CN116615462A - 抗体构建体的表达技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体构建体的表达载体设计。抗体构建体的不同多肽链在相同的开放阅读框内编码，通过2A肽接头彼此连接。此表达载体设计实现了抗体构建体的均匀表达和正确组装。

Description

抗体构建体的表达技术

技术领域

本发明涉及重组蛋白质生产领域。提供了抗体构建体的新表达策略。特别地，提供核酸产物用于产生具有若干不同多肽链的抗体构建体，其中多肽链在由2A肽隔开的相同开放阅读框内编码，从而导致生成分离的多肽链。因此，实现了抗体构建体的均匀表达和正确组装。

背景技术

双特异性抗体是结合两个不同表位的抗体。最常见地，它们是通过将针对第一表位的重链-轻链对与针对第二表位的另一个重链-轻链对配对来构建的。这样的抗体构建体是本领域熟知的。产生双特异性抗体的一种方法是所谓的旋钮入孔(knob-into-hole，KiH)技术，例如，由Ridgway等人(1996)Protein Engineering[蛋白质工程]9(7):617-621所描述的。本文中，通过用较小的氨基酸取代较大的氨基酸来修饰第一重链以显示孔样结构，并且使用氨基酸取代(其中较小的氨基酸由较大的氨基酸替换)来修饰第二重链以在重链:重链界面的对应位点处显示旋钮样结构。由于有利于旋钮和孔重链的配对，因此形成双特异性抗体，即由两条不同轻链和两条不同重链组成的异四聚体蛋白质。

然而，在宿主细胞中仍然会发生抗体的错误组装，尤其是由于轻链与错误的重链错配或两条相同的重链配对，或缺失一条多肽链的不完整构建体。此外，双特异性抗体的多肽链通常以不同的量表达，例如，因为多肽链的表达盒以不同的量表达，导致mRNA水平失衡。这增加了错误组装的抗体构建体的量。

错误组装的抗体会降低生产工艺的总得率，并且在纯化工艺期间特别难以去除。

因此，现有的生成双特异性抗体的方法可能不能以足够具有成本效益的方式提供足够的总得率、纯度和产品质量，从而无法大规模生产用于临床开发和商业化。此外，蛋白质链的任何修饰固有地增加了诱导抗药物抗体的风险。因此，仅需要极少的蛋白质工程的方法在临床上可能是有利的。

鉴于上述情况，本领域需要提供改善的策略来产生双特异性抗体和其他抗体构建体，从而得到较高得率和比率的正确组装的抗体构建体。

发明内容

本发明诸位发明人已发现，如果至少一些不同多肽链使用自切割肽接头(例如所述多肽链之间的2A肽)在相同开放阅读框内编码，则可以生成包含三条或更多条不同多肽链的抗体构建体(如双特异性抗体或抗体融合蛋白质)，且具有显著增加的功效。发明人证明这一方法可提供mRNA水平的均衡表达，从而也导致更均衡的蛋白质水平。此外，来自一个mRNA的不同多肽链的翻译在宿主细胞中近距离发生。因此，所产生的抗体构建体被正确组装，并且防止了多肽链的不必要错配以及一些多肽链的过量产生。因此，本发明可使由宿主细胞表达的正确形成的抗体构建体的比率增加，并且从而使期望产物的总得率和纯度增加。发明人能够证明根据本发明的方法对于若干不同抗体构建体的优点，与传统方法相比，这些构建体均显示出更高的蛋白质正确组装率。

因此，在第一方面，本发明涉及由一个或多个载体核酸组成的核酸产物，该一个或多个载体核酸编码包含至少三条不同多肽链的抗体构建体，其中抗体构建体包含抗体重链，并且其中抗体构建体的至少两条不同多肽链在相同开放阅读框内编码，其中在所述开放阅读框内编码的连续多肽链通过包含2A肽的肽接头连接。

在第二方面，本发明提供包含根据第一方面的核酸产物的宿主细胞。

在第三方面，本发明提供用于产生抗体构建体的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供根据第二方面的宿主细胞，

(b)在允许产生抗体构建体的条件下，在细胞培养物中培养宿主细胞，

(c)从细胞培养物中获得抗体构建体，以及

(d)任选地加工抗体构建体。

在第四方面，本发明提供根据第一方面的核酸产物或根据第二方面的宿主细胞在抗体构建体产生方面的用途。

在第五方面，本发明提供产生根据第二方面的宿主细胞的方法，该方法包括将根据第一方面的核酸产物引入宿主细胞中。

从以下描述和所附权利要求，本发明的其他目的、特征、优点和方面对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求和指示本申请优选实施例的具体实例仅以说明的方式给出。通过阅读以下内容，在所披露发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。

定义

如本文所用，以下表述通常意在优选地具有如下文所述的含义，除非在使用它们的上下文中另有指示。

除了其字面含义之外，如本文所用的表述“包含(comprise)”还包括并且具体是指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”具体列出的元素的主题不包含另外元素的实施例，以及其中“包含”具体列出的元素的主题可能和/或确实涵盖另外元素的实施例。同样，表述“具有”应理解为表述“包含”，还包括并且具体是指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。在可能的情况下，术语“基本上由……组成”特别是指其中除了主题基本上由其组成的具体列出的元素外主题还包含20％或更少、特别是15％或更少、10％或更少、或尤其是5％或更少的另外元素的实施例。

术语“核酸”包括单链和双链核酸、核糖核酸以及脱氧核糖核酸。其可能包含天然存在的以及合成的核苷酸，并且可经过天然修饰或以合成方法修饰(例如通过甲基化、5'-和/或3'-封端)。在特定的实施例中，核酸是指双链脱氧核糖核酸。

根据本发明的“核酸产物”是一个核酸或一组两个或更多个核酸，它们共同编码期望的多肽或蛋白质。特别地，编码由两条或更多条不同多肽链组成的蛋白质的核酸产物包括由编码所有不同多肽链的一个核酸组成的核酸产物，以及由两个或更多个核酸组成的核酸产物，其中这些核酸中的每一个编码至少一条不同多肽链，并且核酸产物的所有核酸一起编码蛋白质的所有不同多肽链。核酸产物的不同核酸通常设计成彼此协调。例如，不同的核酸可能具有不同的选择标记，从而可以控制经转染的宿主细胞中每种核酸的维持。

术语“表达盒”特别是指能够启动和调节其中引入的编码核酸序列的表达的核酸构建体。表达盒可以包含启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。表达盒的确切结构可能根据物种或细胞类型而变化，但通常包含分别涉及转录和翻译起始的5'-未转录以及5'-和3'-未翻译序列，例如TATA盒、封端序列、CAAT序列等。更特别地，5'-未转录表达控制序列包含启动子区，该启动子区包括用于可操作地连接的核酸的转录控制的启动子序列。表达盒还可以包含增强子序列或上游激活因子序列。

根据本发明，术语“启动子”是指位于待表达的核酸序列上游(5')的核酸序列，并通过提供RNA-聚合酶的识别和结合位点来控制序列的表达。“启动子”可能包括参与基因转录调控的另外因子的另外识别和结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“诱导型的”，即响应于诱导剂而启动转录，或者如果转录不受诱导剂控制，可以是“组成型的”。如果不存在诱导剂，则在诱导型启动子控制下的基因不表达或仅以很小程度表达。在存在诱导剂的情况下，基因开启或转录水平增加。这通常由特异性转录因子的结合来介导。

本文中，术语“载体”以其最一般的含义使用，并且包含核酸的任何中间媒介物，该媒介物能够将所述核酸例如引入到原核和/或真核细胞中，并且在适当时整合到基因组中。此类载体优选地在细胞中复制和/或表达。载体包含质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。如本文所用的术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常为环状DNA双链体，其可不依赖染色体DNA进行复制。根据本发明的载体可以以环状或线性化形式存在。如本文所用的“载体核酸”是形成载体的核酸或是载体的核酸部分。

术语“5'”和“3'”惯例用于描述与遗传元件位置和/或事件方向(5'至3')相关的核酸序列特征，比如例如在5'至3'方向上通过RNA聚合酶进行转录或通过核糖体进行翻译。同义词为上游(5')和下游(3')。按照惯例，DNA序列、基因图谱、载体卡和RNA序列从左向右以5'至3'绘制，或用箭头指示5'至3'方向，其中箭头指向3'方向。因此，当遵循此惯例时，5'(上游)表示朝向左手侧定位的遗传元件，并且3'(下游)表示朝向右手侧定位的遗传元件。

“多肽”或“多肽链”是指包含通过肽键连接在一起的氨基酸聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白质(例如，具有50个以上氨基酸)和肽(例如，具有2-49个氨基酸)。尤其是，多肽或多肽链可以是由两条或更多条多肽链组成的蛋白质的一部分。多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白质和/或肽。多肽可以是药学上或治疗上的活性化合物，或用于测定等的研究工具。适用实例概述如下。

如果靶氨基酸序列与参比氨基酸序列在其整个长度上具有至少75％，更优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，则靶氨基酸序列“衍生”自或“对应”于参比氨基酸序列。在特定的实施例中，“衍生”自或“对应”于参比氨基酸序列的靶氨基酸序列在其整个长度上与参比氨基酸序列是100％同源的，或特别地是100％相同的。类似地，如果靶核苷酸序列与参比核苷酸序列在其整个长度上具有至少75％，更优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，则靶核苷酸序列“衍生”自或“对应”于参比核苷酸序列。在特定的实施例中，“衍生”自或“对应”于参比核苷酸序列的靶核苷酸序列在其整个长度上与参比氨基酸序列是100％相同的。优选地根据本发明在参比序列的整个长度上确定氨基酸序列或核苷酸序列的“同一性”。

术语“抗体”特别地是指包含由二硫键连接的至少两条重链和两条轻链的抗体蛋白质。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包含三个或(在IgM或IgE型抗体的情况下)四个重链恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一恒定结构域CH1与可变区相邻，并且可以通过铰链区连接至第二恒定结构域CH2。人γ1型重链的CH1、铰链区、CH2和CH3的氨基酸序列分别于SEQID NO:1至4中示出，并且人γ1型重链的整个恒定区于SEQ ID NO:5中示出。轻链恒定区仅由一个恒定结构域组成。可变区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间穿插有称为框架区(FR)的更保守区域，其中每个可变区包含三个CDR和四个FR。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。重链恒定区可以是任何类型，如γ、δ、α、μ或ε型重链。优选地，抗体的重链是γ链。此外，轻链恒定区还可以是任何类型，如κ或λ型轻链。人λ型和κ型轻链的恒定结构域CL的氨基酸序列分别于SEQ ID NO:6和7中示出。术语“γ(δ、α、μ或ε)型重链”和“κ(λ)型轻链”分别是指抗体重链或抗体轻链，它们具有衍生自天然存在的重链或轻链恒定区氨基酸序列的恒定区氨基酸序列，尤其是人重链或轻链恒定区氨基酸序列。抗体可以是例如人源化、人或嵌合抗体。

