に決定することができる。
(a)シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの後(下流)における、タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドのインフレーム挿入に適したクローニング部位;
(c)グリコホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドであって、ベクターが、シグナルペプチド及びGPI原形質膜アンカードメインに融合したタンパク質変異体を含む融合タンパク質を産生可能であるように、配置されている前記ポリヌクレオチド;並びに
(d)前記融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター。
特定の実施形態において、GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。ペリプラズム標的化発現ベクターは、GPI原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドとクローニング部位との間に配置されたリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。このクローニング部位は、1つ以上の制限酵素部位を含み得る。ペリプラズム標的化発現ベクターは、選択可能なマーカーをさらに含み得る。
キットは、本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー、又は酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを調製するための薬剤(ペリプラズムアンカータンパク質に連結されたタンパク質変異体の産生のためのタンパク質変異体をコードする核酸をクローニングするための適当なベクターなど)、酵母細胞、トランスフェクション剤、酵母細胞を増殖させるのに適当な培地、細胞のポジティブ及びネガティブセレクションのための薬剤、並びに必要な他の試薬を含み得る。本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの生成及び/又はスクリーニングのための説明書(例えば、書面、CD-ROM、DVD、ブルーレイ、フラッシュドライブ、デジタルダウンロードなど)は、通常、前記キットに含まれる。
(a)シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの後(下流)における、タンパク質変異体(例えば、抗体)をコードするポリヌクレオチドのインフレーム挿入に適したクローニング部位;
(c)グリコホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドであって、ベクターが、シグナルペプチド及びGPI原形質膜アンカードメインに融合したタンパク質変異体を含む融合タンパク質の生成が可能であるように、配置されている前記ポリヌクレオチド;並びに
(d)前記融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター。
別の実施形態において、前記シグナルペプチドは、プレプロアルファ因子シグナル配列を含む。特定の実施形態において、前記GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。別の実施形態において、前記ペリプラズム標的化発現ベクターは、リンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、リンカーをコードする前記ポリヌクレオチドは、クローニング部位とGPI原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドとの間に配置される。リンカーはさらにタグを含むことができる。別の実施形態において、ペリプラズム標的化発現ベクターは、選択可能なマーカーをさらに含む。別の実施形態において、クローニング部位は、1つ以上の制限酵素部位を含む。
本発明は、結合、触媒、集合、輸送などを含む、有用な又は所望の機能を果たすタンパク質のスクリーニングに広く適用することができる。例えば、酵母ペリプラズムディスプレイは、受容体のアゴニスト及びアンタゴニストの同定、治療用のタンパク質及び抗体の操作、タンパク質-タンパク質相互作用の同定、並びにエピトープマッピングに使用することができる。
本明細書で提供される実施形態は以下を含む:
(1)複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;及び
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(2)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(3)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(4)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態1~3のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(5)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態1~3のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(6)前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインである、実施形態5に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(7)前記GPI原形質膜アンカードメインが、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態6に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(8)前記ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態7に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(9)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(10)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質をペリプラズムに配置する、細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(11)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(12)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質がペリプラズムに保持されるのに十分な大きさである、実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(13)複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される前記抗体が異なり、抗体が酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への抗体の輸送を指示するシグナル配列に連結されている、前記抗体;及び
(b)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(14)前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムをさらに含む、実施形態1~13のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(15)前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(16)前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1からなる群より選択される、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(17)前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(18)前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(19)前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン(aequorin)である、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(20)前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(21)前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記増加がポジティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような選択可能なマーカーである、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(22)前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記減少がネガティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような対抗選択可能なマーカーである、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(23)前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態1~22のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(24)前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態23に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(25)前記GPCRが外来性GPCRである、実施形態24に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(26)前記酵母宿主細胞がさらに内在性GPCRを含む、実施形態25に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(27)前記外来性GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態25又は26に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(28)前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態27に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(29)前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態28に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(30)前記外来性GPCRが哺乳動物GPCRである、実施形態25~29のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(31)前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態30に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(32)前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態31に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(33)前記哺乳動物Gαサブユニットが、Gアルファ-S、Gアルファ-I、Gアルファ-O、Gアルファ-T、Gアルファ-Z、Gアルファ-Q、Gアルファ-11、Gアルファ-12、Gアルファ-13、及びトランスデューシンからなる群より選択される、実施形態31又は32に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(34)前記キメラGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む、実施形態28~33のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(35)前記哺乳動物GPCRがヒトGPCRである、実施形態30~34のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(36)前記ヒトGPCRが、CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択される、実施形態35に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(37)目的のGPCR標的膜タンパク質が恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態24~36のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(38)前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態24~37のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(39)前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態24~36のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(40)前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態1~39のