KR102180660B1 - 발현 방법 - Google Patents

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후지필름 다이오신쓰 바이오테크놀로지스 유케 리미티드
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Abstract

표적 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 본 방법은 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 표적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 벡터를 발현시키는 단계로서, 상기 발현 벡터는 피브로넥틴 분비 선도자 서열에 작동 가능하게 연결된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것인 단계; 및 상기 표적 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.

Description

발현 방법{Expression process}
본 발명은 재조합 폴리펩티드의 발현 및 특히 재조합 폴리펩티드의 분비를 위한 방법에 관한 것이다.
재조합 폴리펩티드 생산에서, 관심 있는 폴리펩티드가 이것이 발현된 세포로부터 방출될 수 있다면, 이는 상당한 이점이 된다. 따라서 발현 시스템은 이러한 방출(export), 또는 분비가 가능하도록 유리하게 설계되어야 한다. 숙주 세포로부터의 재조합 폴리펩티드의 분비는, 일반적으로 세포질로부터 방출될 것인 진핵성(eukaryotic) 및 원핵성(prokaryotic) 단백질의 대부분에서 발견되는 신호 펩티드를 이용한다. 이러한 발현 시스템에서 이용되는 분비 선도자(leader)는 일반적으로 발현 숙주에 고유적인 것이고, 예를 들면 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)의 신호 펩티드 PhoA, MalB 및 OmpA가 그 유기체의 주변 세포질(periplasm)에 폴리펩티드를 분비하기 위해 광범위하게 사용된다.
US 7,071,172는 유전자 치료에 사용하기 위한 AAV-기반 전달 벡터(delivery vector)에서 피브로넥틴 분비 선도자의 이용을 기술한다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 하기를 포함하는 표적 폴리펩티드의 생산을 위한 방법이 제공된다:
a) 숙주 세포 내에서 표적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 벡터를 발현시키는 단계로서, 상기 발현 벡터는 피브로넥틴 분비 선도자 서열 또는 이의 기능적 동등체(equivalent)에 작동 가능하게(operably) 연결된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트(cassette)를 포함하는 발현 벡터인 단계; 및
b) 표적 폴리펩티드를 회수하는 단계.
본 발명에서 이용될 수 있는 피브로넥틴 분비 선도자는 포유류 및 파충류의 피브로넥틴 분비 선도자를 포함한다. 파충류 피브로넥틴 분비 선도자의 예시는 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 피브로넥틴 분비 선도자를 포함한다. 포유류의 피브로넥틴 분비 선도자의 예시는, 서열 MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGA(서열 번호 1)을 갖는 인간 피브로넥틴 분비 선도자와 같은, 인간, 랫(rat), 쥐(murine), 소(bovine), 돼지, 개, 고양이 및 중국 햄스터 피브로넥틴 분비 선도자 및 이의 기능적 동등체를 포함한다. 특정 구체예에서, 아미노산 서열 MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA(서열 번호 2)를 갖는 중국 햄스터 피브로넥틴 분비 선도자 및 이의 기능적 동등체가 바람직하다
분비 선도자에 대한 기능적 동등체는 아미노산 서열의 70% 이상의 동일성을 공유, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일성 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성과 같은 90% 이상의 동일성을 공유하고, 그 재조합 폴리펩티드를 분비할 수 있는 능력을 얻은 것이다. 일부 구체예에서, 기능적으로 동등한 분비 선도자는 첨가, 결실 또는 교체 중 임의의 것으로 인해, 하나의 아미노산이 다른 것이다.
많은 구체예에서, 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열은 인접(contiguous)해 있고, 분비 선도자의 경우, 인접해 있고 동일한 해독틀(reading frame)내에 있다.
바람직하게는 피브로넥틴 분비 선도자 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이의 연결은 분비 선도자가 재조합 폴리펩티드의 N-말단에 부착되는 것 등이다. 특정 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 N-말단 태그(tag)를 포함하고, 분비 선도자 서열 및 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이의 연결은 분비 선도자가 태그, 바람직하게는 태그의 N-말단에 부착된 것이다.
