JP7357771B2 - タンパク質生産性の向上のための個別バーコーディングシステムを導入したシグナルペプチド超高速選別方法 - Google Patents

タンパク質生産性の向上のための個別バーコーディングシステムを導入したシグナルペプチド超高速選別方法 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、様々なシグナルペプチドの中から、目的タンパク質を宿主細胞外に効率的に分泌する特定のシグナルペプチドを選別するための、バーコーディング配列を含む組成物に関する。
〔背景技術〕
全世界的に生命工学技術の発達に伴ってタンパク質の構造及び機能に関する研究が活発に行われてきており、疾病ターゲットに特異的で且つ副作用の低い治療用抗体を含む組換え医薬品市場の爆発的な成長により、既存の低分子医薬品が主導権を持っていた世界製薬市場の流れが変わり始めている。
組換えタンパク質医薬品は、遺伝子組換え技術を用いて、生体から得難い治療用タンパク質成分を微生物や動物細胞システムによって大量生産した医薬品のことを指す。組換えタンパク質は、細胞内に発現させたり細胞外に分泌されるように調節したりできる。細胞内発現時に、タンパク質の過発現によって細胞内に不活性化状態の不溶性塊りとして蓄積される場合が多く、そうでないとしても、細胞を破砕する面倒さと、細胞内に存在する多数のタンパク質と分離させるための精製工程の困難など、生産性を低下させる多い要因を提供する。これに対し、生成されたタンパク質を細胞外に分泌させる場合には、前者の場合に伴う不都合を容易に回避することができる。また、タンパク質の細胞外分泌は、転写後タンパク質の折り畳み及び修飾が正確になされた時にのみ可能であるため、治療用タンパク質の生産時に、活性化された形態の正確な３次構造を有する可溶性タンパク質を得ることができるという長所がある。したがって、組換えタンパク質を細胞外への分泌可能に生産することは、タンパク質の生産収率の側面の他、タンパク質の品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）の側面でも有利である。このため、組換えタンパク質医薬品を製造する上で、組換えタンパク質を効率的に細胞外に分泌させ得る最適化段階が重要である。
シグナルペプチドは、分泌タンパク質や膜タンパク質のＮ末端に位置して分泌性タンパク質又は膜タンパク質の標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）信号として機能するアミノ酸配列であり、現在まで知られた真核生物のシグナルペプチドの種類だけでも４千～５千余種を超えており、非常に多様である。目的タンパク質を生産するに当たって、いかなるシグナルペプチドを適用するかによって目的タンパク質の細胞外分泌率が変わることがあり、これと関連して目的タンパク質に適するシグナルペプチドを選定し、目的タンパク質細胞外分泌を最適化する研究が報告されたことがある（Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）（２０１１）４３（２）：９６－１０２，Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ Ｊａｎ １；３９１（１）：９３１－５，Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ．）。
したがって、タンパク質医薬品の開発時に、上記の４千個以上のシグナルペプチドの中から、目的タンパク質発現に最も適するシグナルペプチドを超高速でスクリーニングして目的タンパク質に導入すれば、人為的に組換えタンパク質医薬品生産量の極大化を誘導することができる。
上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に関する理解の増進のためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものとして理解してはならない。
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、目的タンパク質を細胞外に高効率で分泌させることができる、目的タンパク質の分泌に最も適するシグナルペプチドを超高速で探索する方法を見出すために鋭意努力した。その結果、特定の種類のアミノ酸を組み合わせて前記シグナルペプチド別にバーコーディング配列を作り、それをライブラリー化した後に宿主細胞で発現させ、宿主細胞の培養液を用いて目的タンパク質を定量すると、目的タンパク質を外部に効率的に分泌させることができる最適のシグナルペプチドが選別できることを確認し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、様々なシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）の中から、目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）を宿主細胞外に効率的に分泌する特定のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を選別するための組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、宿主細胞内で目的タンパク質を発現させ、宿主細胞の外部に前記目的タンパク質を分泌する特定のシグナルペプチドの選別方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記する発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面から、より明らかになる。
〔課題を解決するための手段〕
本発明の一態様によれば、本発明は、様々なシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）の中から、目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）を宿主細胞外に効率的に分泌する特定のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を選別するための組成物を提供する。
本発明者らは、目的タンパク質を細胞外に高効率で分泌させることができる、目的タンパク質の分泌に最も適するシグナルペプチドを超高速で探索する方法を見つけるために努力した結果、特定の種類のアミノ酸を組み合わせて前記シグナルペプチド別にバーコーディング配列を作り、それを目的タンパク質に適用すると、目的タンパク質を外部に効率的に分泌させることができる最適のシグナルペプチドが選別できることを発見した。
本明細書において用語“シグナルペプチド”又は“ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ”は、細胞の外部に分泌される分泌性タンパク質のＮ末端（前端）に結合して細胞膜を通過させるペプチドを意味する。前記シグナルペプチドは、通常、１０個～３０個のアミノ酸で構成されており、膜通過において特異的なプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって切断されて除去され、細胞の外部には前記分泌性タンパク質だけが分泌される。現在までは、真核細胞内に存在するシグナルペプチドだけでも合計４１３７個が知られている（Ｕｎｉｐｒｏｔ，２０１７．０６．）
細胞の外部に分泌される分泌性タンパク質ごとに固有のシグナルペプチドを有するが、これは、発現させる細胞の種類、発現したタンパク質の役割、又は適正量のタンパク質の発現のためにそれぞれの異なるシグナルペプチドを有していると予想される。
本明細書において用語“目的タンパク質”又は“ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ”は、適当な宿主細胞を用いて高効率で生産しようとするタンパク質を意味し、バイオ医薬品の開発時に、目的タンパク質に対する最適のシグナルペプチドを組換えタンパク質に導入すると、人為的に前記目的タンパク質の生産量の極大化を誘導することができる。
本発明の好ましい具現例によれば、前記組成物は、シグナルペプチドタグ（Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ，ＳＰ－ｔａｇ）を含むポリペプチド又はこれをコードする核酸分子を含む。
本明細書において用語“シグナルペプチドタグ”、“Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ”又は“ＳＰ－ｔａｇ”は、それぞれのシグナルペプチド別に異なるようにバーコードされている３個以上のアミノ酸からなっているバーコーディング配列（Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｔｅ）を含むタグであり、直接又はリンカーを用いて目的タンパク質のＣ末端（後端）に結合可能なペプチドタグを意味する。
本発明の好ましい具現例によれば、前記３個以上のアミノ酸は、Ｌ（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｐ（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、Ａ（Ａｌａｎｉｎｅ）、Ｗ（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、Ｙ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、Ｔ（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、Ｓ（Ｓｅｒｉｎｅ）、Ｅ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）及びＤ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）からなる群から選ばれるものである。
