CN117402885A - 编码泽贝妥单抗的核酸分子及其应用 - Google Patents

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CN117402885A CN202311318918.6A CN202311318918A CN117402885A CN 117402885 A CN117402885 A CN 117402885A CN 202311318918 A CN202311318918 A CN 202311318918A CN 117402885 A CN117402885 A CN 117402885A
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Abstract

本发明属于生物学领域，涉及编码泽贝妥单抗的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体以及表达方法，其中，所述核酸分子包含针对表达细胞所优化的密码子。利用本发明的核酸分子，能够提高泽贝妥单抗在细胞中的表达量，提升泽贝妥单抗的产量，降低生产成本。

Description

编码泽贝妥单抗的核酸分子及其应用
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及编码泽贝妥单抗的核酸分子。
背景技术
泽贝妥单抗(又称HS006)是靶向CD20的单克隆抗体，它能与B细胞表面CD20抗原特异性结合，通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)等，快速、彻底、持久并可逆地清除B细胞。
临床前研究数据表明，相比于其它同类CD20抗体，泽贝妥单抗介导的细胞毒性效应(ADCC)更强，同时具有更大的稳态分布容积，能够对B细胞产生更持久的清除作用，从而发挥更好的药物作用。泽贝妥单抗已被批准已用于治疗CD20阳性弥漫大B细胞淋巴瘤，为淋巴瘤患者提供了新的选择。
但现有的生产泽贝妥单抗的细胞表达量有限，极大影响了泽贝妥的产量。因此，如何提高泽贝妥单抗的产量是本领域亟需解决的一大问题。
发明内容
本发明的目的是对泽贝妥单抗的密码子进行优化，以提高细胞中的单抗表达量。
在第一个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，以及编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中：
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:22所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:23所示，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ IDNO:26所示；或者
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:27所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:28所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:29所示，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:30所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:31所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ IDNO:32所示。
在一些实施方案中，前述的核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链可变区和轻链可变区的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的所述核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链可变区和轻链可变区的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链和轻链的核酸序列，其中：
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与其具有至少85％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链和轻链的核酸序列，其中：
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:18所示，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在第二个方面，本发明提供一种重组载体，其包含本发明的核酸分子。
在一些实施方案中，所述重组载体的出发载体是表达载体。
在一些实施方案中，所述重组载体的出发载体是pcDNA3.4-TOPO载体。
在第三个方面，本发明提供一种表达泽贝妥单抗的载体系统，其包含第一载体和第二载体，其中：
第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，其中：
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:22所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:23所示；或者
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:27所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:28所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:29所示；和
第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中：
编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:26所示；或者
编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:30所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:31所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:32所示。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，其中，编码HCDR1的核酸序列如SEQID NO:21所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:22所示，和编码HCDR3的核酸序列如SEQID NO:23所示；和
第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:26所示。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，其中，编码HCDR1的核酸序列如SEQID NO:27所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:28所示，和编码HCDR3的核酸序列如SEQID NO:29所示；和