如本文所用的术语“抗体”还包括所述抗体的片段、衍生物和移植物。抗体的“片段或衍生物”特别地是衍生自所述抗体且能够结合与该抗体相同的抗原(特别是结合与该抗体相同的表位)的蛋白质或糖蛋白。在另外的实施例中，抗体的“片段或衍生物”尤其是指包含抗体的一个或多个Fc区并且可能包含或可能不包含抗原结合区的多肽或蛋白质。因此，本文中抗体的片段或衍生物通常是指功能性片段或衍生物，其中抗体的功能是结合抗原和/或与Fc受体相互作用。抗体的“移植物”尤其是指其中异源多肽被引入其中或(部分)替换该抗体的CDR序列的所述抗体。示例性抗体移植物在US 2017/0158747A1中进行了描述。

如本文所用的术语“抗体构建体”是指包含至少一个衍生自抗体的蛋白质结构域的任何蛋白质。特别地，抗体构建体是人工蛋白质并且可包含不同天然或基因工程化蛋白质的部分，包括至少一种抗体。尤其是，抗体构建体包含至少一个衍生自抗体，特别是衍生自人IgG抗体的免疫球蛋白结构域。在某些实施例中，抗体构建体包含至少衍生自抗体的恒定免疫球蛋白结构域，如CH2结构域或CH3结构域，尤其是CH2结构域和CH3结构域。

本文提及的细胞特别是宿主细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。特别优选哺乳动物细胞，如人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可能衍生自多种组织类型，并包含原代细胞和细胞系。核酸可以以单拷贝或者两个或更多个拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施例中在宿主细胞中表达。

多肽链的“均匀产生”是指由于转录后获得的编码mRNA的水平均衡，翻译后获得的在相同开放阅读框内编码的多肽链的水平均衡。

术语“药物组合物”或“药物配制品”特别是指适于施用于人或动物的组合物，即，包含药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或者其盐或药物前体，以及载体、稀释剂或药用辅料，如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂。

本文给出的数字优选地理解为近似数字。特别地，数字优选地可以高和/或低多达10％，特别地高和/或低多达9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

本文所述的数字范围包括定义范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过参考整个说明书来阅读。根据一个实施例，本文在方法的情况下描述为包含某些步骤的主题或在组合物的情况下描述为包含某些成分的主题是指由相应步骤或成分组成的主题。优选地选择并组合本文所述的优选方面和实施例，并且由优选实施例的相应组合产生的特定主题也属于本披露内容。

具体实施方式

本发明基于用于抗体构建体的新表达载体的开发。抗体构建体的不同多肽链在这些载体上在一个开放阅读框中编码。多肽链各自经由包含2A肽的肽接头在该开放阅读框中连接。2A肽是“自切割”肽，翻译后会自动产生分离的多肽链。将编码不同多肽链的开放阅读框转录至一个mRNA，然后经过翻译并自动切割成不同多肽链。

通过在N末端多肽链和2A肽之间并入特定的蛋白酶切割位点并使用相应的蛋白酶(例如弗林蛋白酶)，可以任选地去除保留在N末端多肽链的C末端上的2A肽接头的氨基酸。有利地，N末端多肽链是抗体重链。在这种情况下，当重链的天然C末端赖氨酸残基经细胞羧肽酶切割时，接头肽的残留C末端氨基酸被去除。

为了去除保留在C末端多肽链N末端的2A肽的残留氨基酸，可以对所述多肽链进行编码，包括信号肽。信号肽通过蛋白质成熟的细胞过程被切割掉，从而也去除了2A肽的残留氨基酸。

上述方法非常有利于产生抗体构建体，尤其是包含三条或更多条不同多肽链的构建体。本发明诸位发明人可以证明通过使用相应的表达构建体显著增加了均衡表达。不同多肽链翻译自相同的mRNA，因此通常以等摩尔量产生。因此，可以避免由于表达不均衡而仅产生一些不需要的多余多肽链。此外，使用2A肽技术对编码若干不同多肽链的mRNA进行翻译，可导致这些多肽链在细胞中近距离产生，因为据信它们由相同的核糖体产生。这显著增强了正确的链配对和蛋白质组装，使得正确形成的抗体构建体的相对量更高，并且不需要的副产物(例如具有错误或缺失多肽链的复合物)更少。因此，使期望的抗体构建体的纯化变得容易，并最终提高了总得率。

1.编码抗体构建体的核酸产物

鉴于这些发现，本发明在第一方面提供由一个或多个载体核酸组成的核酸产物，该一个或多个载体核酸编码包含至少三条不同多肽链的抗体构建体，其中抗体构建体包含抗体重链，并且其中抗体构建体的至少两条不同多肽链在相同开放阅读框内编码，其中在所述开放阅读框内编码的连续多肽链通过包含2A肽的肽接头连接。

特别地，与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的多肽链的产生相比，核酸产物提供抗体构建体的多肽链的更均匀的细胞产生。

多肽链的细胞产物可根据蛋白质水平或mRNA水平确定。多肽链的更均匀的细胞产生特别是指由细胞产生的每条多肽链的量之间的差异更小。尤其是，与其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物相比，当使用根据本发明的核酸产物时，由宿主细胞产生的抗体构建体的多肽链的最高量除以多肽链的最低量的商更低。此外，多肽链的更均匀的细胞产生例如是指编码由细胞产生的每条多肽链的mRNA的量之间的差异更小。尤其是，与其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物相比，当使用根据本发明的核酸产物时，由宿主细胞产生的抗体构建体的编码多肽链的mRNA的最高量除以编码多肽链的mRNA的最低量的商更低。

在某些实施例中，细胞中所述抗体构建体的不同多肽链的量相差不超过20倍，尤其是不超过10倍、不超过8倍或不超过5倍。在另外的实施例中，细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过20倍，尤其是不超过10倍、不超过8倍或不超过5倍。

此外，与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时在抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量相比，该核酸产物尤其提供在抗体构建体的多肽链表达后更高的正确组装的抗体构建体的相对量。在某些实施例中，在抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少5个百分点，尤其是至少10个百分点、至少15个百分点或至少20个百分点。

与其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物的比较特别地是在相同或高度相似的条件和产生方式下进行的，尤其是在相同编码序列、相同启动子、相同宿主细胞系下以及相同培养条件下进行的。

1.1核酸产物

核酸产物涵盖一个或多个开放阅读框，它们共同编码抗体构建体的所有多肽链。如果抗体构建体的多肽链由一个以上开放阅读框编码，则这些开放阅读框可存在于相同或不同载体核酸上。在某些实施例中，核酸产物由编码抗体构建体的一个载体核酸组成。在这些实施例中，编码抗体构建体的所有多肽链的一个或多个开放阅读框存在于该载体核酸上。在其他实施例中，核酸产物由编码抗体构建体的两个或更多个，特别是两个载体核酸组成。在这些实施例中，抗体构建体的多肽链通常由存在于两个或更多个载体核酸上的两个或更多个开放阅读框编码。一个载体核酸可以包含编码抗体构建体多肽链的一个或多个开放阅读框。优选地仅使用一个载体核酸。

在相同开放阅读框中编码的抗体构建体的不同多肽链通过包含2A肽的肽接头连接。在其中抗体构建体的两条以上多肽链在相同开放阅读框中编码的实施例中，包含2A肽的肽接头连接连续的多肽链。

在某些实施例中，编码抗体构建体的两条或更多条多肽链的开放阅读框是使开放阅读框能够表达的表达盒的一部分。如果抗体构建体的多肽链由一个以上的开放阅读框编码，则不同的开放阅读框可以是相同表达盒的一部分或是单独表达盒的一部分。在其中两个或更多个开放阅读框是相同表达盒的一部分的实施例中，连续开放阅读框特别地通过内核糖体进入位点(IRES)连接。

除开放阅读框外，表达盒特别地包含可操作地连接至开放阅读框的启动子。在表达盒中使用的启动子可以是任何适用于在哺乳动物宿主细胞中驱动表达的启动子。启动子可以例如选自由巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、泛素C(UBC)启动子、延伸因子1α(EF1A)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、BROAD3启动子、小鼠rosa 26启动子、pCEFL启动子和任选地与CMV早期增强子(CAGG)偶联的β-肌动蛋白启动子组成的组。启动子的特定实例包括巨细胞病毒早期瞬时启动子、猿猴病毒40早期启动子、人泛素C启动子、人延伸因子1α启动子、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列启动子和与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子。在特定的实施例中，启动子是CMV启动子。

在其中编码抗体构建体的多肽链的开放阅读框由一个以上表达盒表达的实施例中，表达盒优选包含相似的表达调控元件，尤其是具有相似强度的启动子。可使用不同启动子或相同启动子，以及特别地使用具有相似强度的不同启动子。

载体核酸可以包含另外的元件，比如标记基因及起点或复制。在一些实施例中，载体核酸适用于稳定转染宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞，例如啮齿动物或人细胞，尤其是CHO细胞。特别地，载体核酸是质粒。

在一些实施例中，核酸产物的每个载体核酸包含至少一个选择性标记基因。选择性标记基因特别地是哺乳动物选择性标记基因，其允许选择包含所述基因的哺乳动物宿主细胞，并因此允许选择包含载体核酸的哺乳动物宿主细胞。

哺乳动物选择性标记基因的非限制性实例包括抗生素抗性基因，例如对以下抗生素产生抗性：G418；潮霉素(hygro)(hyg或hph，从马里兰州盖瑟斯堡(Gaithesboro)生命技术公司(Life Technologies,Inc.)商购获得)；新霉素(neo，从马里兰州盖瑟斯堡(Gaithesboro)生命技术公司(Life Technologies,Inc.)商购获得)；吉欧霉素(Sh Ble，从加利福尼亚州圣地亚哥法敏进公司(Pharmingen)商购获得)；嘌呤霉素(puro)(pac，嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶，可从加利福尼亚州帕洛阿尔托克隆科技公司(Clontech)获得)、哇巴因(oua，可从法敏进公司(Pharmingen)获得)和杀稻瘟素(可从英杰公司(Invitrogen)获得)。另外合适的选择性标记基因包括叶酸受体基因，例如叶酸受体α基因，或编码荧光蛋白质(如GFP和RFP)的基因。相应的哺乳动物选择性标记基因是众所周知的，并且允许选择包含所述基因的哺乳动物细胞，并因此允许选择包含载体的细胞。使用叶酸受体基因的系统在WO 2009/080759和WO 2015/015419中进行了描述。如本文所用的术语“基因”是指编码提供预期抗性的选择性标记的功能性变体的天然或合成多核苷酸。因此，也涵盖野生型基因或合成多核苷酸的截短或突变版本，只要它们提供预期抗性即可。

