KR102406463B1 - 단백질 생산성 향상을 위한 개별 바코딩 시스템 도입한 시그널 펩타이드 초고속 선별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 중에서 목적 단백질을 세포 밖으로 효율적으로 분비하는 최적의 시그널 펩타이드를 선별하기 위한 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 목적 단백질을 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및/또는 선별방법을 이용하면, 상기 시그널 펩타이드 별로 만들어진 바코딩 서열을 통해 목적 단백질에 최적인 시그널 펩타이드를 초고속으로 선별할 수 있어 재조합 단백질의 생산 수율을 극대화 할 수 있다.
Description
본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 중에서 목적 단백질을 숙주 세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드를 선별하기 위한, 바코딩 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 재조합 의약품 시장의 폭발적인 성장을 통해 기존의 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약시장의 판권이 뒤집히고 있다.
재조합 단백질 의약품은 유전자 재조합 기술을 이용하여 생체에서 얻기 힘든 치료용 단백질 성분을 미생물이나 동물세포시스템을 통해 대량생산한 의약품을 말한다. 재조합 단백질은 세포 내에 발현시키거나 세포 외로 분비되도록 조절할 수 있다. 세포 내 발현 시 단백질의 과발현으로 인하여 세포 내에 비활성화 상태의 불용성 덩어리로 축적되는 경우가 많으며, 그렇지 않다 하더라도 세포를 파쇄하는 번거로움과 세포 내에 존재하는 수많은 단백질들과 분리하기 위한 정제공정의 어려움 등 생산성을 저하시키는 많은 요인들을 제공한다. 반면에 생성된 단백질을 세포 외로 분비시킬 경우 전자의 경우에 따르는 어려움을 쉽게 회피할 수 있다. 또한 단백질의 세포외 분비는 전사 후 단백질의 접힘 및 수식이 정확하게 이루어졌을 때만 가능하므로 치료용 단백질의 생산 시 활성화된 형태의 정확한 3차 구조를 가진 가용성 단백질을 얻을 수 있는 장점이 있다. 따라서 재조합 단백질을 세포 외로 분비될 수 있도록 생산하는 것은 단백질의 생산수율 측면뿐만 아니라 단백질의 품질관리(quality control) 측면에서도 유리하다. 그러므로 재조합 단백질 의약품을 제조하는 데에 있어, 재조합 단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 최적화 단계가 중요하다.
시그널 펩타이드는 분비 단백질이나 막단백질의 N 말단에 위치하여 분비성 단백질 또는 막 단백질의 표적화 (targeting) 신호로 기능하는 아미노산 서열로, 현재까지 알려진 진핵생물의 시그널 펩타이드의 종류만 4~ 5천여 가지로 매우 다양하다. 목적 단백질을 생산함에 있어서, 어떠한 시그널 펩타이드를 적용하느냐에 따라 목적 단백질의 세포외 분비율이 달라질 수 있으며, 이와 관련하여 목적 단백질에 맞는 시그널 펩타이드를 선정하여 목적 단백질 세포외 분비를 최적화하는 연구가 보고된 바 있다 (Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2011) 43 (2): 96-102, Signal peptide replacements enhance expression and secretion of hepatitis C virus envelope glycoproteins. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Jan 1;391(1):931-5, Signal peptide design for improving recombinant protein secretion in the baculovirus expression vector system.).
따라서, 단백질 의약품 개발시 상기 4천개 이상의 시그널 펩타이드 중 목적 단백질 발현에 가장 적합한 시그널 펩타이드를 초고속으로 스크리닝하여 목적 단백질에 도입한다면 인위적으로 재조합 단백질 의약품 생산량의 극대화를 유도할 수 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 목적 단백질을 세포 외로 고효율로 분비시킬 수 있는, 목적단백질의 분비에 가장 적합한 시그널 펩타이드를 초고속으로 탐색하는 방법을 찾고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 특정한 종류의 아미노산을 조합하여 상기 시그널 펩타이드 별로 바코딩 서열을 만들어 이를 라이브러리화 한 후 숙주세포에서 발현시키고 숙주세포의 배양액을 이용하여 목적 단백질을 정량하면, 목적 단백질을 외부로 효율적으로 분비시킬 수 있는 최적의 시그널 펩타이드를 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다양한 시그널 펩타이드 (signal peptide) 중에서 목적 단백질 (target peptide)을 숙주세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드 (signal peptide)를 선별하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 상기 목적 단백질을 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 (signal peptide) 중에서 목적 단백질 (target peptide)을 숙주세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드 (signal peptide)를 선별하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 목적 단백질을 세포 외로 고효율로 분비시킬 수 있는, 목적단백질의 분비에 가장 적합한 시그널 펩타이드를 초고속으로 탐색하는 방법을 찾고자 노력한 결과, 특정한 종류의 아미노산을 조합하여 상기 시그널 펩타이드 별로 바코딩 서열을 만들어 이를 목적 단백질에 적용할 경우, 목적 단백질을 외부로 효율적으로 분비시킬 수 있는 최적의 시그널 펩타이드를 선별할 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "시그널 펩타이드" 또는 "signal peptide"는 세포 외부로 분비되는 분비성 단백질의 N 말단 (전단)에 결합되어 세포막을 통과시키는 펩타이드를 의미한다. 상기 시그널 펩타이드는 보통 10 내지 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 막통과에 있어 특이적인 protease에 의해 절단되어 제거되며, 세포 외부로는 상기 분비성 단백질만이 분비되게 된다. 현재까지 알려진 바로는 진핵세포 내에 존재하는 시그널 펩타이드만도 총 4137개가 알려져 있다 (Uniprot, 2017.06.)
세포 외부로 분비되는 분비성 단백질마다 고유의 시그널 펩타이드를 가지고 있는데, 이는 발현하는 세포의 종류, 발현된 단백질의 역할, 또는 적정량의 단백질의 발현을 위해서 각각의 다른 시그널 펩타이드를 가지고 있는 것으로 예상되고 있다.
본 명세서에서 용어 "목적 단백질" 또는 "target protein"은 적당한 숙주세포를 이용하여 이를 고효율로 생산하고자 하는 단백질을 의미하며, 바이오 의약품의 개발시 목적 단백질에 대한 최적의 시그널 펩타이드를 재조합 단백질에 도입한다면 인위적으로 상기 목적 단백질 생산량의 극대화를 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 시그널 펩타이드 태그(Signal peptide tag, SP-tag)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "시그널 펩타이드 태그", "Signal peptide tag" 또는 "SP-tag"는 각각의 시그널 펩타이드 별로 다르게 바코딩 되어 있는 3개 이상의 아미노산으로 이루어져 있는 바코딩 서열 (Barcoding sequence site)을 포함하는 태그로서, 직접 또는 링커를 활용하여 목적 단백질의 C 말단 (후단)에 결합될 수 있는 펩타이드 태그를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 3개 이상의 아미노산은 L(Leucine), P(Proline), A(Alanine), W(Tryptophan), Y(Tyrosine), T(Threonine), S(Serine), E(Glutamate) 및 D(Aspartate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 9가지 아미노산 중 3개를 조합하여 코돈을 만들 경우, 총 729가지(9x9x9)의 시그널 펩타이드를 바코딩 할 수 있으며, 4개를 조합하여 코돈을 만들 경우 6,561가지(9x9x9x9), 5개를 조합하여 코돈을 만들 경우 59,049가지(9x9x9x9x9)의 시그널 펩타이드를 바코딩 할 수 있다. 현재까지 밝혀진 진핵생물의 시그널 펩타이드 종류가 4,137개인 점을 고려하면 상기 바코딩 서열은 바람직하게는 3 내지 8개, 보다 바람직하게는 3 내지 5개가 적합하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 동일한 3개의 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
예를 들어, LLL, PPP, AAA, WWW, YYY, TTT, SSS, EEE 및 DDD로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 2개는 동일한 아미노산을, 다른 1개는 다른 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
예를 들어, LLP, PPA, AAW, WWY, YYT, TTS, SSE, EED 및 DDL과 같이 동일한 아미노산이 연속해서 반복되는 형태로 서열을 구성하거나, LDL, PEP, ASA, WTW, YLY, TPT, SAS, EWE 및 DYD 등과 같이 동일한 아미노산 사이에 다른 아미노산이 삽입된 형태로 구성할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 3가지 모두 다른 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
예를 들어, LPA, PAW, AWY, WYT, YTS, TSE, SED, EDL 및 DLP 등과 같이 서로 다른 아미노산이 나열된 형태로 서열을 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 동일한 4개의 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 일부는 동일한 아미노산을, 일부는 다른 아미노산을 서로 조합하여 4개의 아미노산으로 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 동일한 5개의 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 일부는 동일한 아미노산을, 일부는 다른 아미노산을 서로 조합하여 5개의 아미노산으로 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 하기의 서열목록 제1서열을 포함하거나, 서열목록 제1서열로 구성되는 것이다.
[L]1[L]2[L]3 (서열목록 제1서열)
상기 서열목록 제1서열에 있어서 [L]1, [L]2 또는 [L]3는 P, A, W, Y, T, S, E 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 하기의 서열목록 제2서열을 포함하거나, 서열목록 제2서열로 구성되는 것이다.
[L]1[L]2[L]3[L]4 (서열목록 제2서열)
상기 서열목록 제2서열에 있어서 [L]1, [L]2, [L]3 또는 [L]4는 P, A, W, Y, T, S, E 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 하기의 서열목록 제3서열을 포함하거나, 서열목록 제3서열로 구성되는 것이다.
[L]1[L]2[L]3[L]4[L]5 (서열목록 제3서열)
상기 서열목록 제3서열에 있어서 [L]1, [L]2, [L]3, [L]4 또는 [L]5는 P, A, W, Y, T, S, E 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 9가지의 아미노산을 바코딩 서열로 선정한 이유는 다음과 같다:
① 먼저 20 종의 아미노산에서 후술하는 트립신 절단 부위인 K 및 R을 제외하여 18종의 아미노산을 선정하였다.
② 이후, 아래와 같은 실험을 통해 상기 18종의 아미노산 중 소수성 지표(hydropathy index)가 높거나 낮은 V, F, G, C, H 및 N의 6종을 제외하여 12종의 아미노산을 선정하였다: 먼저 아미노산을 1개씩 다르게 하여 LC-MS 분석을 통해 발현량이 동일한지 확인을 하였다. 상기 아미노산들 중 LC-MS 분석 시 V, F, G, C, H 및 N의 경우 상대적으로 높거나 낮은 값이 확인이 되어 이를 제외하였다 (또한, 상기 H는 His tag에 영향을 줄 가능성 및 전하 변경의 우려도 존재함).
③ 추가적으로, 상기 12종의 아미노산 중 M은 단백질 digestion시 oxidation modification이 발생할 수 있어서 배제하여 총 11종의 아미노산을 선정하였다.
④ 마지막으로, 이들 중 유사한 질량 (Similar Mass)을 갖는 I, Q, N, L, E 및 D 중에서는 I 및 Q를 배제 (N은 단계 ②에서 배제)하고 L, E 및 D 만 사용하여 최종적으로 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D의 9종을 바코팅 시퀀스로 디자인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그는 단백질 분해성 절단 부위 (proteolytic cleavage site)를 상기 바코딩 서열의 N 말단 (전단)에 추가적으로 포함하여, 상기 단백질에 의해 바코딩 서열이 절단될 수 있는 것이다.
본 명세서에서 용어 "단백질 분해성 절단 부위" 또는 "proteolytic cleavage site"는 절단하고자 하는 단백질 또는 펩타이드 내에 포함된 부위로서, 특정 단백질이 상기 부위를 인식하여 절단하고자 하는 단백질 또는 펩타이드를 절단할 수 있는 부위를 의미한다.
당업계에는 다양한 단백질 분해성 절단 부위가 알려져 있으며, 바람직하게는 트립신 절단 부위 (trypsin cleavage site), 트롬빈 절단 부위 (thrombin cleavage site), 엔터로키나아제 절단 부위 (enterokinase cleavage site), 인자 Xa 절단 부위 (Factor Xa cleavage site), 콜라게나아제 절단 부위 (collagenase cleavage site) 및 TEV 프로테아제 절단부위 (TEV protease cleavage site)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 트립신에 의해 절단되는 트립신 절단 부위인 것이다.
트립신은 K(Lysine) 또는 R(Arginine) 옆을 절단하는 단백질 분해성 효소로서, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 K 및 R로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 단백질 분해성 절단 부위는 바코딩 서열과 직접 연결되거나 링커로 연결될 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 링커로 연결될 수 있으나, 바람직하게는 G(Glycine)을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 링커로서 G를 선정하였는데, 이는 K 옆에 P가 있으면 트립신 절단이 완벽히 이루어지지 않으며, 산성 잔기 (Acidic residue)인 D 및 E의 경우 가수 분해 속도를 저해하여 절단 오류 (miss cleavage)가 발생될 수 있기 때문에 P, D 및 E는 부적합하며, 바코딩 서열로 사용한 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D를 제외하여 안정적 절단을 고려한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 링커는 1개 이상의 G를 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 숙주세포 배양액에서 바코딩 서열을 분리 및 정제하기 위한 친화-태그 (Affinity tag)를 상기 바코딩 서열 말단에 추가적으로 포함하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "친화-태그" 또는 "Affinity tag"는 관심 분자(molecule of interest)에 결합되어, 친화 태그 수용체 (affinity tag receptor)를 이용한 관심 분자 (예를 들어, 바코딩 서열)를 분리 및 정제하기 위한 태그를 의미하며, 당업계에 공지된 다양한 친화-태그를 본 발명의 구현에 이용할 수 있다.
상기 친화-태그는 His-tag (Histidine tag), myc-tag, FLAG-tag, SUMO-tag (small ubiquitin-like modifier tag), CYD-tag (covalent yet dissociable NorpD peptide tag), HPC-tag (heavy chain of protein C tag), CBP-tag (calmodulin binding peptide tag) 및 HA-tag (hemagglutinin-tag)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 15개의 히스티딘으로 구성된 His-tag인 것이다.
또한, 본 발명의 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 1로 표시될 수 있다:
<식 1>
트립신 절단 부위 - 링커 - 바코딩 서열 - 링커 - 친화 태그 - 트립신 절단 부위.
또한, 본 발명의 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 2로 표시될 수 있다:
<식 2>
K(Lysine) 또는 R(Arginine) - G(Glycine) - 바코딩 서열 - G(Glycine) - 친화 태그 - K(Lysine) 또는 R(Arginine).
보다 바람직하게는 본 발명의 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 3으로 표시될 수 있다:
<식 3>
K(Lysine) - G(Glycine) - 바코딩 서열 - G(Glycine) - 친화 태그 - R(Arginine).
펩타이드의 C 말단에 트립신 절단부위인 R(아르기닌)을 삽입할 경우 펩타이드 이온화 안정성을 확보할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 친화-태그인 His tag의 경우, 말단 H는 전하 변경의 우려가 있어, C 말단에 이온화 안정성 확보를 위해 R(아르기닌)을 추가 하였다. 이외에도, 정량성 확보를 위해 internal standard로 isotope labeled peptide를 합성하여 진행시에도 R (아르기닌)을 사용하였다(참고: 15N, 13C 표지된 아르기닌 잔기를 합성).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드 태그의 N 말단(전단)에 목적 단백질이 결합되어 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 상기 목적 단백질의 N 말단(전단)에 시그널 펩타이드가 결합되어 있는 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. "단리된 핵산"은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다 (Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
상기와 같이 시그널 펩타이드 별로 특정한 아미노산 암호로 바코딩된 바코딩 서열을 포함하는 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산서열을 "시그널 펩타이드-목적 단백질-시그널 펩타이드 태그" 형태로 제작하여 벡터에 삽입한 후 이를 적당한 숙주세포에서 발현 시킬 수 있다. 이 경우, 상기 시그널 펩타이드가 "목적 단백질-시그널 펩타이드 태그"를 숙주세포의 세포막으로 효율적으로 분비할 경우, 시그널 펩타이드 태그 내의 바코딩 서열을 확인함으로써 상기 목적단백질을 효율적으로 분비한 시그널 펩타이드의 종류를 손쉽게 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 상기 목적 단백질을 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법을 제공한다:
1) 다양한 시그널 펩타이드에 대한 벡터를 제작하여 라이브러리를 구축하는 단계;
2) 상기 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환 시키는 단계;
3) 상기 형질전환된 숙주세포로부터 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
4) 상기 형질전환된 숙주세포 외부로 분비된 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열을 정량하는 단계.
본 명세서에서 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “형질전환”은 형질감염 (transfection), 형질도입 (transduction) 또는 형질전환 (transformation)을 포함하는 의미로 사용된다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염 (transfected), 형질도입 (transduced) 또는 형질전환 (transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균 (bacteria)세포, 이스트 (yeast), 동물 (CHO 세포 등) 또는 인간 세포 (HeLa 세포, HEK293 세포, BHK 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포, MDCK 세포, WI38 세포 등)을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 단계 3) (상기 형질전환된 숙주세포로부터 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시키는 단계) 이후에, 친화 태그를 이용하여 분리 및 정제하는 단계(단계 3-1))를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 3) 이후에, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드에 트립신을 처리하는 단계(단계 3-2))를 추가적으로 포함하여, 트립신 절단에 의해 목적 단백질과 바코딩 서열을 효율적으로 분리할 수 있다.
상기 단계 3-1) 및 3-2)은 상기 단계 3) 이후, 개별로 실시하거나 순서대로 또는 역순으로 실시할 수 있다.
상기 단계 4)의 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열의 정량은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선면역분석 (radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학 (immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학 (immunocytochemistry) 분석, 면역침강법 (immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블롯 (western blot), 및 ELISA (enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열의 정량을 각각 웨스턴 블롯으로 정량한 경우와 LC-MS/MS를 이용한 초고속으로 정량한 경우를 비교하여 보았다. 이 경우 상기 바코딩 서열을 이용하여 LC-MS/MS로 초고속으로 정량한 경우에도 가장 발현량이 높은 3가지의 시그널 펩타이드가 웨스턴 블롯의 경우와 일치하여, LC-MS/MS를 이용한 초고속으로 정량의 효용성을 검증하였다.
초고속 펩타이드 정량을 위해 LC-MS/MS를 이용하는 경우, 최대 20개 아미노산까지 포함하는 경우 정량성 확보에 용이한 점을 고려하여, 상기 시그널 펩타이드 태그의 길이는 총 20개 아미노산 이내인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 하기 식 1에서 링커는 1-3개의 아미노산, 바코딩 서열은 3-5개의 아미노산, 친화 태그는 2 내지 10개의 아미노산으로 구성하여 전체 길이를 20개 아미노산 이내로 구성하는 것이 LC-MS/MS를 이용한 정량에 적합하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 중에서 목적 단백질을 세포 밖으로 효율적으로 분비하는 최적의 시그널 펩타이드를 선별하기 위한 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 목적 단백질을 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물 및/또는 선별방법을 이용하면, 상기 시그널 펩타이드 별로 만들어진 바코딩 서열을 통해 목적 단백질에 최적인 시그널 펩타이드를 초고속으로 선별할 수 있어 재조합 단백질의 생산 수율을 극대화 할 수 있다.
도 1은 Signal peptide tag (SP-tag)을 이용하여 해당 signal peptide를 식별하는 원리에 대한 모식도이다.
도 2는 SP-tag을 이용하여 단백질 생산량을 증가시키는 signal peptide 선별 방법 모식도를 나타낸다.
도 3은 signal peptide-표적 단백질-SP-tag을 발현하는 벡터의 구축 예시를 나타낸다.
도 4는 1200종의 Signal peptide와 SP-tag으로 이루어진 라이브러리 구축한예시를 나타낸다.
도 5는 SP-tag를 디자인하는 방법을 나타낸다.
도 6은 아미노산 18종을 각각 가지고 있는 18종 SP-tagging 단백질 발현 정제 결과를 나타낸다.
도 7은 18종의 아미노산을 하나씩 포함한 SP-tag의 상대정량 결과를 나타낸다.
도 8은 10종류의 signal peptide 벡터들을 이용한 라이브러리 제작 방법 검증 결과를 나타낸다.
도 9는 LC-MS/MS를 이용한 optimal signal peptide 스크리닝 방법 검증 실험 모식도를 나타낸다.
도 10은 LC-MS/MS와 western blot 실험 결과 비교 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 LC-MS/MS와 western blot 결과를 통한 signal peptide 랭킹화 결과를 나타낸다.
도 12는 9종의 SP-tag 발현량에 따른 LC-MS/MS peak 그래프를 나타낸다.
도 13은 SP-tag과 LC-MS/MS를 이용한 signal peptide 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 14는 Peak area와 intensity에 따른 상대 정량 peak 종류를 나타낸다.
도 15는 선별된 10종의 signal peptide를 나타내는 표이다.
도 16은 시료에 존재하지 않는 isotope labeled peptide 기반의 글로벌 스탠다드 펩타이드 (EQVTNVGGAVVTGVTAVAQK)로 16개 그룹의 MRM 분석결과를 보정하기 위한 수치를 나타낸다.
도 17은 Aflibercept 발현에 적합한 signal peptide 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 18은 LC-MS/MS 분석 결과에서 도출된 결과중 상위 24종과 하위 24종의 individual 발현을 western blot과 OCTET으로 정량하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 19는 western blot과 OCTET으로 분석하여 얻은 2차 hit에 대한 signal peptide를 나타내는 표이다.
도 2는 SP-tag을 이용하여 단백질 생산량을 증가시키는 signal peptide 선별 방법 모식도를 나타낸다.
도 3은 signal peptide-표적 단백질-SP-tag을 발현하는 벡터의 구축 예시를 나타낸다.
도 4는 1200종의 Signal peptide와 SP-tag으로 이루어진 라이브러리 구축한예시를 나타낸다.
도 5는 SP-tag를 디자인하는 방법을 나타낸다.
도 6은 아미노산 18종을 각각 가지고 있는 18종 SP-tagging 단백질 발현 정제 결과를 나타낸다.
도 7은 18종의 아미노산을 하나씩 포함한 SP-tag의 상대정량 결과를 나타낸다.
도 8은 10종류의 signal peptide 벡터들을 이용한 라이브러리 제작 방법 검증 결과를 나타낸다.
도 9는 LC-MS/MS를 이용한 optimal signal peptide 스크리닝 방법 검증 실험 모식도를 나타낸다.
도 10은 LC-MS/MS와 western blot 실험 결과 비교 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 LC-MS/MS와 western blot 결과를 통한 signal peptide 랭킹화 결과를 나타낸다.
도 12는 9종의 SP-tag 발현량에 따른 LC-MS/MS peak 그래프를 나타낸다.
도 13은 SP-tag과 LC-MS/MS를 이용한 signal peptide 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 14는 Peak area와 intensity에 따른 상대 정량 peak 종류를 나타낸다.
도 15는 선별된 10종의 signal peptide를 나타내는 표이다.
도 16은 시료에 존재하지 않는 isotope labeled peptide 기반의 글로벌 스탠다드 펩타이드 (EQVTNVGGAVVTGVTAVAQK)로 16개 그룹의 MRM 분석결과를 보정하기 위한 수치를 나타낸다.
도 17은 Aflibercept 발현에 적합한 signal peptide 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 18은 LC-MS/MS 분석 결과에서 도출된 결과중 상위 24종과 하위 24종의 individual 발현을 western blot과 OCTET으로 정량하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 19는 western blot과 OCTET으로 분석하여 얻은 2차 hit에 대한 signal peptide를 나타내는 표이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
1. Barcoding sequence 에 사용될 아미노산 선정
LC-MS/MS에서 효율적이고 동등한 이온화 및 검출을 위해 barcoding sequence로 사용할 아미노산을 선정하였다. 총 20종의 아미노산 중 trypsin에 절단되는 K(라이신)와 R(아르기닌)을 제외한 18종의 아미노산이 각각 하나씩 포함된 tag을 한 종의 표적단백질 c-terminal에 fusion된 형태의 18종의 clone들을 제작하였다.
Overlapping PCR (SET15-R500, Solgent)을 이용해 표적유전자를 만들고 vector와 유전자에 제한 효소 AscI (R0558S, New England Biolabs) / XhoI (R0146S, New England Biolabs)을 처리하였다. Vector와 PCR product를 DNA ligation mixture (6023, Takara)와 섞은 후 상온에서 10분간 ligation 시킨 후 DH5α (CP010, Enzynomics)에 transformation하여 클로닝 하였다. 18종의 plasmid를 FreeStyle 293-F 세포 (R79007, ThermoFisher Scientific)에 발현시켰고 3일 후 세포배양액을 수거하였다. 세포배양액에 있는 표적단백질을 Ni-NTA resin (05893801001, Roche)을 이용해 His affinity chromatography로 분리 정제하였다. 18종의 단백질 1 ug 씩 전처리 후 LC-Ms/Ms로 정량하여 peak area 값을 구하고 비교하였다.
2. Signal peptide와 SP-tag vector 구축
1200종의 SP-tag에 대한 primer를 합성하였고 (Cosmogenetech, Republic of Korea) Overlapping PCR (SET15-R500, Solgent)을 이용해 SP-tag 유전자를 제작하였다. Vector와 PCR product에 제한효소 AscI (R0558S, New England Biolabs) / XhoI (R0146S, New England Biolabs)을 처리하고 DNA ligation (6023, Takara)을 하였다. Ligation mixture를 DH5α (CP010, Enzynomics) 에 transformation하여 클로닝 하였다.
3. 표적 단백질 라이브러리 제작 protocol 검증
10종의 signal peptide가 있는 10종 vector들과 1종 표적단백질 유전자를 제한효소 AscI (R0558S, New England Biolabs) / XhoI (R0146S, New England Biolabs)을 각각 처리하고 10종의 vector와 insert를 DNA ligation (6023, Takara) 하였다. 다음 ligation mixture를 DH5α (CP010, Enzynomics)에 transformation하여 mini-library를 제작하였다. Mini-library의 다양성을 확인하기 위해 re-transfromation하여 100개의 colony를 picking 하여 sequencing (Solgent, Republic of Korea) 진행하였다.
4. Signal peptide screening 검증
9종의 SP-tag이 있는 vector들과 1종 표적단백질 유전자를 각각 클로닝하여 9종의 clones을 제작하였다. 9종을 섞어서 혹은 독립적으로 FreeStyle 293-F 세포 (R79007, ThermoFisher Scientific)에 발현시키고 3일 후 세포 배양액을 확보하였다. 세포 배양액에 있는 표적단백질을 검출하기 위해 anti-6 x his antibody (ab18184, Abcam)를 이용해 western blot을 진행하였다. 또한 세포 배양액을 Ni-NTA resin (05893801001, Roche)을 이용해 His affinity chromatograpy를 진행하여 전처리 후 LC-Ms/Ms를 실시하여 peak area 값을 얻었다. Western blot 결과와 LC-MS/MS결과를 비교 분석하였다.
5. 다중반응 모니터링 (MRM : Multiple reaction monitoring)을 이용한 정량
MRM은 나노전자분무 인터페이스를 갖춘 하이브리드 트리플 쿼드러플/이온 트랩 질량 분석기 (6500QTRAP, AB SCIEX, USA)에 연결된 나노 LC 시스템(nanoACQUITY UPLC System Nano-LC, Waters)에서 수행하였다. 상기 질량분석기를 양성 이온 MRM 모드에서 작동하였으며, Q1 and Q3는 상이한 전구체/산물 이온쌍을 전달하도록 세팅하였다.
LC 버퍼 시스템은 하기와 같다: 이동상 A, 2% 아세토니트릴/0.1% 포름산 (Fisher Scientific, Cat# LS118-4) 및 이동상 B, 98% 아세토니트릴/0.1% 포름산 (Fisher Scientific, Cat# LS120-212). 펩타이드를 분리하여 유속 300 nl/min로 45분 내에 5% 내지 95% B로 선형 농도 구배의 이동상 B에서 용출하였다. 총 LC 분석 시간은 60분이었으며, 트랩 (100Å, 5 μm, 180 μm x 20 mm, 2G, V/M, Cat# 186006527)과 분석 (130Å, 1.7 μm, 100 μm X 100, Cat# 186003546)용 컬럼을 각각 사용하였다.