피브로넥틴 분비 선도자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 부착되고, 바람직하게는 ATGCTGAGAGGCCCTGGACCTGGACTGCTGCTGCTGGCTGTGCAGTGTCTGGGAACCGCCGTGCCTTCTACCGGCGCC(서열 번호 3) 또는 ATGCTCAGGGGTCCGGGACCCGGGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGG GACAGCGGTGCGCTGTACCGAAGCC(서열 번호 4) 서열을 갖는다.
본 발명의 벡터는 분비 선도자에 대한 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 재조합 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에 따른 벡터에서 사용될 수 있는 프로모터는 발현 카세트가 발현되어야 하는 숙주 세포에 따라 선택된다.
진핵 숙주 세포에서 사용될 수 있는 프로모터는, 본 명세서에 참조로서 통합된 Studier and Moffat, J. Mol. Biol. 189:113-130 (1986)에 개시된 것들을 포함하는, 단일 T7 프로모터 영역, 특히 T7 유전자 10 프로모터 영역 및 숙주 폴리머라제 프로모터, 특히 T7A1, T7A2, T7A3, lpL, lpR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA 및 rrnB 등의 대장균(E. coli) 폴리머라제 프로모터 등의 파지 폴리머라제-프로모터를 포함한다.
T7 RNA-폴리머라제 의존적 프로모터 영역이 사용될 때, 당업계에 알려진 방법에 의해 제공되고, 일반적으로 필요한 파지 폴리머라제를 숙주 균주에 발현시켜 용원성 숙주 균주를 만드는, λDE3 프로파지(prophage)의 삽입에 의한 T7 RNA 폴리머라제의 공급원(source)이 필요하다는 것이 인식될 것이다. T7 RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 유전자를 운반하는 특수화된(specialised) λ 형질도입 파지를 감염시켜 세포로 전달할 수 있다.
효모 숙주 세포에서 사용될 수 있는 프로모터는 AOX1 및 AOX2, GAP(글리세랄데히드 3-포스페이트 데히드로게나제), FLP(포름알데히드 데히드로게나제) 및 GAL1 및 GAL10 등의 gal 프로모터 및 AOX 프로모터를 포함한다.
포유동물 숙주 세포에서 사용될 수 있는 프로모터는 숙주 세포에 대해 내인성(endogenous) 또는 외인성(exogenous)일 수 있다. 적절한 프로모터는 CMV, SV40 프로모터, 및 RSR-LTR 등의 바이러스성 프로모터를 포함한다. hEF1a 및 쥐 포스포글리세레이트 키나제(mPGK) 등의 항존 유전자(housekeeping gene)로부터의 프로모터 또한 이용 가능하다. 일부 구체예에서, 바람직한 프로모터는 인간 CMV 및 랫 CMV이다. 하나 초과의 폴리펩티드가 발현되고 있는 경우(예를 들면 MAb HC 및 LC 폴리펩티드), 그 프로모터는 같거나 다를 수 있다. 프로모터는 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 특히 인간 시토메갈로바이러스의 주요 최초기(immediate early) 증폭자 등의 증폭자(enhancer) 서열과 조합으로 사용될 수 있다.
발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합되거나 또는 플라스미드 등의 외부 염색체 요소 내에 포함될 수 있다.
발현 벡터는 또한 통상적으로 그 벡터가 발현될 숙주 세포에 적절한 선별적 마커를 포함한다. 진핵 숙주 세포에서 사용하기 위한 선별적 마커는 테트라사이클린 또는 카나마이신 저항성 마커 등의 항생 저항성 마커를 포함한다. 효모 숙주에서 사용하기 위한 선별적 마커는 제오신(Zeocin), 푸로마이신, 네오신 및 히그로마이신 저항성 마커 등의 항생 저항성 마커를 포함한다. 포유동물 세포, 특히 중국 햄스터 난소 세포에 대한 선별적 마커는 글루타민 신테타제(synthetase) 및 디히드로폴레이트 레덕타제(reductase) 마커 시스템을 포함한다.
