KR102406463B1 - 단백질 생산성 향상을 위한 개별 바코딩 시스템 도입한 시그널 펩타이드 초고속 선별방법 - Google Patents

단백질 생산성 향상을 위한 개별 바코딩 시스템 도입한 시그널 펩타이드 초고속 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 중에서 목적 단백질을 세포 밖으로 효율적으로 분비하는 최적의 시그널 펩타이드를 선별하기 위한 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 목적 단백질을 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및/또는 선별방법을 이용하면, 상기 시그널 펩타이드 별로 만들어진 바코딩 서열을 통해 목적 단백질에 최적인 시그널 펩타이드를 초고속으로 선별할 수 있어 재조합 단백질의 생산 수율을 극대화 할 수 있다.

Description

단백질 생산성 향상을 위한 개별 바코딩 시스템 도입한 시그널 펩타이드 초고속 선별방법{High-Throughput Screening Method using Individual Barcoding System for Identifying Optimal Signal Peptides to Enhance the Productivity of Protein}
본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 중에서 목적 단백질을 숙주 세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드를 선별하기 위한, 바코딩 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 재조합 의약품 시장의 폭발적인 성장을 통해 기존의 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약시장의 판권이 뒤집히고 있다.
재조합 단백질 의약품은 유전자 재조합 기술을 이용하여 생체에서 얻기 힘든 치료용 단백질 성분을 미생물이나 동물세포시스템을 통해 대량생산한 의약품을 말한다. 재조합 단백질은 세포 내에 발현시키거나 세포 외로 분비되도록 조절할 수 있다. 세포 내 발현 시 단백질의 과발현으로 인하여 세포 내에 비활성화 상태의 불용성 덩어리로 축적되는 경우가 많으며, 그렇지 않다 하더라도 세포를 파쇄하는 번거로움과 세포 내에 존재하는 수많은 단백질들과 분리하기 위한 정제공정의 어려움 등 생산성을 저하시키는 많은 요인들을 제공한다. 반면에 생성된 단백질을 세포 외로 분비시킬 경우 전자의 경우에 따르는 어려움을 쉽게 회피할 수 있다. 또한 단백질의 세포외 분비는 전사 후 단백질의 접힘 및 수식이 정확하게 이루어졌을 때만 가능하므로 치료용 단백질의 생산 시 활성화된 형태의 정확한 3차 구조를 가진 가용성 단백질을 얻을 수 있는 장점이 있다. 따라서 재조합 단백질을 세포 외로 분비될 수 있도록 생산하는 것은 단백질의 생산수율 측면뿐만 아니라 단백질의 품질관리(quality control) 측면에서도 유리하다. 그러므로 재조합 단백질 의약품을 제조하는 데에 있어, 재조합 단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 최적화 단계가 중요하다.
시그널 펩타이드는 분비 단백질이나 막단백질의 N 말단에 위치하여 분비성 단백질 또는 막 단백질의 표적화 (targeting) 신호로 기능하는 아미노산 서열로, 현재까지 알려진 진핵생물의 시그널 펩타이드의 종류만 4~ 5천여 가지로 매우 다양하다. 목적 단백질을 생산함에 있어서, 어떠한 시그널 펩타이드를 적용하느냐에 따라 목적 단백질의 세포외 분비율이 달라질 수 있으며, 이와 관련하여 목적 단백질에 맞는 시그널 펩타이드를 선정하여 목적 단백질 세포외 분비를 최적화하는 연구가 보고된 바 있다 (Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2011) 43 (2): 96-102, Signal peptide replacements enhance expression and secretion of hepatitis C virus envelope glycoproteins. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Jan 1;391(1):931-5, Signal peptide design for improving recombinant protein secretion in the baculovirus expression vector system.).
따라서, 단백질 의약품 개발시 상기 4천개 이상의 시그널 펩타이드 중 목적 단백질 발현에 가장 적합한 시그널 펩타이드를 초고속으로 스크리닝하여 목적 단백질에 도입한다면 인위적으로 재조합 단백질 의약품 생산량의 극대화를 유도할 수 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 목적 단백질을 세포 외로 고효율로 분비시킬 수 있는, 목적단백질의 분비에 가장 적합한 시그널 펩타이드를 초고속으로 탐색하는 방법을 찾고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 특정한 종류의 아미노산을 조합하여 상기 시그널 펩타이드 별로 바코딩 서열을 만들어 이를 라이브러리화 한 후 숙주세포에서 발현시키고 숙주세포의 배양액을 이용하여 목적 단백질을 정량하면, 목적 단백질을 외부로 효율적으로 분비시킬 수 있는 최적의 시그널 펩타이드를 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다양한 시그널 펩타이드 (signal peptide) 중에서 목적 단백질 (target peptide)을 숙주세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드 (signal peptide)를 선별하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 상기 목적 단백질을 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 (signal peptide) 중에서 목적 단백질 (target peptide)을 숙주세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드 (signal peptide)를 선별하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 목적 단백질을 세포 외로 고효율로 분비시킬 수 있는, 목적단백질의 분비에 가장 적합한 시그널 펩타이드를 초고속으로 탐색하는 방법을 찾고자 노력한 결과, 특정한 종류의 아미노산을 조합하여 상기 시그널 펩타이드 별로 바코딩 서열을 만들어 이를 목적 단백질에 적용할 경우, 목적 단백질을 외부로 효율적으로 분비시킬 수 있는 최적의 시그널 펩타이드를 선별할 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "시그널 펩타이드" 또는 "signal peptide"는 세포 외부로 분비되는 분비성 단백질의 N 말단 (전단)에 결합되어 세포막을 통과시키는 펩타이드를 의미한다. 상기 시그널 펩타이드는 보통 10 내지 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 막통과에 있어 특이적인 protease에 의해 절단되어 제거되며, 세포 외부로는 상기 분비성 단백질만이 분비되게 된다. 현재까지 알려진 바로는 진핵세포 내에 존재하는 시그널 펩타이드만도 총 4137개가 알려져 있다 (Uniprot, 2017.06.)
세포 외부로 분비되는 분비성 단백질마다 고유의 시그널 펩타이드를 가지고 있는데, 이는 발현하는 세포의 종류, 발현된 단백질의 역할, 또는 적정량의 단백질의 발현을 위해서 각각의 다른 시그널 펩타이드를 가지고 있는 것으로 예상되고 있다.
본 명세서에서 용어 "목적 단백질" 또는 "target protein"은 적당한 숙주세포를 이용하여 이를 고효율로 생산하고자 하는 단백질을 의미하며, 바이오 의약품의 개발시 목적 단백질에 대한 최적의 시그널 펩타이드를 재조합 단백질에 도입한다면 인위적으로 상기 목적 단백질 생산량의 극대화를 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 시그널 펩타이드 태그(Signal peptide tag, SP-tag)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "시그널 펩타이드 태그", "Signal peptide tag" 또는 "SP-tag"는 각각의 시그널 펩타이드 별로 다르게 바코딩 되어 있는 3개 이상의 아미노산으로 이루어져 있는 바코딩 서열 (Barcoding sequence site)을 포함하는 태그로서, 직접 또는 링커를 활용하여 목적 단백질의 C 말단 (후단)에 결합될 수 있는 펩타이드 태그를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 3개 이상의 아미노산은 L(Leucine), P(Proline), A(Alanine), W(Tryptophan), Y(Tyrosine), T(Threonine), S(Serine), E(Glutamate) 및 D(Aspartate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 9가지 아미노산 중 3개를 조합하여 코돈을 만들 경우, 총 729가지(9x9x9)의 시그널 펩타이드를 바코딩 할 수 있으며, 4개를 조합하여 코돈을 만들 경우 6,561가지(9x9x9x9), 5개를 조합하여 코돈을 만들 경우 59,049가지(9x9x9x9x9)의 시그널 펩타이드를 바코딩 할 수 있다. 현재까지 밝혀진 진핵생물의 시그널 펩타이드 종류가 4,137개인 점을 고려하면 상기 바코딩 서열은 바람직하게는 3 내지 8개, 보다 바람직하게는 3 내지 5개가 적합하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 동일한 3개의 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
예를 들어, LLL, PPP, AAA, WWW, YYY, TTT, SSS, EEE 및 DDD로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 2개는 동일한 아미노산을, 다른 1개는 다른 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
예를 들어, LLP, PPA, AAW, WWY, YYT, TTS, SSE, EED 및 DDL과 같이 동일한 아미노산이 연속해서 반복되는 형태로 서열을 구성하거나, LDL, PEP, ASA, WTW, YLY, TPT, SAS, EWE 및 DYD 등과 같이 동일한 아미노산 사이에 다른 아미노산이 삽입된 형태로 구성할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 3가지 모두 다른 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
예를 들어, LPA, PAW, AWY, WYT, YTS, TSE, SED, EDL 및 DLP 등과 같이 서로 다른 아미노산이 나열된 형태로 서열을 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 동일한 4개의 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 일부는 동일한 아미노산을, 일부는 다른 아미노산을 서로 조합하여 4개의 아미노산으로 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 동일한 5개의 아미노산을 이용하여 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 상기 9가지 아미노산 중 일부는 동일한 아미노산을, 일부는 다른 아미노산을 서로 조합하여 5개의 아미노산으로 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 하기의 서열목록 제1서열을 포함하거나, 서열목록 제1서열로 구성되는 것이다.
[L]1[L]2[L]3 (서열목록 제1서열)
상기 서열목록 제1서열에 있어서 [L]1, [L]2 또는 [L]3는 P, A, W, Y, T, S, E 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 하기의 서열목록 제2서열을 포함하거나, 서열목록 제2서열로 구성되는 것이다.
[L]1[L]2[L]3[L]4 (서열목록 제2서열)
상기 서열목록 제2서열에 있어서 [L]1, [L]2, [L]3 또는 [L]4는 P, A, W, Y, T, S, E 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바코딩 서열은 하기의 서열목록 제3서열을 포함하거나, 서열목록 제3서열로 구성되는 것이다.
[L]1[L]2[L]3[L]4[L]5 (서열목록 제3서열)
상기 서열목록 제3서열에 있어서 [L]1, [L]2, [L]3, [L]4 또는 [L]5는 P, A, W, Y, T, S, E 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 9가지의 아미노산을 바코딩 서열로 선정한 이유는 다음과 같다:
① 먼저 20 종의 아미노산에서 후술하는 트립신 절단 부위인 K 및 R을 제외하여 18종의 아미노산을 선정하였다.
② 이후, 아래와 같은 실험을 통해 상기 18종의 아미노산 중 소수성 지표(hydropathy index)가 높거나 낮은 V, F, G, C, H 및 N의 6종을 제외하여 12종의 아미노산을 선정하였다: 먼저 아미노산을 1개씩 다르게 하여 LC-MS 분석을 통해 발현량이 동일한지 확인을 하였다. 상기 아미노산들 중 LC-MS 분석 시 V, F, G, C, H 및 N의 경우 상대적으로 높거나 낮은 값이 확인이 되어 이를 제외하였다 (또한, 상기 H는 His tag에 영향을 줄 가능성 및 전하 변경의 우려도 존재함).
③ 추가적으로, 상기 12종의 아미노산 중 M은 단백질 digestion시 oxidation modification이 발생할 수 있어서 배제하여 총 11종의 아미노산을 선정하였다.
④ 마지막으로, 이들 중 유사한 질량 (Similar Mass)을 갖는 I, Q, N, L, E 및 D 중에서는 I 및 Q를 배제 (N은 단계 ②에서 배제)하고 L, E 및 D 만 사용하여 최종적으로 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D의 9종을 바코팅 시퀀스로 디자인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그는 단백질 분해성 절단 부위 (proteolytic cleavage site)를 상기 바코딩 서열의 N 말단 (전단)에 추가적으로 포함하여, 상기 단백질에 의해 바코딩 서열이 절단될 수 있는 것이다.
본 명세서에서 용어 "단백질 분해성 절단 부위" 또는 "proteolytic cleavage site"는 절단하고자 하는 단백질 또는 펩타이드 내에 포함된 부위로서, 특정 단백질이 상기 부위를 인식하여 절단하고자 하는 단백질 또는 펩타이드를 절단할 수 있는 부위를 의미한다.
당업계에는 다양한 단백질 분해성 절단 부위가 알려져 있으며, 바람직하게는 트립신 절단 부위 (trypsin cleavage site), 트롬빈 절단 부위 (thrombin cleavage site), 엔터로키나아제 절단 부위 (enterokinase cleavage site), 인자 Xa 절단 부위 (Factor Xa cleavage site), 콜라게나아제 절단 부위 (collagenase cleavage site) 및 TEV 프로테아제 절단부위 (TEV protease cleavage site)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 트립신에 의해 절단되는 트립신 절단 부위인 것이다.
트립신은 K(Lysine) 또는 R(Arginine) 옆을 절단하는 단백질 분해성 효소로서, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 K 및 R로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 단백질 분해성 절단 부위는 바코딩 서열과 직접 연결되거나 링커로 연결될 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 링커로 연결될 수 있으나, 바람직하게는 G(Glycine)을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 링커로서 G를 선정하였는데, 이는 K 옆에 P가 있으면 트립신 절단이 완벽히 이루어지지 않으며, 산성 잔기 (Acidic residue)인 D 및 E의 경우 가수 분해 속도를 저해하여 절단 오류 (miss cleavage)가 발생될 수 있기 때문에 P, D 및 E는 부적합하며, 바코딩 서열로 사용한 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D를 제외하여 안정적 절단을 고려한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 링커는 1개 이상의 G를 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 숙주세포 배양액에서 바코딩 서열을 분리 및 정제하기 위한 친화-태그 (Affinity tag)를 상기 바코딩 서열 말단에 추가적으로 포함하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "친화-태그" 또는 "Affinity tag"는 관심 분자(molecule of interest)에 결합되어, 친화 태그 수용체 (affinity tag receptor)를 이용한 관심 분자 (예를 들어, 바코딩 서열)를 분리 및 정제하기 위한 태그를 의미하며, 당업계에 공지된 다양한 친화-태그를 본 발명의 구현에 이용할 수 있다.
상기 친화-태그는 His-tag (Histidine tag), myc-tag, FLAG-tag, SUMO-tag (small ubiquitin-like modifier tag), CYD-tag (covalent yet dissociable NorpD peptide tag), HPC-tag (heavy chain of protein C tag), CBP-tag (calmodulin binding peptide tag) 및 HA-tag (hemagglutinin-tag)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 15개의 히스티딘으로 구성된 His-tag인 것이다.
또한, 본 발명의 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 1로 표시될 수 있다:
<식 1>
트립신 절단 부위 - 링커 - 바코딩 서열 - 링커 - 친화 태그 - 트립신 절단 부위.
또한, 본 발명의 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 2로 표시될 수 있다:
<식 2>
K(Lysine) 또는 R(Arginine) - G(Glycine) - 바코딩 서열 - G(Glycine) - 친화 태그 - K(Lysine) 또는 R(Arginine).
보다 바람직하게는 본 발명의 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 3으로 표시될 수 있다:
<식 3>
K(Lysine) - G(Glycine) - 바코딩 서열 - G(Glycine) - 친화 태그 - R(Arginine).
펩타이드의 C 말단에 트립신 절단부위인 R(아르기닌)을 삽입할 경우 펩타이드 이온화 안정성을 확보할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 친화-태그인 His tag의 경우, 말단 H는 전하 변경의 우려가 있어, C 말단에 이온화 안정성 확보를 위해 R(아르기닌)을 추가 하였다. 이외에도, 정량성 확보를 위해 internal standard로 isotope labeled peptide를 합성하여 진행시에도 R (아르기닌)을 사용하였다(참고: 15N, 13C 표지된 아르기닌 잔기를 합성).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드 태그의 N 말단(전단)에 목적 단백질이 결합되어 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 상기 목적 단백질의 N 말단(전단)에 시그널 펩타이드가 결합되어 있는 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. "단리된 핵산"은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다 (Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
상기와 같이 시그널 펩타이드 별로 특정한 아미노산 암호로 바코딩된 바코딩 서열을 포함하는 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산서열을 "시그널 펩타이드-목적 단백질-시그널 펩타이드 태그" 형태로 제작하여 벡터에 삽입한 후 이를 적당한 숙주세포에서 발현 시킬 수 있다. 이 경우, 상기 시그널 펩타이드가 "목적 단백질-시그널 펩타이드 태그"를 숙주세포의 세포막으로 효율적으로 분비할 경우, 시그널 펩타이드 태그 내의 바코딩 서열을 확인함으로써 상기 목적단백질을 효율적으로 분비한 시그널 펩타이드의 종류를 손쉽게 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 상기 목적 단백질을 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법을 제공한다:
1) 다양한 시그널 펩타이드에 대한 벡터를 제작하여 라이브러리를 구축하는 단계;
2) 상기 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환 시키는 단계;
3) 상기 형질전환된 숙주세포로부터 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
4) 상기 형질전환된 숙주세포 외부로 분비된 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열을 정량하는 단계.
본 명세서에서 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “형질전환”은 형질감염 (transfection), 형질도입 (transduction) 또는 형질전환 (transformation)을 포함하는 의미로 사용된다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염 (transfected), 형질도입 (transduced) 또는 형질전환 (transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균 (bacteria)세포, 이스트 (yeast), 동물 (CHO 세포 등) 또는 인간 세포 (HeLa 세포, HEK293 세포, BHK 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포, MDCK 세포, WI38 세포 등)을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 단계 3) (상기 형질전환된 숙주세포로부터 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시키는 단계) 이후에, 친화 태그를 이용하여 분리 및 정제하는 단계(단계 3-1))를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 3) 이후에, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드에 트립신을 처리하는 단계(단계 3-2))를 추가적으로 포함하여, 트립신 절단에 의해 목적 단백질과 바코딩 서열을 효율적으로 분리할 수 있다.
상기 단계 3-1) 및 3-2)은 상기 단계 3) 이후, 개별로 실시하거나 순서대로 또는 역순으로 실시할 수 있다.
상기 단계 4)의 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열의 정량은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선면역분석 (radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학 (immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학 (immunocytochemistry) 분석, 면역침강법 (immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블롯 (western blot), 및 ELISA (enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열의 정량을 각각 웨스턴 블롯으로 정량한 경우와 LC-MS/MS를 이용한 초고속으로 정량한 경우를 비교하여 보았다. 이 경우 상기 바코딩 서열을 이용하여 LC-MS/MS로 초고속으로 정량한 경우에도 가장 발현량이 높은 3가지의 시그널 펩타이드가 웨스턴 블롯의 경우와 일치하여, LC-MS/MS를 이용한 초고속으로 정량의 효용성을 검증하였다.
초고속 펩타이드 정량을 위해 LC-MS/MS를 이용하는 경우, 최대 20개 아미노산까지 포함하는 경우 정량성 확보에 용이한 점을 고려하여, 상기 시그널 펩타이드 태그의 길이는 총 20개 아미노산 이내인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 하기 식 1에서 링커는 1-3개의 아미노산, 바코딩 서열은 3-5개의 아미노산, 친화 태그는 2 내지 10개의 아미노산으로 구성하여 전체 길이를 20개 아미노산 이내로 구성하는 것이 LC-MS/MS를 이용한 정량에 적합하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 다양한 시그널 펩타이드 중에서 목적 단백질을 세포 밖으로 효율적으로 분비하는 최적의 시그널 펩타이드를 선별하기 위한 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 목적 단백질을 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물 및/또는 선별방법을 이용하면, 상기 시그널 펩타이드 별로 만들어진 바코딩 서열을 통해 목적 단백질에 최적인 시그널 펩타이드를 초고속으로 선별할 수 있어 재조합 단백질의 생산 수율을 극대화 할 수 있다.
도 1은 Signal peptide tag (SP-tag)을 이용하여 해당 signal peptide를 식별하는 원리에 대한 모식도이다.
도 2는 SP-tag을 이용하여 단백질 생산량을 증가시키는 signal peptide 선별 방법 모식도를 나타낸다.
도 3은 signal peptide-표적 단백질-SP-tag을 발현하는 벡터의 구축 예시를 나타낸다.
도 4는 1200종의 Signal peptide와 SP-tag으로 이루어진 라이브러리 구축한예시를 나타낸다.
도 5는 SP-tag를 디자인하는 방법을 나타낸다.
도 6은 아미노산 18종을 각각 가지고 있는 18종 SP-tagging 단백질 발현 정제 결과를 나타낸다.
도 7은 18종의 아미노산을 하나씩 포함한 SP-tag의 상대정량 결과를 나타낸다.
도 8은 10종류의 signal peptide 벡터들을 이용한 라이브러리 제작 방법 검증 결과를 나타낸다.
도 9는 LC-MS/MS를 이용한 optimal signal peptide 스크리닝 방법 검증 실험 모식도를 나타낸다.
도 10은 LC-MS/MS와 western blot 실험 결과 비교 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 LC-MS/MS와 western blot 결과를 통한 signal peptide 랭킹화 결과를 나타낸다.
도 12는 9종의 SP-tag 발현량에 따른 LC-MS/MS peak 그래프를 나타낸다.
도 13은 SP-tag과 LC-MS/MS를 이용한 signal peptide 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 14는 Peak area와 intensity에 따른 상대 정량 peak 종류를 나타낸다.
도 15는 선별된 10종의 signal peptide를 나타내는 표이다.
도 16은 시료에 존재하지 않는 isotope labeled peptide 기반의 글로벌 스탠다드 펩타이드 (EQVTNVGGAVVTGVTAVAQK)로 16개 그룹의 MRM 분석결과를 보정하기 위한 수치를 나타낸다.
도 17은 Aflibercept 발현에 적합한 signal peptide 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 18은 LC-MS/MS 분석 결과에서 도출된 결과중 상위 24종과 하위 24종의 individual 발현을 western blot과 OCTET으로 정량하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 19는 western blot과 OCTET으로 분석하여 얻은 2차 hit에 대한 signal peptide를 나타내는 표이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
1. Barcoding sequence 에 사용될 아미노산 선정
LC-MS/MS에서 효율적이고 동등한 이온화 및 검출을 위해 barcoding sequence로 사용할 아미노산을 선정하였다. 총 20종의 아미노산 중 trypsin에 절단되는 K(라이신)와 R(아르기닌)을 제외한 18종의 아미노산이 각각 하나씩 포함된 tag을 한 종의 표적단백질 c-terminal에 fusion된 형태의 18종의 clone들을 제작하였다.