전형적인 장비 세팅은 다음과 같다: 이온스프레이(IS) 볼트 2.3 kV, 인터페이스 히터의 온도 300℃, GS1 (nebulizer gas) 셋팅 15, 및 커튼 가스 셋팅 20. 디클러스터링 전위 (DP) 및 충돌 에너지 (CE) MS 계수는 각 펩타이드의 적정화된 수치를 선형 회귀분석 및 매뉴얼 튜닝 하여 결정하였다. MRM 실험은 Q1 and Q3에 대하여 각각 0.2/0.7 Da (FWHM)의 해상도를 이용하여 20 ms의 스캐닝 시간 0.002 m/z의 스캐닝 폭으로 수행되었다. MRM 수행 시 스캐닝 시간은 각 트랜지션에서 20 ms이었고, 트랜지션 스캐닝 간의 퍼즈는 1 ms로 맞추었다. MRM 트랜지션은 최고 강도의 단편 이온을 모니터링 하기 위해 선별되었다.
6. 시료전처리 (In solution digestion)
MRM 분석을 위해 단백질을 다음과 같이 처리하였다. 시료 단백질은 비씨코닌산 (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo ScientificTM, 23225) 분석법으로 정량하였다. 100 μg의 단백질 시료를 6 M urea (GE Healthcare, PN 17-1319-01), 50 mM Tris, pH 8.0 (Invitrogen, AM9855G), 및 30 mM dithiothreitol (DTT, Sigma-Aldrich, PN D0632-10G)를 이용하여 37℃에서 60분간 변성한 후 50 mM iodoacetamide (IAA, Sigma-Aldrich, PN I1149-25G)로 실온의 암실에서 30분간 알킬화 하였다. 우레아를 50 mM Tris, pH 8.0를 이용하여 15배 희석한 후 트립신/라이스씨(Promega, PN V0571)을 1:50 (w/w)의 효소 대 단백질 농도의 비로 첨가하여 37℃에서 Overnight 배양하였다.
트립신 분해는 최종농도 1%의 포름산 (SIGMA Aldrich, F0507) 을 첨가하여 중지하였으며, OASIS cartridges (Waters, PN WAT094225)에서 염을 제거하였다. 상기 카트리지는 사용 전에 0.1% 포름산을 포함하는 3 ml의 물 및 3 ml의 메탄올로 평형화하였다. 사용 후 3 ml 0.1% 포름산으로 세척한 후 1 ml의 60% ACN, 0.1 % 포름산으로 용출하였다. 용출된 시료를 스피드 진공에서 건조 후 동결하였다. MRM 분석 전에 시료는 0.1% 포름산에 0.2 μg/μl 농도로 용해하여 사용하였다.
7. SP-tag design
SP-tag은 cleavage site, barcoding sequence, his tag으로 구성된다. SP-tag에 사용되는 아미노산은 최소 14-20까지 가능하며 (LC-MS 분석 시 최대 20개 amino acid까지가 정량성 확보가 가능), 본 발명자들은 아래와 같은 방식으로 14개의 아미노산을 활용하였다. 14개의 아미노산의 펩타이드 길이를 유지 하면서 1200종의 peptide mass 값이 차이나는 펩타이드를 디자인 하기 위해, SP-Tag 역할을 하는 펩타이드는 정량적으로 차이를 보이지 않게 디자인하였다.
(1) 바코딩 시퀀스 선정
① MRM 분석을 위해 단백질 펩타이드 최대 길이는 20, 최소 길이는 8개 아미노산으로, Trypsin cleavage site인 R 또는 K은 포함시키지 않았다. 즉, 먼저 20 종의 아미노산에서 K 및 R을 제외하여 18종의 아미노산을 선정하였다.
② 이후, 아래와 같은 실험을 통해 상기 18종의 아미노산 중 소수성 지표(hydropathy index)가 높거나 낮은 V, F, G, C, H 및 N의 6종을 제외하여 12종의 아미노산을 선정하였다: 먼저 아미노산을 1개씩 다르게 하여 LC-MS 분석을 통해 발현량이 동일한지 확인을 하였다. 상기 아미노산들 중 LC-MS 분석 시 V, F, G, C, H 및 N의 경우 상대적으로 높거나 낮은 값이 확인이 되어 이를 제외하였다 (또한, 상기 H는 His tag에 영향을 줄 가능성 및 전하 변경의 우려도 존재함).
③ 추가적으로, 상기 12종의 아미노산 중 M은 단백질 digestion시 oxidation modification이 발생할 수 있어서 배제하여 총 11종의 아미노산을 선정하였다.
④ 마지막으로, 이들 중 유사한 질량 (Similar Mass)을 갖는 I, Q, N, L, E 및 D 중에서는 I 및 Q를 배제 (N은 단계 ②에서 배제)하고 L, E 및 D 만 사용하여 최종적으로 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D의 9종을 이용하여 5자리 바코팅 시퀀스를 design 하였다.
(2) Cleavage site 및 his tag design
Cleavage site design으로서, Trypsin cleavage를 위해 앞쪽에 Lysine (K)을 삽입 하였으며, 펩타이드 이온화 안정성과 정량성 확보를 위해 Arginine (R)을 맨 뒤쪽에 삽입하였다.
또한 KP, KD, KE 연속 sequence 발생 방지를 위해 K 뒤에 G를 삽입하였는데, K 옆에 P가 있으면 Trypsin cleavage가 완벽히 이루어지지 않으며, Acidic residue인 D 및 E의 경우 가수 분해 속도를 저해하여 miss cleavage의 발생 원인이기 때문이다. 또한, G를 선정한 이유는 ① 먼저 P, D, E를 제외하고, ② 바코딩 sequence로 사용한 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D를 제외하였으며, ③ 안정적 cleavage site를 고려하여 G를 선정하였다.
His tag은 표적 단백질만을 분리 정제하기 위한 6 x Histidine tag을 붙였다.
실험결과
1. Signal peptide tag (SP-tag)을 이용하여 해당 signal peptide를 찾은 방법 고안
세포 내에서 translation되는 단백질의 N-terminus에 있는 Signal peptide는 단백질 분비에 매우 중요한 역할을 한다. 재조합 단백질의 생산시 다양한 signal peptide를 접목시킴으로써 세포 밖 분비를 촉진시켜 생산량을 증가 시킬 수 있다. 본 발명은 단백질 생산에 최적의 signal peptide를 찾기 위한 초고속 탐색 방법을 고안하였다. 단백질 N-terminus에 있는 signal peptide는 세포 내에서 cleavage 되므로 분비된 단백질에는 signal peptide가 존재하지 않는다. 그 대신 단백질 C-terminus에 signal peptide tag (SP-tag)를 붙이고 이를 동정함으로써 그에 해당하는 signal peptide를 식별하는 방법을 고안하였다 (도 1).
단백질 생산량을 증가시키는 signal peptide 스크리닝 방법에 대한 모식도는 도 2와 같다:
1) 표적 단백질 라이브러리 제작: 다양한 signal peptide와 이에 해당하는 서로 다른 분자량을 가진 SP-tag들을 가지고 있는 벡터에 표적 단백질을 클로닝하여 표적 단백질 라이브러리를 제작한다.
2) 표적 단백질 라이브러리 발현: 표적 단백질 라이브러리를 동물세포에 transfection 시킨 후, 수일 뒤 세포 밖으로 분비된 단백질을 포함하고 있는 세포 배양액을 모은다. 이때 signal peptide 종류에 따라 분비된 단백질의 양이 다르며 이는 각 signal peptide에 해당하는 SP-tag에 따라 구분될 수 있다.
3) 단백질 생산량을 증가 시키는 signal peptide 선별: 생산된 단백질을 포함한 세포배양액에서 LC-MS/MS를 이용해 다양한 SP-tag을 동정하고 상대정량을 실시한다. 상대정량 값을 이용해 동정된 SP-tag들을 ranking화하고 해당 되는 signal peptide를 식별함으로써 단백질 생산량을 증가시키는 최적의 signal peptide를 찾을 수 있다.
2. Signal peptide 및 SP-tag을 가지고 있는 라이브러리 구축
Signal peptide와 SP-tag 사이에 표적 단백질을 제한 효소 ASC I - Xba I/Nhe I을 이용하여 클로닝 해서 [signal peptide - 표적 단백질 - SP-tag] 형태를 포함하는 벡터를 제작하였다(도 3).
또한, 도 4와 같이 1200종의 signal peptide를 가지고 있는 벡터에 각 signal peptide에 해당하는 1200종의 SP-tag을 클로닝하여 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 구축에 사용된 1200종의 signal peptide는 이미 알려져 있는 인간 분비 단백질의 signal peptide를 사용하였다(표 1).
| No. | Name of Signal peptides | Amino acid sequence |
| 1 | Afamin | MKLLKLTGFIFFLFFLTESLT |
| 2 | Alkaline phosphatase | MQGPWVLLLLGLRLQLSLG |
| 3 | Alpha-1-antitrypsin | MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA |
| 4 | Alpha-2-macroglobulin | MGKNKLLHPSLVLLLLVLLPTDA |
| 5 | Angiogenin | MVMGLGVLLLVFVLGLGLTPPTLA |
| 6 | Apolipoprotein E | MKVLWAALLVTFLAGCQA |
| 7 | Appetite-regulating hormone | MPSPGTVCSLLLLGMLWLDLAMA |
| 8 | Arylsulfatase A | MGAPRSLLLALAAGLAVA |
| 9 | Azurocidin | MTRLTVLALLAGLLASSRAGSSPLLD |
| 10 | Cadherin-2 | MCRIAGALRTLLPLLAALLQASVEA |
| 11 | Calcitonin | MGFQKFSPFLALSILVLLQAGSLHA |
| 12 | Carboxypeptidase A1 | MRGLLVLSVLLGAVFG |
| 13 | Cathepsin B | MWQLWASLCCLLVLANA |
| 14 | Chromogranin-A | MRSAAVLALLLCAGQVTA |
| 15 | Cortistatin | MPLSPGLLLLLLSGATAT |
| 16 | Elastin | MAGLTAAAPRPGVLLLLLSILHPSRP |
| 17 | Fibroblast growth factor 4 | MSGPGTAAVALLPAVLLALLAPWAGRGGAA |
| 18 | Fibronectin | MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGASKSKR |
| 19 | Fibulin-1 | MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA |
| 20 | Gastric triacylglycerol lipase | MWLLLTMASLISVLGTTHG |
| 21 | Gastrin | MQRLCVYVLIFALALAAFSEA |
| 22 | Glucosylceramidase | MAGSLTGLLLLQAVSWASG |
| 23 | High IgG Fc receptor I | MWFLTTLLLWVPVDG |
| 24 | Histatin-3 | MKFFVFALILALMLSMTGA |
| 25 | Human Serum Albumin | MKWVTFISLLFLFSSAYS |
| 26 | Insulin | MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA |
| 27 | Insulin-like growth factor 1 | MGKISSLPTQLFKCCFCDFLK |
| 28 | Interferon alpha-17 | MALSFSLLMAVLVLSYKSICSLG |
| 29 | Interleukin-2 | MQLLSCIALILALV |
| 30 | Lactotransferrin | MKLVFLVLLFLGALGLCLA |
| 31 | Nephronectin | MDFLLALVLVSSLYLQAAA |
| 32 | Neuropeptide B | MARSATLAAAALALCLLLAPPGLA |
| 33 | Neurotrophin 4 | MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES |
| 34 | Neutrophil defensin 1 | MRTLAILAAILLVALQAQA |
| 35 | Oxytocin | MAGSSLACCLLGLLALTSA |
| 36 | Pancreatic alpha amylase | MKFFLLLFTIGFCWA |
| 37 | Pancreatic prohormone | MAAARLCLSLLLLSTCVALLLQPLLGAQG |
| 38 | Pepsin A4 | MKWLLLLGLVALSEC |
| 39 | Proenkephalin-A | MARFLTLCTWLLLLGPGLLATVRA |
| 40 | Resistin | MKALCLLLLPVLGLLVSS |
| 41 | slit3 | MAPGWAGVGAAVRARLALALALASVLSGPPAVA |
| 42 | SOD3 | MLALLCSCLLLAAGASDA |
| 43 | Statherin | MKFLVFAFILALMVSMIGA |
| 44 | Thromopoietin | MELTELLLVVMLLLTARLTLS |
| 45 | Tissue-type plasminogen activator | MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP |
| 46 | Trypsinogen-2 | MNLLLILTFVAAAVA |
| 47 | Tyrosinase | MLLAVLYCLLWSFQTSAG |
| 48 | Uteroglobin | MKLAVTLTLVTLALCCSSASA |
| 49 | Vascular endothelial growth factor A | MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQA |
| 50 | Wnt-1 | MGLWALLPGWVSATLLLALAALPAALA |
| 51 | Acidic mammalian chitinase | MTKLILLTGLVLILNLQLGSA |
| 52 | Acrosin | MVEMLPTAILLVLAVSVVA |
| 53 | Acrosomal protein SP-10 | MNRFLLLMSLYLLGSARGTSS |
| 54 | Acyloxyacyl hydrolase | MQSPWKILTVAPLFLLLSLQSSA |
| 55 | ADAM DEC1 | MLRGISQLPAVATMSWVLLPVLWLIVQTQA |
| 56 | ADAMTS-like protein 1 | MECCRRATPGTLLLFLAFLLLSSRTARS |
| 57 | Adipolin | MRRWAWAAVVVLLGPQLVLL |
| 58 | Adiponectin | MLLLGAVLLLLALPGHDQ |
| 59 | Adrenomedullin | MKLVSVALMYLGSLAFLGADT |
| 60 | Agouti-related protein | MLTAAVLSCALLLALPATRG |
| 61 | Agouti-signaling protein | MDVTRLLLATLLVFLCFFTANS |
| 62 | Agrin | MAGRSHPGPLRPLLPLLVVAACVLPGAGG |
| 63 | Alpha-1B-glycoprotein | MSMLVVFLLLWGVTWGPVTEA |
| 64 | Alpha-2-macroglobulin-like protein 1 | MWAQLLLGMLALSPAIA |
| 65 | Alpha-fetoprotein | MKWVESIFLIFLLNFTES |
| 66 | Alpha-lactalbumin | MRFFVPLFLVGILFPAILA |
| 67 | Ameloblastin | MSASKIPLFKMKDLILILCLLEMSFA |
| 68 | Amelogenin | MGTWILFACLLGAAFA |
| 69 | Amelotin | MRSTILLFCLLGSTRS |
| 70 | Amiloride-sensitive amine oxidase | MGRGTLALGWAGAALLLLQMLAAA |
| 71 | Amphiregulin | MRAPLLPPAPVVLSLLILG |
| 72 | Amyloid beta A4 protein | MLPGLALLLLAAWTARA |
| 73 | Angiotensinogen | MRKRAPQSEMAPAGVSLRATILCLLAWAGLAAG |
| 74 | Anosmin-1 | MVPGVPGAVLTLCLWLAASSGCLA |
| 75 | Antileukoproteinase | MKSSGLFPFLVLLALGTLAPWAVEG |
| 76 | Apelin | MNLRLCVQALLLLWLSLTAVCG |
| 77 | Apolipoprotein A-I | MKAAVLTLAVLFLTGSQA |
| 78 | Apolipoprotein B-100 | MDPPRPALLALLALPALLLLLLAGARA |
| 79 | Aspartylglucosaminidase | MARKSNLPVLLVPFLLCQALVRC |
| 80 | Asporin | MKEYVLLLFLALCS |
| 81 | Augurin | MAASPARPAVLALTGLALLLLLCWGPGGISG |
| 82 | Basigin | MAAALFVLLGFALLGTHGASG |
| 83 | Beta-2-glycoprotein 1 | MISPVLILFSSFLCHVAIA |
| 84 | Beta-2-microglobulin | MSRSVALAVLALLSLSGLEA |
| 85 | Beta-hexosaminidase subunit alpha | MTSSRLWFSLLLAAAFAGRATA |
| 86 | Beta-microseminoprotein | MNVLLGSVVIFATFVTLCNA |
| 87 | Beta-secretase 2 | MGALARALLLPLLAQWLLRA |
| 88 | Biglycan | MWPLWRLVSLLALSQA |
| 89 | Bone marrow proteoglycan | MKLPLLLALLFGAVSA |
| 90 | Brevican core protein | MAQLFLPLLAALVLAQAPAALA |
| 91 | Calreticulin | MLLSVPLLLGLLGLAVA |
| 92 | Calsequestrin-2 | MKRTHLFIVGIYFLSSCRA |
| 93 | Carboxylesterase 1 | MWLRAFILATLSASAAW |
| 94 | Cartilage intermediate layer protein 1 | MVGTKAWVFSFLVLEVTSVLG |
| 95 | Cerebellin-1 | MLGVLELLLLGAAWLAGPARG |
| 96 | Ceruloplasmin | MKILILGIFLFLCSTPAWA |
| 97 | Cholecystokinin | MNSGVCLCVLMAVLAAGALT |
| 98 | Cholinesterase | MHSKVTIICIRFLFWFLLLCMLIGKSHT |
| 99 | Chondroadherin-like protein | MEGPRSSTHVPLVLPLLVLLLLAPARQAAA |
| 100 | Chordin | MPSLPAPPAPLLLLGLLLLGSRPARG |
| 101 | Choriogonadotropin subunit beta 3 | MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA |
| 102 | Chorionic somatomammotropin hormone 2 isoform 2 | MAAGSRTSLLLAFALLCLPWLQEAGA |
| 103 | Chymase | MLLLPLPLLLFLLCSRAEA |
| 104 | Clusterin | MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG |
| 105 | Coagulation factor V | MFPGCPRLWVLVVLGTSWVGWGSQGTEA |
| 106 | Colipase | MEKILILLLVALSVAYA |
| 107 | Collagen alpha-1(I) chain | MFSFVDLRLLLLLAATALLTHG |
| 108 | Complement C3 | MGPTSGPSLLLLLLTHLPLALG |
| 109 | Contactin-1 | MKMWLLVSHLVIISITTCLA |
| 110 | Corneodesmosin | MGSSRAPWMGRVGGHGMMALLLAGLLLPGTLA |
| 111 | Corticoliberin | MRLPLLVSAGVLLVALLPCPPCRA |
| 112 | Corticosteroid-binding globulin | MPLLLYTCLLWLPTSGLWTVQA |
| 113 | Corticotropin-releasing factor-binding protein | MSPNFKLQCHFILIFLTALRGESR |
| 114 | C-reactive protein | MEKLLCFLVLTSLSHAFG |
| 115 | Cubilin | MMNMSLPFLWSLLTLLIFAEVNG |
| 116 | Cystatin-C | MAGPLRAPLLLLAILAVALAVSPAAG |
| 117 | Deoxyribonuclease-1 | MRGMKLLGALLALAALLQGAVS |
| 118 | Dermatopontin | MDLSLLWVLLPLVTMAWG |
| 119 | Dermcidin | MRFMTLLFLTALAGALVCA |
| 120 | Dickkopf-related protein 1 | MMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSA |
| 121 | Dystroglycan | MRMSVGLSLLLPLSGRTFLLLLSVVMAQS |
| 122 | EGF-like domain-containing protein 1 | MGAAAVRWHLCVLLALGTRGRLA |
| 123 | Enamelin | MLVLRCRLGTSFPKLDNLVPKGKMKILLVFLGLLGNSVA |
| 124 | Endothelin-1 | MDYLLMIFSLLFVACQG |
| 125 | Endothelin-2 | MVSVPTTWCSVALALLVALHEGKG |
| 126 | Ephrin-A2 | MAPAQRPLLPLLLLLLPLPPPPFA |
| 127 | Epiphycan | MKTLAGLVLGLVIFDAAVT |
| 128 | Eppin | MGSSGLLSLLVLFVLLANVQG |
| 129 | Erythroferrone | MAPARRPAGARLLLVYAGLLAAAAAGLG |
| 130 | Erythropoietin | MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLG |
| 131 | E-selectin | MIASQFLSALTLVLLIKESGA |
| 132 | Fibromodulin | MQWTSLLLLAGLFSLSQA |
| 133 | Follicular dendritic cell secreted peptide | MKKVLLLITAILAVAVG |
| 134 | Follistatin | MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQA |
| 135 | Furin | MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADA |
| 136 | Galanin peptides | MARGSALLLASLLLAAALS |
| 137 | Galanin-like peptide | MAPPSVPLVLLLVLLLSLAETPAS |
| 138 | Gastrokine-1 | MLAYSSVHCFREDKMKFTIVFAGLLGVFLAPALA |
| 139 | Glucagon | MKSIYFVAGLFVMLVQGSWQ |
| 140 | Glycophorin-A | MYGKIIFVLLLSEIVSISA |
| 141 | Glypican-1 | MELRARGWWLLCAAAALVACARG |
| 142 | GPHB5 protein | MKLAFLFLGPMALLLLAGYGCVLG |
| 143 | Granulysin | MATWALLLLAAMLLGNPGLVFS |
| 144 | Granzyme B | MQPILLLLAFLLLPRADA |
| 145 | Growth hormone variant | MAAGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSA |
| 146 | Guanylin | MNAFLLSALCLLGAWAALAGG |
| 147 | Haptoglobin | MSALGAVIALLLWGQLFA |
| 148 | Heparanase | MLLRSKPALPPPLMLLLLGPLGPLSPGALPRPAQA |
| 149 | Hepatocyte growth factor | MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEG |
| 150 | Hepcidin | MALSSQIWAACLLLLLLLASLTSG |
| 151 | Ig heavy chain V-III region 23 | MEFGLSWLFLVAILKGVQC |
| 152 | Ig kappa chain V-III region HIC | METPAQLLFLLLLWLPDTTG |
| 153 | Insulin-like peptide INSL6 | MPRLLRLSLLWLGLLLVRFS |
| 154 | Integrin alpha-2 | MGPERTGAAPLPLLLVLALSQGILNCCLA |
| 155 | Intelectin-1 | MNQLSFLLFLIATTRGWS |
| 156 | Interferon alpha-inducible protein 27-like protein 2 | MMKRAAAAAVGGALAVGAVPVVLS |
| 157 | Interleukin-2 | MYRMQLLSCIALSLALVTNS |
| 158 | Interleukin-6 | MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAP |
| 159 | Kallikrein-1 | MWFLVLCLALSLGGTGAA |
| 160 | Kallikrein-6 | MKKLMVVLSLIAAAWA |
| 161 | Keratocan | MAGTICFIMWVLFITDTVWS |
| 162 | Kininogen-1 | MKLITILFLCSRLLLSLT |
| 163 | Klotho | MPASAPPRRPRPPPPSLSLLLVLLGLGGRRLRA |
| 164 | Lactoperoxidase | MRVLLHLPALLASLILLQAAASTTRA |
| 165 | Legumain | MVWKVAVFLSVALGIGA |
| 166 | Leptin | MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQA |
| 167 | Lumican | MSLSAFTLFLALIGGTSG |
| 168 | Lymphotactin | MRLLILALLGICSLTAYIVEG |
| 169 | Lysyl oxidase homolog 2 | MERPLCSHLCSCLAMLALLSPLSLA |
| 170 | Mammalian ependymin-related protein 1 | MPGRAPLRTVPGALGAWLLGGLWAWTLCGLCSLGAVG |
| 171 | Mannose-binding protein C | MSLFPSLPLLLLSMVAASYS |
| 172 | Matrilin-2 | MEKMLAGCFLLILGQIVLLPAEA |
| 173 | Metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2) | MGAAARTLRLALGLLLLATLLRPADA |
| 174 | Methyltransferase-like protein 7B | MDILVPLLQLLVLLLTLPLHLMA |
| 175 | Midkine | MQHRGFLLLTLLALLALTSA |
| 176 | Mucin-5AC | MSVGRRKLALLWALALALACTRHTGHA |
| 177 | Muellerian-inhibiting factor | MRDLPLTSLALVLSALGA |
| 178 | Multimerin-1 | MKGARLFVLLSSLWSGGIG |
| 179 | Myostatin | MQKLQLCVYIYLFMLIVA |
| 180 | Napsin-A | MSPPPLLQPLLLLLPLLNVEPSGAT |
| 181 | Natriuretic peptides A | MSSFSTTTVSFLLLLAFQLLGQTRA |
| 182 | Natriuretic peptides B | MDPQTAPSRALLLLLFLHLAFLGGRS |
| 183 | Netrin-4 | MGSCARLLLLWGCTVVAA |
| 184 | Neural cell adhesion molecule 1 | MLQTKDLIWTLFFLGTAVS |
| 185 | Neurexophilin-2 | MRLRPLPLVVVPGLLQLLFCDS |
| 186 | Neurocan core protein | MGAPFVWALGLLMLQMLLFVAG |
| 187 | Neuroendocrine convertase 1 | MERRAWSLQCTAFVLFCAWCALNSAKA |
| 188 | Neuroendocrine convertase 2 | MKGGCVSQWKAAAGFLFCVMVFASA |
| 189 | Neuromedin-B | MARRAGGARMFGSLLLFALLAAGV |
| 190 | Neurosecretory protein VGF | MKALRLSASALFCLLLINGLGA |
| 191 | Niemann-Pick C1 protein | MTARGLALGLLLLLLCPAQVFS |
| 192 | Noggin | MERCPSLGVTLYALVVVLGLRATPAGG |
| 193 | Norrin | MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDS |
| 194 | Nyctalopin | MKGRGMLVLLLHAVVLGLPSAWA |
| 195 | Olfactomedin-4 | MRPGLSFLLALLFFLGQAAG |
| 196 | Osteoglycin | MKTLQSTLLLLLLVPLIKP |
| 197 | Otospiralin | MQACMVPGLALCLLLGPLAGA |
| 198 | Ovochymase-2 | MLISRNKLILLLGIVFFERGKS |
| 199 | Palmitoyl-protein thioesterase 1 | MASPGCLWLLAVALLPWTCASRALQHL |
| 200 | Pancreatic lipase-related protein 3 | MLGIWIVAFLFFGTSRG |
| 201 | Parathyroid hormone | MIPAKDMAKVMIVMLAICFLTKSDG |
| 202 | Peptide YY | MVFVRRPWPALTTVLLALLVCLGALVDA |
| 203 | Persephin | MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQG |
| 204 | Pikachurin | MDLIRGVLLRLLLLASSLGPGAVS |
| 205 | Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide | MTMCSGARLALLVYGIIMHSSVYS |
| 206 | Placenta-specific protein 1 | MKVFKFIGLMILLTSAFSAGSG |
| 207 | Plasma serine protease inhibitor | MQLFLLLCLVLLSPQGASL |
| 208 | Platelet-derived growth factor receptor beta | MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQG |
| 209 | Prenylcysteine oxidase 1 | MGRVVAELVSSLLGLWLLLCSCGCPEG |
| 210 | Prepronociceptin | MKVLLCDLLLLSLFSSVFS |
| 211 | Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3 | MTSSGPGPRFLLLLPLLLPPAASA |
| 212 | Proenkephalin-B | MAWQGLVLAACLLMFPSTTA |
| 213 | Pro-epidermal growth factor | MLLTLIILLPVVSKFSFVSLSA |
| 214 | Proepiregulin | MTAGRRMEMLCAGRVPALLLCLGFHLLQA |
| 215 | Progonadoliberin-1 | MKPIQKLLAGLILLTWCVEGCSS |
| 216 | Prokineticin-1 | MRGATRVSIMLLLVTVSDC |
| 217 | Prokineticin-2 | MRSLCCAPLLLLLLLPPLLLTPRAGDA |
| 218 | Prolactin releasing hormone | MKVLRAWLLCLLMLGLALRGAAS |
| 219 | Prolactin-inducible protein | MRLLQLLFRASPATLLLVLCLQLGANKA |
| 220 | Prolyl 3-hydroxylase 2 | MRERIWAPPLLLLLPLLLPPPLWG |
| 221 | Prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-1 | MIWYILIIGILLPQSLA |
| 222 | Promotilin | MVSRKAVAALLVVHVAAMLASQTEA |
| 223 | Pro-neuropeptide Y | MLGNKRLGLSGLTLALSLLVCLGALAEA |
| 224 | Pro-opiomelanocortin | MPRSCCSRSGALLLALLLQASMEVRG |
| 225 | Prorelaxin H2 | MPRLFFFHLLGVCLLLNQFSRAVA |
| 226 | ProSAAS | MAGSPLLWGPRAGGVGLLVLLLLGLFRPPPALC |
| 227 | Prosalusin | MAAATRGCRPWGSLLGLLGLVSAAAA |
| 228 | Prostaglandin-H2 D-isomerase | MATHHTLWMGLALLGVLGDLQA |
| 229 | Prostate and testis expressed protein 2 | MLVLFLLGTVFLLCPYWGELHDPIKA |
| 230 | Protachykinin-1 | MKILVALAVFFLVSTQLFA |
| 231 | Protein disulfide-isomerase | MLRRALLCLAVAALVRA |
| 232 | Protein O-glucosyltransferase 1 | MEWWASSPLRLWLLLFLLPSAQG |
| 233 | Prothrombin | MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHS |
| 234 | Pro-thyrotropin-releasing hormone | MPGPWLLLALALTLNLTGVPGGRA |
| 235 | Pulmonary surfactant-associated protein D | MLLFLLSALVLLTQPLGYLE |
| 236 | Relaxin-3 | MARYMLLLLLAVWVLTGELWPGAEA |
| 237 | Renalase | MAQVLIVGAGMTGSLCA |
| 238 | Renin | MDGWRRMPRWGLLLLLWGSCTFG |
| 239 | Reticulocalbin-2 | MRLGPRTAALGLLLLCAAAAGA |
| 240 | Sarcalumenin | MRALVLLGCLLASLLFSGQA |
| 241 | Sclerostin | MQLPLALCLVCLLVHTAFRVVEG |
| 242 | Secretin | MAPRPLLLLLLLLGGSAA |
| 243 | Secretoglobin family 1D member 1 | MRLSVCLLLLTLALCCYRANA |
| 244 | Secretogranin-1 | MQPTLLLSLLGAVGLAAVNS |
| 245 | Selenoprotein M | MSLLLPPLALLLLLAALVAPATA |
| 246 | Semenogelin-1 | MKPNIIFVLSLLLILEKQAAVMG |
| 247 | Serglycin | MMQKLLKCSRLVLALALILVLESSVQG |
| 248 | Serotransferrin | MRLAVGALLVCAVLGLCLA |
| 249 | Serum amyloid A-1 protein | MKLLTGLVFCSLVLGVSS |
| 250 | Serum amyloid P-component | MNKPLLWISVLTSLLEAFA |
| 251 | Somatomedin-B and thrombospondin type-1 domain-containingprotein |
MRTLWMALCALSRLWPGAQA |
| 252 | Somatotropin | MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA |
| 253 | Sperm acrosome-associated protein 5 | MKAWGTVVVTLATLMVVTVDA |
| 254 | Spexin | MKGLRSLAATTLALFLVFVFLGNSSC |
| 255 | Spondin-1 | MRLSPAPLKLSRTPALLALALPLAAALA |
| 256 | Stanniocalcin-1 | MLQNSAVLLVLVISASA |
| 257 | Stereocilin | MALSLWPLLLLLLLLLLLSFAV |
| 258 | Steryl-sulfatase | MPLRKMKIPFLLLFFLWEAES |
| 259 | Submaxillary gland androgen-regulated protein 3A | MKSLTWILGLWALAACFTPGES |