在一些实施例中，哺乳动物选择性标记基因可以是可扩增的并且允许选择包含载体的哺乳动物宿主细胞以及基因扩增。可扩增、可选择的哺乳动物标记基因的非限制性实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。目前使用的其他系统包括谷氨酰胺合成酶(gs)系统和组氨醇驱动的选择系统。这些可扩增的标记也是选择性标记，因此可用于选择那些获得载体核酸的细胞。对于可扩增系统，例如DHFR系统，在DHFR系统的情况下通过将细胞暴露于某些促进基因扩增的试剂，例如抗叶酸剂(如甲氨蝶呤(MTX))，可增加重组蛋白质的表达。适合GS促进基因扩增的抑制剂是甲硫氨酸砜亚胺(MSX)。暴露于MSX也会导致基因扩增。

在其中核酸产物包含两个或更多个载体核酸的实施例中，不同载体核酸特别地包含不同的选择性标记基因。

载体核酸特别地适用于整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，用载体核酸稳定地转染宿主细胞。在某些实施例中，载体核酸进一步包含原核选择性标记基因。所述原核选择性标记可以提供对抗生素比如例如氨苄西林、卡那霉素、四环素和/或氯霉素的抗性。

1.2抗体构建体

抗体构建体可以是包含三条或多条不同多肽链的任何蛋白质，其中这些多肽链中的至少一条是抗体的重链。因此，抗体构建体的不同多肽链涵盖至少一条抗体重链，在下文中也称为第一重链。

在特定的实施例中，抗体重链是抗体构建体在相同开放阅读框内编码的至少两条不同多肽链中的一条。特别地，抗体重链是在核酸产物的开放阅读框内编码的N-末端多肽链。

剩余的多肽链可以是任何多肽链，只要它们能够组装在一起形成抗体构建体。在某些实施例中，另外的多肽链包括至少一条抗体轻链和/或至少一条不同于第一重链的另外的抗体重链。在特定的实施例中，抗体构建体的多肽链都是抗体重链和任选地抗体轻链。抗体构建体的不同多肽链的示例性集包括：两条不同抗体重链和两条不同抗体轻链，两条不同抗体重链和一条抗体轻链，一条抗体重链和两条不同抗体轻链，以及两条不同抗体重链和三条不同抗体轻链。

在某些实施例中，抗体构建体包含与第一重链结合的抗体轻链。该抗体轻链在下面也称为第一轻链。在特定的实施例中，第一重链和第一轻链在相同开放阅读框内编码。在这些实施例中，第一抗体重链优选地是在所述开放阅读框内编码的N-末端多肽链。特别地，第一轻链是在所述开放阅读框内编码的第二多肽链，第一重链通过包含2A肽的肽接头连接至该链。在这些实施例中，在翻译方向上，开放阅读框优选地首先编码第一重链、然后编码肽接头、然后编码第一轻链，使得肽接头连接重链的C末端与轻链的N末端。

在特定的实施例中，第一重链包含重链可变区，并且第一轻链包含轻链可变区。在这些实施例中，重链可变区和轻链可变区可以特别地形成抗原结合区。抗原结合区尤其能够特异性结合抗原。

在某些实施例中，抗体构建体包含第二抗体重链。第二重链特别地不同于第一重链。优选地，第一重链和第二重链在抗体构建体中彼此结合。在特定的实施例中，第一重链和第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

在其中抗体构建体包含第二重链的实施例中，可以在与第一重链相同的开放阅读框内编码第二重链。第一重链、接头肽和第二重链可以按5'至3'的顺序连续编码。如果该开放阅读框编码另外的多肽链，如第一轻链，则可以例如在第一和第二重链之间或在第二重链之后编码所述另外的多肽链。

在其中抗体构建体包含第二重链的替代性实施例中，第二重链在与编码第一重链的开放阅读框不同的第二开放阅读框内编码。在这些实施例中，抗体构建体的一条或多条另外的多肽链可以在第二开放阅读框内编码。在这种情况下，在所述第二开放阅读框内编码的N-末端多肽链优选地是第二重链，该第二重链通过包含2A肽的肽接头连接至在所述第二开放阅读框内编码的另外的多肽链。

在其中抗体构建体包含第二重链的实施例中，第一重链和第二重链特别地使用旋钮入孔技术彼此结合。

在某些实施例中，抗体构建体包含第二抗体轻链。在其中抗体构建体包含第二抗体重链和第二抗体轻链的实施例中，第二轻链特别地结合至第二重链。在这些实施例中，第二重链和第二轻链优选地在包含连接这两条多肽链的肽接头的相同开放阅读框内编码，其中肽接头包含2A肽。特别地，在翻译方向上，所述开放阅读框首先编码第二重链，然后编码肽接头，然后编码第二轻链，使得肽接头连接重链的C末端与轻链的N末端。

在特定的实施例中，第二重链包含重链可变区，并且第二轻链包含轻链可变区。在这些实施例中，重链可变区和轻链可变区可以特别地形成抗原结合区。抗原结合区尤其能够特异性结合抗原。

在其中第一重链和轻链的重链和轻链可变区形成第一抗原结合区且第二重链和轻链的重链和轻链可变区形成第二抗原结合区的实施例中，第一抗原结合区特别地能够特异性结合第一抗原且第二抗原结合区特别地能够特异性结合第二抗原。

1.3抗体重链

根据本发明，抗体的重链，在本文中也称为“重链”或“抗体重链”，是包含至少一部分抗体重链恒定区的多肽链，特别是重链恒定区(也称为重链恒定结构域(CH))的至少一个免疫球蛋白结构域，例如CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。

在优选的实施例中，抗体重链包含CH3结构域。在某些实施例中，CH3结构域在其C末端包含赖氨酸残基。

如本文所用的CH3结构域是指衍生自天然人抗体的CH3结构域的抗体重链恒定结构域，尤其是具有γ型重链的天然人IgG抗体的CH3结构域。类似地，如本文所用的另外的免疫球蛋白结构域(VH、CH1、CH2、VL、CL)是指衍生自天然人抗体(尤其是具有γ型重链和κ型或λ型轻链的天然人IgG抗体)的相应免疫球蛋白结构域的抗体重链或轻链结构域。如本文所用的铰链区是指衍生自天然人抗体的铰链区的抗体重链铰链区，尤其是具有γ型重链的天然人IgG抗体的铰链区。在此方面，术语“衍生自”特别意指免疫球蛋白结构域的氨基酸序列与天然人抗体的相应免疫球蛋白结构域至少90％相同，特别地至少95％相同。抗体的免疫球蛋白结构域和铰链区(如VH、CH1、CH2、CH3、VL、CL和铰链区)在本文中统称为抗体结构域。

在某些实施例中，抗体重链包含CH2结构域，尤其是CH2结构域和CH3结构域。在特定的实施例中，抗体重链包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。抗体重链特别地能够结合另一条抗体重链，并且尤其是能够与相同抗体重链形成同二聚体或与另一条抗体重链形成异二聚体。

在特定的实施例中，抗体重链包含一个或多个氨基酸取代，这使其适用于旋钮入孔技术。根据这项众所周知的技术，两条不同重链发生突变，在一条重链中形成“旋钮”，并且在另一条重链中形成对应的“孔”。这些旋钮和孔是通过在抗体中彼此接触的位置引入较大、大量的氨基酸作为旋钮和较小的氨基酸作为孔而形成的。合适的“旋钮”氨基酸是例如酪氨酸和色氨酸，并且合适的“孔”氨基酸是例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。氨基酸取代通常存在于CH3结构域中，因为该结构域提供了抗体两条重链之间的主要接触位点。也可以使用两个或三个“旋钮”和相应数量的“孔”，其中一条重链可以同时包含至少一个旋钮和至少一个孔。旋钮入孔技术是众所周知的，并且在本领域得到了确立(参见，例如，Ridgway等人(1996)Protein Engineering[蛋白质工程]9(7):617-621)。合适的突变包括T366W、T366Y和T394W作为旋钮以及T366S、L368A、F405A、Y407V和Y407T作为孔，其中示例性旋钮/孔对是T366Y/Y407T和F405A/T394W。

在某些实施例中，抗体重链包含CH1结构域和/或重链可变结构域(VH)。特别地，除了CH2结构域、CH3结构域和任选地铰链区之外，抗体重链还包含CH1结构域和/或VH结构域。

抗体的重链结构域(就目前而言)特别地按照天然抗体中发现的其自然顺序排列，即从VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域的N末端到C末端的顺序排列。

在某些实施例中，除抗体结构域外，抗体重链还包含一个或多个另外的多肽部分。这些另外的多肽部分可以定位在重链中的任何位置，例如在N末端、C末端或两个抗体结构域之间。特别地，定位另外的多肽部分，以使其不干扰重链与另一条重链或与轻链的结合。

在某些实施例中，抗体重链由N末端的信号肽编码。信号肽是宿主细胞分泌产生的多肽链的信号，并且在翻译后被切断。特别地，如果抗体重链是在开放阅读框中编码的第一多肽链，则由信号肽进行编码。

在其中抗体构建体包含至少两条不同抗体重链的实施例中，这些重链可以各自独立地具有上述特征中的一个或多个。不同抗体重链彼此存在至少一个氨基酸的差异。

1.4抗体轻链

根据本发明，抗体的轻链，在本文中也称为“轻链”或“抗体轻链”，是包含抗体的至少一部分轻链恒定区，特别是轻链恒定区(也称为轻链恒定结构域(CL))的至少一个免疫球蛋白结构域的多肽链。

在优选的实施例中，抗体轻链包含CL结构域，尤其是衍生自天然人抗体的CL结构域的CL结构域，尤其是具有κ或λ型轻链的天然人抗体的CL结构域。

在某些实施例中，抗体轻链包含轻链可变结构域(VL)。特别地，除了包含CL结构域之外，抗体轻链还包含VL结构域。抗体轻链特别地能够与抗体重链结合，尤其是能够与抗体重链形成异二聚体。