前記９種のアミノ酸のうち３個を組み合わせてコドンを作る場合、合計７２９種（９×９×９）のシグナルペプチドをバーコードでき、４個を組み合わせてコドンを作る場合に６，５６１種（９×９×９×９）、５個を組み合わせてコドンを作る場合に５９，０４９種（９×９×９×９×９）、のシグナルペプチドをバーコードできる。現在まで明らかにされた真核生物のシグナルペプチド種が４，１３７個である点を考慮すれば、前記バーコーディング配列は、好ましくは３～８個、より好ましくは３～５個がでよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、前記９種のアミノ酸のうち、同一の３個のアミノ酸を用いて構成してよい。
例えば、ＬＬＬ、ＰＰＰ、ＡＡＡ、ＷＷＷ、ＹＹＹ、ＴＴＴ、ＳＳＳ、ＥＥＥ及びＤＤＤからなる群から選ばれてよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、前記９種のアミノ酸において、２個は同一のアミノ酸を、残り１個は別のアミノ酸を用いて構成できる。
例えば、ＬＬＰ、ＰＰＡ、ＡＡＷ、ＷＷＹ、ＹＹＴ、ＴＴＳ、ＳＳＥ、ＥＥＤ及びＤＤＬのように、同一アミノ酸が連続して反復される形態で配列を構成してもよく、ＬＤＬ、ＰＥＰ、ＡＳＡ、ＷＴＷ、ＹＬＹ、ＴＰＴ、ＳＡＳ、ＥＷＥ及びＤＹＤなどのように、同一アミノ酸の間に別のアミノ酸が挿入された形態で構成してもよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、前記９種のアミノ酸において、３個をいずれも異なるアミノ酸で構成してもよい。
例えば、ＬＰＡ、ＰＡＷ、ＡＷＹ、ＷＹＴ、ＹＴＳ、ＴＳＥ、ＳＥＤ、ＥＤＬ及びＤＬＰなどのように、いずれも異なるアミノ酸が並べられた形態で配列を構成してもよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、前記９種のアミノ酸のうち、同一の４個のアミノ酸を用いて構成してもよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、前記９種のアミノ酸のうち、一部は同一のアミノ酸を、他部は異なるアミノ酸を組み合わせて４個のアミノ酸で構成してもよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、前記９種のアミノ酸のうち、同一の５個のアミノ酸を用いて構成してもよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、前記９種のアミノ酸のうち、一部は同一のアミノ酸を、他部は異なるアミノ酸を組み合わせて５個のアミノ酸で構成してもよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、下記の配列目録第１配列を含む、或いは配列目録第１配列で構成されるものである。
［Ｌ］１［Ｌ］２［Ｌ］３（配列目録第１配列）
前記配列目録第１配列において、［Ｌ］１、［Ｌ］２又は［Ｌ］３は、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されてよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、下記の配列目録第２配列を含む、或いは配列目録第２配列で構成されるものである。
［Ｌ］１［Ｌ］２［Ｌ］３［Ｌ］４（配列目録第２配列）
前記配列目録第２配列において、［Ｌ］１、［Ｌ］２、［Ｌ］３又は［Ｌ］４は、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されてよい。
本発明の好ましい具現例によれば、前記バーコーディング配列は、下記の配列目録第３配列を含む、或いは配列目録第３配列で構成されるものである。
［Ｌ］１［Ｌ］２［Ｌ］３［Ｌ］４［Ｌ］５（配列目録第３配列）
前記配列目録第３配列において、［Ｌ］１、［Ｌ］２、［Ｌ］３、［Ｌ］４又は［Ｌ］５は、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されてよい。
本発明の一実施例によれば、前記９種のアミノ酸をバーコーディング配列に選定した理由は次の通りである：
［１］まず、２０種のアミノ酸から、後述のトリプシン切断部位であるＫ及びＲを除外して１８種のアミノ酸を選定した。
［２］その後、次のような実験により、前記１８種のアミノ酸のうち、疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ）が高い又は低いＶ、Ｆ、Ｇ、Ｃ、Ｈ及びＮの６種を除外し、１２種のアミノ酸を選定した：まず、アミノ酸を１個ずつ替えながら、発現量が同一であるかどうかをＬＣ－ＭＳ分析で確認した。前記アミノ酸のうち、ＬＣ－ＭＳ分析時にＶ、Ｆ、Ｇ、Ｃ、Ｈ及びＮは、相対的に高い又は低い値が確認され、それらを除外した（しかも、前記Ｈは、Ｈｉｓタグに影響を与える可能性及び電荷変更の恐れも存在）。
［３］さらに、前記１２種のアミノ酸のうち、Ｍは、タンパク質消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）時に酸化修飾（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が発生することがあるため排除し、総１１種のアミノ酸を選定した。
［４］最後に、それらのうち類似の質量（Ｓｉｍｉｌａｒ Ｍａｓｓ）を有するＩ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｅ及びＤからはＩ及びＱを排除（Ｎは、段階［２］で排除）し、Ｌ、Ｅ及びＤだけを使用し、最終的にＬ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤの９種をバーコーディング配列にデザインした。
本発明の好ましい具現例によれば、前記シグナルペプチドタグは、タンパク質分解性切断部位（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）を前記バーコーディング配列のＮ末端（前端）にさらに含み、前記タンパク質によってバーコーディング配列が切断され得るものである。
本明細書において、用語“タンパク質分解性切断部位”又は“ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ”は、切断しようとするタンパク質又はペプチド内に含まれた部位であって、特定タンパク質が前記部位を認識し、切断しようとするタンパク質又はペプチドを切断できる部位を意味する。
当業界には様々なタンパク質分解性切断部位が知られており、好ましくは、トリプシン切断部位（ｔｒｙｐｓｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、トロンビン切断部位（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、エンテロキナーゼ切断部位（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、因子Ｘａ切断部位（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、コラゲナーゼ切断部位（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）を含むが、これに制限されない。
本発明の好ましい具現例によれば、前記タンパク質分解性切断部位は、トリプシンによって切断されるトリプシン切断部位である。
トリプシンは、Ｋ（Ｌｙｓｉｎｅ）又はＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）の傍を切断するタンパク質分解性酵素であり、前記タンパク質分解性切断部位は、Ｋ及びＲからなる群から選ばれてよい。
前記タンパク質分解性切断部位は、バーコーディング配列と直接連結されるか、或いはリンカーで連結されてよく、当業界に公知の様々なリンカーで連結されてよいが、好ましくは、Ｇ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）を用いることができる。
本発明の一実施例によれば、リンカーとしてＧを選定したが、これは、Ｋの傍にＰがあればトリプシン切断が完全になされず、また、酸性残基（Ａｃｉｄｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ）であるＤ及びＥは加水分解速度を阻害し、切断誤り（ｍｉｓｓ ｃｌｅａｖａｇｅ）が発生することがあるため、Ｐ、Ｄ及びＥは不適であり、バーコーディング配列に使用したＬ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤを除いて安定した切断を考慮したものである。
本発明の好ましい具現例によれば、前記リンカーは、１個以上のＧを含むものである。
本発明の好ましい具現例によれば、シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、宿主細胞培養液でバーコーディング配列を分離及び精製するための親和タグ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）を前記バーコーディング配列の末端にさらに含むものである。
本明細書において、用語“親和タグ”又は“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ”は、関心分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に結合して、親和タグ受容体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を用いた関心分子（例えば、バーコーディング配列）を分離及び精製するためのタグを意味し、当業界に公知の様々な親和タグを、本発明の具現に用いることができる。