Overlapping PCR (SET15-R500, Solgent)을 이용해 표적유전자를 만들고 vector와 유전자에 제한 효소 AscI (R0558S, New England Biolabs) / XhoI (R0146S, New England Biolabs)을 처리하였다. Vector와 PCR product를 DNA ligation mixture (6023, Takara)와 섞은 후 상온에서 10분간 ligation 시킨 후 DH5α (CP010, Enzynomics)에 transformation하여 클로닝 하였다. 18종의 plasmid를 FreeStyle 293-F 세포 (R79007, ThermoFisher Scientific)에 발현시켰고 3일 후 세포배양액을 수거하였다. 세포배양액에 있는 표적단백질을 Ni-NTA resin (05893801001, Roche)을 이용해 His affinity chromatography로 분리 정제하였다. 18종의 단백질 1 ug 씩 전처리 후 LC-Ms/Ms로 정량하여 peak area 값을 구하고 비교하였다.
2. Signal peptide와 SP-tag vector 구축
1200종의 SP-tag에 대한 primer를 합성하였고 (Cosmogenetech, Republic of Korea) Overlapping PCR (SET15-R500, Solgent)을 이용해 SP-tag 유전자를 제작하였다. Vector와 PCR product에 제한효소 AscI (R0558S, New England Biolabs) / XhoI (R0146S, New England Biolabs)을 처리하고 DNA ligation (6023, Takara)을 하였다. Ligation mixture를 DH5α (CP010, Enzynomics) 에 transformation하여 클로닝 하였다.
3. 표적 단백질 라이브러리 제작 protocol 검증
10종의 signal peptide가 있는 10종 vector들과 1종 표적단백질 유전자를 제한효소 AscI (R0558S, New England Biolabs) / XhoI (R0146S, New England Biolabs)을 각각 처리하고 10종의 vector와 insert를 DNA ligation (6023, Takara) 하였다. 다음 ligation mixture를 DH5α (CP010, Enzynomics)에 transformation하여 mini-library를 제작하였다. Mini-library의 다양성을 확인하기 위해 re-transfromation하여 100개의 colony를 picking 하여 sequencing (Solgent, Republic of Korea) 진행하였다.
4. Signal peptide screening 검증
9종의 SP-tag이 있는 vector들과 1종 표적단백질 유전자를 각각 클로닝하여 9종의 clones을 제작하였다. 9종을 섞어서 혹은 독립적으로 FreeStyle 293-F 세포 (R79007, ThermoFisher Scientific)에 발현시키고 3일 후 세포 배양액을 확보하였다. 세포 배양액에 있는 표적단백질을 검출하기 위해 anti-6 x his antibody (ab18184, Abcam)를 이용해 western blot을 진행하였다. 또한 세포 배양액을 Ni-NTA resin (05893801001, Roche)을 이용해 His affinity chromatograpy를 진행하여 전처리 후 LC-Ms/Ms를 실시하여 peak area 값을 얻었다. Western blot 결과와 LC-MS/MS결과를 비교 분석하였다.
5. 다중반응 모니터링 (MRM : Multiple reaction monitoring)을 이용한 정량
MRM은 나노전자분무 인터페이스를 갖춘 하이브리드 트리플 쿼드러플/이온 트랩 질량 분석기 (6500QTRAP, AB SCIEX, USA)에 연결된 나노 LC 시스템(nanoACQUITY UPLC System Nano-LC, Waters)에서 수행하였다. 상기 질량분석기를 양성 이온 MRM 모드에서 작동하였으며, Q1 and Q3는 상이한 전구체/산물 이온쌍을 전달하도록 세팅하였다.
LC 버퍼 시스템은 하기와 같다: 이동상 A, 2% 아세토니트릴/0.1% 포름산 (Fisher Scientific, Cat# LS118-4) 및 이동상 B, 98% 아세토니트릴/0.1% 포름산 (Fisher Scientific, Cat# LS120-212). 펩타이드를 분리하여 유속 300 nl/min로 45분 내에 5% 내지 95% B로 선형 농도 구배의 이동상 B에서 용출하였다. 총 LC 분석 시간은 60분이었으며, 트랩 (100Å, 5 μm, 180 μm x 20 mm, 2G, V/M, Cat# 186006527)과 분석 (130Å, 1.7 μm, 100 μm X 100, Cat# 186003546)용 컬럼을 각각 사용하였다.
전형적인 장비 세팅은 다음과 같다: 이온스프레이(IS) 볼트 2.3 kV, 인터페이스 히터의 온도 300℃, GS1 (nebulizer gas) 셋팅 15, 및 커튼 가스 셋팅 20. 디클러스터링 전위 (DP) 및 충돌 에너지 (CE) MS 계수는 각 펩타이드의 적정화된 수치를 선형 회귀분석 및 매뉴얼 튜닝 하여 결정하였다. MRM 실험은 Q1 and Q3에 대하여 각각 0.2/0.7 Da (FWHM)의 해상도를 이용하여 20 ms의 스캐닝 시간 0.002 m/z의 스캐닝 폭으로 수행되었다. MRM 수행 시 스캐닝 시간은 각 트랜지션에서 20 ms이었고, 트랜지션 스캐닝 간의 퍼즈는 1 ms로 맞추었다. MRM 트랜지션은 최고 강도의 단편 이온을 모니터링 하기 위해 선별되었다.
6. 시료전처리 (In solution digestion)
MRM 분석을 위해 단백질을 다음과 같이 처리하였다. 시료 단백질은 비씨코닌산 (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo ScientificTM, 23225) 분석법으로 정량하였다. 100 μg의 단백질 시료를 6 M urea (GE Healthcare, PN 17-1319-01), 50 mM Tris, pH 8.0 (Invitrogen, AM9855G), 및 30 mM dithiothreitol (DTT, Sigma-Aldrich, PN D0632-10G)를 이용하여 37℃에서 60분간 변성한 후 50 mM iodoacetamide (IAA, Sigma-Aldrich, PN I1149-25G)로 실온의 암실에서 30분간 알킬화 하였다. 우레아를 50 mM Tris, pH 8.0를 이용하여 15배 희석한 후 트립신/라이스씨(Promega, PN V0571)을 1:50 (w/w)의 효소 대 단백질 농도의 비로 첨가하여 37℃에서 Overnight 배양하였다.
트립신 분해는 최종농도 1%의 포름산 (SIGMA Aldrich, F0507) 을 첨가하여 중지하였으며, OASIS cartridges (Waters, PN WAT094225)에서 염을 제거하였다. 상기 카트리지는 사용 전에 0.1% 포름산을 포함하는 3 ml의 물 및 3 ml의 메탄올로 평형화하였다. 사용 후 3 ml 0.1% 포름산으로 세척한 후 1 ml의 60% ACN, 0.1 % 포름산으로 용출하였다. 용출된 시료를 스피드 진공에서 건조 후 동결하였다. MRM 분석 전에 시료는 0.1% 포름산에 0.2 μg/μl 농도로 용해하여 사용하였다.
7. SP-tag design
SP-tag은 cleavage site, barcoding sequence, his tag으로 구성된다. SP-tag에 사용되는 아미노산은 최소 14-20까지 가능하며 (LC-MS 분석 시 최대 20개 amino acid까지가 정량성 확보가 가능), 본 발명자들은 아래와 같은 방식으로 14개의 아미노산을 활용하였다. 14개의 아미노산의 펩타이드 길이를 유지 하면서 1200종의 peptide mass 값이 차이나는 펩타이드를 디자인 하기 위해, SP-Tag 역할을 하는 펩타이드는 정량적으로 차이를 보이지 않게 디자인하였다.
(1) 바코딩 시퀀스 선정
① MRM 분석을 위해 단백질 펩타이드 최대 길이는 20, 최소 길이는 8개 아미노산으로, Trypsin cleavage site인 R 또는 K은 포함시키지 않았다. 즉, 먼저 20 종의 아미노산에서 K 및 R을 제외하여 18종의 아미노산을 선정하였다.
② 이후, 아래와 같은 실험을 통해 상기 18종의 아미노산 중 소수성 지표(hydropathy index)가 높거나 낮은 V, F, G, C, H 및 N의 6종을 제외하여 12종의 아미노산을 선정하였다: 먼저 아미노산을 1개씩 다르게 하여 LC-MS 분석을 통해 발현량이 동일한지 확인을 하였다. 상기 아미노산들 중 LC-MS 분석 시 V, F, G, C, H 및 N의 경우 상대적으로 높거나 낮은 값이 확인이 되어 이를 제외하였다 (또한, 상기 H는 His tag에 영향을 줄 가능성 및 전하 변경의 우려도 존재함).
③ 추가적으로, 상기 12종의 아미노산 중 M은 단백질 digestion시 oxidation modification이 발생할 수 있어서 배제하여 총 11종의 아미노산을 선정하였다.
④ 마지막으로, 이들 중 유사한 질량 (Similar Mass)을 갖는 I, Q, N, L, E 및 D 중에서는 I 및 Q를 배제 (N은 단계 ②에서 배제)하고 L, E 및 D 만 사용하여 최종적으로 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D의 9종을 이용하여 5자리 바코팅 시퀀스를 design 하였다.
(2) Cleavage site 및 his tag design
Cleavage site design으로서, Trypsin cleavage를 위해 앞쪽에 Lysine (K)을 삽입 하였으며, 펩타이드 이온화 안정성과 정량성 확보를 위해 Arginine (R)을 맨 뒤쪽에 삽입하였다.
또한 KP, KD, KE 연속 sequence 발생 방지를 위해 K 뒤에 G를 삽입하였는데, K 옆에 P가 있으면 Trypsin cleavage가 완벽히 이루어지지 않으며, Acidic residue인 D 및 E의 경우 가수 분해 속도를 저해하여 miss cleavage의 발생 원인이기 때문이다. 또한, G를 선정한 이유는 ① 먼저 P, D, E를 제외하고, ② 바코딩 sequence로 사용한 L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D를 제외하였으며, ③ 안정적 cleavage site를 고려하여 G를 선정하였다.
His tag은 표적 단백질만을 분리 정제하기 위한 6 x Histidine tag을 붙였다.
실험결과
1. Signal peptide tag (SP-tag)을 이용하여 해당 signal peptide를 찾은 방법 고안
세포 내에서 translation되는 단백질의 N-terminus에 있는 Signal peptide는 단백질 분비에 매우 중요한 역할을 한다. 재조합 단백질의 생산시 다양한 signal peptide를 접목시킴으로써 세포 밖 분비를 촉진시켜 생산량을 증가 시킬 수 있다. 본 발명은 단백질 생산에 최적의 signal peptide를 찾기 위한 초고속 탐색 방법을 고안하였다. 단백질 N-terminus에 있는 signal peptide는 세포 내에서 cleavage 되므로 분비된 단백질에는 signal peptide가 존재하지 않는다. 그 대신 단백질 C-terminus에 signal peptide tag (SP-tag)를 붙이고 이를 동정함으로써 그에 해당하는 signal peptide를 식별하는 방법을 고안하였다 (도 1).
단백질 생산량을 증가시키는 signal peptide 스크리닝 방법에 대한 모식도는 도 2와 같다:
1) 표적 단백질 라이브러리 제작: 다양한 signal peptide와 이에 해당하는 서로 다른 분자량을 가진 SP-tag들을 가지고 있는 벡터에 표적 단백질을 클로닝하여 표적 단백질 라이브러리를 제작한다.
2) 표적 단백질 라이브러리 발현: 표적 단백질 라이브러리를 동물세포에 transfection 시킨 후, 수일 뒤 세포 밖으로 분비된 단백질을 포함하고 있는 세포 배양액을 모은다. 이때 signal peptide 종류에 따라 분비된 단백질의 양이 다르며 이는 각 signal peptide에 해당하는 SP-tag에 따라 구분될 수 있다.
3) 단백질 생산량을 증가 시키는 signal peptide 선별: 생산된 단백질을 포함한 세포배양액에서 LC-MS/MS를 이용해 다양한 SP-tag을 동정하고 상대정량을 실시한다. 상대정량 값을 이용해 동정된 SP-tag들을 ranking화하고 해당 되는 signal peptide를 식별함으로써 단백질 생산량을 증가시키는 최적의 signal peptide를 찾을 수 있다.
2. Signal peptide 및 SP-tag을 가지고 있는 라이브러리 구축
Signal peptide와 SP-tag 사이에 표적 단백질을 제한 효소 ASC I - Xba I/Nhe I을 이용하여 클로닝 해서 [signal peptide - 표적 단백질 - SP-tag] 형태를 포함하는 벡터를 제작하였다(도 3).
또한, 도 4와 같이 1200종의 signal peptide를 가지고 있는 벡터에 각 signal peptide에 해당하는 1200종의 SP-tag을 클로닝하여 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 구축에 사용된 1200종의 signal peptide는 이미 알려져 있는 인간 분비 단백질의 signal peptide를 사용하였다(표 1).
라이브러리를 구성하는 1200종의 인간 signal peptides
No. Name of Signal peptides Amino acid sequence
1 Afamin MKLLKLTGFIFFLFFLTESLT
2 Alkaline phosphatase MQGPWVLLLLGLRLQLSLG
3 Alpha-1-antitrypsin MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
4 Alpha-2-macroglobulin MGKNKLLHPSLVLLLLVLLPTDA
5 Angiogenin MVMGLGVLLLVFVLGLGLTPPTLA
6 Apolipoprotein E MKVLWAALLVTFLAGCQA
7 Appetite-regulating hormone MPSPGTVCSLLLLGMLWLDLAMA
8 Arylsulfatase A MGAPRSLLLALAAGLAVA
9 Azurocidin MTRLTVLALLAGLLASSRAGSSPLLD
10 Cadherin-2 MCRIAGALRTLLPLLAALLQASVEA
11 Calcitonin MGFQKFSPFLALSILVLLQAGSLHA
12 Carboxypeptidase A1 MRGLLVLSVLLGAVFG
13 Cathepsin B MWQLWASLCCLLVLANA
14 Chromogranin-A MRSAAVLALLLCAGQVTA
15 Cortistatin MPLSPGLLLLLLSGATAT
16 Elastin MAGLTAAAPRPGVLLLLLSILHPSRP
17 Fibroblast growth factor 4 MSGPGTAAVALLPAVLLALLAPWAGRGGAA
18 Fibronectin MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGASKSKR
19 Fibulin-1 MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA
20 Gastric triacylglycerol lipase MWLLLTMASLISVLGTTHG
21 Gastrin MQRLCVYVLIFALALAAFSEA
22 Glucosylceramidase MAGSLTGLLLLQAVSWASG
23 High IgG Fc receptor I MWFLTTLLLWVPVDG
24 Histatin-3 MKFFVFALILALMLSMTGA
25 Human Serum Albumin MKWVTFISLLFLFSSAYS
26 Insulin MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA
27 Insulin-like growth factor 1 MGKISSLPTQLFKCCFCDFLK
28 Interferon alpha-17 MALSFSLLMAVLVLSYKSICSLG
29 Interleukin-2 MQLLSCIALILALV
30 Lactotransferrin MKLVFLVLLFLGALGLCLA
31 Nephronectin MDFLLALVLVSSLYLQAAA
32 Neuropeptide B MARSATLAAAALALCLLLAPPGLA
33 Neurotrophin 4 MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES
34 Neutrophil defensin 1 MRTLAILAAILLVALQAQA
35 Oxytocin MAGSSLACCLLGLLALTSA
36 Pancreatic alpha amylase MKFFLLLFTIGFCWA
37 Pancreatic prohormone MAAARLCLSLLLLSTCVALLLQPLLGAQG
38 Pepsin A4 MKWLLLLGLVALSEC
39 Proenkephalin-A MARFLTLCTWLLLLGPGLLATVRA
40 Resistin MKALCLLLLPVLGLLVSS
41 slit3 MAPGWAGVGAAVRARLALALALASVLSGPPAVA
42 SOD3 MLALLCSCLLLAAGASDA
43 Statherin MKFLVFAFILALMVSMIGA
44 Thromopoietin MELTELLLVVMLLLTARLTLS
45 Tissue-type plasminogen activator MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP
46 Trypsinogen-2 MNLLLILTFVAAAVA
47 Tyrosinase MLLAVLYCLLWSFQTSAG
48 Uteroglobin MKLAVTLTLVTLALCCSSASA
49 Vascular endothelial growth factor A MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQA
50 Wnt-1 MGLWALLPGWVSATLLLALAALPAALA
51 Acidic mammalian chitinase MTKLILLTGLVLILNLQLGSA
52 Acrosin MVEMLPTAILLVLAVSVVA
53 Acrosomal protein SP-10 MNRFLLLMSLYLLGSARGTSS
54 Acyloxyacyl hydrolase MQSPWKILTVAPLFLLLSLQSSA
55 ADAM DEC1 MLRGISQLPAVATMSWVLLPVLWLIVQTQA
56 ADAMTS-like protein 1 MECCRRATPGTLLLFLAFLLLSSRTARS
57 Adipolin MRRWAWAAVVVLLGPQLVLL
58 Adiponectin MLLLGAVLLLLALPGHDQ
59 Adrenomedullin MKLVSVALMYLGSLAFLGADT
60 Agouti-related protein MLTAAVLSCALLLALPATRG
61 Agouti-signaling protein MDVTRLLLATLLVFLCFFTANS
62 Agrin MAGRSHPGPLRPLLPLLVVAACVLPGAGG
63 Alpha-1B-glycoprotein MSMLVVFLLLWGVTWGPVTEA
64 Alpha-2-macroglobulin-like protein 1 MWAQLLLGMLALSPAIA
65 Alpha-fetoprotein MKWVESIFLIFLLNFTES
66 Alpha-lactalbumin MRFFVPLFLVGILFPAILA
67 Ameloblastin MSASKIPLFKMKDLILILCLLEMSFA
68 Amelogenin MGTWILFACLLGAAFA
69 Amelotin MRSTILLFCLLGSTRS
70 Amiloride-sensitive amine oxidase MGRGTLALGWAGAALLLLQMLAAA
71 Amphiregulin MRAPLLPPAPVVLSLLILG
72 Amyloid beta A4 protein MLPGLALLLLAAWTARA
73 Angiotensinogen MRKRAPQSEMAPAGVSLRATILCLLAWAGLAAG
74 Anosmin-1 MVPGVPGAVLTLCLWLAASSGCLA
75 Antileukoproteinase MKSSGLFPFLVLLALGTLAPWAVEG
76 Apelin MNLRLCVQALLLLWLSLTAVCG
77 Apolipoprotein A-I MKAAVLTLAVLFLTGSQA
78 Apolipoprotein B-100 MDPPRPALLALLALPALLLLLLAGARA
79 Aspartylglucosaminidase MARKSNLPVLLVPFLLCQALVRC
80 Asporin MKEYVLLLFLALCS
81 Augurin MAASPARPAVLALTGLALLLLLCWGPGGISG
82 Basigin MAAALFVLLGFALLGTHGASG
83 Beta-2-glycoprotein 1 MISPVLILFSSFLCHVAIA
84 Beta-2-microglobulin MSRSVALAVLALLSLSGLEA
85 Beta-hexosaminidase subunit alpha MTSSRLWFSLLLAAAFAGRATA
86 Beta-microseminoprotein MNVLLGSVVIFATFVTLCNA
87 Beta-secretase 2 MGALARALLLPLLAQWLLRA
88 Biglycan MWPLWRLVSLLALSQA
89 Bone marrow proteoglycan MKLPLLLALLFGAVSA
90 Brevican core protein MAQLFLPLLAALVLAQAPAALA
91 Calreticulin MLLSVPLLLGLLGLAVA
92 Calsequestrin-2 MKRTHLFIVGIYFLSSCRA
93 Carboxylesterase 1 MWLRAFILATLSASAAW
94 Cartilage intermediate layer protein 1 MVGTKAWVFSFLVLEVTSVLG
95 Cerebellin-1 MLGVLELLLLGAAWLAGPARG
96 Ceruloplasmin MKILILGIFLFLCSTPAWA
97 Cholecystokinin MNSGVCLCVLMAVLAAGALT
98 Cholinesterase MHSKVTIICIRFLFWFLLLCMLIGKSHT
99 Chondroadherin-like protein MEGPRSSTHVPLVLPLLVLLLLAPARQAAA
100 Chordin MPSLPAPPAPLLLLGLLLLGSRPARG
101 Choriogonadotropin subunit beta 3 MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA
102 Chorionic somatomammotropin hormone 2 isoform 2 MAAGSRTSLLLAFALLCLPWLQEAGA
103 Chymase MLLLPLPLLLFLLCSRAEA
104 Clusterin MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG
105 Coagulation factor V MFPGCPRLWVLVVLGTSWVGWGSQGTEA
106 Colipase MEKILILLLVALSVAYA
107 Collagen alpha-1(I) chain MFSFVDLRLLLLLAATALLTHG
108 Complement C3 MGPTSGPSLLLLLLTHLPLALG
109 Contactin-1 MKMWLLVSHLVIISITTCLA
110 Corneodesmosin MGSSRAPWMGRVGGHGMMALLLAGLLLPGTLA
111 Corticoliberin MRLPLLVSAGVLLVALLPCPPCRA
112 Corticosteroid-binding globulin MPLLLYTCLLWLPTSGLWTVQA
113 Corticotropin-releasing factor-binding protein MSPNFKLQCHFILIFLTALRGESR
114 C-reactive protein MEKLLCFLVLTSLSHAFG
115 Cubilin MMNMSLPFLWSLLTLLIFAEVNG
116 Cystatin-C MAGPLRAPLLLLAILAVALAVSPAAG
117 Deoxyribonuclease-1 MRGMKLLGALLALAALLQGAVS
118 Dermatopontin MDLSLLWVLLPLVTMAWG
119 Dermcidin MRFMTLLFLTALAGALVCA
120 Dickkopf-related protein 1 MMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSA
121 Dystroglycan MRMSVGLSLLLPLSGRTFLLLLSVVMAQS
122 EGF-like domain-containing protein 1 MGAAAVRWHLCVLLALGTRGRLA
123 Enamelin MLVLRCRLGTSFPKLDNLVPKGKMKILLVFLGLLGNSVA
124 Endothelin-1 MDYLLMIFSLLFVACQG
125 Endothelin-2 MVSVPTTWCSVALALLVALHEGKG
126 Ephrin-A2 MAPAQRPLLPLLLLLLPLPPPPFA
127 Epiphycan MKTLAGLVLGLVIFDAAVT
128 Eppin MGSSGLLSLLVLFVLLANVQG
129 Erythroferrone MAPARRPAGARLLLVYAGLLAAAAAGLG
130 Erythropoietin MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLG
131 E-selectin MIASQFLSALTLVLLIKESGA
132 Fibromodulin MQWTSLLLLAGLFSLSQA
133 Follicular dendritic cell secreted peptide MKKVLLLITAILAVAVG
134 Follistatin MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQA
135 Furin MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADA
136 Galanin peptides MARGSALLLASLLLAAALS
137 Galanin-like peptide MAPPSVPLVLLLVLLLSLAETPAS
138 Gastrokine-1 MLAYSSVHCFREDKMKFTIVFAGLLGVFLAPALA
139 Glucagon MKSIYFVAGLFVMLVQGSWQ
140 Glycophorin-A MYGKIIFVLLLSEIVSISA
141 Glypican-1 MELRARGWWLLCAAAALVACARG
142 GPHB5 protein MKLAFLFLGPMALLLLAGYGCVLG
143 Granulysin MATWALLLLAAMLLGNPGLVFS
144 Granzyme B MQPILLLLAFLLLPRADA
145 Growth hormone variant MAAGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSA
146 Guanylin MNAFLLSALCLLGAWAALAGG
147 Haptoglobin MSALGAVIALLLWGQLFA
148 Heparanase MLLRSKPALPPPLMLLLLGPLGPLSPGALPRPAQA
149 Hepatocyte growth factor MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEG
150 Hepcidin MALSSQIWAACLLLLLLLASLTSG
151 Ig heavy chain V-III region 23 MEFGLSWLFLVAILKGVQC
152 Ig kappa chain V-III region HIC METPAQLLFLLLLWLPDTTG
153 Insulin-like peptide INSL6 MPRLLRLSLLWLGLLLVRFS
154 Integrin alpha-2 MGPERTGAAPLPLLLVLALSQGILNCCLA
155 Intelectin-1 MNQLSFLLFLIATTRGWS
156 Interferon alpha-inducible protein 27-like protein 2 MMKRAAAAAVGGALAVGAVPVVLS
157 Interleukin-2 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
158 Interleukin-6 MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAP
159 Kallikrein-1 MWFLVLCLALSLGGTGAA
160 Kallikrein-6 MKKLMVVLSLIAAAWA
161 Keratocan MAGTICFIMWVLFITDTVWS
162 Kininogen-1 MKLITILFLCSRLLLSLT
163 Klotho MPASAPPRRPRPPPPSLSLLLVLLGLGGRRLRA
164 Lactoperoxidase MRVLLHLPALLASLILLQAAASTTRA
165 Legumain MVWKVAVFLSVALGIGA
166 Leptin MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQA
167 Lumican MSLSAFTLFLALIGGTSG
168 Lymphotactin MRLLILALLGICSLTAYIVEG
169 Lysyl oxidase homolog 2 MERPLCSHLCSCLAMLALLSPLSLA
170 Mammalian ependymin-related protein 1 MPGRAPLRTVPGALGAWLLGGLWAWTLCGLCSLGAVG
171 Mannose-binding protein C MSLFPSLPLLLLSMVAASYS
172 Matrilin-2 MEKMLAGCFLLILGQIVLLPAEA
173 Metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2) MGAAARTLRLALGLLLLATLLRPADA
174 Methyltransferase-like protein 7B MDILVPLLQLLVLLLTLPLHLMA
175 Midkine MQHRGFLLLTLLALLALTSA
176 Mucin-5AC MSVGRRKLALLWALALALACTRHTGHA
177 Muellerian-inhibiting factor MRDLPLTSLALVLSALGA