第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:30所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:31所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:32所示。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19所示，或与SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:19具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20所示，或与SEQID NO:16或SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，或与SEQ ID NO:19具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示，或与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链的核酸序列，其中：
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18所示，或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链的核酸序列，其中：
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与SEQ ID NO:13具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:14具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，前述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:18所示，或与SEQ ID NO:18具有至少85％、86％、87％、88％、89％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在第四个方面，本发明提供一种重组细胞，包含本发明的核酸分子或重组载体或表达泽贝妥单抗的载体系统。
在一些实施方案中，所述重组细胞经转染本发明的表达泽贝妥单抗的载体系统获得。
在一些实施方案中，所述重组细胞的宿主细胞为CHO细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞的宿主细胞为CHO-K1细胞。
在第五个方面，提供本发明的核酸分子、重组载体、泽贝妥单抗的载体系统或重组细胞在制备泽贝妥单抗中的应用。
在第六个方面，提供一种制备泽贝妥单抗的方法，包括培养本发明的重组细胞使泽贝妥单抗表达。优选地，所述方法还包括抗体的纯化和回收。
在第七个方面，提供一种制备泽贝妥单抗的方法，其包含如下步骤：
a.将本发明前述的核酸分子、重组载体或表达泽贝妥单抗的载体系统导入至宿主细胞中；
b.培养宿主细胞使泽贝妥单抗表达；以及可选地，
c.纯化和回收泽贝妥单抗。可以利用本领域已知的任意方法将核酸分子、重组载体或载体系统导入宿主细胞中。本领域技术人员公知这样的操作，并能够使其表达泽贝妥单抗。
例如，可以利用以下方式导入表达泽贝妥单抗的载体系统：
在一种实施方式中，将本发明所述的表达泽贝妥单抗的载体系统中的第一载体和第二载体同时导入至宿主细胞中。
在一种实施方式中，将本发明所述的表达泽贝妥单抗的载体系统中的第一载体和第二载体顺序地导入至宿主细胞中：
先将本发明所述的表达泽贝妥单抗的载体系统中的第一载体导入至宿主细胞中，然后将所述的表达泽贝妥单抗的载体系统中的第二载体转染至相同的宿主细胞中；或者
先将本发明所述的表达泽贝妥单抗的载体系统中的第二载体导入至宿主细胞中，然后将所述的表达泽贝妥单抗的载体系统中的第一载体转染至相同的宿主细胞中。
本发明在不改变泽贝妥单抗氨基酸序列同时不影响泽贝妥单抗的性能的情况下，优化了表达这些氨基酸的密码子，使得优化后的核酸分子在宿主细胞中表达量明显提高，能够大大提升泽贝妥单抗的产量，降低了生产成本，并且提高了生产抗体的质量。
附图说明
图1为HS006重链表达载体结构示意图；
图2为HS006轻链表达载体结构示意图；
图3为实施例6的不同密码子表达量结果图。
具体实施方式
定义
本发明中，术语“抗体”是能特异识别并结合抗原的免疫球蛋白，其涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、双特异抗体或抗体片段。特别地，本发明的泽贝妥单抗(HS006单抗)的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；重链的三个CDR序列分别如SEQ ID NO:5、6、7所示，轻链的三个CDR序列分别如SEQ ID NO:8、9、10所示。
术语“可变区”指识别并特异结合抗原表位的抗体重链或轻链的结构域。
CDR区或称“互补决定区”指抗体可变区中在序列上高变并形成在结构上确定的环和/或含有抗原接触氨基酸残基的区域。CDR主要负责抗体与抗原表位的结合，决定了抗体的特异性。在一个给定的重链或轻链可变区氨基酸序列中，各CDR的具体氨基酸序列使用许多公知的编号规则的任一种或其组合确定，所述编号规则包括例如Kabat、Contact、AbM和Chothia。
本发明中，“同一性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的氨基酸(或碱基)相同。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性百分比或序列同一性，比如Ausubel等(2007)在Current Protocols inMolecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST。特别地，程序是BLASTN和BLASTP。
本发明中，“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。本发明的核酸分子可以是分离的核酸分子，表示从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子，如通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本发明的核酸分子不限于所示出的序列，还包括其互补序列以及对核酸分子所做的本领域公知的修饰。
本发明中，“表达细胞”指能够用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞，也可以称为“宿主细胞”。表达细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当表达细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。表达细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的表达细胞包括但不限于CHO细胞例如CHO-K1细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞等。
在本发明中，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的表达细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入表达细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入至适当的表达细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入表达细胞基因组的表达载体。可从商业获得的表达载体，特别是在哺乳动物细胞中表达者，例如pIRES(来自Clontech，PaloAlto，USA)、pCI-neo载体(来自Promega，Madison，USA)、pCMV-Script(来自Stratagene，LaJolla，USA)和pCDNA载体(来自Invitrogen，Paisley，UK)。