| 260 | Sulfatase 1 | MKYSCCALVLAVLGTELLGSLC |
| 261 | Syncollin | MSPLRPLLLALALASVPCAQG |
| 262 | Tachykinin-3 | MRIMLLFTAILAFSLA |
| 263 | Tenascin | MGAMTQLLAGVFLAFLALATEG |
| 264 | Thyroglobulin | MALVLEIFTLLASICWVSA |
| 265 | Thyroid peroxidase | MRALAVLSVTLVMACTEA |
| 266 | Transcobalamin-1 | MRQSHQLPLVGLLLFSFIPSQLC |
| 267 | Transforming growth factor beta-1 | MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAG |
| 268 | Transthyretin | MASHRLLLLCLAGLVFVSEA |
| 269 | Trehalase | MPGRTWELCLLLLLGLGLGSQEA |
| 270 | TSHR protein | MRPADLLQLVLLLDLPRDLGG |
| 271 | Tsukushin | MPWPLLLLLAVSGAQT |
| 272 | Urocortin | MRQAGRAALLAALLLLVQLCPGSSQ |
| 273 | Urotensin-2B | MNKILSSTVCFGLLTLLSVLSFLQSVHG |
| 274 | Versican core protein | MFINIKSILWMCSTLIVTHA |
| 275 | Vitrin | MRTVVLTMKASVIEMFLVLLVTGVHS |
| 276 | Vitronectin | MAPLRPLLILALLAWVALA |
| 277 | WAP four-disulfide core domain protein 2 | MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGA |
| 278 | Zymogen granule membrane protein 16 | MLTVALLALLCASASG |
| 279 | Cystatin-S | MARPLCTLLL LMATLAGALA |
| 280 | A disintegrin and metalloproteinase…1 | MQRAVPEGFGRRKLGSDMGNAE RAPGSRSFGPVPTLLLLAAALLAVSDA |
| 281 | Leucine-rich alpha-2-glycoprotein | MSSWSRQRPKSPGGIQPHVSRTLFLLLLLAASAWG |
| 282 | Bone morphogenetic protein 2 | MVAGTRCLLALLLPQVLLGGAAG |
| 283 | Bone morphogenetic protein 7 | MHVRSLRAAAPHSFVALWAPLFLLRSALA |
| 284 | Complement C1q tumor necrosis factor-relatedprotein8 |
MAAPALLLLALLLPVGA |
| 285 | Carboxypeptidase E | MAGRGGSALLALCGALAACGWLLGA |
| 286 | Cholesteryl ester transfer protein | MLAATVLTLALLGNAHA |
| 287 | Complement factor I | MKLLHVFLLFLCFHLRFC |
| 288 | Collagen alpha-3(VI) chain | MRKHRHLPLVAVFCLFLSGFPTTHA |
| 289 | Cysteine-rich motor neuron 1 protein | MYLVAGDRGLAGCGHLLVSLLGLLLLLARSGTRA |
| 290 | UPF0672 protein CXorf36 | MEPQLGPEAAALRPGWLALLLWVSALSCSFS |
| 291 | Cystatin-D | MMWPMHTPLLLLTALMVAVA |
| 292 | Beta-defensin 109 | MRLHLLLLILLLFSILLSPVRG |
| 293 | Dickkopf-related protein 2 | MAALMRSKDSSCCLLLLAAVLMVESSQIGSSRA |
| 294 | EMILIN-1 | MAPRTLWSCYLCCLLTAAAGA |
| 295 | Fibulin-2 | MVLLWEPAGAWLALGLALALGPSVAAA |
| 296 | FRAS1-related extracellular matrix protein 3 | MAGASRHPTGTPRQLLVALACLLLSRPALQ |
| 297 | Gelsolin | MAPHRPAPALLCALSLALCALSLPVRA |
| 298 | Beta-galactosidase-1-like protein | MAPKKLSCLRSLLLPLSLTLLLPQADT |
| 299 | Plasma protease C1 inhibitor | MASRLTLLTLLLLLLAGDRASS |
| 300 | Interleukin-10 | MHSSALLCCLVLLTGVRA |
| 301 | Interleukin-12 subunit alpha | MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA |
| 302 | Interleukin-31 | MASHSGPSTSVLFLFCCLGGWLA |
| 303 | Interleukin-1 receptor-like 1 | MGFWILAILTILMYSTAA |
| 304 | Early placenta insulin-like peptide | MASLFRSYLPAIWLLLSQLLRESLA |
| 305 | Kallikrein-14 | MSLRVLGSGTWPSAPKMF |
| 306 | Extracellular glycoprotein lacritin | MKFTTLLFLAAVAGALVYA |
| 307 | Left-right determination factor 1 | MQPLWLCWALWVLPLASPGAA |
| 308 | Lysyl oxidase homolog 3 | MRPVSVWQWSPWGLLLCLLCSSCLG |
| 309 | 1-O-acylceramide synthase | MGLHLRPYRVGLLPDGLLFLLLLLMLLADPALP |
| 310 | Matrilin-4 | MRGLLCWPVLLLLLQPWE |
| 311 | Matrix metalloproteinase-26 | MQLVILRVTIFLPWCFA |
| 312 | Neutrophil collagenase | MFSLKTLPFLLLLHVQISKA |
| 313 | Netrin-2-like protein | MPGWPWGLLLTAGTLFAALSPGPPAPA |
| 314 | Neuropeptide S | MISSVKLNLILVLSLSTMHVFWC |
| 315 | Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5 | MGWGSRCCCPGRLDLLCVLALLGGCLLPVCRT |
| 316 | Parathyroid hormone-related protein | MQRRLVQQWSVAVFLLSYAVPSCG |
| 317 | Peroxidasin-like protein | MEPRLFCWTTLFLLAGWCLPGLP |
| 318 | Sulfhydryl oxidase 2 | MAAAGAAVARSPGIGAGPALR |
| 319 | Proactivator polypeptide | MYALFLLASLLGAALA |
| 320 | Pulmonary surfactant-associated protein A1 | MWLCPLALNLILMAASGAVC |
| 321 | Tectonic-1 | MRPRGLPPLLVVLLGCWASVSA |
| 322 | Protein TMEM155 | MASDLIRTILAVALISKLGTAVDA |
| 323 | Twisted gastrulation protein homolog 1 | MKLHYVAVLTLAILMFLTWLPESLS |
| 324 | Urokinase plasminogen activator surface receptor | MGHPPLLPLLLLLHTCVPASWG |
| 325 | VIP peptides | MDTRNKAQLLVLLTLLSVLF |
| 326 | Von Willebrand factor D and EGF domain-containingprotein |
MPGGACVLVIALMFLAWGEA |
| 327 | WAP four-disulfide core domain protein 6 | MGLSGLLPILVPFILLGDIQEPGHA |
| 328 | Protein Wnt-8a | MGNLFMLWAALGICCAAFS |
| 329 | Putative uncharacterized protein FLJ46089 | MRCVTRTRNWWRRAARMPRAGSSAWWVAVCKQVCT |
| 330 | HLA class I histocompatibility antigen, Cw-16alphachain |
MRVMAPRTLILLLSGALALTETWA |
| 331 | Acrosin-binding protein | MRKPAAGFLPSLLKVLLLPLAPAAA |
| 332 | Angiopoietin-related protein 1 | MKTFTWTLGVLFFLLVDTGHCRG |
| 333 | Apolipoprotein L1 | MEGAALLRVSVLCIWMSALFLGVGVRA |
| 334 | Brain-specific serine protease 4 | MVVSGAPPALGGGCLGTFTSLLLLASTAILNA |
| 335 | Cocaine- and amphetamine-regulated transcript protein | MESSRVRLLPLLGAALLLMLPLLGTRA |
| 336 | C-C motif chemokine 14 | MKISVAAIPFFLLITIALG |
| 337 | C-C motif chemokine 4 | MKLCVTVLSLLMLVAAFCSPALS |
| 338 | Complement component C6 | MARRSVLYFILLNALINKGQA |
| 339 | Cytokine-like protein 1 | MRTPGPLPVLLLLLAGAPAARP |
| 340 | Dickkopf-like protein 1 | MGEASPPAPARRHLLVLLLLLSTLVIPSAA |
| 341 | Deoxyribonuclease gamma | MSRELAPLLLLLLSIHSALA |
| 342 | Dentin sialophosphoprotein | MKIITYFCIWAVAWA |
| 343 | EGF-like domain-containing protein 7 | MRGSQEVLLMWLLVLAVGGTEHA |
| 344 | Endonuclease domain-containing 1 protein | MGTARWLALGSLFALAGLLEG |
| 345 | Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase familymember2 |
MARRSSFQSCQIISLFTFAVGVNICLG |
| 346 | Abhydrolase domain-containing protein FAM108B1 | MNNLSFSELCCLFCCPPCPG |
| 347 | EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 | MLPCASCLPGSLLLWALLLLLLGSA |
| 348 | Complement factor H-related protein 5 | MLLLFSVILISWVSTVGG |
| 349 | Glypican-4 | MARFGLPALLCTLAVLSA |
| 350 | Ig heavy chain V-I region V35 | MDWTWRILFLVAAATGAHS |
| 351 | Interferon alpha-7 | MARSFSLLMVVLVLSYKSICSLG |
| 352 | Plasma kallikrein-like protein 4 | MVSAAGLSGDGKMRGVLLVLLGLLYSSTSC |
| 353 | Laminin subunit beta-2 | MELTSRERGRGQPLPWELRLGLLLSVLAATLA |
| 354 | Laminin subunit gamma-3 | MAAAALLLGLALLAPRAAG |
| 355 | Lipase member I | MRVYIFLCLMCWVRS |
| 356 | Lactadherin | MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVA |
| 357 | Mannose receptor-like protein 1 | MLHPETSPGRGHLLAVLLALLGTTWA |
| 358 | Mucin-4 | MKGARWRRVPWVSLSCLCLCLLPHVVPG |
| 359 | NKG2D ligand 2 | MAAAAATKILLCLPLLLLLSGWSRA |
| 360 | Noelin-3 | MSPPLLKLGAVLSTMAMISNWMS |
| 361 | Epididymal secretory protein E1 | MRFLAATFLLLALSTAAQA |
| 362 | Otogelin | MGVLASALCWLLCVWLPWGEQA |
| 363 | PATE-like protein B | MRKMNTLLLVSLSFLYLKE |
| 364 | Perforin-1 | MAARLLLLGILLLLLPLPVPA |
| 365 | Peptidoglycan recognition protein I-alpha | MGTLPWLLAFFILGLQA |
| 366 | Prostatic acid phosphatase | MRAAPLLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSVLA |
| 367 | Basic salivary proline-rich protein 4 | MLLILLSVALLALSSA |
| 368 | Prolactin receptor | MKENVASATVFTLLLFLNTCLLNG |
| 369 | Serum amyloid A-4 protein | MRLFTGIVFCSLVMGVTS |
| 370 | Stromal cell-derived factor 2 | MAVVPLLLLGGLWSAVGA |
| 371 | Serpin E3 | MPPFLITLFLFHSCCLRANG |
| 372 | Tenascin-N | MSLQEMFRFPMGLLLGSVLLVASAPATL |
| 373 | Thioredoxin domain-containing protein 16 | MFSGFNVFRVGISFVIMCIFYMPTVNS |
| 374 | Vascular endothelial growth factor receptor 2 | MQSKVLLAVALWLCVETRA |
| 375 | von Willebrand factor A domain-containing protein 5B1 | MPGLLNWITGAALPLTAS |
| 376 | WAP four-disulfide core domain protein 1 | MPLTGVGPGSCRRQIIRALCLLLLLLHAGSA |
| 377 | Putative uncharacterized protein UNQ5830/PRO19650/PRO19816 |
MAILMLSLQLILLLIPSIS |
| 378 | Putative uncharacterized protein ENSP00000380674 | MRPLLCALAGLALLCAVGALA |
| 379 | Putative uncharacterized protein LOC116349 | MPAVFMLASSSALQCGRG |
| 380 | Anterior gradient protein 2 homolog | MEKIPVSAFLLLVALSYTLA |
| 381 | Insulin-like growth factor-binding protein complexacidlabilechain |
MALRKGGLALALLLLSWVALGPRSLEG |
| 382 | Apolipoprotein C-III | MQPRVLLVVALLALLASARA |
| 383 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs16 |
MKPRARGWRGLAALWMLLAQVAEQ |
| 384 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs8 |
MLPAPAAPRWPPLLLLLLLLLPLARGA |
| 385 | Bone morphogenetic protein 1 | MPGVARLPLLLGLLLLPRPGRP |
| 386 | Bactericidal/permeability-increasing protein-like 1 | MAWASRLGLLLALLLPVVGA |
| 387 | Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M160 | MMLPQNSWHIDFGRCCCHQNLFSAVVTCILLLNSCFLISS |
| 388 | Cathepsin D | MQPSSLLPLALCLLAAPA |
| 389 | Putative cat eye syndrome critical region protein 9 | MQSHLAPLACAAAAGRAGGSCQA |
| 390 | UPF0670 protein C8orf55 | MLGLLVALLALGLAVFA |
| 391 | C-C motif chemokine 3-like 1 | MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS |
| 392 | Collagen alpha-2(VIII) chain | MLGTLTPLSSLLLLLLVLVLGCGPRASS |
| 393 | Uncharacterized protein C18orf20 | MINLHRLCIIHVVATLLSTLLSLISVAIS |
| 394 | C-X-C motif chemokine 14 | MSLLPRRAPPVSMRLLAAALLL |
| 395 | Beta-defensin 106 | MRTFLFLFAVLFFLTPAKNA |
| 396 | Coagulation factor X | MGRPLHLVLLSASLAGLLLLGESLFIRREQA |
| 397 | INT-2 proto-oncogene protein | MGLIWLLLLSLLEPGWP |
| 398 | Leucine-rich repeat transmembrane protein FLRT2 | MGLQTTKWPSHGAFFLKSWLIISLGLYSQVSKLLA |
| 399 | Interleukin-18-binding protein | MTMRHNWTPDLSPLWVLLLCAHVVTLLV |
| 400 | Insulin-like growth factor-binding protein 7 | MERPSLRALLLGAAGLLLLLLPLSSS |
| 401 | Serine protease inhibitor Kazal-type 7 | MKITGGLLLLCTVVYFCSS |
| 402 | Isthmin | MVRLAAELLLLLGLLLLTLHITVLRGSGA |
| 403 | Laminin subunit beta-4 | MQFQLTLFLHLGWLSYSKA |
| 404 | Endothelial lipase | MSNSVPLLCFWSLCYCFAAG |
| 405 | Secretoglobin-like protein LOC284402 | MRVTSATCALLLALICSVQLGDA |
| 406 | Lymphocyte antigen 86 | MKGFTATLFLWTLIFPSCSG |
| 407 | Netrin-1-like protein | MPVTFALLLLLGQATA |
| 408 | NHL repeat-containing protein 3 | MARFWVCVAGAGFFLAFLVLHSRFC |
| 409 | Protocadherin-15 | MFRQFYLWTCLASGIILGSLFEICLG |
| 410 | Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 | MGPLSAPPCTQHITWKGLLLTASLLNFWNLPITA |
| 411 | Putative peptide YY-2 | MATVLLALLVYLGALVDA |
| 412 | Ribonuclease K6 | MVLCFPLLLLLLVLWGPVCPLHA |
| 413 | Ribonuclease-like protein 12 | MIIMVIIFLVLLFWENEVND |
| 414 | Signal peptide, CUB and EGF-like domain-containingprotein2 |
MGVAGRNRPGAAWAVLLLLLLLPPLLLLAGA |
| 415 | Serpin A9 | MASYLYGVLFAVGLCAPIYCVSP |
| 416 | Kunitz-type protease inhibitor 4 | MKSAKLGFLLRFFIFCSLNTLLLG |
| 417 | Stanniocalcin-2 | MCAERLGQFMTLALVLATFDPARG |
| 418 | Thrombospondin type-1 domain-containing protein 4 | MVSHFMGSLSVLCFLLLLGFQFVCP |
| 419 | Uromodulin | MGQPSLTWMLMVVVASWFITTAAT |
| 420 | Protein Wnt-4 | MSPRSCLRSLRLLVFAVFSAAA |
| 421 | Protein Wnt-7b | MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVA |
| 422 | Peptidase S1 domain-containing protein LOC136242 | MKYVFYLGVLAGTFFFADS |
| 423 | Complement C1q subcomponent subunit C | MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQA |
| 424 | Uncharacterized protein C2orf66 | MIIDSSRIPSFTQLHSTMTRAPLLLLCVALVLLGHVNG |
| 425 | Cerebellin-4 | MGSGRRALSAVPAVLLVLTLPGLPVWA |
| 426 | Coiled-coil domain-containing protein 3 | MLRQLLLAALCLAGPPAPARA |
| 427 | Eotaxin | MKVSAALLWLLLIAAAFSPQGLA |
| 428 | C-C motif chemokine 23 | MKVSVAALSCLMLVTALGSQA |
| 429 | C-C motif chemokine 3 | MQVSTAALAVLLCTMALCNQFSA |
| 430 | Colipase-like protein C6orf127 | MMLPQWLLLLFLLFFFLFLLTRG |
| 431 | Retinoic acid early transcript 1G protein | MAAAASPAFLLRLPLLLLLSSWCRT |
| 432 | C-type lectin domain family 11 member A | MQAAWLLGALVVPQLLGFGHG |
| 433 | Collagen alpha-4(IV) chain | MWSLHIVLMRCSFRLTKSLATGPWSLILILFSVQYVYG |
| 434 | C3 and PZP-like alpha-2-macroglobulin domain-containingprotein8 |
MSGALLWPLLPLLLLLLSARDGVRA |
| 435 | Cysteine-rich secretory protein 2 | MALLPVLFLVTVLLPSLPAEG |
| 436 | Chymotrypsinogen B | MASLWLLSCFSLVGAAFG |
| 437 | Cystatin-SA | MAWPLCTLLLLLATQAVALA |
| 438 | Coagulation factor VII | MVSQALRLLCLLLGLQGCLA |
| 439 | Fibroblast growth factor-binding protein 1 | MKICSLTLLSFLLLAAQVLLVEG |
| 440 | Growth/differentiation factor 5 | MRLPKLLTFLLWYLAWLDLEFICTVLG |
| 441 | Glypican-2 | MSALRPLLLLLLPLCPGPGPGPG |
| 442 | Hemicentin-1 | MISWEVVHTVFLFALLYSSLA |
| 443 | Hyaluronan and proteoglycan link protein 4 | MVCARAALGPGALWAAAWGVLLLTAPAGA |
| 444 | Interferon beta | MTNKCLLQIALLLCFSTTALS |
| 445 | Gastric intrinsic factor | MAWFALYLLSLLWATAGT |
| 446 | Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 | MRPGTGQGGLEAPGEPGPNLRQRWPLLLLGLAVVTHG |
| 447 | Interleukin-21 | MERIVICLMVIFLGTLVHKSSS |
| 448 | Interleukin-29 | MAAAWTVVLVTLVLGLAVA |
| 449 | Interleukin-4 receptor alpha chain | MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGN |
| 450 | Kin of IRRE-like protein 3 | MKPFQLDLLFVCFFLFSQELG |
| 451 | Kallikrein-13 | MWPLALVIASLTLALS |
| 452 | Kallikrein-9 | MKLGLLCALLSLLAG |
| 453 | Leukemia inhibitory factor | MKVLAAGVVPLLLVLHWKHGAG |
| 454 | Long palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associatedprotein4 |
MWMAWCVAALSVVAVCGT |
| 455 | Stromelysin-3 | MAPAAWLRSAAARALLPPMLLLLLQPPPLLA |
| 456 | Matrix metalloproteinase-19 | MNCQQLWLGFLLPMTVSG |
| 457 | Endomucin | MELLQVTILFLLPSICSS |
| 458 | Nucleobindin-2 | MRWRTILLQYCFLLITCLLTALEA |
| 459 | Polymeric immunoglobulin receptor | MLLFVLTCLLAVFPAIST |
| 460 | Serine protease 27 | MRRPAAVPLLLLLCFGSQRAKA |
| 461 | Stromal cell-derived factor 1 | MNAKVVVVLVLVLTALCLSDG |
| 462 | Signal-regulatory protein delta | MPIPASPLHPPLPSLLLYLLLELAGVTHV |
| 463 | Slit homolog 1 protein | MALTPGWGSSAGPVRPELWLLLWAAAWRLGASA |
| 464 | Sortilin-related receptor | MATRSSRRESRLPFLFTLVALLPPGALC |
| 465 | Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associatedprotein3 |
MMCPLWRLLIFLGLLALPLAP |
| 466 | Tryptase beta-2 | MLNLLLLALPVLASRAYA |
| 467 | Protein Wnt-11 | MRARPQVCEALLFALALQTGVCYG |
| 468 | Fractalkine | MAPISLSWLLRLATFCHLTVLLAG |
| 469 | Ig-like domain-containing protein ENSP00000270642 | MPPPAPGARLRLLAAAALAGLAVISRGLLS |
| 470 | Apolipoprotein M | MFHQIWAALLYFYGIILNSIYQ |
| 471 | Artemin | MELGLGGLSTLSHCPWPRQQPALWPTLAALALLSSVAEA |
| 472 | Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a | MALVRALVCCLLTAWHCRSGLG |
| 473 | Complement C1q tumornecrosisfactor-relatedprotein1 |
MGSRGQGLLLAYCLLLAFASGLVLS |
| 474 | C-C motif chemokine 28 | MQQRGLAIVALAVCAALHA |
| 475 | T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain | MALPVTALLLPLALLLHAARP |
| 476 | Cat eye syndrome critical region protein 1 | MLVDGPSERPALCFLLLAVAMSFFGSALS |
| 477 | Collagen alpha-1(II) chain | MIRLGAPQTLVLLTLLVAAVLRCQG |
| 478 | Collagen alpha-3(IX) chain | MAGPRACAPLLLLLLLGELLAAAGA |
| 479 | Collagen alpha-1(XX) chain | MSSGDPAHLGLCLWLWLGATLG |
| 480 | Peptidase inhibitor R3HDML | MPLLPSTVGLAGLLFWAGQAVNAL |
| 481 | Crumbs homolog 1 | MALKNINYLLIFYLSFSLLIYIKNS |
| 482 | Beta-defensin 116 | MSVMKPCLMTIAILMILAQKTPG |
| 483 | Beta-defensin 125 | MNILMLTFIICGLLTRVTKG |
| 484 | Protein FAM55D | MKISMINYKSLLALLFILASWIIFTVF |
| 485 | Fibronectin type III domain-containing protein 7 | MAGGRETCLPLIGFILICLKMVASAK |
| 486 | Insulin growth factor-like family member 4 | MVPRISAAIFIFELLGSNS |
| 487 | Immunoglobulin superfamily member 21 | MRTAPSLRRCVCLLLAAILDLARG |
| 488 | Interleukin-17A | MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKA |
| 489 | Inhibin beta B chain | MDGLPGRALGAACLLLLAAGWLGPEAWG |
| 490 | Intelectin-2 | MLSMLRTMTRLCFLLFFSVATSGCSA |
| 491 | Leucine-rich repeat and calponin homology domain-containingprotein3 |
MAAAGLVAVAAAAEYSGTVASG |
| 492 | Neurotrypsin | MTLARFVLALMLGALPEVVG |
| 493 | Neurturin | MQRWKAAALASVLCSSVLS |
| 494 | Protease-associated domain-containing proteinof21kDa |
MVPGAAGWCCLVLWLPACVAA |
| 495 | Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 | MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA |
| 496 | Pigment epithelium-derived factor | MQALVLLLCIGALLGHSSC |
| 497 | Peptidase inhibitor 15 | MIAISAVSSALLFSLLCEA |
| 498 | Plasminogen-related protein A | MEHKEVVLLLLLFLKSGQG |
| 499 | Podocan | MAQSRVLLLLLLLPPQLHL |
| 500 | Putative testis-specific prion protein | MQHSLVFFFAVILHLSHL |
| 501 | Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 | MLLILLSVALLAFSSA |
| 502 | PC3-secreted microprotein | MALRMLWAGQAKGILGGWGIICLVMSLLLQHPGVY |
| 503 | Secretogranin-2 | MAEAKTHWLGAALSLIPLIFLISGAEA |
| 504 | Secreted and transmembrane protein 1 | MQTCPLAFPGHVSQALGTLLFLAASLSA |
| 505 | Semaphorin-3D | MNANKDERLKARSQDFHLFPALMMLSMTMLFLPVTG |
| 506 | Secretoglobin family 3A member 2 | MKLVTIFLLVTISLCSYSATA |
| 507 | Sialate O-acetylesterase | MVAPGLVLGLVLPLILWADRSAG |
| 508 | Sialic acid-binding Ig-like lectin 6 | MQGAQEASASEMLPLLLPLLWAGALA |
| 509 | SPARC | MRAWIFFLLCLAGRALA |
| 510 | Hepatocellular carcinoma-associated protein TD26 | MPVPALCLLWALAMVTRPASA |
| 511 | Trypsin-X3 | MKFILLWALLNLTVALA |
| 512 | Urocortin-2 | MTRCALLLLMVLMLGRVLV |
| 513 | Proto-oncogene protein Wnt-3 | MEPHLLGLLLGLLLGGTRVLA |
| 514 | Uncharacterized protein FLJ37543 | MLAPLFLCCLRNLFRKLIS |
| 515 | Putative uncharacterized protein ENSP00000381830 | MSFEYRHYKREAKICTCRGGWAHVLLCIGVSQGAC |
| 516 | Alpha-2-antiplasmin | MALLWGLLVLSWSCLQGPCSVFSPVSA |
| 517 | Angiotensin-converting enzyme | MGAASGRRGPGLLLPLPLLLLLPPQPALA |
| 518 | Angiopoietin-1 | MTVFLSFAFLAAILT |
| 519 | Apolipoprotein C-IV | MSLLRNRLQALPALCLCVLVLACIGA |
| 520 | Brain-derived neurotrophic factor | MTILFLTMVISYFGCMKA |
| 521 | Uncharacterized protein C1orf54 | MDVLFVAIFAVPLILG |
| 522 | Cerebellin-3 | MLGAKPHWLPGPLHSPGLPLVLVLLALGAGWA |
| 523 | Carboxypeptidase B2 | MKLCSLAVLVPIVLFCEQHVFA |
| 524 | C-C motif chemokine 22 | MDRLQTALLVVLVLLAVALQATEA |
| 525 | Colipase-like protein C6orf126 | MAAALALVAGVLSGAVLPLWS |
| 526 | Uncharacterized protein C7orf34 | MPPLAPQLCRAVFLVPILLLLQVKPLNG |
| 527 | Protein canopy homolog 4 | MGPVRLGILLFLFLAVHEAWA |
| 528 | Collagen alpha-2(VI) chain | MLQGTCSVLLLWGILGAIQA |
| 529 | Tenascin-X | MMPAQYALTSSLVLLVLLSTARA |
| 530 | Endothelin-3 | MEPGLWLLFGLTVTSA |
| 531 | Endothelial cell-specific molecule 1 | MKSVLLLTTLLVPAHLVAA |
| 532 | Protein eyes shut homolog | MTDKSIVILSLMVFHSSFING |
| 533 | Coagulation factor XI | MIFLYQVVHFILFTSVSG |
| 534 | Immunoglobulin alpha Fc receptor | MDPKQTTLLCLVLCLGQRIQA |
| 535 | Low affinity immunoglobulin gamma FcregionreceptorIII-B |
MWQLLLPTALLLLVSA |
| 536 | Granzyme A | MRNSYRFLASSLSVVVSLLLIPEDVC |
| 537 | Hyaluronan and proteoglycan link protein 3 | MGLLLLVPLLLLPGSYG |
| 538 | Interleukin-28B | MTGDCMPVLVLMAAVLTVTGAVPVA |
| 539 | Pancreatic secretory trypsin inhibitor | MKVTGIFLLSALALLSLSGNTGA |
| 540 | Kallistatin | MHLIDYLLLLLVGLLALSHG |
| 541 | Kallikrein-12 | MGLSIFLLLCVLGLSQA |
| 542 | Keratinocyte differentiation-associated protein | MKIPVLPAVVLLSLLVLHSAQG |
| 543 | Putative lipocalin 1-like protein 1 | MKPLLLAISLSLIAALQA |
| 544 | Lysozyme C | MKALIVLGLVLLSVTVQG |
| 545 | MAM domain-containing protein 2 | MLLRGVLLALQALQLAGA |
| 546 | Matrilysin | MRLTVLCAVCLLPGSLA |
| 547 | Oxytocin-neurophysin 1 | MAGPSLACCLLGLLALTSA |
| 548 | NPIP-like protein LOC440350 | MRLRFWLLIWLLLGFISH |