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(41)前記目的の標的膜タンパク質が、その活性を増加又は減少させる変異を含む、実施形態1~40のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(42)前記酵母宿主細胞が、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3、又はΔmat株である、実施形態1~40のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(43)前記酵母宿主細胞が、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含むΔmat株である、実施形態42に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(44)前記酵母宿主細胞が、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含む、実施形態1~43のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(45)前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1~387を保持する、実施形態44に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(46)前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1~408を保持する、実施形態44に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(47)前記酵母宿主細胞が一倍体又は二倍体の酵母宿主細胞である、実施形態1~46のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体をコードする第1の複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記工程;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質をコードする第2の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記工程;
(c)第1の複数の組み換えポリヌクレオチド及び第2の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(d)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(e)前記抗体、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
(49)抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを、発現ベクターによって準備する、実施形態48に記載の方法。
(50)抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態48に記載の方法。
(51)実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下:
(a)融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が連結したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程;
(b)融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(c)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(d)前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
(52)融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを発現ベクターによって準備する、実施形態51に記載の方法。
(53)融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態51に記載の方法。
(54)前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態48~53のいずれかに記載の方法。
(55)前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態54に記載の方法。
(56)前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態48~55のいずれかに記載の方法。
(57)前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態56に記載の方法。
(58)前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態57に記載の方法。
(59)前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態57又は58に記載の方法。
(60)哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態59に記載の方法。
(61)前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態60に記載の方法。
(62)前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態55~61のいずれかに記載の方法。
(63)前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態55~61のいずれかに記載の方法。
(65)前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態64に記載の方法。
(66)前記栄養マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、栄養欠乏選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
(67)前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1である、実施形態66に記載の方法。
(68)前記抗生物質耐性マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、抗生物質を含む選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
(69)前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態68に記載の方法。
(70)前記蛍光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する蛍光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
(71)前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態70に記載の方法。
(72)前記生物発光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する生物発光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
(73)前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン(aequorin)である、実施形態72に記載の方法。
(74)前記対抗選択可能なマーカー発現のネガティブセレクションを行うことをさらに含み、提示された前記抗体が前記目的の標的膜タンパク質に結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少が、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞に対抗して(against)選択する薬剤を含む培地での前記酵母宿主細胞の増殖によって検出可能である、実施形態65に記載の方法。
(75)前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態74に記載の方法。
(76)目的の標的GPCRの活性を調節する抗体について、実施形態27に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、培地において、実施形態27に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット(subset)を培養する工程を含み、ペリプラズム空間に提示された抗体を持たない対照酵母宿主細胞と比較した、少なくとも1つの酵母宿主細胞におけるフェロモン応答の活性化又は抑制の検出が、前記少なくとも1つの酵母宿主細胞で提示された前記抗体が前記GPCRに結合し、その活性を調節することを示す、前記方法。
(77)前記目的の標的GPCRがヒトGPCRである、実施形態76に記載の方法。
(78)前記ヒトGPCRをリガンドと接触させることをさらに含む、実施形態77に記載の方法。
(79)前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態78に記載の方法。
(80)前記酵母宿主細胞がFAR1株であって、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅(cessation)をもたらす、実施形態76~79のいずれかに記載の方法。
(81)前記酵母宿主細胞が、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす、実施形態76~79のいずれかに記載の方法。
(82)前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態73に記載の方法。
(83)前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態1~82のいずれかに記載の方法。
(84)前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態83に記載の方法。
(85)前記サッカロマイセス(Saccharomyces)の種が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、実施形態84に記載の方法。
(a)酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;及び
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
(87)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態86に記載の酵母宿主細胞。
(88)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態86に記載の酵母宿主細胞。
(89)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(90)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(91)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(92)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(93)前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態86~92のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(94)前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態93に記載の酵母宿主細胞。
(95)前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを前記酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態86~94のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(96)前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態95に記載の酵母宿主細胞。
(97)前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態96に記載の酵母宿主細胞。
(98)前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態96又は97に記載の酵母宿主細胞。
(99)哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態98に記載の酵母宿主細胞。
(100)前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態99に記載の酵母宿主細胞。
(101)前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態86~100のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(102)前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態86~101のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(103)前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態86~101のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