사용되는 벡터는 적절한 숙주 세포에서 발현하기에 적절한 당업계에서 통상적인 특징을 포함한다. 원핵성 발현 벡터는 통상적으로 복제 원점(origin of replication), 제한 효소 부위, 전사 종결자(terminator), 및 cer 안정성 서열 등의 플라스미드 안정성 좌위(locus)를 포함한다. 효모 발현 벡터는 통상적으로 프로모터, 전사 종결자, 선별 마커, 및 복제하는 경우에는 복제 원점을 포함한다. 포유동물의 발현 벡터는 통상적으로 인간 베타글로빈 폴리 A 서열, 소 성장 호르몬 폴리 A 서열 및 SV40 초기 또는 후기 폴리 A 서열 등의 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합 폴리펩티드, 특히 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 원핵 및 특히 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 원핵 세포의 예시로는, 예를 들면 대장균, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marsescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하는 그람-음성 박테리아 세포, 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함하는 그람 양성 박테리아 세포 등의 박테리아 세포가 있다. 바람직한 원핵 숙주 세포는 박테리아, 특히 엔테로박테리아(enterobacteriacae), 바람직하게는 대장균, 및 특히 이의 B 또는 K12 균주이다.
사용될 수 있는 진핵 숙주 세포의 예시로는 효모, 포유동물 및 곤충 세포가 있다. 효모 숙주 세포는 특히 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 패스토리스(Pichia pastoris) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 포함한다.
바람직한 숙주 세포는 아기 햄스터 신장 세포, 예를 들면 HEK 293 세포주 등의 인간 배아 신장 세포주, 예를 들면 PER.C6 세포 등의 인간 망막-유래 세포주, 예를 들면 NS0 및 SP2세포 등의 쥐 림프 세포주 및 가장 바람직하게는 중국 햄스터 난소 세포, 및 특히 CHOK1, DG44, DUXKB11 및 CHO pro3-세포 등의 포유동물 세포이다.
본 발명의 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드의 형태로 이용된다. 플라스미드는 자가 복제 플라스미드(autonomously replicating plasmid) 또는 통합형 플라스미드(integrative plasmid)일 수 있다.
본 발명의 특정한 매우 바람직한 구체예에서, 피브로넥틴 분비 선도자는 이용되는 숙주 세포에 상응하는 것을 선택한다. 예를 들면, 인간 피브로넥틴은 인간-유래 세포에서 사용되고, 랫 피브로넥틴은 랫 세포에서 사용되고, 특히 중국 햄스터 피브로넥틴은 중국 햄스터 난소 세포에서 사용된다.
본 발명의 방법으로 발현될 수 있는 폴리펩티드는, 시토킨(cytokine), 성장 인자, 항체, 항체 단편, 면역글로불린 유사 폴리펩티드, 효소, 백신, 펩티드 호르몬, 케모킨(chemokine), 수용체, 수용체 단편, 키나제, 포스파타제, 이소머라제(isomerase), 히드롤리아제(hydrolyase), 전사 인자 및 융합 폴리펩티드를 포함하는, 치료용 단백질 및 펩티드를 포함한다.
발현될 수 있는 항체는 모노클론성 항체, 폴리클론성 항체 및 생물학적 활성을 갖는 항체 단편, 및 이들 중 임의의 다가(multivalent) 및/또는 다특이성(multispecific) 형태인 것을 포함한다.
자연적으로 발생하는 항체는 통상적으로 디술피드 결합으로 상호 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 두 개의 동일한 중쇄(H) 및 두 개의 동일한 경쇄(L)가 있다. 각각의 중쇄는 가변 영역(VH) 및 불변 영역(CH)을 포함하고, CH 영역은 이의 고유 형태의 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 가변 영역(VL) 및 하나의 도메인 CL을 포함하는 불변 영역을 포함한다.
VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)으로 명명된 영역인 초가변성 영역과, 이와 함께 산재한, 골격 영역(framework region: FR)으로 명명된 더 보전된 영역으로 더욱 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되고, 아미노-말단에서 카르복시-말단 방향으로 하기의 순서로 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
발현될 수 있는 항체 단편은 온전한 항체의 일부를 포함하고, 상기 일부는 원하는 생물학적 활성을 갖는 것이다. 항체 단편은 일반적으로 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예시는 하기를 포함한다: (ⅰ) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편; (ⅱ) CH1 도메인의 C-말단에, 두 개의 Fab 유도체 사이에서 디술피드 가교로 이가(bivalent) 단편을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab' 단편 등의, Fab 유도체; (ⅲ) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편 ; (ⅳ) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd 단편 등의, Fd 유도체; (ⅴ) 항체의 단일 팔(single arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (ⅵ) VL 및 VH 도메인이 공유적으로 연결된 단일 사슬 Fv(scFv) 항체 등의 단일 사슬 항체 분자; (ⅶ) 불변 영역 도메인(예를 들면, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL)이 있거나 또는 없는 다른 가변 영역(VH 또는 VL 도메인 폴리펩티드)에 연결된 불변 영역 도메인이 없는 VH 또는 VL 도메인 폴리펩티드; (ⅷ) VH 도메인, 또는 VL 도메인, 및 분리된 CDR 영역과 같은 VH 또는 VL 도메인 중 어느 하나에 대한 항원-결합 단편으로 구성된 단편 등의 도메인 항체 단편; (ⅸ) 두 개의 항원 결합 부위, 예를 들면 동일한 폴리펩티드 사슬 내 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 소위 "디아바디(diabody); 및 (ⅹ) 항원 결합 영역 쌍을 형성하는, 함께 상보적인 경쇄 폴리펩티드인, 나란한(tandem) Fd 분절(segment) 쌍을 포함하는, 소위 선형(linear) 항체.
제조할 수 있는 바람직한 항체 단편은 면역글로불린 가변 영역의 서열 특성을 포함하고 항원에 특이적으로 결합(즉, 400 nM 이하, 바람직하게는 250 nM 이하 및 가장 바람직하게는 100 nM 이하 등의 해리 상수 500 nM 이하)하고, 및 단일 가변 도메인으로서 항원에 결합하는, 접힌(folded) 폴리펩티드 도메인을 포함하는 항체 단편인 포유동물 단일 가변 도메인 항체이다; 이는, 임의의 상보적 가변 도메인이 없는 것이다. 단일 가변 도메인 항체는 완전한 항체 가변 도메인뿐만 아니라 변형된(modified) 가변 도메인, 예를 들면 하나 이상의 루프(loop)가 항체 가변 도메인의 특징이 없거나 또는 절단된(truncated) 또는 N- 또는 C-말단 확장뿐만 아니라 가변 도메인의 접힌 단편을 포함하는 항체 가변 도메인의 서열로 교체된 것을 포함한다. 제조할 수 있는 바람직한 단일 가변 도메인은, Vkappa 및 Vlambda를 포함하는 VH 및 VL의 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 단일 가변 도메인은, 인간화된(humanised) 낙타(camelid) 도메인을 포함하는 인간 또는 낙타 도메인이다.
분비되어야 하는 표적 폴리펩티드가 두 개 이상의 사슬을 포함하는 경우, 특히 표적 폴리펩티드가 항체 또는 두 개 이상의 사슬을 포함하는 항체 단편인 경우, 사슬의 하나 이상 및 바람직하게는 각각이 피브로넥틴 분비 선도자에 부착되고, 이러한 폴리펩티드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들은 그에 따라 설계된다. 사용되는 피브로넥틴 분비 선도자들은 동일한 것 또는 다른 것일 수 있다. 두 개 이상의 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들은 동일한 발현 카세트 내에 포함될 수 있으나, 바람직하게는 다른 발현 카세트에 포함된다. 여러 발현 카세트들이 사용되는 경우, 상기 발현 카세트들은 다른 벡터에 위치할 수 있으나, 바람직하게는 동일한 벡터에 위치한다. 사용되는 프로모터들은 동일한 것이거나 다른 것일 수 있다.