前記親和タグは、Ｈｉｓ－ｔａｇ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）、ｍｙｃ－ｔａｇ、ＦＬＡＧ－ｔａｇ、ＳＵＭＯ－ｔａｇ（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｔａｇ）、ＣＹＤ－ｔａｇ（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｙｅｔ ｄｉｓｓｏｃｉａｂｌｅ ＮｏｒｐＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ）、ＨＰＣ－ｔａｇ（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｔａｇ）、ＣＢＰ－ｔａｇ（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ）及びＨＡ－ｔａｇ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｔａｇ）からなる群から選ばれてよく、好ましくは、２～１５個のヒスチジンで構成されたＨｉｓ－ｔａｇである。
また、本発明のシグナルペプチドタグは、下記の式１で表示されてよい：
＜式１＞
トリプシン切断部位 － リンカー － バーコーディング配列 － リンカー － 親和タグ － トリプシン切断部位
また、本発明のシグナルペプチドタグは、下記の式２で表示されてよい：
＜式２＞
Ｋ（Ｌｙｓｉｎｅ）又はＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ） － Ｇ（Ｇｌｙｃｉｎｅ） － バーコーディング配列 － Ｇ（Ｇｌｙｃｉｎｅ） － 親和タグ － Ｋ（Ｌｙｓｉｎｅ）又はＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）
より好ましくは、本発明のシグナルペプチドタグは、下記の式３で表示されてよい：
＜式３＞
Ｋ（Ｌｙｓｉｎｅ） － Ｇ（Ｇｌｙｃｉｎｅ） － バーコーディング配列 － Ｇ（Ｇｌｙｃｉｎｅ） － 親和タグ － Ｒ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）
ペプチドのＣ末端にトリプシン切断部位であるＲ（アルギニン）を挿入する場合に、ペプチドイオン化安定性を確保することができる。
本発明の一実施例によれば、親和タグであるＨｉｓタグの場合、末端Ｈは電荷変更の恐れがあるため、Ｃ末端にイオン化安定性の確保のためにＲ（アルギニン）を追加した。その他にも、定量性確保のために内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ）として同位体標識ペプチド（ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）を合成して進行する時にもＲ（アルギニン）を使用した（参考：１５Ｎ、１３Ｃ標識されたアルギニン残基を合成）。
本発明の好ましい具現例によれば、前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、シグナルペプチドタグのＮ末端（前端）に目的タンパク質が結合しているものである。
本発明の好ましい具現例によれば、前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、前記目的タンパク質のＮ末端（前端）にシグナルペプチドが結合しているものである。
本発明の他の態様によれば、本発明は、シグナルペプチドタグを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の核酸分子は、単離したもの又は組み換えられたものでよく、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他、対応する相補性配列も含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源泉から単離した核酸である場合に、核酸が単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドである場合に、このような手続きで生成された核酸が、単離した核酸分子として理解されてよい。単離した核酸分子は、別個の断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を表す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現する場合にポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与える場合にコーディング配列に作動可能に連結され、又はリポソーム結合部位は翻訳を促進するように配置される時にコーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーは、隣接して同一のリーディングフレーム内に存在することを意味する。ただし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲイションによって達成される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法によって使用する。
本明細書において、用語“ベクター”は、核酸配列を複製可能な細胞への導入のために核酸配列を挿入させることができ伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。
本明細書において、用語“発現ベクター”は、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含んでいるベクターを意味する。場合によっては、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列の他、ベクター及び発現ベクターには、さらに他の機能を提供する核酸配列も含まれてよい。
上記のようにシグナルペプチド別に特定のアミノ酸暗号にバーコードされたバーコーディング配列を含むシグナルペプチドタグを含むポリペプチドをコードする核酸配列を“シグナルペプチド－目的タンパク質－シグナルペプチドタグ”の形態で作製してベクターに挿入した後、これを適当な宿主細胞で発現させることができる。この場合、前記シグナルペプチドが“目的タンパク質－シグナルペプチドタグ”を宿主細胞の細胞膜に効率的に分泌する場合に、シグナルペプチドタグ内のバーコーディング配列を確認することにより、前記目的タンパク質を効率的に分泌したシグナルペプチドの種類を容易に確認することができる。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含む、宿主細胞内で目的タンパク質を発現させ、宿主細胞の外部に前記目的タンパク質を分泌する特定のシグナルペプチドの選別方法を提供する：
１）様々なシグナルペプチドに対するベクターを作製してライブラリーを構築する段階；
２）前記ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させる段階；
３）前記形質転換された宿主細胞からシグナルペプチドタグを含むポリペプチドを発現させる段階；及び
４）前記形質転換された宿主細胞の外部に分泌された、シグナルペプチドタグを含むポリペプチド、シグナルペプチドタグ、又はシグナルペプチドタグに含まれたバーコーディング配列を定量する段階。
本明細書において、用語“宿主細胞”は、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、或いはベクターによってコードされる遺伝子を発現させることができる任意の形質転換可能な生物を意味する。
本明細書において、用語“形質転換”は、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）又はトランスフォーメーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を含む意味で使われる。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されてよく、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。
本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、イースト（ｙｅａｓｔ）、動物（ＣＨＯ細胞など）、又はヒト細胞（ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＷＩ３８細胞など）を挙げることができるが、これに制限されるものではない。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の段階３）（前記形質転換された宿主細胞からシグナルペプチドタグを含むポリペプチドを発現させる段階）後に、親和タグを用いて分離及び精製する段階（段階３－１））をさらに含むことができる。
また、前記段階３）後に、前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドにトリプシンを処理する段階（段階３－２））をさらに含み、トリプシン切断によって目的タンパク質とバーコーディング配列を効率的に分離することができる。
前記段階３－１）及び３－２）は、前記段階３）後に、個別に行ってもよく、順に又は逆順に行ってもよい。