抗体的轻链结构域(就目前而言)特别地按照天然抗体中发现的其自然顺序排列，即从VL结构域和CL结构域的N末端到C末端的顺序排列。

在其中抗体构建体包含至少两条不同抗体轻链及至少两条不同抗体重链的实施例中，重链与轻链之间界面处的一个或多个氨基酸残基可能在抗体重链和/或轻链中发生突变，以增加重链和轻链的正确配对。特别地，对一条或两条轻链和/或一条或两条重链进行工程改造，使得每条轻链强烈偏好其同源重链。相应的技术是本领域已知的。例如，可以采用本文所述用于两条重链配对的旋钮入孔技术。可替代地或另外地，可以使用静电转向机制，其中轻链和重链之间的相互作用表面上的电荷分布通过氨基酸取代而进行工程改造，从而排斥静电力减少或防止轻链与错误的重链结合。在特定的实施例中，对重链的VH和CH1结构域以及轻链的VL和CL结构域进行工程改造，以提高正确的链配对。在替代性实施例中，重链的VH和CH1结构域以及轻链的VL和CL结构域未经工程改造以提高正确的链配对。

在某些实施例中，除抗体结构域外，抗体轻链还包含一个或多个另外的多肽部分。这些另外的多肽部分可以定位在轻链中的任何位置，例如在N末端、C末端或两个抗体结构域之间。特别地，定位另外的多肽部分，以使其不干扰轻链与重链的结合。

在某些实施例中，抗体轻链由N末端的信号肽编码。

在其中抗体构建体包含至少两条不同抗体轻链的实施例中，这些轻链可以各自独立地具有上述特征中的一个或多个。不同抗体轻链彼此存在至少一个氨基酸的差异。

1.5另外的多肽部分

除任何抗体结构域外，抗体构建体的抗体重链和抗体轻链可以包含另外的多肽部分。这些另外的多肽部分可以是任何融合到抗体结构域的多肽。

另外的多肽部分特别地具有特定功能，如结合靶分子。另外的多肽部分的实例包括单链抗体片段，例如由重链可变结构域和轻链可变结构域(通过肽接头连接在一起并形成抗原结合位点)的单链Fv片段(scFv)，以及由重链可变结构域(尤其是衍生自骆驼中发现的重链抗体的重链可变结构域)组成的单结构域抗体片段(sdAb)。特别地，另外的多肽部分可以提供抗原结合区。另外的多肽部分的实例包括配体、细胞因子(例如白细胞介素、细胞黏附分子、生长因子)和功能性片段以及这些部分的组成型活性或显性负性突变体。在某些实施例中，另外的多肽部分能够结合和/或激活或抑制免疫细胞，比如T细胞。多肽部分还可以是小肽，例如肽毒素。

1.6肽接头

在相同开放阅读框中编码的多肽链通过包含2A肽的肽接头连接。肽接头将前一多肽链的C末端与下一多肽链的N末端连接起来。

肽接头中的2A肽是“自切割”肽。“自切割”与共翻译同时发生，从而在翻译后获得N末端多肽链和C末端多肽链。潜在的自切割机制尚未被完全了解，并且可能例如基于在翻译后直接切割肽键或跳过核糖体，使得最初不会形成肽键。在某些实施例中，2A肽衍生自选自由口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、猪捷申病毒(teschovirus)-1和明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒组成的组的病毒。在另外的实施例中，2A肽衍生自非病毒生物体，例如海胆(如紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus))、海绵(如大堡礁海绵(Amphimedonqueenslandica))、柱头虫(如囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii))和文昌鱼(如佛罗里达文昌鱼(Branchiostoma floridae))。特别地，2A肽衍生自口蹄疫病毒。

在特定的实施例中，2A肽具有包含共有序列DXEXNPGP(SEQ ID NO:8)，特别地LXXXGDVEXNPGP(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。2A切割位点位于C末端甘氨酸和脯氨酸残基之间。2A肽特别地包含氨基酸序列，该氨基酸序列在其全长上与根据SEQ ID NO:10至21的氨基酸序列之一至少80％相同，其中尤其是SEQ ID NO:8的共有序列、特别是SEQ ID NO:9的共有序列是保守的。在某些实施例中，2A肽包含选自SEQ ID NO:10至21的氨基酸序列、特别是SEQ ID NO:10的氨基酸序列、尤其是SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施例中，2A肽位于接头肽的C末端。尤其是，C末端多肽链直接与2A肽切割位点的C末端脯氨酸残基融合。因此，C末端多肽链在2A肽自切割后形成，在其N末端仅具有另外的脯氨酸残基。

在某些实施例中，肽接头进一步包含2A肽N末端的蛋白酶识别位点。特别地，蛋白酶识别位点是弗林蛋白酶识别位点。弗林蛋白酶识别位点尤其是具有RX(R/K)R(SEQ IDNO:22)，特别是RKRR或RRKR(SEQ ID No:23和24)的氨基酸序列。在特定的实施例中，蛋白酶识别位点位于接头肽的N末端。

蛋白酶识别位点可以直接融合至2A肽，或在蛋白酶识别位点与2A肽之间可存在另外的接头序列。另外的接头序列可以是任何序列，包括普通接头序列，例如GS接头，如氨基酸序列GSG，以及衍生自2A肽源的序列。在某些实施例中，蛋白酶识别位点直接融合至2A肽且肽接头由蛋白酶识别位点和2A肽组成。

蛋白酶识别位点特别地是蛋白酶的识别位点，其在用于产生抗体构建体的宿主细胞中固有地表达。尤其是，蛋白酶在哺乳动物细胞或甚至真核细胞中普遍表达。优选地，蛋白酶是在几乎每个真核细胞中，并且尤其是在蛋白质生产中用作宿主细胞的任何哺乳动物细胞中表达的弗林蛋白酶。在其他实施例中，使用特定蛋白酶识别位点并且对宿主细胞工程改造以表达识别所述蛋白酶识别位点的蛋白酶或者在抗体构建体产生期间或之后将识别所述蛋白酶识别位点的蛋白酶添加至抗体构建体中。

例如，肽接头可以包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由其组成。

肽接头可以具有适用于连接抗体构建体不同多肽链的任何长度，并且包括自切割2A肽和任选地蛋白酶识别位点。在特定的实施例中，肽接头的长度为60个氨基酸或更少、尤其是50个氨基酸或更少、特别是40个氨基酸或更少。

在其中核酸产物的开放阅读框编码一个以上肽接头的实施例中，这些肽接头可以各自独立地具有上述特征中的一个或多个并且可以彼此不同或相同。

1.7示例性核酸产物

在一个实施例中，核酸产物包含一个或多个载体核酸，在第一开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含第一重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含第一轻链可变区的第一轻链；以及

在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含第二重链可变区的第二重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含第二轻链可变区的第二轻链；

其中第一重链可变区和第一轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且其中第二重链可变区和第二轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且其中第一重链和第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

在一个实施例中，核酸产物包含一个载体核酸，在相同开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含第一重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；

(v)包含第一轻链可变区的第一轻链；

(vi)包含2A肽的接头肽；

(vii)任选地信号肽；

(viii)包含第二重链可变区的第二重链；

(ix)包含2A肽的接头肽；

(x)任选地信号肽；以及

(xi)包含第二轻链可变区的第二轻链；

其中第一重链可变区和第一轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且其中第二重链可变区和第二轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且其中第一重链和第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

在一个实施例中，核酸产物包含一个或多个载体核酸，在第一开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含轻链可变区的轻链；以及

在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；以及

(ii)第二重链；并且

其中第一重链的重链可变区和轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且其中第二重链包含能够结合第二抗原的抗原结合区；并且其中第一重链和第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

在一个实施例中，核酸产物包含一个或多个载体核酸，在第一开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)第二重链；以及

在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；以及

(v)包含轻链可变区的轻链；并且

其中

(a)第一重链包含重链可变区，该重链可变区与轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区，；并且第二重链包含能够结合第二抗原的抗原结合区；或者

(b)第一重链包含能够结合第一抗原的抗原结合区；并且第二重链包含重链可变区，该重链可变区与轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中第一重链和第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

在一个实施例中，核酸产物包含一个载体核酸，在开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；

(v)包含重链可变区的第二重链；

(vi)包含2A肽的接头肽；

(vii)任选地信号肽；以及

(viii)包含轻链可变区的轻链；并且

其中第一重链包含能够结合第一抗原的抗原结合区；并且其中第二重链的重链可变区和轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且其中第一重链和第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

1.8另外的核酸产物

在另外的方面，本发明提供由一个或多个载体核酸组成的核酸产物，该一个或多个载体核酸编码包含第一抗体重链和与第一重链不同的第二抗体重链的抗体构建体，其中抗体构建体的至少两条多肽链在相同开放阅读框内编码，其中所述开放阅读框内的连续多肽链由包含2A肽的肽接头连接。

上述披露的根据第一方面的核酸产物的特征和实施例也同样适用于该核酸产物。在某些实施例中，这一方面的核酸产物由编码抗体构建体的一个载体核酸组成，该抗体构建体由在相同开放阅读框编码的由包含2A肽的肽接头彼此连接的第一抗体重链和第二抗体重链组成。

2.宿主细胞

在第二方面，本发明提供包含本文所述的核酸产物的宿主细胞。

宿主细胞可以是任何细胞类型，并且特别地是可用于以重组方式产生蛋白质的细胞。宿主细胞特别是能够产生抗体构建体的细胞。在某些实施例中，宿主细胞特别地是哺乳动物细胞。宿主细胞可以特别是啮齿动物细胞或人细胞。在某些实施例中，哺乳动物细胞选自但不限于由衍生自以下动物的细胞组成的组：小鼠，例如COP、L、C127、Sp2/0、NS0、NS1、At20和NIH3T3；大鼠，例如PC12、PC12h、GH3、MtT、YB2/0和Y0；仓鼠，例如BHK、CHO和DHFR基因缺陷CHO；猴，例如COS1、COS3、COS7、CV1和Vero；以及人，例如Hela、HEK293、CAP、视网膜衍生的PER-C6、衍生自二倍体成纤维细胞的细胞、骨髓瘤细胞和HepG2。在特定的实施例中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。宿主细胞可能适合于悬浮培养和/或贴壁培养，并且特别地可用于悬浮培养。

在其中肽接头包含蛋白酶识别位点的实施例中，宿主细胞特别地表达特异性识别并切割所述蛋白酶识别位点的蛋白酶。特别地，肽接头包含弗林蛋白酶识别位点并且宿主细胞表达弗林蛋白酶。蛋白酶可以由宿主细胞固有地表达，或者宿主细胞可以经工程改造以表达蛋白酶。优选地，蛋白酶由宿主细胞固有地表达。