| 549 | Phospholipase A2, membrane associated | MKTLLLLAVIMIFGLLQAHG |
| 550 | Group XIIB secretory phospholipase A2-like protein | MKLASGFLVLWLSLGGGLA |
| 551 | Basement membrane-specific heparansulfateproteoglycancoreprotein |
MGWRAAGALLLALLLHGRLLA |
| 552 | Plasma glutamate carboxypeptidase | MKFLIFAFFGGVHLLSLCSG |
| 553 | Melanocyte protein Pmel 17 | MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGAT |
| 554 | Vitamin K-dependent protein Z | MAGCVPLLQGLVLVLALHRVEPS |
| 555 | Sulfhydryl oxidase 1 | MRRCNSGSGPPPSLLLLLLWLLAVPGANA |
| 556 | Regenerating islet-derived protein 3 gamma | MLPPMALPSVSWMLLSCLILLCQVQG |
| 557 | Secretoglobin family 1C member 1 | MKGSRALLLVALTLFCICRMATG |
| 558 | Sex hormone-binding globulin | MESRGPLATSRLLLLLLLLLLRHTRQGWA |
| 559 | Tomoregulin-2 | MVLWESPRQCSSWTLCEGFCWLLLLPVMLLIVARPVKLAA |
| 560 | Trefoil factor 2 | MGRRDAQLLAALLVLGLCALAGS |
| 561 | Tachykinin-4 | MLPCLALLLLMELSVCTVA |
| 562 | Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A | MGLSTVPDLLLPLVLLELLVG |
| 563 | Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 | MVRLPLQCVLWGCLLTAVHP |
| 564 | Usherin | MNCPVLSLGSGFLFQVIEMLIFAYFASISLT |
| 565 | Urotensin-2 | MYKLASCCLLFIGFLNPLLS |
| 566 | V-set and transmembrane domain-containing protein 2A | MMGIFLVYVGFVFFSVLYVQQGL |
| 567 | Protein Wnt-6 | MLPPLPSRLGLLLLLLLCPAHVGG |
| 568 | Putative uncharacterized protein FP248 | MGTGGSLLCGCSLVLSCLCPSAS |
| 569 | Putative serine protease LOC138652 | MGYCQGVSQVAVVLLMFPKEKEA |
| 570 | Zona pellucida sperm-binding protein 3 | MELSYRLFICLLLWGSTELCYP |
| 571 | Signal peptide, CUB and EGF-like domain-containingprotein3 |
MGSGRVPGLCLLVLLVHARA |
| 572 | C-type natriuretic peptide | MHLSQLLACALLLTLLSLRPSEA |
| 573 | Antithrombin-III | MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTC |
| 574 | Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3b | MRLLAWLIFLANWGGARA |
| 575 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs13 |
MHQRHPRARCPPLCVAGILACGFLLGCWG |
| 576 | B melanoma antigen 1 | MAARAVFLALSAQLLQA |
| 577 | Complement C1q subcomponent subunit A | MEGPRGWLVLCVLAISLASMVT |
| 578 | Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 2 | MIPWVLLACALPCAA |
| 579 | Uncharacterized protein C1orf187 | MAGPAIHTAPMLFLVLLLPLELSLA |
| 580 | Carbonic anhydrase-related protein 11 | MGAAARLSAPRALVLWAALGAAA |
| 581 | C-C motif chemokine 19 | MALLLALSLLVLWTSPAPTLS |
| 582 | Monocyte differentiation antigen CD14 | MERASCLLLLLLPLVHVSA |
| 583 | CUB domain-containing protein 1 | MAGLNCGVSIALLGVLLLGAARLPRGAEA |
| 584 | UPF0669 protein C6orf120 | MAAPRGRAAPWTTALLLLLASQVLSPGSCA |
| 585 | Chitinase-3-like protein 1 | MGVKASQTGFVVLVLLQCCSA |
| 586 | Uncharacterized protein C18orf54 | MAKSKTKHRLCSQESSVSALLASCTLSGSNS |
| 587 | Cystatin-8 | MPRCRWLSLILLTIPLALVAR |
| 588 | Secreted frizzled-related protein 3 | MVCGSPGGMLLLRAGLLALAALCLLRVPGARA |
| 589 | Beta-defensin 118 | MKLLLLALPMLVLLPQVIP |
| 590 | Beta-defensin 133 | MKIHVFLFVLFFFLVPIATRVKC |
| 591 | Beta-defensin 1 | MRTSYLLLFTLCLLLSEMASG |
| 592 | Dermokine | MKFQGPLACLLLALCLGSGEA |
| 593 | Protein FAM24A | MAKMFDLRTKIMIGIGSSLLVAAMVLLSVVFC |
| 594 | Fibrinogen-like protein 1 | MAKVFSFILVTTALTMGREISA |
| 595 | Folate receptor gamma | MAWQMMQLLLLALVTAAGSAQPR |
| 596 | Growth/differentiation factor 11 | MVLAAPLLLGFLLLALELRPRGEA |
| 597 | Granzyme K | MTKFSSFSLFFLIVGAYMTHVCFN |
| 598 | Major histocompatibility complexclassI-relatedgeneprotein |
MGELMAFLLPLIIVLMVKHSDS |
| 599 | Immunoglobulin superfamily member 1 | MTLDRPGEGATMLKTFT |
| 600 | Interleukin-1 receptor antagonist protein | MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC |
| 601 | Serine protease inhibitor Kazal-type 5 | MKIATVSVLLPLALCLIQDAAS |
| 602 | Immunoglobulin superfamily containing leucine-richrepeatprotein |
MQELHLLWWALLLGLAQA |
| 603 | Putative killer cell immunoglobulin-like receptorlikeproteinKIR3DP1 |
MSLMVISMACVGFFLLQGAWT |
| 604 | Laminin subunit alpha-4 | MALSSAWRSVLPLWLLWSAACSRA |
| 605 | Leucine zipper protein 2 | MKFSPAHYLLPLLPALVLS |
| 606 | Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein 1 | MRHGVAWALLVAAALGLGARGVRG |
| 607 | Protein-lysine 6-oxidase | MRFAWTVLLLGPLQLCALVHC |
| 608 | Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 | MMLRVLVGAVLPAML |
| 609 | Neurotensin/neuromedin N | MMAGMKIQLVCMLLLAFSSWSLC |
| 610 | Group 3 secretory phospholipase A2 | MGVQAGLFGMLGFLGVALG |
| 611 | Placenta growth factor | MPVMRLFPCFLQLLAGLA |
| 612 | Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 11 | MGPLSAPPCTEHIKWKGLLLTALLLNFWNLPTTA |
| 613 | Ribonuclease T2 | MRPAALRGALLGCLCLALLCLGGA |
| 614 | R-spondin-1 | MRLGLCVVALVLSWTHLTIS |
| 615 | Semaphorin-3E | MASAGHIITLLLWGYLLELWTGGHT |
| 616 | Kunitz-type protease inhibitor 1 | MAPARTMARARLAPAGIPAVALWLLCTLGLQGTQA |
| 617 | Transmembrane protein 25 | MALPPGPAALRHTLLLLPALLSSGWG |
| 618 | WAP four-disulfide core domain protein 10A | MAPQTLLPVLVLCVLLLQAQG |
| 619 | WAP four-disulfide core domain protein 3 | MMLSCLFLLKALLALGSLESWITA |
| 620 | Protein Wnt-10a | MGSAHPRPWLRLRPQPQPRPALWVLLFFLLLLAAA |
| 621 | Abhydrolase domain-containing protein 9 | MPELVVTALLAPSRLSLKLLRAFMWSLVFSVALVA |
| 622 | ADAM 12 | MAARPLPVSPARALLLALAGALLAPCEA |
| 623 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs2 |
MDPPAGAARRLLCPALLLLLLLLPPPLLP |
| 624 | Bone morphogenetic protein 3b | MAHVPARTSPGPGPQLLLLLLPLFLLLLRDVAG |
| 625 | Complement C1q-like protein 4 | MVLLLLVAIPLLVHS |
| 626 | Complement C1r subcomponent-like protein | MPGPRVWGKYLWRSPHSKGCPGAMWWLLLWGVLQA |
| 627 | Uncharacterized protein C1orf56 | MVPAAGALLWVLLLNLGPRAAGA |
| 628 | Cathelicidin antimicrobial peptide | MKTQRDGHSLGRWSLVLLLLGLVMPLAIIA |
| 629 | Carboxypeptidase A2 | MAMRLILFFGALFGHI |
| 630 | C-C motif chemokine 4-like | MKLCVTVLSLLVLVAAFCSLALS |
| 631 | C-C motif chemokine 13 | MKVSAVLLCLLLMTAA |
| 632 | Neural cell adhesion molecule L1-like protein | MEPLLLGRGLIVYLMFLLLKFSKA |
| 633 | Complement C4-B | MRLLWGLIWASSFFTLSLQ |
| 634 | Collagen alpha-1(IX) chain | MKTCWKIPVFFFVCSFLEPWASA |
| 635 | Cartilage oligomeric matrix protein | MVPDTACVLLLTLAALGASG |
| 636 | Cysteine-rich secretory protein LCCL domain-containing 1 | MKCTAREWLRVTTVLFMARAIPA |
| 637 | UPF0556 protein C19orf10 | MAAPSGGWNGVGASLWAALLLGAVALRPAEA |
| 638 | Uncharacterized protein C19orf36 | MALLLCLVCLTAALA |
| 639 | Granulocyte-macrophage colony-stimulating factorreceptorsubunitalpha |
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP |
| 640 | Beta-defensin 103 | MRIHYLLFALLFLFLVPVPGHG |
| 641 | Beta-defensin 123 | MKLLLLTLTVLLLLSQLTPG |
| 642 | Beta-defensin 130 | MKLHSLISVLLLFVTLIPKGKT |
| 643 | Beta-defensin 2 | MRVLYLLFSFLFIFLMPLPGVFG |
| 644 | Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5 | MATSWGTVFFMLVVSCVCSA |
| 645 | Protein FAM55A | MSSNTMLQKTLLILISFSVVT |
| 646 | Protein FAM3B | MRPLAGGLLKVVFVVFASLCAWYSGYLLA |
| 647 | Complement factor H-related protein 4 | MLLLINVILTLWVSCANGQ |
| 648 | Glucose-fructose oxidoreductase domain-containingprotein1 |
MLPGVGVFGTSLTARVIIPLL |
| 649 | Hemopexin | MARVLGAPVALGLWSLCWSLAIA |
| 650 | Ig heavy chain V-I region HG3 | MDWTWRVFCLLAVAPGAHS |
| 651 | Insulin-like growth factor-binding protein 4 | MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG |
| 652 | Interleukin-17B | MDWPHNLLFLLTISIFLGLG |
| 653 | Interleukin-1 receptor type I | MKVLLRLICFIALLISS |
| 654 | Interleukin-5 | MRMLLHLSLLALGAAYVYA |
| 655 | Inhibin beta A chain | MPLLWLRGFLLASCWIIVRS |
| 656 | Epididymal-specific lipocalin-12 | MRLLCGLWLWLSLLKVLQA |
| 657 | Ly-6/neurotoxin-like protein 1 | MTPLLTLILVVLMGLPLAQA |
| 658 | 72 kDa type IV collagenase | MEALMARGALTGPLRALCLLGCLLSHAAA |
| 659 | Serine protease MPN2 | MAAPASVMGPLGPSALGLLLLLLVVAPPRVAA |
| 660 | Neuronal pentraxin-like protein C16orf38 | MGCSWRKTLSFFLVFVPIYLHGASS |
| 661 | Neurexophilin-1 | MQAACWYVLFLLQPTVYLVTC |
| 662 | Group IIE secretory phospholipase A2 | MKSPHVLVFLCLLVALVTG |
| 663 | Platelet-derived growth factor D | MHRLIFVYTLICANFCSC |
| 664 | Platelet factor 4 | MSSAAGFCASRPGLLFLGLLLLPLVVAFASA |
| 665 | Periostin | MIPFLPMFSLLLLLIVNPINA |
| 666 | Basic salivary proline-rich protein 3 | MLLILLSVALLALSSA |
| 667 | Prostasin | MAQKGVLGPGQLGAVAILLYLGLLRSGTG |
| 668 | Poliovirus receptor | MARAMAAAWPLLLVALLVLS |
| 669 | Retinol-binding protein 3 | MMREWVLLMSVLLCGLA |
| 670 | WAP, kazal, immunoglobulin, kunitz and NTRdomain-containingprotein1 |
MPALRPLLPLLLLLRLTSG |
| 671 | Protein Wnt-5a | MKKSIGILSPGVALGMAGSAMSSKFFLVALAIFFS |
| 672 | Uncharacterized lipocalin UNQ2541/PRO6093 | MMSFLLGAILTLLWAPTAQA |
| 673 | Zona pellucida sperm-binding protein 4 | MWLLRCVLLCVSLSLAVS |
| 674 | Alpha-amylase 1 | MKLFWLLFTIGFCWA |
| 675 | Complement C1q-like protein 2 | MALGLLIAVPLLLQAAPRGAA |
| 676 | Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 9 | MRIWWLLLAIEICTGNINS |
| 677 | C-C motif chemokine 24 | MAGLMTIVTSLLFLGVCAHHIIPTGS |
| 678 | Uncharacterized protein C4orf26 | MARRHCFSYWLLVCWLVVTVAEG |
| 679 | CD166 antigen | MESKGASSCRLLFCLLISATVFRPGLG |
| 680 | Uncharacterized protein C14orf93 | MSFSATILFSPPSGSEA |
| 681 | Collagen alpha-5(VI) chain | MKILLIIFVLIIWTETLA |
| 682 | Complement component C8 gamma chain | MLPPGTATLLTLLLAAGSLG |
| 683 | Collagen alpha-1(X) chain | MLPQIPFLLLVSLNLVHG |
| 684 | Putative uncharacterized protein C17orf69 | MHPWLGSALGFPKCRG |
| 685 | Cysteine-rich motor neuron 2 protein | MAGVGAAALSLLLHLGALALAAGAEG |
| 686 | Cysteine-rich secretory protein 3 | MTLFPVLLFLVAGLLPSFPA |
| 687 | Macrophage colony-stimulating factor 1 | MTAPGAAGRCPPTTWLGSLLLLVCLLASRSIT |
| 688 | Beta-defensin 108B | MRIAVLLFAIFFFMSQVLPARG |
| 689 | Complement decay-accelerating factor | MTVARPSVPAALPLLGELPRLLLLVLLCLPAVWG |
| 690 | Estradiol 17-beta-dehydrogenase 11 | MKFLLDILLLLPLLIVCSL |
| 691 | EMILIN-2 | MWQPRRPWPRVPWRWALALLALVGAGLCHA |
| 692 | EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 | MLKALFLTMLTLALVKS |
| 693 | Fibroblast growth factor 5 | MSLSFLLLLFFSHLILS |
| 694 | Fibroblast growth factor receptor 4 | MRLLLALLGVLLSVPGPPVLS |
| 695 | Glia-derived nexin | MNWHLPLFLLASVTLPSIC |
| 696 | Gamma-glutamyl hydrolase | MASPGCLLCVLGLLLCGAASLELS |
| 697 | Glutathione peroxidase 3 | MARLLQASCLLSLLLAGFVS |
| 698 | Histatin-1 | MKFFVFALVLALMISMISA |
| 699 | Insulin-like growth factor II | MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIA |
| 700 | Interleukin-19 | MKLQCVSLWLLGTILILCSVDNHG |
| 701 | Interleukin-32 | MCFPKVLSDDMKKLKARMVMLLPTSAQGLG |
| 702 | Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H5-like protein | MSGWRYLICVSFLLTILLELTYQ |
| 703 | Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 | MKPPRPVRTCSKVLVLLSLLAIHQTTTA |
| 704 | Uncharacterized protein KIAA0495 | MCLLSSSAASDLAATSLTA |
| 705 | Plasma kallikrein | MILFKQATYFISLFATVSC |
| 706 | Ig kappa chain V-I region HK101 | MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC |
| 707 | Laminin subunit gamma-1 | MRGSHRAAPALRPRGRLWPVLAVLAAAAAAGCA |
| 708 | Left-right determination factor 2 | MWPLWLCWALWVLPLAGPGAA |
| 709 | Lipase member H | MLRFYLFISLLCLSRSDA |
| 710 | Noelin | MSVPLLKIGVVLSTMA |
| 711 | Protocadherin alpha-10 | MVSRCSCLGVQCLLLSLLLLAAWEVGSG |
| 712 | Plexin-B1 | MPALGPALLQALWAGWVLT |
| 713 | Prolactin | MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP |
| 714 | Poliovirus receptor-related protein 4 | MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPA |
| 715 | Secretoglobin family 1D member 4 | MRLSVCLLMVSLALCCYQAHA |
| 716 | Slit homolog 2 protein | MRGVGWQMLSLSLGLVLAILNKVAPQACPA |
| 717 | Trefoil factor 1 | MATMENKVICALVLVSMLALGTLA |
| 718 | Scavenger receptor cysteine-rich domain-containingproteinLOC284297 |
MRVLACLLAALVGIQA |
| 719 | Trefoil factor 3 | MAARALCMLGLVLALLSSSSA |
| 720 | Metalloproteinase inhibitor 1 | MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA |
| 721 | Vascular endothelial growth factor receptor 1 | MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSG |
| 722 | WNT1-inducible-signaling pathway protein 1 | MRWFLPWTLAAVTAAAASTVLA |
| 723 | Uncharacterized protein ENSP00000244321 | MRLSRRPETFLLAFVLLCTLLGLGCP |
| 724 | Anthrax toxin receptor 2 | MVAERSPARSPGSWLFPGLWLLVLSGPGGLLRA |
| 725 | Apolipoprotein C-I | MRLFLSLPVLVVVLSIVLEGPAPAQG |
| 726 | Lymphotoxin-alpha | MTPPERLFLPRVCGTTLHLLLLGLLLVLLPGAQG |
| 727 | ADAMTS-like protein 2 | MDGRWQCSCWAWFLLVLAVVAG |
| 728 | ADAMTS-like protein 4 | MENWTGRPWLYLLLLLSLPQLCLD |
| 729 | Complement C1q-like protein 3 | MVLLLVILIPVLVSSAGTSA |
| 730 | Collagen alpha-6(IV) chain | MLINKLWLLLVTLCLTEELAAA |
| 731 | Collagen alpha-6(VI) chain | MMLLILFLVIICSHISVNQ |
| 732 | EGF-like domain-containing protein 6 | MPLPWSLALPLLLSWVAGGFG |
| 733 | EMILIN-3 | MGRRRLLVWLCAVAALLSGAQA |
| 734 | Ephrin type-A receptor 10 | METCAGPHPLRLFLCRMQLCLALLLGPWRPGTA |
| 735 | Fibroblast growth factor-binding protein 3 | MTPPKLRASLSPSLLLLLSGCLLAAA |
| 736 | Complement factor H-related protein 2 | MWLLVSVILISRISSVGG |
| 737 | Fibrinogen beta chain | MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLLLLCVFLVKS |
| 738 | Fibronectin type III domain-containing protein 1 | MAPEAGATLRAPRRLSWAALLLLAALLPVASS |
| 739 | Growth/differentiation factor 6 | MDTPRVLLSAVFLISFLWDLPG |
| 740 | Hyaluronidase-1 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQG |
| 741 | Interferon epsilon-1 | MIIKHFFGTVLVLLASTTIFS |
| 742 | Interleukin-1 receptor accessory protein | MTLLWCVVSLYFYGILQSDA |
| 743 | Ig kappa chain V-I region HK102 | MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC |
| 744 | Ig kappa chain V-II region RPMI 6410 | MRLPAQLLGLLMLWVPGSSG |
| 745 | Epididymal-specific lipocalin-10 | MRQGLLVLALVLVLVLVLA |
| 746 | Leucine-rich repeat LGI family member 3 | MAGLRARGGPGPGLLALSALGFCLMLQVSA |
| 747 | Lysozyme-like protein 6 | MTKALLIYLVSSFLALNQA |
| 748 | Mucin-like protein 1 | MKFLAVLVLLGVSIFLVSAQ |
| 749 | Group IID secretory phospholipase A2 | MELALLCGLVVMAGVIPIQG |
| 750 | Procollagen C-endopeptidase enhancer 2 | MRGANAWAPLCLLLAAATQLSRQ |
| 751 | Basic salivary proline-rich protein 1 | MLLILLSVALLALSSA |
| 752 | Peroxidasin homolog | MAKRSRGPGRRCLLALVLFCAWGTLA |
| 753 | Ribonuclease 8 | MAPARAGCCPLLLLLLGLWVAEVLVRA |
| 754 | Semaphorin-3B | MGRAGAAAVIPGLALLWAVGLGSA |
| 755 | Secreted Ly-6/uPAR-related protein 1 | MASRWAVQLLLVAAWSMGCGE |
| 756 | Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B | MRALEGPGLSLLCLVLALPALLPVPAVRG |
| 757 | Triggering receptor expressed on myeloid cells 1 | MRKTRLWGLLWMLFVSELRA |
| 758 | von Willebrand factor | MIPARFAGVLLALALILPGTLC |
| 759 | Protein Wnt-16 | MDRAALLGLARLCALWAALLVLFPYGAQG |
| 760 | Putative uncharacterized protein FLJ21075 | MGFHFCIWIIFLLPPPCKKC |
| 761 | Arylsulfatase F | MRPRRPLVFMSLVCALLNTCQA |
| 762 | ADAMTS-like protein 5 | MGKLRPGRVEWLASGHTERPHLFQNLLLFLWA |
| 763 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs17 |
MCDGALLPPLVLPVLLLLVWGLDPGTA |
| 764 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs9 |
MQFVSWATLLTLLVRDLA |
| 765 | Bactericidal/permeability-increasing protein-like 2 | MCTKTIPVLWGCFLLWNLYVSSS |
| 766 | Putative uncharacterized protein C1orf191 | MWGFLVLKARWLVTPVRT |
| 767 | Carboxypeptidase B | MLALLVLVTVALASA |
| 768 | Uncharacterized protein C10orf25 | MVPGPPESVVRFFLWFCFLLPPTRKASC |
| 769 | UPF0454 protein C12orf49 | MVNLAAMVWRRLLRKRWVLALVFGLSLVYFLSS |
| 770 | Putative uncharacterized protein C14orf144 | MCRETAGYGWLLASTELLSLLEPLSP |
| 771 | Beta-Ala-His dipeptidase | MDPKLGRMAASLLAVLLLLLERGMFS |
| 772 | Collagen alpha-2(IV) chain | MGRDQRAVAGPALRRWLLLGTVTVG |
| 773 | Complement component C8 alpha chain | MFAVVFFILSLMTCQPGVTA |
| 774 | Collagen alpha-2(XI) chain | MERCSRCHRLLLLLPLVLGLSA |
| 775 | Complement component receptor 1-like protein | MAPPVRLERPFPSRRFPGLLLAALVLLLSSFS |
| 776 | Platelet basic protein | MSLRLDTTPSCNSARPLHALQVLLLLSLLLTALA |
| 777 | Follistatin-related protein 4 | MKPGGFWLHLTLLGASLPAALG |
| 778 | Protein G7c | MLPTEVPQSHPGPSALLLLQLLLPPTSA |
| 779 | Gastric inhibitory polypeptide | MVATKTFALLLLSLFLAVGLG |
| 780 | Gastrokine-1 | MLAYSSVHCFREDKMKFTIV |
| 781 | Glycosyltransferase 1 domain-containing protein 1 | MRLLFLAVLRPHTGNA |
| 782 | Interleukin-20 | MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTG |
| 783 | Interleukin-27 subunit beta | MTPQLLLALVLWASCPPCSG |
| 784 | Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein1 |
MLPPPRPAAALALPVLLLLLVVLTPPPTGA |
| 785 | Kallikrein-10 | MRAPHLHLSAASGARALAKLLPLLMAQLWA |
| 786 | Kallikrein-7 | MARSLLLPLQILLLSLALETAG |
| 787 | Ig kappa chain V region EV15 | MGSQVHLLSFLLLWISDTRA |
| 788 | Long palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associatedprotein1 |
MAGPWTFTLLCGLLAATLIQA |
| 789 | Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 | MGLPEPGPLRLLALLLLLLLLLLLQLQHLAAA |
| 790 | Cartilage matrix protein | MRVLSGTSLMLCSLLLLLQALC |
| 791 | Melanoma-derived growth regulatory protein | MARSLVCLGVIILLSAFSGPGVRG |
| 792 | Matrix metalloproteinase-16 | MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILC |
| 793 | Multimerin-2 | MILSLLFSLGGPLGWGLLGAWA |
| 794 | Protein NOV homolog | MQSVQSTSFCLRKQCLCLTFLLLHLLGQVAA |
| 795 | Oocyte-secreted protein 1 homolog | MKTILGFKGLFYLHSLIWTCAGDWSA |
| 796 | Secretory phospholipase A2 receptor | MLLSPSLLLLLLLGAPRGCA |
| 797 | Proline-rich protein 1 | MKLTFFLGLLALISCFTPSES |
| 798 | Putative pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 7 | MGPLSAPPCTQHITWKGLLLTASLLNFWNPPTTA |
| 799 | Poliovirus receptor-related protein 1 | MARMGLAGAAGRWWGLALGLTAFFLPGVHS |
| 800 | Glutaminyl-peptide cyclotransferase | MAGGRHRRVVGTLHLLLLVAALPWASRG |
| 801 | Trypsin-1 | MNPLLILTFVAAALA |
| 802 | Thyrotropin subunit beta | MTALFLMSMLFGLTCGQAMS |
| 803 | Putative testis serine protease 2 | MSSGGGSRGLLAWLLLLQPWPGQNWA |
| 804 | von Willebrand factor C domain-containing protein 2-like | MALHIHEACILLLVIPGLVTS |
| 805 | EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 | MKRSVAVWLLVGLSLG |
| 806 | ADAM 28 | MLQGLLPVSLLLSVAVSA |
| 807 | B melanoma antigen 5 | MAAGAVFLALSAQLLQA |
| 808 | Probetacellulin | MDRAARCSGASSLPLLLALALGLVILHCVVA |
| 809 | Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 4 | MLPLLLGLLGPAACWA |
| 810 | Carboxypeptidase N catalytic chain | MSDLLSVFLHLLLLFKLVAP |
| 811 | Coiled-coil domain-containing protein 80 | MTWRMGPRFTMLLAMWLVCGS |
| 812 | Protein CEI | MVAPAARVFLRAVRAALTSTVPDLLCLLARGSPRG |
| 813 | Bile salt-activated lipase | MGRLQLVVLGLTCCWAVASA |
| 814 | Putative cystatin-9-like 2 | MWSLPPSRALSCAPLLLLFSFQFLVTYA |
| 815 | Protein CYR61 | MSSRIARALALVVTLLHLTRLALS |
| 816 | Beta-defensin 135 | MATRSVLLALVVLNLLFYVPPGRS |
| 817 | Epidermal growth factor receptor | MRPSGTAGAALLALLAALCPASRA |
| 818 | Elastase-2A | MIRTLLLSTLVAGALS |
| 819 | Inactive carboxylesterase 4 | MWLPALVLATLAASAAWA |
| 820 | Fibrillin-2 | MGRRRRLCLQLYFLWLGCVVLWAQGTAG |
| 821 | Fibroleukin | MKLANWYWLSSAVLATYGFLVVA |
| 822 | Leucine-rich repeat transmembrane protein FLRT1 | MDLRDWLFLCYGLIAFLTEV |
| 823 | Follistatin-related protein 3 | MRPGAPGPLWPLPWGALAWAVGFVSS |