前記段階４）のシグナルペプチドタグを含むポリペプチド、シグナルペプチドタグ、又はシグナルペプチドタグに含まれたバーコーディング配列の定量は、タンパク質チップ分析、免疫測定法、リガンドバインディングアッセイ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｓｕｌｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、放射線免疫分析（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オークタロニー免疫拡散法、ロケット兔役電気泳動、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析、免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、補体固定分析法、２次元電気泳動分析、液状クロマトグラフィー－質量分析（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＬＣＭＳ）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）、及びＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）などがあるが、これに制限されるものではない。
本発明の一実施例によれば、前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチド、シグナルペプチドタグ、又はシグナルペプチドタグに含まれたバーコーディング配列の定量をそれぞれ、ウェスタンブロットで定量した場合と、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた超高速で定量した場合とを比較した。この場合、前記バーコーディング配列を用いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳで超高速で定量した場合にも、最も発現量の高い３つのシグナルペプチドがウェスタンブロットの場合と一致し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた超高速定量の効用性を検証した。
超高速ペプチド定量のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いる場合、最大２０ケアミノ酸まで含むときに定量性確保に容易である点を考慮して、前記シグナルペプチドタグの長さは総２０個アミノ酸以内であることが好ましく、より好ましくは、上記の式１で、リンカーは１～３個のアミノ酸、バーコーディング配列は３～５個のアミノ酸、親和タグは２～１０個のアミノ酸で構成して全長を２０個アミノ酸以内とすることが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用した定量に好適である。
〔発明の効果〕
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、様々なシグナルペプチドの中から、目的タンパク質を細胞外に効率的に分泌する最適のシグナルペプチドを選別するための組成物を提供する。
（ｉｉ）また、本発明は、宿主細胞内で目的タンパク質を発現させ、宿主細胞の外部に目的タンパク質を効率的に分泌する特定のシグナルペプチドの選別方法を提供する。
（ｉｉｉ）本発明の組成物及び／又は選別方法を用いると、前記シグナルペプチド別に作られたバーコーディング配列を用いて、目的タンパク質に最も適するシグナルペプチドを超高速で選別でき、組換えタンパク質の生産収率を極大化させることができる。
〔図面の簡単な説明〕
＜図１＞シグナルペプチドタグ（Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ，ＳＰ－ｔａｇ）を用いて該当のシグナルペプチドを識別する原理を示す模式図である。
＜図２＞ＳＰ－ｔａｇを用いてタンパク質生産量を増加させるシグナルペプチド選別方法の模式図である。
＜図３＞シグナルペプチド－標的タンパク質－ＳＰ－ｔａｇを発現させるベクターの構築例示を示す。
＜図４＞１２００種のシグナルペプチドとＳＰ－ｔａｇからなるライブラリー構築の例示を示す。
＜図５＞ＳＰ－ｔａｇをデザインする方法を示す。
＜図６＞アミノ酸１８種をそれぞれ有している１８種のＳＰタグ付きタンパク質発現精製結果を示す。
＜図７＞１８種のアミノ酸を一つずつ含んでいるＳＰ－ｔａｇの相対定量結果を示す。
＜図８＞１０種のシグナルペプチドベクターを用いたライブラリー作製方法検証結果を示す。
＜図９＞ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた最適シグナルペプチドスクリーニング方法検証実験を示す模式図である。
＜図１０＞ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとウェスタンブロット実験結果の比較分析結果を示す。
＜図１１＞ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとウェスタンブロット結果によるシグナルペプチドのランキング化結果を示す。
＜図１２＞９種のＳＰ－ｔａｇ発現量によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳピークのグラフを示す。
＜図１３＞ＳＰ－ｔａｇとＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いたシグナルペプチドスクリーニング結果を示す。
＜図１４＞ピーク面積（Ｐｅａｋ ａｒｅａ）及び強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による相対定量ピークの種類を示す。
＜図１５＞選別された１０種のシグナルペプチドを示す表である。
＜図１６＞試料に存在しない同位体標識ペプチドベースのグローバルスタンダードペプチド（ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ）で１６個グループのＭＲＭ分析結果を補正するための数値を示す。
＜図１７＞アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）発現に適するシグナルペプチドスクリーニング結果を示す。
＜図１８＞ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果から導出された結果のうち、上位２４種と下位２４種の個別の発現をウェスタンブロットとＯＣＴＥＴで定量して比較した結果を示す。
＜図１９＞ウェスタンブロットとＯＣＴＥＴで分析して得た２次ヒット（ｈｉｔ）に対するシグナルペプチドを示す表である。
〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
〔実施例〕
＜実験材料及び実験方法＞
１．バーコーディング配列（Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に使用されるアミノ酸の選定
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにおいて効率的で同等なイオン化及び検出のためにバーコーディング配列に使用するアミノ酸を選定した。総２０種のアミノ酸のうち、トリプシンで切断されるＫ（ｌｙｓｉｎｅ）及びＲ（アルギニン）を除く１８種のアミノ酸がそれぞれ一つずつ含まれたタグを、１種の標的タンパク質ｃ末端に融合（ｆｕｓｉｏｎ）した形態の１８種のクローンを作製した。
重複ＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）（ＳＥＴ１５－Ｒ５００，Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用いて標的遺伝子を作り、ベクターと遺伝子に制限酵素ＡｓｃＩ（Ｒ０５５８Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）／ＸｈｏＩ（Ｒ０１４６Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を処理した。ベクターとＰＣＲ産物をＤＮＡライゲイション混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）（６０２３，Ｔａｋａｒａ）と混ぜた後、常温で１０分間ライゲイションさせた後、ＤＨ５α（ＣＰ０１０，Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）に形質転換してクローニングした。１８種のプラスミドをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞（Ｒ７９００７，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に発現させ、３日後に細胞培養液を回収した。細胞培養液中の標的タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡレジン（０５８９３８０１００１，Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨｉｓ親和性クロマトグラフィー（Ｈｉｓ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分離精製した。１８種のタンパク質を１ｕｇずつ前処理後に、ＬＣ－Ｍｓ／Ｍｓで定量してピーク面積値を求めて比較した。
２．シグナルペプチドとＳＰ－ｔａｇベクターの構築
１２００種のＳＰ－ｔａｇに対するプライマーを合成し（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）、重複ＰＣＲ（ＳＥＴ１５－Ｒ５００，Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用いてＳＰ－ｔａｇ遺伝子を作製した。ベクターとＰＣＲ産物に制限酵素ＡｓｃＩ（Ｒ０５５８Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）／ＸｈｏＩ（Ｒ０１４６Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を処理し、ＤＮＡライゲイション（６０２３，Ｔａｋａｒａ）をした。ライゲイション混合物をＤＨ５α（ＣＰ０１０，Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）に形質転換してクローニングした。