本发明中，“密码子优化”是一种通过增加靶基因的翻译效率来提高生物体内蛋白质表达水平的技术。通过避免稀有密码子、利用偏爱密码子、简化mRNA的二级结构、优化重复序列、消除限制酶切位点、调整GC含量等方法重新设计蛋白的表达序列，以提高翻译效率，进而提高蛋白表达水平。
本发明中，“密码子”具有本领域公知的含义，表示mRNA(或DNA)上的三联体核苷酸残基组，每个三联体编码着一个特定的氨基酸。密码子具有简并性，除了甲硫氨酸和色氨酸外，每一个氨基酸都至少有两个密码子，不同物种对同一氨基酸的多个密码子具有偏好性。
“载体系统”是指包含两个或多个载体的组合。载体系统通常是用于表达特定的抗体或融合蛋白，如在本发明中用于表达泽贝妥单抗。本领域技术人员公知，可以使用双载体表达系统表达抗体。通常，在双载体表达系统中，包含表达抗体轻链的第一载体和表达抗体重链的第二载体，将第一载体和第二载体同时或顺序的导入至宿主细胞中，进行抗体表达。
将核酸或载体导入细胞的方法为技术人员所熟知，如电穿孔、注射、转染和/或转化。
“宿主细胞”、“细胞系”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞及其后代，而不考虑后代的传代次数。后代在核酸方面允许与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变，只要带有突变的后代与原代细胞具有相同的期望功能或活性即可。
宿主细胞不能发育成完整的动物或植物个体。
宿主细胞包括原核和真核宿主细胞。真核宿主细胞包括但不限于：哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。哺乳动物细胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、山羊、牛、马、仓鼠细胞。示例性宿主细胞包括但不限于CHO、NSO、COS、SP2细胞、HeLa细胞、BHK细胞、人肝细胞癌细胞、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞。真菌细胞包括酵母，例如但不限于毕赤酵母属、酿酒酵母属、多形汉逊酵母属、克鲁维酵母属。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生。说明书及权利要求书中所使用的单数形式“一个”，“一种”包含对应的复数指代，除非内容中另行清楚规定。
以下将通过具体实施方式来详细介绍本发明，但本发明的内容不限于此。任何基于本发明思路的技术方案都落入本发明的范围内。
如无具体说明，以下实施例中使用的仪器和试剂都是本领域常用的，可以通过商购途径获得；所使用的方法为本领域常规技术方法，本领域技术人员根据实施例记载的内容可以毫无疑问地重复所述实验。
实施例1.泽贝妥单抗核酸序列的优化
泽贝妥单抗的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:1、3所示)被反转录以产生编码相同原始氨基酸序列的各种核苷酸序列。使用不同的密码子来生成在所选宿主(例如CHO细胞)中具有最高理论表达水平的多个核苷酸序列，以供后续筛选。经过多系统多轮优化，最终获得了2种序列不同的高表达核酸序列，分别称为JSR和GWZ，相关序列如下：
泽贝妥单抗重链：
EVQLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKA TLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)
泽贝妥单抗重链可变区：
EVQLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKA TLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSS(SEQ ID NO:2)
泽贝妥单抗轻链：
DIELSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:3)
泽贝妥单抗轻链可变区：
DIELSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:4)
表1：泽贝妥单抗的CDR序列
泽贝妥单抗重链的原始编码核酸序列：
HS006-HC(VH、HCDR1、HCDR2、HCDR3)
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAA GGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTAGACAGGGCCTGGAATGGATT GGAGCTATTTATCCAGGAAATGGCGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGTGGACA AATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCCGTCTATTTCTGTGCAAGAGT GGTGTACTATAGTAACTCTTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCTTAAGTCCGGGAAAATAA(SEQ ID NO:11)
HS006-LC(VL、LCDR1、LCDR2、LCDR3)
GATATCGAGCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTG CAGGGCCAGCTCAAGTGTGAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTAT GCCCCATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAA TCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTTTTAACCCACCCACGTTCGGCGC TGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCACCGGTGACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:12)；
优化后获得的泽贝妥单抗的核酸编码序列如下：
JSR-HC：
GAAGTCCAGCTGCAGCAATCTGGCGCTGAACTGGTGCGGCCTGGAGCTAGTGTGAAGATGTCCTGCAA GGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCTTATAATATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTAGACAGGGACTGGAATGGATC GGCGCCATCTACCCTGGCAATGGCGACACCTCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCTACCCTGACCGTGGATA AGTCCTCTTCCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGTCTGACTTCCGAGGACTCTGCTGTGTACTTCTGCGCCAGAGT