在第五方面，本发明提供产生根据本发明的宿主细胞的方法，该方法包括将本文所述的核酸产物引入宿主细胞中。核酸产物经人工引入宿主细胞中。特别地，通过转染引入核酸产物。这一方面中的转染可能是瞬时的或稳定的，尤其是使用稳定转染。因此，在某些实施例中，宿主细胞包含稳定地整合到其基因组中的核酸产物。

本发明进一步提供核酸产物在宿主细胞转染方面的用途。特别地，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

3.产生方法

在第三方面，本发明提供用于产生抗体构建体的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供根据本发明的第二方面的宿主细胞，

(b)在允许产生抗体构建体的条件下，在细胞培养物中培养宿主细胞，

(c)从细胞培养物中获得抗体构建体，以及

(d)任选地加工抗体构建体。

在某些实施例中，该方法在步骤(a)和(b)之间进一步包括步骤

(a1)用宿主细胞接种细胞培养基以提供细胞培养物，以及

(a2)在允许增加细胞培养物中细胞数量的条件下，在细胞培养物中培养宿主细胞。

培养宿主细胞、增加其细胞数量和表达抗体构建体的合适条件取决于方法中使用的特定宿主细胞、载体和表达盒。本领域技术人员可以容易地确定合适的条件，并且对于多种宿主细胞，这些条件也是本领域已知的。在某些实施例中，宿主细胞中的核酸产物包含一个或多个选择性标记基因。在这些实施例中，步骤(a2)和/或(b)中的培养条件可能包括在细胞培养基中存在相应的选择剂。

在步骤(c)中从细胞培养物中获得抗体构建体特别地包括从细胞培养物中分离抗体构建体。抗体构建体的分离特别是指抗体构建体与细胞培养物的剩余组分的分开。如本文所用的术语“细胞培养物”特别地包括细胞培养基和细胞。在某些实施例中，抗体构建体由宿主细胞分泌。在这些实施例中，抗体构建体从细胞培养基中分离。抗体构建体从细胞培养基的分离可以例如通过层析法进行。用于分离抗体构建体的合适方法和手段是本领域已知的并且可由本领域技术人员容易地应用。

获得的抗体构建体可以任选地进行另外的加工步骤，例如另外的纯化、修饰和/或配制步骤，以产生具有期望质量和组成的抗体构建体。这样的另外的加工步骤和方法通常是本领域已知的。合适的纯化步骤例如包括亲和层析、分子排阻层析、阴离子和/或阳离子交换层析、亲水作用层析和反相层析。另外的步骤可能包括病毒灭活、超滤和渗滤。配制步骤可能包括缓冲液交换、配制组分添加、pH调整和浓度调整。可以使用这些步骤和另外的步骤的任何组合。

在某些实施例中，用于产生抗体构建体的方法进一步包括作为步骤(d)或步骤(d)的一部分提供包含抗体构建体的药物配制品的步骤。提供包含抗体构建体的药物配制品或将抗体构建体配制成药物组合物特别地包括交换包含抗体构建体的组合物的缓冲溶液或缓冲溶液组分。此外，这一步骤可能包括抗体构建体的冻干。特别地，将抗体构建体转移至仅包含药学上可接受的成分的组合物中。

在某些实施例中，与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的多肽链的产生相比，抗体产物的多肽链的产生更均匀。在某些实施例中，与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的产生相比，正确组装的抗体构建体的相对量更高。

在第四方面，本发明进一步提供本文所述的核酸产物或本文所述的宿主细胞在抗体构建体产生方面的用途。用于产生本文所述的抗体构建体的方法的特征和实施例同样适用于该用途。

4.特定实施例

在下文中，描述了本发明的特定实施例。这些实施例可以与本文所述的另外的实施例、特征和实例组合。

实施例1.一种核酸产物，所述核酸产物由一个或多个载体核酸组成，所述一个或多个载体核酸编码包含至少三条不同多肽链的抗体构建体，

其中所述抗体构建体包含抗体重链；并且

其中所述抗体构建体的至少两条不同多肽链在相同开放阅读框内编码，

其中在所述开放阅读框内编码的连续多肽链由包含2A肽的肽接头连接。

实施例2.一种核酸产物，所述核酸产物由一个或多个载体核酸组成，所述一个或多个载体核酸编码包含第一抗体重链和与所述第一重链不同的第二抗体重链的抗体构建体，其中所述抗体构建体的至少两条多肽链在相同开放阅读框内编码，其中所述开放阅读框内的连续多肽链由包含2A肽的肽接头连接。

实施例3.根据实施例1或2所述的核酸产物，其中所述(第一)抗体重链是所述抗体构建体在相同开放阅读框内编码的至少两条不同多肽链中的一条。

实施例4.根据实施例3所述的核酸产物，其中在所述开放阅读框内编码的N-末端多肽链是所述(第一)抗体重链。

实施例5.根据实施例1至4中任一项所述的核酸产物，其由编码所述抗体构建体的一个载体核酸组成。

实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体包含与重链结合的抗体轻链。

实施例7.根据实施例6所述的核酸产物，其中在相同开放阅读框内编码的所述至少两条多肽链包含重链和轻链。

实施例8.根据实施例7所述的核酸产物，其中所述轻链是在所述开放阅读框内编码的第二多肽链。

实施例9.根据实施例8所述的核酸产物，其中所述肽接头连接所述重链的C末端与所述轻链的N末端。

实施例10.根据实施例6至9中任一项所述的核酸产物，其中所述重链包含重链可变区，并且所述轻链包含轻链可变区，其中所述重链可变区与所述轻链可变区形成抗原结合区。

实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体包含第二抗体重链。

实施例12.根据实施例11所述的核酸产物，其中所述第一重链和所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

实施例13.根据实施例11或12所述的核酸产物，其中在所述相同开放阅读框内编码的所述至少两条多肽链包含第一重链和第二重链。

实施例14.根据实施例11或12所述的核酸产物，其中所述第二重链在与编码所述第一重链的第一开放阅读框不同的第二开放阅读框内编码。

实施例15.根据实施例14所述的核酸产物，其中

所述抗体构建体的至少两条不同多肽链在所述第二开放阅读框内编码，

在所述第二开放阅读框内编码的N-末端多肽链是所述第二重链，所述第二重链通过包含2A肽的肽接头连接至在所述第二开放阅读框内编码的另外的多肽链。

实施例16.根据实施例11至15中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体包含与所述第二重链结合的第二轻链。

实施例17.根据实施例16所述的核酸产物，其中所述第二重链和所述第二轻链在包含连接这两条多肽链的肽接头的相同开放阅读框内编码，其中所述肽接头包含2A肽。

实施例18.根据实施例17所述的核酸产物，其中所述肽接头连接所述第二重链的C末端与所述第二轻链的N末端。

实施例19.根据实施例16至18中任一项所述的核酸产物，其中所述第二重链包含重链可变区，并且所述第二轻链包含轻链可变区，其中所述第二重链与所述第二轻链的链可变区形成抗原结合区。

实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条重链包含至少一个重链恒定结构域(CH)，特别是至少CH2或CH3，尤其是CH2和CH3。

实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条重链能够与另一条抗体重链形成同二聚体和/或异二聚体。

实施例22.根据实施例1至21中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条重链包含铰链区。

实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条重链包含CH1结构域。

实施例24.根据实施例1至23中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条重链包含重链可变结构域(VH)。

实施例25.根据实施例1至24中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条重链包含一个或多个另外的多肽部分

实施例26.根据实施例1至25中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条重链包含抗原结合区。

实施例27.根据实施例1至26中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条轻链包含轻链恒定结构域(CL)。

实施例28.根据实施例1至27中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条轻链能够与抗体重链形成异二聚体。

实施例29.根据实施例1至28中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条轻链包含轻链可变结构域(VL)。

实施例30.根据实施例1至29中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条轻链包含一个或多个另外的多肽部分

实施例31.根据实施例1至30中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的至少一条，特别是每条轻链包含抗原结合区。

实施例32.根据实施例1至31中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的第一重链由N末端的信号肽编码。

实施例33.根据实施例32所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的每条重链由N末端的信号肽编码。

实施例34.根据实施例1至33中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的第一轻链由N末端的信号肽编码。

实施例35.根据实施例34所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的每条轻链由N末端的信号肽编码。

实施例36.根据实施例1至35中任一项所述的核酸产物，其中一个或多个载体核酸在第一开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含第一重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含第一轻链可变区的第一轻链；并且

其中所述一个或多个载体核酸在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含第二重链可变区的第二重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含第二轻链可变区的第二轻链；

其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

实施例37.根据实施例1至35中任一项所述的核酸产物，其中所述载体核酸在相同开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含第一重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；

(v)包含第一轻链可变区的第一轻链；

(vi)包含2A肽的接头肽；

(vii)任选地信号肽；

(viii)包含第二重链可变区的第二重链；

(ix)包含2A肽的接头肽；

(x)任选地信号肽；以及

(xi)包含第二轻链可变区的第二轻链；

其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

实施例38.根据实施例1至35中任一项所述的核酸产物，其中所述一个或多个载体核酸在第一开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)包含重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含轻链可变区的轻链；并且

其中所述一个或多个载体核酸在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；以及

(ii)第二重链；并且

其中所述第一重链的所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链包含能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

实施例39.根据实施例1至35中任一项所述的核酸产物，其中所述一个或多个载体核酸在第一开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)第二重链；并且

其中所述一个或多个载体核酸在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；以及

(v)包含轻链可变区的轻链；并且

其中

(a)所述第一重链包含重链可变区，所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且所述第二重链包含能够结合第二抗原的抗原结合区；或者

(b)所述第一重链包含能够结合第一抗原的抗原结合区；并且所述第二重链包含重链可变区，所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

实施例40.根据实施例1至35中任一项所述的核酸产物，其中所述载体核酸在所述开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；

(ii)第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；

(v)包含重链可变区的第二重链；

(vi)包含2A肽的接头肽；

(vii)任选地信号肽；以及

(viii)包含轻链可变区的轻链；并且

其中所述第一重链包含能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链的所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

实施例41.根据实施例1至40中任一项所述的核酸产物，其中所述2A肽衍生自选自由口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、猪捷申病毒-1和明脉扁刺蛾病毒组成的组的病毒。

实施例42.根据实施例1至41中任一项所述的核酸产物，其中所述肽接头进一步包含所述2A肽的蛋白酶识别位点N末端。

实施例43.根据实施例42所述的核酸产物，其中所述蛋白酶识别位点是弗林蛋白酶识别位点。

实施例44.根据实施例1至43中任一项所述的核酸产物，其中所述肽接头包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