| 824 | Beta-galactosidase-1-like protein 2 | MTTWSLRRRPARTLGLLLLVVLGFLVLRRLDW |
| 825 | Gremlin-1 | MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEG |
| 826 | Interferon alpha-1/13 | MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLG |
| 827 | Indian hedgehog protein | MSPARLRPRLHFCLVLLLLLVVPAAWG |
| 828 | Interleukin-12 subunit beta | MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA |
| 829 | Interleukin-27 subunit alpha | MGQTAGDLGWRLSLLLLPLLLVQAGVWG |
| 830 | Interleukin-3 | MSRLPVLLLLQLLVRPGLQ |
| 831 | Inhibin beta E chain | MRLPDVQLWLVLLWALVRA |
| 832 | Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 | MKRLTCFFICFFLSEVSG |
| 833 | Kallikrein-5 | MATARPPWMWVLCALITALLLG |
| 834 | Ig kappa chain V-III region VG | MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG |
| 835 | Apolipoprotein(a)-like protein 2 | MEHKEVVLLLLLFLKSAPTET |
| 836 | Complement-activating component of Ra-reactive factor | MRWLLLYYALCFSLSKASA |
| 837 | Microfibrillar-associated protein 5 | MSLLGPKVLLFLAAFIITSDW |
| 838 | Opticin | MRLLAFLSLLALVLQETGT |
| 839 | Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 4 | MGPLSAPPCTQRITWKGVLLTASLLNFWNPPTTA |
| 840 | Secretogranin-3 | MGFLGTGTWILVLVLPIQA |
| 841 | Semaphorin-3G | MAPSAWAICWLLGGLLLHGGSS |
| 842 | Surfactant-associated protein G | MGSGLPLVLLLTLLGSSHG |
| 843 | SPARC-related modular calcium-binding protein 2 | MLLPQLCWLPLLAGLLPPVPA |
| 844 | Kunitz-type protease inhibitor 3 | MQLQASLSFLLILTLCLELRSELA |
| 845 | Protein TSPEAR | MSALLSLCFVLPLAAPGHG |
| 846 | Protein WFDC11 | MVSLMKLWIPMLMTFFCTVLLSVLG |
| 847 | Protein Wnt-10b | MLEEPRPRPPPSGLAGLLFLALCSRALS |
| 848 | Angiopoietin-related protein 4 | MSGAPTAGAALMLCAATAVLLSAQG |
| 849 | Apolipoprotein C-II | MGTRLLPALFLVLLVLGFEVQG |
| 850 | Protein ARMET | MRRMWATQGLAVALALSVLPG |
| 851 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs12 |
MPCAQRSWLANLSVVAQLLNFGALC |
| 852 | Bone morphogenetic protein 10 | MGSLVLTLCALFCLAAYLVSG |
| 853 | Carboxypeptidase A5 | MQGTPGGGTRPGPSPVDRRTLLVFSFILAAALG |
| 854 | Carboxypeptidase Z | MPPPLPLLLLTVLVVAAA |
| 855 | C-C motif chemokine 18 | MKGLAAALLVLVCTMALCSC |
| 856 | Fibronectin type-III domain-containing protein C4orf31 | MVLLHWCLLWLLFPLSSRT |
| 857 | Uncharacterized protein C6orf15 | MQGRVAGSCAPLGLLLVCLHLPGLFA |
| 858 | Complement factor B | MGSNLSPQLCLMPFILGLLSGGVTT |
| 859 | Calcium-activated chloride channel regulator family member 3 | MVFSLKVILFLSLLLSPVLK |
| 860 | Putative uncharacterized protein C13orf28 | MAVSQGDGTLCFVLLLCCWQETEL |
| 861 | Complement component C7 | MKVISLFILVGFIGEFQSFSSA |
| 862 | Cochlin | MSAAWIPALGLGVCLLLLPGPAGS |
| 863 | Chordin-like protein 1 | MGGMKYIFSLLFFLLLEGGKT |
| 864 | UPF0510 protein C19orf63 | MAAASAGATRLLLLLLMAVAAPSRARG |
| 865 | Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor | MWLQSLLLLGTVACSIS |
| 866 | Cystatin-like 1 | MGIGCWRNPLLLLIALVLS |
| 867 | C-X-C motif chemokine 3 | MAHATLSAAPSNPRLLRVALLLLLLVAASRRAAG |
| 868 | 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase 13 | MNIILEILLLLITIIYSYL |
| 869 | Elastase-1 | MLVLYGHS |
| 870 | EGF-like module-containing mucin-like hormonereceptor-like3 |
MQGPLLLPGLCFLLSLFGAVT |
| 871 | Ephrin type-A receptor 3 | MDCQLSILLLLSCSVLDSFG |
| 872 | Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 | MRANDALQVLGLLFSLARG |
| 873 | Fibulin-7 | MVPSSPRALFLLLLILACPEPRAS |
| 874 | Folate receptor beta | MVWKWMPLLLLLVCVA |
| 875 | Follistatin-related protein 1 | MWKRWLALALALVAVAWVRA |
| 876 | Growth hormone receptor | MDLWQLLLTLALAGSSDA |
| 877 | Glutathione peroxidase 7 | MVAATVAAAWLLLWAAACA |
| 878 | Hepatocyte growth factor-like protein | MGWLPLLLLLTQCLGVPG |
| 879 | Hyaluronidase-3 | MTTQLGPALVLGVALCLGCG |
| 880 | Interferon alpha-17 | MALSFSLLMAVLVLSYKSICSLG |
| 881 | Interferon omega-1 | MALLFPLLAALVMTSYSPVGS |
| 882 | Interleukin-4 | MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHG |
| 883 | Interleukin-9 | MLLAMVLTSALLLCSVAG |
| 884 | Serine protease inhibitor Kazal-type 5-like 3 | MAAFPHKIIFFLVCSTLTHVAFS |
| 885 | Laminin subunit alpha-3 | MAAAARPRGRALGPVLPPTPLLLLVLRVLPACGAT |
| 886 | Hepatic triacylglycerol lipase | MDTSPLCFSILLVLCIFIQSSA |
| 887 | Latent-transforming growth factor beta-binding protein 2 | MRPRTKARSPGRALRNPWRGFLPLTLALFVGAGHA |
| 888 | Matrix metalloproteinase-20 | MKVLPASGLAVFLIMALKFSTA |
| 889 | Mucin-7 | MKTLPLFVCICALSACFSFSEG |
| 890 | Matrix-remodeling-associated protein 5 | MPKRAHWGALSVVLILLWGHPRVALA |
| 891 | Ecto-ADP-ribosyltransferase 5 | MALAALMIALGSLGLHTWQAQA |
| 892 | Vasopressin-neurophysin 2-copeptin | MPDTMLPACFLGLLAFSSA |
| 893 | Nidogen-1 | MLASSSRIRAAWTRALLLPLLLAGPVGC |
| 894 | Neurexophilin-3 | MQLTRCCFVFLVQGSLYLVICG |
| 895 | Osteoclast associated immunoglobulin-like receptor | MALVLILQLLTLWPLCHT |
| 896 | Peptidoglycan recognition protein | MSRRSMLLAWALPSLLRLGAA |
| 897 | Plasminogen-related protein B | MEHKEVVLLLLLFLKSGQG |
| 898 | Protein Plunc | MFQTGGLIVFYGLLAQTMA |
| 899 | Podocan-like protein 1 | MAESGLAMWPSLLLLLLLPGPPPVAG |
| 900 | Placental protein 11 | MRACISLVLAVLCGLAWA |
| 901 | Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta | MRILKRFLACIQLLCVCRLDWANG |
| 902 | Prorelaxin H2 | MPRLFFFHLLGVCLLLNQFSRAVA |
| 903 | Ribonuclease pancreatic | MALEKSLVRLLLLVLILLVLGWVQPSLG |
| 904 | Ribonuclease-like protein 9 | MMRTLITTHPLPLLLLPQQLLQLVQF |
| 905 | Ribonuclease-like protein 10 | MKLNLVQIFFMLLMLLLGLGMGLGLG |
| 906 | Secreted frizzled-related protein 1 | MGIGRSEGGRRGAALGVLLALGAALLAVGSA |
| 907 | Pulmonary surfactant-associated protein D | MLLFLLSALVLLTQPLGYLE |
| 908 | Spermatogenesis-associated protein 6 | MPKVKALQCALALEISSVTC |
| 909 | Tissue factor pathway inhibitor 2 | MDPARPLGLSILLLFLTEAALG |
| 910 | Thrombospondin-4 | MLAPRGAAVLLLHLVLQRWLAAGAQA |
| 911 | Protein Wnt-9b | MRPPPALALAGLCLLALPAAAA |
| 912 | Dickkopf-related protein 3 | MQRLGATLLCLLLAAAVPTAP |
| 913 | Alpha-1-acid glycoprotein 2 | MALSWVLTVLSLLPLLEA |
| 914 | Amiloride-sensitive amine oxidase [copper-containing] | MPALGWAVAAILMLQTAMA |
| 915 | ADM2 | MARIPTAALGCISLLCLQLPGSLS |
| 916 | Amelogenin, Y isoform | MGTWILFACLVGAAFA |
| 917 | Angiopoietin-related protein 5 | MMSPSQASLLFLNVCIFICGEAVQG |
| 918 | Apolipoprotein A-IV | MFLKAVVLTLALVAVAGARA |
| 919 | ADAMTS-like protein 3 | MASWTSPWWVLIGMVFMHSPLPQTTA |
| 920 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs14 |
MAPLRALLSYLLPLHCALCAAA |
| 921 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs7 |
MPGGPSPRSPAPLLRPLLLLLCALAPG |
| 922 | B melanoma antigen 3 | MAAGVVFLALSAQLLQA |
| 923 | Bone morphogenetic protein 15 | MVLLSILRILFLCELVLF |
| 924 | Bone morphogenetic protein 4 | MIPGNRMLMVVLLCQVLLG |
| 925 | Mus musculus Ig H-chain V-regiongene,exonandpartialcds |
MGWSYIILFLVAT |
| 926 | Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 3 | MLWRQLIYWQLLALFFLPFCLC |
| 927 | Carbonic anhydrase 6 | MRALVLLLSLFLLGGQA |
| 928 | C-C motif chemokine 1 | MQIITTALVCLLLAGMWPEDVDS |
| 929 | C-C motif chemokine 5 | MKVSAAALAVILIATALCAPASA |
| 930 | CUB domain-containing protein 2 | MLAEWGACLLLAVALLGPGLQA |
| 931 | Uncharacterized protein C11orf44 | MVLLCLFLASLAATPRA |
| 932 | Collagen alpha-1(IV) chain | MGPRLSVWLLLLPAALLLHEEHSRAAA |
| 933 | Collagen alpha-1(VIII) chain | MAVLPGPLQLLGVLLTISLSSIRLIQA |
| 934 | Collagen alpha-1(XIV) chain | MKIFQRKMRYWLLPPFLAIVYFCTIVQG |
| 935 | Collagen triple helix repeat-containing protein 1 | MRPQGPAASPQRLRGLLLLLLLQLPAPSSA |
| 936 | Beta-defensin 134 | MKPLLVVFVFLFLWDPVLA |
| 937 | Defensin-6 | MRTLTILTAVLLVALQAKA |
| 938 | Dentin matrix protein 4 | MKMMLVRRFRVLILMVFLVAC |
| 939 | Epididymal sperm-binding protein 1 | MTRWSSYLLGWTTFLLYSYESSGG |
| 940 | Coagulation factor VIII | MQIELSTCFFLCLLRFCFS |
| 941 | Fibroblast growth factor 8 | MGSPRSALSCLLLHLLVLCLQA |
| 942 | Growth arrest-specific protein 6 | MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALA |
| 943 | Growth/differentiation factor 9 | MARPNKFLLWFCCFAWLCFPISLG |
| 944 | Histidine-rich glycoprotein | MKALIAALLLITLQYSCA |
| 945 | Interleukin-17 receptor E | MGSSRLAALLLPLLLIVIDLSDS |
| 946 | Insulin-like growth factor-binding protein 6 | MTPHRLLPPLLLLLALLLAASPGGALA |
| 947 | Interleukin-11 | MNCVCRLVLVVLSLWPDTAVA |
| 948 | Interleukin-25 | MRERPRLGEDSSLISLFLQVVAFLAMVMGTHT |
| 949 | Serine protease inhibitor Kazal-type 6 | MKLSGMFLLLSLALFCFLTGVFS |
| 950 | Uncharacterized protein KIAA0564 | MQSRLLLLGAPGGHG |
| 951 | Putative killer cell immunoglobulin-like receptor-likeproteinKIR3DX1 |
MAPKLITVLCLGFCLN |
| 952 | Laminin subunit alpha-5 | MAKRLCAGSALCVRGPRGPAPLLLVGLALLGAARA |
| 953 | Laminin subunit beta-3 | MRPFFLLCFALPGLLHA |
| 954 | Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamilyAmember2 |
MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQA |
| 955 | Matrix metalloproteinase-21 | MLAASIFRPTLLLCWLAAPWPTQP |
| 956 | Neurexophilin-4 | MRLLPEWFLLLFGPWLLRKAVSA |
| 957 | Polyserase-3 | MKWCWGPVLLIAGATVLMEGLQA |
| 958 | Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 | MGPLSAPPCTEHIKWKGLLVTASLLNFWNLPTTA |
| 959 | R-spondin-2 | MQFRLFSFALIILNCMDYSHC |
| 960 | Semaphorin-3F | MLVAGLLLWASLLTGAWP |
| 961 | Sperm-associated antigen 11B | MRQRLLPSVTSLLLVALLFPGSSQ |
| 962 | SPARC-related modular calcium-binding protein 1 | MLPARCARLLTPHLLLVLVQLSPARG |
| 963 | Thrombospondin type-1 domain-containing protein 1 | MKPMLKDFSNLLLVVLCDYVLGEA |
| 964 | V-set and transmembrane domain-containing protein 1 | MTAEFLSLLCLGLCLG |
| 965 | von Willebrand factor A domain-containing protein 3A | MKKYRKISIGCFAMATQTSHVFHG |
| 966 | Wnt inhibitory factor 1 | MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEA |
| 967 | Protein Z-dependent protease inhibitor | MKVVPSLLLSVLLAQVWLVPG |
| 968 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs19 |
MRLTHICCCCLLYQLGFLSNG |
| 969 | Bone morphogenetic protein 6 | MPGLGRRAQWLCWWWGLLCS |
| 970 | Complement C1q subcomponent subunit B | MMMKIPWGSIPVLMLLLLLGLIDIS |
| 971 | C-C motif chemokine 7 | MKASAALLCLLLTAAAFSPQGLA |
| 972 | Putative uncharacterized protein C10orf31 | MFCLLHLCFYLANFASSIKRTHA |
| 973 | Uncharacterized protein C12orf73 | MPAGVPMSTYLKMFAASLLAMCAGA |
| 974 | Collagen alpha-3(IV) chain | MSARTAPRPQVLLLPLLLVLLAAAPAAS |
| 975 | Complement component C8 beta chain | MKNSRTWAWRAPVELFLLCAALGCLSLPGSRG |
| 976 | Collectin-11 | MRGNLALVGVLISLAFLSLLPSGHP |
| 977 | Uncharacterized protein C16orf89 | MASLGLLLLLLLTALPPLWS |
| 978 | Uncharacterized protein C17orf67 | MASFKLADSVWEDSLSKR |
| 979 | Protein CREG2 | MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG |
| 980 | C-X-C motif chemokine 9 | MKKSGVLFLLGIILLVLIGVQG |
| 981 | Beta-defensin 107 | MPGAMKIFVFILAALILLAQIF |
| 982 | Beta-defensin 128 | MKLFLVLIILLFEVLTDG |
| 983 | Ephrin-A4 | MRLLPLLRTVLWAAFLGSPLRGGSS |
| 984 | EMI domain-containing protein 1 | MGGPRAWALLCLGLLLPGGGAA |
| 985 | Protein FAM131A | MFLATLSFLLPFAHPFGTVSC |
| 986 | UPF0528 protein FAM172A | MSISLSSLILLPIWINMA |
| 987 | Fas apoptotic inhibitory molecule 3 | MDFWLWPLYFLPVSGAL |
| 988 | Low affinity immunoglobulin gamma FcregionreceptorIII-A |
MWQLLLPTALLLLVSA |
| 989 | Fibroblast growth factor receptor 3 | MGAPACALALCVAVAIVAGASS |
| 990 | Growth/differentiation factor 3 | MLRFLPDLAFSFLLILALGQAVQF |
| 991 | Gastrokine-2 | MKILVAFLVVLTIFGIQSHG |
| 992 | Gastrin-releasing peptide | MRGRELPLVLLALVLCLAPRGRA |
| 993 | Inducible T-cell costimulator | MKSGLWYFFLFCLRIKVLTG |
| 994 | Interphotoreceptor matrix proteoglycan 1 | MYLETRRAIFVFWIFLQVQG |
| 995 | Serine protease inhibitor Kazal-type 9 | MRATAIVLLLALTLATMFS |
| 996 | Kallikrein-8 | MGRPRPRAAKTWMFLLLLGGAWAGHSRA |
| 997 | Leucine-rich glioma-inactivated protein 1 | MESERSKRMGNACIPLKRIAYFLCLLSALLLTEG |
| 998 | Lipase member N | MMWLLLTTTCLICGTLNA |
| 999 | Long palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associatedprotein3 |
MQPVMLALWSLLLLWGLATP |
| 1000 | Lysozyme-like protein 2 | MKAAGILTLIGCLVTGAES |
| 1001 | Stromelysin-2 | MMHLAFLVLLCLPVCSA |
| 1002 | Matrix metalloproteinase-17 | MRRRAARGPGPPPPGPGLSRLPLPLLLLLALGTRGGCA |
| 1003 | Nodal homolog | MHAHCLPFLLHAWWALLQAGAATVAT |
| 1004 | Neuronal cell adhesion molecule | MQLKIMPKKKRLSAGRVPLILFLC |
| 1005 | Glycodelin | MLCLLLTLGVALVCGVPA |
| 1006 | Plasminogen activator inhibitor 1 | MQMSPALTCLVLGLALVFGEGSA |
| 1007 | Platelet-derived growth factor subunit B | MNRCWALFLSLCCYLRLVSA |
| 1008 | Paired immunoglobulin-like type 2 receptor alpha | MGRPLLLPLLPLLLPPAFL |
| 1009 | Proline-rich acidic protein 1 | MRRLLLVTSLVVVLLWEAGA |
| 1010 | R-spondin-4 | MRAPLCLLLLVAHAVDMLA |
| 1011 | Syndecan-4 | MAPARLFALLLFFVGGVA |
| 1012 | Secreted frizzled-related protein 4 | MFLSILVALCLWLHLALG |
| 1013 | Vitelline membrane outer layer protein 1 homolog | MERGAGAKLLPLLLLLRATGFTCA |
| 1014 | Brorin | MPSSTAMAVGALSSSLLVTCCLMVALC |
| 1015 | WAP four-disulfide core domain protein 12 | MGSSSFLVLMVSLVLVTLVAVEG |
| 1016 | Zinc-alpha-2-glycoprotein | MVRMVPVLLSLLLLLGP |
| 1017 | Angiopoietin-related protein 7 | MLKKPLSAVTWLCIFIVAFVSHPAWL |
| 1018 | Neutrophil defensin 1 | MRTLAILAAILLVALQAQA |
| 1019 | Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 | MALFVRLLALALALALGPAATLA |
| 1020 | Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 5 | MRPLLVLLLLGLAAG |
| 1021 | Beta-casein | MKVLILACLVALALA |
| 1022 | Coiled-coil domain-containing protein 134 | MDLLQFLAFLFVLLLSGMGATG |
| 1023 | C-C motif chemokine 20 | MCCTKSLLLAALMSVLLLHLCGESEA |
| 1024 | Tryptase beta-1 | MLNLLLLALPVLASRAYA |
| 1025 | Cerberus | MHLLLFQLLVLLPLGKT |
| 1026 | Complement factor D | MHSWERLAVLVLLGAAACAA |
| 1027 | Chitinase-3-like protein 2 | MGATTMDQKSLWAGVVVLLLLQGGSA |
| 1028 | Contactin-associated protein-like 3 | MASVAWAVLKVLLLLPTQTWSPVGA |
| 1029 | Complement C2 | MGPLMVLFCLLFLYPGLADS |
| 1030 | Collagen alpha-1(XVI) chain | MWVSWAPGLWLLGLWATFGHG |
| 1031 | Probable carboxypeptidase X1 | MWGLLLALAAFAPAVGPALG |
| 1032 | Cystatin-9 | MSSPQRRKAMPWALSLLLMGFQLLVTYA |
| 1033 | C-X-C motif chemokine 6 | MSLPSSRAARVPGPSGSLCALLALLLLLTPPGPLASA |
| 1034 | Beta-defensin 136 | MNLCLSALLFFLVILLPSGKG |
| 1035 | Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase familymember5 |
MTSKFLLVSFILAALSLSTTFSLQ |
| 1036 | Ephrin type-B receptor 6 | MATEGAAQLGNRVAGMVCSLWVLLLVSSVLA |
| 1037 | Fibrillin-3 | MTLEGLYLARGPLARLLLAWSALLCMAGGQG |
| 1038 | Leucine-rich repeat transmembrane protein FLRT3 | MISAAWSIFLIGTKIGLFLQVAPLSVMA |
| 1039 | Embryonic growth/differentiation factor 1 | MPPPQQGPCGHHLLLLLALLLPSLPLTRA |
| 1040 | Ig heavy chain V-II region ARH-77 | MDLLHKNMKHLWFFLLLVA |
| 1041 | Interferon kappa | MSTKPDMIQKCLWLEILMGIFIAGTLS |
| 1042 | IgA-inducing protein homolog | MCSYYHMKKRSVSGCNITIFAVMFSHLSAG |
| 1043 | Interleukin-7 | MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASS |
| 1044 | Inhibin alpha chain | MVLHLLLFLLLTPQGGHS |
| 1045 | Lipase member M | MLETLSRQWIVSHRMEMWLLILVAYMFQRNVNS |
| 1046 | Ig lambda chain V region 4A | MAWTPLFLFLLTCCPGSNSQ |
| 1047 | Mannan-binding lectin serine protease 2 | MRLLTLLGLLCGSVA |
| 1048 | Stromelysin-1 | MKSLPILLLLCVAVCSA |
| 1049 | Mesothelin | MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRT |
| 1050 | Mucin-1 | MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG |
| 1051 | Protein kinase C-binding protein NELL2 | MESRVLLRTFCLIFGLGAVWG |
| 1052 | Neutrophil gelatinase-associated lipocalin | MPLGLLWLGLALLGALHAQA |
| 1053 | Orexigenic neuropeptide QRFP | MVRPYPLIYFLFLPLGAC |
| 1054 | Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 6 | MGPLSAPPCTQHITWKGLLLTASLLNFWNLPTTA |
| 1055 | Putative peptide YY-3 | MVSVCRPWPAVAIALLALLVCLG |
| 1056 | Regenerating islet-derived protein 3 alpha | MLPPMALPSVSWMLLSCLMLLSQVQG |
| 1057 | Serpin A11 | MGPAWLWLLGTGILASVHC |
| 1058 | Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxindomain-containingprotein1 |
MWPRLAFCCWGLALVSG |
| 1059 | TGF-beta receptor type III | MTSHYVIAIFALMSSCLATA |
| 1060 | Thyroxine-binding globulin | MSPFLYLVLLVLGLHATIHC |
| 1061 | Tubulointerstitial nephritis antigen-like | MWRCPLGLLLLLPLAGHLALG |
| 1062 | Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 | MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLG |
| 1063 | WAP four-disulfide core domain protein 5 | MRTQSLLLLGALLAVGSQLPAVFG |
| 1064 | Apolipoprotein A-V | MASMAAVLTWALALLSAFSATQA |
| 1065 | Apolipoprotein O | MFKVIQRSVGPASLSLLTFKVYAAP |
| 1066 | Chymotrypsinogen B2 | MAFLWLLSCWALLGTTFG |
| 1067 | Bone morphogenetic protein 5 | MHLTVFLLKGIVGFLWSCWVLVGYAKGGLG |
| 1068 | Biotinidase | MAHAHIQGGRRAKSRFVVCIM |
| 1069 | Calumenin | MDLRQFLMCLSLCTAFALS |
| 1070 | Collagen alpha-1(VI) chain | MRAARALLPLLLQACWTAA |
| 1071 | Carboxypeptidase-like protein X2 | MSRPGTATPALALVLLAVTLAGVGA |
| 1072 | Protein CREG1 | MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARG |
| 1073 | Granulocyte colony-stimulating factor | MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQE |
| 1074 | C-X-C motif chemokine 16 | MGRDLRPGSRVLLLLLLLLLVYLTQPGNG |
| 1075 | Beta-defensin 127 | MGLFMIIAILLFQKPTVTEQ |
| 1076 | Dehydrogenase/reductase SDR family member 4-like 2 | MARLLGLCAWARKSVRLASS |
| 1077 | Extracellular matrix protein 1 | MGTTARAALVLTYLAVASA |
| 1078 | Eosinophil cationic protein | MVPKLFTSQICLLLLLGLMGVEGSLHA |
| 1079 | Elastase-2B | MIRTLLLSTLVAGALS |
| 1080 | Protein FAM150A | MRPLKPGAPLPALFLLALALSPHGAHG |
| 1081 | Protein FAM5B | MRWQCGTRFRGLRPAVAPWTALLALGLPGWVLA |
| 1082 | Growth/differentiation factor 2 | MCPGALWVALPLLSLLAGSLQG |
| 1083 | Glycoprotein hormones alpha chain | MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHS |
| 1084 | Progonadoliberin-2 | MASSRRGLLLLLLLTAHLGPSEA |
| 1085 | Glypican-6 | MPSWIGAVILPLLGLLLSLPAGA |
| 1086 | Proheparin-binding EGF-like growth factor | MKLLPSVVLKLFLAAVLSA |
| 1087 | Protein HEG homolog 1 | MASPRASRWPPPLLLLLLPLLLLPPAAPG |
| 1088 | Hyaluronan and proteoglycan link protein 2 | MPGWLTLPTLCRFLLWAFTIFHKAQG |
| 1089 | Insulin-like growth factor-binding protein 2 | MLPRVGCPALPLPPPPLLPLLLLLLGASGGGGGARAEVL |
| 1090 | Insulin-like 3 | MDPRLPAWALVLLGPALVFA |
| 1091 | Serine protease inhibitor Kazal-type 8 | MKGICSDAILVLATSMWMAFA |
| 1092 | Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase | MGPPGSPWQWVTLLLGLLLPPAAP |
| 1093 | Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamilyBmember1 |
MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQA |
| 1094 | Lysozyme-like protein 1 | MKAAGILTLIGCLVTGAES |
| 1095 | Netrin-1 | MMRAVWEALAALAAVACLVGAVRG |
| 1096 | Neuropilin-2 | MDMFPLTWVFLALYFSRHQV |
| 1097 | Neurotrophin-3 | MSILFYVIFLAYLRGIQG |
| 1098 | Otoraplin | MARILLLFLPGLVAVCA |
| 1099 | Protocadherin alpha-6 | MVFTPEDRLGKQCLLLPLLLLAAWKVGSG |
| 1100 | Gastricsin | MKWMVVVLVCLQLLEA |
| 1101 | Platelet factor 4 variant | MSSAARSRLTRATRQEMLFLALLLLPVVVA |
| 1102 | Proline-rich protein 4 | MLLVLLSVVLLALSSA |
| 1103 | Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 8 | MGLLSAPPCTQRITWKGLLLTASLLNFWNPPTTA |
| 1104 | Pulmonary surfactant-associated protein B | MAESHLLQWLLLLLPTLCGPGTAA |