TGTCTACTACTCCAACTCCTACTGGTATTTCGACGTCTGGGGCACAGGCACAACTGTGACCGTGAGCTCTGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGAGCACCTCTGGCGGCACCGCTGCTCTGGGTTGCCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAACTCCGGCGCTCTGACCTCTGGAGTGCATACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCAGCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCTAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCTAAACCTAAGGATACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAAGTCACCTGCGTGGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCCCGCGAGGAACAGTACAACTCTACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTTAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAAGCTAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAAGTGTACACACTGCCTCCATCTCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTCACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAAACCACACCACCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAATCTAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCATAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGTCCCCTGGCAAGTGATAA(SEQ ID NO:13)
JSR-LC：
GACATCGAGCTGTCTCAGTCTCCCGCCATCCTGTCTGCTTCCCCTGGAGAAAAAGTGACCATGACCTG CAGAGCCTCCTCTAGCGTGTCCTACATGCACTGGTACCAGCAAAAGCCCGGATCTTCTCCTAAGCCTTGGATCTAC GCCCCTTCCAACCTGGCCTCTGGCGTTCCTGCCAGATTCAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCTCGTATTCCCTGACCA TCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGATGCTGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCTCCTACCTTCGGCGC TGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCATCCGTGTTCATCTTCCCCCCATCTGATGAACAGCTGAAGTCCGGCACCGCTTCTGTGGTGTGTCTCCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCCGTCACAGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACTCTCTGTCCTCCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGAGCAGCCCTGTGACAAAATCCTTTAATAGAGGCGAGTGCTGATAA(SEQ ID NO:14)
JSR-VH：
GAAGTCCAGCTGCAGCAATCTGGCGCTGAACTGGTGCGGCCTGGAGCTAGTGTGAAGATGTCCTGCAA GGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCTTATAATATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTAGACAGGGACTGGAATGGATC GGCGCCATCTACCCTGGCAATGGCGACACCTCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCTACCCTGACCGTGGATA AGTCCTCTTCCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGTCTGACTTCCGAGGACTCTGCTGTGTACTTCTGCGCCAGAGT TGTCTACTACTCCAACTCCTACTGGTATTTCGACGTCTGGGGCACAGGCACAACTGTGACCGTGAGCTCT(SEQ IDNO:15)
JSR-VL：
GACATCGAGCTGTCTCAGTCTCCCGCCATCCTGTCTGCTTCCCCTGGAGAAAAAGTGACCATGACCTG CAGAGCCTCCTCTAGCGTGTCCTACATGCACTGGTACCAGCAAAAGCCCGGATCTTCTCCTAAGCCTTGGATCTAC GCCCCTTCCAACCTGGCCTCTGGCGTTCCTGCCAGATTCAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCTCGTATTCCCTGACCA TCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGATGCTGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCTCCTACCTTCGGCGC TGGCACCAAGCTGGAAATCAAG(SEQ ID NO:16)
JWZ-HC：
GAGGTGCAGCTGCAACAGAGCGGAGCCGAGCTGGTGAGACCTGGCGCTAGCGTGAAGATGAGCTGCAA GGCTAGCGGCTACACCTTCACAAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTAGACAAGGCCTGGAGTGGATC GGCGCCATCTACCCTGGCAACGGCGACACAAGCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTCGACA AAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACAAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCTAGAGT GGTGTACTACAGCAACAGCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACCGGCACCACCGTGACCGTCAGCAGCGCTAGCACCAAGGGACCTAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACAAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTCGTGACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCTTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTCGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGACAGCCTAGAGAGCCTCAAGTGTACACCCTGCCTCCTAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAAGTGAGCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGATTCTACCCTAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAAAGCAGATGGCAGCAAGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCTGGCAAGTGATAA(SEQ ID NO:17)