178 Multimerin-1 MKGARLFVLLSSLWSGGIG
179 Myostatin MQKLQLCVYIYLFMLIVA
180 Napsin-A MSPPPLLQPLLLLLPLLNVEPSGAT
181 Natriuretic peptides A MSSFSTTTVSFLLLLAFQLLGQTRA
182 Natriuretic peptides B MDPQTAPSRALLLLLFLHLAFLGGRS
183 Netrin-4 MGSCARLLLLWGCTVVAA
184 Neural cell adhesion molecule 1 MLQTKDLIWTLFFLGTAVS
185 Neurexophilin-2 MRLRPLPLVVVPGLLQLLFCDS
186 Neurocan core protein MGAPFVWALGLLMLQMLLFVAG
187 Neuroendocrine convertase 1 MERRAWSLQCTAFVLFCAWCALNSAKA
188 Neuroendocrine convertase 2 MKGGCVSQWKAAAGFLFCVMVFASA
189 Neuromedin-B MARRAGGARMFGSLLLFALLAAGV
190 Neurosecretory protein VGF MKALRLSASALFCLLLINGLGA
191 Niemann-Pick C1 protein MTARGLALGLLLLLLCPAQVFS
192 Noggin MERCPSLGVTLYALVVVLGLRATPAGG
193 Norrin MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDS
194 Nyctalopin MKGRGMLVLLLHAVVLGLPSAWA
195 Olfactomedin-4 MRPGLSFLLALLFFLGQAAG
196 Osteoglycin MKTLQSTLLLLLLVPLIKP
197 Otospiralin MQACMVPGLALCLLLGPLAGA
198 Ovochymase-2 MLISRNKLILLLGIVFFERGKS
199 Palmitoyl-protein thioesterase 1 MASPGCLWLLAVALLPWTCASRALQHL
200 Pancreatic lipase-related protein 3 MLGIWIVAFLFFGTSRG
201 Parathyroid hormone MIPAKDMAKVMIVMLAICFLTKSDG
202 Peptide YY MVFVRRPWPALTTVLLALLVCLGALVDA
203 Persephin MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQG
204 Pikachurin MDLIRGVLLRLLLLASSLGPGAVS
205 Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide MTMCSGARLALLVYGIIMHSSVYS
206 Placenta-specific protein 1 MKVFKFIGLMILLTSAFSAGSG
207 Plasma serine protease inhibitor MQLFLLLCLVLLSPQGASL
208 Platelet-derived growth factor receptor beta MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQG
209 Prenylcysteine oxidase 1 MGRVVAELVSSLLGLWLLLCSCGCPEG
210 Prepronociceptin MKVLLCDLLLLSLFSSVFS
211 Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3 MTSSGPGPRFLLLLPLLLPPAASA
212 Proenkephalin-B MAWQGLVLAACLLMFPSTTA
213 Pro-epidermal growth factor MLLTLIILLPVVSKFSFVSLSA
214 Proepiregulin MTAGRRMEMLCAGRVPALLLCLGFHLLQA
215 Progonadoliberin-1 MKPIQKLLAGLILLTWCVEGCSS
216 Prokineticin-1 MRGATRVSIMLLLVTVSDC
217 Prokineticin-2 MRSLCCAPLLLLLLLPPLLLTPRAGDA
218 Prolactin releasing hormone MKVLRAWLLCLLMLGLALRGAAS
219 Prolactin-inducible protein MRLLQLLFRASPATLLLVLCLQLGANKA
220 Prolyl 3-hydroxylase 2 MRERIWAPPLLLLLPLLLPPPLWG
221 Prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-1 MIWYILIIGILLPQSLA
222 Promotilin MVSRKAVAALLVVHVAAMLASQTEA
223 Pro-neuropeptide Y MLGNKRLGLSGLTLALSLLVCLGALAEA
224 Pro-opiomelanocortin MPRSCCSRSGALLLALLLQASMEVRG
225 Prorelaxin H2 MPRLFFFHLLGVCLLLNQFSRAVA
226 ProSAAS MAGSPLLWGPRAGGVGLLVLLLLGLFRPPPALC
227 Prosalusin MAAATRGCRPWGSLLGLLGLVSAAAA
228 Prostaglandin-H2 D-isomerase MATHHTLWMGLALLGVLGDLQA
229 Prostate and testis expressed protein 2 MLVLFLLGTVFLLCPYWGELHDPIKA
230 Protachykinin-1 MKILVALAVFFLVSTQLFA
231 Protein disulfide-isomerase MLRRALLCLAVAALVRA
232 Protein O-glucosyltransferase 1 MEWWASSPLRLWLLLFLLPSAQG
233 Prothrombin MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHS
234 Pro-thyrotropin-releasing hormone MPGPWLLLALALTLNLTGVPGGRA
235 Pulmonary surfactant-associated protein D MLLFLLSALVLLTQPLGYLE
236 Relaxin-3 MARYMLLLLLAVWVLTGELWPGAEA
237 Renalase MAQVLIVGAGMTGSLCA
238 Renin MDGWRRMPRWGLLLLLWGSCTFG
239 Reticulocalbin-2 MRLGPRTAALGLLLLCAAAAGA
240 Sarcalumenin MRALVLLGCLLASLLFSGQA
241 Sclerostin MQLPLALCLVCLLVHTAFRVVEG
242 Secretin MAPRPLLLLLLLLGGSAA
243 Secretoglobin family 1D member 1 MRLSVCLLLLTLALCCYRANA
244 Secretogranin-1 MQPTLLLSLLGAVGLAAVNS
245 Selenoprotein M MSLLLPPLALLLLLAALVAPATA
246 Semenogelin-1 MKPNIIFVLSLLLILEKQAAVMG
247 Serglycin MMQKLLKCSRLVLALALILVLESSVQG
248 Serotransferrin MRLAVGALLVCAVLGLCLA
249 Serum amyloid A-1 protein MKLLTGLVFCSLVLGVSS
250 Serum amyloid P-component MNKPLLWISVLTSLLEAFA
251 Somatomedin-B and thrombospondin type-1
domain-containingprotein
MRTLWMALCALSRLWPGAQA
252 Somatotropin MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA
253 Sperm acrosome-associated protein 5 MKAWGTVVVTLATLMVVTVDA
254 Spexin MKGLRSLAATTLALFLVFVFLGNSSC
255 Spondin-1 MRLSPAPLKLSRTPALLALALPLAAALA
256 Stanniocalcin-1 MLQNSAVLLVLVISASA
257 Stereocilin MALSLWPLLLLLLLLLLLSFAV
258 Steryl-sulfatase MPLRKMKIPFLLLFFLWEAES
259 Submaxillary gland androgen-regulated protein 3A MKSLTWILGLWALAACFTPGES
260 Sulfatase 1 MKYSCCALVLAVLGTELLGSLC
261 Syncollin MSPLRPLLLALALASVPCAQG
262 Tachykinin-3 MRIMLLFTAILAFSLA
263 Tenascin MGAMTQLLAGVFLAFLALATEG
264 Thyroglobulin MALVLEIFTLLASICWVSA
265 Thyroid peroxidase MRALAVLSVTLVMACTEA
266 Transcobalamin-1 MRQSHQLPLVGLLLFSFIPSQLC
267 Transforming growth factor beta-1 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAG
268 Transthyretin MASHRLLLLCLAGLVFVSEA
269 Trehalase MPGRTWELCLLLLLGLGLGSQEA
270 TSHR protein MRPADLLQLVLLLDLPRDLGG
271 Tsukushin MPWPLLLLLAVSGAQT
272 Urocortin MRQAGRAALLAALLLLVQLCPGSSQ
273 Urotensin-2B MNKILSSTVCFGLLTLLSVLSFLQSVHG
274 Versican core protein MFINIKSILWMCSTLIVTHA
275 Vitrin MRTVVLTMKASVIEMFLVLLVTGVHS
276 Vitronectin MAPLRPLLILALLAWVALA
277 WAP four-disulfide core domain protein 2 MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGA
278 Zymogen granule membrane protein 16 MLTVALLALLCASASG
279 Cystatin-S MARPLCTLLL LMATLAGALA
280 A disintegrin and metalloproteinase…1 MQRAVPEGFGRRKLGSDMGNAE
RAPGSRSFGPVPTLLLLAAALLAVSDA
281 Leucine-rich alpha-2-glycoprotein MSSWSRQRPKSPGGIQPHVSRTLFLLLLLAASAWG
282 Bone morphogenetic protein 2 MVAGTRCLLALLLPQVLLGGAAG
283 Bone morphogenetic protein 7 MHVRSLRAAAPHSFVALWAPLFLLRSALA
284 Complement C1q tumor necrosis
factor-relatedprotein8
MAAPALLLLALLLPVGA
285 Carboxypeptidase E MAGRGGSALLALCGALAACGWLLGA
286 Cholesteryl ester transfer protein MLAATVLTLALLGNAHA
287 Complement factor I MKLLHVFLLFLCFHLRFC
288 Collagen alpha-3(VI) chain MRKHRHLPLVAVFCLFLSGFPTTHA
289 Cysteine-rich motor neuron 1 protein MYLVAGDRGLAGCGHLLVSLLGLLLLLARSGTRA
290 UPF0672 protein CXorf36 MEPQLGPEAAALRPGWLALLLWVSALSCSFS
291 Cystatin-D MMWPMHTPLLLLTALMVAVA
292 Beta-defensin 109 MRLHLLLLILLLFSILLSPVRG
293 Dickkopf-related protein 2 MAALMRSKDSSCCLLLLAAVLMVESSQIGSSRA
294 EMILIN-1 MAPRTLWSCYLCCLLTAAAGA
295 Fibulin-2 MVLLWEPAGAWLALGLALALGPSVAAA
296 FRAS1-related extracellular matrix protein 3 MAGASRHPTGTPRQLLVALACLLLSRPALQ
297 Gelsolin MAPHRPAPALLCALSLALCALSLPVRA
298 Beta-galactosidase-1-like protein MAPKKLSCLRSLLLPLSLTLLLPQADT
299 Plasma protease C1 inhibitor MASRLTLLTLLLLLLAGDRASS
300 Interleukin-10 MHSSALLCCLVLLTGVRA
301 Interleukin-12 subunit alpha MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA
302 Interleukin-31 MASHSGPSTSVLFLFCCLGGWLA
303 Interleukin-1 receptor-like 1 MGFWILAILTILMYSTAA
304 Early placenta insulin-like peptide MASLFRSYLPAIWLLLSQLLRESLA
305 Kallikrein-14 MSLRVLGSGTWPSAPKMF
306 Extracellular glycoprotein lacritin MKFTTLLFLAAVAGALVYA
307 Left-right determination factor 1 MQPLWLCWALWVLPLASPGAA
308 Lysyl oxidase homolog 3 MRPVSVWQWSPWGLLLCLLCSSCLG
309 1-O-acylceramide synthase MGLHLRPYRVGLLPDGLLFLLLLLMLLADPALP
310 Matrilin-4 MRGLLCWPVLLLLLQPWE
311 Matrix metalloproteinase-26 MQLVILRVTIFLPWCFA
312 Neutrophil collagenase MFSLKTLPFLLLLHVQISKA
313 Netrin-2-like protein MPGWPWGLLLTAGTLFAALSPGPPAPA
314 Neuropeptide S MISSVKLNLILVLSLSTMHVFWC
315 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5 MGWGSRCCCPGRLDLLCVLALLGGCLLPVCRT
316 Parathyroid hormone-related protein MQRRLVQQWSVAVFLLSYAVPSCG
317 Peroxidasin-like protein MEPRLFCWTTLFLLAGWCLPGLP
318 Sulfhydryl oxidase 2 MAAAGAAVARSPGIGAGPALR
319 Proactivator polypeptide MYALFLLASLLGAALA
320 Pulmonary surfactant-associated protein A1 MWLCPLALNLILMAASGAVC
321 Tectonic-1 MRPRGLPPLLVVLLGCWASVSA
322 Protein TMEM155 MASDLIRTILAVALISKLGTAVDA
323 Twisted gastrulation protein homolog 1 MKLHYVAVLTLAILMFLTWLPESLS
324 Urokinase plasminogen activator surface receptor MGHPPLLPLLLLLHTCVPASWG
325 VIP peptides MDTRNKAQLLVLLTLLSVLF
326 Von Willebrand factor D and EGF
domain-containingprotein
MPGGACVLVIALMFLAWGEA
327 WAP four-disulfide core domain protein 6 MGLSGLLPILVPFILLGDIQEPGHA
328 Protein Wnt-8a MGNLFMLWAALGICCAAFS
329 Putative uncharacterized protein FLJ46089 MRCVTRTRNWWRRAARMPRAGSSAWWVAVCKQVCT
330 HLA class I histocompatibility antigen,
Cw-16alphachain
MRVMAPRTLILLLSGALALTETWA
331 Acrosin-binding protein MRKPAAGFLPSLLKVLLLPLAPAAA
332 Angiopoietin-related protein 1 MKTFTWTLGVLFFLLVDTGHCRG
333 Apolipoprotein L1 MEGAALLRVSVLCIWMSALFLGVGVRA
334 Brain-specific serine protease 4 MVVSGAPPALGGGCLGTFTSLLLLASTAILNA
335 Cocaine- and amphetamine-regulated transcript protein MESSRVRLLPLLGAALLLMLPLLGTRA
336 C-C motif chemokine 14 MKISVAAIPFFLLITIALG
337 C-C motif chemokine 4 MKLCVTVLSLLMLVAAFCSPALS
338 Complement component C6 MARRSVLYFILLNALINKGQA
339 Cytokine-like protein 1 MRTPGPLPVLLLLLAGAPAARP
340 Dickkopf-like protein 1 MGEASPPAPARRHLLVLLLLLSTLVIPSAA
341 Deoxyribonuclease gamma MSRELAPLLLLLLSIHSALA
342 Dentin sialophosphoprotein MKIITYFCIWAVAWA
343 EGF-like domain-containing protein 7 MRGSQEVLLMWLLVLAVGGTEHA
344 Endonuclease domain-containing 1 protein MGTARWLALGSLFALAGLLEG
345 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase
familymember2
MARRSSFQSCQIISLFTFAVGVNICLG
346 Abhydrolase domain-containing protein FAM108B1 MNNLSFSELCCLFCCPPCPG
347 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 MLPCASCLPGSLLLWALLLLLLGSA
348 Complement factor H-related protein 5 MLLLFSVILISWVSTVGG
349 Glypican-4 MARFGLPALLCTLAVLSA
350 Ig heavy chain V-I region V35 MDWTWRILFLVAAATGAHS
351 Interferon alpha-7 MARSFSLLMVVLVLSYKSICSLG
352 Plasma kallikrein-like protein 4 MVSAAGLSGDGKMRGVLLVLLGLLYSSTSC
353 Laminin subunit beta-2 MELTSRERGRGQPLPWELRLGLLLSVLAATLA
354 Laminin subunit gamma-3 MAAAALLLGLALLAPRAAG
355 Lipase member I MRVYIFLCLMCWVRS
356 Lactadherin MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVA
357 Mannose receptor-like protein 1 MLHPETSPGRGHLLAVLLALLGTTWA
358 Mucin-4 MKGARWRRVPWVSLSCLCLCLLPHVVPG
359 NKG2D ligand 2 MAAAAATKILLCLPLLLLLSGWSRA
360 Noelin-3 MSPPLLKLGAVLSTMAMISNWMS
361 Epididymal secretory protein E1 MRFLAATFLLLALSTAAQA
362 Otogelin MGVLASALCWLLCVWLPWGEQA
363 PATE-like protein B MRKMNTLLLVSLSFLYLKE
364 Perforin-1 MAARLLLLGILLLLLPLPVPA
365 Peptidoglycan recognition protein I-alpha MGTLPWLLAFFILGLQA
366 Prostatic acid phosphatase MRAAPLLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSVLA
367 Basic salivary proline-rich protein 4 MLLILLSVALLALSSA
368 Prolactin receptor MKENVASATVFTLLLFLNTCLLNG
369 Serum amyloid A-4 protein MRLFTGIVFCSLVMGVTS
370 Stromal cell-derived factor 2 MAVVPLLLLGGLWSAVGA
371 Serpin E3 MPPFLITLFLFHSCCLRANG
372 Tenascin-N MSLQEMFRFPMGLLLGSVLLVASAPATL
373 Thioredoxin domain-containing protein 16 MFSGFNVFRVGISFVIMCIFYMPTVNS
374 Vascular endothelial growth factor receptor 2 MQSKVLLAVALWLCVETRA
375 von Willebrand factor A domain-containing protein 5B1 MPGLLNWITGAALPLTAS
376 WAP four-disulfide core domain protein 1 MPLTGVGPGSCRRQIIRALCLLLLLLHAGSA
377 Putative uncharacterized protein
UNQ5830/PRO19650/PRO19816
MAILMLSLQLILLLIPSIS
378 Putative uncharacterized protein ENSP00000380674 MRPLLCALAGLALLCAVGALA
379 Putative uncharacterized protein LOC116349 MPAVFMLASSSALQCGRG
380 Anterior gradient protein 2 homolog MEKIPVSAFLLLVALSYTLA
381 Insulin-like growth factor-binding protein
complexacidlabilechain
MALRKGGLALALLLLSWVALGPRSLEG
382 Apolipoprotein C-III MQPRVLLVVALLALLASARA
383 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs16
MKPRARGWRGLAALWMLLAQVAEQ
384 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs8
MLPAPAAPRWPPLLLLLLLLLPLARGA
385 Bone morphogenetic protein 1 MPGVARLPLLLGLLLLPRPGRP
386 Bactericidal/permeability-increasing protein-like 1 MAWASRLGLLLALLLPVVGA
387 Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M160 MMLPQNSWHIDFGRCCCHQNLFSAVVTCILLLNSCFLISS
388 Cathepsin D MQPSSLLPLALCLLAAPA
389 Putative cat eye syndrome critical region protein 9 MQSHLAPLACAAAAGRAGGSCQA
390 UPF0670 protein C8orf55 MLGLLVALLALGLAVFA
391 C-C motif chemokine 3-like 1 MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS
392 Collagen alpha-2(VIII) chain MLGTLTPLSSLLLLLLVLVLGCGPRASS
393 Uncharacterized protein C18orf20 MINLHRLCIIHVVATLLSTLLSLISVAIS
394 C-X-C motif chemokine 14 MSLLPRRAPPVSMRLLAAALLL
395 Beta-defensin 106 MRTFLFLFAVLFFLTPAKNA
396 Coagulation factor X MGRPLHLVLLSASLAGLLLLGESLFIRREQA
397 INT-2 proto-oncogene protein MGLIWLLLLSLLEPGWP
398 Leucine-rich repeat transmembrane protein FLRT2 MGLQTTKWPSHGAFFLKSWLIISLGLYSQVSKLLA
399 Interleukin-18-binding protein MTMRHNWTPDLSPLWVLLLCAHVVTLLV
400 Insulin-like growth factor-binding protein 7 MERPSLRALLLGAAGLLLLLLPLSSS
401 Serine protease inhibitor Kazal-type 7 MKITGGLLLLCTVVYFCSS
402 Isthmin MVRLAAELLLLLGLLLLTLHITVLRGSGA
403 Laminin subunit beta-4 MQFQLTLFLHLGWLSYSKA
404 Endothelial lipase MSNSVPLLCFWSLCYCFAAG
405 Secretoglobin-like protein LOC284402 MRVTSATCALLLALICSVQLGDA
406 Lymphocyte antigen 86 MKGFTATLFLWTLIFPSCSG
407 Netrin-1-like protein MPVTFALLLLLGQATA
408 NHL repeat-containing protein 3 MARFWVCVAGAGFFLAFLVLHSRFC
409 Protocadherin-15 MFRQFYLWTCLASGIILGSLFEICLG
410 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 MGPLSAPPCTQHITWKGLLLTASLLNFWNLPITA
411 Putative peptide YY-2 MATVLLALLVYLGALVDA
412 Ribonuclease K6 MVLCFPLLLLLLVLWGPVCPLHA
413 Ribonuclease-like protein 12 MIIMVIIFLVLLFWENEVND
414 Signal peptide, CUB and EGF-like
domain-containingprotein2
MGVAGRNRPGAAWAVLLLLLLLPPLLLLAGA
415 Serpin A9 MASYLYGVLFAVGLCAPIYCVSP
416 Kunitz-type protease inhibitor 4 MKSAKLGFLLRFFIFCSLNTLLLG
417 Stanniocalcin-2 MCAERLGQFMTLALVLATFDPARG
418 Thrombospondin type-1 domain-containing protein 4 MVSHFMGSLSVLCFLLLLGFQFVCP
419 Uromodulin MGQPSLTWMLMVVVASWFITTAAT
420 Protein Wnt-4 MSPRSCLRSLRLLVFAVFSAAA
421 Protein Wnt-7b MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVA
422 Peptidase S1 domain-containing protein LOC136242 MKYVFYLGVLAGTFFFADS
423 Complement C1q subcomponent subunit C MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQA
424 Uncharacterized protein C2orf66 MIIDSSRIPSFTQLHSTMTRAPLLLLCVALVLLGHVNG
425 Cerebellin-4 MGSGRRALSAVPAVLLVLTLPGLPVWA
426 Coiled-coil domain-containing protein 3 MLRQLLLAALCLAGPPAPARA
427 Eotaxin MKVSAALLWLLLIAAAFSPQGLA
428 C-C motif chemokine 23 MKVSVAALSCLMLVTALGSQA
429 C-C motif chemokine 3 MQVSTAALAVLLCTMALCNQFSA
430 Colipase-like protein C6orf127 MMLPQWLLLLFLLFFFLFLLTRG
431 Retinoic acid early transcript 1G protein MAAAASPAFLLRLPLLLLLSSWCRT
432 C-type lectin domain family 11 member A MQAAWLLGALVVPQLLGFGHG
433 Collagen alpha-4(IV) chain MWSLHIVLMRCSFRLTKSLATGPWSLILILFSVQYVYG
434 C3 and PZP-like alpha-2-macroglobulin
domain-containingprotein8
MSGALLWPLLPLLLLLLSARDGVRA
435 Cysteine-rich secretory protein 2 MALLPVLFLVTVLLPSLPAEG
436 Chymotrypsinogen B MASLWLLSCFSLVGAAFG
437 Cystatin-SA MAWPLCTLLLLLATQAVALA
438 Coagulation factor VII MVSQALRLLCLLLGLQGCLA
439 Fibroblast growth factor-binding protein 1 MKICSLTLLSFLLLAAQVLLVEG
440 Growth/differentiation factor 5 MRLPKLLTFLLWYLAWLDLEFICTVLG
441 Glypican-2 MSALRPLLLLLLPLCPGPGPGPG
442 Hemicentin-1 MISWEVVHTVFLFALLYSSLA
443 Hyaluronan and proteoglycan link protein 4 MVCARAALGPGALWAAAWGVLLLTAPAGA
444 Interferon beta MTNKCLLQIALLLCFSTTALS
445 Gastric intrinsic factor MAWFALYLLSLLWATAGT
446 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 MRPGTGQGGLEAPGEPGPNLRQRWPLLLLGLAVVTHG
447 Interleukin-21 MERIVICLMVIFLGTLVHKSSS