(104)前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態103に記載の酵母宿主細胞。
(105)前記サッカロマイセス(Saccharomyces)の種が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、実施形態104に記載の酵母宿主細胞。
(107)前記抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、実施形態106に記載の抗体。
(108)前記抗体が酵母宿主細胞中で産生されたとき、抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、実施形態106に記載の抗体。
(109)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態106~108のいずれかに記載の抗体。
(110)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態106~108のいずれかに記載の抗体。
(111)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への前記ペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
(112)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
(113)前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインである、実施形態112に記載の抗体。
(114)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
(115)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
(116)前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態106~115のいずれかに記載の抗体。
(117)前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態107~116のいずれかに記載の抗体。
(118)前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態117に記載の抗体。
(121)抗体がペリプラズム空間に局在するように、前記抗体をペリプラズムアンカータンパク質に連結することを含む、酵母宿主細胞ペリプラズム空間への抗体の局在化方法。
(122)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態121に記載の方法。
(123)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態122に記載の方法。
(124)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態121~123のいずれかに記載の方法。
(125)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態121~123のいずれかに記載の方法。
(126)前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインである、実施形態125に記載の方法。
(127)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態121~123のいずれかに記載の方法。
(128)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態120~123のいずれかに記載の方法。
(129)前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態121~128のいずれかに記載の方法。
(130)前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態121~129のいずれかに記載の方法。
(131)前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態130に記載の方法。
(132)前記サッカロマイセス(Saccharomyces)の種が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、実施形態131に記載の方法。
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;及び
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(134)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(135)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結している、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(136)前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムをさらに含む、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(137)前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態136に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(138)前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1からなる群より選択される、実施形態137に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(139)前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態137に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(140)前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態137に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(141)前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン(aequorin)である、実施形態137に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(142)前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態137に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(143)前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記増加がポジティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような選択可能なマーカーである、実施形態136に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(144)前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記減少がネガティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような対抗選択可能なマーカーである、実施形態136に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(145)前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(146)前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態145に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(147)前記GPCRが外来性GPCRである、実施形態146に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(148)前記外来性GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態147に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(149)前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態148に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(150)前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態149に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(151)前記外来性GPCRが哺乳動物GPCRである、実施形態149に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(152)前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態151に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(153)前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態152に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(154)前記哺乳動物Gαサブユニットが、Gアルファ-S、Gアルファ-I、Gアルファ-O、Gアルファ-T、Gアルファ-Z、Gアルファ-Q、Gアルファ-11、Gアルファ-12、Gアルファ-13、及びトランスデューシンからなる群より選択される、実施形態151に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(155)前記キメラGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む、実施形態149に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(156)前記哺乳動物GPCRがヒトGPCRである、実施形態151に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(157)前記ヒトGPCRが、CXCR4、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択される、実施形態156に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(158)前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態146に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(159)前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態146に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(160)前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態146に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(161)前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(162)前記目的の標的膜タンパク質が、その活性を増加又は減少させる変異を含む、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(163)前記酵母宿主細胞が、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3、又はΔmat株である、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(164)前記Δmat株が、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含む、実施形態163に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(165)前記酵母宿主細胞が、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含む、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(166)前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1~387を保持する、実施形態165に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(167)前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1~408を保持する、実施形態166に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(168)前記酵母宿主細胞が一倍体又は二倍体の酵母宿主細胞である、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(169)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、融合したタンパク質変異体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への融合タンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(170)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、融合したタンパク質変異体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(171)前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインである、実施形態170に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(172)前記GPI原形質膜アンカードメインが、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態171に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(173)前記ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態172に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(174)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、提示されたタンパク質変異体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(175)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質がペリプラズムに保持されるのに十分に大きい、実施形態133に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