JWZ-LC：
GACATCGAGCTGAGCCAAAGCCCTGCCATCCTGAGCGCTAGCCCTGGCGAGAAGGTGACCATGACCTG CAGAGCTAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTAC GCCCCTAGCAACCTGGCTAGCGGCGTGCCTGCTAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACAAGCTACAGCCTGACCA TCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGTCAGCAGTGGAGCTTCAACCCTCCTACCTTCGGCGC CGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCCGCCCCTAGCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAAGAGAGCGTGACCGAGCAAGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAAGGCCTGAGCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGCGAGTGCTGATAA(SEQ ID NO:18)
JWZ-VH：
GAGGTGCAGCTGCAACAGAGCGGAGCCGAGCTGGTGAGACCTGGCGCTAGCGTGAAGATGAGCTGCAA GGCTAGCGGCTACACCTTCACAAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTAGACAAGGCCTGGAGTGGATC GGCGCCATCTACCCTGGCAACGGCGACACAAGCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTCGACA AAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACAAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCTAGAGT GGTGTACTACAGCAACAGCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACCGGCACCACCGTGACCGTCAGCAGC(SEQ IDNO:19)
JWZ-VL：
GACATCGAGCTGAGCCAAAGCCCTGCCATCCTGAGCGCTAGCCCTGGCGAGAAGGTGACCATGACCTG CAGAGCTAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTAC GCCCCTAGCAACCTGGCTAGCGGCGTGCCTGCTAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACAAGCTACAGCCTGACCA TCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGTCAGCAGTGGAGCTTCAACCCTCCTACCTTCGGCGC CGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:20)
表2：泽贝妥单抗CDR编码序列-JSR
表3：泽贝妥单抗CDR编码序列-JWZ
经序列比对，对于抗体全长核酸序列，JSR-LC与HS006-LC的同源性仅为78.8％，JWZ-LC与HS006-LC的同源性仅为76.5％。JSR-HC与HS006-HC的同源性仅为81.6％，JWZ-HC与HS006-HC的同源性仅为81.4％。
对于可变区，JSR-VL与HS006-VL的同源性仅为78.6％，JWZ-VL与HS006-VL的同源性仅为73.9％。JSR-VH与HS006-VH的同源性仅为82.2％，JWZ-VH与HS006-VH的同源性仅为80.1％。
实施例2.质粒构建
分别合成编码HS006抗体的轻链和重链氨基酸的核酸序列(原始序列、JSR序列和JWZ序列)，利用限制性酶切位点AflII和EcoRV将含信号肽的轻、重链核酸序列分别重组至pcDNA3.4-TOPO载体(Thermo fisher，A14697)上，构建分别表达HS006轻链和重链的表达载体pcDNA3.4-TOPO-HS006HC和pcDNA3.4-TOPO-HS006LC，其图谱分别见图1和图2。将表达载体分别转化大肠杆菌细胞DH5α(Takara，9057)，进行扩增培养。提取表达载体，测序确认正确后，将得到的转化大肠杆菌-20℃保存用于后续瞬转实验。
实施例3.质粒扩增和提取
实施例2获得的转化大肠杆菌使用LB培养基，根据pcDNA3.4-TOPO质粒抗性，在LB培养基中加入氨苄青霉素(上海生工，A100339)进行扩大培养。
离心收集扩大培养完成的大肠杆菌，使用质粒提取试剂盒(Axygen，AP-MX-P-25)依据碱裂法裂解大肠杆菌，过程中去除内毒素(上海生工，B641718)，提取质粒。通过微量分光光度计(杭州奥盛，Nano-300)检测质粒浓度，-20℃保存用于后续瞬转实验。
实施例4.质粒转染至CHO细胞
取出1支CHO-K1(ATCC，货号CCL-61TM，批号：70014310)冻存细胞，37℃水浴复苏。细胞计数(Count Star，IC1000)，以0.5×106细胞/mL活细胞密度传代，培养基为包含6mmol/LL-Gln(Sigma，V900419-500G)的CD CHO完全培养基(Gibco，10743029)。CHO-K1细胞在加湿二氧化碳摇床培养箱(Kuhner，ISF4-XC)中37℃、5％二氧化碳培养。每2-4天进行传代培养，传代活细胞密度为0.2～0.5×106细胞/mL。细胞恢复后转移至Dynamis完全培养基(Dynamis培养基+6mmol/L L-Gln，Gibco，A26175)中传代。转染前24小时，在Dynamis完全培养基中传代，传代活细胞密度为3～4×106细胞/mL。
瞬转当天，使用Dynamis完全培养基将活细胞密度调整至6×106细胞/mL。瞬转体系为每毫升细胞培养液添加10.5μg PEI(Polyscoences，23966)、1.75μg重链重组质粒、1.75μg轻链重组质粒和2.625μg惰性DNA(Sigma，31149-10G-F)。瞬转后4h，补充总体积4％Cell Boost 7a溶液(Cytiva，SH31026.02)、0.4％ Cell Boost 7b溶液(Cytiva，SH31027.07CN)和0.125％ DMA。瞬转第一天补充D-葡萄糖至7g/L，降温至32℃培养；瞬转第二天补充2mM L-Gln；瞬转第5天补充6％ Cell Boost 7a溶液、0.6％Cell Boost 7b溶液和4mM L-Gln；瞬转第7天收获瞬时转染细胞培养上清。收获上清进行抗体表达量检测和一步亲和纯化(具体见实施例5)，纯化后样品进行SEC-HPLC、nrCE-SDS和IEC-HPLC质量检测(具体见实施例7)。