448 Interleukin-29 MAAAWTVVLVTLVLGLAVA
449 Interleukin-4 receptor alpha chain MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGN
450 Kin of IRRE-like protein 3 MKPFQLDLLFVCFFLFSQELG
451 Kallikrein-13 MWPLALVIASLTLALS
452 Kallikrein-9 MKLGLLCALLSLLAG
453 Leukemia inhibitory factor MKVLAAGVVPLLLVLHWKHGAG
454 Long palate, lung and nasal epithelium
carcinoma-associatedprotein4
MWMAWCVAALSVVAVCGT
455 Stromelysin-3 MAPAAWLRSAAARALLPPMLLLLLQPPPLLA
456 Matrix metalloproteinase-19 MNCQQLWLGFLLPMTVSG
457 Endomucin MELLQVTILFLLPSICSS
458 Nucleobindin-2 MRWRTILLQYCFLLITCLLTALEA
459 Polymeric immunoglobulin receptor MLLFVLTCLLAVFPAIST
460 Serine protease 27 MRRPAAVPLLLLLCFGSQRAKA
461 Stromal cell-derived factor 1 MNAKVVVVLVLVLTALCLSDG
462 Signal-regulatory protein delta MPIPASPLHPPLPSLLLYLLLELAGVTHV
463 Slit homolog 1 protein MALTPGWGSSAGPVRPELWLLLWAAAWRLGASA
464 Sortilin-related receptor MATRSSRRESRLPFLFTLVALLPPGALC
465 Short palate, lung and nasal epithelium
carcinoma-associatedprotein3
MMCPLWRLLIFLGLLALPLAP
466 Tryptase beta-2 MLNLLLLALPVLASRAYA
467 Protein Wnt-11 MRARPQVCEALLFALALQTGVCYG
468 Fractalkine MAPISLSWLLRLATFCHLTVLLAG
469 Ig-like domain-containing protein ENSP00000270642 MPPPAPGARLRLLAAAALAGLAVISRGLLS
470 Apolipoprotein M MFHQIWAALLYFYGIILNSIYQ
471 Artemin MELGLGGLSTLSHCPWPRQQPALWPTLAALALLSSVAEA
472 Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a MALVRALVCCLLTAWHCRSGLG
473 Complement C1q
tumornecrosisfactor-relatedprotein1
MGSRGQGLLLAYCLLLAFASGLVLS
474 C-C motif chemokine 28 MQQRGLAIVALAVCAALHA
475 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain MALPVTALLLPLALLLHAARP
476 Cat eye syndrome critical region protein 1 MLVDGPSERPALCFLLLAVAMSFFGSALS
477 Collagen alpha-1(II) chain MIRLGAPQTLVLLTLLVAAVLRCQG
478 Collagen alpha-3(IX) chain MAGPRACAPLLLLLLLGELLAAAGA
479 Collagen alpha-1(XX) chain MSSGDPAHLGLCLWLWLGATLG
480 Peptidase inhibitor R3HDML MPLLPSTVGLAGLLFWAGQAVNAL
481 Crumbs homolog 1 MALKNINYLLIFYLSFSLLIYIKNS
482 Beta-defensin 116 MSVMKPCLMTIAILMILAQKTPG
483 Beta-defensin 125 MNILMLTFIICGLLTRVTKG
484 Protein FAM55D MKISMINYKSLLALLFILASWIIFTVF
485 Fibronectin type III domain-containing protein 7 MAGGRETCLPLIGFILICLKMVASAK
486 Insulin growth factor-like family member 4 MVPRISAAIFIFELLGSNS
487 Immunoglobulin superfamily member 21 MRTAPSLRRCVCLLLAAILDLARG
488 Interleukin-17A MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKA
489 Inhibin beta B chain MDGLPGRALGAACLLLLAAGWLGPEAWG
490 Intelectin-2 MLSMLRTMTRLCFLLFFSVATSGCSA
491 Leucine-rich repeat and calponin homology
domain-containingprotein3
MAAAGLVAVAAAAEYSGTVASG
492 Neurotrypsin MTLARFVLALMLGALPEVVG
493 Neurturin MQRWKAAALASVLCSSVLS
494 Protease-associated domain-containing
proteinof21kDa
MVPGAAGWCCLVLWLPACVAA
495 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA
496 Pigment epithelium-derived factor MQALVLLLCIGALLGHSSC
497 Peptidase inhibitor 15 MIAISAVSSALLFSLLCEA
498 Plasminogen-related protein A MEHKEVVLLLLLFLKSGQG
499 Podocan MAQSRVLLLLLLLPPQLHL
500 Putative testis-specific prion protein MQHSLVFFFAVILHLSHL
501 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 MLLILLSVALLAFSSA
502 PC3-secreted microprotein MALRMLWAGQAKGILGGWGIICLVMSLLLQHPGVY
503 Secretogranin-2 MAEAKTHWLGAALSLIPLIFLISGAEA
504 Secreted and transmembrane protein 1 MQTCPLAFPGHVSQALGTLLFLAASLSA
505 Semaphorin-3D MNANKDERLKARSQDFHLFPALMMLSMTMLFLPVTG
506 Secretoglobin family 3A member 2 MKLVTIFLLVTISLCSYSATA
507 Sialate O-acetylesterase MVAPGLVLGLVLPLILWADRSAG
508 Sialic acid-binding Ig-like lectin 6 MQGAQEASASEMLPLLLPLLWAGALA
509 SPARC MRAWIFFLLCLAGRALA
510 Hepatocellular carcinoma-associated protein TD26 MPVPALCLLWALAMVTRPASA
511 Trypsin-X3 MKFILLWALLNLTVALA
512 Urocortin-2 MTRCALLLLMVLMLGRVLV
513 Proto-oncogene protein Wnt-3 MEPHLLGLLLGLLLGGTRVLA
514 Uncharacterized protein FLJ37543 MLAPLFLCCLRNLFRKLIS
515 Putative uncharacterized protein ENSP00000381830 MSFEYRHYKREAKICTCRGGWAHVLLCIGVSQGAC
516 Alpha-2-antiplasmin MALLWGLLVLSWSCLQGPCSVFSPVSA
517 Angiotensin-converting enzyme MGAASGRRGPGLLLPLPLLLLLPPQPALA
518 Angiopoietin-1 MTVFLSFAFLAAILT
519 Apolipoprotein C-IV MSLLRNRLQALPALCLCVLVLACIGA
520 Brain-derived neurotrophic factor MTILFLTMVISYFGCMKA
521 Uncharacterized protein C1orf54 MDVLFVAIFAVPLILG
522 Cerebellin-3 MLGAKPHWLPGPLHSPGLPLVLVLLALGAGWA
523 Carboxypeptidase B2 MKLCSLAVLVPIVLFCEQHVFA
524 C-C motif chemokine 22 MDRLQTALLVVLVLLAVALQATEA
525 Colipase-like protein C6orf126 MAAALALVAGVLSGAVLPLWS
526 Uncharacterized protein C7orf34 MPPLAPQLCRAVFLVPILLLLQVKPLNG
527 Protein canopy homolog 4 MGPVRLGILLFLFLAVHEAWA
528 Collagen alpha-2(VI) chain MLQGTCSVLLLWGILGAIQA
529 Tenascin-X MMPAQYALTSSLVLLVLLSTARA
530 Endothelin-3 MEPGLWLLFGLTVTSA
531 Endothelial cell-specific molecule 1 MKSVLLLTTLLVPAHLVAA
532 Protein eyes shut homolog MTDKSIVILSLMVFHSSFING
533 Coagulation factor XI MIFLYQVVHFILFTSVSG
534 Immunoglobulin alpha Fc receptor MDPKQTTLLCLVLCLGQRIQA
535 Low affinity immunoglobulin gamma
FcregionreceptorIII-B
MWQLLLPTALLLLVSA
536 Granzyme A MRNSYRFLASSLSVVVSLLLIPEDVC
537 Hyaluronan and proteoglycan link protein 3 MGLLLLVPLLLLPGSYG
538 Interleukin-28B MTGDCMPVLVLMAAVLTVTGAVPVA
539 Pancreatic secretory trypsin inhibitor MKVTGIFLLSALALLSLSGNTGA
540 Kallistatin MHLIDYLLLLLVGLLALSHG
541 Kallikrein-12 MGLSIFLLLCVLGLSQA
542 Keratinocyte differentiation-associated protein MKIPVLPAVVLLSLLVLHSAQG
543 Putative lipocalin 1-like protein 1 MKPLLLAISLSLIAALQA
544 Lysozyme C MKALIVLGLVLLSVTVQG
545 MAM domain-containing protein 2 MLLRGVLLALQALQLAGA
546 Matrilysin MRLTVLCAVCLLPGSLA
547 Oxytocin-neurophysin 1 MAGPSLACCLLGLLALTSA
548 NPIP-like protein LOC440350 MRLRFWLLIWLLLGFISH
549 Phospholipase A2, membrane associated MKTLLLLAVIMIFGLLQAHG
550 Group XIIB secretory phospholipase A2-like protein MKLASGFLVLWLSLGGGLA
551 Basement membrane-specific
heparansulfateproteoglycancoreprotein
MGWRAAGALLLALLLHGRLLA
552 Plasma glutamate carboxypeptidase MKFLIFAFFGGVHLLSLCSG
553 Melanocyte protein Pmel 17 MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGAT
554 Vitamin K-dependent protein Z MAGCVPLLQGLVLVLALHRVEPS
555 Sulfhydryl oxidase 1 MRRCNSGSGPPPSLLLLLLWLLAVPGANA
556 Regenerating islet-derived protein 3 gamma MLPPMALPSVSWMLLSCLILLCQVQG
557 Secretoglobin family 1C member 1 MKGSRALLLVALTLFCICRMATG
558 Sex hormone-binding globulin MESRGPLATSRLLLLLLLLLLRHTRQGWA
559 Tomoregulin-2 MVLWESPRQCSSWTLCEGFCWLLLLPVMLLIVARPVKLAA
560 Trefoil factor 2 MGRRDAQLLAALLVLGLCALAGS
561 Tachykinin-4 MLPCLALLLLMELSVCTVA
562 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A MGLSTVPDLLLPLVLLELLVG
563 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHP
564 Usherin MNCPVLSLGSGFLFQVIEMLIFAYFASISLT
565 Urotensin-2 MYKLASCCLLFIGFLNPLLS
566 V-set and transmembrane domain-containing protein 2A MMGIFLVYVGFVFFSVLYVQQGL
567 Protein Wnt-6 MLPPLPSRLGLLLLLLLCPAHVGG
568 Putative uncharacterized protein FP248 MGTGGSLLCGCSLVLSCLCPSAS
569 Putative serine protease LOC138652 MGYCQGVSQVAVVLLMFPKEKEA
570 Zona pellucida sperm-binding protein 3 MELSYRLFICLLLWGSTELCYP
571 Signal peptide, CUB and EGF-like
domain-containingprotein3
MGSGRVPGLCLLVLLVHARA
572 C-type natriuretic peptide MHLSQLLACALLLTLLSLRPSEA
573 Antithrombin-III MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTC
574 Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3b MRLLAWLIFLANWGGARA
575 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs13
MHQRHPRARCPPLCVAGILACGFLLGCWG
576 B melanoma antigen 1 MAARAVFLALSAQLLQA
577 Complement C1q subcomponent subunit A MEGPRGWLVLCVLAISLASMVT
578 Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 2 MIPWVLLACALPCAA
579 Uncharacterized protein C1orf187 MAGPAIHTAPMLFLVLLLPLELSLA
580 Carbonic anhydrase-related protein 11 MGAAARLSAPRALVLWAALGAAA
581 C-C motif chemokine 19 MALLLALSLLVLWTSPAPTLS
582 Monocyte differentiation antigen CD14 MERASCLLLLLLPLVHVSA
583 CUB domain-containing protein 1 MAGLNCGVSIALLGVLLLGAARLPRGAEA
584 UPF0669 protein C6orf120 MAAPRGRAAPWTTALLLLLASQVLSPGSCA
585 Chitinase-3-like protein 1 MGVKASQTGFVVLVLLQCCSA
586 Uncharacterized protein C18orf54 MAKSKTKHRLCSQESSVSALLASCTLSGSNS
587 Cystatin-8 MPRCRWLSLILLTIPLALVAR
588 Secreted frizzled-related protein 3 MVCGSPGGMLLLRAGLLALAALCLLRVPGARA
589 Beta-defensin 118 MKLLLLALPMLVLLPQVIP
590 Beta-defensin 133 MKIHVFLFVLFFFLVPIATRVKC
591 Beta-defensin 1 MRTSYLLLFTLCLLLSEMASG
592 Dermokine MKFQGPLACLLLALCLGSGEA
593 Protein FAM24A MAKMFDLRTKIMIGIGSSLLVAAMVLLSVVFC
594 Fibrinogen-like protein 1 MAKVFSFILVTTALTMGREISA
595 Folate receptor gamma MAWQMMQLLLLALVTAAGSAQPR
596 Growth/differentiation factor 11 MVLAAPLLLGFLLLALELRPRGEA
597 Granzyme K MTKFSSFSLFFLIVGAYMTHVCFN
598 Major histocompatibility
complexclassI-relatedgeneprotein
MGELMAFLLPLIIVLMVKHSDS
599 Immunoglobulin superfamily member 1 MTLDRPGEGATMLKTFT
600 Interleukin-1 receptor antagonist protein MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC
601 Serine protease inhibitor Kazal-type 5 MKIATVSVLLPLALCLIQDAAS
602 Immunoglobulin superfamily containing
leucine-richrepeatprotein
MQELHLLWWALLLGLAQA
603 Putative killer cell immunoglobulin-like
receptorlikeproteinKIR3DP1
MSLMVISMACVGFFLLQGAWT
604 Laminin subunit alpha-4 MALSSAWRSVLPLWLLWSAACSRA
605 Leucine zipper protein 2 MKFSPAHYLLPLLPALVLS
606 Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein 1 MRHGVAWALLVAAALGLGARGVRG
607 Protein-lysine 6-oxidase MRFAWTVLLLGPLQLCALVHC
608 Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 MMLRVLVGAVLPAML
609 Neurotensin/neuromedin N MMAGMKIQLVCMLLLAFSSWSLC
610 Group 3 secretory phospholipase A2 MGVQAGLFGMLGFLGVALG
611 Placenta growth factor MPVMRLFPCFLQLLAGLA
612 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 11 MGPLSAPPCTEHIKWKGLLLTALLLNFWNLPTTA
613 Ribonuclease T2 MRPAALRGALLGCLCLALLCLGGA
614 R-spondin-1 MRLGLCVVALVLSWTHLTIS
615 Semaphorin-3E MASAGHIITLLLWGYLLELWTGGHT
616 Kunitz-type protease inhibitor 1 MAPARTMARARLAPAGIPAVALWLLCTLGLQGTQA
617 Transmembrane protein 25 MALPPGPAALRHTLLLLPALLSSGWG
618 WAP four-disulfide core domain protein 10A MAPQTLLPVLVLCVLLLQAQG
619 WAP four-disulfide core domain protein 3 MMLSCLFLLKALLALGSLESWITA
620 Protein Wnt-10a MGSAHPRPWLRLRPQPQPRPALWVLLFFLLLLAAA
621 Abhydrolase domain-containing protein 9 MPELVVTALLAPSRLSLKLLRAFMWSLVFSVALVA
622 ADAM 12 MAARPLPVSPARALLLALAGALLAPCEA
623 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs2
MDPPAGAARRLLCPALLLLLLLLPPPLLP
624 Bone morphogenetic protein 3b MAHVPARTSPGPGPQLLLLLLPLFLLLLRDVAG
625 Complement C1q-like protein 4 MVLLLLVAIPLLVHS
626 Complement C1r subcomponent-like protein MPGPRVWGKYLWRSPHSKGCPGAMWWLLLWGVLQA
627 Uncharacterized protein C1orf56 MVPAAGALLWVLLLNLGPRAAGA
628 Cathelicidin antimicrobial peptide MKTQRDGHSLGRWSLVLLLLGLVMPLAIIA
629 Carboxypeptidase A2 MAMRLILFFGALFGHI
630 C-C motif chemokine 4-like MKLCVTVLSLLVLVAAFCSLALS
631 C-C motif chemokine 13 MKVSAVLLCLLLMTAA
632 Neural cell adhesion molecule L1-like protein MEPLLLGRGLIVYLMFLLLKFSKA
633 Complement C4-B MRLLWGLIWASSFFTLSLQ
634 Collagen alpha-1(IX) chain MKTCWKIPVFFFVCSFLEPWASA
635 Cartilage oligomeric matrix protein MVPDTACVLLLTLAALGASG
636 Cysteine-rich secretory protein LCCL domain-containing 1 MKCTAREWLRVTTVLFMARAIPA
637 UPF0556 protein C19orf10 MAAPSGGWNGVGASLWAALLLGAVALRPAEA
638 Uncharacterized protein C19orf36 MALLLCLVCLTAALA
639 Granulocyte-macrophage colony-stimulating
factorreceptorsubunitalpha
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
640 Beta-defensin 103 MRIHYLLFALLFLFLVPVPGHG
641 Beta-defensin 123 MKLLLLTLTVLLLLSQLTPG
642 Beta-defensin 130 MKLHSLISVLLLFVTLIPKGKT
643 Beta-defensin 2 MRVLYLLFSFLFIFLMPLPGVFG
644 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5 MATSWGTVFFMLVVSCVCSA
645 Protein FAM55A MSSNTMLQKTLLILISFSVVT
646 Protein FAM3B MRPLAGGLLKVVFVVFASLCAWYSGYLLA
647 Complement factor H-related protein 4 MLLLINVILTLWVSCANGQ
648 Glucose-fructose oxidoreductase
domain-containingprotein1
MLPGVGVFGTSLTARVIIPLL
649 Hemopexin MARVLGAPVALGLWSLCWSLAIA
650 Ig heavy chain V-I region HG3 MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
651 Insulin-like growth factor-binding protein 4 MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG
652 Interleukin-17B MDWPHNLLFLLTISIFLGLG
653 Interleukin-1 receptor type I MKVLLRLICFIALLISS
654 Interleukin-5 MRMLLHLSLLALGAAYVYA
655 Inhibin beta A chain MPLLWLRGFLLASCWIIVRS
656 Epididymal-specific lipocalin-12 MRLLCGLWLWLSLLKVLQA
657 Ly-6/neurotoxin-like protein 1 MTPLLTLILVVLMGLPLAQA
658 72 kDa type IV collagenase MEALMARGALTGPLRALCLLGCLLSHAAA
659 Serine protease MPN2 MAAPASVMGPLGPSALGLLLLLLVVAPPRVAA
660 Neuronal pentraxin-like protein C16orf38 MGCSWRKTLSFFLVFVPIYLHGASS
661 Neurexophilin-1 MQAACWYVLFLLQPTVYLVTC
662 Group IIE secretory phospholipase A2 MKSPHVLVFLCLLVALVTG
663 Platelet-derived growth factor D MHRLIFVYTLICANFCSC
664 Platelet factor 4 MSSAAGFCASRPGLLFLGLLLLPLVVAFASA
665 Periostin MIPFLPMFSLLLLLIVNPINA
666 Basic salivary proline-rich protein 3 MLLILLSVALLALSSA
667 Prostasin MAQKGVLGPGQLGAVAILLYLGLLRSGTG
668 Poliovirus receptor MARAMAAAWPLLLVALLVLS
669 Retinol-binding protein 3 MMREWVLLMSVLLCGLA
670 WAP, kazal, immunoglobulin, kunitz and
NTRdomain-containingprotein1
MPALRPLLPLLLLLRLTSG
671 Protein Wnt-5a MKKSIGILSPGVALGMAGSAMSSKFFLVALAIFFS
672 Uncharacterized lipocalin UNQ2541/PRO6093 MMSFLLGAILTLLWAPTAQA
673 Zona pellucida sperm-binding protein 4 MWLLRCVLLCVSLSLAVS
674 Alpha-amylase 1 MKLFWLLFTIGFCWA
675 Complement C1q-like protein 2 MALGLLIAVPLLLQAAPRGAA
676 Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 9 MRIWWLLLAIEICTGNINS
677 C-C motif chemokine 24 MAGLMTIVTSLLFLGVCAHHIIPTGS
678 Uncharacterized protein C4orf26 MARRHCFSYWLLVCWLVVTVAEG
679 CD166 antigen MESKGASSCRLLFCLLISATVFRPGLG
680 Uncharacterized protein C14orf93 MSFSATILFSPPSGSEA
681 Collagen alpha-5(VI) chain MKILLIIFVLIIWTETLA
682 Complement component C8 gamma chain MLPPGTATLLTLLLAAGSLG
683 Collagen alpha-1(X) chain MLPQIPFLLLVSLNLVHG
684 Putative uncharacterized protein C17orf69 MHPWLGSALGFPKCRG
685 Cysteine-rich motor neuron 2 protein MAGVGAAALSLLLHLGALALAAGAEG
686 Cysteine-rich secretory protein 3 MTLFPVLLFLVAGLLPSFPA
687 Macrophage colony-stimulating factor 1 MTAPGAAGRCPPTTWLGSLLLLVCLLASRSIT
688 Beta-defensin 108B MRIAVLLFAIFFFMSQVLPARG
689 Complement decay-accelerating factor MTVARPSVPAALPLLGELPRLLLLVLLCLPAVWG
690 Estradiol 17-beta-dehydrogenase 11 MKFLLDILLLLPLLIVCSL
691 EMILIN-2 MWQPRRPWPRVPWRWALALLALVGAGLCHA
692 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 MLKALFLTMLTLALVKS
693 Fibroblast growth factor 5 MSLSFLLLLFFSHLILS
694 Fibroblast growth factor receptor 4 MRLLLALLGVLLSVPGPPVLS
695 Glia-derived nexin MNWHLPLFLLASVTLPSIC
696 Gamma-glutamyl hydrolase MASPGCLLCVLGLLLCGAASLELS
697 Glutathione peroxidase 3 MARLLQASCLLSLLLAGFVS
698 Histatin-1 MKFFVFALVLALMISMISA
699 Insulin-like growth factor II MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIA
700 Interleukin-19 MKLQCVSLWLLGTILILCSVDNHG
701 Interleukin-32 MCFPKVLSDDMKKLKARMVMLLPTSAQGLG
702 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H5-like protein MSGWRYLICVSFLLTILLELTYQ
703 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 MKPPRPVRTCSKVLVLLSLLAIHQTTTA
704 Uncharacterized protein KIAA0495 MCLLSSSAASDLAATSLTA