３．標的タンパク質ライブラリー作製プロトコルの検証
１０種のシグナルペプチドが存在する１０種のベクターと１種の標的タンパク質遺伝子を、制限酵素ＡｓｃＩ（Ｒ０５５８Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）／ＸｈｏＩ（Ｒ０１４６Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をそれぞれ処理し、１０種のベクターとインサートをＤＮＡライゲイション（６０２３，Ｔａｋａｒａ）した。次に、ライゲイション混合物をＤＨ５α（ＣＰ０１０，Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）に形質転換してミニライブラリー（ｍｉｎｉ－ｌｉｂｒａｒｙ）を作製した。ミニライブラリーの多様性を確認するために、再形質転換（ｒｅ－ｔｒａｎｓｆｒｏｍａｔｉｏｎ）して１００個のコロニーを選別（ｐｉｃｋｉｎｇ）し、シーケンシング（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を行った。
４．シグナルペプチドスクリーニング検証
９種のＳＰ－ｔａｇが存在するベクターと１種の標的タンパク質遺伝子をそれぞれクローニングし、９種のクローンを作製した。９種を混ぜて或いは独立にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞（Ｒ７９００７，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に発現させ、３日後に細胞培養液を確保した。細胞培養液中の標的タンパク質を検出するために、抗６ｘｈｉｓ抗体（ａｂ１８１８４，Ａｂｃａｍ）を用いてウェスタンブロットを行った。また、細胞培養液をＮｉ－ＮＴＡレジン（０５８９３８０１００１，Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨｉｓ親和性クロマトグラフーを行って前処理後に、ＬＣ－Ｍｓ／Ｍｓを行ってピーク面積値を得た。ウェスタンブロット結果とＬＣ－ＭＳ／ＭＳ結果とを比較分析した。
５．多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を用いた定量
ＭＲＭは、ナノ電子噴霧インターフェースを備えたハイブリッドトリプルクォドルプル／イオントラップ質量分析機（６５００ＱＴＲＡＰ，ＡＢ ＳＣＩＥＸ，ＵＳＡ）に連結されたナノＬＣシステム（ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ Ｎａｎｏ－ＬＣ，Ｗａｔｅｒｓ）で行った。前記質量分析機を陽性イオンＭＲＭモードで作動し、Ｑ１及びＱ３は、異なる前駆体／産物イオン対を伝達するようにセッティングした。
ＬＣバッファシステムは、下記の通りである：移動相Ａ、２％アセトニトリル／０．１％ギ酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃ ＬＳ１１８－４）、及び移動相Ｂ、９８％アセトニトリル／０．１％ギ酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃ ＬＳ１２０－２１２）。ペプチドを分離して流速３００ｎｌ／ｍｉｎで４５分内に５％～９５％ Ｂで線形濃度勾配の移動相Ｂで溶出した。総ＬＣ分析時間は６０分であり、トラップ（１００Å、５μｍ、１８０μｍ×２０ｍｍ、２Ｇ、Ｖ／Ｍ、Ｃａｔ＃１８６００６５２７）と分析（１３０Å、１．７μｍ、１００μｍ×１００、Ｃａｔ＃１８６００３５４６）用カラムをそれぞれ使用した。
典型的な装備セッティングは次の通りである：イオンスプレー（ＩＳ）ボルト２．３ｋＶ、インターフェースヒーターの温度３００℃、ＧＳ１（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ ｇａｓ）セッティング１５、及びカーテンガスセッティング２０。デクラスタリング電位（ＤＰ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）ＭＳ係数は、各ペプチドの適正化された数値を線形回帰分析及びマニュアルチューニングして決定した。ＭＲＭ実験は、Ｑ１及びＱ３に対してそれぞれ０．２／０．７Ｄａ（ＦＷＨＭ）の解像度を用いて２０ｍｓのスキャニング時間、０．００２ｍ／ｚのスキャニング幅で行われた。ＭＲＭ時に、スキャニング時間は各トランジションで２０ｍｓであったし、トランジションスキャニング間のポーズは１ｍｓに合わせた。ＭＲＭトランジションは、最高強度の断片イオンをモニタリングするために選別された。
６．試料前処理（Ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）
ＭＲＭ分析のためにタンパク質を次のように処理した。試料タンパク質は、ビシンコニン酸（Ｐｉｅｒｃｅ（商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ，２３２２５）分析法で定量した。１００μｇのタンパク質試料を６Ｍウレア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＰＮ１７－１３１９－０１）、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＡＭ９８５５Ｇ）、及び３０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＰＮ Ｄ０６３２－１０Ｇ）を用いて３７℃で６０分間変性した後、５０ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＰＮ Ｉ１１４９－２５Ｇ）で室温の暗室で３０分間アルキル化した。ウレアを５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０を用いて１５倍希釈した後、トリプシン／米ぬか（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＰＮ Ｖ０５７１）を１：５０（ｗ／ｗ）の酵素対タンパク質濃度の比で添加し、３７℃で一晩培養した。
トリプシン分解は、最終濃度１％のギ酸（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆ０５０７）を添加して中止し、ＯＡＳＩＳ ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｗａｔｅｒｓ，ＰＮ ＷＡＴ０９４２２５）で塩を除去した。前記カートリッジは、使用前に０．１％ギ酸を含む３ｍｌの水及び３ｍｌのメタノールで平衡化した。使用後、３ｍｌ、０．１％ギ酸で洗浄した後、１ｍｌの６０％ ＡＣＮ、０．１％ギ酸で溶出した。溶出された試料をスピード真空で乾燥後に凍結させた。試料は、ＭＲＭ分析前に０．１％ギ酸に０．２μｇ／μｌ濃度で溶解し、使用した。
７．ＳＰ－ｔａｇデザイン
ＳＰ－ｔａｇは、切断部位（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、バーコーディング配列、ｈｉｓタグで構成される。ＳＰ－ｔａｇに使用されるアミノ酸は、最小１４から２０まで可能（ＬＣ－ＭＳ分析時に最大で２０個アミノ酸まで定量性確保可能）であり、本発明者らは、下記のような方式で１４個のアミノ酸を活用した。１４個のアミノ酸のペプチド長を維持しながら、１２００種のペプチド質量（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ）値が異なるペプチドをデザインするために、ＳＰ－Ｔａｇの役目を担うペプチドは、定量的に差異を示さないようにデザインした。
（１）バーコーディング配列選定
［１］ＭＲＭ分析のために、タンパク質ペプチドの最大長は２０個、最小長は８個ケアミノ酸とし、トリプシン切断部位であるＲ又はＫは含めなかった。すなわち、まず、２０種のアミノ酸からＫ及びＲを除き、１８種のアミノ酸を選定した。
［２］その後、下記のような実験により、前記１８種のアミノ酸のうち、疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ）が高い又は低いＶ、Ｆ、Ｇ、Ｃ、Ｈ及びＮの６種を除いて１２種のアミノ酸を選定した：まず、アミノ酸を１個ずつ替えながら、発現量が同一かどうかをＬＣ－ＭＳ分析で確認した。前記アミノ酸のうち、ＬＣ－ＭＳ分析時にＶ、Ｆ、Ｇ、Ｃ、Ｈ及びＮは、相対的に高い又は低い値が確認され、それらを除外した（しかも、前記Ｈは、Ｈｉｓタグに影響を与える可能性及び電荷変更の恐れもある。）。
［３］さらに、前記１２種のアミノ酸のうち、Ｍは、タンパク質消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）時に酸化修飾（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が発生することがあるため排除し、総１１種のアミノ酸を選定した。
［４］最後に、それらのうち類似の質量（Ｓｉｍｉｌａｒ Ｍａｓｓ）を有するＩ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｅ及びＤからはＩ及びＱを排除（Ｎは、段階［２］で排除）し、Ｌ、Ｅ及びＤだけを使用し、最終的にＬ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤの９種を用いて５桁のバーコーディング配列をデザインした。
（２）切断部位及びｈｉｓタグのデザイン
切断部位デザインとして、トリプシン切断（Ｔｒｙｐｓｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ）のために前方にリジン（Ｋ）を挿入し、ペプチドイオン化安定性と定量性の確保のためにアルギニン（Ｒ）を最後に挿入した。