实施例45.根据实施例1至44中任一项所述的核酸产物，与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的多肽链的产生相比，所述核酸产物提供抗体构建体的多肽链的更均匀的细胞产生。

实施例46.根据实施例45所述的核酸产物，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过20倍。

实施例47.根据实施例45所述的核酸产物，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过10倍。

实施例48.根据实施例45所述的核酸产物，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过8倍。

实施例49.根据实施例45所述的核酸产物，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过5倍。

实施例50.根据实施例1至49中任一项所述的核酸产物，与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时在抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量相比，所述核酸产物提供在抗体构建体的多肽链表达后更高的正确组装的抗体构建体的相对量。

实施例51.根据实施例50所述的核酸产物，其中在所述抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少5个百分点。

实施例52.根据实施例50所述的核酸产物，其中在所述抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少10个百分点。

实施例53.根据实施例50所述的核酸产物，其中在所述抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少15个百分点。

实施例54.根据实施例50所述的核酸产物，其中在所述抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少20个百分点。

实施例55.根据实施例1至54中任一项所述的核酸产物，其中编码所述抗体构建体的两条或更多条多肽链的开放阅读框是使所述开放阅读框能够表达的表达盒的一部分。

实施例56.根据实施例1至55中任一项所述的核酸产物，其中所述载体核酸是质粒。

实施例57.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施例1至56中任一项所述的核酸产物。

实施例58.根据实施例57所述的宿主细胞，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，尤其是人或啮齿动物细胞，例如CHO细胞。

实施例59.一种用于产生抗体构建体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据实施例57或58所述的宿主细胞，

(b)在允许产生所述抗体构建体的条件下，在细胞培养物中培养所述宿主细胞，

(c)从所述细胞培养物中获得所述抗体构建体，以及

(d)任选地加工所述抗体构建体。

实施例60.根据实施例59所述的方法，其中步骤(c)包括分离所述抗体构建体和/或将所述抗体构建体与所述细胞培养物的剩余组分分开。

实施例61.根据实施例59或60所述的方法，其中步骤(d)包括将所述抗体构建体配制成药物组合物。

实施例62.根据实施例59至61中任一项所述的方法，其中与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的多肽链的产生相比，抗体产物的多肽链的产生更均匀。

实施例63.根据实施例62所述的方法，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过20倍。

实施例64.根据实施例62所述的方法，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过10倍。

实施例65.根据实施例62所述的方法，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过8倍。

实施例66.根据实施例62所述的方法，其中细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过5倍。

实施例67.根据实施例51至54中任一项所述的方法，其中与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的产生相比，正确组装的抗体构建体的相对量更高。

实施例68.根据实施例67所述的方法，其中正确组装的抗体构建体的所述相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少5个百分点。

实施例69.根据实施例67所述的方法，其中正确组装的抗体构建体的所述相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少10个百分点。

实施例70.根据实施例67所述的方法，其中正确组装的抗体构建体的所述相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少15个百分点。

实施例71.根据实施例67所述的方法，其中正确组装的抗体构建体的所述相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少20个百分点。

实施例72.根据实施例1至56中任一项所述的核酸产物或根据实施例57或58所述的宿主细胞用于产生抗体构建体的用途。

实施例73.一种用于产生根据实施例57或58所述的宿主细胞的方法，所述方法包括将根据实施例1至56中任一项所述的核酸产物引入宿主细胞中。

附图说明

图1显示了用于双特异性抗体构建体(bsAb)表达的标准双载体设置的原理，以及使用旋钮入孔(KiH)技术的bsAb的结构。

图2显示了如果使用2A/弗林蛋白酶接头肽以及包含将两条链组合至一个表达盒的两个质粒和两个mRNA的载体设置发生的细胞机制的原理。

图3显示了分子结构概述以及测试用于双特异性抗体表达的标准和2A/弗林蛋白酶载体设置。

图4显示了使用图3中展示的不同载体设置的重链和轻链的相对mRNA水平。

图5显示了使用图3中展示的不同载体设置的双特异性抗体的合并液产率。

图6显示了测试用于双特异性抗体表达的2A/弗林蛋白酶载体设置。

图7显示了使用图6中展示的不同载体设置的重链和轻链的相对mRNA水平。

图8显示了使用图6中展示的不同载体设置的双特异性抗体的合并液产率。

图9显示了三功能抗体构建体(A)的标准(B)和弗林蛋白酶/2A(C)载体设置。

图10显示了使用图9中展示的标准(A)和弗林蛋白酶/2A(B)载体设置的三功能抗体构建体的合并液产率和质量分析(通过SEC和labchip)。显示的是抗体滴度和分别通过SEC和labchip分析获得的主峰百分比。

实例

实例1：标准载体设计和根据本发明的载体设计。

与单克隆抗体相比，开发表达正确组装的双特异性抗体构建体(bsAb)的细胞系的复杂性增加，因为需要表达四条链。两个单独的质粒(每个质粒在单独的表达盒中表达两条轻链(LC)和重链(HC)中的一条)的共转染和共选择可能形成未整合、整合一个或两个质粒或整合数量不相等的两个质粒的不均匀的细胞合并液。此外，各条链的不同转录和翻译效率可能导致各条链的mRNA和蛋白质水平失衡。蛋白质链的不均匀分布会扰乱正确的蛋白质组装，并且各条链的进入会形成不需要的物质，例如错配的抗体构建体、半组装的双特异性抗体和同二聚体，使纯化过程复杂化。标准载体设置和产生过程在图1中展示。

在新开发的载体设置中，双特异性抗体的一个臂的重链和轻链在一个开放阅读框内编码，由包含弗林蛋白酶识别位点和2A肽的接头肽隔开。转录形成一个从一个质粒编码链1-2AF-链2(HC1-旋钮–弗林蛋白酶/2A接头–LC1)的mRNA和另一个从第二质粒编码链3-2AF-链4(HC2-孔–弗林蛋白酶/2A接头–LC2)的mRNA(参见图2)。在2A肽翻译后通过切割2A肽(1)获得两个不同的蛋白质。来自一个mRNA的对应轻链和重链的共翻译有利于正确的链配对和蛋白质组装。弗林蛋白酶(2)在高尔基体中切割N末端2A肽的剩余氨基酸。羧肽酶D(3)切割重链的C末端赖氨酸以及剩余的弗林蛋白酶切割位点，并且信号肽肽酶(4)切割2A肽的剩余C末端脯氨酸连同轻链的信号肽。

如以下实例所示，发明的载体设计是优越的：

1)将从一个mRNA的各条链的表达组合，使得mRNA和蛋白质水平均衡，并克服表达失衡。

2)合并液产率相当。

3)如果LC1和HC1在一个单一mRNA上编码，并且LC2和HC2在第二单一mRNA上编码，以及如果所有4条链都在1个单一mRNA上编码，则正确配对的双特异性抗体构建体的百分比增加。

4)如果2个蛋白质以HC-弗林蛋白酶/2A-LC的顺序表达，则重链和轻链的N和C末端会得到正确加工。如果弗林蛋白酶/2A肽位于轻链的C末端，则观察到弗林蛋白酶识别位点剩余的不同氨基酸延伸(R、RK和RKR)。

5)采用旋钮入孔技术(KiH)的双特异性抗体构建体的错配物质百分比降低。

实例2：标准和不同弗林蛋白酶/2A载体设计之间的比较。

单个载体可以编码若干条链，允许转染和选择一个质粒，而不是共转染两个单独的质粒。单个质粒的转染和选择可增加获得更均匀的合并液的概率：细胞整合了质粒或者未整合。共转染和共选择可能形成更不均匀的合并液：细胞未整合、整合一个或两个质粒，或整合不相等数量的两个质粒。

将四种不同的弗林蛋白酶/2A载体设计与标准载体设计进行了比较。根据标准设计，双特异性抗体构建体的四条不同多肽链中的每一条都在单独的开放阅读框中编码，从而产生四个单独的mRNA。双特异性抗体每个臂的重链和轻链对的表达盒存在于单个质粒上，因此宿主细胞用两个质粒转染(“2个质粒，4个mRNA”；参见图3，“STD”)。

在四种弗林蛋白酶/2A载体设计中的两种中，每个重链和轻链对都在一个开放阅读框中编码，首先编码重链，然后编码弗林蛋白酶/2A接头，最后编码轻链。这两个开放阅读框存在于单独的质粒上(“2个质粒，2个mRNA”)或者存在于相同的质粒上(“1个质粒，2个mRNA”)。在其他两种弗林蛋白酶/2A载体设计中，双特异性抗体的所有多肽链都在相同开放阅读框内以HC1-弗林蛋白酶/2A-LC1-弗林蛋白酶/2A-HC2-弗林蛋白酶/2A-LC2的顺序编码(“1个质粒”，“1个mRNA”；参见图3，“2A/弗林蛋白酶”)。在这两种不同的设置中，双特异性抗体两个臂的编码区被调换。

将相应的质粒转移至CHO细胞中以产生双特异性抗体。测定了mRNA的表达以及正确组装和错配的双特异性抗体构建体的产生

图4中的结果表明，对于标准载体设置，不同多肽链的mRNA水平高度失衡。“2个质粒、2个mRNA设置”改善了平衡，而只有1个质粒的设置显示出更加平衡的mRNA水平。1个质粒设置的产率也明显提高(参见图5)。在1个质粒、1个mRNA载体设计中，双特异性抗体的不同臂在开放阅读框内的编码顺序可能对产率有影响。

双特异性抗体构建体的正确组装以及错配构建体、同二聚体和半抗体的形成总结在表1中：

表1

*仅半定量，因为无法实现所有物质的完全分离(UV)。

通过组合UV面积和MS强度计算所有值(％)。

**通过完整LC-MS的正确双特异性也可能包括完整LC交换物质

表1显示了用于标准载体设计(“STD”)和不同弗林蛋白酶/2A载体设置(“2AF”)的蛋白A捕获材料的质谱数据。与标准载体设置相比，所有弗林蛋白酶/2A载体设置的正确组装双特异性抗体的百分比增加。检测到在一个mRNA和载体上编码所有4条链的弗林蛋白酶/2A载体设置的正确组装的双特异性抗体的百分比最高。然而，观察到在C末端具有弗林蛋白酶/2A肽的轻链的轻链延伸。

实例3：使用在1个质粒上具有2个mRNA的多种弗林蛋白酶/2A载体设置的双特异性抗体构建体的产生的评价。

使用标准载体设置和使用不同设计的“1个质粒，2个mRNA”弗林蛋白酶/2A载体设置产生双特异性抗体构建体。双特异性抗体的每个臂都在一个开放阅读框中编码，重链位于N末端，随后是弗林蛋白酶/2A接头肽和轻链。设计了两种弗林蛋白酶/2A载体设置，一种是编码第一臂的开放阅读框位于编码第二臂的开放阅读框的5′，另一种是相反的顺序。