705 Plasma kallikrein MILFKQATYFISLFATVSC
706 Ig kappa chain V-I region HK101 MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC
707 Laminin subunit gamma-1 MRGSHRAAPALRPRGRLWPVLAVLAAAAAAGCA
708 Left-right determination factor 2 MWPLWLCWALWVLPLAGPGAA
709 Lipase member H MLRFYLFISLLCLSRSDA
710 Noelin MSVPLLKIGVVLSTMA
711 Protocadherin alpha-10 MVSRCSCLGVQCLLLSLLLLAAWEVGSG
712 Plexin-B1 MPALGPALLQALWAGWVLT
713 Prolactin MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP
714 Poliovirus receptor-related protein 4 MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPA
715 Secretoglobin family 1D member 4 MRLSVCLLMVSLALCCYQAHA
716 Slit homolog 2 protein MRGVGWQMLSLSLGLVLAILNKVAPQACPA
717 Trefoil factor 1 MATMENKVICALVLVSMLALGTLA
718 Scavenger receptor cysteine-rich
domain-containingproteinLOC284297
MRVLACLLAALVGIQA
719 Trefoil factor 3 MAARALCMLGLVLALLSSSSA
720 Metalloproteinase inhibitor 1 MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA
721 Vascular endothelial growth factor receptor 1 MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSG
722 WNT1-inducible-signaling pathway protein 1 MRWFLPWTLAAVTAAAASTVLA
723 Uncharacterized protein ENSP00000244321 MRLSRRPETFLLAFVLLCTLLGLGCP
724 Anthrax toxin receptor 2 MVAERSPARSPGSWLFPGLWLLVLSGPGGLLRA
725 Apolipoprotein C-I MRLFLSLPVLVVVLSIVLEGPAPAQG
726 Lymphotoxin-alpha MTPPERLFLPRVCGTTLHLLLLGLLLVLLPGAQG
727 ADAMTS-like protein 2 MDGRWQCSCWAWFLLVLAVVAG
728 ADAMTS-like protein 4 MENWTGRPWLYLLLLLSLPQLCLD
729 Complement C1q-like protein 3 MVLLLVILIPVLVSSAGTSA
730 Collagen alpha-6(IV) chain MLINKLWLLLVTLCLTEELAAA
731 Collagen alpha-6(VI) chain MMLLILFLVIICSHISVNQ
732 EGF-like domain-containing protein 6 MPLPWSLALPLLLSWVAGGFG
733 EMILIN-3 MGRRRLLVWLCAVAALLSGAQA
734 Ephrin type-A receptor 10 METCAGPHPLRLFLCRMQLCLALLLGPWRPGTA
735 Fibroblast growth factor-binding protein 3 MTPPKLRASLSPSLLLLLSGCLLAAA
736 Complement factor H-related protein 2 MWLLVSVILISRISSVGG
737 Fibrinogen beta chain MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLLLLCVFLVKS
738 Fibronectin type III domain-containing protein 1 MAPEAGATLRAPRRLSWAALLLLAALLPVASS
739 Growth/differentiation factor 6 MDTPRVLLSAVFLISFLWDLPG
740 Hyaluronidase-1 MAAHLLPICALFLTLLDMAQG
741 Interferon epsilon-1 MIIKHFFGTVLVLLASTTIFS
742 Interleukin-1 receptor accessory protein MTLLWCVVSLYFYGILQSDA
743 Ig kappa chain V-I region HK102 MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC
744 Ig kappa chain V-II region RPMI 6410 MRLPAQLLGLLMLWVPGSSG
745 Epididymal-specific lipocalin-10 MRQGLLVLALVLVLVLVLA
746 Leucine-rich repeat LGI family member 3 MAGLRARGGPGPGLLALSALGFCLMLQVSA
747 Lysozyme-like protein 6 MTKALLIYLVSSFLALNQA
748 Mucin-like protein 1 MKFLAVLVLLGVSIFLVSAQ
749 Group IID secretory phospholipase A2 MELALLCGLVVMAGVIPIQG
750 Procollagen C-endopeptidase enhancer 2 MRGANAWAPLCLLLAAATQLSRQ
751 Basic salivary proline-rich protein 1 MLLILLSVALLALSSA
752 Peroxidasin homolog MAKRSRGPGRRCLLALVLFCAWGTLA
753 Ribonuclease 8 MAPARAGCCPLLLLLLGLWVAEVLVRA
754 Semaphorin-3B MGRAGAAAVIPGLALLWAVGLGSA
755 Secreted Ly-6/uPAR-related protein 1 MASRWAVQLLLVAAWSMGCGE
756 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B MRALEGPGLSLLCLVLALPALLPVPAVRG
757 Triggering receptor expressed on myeloid cells 1 MRKTRLWGLLWMLFVSELRA
758 von Willebrand factor MIPARFAGVLLALALILPGTLC
759 Protein Wnt-16 MDRAALLGLARLCALWAALLVLFPYGAQG
760 Putative uncharacterized protein FLJ21075 MGFHFCIWIIFLLPPPCKKC
761 Arylsulfatase F MRPRRPLVFMSLVCALLNTCQA
762 ADAMTS-like protein 5 MGKLRPGRVEWLASGHTERPHLFQNLLLFLWA
763 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs17
MCDGALLPPLVLPVLLLLVWGLDPGTA
764 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs9
MQFVSWATLLTLLVRDLA
765 Bactericidal/permeability-increasing protein-like 2 MCTKTIPVLWGCFLLWNLYVSSS
766 Putative uncharacterized protein C1orf191 MWGFLVLKARWLVTPVRT
767 Carboxypeptidase B MLALLVLVTVALASA
768 Uncharacterized protein C10orf25 MVPGPPESVVRFFLWFCFLLPPTRKASC
769 UPF0454 protein C12orf49 MVNLAAMVWRRLLRKRWVLALVFGLSLVYFLSS
770 Putative uncharacterized protein C14orf144 MCRETAGYGWLLASTELLSLLEPLSP
771 Beta-Ala-His dipeptidase MDPKLGRMAASLLAVLLLLLERGMFS
772 Collagen alpha-2(IV) chain MGRDQRAVAGPALRRWLLLGTVTVG
773 Complement component C8 alpha chain MFAVVFFILSLMTCQPGVTA
774 Collagen alpha-2(XI) chain MERCSRCHRLLLLLPLVLGLSA
775 Complement component receptor 1-like protein MAPPVRLERPFPSRRFPGLLLAALVLLLSSFS
776 Platelet basic protein MSLRLDTTPSCNSARPLHALQVLLLLSLLLTALA
777 Follistatin-related protein 4 MKPGGFWLHLTLLGASLPAALG
778 Protein G7c MLPTEVPQSHPGPSALLLLQLLLPPTSA
779 Gastric inhibitory polypeptide MVATKTFALLLLSLFLAVGLG
780 Gastrokine-1 MLAYSSVHCFREDKMKFTIV
781 Glycosyltransferase 1 domain-containing protein 1 MRLLFLAVLRPHTGNA
782 Interleukin-20 MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTG
783 Interleukin-27 subunit beta MTPQLLLALVLWASCPPCSG
784 Kazal-type serine protease inhibitor
domain-containingprotein1
MLPPPRPAAALALPVLLLLLVVLTPPPTGA
785 Kallikrein-10 MRAPHLHLSAASGARALAKLLPLLMAQLWA
786 Kallikrein-7 MARSLLLPLQILLLSLALETAG
787 Ig kappa chain V region EV15 MGSQVHLLSFLLLWISDTRA
788 Long palate, lung and nasal epithelium
carcinoma-associatedprotein1
MAGPWTFTLLCGLLAATLIQA
789 Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 MGLPEPGPLRLLALLLLLLLLLLLQLQHLAAA
790 Cartilage matrix protein MRVLSGTSLMLCSLLLLLQALC
791 Melanoma-derived growth regulatory protein MARSLVCLGVIILLSAFSGPGVRG
792 Matrix metalloproteinase-16 MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILC
793 Multimerin-2 MILSLLFSLGGPLGWGLLGAWA
794 Protein NOV homolog MQSVQSTSFCLRKQCLCLTFLLLHLLGQVAA
795 Oocyte-secreted protein 1 homolog MKTILGFKGLFYLHSLIWTCAGDWSA
796 Secretory phospholipase A2 receptor MLLSPSLLLLLLLGAPRGCA
797 Proline-rich protein 1 MKLTFFLGLLALISCFTPSES
798 Putative pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 7 MGPLSAPPCTQHITWKGLLLTASLLNFWNPPTTA
799 Poliovirus receptor-related protein 1 MARMGLAGAAGRWWGLALGLTAFFLPGVHS
800 Glutaminyl-peptide cyclotransferase MAGGRHRRVVGTLHLLLLVAALPWASRG
801 Trypsin-1 MNPLLILTFVAAALA
802 Thyrotropin subunit beta MTALFLMSMLFGLTCGQAMS
803 Putative testis serine protease 2 MSSGGGSRGLLAWLLLLQPWPGQNWA
804 von Willebrand factor C domain-containing protein 2-like MALHIHEACILLLVIPGLVTS
805 EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 MKRSVAVWLLVGLSLG
806 ADAM 28 MLQGLLPVSLLLSVAVSA
807 B melanoma antigen 5 MAAGAVFLALSAQLLQA
808 Probetacellulin MDRAARCSGASSLPLLLALALGLVILHCVVA
809 Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 4 MLPLLLGLLGPAACWA
810 Carboxypeptidase N catalytic chain MSDLLSVFLHLLLLFKLVAP
811 Coiled-coil domain-containing protein 80 MTWRMGPRFTMLLAMWLVCGS
812 Protein CEI MVAPAARVFLRAVRAALTSTVPDLLCLLARGSPRG
813 Bile salt-activated lipase MGRLQLVVLGLTCCWAVASA
814 Putative cystatin-9-like 2 MWSLPPSRALSCAPLLLLFSFQFLVTYA
815 Protein CYR61 MSSRIARALALVVTLLHLTRLALS
816 Beta-defensin 135 MATRSVLLALVVLNLLFYVPPGRS
817 Epidermal growth factor receptor MRPSGTAGAALLALLAALCPASRA
818 Elastase-2A MIRTLLLSTLVAGALS
819 Inactive carboxylesterase 4 MWLPALVLATLAASAAWA
820 Fibrillin-2 MGRRRRLCLQLYFLWLGCVVLWAQGTAG
821 Fibroleukin MKLANWYWLSSAVLATYGFLVVA
822 Leucine-rich repeat transmembrane protein FLRT1 MDLRDWLFLCYGLIAFLTEV
823 Follistatin-related protein 3 MRPGAPGPLWPLPWGALAWAVGFVSS
824 Beta-galactosidase-1-like protein 2 MTTWSLRRRPARTLGLLLLVVLGFLVLRRLDW
825 Gremlin-1 MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEG
826 Interferon alpha-1/13 MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLG
827 Indian hedgehog protein MSPARLRPRLHFCLVLLLLLVVPAAWG
828 Interleukin-12 subunit beta MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA
829 Interleukin-27 subunit alpha MGQTAGDLGWRLSLLLLPLLLVQAGVWG
830 Interleukin-3 MSRLPVLLLLQLLVRPGLQ
831 Inhibin beta E chain MRLPDVQLWLVLLWALVRA
832 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 MKRLTCFFICFFLSEVSG
833 Kallikrein-5 MATARPPWMWVLCALITALLLG
834 Ig kappa chain V-III region VG MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG
835 Apolipoprotein(a)-like protein 2 MEHKEVVLLLLLFLKSAPTET
836 Complement-activating component of Ra-reactive factor MRWLLLYYALCFSLSKASA
837 Microfibrillar-associated protein 5 MSLLGPKVLLFLAAFIITSDW
838 Opticin MRLLAFLSLLALVLQETGT
839 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 4 MGPLSAPPCTQRITWKGVLLTASLLNFWNPPTTA
840 Secretogranin-3 MGFLGTGTWILVLVLPIQA
841 Semaphorin-3G MAPSAWAICWLLGGLLLHGGSS
842 Surfactant-associated protein G MGSGLPLVLLLTLLGSSHG
843 SPARC-related modular calcium-binding protein 2 MLLPQLCWLPLLAGLLPPVPA
844 Kunitz-type protease inhibitor 3 MQLQASLSFLLILTLCLELRSELA
845 Protein TSPEAR MSALLSLCFVLPLAAPGHG
846 Protein WFDC11 MVSLMKLWIPMLMTFFCTVLLSVLG
847 Protein Wnt-10b MLEEPRPRPPPSGLAGLLFLALCSRALS
848 Angiopoietin-related protein 4 MSGAPTAGAALMLCAATAVLLSAQG
849 Apolipoprotein C-II MGTRLLPALFLVLLVLGFEVQG
850 Protein ARMET MRRMWATQGLAVALALSVLPG
851 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs12
MPCAQRSWLANLSVVAQLLNFGALC
852 Bone morphogenetic protein 10 MGSLVLTLCALFCLAAYLVSG
853 Carboxypeptidase A5 MQGTPGGGTRPGPSPVDRRTLLVFSFILAAALG
854 Carboxypeptidase Z MPPPLPLLLLTVLVVAAA
855 C-C motif chemokine 18 MKGLAAALLVLVCTMALCSC
856 Fibronectin type-III domain-containing protein C4orf31 MVLLHWCLLWLLFPLSSRT
857 Uncharacterized protein C6orf15 MQGRVAGSCAPLGLLLVCLHLPGLFA
858 Complement factor B MGSNLSPQLCLMPFILGLLSGGVTT
859 Calcium-activated chloride channel regulator family member 3 MVFSLKVILFLSLLLSPVLK
860 Putative uncharacterized protein C13orf28 MAVSQGDGTLCFVLLLCCWQETEL
861 Complement component C7 MKVISLFILVGFIGEFQSFSSA
862 Cochlin MSAAWIPALGLGVCLLLLPGPAGS
863 Chordin-like protein 1 MGGMKYIFSLLFFLLLEGGKT
864 UPF0510 protein C19orf63 MAAASAGATRLLLLLLMAVAAPSRARG
865 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor MWLQSLLLLGTVACSIS
866 Cystatin-like 1 MGIGCWRNPLLLLIALVLS
867 C-X-C motif chemokine 3 MAHATLSAAPSNPRLLRVALLLLLLVAASRRAAG
868 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase 13 MNIILEILLLLITIIYSYL
869 Elastase-1 MLVLYGHS
870 EGF-like module-containing mucin-like
hormonereceptor-like3
MQGPLLLPGLCFLLSLFGAVT
871 Ephrin type-A receptor 3 MDCQLSILLLLSCSVLDSFG
872 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 MRANDALQVLGLLFSLARG
873 Fibulin-7 MVPSSPRALFLLLLILACPEPRAS
874 Folate receptor beta MVWKWMPLLLLLVCVA
875 Follistatin-related protein 1 MWKRWLALALALVAVAWVRA
876 Growth hormone receptor MDLWQLLLTLALAGSSDA
877 Glutathione peroxidase 7 MVAATVAAAWLLLWAAACA
878 Hepatocyte growth factor-like protein MGWLPLLLLLTQCLGVPG
879 Hyaluronidase-3 MTTQLGPALVLGVALCLGCG
880 Interferon alpha-17 MALSFSLLMAVLVLSYKSICSLG
881 Interferon omega-1 MALLFPLLAALVMTSYSPVGS
882 Interleukin-4 MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHG
883 Interleukin-9 MLLAMVLTSALLLCSVAG
884 Serine protease inhibitor Kazal-type 5-like 3 MAAFPHKIIFFLVCSTLTHVAFS
885 Laminin subunit alpha-3 MAAAARPRGRALGPVLPPTPLLLLVLRVLPACGAT
886 Hepatic triacylglycerol lipase MDTSPLCFSILLVLCIFIQSSA
887 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 2 MRPRTKARSPGRALRNPWRGFLPLTLALFVGAGHA
888 Matrix metalloproteinase-20 MKVLPASGLAVFLIMALKFSTA
889 Mucin-7 MKTLPLFVCICALSACFSFSEG
890 Matrix-remodeling-associated protein 5 MPKRAHWGALSVVLILLWGHPRVALA
891 Ecto-ADP-ribosyltransferase 5 MALAALMIALGSLGLHTWQAQA
892 Vasopressin-neurophysin 2-copeptin MPDTMLPACFLGLLAFSSA
893 Nidogen-1 MLASSSRIRAAWTRALLLPLLLAGPVGC
894 Neurexophilin-3 MQLTRCCFVFLVQGSLYLVICG
895 Osteoclast associated immunoglobulin-like receptor MALVLILQLLTLWPLCHT
896 Peptidoglycan recognition protein MSRRSMLLAWALPSLLRLGAA
897 Plasminogen-related protein B MEHKEVVLLLLLFLKSGQG
898 Protein Plunc MFQTGGLIVFYGLLAQTMA
899 Podocan-like protein 1 MAESGLAMWPSLLLLLLLPGPPPVAG
900 Placental protein 11 MRACISLVLAVLCGLAWA
901 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta MRILKRFLACIQLLCVCRLDWANG
902 Prorelaxin H2 MPRLFFFHLLGVCLLLNQFSRAVA
903 Ribonuclease pancreatic MALEKSLVRLLLLVLILLVLGWVQPSLG
904 Ribonuclease-like protein 9 MMRTLITTHPLPLLLLPQQLLQLVQF
905 Ribonuclease-like protein 10 MKLNLVQIFFMLLMLLLGLGMGLGLG
906 Secreted frizzled-related protein 1 MGIGRSEGGRRGAALGVLLALGAALLAVGSA
907 Pulmonary surfactant-associated protein D MLLFLLSALVLLTQPLGYLE
908 Spermatogenesis-associated protein 6 MPKVKALQCALALEISSVTC
909 Tissue factor pathway inhibitor 2 MDPARPLGLSILLLFLTEAALG
910 Thrombospondin-4 MLAPRGAAVLLLHLVLQRWLAAGAQA
911 Protein Wnt-9b MRPPPALALAGLCLLALPAAAA
912 Dickkopf-related protein 3 MQRLGATLLCLLLAAAVPTAP
913 Alpha-1-acid glycoprotein 2 MALSWVLTVLSLLPLLEA
914 Amiloride-sensitive amine oxidase [copper-containing] MPALGWAVAAILMLQTAMA
915 ADM2 MARIPTAALGCISLLCLQLPGSLS
916 Amelogenin, Y isoform MGTWILFACLVGAAFA
917 Angiopoietin-related protein 5 MMSPSQASLLFLNVCIFICGEAVQG
918 Apolipoprotein A-IV MFLKAVVLTLALVAVAGARA
919 ADAMTS-like protein 3 MASWTSPWWVLIGMVFMHSPLPQTTA
920 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs14
MAPLRALLSYLLPLHCALCAAA
921 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs7
MPGGPSPRSPAPLLRPLLLLLCALAPG
922 B melanoma antigen 3 MAAGVVFLALSAQLLQA
923 Bone morphogenetic protein 15 MVLLSILRILFLCELVLF
924 Bone morphogenetic protein 4 MIPGNRMLMVVLLCQVLLG
925 Mus musculus Ig H-chain
V-regiongene,exonandpartialcds
MGWSYIILFLVAT
926 Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 3 MLWRQLIYWQLLALFFLPFCLC
927 Carbonic anhydrase 6 MRALVLLLSLFLLGGQA
928 C-C motif chemokine 1 MQIITTALVCLLLAGMWPEDVDS
929 C-C motif chemokine 5 MKVSAAALAVILIATALCAPASA
930 CUB domain-containing protein 2 MLAEWGACLLLAVALLGPGLQA
931 Uncharacterized protein C11orf44 MVLLCLFLASLAATPRA
932 Collagen alpha-1(IV) chain MGPRLSVWLLLLPAALLLHEEHSRAAA
933 Collagen alpha-1(VIII) chain MAVLPGPLQLLGVLLTISLSSIRLIQA
934 Collagen alpha-1(XIV) chain MKIFQRKMRYWLLPPFLAIVYFCTIVQG
935 Collagen triple helix repeat-containing protein 1 MRPQGPAASPQRLRGLLLLLLLQLPAPSSA
936 Beta-defensin 134 MKPLLVVFVFLFLWDPVLA
937 Defensin-6 MRTLTILTAVLLVALQAKA
938 Dentin matrix protein 4 MKMMLVRRFRVLILMVFLVAC
939 Epididymal sperm-binding protein 1 MTRWSSYLLGWTTFLLYSYESSGG
940 Coagulation factor VIII MQIELSTCFFLCLLRFCFS
941 Fibroblast growth factor 8 MGSPRSALSCLLLHLLVLCLQA
942 Growth arrest-specific protein 6 MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALA
943 Growth/differentiation factor 9 MARPNKFLLWFCCFAWLCFPISLG
944 Histidine-rich glycoprotein MKALIAALLLITLQYSCA
945 Interleukin-17 receptor E MGSSRLAALLLPLLLIVIDLSDS
946 Insulin-like growth factor-binding protein 6 MTPHRLLPPLLLLLALLLAASPGGALA
947 Interleukin-11 MNCVCRLVLVVLSLWPDTAVA
948 Interleukin-25 MRERPRLGEDSSLISLFLQVVAFLAMVMGTHT
949 Serine protease inhibitor Kazal-type 6 MKLSGMFLLLSLALFCFLTGVFS
950 Uncharacterized protein KIAA0564 MQSRLLLLGAPGGHG
951 Putative killer cell immunoglobulin-like
receptor-likeproteinKIR3DX1
MAPKLITVLCLGFCLN
952 Laminin subunit alpha-5 MAKRLCAGSALCVRGPRGPAPLLLVGLALLGAARA
953 Laminin subunit beta-3 MRPFFLLCFALPGLLHA
954 Leukocyte immunoglobulin-like receptor
subfamilyAmember2
MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQA
955 Matrix metalloproteinase-21 MLAASIFRPTLLLCWLAAPWPTQP
956 Neurexophilin-4 MRLLPEWFLLLFGPWLLRKAVSA
957 Polyserase-3 MKWCWGPVLLIAGATVLMEGLQA