발현 시스템은 이용되는 세포에 관하여 당업계에 잘 알려진 방법으로 발현된다. 바람직한 발현 방법은 숙주 세포를 성장 배지에서 배양하고, 이후 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다. 용어 "성장 배지(growth medium)"는 숙주 세포를 증식시키기 위해 사용되는 영양 배지를 의미한다. 많은 구체예에서, 영양액이 이용된다. 주어진 숙주 세포에 대한 적절한 성장 배지 및 폴리펩티드를 회수하는 적절한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
많은 구체예에서, 폴리펩티드 회수는 단백질 A 친화 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 겔 여과 및 HPLC 등의 하나 이상의 여과, 원심분리, 투석여과(diafiltration), 이온-교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면 하기를 포함하는 표적 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다:
(a) 숙주 세포에서 표적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 벡터로 숙주 세포를 형질주입 또는 형질전환시키는 단계로서, 상기 발현 벡터는 피브로넥틴 분비 선도자 서열 또는 이의 기능적 동등체에 작동 가능하게 연결된 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터인 단계;
(b) 숙주 세포의 증식이 가능한 환경에서 숙주 세포를 배양하고 숙주 세포로부터 표적 폴리펩티드를 발현 및 분비시키는 단계; 및
(c) 표적 폴리펩티드를 회수하는 단계.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 피브로넥틴 분비 선도자 서열 또는 이의 기능적 동등체에 작동 가능하게 연결된 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터로 형질 주입된, 중국 햄스터 난소 세포, 바람직하게는 CHOK1, DG44, DUXKB11 또는 CHO pro3-세포가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서 코딩된 표적 폴리펩티드는 바람직하게는 모노클론성 항체를 포함한다. 모노클론성 항체의 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는, 바람직하게는 이들 각각이 피브로넥틴 분비 선도자에 작동 가능하게 연결된, 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 발현 카세트가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 분리된 발현 카세트들이 이용되고, 이들은 분리된 벡터 상에 위치할 수 있으나, 종종 동일한 벡터상에 위치할 수 있다. 이용되는 피브로넥틴 분비 선도자는 동일 또는 다른 것일 수 있으나, 바람직하게는 동일한 것이다.
많은 바람직한 구체예에서, 상기 발현 카세트는 항존 유전자 프로모터, 특히 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 hEF1a 프로모터를 포함하고, 두 개 이상의 발현 카세트가 이용되는 경우, 각각의 발현 카세트는 항존 유전자 프로모터, 바람직하게는 동일한 프로모터, 가장 바람직하게는 hEF1a 프로모터를 포함한다.
상기 표적 폴리펩티드에 대한 상기, 또는 각각의 발현 카세트는 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리 A 서열을 포함한다.
발현 벡터는 바람직하게는 선별 마커, 가장 바람직하게는 디히드로폴레이트 레덕타제 마커 시스템을 포함한다. 특정 상황에서, 디히드로폴레이트 레덕타제 마커 시스템은 쥐 포스포글리세레이트 키나제 프로모터를 더 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 포유동물 세포에서 효과적인 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 DNA 구조체(construct) 및 피브로넥틴 분비 선도자 서열에 작동 가능하게 연결된 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형성된다.
DNA 구조체는 바람직하게는 모노클론성 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 분리된 발현 카세트를 포함한다. 가장 바람직하게는, 각각의 발현 카세트는 동일한 프로모터, 특히 항존 유전자 프로모터, 가장 바람직하게는 hEF1a 프로모터를 포함한다. 특히 바람직하게는 각각의 발현 카세트는 추가적으로 소 성장 호르몬 폴리 A 서열을 포함한다. DNA 구조체는 종종 유리하게, 선별 마커, 가장 바람직하게는 디히드로폴레이트 레덕타제 마커 시스템을 포함한다. 특정 상황에서, 디히드로폴레이트 레덕타제 마커 시스템은 쥐 포스포글리세레이트 키나제 프로모터를 추가적으로 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
본 발명은 하기의 실시예에 따라 설명되고, 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
각각의 평가되는 분비 선도자(SL)에 대해, 항-MUC-1 MAb의 hγ1 FL 중쇄(HC) 또는 항-MUC-1 MAb의 람다(lambda) 경쇄(LC) 중 하나를 포함하는 두 개의 단일 유전자 벡터를 제작하였다. 각각의 발현 카세트는, HC 또는 LC 성숙 폴리펩티드 및 인간 베타글로빈 폴리 A 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 프레임(frame) 내에서 연결된 분비 선도자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된, 쥐 CMV 프로모터로 구성되었다. 발현 카세트의 구조는 도 1에 도시되어 있다.