また、ＫＰ、ＫＤ、ＫＥ連続配列の発生の防止のために、Ｋの後にＧを挿入したが、これは、Ｋの傍にＰがあるとトリプシン切断が完全になされず、また、酸性残基（Ａｃｉｄｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ）であるＤ及びＥは加水分解速度を阻害し、切断誤り（ｍｉｓｓ ｃｌｅａｖａｇｅ）の発生原因となるためである。また、Ｇの選定は、［１］まず、Ｐ、Ｄ、Ｅを除外し、［２］バーコーディング配列に使用したＬ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤを除外し、［３］安定した切断部位を考慮してＧを選定した。
Ｈｉｓタグは、標的タンパク質だけを分離精製するための６ｘヒスチジンタグを付けた。
＜実験結果＞
１．シグナルペプチドタグ（ＳＰ－ｔａｇ）を用いて該当のシグナルペプチドを探す方法の考案
細胞内で翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）されるタンパク質のＮ末端にあるシグナルペプチドは、タンパク質分泌に非常に重要な役割を担う。組換えタンパク質の生産時に様々なシグナルペプチドを接合させることによって細胞外分泌を促進させ、生産量を増加させることができる。本発明は、タンパク質生産に最適のシグナルペプチドを探すための超高速探索方法を考案した。タンパク質Ｎ末端にあるシグナルペプチドは細胞内で切断されるため、分泌されたタンパク質にはシグナルペプチドが存在しない。その代わりに、タンパク質Ｃ末端にシグナルペプチドタグ（ＳＰ－ｔａｇ）を付け、これを同定することにより、それに該当するシグナルペプチドを識別する方法を考案した（図１）。
タンパク質生産量を増加させるシグナルペプチドスクリーニング方法の模式図は、図２の通りである：
１）標的タンパク質ライブラリー作製：様々なシグナルペプチドと、これらに該当する異なる分子量を持つＳＰ－ｔａｇを有しているベクターに標的タンパク質をクローニングして、標的タンパク質ライブラリーを作製する。
２）標的タンパク質ライブラリー発現：標的タンパク質ライブラリーを動物細胞に形質感染させた後、数日後に細胞外に分泌されたタンパク質を含んでいる細胞培養液を集める。このとき、シグナルペプチドの種類によって分泌されたタンパク質の量が異なり、これは、各シグナルペプチドに該当するＳＰ－ｔａｇによって区分されてよい。
３）タンパク質生産量を増加させるシグナルペプチド選別：生産されたタンパク質を含んでいる細胞培養液からＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて様々なＳＰタグを同定し、相対定量を行う。相対定量値を用いて、同定したＳＰ－ｔａｇをランク付けし、該当するシグナルペプチドを識別することにより、タンパク質生産量を増加させる最適のシグナルペプチドを探すことができる。
２．シグナルペプチド及びＳＰタグを有しているライブラリー構築
シグナルペプチドとＳＰ－ｔａｇとの間に標的タンパク質を、制限酵素ＡＳＣ Ｉ－Ｘｂａ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉを用いてクローニングし、［シグナルペプチド－標的タンパク質－ＳＰ－ｔａｇ］形態を含むベクターを作製した（図３）。
また、図４に示すように、１２００種のシグナルペプチドを有しているベクターに、各シグナルペプチドに該当する１２００種のＳＰ－ｔａｇをクローニングし、ライブラリーを構築した。ライブラリー構築に使用された１２００種のシグナルペプチドは、既に知られているヒト分泌タンパク質のシグナルペプチドを使用した（表１）。
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ライブラリーを構成する１２００種のヒトシグナルペプチド
３．１２００種のシグナルペプチドが区分可能なＳＰ－ｔａｇデザイン
ＳＰ－ｔａｇは、大きく、１２００種以上の多様性を作るバーコーディング配列とヒスチジンタグからなるようにデザインした（図５）。１２００種のシグナルペプチドにそれぞれ一つずつ対応するように、アミノ酸５桁からなるバーコーディング配列を考案した。そして、その後、実験の正確度のために、細胞培養液で標的タンパク質だけを分離精製するための６ｘヒスチジンタグを付けた。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ時に、効果的なトリプシン切断のために両端にリジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）を挿入した。タンパク質－バーコーディング配列－ｈｉｓタグの間にはリンカーアミノ酸としてグリシンを挿入してデザインした。
バーコーディング配列に使用するアミノ酸を選定するために、トリプシン切断部位であるＫとＲを除外した総１８種のアミノ酸を確認した。１８種のアミノ酸を一つずつ含んでいる１８種のＳＰタグ付きタンパク質を発現精製した（図６）。
１８種のタンパク質同量をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで識別し、相対定量に適するアミノ酸を選別した（図７）。同量のタンパク質を用いた相対定量の結果、１８種のアミノ酸のうち６種（Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｃ、Ｈ及びＮ）の値は相対的に高すぎる又は低すぎるため、定量において不適であった。１２種のアミノ酸（Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｑ及びＤ）は互いにピーク面積値が類似しており、定量に影響を与えなかった。すなわち、アミノ酸の種類に関係なくその量だけでピーク面積値が定められるので、相対定量に適していると判断された。結果的に、バーコーディング配列デザインのために一次的に１２種のアミノ酸を選別した。
４．５桁バーコーディング配列をデザインし、互いに異なる分子量を持つ１２００種のＳＰ－ｔａｇライブラリーを構築
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ上で効果的な識別のために、１２００種のＳＰ－ｔａｇは互いに異なる分子量を有しなければならない。そのため、バーコーディング配列のデザイン時に、全てのシーケンス間の分子量が２以上の差を有するようにした。選別された１２種のアミノ酸のうち、ＩとＬ、Ｅ及びＱ、ＤとＮは、分子量が同一であるか、或いは約１程度の差を有するので、Ｉ、Ｑ及びＮを排除し、Ｌ、Ｅ及びＤのみを使用した。総９種のアミノ酸（Ｌ、Ｐ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｓ、Ｅ及びＤ）を用いて５桁のバーコーディング配列をデザインし、ライブラリーを構築した（表２）。
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アミノ酸５桁からなるバーコーディング配列
５．効果的な標的ライブラリー構築方法の確認
１２００種のベクターからなるライブラリーを一つずつクローニングすることができず、効果的に標的ライブラリー構築方法をテストした。１０種のシグナルペプチドを持っているベクターに、１種類の標的タンパク質遺伝子をクローニングした（表３）。同量の１０種のベクターを混合物状態にしてライゲイション－形質転換－プラスミド調製（ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐ）を行った。プラスミド中のシグナルペプチドの分布を確認するために、１００個のコロニーでそれぞれプラスミドを調製し、該当のシグナルペプチドに対するシーケンシングを行った（表４）。
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ライブラリー作製テストに用いられた１０種類のシグナルペプチド
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１００個のコロニーで調製したプラスミドシーケンシング結果
９７個のプラスミドがシーケンシングされており、１０種のＳＰ－ｔａｇが全て確認され、その分布が７～１２％と均一になっていることを確認した（図８）。効率的なライブラリー構築のために同量のベクターを混合してライブラリーを作製しても、ＳＰ－ｔａｇ種類に関係なく多様性を維持するライブラリーが構築されるということを確認した。
６．組換えタンパク質生産量を増加させるシグナルペプチドスクリーニング方法の検証
ライブラリーで発現させてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて定量する方法の効用性を検証するために、独立に発現させてウェスタンブロットで定量する方法を比較した（図９）。標的タンパク質を挿入した９種のシグナルペプチド／ＳＰ－ｔａｇクローンを混ぜて動物細胞に形質感染した後、数日後に細胞培養液に分泌されたＳＰタグタンパク質をＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて相対定量し、ランクを付けた。これと同時に、９種のＳＰ－ｔａｇベクターをそれぞれ９個の個別フラスコに独立して形質感染させた後、数日後に細胞培養液に分泌されたＳＰタグタンパク質をウェスタンブロットを用いて発現を確認し、発現量を相対比較した（図１０）。
ライブラリー発現方式を用いたＬＣ－ＭＳ／ＭＳの結果、ピークグラフから見ると、８番、１番及び５番が最も高い発現量を示し、その次は３番及び６番だった（図１０～１２）。２番、４番、７番及び９番は、発現量が顕著に低いため、ランクを付けることができなかった。そして、独立に発現させてウェスタンブロットを行った結果からは、１番、８番及び５番が発現量トップ３と確認され、７番、６番、９番、４番、３番及び２番の順に測定された（図１０及び図１１）。本発明は、タンパク質生産量を最大に増加させるシグナルペプチドを選別することが目的であるところ、２種類の実験におけるトップ３が一致する結果に照らすと、ＳＰ－ｔａｇライブラリーを用いたシグナルペプチド選別方法の効用が検証されたことを確認した。