958 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 MGPLSAPPCTEHIKWKGLLVTASLLNFWNLPTTA
959 R-spondin-2 MQFRLFSFALIILNCMDYSHC
960 Semaphorin-3F MLVAGLLLWASLLTGAWP
961 Sperm-associated antigen 11B MRQRLLPSVTSLLLVALLFPGSSQ
962 SPARC-related modular calcium-binding protein 1 MLPARCARLLTPHLLLVLVQLSPARG
963 Thrombospondin type-1 domain-containing protein 1 MKPMLKDFSNLLLVVLCDYVLGEA
964 V-set and transmembrane domain-containing protein 1 MTAEFLSLLCLGLCLG
965 von Willebrand factor A domain-containing protein 3A MKKYRKISIGCFAMATQTSHVFHG
966 Wnt inhibitory factor 1 MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEA
967 Protein Z-dependent protease inhibitor MKVVPSLLLSVLLAQVWLVPG
968 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs19
MRLTHICCCCLLYQLGFLSNG
969 Bone morphogenetic protein 6 MPGLGRRAQWLCWWWGLLCS
970 Complement C1q subcomponent subunit B MMMKIPWGSIPVLMLLLLLGLIDIS
971 C-C motif chemokine 7 MKASAALLCLLLTAAAFSPQGLA
972 Putative uncharacterized protein C10orf31 MFCLLHLCFYLANFASSIKRTHA
973 Uncharacterized protein C12orf73 MPAGVPMSTYLKMFAASLLAMCAGA
974 Collagen alpha-3(IV) chain MSARTAPRPQVLLLPLLLVLLAAAPAAS
975 Complement component C8 beta chain MKNSRTWAWRAPVELFLLCAALGCLSLPGSRG
976 Collectin-11 MRGNLALVGVLISLAFLSLLPSGHP
977 Uncharacterized protein C16orf89 MASLGLLLLLLLTALPPLWS
978 Uncharacterized protein C17orf67 MASFKLADSVWEDSLSKR
979 Protein CREG2 MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG
980 C-X-C motif chemokine 9 MKKSGVLFLLGIILLVLIGVQG
981 Beta-defensin 107 MPGAMKIFVFILAALILLAQIF
982 Beta-defensin 128 MKLFLVLIILLFEVLTDG
983 Ephrin-A4 MRLLPLLRTVLWAAFLGSPLRGGSS
984 EMI domain-containing protein 1 MGGPRAWALLCLGLLLPGGGAA
985 Protein FAM131A MFLATLSFLLPFAHPFGTVSC
986 UPF0528 protein FAM172A MSISLSSLILLPIWINMA
987 Fas apoptotic inhibitory molecule 3 MDFWLWPLYFLPVSGAL
988 Low affinity immunoglobulin gamma
FcregionreceptorIII-A
MWQLLLPTALLLLVSA
989 Fibroblast growth factor receptor 3 MGAPACALALCVAVAIVAGASS
990 Growth/differentiation factor 3 MLRFLPDLAFSFLLILALGQAVQF
991 Gastrokine-2 MKILVAFLVVLTIFGIQSHG
992 Gastrin-releasing peptide MRGRELPLVLLALVLCLAPRGRA
993 Inducible T-cell costimulator MKSGLWYFFLFCLRIKVLTG
994 Interphotoreceptor matrix proteoglycan 1 MYLETRRAIFVFWIFLQVQG
995 Serine protease inhibitor Kazal-type 9 MRATAIVLLLALTLATMFS
996 Kallikrein-8 MGRPRPRAAKTWMFLLLLGGAWAGHSRA
997 Leucine-rich glioma-inactivated protein 1 MESERSKRMGNACIPLKRIAYFLCLLSALLLTEG
998 Lipase member N MMWLLLTTTCLICGTLNA
999 Long palate, lung and nasal epithelium
carcinoma-associatedprotein3
MQPVMLALWSLLLLWGLATP
1000 Lysozyme-like protein 2 MKAAGILTLIGCLVTGAES
1001 Stromelysin-2 MMHLAFLVLLCLPVCSA
1002 Matrix metalloproteinase-17 MRRRAARGPGPPPPGPGLSRLPLPLLLLLALGTRGGCA
1003 Nodal homolog MHAHCLPFLLHAWWALLQAGAATVAT
1004 Neuronal cell adhesion molecule MQLKIMPKKKRLSAGRVPLILFLC
1005 Glycodelin MLCLLLTLGVALVCGVPA
1006 Plasminogen activator inhibitor 1 MQMSPALTCLVLGLALVFGEGSA
1007 Platelet-derived growth factor subunit B MNRCWALFLSLCCYLRLVSA
1008 Paired immunoglobulin-like type 2 receptor alpha MGRPLLLPLLPLLLPPAFL
1009 Proline-rich acidic protein 1 MRRLLLVTSLVVVLLWEAGA
1010 R-spondin-4 MRAPLCLLLLVAHAVDMLA
1011 Syndecan-4 MAPARLFALLLFFVGGVA
1012 Secreted frizzled-related protein 4 MFLSILVALCLWLHLALG
1013 Vitelline membrane outer layer protein 1 homolog MERGAGAKLLPLLLLLRATGFTCA
1014 Brorin MPSSTAMAVGALSSSLLVTCCLMVALC
1015 WAP four-disulfide core domain protein 12 MGSSSFLVLMVSLVLVTLVAVEG
1016 Zinc-alpha-2-glycoprotein MVRMVPVLLSLLLLLGP
1017 Angiopoietin-related protein 7 MLKKPLSAVTWLCIFIVAFVSHPAWL
1018 Neutrophil defensin 1 MRTLAILAAILLVALQAQA
1019 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 MALFVRLLALALALALGPAATLA
1020 Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 5 MRPLLVLLLLGLAAG
1021 Beta-casein MKVLILACLVALALA
1022 Coiled-coil domain-containing protein 134 MDLLQFLAFLFVLLLSGMGATG
1023 C-C motif chemokine 20 MCCTKSLLLAALMSVLLLHLCGESEA
1024 Tryptase beta-1 MLNLLLLALPVLASRAYA
1025 Cerberus MHLLLFQLLVLLPLGKT
1026 Complement factor D MHSWERLAVLVLLGAAACAA
1027 Chitinase-3-like protein 2 MGATTMDQKSLWAGVVVLLLLQGGSA
1028 Contactin-associated protein-like 3 MASVAWAVLKVLLLLPTQTWSPVGA
1029 Complement C2 MGPLMVLFCLLFLYPGLADS
1030 Collagen alpha-1(XVI) chain MWVSWAPGLWLLGLWATFGHG
1031 Probable carboxypeptidase X1 MWGLLLALAAFAPAVGPALG
1032 Cystatin-9 MSSPQRRKAMPWALSLLLMGFQLLVTYA
1033 C-X-C motif chemokine 6 MSLPSSRAARVPGPSGSLCALLALLLLLTPPGPLASA
1034 Beta-defensin 136 MNLCLSALLFFLVILLPSGKG
1035 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase
familymember5
MTSKFLLVSFILAALSLSTTFSLQ
1036 Ephrin type-B receptor 6 MATEGAAQLGNRVAGMVCSLWVLLLVSSVLA
1037 Fibrillin-3 MTLEGLYLARGPLARLLLAWSALLCMAGGQG
1038 Leucine-rich repeat transmembrane protein FLRT3 MISAAWSIFLIGTKIGLFLQVAPLSVMA
1039 Embryonic growth/differentiation factor 1 MPPPQQGPCGHHLLLLLALLLPSLPLTRA
1040 Ig heavy chain V-II region ARH-77 MDLLHKNMKHLWFFLLLVA
1041 Interferon kappa MSTKPDMIQKCLWLEILMGIFIAGTLS
1042 IgA-inducing protein homolog MCSYYHMKKRSVSGCNITIFAVMFSHLSAG
1043 Interleukin-7 MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASS
1044 Inhibin alpha chain MVLHLLLFLLLTPQGGHS
1045 Lipase member M MLETLSRQWIVSHRMEMWLLILVAYMFQRNVNS
1046 Ig lambda chain V region 4A MAWTPLFLFLLTCCPGSNSQ
1047 Mannan-binding lectin serine protease 2 MRLLTLLGLLCGSVA
1048 Stromelysin-1 MKSLPILLLLCVAVCSA
1049 Mesothelin MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRT
1050 Mucin-1 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG
1051 Protein kinase C-binding protein NELL2 MESRVLLRTFCLIFGLGAVWG
1052 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin MPLGLLWLGLALLGALHAQA
1053 Orexigenic neuropeptide QRFP MVRPYPLIYFLFLPLGAC
1054 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 6 MGPLSAPPCTQHITWKGLLLTASLLNFWNLPTTA
1055 Putative peptide YY-3 MVSVCRPWPAVAIALLALLVCLG
1056 Regenerating islet-derived protein 3 alpha MLPPMALPSVSWMLLSCLMLLSQVQG
1057 Serpin A11 MGPAWLWLLGTGILASVHC
1058 Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and
pentraxindomain-containingprotein1
MWPRLAFCCWGLALVSG
1059 TGF-beta receptor type III MTSHYVIAIFALMSSCLATA
1060 Thyroxine-binding globulin MSPFLYLVLLVLGLHATIHC
1061 Tubulointerstitial nephritis antigen-like MWRCPLGLLLLLPLAGHLALG
1062 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLG
1063 WAP four-disulfide core domain protein 5 MRTQSLLLLGALLAVGSQLPAVFG
1064 Apolipoprotein A-V MASMAAVLTWALALLSAFSATQA
1065 Apolipoprotein O MFKVIQRSVGPASLSLLTFKVYAAP
1066 Chymotrypsinogen B2 MAFLWLLSCWALLGTTFG
1067 Bone morphogenetic protein 5 MHLTVFLLKGIVGFLWSCWVLVGYAKGGLG
1068 Biotinidase MAHAHIQGGRRAKSRFVVCIM
1069 Calumenin MDLRQFLMCLSLCTAFALS
1070 Collagen alpha-1(VI) chain MRAARALLPLLLQACWTAA
1071 Carboxypeptidase-like protein X2 MSRPGTATPALALVLLAVTLAGVGA
1072 Protein CREG1 MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARG
1073 Granulocyte colony-stimulating factor MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQE
1074 C-X-C motif chemokine 16 MGRDLRPGSRVLLLLLLLLLVYLTQPGNG
1075 Beta-defensin 127 MGLFMIIAILLFQKPTVTEQ
1076 Dehydrogenase/reductase SDR family member 4-like 2 MARLLGLCAWARKSVRLASS
1077 Extracellular matrix protein 1 MGTTARAALVLTYLAVASA
1078 Eosinophil cationic protein MVPKLFTSQICLLLLLGLMGVEGSLHA
1079 Elastase-2B MIRTLLLSTLVAGALS
1080 Protein FAM150A MRPLKPGAPLPALFLLALALSPHGAHG
1081 Protein FAM5B MRWQCGTRFRGLRPAVAPWTALLALGLPGWVLA
1082 Growth/differentiation factor 2 MCPGALWVALPLLSLLAGSLQG
1083 Glycoprotein hormones alpha chain MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHS
1084 Progonadoliberin-2 MASSRRGLLLLLLLTAHLGPSEA
1085 Glypican-6 MPSWIGAVILPLLGLLLSLPAGA
1086 Proheparin-binding EGF-like growth factor MKLLPSVVLKLFLAAVLSA
1087 Protein HEG homolog 1 MASPRASRWPPPLLLLLLPLLLLPPAAPG
1088 Hyaluronan and proteoglycan link protein 2 MPGWLTLPTLCRFLLWAFTIFHKAQG
1089 Insulin-like growth factor-binding protein 2 MLPRVGCPALPLPPPPLLPLLLLLLGASGGGGGARAEVL
1090 Insulin-like 3 MDPRLPAWALVLLGPALVFA
1091 Serine protease inhibitor Kazal-type 8 MKGICSDAILVLATSMWMAFA
1092 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase MGPPGSPWQWVTLLLGLLLPPAAP
1093 Leukocyte immunoglobulin-like receptor
subfamilyBmember1
MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQA
1094 Lysozyme-like protein 1 MKAAGILTLIGCLVTGAES
1095 Netrin-1 MMRAVWEALAALAAVACLVGAVRG
1096 Neuropilin-2 MDMFPLTWVFLALYFSRHQV
1097 Neurotrophin-3 MSILFYVIFLAYLRGIQG
1098 Otoraplin MARILLLFLPGLVAVCA
1099 Protocadherin alpha-6 MVFTPEDRLGKQCLLLPLLLLAAWKVGSG
1100 Gastricsin MKWMVVVLVCLQLLEA
1101 Platelet factor 4 variant MSSAARSRLTRATRQEMLFLALLLLPVVVA
1102 Proline-rich protein 4 MLLVLLSVVLLALSSA
1103 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 8 MGLLSAPPCTQRITWKGLLLTASLLNFWNPPTTA
1104 Pulmonary surfactant-associated protein B MAESHLLQWLLLLLPTLCGPGTAA
1105 Inactive serine protease RAMP MELGCWTQLGLTFLQLLLISS
1106 Ribonuclease-like protein 13 MAPAVTRLLFLQLVLGPTLV
1107 R-spondin-3 MHLRLISWLFIILNFMEYIGS
1108 Suprabasin MHLARLVGSCSLLLLLGALSGWAAS
1109 Metalloproteinase inhibitor 3 MTPWLGLIVLLGSWSLGDWGAEA
1110 Thymic stromal lymphopoietin MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLT
1111 Testis-expressed sequence 264 protein MSDLLLLGLIGGLTLLLLLTLLAFAGYSGLLA
1112 Retinoschisin MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLS
1113 C-type lectin domain-containing protein
UNQ5810/PRO19627
MQRWTLWAAAFLTLHSAQA
1114 Uncharacterized aarF domain-containing protein kinase 1 MARKALKLASWTSMALA
1115 Attractin MVAAAAATEARLRRR
1116 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs6
MEILWKTLTWILSLIMASSEF
1117 BMP-binding endothelial regulator protein MLWFSGVGALAERYCRRSPGITCCVLLLLNCSGVPMSLA
1118 Complement C1q tumor necrosis
factor-relatedprotein9-like
MRIWWLLLAIEICTGNINS
1119 Carboxypeptidase A6 MKCLGKRRGQAAAFLPLCWLFLKILQPGHS
1120 Collagen alpha-3(V) chain MGNRRDLGQPRAGLCLLLAALQLLPGTQA
1121 Complement component C9 MSACRSFAVAICILEISILTA
1122 B melanoma antigen 2 MAAGVVFLALSAQLLQA
1123 Chordin-like protein 2 MVPEVRVLSSLLGLALLWFPLDSHA
1124 C-X-C motif chemokine 5 MSLLSSRAARVPGPSSSLCALLVLLLLLTQPGPIAS
1125 C-X-C motif chemokine 11 MSVKGMAIALAVILCATVVQG
1126 Desert hedgehog protein MALLTNLLPLCCLALLALPAQS
1127 Protein FAM180A MHWKMLLLLLLYYNAEA
1128 Protein FAM19A4 MRSPRMRVCAKSVLLSHWLFLAYVLMVCCKLMSAS
1129 Fibrillin-1 MRRGRLLEIALGFTVLLASYTSHGADA
1130 Fibroblast growth factor 10 MWKWILTHCASAFPHLPGCCCCCFLLLFLVSSVPVTC
1131 Glypican-5 MDAQTWPVGFRCLLLLALVGSARS
1132 Hyaluronan-binding protein 2 MFARMSDLHVLLLMALVGKTACG
1133 Probable serine protease HTRA4 MIRPQLRTAGLGRCLLPGLLLLLVPVLWAGA
1134 Islet amyloid polypeptide MGILKLQVFLIVLSVALNHLKA
1135 Interleukin-15 MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEA
1136 Interferon-alpha/beta receptor beta chain MLLSQNAFIFRSLNLVLMVYISLVFG
1137 Inhibin beta C chain MTSSLLLAFLLLAPTTVA
1138 Ig kappa chain V-IV region MVLQTQVFISLLLWISGAYG
1139 Epididymal-specific lipocalin-8 MPGAAEALPTVTVTLVAGAVPPASG
1140 Leucine-rich repeat-containing protein 17 MRVVTIVILLCFCKAAEL
1141 Collagen alpha-5(IV) chain MKLRGVSLAAGLFLLALSLWGQPAEA
1142 Lysozyme g-like protein 1 MSALWLLLGLLALMDLSES
1143 Multiple epidermal growth factor-like domains 6 MSFLEEARAAGRAVVLALVLLLLPAV
1144 Microfibril-associated glycoprotein 4 MKALLALPLLLLLSTPPCAPQ
1145 Protein kinase C-binding protein NELL1 MPMDLILVVWFCVCTA
1146 Nidogen-2 MEGDRVAGRPVLSSLPVLLLLPLLMLRAAA
1147 Platelet-activating factor acetylhydrolase MVPPKLHVLFCLCGCLAVVYP
1148 Peptidase inhibitor 16 MHGSCSFLMLLLPLLLLLVATTGPVGA
1149 Phospholipase A1 member A MPPGPWESCFWVGGLILWLSVGSSG
1150 Vitamin K-dependent protein C MWQLTSLLLFVATWGISGTPAPLDSVFSSSER
1151 Properdin MITEGAQAPRLLLPPLLLLLTLPATGS
1152 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 1 MGTLSAPPCTQRIKWKGLLLTASLLNFWNLPTTA
1153 Pregnancy zone protein MRKDRLLHLCLVLLLILLSASDSNS
1154 Regulated endocrine-specific protein 18 MQHPLWPGSSEGLQLLVCFLLLNSCPGGCS
1155 FMRFamide-related peptides MEIISSKLFILLTLATSSLLTSNIFC
1156 Sperm-associated antigen 11A MRQRLLPSVTSLLLVALLFPGSSQA
1157 Thrombospondin and AMOP
domain-containingisthmin-likeprotein1
MRALRDRAGLLLCVLLLAALLEAALG
1158 Collagen alpha-2(I) chain MLSFVDTRTLLLLAVTLCLATCQS
1159 Testican-2 MRAPGCGRLVLPLLLLAAAALA
1160 T-cell immunomodulatory protein MAAAGRLPSSWALFSPLLAGLALLGVGPVPARA
1161 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B MNNLLCCALVFLDISIKWTTQ
1162 Putative trypsin-6 MNPLLILAFVGAAVA
1163 Urocortin-3 MLMPVHFLLLLLLLLGGPRTG
1164 Vasorin MCSRVPLLLPLLLLLALGPGVQG
1165 Protein WFDC10B MAPQTLLLVLVLCVLLLQAQG
1166 Protein Wnt-5b MPSLLLLFTAALLSSWA
1167 Angiopoietin-related protein 6 MGKPWLRALQLLLLLGASWA
1168 A disintegrin and metalloproteinase
withthrombospondinmotifs15
MLLLGILTLAFAGRTAG
1169 B melanoma antigen 4 MAAGAVFLALSAQLLQA
1170 UPF0672 protein C3orf58 MWRLVPPKLGRLSRSLKLAALGSLLVLMVLHSPSL
1171 C-C motif chemokine 2 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLA
1172 T-cell surface glycoprotein CD8 beta chain MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSV
1173 Putative uncharacterized protein C11orf45 MLTRLVLSAHLSSTTSPPWTHA
1174 Complement C5 MGLLGILCFLIFLGKTWG
1175 Collagen alpha-1(XI) chain MEPWSSRWKTKRWLWDFTVTTLALTFLFQAREVRGA
1176 Collectin-10 MNGFASLLRRNQFILLVLFLLQIQSLG
1177 Uncharacterized protein C17orf99 MGLPGLFCLAVLAASSFSKA
1178 Cartilage-associated protein MEPGRRGAAALLALLCVACALRAGRA
1179 Granulocyte colony-stimulating factor receptor MARLGNCSLTWAALIILLLPGSLE
1180 Cystatin-9-like MLGLPWKGGLSWALLLLLLGSQILLIYA
1181 C-X-C motif chemokine 13 MKFISTSLLLMLLVSSLSPVQG
1182 Beta-defensin 126 MKSLLFTLAVFMLLAQLVSG
1183 Protein FAM24B MPVIAGGILAALLLLIVVVLC
1184 Fibroblast growth factor receptor 2 MVSWGRFICLVVVTMATLSLA
1185 Fibrinogen alpha chain MFSMRIVCLVLSVVGTAWT
1186 Growth/differentiation factor 15 MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGA
1187 Pancreatic secretory granule membrane
majorglycoproteinGP2
MPHLMERMVGSGLLWLALVSCILTQASA
1188 Insulin-like growth factor-binding protein-like 1 MPRLSLLLPLLLLLLLPLLPPLSPS
1189 Interleukin-26 MLVNFILRCGLLLVTLSLAIA
1190 Interleukin-6 receptor subunit beta MLTLQTWLVQALFIFLTTESTG
1191 Interleukin-7 receptor subunit alpha MTILGTTFGMVFSLLQVVSG
1192 Kallikrein-4 MATAGNPWGWFLGYLILGVAGSLVSG
1193 Ig kappa chain V-I region Daudi MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC
1194 Latherin MLNVSGLFVLLCGLLVSSSA
1195 Epididymal-specific lipocalin-9 MALLLLSLGLSLIAA
1196 Leukocyte immunoglobulin-like receptor
subfamilyAmember3
MTPILTVLICLGLSLDPRTHVQA
1197 Lutropin subunit beta MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA
1198 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4 MPRPGTSGRRPLLLVLLLPLFAAATSA
1199 Lysozyme g-like protein 2 MLSSVVFWGLIALIGTSRG
1200 Meteorin MGFPAAALLCALCCGLLAPAARA
3. 1200종의 signal peptides를 구분할 수 있는 SP-tag 디자인
SP-tag은 크게 1200종 이상의 다양성을 만들어 내는 barcoding sequence와 Histidine tag으로 이루어지게 디자인하였다(도 5). 1200종의 signal peptides에 각각 하나씩 대응하기 위해 아미노산 5자리로 이루어진 barcoding sequences를 고안하였다. 그리고 그 뒤에 실험의 정확도를 위해 세포배양액에서 표적 단백질만을 분리 정제하기 위한 6 x Histidine tag을 붙였다. LC-MS/MS 수행 시 효과적인 Trypsin cleavage를 위해 양 끝에 Lysine (K)과 Arginine (R)을 삽입하였다. 단백질-barcoding sequence-his tag사이에는 linker 아미노산으로 glycine을 삽입하여 디자인하였다.