实施例5.抗体的纯化
实施例4中使用了一步亲和层析法纯化抗体，步骤为：离心(12000g离心10min)收集瞬时转染重组载体的细胞培养上清，在蛋白纯化层析系统(Cytiva，AKTAavant)上使用ProteinA亲和层析柱(Cytiva，17543803)纯化，使用pH3.0醋酸溶液(麦克林，A801295)洗脱目的蛋白。
实施例6.抗体表达量检测
使用HPLC检测抗体的表达量：
依据ProteinA一步亲和层析法，使用低pH溶液将抗体洗脱，统计标准品(市售泽贝妥单抗)和样品洗脱峰的面积，建立标品浓度和色谱峰面积线性关系，依据标品线性关系和样品峰面积算出样品中抗体浓度。
仪器：高效液相色谱仪(Agilent，1260Infinity IIPrime)。色谱柱：Thermo Fish的POROS A/20，1502412色谱柱，规格为2.1*30mm。
检测流动相A：50mM Na2HPO4(国药，10020318)和150mM NaCl(国药，10019318)，pH7.0；流速：3.0mL/min。
检测流动相B：150mM NaCL(国药，10019318)，pH 1.9；流速：3.0mL/min。
进样量：30μL；柱温：25.0±5.0℃。样品室温：2-8℃。检测波长：280nm，检测时间3分钟。
检测时首先进行色谱柱平衡，即用100％流动相A以3.0mL/min的流速平衡系统至基线平稳，然后进样，进行样品浓度测定，记录色谱图。样品测定采用梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示：
表4.HPLC法蛋白质含量测定色谱洗脱梯度
根据色谱图进行积分，通过分析计算标准曲线溶液和供试品溶液目标峰的峰面积得到蛋白质含量。结果见下表5和图3：
表5.不同序列核酸的抗体表达量
由表达量结果知，HS006抗体杂交瘤中原始密码子表达量最低，优化后的密码子的表达量显著提高。
实施例7.抗体质量检测
7.1SEC-HPLC
仪器：高效液相色谱仪(Agilent，1260Infinity IIPrime)。色谱柱：TOSOH G3000SWxL色谱柱，规格为7.8*300mm，5um。
检测流动相：0.2M氯化钠(国药，10019318)、0.04M二水合磷酸二氢钠(国药，20040718)和0.04M十二水合磷酸氢二钠(国药，10020318)，pH7.0。
进样量：25μL；柱温：25.0±5.0℃。样品室温：2-8℃。检测波长：280nm，检测时间30分钟。
检测时首先进行色谱柱平衡，即用100％流动相以0.5mL/min的流速平衡系统至基线平稳，然后进样，进行样品测定，记录色谱图。
根据色谱图进行积分，通过分析计算目标峰的峰面积得到聚体含量和单体峰含量。
7.2非还原CE-SDS
样品经非还原CE-SDS样品稀释液(pH6.5，包含0.04M二水合磷酸二氢钠0.04M十二水合磷酸氢二钠和1％ SDS)稀释至1.0mg/mL，加入总体积5％的800mM碘乙酰胺(TCI，I0044)并混合均匀，70℃水浴5min。冷却后6000rpm离心1min，取75μL上清作为上样样品。
仪器：毛细管电泳仪(Agilent，7100)。色谱柱：CE-SDS毛细管(Agilent，G1600-6411)，柱长224mm/310mm。
样品缓冲液：0.04M二水合磷酸二氢钠、0.04M十二水合磷酸氢二钠和1％ SDS，pH6.5。
运行缓冲液：SCIEX凝胶。
进样：进样‘-10KV，40S，运行‘-15KV，40min；柱温：20℃。
进样盘温度：18-22℃。DAD检测波长：220nm/360nm，检测时间40分钟。
根据色谱图进行积分，通过分析计算目标峰的峰面积比例得到低分子片段含量和单体峰含量。
7.3IEC-HPLC
仪器：高效液相色谱仪(Agilent，1260Infinity IIPrime)。色谱柱：ThermoMabPacSCX-10，074625色谱柱，规格为4*250mm。
检测流动相A：0.0175M二水合磷酸二氢钠和0.005M十二水合磷酸氢二钠，pH6.1；流速：1.0mL/min。
流动相B：0.075M二水合磷酸二氢钠和0.003M十二水合磷酸氢二钠，pH6.0；流速：1.0mL/min。
进样量：10μL；柱温：25.0±5.0℃。样品室温：2-8℃。检测波长：214nm，检测时间70分钟。
检测时首先进行色谱柱平衡，即用100％流动相A以1.0mL/min的流速平衡系统至基线平稳，然后进样，进行样品测定，记录色谱图。样品测定采用梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示：
表6.IEC-HPLC法蛋白质电荷变体测定色谱洗脱梯度
根据色谱图进行积分，通过分析计算供试品溶液目标峰的峰面积得到电荷变体酸性峰、主峰和碱性峰含量。
不同密码子表达的抗体的质量见下表：
表7.不同密码子表达的抗体质量结果
由SEC-HPLC和CE-SDS数据知，HS006原始密码子表达的抗体的聚体比例和低分子片段比例最高，密码子优化后，可显著降低抗体中聚体和片段的含量。其中，HS006-JSR密码子表达的抗体的聚体和片段的比例最低，HS006-JWZ密码子次之。由IEC-HPLC数据知，3种密码子电荷变体比例差异不大。
综上所述，HS006原始密码子表达量、纯度均低于优化后的密码子。

Claims (10)

1.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，以及编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中：
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:22所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:23所示，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:26所示；或者
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:27所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:28所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:29所示，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:30所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:31所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:32所示。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，所述核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链可变区和轻链可变区的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与其具有至少90％序列同一性，和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与其具有至少90％序列同一性；或者，