(a)融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が連結したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程;
(b)融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(c)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに、
(d)前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態134に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
(177)融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを発現ベクターによって準備する、実施形態176に記載の方法。
(178)融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態176に記載の方法。
(179)前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態176に記載の方法。
(180)前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態179に記載の方法。
(181)前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態180に記載の方法。
(182)前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態181に記載の方法。
(183)前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態182に記載の方法。
(184)前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態182に記載の方法。
(185)哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態184に記載の方法。
(186)前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態185に記載の方法。
(187)前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態181に記載の方法。
(188)前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態181に記載の方法。
(190)前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態189に記載の方法。
(191)前記栄養マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、栄養欠乏選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態190に記載の方法。
(192)前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1である、実施形態191に記載の方法。
(193)前記抗生物質耐性マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、抗生物質を含む選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態190に記載の方法。
(194)前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態193に記載の方法。
(195)前記蛍光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する蛍光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態190に記載の方法。
(196)前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態195に記載の方法。
(197)前記生物発光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する生物発光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態190に記載の方法。
(198)前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン(aequorin)である、実施形態197に記載の方法。
(199)前記対抗選択可能なマーカー発現のネガティブセレクションを行うことをさらに含み、提示された前記抗体が前記目的の標的膜タンパク質に結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少が、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞に対抗して(against)選択する薬剤を含む培地での前記酵母宿主細胞の増殖によって検出可能である、実施形態190に記載の方法。
(200)前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態199に記載の方法。
(202)ヒトGPCRをリガンドと接触させることをさらに含む、実施形態201に記載の方法。
(203)前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態201に記載の方法。
(204)前記酵母宿主細胞がFAR1株であって、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅(cessation)をもたらす、実施形態201に記載の方法。
(205)前記酵母宿主細胞が、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす、実施形態201に記載の方法。
(206)前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態205に記載の方法。
本発明は、本発明を実施するための具体的な実施形態に係る以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。実施例は説明のためにのみ提供されるのであって、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。その観点から様々な改変又は変更は、当業者に示唆され、本出願の精神及び目的、並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることになる。
概要
癌や炎症などの疾患における多くの治療標的は、Gタンパク質共役受容体(GPCR)に関係している。しかし、インパクトの大きい(high-impact)疾患に対して最大の治療上の可能性を有するGPCRの多くは、薬にするのが困難である。GPCRの機能に影響を及ぼす低分子は容易に見つかるが、GPCRリガンド結合ポケット間での構造上の類似性のためにしばしば非特異的であり、著しいオフターゲットの副作用を引き起こす可能性がある。低分子とは異なり、抗体並びに関連する親和性分子(例えば、ナノボディ、ScFv及びFab)は、それらの潜在的に優れた特異性、機能的多様性、及び薬理学的特性により、魅力的な医薬分類である。さらに、抗体は、細胞外のドメイン及びループとより良好に相互作用する、低分子よりも洗練された方法でGPCRの構造を(したがって機能も)調節することができる。しかし、現在までのところ、承認されたGPCR抗体治療薬は米国では1つもなく、世界中で唯一、日本にしかない。
(1)使用される抗原が欠如している。細胞外のGPCRペプチド又は断片に由来する抗原は、ウエスタンブロットのための抗体を開発するのにはよいが、治療上適切な標的を構造的には再現していない。さらに、均一に、機能的に折りたたまれた完全長のタンパク質を、脂質若しくは界面活性剤中で、免疫化、ファージディスプレイ、又は酵母ディスプレイに十分な量で調製することが困難であり得る。
(2)その高い親和性によって選択される抗体はほとんどが機能的でない。それらはGPCRの機能に影響しない領域に結合する。
(3)ワークフローは、選択された抗体において、著しい抗体の多様性を(したがって機能性も)失う。まず強固に結合する抗体を選択し、残りを捨てることによって、膨大な量の機能的多様性が失われる。
抗体候補サブセットを自己分泌的に、機能的にスクリーニングするために哺乳動物細胞系が作製され(Zhang 2014)、部分的に問題(2)に対処しているが、形質転換効率(約104)により、及び、選択(スクリーニング)可能なリードアウト(readouts)の操作可能性(engineerability)が限られていることにより、小さなサブセットの候補のスクリーニングに限定される。
酵母は、in vitroにおける生化学的及び構造的研究のために、ヒト由来の完全長で機能的なGPCRを発現するために選択される系である。注目すべきことに、酵母はまた、ヒトGPCRを酵母フェロモン応答経路に機能的に共役させ、そのリードアウトに応じた、GPCRと機能的に相互作用する低分子、ペプチド、又はタンパク質のリガンドのスクリーニング(選択)に成功的に使用されている(King 1990, Brown 2000, Erlenbach 2001, Minic 2005, Dowell 2009, Dong 2010, Liu 2016)。共役の最も「一般的」な方法は、酵母GαサブユニットであるGpa1を改変してヒトGPCRに結合し、関連する(cognate)ヒトGαの5つのC末端残基を移植することでGpa1中の本来(天然)の5つのC末端アミノ酸を置き換え「Gα移植物」を製造することによってシグナルを伝達するというものである(Conklin 1993, Brown 2000, Erlenbach 2001)。他の方法には、ヒト受容体の関連するGαの完全長のものによるGpa1の完全な置き換え(King 1990)、又は、より複雑なGpa1/Gαキメラ(各々の異なる部分を組み合わせたヒト/酵母ハイブリッドGα(hybrid human/yeast Gα))の構築(Klein 1998, Price 1995)が含まれる。
酵母において、IgG、ScFv、Fab、及びナノボディのような親和性分子を発現し、分泌することに関しても、相当な知識が存在する(Horwitz 1988, Hamilton 2006, Jeong 2011)。複数の抗体臨床候補は、Adimabのような酵母ディスプレイ中心の企業によって開発された。多くの学術研究所や企業は、細胞壁の細胞外表面に共有結合しているタンパク質(例えばAga1やAga2)に親和性分子を融合させることで、酵母においてこれらの分子を発現させ、「提示」する方法を改良してきた(Boder 1997, Bidlingmaier 2015)。109もの複雑なライブラリーが、酵母において日常的に開発されており、これは通常の結合の研究に充分であり、本発明者らの機能的選択プラットフォームにとっては十分以上である(図1に記載された理由による)。
本発明者らは、GPCRリガンドで処理した場合に増殖せず、増殖を可能にするようなしばしば起こる変異も起こしにくい酵母株を作製した。本発明者らは、10-7のバックグラウンド(偽陽性)率を目指した。
発明者らは、N末端分泌シグナルであるMFアルファプレプロ(Brake 1984)、続いて単一のFLAGエピトープ(DYKDDDDK)を含む18アミノ酸のリンカー、最後にYPS1グリコホスファチジルイノシトール(GPI)アンカードメインを持つ、キメラの発現を駆動する一組のペリプラズム標的化発現ベクターを構築した。このプレプロシグナルは小胞体内への移行及び分泌のためにタンパク質を標的化し、後に切断される。一方、小胞体中でのYPS1 GPIドメインのプロセシングにより、原形質膜に係留された状態にキメラを保持するN末端GPIアンカーが生じる(Frieman 2003)。MFアルファプレプロをコードする配列の直ぐ後(下流)の制限酵素部位により、(例えば、ナノボディcDNAライブラリーの作製のための)親和性分子のクローニングが可能になる。前記ベクターは選択可能なマーカーURA3を担持し、これによりウラシル欠乏培地でのポジティブセレクション、及び対抗選択も可能になる(下記参照)。
A.ナノボディライブラリーからのフェロモン耐性クローンの選択:
本発明者らは、実施例3に記載したライブラリー001からフェロモン耐性クローンを選択した。数枚のU-/H- プレート上でα因子と共に細胞108個を播種し、5日間インキュベートした。増殖した約300個のうち90個のコロニーの無作為サンプルを解析した。次に本発明者らは、それらのα因子上での増殖能がプラスミド依存的であるかを判定した。URA3を発現する細胞に対し毒性がある5-FOAを含む培地上でそれらを平板培養することにより、プラスミドを自発的に失ったクローンを選択した。そして、5-FOA選択前に増殖したが、その後には増殖しなかったクローンを試験した。本発明者らはハロアッセイ(halo assay)を行い、最初に単離した90個のうち12個のクローンが、ハロアッセイで5-FOA選択をした後にα因子含有寒天培地上で増殖能を失うことを見出した(図5)。
候補ナノボディ親和性分子が特異的であるか(つまり、フェロモン応答を遮断するために標的受容体Ste2を必要とするか)を試験するために、本発明者らはMATアルファ株において前記候補を発現する。MATアルファ細胞はa因子受容体Ste3を発現し、Ste2を発現しない。Ste3はSte2と遠い類縁関係しかないGPCRであり、そのリガンドであるa因子フェロモンはα因子とは全く異なった、グリコシル化されたペプチドである。MATa及びMATアルファの両者とも、その受容体の下流にあるフェロモンシグナル伝達カスケードは同一である。MATa及びMATアルファ細胞はともに、その関連するフェロモンに応答して、それらの細胞周期を停止させ、フェロモン誘導性遺伝子を活性化する。本発明者らのMATa及びMATアルファ試験用細胞は、フェロモン誘導性転写レポーターP(PRM1)-YFPを担持し、アンタゴニスト候補の非存在下及び存在下における経路機能を試験するために使用することができる。そこで、本発明者らは、それらの関連するフェロモンに曝露したMATa及びMATアルファ細胞において、細胞周期の停止及びYFPの誘導を測定することにより、アンタゴニスト候補の効果を比較して特異性を評価する。MATa(Ste2)株のみでアンタゴニストとして作用すれば、候補を進める。
可能性は低いが、GPCRの拮抗作用は、Ste2の原形質膜への局在の混乱(disruption)及び細胞内での結合から生じる可能性があった。いかなる「結合剤」抗体も潜在的にこのように作用する可能性があるため、本発明者らは、外来的に添加した際の前記候補のGPCRの機能調節能を試験している。
本発明者らは、増殖にSte2刺激を必要とするアゴニスト選択株を構築する。P(MFA1)-HIS3マーカーを欠く本発明者らのプラットフォーム株のバージョンにおいて、CRISPR-Cas9アプローチ(Horwitz 2015)を使用してFAR1の両方のゲノムコピーを欠失させることによりフェロモン誘導性細胞周期停止機能を無効にする。次に、この二倍体株のPRM1対立遺伝子のうち1つのPRM1のオープンリーディングフレームをHIS3のORFで置き換え、P(PRM1)-HIS3選択マーカーを作製する。他の株にP(PRM1)-HIS3を組み込んだところ、著しい「漏れやすさ」は観察されなかった(つまり、これらの細胞はα因子の存在下でのみ、H- プレート上で増殖する)。本発明者らは、特異性試験のために、この株のMATa及びMATαバージョンを作製する。予想通り、フェロモンカスケードをオンにする突然変異がそれをオフにする突然変異よりもまれであるため(Brown 2000)、P(PRM1)-HIS3株の偽陽性率はアンタゴニスト選択株よりもはるかに低い。ナノボディライブラリーを発現する細胞を平板培養したときに、H- プレートで弱い「増殖体」の存在が観察される場合、本発明者らは、HIS3発現の漏れやすさによる増殖を遮断するHis3阻害剤である3-アミノトリアゾールを経験的に決定された最小限の濃度で使用している(酵母HIS3選択用途のための標準的な戦略)。
A.Gpa1移植物パネル
ヒトGPCRを酵母フェロモン経路と共役させるために広く使用されている方法は、そのC末端アミノ酸の5つをヒトGαのものに変更するように、酵母Gα(Gpa1)を改変し、「GPA1移植物」を生成するというものである(Brown 2000, Erlenbach 2001)。各受容体について、適切なGαはしばしば経験的に見出される(Dowell 2009)。ほとんどの場合、Gαi、Gαq、Gαs又はGαoのいずれかへの移植により共役が達成される(Dong 2010)。本発明者らは、CRISPRアプローチ(Horwitz 2015)を使用して、これら4種類のGα移植株につき、アゴニスト及びアンタゴニストのGPA1移植株二倍体のパネルを作製している。
ほとんどの場合、ヒトGPCRは、P(ACT1)のような適度なプロモーターにより駆動されるゲノム組み込みコンストラクトから酵母において最もよく発現する(Shiroishi 2012, Schutz 2016)。よく発現するGPCRは、しばしば、N末端切断可能な分泌シグナル(典型的にはMFアルファプレプロ)、続いて免疫検出のためのFLAGエピトープタグを有し、及び、ときには、C末端GFPを有するキメラである。本発明者らはこれらの特徴を持つベクターを構築しており、個々の事例に応じて容易に改変可能である。本発明者らは、表2の受容体をこれらのベクターにクローニングし、それらの発現レベル及び原形質膜局在を蛍光顕微鏡及び/又は抗FLAG免疫蛍光法により試験する。
A.選ばれたGPCRの抗体選択プロセスへの提示(Submit)
以下を除いて、Ste2に関する本発明者らの先の実験(previous work)と同様のアプローチに従う。本発明者らは、多様化ヒトScFvライブラリー(108-109の多様性が保証されている、Oak Biosciences)を使用している。このライブラリーを前述のものと同じ親和性分子ベクターにクローニングし、YPS1 GPIアンカーを持つキメラとしてScFvを原形質膜に発現させる。アンタゴニストの選択のために、共役した受容体からのシグナル伝達が細胞周期の停止を引き起こすほど強いとは予想されない。そこで本発明者らは、対抗選択可能なマーカーP(FUS2)-CAN1を使用している(Erlenbach 2001)。P(FUS2)はP(PRM1)と同様、フェロモン誘導性プロモーターである。CAN1は、アルギニン(毒性のあるアルギニン類似体カナバニンも)の原形質膜トランスポーターをコードしている。P(FUS2)-CAN1を担持する細胞は、フェロモン応答と共役した活性化ヒトGPCRを担持するならば、カナバニンプレートでは増殖できない。この表現型により、カナバニンプレートでヒトGPCRに対する拮抗抗体を選択することが可能になる。アゴニストの選択のためには、本発明者らは、前述のようにP(PRM1)-HIS3マーカーを使用する。候補を選択した後、上記のように、これらのクローンのプラスミド非含有誘導体(plasmid-free derivatives)を単離し、それらのフェロモン遮断表現型のプラスミド依存性を試験した。
(1)他のGPCRで試験する
本発明者らは、他の受容体を発現する株に前記プラスミドを形質転換することにより、プラスミド依存性のある前記候補の特異性を検証する。この場合、MATa(Ste2)及びMATα(Ste3)株、並びに、GPA1移植物を介してフェロモン応答と共役する少なくとも2つの他のヒトGPCRを発現する株でそれらを試験する(つまり、アゴニスト又はアンタゴニストが他のGPCRに作用しないことを確認するためである)。
ナノボディ(15kDa)は酵母細胞壁を通って拡散できるが(Ries 2012)、より大きなScFv(27kDa)は著しく制限される可能性がある。本発明者らは、細胞壁の消化のあり及びなしによって、酵母において標識された候補ScFvの免疫蛍光法を行う。
アゴニストの提示が酵母細胞の増殖速度に及ぼす影響を決定するために、本発明者らは、ヒトGPCRタンパク質、ヒトカンナビノイド受容体2型(CB2受容体)を発現する酵母株を構築し、それらを、空のプラスミド(VHHなし)又は単一ドメインVHH抗体Ab101が異なる方法で提示されるアゴニスト発現プラスミド(plasmids)のいずれかで形質転換した。本発明者らは、VHHドメインが(1)Yps1原形質膜アンカーに連結された短いリンカーによって、(2)Yps1原形質膜アンカーに連結された長いリンカーによって、(3)可溶性ペリプラズム(periplasmid)酵素Suc2に連結されたN末端融合物によって、及び(4)タグ付けされていないVHHのペリプラズムへの直接分泌によって提示される4つの異なるアゴニストVHH発現プラスミドを試験した。2~5個の独立したクローンを、選択のない状態で飽和まで増殖させた。飽和細胞を使用して、プレートリーダーでの自動吸光度測定(OD630)のために、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて技術的二回反復を伴う培養を開始した。2種類の培養培地製剤を用いた。一つ目の培養培地製剤は、フェロモン応答レポーターの発現を必要としない(選択なし)。二つ目の培養培地製剤は、一つ目のものと同じであったが、フェロモン応答レポーター発現の結果としてのみ生産され得るアミノ酸を1つ欠いている(選択)。吸光度測定は5分ごとに48時間とおして行った。各技術的反復について、生の吸光度測定値から最大増殖速度を計算的に抽出した。生成された全てのデータをグラフ化し、増殖速度の中央値を横棒で示した(図7)。グラフの下の図は、各提示様式を描いている(図7)。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する:
[実施形態1]複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;及び
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態2]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態3]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態4]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態1~3のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態5]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態1~3のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態6]前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインである、実施形態5に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態7]前記GPI原形質膜アンカードメインが、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態6に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態8]前記ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態7に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態9]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態10]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質をペリプラズムに配置する、細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態11]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態12]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質がペリプラズムに保持されるのに十分な大きさである、実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態13]複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される前記抗体が異なり、抗体が酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への抗体の輸送を指示するシグナル配列に連結されている、前記抗体;及び