Barcoding sequence에 사용할 아미노산을 선정하기 위해 Trypsin cleavage site인 K와 R을 제외한 총 18종의 아미노산을 확인하였다. 18종의 아미노산을 하나씩 포함한 18종의 SP-tag이 달린 단백질을 발현 정제하였다(도 6).
18종의 단백질 동량을 LC-MS/MS로 식별하여 상대 정량에 적합한 아미노산을 선별하였다(도 7). 동량의 단백질을 이용한 상대 정량 결과 18종의 아미노산 중 6종(V, F, G, C, H 및 N)의 값은 상대적으로 너무 높거나 낮아서 정량하는데 있어서 부적합하였다. 12종의 아미노산(I, L, P, A, W, Y, P, T, S, E, Q 및 D)은 서로 peak area 값이 비슷하여 정량하는데 영향을 주지 않았다. 즉, 아미노산 종류에 상관없이 그 양으로만 peak area 값이 정해짐으로 상대 정량을 하기에 적합하다고 판단되었다. 결과적으로 Barcoding sequence 디자인을 위해 1차적으로 12종의 아미노산을 선별하였다.
4. 5자리 Barcoding sequences를 디자인하여 서로 다른 분자량을 가진 1200종의 SP-tag 라이브러리 구축
LC-MS/MS 상에서 효과적인 식별을 위해 1200종의 SP-tag은 서로 다른 분자량을 가져야 한다. 그렇기 때문에 Barcoding sequences 디자인 시 모든 sequences간의 분자량이 2이상 차이가 나게 하였다. 선별된 12종의 아미노산 중 I와 L, E 및 Q, D와 N은 분자량이 같거나 약 1정도의 차이를 보이기 때문에 I, Q 및 N을 배제하고 L, E 및 D 만 사용하였다. 총 9종의 아미노산(L, P, A, W, Y, T, S, E 및 D)을 이용하여 5자리의 Barcoding sequences 를 디자인하여 라이브러리를 구축하였다(표 2).
아미노산 5자리로 이루어진 Barcoding sequence
Number Sequence Number Sequence Number Sequence Number Sequence
SP-tag #1 SADAA SP-tag #301 WLELW SP-tag #601 EWPWP SP-tag #901 SLSYP
SP-tag #2 TADAA SP-tag #302 EWELW SP-tag #602 YYPWP SP-tag #902 PLSYP
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SP-tag #263 PAELL SP-tag #563 EYPWD SP-tag #863 TASWW SP-tag #1163 SATYP
SP-tag #264 DAELL SP-tag #564 SAPWE SP-tag #864 DASWW SP-tag #1164 TLTYP
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SP-tag #300 PWELW SP-tag #600 EYPWP SP-tag #900 ALSYP SP-tag #1200 YYTYW
5. 효과적인 표적 라이브러리 구축 방법 확인
1200종의 벡터로 이루어진 라이브러리를 하나씩 클로닝 할 수 없으므로 효과적으로 표적 라이브러리 구축 방법을 테스트하였다. 10종의 signal peptides를 가지고 있는 벡터에 1종류의 표적 단백질 유전자를 클로닝 하였다(표 3). 동량의 10종 벡터를 mixture상태로 만들어서 ligation-transformation-plasmid prep을 진행하였다. plasmid 내에 signal peptide의 분포를 확인하기 위해 100개의 colonies에서 각각 plasmid를 prep하여 해당 signal peptide에 대한 sequencing을 진행하였다 (표 4).
라이브러리 제작 테스트에 사용된 10종류의 signal peptide
No Signal peptides Sequence
1 Nephronectin MDFLLALVLVSSLYLQA
2 Neuropeptide B MARSATLAAAALALCLL
3 Neurotrophin-4 MLPLPSCSLPILLLFLL
4 Neutrophil defensin 1 MRTLAILAAILLVALQA
5 Oxytocin MAGSSLACCLLGLLALT
6 Pancreatic alpha amylase MKFFLLLFTIGFCWAGR
7 PPY MAAARLCLSLLLLSTCV
8 Pepsin MKWLLLLGLVALSECGR
9 PENK-A MARFLTLCTWLLLLGPG
10 Resistin MKALCLLLLPVLGLLVS
100개의 colonies에서 prep한 plasmid sequencing 결과
Signal peptide -1 Signal peptide -2 Signal peptide -3 Signal peptide -4 Signal peptide -5 Signal peptide -6 Signal peptide -7 Signal peptide -8 Signal peptide -9 Signal peptide -10 N.D.
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony번호
해당되는
colony
번호
18 1 2 8 7 4 12 16 21 5 3
23 6 13 9 28 24 14 17 26 19 62
34 10 22 11 32 31 40 39 29 20 74
35 25 33 15 44 49 45 70 46 38
50 27 42 30 64 60 53 71 56 48
52 37 43 36 66 77 76 80 61 55
54 51 47 41 75 83 85 87 78 57
63 59 68 69 82 94 91 79 58
84 65 90 72 100 95 96
86 67 97 81 98 99
88 73 89
93 92
총12개 총12 개 총10 개 총11 개 총8 개 총9 개 총10 개 총7 개 총8 개 총10 개 총3 개
97개의 plasmid가 sequencing되었으며 10종의 SP-tag이 모두 확인되었고 그 분포가 7~12%로 골고루 이루어져 있음을 확인하였다(도 8). 효율적인 라이브러리 구축을 위해 동량의 벡터를 혼합하여 라이브러리를 제작하여도 SP-tag 종류에 상관없이 다양성을 유지하는 라이브러리가 구축된다는 것을 확인하였다.
6. 재조합 단백질 생산량을 증가시키는 signal peptide 스크리닝 방법 검증
라이브러리로 발현하여 LC-MS/MS를 이용하여 정량하는 방법의 효용성을 검증하기 위해 독립적으로 발현하여 western blot으로 정량하는 방법을 비교하였다 (도 9). 표적 단백질을 삽입한 9종의 Signal peptide/SP-tag 클론들을 섞어서 동물세포에 transfection한 뒤 수일 후 세포 배양액으로 분비된 SP-tagging 단백질을 LC-MS/MS를 이용해 상대 정량하여 랭킹화 하였다. 이와 동시에 9종의 SP-tag 벡터를 각각 9개의 다른 플라스크에 독립적으로 transfection 시킨 뒤 수일 후 세포 배양액으로 분비된 SP-tagging 단백질들을 western blot을 이용해 발현을 확인하여 발현량을 상대 비교하였다 (도 10).
라이브러리 발현 방식을 이용한 LC-MS/MS 결과 peak 그래프에서 보면 8번, 1번 및 5번이 가장 높은 발현량을 보였고, 3번 및 6번이 각각 그 뒤를 이었다 (도 10 내지 12). 2번, 4번, 7번 및 9번은 발현량이 현저히 낮아 랭킹화 할 수 없었다. 그리고 독립적으로 발현하여 western blot을 진행한 결과에서 보면 1번, 8번 및 5번이 발현량 top 3로 확인되었고, 7번, 6번, 9번, 4번, 3번 및 2번 순서대로 측정되었다 (도 10 및 11). 본 발명은 단백질 생산량을 가장 증가시키는 signal peptide를 선별하는 것이 목적이었던 바, 두 가지 실험의 top 3가 일치하는 결과로 비추어 볼 때 SP-tag 라이브러리를 이용한 signal peptide 선별 방법의 효용이 검증되었음을 확인하였다.
7. SP-tag을 이용한 optimal signal peptide 선별 테스트
Signal peptide/SP-tag을 포함하고 있는 라이브러리에 표적 단백질 human vascular endothelial growth factor (hVEGF)를 클로닝 하여 표적 단백질 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리를 HEK 293 세포에서 발현시키고 3일 뒤 세포 배양액을 모아서 his tag을 이용해 발현된 단백질을 분리 정제하였다. 단백질 샘플을 trypsin을 처리한 후 LC-MS/MS를 이용해 Peak area 값을 구하여 SP-tag에 대해서 상대 정량을 실시하였다 (도 13).
LC-MS/MS 결과 peak 그래프를 보면 발현의 높낮이에 따라 peak의 높이 와 sharpness, noise 강도 등에서 확연한 차이를 보여주는 것을 확인 할 수 있었다 (도 14). 발현량이 높은 SP-tag은 single peak로 확연히 구분되는 반면 발현량이 낮은 SP-tag은 noise signal과 구분되지 않았다. 도 13에서 발현이 높게 확인된 10종의 SP-tag에 해당되는 signal peptide를 선별할 수 있었다 (도 15).
8. SP-tag 정량을 위한 표준 펩타이드 합성
1,200 시그널 펩타이드 스크리닝을 위한 MRM 분석법 개발을 위해 internal standard로 1,200 바코딩 시퀀스 기반의 isotope labeled peptide (15N, 13C 표지된 아르기닌 잔기를 합성)를 합성 (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany) 하여 사용하였다. 1,200 표준용 펩타이드 (internal standard)는 MRM 분석 전에 100 fmol/㎕농도로 단백질 발현 혼합물에 추가하여 사용하였으며, MRM 분석 시 RT (retention time)을 통해 non-specific peak과 target peak을 정확히 구별해 내는 데 사용하였다. 또한 각 그룹 간의 분석 시 발생 되는 오차를 최소화하기 위한 isotope labeled peptide (15N, 13C 표지된 라이신 잔기를 합성) 기반의 글로벌 스탠다드 펩타이드 (EQVTNVGGAVVTGVTAVAQK)를 합성하였다. 글로벌 스탠다드 펩타이드는 시료에 존재하지 않는 펩타이드 시퀀스를 사용하였으며, MRM 분석 전에 50 fmol/㎕ 농도로 단백질 발현 혼합물에 추가하여 사용하였다.
화학적으로 합성한 SP tag 펩타이드 리스트
Number 서열 Number 서열 Number 서열 Number 서열
Peptide_001 GAAPAPGHHHHHHR Peptide_301 GSYTLSGHHHHHHR Peptide_601 GWWPAAGHHHHHHR Peptide_901 GEYPWPGHHHHHHR
Peptide_002 GTAPAAGHHHHHHR Peptide_302 GSLSYTGHHHHHHR Peptide_602 GAAPWWGHHHHHHR Peptide_902 GLLPYWGHHHHHHR
Peptide_003 GALSAAGHHHHHHR Peptide_303 GTWPAPGHHHHHHR Peptide_603 GSYTYPGHHHHHHR Peptide_903 GWWDADGHHHHHHR
Peptide_004 GAASLAGHHHHHHR Peptide_304 GTAPWPGHHHHHHR Peptide_604 GYYTLAGHHHHHHR Peptide_904 GEWTWAGHHHHHHR
Peptide_005 GSADAAGHHHHHHR Peptide_305 GELTLPGHHHHHHR Peptide_605 GYATYLGHHHHHHR Peptide_905 GWAEWTGHHHHHHR
Peptide_006 GAATATGHHHHHHR Peptide_306 GDLDLPGHHHHHHR Peptide_606 GEWPAEGHHHHHHR Peptide_906 GEATWWGHHHHHHR
Peptide_007 GTASASGHHHHHHR Peptide_307 GTLELPGHHHHHHR Peptide_607 GPAEWEGHHHHHHR Peptide_907 GDADWWGHHHHHHR
Peptide_008 GSASATGHHHHHHR Peptide_308 GEWPAAGHHHHHHR Peptide_608 GALELWGHHHHHHR Peptide_908 GTAEWWGHHHHHHR
Peptide_009 GPAPASGHHHHHHR Peptide_309 GWAPAEGHHHHHHR Peptide_609 GLLSLWGHHHHHHR Peptide_909 GYYSYPGHHHHHHR
Peptide_010 GSAPAPGHHHHHHR Peptide_310 GPAEWAGHHHHHHR Peptide_610 GEYSAYGHHHHHHR Peptide_910 GPWDLYGHHHHHHR
Peptide_011 GALPAAGHHHHHHR Peptide_311 GAAEWPGHHHHHHR Peptide_611 GSAEYYGHHHHHHR Peptide_911 GPYDWLGHHHHHHR
Peptide_012 GAAPALGHHHHHHR Peptide_312 GWLSAPGHHHHHHR Peptide_612 GTADYYGHHHHHHR Peptide_912 GPLDYWGHHHHHHR
Peptide_013 GSATAPGHHHHHHR Peptide_313 GSWPALGHHHHHHR Peptide_613 GELELEGHHHHHHR Peptide_913 GYYDAYGHHHHHHR
Peptide_014 GALTAAGHHHHHHR Peptide_314 GSAPWLGHHHHHHR Peptide_614 GYYSLSGHHHHHHR Peptide_914 GYADYYGHHHHHHR
Peptide_015 GAATLAGHHHHHHR Peptide_315 GYYSAAGHHHHHHR Peptide_615 GSYSLYGHHHHHHR Peptide_915 GDWDYPGHHHHHHR
Peptide_016 GEASAAGHHHHHHR Peptide_316 GYASAYGHHHHHHR Peptide_616 GEWDLAGHHHHHHR Peptide_916 GPWDYDGHHHHHHR
Peptide_017 GTADAAGHHHHHHR Peptide_317 GELELAGHHHHHHR Peptide_617 GDWELAGHHHHHHR Peptide_917 GWYTLLGHHHHHHR
Peptide_018 GSASLAGHHHHHHR Peptide_318 GEAELLGHHHHHHR Peptide_618 GEADWLGHHHHHHR Peptide_918 GYYSYTGHHHHHHR
Peptide_019 GAASLSGHHHHHHR Peptide_319 GALELEGHHHHHHR Peptide_619 GWYPAPGHHHHHHR Peptide_919 GEWEYAGHHHHHHR
Peptide_020 GDASASGHHHHHHR Peptide_320 GDLTLLGHHHHHHR Peptide_620 GYAPWPGHHHHHHR Peptide_920 GEYEWAGHHHHHHR
Peptide_021 GSATATGHHHHHHR Peptide_321 GTLDLLGHHHHHHR Peptide_621 GSWDLLGHHHHHHR Peptide_921 GWAEYEGHHHHHHR
Peptide_022 GTAPAPGHHHHHHR Peptide_322 GSWPADGHHHHHHR Peptide_622 GLLTWTGHHHHHHR Peptide_922 GYAEWEGHHHHHHR
Peptide_023 GAAPAEGHHHHHHR Peptide_323 GSAPWDGHHHHHHR Peptide_623 GTLTLWGHHHHHHR Peptide_923 GEAEYWGHHHHHHR
Peptide_024 GPLSAAGHHHHHHR Peptide_324 GTAPWTGHHHHHHR Peptide_624 GWATAWGHHHHHHR Peptide_924 GWYSLEGHHHHHHR
Peptide_025 GSLPAAGHHHHHHR Peptide_325 GWLDAAGHHHHHHR Peptide_625 GAATWWGHHHHHHR Peptide_925 GSWEYLGHHHHHHR
Peptide_026 GPASLAGHHHHHHR Peptide_326 GWADALGHHHHHHR Peptide_626 GTYSYTGHHHHHHR Peptide_926 GSYEWLGHHHHHHR
Peptide_027 GSADAPGHHHHHHR Peptide_327 GAADWLGHHHHHHR Peptide_627 GSYTYTGHHHHHHR Peptide_927 GELSWYGHHHHHHR
Peptide_028 GTATAPGHHHHHHR Peptide_328 GDLSLEGHHHHHHR Peptide_628 GYLELPGHHHHHHR Peptide_928 GDWTYLGHHHHHHR
Peptide_029 GALDAAGHHHHHHR Peptide_329 GELTLTGHHHHHHR Peptide_629 GPYELLGHHHHHHR Peptide_929 GDYTWLGHHHHHHR
Peptide_030 GSATLAGHHHHHHR Peptide_330 GPLSYPGHHHHHHR Peptide_630 GEWTAEGHHHHHHR Peptide_930 GDLTWYGHHHHHHR
Peptide_031 GAASLTGHHHHHHR Peptide_331 GLLPAYGHHHHHHR Peptide_631 GEADWDGHHHHHHR Peptide_931 GEWSYDGHHHHHHR
Peptide_032 GDATASGHHHHHHR Peptide_332 GEATWAGHHHHHHR Peptide_632 GDAEWDGHHHHHHR Peptide_932 GSYEWDGHHHHHHR
Peptide_033 GTASADGHHHHHHR Peptide_333 GAADWDGHHHHHHR Peptide_633 GDWDLSGHHHHHHR Peptide_933 GEYTWTGHHHHHHR
Peptide_034 GSLSASGHHHHHHR Peptide_334 GWLSATGHHHHHHR Peptide_634 GTLSWEGHHHHHHR Peptide_934 GTYTWEGHHHHHHR
Peptide_035 GDAPAPGHHHHHHR Peptide_335 GTWSLAGHHHHHHR Peptide_635 GWWSASGHHHHHHR Peptide_935 GWYPAYGHHHHHHR
Peptide_036 GTLPAAGHHHHHHR Peptide_336 GWASLTGHHHHHHR Peptide_636 GSASWWGHHHHHHR Peptide_936 GYYPAWGHHHHHHR
Peptide_037 GTAPALGHHHHHHR Peptide_337 GTLSAWGHHHHHHR Peptide_637 GEYDLPGHHHHHHR Peptide_937 GWAPYYGHHHHHHR
Peptide_038 GAATLPGHHHHHHR Peptide_338 GSATWLGHHHHHHR Peptide_638 GELDYPGHHHHHHR Peptide_938 GYAPYWGHHHHHHR
Peptide_039 GEASAPGHHHHHHR Peptide_339 GPLDAYGHHHHHHR Peptide_639 GWYTAPGHHHHHHR Peptide_939 GPWDWPGHHHHHHR
Peptide_040 GTAPADGHHHHHHR Peptide_340 GEWSASGHHHHHHR Peptide_640 GTWPAYGHHHHHHR Peptide_940 GELDYYGHHHHHHR
Peptide_041 GSASLPGHHHHHHR Peptide_341 GSAEWSGHHHHHHR Peptide_641 GWATYPGHHHHHHR Peptide_941 GDLEYYGHHHHHHR
Peptide_042 GALSLAGHHHHHHR Peptide_342 GTWSADGHHHHHHR Peptide_642 GYATWPGHHHHHHR Peptide_942 GWWTLPGHHHHHHR
Peptide_043 GEADAAGHHHHHHR Peptide_343 GTATWTGHHHHHHR Peptide_643 GTAPYWGHHHHHHR Peptide_943 GWLPWTGHHHHHHR
Peptide_044 GDLSAAGHHHHHHR Peptide_344 GSWSLSGHHHHHHR Peptide_644 GEYTLLGHHHHHHR Peptide_944 GTWPWLGHHHHHHR
Peptide_045 GSADALGHHHHHHR Peptide_345 GPADYDGHHHHHHR Peptide_645 GELTLYGHHHHHHR Peptide_945 GTLPWWGHHHHHHR
Peptide_046 GTATLAGHHHHHHR Peptide_346 GEYTAPGHHHHHHR Peptide_646 GTLEYLGHHHHHHR Peptide_946 GWYTAYGHHHHHHR
Peptide_047 GAATLTGHHHHHHR Peptide_347 GEAPYTGHHHHHHR Peptide_647 GYAEWAGHHHHHHR Peptide_947 GYYTAWGHHHHHHR
Peptide_048 GEASATGHHHHHHR Peptide_348 GTYSLPGHHHHHHR Peptide_648 GAAEYWGHHHHHHR Peptide_948 GEYDYDGHHHHHHR
Peptide_049 GSADADGHHHHHHR Peptide_349 GSYTLPGHHHHHHR Peptide_649 GWYSALGHHHHHHR Peptide_949 GDYEYDGHHHHHHR
Peptide_050 GDATATGHHHHHHR Peptide_350 GALTYLGHHHHHHR Peptide_650 GWLSYAGHHHHHHR Peptide_950 GTYEYEGHHHHHHR
Peptide_051 GTLSASGHHHHHHR Peptide_351 GEAEYAGHHHHHHR Peptide_651 GYLSAWGHHHHHHR Peptide_951 GWWELAGHHHHHHR
Peptide_052 GTASLSGHHHHHHR Peptide_352 GAAEYEGHHHHHHR Peptide_652 GEAEYEGHHHHHHR Peptide_952 GWLEWAGHHHHHHR
Peptide_053 GAASAYGHHHHHHR Peptide_353 GSYELAGHHHHHHR Peptide_653 GEYSLEGHHHHHHR Peptide_953 GWAEWLGHHHHHHR
Peptide_054 GEAPAPGHHHHHHR Peptide_354 GELSYAGHHHHHHR Peptide_654 GSYELEGHHHHHHR Peptide_954 GALEWWGHHHHHHR
Peptide_055 GPAPAEGHHHHHHR Peptide_355 GSAELYGHHHHHHR Peptide_655 GTLDYEGHHHHHHR Peptide_955 GELEWEGHHHHHHR
Peptide_056 GALPALGHHHHHHR Peptide_356 GDYTLAGHHHHHHR Peptide_656 GSWDYAGHHHHHHR Peptide_956 GWYSYSGHHHHHHR
Peptide_057 GDLPAAGHHHHHHR Peptide_357 GTYDALGHHHHHHR Peptide_657 GDASWYGHHHHHHR Peptide_957 GSYSYWGHHHHHHR
Peptide_058 GEAPATGHHHHHHR Peptide_358 GTADLYGHHHHHHR Peptide_658 GSADYWGHHHHHHR Peptide_958 GWADWEGHHHHHHR
Peptide_059 GDADAPGHHHHHHR Peptide_359 GLLSYSGHHHHHHR Peptide_659 GWYTATGHHHHHHR Peptide_959 GEADWWGHHHHHHR
Peptide_060 GAATLLGHHHHHHR Peptide_360 GWLPAPGHHHHHHR Peptide_660 GTWTYAGHHHHHHR Peptide_960 GDWSLWGHHHHHHR
Peptide_061 GELSAAGHHHHHHR Peptide_361 GPWPALGHHHHHHR Peptide_661 GWATYTGHHHHHHR Peptide_961 GSWDWLGHHHHHHR
Peptide_062 GSAELAGHHHHHHR Peptide_362 GDYSAEGHHHHHHR Peptide_662 GYATWTGHHHHHHR Peptide_962 GWWTLTGHHHHHHR
Peptide_063 GDLTAAGHHHHHHR Peptide_363 GSADYEGHHHHHHR Peptide_663 GTATYWGHHHHHHR Peptide_963 GTLTWWGHHHHHHR
Peptide_064 GTLDAAGHHHHHHR Peptide_364 GEYTATGHHHHHHR Peptide_664 GPWELPGHHHHHHR Peptide_964 GTYPYYGHHHHHHR
Peptide_065 GTADALGHHHHHHR Peptide_365 GTYDADGHHHHHHR Peptide_665 GELPWPGHHHHHHR Peptide_965 GWYELPGHHHHHHR