이용되는 분비 선도자는 하기와 같았다:
분비 선도자 A: 인간 콜라겐, 서열 MLSFVDTRTLLLLAVTLCLATCQS (서열 번호 5)
분비 선도자 B: 인간 피브로넥틴, 서열 MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGA (서열 번호 1)
분비 선도자 C: 중국 햄스터 피브로넥틴, 서열 MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA (서열 번호 2)
분비 선도자 D: 중국 햄스터 알부민, 서열 MKWVTFLLLLFVSDSAFS (서열 번호 6)
CHO DG44 숙주 세포를 세고 6웰 플레이트의 웰상의 10% 혈청, 2 mM 글루타민 및 0.45% 글로코스로 보충된 MEM-α 배지 내에 1.2 x 106 세포/웰로 분주하였고, 36.5℃, 7.5% CO2에서 밤새 배양하였다.
각각의 형질 주입을 위해 HC 4 μg 및 LC 단일 유전자 벡터(2 μg)를 혼합하여 250 μL 무혈청 MEM-α 배지(Life Technologies) 내에서 희석하였다. 모의 횡단(mock transection)(PBS only) 또한 포함되었다. 각각의 형질주입을 위해 12.5 μL Lipofectamine 2000(Life Technologies)을 250 μL 무혈청 MEM-α 배지 내에서 희석하고 혼합하였다. 그 혼합물은 상온(15-25℃)에서 5분간 배양하였다. 그 혼합된 DNA와 Lipofectamine 2000TM 시약을 결합시키고, 혼합하고 상온에서 20분간 배양하였다. 추가적인 500 μL MEM-α 배지를 각각의 형질주입 혼합물에 첨가하였고, 성장 배지를 웰로부터 제거하였고, 이후 그 복합체를 세포를 포함하는 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 5시간 후 배지를 제거하고 새로운 성장 배지를 첨가하였다. 세포는 36.5℃, 7.5% CO2에서 5일간 배양하였다. 상층액을 회수하고 원심분리로 맑게 만들었다. 항체 역가(titre)를 Octet(Forte BIO) 단백질 A 분석을 이용하여 결정하였다.
그 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다.
표 1
Figure 112015110668888-pct00001
생산된 항체는 단백질 A 포획으로 상층액으로부터 회수하였고, 낮은 pH에서 용출하고 양이온 교환 크로마토그래피 후 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액에 바이러스 나노여과(viral nanofiltration)를 수행한 후 버퍼 교환 및 농축하였다.
실시예 2
벡터 제작(vector construction)
항-MUC-1 MAb의 hγ1 FL 중쇄 및 항-MUC-1 MAb의 인간 람다 경쇄 모두의 발현을 작동(driving)시키는 hEF1a 프로모터를 포함하는 이중 유전자(double gene) 벡터를 제작하였다
또한 hEF1α 프로모터가 hCMV-MIE 프로모터 또는 랫 CMV 프로모터 중 하나로 교환된 이중 유전자 벡터도 제작하였다.
이중 유전자 벡터 내의 각각의 발현 카세트는 HC 또는 LC 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 프레임 내에서 연결된, 실시예 1의 CHO 피브로넥틴 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터로 구성되었다. 정확한 mRNA 가공(processing)은 소 성장 호르몬 폴리 A 서열의 존재로 보장된다.
안정한 세포주의 선별을 가능하게 하기 위해, 벡터는 또한 쥐 포스포글리세레이트(mPGK) 프로모터로 조절되는 마우스 디히드로폴레이트 레덕타제(dhfr) 유전자 및 티미딘 키나제(TK) 프로모터로 조절되는 히그로마이신 저항성 유전자 카피를 포함하였다.