(b)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態14]前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムをさらに含む、実施形態1~13のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態15]前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態16]前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1からなる群より選択される、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態17]前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態18]前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態19]前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン(aequorin)である、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態20]前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態15に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態21]前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記増加がポジティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような選択可能なマーカーである、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態22]前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記減少がネガティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような対抗選択可能なマーカーである、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態23]前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態1~22のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態24]前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態23に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態25]前記GPCRが外来性GPCRである、実施形態24に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態26]前記酵母宿主細胞がさらに内在性GPCRを含む、実施形態25に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態27]前記外来性GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態25又は26に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態28]前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態27に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態29]前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態28に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態30]前記外来性GPCRが哺乳動物GPCRである、実施形態25~29のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態31]前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態30に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態32]前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態31に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態33]前記哺乳動物Gαサブユニットが、Gアルファ-S、Gアルファ-I、Gアルファ-O、Gアルファ-T、Gアルファ-Z、Gアルファ-Q、Gアルファ-11、Gアルファ-12、Gアルファ-13、及びトランスデューシンからなる群より選択される、実施形態31又は32に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態34]前記キメラGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む、実施形態28~33のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態35]前記哺乳動物GPCRがヒトGPCRである、実施形態30~34のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態36]前記ヒトGPCRが、CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択される、実施形態35に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態37]目的のGPCR標的膜タンパク質が恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態24~36のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態38]前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態24~37のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態39]前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態24~36のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態40]前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab') 2 断片、F v 断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態1~39のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態41]前記目的の標的膜タンパク質が、その活性を増加又は減少させる変異を含む、実施形態1~40のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態42]前記酵母宿主細胞が、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3、又はΔmat株である、実施形態1~40のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態43]前記酵母宿主細胞が、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含むΔmat株である、実施形態42に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態44]前記酵母宿主細胞が、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含む、実施形態1~43のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態45]前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1~387を保持する、実施形態44に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態46]前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1~408を保持する、実施形態44に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態47]前記酵母宿主細胞が一倍体又は二倍体の酵母宿主細胞である、実施形態1~46のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
[実施形態48]実施形態1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体をコードする第1の複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記工程;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質をコードする第2の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記工程;
(c)第1の複数の組み換えポリヌクレオチド及び第2の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(d)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(e)前記抗体、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
[実施形態49]抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを、発現ベクターによって準備する、実施形態48に記載の方法。
[実施形態50]抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態48に記載の方法。
[実施形態51]実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下:
(a)融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が連結したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程;
(b)融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(c)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(d)前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態3に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
[実施形態52]融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを発現ベクターによって準備する、実施形態51に記載の方法。
[実施形態53]融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態51に記載の方法。
[実施形態54]前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態48~53のいずれかに記載の方法。
[実施形態55]前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態54に記載の方法。
[実施形態56]前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態48~55のいずれかに記載の方法。
[実施形態57]前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態56に記載の方法。
[実施形態58]前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態57に記載の方法。
[実施形態59]前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態57又は58に記載の方法。
[実施形態60]哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態59に記載の方法。
[実施形態61]前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態60に記載の方法。
[実施形態62]前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態55~61のいずれかに記載の方法。
[実施形態63]前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態55~61のいずれかに記載の方法。
[実施形態64]目的の標的膜タンパク質の活性を調節する抗体について、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、選択培地において、実施形態14に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット(subset)を培養する工程;及び、前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程を含み、レポーター遺伝子の発現の増加が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を増加させることを示し、レポーター遺伝子の発現の減少が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を減少させることを示す、前記方法。
[実施形態65]前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態64に記載の方法。
[実施形態66]前記栄養マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、栄養欠乏選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
[実施形態67]前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1である、実施形態66に記載の方法。
[実施形態68]前記抗生物質耐性マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、抗生物質を含む選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
[実施形態69]前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態68に記載の方法。
[実施形態70]前記蛍光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する蛍光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
[実施形態71]前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態70に記載の方法。
[実施形態72]前記生物発光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する生物発光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態65に記載の方法。
[実施形態73]前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン(aequorin)である、実施形態72に記載の方法。