７．ＳＰタグを用いた最適シグナルペプチド選別テスト
シグナルペプチド／ＳＰタグを含んでいるライブラリーに標的タンパク質ｈＶＥＧＦ（ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）をクローニングし、標的タンパク質ライブラリーを構築した。ライブラリーをＨＥＫ２９３細胞で発現させ、３日後に細胞培養液を集め、ｈｉｓタグを用いて、発現したタンパク質を分離精製した。タンパク質サンプルをトリプシンで処理した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いてピーク面積値を求め、ＳＰ－ｔａｇに対して相対定量を行った（図１３）。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの結果、ピークグラフから、発現の高低によってピークの高さと急さ（ｓｈａｒｐｎｅｓｓ）、ノイズ（ｎｏｉｓｅ）強度などにおいて明確な差を有することが確認できた（図１４）。発現量の高いＳＰ－ｔａｇは信号ピークで明確に区分されるのに対し、発現量の低いＳＰ－ｔａｇはノイズ信号と区分されなかった。図１３で、高い発現が確認された１０種のＳＰ－ｔａｇに該当するシグナルペプチドが選別できた（図１５）。
８．ＳＰ－ｔａｇ定量のための標準ペプチド合成
１，２００シグナルペプチドスクリーニングのためのＭＲＭ分析法の開発のために、内部標準として１，２００バーコーディング配列ベースの同位体標識ペプチド（１５Ｎ、１３Ｃ標識されたアルギニン残基を合成）を合成（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）して使用した。１，２００標準用ペプチド（内部標準）は、ＭＲＭ分析前に１００ｆｍｏｌ／μｌ濃度でタンパク質発現混合物に追加して使用し、ＭＲＭ分析時に、ＲＴ（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を通じて非特異的（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ピークとターゲット（ｔａｒｇｅｔ）ピークとを正確に区別するのに使用した。また、各グループ間の分析時に発生なる誤差を最小化するための同位体標識ペプチド（１５Ｎ、１３Ｃ標識されたリジン残基を合成）ベースのグローバルスタンダードペプチド（ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ）を合成した。グローバルスタンダードペプチドは、試料に存在しないペプチドシーケンスを使用しており、ＭＲＭ分析前に５０ｆｍｏｌ／μｌ濃度でタンパク質発現混合物に追加して使用した。
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化学的に合成したＳＰタグペプチドリスト
１０．アフリベルセプト標的ライブラリーを用いて生産量を増加させるシグナルペプチドスクリーニング
シグナルペプチド／ＳＰタグを含んでいるライブラリーに、モデル標的タンパク質としてアフリベルセプトをクローニングし、標的タンパク質ライブラリーを構築した。ライブラリーをＨＥＫ２９３細胞で発現させ、３日後に細胞培養液を集め、ｈｉｓタグを用いて発現したタンパク質を分離精製した。タンパク質サンプルを、トリプシンを処理した後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いてピーク面積値を求め、ＳＰ－ｔａｇに対して相対定量を行った。シグナルペプチドスクリーニングのためにデザインされた１，２００バーコーディングペプチドと合成された標準ペプチド１，２００個（合計で２，４００ペプチド）を効果的に分析するために、合計１６グループ（各１５０個ターゲットペプチド）に分けてＭＲＭ分析を行った。各グループ（１５０個ターゲットペプチド）は、７５個のバーコーディングペプチドと７５個の標準ペプチドで構成した。また、１６ケグループ間の差異を最小化するために、グローバルスタンダードペプチドを共に分析し、各グループ間の差を減らすための正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った（図１６）。１６個グループに対するシステム安定性を確認した結果、変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＶ）は、１７．２６％と安定的だった（図１６）。１６個グループ（バーコーディング＆標準ペプチド：２，４００個）に対してそれぞれＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析し、グローバルスタンダードで補正したピーク面積値をグラフで示し、高い値を有するものが１次ヒットとして選定された（図１７）。スクリーニングシステムを検証し、２次ヒットを選別するために、上位２４種と下位２４種に該当するプラスミドをそれぞれ個別発現（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させ、その発現量をウェスタンブロットで比較した（図１８）。定量分析のために個別発現させたサンプルをＯＣＴＥＴ装備を用いて定量し、二重で比較した（図１８）。これに基づき、高い発現が確認されたＳＰ－ｔａｇ １４種にそれぞれマッチングされるシグナルペプチド１４種を選別した（図１９）。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とその等価物によって定義されるといえよう。
シグナルペプチドタグ（Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ，ＳＰ－ｔａｇ）を用いて該当のシグナルペプチドを識別する原理を示す模式図である。 ＳＰ－ｔａｇを用いてタンパク質生産量を増加させるシグナルペプチド選別方法の模式図である。 シグナルペプチド－標的タンパク質－ＳＰ－ｔａｇを発現させるベクターの構築例示を示す。 １２００種のシグナルペプチドとＳＰ－ｔａｇからなるライブラリー構築の例示を示す。 ＳＰ－ｔａｇをデザインする方法を示す。 アミノ酸１８種をそれぞれ有している１８種のＳＰタグ付きタンパク質発現精製結果を示す。 １８種のアミノ酸を一つずつ含んでいるＳＰ－ｔａｇの相対定量結果を示す。 １０種のシグナルペプチドベクターを用いたライブラリー作製方法検証結果を示す。 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた最適シグナルペプチドスクリーニング方法検証実験を示す模式図である。 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとウェスタンブロット実験結果の比較分析結果を示す。 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとウェスタンブロット結果によるシグナルペプチドのランキング化結果を示す。 ９種のＳＰ－ｔａｇ発現量によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳピークのグラフを示す。 ＳＰ－ｔａｇとＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いたシグナルペプチドスクリーニング結果を示す。 ピーク面積（Ｐｅａｋ ａｒｅａ）及び強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による相対定量ピークの種類を示す。 選別された１０種のシグナルペプチドを示す表である。 試料に存在しない同位体標識ペプチドベースのグローバルスタンダードペプチド（ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ）で１６個グループのＭＲＭ分析結果を補正するための数値を示す。 アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）発現に適するシグナルペプチドスクリーニング結果を示す。 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果から導出された結果のうち、上位２４種と下位２４種の個別の発現をウェスタンブロットとＯＣＴＥＴで定量して比較した結果を示す。 ウェスタンブロットとＯＣＴＥＴで分析して得た２次ヒット（ｈｉｔ）に対するシグナルペプチドを示す表である。

Claims (20)

  1. 様々なシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）の中から、目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を宿主細胞外に効率的に分泌する特定のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を選別するための組成物であって、
    前記組成物は、シグナルペプチドタグ（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ，ＳＰ－ｔａｇ）を含むポリペプチド又はこれをコードする核酸分子を含み；
    前記シグナルペプチドタグは、それぞれのシグナルペプチド別に異なるようにバーコードされている３個以上のアミノ酸からなっているバーコーディング配列（Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｔｅ）を含み；