| 1105 | Inactive serine protease RAMP | MELGCWTQLGLTFLQLLLISS |
| 1106 | Ribonuclease-like protein 13 | MAPAVTRLLFLQLVLGPTLV |
| 1107 | R-spondin-3 | MHLRLISWLFIILNFMEYIGS |
| 1108 | Suprabasin | MHLARLVGSCSLLLLLGALSGWAAS |
| 1109 | Metalloproteinase inhibitor 3 | MTPWLGLIVLLGSWSLGDWGAEA |
| 1110 | Thymic stromal lymphopoietin | MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLT |
| 1111 | Testis-expressed sequence 264 protein | MSDLLLLGLIGGLTLLLLLTLLAFAGYSGLLA |
| 1112 | Retinoschisin | MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLS |
| 1113 | C-type lectin domain-containing protein UNQ5810/PRO19627 |
MQRWTLWAAAFLTLHSAQA |
| 1114 | Uncharacterized aarF domain-containing protein kinase 1 | MARKALKLASWTSMALA |
| 1115 | Attractin | MVAAAAATEARLRRR |
| 1116 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs6 |
MEILWKTLTWILSLIMASSEF |
| 1117 | BMP-binding endothelial regulator protein | MLWFSGVGALAERYCRRSPGITCCVLLLLNCSGVPMSLA |
| 1118 | Complement C1q tumor necrosis factor-relatedprotein9-like |
MRIWWLLLAIEICTGNINS |
| 1119 | Carboxypeptidase A6 | MKCLGKRRGQAAAFLPLCWLFLKILQPGHS |
| 1120 | Collagen alpha-3(V) chain | MGNRRDLGQPRAGLCLLLAALQLLPGTQA |
| 1121 | Complement component C9 | MSACRSFAVAICILEISILTA |
| 1122 | B melanoma antigen 2 | MAAGVVFLALSAQLLQA |
| 1123 | Chordin-like protein 2 | MVPEVRVLSSLLGLALLWFPLDSHA |
| 1124 | C-X-C motif chemokine 5 | MSLLSSRAARVPGPSSSLCALLVLLLLLTQPGPIAS |
| 1125 | C-X-C motif chemokine 11 | MSVKGMAIALAVILCATVVQG |
| 1126 | Desert hedgehog protein | MALLTNLLPLCCLALLALPAQS |
| 1127 | Protein FAM180A | MHWKMLLLLLLYYNAEA |
| 1128 | Protein FAM19A4 | MRSPRMRVCAKSVLLSHWLFLAYVLMVCCKLMSAS |
| 1129 | Fibrillin-1 | MRRGRLLEIALGFTVLLASYTSHGADA |
| 1130 | Fibroblast growth factor 10 | MWKWILTHCASAFPHLPGCCCCCFLLLFLVSSVPVTC |
| 1131 | Glypican-5 | MDAQTWPVGFRCLLLLALVGSARS |
| 1132 | Hyaluronan-binding protein 2 | MFARMSDLHVLLLMALVGKTACG |
| 1133 | Probable serine protease HTRA4 | MIRPQLRTAGLGRCLLPGLLLLLVPVLWAGA |
| 1134 | Islet amyloid polypeptide | MGILKLQVFLIVLSVALNHLKA |
| 1135 | Interleukin-15 | MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEA |
| 1136 | Interferon-alpha/beta receptor beta chain | MLLSQNAFIFRSLNLVLMVYISLVFG |
| 1137 | Inhibin beta C chain | MTSSLLLAFLLLAPTTVA |
| 1138 | Ig kappa chain V-IV region | MVLQTQVFISLLLWISGAYG |
| 1139 | Epididymal-specific lipocalin-8 | MPGAAEALPTVTVTLVAGAVPPASG |
| 1140 | Leucine-rich repeat-containing protein 17 | MRVVTIVILLCFCKAAEL |
| 1141 | Collagen alpha-5(IV) chain | MKLRGVSLAAGLFLLALSLWGQPAEA |
| 1142 | Lysozyme g-like protein 1 | MSALWLLLGLLALMDLSES |
| 1143 | Multiple epidermal growth factor-like domains 6 | MSFLEEARAAGRAVVLALVLLLLPAV |
| 1144 | Microfibril-associated glycoprotein 4 | MKALLALPLLLLLSTPPCAPQ |
| 1145 | Protein kinase C-binding protein NELL1 | MPMDLILVVWFCVCTA |
| 1146 | Nidogen-2 | MEGDRVAGRPVLSSLPVLLLLPLLMLRAAA |
| 1147 | Platelet-activating factor acetylhydrolase | MVPPKLHVLFCLCGCLAVVYP |
| 1148 | Peptidase inhibitor 16 | MHGSCSFLMLLLPLLLLLVATTGPVGA |
| 1149 | Phospholipase A1 member A | MPPGPWESCFWVGGLILWLSVGSSG |
| 1150 | Vitamin K-dependent protein C | MWQLTSLLLFVATWGISGTPAPLDSVFSSSER |
| 1151 | Properdin | MITEGAQAPRLLLPPLLLLLTLPATGS |
| 1152 | Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 1 | MGTLSAPPCTQRIKWKGLLLTASLLNFWNLPTTA |
| 1153 | Pregnancy zone protein | MRKDRLLHLCLVLLLILLSASDSNS |
| 1154 | Regulated endocrine-specific protein 18 | MQHPLWPGSSEGLQLLVCFLLLNSCPGGCS |
| 1155 | FMRFamide-related peptides | MEIISSKLFILLTLATSSLLTSNIFC |
| 1156 | Sperm-associated antigen 11A | MRQRLLPSVTSLLLVALLFPGSSQA |
| 1157 | Thrombospondin and AMOP domain-containingisthmin-likeprotein1 |
MRALRDRAGLLLCVLLLAALLEAALG |
| 1158 | Collagen alpha-2(I) chain | MLSFVDTRTLLLLAVTLCLATCQS |
| 1159 | Testican-2 | MRAPGCGRLVLPLLLLAAAALA |
| 1160 | T-cell immunomodulatory protein | MAAAGRLPSSWALFSPLLAGLALLGVGPVPARA |
| 1161 | Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B | MNNLLCCALVFLDISIKWTTQ |
| 1162 | Putative trypsin-6 | MNPLLILAFVGAAVA |
| 1163 | Urocortin-3 | MLMPVHFLLLLLLLLGGPRTG |
| 1164 | Vasorin | MCSRVPLLLPLLLLLALGPGVQG |
| 1165 | Protein WFDC10B | MAPQTLLLVLVLCVLLLQAQG |
| 1166 | Protein Wnt-5b | MPSLLLLFTAALLSSWA |
| 1167 | Angiopoietin-related protein 6 | MGKPWLRALQLLLLLGASWA |
| 1168 | A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondinmotifs15 |
MLLLGILTLAFAGRTAG |
| 1169 | B melanoma antigen 4 | MAAGAVFLALSAQLLQA |
| 1170 | UPF0672 protein C3orf58 | MWRLVPPKLGRLSRSLKLAALGSLLVLMVLHSPSL |
| 1171 | C-C motif chemokine 2 | MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLA |
| 1172 | T-cell surface glycoprotein CD8 beta chain | MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSV |
| 1173 | Putative uncharacterized protein C11orf45 | MLTRLVLSAHLSSTTSPPWTHA |
| 1174 | Complement C5 | MGLLGILCFLIFLGKTWG |
| 1175 | Collagen alpha-1(XI) chain | MEPWSSRWKTKRWLWDFTVTTLALTFLFQAREVRGA |
| 1176 | Collectin-10 | MNGFASLLRRNQFILLVLFLLQIQSLG |
| 1177 | Uncharacterized protein C17orf99 | MGLPGLFCLAVLAASSFSKA |
| 1178 | Cartilage-associated protein | MEPGRRGAAALLALLCVACALRAGRA |
| 1179 | Granulocyte colony-stimulating factor receptor | MARLGNCSLTWAALIILLLPGSLE |
| 1180 | Cystatin-9-like | MLGLPWKGGLSWALLLLLLGSQILLIYA |
| 1181 | C-X-C motif chemokine 13 | MKFISTSLLLMLLVSSLSPVQG |
| 1182 | Beta-defensin 126 | MKSLLFTLAVFMLLAQLVSG |
| 1183 | Protein FAM24B | MPVIAGGILAALLLLIVVVLC |
| 1184 | Fibroblast growth factor receptor 2 | MVSWGRFICLVVVTMATLSLA |
| 1185 | Fibrinogen alpha chain | MFSMRIVCLVLSVVGTAWT |
| 1186 | Growth/differentiation factor 15 | MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGA |
| 1187 | Pancreatic secretory granule membrane majorglycoproteinGP2 |
MPHLMERMVGSGLLWLALVSCILTQASA |
| 1188 | Insulin-like growth factor-binding protein-like 1 | MPRLSLLLPLLLLLLLPLLPPLSPS |
| 1189 | Interleukin-26 | MLVNFILRCGLLLVTLSLAIA |
| 1190 | Interleukin-6 receptor subunit beta | MLTLQTWLVQALFIFLTTESTG |
| 1191 | Interleukin-7 receptor subunit alpha | MTILGTTFGMVFSLLQVVSG |
| 1192 | Kallikrein-4 | MATAGNPWGWFLGYLILGVAGSLVSG |
| 1193 | Ig kappa chain V-I region Daudi | MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC |
| 1194 | Latherin | MLNVSGLFVLLCGLLVSSSA |
| 1195 | Epididymal-specific lipocalin-9 | MALLLLSLGLSLIAA |
| 1196 | Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamilyAmember3 |
MTPILTVLICLGLSLDPRTHVQA |
| 1197 | Lutropin subunit beta | MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA |
| 1198 | Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4 | MPRPGTSGRRPLLLVLLLPLFAAATSA |
| 1199 | Lysozyme g-like protein 2 | MLSSVVFWGLIALIGTSRG |
| 1200 | Meteorin | MGFPAAALLCALCCGLLAPAARA |
3. 1200종의 signal peptides를 구분할 수 있는 SP-tag 디자인
SP-tag은 크게 1200종 이상의 다양성을 만들어 내는 barcoding sequence와 Histidine tag으로 이루어지게 디자인하였다(도 5). 1200종의 signal peptides에 각각 하나씩 대응하기 위해 아미노산 5자리로 이루어진 barcoding sequences를 고안하였다. 그리고 그 뒤에 실험의 정확도를 위해 세포배양액에서 표적 단백질만을 분리 정제하기 위한 6 x Histidine tag을 붙였다. LC-MS/MS 수행 시 효과적인 Trypsin cleavage를 위해 양 끝에 Lysine (K)과 Arginine (R)을 삽입하였다. 단백질-barcoding sequence-his tag사이에는 linker 아미노산으로 glycine을 삽입하여 디자인하였다.
Barcoding sequence에 사용할 아미노산을 선정하기 위해 Trypsin cleavage site인 K와 R을 제외한 총 18종의 아미노산을 확인하였다. 18종의 아미노산을 하나씩 포함한 18종의 SP-tag이 달린 단백질을 발현 정제하였다(도 6).
18종의 단백질 동량을 LC-MS/MS로 식별하여 상대 정량에 적합한 아미노산을 선별하였다(도 7). 동량의 단백질을 이용한 상대 정량 결과 18종의 아미노산 중 6종(V, F, G, C, H 및 N)의 값은 상대적으로 너무 높거나 낮아서 정량하는데 있어서 부적합하였다. 12종의 아미노산(I, L, P, A, W, Y, P, T, S, E, Q 및 D)은 서로 peak area 값이 비슷하여 정량하는데 영향을 주지 않았다. 즉, 아미노산 종류에 상관없이 그 양으로만 peak area 값이 정해짐으로 상대 정량을 하기에 적합하다고 판단되었다. 결과적으로 Barcoding sequence 디자인을 위해 1차적으로 12종의 아미노산을 선별하였다.
4. 5자리 Barcoding sequences를 디자인하여 서로 다른 분자량을 가진 1200종의 SP-tag 라이브러리 구축
LC-MS/MS 상에서 효과적인 식별을 위해 1200종의 SP-tag은 서로 다른 분자량을 가져야 한다. 그렇기 때문에 Barcoding sequences 디자인 시 모든 sequences간의 분자량이 2이상 차이가 나게 하였다. 선별된 12종의 아미노산 중 I와 L, E 및 Q, D와 N은 분자량이 같거나 약 1정도의 차이를 보이기 때문에 I, Q 및 N을 배제하고 L, E 및 D 만 사용하였다. 총 9종의 아미노산(L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D)을 이용하여 5자리의 Barcoding sequences 를 디자인하여 라이브러리를 구축하였다(표 2).
| Number | Sequence | Number | Sequence | Number | Sequence | Number | Sequence |
| SP-tag #1 | SADAA | SP-tag #301 | WLELW | SP-tag #601 | EWPWP | SP-tag #901 | SLSYP |
| SP-tag #2 | TADAA | SP-tag #302 | EWELW | SP-tag #602 | YYPWP | SP-tag #902 | PLSYP |
| SP-tag #3 | ALDAA | SP-tag #303 | SAELY | SP-tag #603 | WYPWP | SP-tag #903 | PYSYP |
| SP-tag #4 | EADAA | SP-tag #304 | ALELY | SP-tag #604 | WWPWP | SP-tag #904 | EYSYP |
| SP-tag #5 | TLDAA | SP-tag #305 | DLELY | SP-tag #605 | AAPWT | SP-tag #905 | WLSYP |
| SP-tag #6 | LLDAA | SP-tag #306 | ELELY | SP-tag #606 | SAPWT | SP-tag #906 | YYSYP |
| SP-tag #7 | SYDAA | SP-tag #307 | WAELY | SP-tag #607 | TAPWT | SP-tag #907 | WYSYP |
| SP-tag #8 | WADAA | SP-tag #308 | EYELY | SP-tag #608 | EAPWT | SP-tag #908 | WWSYP |
| SP-tag #9 | SWDAA | SP-tag #309 | DWELY | SP-tag #609 | LLPWT | SP-tag #909 | AASYS |
| SP-tag #10 | EYDAA | SP-tag #310 | YYELY | SP-tag #610 | ELPWT | SP-tag #910 | SASYS |
| SP-tag #11 | WLDAA | SP-tag #311 | AAEWA | SP-tag #611 | SYPWT | SP-tag #911 | PASYS |
| SP-tag #12 | EWDAA | SP-tag #312 | SAEWA | SP-tag #612 | WLPWT | SP-tag #912 | DASYS |
| SP-tag #13 | YYDAA | SP-tag #313 | PAEWA | SP-tag #613 | WYPWT | SP-tag #913 | EASYS |
| SP-tag #14 | WYDAA | SP-tag #314 | EAEWA | SP-tag #614 | AAPWW | SP-tag #914 | PLSYS |
| SP-tag #15 | WWDAA | SP-tag #315 | TLEWA | SP-tag #615 | SAPWW | SP-tag #915 | LLSYS |
| SP-tag #16 | SADAD | SP-tag #316 | YAEWA | SP-tag #616 | TAPWW | SP-tag #916 | YASYS |
| SP-tag #17 | DADAD | SP-tag #317 | SYEWA | SP-tag #617 | DAPWW | SP-tag #917 | ELSYS |
| SP-tag #18 | DLDAD | SP-tag #318 | WAEWA | SP-tag #618 | EAPWW | SP-tag #918 | SYSYS |
| SP-tag #19 | TYDAD | SP-tag #319 | SWEWA | SP-tag #619 | TLPWW | SP-tag #919 | WASYS |
| SP-tag #20 | TWDAD | SP-tag #320 | PWEWA | SP-tag #620 | LLPWW | SP-tag #920 | SWSYS |
| SP-tag #21 | WWDAD | SP-tag #321 | EYEWA | SP-tag #621 | YAPWW | SP-tag #921 | EYSYS |
| SP-tag #22 | TADAE | SP-tag #322 | WLEWA | SP-tag #622 | ELPWW | SP-tag #922 | WLSYS |
| SP-tag #23 | PLDAE | SP-tag #323 | EWEWA | SP-tag #623 | SYPWW | SP-tag #923 | EWSYS |
| SP-tag #24 | YADAE | SP-tag #324 | YYEWA | SP-tag #624 | PYPWW | SP-tag #924 | YYSYS |
| SP-tag #25 | SADAL | SP-tag #325 | WWEWA | SP-tag #625 | YLPWW | SP-tag #925 | WYSYS |
| SP-tag #26 | TADAL | SP-tag #326 | PAEWD | SP-tag #626 | PWPWW | SP-tag #926 | WWSYS |
| SP-tag #27 | WADAL | SP-tag #327 | DAEWD | SP-tag #627 | EYPWW | SP-tag #927 | TASYT |
| SP-tag #28 | TYDAL | SP-tag #328 | EAEWD | SP-tag #628 | WLPWW | SP-tag #928 | SLSYT |
| SP-tag #29 | EYDAL | SP-tag #329 | SYEWD | SP-tag #629 | EWPWW | SP-tag #929 | LLSYT |
| SP-tag #30 | DWDAL | SP-tag #330 | TYEWD | SP-tag #630 | AAPWY | SP-tag #930 | ELSYT |
| SP-tag #31 | WYDAL | SP-tag #331 | EYEWD | SP-tag #631 | ELPWY | SP-tag #931 | SYSYT |
| SP-tag #32 | SADAP | SP-tag #332 | DWEWD | SP-tag #632 | WAPWY | SP-tag #932 | WASYT |
| SP-tag #33 | DADAP | SP-tag #333 | AAEWE | SP-tag #633 | EYPWY | SP-tag #933 | TYSYT |
| SP-tag #34 | EADAP | SP-tag #334 | SAEWE | SP-tag #634 | EWPWY | SP-tag #934 | SWSYT |
| SP-tag #35 | WADAP | SP-tag #335 | PAEWE | SP-tag #635 | WWPYA | SP-tag #935 | EYSYT |
| SP-tag #36 | PWDAP | SP-tag #336 | ALEWE | SP-tag #636 | EAPYD | SP-tag #936 | EWSYT |
| SP-tag #37 | EYDAP | SP-tag #337 | EAEWE | SP-tag #637 | TLPYD | SP-tag #937 | YYSYT |
| SP-tag #38 | EWDAP | SP-tag #338 | TLEWE | SP-tag #638 | DYPYD | SP-tag #938 | WYSYT |
| SP-tag #39 | YYDAP | SP-tag #339 | LLEWE | SP-tag #639 | EYPYD | SP-tag #939 | WWSYT |
| SP-tag #40 | WYDAP | SP-tag #340 | YAEWE | SP-tag #640 | EWPYD | SP-tag #940 | AASYW |
| SP-tag #41 | WWDAP | SP-tag #341 | ELEWE | SP-tag #641 | SAPYS | SP-tag #941 | SASYW |
| SP-tag #42 | ELDAS | SP-tag #342 | SYEWE | SP-tag #642 | TAPYS | SP-tag #942 | TASYW |
| SP-tag #43 | SYDAT | SP-tag #343 | WAEWE | SP-tag #643 | LLPYS | SP-tag #943 | SYSYW |
| SP-tag #44 | AADAY | SP-tag #344 | TYEWE | SP-tag #644 | YAPYS | SP-tag #944 | WASYW |
| SP-tag #45 | SADAY | SP-tag #345 | SWEWE | SP-tag #645 | ELPYS | SP-tag #945 | TYSYW |
| SP-tag #46 | PADAY | SP-tag #346 | TWEWE | SP-tag #646 | SYPYS | SP-tag #946 | PWSYW |
| SP-tag #47 | DADAY | SP-tag #347 | WLEWE | SP-tag #647 | DYPYS | SP-tag #947 | YYSYW |
| SP-tag #48 | PLDAY | SP-tag #348 | EWEWE | SP-tag #648 | EWPYS | SP-tag #948 | ALTAA |
| SP-tag #49 | DLDAY | SP-tag #349 | YYEWE | SP-tag #649 | EAPYT | SP-tag #949 | DLTAA |
| SP-tag #50 | SYDAY | SP-tag #350 | WYEWE | SP-tag #650 | YAPYT | SP-tag #950 | SYTAA |
| SP-tag #51 | EYDAY | SP-tag #351 | TAEWL | SP-tag #651 | SAPYW | SP-tag #951 | WATAA |
| SP-tag #52 | YYDAY | SP-tag #352 | EAEWL | SP-tag #652 | TAPYW | SP-tag #952 | TYTAA |
| SP-tag #53 | WYDAY | SP-tag #353 | TLEWL | SP-tag #653 | EAPYW | SP-tag #953 | TWTAA |
| SP-tag #54 | WWDAY | SP-tag #354 | YAEWL | SP-tag #654 | PLPYW | SP-tag #954 | DLTAD |
| SP-tag #55 | ALDLA | SP-tag #355 | SYEWL | SP-tag #655 | LLPYW | SP-tag #955 | ELTAE |
| SP-tag #56 | EADLA | SP-tag #356 | WAEWL | SP-tag #656 | YAPYW | SP-tag #956 | YLTAE |
| SP-tag #57 | TLDLA | SP-tag #357 | EYEWL | SP-tag #657 | SYPYW | SP-tag #957 | EWTAE |
| SP-tag #58 | DLDLA | SP-tag #358 | YYEWL | SP-tag #658 | SWPYW | SP-tag #958 | WATAL |
| SP-tag #59 | ELDLA | SP-tag #359 | WYEWL | SP-tag #659 | PWPYW | SP-tag #959 | EWTAL |
| SP-tag #60 | SYDLA | SP-tag #360 | AAEWP | SP-tag #660 | WLPYW | SP-tag #960 | SATAP |
| SP-tag #61 | SWDLA | SP-tag #361 | DAEWP | SP-tag #661 | YYPYW | SP-tag #961 | TATAP |
| SP-tag #62 | EWDLA | SP-tag #362 | SYEWP | SP-tag #662 | AAPYY | SP-tag #962 | DLTAP |
| SP-tag #63 | YYDLA | SP-tag #363 | DYEWP | SP-tag #663 | SAPYY | SP-tag #963 | ELTAP |
| SP-tag #64 | WWDLA | SP-tag #364 | WLEWP | SP-tag #664 | TAPYY | SP-tag #964 | SYTAP |
| SP-tag #65 | SADLL | SP-tag #365 | WYEWP | SP-tag #665 | ALPYY | SP-tag #965 | WATAP |
| SP-tag #66 | PADLL | SP-tag #366 | SAEWS | SP-tag #666 | EAPYY | SP-tag #966 | TYTAP |
| SP-tag #67 | SLDLL | SP-tag #367 | TAEWS | SP-tag #667 | PLPYY | SP-tag #967 | DYTAP |
| SP-tag #68 | TLDLL | SP-tag #368 | EAEWS | SP-tag #668 | YAPYY | SP-tag #968 | EYTAP |
| SP-tag #69 | LLDLL | SP-tag #369 | SYEWS | SP-tag #669 | ELPYY | SP-tag #969 | WLTAP |
| SP-tag #70 | ELDLL | SP-tag #370 | DWEWS | SP-tag #670 | WAPYY | SP-tag #970 | EWTAP |
| SP-tag #71 | SYDLL | SP-tag #371 | LLEWT | SP-tag #671 | TYPYY | SP-tag #971 | YYTAP |
| SP-tag #72 | WADLL | SP-tag #372 | YAEWT | SP-tag #672 | YLPYY | SP-tag #972 | WYTAP |
| SP-tag #73 | TYDLL | SP-tag #373 | WAEWT | SP-tag #673 | EYPYY | SP-tag #973 | WWTAP |
| SP-tag #74 | SWDLL | SP-tag #374 | DYEWT | SP-tag #674 | DWPYY | SP-tag #974 | DATAS |
| SP-tag #75 | PWDLL | SP-tag #375 | EYEWT | SP-tag #675 | EWPYY | SP-tag #975 | LLTAS |
| SP-tag #76 | EYDLL | SP-tag #376 | WLEWT | SP-tag #676 | YYPYY | SP-tag #976 | SYTAS |
| SP-tag #77 | DWDLL | SP-tag #377 | WYEWT | SP-tag #677 | WYPYY | SP-tag #977 | TYTAS |
| SP-tag #78 | EWDLL | SP-tag #378 | AAEWW | SP-tag #678 | ALSAA | SP-tag #978 | SWTAS |
| SP-tag #79 | YYDLL | SP-tag #379 | SAEWW | SP-tag #679 | EASAA | SP-tag #979 | TWTAS |
| SP-tag #80 | WWDLL | SP-tag #380 | TAEWW | SP-tag #680 | PLSAA | SP-tag #980 | EWTAS |
| SP-tag #81 | SADLP | SP-tag #381 | ALEWW | SP-tag #681 | DLSAA | SP-tag #981 | AATAT |
| SP-tag #82 | TADLP | SP-tag #382 | EAEWW | SP-tag #682 | ELSAA | SP-tag #982 | SATAT |
| SP-tag #83 | DADLP | SP-tag #383 | TLEWW | SP-tag #683 | PYSAA | SP-tag #983 | DATAT |
| SP-tag #84 | EADLP | SP-tag #384 | YAEWW | SP-tag #684 | SWSAA | SP-tag #984 | SLTAT |
| SP-tag #85 | TLDLP | SP-tag #385 | ELEWW | SP-tag #685 | PWSAA | SP-tag #985 | TLTAT |
| SP-tag #86 | DLDLP | SP-tag #386 | SYEWW | SP-tag #686 | EYSAA | SP-tag #986 | YATAT |
| SP-tag #87 | ELDLP | SP-tag #387 | PYEWW | SP-tag #687 | WLSAA | SP-tag #987 | SYTAT |
| SP-tag #88 | SYDLP | SP-tag #388 | YLEWW | SP-tag #688 | EWSAA | SP-tag #988 | SWTAT |
| SP-tag #89 | PYDLP | SP-tag #389 | PWEWW | SP-tag #689 | YYSAA | SP-tag #989 | EYTAT |
| SP-tag #90 | SWDLP | SP-tag #390 | EYEWW | SP-tag #690 | WYSAA | SP-tag #990 | EWTAT |
| SP-tag #91 | EYDLP | SP-tag #391 | DWEWW | SP-tag #691 | WWSAA | SP-tag #991 | YYTAT |
| SP-tag #92 | WLDLP | SP-tag #392 | SAEWY | SP-tag #692 | TASAD | SP-tag #992 | WYTAT |
| SP-tag #93 | EWDLP | SP-tag #393 | TAEWY | SP-tag #693 | DLSAD | SP-tag #993 | WWTAT |
| SP-tag #94 | WWDLP | SP-tag #394 | DAEWY | SP-tag #694 | WASAD | SP-tag #994 | SATAW |
| SP-tag #95 | DWDLS | SP-tag #395 | SAEYA | SP-tag #695 | TYSAD | SP-tag #995 | TATAW |
| SP-tag #96 | DADLT | SP-tag #396 | PAEYA | SP-tag #696 | TWSAD | SP-tag #996 | ALTAW |
| SP-tag #97 | SYDLT | SP-tag #397 | EAEYA | SP-tag #697 | WLSAD | SP-tag #997 | YATAW |
| SP-tag #98 | DYDLT | SP-tag #398 | PLEYA | SP-tag #698 | TYSAE | SP-tag #998 | SYTAW |
| SP-tag #99 | SADLW | SP-tag #399 | YAEYA | SP-tag #699 | DYSAE | SP-tag #999 | WATAW |
| SP-tag #100 | LLDLW | SP-tag #400 | ELEYA | SP-tag #700 | TWSAE | SP-tag #1000 | SWTAW |
| SP-tag #101 | ELDLW | SP-tag #401 | PYEYA | SP-tag #701 | DWSAE | SP-tag #1001 | EYTAW |
| SP-tag #102 | TWDLW | SP-tag #402 | EYEYA | SP-tag #702 | WWSAE | SP-tag #1002 | YYTAW |
| SP-tag #103 | EWDLW | SP-tag #403 | EWEYA | SP-tag #703 | SWSAL | SP-tag #1003 | TATAY |
| SP-tag #104 | SADLY | SP-tag #404 | WWEYA | SP-tag #704 | WYSAL | SP-tag #1004 | DATAY |
| SP-tag #105 | TADLY | SP-tag #405 | SYEYD | SP-tag #705 | EASAP | SP-tag #1005 | TLTAY |
| SP-tag #106 | EADLY | SP-tag #406 | DYEYD | SP-tag #706 | YASAP | SP-tag #1006 | YATAY |
| SP-tag #107 | PLDLY | SP-tag #407 | DWEYD | SP-tag #707 | ELSAP | SP-tag #1007 | ELTAY |
| SP-tag #108 | ELDLY | SP-tag #408 | AAEYE | SP-tag #708 | WASAP | SP-tag #1008 | SYTAY |
| SP-tag #109 | WADLY | SP-tag #409 | SAEYE | SP-tag #709 | YLSAP | SP-tag #1009 | TYTAY |
| SP-tag #110 | PWDLY | SP-tag #410 | TAEYE | SP-tag #710 | EYSAP | SP-tag #1010 | YYTAY |
| SP-tag #111 | DWDLY | SP-tag #411 | DAEYE | SP-tag #711 | WLSAP | SP-tag #1011 | WYTAY |
| SP-tag #112 | WWDLY | SP-tag #412 | EAEYE | SP-tag #712 | EWSAP | SP-tag #1012 | AATLA |
| SP-tag #113 | AADWD | SP-tag #413 | PLEYE | SP-tag #713 | YYSAP | SP-tag #1013 | SATLA |
| SP-tag #114 | TADWD | SP-tag #414 | DLEYE | SP-tag #714 | WYSAP | SP-tag #1014 | TATLA |
| SP-tag #115 | DADWD | SP-tag #415 | ELEYE | SP-tag #715 | TASAS | SP-tag #1015 | EATLA |
| SP-tag #116 | EADWD | SP-tag #416 | SYEYE | SP-tag #716 | DASAS | SP-tag #1016 | TLTLA |
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5. 효과적인 표적 라이브러리 구축 방법 확인
1200종의 벡터로 이루어진 라이브러리를 하나씩 클로닝 할 수 없으므로 효과적으로 표적 라이브러리 구축 방법을 테스트하였다. 10종의 signal peptides를 가지고 있는 벡터에 1종류의 표적 단백질 유전자를 클로닝 하였다(표 3). 동량의 10종 벡터를 mixture상태로 만들어서 ligation-transformation-plasmid prep을 진행하였다. plasmid 내에 signal peptide의 분포를 확인하기 위해 100개의 colonies에서 각각 plasmid를 prep하여 해당 signal peptide에 대한 sequencing을 진행하였다 (표 4).