[実施形態74]前記対抗選択可能なマーカー発現のネガティブセレクションを行うことをさらに含み、提示された前記抗体が前記目的の標的膜タンパク質に結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少が、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞に対抗して(against)選択する薬剤を含む培地での前記酵母宿主細胞の増殖によって検出可能である、実施形態65に記載の方法。
[実施形態75]前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態74に記載の方法。
[実施形態76]目的の標的GPCRの活性を調節する抗体について、実施形態27に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、培地において、実施形態27に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット(subset)を培養する工程を含み、ペリプラズム空間に提示された抗体を持たない対照酵母宿主細胞と比較した、少なくとも1つの酵母宿主細胞におけるフェロモン応答の活性化又は抑制の検出が、前記少なくとも1つの酵母宿主細胞で提示された前記抗体が前記GPCRに結合し、その活性を調節することを示す、前記方法。
[実施形態77]前記目的の標的GPCRがヒトGPCRである、実施形態76に記載の方法。
[実施形態78]前記ヒトGPCRをリガンドと接触させることをさらに含む、実施形態77に記載の方法。
[実施形態79]前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態78に記載の方法。
[実施形態80]前記酵母宿主細胞がFAR1株であって、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅(cessation)をもたらす、実施形態76~79のいずれかに記載の方法。
[実施形態81]前記酵母宿主細胞が、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす、実施形態76~79のいずれかに記載の方法。
[実施形態82]前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態73に記載の方法。
[実施形態83]前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態1~82のいずれかに記載の方法。
[実施形態84]前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態83に記載の方法。
[実施形態85]前記サッカロマイセス(Saccharomyces)の種が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、実施形態84に記載の方法。
[実施形態86]以下を含む酵母宿主細胞:
(a)酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;及び
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
[実施形態87]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態86に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態88]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態86に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態89]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態90]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態91]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態92]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態86~88のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態93]前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態86~92のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態94]前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、実施形態93に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態95]前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを前記酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態86~94のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態96]前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである、実施形態95に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態97]前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態96に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態98]前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態96又は97に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態99]哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態98に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態100]前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態99に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態101]前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態86~100のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態102]前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態86~101のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態103]前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態86~101のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
[実施形態104]前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態103に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態105]前記サッカロマイセス(Saccharomyces)の種が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、実施形態104に記載の酵母宿主細胞。
[実施形態106]ペリプラズムアンカータンパク質に連結した抗体。
[実施形態107]前記抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、実施形態106に記載の抗体。
[実施形態108]前記抗体が酵母宿主細胞中で産生されたとき、抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、実施形態106に記載の抗体。
[実施形態109]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態106~108のいずれかに記載の抗体。
[実施形態110]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態106~108のいずれかに記載の抗体。
[実施形態111]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への前記ペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
[実施形態112]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
[実施形態113]前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインである、実施形態112に記載の抗体。
[実施形態114]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
[実施形態115]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態107~110のいずれかに記載の抗体。
[実施形態116]前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab') 2 断片、F v 断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態106~115のいずれかに記載の抗体。
[実施形態117]前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態107~116のいずれかに記載の抗体。
[実施形態118]前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態117に記載の抗体。
[実施形態119]前記サッカロマイセス(Saccharomyces)の種が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、実施形態118に記載の抗体。
[実施形態120]実施形態106~119のいずれかに記載の抗体を含む酵母宿主細胞。
[実施形態121]抗体がペリプラズム空間に局在するように、前記抗体をペリプラズムアンカータンパク質に連結することを含む、酵母宿主細胞ペリプラズム空間への抗体の局在化方法。
[実施形態122]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態121に記載の方法。
[実施形態123]前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態122に記載の方法。
[実施形態124]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態121~123のいずれかに記載の方法。
[実施形態125]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態121~123のいずれかに記載の方法。
[実施形態126]前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインである、実施形態125に記載の方法。
[実施形態127]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態121~123のいずれかに記載の方法。
[実施形態128]前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態120~123のいずれかに記載の方法。
[実施形態129]前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab') 2 断片、F v 断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態121~128のいずれかに記載の方法。
[実施形態130]前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、実施形態121~129のいずれかに記載の方法。
[実施形態131]前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス(Saccharomyces)である、実施形態130に記載の方法。
[実施形態132]前記サッカロマイセス(Saccharomyces)の種が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、実施形態131に記載の方法。
Claims (30)
- 複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の標的膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質;及び
(d)前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステム
を含み、
前記レポーター遺伝子が、(i)栄養マーカー、(ii)抗生物質耐性マーカー又は(iii)対抗選択可能なマーカーである、
酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。 - (A)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結している、又は
(B)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、
請求項1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。 - 前記ペリプラズムアンカータンパク質が、以下:
(A)前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列;又は
(B)前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)、膜にまたがる膜貫通ドメイン又はグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメイン
をさらに含む、請求項1又は2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。 - 前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結しており、かつ、前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、請求項2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- 前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合しており、かつ、前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質をペリプラズムに配置する、細胞壁の内面に結合するタンパク質である、請求項2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- 複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される前記抗体が異なり、抗体が酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への抗体の輸送を指示するシグナル配列に連結されている、前記抗体;
(b)目的の標的膜タンパク質であって、前記目的の標的膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質;及び
(c)前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステム
を含み、
前記レポーター遺伝子が、(i)栄養マーカー、(ii)抗生物質耐性マーカー又は(iii)対抗選択可能なマーカーである、
酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。 - 前記レポーター遺伝子が、以下:
(A)HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1からなる群より選択される、栄養マーカー;
(B)ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、抗生物質耐性マーカー;
(C)CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、対抗選択可能なマーカー;又は
(D)前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記減少がネガティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能である、対抗選択可能なマーカー
である、請求項1~6のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。 - 前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- 前記受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、請求項8に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- 前記GPCRが外来性GPCRであり、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが、前記外来性GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、請求項9に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- 前記GPCRが外来性GPCRであり、前記外来性GPCRが哺乳動物GPCRである、請求項9又は10に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- 酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ(Gα)サブユニットである操作されたGαサブユニットを含み、前記キメラGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む、請求項10又は11に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の抗原に結合する組み換え断片、抗原に結合するFab断片、抗原に結合するFab'断片、抗原に結合するF(ab')2断片、抗原に結合するFv断片、及び抗原に結合するscFv断片からなる群より選択される、請求項1~12のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
- (a)前記酵母宿主細胞が、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3、又はΔmat株である;又は
(b)前記酵母宿主細胞が、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含むΔmat株である、
請求項1~13のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。 - 請求項1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下:
(a)酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体をコードする第1の複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記工程;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質をコードする第2の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結するようにコードされている、前記工程;
(c)第1の複数の組み換えポリヌクレオチド及び第2の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(d)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(e)前記抗体、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、請求項1に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。 - (A)抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを、発現ベクターによって準備する;又は
(B)抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、
請求項15に記載の方法。 - 請求項2に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合しており、以下:
(a)融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が連結したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程;
(b)融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;
(c)目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程;並びに
(d)前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。 - (A)融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを発現ベクターによって準備する;又は
(B)融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる
請求項17に記載の方法。 - 前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、請求項15~18のいずれか一項に記載の方法。
- 目的の標的膜タンパク質の活性を調節する抗体について、請求項7に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、選択培地において、請求項7に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット(subset)を培養する工程;及び、前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程を含み、レポーター遺伝子の発現の増加が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を増加させることを示し、レポーター遺伝子の発現の減少が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を減少させることを示す、
前記方法。 - 目的の標的GPCRの活性を調節する抗体について、請求項10に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、培地において、請求項10に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット(subset)を培養する工程を含み、ペリプラズム空間に提示された抗体を持たない対照酵母宿主細胞と比較した、少なくとも1つの酵母宿主細胞におけるフェロモン応答の活性化又は抑制の検出が、前記少なくとも1つの酵母宿主細胞で提示された前記抗体が前記GPCRに結合し、その活性を調節することを示す、前記方法。
- 前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、請求項15~21のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む酵母宿主細胞:
(a)酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体;
(b)ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質;及び
(c)目的の標的膜タンパク質であって、目的の標的膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質;及び
(d)前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムであって、前記レポーター遺伝子が、(i)栄養マーカー、(ii)抗生物質耐性マーカー又は(iii)対抗選択可能なマーカーである、前記レポーターシステム。 - (A)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結している;又は
(B)前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、
請求項23に記載の酵母宿主細胞。 - (A)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む;
(B)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する(project into)、膜にまたがる膜貫通ドメイン又はグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)原形質膜アンカードメインを含む;
(C)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である;又は
(D)前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、
請求項23又は24に記載の酵母宿主細胞。 - 前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、請求項23~25のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
- 前記目的の標的膜タンパク質がGタンパク質共役受容体(GPCR)である受容体であり、前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、請求項23~26のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
- 前記目的の標的膜タンパク質がGタンパク質共役受容体(GPCR)である受容体であり、前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アンタゴニストの選択のための、FAR1の両方のゲノムコピーを有するFAR1株である、請求項23~27のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
- 前記目的の標的膜タンパク質がGタンパク質共役受容体(GPCR)である受容体であり、前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、請求項23~27のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
- 前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、及びヤロウイア(Yarrowia)からなる群より選択される、請求項23~29のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
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