    前記３個以上のアミノ酸は、Ｌ（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｐ（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、Ａ（Ａｌａｎｉｎｅ）、Ｗ（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、Ｙ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、Ｔ（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、Ｓ（Ｓｅｒｉｎｅ）、Ｅ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）及びＤ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）からなる群から選ばれ、
    前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、前記シグナルペプチドタグのＮ末端に前記目的タンパク質が結合している、
    ことを特徴とする組成物。
  2. 前記シグナルペプチドタグは、タンパク質分解性切断部位（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）を前記バーコーディング配列のＮ末端にさらに含み、タンパク質によってバーコーディング配列が切断可能であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記タンパク質分解性切断部位は、トリプシン切断部位（ｔｒｙｐｓｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、トロンビン切断部位（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、エンテロキナーゼ切断部位（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、因子Ｘａ切断部位（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、コラゲナーゼ切断部位（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記タンパク質分解性切断部位は、トリプシン切断部位であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記トリプシン切断部位は、Ｋ（Ｌｙｓｉｎｅ）及びＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記タンパク質分解性切断部位はバーコーディング配列とリンカーで連結されていることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
  7. 前記リンカーは、１個以上のＧ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）を含むことを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、宿主細胞培養液でバーコーディング配列を分離及び精製するための親和タグ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）を、前記バーコーディング配列のＣ末端にさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記親和タグは、Ｈｉｓ－ｔａｇ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）、ｍｙｃ－ｔａｇ、ＦＬＡＧ－ｔａｇ、ＳＵＭＯ－ｔａｇ（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｔａｇ）、ＣＹＤ－ｔａｇ（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｙｅｔ ｄｉｓｓｏｃｉａｂｌｅ ＮｏｒｐＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ）、ＨＰＣ－ｔａｇ（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｔａｇ）、ＣＢＰ－ｔａｇ（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ）及びＨＡ－ｔａｇ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｔａｇ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記親和タグは、２～１５個のヒスチジンで構成されたＨｉｓ－ｔａｇであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記シグナルペプチドタグは、下記の式１で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
    ＜式１＞
    トリプシン切断部位 － リンカー － バーコーディング配列 － リンカー － 親和タグ － トリプシン切断部位
  12. 前記シグナルペプチドタグは、下記の式２で表示されることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物：
    ＜式２＞
    Ｋ（Ｌｙｓｉｎｅ）又はＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ） － Ｇ（Ｇｌｙｃｉｎｅ） － バーコーディング配列 － Ｇ（Ｇｌｙｃｉｎｅ） － 親和タグ － Ｋ（Ｌｙｓｉｎｅ）又はＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）
  13. 前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、前記目的タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドが結合していることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  14. 様々なシグナルペプチドの中から、目的タンパク質を宿主細胞外に効率的に分泌する特定のシグナルペプチドを選別するためのシグナルペプチドタグを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターであって、
    前記シグナルペプチドタグは、それぞれのシグナルペプチド別に異なるようにバーコードされている３個以上のアミノ酸からなっているバーコーディング配列を含み；
    前記３個以上のアミノ酸は、Ｌ（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｐ（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、Ａ（Ａｌａｎｉｎｅ）、Ｗ（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、Ｙ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、Ｔ（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、Ｓ（Ｓｅｒｉｎｅ）、Ｅ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）及びＤ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）からなる群から選ばれ、
    前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、前記シグナルペプチドタグのＮ末端に前記目的タンパク質が結合している、
    ベクター。
  15. 前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドは、前記目的タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドが結合していることを特徴とする、請求項１４に記載のベクター。
  16. 下記の段階を含む、宿主細胞内で目的タンパク質を発現させ、宿主細胞の外部に前記目的タンパク質を分泌する特定のシグナルペプチドの選別方法：
    １）様々なシグナルペプチドに対する請求項１４又は１５のベクターを作製して、ライブラリーを構築する段階；
    ２）前記ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させる段階；
    ３）前記形質転換された宿主細胞からシグナルペプチドタグを含むポリペプチドを発現させる段階；及び
    ４）前記形質転換された宿主細胞の外部に分泌されたシグナルペプチドタグを含むポリペプチド、シグナルペプチドタグ、又はシグナルペプチドタグに含まれたバーコーディング配列を定量する段階。
  17. 前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＤＣＫ細胞、及びＷＩ３８細胞からなる群から選ばれる細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の選別方法。
  18. 前記段階３）は、シグナルペプチドタグを含むポリペプチドを発現させた後、親和タグを用いて分離及び精製する段階（段階３－１））をさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載の選別方法。
  19. 前記段階３）は、前記シグナルペプチドタグを含むポリペプチドにトリプシンを処理する段階（段階３－２））をさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載の選別方法。
  20. 前記段階４）は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて定量することを特徴とする、請求項１６に記載の選別方法。
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