CHO DG44 세포의 통상적 계대배양
CHO DG44 세포를 8 mM L-글루타민 및 1 x HT 보충물(Life Technologies)로 보충된 EX-CELL ACF CHO 배지(Sigma) 내 현탁액 진탕 플라스크 내에서 절차대로 배양하였다. 세포를 2 x 105 세포/ml의 농도로 분주하였고, 세포들을 3일마다 분할하였다. 플라스크를 37℃, 7.5% CO2에서, 140 rpm의 오비탈 진탕 배양기에서 배양하였다.
안정한 세포주의 생성을 위한 형질 주입
형질 주입을 위해 사용되는 세포는 상기 기재한 바와 같이 세포 현탁액 배양물(culture)에서 증식시켰다. 성장 배양물에서 얻은 세포를 원심분리 하였고, 2x107 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 0.1 mL 부피의 세포 현탁액 및 4 μg의 선형화된 플라스미드 DNA를 전기천공(electoroporaion) 큐벳(cuvette)에 첨가하였다. 그 큐벳은 이후 Amaxa nucleofactor(Lonza)에 위치시켰고 뉴클레오펙션(nucleofection)하였다. 이후의 형질 주입에서, 상기 세포들을 T74 플라스크 내 8 mM 글루타민 및 1 x HT 보충물로 보충된 20 mL의 예열된 EX-CELL ACF CHO 배지(Sigma)에 첨가하였다. 형질 주입된 세포들을 37℃ 7.5% CO2에서 배양하였다. 이후 배지로부터 히포크산틴 및 티미딘(HT)을 제거(형질 주입 후 48시간)하고, 400μg/mL 히그로마이신 B(invitrogen) 및 25 nM MTX를 첨가(형질 주입 후 144시간)하고, 세포들을 96웰 플레이트에 5000 세포/웰(2.5 x 104/mL)로 플레이팅하였다. 상기 플레이트를 37℃, 공기 중 7.5% CO2의 대기에서 배양하였다. 상기 플레이트를 형질 주입 후 약 3주까지 콜로니 성장에 대해 관찰하였다. 세포 성장물을 포함하는 최대 100개 웰로부터 얻은 상층액을 수확하고 Octet(Forte Bio) 단백질 A 분석법을 이용하여 그 항체를 분석하였다. 상위 24개의 발현 콜로니를 24개 웰 플레이트로 확장하여 10일간 배양하였다. 이후 상층액을 그 항체에 대해 Octet(Forte Bio) 단백질 A 분석법을 이용하여 분석하였다. 결과는 하기 표 2에 제시되어 있다.
표 2
Figure 112015110668888-pct00002
실시예 3
CHO 상층액으로부터 얻은 항체의 정제
실시예 2에 기재된 hEF1α 프로모터 이중 유전자 벡터를 이용하여 제작한 재조합 CHO DG44 세포주로부터 얻은 상층액을 단백질 A 레진을 이용하여 정제하였다. 350 mL의 맑게한 수확물을 MabSelect SuRe 레진(GE Healthcare)을 포함하는 사전 충전된 칼럼에 로딩하였다. 레진을 20 mM 소듐 포스페이트, 1 M NaCl(pH 7.0)로 최초 세척하였고, 이후 20 mM 소듐 포스페이트(pH 7.0)로 세척하였다. 이후 항체를 100 mM 아세트산으로 용출하였다. 회수된 생성물을 Octet(Forte Bio) 단백질 A 분석법을 이용하여 정량화 하였고, 표 3에 나타나있다.