Peptide_066 GALSLSGHHHHHHR Peptide_366 GEATYTGHHHHHHR Peptide_666 GPLPWEGHHHHHHR Peptide_966 GELPWYGHHHHHHR
Peptide_067 GTLSATGHHHHHHR Peptide_367 GYYPAAGHHHHHHR Peptide_667 GYYPAEGHHHHHHR Peptide_967 GPLEYWGHHHHHHR
Peptide_068 GSLTATGHHHHHHR Peptide_368 GSYTLTGHHHHHHR Peptide_668 GPYEYAGHHHHHHR Peptide_968 GDWSWDGHHHHHHR
Peptide_069 GTASLTGHHHHHHR Peptide_369 GYAPAYGHHHHHHR Peptide_669 GEAPYYGHHHHHHR Peptide_969 GYYSLYGHHHHHHR
Peptide_070 GSATLTGHHHHHHR Peptide_370 GTLTYSGHHHHHHR Peptide_670 GPAEYYGHHHHHHR Peptide_970 GEWPYDGHHHHHHR
Peptide_071 GAAPAYGHHHHHHR Peptide_371 GAAPYYGHHHHHHR Peptide_671 GSWSYTGHHHHHHR Peptide_971 GEYPWDGHHHHHHR
Peptide_072 GPLPAPGHHHHHHR Peptide_372 GPLELLGHHHHHHR Peptide_672 GWLDLPGHHHHHHR Peptide_972 GDYEWPGHHHHHHR
Peptide_073 GYASASGHHHHHHR Peptide_373 GPWDAPGHHHHHHR Peptide_673 GPWDLLGHHHHHHR Peptide_973 GSYDYYGHHHHHHR
Peptide_074 GSASAYGHHHHHHR Peptide_374 GDAPWPGHHHHHHR Peptide_674 GPLDWLGHHHHHHR Peptide_974 GYYTYTGHHHHHHR
Peptide_075 GAASYSGHHHHHHR Peptide_375 GELDLPGHHHHHHR Peptide_675 GDYPYSGHHHHHHR Peptide_975 GEWTLYGHHHHHHR
Peptide_076 GPATLPGHHHHHHR Peptide_376 GDLELPGHHHHHHR Peptide_676 GSYDYPGHHHHHHR Peptide_976 GDWDLYGHHHHHHR
Peptide_077 GELPAAGHHHHHHR Peptide_377 GLLDLLGHHHHHHR Peptide_677 GTYTYPGHHHHHHR Peptide_977 GEYTWLGHHHHHHR
Peptide_078 GEAPALGHHHHHHR Peptide_378 GWLTAPGHHHHHHR Peptide_678 GYYDLAGHHHHHHR Peptide_978 GELTYWGHHHHHHR
Peptide_079 GALPAEGHHHHHHR Peptide_379 GTLPWAGHHHHHHR Peptide_679 GYADYLGHHHHHHR Peptide_979 GDLDYWGHHHHHHR
Peptide_080 GAAELPGHHHHHHR Peptide_380 GTAPWLGHHHHHHR Peptide_680 GELPWTGHHHHHHR Peptide_980 GWWSAYGHHHHHHR
Peptide_081 GPLSLAGHHHHHHR Peptide_381 GYATAYGHHHHHHR Peptide_681 GWLTLLGHHHHHHR Peptide_981 GWYSWAGHHHHHHR
Peptide_082 GEADAPGHHHHHHR Peptide_382 GELTLLGHHHHHHR Peptide_682 GPWSWAGHHHHHHR Peptide_982 GWASYWGHHHHHHR
Peptide_083 GSADLPGHHHHHHR Peptide_383 GEWSAPGHHHHHHR Peptide_683 GYAEYTGHHHHHHR Peptide_983 GYASWWGHHHHHHR
Peptide_084 GTLPATGHHHHHHR Peptide_384 GSAPWEGHHHHHHR Peptide_684 GDADYYGHHHHHHR Peptide_984 GSWEYEGHHHHHHR
Peptide_085 GLLDAAGHHHHHHR Peptide_385 GDATWPGHHHHHHR Peptide_685 GSAPWWGHHHHHHR Peptide_985 GSYEWEGHHHHHHR
Peptide_086 GALDLAGHHHHHHR Peptide_386 GTADWPGHHHHHHR Peptide_686 GYYSLTGHHHHHHR Peptide_986 GEYTWDGHHHHHHR
Peptide_087 GEATLAGHHHHHHR Peptide_387 GWAELAGHHHHHHR Peptide_687 GSYTYLGHHHHHHR Peptide_987 GDYEWTGHHHHHHR
Peptide_088 GLLTASGHHHHHHR Peptide_388 GAAELWGHHHHHHR Peptide_688 GWAELEGHHHHHHR Peptide_988 GTYEWDGHHHHHHR
Peptide_089 GTASLLGHHHHHHR Peptide_389 GPWSLSGHHHHHHR Peptide_689 GEAEWLGHHHHHHR Peptide_989 GEWPWPGHHHHHHR
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Peptide_091 GAASAWGHHHHHHR Peptide_391 GWLSLAGHHHHHHR Peptide_691 GEWSLLGHHHHHHR Peptide_991 GLLPWWGHHHHHHR
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Peptide_093 GTADAEGHHHHHHR Peptide_393 GYYSASGHHHHHHR Peptide_693 GELSLWGHHHHHHR Peptide_993 GSYPYWGHHHHHHR
Peptide_094 GELSASGHHHHHHR Peptide_394 GSYSAYGHHHHHHR Peptide_694 GWWDAAGHHHHHHR Peptide_994 GEYELYGHHHHHHR
Peptide_095 GSAELSGHHHHHHR Peptide_395 GYASYSGHHHHHHR Peptide_695 GEYSYSGHHHHHHR Peptide_995 GELEYYGHHHHHHR
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Peptide_110 GELSAPGHHHHHHR Peptide_410 GLLPYSGHHHHHHR Peptide_710 GSATWWGHHHHHHR Peptide_1010 GEAEWWGHHHHHHR
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Peptide_113 GTLPADGHHHHHHR Peptide_413 GTAEWSGHHHHHHR Peptide_713 GWYDAPGHHHHHHR Peptide_1013 GELSWWGHHHHHHR
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Peptide_123 GEATLSGHHHHHHR Peptide_423 GELTAYGHHHHHHR Peptide_723 GWYTLAGHHHHHHR Peptide_1023 GYAPWWGHHHHHHR
Peptide_124 GTASLEGHHHHHHR Peptide_424 GDLDAYGHHHHHHR Peptide_724 GWLTYAGHHHHHHR Peptide_1024 GYYTLYGHHHHHHR
Peptide_125 GDLSADGHHHHHHR Peptide_425 GEATLYGHHHHHHR Peptide_725 GWATLYGHHHHHHR Peptide_1025 GSYEYYGHHHHHHR
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Peptide_131 GPYSASGHHHHHHR Peptide_431 GWYSAAGHHHHHHR Peptide_731 GEWSAYGHHHHHHR Peptide_1031 GWYTWAGHHHHHHR
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Peptide_133 GPASYSGHHHHHHR Peptide_433 GYASAWGHHHHHHR Peptide_733 GSYEWAGHHHHHHR Peptide_1033 GEWDYDGHHHHHHR
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Peptide_260 GPYPALGHHHHHHR Peptide_560 GEWSLSGHHHHHHR Peptide_860 GYAEWLGHHHHHHR Peptide_1160 GYYSYWGHHHHHHR
Peptide_261 GSLDLLGHHHHHHR Peptide_561 GDWTLSGHHHHHHR Peptide_861 GELEYEGHHHHHHR Peptide_1161 GWWDLYGHHHHHHR
Peptide_262 GSAPWTGHHHHHHR Peptide_562 GTLSWDGHHHHHHR Peptide_862 GYYSYSGHHHHHHR Peptide_1162 GWLDYWGHHHHHHR
Peptide_263 GWATALGHHHHHHR Peptide_563 GTWTLTGHHHHHHR Peptide_863 GPWPWPGHHHHHHR Peptide_1163 GWWTYEGHHHHHHR
Peptide_264 GALTAWGHHHHHHR Peptide_564 GDLDYPGHHHHHHR Peptide_864 GEWDYAGHHHHHHR Peptide_1164 GWYEWTGHHHHHHR
Peptide_265 GAATWLGHHHHHHR Peptide_565 GWYSAPGHHHHHHR Peptide_865 GWADYEGHHHHHHR Peptide_1165 GEWTWYGHHHHHHR
Peptide_266 GELTAEGHHHHHHR Peptide_566 GPWSYAGHHHHHHR Peptide_866 GEADWYGHHHHHHR Peptide_1166 GEYTWWGHHHHHHR
Peptide_267 GTAELEGHHHHHHR Peptide_567 GSAPYWGHHHHHHR Peptide_867 GDAEWYGHHHHHHR Peptide_1167 GWWPWLGHHHHHHR
Peptide_268 GTLSLEGHHHHHHR Peptide_568 GELEYAGHHHHHHR Peptide_868 GDWSYLGHHHHHHR Peptide_1168 GWLPWWGHHHHHHR
Peptide_269 GDLSLDGHHHHHHR Peptide_569 GYAELEGHHHHHHR Peptide_869 GDYSLWGHHHHHHR Peptide_1169 GWYEYEGHHHHHHR
Peptide_270 GEWSAAGHHHHHHR Peptide_570 GEAEYLGHHHHHHR Peptide_870 GSWDYLGHHHHHHR Peptide_1170 GYYEWEGHHHHHHR
Peptide_271 GEASAWGHHHHHHR Peptide_571 GEYSLLGHHHHHHR Peptide_871 GSYDWLGHHHHHHR Peptide_1171 GEWEYYGHHHHHHR
Peptide_272 GSAEWAGHHHHHHR Peptide_572 GSYELLGHHHHHHR Peptide_872 GDLSWYGHHHHHHR Peptide_1172 GEYEYWGHHHHHHR
Peptide_273 GAASWEGHHHHHHR Peptide_573 GTYDLLGHHHHHHR Peptide_873 GWYTLTGHHHHHHR Peptide_1173 GPWDWWGHHHHHHR
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Peptide_275 GSWSALGHHHHHHR Peptide_575 GWADYAGHHHHHHR Peptide_875 GYYELPGHHHHHHR Peptide_1175 GWLTWWGHHHHHHR
Peptide_276 GTLPAYGHHHHHHR Peptide_576 GAADWYGHHHHHHR Peptide_876 GELPYYGHHHHHHR Peptide_1176 GWYPYYGHHHHHHR
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Peptide_295 GTYTLAGHHHHHHR Peptide_595 GPLPWDGHHHHHHR Peptide_895 GSYEYEGHHHHHHR Peptide_1195 GEWEYWGHHHHHHR
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Peptide_298 GTATYLGHHHHHHR Peptide_598 GWLTLPGHHHHHHR Peptide_898 GWWDLAGHHHHHHR Peptide_1198 GDWEWWGHHHHHHR
Peptide_299 GTYSAEGHHHHHHR Peptide_599 GPWTLLGHHHHHHR Peptide_899 GDWELEGHHHHHHR Peptide_1199 GWYEYYGHHHHHHR
Peptide_300 GSADYDGHHHHHHR Peptide_600 GLLPWTGHHHHHHR Peptide_900 GELDWEGHHHHHHR Peptide_1200 GYYEYWGHHHHHHR
10. Aflibercept 표적 라이브러리를 이용하여 생산량을 증가시키는 signal peptide 스크리닝
Signal peptide/SP-tag을 포함하고 있는 라이브러리에 모델 표적 단백질로 Aflibercept를 클로닝 하여 표적 단백질 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리를 HEK 293 세포에서 발현시키고 3일 뒤 세포 배양액을 모아서 his tag을 이용해 발현된 단백질을 분리 정제하였다. 단백질 샘플을 trypsin을 처리한 후 LC-MS/MS를 이용해 Peak area 값을 구하여 SP-tag에 대해서 상대 정량을 실시하였다. 시그널 펩타이드 스크리닝을 위해 디자인된 1,200 바코딩 펩타이드와 합성된 표준 펩타이드 1,200 (총 2,400 펩타이드)개를 효과적으로 분석하기 위해 총 16 그룹 (각 150개 타깃 펩타이드)으로 나누어 MRM 분석을 진행하였다. 각 그룹 (150개 타깃 펩타이드)에는 75개의 바코딩 펩타이드와 75개의 표준 펩타이드로 구성하였다. 또한 16개 그룹 간의 차이를 최소화 하기 위해 글로벌 스탠다드 펩타이드를 함께 분석하여 각 그룹 간 차이를 줄이기 위한 normalization을 수행하였다 (도 16). 16개 그룹에 대한 시스템 안정성을 확인해 본 결과 변동계수 (coefficient of variation, CV)는 17.26 %로 안정적으로 나타났다 (도 16). 16개 그룹 (바코딩&표준 펩타이드: 2,400개)에 대한 각각 LC-MS/MS로 분석하고 글로벌 스탠다드로 보정한 peak area 값을 그래프로 나타내었고 높은 값을 가지는 것이 1차 hit로 선정되었다 (도 17). 스크리닝 시스템을 검증하고 2차 hit를 선별하기 위해 상위 24 종과 하위 24 종에 해당하는 plasmid를 각각 individual expression 시키고 그 발현량을 western blot으로 비교 하였다 (도 18). 정량 분석을 위해 individual expression 시킨 sample을 OCTET 장비를 이용해 정량 하여 이중으로 비교하였다 (도 18). 이를 바탕으로 발현이 높게 확인된 SP-tag 14종에 각각 매칭되는 signal peptide 14종을 선별하였다 (도 19).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등기물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Osong Hi-Tech Medical Industry Promotion Foundation The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University <120> High-Throughput Screening Method using Individual Barcoding System for Identifying Optimal Signal Peptides to Enhance the Productivity of Protein <130> HP9504 <150> KR 10-2019-0108722 <151> 2019-09-03 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding Sequence 3 <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <400> 1 Leu Leu Leu 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding Sequence 4 <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> 4th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <400> 2 Leu Leu Leu Leu 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding Sequence 5 <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> 4th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> 5th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu or Asp <400> 3 Leu Leu Leu Leu Leu 1 5

Claims (20)

  1. 다양한 시그널 펩타이드 (signal peptide) 중에서 목적 단백질 (target peptide)을 숙주세포 밖으로 효율적으로 분비하는 특정 시그널 펩타이드 (signal peptide)를 선별하기 위한 조성물로서,
    상기 조성물은 시그널 펩타이드 태그 (Signal peptide tag, SP-tag)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하고;
    상기 시그널 펩타이드 태그는 각각의 시그널 펩타이드 별로 다르게 바코딩 되어 있는 3개 이상의 아미노산으로 이루어져 있는 바코딩 서열 (Barcoding sequence site)을 포함하며;
    상기 3개 이상의 아미노산은 L(Leucine), P(Proline), A(Alanine), W(Tryptophan), Y(Tyrosine), T(Threonine), S(Serine), E(Glutamate) 및 D(Aspartate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며, 상기 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:

    단백질 분해성 절단 부위 - 링커 - 바코딩 서열 - 링커 - 친화 태그 - 단백질 분해성 절단 부위.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 트립신 절단 부위(trypsin cleavage site), 트롬빈 절단 부위(thrombin cleavage site), 엔터로키나아제 절단 부위 (enterokinase cleavage site), 인자 Xa 절단 부위 (Factor Xa cleavage site), 콜라게나아제 절단 부위 (collagenase cleavage site) 및 TEV 프로테아제 절단부위 (TEV protease cleavage site)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 단백질 분해성 절단 부위는 트립신 절단 부위인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 트립신 절단 부위는 K(Lysine) 및 R(Arginine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 링커는 1개 이상의 G(Glycine)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 친화 태그는 His-tag (Histidine tag), myc-tag, FLAG-tag, SUMO-tag (small ubiquitin-like modifier tag), CYD-tag (covalent yet dissociable NorpD peptide tag), HPC-tag (heavy chain of protein C tag), CBP-tag (calmodulin binding peptide tag) 및 HA-tag (hemagglutinin-tag)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 친화 태그는 2 내지 15개의 히스티딘으로 구성된 His-tag인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    <식 1>
    트립신 절단 부위 - 링커 - 바코딩 서열 - 링커 - 친화 태그 - 트립신 절단 부위.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그는 하기의 식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    <식 2>
    K(Lysine) 또는 R(Arginine) - G(Glycine) - 바코딩 서열 - G(Glycine) - 친화 태그 - K(Lysine) 또는 R(Arginine).
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드 태그의 N 말단에 목적 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드는 상기 목적 단백질의 N 말단에 시그널 펩타이드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1 항 또는 제 14 항의 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터.
  16. 하기의 단계를 포함하는, 숙주세포 내에서 목적 단백질을 발현하여 숙주세포 외부로 상기 목적 단백질을 분비하는 특정 시그널 펩타이드의 선별방법:
    1) 다양한 시그널 펩타이드에 대한 제 15 항의 벡터를 제작하여 라이브러리를 구축하는 단계;
    2) 상기 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시키는 단계;
    3) 상기 형질전환된 숙주세포로부터 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
    4) 상기 형질전환된 숙주세포 외부로 분비된 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드, 시그널 펩타이드 태그 또는 시그널 펩타이드 태그에 포함된 바코딩 서열을 정량하는 단계.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 숙주세포는 CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포, MDCK 세포 및 WI38 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포인 것을 특징으로 하는 선별방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 단계 3)은 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시킨 후, 친화 태그를 이용하여 분리 및 정제하는 단계 (단계 3-1))를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 선별방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 단계 3)은 상기 시그널 펩타이드 태그를 포함하는 폴리펩타이드에 트립신을 처리하는 단계 (단계 3-2))를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 선별방법.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 단계 4)는 LC-MS/MS를 이용하여 정량하는 것을 특징으로 하는 선별방법.
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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