| No | Signal peptides | Sequence |
| 1 | Nephronectin | MDFLLALVLVSSLYLQA |
| 2 | Neuropeptide B | MARSATLAAAALALCLL |
| 3 | Neurotrophin-4 | MLPLPSCSLPILLLFLL |
| 4 | Neutrophil defensin 1 | MRTLAILAAILLVALQA |
| 5 | Oxytocin | MAGSSLACCLLGLLALT |
| 6 | Pancreatic alpha amylase | MKFFLLLFTIGFCWAGR |
| 7 | PPY | MAAARLCLSLLLLSTCV |
| 8 | Pepsin | MKWLLLLGLVALSECGR |
| 9 | PENK-A | MARFLTLCTWLLLLGPG |
| 10 | Resistin | MKALCLLLLPVLGLLVS |
| Signal peptide -1 | Signal peptide -2 | Signal peptide -3 | Signal peptide -4 | Signal peptide -5 | Signal peptide -6 | Signal peptide -7 | Signal peptide -8 | Signal peptide -9 | Signal peptide -10 | N.D. | |
|
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony번호 |
해당되는
colony 번호 |
|
| 18 | 1 | 2 | 8 | 7 | 4 | 12 | 16 | 21 | 5 | 3 | |
| 23 | 6 | 13 | 9 | 28 | 24 | 14 | 17 | 26 | 19 | 62 | |
| 34 | 10 | 22 | 11 | 32 | 31 | 40 | 39 | 29 | 20 | 74 | |
| 35 | 25 | 33 | 15 | 44 | 49 | 45 | 70 | 46 | 38 | ||
| 50 | 27 | 42 | 30 | 64 | 60 | 53 | 71 | 56 | 48 | ||
| 52 | 37 | 43 | 36 | 66 | 77 | 76 | 80 | 61 | 55 | ||
| 54 | 51 | 47 | 41 | 75 | 83 | 85 | 87 | 78 | 57 | ||
| 63 | 59 | 68 | 69 | 82 | 94 | 91 | 79 | 58 | |||
| 84 | 65 | 90 | 72 | 100 | 95 | 96 | |||||
| 86 | 67 | 97 | 81 | 98 | 99 | ||||||
| 88 | 73 | 89 | |||||||||
| 93 | 92 | ||||||||||
| 총12개 | 총12 개 | 총10 개 | 총11 개 | 총8 개 | 총9 개 | 총10 개 | 총7 개 | 총8 개 | 총10 개 | 총3 개 | |
97개의 plasmid가 sequencing되었으며 10종의 SP-tag이 모두 확인되었고 그 분포가 7~12%로 골고루 이루어져 있음을 확인하였다(도 8). 효율적인 라이브러리 구축을 위해 동량의 벡터를 혼합하여 라이브러리를 제작하여도 SP-tag 종류에 상관없이 다양성을 유지하는 라이브러리가 구축된다는 것을 확인하였다.
6. 재조합 단백질 생산량을 증가시키는 signal peptide 스크리닝 방법 검증
라이브러리로 발현하여 LC-MS/MS를 이용하여 정량하는 방법의 효용성을 검증하기 위해 독립적으로 발현하여 western blot으로 정량하는 방법을 비교하였다 (도 9). 표적 단백질을 삽입한 9종의 Signal peptide/SP-tag 클론들을 섞어서 동물세포에 transfection한 뒤 수일 후 세포 배양액으로 분비된 SP-tagging 단백질을 LC-MS/MS를 이용해 상대 정량하여 랭킹화 하였다. 이와 동시에 9종의 SP-tag 벡터를 각각 9개의 다른 플라스크에 독립적으로 transfection 시킨 뒤 수일 후 세포 배양액으로 분비된 SP-tagging 단백질들을 western blot을 이용해 발현을 확인하여 발현량을 상대 비교하였다 (도 10).
라이브러리 발현 방식을 이용한 LC-MS/MS 결과 peak 그래프에서 보면 8번, 1번 및 5번이 가장 높은 발현량을 보였고, 3번 및 6번이 각각 그 뒤를 이었다 (도 10 내지 12). 2번, 4번, 7번 및 9번은 발현량이 현저히 낮아 랭킹화 할 수 없었다. 그리고 독립적으로 발현하여 western blot을 진행한 결과에서 보면 1번, 8번 및 5번이 발현량 top 3로 확인되었고, 7번, 6번, 9번, 4번, 3번 및 2번 순서대로 측정되었다 (도 10 및 11). 본 발명은 단백질 생산량을 가장 증가시키는 signal peptide를 선별하는 것이 목적이었던 바, 두 가지 실험의 top 3가 일치하는 결과로 비추어 볼 때 SP-tag 라이브러리를 이용한 signal peptide 선별 방법의 효용이 검증되었음을 확인하였다.
7. SP-tag을 이용한 optimal signal peptide 선별 테스트
Signal peptide/SP-tag을 포함하고 있는 라이브러리에 표적 단백질 human vascular endothelial growth factor (hVEGF)를 클로닝 하여 표적 단백질 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리를 HEK 293 세포에서 발현시키고 3일 뒤 세포 배양액을 모아서 his tag을 이용해 발현된 단백질을 분리 정제하였다. 단백질 샘플을 trypsin을 처리한 후 LC-MS/MS를 이용해 Peak area 값을 구하여 SP-tag에 대해서 상대 정량을 실시하였다 (도 13).
LC-MS/MS 결과 peak 그래프를 보면 발현의 높낮이에 따라 peak의 높이 와 sharpness, noise 강도 등에서 확연한 차이를 보여주는 것을 확인 할 수 있었다 (도 14). 발현량이 높은 SP-tag은 single peak로 확연히 구분되는 반면 발현량이 낮은 SP-tag은 noise signal과 구분되지 않았다. 도 13에서 발현이 높게 확인된 10종의 SP-tag에 해당되는 signal peptide를 선별할 수 있었다 (도 15).
8. SP-tag 정량을 위한 표준 펩타이드 합성
1,200 시그널 펩타이드 스크리닝을 위한 MRM 분석법 개발을 위해 internal standard로 1,200 바코딩 시퀀스 기반의 isotope labeled peptide (15N, 13C 표지된 아르기닌 잔기를 합성)를 합성 (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany) 하여 사용하였다. 1,200 표준용 펩타이드 (internal standard)는 MRM 분석 전에 100 fmol/㎕농도로 단백질 발현 혼합물에 추가하여 사용하였으며, MRM 분석 시 RT (retention time)을 통해 non-specific peak과 target peak을 정확히 구별해 내는 데 사용하였다. 또한 각 그룹 간의 분석 시 발생 되는 오차를 최소화하기 위한 isotope labeled peptide (15N, 13C 표지된 라이신 잔기를 합성) 기반의 글로벌 스탠다드 펩타이드 (EQVTNVGGAVVTGVTAVAQK)를 합성하였다. 글로벌 스탠다드 펩타이드는 시료에 존재하지 않는 펩타이드 시퀀스를 사용하였으며, MRM 분석 전에 50 fmol/㎕ 농도로 단백질 발현 혼합물에 추가하여 사용하였다.
| Number | 서열 | Number | 서열 | Number | 서열 | Number | 서열 |
| Peptide_001 | GAAPAPGHHHHHHR | Peptide_301 | GSYTLSGHHHHHHR | Peptide_601 | GWWPAAGHHHHHHR | Peptide_901 | GEYPWPGHHHHHHR |
| Peptide_002 | GTAPAAGHHHHHHR | Peptide_302 | GSLSYTGHHHHHHR | Peptide_602 | GAAPWWGHHHHHHR | Peptide_902 | GLLPYWGHHHHHHR |
| Peptide_003 | GALSAAGHHHHHHR | Peptide_303 | GTWPAPGHHHHHHR | Peptide_603 | GSYTYPGHHHHHHR | Peptide_903 | GWWDADGHHHHHHR |
| Peptide_004 | GAASLAGHHHHHHR | Peptide_304 | GTAPWPGHHHHHHR | Peptide_604 | GYYTLAGHHHHHHR | Peptide_904 | GEWTWAGHHHHHHR |
| Peptide_005 | GSADAAGHHHHHHR | Peptide_305 | GELTLPGHHHHHHR | Peptide_605 | GYATYLGHHHHHHR | Peptide_905 | GWAEWTGHHHHHHR |
| Peptide_006 | GAATATGHHHHHHR | Peptide_306 | GDLDLPGHHHHHHR | Peptide_606 | GEWPAEGHHHHHHR | Peptide_906 | GEATWWGHHHHHHR |
| Peptide_007 | GTASASGHHHHHHR | Peptide_307 | GTLELPGHHHHHHR | Peptide_607 | GPAEWEGHHHHHHR | Peptide_907 | GDADWWGHHHHHHR |
| Peptide_008 | GSASATGHHHHHHR | Peptide_308 | GEWPAAGHHHHHHR | Peptide_608 | GALELWGHHHHHHR | Peptide_908 | GTAEWWGHHHHHHR |
| Peptide_009 | GPAPASGHHHHHHR | Peptide_309 | GWAPAEGHHHHHHR | Peptide_609 | GLLSLWGHHHHHHR | Peptide_909 | GYYSYPGHHHHHHR |
| Peptide_010 | GSAPAPGHHHHHHR | Peptide_310 | GPAEWAGHHHHHHR | Peptide_610 | GEYSAYGHHHHHHR | Peptide_910 | GPWDLYGHHHHHHR |
| Peptide_011 | GALPAAGHHHHHHR | Peptide_311 | GAAEWPGHHHHHHR | Peptide_611 | GSAEYYGHHHHHHR | Peptide_911 | GPYDWLGHHHHHHR |
| Peptide_012 | GAAPALGHHHHHHR | Peptide_312 | GWLSAPGHHHHHHR | Peptide_612 | GTADYYGHHHHHHR | Peptide_912 | GPLDYWGHHHHHHR |
| Peptide_013 | GSATAPGHHHHHHR | Peptide_313 | GSWPALGHHHHHHR | Peptide_613 | GELELEGHHHHHHR | Peptide_913 | GYYDAYGHHHHHHR |
| Peptide_014 | GALTAAGHHHHHHR | Peptide_314 | GSAPWLGHHHHHHR | Peptide_614 | GYYSLSGHHHHHHR | Peptide_914 | GYADYYGHHHHHHR |
| Peptide_015 | GAATLAGHHHHHHR | Peptide_315 | GYYSAAGHHHHHHR | Peptide_615 | GSYSLYGHHHHHHR | Peptide_915 | GDWDYPGHHHHHHR |
| Peptide_016 | GEASAAGHHHHHHR | Peptide_316 | GYASAYGHHHHHHR | Peptide_616 | GEWDLAGHHHHHHR | Peptide_916 | GPWDYDGHHHHHHR |
| Peptide_017 | GTADAAGHHHHHHR | Peptide_317 | GELELAGHHHHHHR | Peptide_617 | GDWELAGHHHHHHR | Peptide_917 | GWYTLLGHHHHHHR |
| Peptide_018 | GSASLAGHHHHHHR | Peptide_318 | GEAELLGHHHHHHR | Peptide_618 | GEADWLGHHHHHHR | Peptide_918 | GYYSYTGHHHHHHR |
| Peptide_019 | GAASLSGHHHHHHR | Peptide_319 | GALELEGHHHHHHR | Peptide_619 | GWYPAPGHHHHHHR | Peptide_919 | GEWEYAGHHHHHHR |
| Peptide_020 | GDASASGHHHHHHR | Peptide_320 | GDLTLLGHHHHHHR | Peptide_620 | GYAPWPGHHHHHHR | Peptide_920 | GEYEWAGHHHHHHR |
| Peptide_021 | GSATATGHHHHHHR | Peptide_321 | GTLDLLGHHHHHHR | Peptide_621 | GSWDLLGHHHHHHR | Peptide_921 | GWAEYEGHHHHHHR |
| Peptide_022 | GTAPAPGHHHHHHR | Peptide_322 | GSWPADGHHHHHHR | Peptide_622 | GLLTWTGHHHHHHR | Peptide_922 | GYAEWEGHHHHHHR |
| Peptide_023 | GAAPAEGHHHHHHR | Peptide_323 | GSAPWDGHHHHHHR | Peptide_623 | GTLTLWGHHHHHHR | Peptide_923 | GEAEYWGHHHHHHR |
| Peptide_024 | GPLSAAGHHHHHHR | Peptide_324 | GTAPWTGHHHHHHR | Peptide_624 | GWATAWGHHHHHHR | Peptide_924 | GWYSLEGHHHHHHR |
| Peptide_025 | GSLPAAGHHHHHHR | Peptide_325 | GWLDAAGHHHHHHR | Peptide_625 | GAATWWGHHHHHHR | Peptide_925 | GSWEYLGHHHHHHR |
| Peptide_026 | GPASLAGHHHHHHR | Peptide_326 | GWADALGHHHHHHR | Peptide_626 | GTYSYTGHHHHHHR | Peptide_926 | GSYEWLGHHHHHHR |
| Peptide_027 | GSADAPGHHHHHHR | Peptide_327 | GAADWLGHHHHHHR | Peptide_627 | GSYTYTGHHHHHHR | Peptide_927 | GELSWYGHHHHHHR |
| Peptide_028 | GTATAPGHHHHHHR | Peptide_328 | GDLSLEGHHHHHHR | Peptide_628 | GYLELPGHHHHHHR | Peptide_928 | GDWTYLGHHHHHHR |
| Peptide_029 | GALDAAGHHHHHHR | Peptide_329 | GELTLTGHHHHHHR | Peptide_629 | GPYELLGHHHHHHR | Peptide_929 | GDYTWLGHHHHHHR |
| Peptide_030 | GSATLAGHHHHHHR | Peptide_330 | GPLSYPGHHHHHHR | Peptide_630 | GEWTAEGHHHHHHR | Peptide_930 | GDLTWYGHHHHHHR |
| Peptide_031 | GAASLTGHHHHHHR | Peptide_331 | GLLPAYGHHHHHHR | Peptide_631 | GEADWDGHHHHHHR | Peptide_931 | GEWSYDGHHHHHHR |
| Peptide_032 | GDATASGHHHHHHR | Peptide_332 | GEATWAGHHHHHHR | Peptide_632 | GDAEWDGHHHHHHR | Peptide_932 | GSYEWDGHHHHHHR |
| Peptide_033 | GTASADGHHHHHHR | Peptide_333 | GAADWDGHHHHHHR | Peptide_633 | GDWDLSGHHHHHHR | Peptide_933 | GEYTWTGHHHHHHR |
| Peptide_034 | GSLSASGHHHHHHR | Peptide_334 | GWLSATGHHHHHHR | Peptide_634 | GTLSWEGHHHHHHR | Peptide_934 | GTYTWEGHHHHHHR |
| Peptide_035 | GDAPAPGHHHHHHR | Peptide_335 | GTWSLAGHHHHHHR | Peptide_635 | GWWSASGHHHHHHR | Peptide_935 | GWYPAYGHHHHHHR |
| Peptide_036 | GTLPAAGHHHHHHR | Peptide_336 | GWASLTGHHHHHHR | Peptide_636 | GSASWWGHHHHHHR | Peptide_936 | GYYPAWGHHHHHHR |
| Peptide_037 | GTAPALGHHHHHHR | Peptide_337 | GTLSAWGHHHHHHR | Peptide_637 | GEYDLPGHHHHHHR | Peptide_937 | GWAPYYGHHHHHHR |
| Peptide_038 | GAATLPGHHHHHHR | Peptide_338 | GSATWLGHHHHHHR | Peptide_638 | GELDYPGHHHHHHR | Peptide_938 | GYAPYWGHHHHHHR |
| Peptide_039 | GEASAPGHHHHHHR | Peptide_339 | GPLDAYGHHHHHHR | Peptide_639 | GWYTAPGHHHHHHR | Peptide_939 | GPWDWPGHHHHHHR |
| Peptide_040 | GTAPADGHHHHHHR | Peptide_340 | GEWSASGHHHHHHR | Peptide_640 | GTWPAYGHHHHHHR | Peptide_940 | GELDYYGHHHHHHR |
| Peptide_041 | GSASLPGHHHHHHR | Peptide_341 | GSAEWSGHHHHHHR | Peptide_641 | GWATYPGHHHHHHR | Peptide_941 | GDLEYYGHHHHHHR |
| Peptide_042 | GALSLAGHHHHHHR | Peptide_342 | GTWSADGHHHHHHR | Peptide_642 | GYATWPGHHHHHHR | Peptide_942 | GWWTLPGHHHHHHR |
| Peptide_043 | GEADAAGHHHHHHR | Peptide_343 | GTATWTGHHHHHHR | Peptide_643 | GTAPYWGHHHHHHR | Peptide_943 | GWLPWTGHHHHHHR |
| Peptide_044 | GDLSAAGHHHHHHR | Peptide_344 | GSWSLSGHHHHHHR | Peptide_644 | GEYTLLGHHHHHHR | Peptide_944 | GTWPWLGHHHHHHR |
| Peptide_045 | GSADALGHHHHHHR | Peptide_345 | GPADYDGHHHHHHR | Peptide_645 | GELTLYGHHHHHHR | Peptide_945 | GTLPWWGHHHHHHR |
| Peptide_046 | GTATLAGHHHHHHR | Peptide_346 | GEYTAPGHHHHHHR | Peptide_646 | GTLEYLGHHHHHHR | Peptide_946 | GWYTAYGHHHHHHR |
| Peptide_047 | GAATLTGHHHHHHR | Peptide_347 | GEAPYTGHHHHHHR | Peptide_647 | GYAEWAGHHHHHHR | Peptide_947 | GYYTAWGHHHHHHR |
| Peptide_048 | GEASATGHHHHHHR | Peptide_348 | GTYSLPGHHHHHHR | Peptide_648 | GAAEYWGHHHHHHR | Peptide_948 | GEYDYDGHHHHHHR |
| Peptide_049 | GSADADGHHHHHHR | Peptide_349 | GSYTLPGHHHHHHR | Peptide_649 | GWYSALGHHHHHHR | Peptide_949 | GDYEYDGHHHHHHR |
| Peptide_050 | GDATATGHHHHHHR | Peptide_350 | GALTYLGHHHHHHR | Peptide_650 | GWLSYAGHHHHHHR | Peptide_950 | GTYEYEGHHHHHHR |
| Peptide_051 | GTLSASGHHHHHHR | Peptide_351 | GEAEYAGHHHHHHR | Peptide_651 | GYLSAWGHHHHHHR | Peptide_951 | GWWELAGHHHHHHR |
| Peptide_052 | GTASLSGHHHHHHR | Peptide_352 | GAAEYEGHHHHHHR | Peptide_652 | GEAEYEGHHHHHHR | Peptide_952 | GWLEWAGHHHHHHR |
| Peptide_053 | GAASAYGHHHHHHR | Peptide_353 | GSYELAGHHHHHHR | Peptide_653 | GEYSLEGHHHHHHR | Peptide_953 | GWAEWLGHHHHHHR |
| Peptide_054 | GEAPAPGHHHHHHR | Peptide_354 | GELSYAGHHHHHHR | Peptide_654 | GSYELEGHHHHHHR | Peptide_954 | GALEWWGHHHHHHR |
| Peptide_055 | GPAPAEGHHHHHHR | Peptide_355 | GSAELYGHHHHHHR | Peptide_655 | GTLDYEGHHHHHHR | Peptide_955 | GELEWEGHHHHHHR |
| Peptide_056 | GALPALGHHHHHHR | Peptide_356 | GDYTLAGHHHHHHR | Peptide_656 | GSWDYAGHHHHHHR | Peptide_956 | GWYSYSGHHHHHHR |
| Peptide_057 | GDLPAAGHHHHHHR | Peptide_357 | GTYDALGHHHHHHR | Peptide_657 | GDASWYGHHHHHHR | Peptide_957 | GSYSYWGHHHHHHR |
| Peptide_058 | GEAPATGHHHHHHR | Peptide_358 | GTADLYGHHHHHHR | Peptide_658 | GSADYWGHHHHHHR | Peptide_958 | GWADWEGHHHHHHR |
| Peptide_059 | GDADAPGHHHHHHR | Peptide_359 | GLLSYSGHHHHHHR | Peptide_659 | GWYTATGHHHHHHR | Peptide_959 | GEADWWGHHHHHHR |
| Peptide_060 | GAATLLGHHHHHHR | Peptide_360 | GWLPAPGHHHHHHR | Peptide_660 | GTWTYAGHHHHHHR | Peptide_960 | GDWSLWGHHHHHHR |
| Peptide_061 | GELSAAGHHHHHHR | Peptide_361 | GPWPALGHHHHHHR | Peptide_661 | GWATYTGHHHHHHR | Peptide_961 | GSWDWLGHHHHHHR |
| Peptide_062 | GSAELAGHHHHHHR | Peptide_362 | GDYSAEGHHHHHHR | Peptide_662 | GYATWTGHHHHHHR | Peptide_962 | GWWTLTGHHHHHHR |
| Peptide_063 | GDLTAAGHHHHHHR | Peptide_363 | GSADYEGHHHHHHR | Peptide_663 | GTATYWGHHHHHHR | Peptide_963 | GTLTWWGHHHHHHR |
| Peptide_064 | GTLDAAGHHHHHHR | Peptide_364 | GEYTATGHHHHHHR | Peptide_664 | GPWELPGHHHHHHR | Peptide_964 | GTYPYYGHHHHHHR |
| Peptide_065 | GTADALGHHHHHHR | Peptide_365 | GTYDADGHHHHHHR | Peptide_665 | GELPWPGHHHHHHR | Peptide_965 | GWYELPGHHHHHHR |
| Peptide_066 | GALSLSGHHHHHHR | Peptide_366 | GEATYTGHHHHHHR | Peptide_666 | GPLPWEGHHHHHHR | Peptide_966 | GELPWYGHHHHHHR |
| Peptide_067 | GTLSATGHHHHHHR | Peptide_367 | GYYPAAGHHHHHHR | Peptide_667 | GYYPAEGHHHHHHR | Peptide_967 | GPLEYWGHHHHHHR |
| Peptide_068 | GSLTATGHHHHHHR | Peptide_368 | GSYTLTGHHHHHHR | Peptide_668 | GPYEYAGHHHHHHR | Peptide_968 | GDWSWDGHHHHHHR |
| Peptide_069 | GTASLTGHHHHHHR | Peptide_369 | GYAPAYGHHHHHHR | Peptide_669 | GEAPYYGHHHHHHR | Peptide_969 | GYYSLYGHHHHHHR |
| Peptide_070 | GSATLTGHHHHHHR | Peptide_370 | GTLTYSGHHHHHHR | Peptide_670 | GPAEYYGHHHHHHR | Peptide_970 | GEWPYDGHHHHHHR |
| Peptide_071 | GAAPAYGHHHHHHR | Peptide_371 | GAAPYYGHHHHHHR | Peptide_671 | GSWSYTGHHHHHHR | Peptide_971 | GEYPWDGHHHHHHR |
| Peptide_072 | GPLPAPGHHHHHHR | Peptide_372 | GPLELLGHHHHHHR | Peptide_672 | GWLDLPGHHHHHHR | Peptide_972 | GDYEWPGHHHHHHR |
| Peptide_073 | GYASASGHHHHHHR | Peptide_373 | GPWDAPGHHHHHHR | Peptide_673 | GPWDLLGHHHHHHR | Peptide_973 | GSYDYYGHHHHHHR |
| Peptide_074 | GSASAYGHHHHHHR | Peptide_374 | GDAPWPGHHHHHHR | Peptide_674 | GPLDWLGHHHHHHR | Peptide_974 | GYYTYTGHHHHHHR |
| Peptide_075 | GAASYSGHHHHHHR | Peptide_375 | GELDLPGHHHHHHR | Peptide_675 | GDYPYSGHHHHHHR | Peptide_975 | GEWTLYGHHHHHHR |
| Peptide_076 | GPATLPGHHHHHHR | Peptide_376 | GDLELPGHHHHHHR | Peptide_676 | GSYDYPGHHHHHHR | Peptide_976 | GDWDLYGHHHHHHR |
| Peptide_077 | GELPAAGHHHHHHR | Peptide_377 | GLLDLLGHHHHHHR | Peptide_677 | GTYTYPGHHHHHHR | Peptide_977 | GEYTWLGHHHHHHR |
| Peptide_078 | GEAPALGHHHHHHR | Peptide_378 | GWLTAPGHHHHHHR | Peptide_678 | GYYDLAGHHHHHHR | Peptide_978 | GELTYWGHHHHHHR |
| Peptide_079 | GALPAEGHHHHHHR | Peptide_379 | GTLPWAGHHHHHHR | Peptide_679 | GYADYLGHHHHHHR | Peptide_979 | GDLDYWGHHHHHHR |
| Peptide_080 | GAAELPGHHHHHHR | Peptide_380 | GTAPWLGHHHHHHR | Peptide_680 | GELPWTGHHHHHHR | Peptide_980 | GWWSAYGHHHHHHR |
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| Peptide_222 | GEYPAAGHHHHHHR | Peptide_522 | GELPAWGHHHHHHR | Peptide_822 | GELPWEGHHHHHHR | Peptide_1122 | GEYTYWGHHHHHHR |
| Peptide_223 | GEAPAYGHHHHHHR | Peptide_523 | GEAPWLGHHHHHHR | Peptide_823 | GEYEYAGHHHHHHR | Peptide_1123 | GTWEYYGHHHHHHR |
| Peptide_224 | GPAEYAGHHHHHHR | Peptide_524 | GPLSLWGHHHHHHR | Peptide_824 | GWWDAPGHHHHHHR | Peptide_1124 | GPWSWWGHHHHHHR |
| Peptide_225 | GYLSAPGHHHHHHR | Peptide_525 | GYAEYAGHHHHHHR | Peptide_825 | GWAPWDGHHHHHHR | Peptide_1125 | GDYDYWGHHHHHHR |
| Peptide_226 | GSYPALGHHHHHHR | Peptide_526 | GAAEYYGHHHHHHR | Peptide_826 | GDAPWWGHHHHHHR | Peptide_1126 | GEWELWGHHHHHHR |
| Peptide_227 | GYASLPGHHHHHHR | Peptide_527 | GSYPYSGHHHHHHR | Peptide_827 | GYYSLEGHHHHHHR | Peptide_1127 | GWLEWEGHHHHHHR |
| Peptide_228 | GPLSAYGHHHHHHR | Peptide_528 | GYYSLAGHHHHHHR | Peptide_828 | GSYEYLGHHHHHHR | Peptide_1128 | GELEWWGHHHHHHR |