对于一些标准载体设置，不同多肽链的mRNA水平高度失衡(参见图7，“STD 2个质粒4个mRNA”)。相比之下，对于弗林蛋白酶/2A载体设置，mRNA水平均衡。所有载体设置的产率相当(参见图8)。

双特异性抗体构建体的正确组装以及错配构建体、同二聚体和半抗体的形成总结在表2中：

表2

*仅半定量，因为无法实现所有物质的完全分离(UV)。

通过组合UV面积和MS强度计算所有值(％)。

**通过完整LC-MS的正确双特异性也可能包括完整LC交换物质

表2显示了比较不同的标准载体设计(“STD”)和弗林蛋白酶/2A载体设置(“2AF”)的蛋白A捕获材料的质谱数据。弗林蛋白酶/2AF“1个质粒，2个mRNA”载体设置的表达增加了正确组装的双特异性抗体的百分比，并降低了测试候选物的错配物质的百分比。结果还显示，在弗林蛋白酶/2A载体设置中实现了正确的轻链配对，因为这些设置产生的错配轻链少于10％，而标准设置超过30％。推定地，这一结果的原因是重链-轻链对在细胞内近距离产生，因为它们由相同的mRNA编码。

较低的错配百分比减少了纯化过程所需的努力，并且将纯化过程中无法去除的完全交换的轻链物质的可能性最小化。

实例4：使用不同的弗林蛋白酶/2A载体设置的另一种抗体构建体的产生的评价。

还测试了使用新弗林蛋白酶/2A载体设置的非标准抗体构建体的表达。示例性抗体构建体包含一个具有重链和轻链的臂，该重链和该轻链形成对第一抗原(anti1)特异的正常抗原结合区，其中针对第二抗原(anti2)的scFv片段在该重链的CH1和铰链区之间融合。第二臂是包含铰链、CH2和CH3的重链恒定区，使用旋钮入孔技术将该臂连接到第一臂，并且其中细胞黏附分子融合到铰链区的N末端(参见图9A)。设计了其中两种构建体，不同之处在于CH3结构域的旋钮和孔突变(抗体构建体AC3：臂1-旋钮/臂2-孔，抗体构建体AC4：臂1-孔/臂2-旋钮)。

根据标准载体设置，使用了包含第一臂的轻链和重链的表达盒的一个质粒和包含第二臂的表达盒的一个质粒(参见图9B)。在弗林蛋白酶/2A载体设置中，仅使用了具有一个表达盒或两个表达盒的一个质粒。在只有一个开放阅读框的设计中，编码区从5'到3'排序为HC2-弗林蛋白酶/2A-HC1-弗林蛋白酶/2A-LC1。在具有两个开放阅读框的设计中，弗林蛋白酶/2A接头位于HC2和HC1之间或HC1和LC1之间(参见图9C)。

用质粒转染不同的CHO细胞系，并在标准条件下产生抗体构建体。对于标准载体设置，两种质粒以1:1的比率和1:2的比率进行转染。根据转染期间使用的质粒比率和使用的宿主细胞系，两种候选物的标准载体设置的合并液产率在0.5和0.75g/L之间。通过SEC和labchip分析质量，并显示主峰的百分比(参见图10A)。

图10B显示，与使用标准方法生成的合并液相比，弗林蛋白酶/2A载体设置的合并液产率提高。通过SEC和labchip分析质量。与标准方法相比，使用弗林蛋白酶/2A载体设置的第一旋钮入孔设计的主峰百分比增加至79％(SEC)和87％(Labchip)，第二旋钮入孔设计的主峰百分比增加至79％(SEC)和89％(Labchip)。

这些数据表明，使用弗林蛋白酶/2A载体设计提高了抗体构建体的产率和正确组装。

实例5：材料和方法。

在实例1至4中使用了以下材料和方法。

1.表达载体构建

实例中使用的载体由以下元件组成：驱动抗体构建体组装所需各个基因的表达的hCMV启动子/增强子、多腺苷酸化信号(polyA)、作为选择标记的叶酸受体和DHFR基因、复制的大肠杆菌起点(CoIE ori)和提供氨苄西林(amp)抗性以启动细菌中扩增的β-内酰胺酶基因。评价了不同的质粒设置，并在图中提供了更多详细信息。

2.细胞系、培养、转染和选择

使用两种不同的亲本CHO细胞系作为抗体构建体产生的宿主细胞系。宿主细胞系衍生自CHO-K1细胞系。使用来自CHO系的单个小瓶制备重组细胞系。CHO细胞系在150rpm、10％ CO₂、36.5℃条件下的非加湿柜式摇床中的摇瓶中，悬浮于具有专利的化学成分确定的培养基中进行培养。通过自动化系统(ViCell，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))监测细胞活力和生长速率。每周将细胞传代2-3次至新鲜培养基中，并维持在对数生长期。

通过电穿孔(Amaxa Nucleofection系统，龙沙公司(Lonza)，德国)转染编码抗体构建体的SwaI线性化表达质粒。根据制造商的说明，转染反应在化学成分确定的培养基中进行。用于转染的亲本CHO细胞处于指数生长期，具有高于95％的细胞活力。每次转染使用5x 10⁶个细胞进行转染。转染后立即将细胞转移至含有化学成分确定的培养基的摇瓶中。在开始选择过程之前，将细胞合并液在36.5℃和10％ CO2条件下孵育48小时。

如上所述，使用由各个表达载体编码的选择标记进行选择程序。两种蛋白质(FoIR和DHFR)都参与相同的分子途径；FolR将叶酸以及叶酸类似物MTX运输到细胞中，DHFR将其转化为用于嘌呤和甲硫氨酸合成的重要前体。将它们组合作为选择原理，可以采用特定的强选择方案来富集表达两种重组蛋白的重组细胞。

在低叶酸条件下转染和生长后48小时，通过向化学成分确定的培养基中添加10nMMTX来施加另外的选择压力。回收合并液后，将细胞冷冻在补充7.5％ DMSO的培养基中，并制备细胞沉淀。

3.通过定量实时PCR进行基因表达分析

根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy微型试剂盒进行RNA提取。对于实时qPCR，使用High Capacity RNA-to-cDNA预混合物(应用生物系统公司(Applied Biosystems))从200ng/μl稀释的RNA来合成cDNA，并使用QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))一式三份分析10x稀释的cDNA。作为归一化的内源性对照，扩增了GAPDH。使用ABI7900HT序列检测系统进行了扩增和分析。为了计算用于样品比较的基因表达的相对量(RQ)，使用了比较性2^-ΔΔCt方法，并对数据进行了归一化。

4.上游加工

选择后，在摇瓶加料分批培养物或tube spin生物反应器中产生材料。以4E5vc/ml的细胞接种密度接种加料分批培养物(从第3天开始添加具有专利的补料溶液，第5天培养温度变为33℃)。在培养期间进行过程控制，以监测抗体构建体的浓度。在14天的时间培养单个培养物。在培养过程结束时，通过离心将细胞与培养物上清液分离，然后在进一步下游加工之前进行除菌过滤。通过蛋白A HPLC测定细胞培养上清液中选定合并液的体积产率，以确定携带Fc部分的所有类型的产物和相关杂质。

5.在MabSelect^TMSuRe^TM上通过亲和液相层析捕获

通过MabSelect^TMSuRe^TM上的亲和液相层析(ALC)步骤从无细胞上清液中捕获携带Fc部分的抗体构建体和潜在抗体构建体变体。

在室温下进行层析。上样前用20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.0)平衡柱。为了从产品(和产品变体)中去除非特异性结合杂质，例如宿主细胞蛋白(HCP)、培养基组分和DNA，在将无细胞上清液上样到ALC柱上后使用250mM精氨酸-HCl、1M NaCl、88mM NaOH(pH 9.0)然后是平衡缓冲液洗涤层析柱。通过使用50mM乙酸(pH 3.0)，从层析柱洗脱抗体构建体和潜在的抗体构建体变体。分别用0.1或1M Tris、或0.5M Bis-Tris将ALC洗脱液的pH调整至约pH5.0，然后储存于2-8℃进行分析评估。

6.分析表征和纯度评估

通过不同的分析方法仔细评价了合并液中的蛋白A捕获材料，以判断产物特性和质量参数。

(a)完整抗体构建体和变体的LC-MS筛选

将100ug蛋白A纯化的抗体构建体样品在96孔板中冻干并溶解于100ul 50nMTris-HCl(pH 7.5)缓冲液中。在37℃下通过PNGaseF(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs))对样品去糖基化18小时。在连接至Vion Q-TOF质谱仪(沃特世公司(Waters))的UPLC(沃特世公司(Waters))上使用MassPREP Micro脱盐柱2 1x 5mm(沃特世公司(Waters))在80℃下通过LC-ESI-MS测量样品。以0.3ml/min应用线性梯度，其中流动相A：0.1甲酸水溶液，流动相B：0.1％ FA乙腈溶液：0-2min 5％ B，2-12min 5％-90％ B。MS参数：ESI+Resolution模式，毛细管电压3kV，采样锥40V，源温度150℃，脱溶剂气温度400℃。使用Genedata MS refiner软件通过自动MaxEnt1去卷积处理数据。抗体构建体物质和错配变体的鉴别和相对定量基于与理论质量的匹配以及去卷积质谱的对应相对峰强度。

(b)Labchip

根据制造商的说明，使用来自卡培拉生命科学(Caliper LifeSciences)的HTProtein Express试剂盒和HT Protein Express LabChip进行非还原Labchip运行。通过向5uL样品(1mg/ml)中添加35uL IAM缓冲液(300uL 250mM IAM于3mL Protein Express样品缓冲液中)制备蛋白A纯化样品。在卡培拉生命科学(Caliper LifeSciences)的LabChipGXII上运行Labchip之前，将样品加热至70℃ 10min，然后添加70uL水。

(c)分子排阻层析

将蛋白A纯化的样品上样至Waters UPLC BEH200(Waters#186005225，1.7um，4.6mm x 150mm)SEC柱，孔径200A。流动相是50mM磷酸钠溶液(pH 6.0)。流速为0 4ml/min。柱温为30℃。在210nm处记录UV。使用Chromeleon^TM7(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))进行数据采集和峰积分。