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，或与其具有至少90％序列同一性，和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示，或与其具有至少90％序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，所述核酸分子包含编码泽贝妥单抗重链和轻链的核酸序列，其中：
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与其具有至少85％序列同一性，和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与其具有至少85％序列同一性；或者，
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与其具有至少85％序列同一性，和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:18所示，或与其具有至少85％序列同一性。
4.一种重组载体，包含权利要求1～3任一项所述的核酸分子；优选地，所述重组载体的出发载体是表达载体；更优选地，所述重组载体的出发载体为pcDNA3.4-TOPO载体。
5.一种表达泽贝妥单抗的载体系统，其包含第一载体和第二载体，其中：
第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，其中：
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:22所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:23所示；或者
编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:27所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:28所示，编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:29所示；和
第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中：
编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:26所示；或者
编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:30所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:31所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:32所示；
优选地，
第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，其中，编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:22所示，和编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:23所示；和
第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:26所示；或者
第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，其中，编码HCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:27所示，编码HCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:28所示，和编码HCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:29所示；和
第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，其中，编码LCDR1的核酸序列如SEQ ID NO:30所示，编码LCDR2的核酸序列如SEQ ID NO:31所示，和编码LCDR3的核酸序列如SEQ ID NO:32所示。
6.根据权利要求5所述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链可变区的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链可变区的核酸序列，其中：
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19所示，或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19具有至少90％序列同一性；和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20所示，或与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20具有至少90％序列同一性；
优选地，
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与其具有至少90％序列同一性；和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与其具有至少90％序列同一性；或者
编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，或与其具有至少90％序列同一性；和编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示，或与其具有至少90％序列同一性。
7.根据权利要求5或6所述的表达泽贝妥单抗的载体系统，其中，第一载体包含编码泽贝妥单抗重链的核酸的序列，第二载体包含编码泽贝妥单抗轻链的核酸序列，其中：
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:13或SEQID NO:17具有至少85％序列同一性；和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18所示，或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18具有至少85％序列同一性；
优选地，
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与其具有至少85％序列同一性；和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与其具有至少85％序列同一性；或者
编码重链的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与其具有至少85％序列同一性；和编码轻链的核酸序列如SEQ ID NO:18所示，或与其具有至少85％序列同一性。
8.一种重组细胞，其包含权利要求1～3任一项所述的核酸分子、或权利要求4所述的重组载体、或权利要求5～7任一项所述的表达泽贝妥单抗的载体系统；优选地，所述重组细胞的宿主细胞为CHO细胞，更优选为CHO-K1细胞。
9.权利要求1～3任一项所述的核酸分子、权利要求4所述的重组载体、权利要求5～7任一项所述的表达泽贝妥单抗的载体系统、或权利要求8所述的重组细胞在制备泽贝妥单抗中的应用。
10.一种制备泽贝妥单抗的方法，其包含如下步骤：
a.将权利要求1～3任一项所述的核酸分子、权利要求4所述的重组载体或权利要求5～7任一项所述的表达泽贝妥单抗的载体系统导入至宿主细胞中；
b.培养宿主细胞使泽贝妥单抗表达；以及可选地，
c.纯化和回收泽贝妥单抗。
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