표 3
Figure 112015110668888-pct00003
<110> FUJIFILM Diosynth Biotechnologies UK Limited <120> EXPRESSION PROCESS <130> PM032168 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Gln Cys 1 5 10 15 Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 2 Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu 1 5 10 15 Gly Thr Ala Val Arg Cys Thr Glu Ala 20 25 <210> 3 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgctgagag gccctggacc tggactgctg ctgctggctg tgcagtgtct gggaaccgcc 60 gtgccttcta ccggcgcc 78 <210> 4 <211> 75 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 4 atgctcaggg gtccgggacc cgggctgctg ctggccgtcc tgtgcctggg gacagcggtg 60 cgctgtaccg aagcc 75 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Ala Thr Cys Gln Ser 20 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 6 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Asp Ser Ala 1 5 10 15 Phe Ser

Claims (25)

  1. 하기의 단계를 포함하는 표적 폴리펩티드를 생산하는 방법:
    (a) CHO 세포 내에서 표적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 벡터를 발현시키는 단계로서, 상기 발현 벡터는 CHO 피브로넥틴 분비 선도자 서열에 작동 가능하게(operably) 연결된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 표적 폴리펩티드를 회수하는 단계.
  2. 하기의 단계를 포함하는 표적 폴리펩티드를 생산하는 방법:
    (a) CHO 세포에서 표적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 벡터로 CHO 세포를 형질주입 또는 형질전환시키는 단계로서, 상기 발현 벡터는 CHO 피브로넥틴 분비 선도자 서열에 작동 가능하게 연결된 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것인 단계;
    (b) CHO 세포의 증식이 가능하게 하는 환경에서 CHO 세포를 배양하고 상기 CHO 세포로부터 표적 폴리펩티드를 발현 및 분비시키는 단계; 및
    (c) 표적 폴리펩티드를 회수하는 단계.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 CHO 세포는 CHOK1, DG44, DUXKB11 또는 CHO pro3-세포인 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 CHO 세포는 DG44 세포인 것인 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 발현 카세트는 hEF1a 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 발현 카세트는 폴리 A 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 폴리 A 서열은 인간 베타글로빈 폴리 A 서열, 소 성장 호르몬 폴리 A 서열, 및 SV40 초기 또는 후기 폴리 A 서열로부터 선택된 것인 방법.
  8. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 피브로넥틴 분비 선도자는 서열 MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA을 갖는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 CHO 세포는 DG44 세포이고, 상기 발현 카세트는 hEF1a 프로모터를 포함하고, 및/또는 상기 발현 카세트는 인간 베타글로빈 폴리 A 서열, 소 성장호르몬 폴리 A 서열, 및 SV40 조기 또는 만기 폴리 A 서열로부터 선택된 폴리A 서열을 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 방법은 두 개의 발현 카세트를 사용하는 것이고, 제1 발현 카세트는 모노클론성 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 발현 카세트는 모노클론성 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 두 개의 발현 카세트는 동일한 프로모터, 분비 선도자 및 폴리 A 서열을 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 프로모터는 hEF1a 프로모터이고, 상기 피브로넥틴 분비 선도자는 중국 햄스터 피브로넥틴 분비 선도자이고, 및 상기 폴리 A 서열은 소 베타글로빈 폴리 A 서열인 것인 방법.
  13. CHO 피브로넥틴 분비 선도자 서열에 작동 가능하게 연결된 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터로 형질 주입된 CHO 세포.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 모노클론성 항체를 포함하는 것인 CHO 세포.
  15. 청구항 14에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 별개의 발현 카세트들을 이용하는 것인 CHO 세포.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 발현 카세트들은 동일한 벡터 상에 위치한 것인 CHO 세포.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 발현 카세트 각각은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 항존 유전자 프로모터를 포함하는 것인 CHO 세포.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 발현 카세트 각각은 소 성장 호르몬 폴리 A 서열을 포함하는 것인 CHO 세포.
  19. 청구항 13에 있어서, 상기 세포는 디히드로폴레이트 레덕타제 마커 시스템을 더 포함하는 것인 CHO 세포.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 디히드로폴레이트 레덕타제 마커 시스템은 쥐(murine) 포스포글리세레이트 키나제 프로모터를 포함하는 것인 CHO 세포.
  21. 청구항 17에 있어서, 상기 발현 카세트는 소 성장 호르몬 폴리A 서열을 포함하는 것인 CHO 세포.
  22. 청구항 13 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 피브로넥틴 분비 선도자는 서열 MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA을 갖는 것인 CHO 세포.
  23. 청구항 13 내지 21 중 어느 하나에 따른 CHO 세포를 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  25. 삭제
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