| Peptide_229 | GALSYPGHHHHHHR | Peptide_529 | GEWDAPGHHHHHHR | Peptide_829 | GSLEYYGHHHHHHR | Peptide_1129 | GEWDWEGHHHHHHR |
| Peptide_230 | GSWTASGHHHHHHR | Peptide_530 | GEAPWDGHHHHHHR | Peptide_830 | GTYDYLGHHHHHHR | Peptide_1130 | GWYPWLGHHHHHHR |
| Peptide_231 | GSYPADGHHHHHHR | Peptide_531 | GDAEWPGHHHHHHR | Peptide_831 | GEWDLLGHHHHHHR | Peptide_1131 | GWLPYWGHHHHHHR |
| Peptide_232 | GPASYDGHHHHHHR | Peptide_532 | GPAEWDGHHHHHHR | Peptide_832 | GDWELLGHHHHHHR | Peptide_1132 | GYLPWWGHHHHHHR |
| Peptide_233 | GSADYPGHHHHHHR | Peptide_533 | GDWSLPGHHHHHHR | Peptide_833 | GELDLWGHHHHHHR | Peptide_1133 | GSWTWWGHHHHHHR |
| Peptide_234 | GTYTAPGHHHHHHR | Peptide_534 | GSWDLPGHHHHHHR | Peptide_834 | GPLPYWGHHHHHHR | Peptide_1134 | GYYEYEGHHHHHHR |
| Peptide_235 | GDADAYGHHHHHHR | Peptide_535 | GTLTWPGHHHHHHR | Peptide_835 | GEYSYDGHHHHHHR | Peptide_1135 | GWWDYPGHHHHHHR |
| Peptide_236 | GAADYDGHHHHHHR | Peptide_536 | GWADLLGHHHHHHR | Peptide_836 | GSYEYDGHHHHHHR | Peptide_1136 | GWYDWPGHHHHHHR |
| Peptide_237 | GSYTLAGHHHHHHR | Peptide_537 | GSYDAYGHHHHHHR | Peptide_837 | GTYDYDGHHHHHHR | Peptide_1137 | GPYDWWGHHHHHHR |
| Peptide_238 | GYASLTGHHHHHHR | Peptide_538 | GSADYYGHHHHHHR | Peptide_838 | GWWTLAGHHHHHHR | Peptide_1138 | GYYPYYGHHHHHHR |
| Peptide_239 | GALTYSGHHHHHHR | Peptide_539 | GYYTATGHHHHHHR | Peptide_839 | GWATWLGHHHHHHR | Peptide_1139 | GWYSWEGHHHHHHR |
| Peptide_240 | GSATYLGHHHHHHR | Peptide_540 | GTYTAYGHHHHHHR | Peptide_840 | GYYPAYGHHHHHHR | Peptide_1140 | GEWSWYGHHHHHHR |
| Peptide_241 | GEYSASGHHHHHHR | Peptide_541 | GYATYTGHHHHHHR | Peptide_841 | GYAPYYGHHHHHHR | Peptide_1141 | GEYSWWGHHHHHHR |
| Peptide_242 | GEASYSGHHHHHHR | Peptide_542 | GPYELPGHHHHHHR | Peptide_842 | GELDWDGHHHHHHR | Peptide_1142 | GSWEYWGHHHHHHR |
| Peptide_243 | GTYSADGHHHHHHR | Peptide_543 | GEWTALGHHHHHHR | Peptide_843 | GDLDWEGHHHHHHR | Peptide_1143 | GSYEWWGHHHHHHR |
| Peptide_244 | GSYDATGHHHHHHR | Peptide_544 | GDWDALGHHHHHHR | Peptide_844 | GTLEWEGHHHHHHR | Peptide_1144 | GTWDYWGHHHHHHR |
| Peptide_245 | GTATYTGHHHHHHR | Peptide_545 | GTWELAGHHHHHHR | Peptide_845 | GWWSAEGHHHHHHR | Peptide_1145 | GWWPWPGHHHHHHR |
| Peptide_246 | GPLTLLGHHHHHHR | Peptide_546 | GELTWAGHHHHHHR | Peptide_846 | GEWSAWGHHHHHHR | Peptide_1146 | GPWPWWGHHHHHHR |
| Peptide_247 | GPWPASGHHHHHHR | Peptide_547 | GTLEWAGHHHHHHR | Peptide_847 | GSWEWAGHHHHHHR | Peptide_1147 | GYYEWLGHHHHHHR |
| Peptide_248 | GSAPWPGHHHHHHR | Peptide_548 | GEATWLGHHHHHHR | Peptide_848 | GWASWEGHHHHHHR | Peptide_1148 | GWLEYYGHHHHHHR |
| Peptide_249 | GWLPAAGHHHHHHR | Peptide_549 | GDADWLGHHHHHHR | Peptide_849 | GEASWWGHHHHHHR | Peptide_1149 | GWYDYEGHHHHHHR |
| Peptide_250 | GAAPWLGHHHHHHR | Peptide_550 | GTAEWLGHHHHHHR | Peptide_850 | GSAEWWGHHHHHHR | Peptide_1150 | GEWDYYGHHHHHHR |
| Peptide_251 | GELPAEGHHHHHHR | Peptide_551 | GSWTLLGHHHHHHR | Peptide_851 | GDATWWGHHHHHHR | Peptide_1151 | GWWEWAGHHHHHHR |
| Peptide_252 | GEAELPGHHHHHHR | Peptide_552 | GWWSAAGHHHHHHR | Peptide_852 | GTADWWGHHHHHHR | Peptide_1152 | GEWEWEGHHHHHHR |
| Peptide_253 | GTLDLPGHHHHHHR | Peptide_553 | GWASAWGHHHHHHR | Peptide_853 | GWYTLPGHHHHHHR | Peptide_1153 | GDWSWWGHHHHHHR |
| Peptide_254 | GLLSLLGHHHHHHR | Peptide_554 | GAASWWGHHHHHHR | Peptide_854 | GTYPWLGHHHHHHR | Peptide_1154 | GSWDWWGHHHHHHR |
| Peptide_255 | GWADAPGHHHHHHR | Peptide_555 | GSYSYTGHHHHHHR | Peptide_855 | GYYTAYGHHHHHHR | Peptide_1155 | GWWTWTGHHHHHHR |
| Peptide_256 | GAADWPGHHHHHHR | Peptide_556 | GPLDLYGHHHHHHR | Peptide_856 | GEWPYSGHHHHHHR | Peptide_1156 | GWYEWPGHHHHHHR |
| Peptide_257 | GELDLAGHHHHHHR | Peptide_557 | GEAEWSGHHHHHHR | Peptide_857 | GSYEWPGHHHHHHR | Peptide_1157 | GEWPWYGHHHHHHR |
| Peptide_258 | GDAELLGHHHHHHR | Peptide_558 | GSAEWEGHHHHHHR | Peptide_858 | GDWTYPGHHHHHHR | Peptide_1158 | GEYPWWGHHHHHHR |
| Peptide_259 | GYLPAPGHHHHHHR | Peptide_559 | GDADWDGHHHHHHR | Peptide_859 | GWAELYGHHHHHHR | Peptide_1159 | GPYEWWGHHHHHHR |
| Peptide_260 | GPYPALGHHHHHHR | Peptide_560 | GEWSLSGHHHHHHR | Peptide_860 | GYAEWLGHHHHHHR | Peptide_1160 | GYYSYWGHHHHHHR |
| Peptide_261 | GSLDLLGHHHHHHR | Peptide_561 | GDWTLSGHHHHHHR | Peptide_861 | GELEYEGHHHHHHR | Peptide_1161 | GWWDLYGHHHHHHR |
| Peptide_262 | GSAPWTGHHHHHHR | Peptide_562 | GTLSWDGHHHHHHR | Peptide_862 | GYYSYSGHHHHHHR | Peptide_1162 | GWLDYWGHHHHHHR |
| Peptide_263 | GWATALGHHHHHHR | Peptide_563 | GTWTLTGHHHHHHR | Peptide_863 | GPWPWPGHHHHHHR | Peptide_1163 | GWWTYEGHHHHHHR |
| Peptide_264 | GALTAWGHHHHHHR | Peptide_564 | GDLDYPGHHHHHHR | Peptide_864 | GEWDYAGHHHHHHR | Peptide_1164 | GWYEWTGHHHHHHR |
| Peptide_265 | GAATWLGHHHHHHR | Peptide_565 | GWYSAPGHHHHHHR | Peptide_865 | GWADYEGHHHHHHR | Peptide_1165 | GEWTWYGHHHHHHR |
| Peptide_266 | GELTAEGHHHHHHR | Peptide_566 | GPWSYAGHHHHHHR | Peptide_866 | GEADWYGHHHHHHR | Peptide_1166 | GEYTWWGHHHHHHR |
| Peptide_267 | GTAELEGHHHHHHR | Peptide_567 | GSAPYWGHHHHHHR | Peptide_867 | GDAEWYGHHHHHHR | Peptide_1167 | GWWPWLGHHHHHHR |
| Peptide_268 | GTLSLEGHHHHHHR | Peptide_568 | GELEYAGHHHHHHR | Peptide_868 | GDWSYLGHHHHHHR | Peptide_1168 | GWLPWWGHHHHHHR |
| Peptide_269 | GDLSLDGHHHHHHR | Peptide_569 | GYAELEGHHHHHHR | Peptide_869 | GDYSLWGHHHHHHR | Peptide_1169 | GWYEYEGHHHHHHR |
| Peptide_270 | GEWSAAGHHHHHHR | Peptide_570 | GEAEYLGHHHHHHR | Peptide_870 | GSWDYLGHHHHHHR | Peptide_1170 | GYYEWEGHHHHHHR |
| Peptide_271 | GEASAWGHHHHHHR | Peptide_571 | GEYSLLGHHHHHHR | Peptide_871 | GSYDWLGHHHHHHR | Peptide_1171 | GEWEYYGHHHHHHR |
| Peptide_272 | GSAEWAGHHHHHHR | Peptide_572 | GSYELLGHHHHHHR | Peptide_872 | GDLSWYGHHHHHHR | Peptide_1172 | GEYEYWGHHHHHHR |
| Peptide_273 | GAASWEGHHHHHHR | Peptide_573 | GTYDLLGHHHHHHR | Peptide_873 | GWYTLTGHHHHHHR | Peptide_1173 | GPWDWWGHHHHHHR |
| Peptide_274 | GWLSASGHHHHHHR | Peptide_574 | GWYDAAGHHHHHHR | Peptide_874 | GTLTYWGHHHHHHR | Peptide_1174 | GWWTLWGHHHHHHR |
| Peptide_275 | GSWSALGHHHHHHR | Peptide_575 | GWADYAGHHHHHHR | Peptide_875 | GYYELPGHHHHHHR | Peptide_1175 | GWLTWWGHHHHHHR |
| Peptide_276 | GTLPAYGHHHHHHR | Peptide_576 | GAADWYGHHHHHHR | Peptide_876 | GELPYYGHHHHHHR | Peptide_1176 | GWYPYYGHHHHHHR |
| Peptide_277 | GSASWDGHHHHHHR | Peptide_577 | GLLPWPGHHHHHHR | Peptide_877 | GPLEYYGHHHHHHR | Peptide_1177 | GYYPYWGHHHHHHR |
| Peptide_278 | GTWTASGHHHHHHR | Peptide_578 | GPLPWLGHHHHHHR | Peptide_878 | GEWSYTGHHHHHHR | Peptide_1178 | GWWSWEGHHHHHHR |
| Peptide_279 | GSWTATGHHHHHHR | Peptide_579 | GDAEYEGHHHHHHR | Peptide_879 | GDWDYSGHHHHHHR | Peptide_1179 | GEWSWWGHHHHHHR |
| Peptide_280 | GEYSAPGHHHHHHR | Peptide_580 | GELDYSGHHHHHHR | Peptide_880 | GDYDWSGHHHHHHR | Peptide_1180 | GYYTYWGHHHHHHR |
| Peptide_281 | GDYTAPGHHHHHHR | Peptide_581 | GSLDYEGHHHHHHR | Peptide_881 | GSYDWDGHHHHHHR | Peptide_1181 | GWYEWLGHHHHHHR |
| Peptide_282 | GTYPADGHHHHHHR | Peptide_582 | GTLTYEGHHHHHHR | Peptide_882 | GEYPYDGHHHHHHR | Peptide_1182 | GYLEWWGHHHHHHR |
| Peptide_283 | GTADYPGHHHHHHR | Peptide_583 | GDYDLTGHHHHHHR | Peptide_883 | GYYDLLGHHHHHHR | Peptide_1183 | GWWDYEGHHHHHHR |
| Peptide_284 | GAAEYLGHHHHHHR | Peptide_584 | GPYSYPGHHHHHHR | Peptide_884 | GPWEWAGHHHHHHR | Peptide_1184 | GDWEYWGHHHHHHR |
| Peptide_285 | GSYSLPGHHHHHHR | Peptide_585 | GYYPALGHHHHHHR | Peptide_885 | GEAPWWGHHHHHHR | Peptide_1185 | GEYDWWGHHHHHHR |
| Peptide_286 | GPLSYSGHHHHHHR | Peptide_586 | GYLPAYGHHHHHHR | Peptide_886 | GWWSLPGHHHHHHR | Peptide_1186 | GEWPWWGHHHHHHR |
| Peptide_287 | GSLSYPGHHHHHHR | Peptide_587 | GALPYYGHHHHHHR | Peptide_887 | GEYTLYGHHHHHHR | Peptide_1187 | GPWEWWGHHHHHHR |
| Peptide_288 | GLLSYAGHHHHHHR | Peptide_588 | GWYSATGHHHHHHR | Peptide_888 | GYLEYTGHHHHHHR | Peptide_1188 | GYYSWWGHHHHHHR |
| Peptide_289 | GEYDAAGHHHHHHR | Peptide_589 | GSWTYAGHHHHHHR | Peptide_889 | GSWPWLGHHHHHHR | Peptide_1189 | GWWTWEGHHHHHHR |
| Peptide_290 | GYADAEGHHHHHHR | Peptide_590 | GTYSAWGHHHHHHR | Peptide_890 | GPLSWWGHHHHHHR | Peptide_1190 | GEWTWWGHHHHHHR |
| Peptide_291 | GAADYEGHHHHHHR | Peptide_591 | GWASYTGHHHHHHR | Peptide_891 | GWYSAYGHHHHHHR | Peptide_1191 | GDWDWWGHHHHHHR |
| Peptide_292 | GSYDLAGHHHHHHR | Peptide_592 | GSYTAWGHHHHHHR | Peptide_892 | GEWELLGHHHHHHR | Peptide_1192 | GYYDYWGHHHHHHR |
| Peptide_293 | GDASYLGHHHHHHR | Peptide_593 | GTASYWGHHHHHHR | Peptide_893 | GELELWGHHHHHHR | Peptide_1193 | GWWEYEGHHHHHHR |
| Peptide_294 | GSADLYGHHHHHHR | Peptide_594 | GSATYWGHHHHHHR | Peptide_894 | GLLEWEGHHHHHHR | Peptide_1194 | GWYEWEGHHHHHHR |
| Peptide_295 | GTYTLAGHHHHHHR | Peptide_595 | GPLPWDGHHHHHHR | Peptide_895 | GSYEYEGHHHHHHR | Peptide_1195 | GEWEYWGHHHHHHR |
| Peptide_296 | GTLTAYGHHHHHHR | Peptide_596 | GYYDAPGHHHHHHR | Peptide_896 | GSWDWPGHHHHHHR | Peptide_1196 | GEYEWWGHHHHHHR |
| Peptide_297 | GALTYTGHHHHHHR | Peptide_597 | GSWSYSGHHHHHHR | Peptide_897 | GTWTWPGHHHHHHR | Peptide_1197 | GEWDWWGHHHHHHR |
| Peptide_298 | GTATYLGHHHHHHR | Peptide_598 | GWLTLPGHHHHHHR | Peptide_898 | GWWDLAGHHHHHHR | Peptide_1198 | GDWEWWGHHHHHHR |
| Peptide_299 | GTYSAEGHHHHHHR | Peptide_599 | GPWTLLGHHHHHHR | Peptide_899 | GDWELEGHHHHHHR | Peptide_1199 | GWYEYYGHHHHHHR |
| Peptide_300 | GSADYDGHHHHHHR | Peptide_600 | GLLPWTGHHHHHHR | Peptide_900 | GELDWEGHHHHHHR | Peptide_1200 | GYYEYWGHHHHHHR |
10. Aflibercept 표적 라이브러리를 이용하여 생산량을 증가시키는 signal peptide 스크리닝
Signal peptide/SP-tag을 포함하고 있는 라이브러리에 모델 표적 단백질로 Aflibercept를 클로닝 하여 표적 단백질 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리를 HEK 293 세포에서 발현시키고 3일 뒤 세포 배양액을 모아서 his tag을 이용해 발현된 단백질을 분리 정제하였다. 단백질 샘플을 trypsin을 처리한 후 LC-MS/MS를 이용해 Peak area 값을 구하여 SP-tag에 대해서 상대 정량을 실시하였다. 시그널 펩타이드 스크리닝을 위해 디자인된 1,200 바코딩 펩타이드와 합성된 표준 펩타이드 1,200 (총 2,400 펩타이드)개를 효과적으로 분석하기 위해 총 16 그룹 (각 150개 타깃 펩타이드)으로 나누어 MRM 분석을 진행하였다. 각 그룹 (150개 타깃 펩타이드)에는 75개의 바코딩 펩타이드와 75개의 표준 펩타이드로 구성하였다. 또한 16개 그룹 간의 차이를 최소화 하기 위해 글로벌 스탠다드 펩타이드를 함께 분석하여 각 그룹 간 차이를 줄이기 위한 normalization을 수행하였다 (도 16). 16개 그룹에 대한 시스템 안정성을 확인해 본 결과 변동계수 (coefficient of variation, CV)는 17.26 %로 안정적으로 나타났다 (도 16). 16개 그룹 (바코딩&표준 펩타이드: 2,400개)에 대한 각각 LC-MS/MS로 분석하고 글로벌 스탠다드로 보정한 peak area 값을 그래프로 나타내었고 높은 값을 가지는 것이 1차 hit로 선정되었다 (도 17). 스크리닝 시스템을 검증하고 2차 hit를 선별하기 위해 상위 24 종과 하위 24 종에 해당하는 plasmid를 각각 individual expression 시키고 그 발현량을 western blot으로 비교 하였다 (도 18). 정량 분석을 위해 individual expression 시킨 sample을 OCTET 장비를 이용해 정량 하여 이중으로 비교하였다 (도 18). 이를 바탕으로 발현이 높게 확인된 SP-tag 14종에 각각 매칭되는 signal peptide 14종을 선별하였다 (도 19).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등기물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Osong Hi-Tech Medical Industry Promotion Foundation
The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University
<120> High-Throughput Screening Method using Individual Barcoding
System for Identifying Optimal Signal Peptides to Enhance the
Productivity of Protein
<130> HP9504
<150> KR 10-2019-0108722
<151> 2019-09-03
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Barcoding Sequence 3
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<400> 1
Leu Leu Leu
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Barcoding Sequence 4
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> 4th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<400> 2
Leu Leu Leu Leu
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Barcoding Sequence 5
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> 4th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)
<223> 5th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<400> 3
Leu Leu Leu Leu Leu
1 5
Claims (20)
- 다양한 시그널 펩타이드 (signal peptide) 중에서 목적 단백질 (target peptide)을 숙주세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드 (signal peptide)를 선별하기 위한 조성물로서,
상기 조성물은 시그널 펩타이드 태그 (Signal peptide tag, SP-tag)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하고;
상기 시그널 펩타이드 태그는 각각의 시그널 펩타이드 별로 다르게 바코딩 되어 있는 3개 이상의 아미노산으로 이루어져 있는 바코딩 서열 (Barcoding sequence site)을 포함하며;
상기 3개 이상의 아미노산은 L(Leucine), P(Proline), A(Alanine), W(Tryptophan), Y(Tyrosine), T(Threonine), S(Serine), E(Glutamate) 및 D(Aspartate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며, 상기 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:
단백질 분해성 절단 부위 - 링커 - 바코딩 서열 - 링커 - 친화 태그 - 단백질 분해성 절단 부위.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 트립신 절단 부위(trypsin cleavage site), 트롬빈 절단 부위(thrombin cleavage site), 엔터로키나아제 절단 부위 (enterokinase cleavage site), 인자 Xa 절단 부위 (Factor Xa cleavage site), 콜라게나아제 절단 부위 (collagenase cleavage site) 및 TEV 프로테아제 절단부위 (TEV protease cleavage site)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 트립신 절단 부위인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 트립신 절단 부위는 K(Lysine) 및 R(Arginine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 링커는 1개 이상의 G(Glycine)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 친화 태그는 His-tag (Histidine tag), myc-tag, FLAG-tag, SUMO-tag (small ubiquitin-like modifier tag), CYD-tag (covalent yet dissociable NorpD peptide tag), HPC-tag (heavy chain of protein C tag), CBP-tag (calmodulin binding peptide tag) 및 HA-tag (hemagglutinin-tag)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 9 항에 있어서, 상기 친화 태그는 2 내지 15개의 히스티딘으로 구성된 His-tag인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:
<식 1>
트립신 절단 부위 - 링커 - 바코딩 서열 - 링커 - 친화 태그 - 트립신 절단 부위.
- 제 11 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:
<식 2>
K(Lysine) 또는 R(Arginine) - G(Glycine) - 바코딩 서열 - G(Glycine) - 친화 태그 - K(Lysine) 또는 R(Arginine).
- 제 1 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드 태그의 N 말단에 목적 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 상기 목적 단백질의 N 말단에 시그널 펩타이드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 14 항의 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터.
- 하기의 단계를 포함하는, 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 상기 목적 단백질을 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법:
1) 다양한 시그널 펩타이드에 대한 제 15 항의 벡터를 제작하여 라이브러리를 구축하는 단계;
2) 상기 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시키는 단계;
3) 상기 형질전환된 숙주세포로부터 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
4) 상기 형질전환된 숙주세포 외부로 분비된 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열을 정량하는 단계.
- 제 16 항에 있어서, 상기 숙주세포는 CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포, MDCK 세포 및 WI38 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포인 것을 특징으로 하는 선별방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 단계 3)은 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시킨 후, 친화 태그를 이용하여 분리 및 정제하는 단계 (단계 3-1))를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 선별방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 단계 3)은 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드에 트립신을 처리하는 단계 (단계 3-2))를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 선별방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 단계 4)는 LC-MS/MS를 이용하여 정량하는 것을 특징으로 하는 선별방법.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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