序列表

序列表

<110> 诺华股份有限公司（Novartis Pharma AG）

<120> 抗体构建体的表达技术

<130> PAT059005-WO-PCT

<150> US 63/117,379

<151> 2020-11-23

<160> 25

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

1 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

20 25 30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

35 40 45

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

50 55 60

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

65 70 75 80

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

85 90 95

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

100 105 110

Lys

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 5

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 6

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A肽共有序列

<220>

<221> 变体

<222> 2

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> 4

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 8

Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A肽共有序列

<220>

<221> 变体

<222> 2

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> 3

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> 4

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> 9

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 9

Leu Xaa Xaa Xaa Gly Asp Val Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 口蹄疫病毒的2A肽

<400> 10

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

1 5 10 15

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 11

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 口蹄疫病毒的2A肽

<400> 11

Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu

1 5 10 15

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

20 25 30

Pro

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪捷申病毒-1的2A肽

<400> 12

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 马鼻炎A病毒的2A肽

<400> 13

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 14

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 明脉扁刺蛾病毒的2A肽

<400> 14

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 明脉扁刺蛾病毒的2A肽

<400> 15

Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 16

<211> 25

<212> PRT

<213> 紫色球海胆（Strongylocentrotus purpuratus）

<400> 16

Asp Gly Phe Cys Ile Leu Tyr Leu Leu Leu Ile Leu Leu Met Arg Ser

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 大堡礁海绵（Amphimedon queenslandica）

<400> 17

Leu Leu Cys Phe Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Leu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 大堡礁海绵（Amphimedon queenslandica）

<400> 18

His His Phe Met Phe Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly Asp Ile Glu Leu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> 囊舌虫（Saccoglossus kowalevskii）

<400> 19

Trp Phe Leu Val Leu Leu Ser Phe Ile Leu Ser Gly Asp Ile Glu Val

1 5 10 15

Asn Pro Gly

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 佛罗里达文昌鱼（Branchiostoma floridae）

<400> 20

Lys Asn Cys Ala Met Tyr Met Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 佛罗里达文昌鱼（Branchiostoma floridae）

<400> 21

Met Val Ile Ser Gln Leu Met Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 弗林蛋白酶识别位点

<220>

<221> 变体

<222> 2

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> 3

<223> Xaa可以是Arg或Lys

<400> 22

Arg Xaa Xaa Arg

1

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 弗林蛋白酶识别位点

<400> 23

Arg Lys Arg Arg

1

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 弗林蛋白酶识别位点

<400> 24

Arg Arg Lys Arg

1

<210> 25

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 弗林蛋白酶/2A肽接头

<400> 25

Arg Lys Arg Arg Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val

1 5 10 15

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

20 25 30

Ser Asn Pro Gly Pro

35

Claims (21)

1.一种核酸产物，所述核酸产物由一个或多个载体核酸组成，所述一个或多个载体核酸编码包含至少三条不同多肽链的抗体构建体，

其中所述抗体构建体包含抗体重链；并且

其中所述抗体构建体的至少两条不同多肽链在相同开放阅读框内编码，

其中在所述开放阅读框内编码的连续多肽链由包含2A肽的肽接头连接。

2.根据权利要求1所述的核酸产物，所述核酸产物由编码所述抗体构建体的一个载体核酸组成。

3.根据权利要求1或2所述的核酸产物，其中所述抗体重链是所述抗体构建体在所述相同开放阅读框内编码的所述至少两条不同多肽链中的一条，并且任选地，所述抗体重链是在所述开放阅读框中编码的N-末端多肽链。

4.根据权利要求1或3中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体包含与所述抗体重链结合的抗体轻链，其中所述抗体轻链任选地

·在所述开放阅读框内编码；并且/或者

·与所述抗体重链一起在所述开放阅读框内编码；并且/或者

·包含轻链可变区，并且所述抗体重链包含重链可变区，其中所述重链可变区与轻链可变区形成抗原结合区。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体包含第二抗体重链，其中所述第二抗体重链任选地

·结合至所述抗体构建体中的第一抗体重链，任选地使用旋钮入孔技术，并且/或者

·在与第一重链相同的开放阅读框内编码，或者在与编码第一重链的第一开放阅读框不同的第二开放阅读框内编码。

6.根据权利要求5所述的核酸产物，其中所述抗体构建体包含与所述第二抗体重链结合的第二抗体轻链，其中所述第二抗体轻链任选地

·在与第二重链相同的开放阅读框内编码，其中所述开放阅读框含有包含2A肽的肽接头，所述肽接头连接所述第二重链的C末端与第二轻链的N末端，并且/或者

·包含轻链可变区，且所述第二抗体重链包含重链可变区，其中所述重链可变区与所述轻链可变区形成抗原结合区。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的每条重链独立地具有以下特征中的一个或多个：

(i)其包含衍生自天然人抗体的抗体结构域，尤其是衍生自天然人IgG抗体的γ型重链的抗体结构域；

(ii)其包含至少一个重链恒定结构域(CH)，特别是至少一个CH2结构域或CH3结构域，尤其是CH2结构域和CH3结构域；

(iii)其能够与另一条抗体重链形成同二聚体和/或异二聚体；

(iv)其包含铰链区；

(v)其包含CH1结构域；

(vi)其包含重链可变结构域(VH)；以及

(vii)其包含一个或多个另外的多肽部分。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的每条轻链独立地具有以下特征中的一个或多个：

(i)其包含衍生自天然人抗体的抗体结构域，尤其是衍生自天然人抗体的κ或λ型轻链的抗体结构域；

(ii)其包含轻链恒定结构域(CL)；

(iii)其能够与抗体重链形成异二聚体；

(iv)其包含轻链可变结构域(VL)；以及

(v)其包含一个或多个另外的多肽部分。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸产物，其中所述抗体构建体的第一重链，且特别是所述抗体构建体的每条重链，由N末端的信号肽编码；并且/或者其中所述抗体构建体的第一轻链，且特别是所述抗体构建体的每条轻链，由N末端的信号肽编码。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸产物，其中一个或多个载体核酸编码

(a)在第一开放阅读框内，以从N末端到C末端的方向，

(i)信号肽；

(ii)包含第一重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含第一轻链可变区的第一轻链；以及

在第二开放阅读框内，以从N末端到C末端的方向，

(i)信号肽；

(ii)包含第二重链可变区的第二重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含第二轻链可变区的第二轻链；

其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合；或者

(b)在所述相同开放阅读框内，以从N末端到C末端的方向，

(i)信号肽；

(ii)包含第一重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；

(v)包含第一轻链可变区的第一轻链；

(vi)包含2A肽的接头肽；

(vii)任选地信号肽；

(viii)包含第二重链可变区的第二重链；

(ix)包含2A肽的接头肽；

(x)任选地信号肽；以及

(xi)包含第二轻链可变区的第二轻链；

其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合；或者

(c)在第一开放阅读框内，以从N末端到C末端的方向，

(i)信号肽；

(ii)包含重链可变区的第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)包含轻链可变区的轻链；并且

其中所述一个或多个载体核酸在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；以及

(ii)第二重链；并且

其中所述第一重链的所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链包含能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合；或者

(d)在第一开放阅读框内，以从N末端到C末端的方向，

(i)信号肽；

(ii)第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；以及

(v)第二重链；并且

其中所述一个或多个载体核酸在第二开放阅读框内以从N末端到C末端的方向编码，

(i)信号肽；以及

(v)包含轻链可变区的轻链；并且

其中所述第一重链包含重链可变区，所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第一抗原的抗原结合区；并且所述第二重链包含能够结合第二抗原的抗原结合区，或者所述第一重链包含能够结合第一抗原的抗原结合区；并且所述第二重链包含重链可变区，所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合；或者

(e)在所述开放阅读框内，以从N末端到C末端的方向，

(i)信号肽；

(ii)第一重链；

(iii)包含2A肽的接头肽；

(iv)任选地信号肽；

(v)包含重链可变区的第二重链；

(vi)包含2A肽的接头肽；

(vii)任选地信号肽；以及

(viii)包含轻链可变区的轻链；并且

其中所述第一重链包含能够结合第一抗原的抗原结合区；并且

其中所述第二重链的所述重链可变区与所述轻链可变区形成能够结合第二抗原的抗原结合区；并且

其中所述第一重链与所述第二重链使用旋钮入孔技术彼此结合。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸产物，其中所述肽接头具有以下特征中的一个或多个：

(i)其包含2A肽，所述2A肽衍生自选自由口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、猪捷申病毒-1和明脉扁刺蛾病毒组成的组的病毒；

(ii)其进一步包含所述2A肽N末端的蛋白酶识别位点，其中所述蛋白酶识别位点特别地是弗林蛋白酶识别位点；

(iii)其包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸产物，

(i)与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的多肽链的细胞产生相比，所述核酸产物提供抗体构建体的多肽链的更均匀的细胞产生，其中任选地细胞中编码所述抗体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过10倍；并且/或者

(ii)与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时在抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量相比，所述核酸产物提供在抗体构建体的多肽链表达后更高的正确组装的抗体构建体的相对量，其中任选地在所述抗体构建体的多肽链表达后正确组装的抗体构建体的相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少10个百分点。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的核酸产物，其中编码所述抗体构建体的两条或更多条多肽链的开放阅读框是使所述开放阅读框能够表达的表达盒的一部分。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的核酸产物，其中所述载体核酸是质粒。

15.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1至14中任一项所述的核酸产物。

16.根据权利要求15所述的宿主细胞，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，尤其是人或啮齿动物细胞，特别是CHO细胞。

17.一种用于产生抗体构建体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据权利要求15或16所述的宿主细胞，

(b)在允许产生所述抗体构建体的条件下，在细胞培养物中培养所述宿主细胞，

(c)从所述细胞培养物中获得所述抗体构建体，以及

(d)任选地加工所述抗体构建体。

18.根据权利要求17所述的方法，其中

·步骤(c)包括分离所述抗体构建体和/或将所述抗体构建体与所述细胞培养物的剩余组分分开；并且/或者

·步骤(d)包括将所述抗体构建体配制成药物组合物。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中

(i)与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的多肽链的产生相比，抗体产物的多肽链的产生更均匀，其中任选地细胞中编码所述抗体构建体的不同多肽链的mRNA的量相差不超过10倍；并且/或者

(ii)与使用其中抗体构建体的每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时抗体构建体的产生相比，正确组装的抗体构建体的相对量更高，其中任选地所述正确组装的抗体构建体的相对量比使用其中每条多肽链在单独的开放阅读框内编码的核酸产物时正确组装的抗体构建体的相对量高至少10个百分点。

20.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸产物或根据权利要求15或16所述的宿主细胞用于产生抗体构建体的用途。

21.一种产生根据权利要求15或16所述的宿主细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求1至14中任一项所述的核酸产物引入宿主细胞中。